CN107667117B - 激动型icos结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种ICOS结合蛋白或其抗原结合部分以及用所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分治疗癌症、传染性疾病和/或败血症的方法，所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分为人ICOS的激动剂，且当在体内与T细胞接触时不诱导补体、ADCC或CDC。此外，本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分在与所述T细胞接触时能活化T细胞；在与所述T细胞接触时刺激T细胞增殖；和/或在与所述T细胞接触时诱导细胞因子产生。本发明涉及ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其包含以下一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6。

Description

激动型ICOS结合蛋白
技术领域
本发明大体上涉及用于治疗人类疾病和减少与之相关的不良事件的免疫治疗。更具体地，本发明涉及包括ICOS激动剂抗体的ICOS结合蛋白的用途，以及其在治疗癌症、传染性疾病和/或败血症中作为免疫调节剂的用途。
背景技术
对于癌症治疗来说，增强抗肿瘤T细胞功能和诱导T细胞增殖是有效的新方法。目前市场上有三种免疫肿瘤学抗体(例如免疫调节剂)。认为抗 CTLA-4(YERVOY/依匹木单抗(Ipilimumab))在T细胞启动点放大免疫反应，抗PD-1抗体(OPDIVO/纳武单抗(Nivolumab)和KEYTRUDA/派姆单抗 (Pembrolizumab))被认为通过缓解已经被启动和活化的肿瘤特异性T细胞中的抑制性检查点而在局部肿瘤微环境中起作用。
ICOS是与CD28/CTLA-4-Ig超家族在结构和功能方面相关的共刺激性 T细胞受体(Hutloff等人，"ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally andfunctionally related to CD28",Nature,397:263-266(1999))。ICOS是通过 ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)结合而发生活化。B7-1和B7-2(CD28和CTLA4的配体)都不结合或活化ICOS。然而，ICOS-L已经显示与CD28和CTLA-4两者的弱结合(Yao S等人，“B7-H2 is acostimulatory ligand for CD28 in human”, Immunity,34(5)；729-40(2011))。ICOS的表达似乎限于T细胞。ICOS表达水平在不同的T细胞亚群和T细胞活化状态之间变化。已经显示在休止TH17、 T滤泡辅助(TFH)和调节性T(Treg)细胞上有ICOS表达；然而，不同于CD28，ICOS在初始TH1和TH2效应子T细胞群上并未高度表达(Paulos CM等人，“The induciblecostimulator(ICOS)is critical for the development of human Th17 cells”,SciTransl Med,2(55)；55ra78(2010))。在通过TCR接合而活化后， ICOS表达在CD4+和CD8+效应子T细胞上被高度诱导(Wakamatsu E等人，“Convergent and divergent effects ofcostimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+T cell”,Proc NatalAcad Sci USA,110(3)；1023-8(2013))。通过ICOS受体的共刺激信号仅发生在接受了并发TCR活化信号的T细胞中 (Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28 Superfamily”,Nat.Rev Immunol, 2(2)；116-26(2002))。在活化的抗原特异性T细胞中，ICOS调节TH1和TH2细胞因子的产生，所述TH1和TH2细胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、 IL-4、IL-13等。ICOS还刺激效应子T细胞增殖，尽管程度小于CD28(Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28Superfamily”,Nat.Rev Immunol,2(2)；116- 26(2002))。
越来越多的文献支持激活在CD4+和CD8+效应子T细胞上的ICOS具有抗肿瘤潜力的想法。在具有SA-1(肉瘤)、Meth A(纤维肉瘤)、EMT6(乳腺) 和P815(肥大细胞瘤)和EL-4(浆细胞瘤)同基因肿瘤的小鼠中，ICOS-L-Fc融合蛋白导致肿瘤生长延迟和肿瘤完全消除，但在已知是低免疫原性的B16- F10(黑素瘤)肿瘤模型中没有观察到活性(Ara G等人，“Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors insyngeneic hosts”,Int.J Cancer, 103(4)；501-7(2003))。ICOS-L-Fc的抗肿瘤活性取决于完整的免疫应答，因为活性在裸鼠中生长的肿瘤中完全丧失。分析经ICOS-L-Fc处理的小鼠肿瘤，显示对治疗有反应的肿瘤中CD4+和CD8+T细胞浸润显著增加，支持ICOS- L-Fc在这些模型中的免疫刺激作用。
使用ICOS-/-和ICOS-L-/-小鼠的另一报告证实，B16/B16黑素瘤同基因肿瘤模型中，ICOS信号传导在介导抗CTLA4抗体的抗肿瘤活性中是必需的 (Fu T等人，“The ICOS/ICOSLpathway is required for optimal antitumor responses mediated by抗-CTLA-4therapy”,Cancer Res,71(16)；5445-54 (2011))。与野生型小鼠相比，在抗CTLA4抗体治疗后，缺乏ICOS或ICOS- L的小鼠存活率明显降低。在一项独立研究中，转导B16/B16肿瘤细胞以过表达重组鼠ICOS-L。与用对照蛋白转导的B16/B16肿瘤细胞相比，发现这些肿瘤对抗CTLA4治疗显著更敏感(Allison J等人，“Combination immunotherapy for thetreatment of cancer”,WO2011/041613A2(2009))。这些研究为ICOS激动剂单独和与其他免疫调节抗体组合的抗肿瘤潜力提供了证据。
来自经抗CTLA4抗体治疗的患者的新数据也表明，ICOS+效应子T细胞在介导抗肿瘤免疫应答方面的积极作用。患有转移性黑素瘤(Giacomo AMD等人，“Long-term survivaland immunological parameters in metastatic melanoma patients who respond toipilimumab 10mg/kg within an expanded access program”,Cancer ImmunolImmunother.,62(6)；1021-8(2013))；泌尿道上皮癌(Carthon BC等人，“PreoperativeCTLA-4blockade:Tolerability and immune monitoring in the setting of apresurgical clinical trial”Clin Cancer Res., 16(10)；2861-71(2010))；乳腺癌(Vonderheide RH等人，“Tremelimumab in combination with exemestane in patientswith advanced breast and treatment- associated modulation of induciblecostimulator expression on patient Tcell”,Clin Cancer Res.,16(13)；3485-94(2010))；和前列腺癌的患者(其循环与肿瘤浸润的CD4+ICOS+与CD8+ICOS+T细胞的绝对计数在经依匹木单抗治疗后增加) 与所观察到的绝对计数增加很少或没有增加的患者相比有明显更好的治疗相关结果。重要的是，显示依匹木单抗改变了ICOS+T效应子:Treg的比例，将治疗前Treg过量逆转为治疗后T效应子相对于Treg的显著过量(Liakou CI 等人，“CTLA-4blockade increases IFN-gamma producing CD4+ICOShi cells to shift the ratioof effector to regulatory Tcell in cancer patients”,Proc Natl Acad SciUSA.105(39)；14987-92(2008))和(Vonderheide RH等人，Clin Cancer Res., 16(13)；3485-94(2010))。因此，ICOS阳性T效应子细胞是依匹木单抗反应的正向预测性生物标志物，其指示用激动剂ICOS抗体活化该细胞群的潜在优势。
因此，需要额外的T细胞增殖诱导分子来治疗癌症。
发明内容
在本发明的一个实施方案中，提供了ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其包含以下中的一个或多个:SEQID NO:1所示的CDRH1；SEQID NO:2所示的CDRH2；SEQ ID NO:3所示的CDRH3；SEQID NO:4所示的CDRL1；SEQID NO:5所示的CDRL2和/或SEQID NO:6所示的CDRL3或或各CDR的直接等价物，其中直接等价物在所述CDR中具有不超过两个的氨基酸替换。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异性结合至人ICOS的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中所述ICOS结合蛋白包含VH结构域和/或包含VL结构域，其中所述VH结构域含有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，和所述VL结构域含有与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了人源化单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含具有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链CDR。在一个实施方案中，提供了人源化单克隆抗体，其包含： ahIgG4PE骨架；VH结构域，其包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列；和 VL结构域，其包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。本发明的抗体在与 T细胞接触时可刺激细胞因子的生成。
在一个实施方案中，提供了ICOS结合蛋白，其与本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分中的任一种竞争结合至人ICOS。
在一个实施方案中，提供了治疗癌症、传染性疾病和/或败血症败血症的方法，其中使用ICOS结合蛋白或包含至少一种本发明的ICOS结合蛋白的药物组合物。
附图简述
图1：CD4+CD25-T细胞中IFN-γ的产生。
图2：CD4+CD25-T细胞中的增殖。
图3：抗-ICOS 422.2的H2L5人源化变体在PBMC细胞中显示更好的细胞因子产生。其中，从健康人供体中新鲜分离人PBMC，并在预先用抗CD3 (OKT3)以及四种可溶性抗ICOS422.2人源化变体中的每一种涂覆的板上活化。处理2.5天后，通过MSD测定上清液中IFN-γ(A)、IL-10(B)和 TFN-α(C)的含量。
图4：422H2L5 IgG1诱导T细胞成活力降低，而Fc-失能型或hIgG4PE 同型则不明显。其中，将人PBMC在预先用抗CD3(OKT3)和具有不同的 Fc同型的可溶性人源化抗ICOS422.2涂覆的板上新鲜活化。处理2.5天后，通过流式细胞测量术检测活的CD4+T细胞的百分比。
图5：在人CD4+T细胞中H2L5 hIgG4PE诱导的促炎细胞因子诱导的剂量反应。其中，用抗CD3(OKT3)+连续浓度的同型对照(Synagis IgG4PE) 或H2L5 hIgG4PE mAb以板结合型或可溶形式对被抗CD3/CD28预刺激2 天的人健康供体CD4+T细胞进行再刺激。在处理3.5天后，通过MSD测定在上清液中的(A)IFN-γ的浓度和(B)TFN-α的浓度。图6：H2L5 hIgG4PE 在健康人类供体的活化的PBMC中诱导增殖、细胞因子产生和细胞毒性效力的增加。其中，通过抗CD3(OKT3)+可溶性H2L5 hIgG4PE mAb或同型对照，对被抗CD3/CD28预刺激2天的人PBMC细胞进行再刺激。处理 2.5天后，通过CFSE FACS测定(A)测量T细胞增殖。通过MSD(B)测量上清液中的IFN-γ的浓度。通过流式细胞测量术测量CD4+T细胞的细胞内颗粒酶B表达。
图7：Meso Scale Discovery(MSD)分析显示通过H2L5 hIgG4PE抑制了 ICOS-L结合至ICOS，表明其结合至ICOS上与ICOS-L相同的表位且竞争结合。
图8：由杂交瘤克隆422.2的RNA回收的抗体VH和VL基因。
图9：具有信号序列的H2L5 hIgG4PE重链和轻链的蛋白质序列。
图10：编码具有信号序列的H2L5 hIgG4PE重链区的DNA序列。
图11：编码具有信号序列的H2L5 hIgG4PE轻链区的DNA序列。
图12：食蟹猴中H2L5 hIgG4PE的血浆浓度。在(A)第一次给药或(B)第二次给药(第15天)后确定H2L5 hIgG4PE的浓度。在第二次给药后48小时处死动物进行组织样品收集和组织病理学分析。
图13：检测来自猴子脾和腋窝淋巴结的H2L5 hIgG4PE与CD4+T细胞的结合。在第二次给药后48小时(第17天)收集组织。
图14：在食蟹猴的血液CD4+T细胞中H2L5 hIgG4PE的受体占用率。
(A)ICOS“游离受体”，其通过用于流式细胞测量术的抗-ICOS荧光标记的抗体的阳性结合来测量，仅当H2L5 hIgG4PE不存在时才会结合。
(B)外周血液CD4+细胞上受体结合的H2L5 hIgG4PE，其通过荧光标记的抗-人IgG测量。
图15：(a)在用H2L5 hIgG4PE处理的Ba/F3-ICOS细胞中的磷酸-AKT (T308)表达水平-细胞内信号传导抗体阵列；(b)在用H2L5 hIgG4PE处理的 Ba/F3-ICOS细胞中的磷酸-AKT(S473)表达水平-细胞内信号传导抗体阵列。
图16：相比于单一抗体处理，与依匹木单抗组合的H2L5 hIgG4PE在 PBMC预刺激分析中导致促炎细胞因子的产生增加。
图17：相比于单一抗体处理，与派姆单抗组合的H2L5 hIgG4PE在PBMC 预刺激分析导致促炎细胞因子的产生增加。
图18：在使用CEFT肽和预孵育的经改变的MLR分析中，H2L5 hIgG4PE+依匹木单抗的组合导致促炎细胞因子的产生增加。
图19：在使用CEFT肽和预孵育的经改变的MLR分析中，H2L5 hIgG4PE+派姆单抗的组合导致促炎细胞因子的产生增加。
图20：在人PBMC A2058黑素瘤小鼠肿瘤模型中，H2L5 hIgG4PE抗- ICOS激动剂mAb单独以及与派姆单抗组合时导致对肿瘤生长的抑制。
图21：在CT26小鼠肿瘤模型中，抗-ICOS鼠类代用mAb在与抗-PD1 鼠类代用mAb组合时导致显著的对肿瘤生长的抑制和增加的存活。
图22：在EMT6小鼠肿瘤模型中，抗-ICOS鼠类代用mAb在与抗-PD1 鼠类代用mAb组合时导致对肿瘤生长的显著抑制和存活的增加。
发明详述
定义
如本发明所用，“ICOS”是指任何可诱导型T细胞共刺激蛋白。ICOS(可诱导型T细胞共刺激剂)的替代名称包括AILIM、CD278、CVID1、JTT-1或 JTT-2、MGC39850或8F4。ICOS是在活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激性分子。由该基因编码的蛋白质属于CD28和CTLA-4细胞表面受体家族。它形成同型二聚体并在细胞-细胞信号传导、免疫应答和细胞增殖调节中起重要作用。人ICOS的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
Figure GDA0003245324200000061
如本发明所用，“ICOS-L”和“ICOS配体”可互用使用，并表示人ICOS 的膜结合自然配体。ICOS配体是一种蛋白质，其在人中由ICOSLG基因编码。ICOSLG也被命名为CD275(分化簇275)。ICOS-L的替代名称包括B7RP- 1和B7-H2。
如本发明所用，术语“激动剂”是指抗原结合蛋白，例如ICOS结合蛋白，其在与ICOS接触时引起以下中的一种或多种：(1)刺激或活化ICOS受体；(2)增强、增加或促进、诱导或延长ICOS的活性、功能或存在；和/或(3) 增强、增加、促进或诱导ICOS的表达。可以通过本领域已知的各种分析在体外测量激动剂活性，例如但不限于测量细胞信号传导、细胞增殖、免疫细胞活化标记、细胞因子产生。还可以通过测量替代终点(例如但不限于测量T 细胞增殖或细胞因子产生)的各种分析在体内测量激动剂活性。
如本发明所用，术语“交叉竞争结合”是指将与本发明的任何ICOS结合蛋白竞争结合至ICOS的任何ICOS结合蛋白。针对ICOS的两个分子之间的结合竞争可以通过本领域已知的各种方法测试，包括流式细胞测量术、 Meso Scale Discovery和ELISA。结合可被直接测量，意味着可以将两种或更多种结合蛋白与ICOS接触，并且可以测量其中一种或每种蛋白的结合。或者，可以针对结合或天然配体来测试感兴趣的分子的结合，并彼此进行定量比较。
如本发明所用，术语“ICOS结合蛋白”是指能够结合ICOS的抗体和其他蛋白质构建体，例如结构域。在某些情况下，ICOS是人ICOS。术语“ICOS 结合蛋白”可以与“ICOS抗原结合蛋白”互换使用。因此，如本领域所知，抗-ICOS抗体和/或ICOS抗原结合蛋白将被认为是ICOS结合蛋白。如本发明所用，“抗原结合蛋白”是与抗原(例如ICOS)结合的任何蛋白质，包括但不限于本发明所述的抗体、结构域和其他构建体。如本发明所用，ICOS结合蛋白的“抗原结合部分”将包括能够结合ICOS的ICOS结合蛋白的任何部分，包括但不限于抗原结合抗体片段。
术语“抗体”在本发明中就最广义来说是指具有免疫球蛋白样结构域(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的分子，并且包括单克隆、重组、多克隆、嵌合、人、人源化、多特异性的抗体包括双特异性抗体和异源偶联抗体；单个可变结构域(例如VH、VHH、VL、结构域抗体(dAbTM))、抗原结合抗体片段、 Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、二硫键连接的scFv、双抗体、 TANDABSTM等，以及上述任一种的修改版本。
可选择的抗体形式包括可选择骨架，其中抗原结合蛋白的一个或多个CDR可以被排列在合适的非免疫球蛋白骨架或基本部分上，例如亲合体、 SpA骨架、LDL受体型A型结构域、avimer或EGF结构域。
术语“结构域”是指折叠的蛋白质结构，其保留其独立于蛋白质的其余部分的三级结构。结构域一般是负责蛋白质的离散的功能性质，并且在许多情况下可以被添加、除去或转移到其他蛋白质，而不损失蛋白质和/或结构域的其余部分的功能。
术语“单一可变域”是指包含抗体可变域特征序列的折叠多肽结构域。因此，其包括例如VH、VHH和VL的完整抗体可变域以及经修饰的抗体可变域(例如，其中一个或多个环已经被抗体可变域的非特征序列替代)，或已被截短或包含N-或C-末端延伸的抗体可变域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变域的折叠片段。单一可变域能够独立结合不同的可变区或可变域的抗原或表位。“域抗体”或“dAbTM”可以被认为与“单一可变域”相同。单一可变域可为人的单一可变域，但也包括来自其他物种的单一可变域，如啮齿类铰口鲨和骆驼科VHH dAbTM。骆驼科VHH是衍生自包括骆驼，美洲驼，羊驼，单峰骆驼和原驼的物种的免疫球蛋白单一可变域多肽，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。这样的VHH结构域可以根据本领域可用的标准技术被人源化，并且这样的结构域被认为是“单一可变域”。如本发明所用，VH包括骆驼科VHH域。
可以通过在非抗体蛋白骨架上布置一个或多个CDR来提供抗原结合片段。如本发明所用，“蛋白质骨架”包括但不限于免疫球蛋白(Ig)骨架，例如可以是四链或二链抗体的IgG骨架，或可仅包含抗体的Fc区，或其可以包含来自抗体的一个或多个恒定区，其中该恒定区可以是人或灵长类来源，或者可以是人和灵长类动物恒定区的人造嵌合体。
蛋白质骨架可以是Ig骨架，例如IgG或IgA骨架。IgG骨架可以包含抗体的一些或全部结构域(即，CH1、CH2、CH3、VH、VL)。抗原结合蛋白可以包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE的IgG骨架。例如，骨架可以是IgG1。骨架可以由抗体的Fc区组成或包含抗体的Fc区，或者是其一部分。
蛋白质骨架可以是选自以下的骨架的衍生物：CTLA-4、脂质运载蛋白(lipocalin)、蛋白A衍生的分子(如蛋白A的Z结构域(亲合体，SpA)、A结构域(Avimer/Maxibody))；热休克蛋白如GroE1和GroES；转铁蛋白(trans- body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C型凝集素结构域(Tetranectin)；人类γ晶体蛋白和人类泛素(affilin)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素库尼兹型结构域；和纤维结合素/纤连蛋白(adnectin)；其受到蛋白质改造以获得与除天然配体之外的抗原(例如ICOS)的结合。
抗原结合位点是指能够特异性结合抗原的抗原结合蛋白上的位点，其可以是单一可变域，或者可以是配对的VH/VL结构域，如可见于标准抗体上。单链Fv(ScFv)结构域也可提供抗原结合位点。术语“表位结合结构域”是指特异性结合至抗原某个区域的结构域，该区域已知为表位，其独立于不同结构域。
术语多特异性抗原结合蛋白是指包含至少两个不同抗原结合位点的抗原结合蛋白。这些抗原结合位点中的每一个将能够结合到不同表位，所述表位可以存在于相同抗原或不同抗原上。多特异性抗原结合蛋白将对多于一种抗原，例如两种抗原或三种抗原或四种抗原具有特异性。
多特异性抗原结合蛋白的实例包括由抗体的Fc区组成、或基本上由其组成的那些或其一部分，所述Fc区在每一端直接或间接(例如通过接头序列) 连接至结合域。这样的抗原结合蛋白可以包含由Fc区分开的两个结合域或其一部分。分开意味着结合域不是彼此直接连接，并且可以位于Fc区或任何其他骨架区的相反端(C和N末端)。
抗原结合蛋白可以包含两个骨架区，每个骨架区直接或通过接头间接地结合到两个结合域，例如在每个骨架区的N和C末端。每个结合域可以结合不同的抗原。
如本发明所用，术语mAbdAb是指连接至另一结合域的单克隆抗体，特别是单一可变域如结构域抗体。mAbAb具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自结构域抗体，并且至少一个来自配对的VH/VL结构域。
“dAbTM缀合物”是指包含dAb的组合物，其中药物通过共价或非共价键以化学的方式缀合至该dAb。优选地，dAb和药物共价键合。这种共价连接可以经由肽键或其它方式，例如通过经修饰的侧链。非共价结合可以是直接的(例如，静电相互作用，疏水相互作用)或间接的(例如，通过互补结合配偶体(例如生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合，其中一个配偶体共价键合到药物上，并且互补结合配偶体与dAbTM共价结合)。当使用互补结合配偶体时，结合配偶体之一可以直接或通过合适的接头部分共价键合到药物上，并且互补结合配偶体可以直接或通过合适的接头部分共价键合到dAbTM上。
如本发明所用，“dAbTM融合物”是指包含dAbTM和多肽药物(其可以是 dAbTM或mAb)的融合蛋白。dAbTM和多肽药物作为单一连续多肽链的离散部分存在。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白显示人ICOS和来自其他物种的ICOS(如食蟹猴ICOS)之间的交叉反应性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白特异性结合人和食蟹猴的ICOS。提供可以结合人类和猴子物种的药物使人们能够在这些系统中测试结果，并使用相同的药物并行比较数据。预期在疾病模型中使用的其它物种(诸如狗或猴子，特别是猴子的)之间有交叉反应性。
ICOS结合蛋白与参考ICOS结合蛋白之间的竞争可以通过竞争MSD、 ELISA、FMAT或BIAcore测定。在一个实施方案中，通过比较ICOS结合蛋白与ICOS配体结合进行竞争测定。这种竞争有几个可能的原因：两种蛋白质可结合相同或重叠的表位；可存在对结合的立体位阻；或第一蛋白的结合可以诱导抗原中的构象变化，其阻止或减少了第二蛋白的结合。
在本说明书中使用的术语“中和”是指，相比于不存在ICOS结合蛋白时ICOS和ICOS-L的相互作用，在本发明所述的抗原结合蛋白存在下，ICOS 和ICOS-L之间的相互作用在体外或体内下降。中和可以是由于以下中的一个或多个：阻断ICOS与其配体结合；阻止ICOS被其配体活化；下调ICOS 或其受体；或影响效应子功能。例如，实施例3和5中描述的配体结合竞争可用于评估ICOS结合蛋白的中和能力。
ICOS结合蛋白对ICOS和ICOS-L之间的相互作用的影响可以是部分或全部的。相对于不存在ICOS结合蛋白时的ICOS-ICOS-L相互作用，中和 ICOS结合蛋白可以将ICOS与ICOS-L的相互作用阻断至少20％、30％40％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、 92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
可以使用本领域技术人员已知的或如本发明所述的一种或多种测定来确定或测量中和。
亲和力是一个分子(例如本发明的抗原结合蛋白)与另一分子(例如其目标抗原)在单一结合位点的结合强度。可以通过平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定(RIA))或动力学(例如BIACORETM分析)来确定抗原结合蛋白与其靶标的结合亲和力。例如，实施例5中描述的BiacoreTM方法可用于测量结合亲和力。
结合性(avidity)是两个分子在多个位点彼此结合的强度的总和，例如，考虑到相互作用的价数。
在一个实施方案中，ICOS结合蛋白-ICOS相互作用的平衡解离常数(KD) 为100nM以下、10nM以下、2nM以下或1nM以下。或者，KD可为5至 10nM之间；或1至2nM。KD可为1pM至500pM；或500pM至1nM。技术人员将会意识到KD数值越小，结合越强。KD的倒数(即1/KD)是单位为 M-1的平衡缔合常数(KA)。技术人员将会意识到，KA数值越大，结合越强。
解离速率常数(kd)或“解离速率”描述了ICOS结合蛋白ICOS复合物的稳定性，即，每秒衰减的复合物分数。例如，0.01s-1的kd相当于每秒衰减 1％的复合物。在一个实施方案中，解离速率常数(kd)为1x10-3s-1以下、1x10-4s-1以下、1x10-5s-1以下或1x10-6s-1以下。Kd可为1x10-5s-1至1x10-4s-1；或 1x10-4s-1至1x10-3s-1。
缔合速率常数(ka)或“缔合速率”描述了ICOS结合蛋白-ICOS复合物的形成速率。在一个实施方案中，缔合速率常数(ka)为约1.0x105M-1s-1。
“分离”是指将该分子，例如抗原结合蛋白或核酸，从发现其的自然界环境中移出。例如，分子可以从与其一起正常存在于自然界中的物质中纯化出来。例如，样品中分子的质量可以是总质量的95％。
如本发明所用术语“表达载体”，是指可用于将感兴趣的核酸引入细胞 (如真核细胞或原核细胞)或无细胞表达系统中的分离的核酸，其中感兴趣的核酸序列被表达为肽链，如蛋白质。这样的表达载体可以是例如包含感兴趣的核酸的粘粒、质粒、病毒序列、转座子和线性核酸。一旦将表达载体导入细胞或无细胞表达系统(例如网织红细胞裂解物)中，由感兴趣的核酸编码的蛋白质通过转录/翻译机制产生。本发明范围内的表达载体可为真核或原核表达提供必要的元件，并且包括病毒启动子驱动的载体，例如CMV启动子驱动的载体(例如pcDNA3.1、pCEP4及其衍生物)、杆状病毒表达载体，果蝇表达载体；以及由哺乳动物基因启动子，如人Ig基因启动子驱动的表达载体。其他实例包括原核表达载体，例如T7启动子驱动的载体(例如pET41)、乳糖启动子驱动的载体和阿拉伯糖基因启动子驱动的载体。本领域普通技术人员将认识到许多其它合适的表达载体和表达系统。
术语“重组宿主细胞”如本发明所用，是指包含感兴趣的核酸序列的细胞，所述核酸序列在将其引入细胞之前被分离。例如，感兴趣的核酸序列可以是表达载体，而细胞可以是原核的或真核的。示例性真核细胞是哺乳动物细胞，例如但不限于COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、 653、SP2/0、NS0、293、HeLa、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞或其衍生物。最优选地，真核细胞是HEK293、NS0、SP2/0或CHO细胞。大肠杆菌是示例性的原核细胞。根据本发明的重组T细胞可以通过转染、细胞融合、永生化或本领域熟知的其它方法产生。转染入细胞的感兴趣的核酸序列，例如表达载体，可以是染色体外的或被稳定整合到细胞染色体中。
“嵌合抗体”是指一种工程化抗体，其含有衍生自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)，其与衍生自受体抗体的轻链和重链恒定区缔合。
“人源化抗体”是指具有衍生自非人供体免疫球蛋白的CDR的工程化抗体类型，该分子的其它免疫球蛋白衍生部分衍生自一种或多种人免疫球蛋白。另外，可以改变框架支撑残基以保持结合亲和力(参见例如，Queen等人， Proc.Natl Acad Sci USA,86:10029-10032(1989),Hodgson等人，Bio/Technology, 9:421(1991))。根据与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性，可以由常规数据库中选择合适的人受体抗体，例如KABATTM数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。特征在于与供体抗体的框架区同源(基于氨基酸)的人抗体可适于提供重链恒定区和/或重链可变框架区以用于插入供体 CDR。可以类似的方式选择能够提供轻链恒定区或可变框架区的合适的受体抗体。应当注意，受体抗体的重链和轻链不需要来源于相同的受体抗体。现有技术描述了生产这种人源化抗体的几种方法-例如参见EP-A-0239400和 EP-A-054951。
术语“完全人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗体。本发明的人序列抗体可以包括不被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变引入的突变，或通过体内体细胞突变引入的突变)。完全人体抗体包含仅由最终人类来源的多核苷酸编码的氨基酸序列或与这些序列相同的氨基酸序列。如本发明所述，插入到转基因小鼠中产生的小鼠基因组中的抗体(由编码人免疫球蛋白的DNA编码)是完全人抗体，因为它们由最终为人类来源的DNA编码。在这种情况下，编码人免疫球蛋白的DNA可以在小鼠内重排(以编码抗体)，并且也可能发生体细胞突变。由在小鼠中经历这种变化的人类来源的DNA 编码的抗体是本发明所指的完全人抗体。使用这样的转基因小鼠使得可以针对人抗原选择完全人抗体。如本领域所理解的，可以使用噬菌体展示技术制备完全人抗体，其中将人DNA库插入噬菌体中以产生包含人种系DNA序列的抗体。
术语“供体抗体”是指将其可变区、CDR或其它功能片段或类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体的抗体。因此，供体提供了改变的免疫球蛋白编码区，并导致所表达改变的抗体，该表达改变的抗体具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特征。
术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体，其向第一免疫球蛋白配偶体贡献编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的全部 (或任何部分)氨基酸序列。人抗体可以是受体抗体。
本发明所用的术语“VH”和“VL”分别指抗原结合蛋白的重链可变区和轻链可变区。
“CDR”被定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链CDR 和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，“CDR”，如本发明所用，是指全部三个重链CDR、全部三个轻链CDR、全部重链CDR和轻链CDR、或至少两个CDR。
在本说明书中，可变域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基根据Kabat 编号惯例编号。类似地，实施例中使用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”遵循Kabat编号惯例。有关更多信息，请参见Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1991)。
对于本领域技术人员显而易见的是，在可变域序列和全长抗体序列中存在氨基酸残基的替代性编号惯例。也有CDR序列的替代编号惯例，例如在 Chothia等人(1989)Nature342:877-883中列出的那些。抗体的结构和蛋白质折叠可意味着其他残基被认为是CDR序列的一部分，且为本领域技术人员所理解。
本领域技术人员可获得的CDR序列的其他编号惯例包括“AbM” (University ofBath)和“接触(contact)”(University College London)方法。可使用Kabat、Chothia、AbM和接触方法中的至少两种确定最小重叠区域以提供“最小结合单元”。最小结合单元可以是CDR的子部分。
以下表1表示针对各CDR或结合单元使用每一种编号惯例的定义。表 1中使用Kabat编号方案对可变域氨基酸序列进行编号。应当注意，一些CDR 定义可以随所使用的各个出版物而变化。
表1
Figure GDA0003245324200000141
因此，提供了ICOS结合蛋白，其包含以下CDR中的任一种或组合：
CDRH1：DYAMH(SEQ ID NO：1)
CDRH2：LISIYSDHTNYNQKFQG(SEQ ID NO：2)
CDRH3：NNYGNYGWYFDV(SEQ ID NO：3)
CDRL1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：4)
CDRL2：DTSKLAS(SEQ ID NO：5)
CDRL3：FQGSGYPYT(SEQ ID NO：6)
在本发明的一个实施方案中，ICOS结合蛋白在具有SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的重链可变区中包含CDRH1(SEQ ID NO：1)、CDRH2(SEQ ID NO：2)和CDRH3(SEQ ID NO：3)。包含SEQ ID NO：7中所示的人源化重链可变区的本发明的ICOS结合蛋白被命名为“H2”。在一些实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白包含重链可变区，其与SEQ ID NO：7具有至少90％的序列同一性。适当地，本发明的ICOS结合蛋白包含重链可变区，其与SEQ ID NO：7具有约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
人源化重链(VH)可变区(H2)：
Figure GDA0003245324200000142
在本发明的一个实施方案中，ICOS结合蛋白在具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的轻链可变区中包含CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：6)。包含SEQ ID NO：8中所示的人源化轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白被命名为“L5”。因此，包含SEQ ID NO：7 的重链可变区和SEQ ID NO：8的轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白在本发明中可被命名为H2L5。
适当地，在图9中显示了可变的重链和轻链构建体的前导序列，且包括但不限于MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：11)。
在一些实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白包含与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的轻链可变区。适当地，本发明的ICOS结合蛋白可包含与SEQ ID NO：8具有约85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。
人源化轻链(VL)可变区(L5)
Figure GDA0003245324200000151
CDR或最小结合单元可以通过至少一个氨基酸的替换、缺失或添加进行修饰，其中变体抗原结合蛋白基本上保留未修饰蛋白的生物学特性，例如由克隆422.2产生的鼠类抗体或包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的抗体。
将理解，CDR H1，H2，H3，L1，L2，L3中的每个都可以单独或与任何其它 CDR组合以排列或组合的方式得到修饰。在一个实施方案中，通过替换、缺失或添加至多3个氨基酸(例如1或2个氨基酸，例如1个氨基酸)来修饰 CDR。典型地，该修饰通常为替换，尤其是保守替换，如下表2所示。
表2
侧链 成员
疏水性 Met，Ala，Val，Leu，Ile
中性亲水性 Cys，Ser，Thr
酸性 Asp，Glu
碱性 Asn，Gln，His，Lys，Arg
影响链取向的残基 Gly，Pro
芳香族 Trp，Tyr，Phe
例如，在变体CDR中，最小结合单元的氨基酸残基可以保持相同，但是包含作为Kabat或Chothia定义的一部分的CDR的侧翼残基可以被保守性氨基酸残基所替换。
包含如上所述的修饰的CDR或最小结合单元的此类抗原结合蛋白在本发明中可称为“功能性CDR变体”或“功能性结合单元变体”。适当地，在一个实施方案中，提供了ICOS结合蛋白，其包含一个或多个具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中所示的氨基酸序列和/或其功能CDR变体的 CDR。
如本发明所用的术语“表位”，是指抗原的一部分，其与抗原结合蛋白的特定结合域接触。表位可以是线性的或构象型/不连续的。构象型或不连续表位包含由其他序列分开的氨基酸残基，即在抗原的一级序列中不连续的序列。虽然残基可以来自肽链的不同区域，但是它们在抗原的三维结构中非常接近。在多聚体抗原的情况下，构象型或不连续表位可以包括来自不同肽链的残基。包含在表位内的特定残基可以通过计算机建模程序或通过本领域已知的方法如X射线晶体学获得的三维结构来确定。
CDR L1、L2、L3、H1和H2倾向于在结构上展示数量有限的主链构象之一。CDR的特定标准结构类型由CDR的长度和环堆积(loop packing)定义，其由位于CDR和框架区中关键位置的残基(结构决定残基或SDR)确定。 Martin和Thornton(1996；J Mol Biol 263:800-815)已经开发了一种定义“关键残基”标准模板的自动化方法。使用簇分析来定义CDR组的标准类型，然后通过分析掩蔽的疏水性、氢键合的残基和保守的甘氨酸和脯氨酸来进行鉴定。抗体序列的CDR可以通过将序列与关键残基模板进行比较来分配到标准类别中，并使用一致性或相似性矩阵对每个模板进行评分。
每个CDR、每个相应CDR、每个结合单元、每个重链可变区或轻链可变区、每个重链或轻链以及每个抗原结合蛋白可以有多个变体CDR标准位置，因此可以在本发明的抗原结合蛋白中存在任何替换的组合，条件是保持 CDR的标准结构，使得抗原结合蛋白能够特异性结合ICOS。
如上所述，CDR的特定标准结构类别由CDR长度和环堆积两者定义，其由位于CDR和框架区中的关键位置的残基确定。
查询核酸序列和主题核酸序列之间的“同一性百分比”为“同一性”值，以百分比表示，其是在进行了成对BLASTN比对后，当主题核酸序列与查询核酸序列具有100％查询覆盖率时，通过BLASTN算法计算得到的。查询核酸序列和主题核酸序列之间的这种成对BLASTN比对是通过使用 BLASTN算法的默认设置(可获自National Center for BiotechnologyInstitute 网站)进行的，其中关闭低复杂度区域的过滤器。重要的是，查询核酸序列可以由在本发明的一个或多个权利要求中定义的核酸序列来描述。
查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的“同一性百分比”为“同一性”值，以百分比表示，其是在进行了成对BLASTN比对后，当主题氨基酸序列与查询氨基酸序列具有100％查询覆盖率时，通过BLASTN算法计算得到的。查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的这种成对BLASTN比对是通过使用BLASTN算法的默认设置(可获自National Center forBiotechnology Institute网站)进行的，其中关闭低复杂度区域的过滤器。重要的是，查询氨基酸序列可以由在本发明的一个或多个权利要求中定义的氨基酸序列来描述。
查询序列可以与主题序列具有100％同一性，或者与主题序列相比，它可以包括多达一定整数数量的氨基酸或核苷酸改变，使得同一性百分比小于 100％。例如，查询序列与主题序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。这种改变包括至少一个氨基酸的缺失、替换(包括保守和非保守替换)或插入，并且其中所述改变可以发生在查询序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之间的任何位置，其单独的散布在查询序列中的氨基酸或核苷酸之间，或在查询序列内的一个或多个连续的群组中。
可以在查询序列的整个长度(包括CDR)上确定同一性百分比。或者，同一性百分比可以排除CDR，例如CDR与主题序列具有100％同一性，并且同一性百分比的变化位于查询序列的剩余部分中，使得CDR序列是固定的/ 完整的。
变体序列基本上保留未修饰蛋白质的生物学特性，如SEQ ID NO:7或 SEQ ID NO:8。
VH或VL序列可以是具有多达15个氨基酸替换、添加或的变体序列。例如，变体序列可以具有多达15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、 4、3、2或1个氨基酸替换、添加或删除。
序列变异可以排除CDR，例如CDR与VH或VL(或HC或LC)序列相同，并且变异位于VH或VL(或HC或LC)序列的其余部分中，使得CDR序列是固定的/完整的。
本领域技术人员将理解，在产生抗原结合蛋白例如抗体后可发生翻译后修饰，尤其是取决于所使用的细胞系和抗原结合蛋白的特定氨基酸序列。例如，这可包括切割某些前导序列、以各种糖基化和磷酸化模式中添加各种糖部分、脱酰胺化、氧化、二硫键扰乱(disulfide bond scrambling)、异构化、C- 末端赖氨酸剪切和N-末端谷氨酰胺环化。本发明包括抗原结合蛋白的用途，所述抗原结合蛋白经历或已经历一个或多个翻译后修饰。因此，本发明的“抗原结合蛋白”或“抗体”分别包括经历如本发明所述的翻译后修饰的如前所定义的“抗原结合蛋白”或“抗体”。
脱酰胺化是一种酶反应，主要是将天冬酰胺(N)转化成大约3:1比例的异天冬氨酸和天冬氨酸(D)。在较小程度上，谷氨酰胺残基可以类似的方式发生脱酰胺化。CDR中的脱酰氨基化导致分子的电荷变化，但通常不会导致抗原结合的变化，也不会对PK/PD产生影响。
氧化可以在生产和储存期间(即，在氧化条件的存在下)发生，并且造成蛋白质的共价修饰，其由反应性氧物质直接诱导或通过与氧化应激的次生副产物反应而被间接诱导。氧化主要发生在甲硫氨酸残基上，但偶尔可能发生在色氨酸和游离半胱氨酸残基上。
二硫键扰乱可发生在生产和碱性储存条件下。在某些情况下，二硫键会破裂或不正确形成，导致不成对的半胱氨酸残基(-SH)。这些游离(不成对的) 巯基(-SH)可促进改组(shuffling)。
异构化通常在生产、纯化和储存期间(酸性pH)发生，通常在通过化学过程将天冬氨酸转化为异天冬氨酸时发生。
重链和/或轻链中的N-末端谷氨酰胺可能形成焦谷氨酸(pGlu)。大多数 pGlu的形成发生在生产用生物反应器中，但可以非酶促形式形成，这取决于加工和储存条件的pH和温度。pGlu形成被认为是重组mAb的主要降解途径之一。
C-末端赖氨酸剪切是由羧肽酶催化的酶反应，并且通常在重组mAb中观察到。该方法的变体包括从一个或两个重链中除去赖氨酸。赖氨酸剪切似乎不影响生物活性，且对mAb效应子功能无影响。
可以结合蛋白质的天然存在的自体抗体存在于人体内。因此，自体抗体可以结合内源性蛋白(存在于初始受试者中)以及结合为了治疗目的被施用于受试者的蛋白质或肽。结合治疗性蛋白的自体抗体和响应于药物治疗而新形成的抗体被统称为抗药物抗体(ADA)。预先存在的针对被施用于受试者的分子(如治疗蛋白质和肽)的抗体可影响其效力，并且可在被治疗的患者中产生给药反应、超敏反应、改变的临床反应，以及通过维持、消除或中和该分子而改变生物利用度。提供治疗用分子是有利的，该分子包含人免疫球蛋白(抗体)单一可变域或dAbTM，其具有降低的免疫原性(即，当施用于受试者，特别是人类受试者时，结合预先存在的ADA的能力降低)。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了修饰的dAbTM，与未修饰的等效分子相比，其与预先存在的抗体(ADA)结合的能力降低。降低的结合能力意味着修饰的分子以降低的亲和力或降低的结合性结合至预先存在的 ADA。所述修饰的dAbTM包含选自以下的一种或多种修饰：(a)C-末端的添加、延伸、缺失或标记；和/或(b)一个或多个氨基酸框架替换。
本发明的多肽和dAbTM以及包含这些的激动剂可以被调制为具有较大的流体动力学尺寸，例如通过结合PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与抗体结构域结合。例如，多肽dAbTM和激动剂可被调制为抗体的较大抗原结合片段或被调制为抗体(例如，调制为Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFv)。
如本发明所用，“流体动力学尺寸”是指分子(例如抗原结合蛋白)的表观尺寸，其是基于分子通过水溶液的扩散。可以对蛋白质通过溶液的扩散或运动进行加工以给出蛋白质的表观尺寸，其中该尺寸以蛋白质颗粒的“斯托克斯半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白质的“流体动力学尺寸”取决于质量和形状(构象)，使得具有相同分子量的两种蛋白质可以基于蛋白质的总体构象和电荷而具有不同的流体动力学尺寸。流体动力学尺寸的增加可导致肾脏清除率的相应降低，导致观察到的半衰期(t1/2)增加。
本发明的抗原结合蛋白(例如，域抗体单体和多聚体)的流体动力学尺寸可以使用本领域熟知的方法来确定。例如，可以使用凝胶过滤色谱来测定抗原结合蛋白的流体动力学尺寸。用于确定抗原结合蛋白的流体动力学尺寸的合适的凝胶过滤基质，如交联琼脂糖基质，是众所周知的并且容易获得。
抗原结合蛋白形式的尺寸(例如，连接于域抗体单体的PEG部分的尺寸) 可根据所期望的应用而变化。例如，当抗原结合蛋白旨在离开循环并进入外周组织时，希望将ICOS结合蛋白的流体动力学尺寸保持在低水平以便于从血流中流出。或者，当希望使抗原结合蛋白在全身循环中保持更长时间时，可以增加抗原结合蛋白的大小，例如通过调制为Ig样蛋白。
药物组合物
本发明所述的抗原结合蛋白可以掺入药物组合物中以用于治疗本发明所述的人类疾病。在一个实施方案中，药物组合物包含抗原结合蛋白，其任选与一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂组合。
这样的组合物包含可接受的药学实践已知且要求的药学上可接受的载体。
药物组合物可以通过注射或连续输注来给药(实例包括但不限于静脉内、腹膜内、皮内、皮下、肌内和门静脉内)。在一个实施方案中，组合物适于静脉内给药。药物组合物可以适于局部给药(其包括但不限于表皮、吸入、鼻内或眼部施用)或肠内施用(其包括但不限于口服或直肠施用)。
药物组合物可以包含0.5mg至10g的ICOS结合蛋白，例如5mg至1g 的抗原结合蛋白。或者，组合物可以包含5mg至500mg，例如5mg至50mg。
制备这种药物组合物的方法是本领域技术人员公知的。如果对给药方式和所用的特定蛋白质合适的话，可以向组合物中加入其它赋形剂。Lowe等人(2011)中描述了不同赋形剂的实例及其用途。
用于施用抗原结合蛋白的有效剂量和治疗方案可以取决于多种因素，诸如患者的年龄、体重和健康状况以及待治疗的疾病。这些因素落入主治医师的职权范围内。可以在例如Bai等人(2012)中找到对选择适当剂量的指南。
药物组合物可以包含试剂盒，其具有多份抗原结合蛋白和其它药物，任选地该试剂盒具有使用说明书。为了方便起见，试剂盒可以包含预定量的试剂和使用说明书。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本发明中可互换使用。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，如灵长类动物，例如绒猴或猴子。在另一个实施方案中，受试者是人。
本发明所述的抗原结合蛋白也可用于治疗方法。治疗可以是治疗性的、预防性的或防止性的。治疗包括缓解、降低或防止疾病的至少一个方面或症状，并且包括防止或治愈本发明所述的疾病。
本发明所述的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分以对治疗性、预防性或防止性治疗来说有效的量使用。本发明所述的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的治疗有效量是有效改善或降低疾病的一种或多种症状或预防或治愈疾病的量。
因此，在一个实施方案中，提供了本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分以用于治疗。在一个实施方案中，提供了本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分以用于治疗癌症、传染性疾病和/或败血症败血症。本发明还提供了本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症、传染性疾病和/或败血症的药物中的用途。
因此，本发明提供了分离的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，或包含所述分离的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的药物组合物，其用于治疗癌症、传染性疾病和/或败血症。
制备方法
抗原结合蛋白可以通过一些常规技术中的任何一种来制备。例如，可以从天然表达它们的细胞中纯化抗原结合蛋白(例如，可以从产生抗体的杂交瘤中纯化该抗体)，或者在重组表达系统中产生。
许多不同的表达系统和纯化方案可用于产生本发明的抗原结合蛋白。通常，将宿主细胞用编码所需抗原结合蛋白的重组表达载体转化。可以使用各种宿主细胞，包括原核生物(包括革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌，杆菌属(Bacilli sp.)，假单细菌属(Pseudomonas sp.)，棒状杆菌属 Corynebacterium sp.))；真核生物，包括酵母(例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，毕赤巴斯德酵母(毕赤酵母))；真菌(例如曲菌属(Aspergilus sp.)))；或高等真核生物，包括昆虫细胞和哺乳动物来源的细胞系(例如，CHO、Perc6、 HEK293、HeLa)。
宿主细胞可为分离的宿主细胞。宿主细胞通常不是多细胞生物(例如植物或动物)的一部分。宿主细胞可为非人宿主细胞。
适用于细菌，真菌，酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体、以及克隆方法是本领域已知的。
可以在促进抗原结合蛋白表达的条件下培养细胞，并且通过常规蛋白质纯化程序回收多肽。考虑用于本发明的抗原结合蛋白包括基本上均质的抗原结合蛋白，其基本上不含污染物质。
技术人员将理解，在产生抗原结合蛋白时，特别是取决于所使用的细胞系和抗原结合蛋白的特定氨基酸序列，会发生翻译后修饰。这可包括某些前导序列的切割、添加各种糖基化模式的各种糖部分、脱酰胺化(例如对天冬酰胺或谷氨酰胺残基)、氧化(例如对甲硫氨酸，色氨酸或游离半胱氨酸残基)、二硫键扰乱、异构化(例如对天冬氨酸残基)、C-末端赖氨酸剪切(例如从一个或两个重链)和N-末端谷氨酰胺环化(例如在重链和/或轻链中)。本发明包括抗体的用途，该抗体经历或已经经历一个或多个翻译后修饰。修饰可以发生在CDR、可变框架区或恒定区中。该修饰可导致分子的电荷变化。修饰通常不会导致抗原结合、功能、生物活性的变化，也不会影响ICOS结合蛋白的药代动力学(PK)或药效学(PD)特征。
如本发明所用的术语“效应子功能”，是指以下中的一种或多种：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性(CDC)介导的应答、Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，和通过 FcRn受体的抗体再循环。
据信抗原结合蛋白的恒定区与各种Fc受体(FcR)(包括FcγRI(CD64)、 FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))之间的相互作用介导抗原结合蛋白的效应子功能。显著的生物效应可以是效应子功能的结果。通常，介导效应子功能的能力需要抗原结合蛋白与抗原的结合，且并不是所有的抗原结合蛋白都将介导每种效应子功能。
效应子功能可以通过多种方式测量，包括例如通过在自然杀伤细胞上结合FcγRIII或通过单核细胞/巨噬细胞上的FcγRI来测量ADCC/ADCP效应子功能。例如，可以在自然杀伤细胞测定中评估本发明的抗原结合蛋白质的ADCC效应子功能。评估ADCC和/或CDC功能的实用方法可以在(Kellner C等人，“Boosting ADCC and CDC activity by Fcengineering and evaluation of antibody effector functions”,Methods,1；65(1):105-13(2014))中找到。
人类恒定区的一些同型，特别是IgG4和IgG2同型的下列功能降低：a) 通过经典途径活化补体；和b)抗体依赖性细胞的细胞毒性。可以根据所需的效应子性质对抗原结合蛋白的重链恒定区进行各种修饰。已经分别描述了含有特异性突变的IgG1恒定区会减少与Fc受体的结合，从而降低ADCC和 CDC(Kellner C等人，“Boosting ADCC and CDC activityby Fc engineering and evaluation of antibody effector functions”,Methods,1；65(1):105-13(2014))。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含恒定区的抗原结合蛋白，使得抗原结合蛋白的ADCC和/或补体活化或效应子功能降低。在一个这样的实施方案中，重链恒定区可以包含IgG2或IgG4同型的天然失能型或突变的 IgG1恒定区。一个实例包括在235和237位(EU索引编号)的丙氨酸残基的替换。
抗体的亚型在某种程度上决定了次级效应子功能，例如补体活化或Fc 受体(FcR)结合和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Huber等人，Nature 229(5284):419-20(1971)；Brunhouse等人，Mol Immunol 16(11):907-17(1979))。在确定用于特定应用的最佳抗体类型时，可以考虑抗体的效应子功能。例如， hIgG1抗体具有较长的半衰期，在固定补体方面非常有效，并且它们与Fcγ RI和FcγRII结合。相比之下，人IgG4抗体的半衰期较短，不固定补体并且对FcR具有较低的亲和力。在IgG4的Fc区用脯氨酸替换丝氨酸228(S228P) 降低了用hIgG4观察到的异质性并延长了血清半衰期(Kabat等人，“Sequences of proteins ofimmunological interest”5.sup.th Edition(1991)；Angal 等人，Mol Immunol 30(1):105-8(1993))。用谷氨酸替换亮氨酸235(L235E)的第二个突变消除了残余FcR结合和补体结合活性(Alegre等人，J Immunol 148(11):3461-8(1992))。所得到的具有两个突变的抗体被称为IgG4PE。hIgG4 氨基酸的编号来源于EU编号参考资料：Edelman,G.M.等人，Proc.Natl.Acad. USA,63,78-85(1969).PMID:5257969。在本发明的一个实施方案中，包含具有S228P和L235E替换的IgG4 Fc区的ICOS抗原结合蛋白可被命名为 IgG4PE。因此，具有重链可变区H2和轻链可变区L5以及IgG4PE Fc区的 ICOS结合蛋白将被称为H2L5 IgG4PE或同义的H2L5 hIgG4PE。
增强的ADCC/CDC
如本领域所理解的，已知各种技术将增加抗体的ADCC和/或CDC活性。这些包括但不限于Fc区中的各种突变、Complegent和Potelligent技术。在本发明的一个方面，可将一种或多种ADCC/CDC增强技术应用于本发明的ICOS结合蛋白。
突变
也描述了含有特定突变或残基Asn297上改变的糖基化的人IgG1恒定区增强了与Fc受体的结合。在一些情况下，也显示出这些突变会增强ADCC 和CDC，参见例如Kellner(2013)。
在本发明的一个实施方案中，这些突变位于选自239、332和330(IgG1) 中的一个或多个位置，或其他IgG同型中的等同位置。合适的突变的实例是 S239D和I332E和A330L。在一个实施方案中，本发明所述的本发明的抗原结合蛋白在239位和332位发生突变，例如S239D和I332E，或在另一个实施方案中，其在选自239位和位332位和330位中的三个或更多个位置发生突变，例如S239D和I332E和A330L(EU索引编号)。
补体
在本发明的一个实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，例如包含具有来自IgG3的至少一个CH2结构域的嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如其中其具有增强的ADCC或增强的CDC，或增强的ADCC和CDC功能。在一个这样的实施方案中，抗原结合蛋白可以包含来自IgG3的一个CH2结构域，或者两个CH2结构域均可以来自IgG3。
还提供了根据本发明的产生抗原结合蛋白的方法，包括以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，该表达载体包含如本发明所述的分离的核酸，其中所述表达载体包含编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的Fc结构域的核酸序列；和
b)回收该抗原结合蛋白。
用于生产抗原结合蛋白的这种方法可以例如使用来自BioWa,Inc. (Princeton,NJ)和Kyowa Hakko Kogyo(现在的Kyowa Hakko Kirin Co.， Ltd.)Co.,Ltd.的COMPLEGENTTM技术系统进行，其中使包含表达载体的重组宿主细胞进行表达，其中该表达载体中有编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基两者的嵌合Fc结构域的核酸序列，从而产生相对于在其它方面相同但缺少该嵌合Fc结构域的抗原结合蛋白具有增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的抗原结合蛋白。在WO2007011041和US20070148165中描述了COMPLEGENTTM技术系统的各个方面，其各自并入本发明作为参考。在替代实施方案中，通过将序列特异性突变引入IgG链的Fc区可以增加 CDC活性。本领域普通技术人员还会知晓其他合适的系统。
Potelligent
本发明还提供了一种制备根据本发明的抗原结合蛋白的方法，包括以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，其中该表达载体包含如本发明所述的分离的核酸，其中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已在重组宿主细胞中被灭活；和
b)回收该抗原结合蛋白。
用于生产抗原结合蛋白的这种方法可以例如使用来自BioWa,Inc. (Princeton,NJ)的POTELLIGENTTM技术系统进行，其中，相对于在具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同的单克隆抗体，缺乏FUT8基因的功能拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)活性的单克隆抗体。在US7214775、US6946292、WO0061739和 WO0231240中描述了POTELLIGENTTM技术系统的各个方面，所有这些都并入本发明作为参考。本领域普通技术人员还将知晓其他合适的系统。
对于本领域技术人员显而易见的是，这样的修饰可以不仅可以单独使用，而且可以彼此组合使用，以进一步增强效应子功能。
在本发明的一个这样的实施方案中，提供了包含重链恒定区的抗原结合蛋白，其包含突变和嵌合的重链恒定区，例如其中包含至少一个来自IgG3的 CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域的抗原结合蛋白，其中所述IgG1 CH2结构域在选自239位和332位和330位具有一个或多个突变(例如，所述突变可以选自S239D和I332E和A330L)，使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如，其中其具有一个或多个以下功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。在一个实施方案中， IgG1 CH2结构域具有S239D和I332E突变。
在本发明的替代实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区并且具有改变的糖基化谱的抗原结合蛋白。在一个这样的实施方案中，重链恒定区包含来自IgG3的至少一个CH2结构域和来自IgG1的一个CH2结构域，并且具有改变的糖基化谱，使得岩藻糖与甘露糖的比例为0.8:3以下，例如其中抗原结合蛋白去岩藻糖基化，使得相比于具有缺乏所述突变和改变的糖基化谱的免疫球蛋白重链恒定区的等同抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如其中其具有一个或多个以下功能：增强的ADCC或增强的 CDC，例如其具有增强的ADCC和增强的CDC。
在替代实施方案中，抗原结合蛋白具有至少一个IgG3 CH2结构域和至少一个来自IgG1的重链恒定域，其中两个IgG CH2结构域根据本发明所述的限制条件而突变。
在本发明的一个方面，提供了一种制备本发明所述的抗原结合蛋白的方法，包括以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体含有本发明所述的分离的核酸，所述表达载体还包含编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基的嵌合Fc结构域的Fc核酸序列，并且其中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已在重组宿主细胞中被灭活；
b)回收该抗原结合蛋白。
用于生产抗原结合蛋白的这种方法可以例如使用来自BioWa,Inc. (Princeton,NJ)的ACCRETAMABTM技术系统进行，其结合了 POTELLIGENTTM和COMPLEGENTTM技术系统，从而相对于其它方面相同但缺少嵌合Fc结构域且在寡糖尚有岩藻糖的单克隆抗体，产生具有增强的 ADCC和CDC活性的抗原结合蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含突变和嵌合的重链恒定区的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有改变的糖基化谱，使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如其中具有一个或多个以下功能：增强的 ADCC或增强的CDC。在一个实施方案中，突变选自239位和332位和330 位，例如突变选自S239D和I332E和A330L。在另一个实施方案中，重链恒定区包含来自IgG3的至少一个CH2结构域和来自IgG1的一个Ch2结构域。在一个实施方案中，重链恒定区具有改变的糖基化谱，使得岩藻糖与甘露糖的比例为0.8:3以下，例如抗原结合蛋白被去岩藻糖基化，使得相对于等价的非嵌合抗原结合蛋白或缺少所述突变和改变的糖基化谱的免疫球蛋白重链恒定区，所述抗原结合蛋白具有增强的效应子功能。
据报道，IgG抗体的长半衰期取决于其与FcRn的结合。因此，Kuo和 Aveson(2011)已经广泛研究了在pH 6.0下增加IgG对FcRn的结合亲和力的替代，同时通过改造恒定区来保持相互作用的pH依赖性。
修饰本发明抗原结合蛋白的另一种方法包括通过修饰免疫球蛋白恒定域或FcRn(新生儿Fc受体)结合域来增加这些蛋白质的体内半衰期。
在成年哺乳动物中，FcRn，也被称为新生儿Fc受体，通过作为保护性受体结合IgG同型抗体并挽救IgG同型抗体免于降解，从而在维持血清抗体水平中起关键作用。IgG分子被内皮细胞内吞，如果它们与FcRn结合，则会再循环到循环中。相比之下，不结合FcRn的IgG分子进入细胞并被靶向至溶酶体途径，在那里它们被降解。
据信，新生儿FcRn受体参与抗体清除和组织间的胞转作用，Kuo和 Aveson(2011)。确定与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、 Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。在本节中描述的这些位置中任一者的切换可以增加本发明的抗原结合蛋白的血清半衰期和/或改变的效应子特性。
通过增加对FcRn的亲和力来增加半衰期的突变
本发明的抗原结合蛋白可以具有一个或多个增加恒定域或其片段对 FcRn的亲和力的氨基酸修饰。这些可能导致这些蛋白质的半衰期延长(Kuo 和Aveson(2011))。增加治疗用IgG和诊断用IgG与其他生物活性分子的半衰期有许多好处，包括减少这些分子的给药量和/或给药频率。因此，在一个实施方案中，提供了本文提供的本发明的抗原结合或融合蛋白，其包含具有一个或多个这些氨基酸修饰的IgG恒定域的全部或一部分(FcRn结合部分)，以及与这种修饰的IgG恒定域结合的非IgG蛋白质或非蛋白质分子，其中修饰的IgG恒定域的存在增加了抗原结合蛋白的体内半衰期。
已知许多可以导致半衰期增加的方法(Kuo和Aveson，(2011))，包括氨基酸修饰，其可以通过包括丙氨酸扫描诱变、随机诱变和筛选的技术产生，以评估与FcRn的结合和/或体内行为。在电脑策略之后进行诱变也可用于选出一个氨基酸突变以进行突变。
因此，本发明提供了具有优化的与FcRn结合的抗原结合蛋白的变体。在优选的实施方案中，抗原结合蛋白的所述变体包含在所述抗原结合蛋白的 Fc区中的至少一个氨基酸修饰，其中相对于所述亲本多肽，所述修饰选自以下：Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、 250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、 311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、 343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、 371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、 416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446和447，其中Fc区中的氨基酸编号为Kabat的EU索引编号。
在本发明的又一方面，该修饰为M252Y/S254T/T256E。
此外，各出版物描述了用于获得半衰期被修饰的生理活性分子的方法，参见例如K缔合termann(2009)，其通过将FcRn结合多肽引入分子中，或者通过将分子与其中FcRn结合亲和力被保留但与其他Fc受体的亲和力被显著降低的抗体融合，或者通过与抗体的FcRn结合域融合。
增加半衰期的pH切换技术
尽管在恒定区中的替换能够显著改善治疗性IgG抗体的功能，但在严格保守的恒定区中的替换在人体中具有免疫原性的风险，并且在高度变异的可变区序列中的替换会具有较低的免疫原性。涉及可变区的报告包括改造CDR 残基以提高对抗原的结合亲和力，和改造CDR和框架残基以提高稳定性并降低免疫原性风险。众所周知，可以通过亲和力成熟，使用随机化库的噬菌体或核糖体展示来提高对抗原的亲和力。
从基于序列和结构的合理设计可以合理地获得改进的稳定性。免疫原性风险的降低(去免疫化)可以通过各种人源化方法以及移除T细胞表位来实现，这可以使用计算机技术(in silico technology)预测或通过体外测定来确定。此外，可变区已被改造成具有降低的pI。与野生型抗体相比，尽管与FcRn的结合相当，但是对于这些抗体观察到较长的半衰期。如果抗原介导的清除机制通常在与抗原结合时降解抗体，则可以缩短对具有pH依赖性抗原结合的抗体的改造或选择，以改变抗体和/或抗原半衰期(例如IgG2抗体半衰期)。类似地，抗原:抗体复合物可影响抗原的半衰期，不论是通过保护抗原免受典型的降解过程来延长半衰期，或是通过抗体介导的降解来缩短半衰期。一个实施方案涉及与内涵体pH(即pH5.5-6.0)相比，在pH 7.4下对抗原具有更高亲和力的抗体，使得在pH5.5/pH7.4下或在pH6.0/pH7.4下的KD比为2或更高。例如，为了增强抗体的药代动力学(PK)和药效学(PD)性质，可以通过将组氨酸引入CDR残基来改造对抗体的pH敏感性结合。
此外，还提供了产生具有降低的生物半衰期的抗原结合蛋白的方法。变体IgG(其中His435突变为丙氨酸)导致FcRn结合的选择性丧失和血清半衰期的显著降低(参见例如US6,165,745，其中公开了通过以下方法生产具有降低的生物半衰期的抗原结合蛋白的方法：在编码抗原结合蛋白的DNA片段中引入突变)。突变包括Fc铰链域的253位、310位、311位、433位或434 位的氨基酸替换。
接头
蛋白质骨架可以与天然存在的序列(例如Ig序列)相同，或者为天然存在的序列的片段，并且可以包含附加序列，其可为天然存在的、来自不同来源或为合成的，并且可以在骨架的N或C末端添加。当这些附加序列连接表位结合域和蛋白质骨架(例如本文定义的那些)时，可将其认为是接头。
在另一方面，抗原结合构建体由抗体的Fc区或其一部分组成，或主要由抗体的Fc区或其一部分组成，其在每一端直接或间接(例如通过接头序列) 连接至表位结合域。这样的抗原结合构建体可以包含由Fc区或其一部分分开的2个表位结合域。分开意味着表位结合域彼此不直接相连，并且在一方面，表位结合域位于Fc区或任何其他骨架区的相反端(C和N末端)。
在一方面，抗原结合构建体包含2个骨架区，每个骨架区直接或通过接头间接地结合到2个表位结合域，例如在每个骨架区的N和C末端结合。
本发明的蛋白质骨架可以通过使用接头被连接到表位结合域。合适的接头的实例包括长度为1个氨基酸至150个氨基酸、或1个氨基酸至140个氨基酸的氨基酸序列，例如1个氨基酸至130个氨基酸、或1至120个氨基酸、或1至80个氨基酸、或1至50个氨基酸、或1至20个氨基酸、或1 至10个氨基酸、或5至18个氨基酸。这样的序列可以具有其自己的三级结构，例如，本发明的接头可以包括单一可变域。在一个实施例中，接头的尺寸等同于单一可变域。合适的接头可以具有1至100埃的尺寸，例如可以是 20至80埃的尺寸，或者例如可以是20至60埃，或例如小于40埃、小于 20埃、小于5埃的长度。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含以下一个或多个的ICOS结合蛋白：SEQIDNO:1中所示的CDRH1；SEQ IDNO:2中所示的CDRH2；SEQ IDNO:3中所示的CDRH3；SEQ IDNO:4中所示的CDRL1；SEQ IDNO:5中所示的CDRL2；和/或SEQ IDNO:6中所示的CDRL3，或各CDR的直接等价物，其中直接等价物在所述CDR中具有不超过两个的氨基酸替换。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异性结合至人ICOS的ICOS结合蛋白，其包含含有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH结构域和/或含有与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL结构域。在一方面，本发明的ICOS 结合蛋白也结合至食蟹猴ICOS。在一方面，它们不与鼠类ICOS结合。
在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白为ICOS激动剂。在一方面，该ICOS结合蛋白在T细胞的存在下增加IFN-γ的生产。在另一方面，本发明的ICOS结合蛋白刺激T细胞增殖。
在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白结合至人ICOS，其中：
缔合速率常数(k缔合)为至少1X105M-1s-1；且解离速率常数(k解离)小于 6X10-5s-1；或
解离常数(Kd)小于100nM
其中通过Biacore测量高亲和力。
在一个实施方案中，该ICOS结合蛋白包含CDRH3(SEQ ID NO:3)或 SEQ ID NO.3的变体。在另一实施方案中，该ICOS结合蛋白包含以下的一个或多个：CDRH1(SEQID NO:1)；CDRH2(SEQID NO:2)；CDRH3(SEQ ID NO:3)；CDRL1(SEQID NO:4)；CDRL2(SEQID NO:5)；和/或CDRL3(SEQID NO:6)。在一个实施方案中，该ICOS结合蛋白包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所示的重链CDR和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6中所示的轻链CDR。
在一个实施方案中，ICOS结合蛋白包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有90％序列同一性的VH结构域；和与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有90％序列同一性的VL结构域。在一方面，ICOS结合蛋白包含具有SEQ ID NO.7中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。在一方面，ICOS结合蛋白包含由SEQ ID NO:7组成的重链可变域。在一方面，ICOS结合蛋白包含由SEQ ID NO:8组成的轻链可变域。
在一个实施方案中，本发明提供了ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其包含含有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH结构域；和含有与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分特异性结合至人ICOS。在一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含含有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH结构域；和含有与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中特异性结合至人 ICOS的所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分还包含具有SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链CDR。在一方面，ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域；和含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。在一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合部分为人ICOS的激动剂。在一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合部分还包含IgG4 同型骨架或其变体。在一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含hIgG4PE骨架。
在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体，其包含与SEQID NO:23中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92,％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链氨基酸序列。
Figure GDA0003245324200000311
在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体，其包含与SEQID NO:24中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92,％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链氨基酸序列。
Figure GDA0003245324200000312
在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体，其包含SEQ IDNO:23中所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:24中所示的轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白还包含hIgGPE 骨架。
在一个实施方案中，提供了ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中所述ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体。本发明海提供了包含药学可接受的载体以及要求保护的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的药物组合物。
本发明提供了在有需要的人中治疗疾病的方法，所述疾病选自癌症、传染性疾病和/或败血症，该方法包括向所述人施用本发明的药物组合物的步骤。在一方面，该方法还包括向所述人施用至少一种抗肿瘤剂、至少一种第二免疫调节剂和/或至少一种免疫刺激性佐剂。在一方面，第二免疫调节剂选自：抗-CTLA4抗体和抗-PD-1抗体、抗-PDL1抗体和抗OX40抗体。在一方面，抗-CTLA4抗体是依匹木单抗。在一方面，抗-PD-1抗体选自派姆单抗和/或纳武单抗。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗人类癌症的方法，包括向人施用治疗上可接受量的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。在一些方面，癌症选自结肠直肠癌(CRC)、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、黑素瘤、肾细胞癌(RCC)、EC鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤和前列腺癌。
在一个实施方案中，提供了用于在人类中治疗传染性疾病的方法，包括向人施用治疗上可接受量的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。在一方面，所述传染性疾病为HIV。
在一个实施方案中，提供了用于在人类中治疗败血症的方法，包括向人施用治疗上可接受量的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，提供了用于在人类中刺激T细胞增殖、诱导T细胞活化和/或诱导细胞因子产生的方法，包括向所述人施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了编码本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了包含编码本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的多核苷酸的宿主细胞。本发明还提供了制造ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：a)在适合表达ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的条件下，培养包含编码本发明的所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分的多核苷酸的宿主细胞；和b)分离所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。
本发明还提供了分离的人源化单克隆抗体，其包含：含有SEQ ID NO:7 中所示的氨基酸序列的VH结构域；含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域；和hIgG4骨架或其变体。在一方面，hIgG4骨架为hIgG4PE。
在一个实施方案中，提供了ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中 ICOS结合蛋白或其抗原结合部分与参考抗体或其抗原结合部分交叉竞争结合人ICOS，该参考抗体或其抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域；和含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。
在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白在与T细胞接触时刺激T 细胞增殖。在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白在与T细胞接触时诱导T细胞活化。T细胞活化可以通过某些活化标志物的表达百分比水平的增加来测量，所述标志物例如但不限于CD69、CD25和/或OX40。在一个实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白在与T细胞接触时刺激细胞因子产生。 ICOS结合蛋白与
Figure GDA0003245324200000331
结合，但不与人
Figure GDA0003245324200000332
或人
Figure GDA0003245324200000333
结合。此外，ICOS结合蛋白在与表达ICOS的T细胞接触时，不会耗尽表达ICOS的 T细胞。在一些方面，ICOS结合蛋白在第二细胞的存在下与所述T细胞接触时，交叉连接第二细胞和T细胞。该交叉连接可通过ICOS结合蛋白与第二细胞上的FcγR相连而发生。表达FcγR的细胞包括但不限于：单核细胞、 B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。因此，在一个实施方案中，可向哺乳动物施用该ICOS结合蛋白，其中ICOS结合蛋白将作为T细胞上的ICOS 的激动剂，并且还将与第二细胞上的FcγR相连。
在一个实施方案中，ICOS结合蛋白包含骨架，其选自人IgG1同型或其变体和IgG4同型或其变体。适当地，该骨架包含IgG4同型骨架或其变体。在一方面，该骨架包含hIgG4PE骨架。
在一个实施方案中，ICOS结合蛋白为单克隆抗体。适当地，ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体。在一方面，本发明的单克隆抗体可为完全人单克隆抗体。
在另一方面，ICOS结合蛋白为片段，其为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、微抗体、分离的VH或分离的VL。在一个实施方案中，ICOS结合蛋白为其抗原结合部分。
在一些方面，ICOS结合蛋白以超过0.6nM的亲和力结合至人ICOS。在一方面，亲和力为100nM或更强。在一个实施方案中，ICOS结合蛋白对ICOS具有100nM的KD。适当地，ICOS结合蛋白对ICOS的KD为100nM 以下、50nM以下、25nM以下、10nM以下、2nM以下或1nM以下。
在一个实施方案中，本发明提供了人源化单克隆抗体，其为人ICOS的激动剂。在一个实施方案中，本发明提供了人源化单克隆抗体，其包含具有 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的重链可变区CDR和具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR。在一方面，人源化单克隆抗体在与T细胞接触时，能够刺激细胞因子产生和/或T细胞增殖，而不会诱导补体、ADCC或 CDC。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体具有变体人IgG1 Fc区。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体具有人IgG4 Fc区或其变体。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体具有hIgG4PE Fc区。在一方面，人源化单克隆抗体包含：含有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH结构域；和含有与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL结构域。在一方面，人源化单克隆抗体包含：含有SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域；和含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。在一方面，人源化单克隆抗体包含hIgG4PE骨架。此外，本发明的人源化单克隆抗体在与CD4+或CD8+T 细胞接触时显示刺激T细胞增殖。显示本发明的人源化单克隆抗体诱导T细胞活化且刺激细胞因子产生。
在一个实施方案中，人源化单克隆抗体包含hIgG4PE骨架，且包含含有 SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。本发明的抗体可在与T细胞接触时刺激细胞因子产生。
在一个实施方案中，提供了ICOS结合蛋白，其与本发明的任一种ICOS 结合蛋白竞争结合ICOS。如本领域所知并且如本文所述，可以通过在一种或多种ICOS结合蛋白的存在下比较对配体与ICOS结合的竞争来测量结合竞争。如本领域所理解的，ICOS在CD4+和CD8+T细胞以及Treg细胞上表达。本发明的ICOS结合蛋白作为在T细胞上ICOS的激动剂。它们还阻断了T细胞和Treg细胞上表达的ICOS-L和ICOS之间的相互作用。因此，在一个实施方案中，提供了阻断Treg细胞上ICOS-L与ICOS的相互作用的方法。可以在各种类型的肿瘤中发现表达ICOS的Treg细胞，包括液体肿瘤如淋巴瘤。因此，在本发明的一方面，提供了治疗癌症的方法，包括施用本发明的ICOS结合蛋白，其中ICOS结合蛋白阻断Treg细胞上ICOS-L与 ICOS的相互作用。
本发明还包含本发明所述的ICOS结合蛋白或单克隆抗体的药物组合物。在一方面，本发明的药物组合物还包含至少一种抗肿瘤剂。在一方面，本发明的药物组合物还包含至少一种第二免疫调节剂。在一方面，本发明的药物组合物还包含至少一种免疫刺激佐剂。
在一个实施方案中，提供了在有此需要的人中治疗癌症和/或传染性疾病的方法，其中所述方法包括向所述人施用本发明的药物组合物的步骤。在一个实施方案中，所述人患有癌症。在一个实施方案中，所述人患有传染性疾病。在一个实施方案中，所述人患有HIV。在一方面，该方法还包括向所述人施用至少一种抗肿瘤剂。在另一方面，该方法还包括向所述人施用至少一种第二免疫调节剂。在又一方面，该方法还包括向所述人施用免疫刺激佐剂。
在一方面，所述人具有固体肿瘤。在一方面，该肿瘤选自头颈癌、胃癌、黑素瘤、肾细胞癌(RCC)、食管癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和胰腺癌。在一方面，所述人患有以下一种或多种癌症：结肠直肠癌 (CRC)、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、黑素瘤、肾细胞癌(RCC)、EC鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤和前列腺癌。在另一方面，所述人患有液体肿瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、急性髓细胞性白血病和慢性骨髓性白血病。
本发明还涉及用于治疗癌症或减轻癌症严重性的方法，所述癌症选自：脑癌(神经胶质瘤)、神经胶质母细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、莱-杜病(Lhermitte-Duclos disease)、乳腺癌、炎性乳腺癌、威尔姆氏肿瘤、尤因氏肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨细胞瘤、甲状腺癌、成淋巴细胞性T细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤巨核母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核母细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、红细胞白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞型T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、泌尿道上皮癌、肺癌、外阴癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食管癌、唾腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、口部癌症、GIST(胃肠间质瘤)和睾丸癌。
本发明所用术语“治疗”及其语法变化形式是指治疗性治疗。在提到特定病症时，治疗意味着，通过将病症的一种或多种生物学表现消除或降低到不可检测的水平，该效果持续一段时间(认为期间该表现呈缓解状态，且无额外治疗)，从而：(1)改善或预防病症或该病症的一种或多种生物学表现；(2) 干扰(a)引发或造成该病症的生物级联中的一个或多个点或(b)病症的一种或多种生物学表现；(3)缓解与病症或其治疗相关的一种或多种症状、效应或副作用；(4)延缓病症的发展或该病症的一种或多种生物学表现；和/或(5)治愈所述病症或该病症的一种或多种生物学表现。本领域技术人员将能理解，针对特定疾病或病症被认为是缓解的持续时间。从而也能推想预防性治疗。技术人员将会意识到，“预防”不是绝对的术语。在医学中，“预防”被理解为是指药物的预防性给药，以显著降低病症或其生物学表现的可能性或严重性，或延迟该病症或其生物学表现的发生。例如当认为受试者是处于发展为癌症的高风险时，预防性治疗是适当的(例如当受试者具有极强的癌症家族病史或当受试者暴露于致癌物质时)。
如本发明所用，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可以单数或复数形式互换使用，是指经历恶性转化使其变为对宿主生物体具有病理性的细胞。可以通过成熟的技术，特别是组织学检查，容易地将原发性癌细胞与非癌细胞区分开来。如本发明所用的癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括衍生自前驱癌细胞的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测”的肿瘤是基于肿瘤块可检测到的肿瘤；例如，通过诸如计算机断层摄影 (CT)扫描、磁共振成像(MRI)、X射线、超声或物理检查触诊的程序，和/或由于可检测到从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达。肿瘤可能是造血性(或血液学或血液或血液相关的)癌症，例如衍生自血细胞或免疫细胞的癌症，其可被称为“液体肿瘤”。基于血液肿瘤的临床病症的具体实例包括：白血病，如慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病；浆细胞恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、 MGUS和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；等等。
癌症可以是其中存在异常数量的母细胞或不期望的细胞增殖或被诊断为血癌(包括淋巴性和骨髓性恶性肿瘤)的任何癌症。骨髓性恶性肿瘤包括但不限于：急性骨髓性(或髓细胞性或骨髓性或成髓细胞性)白血病(未分化或分化的)、急性早幼粒细胞(或早幼粒细胞性或前髓细胞性或前髓母细胞性)白血病、急性骨髓单核细胞性(或骨髓单核母细胞性)白血病、急性单核细胞性(或单核母细胞性)白血病、红细胞白血病和巨核细胞性(或巨核母细胞性)白血病。这些白血病可以一起称为急性骨髓性(或髓细胞性或骨髓性的)白血病(AML)。骨髓恶性肿瘤还包括骨髓增生性疾病(MPD)，其包括但不限于：慢性骨髓性 (或髓细胞性)白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、原发性血小板增多症(或血小板增多症)和真性红细胞增多症(PCV)。骨髓恶性肿瘤还包括：骨髓发育不良(或骨髓增生异常综合征或MDS)，其可被称为难治性贫血 (RA)、具有过量母细胞的难治性贫血(RAEB)以及具有过量转化中的母细胞的难治性贫血(RAEBT)；以及伴有或不伴有原因不明性髓样上皮化生的骨髓纤维化(MFS)。
造血型癌症还包括淋巴恶性病，其会影响淋巴结、脾脏、骨髓、外周血和/或结外位点。淋巴癌包括B细胞恶性病，包括但不限于B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)。B-NHL可以是无痛的(或低度)、中度(或侵袭性)或高度(高侵袭性)。无痛B细胞淋巴瘤包括：滤泡性淋巴瘤(FL)；小淋巴细胞性淋巴瘤 (SLL)；边缘区淋巴瘤(MZL)，包括结节MZL、结外MZL、脾MZL和具有绒毛状淋巴细胞的脾MZL；淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)；以及粘膜相关淋巴样组织(MALT或结外边缘区)淋巴瘤。中度B-NHL包括：涉及或不涉及白血病的套细胞性淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性大细胞 (或3级或3B级)淋巴瘤和原发性纵隔淋巴瘤(PML)。高度B-NHL包括伯基特淋巴瘤(BL)、伯基特样淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤(SNCCL)和成淋巴细胞性淋巴瘤。其它B-NHL包括免疫母细胞性淋巴瘤(或免疫细胞瘤)、原发性渗出性淋巴瘤、HIV相关(或AIDS相关)的淋巴瘤和移植后淋巴增生性病症 (PTLD)或淋巴瘤。B细胞恶性病还包括但不限于：慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)、幼淋巴细胞性白血病(PLL)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)、毛细胞白血病(HCL)、大颗粒淋巴细胞性(LGL)白血病、急性淋巴性(或淋巴细胞性或成淋巴母细胞性)白血病和卡斯尔曼氏病。NHL还可包括：T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)，其包括但不限于未列名(NOS)的T细胞非霍奇金淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、血管免疫母细胞性淋巴样病(AILD)、鼻腔型自然杀伤(NK)细胞/T细胞淋巴瘤、γ/δ淋巴瘤、皮肤型T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿和塞扎里综合征(Sezary syndrome)。
造血性癌症还包括霍奇金淋巴瘤(或疾病)，其包括典型霍奇金淋巴瘤, 结节硬化型霍奇金淋巴瘤,混合细胞型霍奇金淋巴瘤,淋巴细胞主型(LP)霍奇金淋巴瘤,结节LP霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞缺乏型霍奇金淋巴瘤。造血性癌症还包括浆细胞疾病或癌症，如多发性骨髓瘤(MM)，其包括和郁积型 MM,意义未确定(或未知或未明)的单克隆丙种球蛋白病(MGUS),浆细胞瘤 (骨,髓外),淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL),瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症,浆细胞白血病和原发性淀粉样变性病(AL)。造血性癌症还可包括其它造血细胞的其它癌症，包括多形核白细胞(或中性粒细胞),嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞,树突状细胞,血小板,红细胞和自然杀伤细胞。包括造血细胞的组织在本发明中被称为“造血细胞组织”，其包括骨髓；外周血；胸腺；和外周淋巴组织，诸如脾脏、淋巴结、与粘膜相关的淋巴组织(例如与肠相关淋巴组织)、扁桃体，派伊尔淋巴集结和阑尾，以及与其他粘膜相关的淋巴组织，例如支气管内衬。
本发明的ICOS结合蛋白、抗体和抗原结合片段也可用于治愈、预防或治疗感染和传染性疾病。ICOS结合蛋白可以单独使用或与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。本发明的ICOS结合蛋白可用于刺激对人有传染性的病毒的免疫应答，该病毒例如但不限于人类免疫缺陷病毒、甲肝病毒、乙肝病毒和丙肝病毒、Eppstein Barr病毒、人巨细胞病毒、人乳头状瘤病毒、疱疹病毒。本发明的ICOS结合蛋白可用于刺激对细菌或真菌寄生虫及其他病原体感染的免疫应答。适当地，本发明提供了治疗已经暴露于特定毒素或病原体的人的方法。因此，本发明的另一方面提供了治疗受试者中传染性疾病的方法，包括向受试者施用ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。
可使用本发明的ICOS结合蛋白的传染性疾病的实例包括但不限于HIV，肝炎(甲肝、乙肝&丙肝)、流感、疱疹、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。引起可用本发明的方法治疗的感染的致病病毒的一些实例包括HIV、肝炎病毒(甲肝、乙肝&丙肝)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV)、 Epstein Barr病毒、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
引起可由本发明方法治疗的感染的致病细菌的一些实例包括衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和柯诺球菌(conococci)、克雷伯氏杆菌、变形菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、杆菌、霍乱弧菌、破伤风菌、肉毒杆菌、炭疽、瘟疫、钩端螺旋体病和莱姆病菌。
引起可由本发明方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌属(白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、平滑念珠菌、热带念珠菌等)、新型隐球菌、曲霉(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉目(毛霉属、犁头霉属、根霉属))、申克孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夹膜组织胞浆菌。
引起可由本发明方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴、结肠小袋绦虫、福勒氏耐格里原虫、棘阿米巴属、贾第鞭毛虫、隐孢子虫属、卡氏肺囊虫、间日疟原虫、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、鼠弓形体和巴西钩虫。
败血症是一种潜在致命的医学病症，其特征在于全身炎性状态(称为全身性炎症反应综合征或SIRS)以及存在已知或疑似的感染。身体可通过免疫系统对血液、尿液、肺、皮肤或其他组织中的微生物发展出炎性反应。简而言之，败血症是一种血液中毒，以下更贴切的是败血病。严重的败血症是全身炎性反应，加上感染以及存在器官功能障碍。
败血病是一种医学相关术语，指血液中存在致病微生物，从而导致败血症。该术语未被明确定义。
败血症和癌症共享类似的免疫抑制机制，包括T调节性细胞增加、骨髓衍生的抑制细胞增加、负向共刺激分子的表达增加、单核细胞/巨噬细胞HLA- DR表达降低。败血症和癌症是慢性炎症的原型病症。慢性炎症刺激了有效和持续的免疫调节反应，包括T调节性细胞的扩张和PD-1以及其他负向调节剂对效应子细胞的上调。Barouch D.H.和Deeks S.G.；Immunologic strategies for HIV-1 remission and eradication.Science 345:169-174 2014。因此，在本发明的一方面，提供了用于在有此需要的人中治疗败血症的方法，包括向所述人施用治疗有效量的本发明的ICOS抗原结合蛋白。Boomer等人，JAMA 306:2594-2605(2011)；Meisel,等人，Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor toreverse sepsis-associated immunosuppression:a double-blind, randomized,placebo-controlled multicenter trial.Am J Respir Crit Care Med 180:640-648(2009)；以及Hall等人，Immunoparalysis and nosocomial infection in children withmultiple organ dysfunction syndrome.Intensive Care Med 37:525- 532(2011)。
本发明的ICOS结合蛋白可以与其他重组蛋白和/或肽(例如肿瘤抗原或癌细胞)结合使用，以增加对这些蛋白质的免疫应答(即，在疫苗接种方案中)。
例如，其ICOS结合蛋白可用于通过将至少一种ICOS结合蛋白与感兴趣的抗原(例如疫苗)共同给药来刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一方面，本发明提供在受试者中增强对抗原的免疫应答的方法，包括对受试者施用：(i)抗原；和(ii)本发明的ICOS结合蛋白，使得在受试者中对抗原的免疫应答增强。抗原可以是，例如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这些抗原的非限制性实例包括但不限于肿瘤抗原或来自病毒、细菌或其它病原体的抗原。
根除HIV的主要障碍是，潜在感染细胞持续不表达病毒抗原，并逃避免疫监视。目前消除潜伏病毒储库的策略被称为“踢和杀(kick and kill)”策略，其旨在随着细胞活化，重新活化HIV基因表达(“踢”)从而导致HIV再活化，并清除被重新活化的细胞(“杀”)。细胞活化受T细胞表面上表达的正向和负向调节因子的平衡的控制。通过活化正向调节因子和拮抗负向调节因子来改变这种平衡，这可以促进HIV重新活化。
可诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)是一种正向调节因子，在刺激后，其在CD4 T细胞上的表达增加。ICOS功能促进了T细胞的增殖、细胞因子的产生和分化。表达高水平PD-1和ICOS的一种重要T细胞子集是T滤泡性辅助细胞(Tfh)。Tfh细胞帮助B细胞进行分化、分类转换、体细胞高度突变，并且是胚中心形成所必需的。HIV/SIV感染后，Tfh细胞显著扩张，并且在慢性慢病毒感染期间，Tfh细胞的失调助长B细胞免疫受损。已经显示经分选的Tfh细胞含有比其他淋巴样CD4亚型更高水平的HIV DNA，并且在刺激后观察到病毒向外生长。Tfh细胞驻留在胚中心，并暴露于在滤泡树突状细胞上捕获的HIV病毒体，这可促进其感染。此外，CD8 T细胞对胚中心的接近有限，滤泡性CD8细胞通常表现出降低的细胞毒性，从而使得Tfh细胞免受抗病毒监测。因此，Tfh细胞是重要的受保护的HIV储存库，并且靶向PD-1和ICOS的策略可以选择性地靶向Tfh细胞并且可用于HIV治疗方案的一部分。适当地，提供了用于治疗感染HIV的人的方法，包括施用本发明的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。
如本发明所用，“肿瘤抗原”是由肿瘤细胞产生的引起免疫应答，特别是 T细胞介导的免疫应答的蛋白质。如本发明所用，术语“肿瘤抗原”包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。肿瘤特异性抗原是肿瘤细胞所特有的，不会在体内的其他细胞上产生。肿瘤相关抗原不是肿瘤细胞特有的，并且在无法诱导出对抗原的免疫耐受状态的条件下反而会在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以发生在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下。肿瘤相关抗原可以是胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统不成熟并且无法产生应答，或者它们可以是通常在正常细胞上以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
肿瘤抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原如MART- 1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE家族抗原，其包括但不限于MAGE1、MAGE3、 MAGE10、MAGE11、MAGE12、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、 MAGEA8、MAGEA9、MAGEB18、MAGEB6、MABEC1、MAGED2、MAGEE1、 MAGEH1、MAGEL2、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；MEL4、黑素瘤相关抗原100+、黑素瘤gp100、NRIP3、NYS48、OCIAD1、OFA-iLRP、OIP5、卵巢癌相关抗原(OV632)、PAGE4、PARP9、PATE、plastin L、PRAME、前列腺特异性抗原、蛋白酶3、prostein、Reg3a、RHAMM、ROPN1、SART2、 SDCCAG8、SEL1L、SEPT1、SLC45A2、SPANX、SSX5、STXGALNAC1、 STEAP4、生存素、TBC1D2、TEM1、TRP1、上皮来源的肿瘤抗原、XAGE1、 XAGE2、WT-1；过表达的胚抗原，如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制因子基因，如p53、Ras、HER-2/neu；染色体易位所产生的独特的肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，如EpsteinBarr病毒抗原EBVA和人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和 E7。
其它肿瘤抗原包括但不限于：TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、 RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG- 72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum- 1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、 CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7- Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原 (PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
典型地，在本发明中，对所治疗的易感肿瘤具有活性的任何抗肿瘤剂都可以在癌症治疗中被共同施用。该药物的实例可以在V.T.Devita和S. Hellman(编辑)的“癌症原理与实践肿瘤学”，第6版(2001年2月15日)， Lippincott Williams&Wilkins出版社中找到。本领域普通技术人员将能够基于药物的特定特征和所涉及的癌症来辨别可使用哪些药剂组合。可用于本发明的典型的抗肿瘤剂包括但不限于：抗微管剂如二萜和长春花生物碱；铂配位络合物；烷基化剂如氮芥、氧氮磷杂己环、烷基磺酸酯、亚硝基脲,和三氮烯；抗生素如蒽环类、放线菌素和博来霉素；拓扑异构酶II抑制剂如表鬼臼毒素；抗代谢物如嘌呤和嘧啶类似物和抗-叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂如喜树碱；激素和激素类似物；信号传导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；和细胞周期信号传导抑制剂。
其它与本发明的ICOS结合蛋白组合使用或共同施用的活性剂的实例为抗肿瘤剂，包括任何化疗剂、免疫调节剂或免疫调节剂和免疫刺激佐剂。
抗微管剂或抗有丝分裂剂是在细胞周期的M期或有丝分裂期的期间有抗肿瘤细胞的微管活性的时相特异性试剂(phase specific agent)。抗微管剂的例子包括但不限于二萜和长春花生物碱。
二萜源自天然来源，是在细胞周期的G2/M期起作用的时相特异性抗癌剂。据信二萜通过与该蛋白质结合来稳定微管的β-微管蛋白亚基。然后，随着有丝分裂被阻止出现对蛋白质分解的抑制以及随后的细胞死亡。二萜的实例包括但不限于紫杉醇及其类似物多西紫杉醇。
紫杉醇,具有(2R,3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨酸的5β,20-环氧基- 1,2α,4,7β,10β,13α-六-羟基紫杉-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-酯；其为从太平洋紫杉(Taxus brevifolia)中分离出的天然二萜产物，在商业上可作为注射溶液TAXOL取得。它是萜类紫杉烷家族的成员。其在1971年由Wani 等人分离(Wani等人，J.Am.Chem,Soc.,93:2325.(1971))，通过化学和X 射线结晶学方法对其结构进行表征。其活性的一个机制涉及紫杉醇结合微管蛋白的能力，从而抑制癌细胞生长(Schiff等人，Proc.Natl,Acad,Sci.USA, 77:1561-1565(1980)；Schiff等人，Nature,277:665-667(1979)；Kumar,J.Biol,Chem,256:10435-10441(1981))。关于一些紫杉醇衍生物的合成和抗癌活性的综述，参见：D.G.I.Kingston等人，Studies in Organic Chemistry vol.26, entitled“New trendsin Natural Products Chemistry 1986”,Attaur-Rahman,P.W. Le Quesne,Eds.(Elsevier,Amsterdam,1986)pp 219-235。
紫杉醇已经在美国被批准临床用于治疗难治性卵巢癌(Markman等人， YaleJournal of Biology and Medicine,64:583,1991；McGuire等人，Ann.lntem, Med.,111:273,1989)以及用于治疗乳腺癌(Holmes等人，J.Nat.Cancer Inst., 83:1797,1991.)。它是治疗皮肤肿瘤(Einzig等人，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol., 20:46)和头颈癌(Forastire等人，Sem.Oncol.,20:56,1990)的潜在候选者。该化合物还显示出治疗多囊性肾病(Woo等人，Nature,368:750.1994)、肺癌和疟疾的潜力。用紫杉醇治疗患者导致骨髓抑制(multiplecell lineages,Ignoff, R.J.et.al,Cancer Chemotherapy Pocket Guide,1998)，其与高于阈值浓度(50nM) 给药持续时间相关(Kearns,C.M.等人，Seminars in Oncology,3(6)p.16-23, 1995)。
多西紫杉醇，具有5β-20-环氧基-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯 -9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-(2R,3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸N-叔丁基酯13 酯三水合物；商业上可作为注射液
Figure GDA0003245324200000441
而获得。多西紫杉醇可用于治疗乳腺癌。多西紫杉醇是适量(q.v.)紫杉醇的半合成衍生物，其使用天然前体制备，所述天然前体为从欧洲紫杉的针叶提取的10-去乙酰基-浆果赤霉素 III。多西紫杉醇的剂量限制毒性是中性粒细胞减少症。
长春花生物碱是源自长春花植物的时相特异性抗肿瘤剂。长春花生物碱通过特异性结合微管蛋白而在细胞周期的M期(有丝分裂)起作用。因此，结合的微管蛋白分子不能聚合成微管。有丝分裂被认为滞留于中期，随后细胞死亡。长春花生物碱示例包括但不限于长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
长春碱，即硫酸长春碱可作为注射液
Figure GDA0003245324200000442
市售可得。尽管其可适用于多种实体瘤的二线治疗，其主要适用于治疗睾丸癌和多种淋巴瘤，包括霍奇金病；淋巴细胞性淋巴瘤和组织细胞性淋巴瘤。骨髓抑制是长春碱的剂量限制副作用。
长春新碱，即22-氧代硫酸长春碱，可作为注射液
Figure GDA0003245324200000443
市售可得。长春新碱适用于治疗急性白血病，也被发现用于霍奇金和非霍奇金恶性淋巴瘤的治疗方案中。脱发和神经系统影响是长春新碱最常见的副作用，骨髓抑制和胃肠粘膜炎影响出现的程度较小。
长春瑞滨，即3’,4’-二去氢-4’-去氧-C’-去甲长春碱[R-(R*,R*)-2,3-二羟基丁二酸盐(1:2)(盐)]，可作为酒石酸长春瑞滨注射液
Figure GDA0003245324200000446
市售可得，其是半合成长春花生物碱。长春瑞滨适合作为单一药剂或与其它化疗剂如顺铂组合治疗多种实体瘤，尤其是非小细胞肺癌、晚期乳腺癌和激素难治性前列腺癌。骨髓抑制是长春瑞滨最常见的剂量限制性副作用。
铂配位络合物是非细胞时相特异性的抗癌剂，其与DNA相互作用。铂络合物进入肿瘤细胞，进行水合作用，并与DNA形成链内和链间的交联，引起对肿瘤不利的生物学作用。铂配位络合物的实例包括但不限于顺铂和卡铂。
顺铂，顺式-二氨二氯合铂，商业上可以
Figure GDA0003245324200000444
注射液得到。顺铂最初用于治疗转移性睾丸癌和卵巢癌以及晚期的膀胱癌。顺铂的主要剂量限制性副作用是肾毒性和耳毒性，所述肾毒性可通过水合和利尿来控制。
卡铂，二氨[1,1-环丁烷-二羧酸酯(2-)-O,O’]合铂，在商业上可以
Figure GDA0003245324200000445
注射液得到。卡铂最初用于晚期卵巢癌的一线和二线治疗。骨髓抑制是卡铂的剂量限制性毒性。
烷基化剂是非细胞周期抗癌的特异性药物和强的亲电试剂。通常，烷基化剂借助于烷基化作用，通过DNA分子的亲核部分如磷酸基(phosphate)、氨基、巯基、羟基、羧基和咪唑基，与DNA形成共价连接。这种烷基化作用破坏核酸功能，导致细胞死亡。烷基化剂的实例包括但不限于氮芥如环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；烷基磺酸酯如白消安；亚硝基脲如卡莫司汀；及三氮烯如达卡巴嗪。
环磷酰胺，2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-氧氮磷杂环己烯 2-氧化物一水合物，商业上可以
Figure GDA0003245324200000451
的注射液或片剂得到。环磷酰胺可作为单独的药物或与其它化学治疗剂组合，用于治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。脱发、恶心、呕吐和白细胞减少是环磷酰胺最常见的剂量限制性副作用。
美法仑，4-[双(2-氯乙基)氨基]-L-苯基丙氨酸，商业上可以
Figure GDA0003245324200000452
的注射液或片剂得到。美法仑可用于多发性骨髓瘤和不可切除的卵巢上皮癌的姑息疗法。骨髓抑制是美法仑最常见的剂量限制性副作用。
苯丁酸氮芥，4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸，商业上可以
Figure GDA0003245324200000453
片剂得到。苯丁酸氮芥可用于慢性淋巴细胞性白血病以及恶性淋巴瘤如淋巴肉瘤、巨滤泡性淋巴瘤、及霍奇金病的姑息疗法。骨髓抑制是苯丁酸氮芥最常见的剂量限制性副作用。
白消安，1,4-丁二醇二甲磺酸酯，商业上可以
Figure GDA0003245324200000454
片剂得到。白消安用于慢性髓细胞性白血病的姑息疗法。骨髓抑制是白消安最常见的剂量限制性副作用。
卡莫司汀，1,3-[双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲，商业上可以
Figure GDA0003245324200000455
单瓶装的冻干产物得到。卡莫司汀可作为单独的药物或与其它药物组合，用于脑瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤的姑息疗法。延迟的骨髓抑制是卡莫司汀最常见的剂量限制性副作用。
达卡巴嗪，5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺，商业上可以
Figure GDA0003245324200000456
单瓶装的产物得到。达卡巴嗪可用于转移性恶性黑素瘤的治疗，并且可与其它药物组合，用于霍奇金病的二线治疗。恶心、呕吐和厌食是达卡巴嗪最常见的剂量限制性副作用。
抗生素类抗癌剂是非细胞时相特异性的药物，其结合或嵌入DNA中。通常，这种作用导致稳定的DNA复合物或链断裂，破坏核酸的正常功能，导致细胞死亡。抗生素类抗肿瘤药物的实例包括但不限于放线菌素如放线菌素D；蒽环类抗生素如柔红霉素和多柔比星；及博来霉素。
放线菌素D(dactinomycin)，也称之为放线菌素D(actinomycin D)，商业上可以
Figure GDA0003245324200000461
注射剂得到。放线菌素D可用于肾母细胞瘤和横纹肌肉瘤的治疗。恶心、呕吐和厌食是放线菌素D最常见的剂量限制性副作用。
柔红霉素，(8S-顺-)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮盐酸盐，商业上可以
Figure GDA0003245324200000462
脂质体注射剂或
Figure GDA0003245324200000463
注射剂得到。柔红霉素可在急性非淋巴细胞性白血病和晚期HIV相关的卡波西肉瘤的治疗中用于诱导缓解。骨髓抑制是柔红霉素最常见的剂量限制性副作用。
多柔比星，(8S,10S)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-8-乙醇酰基-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮盐酸盐，商业上可以
Figure GDA0003245324200000464
或ADRIAMYCIN
Figure GDA0003245324200000465
注射液得到。多柔比星主要用于急性成淋巴细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病的治疗，但也是治疗某些实体瘤和淋巴瘤的有用成分。骨髓抑制是多柔比星最常见的剂量限制性副作用。
博来霉素，是从轮丝链霉菌(Streptomyces verticillus)菌株中分离出来的细胞毒素糖肽类抗生素的混合物，商业上可以
Figure GDA0003245324200000466
得到。博来霉素可作为单独的药物或与其它药物组合，用于鳞状细胞癌、淋巴瘤和睾丸癌的姑息疗法。肺部和皮肤毒性是博来霉素最常见的剂量限制性副作用。
拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于表鬼臼毒素。
表鬼臼毒素是来源于曼德拉草(mandrake)植物的细胞时相特异性抗肿瘤药物。表鬼臼毒素通常通过与拓扑异构酶II和DNA形成三元复合物，导致DNA链断裂来影响处于细胞周期的S和G2期的细胞。链断裂积聚，接着细胞死亡。表鬼臼毒素的实例包括但不限于依托泊苷和替尼泊苷。
依托泊苷，4′-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-O-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，商业上可以
Figure GDA0003245324200000467
的注射液或胶囊得到，并且常称之为VP-16。依托泊苷可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗睾丸癌和非小细胞肺癌。骨髓抑制是依托泊苷最常见的副作用。白细胞减少症的发病率 (incidence)往往比血小板减少症的发病率更严重。
替尼泊苷，4′-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-O-(R)-噻吩亚甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，商业上可以
Figure GDA0003245324200000471
注射液得到，并且常称之为VM-26。替尼泊苷可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗儿童急性白血病。骨髓抑制是替尼泊苷最常见的剂量限制性副作用。替尼泊苷可引起白细胞减少症和血小板减少症。
抗代谢抗肿瘤药物是细胞时相特异性的抗肿瘤药物，其作用于细胞周期的S期(DNA合成)，通过抑制DNA的合成，或者通过抑制嘌呤碱基或嘧啶碱基的合成进而限制DNA的合成。因此，S期不能继续下去，接着发生细胞死亡。抗代谢抗肿瘤药物的实例包括但不限于氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤及吉西他滨。
5-氟尿嘧啶，5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮，商业上可以氟尿嘧啶得到。 5-氟尿嘧啶的给药导致对胸苷酸合成的抑制，并且还掺入到RNA和DNA中。结果通常是细胞死亡。5-氟尿嘧啶可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌和胰腺癌。骨髓抑制和粘膜炎是5- 氟尿嘧啶的剂量限制性副作用。其它的氟嘧啶类似物包括5-氟脱氧尿核苷(氟尿苷)和5-氟脱氧尿核苷一磷酸。
阿糖胞苷，4-氨基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2(1H)-嘧啶酮，商业上可以
Figure GDA0003245324200000472
得到，并且常称之为Ara-C。认为阿糖胞苷在S-期具有细胞时相特异性，其通过将阿糖胞苷末端掺入到生长中的DNA链中而抑制DNA链的延长。阿糖胞苷可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗急性白血病。其它的胞苷类似物包括5-氮杂胞苷和2′,2′-二氟脱氧胞苷酸(吉西他滨)。阿糖胞苷引起白细胞减少症、血小板减少症和粘膜炎。
巯嘌呤，1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮一水合物，商业上可以
Figure GDA0003245324200000473
得到。巯嘌呤在S-期具有细胞时相特异性，其通过至今尚未清楚的机理抑制DNA的合成。巯嘌呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗急性白血病。预期骨髓抑制和胃肠粘膜炎是高剂量巯嘌呤的副作用。可使用的巯嘌呤类似物是硫唑嘌呤。
硫鸟嘌呤，2-氨基-1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮，商业上可以
Figure GDA0003245324200000474
得到。硫鸟嘌呤在S-期具有细胞时相特异性，其通过至今尚未清楚的机理抑制DNA的合成。硫鸟嘌呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗急性白血病。骨髓抑制，包括白细胞减少症、血小板减少症和贫血是给药硫鸟嘌呤最常见的剂量限制性副作用。然而，还发生胃肠副作用，而且该副作用可以是剂量限制性的。其它的嘌呤类似物包括喷司他丁、赤羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyl adenine)、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨。
吉西他滨，2′-脱氧-2′,2′-二氟胞苷一盐酸盐(β-异构体)，商业上可以
Figure GDA0003245324200000481
得到。吉西他滨在S-期具有细胞时相特异性，且通过阻断细胞发育通过G1/S边界。吉西他滨可与顺铂组合，用于治疗局部的晚期非小细胞肺癌，也可以单独地用于治疗局部的晚期胰腺癌。骨髓抑制，包括白细胞减少症、血小板减少症和贫血是给药吉西他滨最常见的剂量限制性副作用。
甲氨蝶呤，N-[4[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，商业上可以甲氨蝶呤钠得到。甲氨蝶呤在S-期具有细胞时相特异性作用，其通过抑制合成嘌呤核苷酸和胸苷酸所需的二氢叶酸还原酶来抑制DNA 的合成、修复和/或复制。甲氨蝶呤可作为单独的药物或与其它化疗剂组合，用于治疗绒毛膜癌、脑膜白血病、非霍奇金淋巴瘤，以及乳腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌和膀胱癌。预期骨髓抑制(白细胞减少症、血小板减少症和贫血) 及粘膜炎是给药甲氨蝶呤的副作用。
喜树碱，包括喜树碱和喜树碱衍生物，其可作为拓扑异构酶I抑制剂来使用或开发。认为喜树碱细胞毒素活性与其拓扑异构酶I抑制活性相关。喜树碱的实例包括但不限于伊立替康、托泊替康及下述7-(4-甲基哌嗪子基- 亚甲基)-10,11-乙二氧基-20-喜树碱的各种旋光体。
盐酸伊立替康，(4S)-4,11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶子基哌啶子基)羰基氧基]-1H-吡喃并[3′,4′,6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮盐酸盐，商业上可以
Figure GDA0003245324200000482
注射液得到。
伊立替康是喜树碱的衍生物，其与其活性代谢物SN-38一起结合在拓扑异构酶I-DNA复合物上。认为由于不可修复的双链断裂，出现细胞毒性，所述断裂是由拓扑异构酶I:DNA:伊立替康或SN-38三元复合物与复制酶之间的相互作用引起的。伊立替康可用于治疗结肠或直肠的转移癌。盐酸伊立替康的剂量限制性副作用是骨髓抑制，包括嗜中性白细胞减少症，以及包括腹泻的GI效应。
盐酸托泊替康，(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3′,4′,6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮一盐酸盐，商业上可以
Figure GDA0003245324200000483
注射液得到。托泊替康是喜树碱的衍生物，其与拓扑异构酶I- DNA复合物结合，并阻止单链断裂的再连接，所述单链断裂是拓扑异构酶I 响应DNA分子的扭曲张力(torsionalstrain)所引起的。托泊替康用于卵巢转移癌和小细胞肺癌的二线治疗。盐酸托泊替康的剂量限制性副作用是骨髓抑制，主要是嗜中性白细胞减少症。
利妥昔单抗是一种嵌合单克隆抗体，以
Figure GDA0003245324200000491
和
Figure GDA0003245324200000492
出售。利妥昔单抗与B细胞上的CD20结合并引起细胞凋亡。利妥昔单抗通过静脉注射给药，且经批准用于治疗类风湿性关节炎和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
奥法木单抗是完全的人单克隆抗体，以
Figure GDA0003245324200000493
出售。奥法木单抗与B细胞上的CD20结合，并用于在成人中治疗氟达拉滨(Fludara)和阿仑单抗(Campath)难治性慢性淋巴细胞性白血病(CLL；一种白细胞癌症)。
曲妥珠单抗
Figure GDA0003245324200000494
是与HER2受体结合的人源化单克隆抗体。其原先用于HER2阳性乳腺癌。
西妥昔单抗
Figure GDA0003245324200000495
是一种嵌合小鼠人类抗体，其抑制上皮生长因子受体(EGFR)。
mTOR抑制剂包括但不限于雷帕霉素(FK506)及其衍生物(rapalog)、 RAD001或依维莫司(Afinitor)、CCI-779或替西罗莫司、AP23573、AZD8055、 WYE-354、WYE-600、WYE-687和Pp121。
贝沙罗汀以
Figure GDA0003245324200000496
出售，且为选择性活化类视色素X受体(RXR)类视色素亚类中的成员。这些类视色素受体的生物活性与视黄酸受体(RAR)不同。化学名为4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸。贝沙罗汀用于治疗患者的皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL，一种皮肤癌)，该疾病无法用至少一种其它药物成功治疗。
索拉非尼，以
Figure GDA0003245324200000497
销售，是一类被称为多激酶抑制剂的药物。其化学名为4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶- 2-甲酰胺。索拉非尼用于治疗晚期肾细胞癌(一种始于肾脏的癌症)。索拉非尼也用于治疗不可切除的肝细胞癌(一种无法通过手术治疗的肝癌)。
erbB抑制剂的实例包括拉帕替尼、厄洛替尼和吉非替尼。拉帕替尼，N- (3-氯-4-{[(3-氟苯基)甲基]氧基}苯基)-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)- 2-呋喃基]-4-喹唑啉胺(由所示式II表示)，是erbB-1和erbB-2(EGFR和HER2) 酪氨酸激酶的一种强效口服小分子双重抑制剂，其被批准与卡培他滨组合用于治疗HER2-阳性的转移性乳腺癌。
Figure GDA0003245324200000501
式(II)化合物的游离碱、盐酸盐和二对甲苯磺酸盐可根据1999年7月15 日公开的WO 99/35146和2002年1月10日公开的WO 02/02552中公开的方法制备。
厄洛替尼，N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二{[2-(甲氧基)乙基]氧基}-4-喹唑啉胺 (以商品名Tarceva市售)由以下所示的式III表示：
Figure GDA0003245324200000502
厄洛替尼的游离碱和盐酸盐可例如根据U.S.5,747,498中的实施例20制备。
吉非替尼，N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-4-吗啉)丙氧基]4-喹唑啉胺由以下所示的式IV表示：
Figure GDA0003245324200000503
吉非替尼，以商品名
Figure GDA0003245324200000504
(Astra-Zenenca)市售，是一种erbB-1抑制剂，其适用于在铂类和多西紫杉醇化疗均失败后的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的单一疗法。吉非替尼的游离碱、盐酸盐和二盐酸盐可根据1996年 4月23日申请并在1996年10月31日作为WO 96/33980公开的国际专利申请PCT/GB96/00961的方法制备。
还感兴趣的是下面式A的喜树碱衍生物，其目前正在开发之中，包括外消旋混合物(R,S)形式，以及R和S对映异构体：
Figure GDA0003245324200000511
已知的化学名称是“7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基-20(R,S)- 喜树碱(外消旋混合物)或者“7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基- 20(R)-喜树碱(R对映异构体)或者“7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱(S对映异构体)。所述化合物和相关的化合物包括其制备方法，参见美国专利号6,063,923、5,342,947、5,559,235、5,491,237及1997年 11月24日提交的待审查美国专利申请第08/977,217号。
激素和激素类似物是治疗癌症有用的化合物，其中在激素与癌的生长和/或不生长之间存在关联。可用于治疗癌症的激素和激素类似物的实例包括但不限于肾上腺皮质类固醇如泼尼松和泼尼松龙，其用于治疗恶性淋巴瘤和儿童急性白血病；氨鲁米特和其它芳香酶抑制剂如阿那曲唑、来曲唑、伏罗唑(vorazole)、及依西美坦，其可用于治疗肾上腺皮质癌和包含雌激素受体的激素依赖性乳腺癌；孕酮类如醋酸甲地孕酮，其用于治疗激素依赖性乳腺癌和子宫内膜癌；雌激素类，雄激素类，及抗雄激素类如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)和5α-还原酶如非那雄胺和度他雄胺，其用于治疗前列腺癌和良性前列腺肥大；抗雌激素类如他莫昔芬，托瑞米芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，吲哚昔芬，以及选择性雌激素受体调节剂 (SERMS)，如美国专利号5,681,835、5,877,219和6,207,716中所述的那些，其用于治疗激素依赖性乳腺癌及其它的易感癌症；及促性腺激素释放激素 (GnRH)及其类似物，其刺激用于治疗前列腺癌的促黄体生成激素(leutinizinghormone)(LH)和/或促卵泡激素(FSH)的释放，例如LHRH激动剂和拮抗剂，如醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)和亮丙瑞林(luprolide)。
信号转导途径抑制剂是阻断或抑制引起细胞内变化的化学过程的抑制剂。这里所用的变化是指细胞的增殖或分化。用于本发明的信号转导抑制剂包括受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、SH2/SH3域阻断剂、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷酯酰肌醇-3激酶、肌醇信号和Ras致癌基因的抑制剂。
若干蛋白酪氨酸激酶催化细胞生长的调节中所涉及的各种蛋白质中的特定酪氨酰残基的磷酸化。这种蛋白酪氨酸激酶可以广义地分为受体或非受体激酶。
受体酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其具有细胞外配体结合域、跨膜域和酪氨酸激酶域。受体酪氨酸激酶与细胞生长的调节有关，并且通常称为生长因子受体。已经表明，这些激酶中很多不适当和非受控活化，即异常的激酶生长因子受体活性，例如由过度表达或突变引起的上述活化，会导致非受控的细胞生长。因此，这种激酶的异常活性已经和恶性组织生长联系在一起。因此，这种激酶的抑制剂可提供癌症治疗方法。例如，生长因子受体包括表皮生长因子受体(EGFr)、血小板来源的生长因子受体(PDGFr)、erbB2、erbB4、血管内皮生长因子受体(VEGFr)、具有类免疫球蛋白样和表皮生长因子同源域(homology domains)的酪氨酸激酶(TIE-2)、胰岛素生长因子-I(IGFI)受体、巨噬细胞集落刺激因子(Cfms)、BTK、ckit、cmet、成纤维细胞生长因子(FGF) 受体、Trk受体(TrkA、TrkB和TrkC)、肝配蛋白(eph)受体及RET原癌基因。正在开发若干生长因子受体的抑制剂，其包括配体拮抗剂、抗体、酪氨酸激酶抑制剂和反义寡核苷酸。有关生长因子受体以及抑制生长因子受体功能的药物的描述，参见例如Kath,John C.,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(6):803- 818；Shawver et alDDT Vol 2,No.2 February 1997；和Lofts,F.J.等人，“Growth factor receptors astargets”,New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy,ed. Workman,Paul andKerr,David,CRC press 1994,London。
酪氨酸激酶，其不是生长因子受体激酶，称为非受体酪氨酸激酶。用于本发明的作为抗癌药物靶标或潜在靶标的非受体酪氨酸激酶包括cSrc、 Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(黏着斑激酶)、Brutons酪氨酸激酶及Bcr- Abl。有关这种非受体激酶和抑制非受体酪氨酸激酶功能的药物的描述，参见Sinh,S.和Corey,S.J.,(1999)Journal of Hematotherapyand Stem Cell Research 8(5):465-80；和Bolen,J.B.,Brugge,J.S.,(1997)Annualreview of Immunology. 15:371-404。
SH2/SH3域阻断剂是破坏结合于各种酶或衔接蛋白中的SH2或SH3 域的药物，所述酶或衔接蛋白包括PI3-K p85亚单元、Src家族激酶、衔接分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)、及Ras-GAP。有关SH2/SH3域作为抗癌药物靶标的论述，参见Smithgall,T.E.(1995),Journal ofPharmacological and Toxicological Methods.34(3)125-32。
丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂包括：MAP激酶级联阻断剂，包括Raf 激酶(rafk)阻断剂、促细胞分裂剂或细胞外调节激酶(MEK)阻断剂、及细胞外调节激酶(ERK)阻断剂；及蛋白激酶C家族成员阻断剂，包括PKC(α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ)阻断剂、IkB激酶家族(IKKa、IKKb)阻断剂、PKB家族激酶阻断剂、akt激酶家族成员阻断剂、及TGFβ受体激酶阻断剂。有关这种丝氨酸/苏氨酸激酶及其抑制剂的描述，参见Yamamoto,T.,Taya,S.,Kaibuchi,K.,(1999),Journal of Biochemistry.126(5)799-803；Brodt,P,Samani,A.和Navab, R.(2000),Biochemical Pharmacology,60.1101-1107；Massague,J.,Weis- Garcia,F.(1996)Cancer Surveys.27:41-64；Philip,P.A.和Harris,A.L.(1995), CancerTreatment and Research.78:3-27,Lackey,K.等人，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters,(10),2000,223-226；U.S.Patent No.6,268,391；和 Martinez-Iacaci,L.,等人，Int.J.Cancer(2000),88(1),44-52。
本发明中还使用磷酯酰肌醇-3激酶家族成员的抑制剂，包括PI3-激酶、 ATM、DNA-PK和Ku的阻断剂。有关这类激酶的讨论，参见Abraham,R.T. (1996),Current Opinion inImmunology.8(3)412-8；Canman,C.E.,Lim,D.S. (1998),Oncogene 17(25)3301-3308；Jackson,S.P.(1997),International Journal of Biochemistry and Cell Biology.29(7):935-8；和Zhong,H.等人，Cancer res, (2000)60(6),1541-1545。
本发明中还使用肌醇信号传导抑制剂，如磷脂酶C阻断剂和肌醇类似物。这种信号抑制剂的说明参见Powis,G.和Kozikowski A.,(1994 New Molecular Targets forCancer Chemotherapy ed.,Paul Workman和David Kerr, CRC press 1994,London。
另一组信号转导途径抑制剂为ras致癌基因的抑制剂。这类抑制剂包括法尼基转移酶抑制剂、牛儿基-牛儿基转移酶抑制剂和CAAX蛋白酶抑制剂，以及反义寡核苷酸、核酶和免疫疗法。已经表明，这类抑制剂阻断包含野生型突变体ras的细胞中的ras活化，因而可充当抗增殖剂。有关ras致癌基因抑制的讨论，参见Scharovsky,O.G.,Rozados,V.R.,Gervasoni,S.I.Matar, P.(2000),Journal of Biomedical Science.7(4 292-8；Ashby,M.N.(1998),Current Opinion in Lipidology.9(2)99-102；和Bennett,C.F.和Cowsert,L.M.BioChim. Biophys.Acta,(1999)1489(1):19-30。
如上所述，受体激酶配体结合的抗体拮抗剂也可以充当信号转导抑制剂。该类信号转导途径抑制剂包括将人源化抗体用于受体酪氨酸激酶的细胞外配体结合域。例如，Imclone C225 EGFR特异性抗体(参见Green,M.C.等人，Monoclonal Antibody Therapyfor Solid Tumors,Cancer Treat.Rev.,(2000), 26(4,269-286)；
Figure GDA0003245324200000541
erbB2antibody(参见Tyrosine Kinase Signalling in Breast Cancer:erbB Family ReceptorTyrosine Kniases,Breast Cancer Res.,2000, 2(3),176-183)；和2CB VEGFR2 specificantibody(参见Brekken,R.A.等人， Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by amonoclonal anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice,Cancer Res.(2000)60,5117-5124。
非受体激酶血管生成抑制剂也用于本发明。与血管生成有关的 VEGFR和TIE2抑制剂，已在上面关于信号转导抑制剂中讨论过(二者的受体均为受体酪氨酸激酶)。血管生成通常与erbB2/EGFR信号传导相关联，因为已经表明erbB2和EGFR的抑制剂抑制血管生成，主要是VEGF的表达。因而，erbB2/EGFR抑制剂与血管生成抑制剂的组合是合理的。因此，非受体酪氨酸激酶抑制剂可与本发明的EGFR/erbB2抑制剂组合。例如，抗-VEGF 抗体不能识别VEGFR(受体酪氨酸激酶)，但却与配体结合；整联蛋白(αvβ3) 的小分子抑制剂会抑制血管生成；也证实了内皮抑素和血管抑素(非-RTK)可与公开的erb家族抑制剂组合使用(参见Bruns CJ et al(2000),Cancer Res.,60： 2926-2935；Schreiber AB,Winkler ME和Derynck R.(1986),Science,232：1250- 1253；Yen L等人，(2000),Oncogene 19：3460-3469)。
免疫治疗方法中使用的药物也可与式(I)化合物组合。有许多免疫策略，以产生对erbB2或EGFR的免疫反应。这些策略一般属于肿瘤疫苗领域。通过用小分子抑制剂组合(combined)抑制erbB2/EGFR信号途径，可以大大地增强免疫方法的疗效。有关抗erbB2/EGFR的免疫/肿瘤疫苗方法的讨论，参见Reilly RT等人，(2000),Cancer Res.60：3569-3576；和Chen Y,Hu D,Eling DJ,Robbins J和Kipps TJ.(1998),Cancer Res.58：1965-1971。
用于促细胞凋亡方法的药物(例如bcl-2反义寡核苷酸)也可用于与本发明的药物组合。蛋白质的Bcl-2家族的成员阻断细胞凋亡。因此，bcl-2的上调与药物抗性相联系。研究表明，表皮生长因子(EGF)刺激bcl-2家族的抗细胞凋亡成员(即mcl-1)。因此，设计下调bcl-2在肿瘤中的表达的策略已经证实在临床上是有益的，现在正处于II/III期试验中，即Genta′s G3139 bcl-2 反义寡核苷酸。有关这种利用bcl-2的反义寡核苷酸促细胞凋亡的策略的讨论，参见Water JS等人，(2000),J.Clin.Oncol.18:1812-1823；和Kitada S等人，(1994),Antisense Res.Dev.4：71-79。
曲妥珠单抗
Figure GDA0003245324200000551
是与HER2受体结合的人源化单克隆抗体。其原先用于HER2阳性乳腺癌。
曲妥珠单抗emtansine(商品名Kadcyla)是由与细胞毒性剂美坦新 (mertansine)(DM1)连接的单克隆抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)组成的抗体-药物偶联物。单独的曲妥珠单抗通过结合HER2/neu受体阻止癌细胞的生长，而美坦新进入细胞并通过与微管蛋白结合而破坏它们。由于单克隆抗体靶向 HER2且HER2仅在癌细胞中过度表达，所以缀合物特异性地将毒素递送到肿瘤细胞。缀合物缩写为T-DM1。
西妥昔单抗
Figure GDA0003245324200000552
是一种嵌合小鼠人类抗体，其抑制上皮生长因子受体(EGFR)。
帕妥珠单抗(也称为2C4，商品名Omnitarg)是单克隆抗体。在一系列被称为“HER二聚化抑制剂”的药剂类别中的第一个。通过结合HER2，它抑制了HER2与其他HER受体的二聚化，认为这导致了肿瘤生长减缓。帕妥珠单抗在2001年1月4日公开的WO01/00245中有描述。
利妥昔单抗是一种嵌合单克隆抗体，以
Figure GDA0003245324200000553
和
Figure GDA0003245324200000554
出售。利妥昔单抗与B细胞上的CD20结合并引起细胞凋亡。利妥昔单抗通过静脉注射给药，且经批准用于治疗类风湿性关节炎和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
奥法木单抗是完全的人单克隆抗体，以
Figure GDA0003245324200000555
出售。奥法木单抗与B细胞上的CD20结合，并用于在成人中治疗氟达拉滨(Fludara)和阿仑单抗(Campath)难治性慢性淋巴细胞性白血病(CLL；一种白细胞癌症)。
细胞周期信号抑制剂抑制细胞周期控制中所涉及的分子。称作细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的蛋白激酶家族，及其与称作细胞周期蛋白的蛋白质家族的相互作用，通过真核细胞周期控制细胞发展。对于通过细胞周期的正常细胞发展而言，不同细胞周期蛋白/CDK复合物的协同活化和钝化是必要的。若干细胞周期信号抑制剂正在开发中。例如，包括CDK2、CDK4和 CDK6的细胞周期蛋白依赖性激酶及其抑制剂的实例剂，可参见，例如，Rosania等人，Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(2):215-230。
如本发明所用，“免疫调节剂”是指任何影响免疫系统的物质，包括单克隆抗体。本发明的ICOS结合蛋白可以被认为是免疫调节剂。免疫调节剂可用作治疗癌症的抗肿瘤剂。例如，免疫调节剂包括但不限于抗-CTLA-4抗体如依匹木单抗(YERVOY)和抗-PD-1抗体(Opdivo/纳武单抗和Keytruda/派姆单抗)。其他免疫调节剂包括但不限于OX-40抗体、PD-L1抗体、LAG3抗体、TIM-3抗体、41BB抗体和GITR抗体。
Yervoy(依匹木单抗)是由Bristol Myers Squibb销售的完全人CTLA-4 抗体。在美国专利6,984,720和7,605,238中描述了依匹木单抗的蛋白质结构和使用方法。
Opdivo/纳武单抗是由Bristol Myers Squibb销售的完全人类单克隆抗体，其具有免疫增强活性，直接对抗负向免疫调节的人类细胞表面受体PD- 1(程序性死亡-1或程序性细胞死亡-1/PCD-1)。通过PD-1(一种Ig超家族跨膜蛋白)的配体PD-L1和PD-L2，纳武单抗结合PD-1且阻断PD-1的活化，导致T细胞和细胞介导的免疫应答的活化，以对抗肿瘤细胞或病原体。活化的PD-1通过抑制P13k/Akt途径的活化，从而负向调节T细胞活化和效应子功能。纳武单抗的其他名称包括：BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。纳武单抗的氨基酸序列以及使用和制备方法在美国专利US 8,008,449中公开。
KEYTRUDA/派姆单抗是由Merck出售用于治疗肺癌的抗-PD-1抗体。派姆单抗的氨基酸序列和使用方法在美国专利8,168,757中公开。
CD134，也称为OX40，是受体TNFR-超家族的成员，与CD28不同，其不会在休止原生T细胞上组成性表达。OX40是次级共刺激分子，在活化后24至72小时表达；其配体OX40L也不在休止的抗原呈递细胞上表达，但在活化后表达。OX40的表达依赖于T细胞的完全激活；没有CD28，OX40 的表达被延迟并且水平降低了四倍。OX-40抗体、OX-40融合蛋白及其使用方法在以下美国专利中公开：US 7,504,101、US 7,758,852、US 7,858,765、 US 7,550,140、US 7,960,515、WO2012027328、WO2013028231。
PD-L1的抗体(也称为CD274或B7-H1)以及使用方法在美国专利 7,943,743、美国专利8,383,796、US20130034559、WO2014055897、美国专利8,168,179和美国专利7,595,048中。PD-L1抗体正在开发中，以作为免疫调节剂用于治疗癌症。
如本发明所用，“免疫刺激剂”是指可以刺激免疫系统的任何试剂。如本发明所用，免疫刺激剂包括但不限于疫苗佐剂。
已知氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)可用作疫苗佐剂和免疫刺激剂，以刺激细胞因子产生、活化巨噬细胞、促进先天免疫应答并增加经免疫的动物中抗体的产生。氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)是Toll样受体4(TLR4) 的合成配体。AGP及其通过TLR4的免疫调节作用在专利公开文本中公开，如WO 2006/016997、WO 2001/090129和/或美国专利6,113,918，并已在文献中报道。其它AGP衍生物在美国专利7,129,219、美国专利6,525,028和美国专利6,911,434中公开。一些AGP作为TLR4的激动剂，而其他AGP被认为是TLR4拮抗剂。
本发明中使用的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物具有以下式1所示的结构：
Figure GDA0003245324200000571
其中
m为0至6；
n为0至4；
X为O或S，优选O；
Y为O或NH；
Z为O或H；
R1、R2、R3中的每个独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；
R4为H或Me；
R5独立地选自-H、-OH、-(Cl-C4)烷氧基、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、 -OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8和-CONR8R9，其中R8和R9各自独立地选自H和(Cl-C4)烷基；和
R6和R7各自独立地为H或PO3H2。
在式1中，正常脂肪酰基残基(即，二级氧氧基或烷氧基残基，例如R1O、 R2O和R3O)连接的3'立体中心的构型是R或S，优选R(由Cahn-Ingold- Prelog优先级规则指定)。R4和R5连接的糖苷配基立体中心的构型可以是R 或S。所有立体异构体、对映体和非对映异构体及其混合物都被认为落入本发明的范围内。
杂原子X与糖苷配基氮原子之间的碳原子数由变量“n”确定，其可以是0至4的整数，优选0至2的整数。
正常脂肪酸R1、R2和R3的链长可为约6至约16个碳原子，优选约9至约14个碳原子。链长可相同或不同。一些优选的实施方案包括R1、R2和 R3的链长为6或10或12或14。
式1涵盖L/D-丝氨酰基、-苏氨酰基、-半胱氨酰基的醚和酯脂质AGP、激动剂和拮抗剂及其同系物(n＝1-4)以及不同羧酸生物电子等排体(即R5为能够形成盐的酸性基团；磷酸根可在葡糖胺单元的4-或6-位，但优选在4-位)。
在本发明的使用式1的AGP化合物的优选实施方案中，n为0，R5为 CO2H，R6为PO3H2且R7为H。该优选的AGP化合物如以下式1a的结构中所示：
Figure GDA0003245324200000581
其中X为O或S；Y为O或NH；Z为O或H；R1、R2、R3各自独立地选自C1-20酰基和C1-20烷基；且R4为H或甲基。
在式1a中，正常脂肪酰基残基(即，二级酰氧基或烷氧基残基，例如R1O、 R2O和R3O)连接的3'立体中心的构型是R或S，优选R(由Cahn-Ingold- Prelog优先级规则指定)。R4和CO2H连接的糖苷配基立体中心的构型可以是R或S。所有立体异构体、对映体和非对映异构体及其混合物都被认为落入本发明的范围内。
式1a涵盖L/D-丝氨酰基、-苏氨酰基、-半胱氨酰基的醚和酯脂质AGP，既有激动剂又有拮抗剂。
在式1及式1a中，Z为通过双键连接的O或各自通过单键连接的两个氢原子。也就是说，该化合物在Z＝Y＝O时是酯连接型的；在Z＝O且Y＝NH 时是酰胺连接型的；且在Z＝H/H且Y＝O时为醚连接型。
式1的尤其优选的化合物被称为CRX-601和CRX-527。其结构如下所示：
Figure GDA0003245324200000591
Figure GDA0003245324200000601
此外，另一优选实施方案使用了具有所示结构的CRX 547。
Figure GDA0003245324200000602
其它实施方案包括AGP，如CRX 602或CRX 526，其对具有较短的二级酰基或烷基链的AGP提供了增加的稳定性。
Figure GDA0003245324200000611
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的方法，包括向该哺乳动物施用治疗有效量的以下物质：
本发明的ICOS结合蛋白，
和b)至少一种抗肿瘤剂。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的方法，包括向该哺乳动物施用治疗有效量的以下物质：
本发明的ICOS结合蛋白，
和b)至少一种第二免疫调节剂。
在一个实施方案中，所述第二免疫调节剂选自抗-CTLA4抗体、抗-PD- 1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-OX40抗体、抗-GITR抗体、和抗-41BB抗体、抗-LAG3抗体和抗-TIM3抗体。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的哺乳动物中治疗癌症的方法，包括向该哺乳动物施用治疗有效量的以下物质：
本发明的ICOS结合蛋白，
和b)至少一种免疫刺激剂。
在一个实施方案中，该免疫刺激剂为TLR4激动剂。在一个实施方案中，该免疫刺激剂为AGP。在一方面，该免疫刺激剂为式I的化合物。在一方面，其为式1a的化合物。在一方面，该免疫刺激剂选自CRX-601、CRX-547、 CRX-602、CRX-527和CRX-526。
实施例
以下实施例说明了本发明的各非限制性方面。
实施例1：癌症中的ICOS表达
一般来说，实体肿瘤具有低水平的浸润性ICOS+T细胞，这与ICOS介导抗肿瘤免疫应答的理论一致。使用来自The Cancer Genome Atlas(TCGA)和其他数据库的公开可得的mRNA表达数据集，产生了各种肿瘤组织学的 ICOS表达分析。表3显示来自各组织学的相对肿瘤百分比，所述每种组织学显示一定可检测水平的ICOS mRNA表达。该分析确定了已知对其他癌症免疫疗法敏感的肿瘤组织学(黑素瘤、RCC、NSCLC)具有相对较高的肿瘤百分比(>10％)，其中具有可检测的ICOS+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，而已知具有较低免疫原性的肿瘤类型(前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌)中，肿瘤百分比相对较低，其具有ICOS+TIL(<10％)(表3)。有趣的是，已知与病毒感染和/或慢性炎症相关的肿瘤类型(H&N、胃癌、食管癌和宫颈癌)落入显示出最高百分比的ICOS+TIL的肿瘤类型中。根据这些mRNA表达分析，尚不清楚在各种肿瘤类型中会表达ICOS的TIL亚群。在一些情况下，ICOS可主要以肿瘤浸润性Treg表达，而在其他情况下，其可以表示ICOS+T效应子细胞浸润的水平。
表3.不同肿瘤类型间的ICOS mRNA表达
Figure GDA0003245324200000631
在原代人类非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、结肠直肠癌 (CRC)、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾细胞癌(RCC)和黑素瘤中通过免疫组织化学(IHC)分析了ICOS表达，以更好地了解哪些TIL亚型与不同肿瘤类型中的ICOS表达相关(表4)。与mRNA表达分析中观察到的相似，ICOS+TIL 的丰度相对较低，即使在存在大量CD4+、CD8+和/或FoxP3+TIL的个体肿瘤中也是如此。再次，黑素瘤、肾细胞癌(RCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的组织学中，肿瘤百分比最高，具有一定水平的可检测ICOS+浸润(表4，第2列)。相反，前列腺、卵巢和胰腺肿瘤几乎没有显示ICOS+TIL(表4)。这些分析清楚地表明，实体肿瘤的ICOS+TIL基础水平较低，并可受益于该细胞群的扩增和功能性诱导。未来研究使用流式细胞测量术和双色免疫组织化学分析原发性人类肿瘤，这有助于确定哪些特异性T细胞亚群表达ICOS。
表4
Figure GDA0003245324200000641
实施例2：筛选ICOS抗体激动剂
分离初代PBMC
从血液供体获得新鲜血液，并用无酚红-10％RPMI1640培养基进行1:1 稀释。在Uni-Sep Max 50ml锥形管中，将稀释的血液层加在密度培养基的顶部，在室温下以400×g间歇离心20分钟。将所得的白色单核层(血沉棕黄层)通过100μM细胞筛小心地提取到新的50mL锥形管中。将等体积的无酚红-10％RPMI1640培养基加入到血沉棕黄层中，并在室温下以300×g离心 10分钟。将细胞沉淀重悬于10ml红细胞裂解液(Sigma Aldrich)中，并在室温下孵育5分钟。细胞用培养基洗涤一次，如前所述进行离心。用无酚红- 10％RPMI1640培养基将体积调至40ml，使用Vicell细胞计数器和成活力分析仪(Beckman Coulter)对细胞进行计数。
分离初代人CD4+CD25-T效应子细胞
通过使用人CD4+CD25+调节T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)的两步磁珠分离程序，从PBMC进一步纯化人CD4+CD25细胞。首先，将PBMC 细胞与生物素-抗体混合物在4℃温育5分钟，随后与抗生物素微珠一起孵育 10分钟。这个步骤是标记非CD4+T细胞。然后使细胞通过MidiMACS分离器的磁场中的LD柱。收集未标记的预富集的CD4+细胞级分的流出物，并在4℃下与CD25微珠一起温育15分钟。使标记的细胞在MiniMACS分离器的磁场中通过MS柱。收集含有未标记的CD4-CD25-T效应子细胞的溢流以用于下游活化测定。
直接从血液中分离初代人CD4+T细胞
使用人CD4+T细胞富集混合物(Stem Cell Technologies)直接从新鲜人血液中分离人CD4+T细胞。将RosetteSep人CD4+T细胞富集混合物(50μ L/mL)加入全血并充分混合。在室温下孵育20分钟后，加入等体积的PBS+ 2％FBS，轻轻搅拌。将稀释的样品层铺在密度介质的顶部，并在室温下以1200×g不中断离心20分钟。将来自密度培养基:血浆界面的富集的细胞小心倒入新的锥形管中。接下来，用红细胞裂解缓冲液(Sigma Aldrich)将红细胞裂解，用PBS+2％FBS洗涤富集的细胞两次。将CD4+T细胞重悬于40ml PBS+2％FBS中，并用Vi-Cell细胞计数器计数。
实验方案
人CD4+CD25-T效应子细胞的体外活化测定-结合测定
将经非组织培养物处理的96孔平底板用100μl/孔的涂覆缓冲液 (Biolegend)涂覆过夜，该缓冲液含有1μg/ml抗人CD3抗体(eBioscience)和各种测试抗体的。第二天，将预先涂覆的板用含有RPMI-1640培养基的10％ FBS洗涤三次。将人CD4+CD25-T效应子细胞分离，并如所述用CFSE标记并接种到平板上。在37℃下孵育2.5天后，收集细胞并通过流式细胞测量术分析增殖和活化标记物表达。还收集细胞培养上清液，用Meso Scale Discovery(MSD)测定多重细胞因子。
CFSE增殖分析
将待标记的细胞在15ml锥形管中重新悬浮于1ml预热的PBS中，最终浓度高达1E7细胞/mL。将1微升的2mM CFSE储备溶液(Life Technologies) 直接加入细胞中，随后立即涡旋以确保均匀标记。在室温下孵育5分钟后，通过加入14ml冰冷的细胞培养介质来淬灭染色。将标记的细胞用冰冷的培养基洗涤三次。将细胞计数并在RPMI1640+10％FBS(PeproTech)(补充有100 IU/ml的IL-2)中调节至1E6细胞/ml，并将其接种在涂覆有抗CD3和测试抗体的板上。T细胞活化后，收集细胞，用PBS+0.5％BSA洗涤一次，然后进行多色染色步骤以进行流式细胞测量术分析。
多色流式细胞测量术
收集活化的T细胞，并用PBS洗涤。首先按照供应商的方案，用 LIVE/DEAD可固定远红细胞成活力染料(Life Technologies)使细胞染色。洗掉染料后，将与不同颜色缀合的检测抗体与细胞在4℃一起孵育30分钟。经染色细胞用冰冷的FACS染色缓冲液(PBS+0.5％BSA)洗涤一次，然后在 FACS Canto或FACS Canto II流式细胞仪上进行测量。每天使用Cytometer Setup&Tracking珠粒(BD Biosciences)检测细胞计数器性能，并且根据未染色细胞设置PMT电压和面增比(area scaling)。使用用与每个荧光染料缀合的检测抗体单独染色的OneComp或UltraComp珠粒(eBioscience)进行补偿。
MSD细胞因子分析
使用MSD人V-Plex定制试剂盒测定组织培养上清液中的IFN-γ、IL-10、 IL-2和TNF-α细胞因子水平。首先将样品在Diluent2中进行1:200稀释。根据试剂盒手册，也在Diluent2中准备校准物。将稀释的样品和校准物加入到黑色MSD板中，随后用粘合板密封件密封，并在室温下振荡孵育2小时。在每个孔中加入25μl检测抗体溶液(在稀释剂2中新鲜制备)，随后将板重新密封，并在室温下继续振荡2小时。将板用150μL/孔的PBS加0.05％Tween-20洗涤3次，然后加入150μl/孔的新鲜稀释的2x读取缓冲液，并立即在MESOQuickPlex读数器上读数。使用MSD Workbench软件分析数据。
人CD4+T细胞的体外活化分析-结合型及可溶型
将新鲜分离的人CD4+T细胞在涂有抗-CD3(1μg/ml)和抗-CD28(3μg/ml)的24孔板上预刺激48小时。将细胞进行收集、洗涤，并在补充有100 IU/ml IL-2(PeproTech)的AIM-V培养基中，以1:1的比例与抗-CD3 DynaBeads(Life Technologies)混合。然后将细胞/珠粒混合物以每孔100k接种到96孔平底板上，平底板可以是未涂覆的(可溶形式)或用H2L5hIgG4PE涂覆(结合形式)。对于可溶性形式，在细胞接种时将H2L5 hIgG4PE加入到孔中。在37℃下孵育3.5天后，收集细胞培养上清液，通过MSD测定多重细胞因子。
可溶性人PBMC体外活化测定
将新鲜分离的人PBMC在涂有抗-CD3(1μg/ml)和抗-CD28(5μg/ml)的 24孔板上预刺激48小时。制备CFSE染色的细胞，并将其在补充有100IU/ml IL-2(PeproTech)的AIM-V培养基中，以1:1的比例与抗-CD3 DynaBeads(Life Technologies)混合。然后将细胞/珠粒混合物以每孔200k接种到96孔平底板上，平底板预先涂覆了1μg/ml的抗CD3抗体。直接将H2L5hIgG4PE和对照抗体以其可溶形式加入孔中。在37℃下孵育3.5天后，收集细胞培养上清液，通过MSD测定多重细胞因子，并收取细胞以用于通过流式细胞测量术进行增殖和标记物表达分析。
数据分析
流式细胞测量术数据分析
由FlowJo软件(FlowJo LLC)分析流式细胞测量术数据。首先根据活/死细胞成活力染料染色来剔除死细胞。在FSC-H:FSC-W散点图上剔除重复细胞。分析所得到的各个活细胞在不同T细胞亚群如CD4+或CD8+T细胞中的活化标记物表达，并报告为亲本群的百分比或中值荧光强度(MFI)。
CFSE增殖分析
也通过Flowjo分析了CFSE数据。在排除死细胞和重复细胞之后，基于未活化的T细胞绘制“增殖细胞”圈。在任何给定样品中落在该圈中的任何细胞都被作为增殖细胞计数。数据报告为增殖百分比。
通过FACS进行细胞消耗分析
通过FlowJo分析细胞消耗。首先，基于活/死细胞成活力染料染色确定活细胞圈。然后如前所述剔除重复的细胞。计算活的CD4+或CD8+T细胞亚群的百分比作为细胞消耗的指标。
抗体剂量应答曲线拟合分析
将剂量反应数据导入GraphPad Prism软件中并转换成对数刻度。使用各种斜率模型的激动剂剂量反应来对数据进行曲线拟合并产生EC 50值。拟合公式如下：
Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogEC50-X)*坡斜率坡斜率))
结果
鉴定前导鼠类抗人ICOS抗体
针对人类和食蟹猴ICOS结合活性和激动剂活性，筛选十四种鼠类mAb。十二种能够重新克隆、测序、生长和纯化至足够用于功能性研究的量。使用 BIAcore测试所有的结合特征。发现两种为非常弱/非结合体。通过功能性“激动作用”分析测试十种纯化的mAb。基于它们在多个健康人供体中诱导T细胞增殖和IFN-γ细胞因子产生的能力，选择四种最佳的激动剂mAb(以下表 5中称为422.2、279.1、314.8和88.2)，并将其制成人IgG1嵌合体。314.8、88.2、92.17、145.1和53.3的CDR序列与其它ICOS mAb一起在 PCT/EP2012/055735(WO2012/131004)中示出。
克隆88.2的重链可变区在以下作为SEQ ID NO:13示出：
Figure GDA0003245324200000681
克隆88.2的轻链可变区在以下作为SEQ ID NO:14示出：
Figure GDA0003245324200000682
表5：ICOS mAb结合及竞争
Figure GDA0003245324200000691
针对IFN-γ产生和T细胞增殖，使用基于细胞的测定，以剂量递增设计，相对于小鼠IgG1和EPR7114对照测试了最佳ICOS结合物中的8种。基于这些测定，选择命名为422.2的克隆以用于人源化。参见图1和图2。
实施例3抗体人源化
实验方案
从mRNA中恢复抗体可变基因并产生嵌合Fc野生型抗体
从422.2杂交瘤细胞沉淀物中纯化总RNA，将其逆转录产生cDNA，通过PCR从中分离可变基因产物(约400bp)，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。
将纯化的可变区片段克隆到含有人IgG1恒定区或人κ恒定区的pTT5 载体中，并转化到DH5α感受态细胞中。挑选群落并用于接种含有氨苄青霉素的L-肉汤。使用QuickLysemini-prep试剂盒从培养物中分离质粒DNA。对可变重链和轻链基因进行测序，并通过信息学对序列数据进行比对，以鉴定可变重链和轻链基因序列。
克隆密码子优化的嵌合422.2抗体
将成熟的小鼠可变区蛋白质序列反向翻译成DNA，然后进行密码子优化。然后修饰VH和VL序列以在任一末端包括优选的五个未翻译区和优选的克隆位点。使用基于PCR的策略以及重叠的寡核苷酸重新构建改造的VH序列，然后将其接枝到pTT载体中存在的人IgG1 Fc野生型或Fc失能型 hIgG1(L235A、G237A)或铰链稳定型hIgG4(S228P、L235E)(IgG4PE)上。使用基于PCR的策略和重叠的寡核苷酸重新构建改造的VL序列，然后将其接枝到存在于pTT5载体中的κ恒定区上。
所得的pTT质粒用于HEK转染以产生嵌合抗体。
人源化422.2的可变域
使用BLASTP，通过CDR掩蔽的422.2V区搜索合适的内部人类种系重链和轻链数据库，从而选择人类可变(V)基因模板以用于422.2人源化。从前几个BLASTP结果选出IGHV1-69和IGKV3-11作为V基因框架模板以用于422.2人源化。选择IGHJ6和IGKJ2人类种系接合(J)基因进行人源化422.2。
确定所选择的人类种系基因与422.2序列之间的残基差异，以帮助选择回复突变(为将特定的人类框架残基改变为鼠残基而进行的突变)。设计了六种人源化VH变体和六种人源化VL变体，进行密码子优化，然后进行修饰以包括优选的5'和3'延伸。使用基于PCR的策略和重叠的寡核苷酸重新构建改造的可变区序列，并将其分别克隆到pTT载体中。
将所得的pTT质粒用于HEK转染以产生人源化抗体。对HEK2936E悬浮细胞进行计数，并使用Freestyle表达培养基293将其稀释至1.5×106细胞 /mL至2×106细胞/mL，所述培养基补充有0.05％遗传霉素，且在一些实验中补充有1％普兰尼克(pluronic)F68。将DNA和转染试剂(Gemini或293- Fectin)加入到OptiMEM中，并在室温下孵育20至30分钟之前轻轻匀浆。然后将DNA-脂质复合物与细胞悬浮液合并，将转染的细胞在37℃、5％CO2、 125rpm下孵育。对于一些转染，在转染后24至48小时，向每次转染中加入胰蛋白胨进料(补充有1％普兰尼克F68和20％w/v胰酪蛋白胨的Freestyle 表达培养基293)。将转染的细胞悬浮液孵育5至8天，直到活细胞降至60％以下，然后离心(取决于构建体)。收获上清液并过滤。
通过使上清液通过1mL HiTrap Protein A HP柱以进行抗体捕获、用10mL PBS洗涤柱并用5mL IgG洗脱液(Pierce，21009)洗脱来纯化抗体。使用 Millipore
Figure GDA0003245324200000701
Centrifugal Filter Unit(30K截断值)将纯化的蛋白质缓冲交换到PBS中，并在Nandrop分光光度计上进行定量。
结果
构建的表达质粒
成功地回收了杂交瘤克隆422.2的鼠类抗体可变基因序列，其序列在以下以及图8中分别显示为SEQ ID NO:19和20。
Figure GDA0003245324200000711
将回收的可变区克隆到选择的pTT5载体中，导致产生质粒，该质粒编码422.2的嵌合轻链序列和hIgG1 Fc野生型、hIgG1 Fc失能型(L235A/G237A， EU编号)或hIgG4 PE(S228P/L235E，EU编号)的嵌合重链序列的质粒。使用嵌合抗体来确认克隆的小鼠V区的功能并确定最合适的同型。
成功构建了编码422.2的各种人源化变体的重链和轻链的pTT哺乳动物表达质粒。
表达、纯化并鉴定H2L5 hIgG4PE
H2L5 hIgG4PE的成熟蛋白质序列连同附加标记已经被纳入图9中。 H2L5 hIgG4PE重链和轻链编码区的DNA序列已经被纳入图10和11中。
实施例4：H2L5的功能性分析
Fc受体结合
将人源化抗体H2L5从人IgG1同型修饰为经修饰的人IgG4同型，其中掺入突变S228P、L235E(EU编号)以防止抗原结合片段(Fab)的臂交换。选择人IgG4PE，而非人IgG1，因为其减少了mAb的结合，以活化Fcγ受体和 C1q，因此，降低了mAb诱导ICOS阳性细胞由于抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 或补体依赖性细胞毒性(CDC)而被消耗的潜力。此外，人IgG4PE(S228P、 L235E)保持与FcγRIIb(抑制性Fcγ受体)的结合。通过启动抗体交联，与Fc γRIIb的相互作用可对ICOS抗体的激动剂活性至关重要。已经显示与Fcγ RIIb的相互作用对于靶向TNF-α家族受体以及CD28的其它免疫调节性抗体的激动剂活性至关重要(Bartholomaeus P等人，“Cell contact-dependent priming and Fc interaction withCD32+immune cells contribute to the TGN1412- triggered cytokine response.”J.Immunol.,192(5)；2091-8(2014))。
进一步显示，人IgG4PE减少了mAb与活化Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa 和FcγRIIIa)和C1q的结合，因此降低了mAb诱导ICOS阳性细胞由于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)而被消耗的潜力。另外，人IgG4PE(S228P、L235E)保持与FcγRIIb(抑制性Fcγ受体)的结合(表6)。
以下表6显示了前导H2L5作为hIgG1或hIgG4PE抗体对人Fcγ受体的代表性结合亲和力。
表6:前导人源化ICOS抗体作为hIgG1或hIgG4PE对人Fcγ受体的代表性亲和力
Figure GDA0003245324200000721
NB＝无结合。
实验方案
422.2人源化变体的功能性评估
为了使四种候选ICOS激动剂抗体人源化，产生了小鼠-人嵌合体，其为小鼠V区和人IgG1 Fc部分的融合物。在人类全PBMC活化测定中以平板结合形式测试这四种嵌合抗体。抗-ICOS嵌合体422.2在结合型PBMC活化测定中显示出最佳的激动剂活性。将结合数据和生物物理性质结合，选择 422.2克隆用于人源化。基于ICOS结合和生物物理特征选择四种人源化422.2 变体(422.2H2L0、H2L5、H5L0和H5L5)，并在结合型人PBMC活化测定中进行测试。相对于其他变体，H2L5变体表现出相当或更好的T细胞活化，这通过细胞因子的产生测量(图3)。
H5变体的重链(VH)可变区和成熟重链分别如SEQ ID NO:15和16所示。
H5 VH
Figure GDA0003245324200000722
成熟H5重链
Figure GDA0003245324200000731
L0变体的轻链(VL)可变区和成熟轻链分别如SEQ ID NO:17和18所示。
L0 VL
Figure GDA0003245324200000732
成熟L0轻链
Figure GDA0003245324200000733
选择IgG4[PE]作为同型
随后以可溶性形式在各种全PBMC活化测定中测试422H2L5 IgG1。这种可溶形式会与体内条件更相关，因为全PBMC测定在同一孔中含有淋巴细胞、单核细胞和其他免疫细胞。然而，422H2L5 IgG1 mAb仍然显示出T 细胞群体的成活力降低，这暗示了T细胞消耗。在11个测试的健康供体中观察到不同程度的该结果，且CD4+T细胞比CD8+T细胞更明显。相比之下，当作为IgG4[PE]或Fc-失能型同型表达时，422H2L5抗体没有显示出T 细胞成活力的显著降低，表明降低的成活力是由于FcγR介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(图4)。
H2L5 hIgG4PE在CD4+T细胞活化测定中的剂量反应
为了量化H2L5 hIgG4PE的T细胞活化效应，首先通过平板结合型抗- CD3(1μg/ml)/抗-CD28(3μg/ml)预先刺激人初代CD4+T细胞48小时，以诱导在T效应子细胞群体的表面上的ICOS受体水平，然后用抗CD3 DynaBeads 和H2L5 hIgG4PE再刺激。在抗-CD3DynaBeads存在下，通过用连续浓度的结合型或可溶型H2L5 hIgG4PE处理预先刺激的CD4+T细胞而产生10点剂量应答曲线。结果表明，结合型和可溶型H2L5 hIgG4PE在两个独立的健康人类供体中以剂量依赖的方式增加了IFN-γ和TNF-α细胞因子的产生(图 5)。进行剂量-反应曲线拟合分析以产生EC50值。有趣的是，当抗体被固定在板上时，H2L5 hIgG4PE的处理导致细胞因子诱导程度明显更大，这与作为可溶性蛋白质被加入到T细胞培养物的上清液中时相反。
H2L5 hIgG4PE在可溶型人PBMC活化测定中的功能性测试
为了检测H2L5 hIgG4PE在全人PBMC离体培养物中的功能，用平板结合型抗-CD3和抗-CD28从健康人供体制备PBMC，历时48小时，然后在抗 CD3 Dynabeads(珠粒:细胞＝1:1的比例)存在下进行可溶性H2L5 hIgG4PE处理，历时3.5天。细胞因子生成和T细胞颗粒酶B的表达作为T细胞功能的功能性读数被检测。来自3个供体的结果总结在图6中，其提供了证据表明，在来自健康人类供体的活化的PBMC中，H2L5 hIgG4PE诱导增殖、细胞因子产生和增加的细胞毒性潜力(图6)。
ICOS mAb对抗预先刺激的人PBMC的活性
在PBMC预刺激分析中评估了H2L5 hIgG4PE的活性，其中通过平板结合型抗-CD3(克隆OKT3，1μg/ml)和抗CD28(克隆CD28.2，3μg/ml)预刺激 PBMC，历时48小时。接下来，为了鉴定最佳的预刺激条件，使用具有不同珠粒：细胞比的人CD3 Dynabeads和CD3/CD28Dynabeads(ThermoFisher)预刺激PBMC。在预刺激48小时后，收获细胞并以磁性去除珠粒，然后在存在或不存在可溶性ICOS mAb的情况下，用抗CD3 Dynabeads(珠粒与细胞的比例＝1:1)再刺激。与同型对照相比，在所有测试的预刺激条件下，H2L5 hIgG4PE ICOS激动剂mAb会诱导IFNγ；然而，IFNγ产生的量级与预刺激的强度呈反向相关。
实施例5-T细胞活化标记物
方法
通过以浓度范围为0.1μg/mL至100μg/mL的固定型H2L5 hIgG4PE处理健康人PBMC，加上同时以0.6μg/mL的抗-CD3抗体处理，来评估功能性终点的浓度依赖性变化。通过流式细胞测量术评估T细胞表面的活化标志物CD69、OX40和CD25的表达变化，并认为这是T细胞活化的量度。通过Ki67核染色的变化测量T细胞的增殖。在MSD平台上，在CD3接合的存在下，评估了各种Th1、Th2和Th17细胞因子水平对H2L5 hIgG4PE处理所产生的变化。选择治疗后24小时和48小时的时间点，以确保捕捉到早期细胞因子变化以及主要在较晚时间点注意到的增殖变化。
实验准备
分离人外周血单核细胞(PBMC)
使用涂有液体肝素钠(Sagent，终浓度10IU/mL)的注射器从健康供体收集全血，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行1:1稀释。将稀释的血液(35mL)层加在15mL Ficoll密度梯度培养基(GE Healthcare)的顶部上，并在室温(RT)下以1200×g不中断离心20分钟。将白色单核细胞层小心地转移到新的50ml 管中。将等体积的PBS加入管中，并在室温下以400×g离心5分钟。PBMC 用PBS洗涤一次，如前所述离心。将PBMC重悬于50mL AIM-V培养基中。使用Vi-Cell细胞计数器和成活力分析仪(BeckmanCoulter)对细胞进行计数。
抗体涂布
将抗-人CD3抗体在涂布缓冲液中稀释至终浓度为0.6μg/mL。在4℃将 100μL稀释的抗体在96孔平底板上涂覆过夜。第二天，将10.1mg H2L5 hIgG4PE和7.9mg抗-RSV IgG4PE同型对照抗体的储备溶液在涂布缓冲液中进行1:2连续稀释，得到最终抗体浓度范围为100至0.1μg/mL。将100μ L稀释的抗体在室温下涂覆在涂有抗-CD3的板上，历时4小时。
实验方案
人PBMC活化测定
在人PBMC活化测定中测试了H2L5 hIgG4PE，其中同时发生通过抗- CD3抗体与TCR的接合和H2L5hIgG4PE对ICOS的共同刺激，并且在活化后24和48小时监测活化效果。该实验用四种不同供体的血液重复四次(n＝ 4)。将AIM-V培养基中的二百(200)μL PBMC(1×106个细胞/mL)加入到涂有抗-CD3抗体的孔中，该孔中具有不同浓度的H2L5 hIgG4PE或IgG4同型对照。每个测定条件包括三次技术重复。将PBMC在37℃和5％CO2下培养如上所述的不同时间。在24小时和48小时的时间点收集上清液，然后储存在-80℃，以用于在MSD平台上分析所分泌的细胞因子。在24和48小时将细胞转移到96深孔板中，并用1mL FACS染色缓冲液(染色有荧光团缀合的抗体或同型对照)洗涤两次。
细胞表面染色
首先在4℃下，于暗处用预先在PBS中稀释为1:1000的100μL的可固定成活力染料eFluor 506将细胞染色30分钟。洗涤细胞，然后与检测抗体在冰上一起孵育30分钟，使得细胞表面标记物与不同荧光团缀合。用细胞表面抗体染色后，用冰冷的FACS染色缓冲液不被染色以用作内化标记物的样品洗涤一次，然后在FACS Canto II流式细胞计数器上进行测量。
使用细胞计数器的Set-up及Tracking珠粒每天适当地评估细胞计数器性能。使用AbC抗-小鼠珠粒试剂盒进行补偿，其单独用与每个荧光染料缀合的检测抗体染色。运行样品，并对适当补偿设置后获得的数据用以上所述的混合珠确定。
Foxp3和Ki67的细胞内染色
在细胞表面染色后，将细胞固定并透化(permeabilize)以用于细胞内标记物的染色。使用转录因子缓冲液组，通过将其在稀释缓冲液中进行1:3稀释而制备固定/渗透缓冲液。通过在去离子水中将透化/洗涤缓冲液原液稀释5 倍来制备透化洗涤缓冲液。将一(1)mL固定/透化缓冲液加入到每个样品中，并将板立即在振荡器上涡旋。将板在4℃在暗处孵育45分钟。离心后，加入 1mL透化/洗涤缓冲液，将板混合并离心，总计2次洗涤。用标记抗体制备内化混合物。将100μL内化抗体加入合适的样品中，将板在暗处在4℃下孵育30分钟。将样品用1mL透化洗涤缓冲液洗涤两次，重悬于250μL流动缓冲液中并在FACS Canto II流式细胞计数器上进行测量。
人Special Order 9-重细胞因子测定
使用MSD人Special Order 9-重试剂盒测量细胞因子水平。将样品和校准物在Diluent 43中稀释。对于9-重测定，将样品稀释为1:10，对于所述IFNγ测定，稀释为1:200，并将其添加至向两个校准组的每一个中。涡旋后，将校准物在冰上孵育至少5分钟。将200μL的各校准组加入到400μL稀释剂中，得到最高浓度的校准物，并使用1:4系列稀释液来制备6个额外的校准物稀释液。Diluent 43被用作板背景。将50μL稀释样品(一式三份)和校准物(一式两份)加入到MSD板中。将板密封并在室温下振荡孵育2小时。将板用来自试剂盒的150μL稀释的MSD洗涤缓冲液洗涤3次。对于每个板，通过60 μL的9种检测抗体中的每一种与Diluent 3组合并补足至3mL来制备检测抗体溶液。加入25μL检测抗体溶液后，将板密封并在室温下在暗处孵育，摇动2小时。如上所述对板进行洗涤。将150μL的2x读取缓冲液加入板中，并在QuickPlex上读取。
人IFNγ细胞因子测定
在Diluent 2中稀释样品和校准物。将1mL的稀释剂加入校准物中。在涡旋后，将校准物在冰上孵育5分钟。此为校准物1。使用1:4的连续稀释来制备6个其它校准物稀释液。使用Diluent 2作为板背景。向MSD板中加入五十(50)μL的稀释样品(一式三份)和校准物(一式两份)。将板密封并在室温下孵育，摇动2小时。用来自试剂盒的150μL的稀释MSD洗涤缓冲液将板洗涤3次。在Diluent 3中制备检测抗体溶液。对于每个板，将60μL的每种检测抗体添加至稀释剂中以获得总共3mL的检测试剂。加入25μL的检测抗体，然后将板密封并在室温下在暗处孵育，摇动2小时。将板洗涤3次。向板中添加读取缓冲液，并在QuickPlex上进行读取。
数据分析
细胞因子和流式细胞测量术的数据分析
使用MSD Discovery Workbench软件(4.0版(Meso-Scale),Microsoft Excel,and Graphpad Prism)分析MSD细胞因子测定结果。使用DIVA分析流式细胞测量术数据，并在GraphPad Prism软件中对进行绘图。
抗体剂量应答曲线拟合分析
将剂量反应数据输入GraphPad Prism软件，并转化为对数量度。使用具有各种斜率模型的激动剂剂量反应来分析数据，并产生EC50值。拟合公式如下所列：
Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogEC50-X)*坡斜率))
统计分析
通过双配对Student's t检验分析了增殖研究中H2L5 hIgG4PE和同型抗体对照值之间的差异，以获得统计学显著性。
结果
使用H2L5 hIgG4PE评估细胞因子变化
在抗-CD3的存在下用固定型H2L5 hIgG4PE处理PBMC以浓度依赖性方式诱导了Th1细胞因子(如IFNγ、TNFα)、Th2细胞因子(IL-6和IL-10)以及Th17细胞因子IL-17a不同程度的分泌。其它测量的细胞因子如IL-4、IL- 5和IL-13对H2L5 hIgG4PE刺激也显示了较低程度的浓度依赖性反应。表7 中总结了来自4个独立供体的结果。
通过流式细胞测量术对H2L5 hIgG4PE对T细胞活化的细胞表面标记物的活性的功 能性评估
H2L5 hIgG4PE处理同时加上CD3的刺激在未活化的人PBMC(n＝4名供体)中诱导T细胞活化标记物产生显著变化(表7和8)。当与人IgG4同型对照样品比较时，在经H2L5hIgG4PE处理的样品中观察到存在CD25和 OX40阳性CD4以及CD8 T细胞的强烈增多。CD69阳性CD4和CD8 T细胞的百分比也在24小时和48小时时间点处以浓度依赖性方式增加。
H2L5 hIgG4PE对T细胞增殖影响的表征
通过细胞内Ki67染色的测量发现，固定型H2L5 hIgG4PE的处理伴随同时的CD3活化以浓度依赖性方式导致了CD4和CD8 T细胞增殖(n＝6名供体) 的增加(表8)。H2L5hIgG4PE还以浓度依赖性方式增加了 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的增殖，但该增殖程度小于针对所有CD4 和CD8 T细胞观察到的结果。仅在48小时时间点处观察到H2L5 hIgG4PE增强了T细胞的增殖。调节性T细胞增殖的增加并不显著，但CD4+细胞增殖(当H2L5 hIgG4PE浓度大于0.4μg/mL时p<0.05)和CD8+T细胞增殖(当浓度在0.2至1.6μg/mL之间时p<0.05)的浓度依赖性增加很显著(参见表7)。
表7.在人PBMC活化测定中，H2L5 hIgG4PE所有的功能性终点的 EC50值(μg/mL)。
Figure GDA0003245324200000791
NA＝未分析(由于曲线拟合不佳，EC50值不精确)。
NT＝未测试。
表8.在抗CD3的存在下用H2L5 hIgG4PE刺激48小时后，人PBMC 中，CD25、Foxp3和Ki67阳性CD4或CD8 T细胞的百分比
Figure GDA0003245324200000792
Figure GDA0003245324200000801
讨论
已经相当确定ICOS对于T细胞活化以及Th1和Th2细胞因子的诱导来说是重要的。在该研究中，通过T细胞活化和细胞因子诱导的各种测量显示了H2L5 hIgG4PE(抗-ICOS激动剂抗体)的体外活性。在经H2L5 hIgG4PE 处理并结合CD3刺激后，所有测量的T细胞活化标记物，CD25(IL-2受体α-链)、CD69(早期活化标志物)和OX-40(共刺激标志物)都被上调。在所有监测的活化标记物中，通过H2L5 hIgG4PE处理大大增加了表达CD69和 OX40的T细胞的百分比。CD69为一种早期活化标志物，并因此在24小时样品中效果明显。另一种重要的T细胞活化标志物，CD25，在用H2L5 hIgG4PE处理后在两个时间点均增加，暗示H2L5 hIgG4PE在维持T细胞的活化方面起到重要作用。Ki67为一种与细胞增殖相关的核蛋白。使用Ki67 细胞内染色的流式细胞测量术表明，在TCR接合的情况中，固定型H2L5 hIgG4PE显著地增强了CD4和CD8 T细胞的增殖。尽管H2L5 hIgG4PE也增加了调节性T细胞的增殖，但该变化不具有统计学显著性。
人Th17在调节抗-肿瘤免疫力方面是一个关键角色[Nunez,S.等人，T helpertype 17 cells contribute to anti-tumour immunity and promote the recruitmentof T helper type 1 cells to the tumour.Immunology 2013；139:61-71]。研究显示，在人Th17发展和功能中涉及了ICOS[Kimura,A.等人，Regulator of Treg/Th17balance.Eur.J.Immunol.2010；40:1830-1835；Paulos CM等人， The induciblecostimulator(ICOS)is critical for the development of human Th17 cells.SciTransl Med.(2010)2(55)；55ra78；Nelson,M.H.,等人，The inducible costimulatoraugments Tc17 cell responses to self and tumor tissue.J Immunol, 2015；194:1737-1747]。在目前对H2L5 hIgG4PE的功能性评估中，在用抗- CD3和H2L5 hIgG4PE刺激后，在细胞培养物的上清液中测得了与炎性和免疫应答相关的大多数细胞因子。H2L5hIgG4PE在人PBMC中强烈地诱导了 Th1细胞因子(IFN-γ和TNF-α)以及Th17细胞因子IL-17a的分泌，暗示 H2L5 hIgG4PE具有在抗-肿瘤反应中起重要作用的潜力。IL-6与TGF-β一起，是诱导由初始T细胞发育Th17细胞的重要细胞因子。相反，IL-6抑制了由TGF-β诱导的Treg分化[Kimura,A.,2010；Korn,T.等人，IL-6 controls Th17 immunity in vivo byinhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+regulatory Tcells.PNAS,2008；105:18460-18465]。在该研究中，发现 H2L5 hIgG4PE增加了IL-6的分泌，这可进一步增强Th17细胞的发育。T细胞受体(如CD28和TNF受体家族成员)的激动剂抗体已经显示产生了钟形剂量应答曲线[White,A.L.等人，Conformation of the HumanImmunoglobulin G2 Hinge Imparts Superagonistic Properties toImmunostimulatory Anticancer Antibodies.Cancer Cell,2015,27:138-148；Luhder,F.,等人，Topological Requirements and Signaling Properties of TCell-activating,Anti-CD28 Antibody Superagonists.J.Exp.Med.2003:955-966；Stebbings,R.等人，“Cytokine Storm” in the Phase I Trial of Monoclonal Antibody TGN1412:Better Understanding the Causes to Improve PreClinical Testing ofImmunotherapeutics J.Immunol.,2007, 179:3325-3331；Rogers PR和Croft M,CD28,Ox-40,LFA-1,and CD4 Modulation of Th1/Th2 Differentiation Is Directly Dependenton the Dose of Antigen.J Immunol 2000 164:2955-2963；doi:10.4049/jimmunol.164.6.2955]。 H2L5 hIgG4PE也显示了类似的双曲线函数应答曲线。该信息在确定将被用于最佳药效学反应的抗体的最佳剂量范围中是一个重要因素。
总的来说，H2L5 hIgG4PE，结合CD3刺激，显示出增强了T细胞活化、增殖和促炎细胞因子诱导，这与其作为T细胞共刺激受体的有效活化剂的作用一致。
实施例6：抗-ICOS抗体的结合
人源化方案(实施例3)产生了36个重链和轻链变体，对其进行筛选以用于结合人类和食蟹猴ICOS，同时还需确保它们不结合至人CD28或CTLA- 4。H2L5变体被确定为对人和食蟹猴的ICOS具有高亲和力(分别为1.34nM 和0.95nM)，同时含有最少数量的回复突变。
将422H2L5的同型由IgG1变为IgG4PE并不影响抗体的抗原结合，因为H2L5hIgG4PE对人ICOS具有1.3nM的亲和力。图7中基于浓度显示了 H2L5 hIgG4PE对ICOS/ICOS-L结合的抑制。
实验方案
H2L5 hIgG4PE对人ICOS的结合
使用BIAcore T200抗-人IgG，在抗-ICOS H2L5 hIgG4PE被捕获到表面上的CM5芯片的Fc2上确定人源化H2L5 hIgG4PE抗体的结合动力学亲和力。抗-人IgG表面被0.1mg/mLhIgG1对照阻断以防止非特异性结合于兔Fc。人和食蟹猴的ICOS(兔Fc)以256nM,64nM,16nM,4nM和1nM流过捕获的抗体。单独的缓冲液被用作双重参考结合曲线。使用MgCl2使表面再生。在25℃进行实验。使用T200评估软件将数据拟合至1:1模型。抗体浓度： 2.5μg/mL。
结果
H2L5 hIgG4PE对人ICOS和食蟹猴ICOS的结合
使用BIAcore T200确定了人源化H2L5 hIgG4PE抗体的结合动力学亲和力。
使用T200数据分析软件将ICOS结合数据拟合至1:1动力学模型。
H2L5 hIgG4PE对人ICOS的结合亲和力为1.34nM，对食蟹猴ICOS的结合亲和力为0.95nM(参见表9)。这些数值相当，且如预期一样，显示该分子Fc区的变化不会影响与ICOS抗原的结合。
表9显示人源化422(H2L5)IgG4PE与人和食蟹猴的ICOS的Ka/Kd/KD。
表9与人ICOS的结合
Figure GDA0003245324200000831
讨论
如实施例1中所示，确定鼠类克隆422-2，其为前导抗-人ICOS鼠类抗体。该抗体的人源化产生了36个重链和轻链变体，其被筛选以用于结合人和食蟹猴的ICOS，同时还需确保它们不会结合至人CD28或CTLA-4。H2L5 变体被确定为对人和食蟹猴的ICOS具有高亲和力(分别为1.34nM和0.95 nM)，同时仍含有最少数量的回复突变。
将同型由IgG1改为IgG4PE不影响抗体与ICOS的结合。
实施例7：H2L5 hIgG4PE与活化的人T细胞的结合
方法
实验准备
CD3阴性分离
通过干细胞Rosette Sep人T细胞富集试剂盒阴性分离CD3+T细胞
Rosette Sep人T细胞富集：通过涂有液体肝素钠(Sagent，终浓度为10 IU/mL)的注射器收集100mL的新鲜全血。将每个收集管的血液合并至烧瓶中，其中每mL血液添加50μL的Rosette Sep人T细胞富集混合物(5mL/100 mL供者血液)。在室温(RT)下将全血/RosetteSep抗体混合物孵育20分钟。然后用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)+2％FBS(胎牛血清)对血/Rosette Sep抗体混合物进行1:1稀释。用FBS将最终体积补足至200mL。接着，将25mL稀释的血/抗体混合物层加至Sepmate管中的15mL Ficoll梯度上(每名供体总计 8个管)。然后在室温以1200xg将所加载的Sepmate管间歇离心20分钟。用移液管取出下到外周血单核细胞(PBMC)界面的血浆顶层，弃去。将剩余的血浆和血沉棕黄层界面从Sepmate管中倒入50mL锥形离心管中(共4管)。将该管用PBS+2％FBS补足至50mL。细胞在室温下以400×g离心10分钟。弃去上清液。然后将来自每个供体的沉淀合并至一个50mL锥形管中，将沉淀重新悬浮在PBS+2％FBS中，总体积为50mL。将细胞在室温以400 ×g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于2mL RPMI完全培养基(RPMI 1640+10％FCS+1mM丙酮酸钠+2mM L-谷氨酰胺+青霉素 100U/mL+链霉素100μg/mL)中。在ViCell仪器上计数回收的CD3细胞，并进一步稀释至1.2×106细胞/mL。针对CD3 PE-Cy7，将1×106个回收细胞染色以证实T细胞分离的品质。
通过Invitrogen UntouchedT细胞分离试剂盒阴性分离CD3+T细胞
PBMC分离：简而言之，用涂有液体肝素钠(Sagent，终浓度为10IU/mL) 的注射器从每个供体收集100mL新鲜全血。将血液用2％FBS的PBS稀释 (1：1)至200mL的最终体积。将二十五(25)mL稀释的血液层加至在Sepmate 管中15mL的Ficoll梯度上(每个供体总计8管)。然后将加载的Sepmate管以室温1200×g间歇离心20分钟。用移液管取出下到PBMC界面的血浆顶层，弃去。将剩余的血浆和血沉棕黄层从Sepmate管中倒入50mL锥形离心管中(共4管)。将管用PBS+2％FBS补足至50mL。细胞在室温下以400× g离心10分钟。弃去上清液。然后将来自每个供体的沉淀合并至一个50ml 锥形管中，并重新悬浮在PBS+2％FBS中，总体积为50mL。将细胞以室温 400×g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重新悬浮于任意体积的分离缓冲液(取决于细胞沉淀的尺寸)，其在Invitrogen-Untouched的T细胞试剂盒中提供。然后将分离的PBMC在ViCell仪器上计数，并在分离缓冲液中达到1×108个细胞/mL的终浓度。
Invitrogen Dynabead-Untouched人T细胞分离：将2x108分离的PBMC (2mL)、400μl的FBS以及然后来自Invitrogen-UntouchedT细胞试剂盒的 400μl的抗体混合物添加至每一个15mL管中，并在4℃孵育20分钟。用 10mL的分离缓冲液洗涤细胞，并在4℃下以350×g离心8分钟。弃去上清液，将沉淀重新悬浮于2mL分离缓冲液中。接下来，向每个管中加入2mL预先洗涤的Depletion Dynabead。在室温下将细胞与珠粒温育15分钟，同时伴随轻柔倾斜和旋转。珠粒孵育后，加入10mL分离缓冲液，将细胞/珠悬浮液上下抽吸10次。将管在室温下放置在磁体中2分钟。不扰动磁珠，收集含有未接触的T细胞的上清液。将珠子用10mL分离缓冲液洗涤1次，并在室温下再次置于磁体中2分钟，并收集清除珠粒的缓冲液。将收集的细胞在室温下以400×g离心5分钟。弃去上清液，根据细胞沉淀的尺寸，将细胞沉淀重新悬浮于任意体积的RPMI完全培养基(2～35mL)。然后在ViCell上计数回收的CD3+细胞，并在RPMI完全培养基中使浓度达到1.2×106细胞 /mL。
CD3确认染色：在暗处在4℃，将1×106个回收的细胞用5μl抗CD3 PE-Cy7或5μlIgG1 Pe-Cy7同型染色40分钟。然后将细胞用含有0.1％ Tween20的冰冷PBS洗涤两次，在4℃以400xg离心5分钟。将染色的细胞重新悬浮在1％甲醛中，并在暗处中在4℃孵育20分钟。然后将细胞在含有 0.1％Tween20的冰冷PBS中洗涤两次，在4℃以400xg离心5分钟，并重新悬浮于含有0.1％Tween20的275μl PBS中。将固定的细胞在暗处在4℃储存，然后进行流式细胞测量术以确认T细胞分离的品质。
活化经分离的人T细胞：
用4mL的1μg/ml CD3/CD28的PBS溶液在37℃下涂覆T75烧瓶，历时2小时。将烧瓶用12mL PBS洗涤两次。向每个T75烧瓶中加入25mL RPMI完全培养基中的30×106个细胞。将细胞在37℃、5％CO2下孵育48 小时以使其发生活化。
结合抗-ICOS(H2L5 hIgG4PE)：
在初始和活化的CD3+T细胞中评估了H2L5 hIgG4PE的结合。采用从 0.00128至100μg/mL的H2L5 hlgG4PE的8点滴定并加上5倍稀释。
以2×106细胞/mL，将初始和/或活化的CD3+T细胞重新悬浮于含有人 FcR阻断溶液的0.1％BSA的PBS中(FACS缓冲液)(每1mL含有5μl FcR 封闭溶液+950μlFACS缓冲液)。以2x105细胞/孔的浓度，将100μl细胞置于2mL的96孔分析板中，并在室温下孵育15分钟。在孵育期间，以2x浓度制备结合抗体抗-ICOS(H2L5 hIgG4PE)或IgG4同型对照抗体的滴定。在FcR阻断的孵育后，将每孔100μl的2倍浓缩的结合抗体加入每孔100μl Fc阻断的T细胞中，以获得最终的1x浓度的抗ICOS(H2L5 hIgG4PE)或 IgG4同型对照抗体(从0.00128至100μg/mL的最终浓度)。将细胞与抗体在室温下孵育20分钟。结合孵育后，将细胞在1mL FACS缓冲液中洗涤两次，在室温下以400×g离心5分钟。
抗-ICOS(H2L5 hIgG4PE)结合后对初始或活化的T细胞染色：
将细胞用以下混合物染色以用于流式细胞测量术：
染色混合物：
Figure GDA0003245324200000861
同型混合物：
Figure GDA0003245324200000862
在与H2L5 hIgG4PE或对照抗体结合孵育后，将Fc阻断的初始或活化的T细胞重新悬浮在80μl FACS缓冲液中。每孔加入20μl的染色混合物或同型混合物。将细胞在暗处在室温下染色20分钟。染色孵育后，将细胞在1mL FACS缓冲液中洗涤两次，在室温下以400×g离心5分钟。
将染色的细胞固定：
将细胞重新悬浮在500μl的1％甲醛(10mL的16x浓缩甲醛+150mL的 1X PBS中)中，并在室温下温育20分钟。然后将细胞用1mL FACS缓冲液洗涤两次，在室温下以400×g离心5分钟。然后将沉淀再悬浮于265μl的 FACS缓冲液中并转移到96孔圆底板中。将细胞在暗处在4℃下储存，直至通过流式细胞测量术分析。
流式细胞测量术:
使用FACSDiva软件(版本8.0)在FACS Fortessa X20或FACS Canto II上进行流式细胞测量术。在采集时，使用单一染色的eBioscience Ultracomp珠粒和FACSDiva中的补偿软件进行补偿。
数据分析
在BD FACS仪器、LSR Fortessa X-20或FACS Canto II上使用BD Diva(8.0版)软件进行数据采集和补偿。数据分析采用Flow Jo软件(10.0.8r1 版)。结果报告为MFI(中值荧光强度)和人IgGκ轻链FITC染色中为阳性的细胞占总的活细胞或合适亲本群的百分比。使用Graphpad Prism 5软件(5.04 版)决定EC50，其中对所转换数据的非线性回归(X＝(log(X))使用了具有4个参数的可变斜率(log(激动剂)vs.反应--可变斜率)。
结果
使用Rosette Sep CD3富集试剂盒或Dynabead未接触T细胞分离试剂盒从新鲜的人全血中分离T细胞，用抗-CD3 PeCy7染色证实。供体的68％至 97％对CD3细胞为阳性。当评估抗人IgG1κ轻链FITC染色时，抗-CD3/抗 -CD28活化CD4+和CD8+细胞群产生H2L5hIgG4PE-浓度依赖性曲线。H2L5 hIgG4PE结合曲线表现为抗人IgG1κ轻链FITC阳性的百分比和FITC中值荧光强度(MFI)。在评估抗人IgG1κ轻链FITC染色时，与IgG4同型对照抗体一起孵育的T细胞未产生浓度依赖性曲线。初始的CD4+或CD8+细胞没有产生完整的曲线；然而，在0.1μg/mL至100μg/mL范围内观察到浓度依赖性增加。
CD4+FITC MFI的中值(范围)EC50值为1.04μg/mL(0.628至1.31μg/mL) 和和CD8+FITC MFI的中值(范围)EC50值0.652μg/mL(0.27至0.74μg/mL)。 CD4+IgGκ轻链FITC阳性百分比的中值(范围)EC50值为0.834μg/mL(0.45- 0.965μg/mL)，CD8+IgGκ轻链FITC百分比的中值(范围)EC50值为0.583 μg/mL(0.371-1.23μg/mL)(表10)。
表10：422H2L5 hIgG4PE对活化的人T细胞的结合EC50值的总结
Figure GDA0003245324200000871
Figure GDA0003245324200000881
讨论
本研究表明，H2L5 hIgG4PE(抗-ICOS激动剂抗体)与来自健康人类供体的活化T细胞上的ICOS受体结合。使用抗用FITC标记的人IgGκ轻链的抗体检测了与T细胞的细胞表面结合的H2L5 hIgG4PE。
通过流式细胞测量术，使用抗-CD3 Pe-Cy7染色证实CD3+T细胞的成功分离。10位供体中有9位在分离后产生大于89％的CD3+T细胞。然而，供体#2100M39在分离后只有68.6％的CD3+。供体#2100M39中的T细胞分离纯度降低的原因尚不清楚。从来自供体#2100M39的圈选的CD4+和 CD8+群体产生的EC50值并不是异常的，并且被纳入在所总结的中值中。
在阴性分离的人T细胞中测定H2L5 hIgG4PE的结合EC 50。当将分离的T细胞于1μg/mL的与平板结合的CD3/CD28抗体中暴露48小时，产生结合曲线。在统计学分析中考虑了来自活化的CD4+和CD8+T细胞的IgGκ轻链FITC阳性细胞百分比和FITC MFI数据。当计算为FITC阳性细胞百分比或FITC MFI时，中值CD4+EC50值相似，分别为1.04μg/mL和0.834μ g/mL。当计算为FITC阳性细胞百分比或FITC MFI时，中值CD8+EC50值也相似，分别为0.652μg/mL和0.583μg/mL。
无论使用何种分析方法，MFI还是阳性细胞百分比，与IgG4 PE同型对照一起孵育的T细胞都不会使得抗人IgGκ轻链FITC结合产生浓度依赖性增加。
在0.00128至100μg/mL的H2L5 hIgG4PE测试范围内，无法从初始或未活化的、阴性分离的T细胞获得完整曲线。然而，对于0.1至100μg/mL H2L5hIgG4PE，在供体中观察到结合的浓度依赖性增加。无法计算EC50，因为初始T细胞的曲线不完整。预期H2L5 hIgG4PE不能以低浓度结合到初始或未活化的细胞，因为ICOS仅在休止的Th17、T滤泡性辅助(TFH)和调节性T(Treg)细胞上微弱表达。需要TCR接合和活化来诱导ICOS表达。因此，在初始或未活化的细胞上表达的ICOS受体会很少，因此H2L5 hIgG4PE 的结合极低。
实施例8：食蟹猴剂量范围搜寻(DRF)研究的TK/PD结果
为了获得H2L5 hIgG4PE在目标相关物种中的体内特征，在食蟹猴中进行了剂量范围搜寻的研究。除了媒介物对照组之外，该研究测试了3种剂量水平(0.3mg/kg、3mg/kg和30mg/kg)。其为重复剂量，在第一次给药14天后进行第二次给药。每组测试一只雄性和一只雌性。H2L5 hIgG4PE在所测试的3种不同剂量下表现出剂量依赖性增加的Cmax(μg/mL)和AUC(μg.h/mL)。在所有三个剂量水平下，在第一次给药后两周在血浆中检测到抗体(图12A)。在单一剂量的猴子中的3只中检测到抗-H2L5hIgG4PE抗体，两只是以0.3mg/kg给药的动物，以及以3mg/kg给药的雌性。抗-H2L5 hIgG4PE抗体与这些动物在第二次给药后血浆浓度的降低相关(图12B)。第二次给药后48小时，处死所有动物以收集组织用于分析药效学和组织病理学分析。
在来自所研究的所有动物的脾脏和腋窝淋巴结的CD4+T细胞中测量 H2L5hIgG4PE受体占用率(RO)。在这两种组织中，观察到在所测试的所有剂量水平，H2L5hIgG4PE结合以剂量依赖性方式增加(图13)。
也在所研究的猴子的外周血的CD4+T细胞上测量受体占用率。在5个时间点(第1天(给药前)、第3天、第8天、第15天(第2次给药前)和第17 天)抽血。在该测定中使用两种不同的测量方法来确定RO。第一种是“游离受体”测定形式，其中在存在或不存在H2L5 hIgG4PE的情况下，测定用于流式细胞测量术检测的抗-ICOS mAb的结合，显示H2L5 hIgG4PE竞争ICOS 结合。因此，根据FACS，不存在抗-ICOS信号意味着H2L5 hIgG54PE占据受体的代用物，相反，抗-ICOS阳性表明不与H2L5 hIgG4PE结合的“游离受体”。图14-A显示ICOS游离受体以剂量依赖性和时间依赖性降低。两只猴子(250和300)表现出无法解释的“游离受体”信号，这可以是由于在这些猴子中产生了抗-H2L5 hIgG4PE抗体。此外，还通过与上述脾脏和淋巴结中相同的测定法在外周血CD4+细胞中测量RO。如预期的那样，通过该读取， 0mg/kg剂量显示无RO(图14-B)。有趣的是，在处理时间内，一些在3.0mg/kg 和30mg/kg剂量水平的猴子显示H2L5 hIgG4PE结合的CD4+细胞数量的时间依赖性增加。特别地，动物350在第3至17天之间显示出药物结合的循环CD4+细胞的增加(>5倍)(图14-B)。CD4+ICOS+细胞数量的增加可能是由于H2L5 hIgG4PE诱导的该群体的增殖。
实施例9:在应答结合试验制备中H2L5 hIgG4PE诱导细胞内信号传导的改变。
实验准备
细胞系
Ba/F3-ICOS细胞获自INSERM(Paris，France)。在37℃、在5％CO2的湿化培养箱中，将细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)、10ng/mL重组鼠IL-3(R&D Systems，Minneapolis，MN))和1mg/mL 遗传霉素(ThermoFisher，Waltham，MA)的合适的培养基中进行培养。
实验方案
细胞内信号传导抗体阵列
根据制造商的说明书，用
Figure GDA0003245324200000901
细胞内信号阵列试剂盒(Cell SignalingTechnologies)测定蛋白质裂解物。简言之，将用IgG4-PE(20μg/mL) 或H2L5 hIgG4PE(0.2μg/mL、2μg/mL或20μg/mL)处理了1、6、24和48小时的Ba/F3-ICOS细胞的裂解物在阵列稀释缓冲液中稀释至1μg/μL，并在4℃在抗体阵列上孵育过夜。使用Odyssey成像软件(LI-CORBiosciences，Lincoln， NE)捕获阵列的图像。
磷酸-AKT酶联免疫吸附测定(ELISA)
根据制造商的说明书，使用Meso Scale Discovery(MSD)磷酸(Ser473)/总 Akt全细胞裂解物试剂盒和磷酸-AKT(Thr308)全细胞裂解物试剂盒测定AKT 的磷酸化。将细胞以0.25×106细胞/孔的细胞密度接种在于合适的培养基 (100μL/孔)中的96孔U底板(BDFalcon)上。在一式两份的孔中，使用3倍稀释方案，在7种不同浓度下(剂量范围：20.0-0.03μg/mL)，使用对照抗体 (IgG4PE)、抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗体或H2L5 hIgG4PE将细胞处理1、2、 4、6小时或48小时。对于使用磷酸-AKT(Thr308)全细胞裂解物试剂盒的一个实验，用一个浓度(10μg/mL)的全部三份抗体在一式三份的孔中处理细胞。每个96孔板的底列含有无细胞对照(两个空白的重复孔)，其中的细胞未用任何抗体处理。处理后，将细胞用30μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液裂解，在冰上孵育30分钟，然后将25μL裂解物转移到ELISA板中，在4℃孵育过夜。
数据分析
细胞内信号传导抗体阵列的密度测定法分析
进行密度测定分析以计算抗体阵列上斑点的积分强度水平。每个斑点的强度相对于为阵列上阳性对照的平均值进行归一化(公式＝样品孔/阳性对照的平均值)，并使用GraphPad Prism 6.0(La Jolla，CA)进行绘制。
分析MSD ELISA数据
使用以下算式来计算每个孔的磷酸蛋白百分比：磷酸蛋白％＝((2×磷酸化信号)/(磷酸信号+总蛋白信号))×100。然后将该值相对于在每个时间点未处理的细胞值进行归一化，该细胞值在Microsoft Excel 2007中绘制为“对照％”。
结果
先前的研究表明，H2L5 hIgG4PE处理在Ba/F3-ICOS细胞中增加了磷酸 -AKT(S473)水平，其中在抗体暴露后30-40分钟观察到最大反应。这里，在稍后的时间点测量磷酸-AKT水平，以观察几天后是否增加的磷酸化水平持续。另外，评估了通过ICOS活化调节的其他细胞内信号传导事件。在Ba/F3- ICOS细胞中，与IgG4-PE同型对照抗体处理的细胞相比，在处理1小时和 6小时后，H2L5 hIgG4PE处理的磷酸-AKT(S473)水平升高，但该效果在24 小时后失效(图15)。有趣的是，当用抗体的Fc区失活的抗-ICOS抗体处理细胞时，观察到类似的效果。与IgG4-PE(图15)同型对照抗体处理的细胞相比，在处理1小时后，在H2L5hIgG4PE和抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗体处理的细胞中也观察到磷酸-AKT(T308)水平有所增加，且持续至48小时(最后一次测量点)。AKT下游的另外两个磷酸化蛋白，即糖原合酶激酶3α(GSK3α) 和核糖体蛋白S6也在ICOS活化时略有增加，但是该效果不如在磷酸-AKT 中观察到的强烈。还使用测量参与细胞内信号传导的18种蛋白质的磷酸化或裂解的抗体阵列分析蛋白质裂解物。使用这种方法，只有三种蛋白质显示磷酸化在ICOS活化时有轻微的增加：磷酸-AKT(S473)，磷酸S6(S235/236) 和磷酸SAPK/JNK(T183/Y185)。
为了使用允许直接定量的测定形式测量AKT磷酸化的变化，用一定剂量范围内的对照抗体(IgG4 PE)、抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗体或H2L5 hIgG4PE随时间处理Ba/F3-ICOS细胞，并通过ELISA进行监测。在抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗体处理的细胞或H2L5 hIgG4PE处理的细胞中，磷酸- AKT(S473)水平增加是剂量依赖性和时间依赖性的。如先前观察到的，在处理1小时后发生最大的磷酸-AKT(S473)活化。磷酸化信号在2小时后略微下降，持续6小时，但最终在24小时后消失。此外还测试了测量磷酸-AKT(T308) 水平的ELISA，但是使用该ELISA试剂盒不能观察到可再现的活化。
讨论
可以通过受体酪氨酸激酶、整联蛋白、B细胞受体和T细胞受体、细胞因子受体、G蛋白偶联受体和其他通过PI3K诱导磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸 (PIP3)产生的刺激来活化AKT信号传导级联[Carnero，2008]。这些脂质起到Akt及其上游激活物PDK1的质膜对接位点的作用。在膜上，PDK1在 Thr308磷酸化AKT，导致Akt的部分活化[Alessi，1996]。通过mTORC2在 Ser473处磷酸化Akt，刺激了完全的酶促活性[Sarbassov，2005]。
ICOS通过促进T细胞的存活、增殖和记忆，在活化的效应子和调节性 CD4+T细胞的功能中起到重要作用。由于其在维持T细胞活化和效应子功能中的作用，用激动剂抗体靶向ICOS可以是提高抗肿瘤免疫力的合理方法。在本研究中，我们观察到H2L5 hIgG4PE对ICOS的活化引起Ba/F3-ICOS细胞中AKT磷酸化的变化。随后，AKT下游的蛋白质，如GSK3α(AKT的直接底物)和核糖体蛋白S6也被磷酸化。该数据与最近在该模型系统中进行的研究成果一致，并且与外界公开的数据一致[Fos，2008]。
实施例10：单独的可溶性H2L5 hIgG4PE和其与抗-PD1及抗-CTLA-4抗体的组合在 人PBMC测定中的功能性效果
实验准备
初代人PBMC的分离
从GSK Health Center献血者获得新鲜血液，并用无酚红-10％RPMI 1640 培养基进行1:1稀释。在Uni-Sep Max 50ml锥形管中将稀释的血液层加在密度培养基的顶部，并在室温下以400rpm间歇离心20分钟。通过100μM 细胞过滤器，将所得到的白色单核层(血沉棕黄层)小心地提取到新的50mL 锥形管中。将等体积的无酚红的-10％RPMI 1640培养基加入到血沉棕黄层中，并在室温下以300xg离心10分钟。将细胞沉淀重新悬于10ml红细胞裂解溶液(Sigma Aldrich)中，并在室温下孵育5分钟。细胞用培养基洗涤一次，且如前所述离心。用无酚红-10％RPMI 1640培养基将体积调至40ml，使用 Vicell细胞计数器和成活力分析仪(Beckman Coulter)对细胞进行计数。
单核细胞衍生的不成熟树突状细胞(iDC)的诱导
使用塑料附着法分离人单核细胞。简言之，将2000万新鲜分离的PBMC 在T-75组织培养烧瓶中在AIM-V培养基(Thermo Fisher)中培养3小时。洗涤未结合至塑料的细胞。在37℃、5％CO2培养箱中，将粘附的单核细胞在补充有1000U/ml的人GM-CSF(Calt#300-03，PeproTech)和500U/ml的人 IL-4(cat#200-04)的AIM-V培养基中培养。7-10天后，收集iDC细胞，以用于与来自不同供体的T细胞在同种异体混合型淋巴细胞反应测试中进行共培养。
直接从血液分离初代人T细胞
使用人T细胞富集混合物(Stem Cell Technologies)直接从新鲜人血中分离人T细胞。将RosetteSep人T细胞富集混合物(50μL/mL)加入到全血中并充分混合。在室温下孵育20分钟后，加入等体积的PBS+2％FBS，轻轻搅拌。将稀释的样品层加在密度培养基的顶部，并在室温下以1200×g不中断离心20分钟。将来自密度培养基:血浆界面的富集的细胞小心倒入新的锥形管中。接下来，将红细胞用红血球裂解缓冲液(Sigma Aldrich)裂解，将富集的细胞用PBS+2％FBS洗涤两次。然后将T细胞重悬于40ml PBS+2％FBS 中，并用Vi-Cell细胞计数器进行计数。
实验方案
人PBMC的预刺激分析
在37℃，在T-75组织培养烧瓶中在补充有100ng/ml MCSF和100IU/ml 的IL-2(PeproTech)的AIM-V培养基中，将新鲜分离的人PBMC用CD3/CD28 T细胞扩增DynaBeads以1:20的珠粒：细胞比进行预刺激。48小时后，通过磁性去除预刺激珠粒，并对细胞进行洗涤、计数，并在被非组织培养基处理的96孔圆底板中在补充有100IU/ml IL-2(PeproTech)的AIM-V培养基中用抗-CD3 DynaBeads和治疗性抗体进行再刺激。接种密度为每孔每100μl培养基中100k细胞。在37℃下培养3.5天后，收集细胞培养物的上清液，以通过MSD进行多重细胞因子测定。
人MLR活化测定
将来自健康人类志愿者的单核细胞衍生的iDC与来自不同供体的新鲜分离的人T细胞以1:10比例(iDC:T)混合，并在37℃在AIM-V培养基中，在0.02μg/ml CEFT肽混合物的存在下预培养24小时。将不同组的处理抗体直接加入到孔中，混合并进一步孵育4天。收集细胞培养上清液，从而通过MSD分析进行多重细胞因子测定。
MSD细胞因子分析
使用MSD人V-重定制试剂盒测定组织培养上清液中的IFN-γ、IL-10、IL-2和TNF-α细胞因子水平。样品首先在Diluent 2中以1:200稀释。还按照制造商的建议在Diluent 2中制备校准物。将稀释的样品和校准物加入到黑色MSD板中，随后用粘着封带密封并在室温下振荡孵育2小时。向每个孔中加入25μl的检测抗体溶液(在Diluent 2中新鲜制备)后，将板重新密封，并在室温下再振荡培养2小时。将板用150μL/孔的PBS加0.05％Tween-20 洗涤3次，然后加入150μl/孔的新鲜稀释的2x读取缓冲液，并立即在MESO QuickPlex读数器上读数。使用MSD Workbench软件分析数据。
数据分析
MSD数据分析
使用Discovery Workbench软件(MSD，4.0.9)分析MSD数据。在每个 MSD板上都包含制造商试剂盒中的校准物，以产生所有情况下R2值超过 0.99的板特异性标准曲线。根据标准曲线对检测到的细胞因子的量进行回推，使用来自三个重复生物实验的平均值和标准偏差来绘图。
统计分析
对经对数转化、相对于每个处理抗体自身的同型对照进行倍数变化的数据进行单因素ANOVA。进行Dunnett的多重比较检测以在不同供体之间比较单一疗法与组合疗法。P<0.05被认为是统计学显著的。
结果
用于H2L5 hIgG4PE与依匹木单抗和派姆单抗的组合活性的PBMC预刺激分析开发及测试
为了确定预刺激的最佳条件，以不同的珠粒：细胞比测试人抗-CD3 Dynabead和抗-CD3/CD28 Dynabead(Thermo Fisher)。在预刺激48小时后，收获细胞并通过磁性除去珠粒，然后用抗-CD3 Dynabead(珠粒：细胞比＝1:1) 与抗-ICOS抗体一起刺激，它们单独或与抗-CTLA-4或抗-PD1组合。在所有所测试的预刺激条件下，与同型对照相比，H2L5 hIgG4PE单剂处理导致IFN- γ的诱导。H2L5 hIgG4PE诱导的IFN-γ的幅度与预刺激的强度呈负相关。在经微弱预刺激的PBMC中，与单独使用H2L5 hIgG4PE或依匹木单抗相比，与依匹木单抗联合使用的H2L5 hIgG4PE显示了增强的细胞因子产生。在与板结合的抗-CD3/抗-CD28预刺激条件下，组合效应消失，这被认为是更强的预刺激条件。基于这些结果，在所有未来的PBMC测定中选择使用抗 -CD3/抗-CD28珠子作为预刺激条件，其中珠粒：细胞比为1:20。图16中总结了抗-CTLA-4组合的四个单独供体的结果，图17中总结了抗-PD-1组合的结果。
H2L5 hIgG4PE在PBMC预刺激分析中导致剂量依赖性的细胞因子诱导
在用抗-CD3/抗-CD28珠粒预刺激(预定的珠粒：细胞比为1:20)的人 PBMC中，评估了H2L5 hIgG4PE的剂量依赖性活性。作为对照，包括了抗 -RSV IgG4PE和Fc失能型抗-ICOS422.2IgG1。测试了八种浓度的H2L5 hIgG4PE(100μg/ml、30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、 0.1μg/ml和0.03μg/ml)。在PBMC样品的组织培养上清液中，通过MSD评估IFN-γ、IL-10和TNF-α。H2L5 hIgG4PE(而不是同型对照的IgG4或Fc 失能型422.2)以剂量依赖的方式诱导IFN-γ、IL-10和TNF-α产生。这些结果用于确定组合研究中使用的H2L5hIgG4PE的浓度。
人MLR测定开发
为了优化人MLR测定，除了将人T细胞和来自不同供体的单核细胞衍生的未成熟DC的共培养之外，还将抗-CD3珠粒加入孔中以提供基础TCR 刺激，从而有助于为细胞做准备。结果表明，抗-CD3珠粒大大增加了IFN- γ诱导的范围。尽管依匹木单抗单独可以在不存在抗-CD3珠子的情况下诱导IFN-γ产生，但单独的H2L5 hIgG4PE或H2L5 hIgG4PE/依匹木单抗组合仅在存在抗-CD3珠粒的情况下，才显示出相比于相应对照增强的IFN-γ产生。
H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗在人MLR测定中的组合活性
在同种异体人MLR测定中测试了H2L5 hIgG4PE单独或与依匹木单抗组合的免疫刺激活性，其中T细胞与来自不匹配供体的单核细胞衍生的未成熟DC在0.02μg/ml CEFT肽的存在下预孵育1天。与任一种单独的试剂相比，H2L5 hIgG4PE/依匹木单抗的组合导致IFN-γ的产生显著增强。结果在测试的三个供体对中是一致的；然而，在供体之间观察到适当的差异(图18)。
H2L5 hIgG4PE和派姆单抗在人MLR测定中的组合活性
还在上述人同种异体MLR测定中测试了H2L5hIgG4PE和派姆单抗的组合。以10μg/ml单独测试H2L5 hIgG4PE以及与派姆单抗组合测试。与任一种单独试剂相比，H2L5hIgG4PE和派姆单抗的组合导致IFN-γ增加。然而，由于供体变异性较高，且部分供体中单-试剂处理抗-PD-1具有显著活性，因此未达到统计学意义(图19)。
讨论
ICOS是一种共刺激受体，在初始T细胞上弱表达，并在活化的CD4+ 和CD8+T细胞中迅速上调。ICOS的配体是ICOS-L(B7h，B7RP-1，CD275)，其由专门的APC表达和在TNF-α刺激后由外周上皮细胞和内皮细胞表达。 ICOS:ICOS-L途径为T细胞增殖和功能提供了关键的共刺激信号。由于其在维持T细胞活化和效应子功能中的作用，通过激动剂抗体靶向ICOS可以是增强抗肿瘤免疫力的合理方法。
在几种癌症模型中，研究显示在依匹木单抗阻断CTLA-4后，ICOShi CD4+效应子T细胞的频率增加。另外，CTLA-4阻断后，该细胞群比ICOSlo CD4+T细胞产生更高的INF-γ水平。事实上，ICOS+CD4 T细胞频率的增加已被确定为依匹木单抗治疗癌症患者的药效学生物标志物。在野生型 C57BL/6小鼠中的研究证明，CTLA-4阻断疗法后有80-90％肿瘤排斥；然而，在ICOS或ICOSL敲除的小鼠中，效力降低到小于50％。ICOS在CLTA- 4阻断的有效性中发挥的重要作用，这表明，在抗-CTLA-4治疗期间刺激 ICOS途径可以提高治疗效果。因此，我们开始评估H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗的组合活性。
2000年报告的程序性细胞死亡-1(PD-1)是另一种免疫检查点分子。PD- 1(B7-H1)(PD-1配体之一)的表达，可以在包括T细胞、上皮细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等许多细胞类型中发现。靶向PD-1/PD-L1轴的抗体也在多种肿瘤类型中显示出临床反应。FDA最近批准了派姆单抗和纳武单抗作为第二代免疫检查点阻滞剂以治疗癌症。Merck的派姆单抗显示在晚期黑素瘤患者中的应答率达到～37％至38％，随后的研究报告了在先用依匹木单抗治疗后患有进行性疾病的患者的整体应答率为26％。纳武单抗，来自BMS的抗-PD- 1抗体，也在转移性黑素瘤患者中显示临床益处，应答率为40％，1年时的总体生存率为72.9％。此外，纳武单抗也被FDA批准用于晚期或转移性非小细胞肺癌。由于PD-1检查点阻断抗体成为临床上主要的癌症免疫治疗，因此评估H2L5 hIgG4PE与抗-PD-1抗体组合的组合抗肿瘤活性是非常重要的。
先前开发了PBMC活化测定法，并用于评价一组抗-ICOS激动剂抗体的 T细胞刺激活性。从这些研究中产生的数据支持候选选择具有IgG4PE同型的422.2克隆H2L5 hIgG4PE。在之前的测定中，PBMC细胞用1μg/ml的与板结合的抗-CD3抗体和3μg/ml的抗-CD28抗体预刺激48小时，然后收获并用抗-CD3和所研究的可溶性ICOS抗体再刺激。H2L5 hIgG4PE显示以剂量依赖的方式诱导IFN-γ产生。为了确定预刺激的最佳条件，以不同的珠粒：细胞比测试人抗-CD3 Dynabead和抗-CD3/CD28 Dynabead(Thermo Fisher)。认为珠粒的刺激是更生理的，并且可以通过构建不同的珠粒：细胞比来更容易地控制刺激的强度。在预刺激48小时后，收获细胞并通过磁性去除珠粒，然后用抗-CD3 Dynabead(珠粒：细胞比＝1:1)携同抗-ICOS抗体进行刺激，它们单独或与抗-CTLA-4组合。结果表明，在所有测试的预刺激条件下，相对于同型对照，H2L5 hIgG4PE单剂处理均能产生IFN-γ诱导。H2L5 hIgG4PE 诱导的IFN-γ的幅度与预刺激的强度呈负相关。与单独的H2L5 hIgG4PE或单独的依匹木单抗相比，与依匹木单抗联合使用的H2L5 hIgG4PE在微弱预刺激的PBMC中，表现出增强的细胞因子产生。在与板结合的抗-CD3/抗- CD28预刺激条件下(被认为是更强的预刺激条件)，组合效应消失。基于这些结果，对于所有未来的PBMC测定，选择使用珠粒：细胞比为1:20的抗-CD3/抗-CD28作为预刺激条件。与任一种抗体单独处理相比，H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗组合显示IFN-γ产生的统计学显著增加。
在对测定进行优化时，将抗-CD3/抗-CD28刺激的珠粒：细胞比固定为 1:20，使在再刺激步骤期间使用的抗-CD3珠粒从珠粒：细胞比1:1下调至1:3 和1:10。结果表明，再刺激强度越低，由H2L5 hIgG4PE产生的IFN-γ诱导越下降。H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗的组合效应在珠粒：细胞比为1:3和 1:10的再刺激下完全消失。因此，对于所有未来的实验，保持再刺激抗-CD3 的珠粒：细胞比为1:1。
随着预刺激和再刺激条件的优化，该测定用于评估H2L5 hIgG4PE的剂量反应。测试了总共8种抗体浓度，分别为100μg/ml、30μg/ml、10μg/ml、 3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml和0.03μg/ml。将抗-RSV IgG4PE 和Fc失能型抗-ICOS 422.2IgG1(H2L5 hIgG4PE的Fc失能型版本)作为对照。结果表明，H2L5 hIgG4PE(而不是同型对照IgG4或Fc失能型422.2)，以剂量依赖的方式诱导IFN-γ、IL-10和TNF-α的产生。有趣的是，Fc失能型版本的H2L5 hIgG4PE表现出有限的细胞因子诱导反应，表明Fc受体接合对H2L5 hIgG4PE的T细胞激动功能至关重要。这些结果也用于确定 H2L5 hIgG4PE的剂量以用于组合研究。
还开发了混合淋巴细胞反应(MLR)测定来评估H2L5 hIgG4PE和检查点阻断抗体的组合效应。MLR测定是一种离体细胞免疫测定法，其中将衍生自初代单核细胞的未成熟树突状细胞(iDC)与从不同供体分离的T细胞混合。 iDC细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子的失配可以在同种异体环境中引起T细胞刺激。在临床上，MLR测定众所周知用于鉴定供体和受体之间组织移植的相容性。
为了开发MLR测定，将新鲜的人单核细胞在补充有人重组GM-CSF和 IL-4的培养基中培养一周，以诱导未成熟的DC表型。然后从不同供体分离新鲜人T细胞，并以10:1比例(T:iDC)与iDC细胞混合。在存在或不存在抗 -CD3珠粒的情况下，将H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗的单一疗法或组合疗法加入到T细胞/iDC共培养物中。抗-CD3珠粒的目的是提供基础TCR刺激来帮助准备T细胞。结果显示，抗-CD3珠粒在测定中大大增加了IFN-γ诱导的范围。尽管依匹木单抗单独可以在不存在抗-CD3珠粒的情况下诱导 IFN-γ产生，但单独的H2L5hIgG4PE或H2L5 hIgG4PE/依匹木单抗组合在抗-CD3珠粒的存在下相对于相应的对照显示出增强的IFN-γ产生。该结果表明，在该测定中，仅通过DC细胞的TCR刺激会不足以在从PBMC中新鲜分离的休止T细胞的表面上诱导ICOS表达。为了改善这种情况，在添加治疗性抗体之前，增加使iDC和T细胞预培养24小时的步骤。还将CEFT 肽混合物加入到测定过程中，以更好地准备T细胞并引发抗原特异性应反应。CEFT肽库由27种肽组成，其选自：来自从人巨细胞病毒(HHV-5；CMV)、 Epstein-Barr病毒(HHV-4；EBV)、甲型流感病毒和破伤风梭菌的确定的HLA I型和II型限制性T细胞表位。考虑到在一般族群中针对流感病毒和破伤风梭菌的疫苗接种率高以及CMV和EBV的发病率高，对大多数人体样品来说，预计是召回抗原反应。结果表明，当T细胞与iDC细胞预培养24小时时，观察到IFN-γ的产生增加，并且当将CEFT肽加入共培养系统时，IFN- γ的产生进一步增加。在同种异体人MLR测定中测试了单独的H2L5 hIgG4PE或与依匹木单抗的组合的免疫刺激活性，其中在0.02μg/ml CEFT 肽的存在下，将T细胞与来自不匹配的供体的单核细胞来源的未成熟DC一起预孵育1天。与单独的任一种试剂相比，H2L5 hIgG4PE/依匹木单抗的组合导致IFN-γ产生的显著增强。结果在测试的三个供体对中是一致的；然而，在供体之间观察到适度的差异。
类似地，还在上述同种异体人MLR测定中测试了H2L5 hIgG4PE和派姆单抗的组合。以10μg/ml测试了单独的H2L5 hIgG4PE以及其与派姆单抗的组合。与单独的任一种药物相比，H2L5 hIgG4PE和派姆单抗的组合导致 IFN-γ增加。然而，由于供体变异性高，且单剂抗-PD-1治疗在一些供体中具有显著的活性，因此未达到统计学意义。
总之，这些研究表明，在两种基于人类免疫细胞的测定中，与单一疗法相比，H2L5hIgG4PE与两种经FDA批准的检查点抑制剂-依匹木单抗和派姆单抗具有优异的组合活性。在这里报道的研究中，H2L5 hIgG4PE显示促进了T细胞活化以及TH1偏差(例如IFN-γ产生)，其为产生性抗肿瘤免疫应答的特征。
实施例11：单独的H2L5 hIgG4PE以及与抗-PD1和抗-CTLA-4抗体的组合的体内功 能性活性
人PBMC小鼠肿瘤模型
方法
实验准备
在开始研究方案之前，所有关于动物的操作是经过GSK动物试验保护与使用委员会审查并批准的。
准备细胞系：
根据ATCC方案增殖A2058。
材料：
·A2058人黑素瘤细胞系：ATCC,Cat#CRL-11147,lot#59349362
·DPBS:ATCC,Cat#30-2200,Lot#63357436
·达尔伯克改良伊格尔培养基：ATCC,Cat#30-2002,Lot# 62596471到期：2015年10月
·胎牛血清：Sigma-Aldrich,Cat#12176c-1000ml,lot #13G180R0H1,到期：2018年7月
·0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA：ATCC,Cat#30-2102, Lot#62420300
·抗生素-抗真菌剂(100X)：Life Technologies,Cat#15240-062
·T175细胞培养烧瓶：Greiner bio-one,Cat#661175
·T75细胞培养烧瓶：Greiner bio-one,Cat#658175
培养基：
·A2058完全生长培养基：达尔伯克改良伊格尔培养基+10％ FBS。培养条件：大气：空气，95％；5％二氧化碳(CO2)；温度：37℃
·在收到细胞后：
·在37℃预温热完全培养基。
·在37℃水浴中快速解冻细胞。用70％乙醇擦拭管，并将细胞转移至填充有经预温热的完全培养基的15mL管中。
·以1200rpm离心5分钟以收集细胞沉淀。
·将细胞加回填充有经预温热的完全培养基的T75烧瓶中，并在 37℃培养。
细胞的继代培养
·根据75cm2烧瓶决定体积(对于T175 cm2烧瓶，依比例需要调整解离和培养基的量)。
·去除并弃去培养基。
·用DPBS简单冲洗细胞层，以除去含有胰蛋白酶抑制剂的所有痕量血清。
·向烧瓶添加2.0至3.0mL的胰蛋白酶-EDTA溶液，并在倒立式显微镜下观察细胞直到细胞层消散(2-3分钟)。
·注意：为了避免成块，不要通过碰撞或摇动烧瓶来搅动细胞，而是静置直到细胞脱离。难以脱离的细胞可被置于37℃以促进消散。
·添加10mL的完全生长培养基，并通过轻轻抽吸搅动(aspirate) 细胞。
·以1200rpm离心5分钟以收集细胞沉淀，添加10mL的完全生长培养基。
·向新的培养容器中添加适当等份的细胞悬浮液。在37℃培育培养物。
·培养基换新：每2-3天一次
准备用于小鼠接种的肿瘤细胞：
·用1X DPBS洗涤细胞，添加3ml 1X胰蛋白酶，历时2-3分钟。
·添加完全生长培养基，并在组织培养箱中在无菌锥形离心管中收集细胞悬浮液。
·以1200rpm离心细胞5分钟以收集细胞沉淀。
·用1X DPBS溶液洗涤细胞，以1200rpm离心5分钟以获得细胞沉淀。重复洗涤两次。
·通过血球计数器计数细胞以获得数量和成活力。
·以用于体内接种的浓度将细胞重悬于冰冷的PBS中(A2058, 2.5e7/ml,2.5e6/100μl/小鼠)。
向NSG小鼠接种肿瘤细胞系
材料：
·小鼠：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ。The Jackson Laboratory库存号：005557雌性，年龄：6周。
·1mL结核菌素注射器加上附接针头25G 5/8：Becton Dickinson, Cat#305554
·PDITM酒精片：专业一次性，Cat#B339
·PDITM碘酒片：专业一次性，
·Cat#B40600
·准备小鼠
·小鼠应为6周大。
·在小鼠抵达后允许有3-5天的适应期。
·在右后肋将小鼠剃毛。
准备注射
·使用碘酒片、接着用酒精片将小鼠接种区进行清洁和杀菌。
·使用1-cc注射器和25-号针头。
·拔出塞柱，混合细胞，并向注射器后部加入100μl细胞，小心插入塞柱。
·将细胞皮下注射(s.c.)到小鼠的右后肋中。
·评估肿瘤生长
·为了测量肿瘤，用70％酒精润湿皮毛以便容易找出肿瘤边缘。每2-3天测量一次肿瘤大小和体重。
·用数位卡尺测量肿瘤大小，并如下确定体积：肿瘤体积(mm3) ＝(长度)×(宽度)2/2
·人PBMC静脉内施用
·人PBMC施用可在肿瘤达到约100mm3的平均体积后1周开始。
材料：
·新鲜人PBMC：Allcells,cat#C-PB102-3B2
·1mL结核菌素注射器加上附接的针头25G 5/8：Becton Dickinson,Cat#305554
·PDITM酒精片：专业一次性，Cat#B339
·PDITM碘酒片：专业一次性，Cat#B40600
·纱布棉拭：Covidien,cat#441211
·鼠尾照明限位器：Braintree scientific,cat#MTI STD
·PBMC制备
·新鲜人PBMC通过隔夜递送由Allcells购买。
·以1400rpm离心细胞5分钟以获得细胞沉淀。
·用1X DPBS溶液洗涤细胞，以1400rpm离心5分钟以获得细胞沉淀。
·以用于体内注射的浓度(20e7/ml)将细胞重悬于冰冷的PBS中。
·使用1-cc注射器和25-号针头。
·拔出塞柱，混合细胞，并向注射器后部加入100μl细胞，小心插入塞柱。
·将细胞保持在冰上。
·尾静脉注射。
·用白炽灯泡温热小鼠5分钟。
·用尾照明限位器限制小鼠。
·将尾巴略微旋转至可看见静脉。
·用碘酒片接着用酒精片对注射位点进行清洁和杀菌。
·以小角度将针头插入静脉中，并注射细胞。
·移出针头并用纱布棉拭轻微压迫直到停止出血。
·使动物返回笼子并观察5-10分钟以确保没有继续出血。
治疗性抗体的施用
·注射人PBMC后1-3天，通过腹膜内注射向小鼠施用抗体。
材料：
·完全人IgG1同型对照：Eureka therapeutics，cat#ET-901(临床前级别)Lot#15-726到期：2017年2月
·依匹木单抗(Yervoy)：Bristol-Myers Squibb NDC 0003-2327-11, lot#921873到期：2015年4月；lot#4H69490，到期：2016年5月
·完全人IgG4同型对照：Eureka therapeutics，cat#ET-904(临床前级别)Lot#15-726到期：2017年2月
·抗人ICOS H2L5 hIgG4PE
·派姆单抗(Keytruda):Merck,NDC 0006-3026-02,lot#L010592, 到期：2016年4月26日
·腹膜内注射：
·将待施用的100μl抽至注射器和针头中。
·使针头斜面与注射器上的数字对准。
·通过非惯用手使动物充分限位。
·针头插入点：沿着刚过膝盖上方的腹部绘制假想线，针头沿着动物右侧的这条线并在靠近中线处插入。由于为雌性，你可以看到插入点在最后一个乳头的前方并在稍微内侧。
·将小鼠头部轻轻地朝向地面倾斜，使其头部低于其后端。
·以约30度的角度将针头插入腹部。
·针头轴应进入约0.5厘米的深度。
·注射后，拔出针头并使小鼠返回笼子。
·血液与肿瘤的取样
·材料：
·Microvette CB300(血清)：Braintree Scientific,Cat#MV- CB300 16440
·Microvette CB300(血液学/EDTA钾)：Braintree Scientific， Cat#MV-CB300 16444
·血液：
·一周对小鼠进行一次尾静脉采血。
·在Microvette CB300(血液学/EDTA钾)中收集30μl的血液以用于流式细胞测量术分析。
·在血清Microvette CB300中收集另外30μl血液，并在室温下孵育2小时以使其凝结，然后以2000xg离心以收集血清。将血清储存在-20℃直至进一步分析。
肿瘤：
·当肿瘤大小达到2000mm3时，将小鼠安乐死。收集肿瘤并按以下步骤进行处理。
实验设计
根据以上所列的过程准备所有研究。
H2L5 hIgG4PE剂量反应
本研究旨在确定H2L5 hIgG4PE在植入了A2058黑素瘤肿瘤的NSG小鼠中的剂量依赖性活性，该小鼠被移植了人PBMC。在每个研究中，分配9 组(每组10只小鼠)以及1个对照组(7只小鼠，仅有肿瘤无PBMC)。表11中总结了使用了来自供体#7129的人PBMC的剂量反应治疗方案。H2L5 hIgG4PE以0.04、0.4、1.2和4mg/kg给药。依匹木单抗以3mg/kg给药，并以1mg/kg测试抗-ICOS激动剂的Fc失能型变体。相对于媒介物和匹配的同型对照组评估测试组。在研究结束时的第49天进行生存力分析。
表11：在小鼠中H2L5 hIgG4PE剂量反应的治疗方案总结
Figure GDA0003245324200001051
Figure GDA0003245324200001061
使用H2L5 hIgG4PE与依匹木单抗和派姆单抗的组合的效力及药效学(PD)活性研 究
研究对象：
评估以0.04mg/kg和0.4mg/kg给药的H2L5 hIgG4PE单一疗法的抗肿瘤活性。
评估与依匹木单抗或派姆单抗组合给药的H2L5 hIgG4PE以及匹配同型对照的抗肿瘤活性。
收集组织用于未来的H2L5 hIgG4PE的药效学活性研究。本研究共分配 22组治疗组，每组10只小鼠。组1-16是疗效组，17-22是药效学活性组。
对于组合治疗，给药H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)和依匹木单抗或 IgG1(3mg/kg)或H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)和派姆单抗或IgG4(5 mg/kg)。H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗以及匹配的同型对照每周给药两次，持续6次，派姆单抗和同型对照每5天给药一次，直至H2L5 hIgG4PE给药结束。对于药效学组织采集组，H2L5 hIgG4PE以0.004、0.04、0.4和1.2mg/kg 给药。相对于媒介物和同型对照组评估治疗组。表12中显示了在供体编号 #6711中使用了人PBMC的媒介物、同型和单独的H2L5 hIgG4PE以及其与依匹木单抗和派姆单抗的组合的治疗组。在第59天研究终止时进行分析。
表12：在A2058黑素瘤肿瘤模型中，小鼠的治疗组
Figure GDA0003245324200001062
Figure GDA0003245324200001071
Figure GDA0003245324200001081
评估与依匹木单抗或派姆单抗组合给药的H2L5 hIgG4PE的效力研究
本研究被设计用于使用A2058黑素瘤肿瘤模型，在移植了人PBMC的 NSG小鼠中评估与依匹木单抗或派姆单抗组合的H2L5 hIgG4PE(以0.01和 0.04mg/kg给药)与匹配的同型对照的抗肿瘤效力。研究中共计分配了13组，每组10只小鼠。组2是人源化IgG1和IgG4的组合同型对照。H2L5 hIgG4PE 以0.01mg/kg(组12)和0.04mg/kg(组13)作为单一药剂给药。对于组合治疗，给药H2L5 hIgG4PE(0.01和0.04mg/kg)和依匹木单抗或IgG1(3mg/kg)或H2L5 hIgG4PE(0.01和0.04mg/kg)和派姆单抗或IgG4(5mg/kg)。H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗以及匹配的同型对照每周给药两次，持续6次，派姆单抗和同型对照每5天给药一次，直至H2L5 hIgG4PE给药结束。在表13中给出了使用来自供体#4568的人PBMC的治疗组的总结。相对于媒介物和同型对照组评估治疗组。在第33天研究终止时进行生存力分析。
表13：在A2058黑素瘤肿瘤模型中，小鼠的治疗组
Figure GDA0003245324200001091
Figure GDA0003245324200001101
统计分析
存活分析的事件为：肿瘤体积>2000mm3、肿瘤溃疡、小鼠体重减轻 >20％、濒死或发现死亡，以先发生者为准。通过在两次观察之间的肿瘤体积对数与天数之间拟合线性线来评估截断体积的确切时间，其中所述两次观察为：第一次观察到超过截断体积和截断体积之前刚刚的一次观察。进行 Kaplan-Meier(KM)法评估给定时间处不同治疗组的存活可能性。报告了至终点的中位时间及其对应的95％置信区间。然后通过对数秩检验来测试任何两组之间的KM存活率曲线是否存在统计学差异。
使用最后一天(即，在任何动物安乐死之前)的肿瘤体积数据来在不同治疗组之间比较肿瘤体积，其中每组10只动物。在分析之前，由于不同治疗组的差异不等，对肿瘤体积进行自然对数变换。然后对该对数变换数据进行 ANOVA，然后进行成对比较。
使用Graphpad Prism软件绘制肿瘤生长和体重数据。
结果
H2L5 hIgG4PE剂量反应(图20A)
肿瘤生长抑制：
对照组：人PBMC(供体7129)对NSG小鼠的A2058肿瘤生长没有影响。具有或不具有人PBMC的携带A2058肿瘤的小鼠\用媒介物和同型对照抗体处理的具有人PBMC的携带A2058肿瘤小鼠长出肿瘤，其如预期一样进展 (组#1vs.组#10，组#1vs.组#2，组#1vs.组#4，p＝1)。
与媒介物对照组#1相比，3mg/kg(#3组)的依匹木单抗治疗显示出显著的肿瘤生长抑制(p<0.03)，然而与同型对照组#2相比则不具有统计学显著性(p<0.22)。这表明同型抗体可影响肿瘤生长。
与其他剂量相比，0.4mg/kg的H2L5 hIgG4PE治疗显示了肿瘤生长抑制趋势和小鼠存活力的提高，但该结果与媒介物或同型对照相比并没有统计学显著性。
临床观察：
在研究期间观察到小鼠体重的减轻，在研究结束时减轻约20％。据报道， GvHD和肿瘤负荷均可导致小鼠体重下降，尽管在本研究中，体重减轻似乎更多地与A2058肿瘤相关，因为携带肿瘤却没有PBMC移植的小鼠(组#10) 显示出同样的趋势。研究期间在多个肿瘤中观察到肿瘤溃疡，包括同型对照组。
小鼠命运：
在肿瘤体积>2000mm3时移除大多数小鼠。三只小鼠由于肿瘤溃疡而被安乐死，三只小鼠由于体重减轻>20％而被安乐死。在所有组中发现有9只小鼠随机死亡，包括在媒介物组中的两只以及同型对照组总共三只。这些死亡归因于模型对移植物抗宿主病的易感性，而不是治疗相关的，因为与媒介物或同型对照组相比，治疗组没有观察到该模式。
H2L5 hIgG4PE与依匹木单抗和派姆单抗的组合的效力研究(图20B)
肿瘤生长抑制：
对照组：用媒介物或同型对照抗体处理的具有人PBMC的携带A2058 肿瘤的小鼠长出肿瘤，其生长一如预期。
单一疗法：
与媒介物对照组#1相比，与IgG4组合的3mg/kg依匹木单抗的治疗(组 #3)导致显著的肿瘤生长抑制(p<0.04)。然而，与同型对照组#2比较，并无统计学显著性(p<0.23)。
2.5mg/kg或5mg/kg的单独派姆单抗治疗(组#13,14)与媒介物或同型对照组#12相比，显示出可观察到的肿瘤生长抑制，却无统计学显著性。派姆单抗与IgG1的组合(组#4)，显示可观察到的肿瘤生长抑制，却无统计学显著性，然而与媒介物对照组#1相比，观察到存活的显著增加(p<0.04)。与同型对照组#2相比，无统计学显著性(p<0.4)。
与媒介物或同型对照组#12相比，单独的0.4mg/kg的H2L5 hIgG4PE处理(组#15)显示可观察到的肿瘤生长抑制，无统计学显著性。以0.04或 0.4mg/kg与IgG1组合的H2L5hIgG4PE(组#5和6)显示可观察到的肿瘤进展延迟和小鼠存活，但未达到统计学显著性。
组合治疗：
将H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)与依匹木单抗(3mg/kg)组合。与单独的依匹单抗(组#3)相比，#8和#9组没有显示出额外的肿瘤生长抑制。与派姆单抗单一疗法(组#4)或H2L5 hIgG4PE单一疗法(组#5和#6)相比， H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)与派姆单抗(5mg/kg)的组合(组#10和组# 11)显示轻微但不显著的肿瘤生长抑制和小鼠存活。
临床观察：
研究期间观察到的小鼠体重减轻约为20％。在研究期间，在大多数组中，多个肿瘤中肿瘤溃疡明显。
小鼠命运：
当肿瘤体积达到>2000mm3时，在160只中共有100只小鼠被安乐死。 29只小鼠由于肿瘤溃疡而被安乐死，发现18只小鼠死亡，12只小鼠由于体重减轻>20％而被安乐死，一只小鼠由于濒死被安乐死。在包括同型对照组 #2的组中发现小鼠死亡。这些死亡归因于模型对移植物抗宿主病的易感性，而不是治疗相关，因为与同型对照组相比，治疗组没有观察到该模式。
评估与依匹木单抗或派姆单抗组合给药的H2L5 hIgG4PE的效力研究 (图20C)
肿瘤生长延迟：
对照组：用媒介物或同型对照抗体处理的具有人PBMC的携带A2058 肿瘤的小鼠长出肿瘤，其生长一如预期。
单一疗法：
与媒介物对照组#1相比，与IgG4组合的3mg/kg依匹木单抗治疗(组# 3)显示明显的肿瘤生长抑制(p<0.02)和存活的显著增加(p<0.01)。然而，与同型对照组#2相比，肿瘤生长抑制没有达到显著性(p<0.13)，而小鼠存活仍显著增加(p<0.04)。
与媒介物或同型对照组#2相比，与IgG1组合的5mg/kg派姆单抗治疗 (组#4)显示肿瘤生长抑制，但无统计学显著性。
与媒介物对照组#1相比，单独使用0.01mg/kg或0.04mg/kg的H2L5 hIgG4PE治疗(组#12和#13)显示出显著的肿瘤生长抑制(p<0.03)。与媒介物对照组1相比，以0.04mg/kg给药的H2L5 hIgG4PE也显示了小鼠存活的显著增加(p<0.048)。然而，与同型对照组#2相比，组#12和组#13的肿瘤生长抑制和存活未达到统计学显著性。与媒介物对照组#1相比，与IgG1 组合的0.01mg/kg H2L5 hIgG4PE(组#5)显示出显著的肿瘤生长抑制(p<0.03) 和小鼠存活(p<0.03)。然而，与同型对照组#2相比，肿瘤生长延迟和存活未达到统计学显著性。与IgG1组合的0.04mg/kg H2L5 hIgG4PE(#6组)显示可观察到的肿瘤生长抑制和小鼠存活，但未达到统计学显著性。
组合治疗：
H2L5 hIgG4PE与依匹木单抗的组合(0.01mg/kg+3mg/kg依匹木单抗；# 8组)显示可观察到的肿瘤生长抑制和小鼠存活，但未达到统计学显著性。与媒介物对照组#1或同型对照组#2(p<0.02)相比，H2L5 hIgG4PE与依匹木单抗的组合(0.04mg/kg+3mg/kg依匹木单抗；组#9)显示显著的肿瘤生长抑制(p<0.00)，且小鼠存活显著增加(p<0.04)。然而，与同型对照组相比，存活无法达到统计学显著性。与单一疗法的依托木单抗组#3或H2L5 hIgG4PE单一治疗组相比，组合活性未达到显著性。
与媒介物对照组#1相比，与派姆单抗(5mg/kg)组合的H2L5 hIgG4PE(0.01mg/kg或0.04mg/kg)(组#10和组#11)显示显著的肿瘤生长抑制作用(p≤0.03)和观察到小鼠存活的显著增加(p<0.03)。当与同型对照组# 2比较时，与派姆单抗组合的0.04mg/kg H2L5hIgG4PE仍保留其肿瘤生长抑制的显著性(p<0.03)。然而，存活的益处未能达到统计学显著性。与单一治疗组派姆单抗组#3或H2L5 hIgG4PE组#5或#6相比，该组合没有达到显著性。因此，H2L5 hIgG4PE与派姆单抗的组合(0.01或0.04mg/kg+5mg/kg 的派姆单抗)显示增加的肿瘤生长抑制和小鼠存活，但与同型对照或单一疗法相比未达到统计学显著性。
临床观察：
研究期间观察到的小鼠体重减轻约为20％。在研究期间，在大多数组中观察到肿瘤溃疡。
小鼠命运：
由于肿瘤大小>2000mm3，共将91只小鼠安乐死。34只小鼠因肿瘤溃疡而被安乐死，且发现5只小鼠死亡。这些死亡归因于模型对移植物抗宿主病的易感性。
讨论
在具有A2058黑素瘤肿瘤的移植了人PBMC的NSG小鼠模型中评估了 H2L5 hIgG4PE作为单一疗法和与派姆单抗以及依匹木单抗组合的效力。静脉注射了人PBMC的成年免疫缺陷型NSG(NOD/SCID/IL-2Rγnull)小鼠的模型被称为Hu-PBMC NSG模型。它诱导移植物抗宿主病(GVHD)，并被用于研究效应子和记忆T细胞的活性。将Hu-PBMC NSG模型皮下植入人癌细胞系A2058，以研究人免疫治疗抗体对肿瘤生长的影响。该模型的局限性包括GvHD症状的发作、体重减轻和频繁的肿瘤溃疡，其阻止了长时间的存活监测，而同基因小鼠肿瘤模型则可以。
评估了0.04mg/kg至4mg/kg剂量范围内的H2L5 hIgG4PE的初步研究表明，较低范围内的剂量表现出适度的肿瘤生长抑制作用。在0.04～0.4mg/kg 范围的剂量组中观察到肿瘤进展的延迟和存活的增加，但与同型对照组相比却无统计学显著性。基于这些研究，选择0.04至0.4mg/kg的H2L5 hIgG4PE 剂量来在两项研究中以单独形式以及与派姆单抗和依匹木单抗组合形式进行进一步评估，其中的PBMC移植物来自两个不同供体(供体#4568和6711)。在所进行的两个组合研究中的一个中观察到针对H2L5 hIgG4PE单一疗法以及与派姆单抗的组合的适度反应。使用PBMC供体4568的组合研究(表13，图20C)显示了单一疗法和组合的抗肿瘤活性，而使用PBMC供体6711的研究(表12，图20B)没有显示出显著的抗肿瘤作用，这可能是研究之间的供体 PBMC差异的结果，其反映了在临床中可观察到的患者反应差异。在使用 PBMC供体4568的第二组合研究中，与单独的任一种试剂相比，在组合组中观察到小鼠增强的肿瘤生长抑制和存活力增加，但该差异没有统计学显著性。然而，观察到组合协同作用，因为与同型对照组相比，0.04mg/kg剂量的H2L5 hIgG4PE与5mg/kg派姆单抗的组合导致第一次给药后10天肿瘤体积的统计学显著性降低，和存活力增加(p≤0.05)，但单一疗法却没有。事实上，H2L5 hIgG4PE和派姆单抗组合组中的50％的小鼠在第33天仍处于研究中，但由于肿瘤溃疡而被排除。仅从研究中由于组合组的肿瘤体积除去 4只小鼠，而在派姆单抗和同型组中从研究中除去8至9只小鼠。
与同型治疗组相比，抗-PD1疗法在该模型中没有显示统计学显著的活性，如就派姆单抗治疗组所观察到的肿瘤生长和存活的有限变化一样。依匹木单抗单一疗法显示肿瘤生长抑制的趋势，在两项研究中均略优于派姆单抗，并且在使用反应性PBMC供体4568的第二次组合研究中，相对于同型组，其显示了统计学显著的存活增加(p≤0.04)。与依匹木单抗相比，0.01mg/kg 剂量的H2L5 hIgG4PE与3mg/kg依匹木单抗的组合的生存率显著升高(p≤ 0.02)，但与H2L5 hIgG4PE单一疗法相比则无显著性。与单独使用的任一试剂相比，在该模型中没有观察到H2L5 hIgG4PE和依匹木单抗的组合对肿瘤体积有额外的显著效果。所有治疗组(包括媒介物和同型对照组)中的小鼠被发现死亡，如命运表中所报告的。这些死亡归因于模型对移植物抗宿主病的易感性，而不是治疗相关的。
实施例12：单独的抗-鼠ICOS激动剂抗体及其与抗-PD1和抗-CTLA-4抗体的组合的 体内功能型活性
CT26和EMT6同基因小鼠肿瘤模型
CT26鼠类结肠癌小鼠肿瘤模型
方法
按照GSK动物试验保护与使用委员会在研究开始之前批准的方案进行该研究。
动物
在该研究中，164只雌性BALB/c小鼠来自Harlan Sprague Dawley。在研究开始时，小鼠要接种时为6至8周大。
细胞培养及接种
将一瓶CT-26细胞(ATCC:CRL-2638)(3×10 6细胞；P-11)从-140℃解冻，并在具有10％FBS的RPMI中铺板。将细胞在10天内继代培养3次。使用胰蛋白酶/EDTA以促进继代培养期间细胞从培养瓶脱离。收集细胞，洗涤两次，并以5×105个细胞/ml重新悬浮于不含FBS的RPMI中。在小鼠右后肋用0.1ml细胞(5×104个细胞/小鼠)进行皮下接种。
在细胞收集和接种的当天，在Beckman Coulter Vi-cell XR上进行细胞计数，并由血球计数器检查。用胰蛋白酶/EDTA将细胞从烧瓶中分离，洗涤两次，首先用RPMI+10％FBS洗涤，第二次仅用RPMI洗涤，重新悬浮于10ml RPMI中。在20ml RPMI中收集具有98.8％成活力的178×106个细胞。将 1.685ml细胞悬浮液(总共15×106个细胞)加入到28.315mlRPMI中。
15x106细胞/30ml培养基＝5x105细胞/ml。这相当于5x104细胞/100μl。
抗体的配制和准备
在给药当天在无菌0.9％盐水中将来自储备来源小瓶的抗体稀释至所需浓度。以0.05mg/kg和0.5mg/kg测试抗-ICOS激动剂克隆C398.4。每次给药也测试了10mg/kg的抗-PD1和1mg/kg的抗-CTLA-4。
实验方案
肿瘤监测及给药
在第0天接种小鼠。在第11天，测量体重和肿瘤体积。根据肿瘤大小，将小鼠随机分入表14所示的12个研究组中，每组10只小鼠。使用Studylog Study Director软件完成随机化。根据研究设计图，从随机化那天开始每周两次对小鼠进行给药，并持续总共6次给药。在100μl体积的0.9％盐水媒介物中进行腹膜内(IP)给药。在整个研究中每周测量3次肿瘤体积和体重。
终点
当肿瘤体积大于2000mm3时，由于肿瘤负荷，从研究中移除小鼠。通过将长度和宽度卡尺测量值代入以下公式计算肿瘤体积：TV＝0.52*L*W2。
此外，当肿瘤长出开放性溃疡时，从研究中移除额外的小鼠。在整个实验中观察到溃疡，但是除非形成开口，否则仅仅是溃疡上的结痂并不是终点。
虽然未适用于本研究中的任何小鼠，但在研究开始时确定的第三终点是体重减少了20％。
药物和材料
抗体 售主 目录# 批号 克隆
ICOS Biolegend 93108 B205973 C398.4
PD1 BioXcell BE0146 5792-10/0815B RMP1-14
CTLA-4 BioXcell BE0164 5632-4/0715 9D9
小鼠IgG2b BioXcell BE0086 4700/1014 MCP-11
大鼠IgG2a BioXcell BE0089 5679-6/0815 2A3
仓鼠IgG Biolegend 92257 B205974 HTK888
将所有抗体在0.9％盐水中稀释至所需浓度，且将盐水用作媒介物对照。
数据分析
存活分析的事件为：肿瘤体积>2000mm3或肿瘤溃疡，以先发生者为准。通过将在两次观察之间的肿瘤体积对数与天数之间拟合线性线来评估截断体积的确切时间，其中所述两次观察为：第一次观察到超过截断体积和在截断体积之前刚刚进行的一次观察。进行Kaplan-Meier(KM)法评估给定时间处不同治疗组的存活可能性。报告了至终点的中位时间及其对应的95％置信区间。然后通过对数秩检验来测试任何两组之间的KM存活曲线是否存在统计学差异。
比较不同治疗组在初始给药后17天的肿瘤体积。在分析之前，由于不同治疗组的差异不等，对肿瘤体积进行自然对数变换。然后对该对数变换数据进行ANOVA，然后进行成对比较。
表14：研究组
组编号 治疗
1 盐水
2 小鼠IgG2b 20μg+仓鼠IgG 10μg
3 大鼠IgG2a 200μg+仓鼠IgG 10μg
4 仓鼠IgG 10μg
5 ICOS 1μg
6 ICOS 10μg
7 CTLA-4 20μg
8 PD1 200μg
9 ICOS 1μg+CTLA-4 20μg
10 ICOS 10μg+CTLA-4 20μg
11 ICOS 1μg+PD1 200μg
12 ICOS 10μg+PD1 200μg
上表中显示了原始p值以及通过伪发现率(FDR)调整的p值，其来自通过比较治疗组之间至事件发生的天数(通过存活分析)以及比较在第10天的对数变换肿瘤体积。使用FDR调整的p值≤0.05的比较被认为具有统计学显著性。
结果
小鼠命运历程显示了由于肿瘤负荷和肿瘤溃疡而被研究中去除的小鼠数量。所有存活下来的小鼠在研究第61天时无肿瘤，除了G7中的1只小鼠具有579.16mm3的肿瘤体积。
对于存活(到终点的时间)，与媒介物对照组相比，组9和12显示存活显著增加(分别为p＝0.008和p＝0.001)。与组2、4和5相比，组12显示出统计学显著的延长存活(p＝0.006、0.001、0.02)。然而，没有组合组相对于单一疗法显示出统计学显著(p<0.05)增加的存活(图21)。
讨论
组合治疗组，特别是高剂量抗-ICOS和抗-PD1组合(组12)，在第61天相对于单一对照组和同型对照组显示了对肿瘤生长的抑制和增加的存活，但没有达到统计学显著性。组12的同型对照为大鼠IgG2a+仓鼠IgG组3。用于比较的单一疗法组为ICOS10μg(组6)和PD1200μg(组8)。组12中总共 5只小鼠保持无肿瘤，而相比之下，组3中为1只，组6为1只，组8为1只。通过采用每只小鼠达到任何预定的研究终点的日期来量化存活益处。由于开放性肿瘤溃疡，而不是由于肿瘤负担，从研究中去除多只小鼠。
在高剂量ICOS+CTLA-4组合组(组10)中，在第31天，由于肿瘤溃疡而去除的小鼠数量增加，这会掩盖了该组合提供的存活和抗肿瘤益处。在该组中，由于肿瘤溃疡去除了5只小鼠，仅2只的肿瘤负荷达到2000mm3。由于肿瘤溃疡而被去除的所有肿瘤在离开研究时仍然具有中等大小，并且预期肿瘤溃疡是这些小鼠中治疗诱导的抗肿瘤免疫反应的结果。在该组中，截止第61天三只小鼠保持无肿瘤。由于肿瘤负荷而去除的2只小鼠在所有组中是由于肿瘤负荷而被去除的小鼠中是数量最小的。
EMT6乳癌小鼠肿瘤模型
实验方案
本发明中描述的所有过程和安乐死标准均符合IACUC方案AUP0606。将动物称重，每只小鼠在右后四分之一处接种100μl的1×105个EMT6肿瘤细胞。接种的小鼠数量等于研究所需的至少130％。假设30％的失败率(在开始研究时太大或太小)，目标是每组n＝10。在肿瘤细胞接种后，每周3次测量总体重并且用Fowler“ProMax”数位卡尺测量肿瘤生长，持续4周或更长时间。从商业供应商获得抗体，并在0.9％盐水中稀释至所需浓度。每两周给药(i.p.)一次，总共6次给药且在当平均肿瘤体积接近100mm3时的随机化当天开始(指定为第0天，在接种后约7至8天)。使用Studylog Study Director Suite软件进行随机化。测量肿瘤的长度和宽度，以使用公式确定肿瘤体积(肿瘤体积＝L*W2*0.52)。对于单只动物测量到大于2000mm3的肿瘤导致从研究中去除该动物。小鼠也会由于体重减轻(>20％)、肿瘤溃疡或任何其他由于发病而对正常小鼠活动有明显抑制而被从研究中去除。
在这项研究中，共计191只动物接种EMT6细胞，以便产生足够的具有所需大小范围内的肿瘤的小鼠，共13组，每组10只，如表15所示。注射盐水媒介物的小鼠和同型对照组作为ICOS、PD1和CTLA-4mAb治疗小鼠的对照。ICOS的同型对照(仓鼠IgG)以10μg单独给药，以及与CTLA-4(小鼠IgG2b)或PD-1(大鼠IgG2a)的同型组合给药。抗-CTLA-4(9D9)和抗-PD- 1(RMP1-14)的单一疗法组分别以每只小鼠20μg和200μg给药，并与ICOS 同型对照组合进行评估。ICOS激动剂的C398.4克隆以每只小鼠10μg和1 μg给药。也以每只小鼠10μg和1μg与抗-CTLA-4或抗-PD-1组合给药，从而评估ICOS激光剂的效力。另外将具有预定浓度的一组PD-1和CTLA- 4包括在内作为阳性对照比较组。在随机化后第13天进行肿瘤体积的统计学分析。存活力分析包括正在研究中到第60天的小鼠。
表15：研究组
Figure GDA0003245324200001191
Figure GDA0003245324200001201
药物和材料
动物
由Harlan Sprague Dawley收到6-8周的雌性Balb/c小鼠，并根据IACUC 标准养育。
EMT6细胞
将EMT6细胞解冻并在细胞培养瓶中培养8天，然后接种。在这段时间内细胞已传代3次。在接种当天，在完全培养基中从烧瓶中收获细胞。将细胞离心并重新悬浮于Weymouth's(含15％FBS)中。在没有FBS的Weymouth 培养基中重复3次该步骤。通过台盼蓝排除法来检测细胞密度和成活力。然后将细胞稀释至所需密度(1×106个细胞/mL)。
免疫治疗剂
在给药当天将所有治疗剂在0.9％氯化钠中稀释至所需浓度，并使用30G 针腹膜内注射。治疗剂稀释液和对照剂稀释液如下表16所示。
表16：治疗剂稀释液
Figure GDA0003245324200001202
数据分析
统计分析
存活分析的事件为：肿瘤体积为2000mm3或肿瘤溃疡，以先发生者为准。通过将在两次观察之间的肿瘤体积对数与天数之间拟合线性线来评估截断体积的确切时间，其中所述两次观察为：第一次观察到超过截断体积和在截断体积之前刚刚进行的一次观察。进行Kaplan-Meier(KM)法评估给定时间处不同治疗组的存活可能性。报告了至终点的中位时间及其对应的95％置信区间。然后通过对数秩检验来测试任何两组之间的KM存活率曲线是否存在统计学差异。
比较不同治疗组在初始给药后13天的肿瘤体积。在分析之前，由于不同治疗组的差异不等，对肿瘤体积进行自然对数变换。然后对该对数变换数据进行ANOVA，然后进行成对比较。使用SAS 9.3和R 3.0.2分析软件。
结果
将Balb/c小鼠接种并在8天后基于治疗方案随机分为10组。于随机化当天(第0天)开始施用治疗剂或对照剂，每周2次，持续3周。
相对于此前的EMT-6研究，盐水治疗组中的肿瘤以预期的速率生长。由于肿瘤大小或溃疡，盐水媒介物组中的所有小鼠在第30天都被安乐死。用单独的仓鼠IgG或其与大鼠IgG2a或小鼠IgG2b的组合进行治疗，其获得的平均肿瘤生长或存活与盐水媒介物组相比无统计学显著的变化。
在随机化后13天，与同型对照相比，ICOS单一疗法组在平均肿瘤生长方面几乎没有可观察到的变化。然而，高剂量ICOS治疗组(10μg)显示出比低剂量组更明显的更多肿瘤生长抑制的趋势。观察到与CTLA-4单一疗法活性相当的效果。使用PD-1mAb的单一疗法也使得第13天的平均肿瘤体积产生一些可观察到但无统计学显著性的降低。然而，与ICOS和CTLA-4单一疗法一样，与适当的同型对照组相比，这并不会导致存活增加。与对照组和单一疗法治疗组相比，用10μg剂量的抗-PD-1和抗-ICOS抗体克隆C398.4 的组合进行治疗导致可观的的肿瘤生长抑制(图22)。该组合组中的三只小鼠实现了完全肿瘤消退，与对照组或单一疗法组相比有相当大的改善。然而，由于使用统计学标准，尚未达到统计学显著的存活改善。与1μg和10μg 的盐水媒介物对照组(p<0.05)和ICOS单一疗法组(p<0.05)相比，抗-PD-1与 1μg ICOS激动剂抗体克隆C398.4的组合确实导致了第13天平均肿瘤生长有统计学显著的降低。来自该治疗方案的四只小鼠实现了完全的肿瘤消退，得到存活产生明显增加的趋势，但未达到统计学显著性。
与用任一抗体进行的单一疗法治疗相比，两种剂量的ICOS抗体与抗- CTLA-4的组合在肿瘤生长抑制或存活方面可观察到的益处不多。
讨论
虽然与盐水媒介物组相比，同型对照导致平均肿瘤体积或总体存活方面没有明显变化，但是在仓鼠IgG组(组4)和仓鼠IgG及大鼠IgG2a组(组3)中存在个别动物显示延迟的肿瘤生长。在仓鼠IgG及大鼠IgG2a同型组中，一只小鼠存活超过最后一只盐水媒介物小鼠，由于具有溃疡而在第36天被处死，其肿瘤体积经测量为1156.56mm3。仓鼠IgG组中的两只小鼠存活时间比盐水组长。一只动物在第36天由于肿瘤大小而被安乐死，第二只在41天由于溃疡加上测量值为1899.28mm3而被安乐死。
抗-PD-1与10μg的抗-ICOS激动剂的给药方案产生了可观察到的肿瘤生长抑制，导致在第13天与同型对照相比肿瘤体积减少，但与抗-PD-1单一疗法相比该差异不显著。然而，组合确实导致总共5只动物存活超过了抗- PD-1单一疗法组中的任一只，其中三只小鼠经历了完全的肿瘤消退，相比之下，在抗-PD-1单一疗法组中没有一只实现完全的肿瘤消退。
与同型对照组和各自的单一疗法组相比，抗-PD-1与1μg剂量ICOS激动剂抗体的组合在第13天产生可观察到的平均肿瘤大小的降低。与盐水媒介物对照组(p<0.05)和1μgICOS单一疗法组(p<0.05)相比，该降低有统计学显著性。四只小鼠经历了完全的肿瘤消退，并存活超过了PD-1单一疗法组中的任何一只。
在第60天，与对照组相比，ICOS+PD1组合组观察到的存活益处没有达到统计学显著性。然而，ICOS+PD1组合治疗组的肿瘤生长抑制和存活益处与PD1+CTLA-4组合组(在本研究中被认为是抗肿瘤活性的阳性对照)中观察到的活性相当。这表明ICOS和PD1抗体的组合可具有类似于CTLA-4 和PD1组合的益处，而CTLA-4和PD1的组合已经在一些肿瘤类型中显示出显著的临床活性。
在本研究中所使用的130只小鼠中，12只在第60天仍然存活，其中11 只实现完全的肿瘤消退。在符合研究去除终点的118只小鼠中，111只是由于达到了2000mm3的肿瘤大小而被去除。剩下的七只小鼠由于肿瘤溃疡而被安乐死。溃疡的发生率在各组之间分布。组1(盐水)、组3(仓鼠IgG和大鼠IgG2a)、组4(仓鼠IgG)、组6(1μg ICOS)和组10(具有1μg ICOS的CTLA- 4)都有一只动物由于溃疡被去除。组13(CTLA-4+PD-1)显示两只动物由于溃疡而被处死。其余组没有动物由于溃疡而被去除。
序列表
<110> 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司
国家健康与医学研究院
让.保利和艾琳.卡梅特研究院
艾克斯-马赛大学
国家科学研究中心
<120> 激动型ICOS结合蛋白
<130> PU65846
<150> 62/247,355
<151> 2015-10-28
<150> 62/192,331
<151> 2015-07-14
<150> 62/108,605
<151> 2015-01-28
<160> 24
<170> FastSEQ 用于Windows版本4.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 1
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 2
Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 3
Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 5
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 6
Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 9
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gly Arg Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
225 230 235 240
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Gly Lys
465
<210> 10
<211> 168
<212> PRT
<213> 人
<400> 10
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro
130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Met
165
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人
<400> 11
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 12
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 12
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val
35 40 45
Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
85 90 95
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr
100 105 110
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Met Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Trp Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn Tyr Tyr Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 14
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn
85 90 95
His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Met Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠类
<400> 20
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ile Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 21
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 21
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gctcaagcgt gaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgac tacgctatgc actgggtgag gcaggccccc 180
ggccagggcc tggagtggat gggcctgatc agcatctaca gcgaccacac caactacaac 240
cagaagttcc agggcagggt gaccatcacc gccgataaga gcaccagcac agcctacatg 300
gagctgagca gcctgaggag cgaagacacc gccgtgtact attgcggcag gaacaactac 360
ggcaactacg gctggtactt cgacgtgtgg ggccagggaa ccactgtcac cgtgagcagc 420
gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccct gcagcagaag caccagcgag 480
agcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 540
tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 600
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc 660
tacacctgca acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagagc 720
aagtacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccccgagt tcgagggcgg accctccgtg 780
ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgggagg aacagttcaa cagcacctac 960
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 1020
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1080
ggccagcctc gggagcccca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggaaga gatgaccaag 1140
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1260
gacggcagct tcttcctgta cagcaggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1320
aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 1380
ctgagcctgt ccctgggcaa g 1401
<210> 22
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 22
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagcgag 60
attgtgctga cccagagccc cgccaccctg agcctgagcc ccggcgaaag ggcaaccctc 120
agctgcagcg ccagcagcag cgtgagctac atgcactggt accagcagaa gcccggccag 180
gcccctaggc tgctgatcta cgacacctcc aagctggcca gcggcatccc agccaggttc 240
tcaggcagcg gcagcggcac cgactatact ctgaccatca gcagcctgga gcccgaggac 300
ttcgccgtgt actactgctt ccagggaagc ggctacccct acaccttcgg ccagggcacc 360
aagctggaga tcaagcgtac ggtggccgcc cccagcgtgt tcatcttccc ccccagcgat 420
gagcagctga agagcggcac cgccagcgtg gtgtgtctgc tgaacaactt ctacccccgg 480
gaggccaagg tgcagtggaa ggtggacaat gccctgcaga gcggcaacag ccaggagagc 540
gtgaccgagc aggacagcaa ggactccacc tacagcctga gcagcaccct gaccctgagc 600
aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgagg tgacccacca gggcctgtcc 660
agccccgtga ccaagagctt caaccggggc gagtgc 696
<210> 23
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (23)

1.一种ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其包含：SEQ ID NO:1中所示的CDRH1；SEQ IDNO:2中所示的CDRH2；SEQ ID NO:3中所示的CDRH3；SEQ ID NO:4中所示的CDRL1；SEQ IDNO:5中所示的CDRL2；和SEQ ID NO:6中所示的CDRL3。
2.权利要求1的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其包含：VH结构域，其包含与SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；和/或VL结构域，其包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述ICOS结合蛋白特异性结合至人ICOS。
3.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中所述ICOS结合蛋白以小于约100nM的解离常数(KD)结合至人ICOS。
4.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其包含：含有SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域；和含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。
5.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含骨架，所述骨架选自人IgG1同型或其变体和人IgG4同型或其变体。
6.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含hIgG4PE骨架。
7.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中所述ICOS结合蛋白为单克隆抗体。
8.权利要求7中的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中该单克隆抗体为人源化的。
9.权利要求8的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，包含IgG4同型骨架或其变体。
10.权利要求9的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分，其中所述单克隆抗体包含hIgG4PE骨架。
11.一种药物组合物，其包含：权利要求1至10中任一项的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分；和药学上可接受的载体。
12.权利要求11的药物组合物在制备用于治疗实体瘤的药物中的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述药物进一步与至少一种抗肿瘤剂、至少一种免疫调节剂和/或至少一种免疫刺激佐剂施用。
14.权利要求13的用途，其中所述免疫调节剂选自：抗-CTLA4抗体或其抗原结合部分、抗-PD-1抗体或其抗原结合部分、抗-PDL1抗体或其抗原结合部分和抗-OX40抗体或其抗原结合部分。
15.权利要求11的药物组合物，其用于在有此需要的人中治疗实体肿瘤。
16.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分,其中所述ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体，其包含与SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链氨基酸序列。
17.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分,其中所述ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体，其包含与SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链氨基酸序列。
18.权利要求1或权利要求2的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分,其中所述ICOS结合蛋白为人源化单克隆抗体，其包含与SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链氨基酸序列。
19.权利要求1-10或16-18中任一项所述的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分在制备用于治疗实体肿瘤的药物中的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述药物进一步与至少一种抗肿瘤剂、至少一种免疫调节剂和/或至少一种免疫刺激佐剂施用。
21.权利要求20的用途，其中所述免疫调节剂选自：抗-CTLA4抗体或其抗原结合部分、抗-PD-1抗体或其抗原结合部分、抗-PDL1抗体或其抗原结合部分和抗-OX40抗体或其抗原结合部分。
22.权利要求20或21的用途，其中所述至少一种抗肿瘤剂是化学治疗剂。
23.权利要求20或21所述的用途，其中所述至少一种抗肿瘤剂是多西紫杉醇，甲氨蝶呤，紫杉醇，吉西他滨，氟尿嘧啶，卡铂或顺铂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2681214T3 (es) 2009-09-30 2018-09-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Inmunoterapia de combinación para el tratamiento del cáncer
CA2830442C (en) * 2011-03-31 2019-09-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Antibodies directed against icos and uses thereof
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CN110981964B (zh) 2013-01-14 2023-09-15 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
EP2972348B1 (en) 2013-03-14 2018-08-15 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Methods of detecting donor-specific antibodies
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CR20160319A (es) 2013-12-12 2016-11-08 Jiangsu Hengrui Medicine Co Anticuerpo pd-1, fragmento de union al antigeno de este y uso médico de este
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
KR102497443B1 (ko) 2014-03-28 2023-02-08 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
PE20171103A1 (es) 2014-11-26 2017-08-07 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
RU2714157C2 (ru) * 2015-02-06 2020-02-12 Хит Байолоджикс, Инк. Вектор, коэкспрессирующий молекулы для вакцинации и костимулирующие молекулы
CN114907481A (zh) 2015-03-23 2022-08-16 震动疗法股份有限公司 Icos的抗体
EP3331919A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies
EP3365372A1 (en) 2015-10-22 2018-08-29 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
US10527613B2 (en) * 2015-11-10 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
CR20200045A (es) 2016-04-07 2020-03-11 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd AMIDAS HETEROCÍCLICAS ÚTILES COMO MODULADORES DE PROTEÍNAS (Divisional 2018-0472)
EP3440072B1 (en) 2016-04-07 2020-01-29 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd Heterocyclic amides useful as protein modulators
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
AU2017290086A1 (en) 2016-06-28 2019-01-24 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
EP3494140A1 (en) 2016-08-04 2019-06-12 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
CN109689688B (zh) 2016-08-09 2023-06-13 科马布有限公司 抗icos抗体
WO2018045110A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3035343A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
WO2018085698A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Aximmune, Inc. Beta-alethine, immune modulators, and uses thereof
EP3569616B1 (en) * 2017-01-13 2021-09-29 Taizhou Hanzhong Biopharmaceutics, Inc. Monoclonal antibody against pd-1 and applications thereof
WO2018140644A1 (en) * 2017-01-25 2018-08-02 Musc Foundation For Research Development Modified t cells and uses thereof
CA3052767A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides as kinase inhibitors
WO2018176144A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Sunnybrook Research Institute Engineered t-cell modulating molecules and methods of using same
WO2018187191A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Jounce Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of cancer
TWI788340B (zh) * 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
JP2020522556A (ja) 2017-06-09 2020-07-30 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 癌を治療するためのｉｃｏｓアゴニストおよびｏｘ４０アゴニストでの組み合わせ療法
EP3635011A1 (en) * 2017-06-09 2020-04-15 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapy with icos agonist and ox40 agonist to treat cancer
CA3066048A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
AU2018326617B2 (en) * 2017-08-31 2022-12-01 Io Therapeutics, Inc. Rar selective agonists in combination with immune modulators for cancer immunotherapy
BR112020005028A2 (pt) * 2017-09-14 2020-09-15 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited tratamento em combinação para câncer
WO2019069270A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited GENERATOR STIMULATOR MODULATORS (STING) INTERFERON
AU2018344902B2 (en) 2017-10-05 2021-06-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modulators of stimulator of interferon genes (STING) useful in treating HIV
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
WO2019122882A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Kymab Limited Bispecific antibody for icos and pd-l1
TW202000891A (zh) 2018-03-07 2020-01-01 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 純化抗體之方法
PE20210665A1 (es) 2018-03-23 2021-03-31 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra mica y/o micb y sus usos
CN112469477A (zh) 2018-04-04 2021-03-09 Xencor股份有限公司 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
EP3781599A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
GB201807924D0 (en) 2018-05-16 2018-06-27 Ctxt Pty Ltd Compounds
BR112020023451A2 (pt) * 2018-05-31 2021-02-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited terapia combinada
EP3801615A1 (en) * 2018-05-31 2021-04-14 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd Combined therapy with icos binding proteins and argininemethyltransferase inhibitors
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
CN110734493B (zh) * 2018-07-20 2021-12-17 厦门大学 抗pd-1抗体及其用途
WO2020031087A1 (en) 2018-08-06 2020-02-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
JP2022513374A (ja) 2018-10-22 2022-02-07 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 投薬
CA3132185A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
EP3969438A1 (en) 2019-05-16 2022-03-23 Stingthera, Inc. Oxoacridinyl acetic acid derivatives and methods of use
US20220251079A1 (en) 2019-05-16 2022-08-11 Stingthera, Inc. Benzo[b][1,8]naphthyridine acetic acid derivatives and methods of use
EP3976831A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
US20220233691A1 (en) 2019-05-30 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
CN114127315A (zh) 2019-05-30 2022-03-01 百时美施贵宝公司 鉴定适合于免疫肿瘤学(i-o)疗法的受试者的方法
GB201910304D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
GB201910305D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
WO2021018941A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treating cancer
WO2021046289A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and ipilimumab
WO2021043961A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and chemotherapy
AU2021256652A1 (en) 2020-04-14 2022-11-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer involving anti-ICOS and anti-PD1 antibodies, optionally further involving anti-tim3 antibodies
AU2021257570A1 (en) 2020-04-14 2022-11-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
EP4136105A1 (en) 2020-04-14 2023-02-22 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer based upon an icos antibody and a pd-l1 antibody tgf-beta-receptor fusion protein
IL297313A (en) * 2020-04-20 2022-12-01 Jounce Therapeutics Inc Compositions and methods for vaccination and treatment of infectious diseases
GB202007099D0 (en) 2020-05-14 2020-07-01 Kymab Ltd Tumour biomarkers for immunotherapy
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
KR102607909B1 (ko) 2020-08-19 2023-12-01 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
WO2022047412A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and immunotherapy
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
US11883432B2 (en) 2020-12-18 2024-01-30 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity
WO2022146948A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
IL303648A (en) 2020-12-28 2023-08-01 Bristol Myers Squibb Co Antibody preparations and methods of using them
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
US20220396623A1 (en) 2021-05-18 2022-12-15 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
WO2023178192A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024030956A2 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 Mozart Therapeutics, Inc. Cd39-specific binding agents and methods of using the same
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102740887A (zh) * 2009-09-30 2012-10-17 斯隆凯特林防癌纪念中心 用于治疗癌症的组合免疫疗法
CN103517922A (zh) * 2011-03-31 2014-01-15 国家医疗保健研究所 抗icos的抗体及其用途
WO2014089113A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5559235A (en) 1991-10-29 1996-09-24 Glaxo Wellcome Inc. Water soluble camptothecin derivatives
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5342947A (en) 1992-10-09 1994-08-30 Glaxo Inc. Preparation of water soluble camptothecin derivatives
US5681835A (en) 1994-04-25 1997-10-28 Glaxo Wellcome Inc. Non-steroidal ligands for the estrogen receptor
US5491237A (en) 1994-05-03 1996-02-13 Glaxo Wellcome Inc. Intermediates in pharmaceutical camptothecin preparation
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
CN1241944C (zh) * 1995-09-11 2006-02-15 协和发酵工业株式会社 抗人白介素－5受体α链的抗体
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
CA2305350C (en) 1997-09-23 2015-04-07 Bundesrepublik Deutschland Letztvertreten Durch Den Direktor Des Robert-Koch-Instituts Costimulating polypeptide of t cells, monoclonal antibodies, and the preparation and use thereof
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
JP2003532370A (ja) 1998-10-07 2003-11-05 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規なＴｈ２特異的分子およびその使用方法
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
BR122014028365B8 (pt) 1999-06-25 2021-07-06 Genentech Inc artigo industrializado compreendendo um primeiro recipiente que compreende uma composição de humab4d5-8 nele contida e um segundo recipiente que compreende uma composição rhumab 2c4 nele contida
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
ES2305086T3 (es) 2000-05-19 2008-11-01 Corixa Corporation Tratamiento profilactico y terapeutico de enfermedades alergicas, autoinmunes e infecciosas con compuestos con base de monosacaridos.
CN1305872C (zh) 2000-06-30 2007-03-21 葛兰素集团有限公司 喹唑啉类化合物的制备方法
JP4843181B2 (ja) 2000-08-04 2011-12-21 コリクサ コーポレイション 免疫エフェクター化合物
US6374470B1 (en) 2000-10-06 2002-04-23 Milliken & Company Face plate for spun-like textured yarn
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002074803A2 (en) 2001-01-16 2002-09-26 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human icos v protein
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
US20050202442A1 (en) 2003-12-15 2005-09-15 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
EP1451224B1 (de) 2001-12-04 2012-08-15 TheraMAB LLC Peptid oder protein enthaltend ein c'-d loop der cd28 rezeptorfamilie
US6525028B1 (en) 2002-02-04 2003-02-25 Corixa Corporation Immunoeffector compounds
US6911434B2 (en) 2002-02-04 2005-06-28 Corixa Corporation Prophylactic and therapeutic treatment of infectious and other diseases with immunoeffector compounds
US20040029226A1 (en) 2002-03-06 2004-02-12 John Alsobrook Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
IL164376A0 (en) 2002-04-03 2005-12-18 Applied Research Systems Ox4or binding agents, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
DE60317677T2 (de) 2002-06-13 2008-10-30 Crucell Holland B.V. Ox40 (=cd134) rezeptor agonisten und therapeutische verwendung
US20040001831A1 (en) 2002-06-26 2004-01-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of demyelinating inflammatory disorders
EP3287144A1 (en) 2002-07-03 2018-02-28 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiating compositions
EP2322203A3 (en) 2002-10-29 2011-07-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
EP2314676A1 (en) 2002-11-26 2011-04-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2970873C (en) 2005-05-09 2022-05-17 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
CN104356236B (zh) 2005-07-01 2020-07-03 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
KR101318611B1 (ko) 2005-07-22 2013-11-13 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 유전자 재조합 항체 조성물
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
AU2006304605A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
MY162024A (en) * 2006-08-28 2017-05-31 La Jolla Inst Allergy & Immunology Antagonistic human light-specific human monoclonal antibodies
EP2703011A3 (en) 2007-05-07 2014-03-26 MedImmune, LLC Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP2211904B1 (en) * 2007-10-19 2016-08-17 Seattle Genetics, Inc. Cd19 binding agents and uses thereof
PT2594590E (pt) 2007-12-14 2015-01-14 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de ligação ao recetor humano ox40
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
US9931386B2 (en) 2008-06-16 2018-04-03 Atsuo Ochi Recombinant multiple domain fusion protein mitogens and use thereof for inducing enhancement or repression of antigen-specific immunity
US20110293605A1 (en) 2008-11-12 2011-12-01 Hasige Sathish Antibody formulation
WO2011020024A2 (en) 2009-08-13 2011-02-17 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
KR101573109B1 (ko) 2009-11-24 2015-12-01 메디뮨 리미티드 Ｂ７―ｈ１에 대한 표적화된 결합 물질
JP5950824B2 (ja) * 2009-12-07 2016-07-13 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 抗腫瘍抗体療法を増強するための方法
JP5894538B2 (ja) 2010-02-04 2016-03-30 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 炎症性ヒトＴｈ１７細胞の増殖および機能を決定的に調節するＩＣＯＳ
US8536672B2 (en) 2010-03-19 2013-09-17 Xintec, Inc. Image sensor package and fabrication method thereof
US20120121633A1 (en) 2010-07-16 2012-05-17 Sudhir Paul Hiv cd4 binding site based covalent immunogen compositions
MY171312A (en) 2010-08-23 2019-10-08 Univ Texas Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
AU2012299421B2 (en) 2011-08-23 2016-02-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-OX40 antibodies and methods of using the same
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9695247B2 (en) 2012-09-03 2017-07-04 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Antibodies directed against ICOS for treating graft-versus-host disease
WO2014055897A2 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
JOP20200094A1 (ar) * 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
SG10201807625PA (en) * 2014-11-17 2018-10-30 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
EP3331919A1 (en) * 2015-08-07 2018-06-13 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102740887A (zh) * 2009-09-30 2012-10-17 斯隆凯特林防癌纪念中心 用于治疗癌症的组合免疫疗法
CN103517922A (zh) * 2011-03-31 2014-01-15 国家医疗保健研究所 抗icos的抗体及其用途
WO2014089113A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins

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