EA036335B1 - Связывающие icos белки - Google Patents

Связывающие icos белки Download PDF

Info

Publication number
EA036335B1
EA036335B1 EA201791706A EA201791706A EA036335B1 EA 036335 B1 EA036335 B1 EA 036335B1 EA 201791706 A EA201791706 A EA 201791706A EA 201791706 A EA201791706 A EA 201791706A EA 036335 B1 EA036335 B1 EA 036335B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
icos
seq
binding protein
cell
cells
Prior art date
Application number
EA201791706A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791706A1 (ru
Inventor
Яо-Бин Лиу
Радха Шах Пармар
Патрик Мэйс
Дэниэл Олив
Original Assignee
Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед
Энсэрм (Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль)
Энститю Жан Паоли Э Ирэн Кальметт
Юниверсите Д'Экс-Марсель
Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьянтифик
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед, Энсэрм (Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль), Энститю Жан Паоли Э Ирэн Кальметт, Юниверсите Д'Экс-Марсель, Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьянтифик filed Critical Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед
Publication of EA201791706A1 publication Critical patent/EA201791706A1/ru
Publication of EA036335B1 publication Critical patent/EA036335B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к связывающему ICOS белку или его антигенсвязывающей части, которые являются агонистами для ICOS человека и не индуцируют комплемент, ADCC или CDC при приведении в контакт с Т-клетками in vivo, и к способам лечения злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса с использованием указанного связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части. Кроме того, связывающие ICOS белки или их антигенсвязывающие части по изобретению являются способными активировать Т-клетку при приведении в контакт с указанной Т-клеткой; стимулировать пролиферацию Т-клетки при приведении в контакт с указанной Т-клеткой и/или индуцировать продукцию цитокинов при приведении в контакт с указанной Т-клеткой. Изобретение относится к связывающим ICOS белкам или их антигенсвязывающим частям, содержащим одну или несколько из SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:6.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится, главным образом, к иммунотерапии в лечении заболевания человека и к уменьшению связанных с ней неблагоприятных событий. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению связывающих ICOS белков, включая антитела-агонисты ICOS, и к их применению в качестве иммуномодуляторов для лечения злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса.
Уровень техники для изобретения
Усиление функции противоопухолевых Т-клеток и индукция пролиферации Т-клеток является мощным и новым способом лечения злокачественных опухолей. Три иммуноонкологических антитела, (например, иммуномодуляторы), представлены на рынке в настоящее время. Считается, что антитело против CTLA-4 (ЕРВОЙ/ипилимумаб) усиливает иммунные ответы в точке примирования Т-клеток, и считают, что антитела против PD-1 (ОПДИВО/ниволумаб и КЕЙТРУДА/пембролизумаб) действуют в местном микроокружении опухолей посредством ослабления ингибирующей контрольной точки в специфических для опухолей Т-клетках, которые уже были примированы и активированы.
ICOS представляет собой костимулирующий рецептор Т-клеток с структурной и функциональной взаимосвязью с суперсемейством CD28/CTLA-4-Ig (Hutloff, et al., ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28, Nature, 397: 263-266 (1999)). Активация ICOS происходит посредством связывания с ICOS-L (B7RP-1/B7-H2). Ни В7-1, ни В7-2 (лиганды для CD2 8 и CTLA4) не связывают или не активируют ICOS. Однако показано, что ICOS-L слабо связывается как с CD28, так и с CTLA-4 (Yao S. et al., В7-Н2 is a costimulatory лиганд for CD28 in human, Immunity, 34(5); 729-40 (2011)). Экспрессия ICOS, по-видимому, ограничена Т-клетками. Уровни экспрессии ICOS меняются между различными подгруппами Т-клеток и в зависимости от статуса активации Т-клеток. Экспрессия ICOS показана на покоящихся клетках ТН17, фолликулярных Т-клетках-помощниках (TFH) и регуляторных Т-клетках (Трег); однако в отличие от CD28, он не экспрессируется на высоком уровне на популяциях наивных эффекторных Т-клеток ТН1 и ТН2 (Paulos C.M. et al., The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells, Sci Transl Med, 2(55); 55ra78 (2010)). Экспрессия IcOs сильно индуцируется на CD4+ и CD8+ эффекторных Т-клетках после активации посредством привлечения TCR (Wakamatsu Е., et al., Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells, Proc Natal Acad Sci USA, 110(3); 1023-8 (2013)). Передача костимулирующих сигналов через рецептор ICOS происходит только в Т-клетках, получающих параллельный сигнал активации TCR (Sharpe А.Н. и Freeman G.J. The B7-CD28 Superfamily, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002)). В активированных антигенспецифических Т-клетках ICOS регулирует продукцию цитокинов как ТН1, так и ТН2, включая IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-4, IL-13 и другие. ICOS стимулирует также пролиферацию эффекторных Т-клеток, хотя и в меньшей степени, чем CD28 (Sharpe А.Н. and Freeman G.J. The B7CD28 Superfamily, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))
Растущий объем литературы подтверждает идею, что активация ICOS на CD4+ и CD8+ эффекторных Т-клетках обладает противоопухолевым потенциалом. Слитый белок ICOS-L-Fc вызывал задержку роста опухолей и полное уничтожение опухолей у мышей с сингенными опухолями SA-1 (саркомой), Meth (фибросаркомой), ЕМТ6 (опухолью молочной железы) и Р815 (мастоцитомой), и EL-4 (плазмацитомой), в то время как активности не наблюдали в модели опухоли B16-F10 (меланомы), которая, как известно, является слабо иммуногенной (Ara G. et al., Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors in syngeneic hosts, Int. J Cancer, 103(4); 501-7 (2003)). Противоопухолевая активность ICOS-L-Fc зависела от интактного иммунного ответа, поскольку активность была полностью утрачена в опухолях, выращенных у мышей nude. Анализ опухолей из мышей, подвергнутых лечению ICOS-L-Fc, показал значительное увеличение инфильтрации CD4+ и CD8+ Т-клеток в опухоли, способные отвечать на лечение, что поддерживает иммуностимулирующий эффект ICOS-L-Fc в этих моделях.
В другом сообщении с использованием мышей ICOS-/- и ICOS-L показано привлечение передачи сигналов ICOS в опосредовании противоопухолевой активности антитела против CTLA4 в модели сингенной опухоли меланомы В16/В16 (Fu T. et al., The ICOS/ICOSL pathway is required for optimal antitumor responses mediated by anti-CTLA-4 therapy, Cancer Res, 71(16); 5445-54 (2011)). Мыши, лишенные ICOS или ICOS-L, обладали значительно уменьшенными процентами выживаемости по сравнению с мышами дикого типа после лечения антителом против CTLA4. В отдельном исследовании клетки опухолей В16/В16 трансдуцировали для сверхэкспрессии рекомбинантного мышиного ICOS-L. Обнаружено, что эти опухоли являются значительно более чувствительными к лечению против CTLA4 по сравнению с клетками опухолей В16/В16, трансдуцированными контрольным белком (Allison J. et al., Combination immunotherapy for the treatment of cancer, WO2011/041613 A2 (2009)). В этих исследованиях представлено доказательство противоопухолевого потенциала агониста ICOS как отдельно, так и в комбинации с другими иммуномодулирующими антителами.
Поступающие данные для пациентов, подвергнутых лечению с использованием антител против CTLA4, также указывают на положительную роль ICOS+ эффекторных Т-клеток в опосредовании противоопухолевого иммунного ответа. Пациенты с метастазирующей меланомой (Giacomo A.M.D. et al., Long-term survival and immunological parameters in metastatic melanom patients who respond to ipilimumab
- 1 036335 mg/kg within an expanded access program, Cancer Immunol Immunother., 62(6); 1021-8 (2013)); уротелиальным раком (Carthon В.С. et al., Preoperative CTLA-4 blockade: Tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial, Clin Cancer Res., 16(10); 2861-71 (2010)); раком молочной железы (Vonderheide R.H. et al., Tremelimumab in combination with exemestane in patients with advanced breast cancer and treatment-associated modulation of inducible costimulator expression on patient T cells, Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010)) и раком предстательной железы, обладающие увеличенным абсолютным количеством циркулирующих и инфильтрующих опухоль CD4' ICOS+ и CD8' ICOS+ T-клеток после лечения ипилимумабом, обладают значительно лучшими связанными с лечением исходами, чем пациенты, у которых наблюдали небольшое увеличение или отсутствие увеличения. Важно, показано, что ипилимумаб изменяет соотношение ICOS+ T эффекторные:Трег, обращая преобладание Трег до лечения в значительное преобладание Т эффекторных по сравнению с Трег после лечения (Liakou C.I. et al., CTLA-4 blockade increases IFN-gamm producing CD4+ICOShi cells to shift ratio of effector to regulatory T cells in cancer patients, Proc Natl Acad Sci USA. 105(39); 14987-92 (2008)) и (Vonderheide R.H. et al., Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010)). Таким образом, положительные по ICOS эффекторные Т-клетки являются положительным прогностическим биомаркером ответа на ипилимумаб, который указывает на потенциальное преимущество активации этой популяции клеток с использованием антитела-агониста ICOS.
Таким образом, существует необходимость в дополнительных молекулах, индуцирующих пролиферацию Т-клеток, для лечения злокачественных опухолей.
Сущность изобретения
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающим ICOS белкам или их антигенсвязывающим частям, содержащим одно или несколько из CDRH1, как указано в SEQ ID NO:1; CDRH2, как указано в SEQ ID NO:2; CDRH3, как указано в SEQ ID NO:3; CDRL1, как указано в SEQ ID NO:4; CDRL2, как указано в SEQ ID NO:5? и/или CDRL3, как указано в SEQ ID NO:6, или прямого эквивалента каждой CDR, где прямой эквивалент имеет не более двух аминокислотных замен в указанной CDR.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающим ICOS белкам их или их антигенсвязывающим частям, специфически связывающимся с ICOS человека, где указанный связывающий ICOS белок содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:7, и/или домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:8.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированным моноклональным антителам или их антигенсвязывающим частям, содержащим CDR тяжелой цепи, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, и CDR легкой цепи, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированным моноклональным антителам, содержащим каркас hIgG4PE; домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:7; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:8. Антитела по настоящему изобретению могут стимулировать продукцию цитокинов при контакте с Т-клетками.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающим ICOS белкам, конкурирующим за связывание с ICOS человека с любым из связывающих ICOS белков или с их антигенсвязывающими частями по изобретению.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса с использованием связывающего ICOS белка или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один связывающий ICOS белок по настоящему изобретению.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - продукция IFN-γ CD4+CD25- Т-клетками.
Фиг. 2 - пролиферация CD4+CD25- Т-клеток.
Фиг. 3 - для гуманизированного варианта H2L5 антитела против ICOS 422.2 показана лучшая продукция цитокинов в клетках РВМС.
Фиг. 4 - 422 H2L5 IgG1 индуцировало уменьшенную жизнеспособность Т-клеток, чего не наблюдали для изотипа с инактивированным Fc или изотипа hIgG4PE.
Фиг. 5 - зависимый от дозы ответ индуцированной H2L5 hIgG4PE индукции провоспалительных цитокинов в CD4+ Т-клетках человека.
Фиг. 6 - H2L5 hIgG4PE индуцирует пролиферацию, продукцию цитокинов и увеличивает цитотоксический потенциал в активированных РВМС от здоровых доноров-людей.
Фиг. 7 - анализ Meso Scale Discovery (MSD), показывающий ингибирование связывания ICOS-L с ICOS посредством H2L5 hIgG4PE, показывающее, что оно связывается с тем же самым эпитопом на ICOS, что и ICOS-L, и конкурирует за связывание.
Фиг. 8 - выделенные гены VH и VL антитела из РНК клона гибридомы 422.2.
- 2 036335
Фиг. 9 - белковые последовательности тяжелых и легких цепей H2L5 hIgG4PE с сигнальной последовательностью.
Фиг. 10 - последовательность ДНК кодирующей области тяжелой цепи H2L5 hIgG4PE с сигнальной последовательностью.
Фиг. 11 - последовательность ДНК кодирующей области легкой цепи H2L5 hIgG4PE с сигнальной последовательностью.
Фиг. 12 - концентрации H2L5 hIgG4PE в плазме яванских макаков. Концентрации определяли после (А) первой или (В) второй дозы (сутки 15) H2L5 hIgG4PE. Животных умерщвляли через 48 ч после второй дозы для сбора образцов ткани и гистопатологического анализа.
Фиг. 13 - детекция связывания H2L5 hIgG4PE с CD4+ Т-клетками из селезенки и подмышечных лимфатических узлов обезьян. Ткань собирали через 48 ч после второй дозы (сутки 17).
Фиг. 14 - занятость рецепторов H2L5 hIgG4PE в CD4+ Т-клетках крови яванских макаков.
(А) Свободный рецептор ICOS, как измерено по положительному связыванию флуоресцентно меченного антитела против ICOS, использованного для проточной цитометрии, которое связывается только когда H2L5 hIgG4PE не присутствует.
(В) Рецептор, связанный с H2L5 hIgG4PE на CD4+ клетках периферической крови, как измерено по флуоресцентно меченному антителу против IgG человека.
Фиг. 15(а) - уровни экспрессии фосфо-АКТ (Т308) в клетках Ba/F3-ICOS, обработанных H2L5 hIgG4PE - массив антител для внутриклеточной передачи сигналов. (b) Уровни экспрессии фосфо-АКТ (S473) в клетках Ba/F3-ICOS, обработанных H2L5 hIgG4PE - массив антител для внутриклеточной передачи сигналов.
Фиг. 16 - H2L5 hIgG4PE в комбинации с ипилимумабом приводит к увеличенной продукции провоспалительных цитокинов по сравнению с обработкой одиночным антителом в анализе предварительной стимуляции РВМС.
Фиг. 17 - H2L5 hIgG4PE в комбинации с пембролизумабом приводит к увеличенной продукции провоспалительных цитокинов по сравнению с лечением одиночным антителом в анализе предварительной стимуляции РВМС.
Фиг. 18 - комбинация H2L5 hIgG4PE плюс ипилимумаб индуцирует увеличенную продукцию провоспалительных цитокинов в модифицированном анализе MLR с использованием пептида CEFT и предварительной инкубации.
Фиг. 19 - комбинация H2L5 hIgG4PE плюс пембролизумаб индуцирует увеличенную продукцию провоспалительных цитокинов в модифицированном анализе MLR с использованием пептида CEFT и предварительной инкубации.
Фиг. 20 - агонистическое mAb против ICOS H2L5 hIgG4PE отдельно и в комбинации с пембролизумабом приводит к ингибированию роста опухолей в модели опухоли меланомы РВМС А2058 человека на мышах.
Фиг. 21 - мышиное суррогатное mAb против ICOS приводит к значительному ингибированию роста опухолей и увеличенной выживаемости в комбинации с мышиным суррогатным mAb против PD1 в модели опухоли СТ26 на мышах.
Фиг. 22 - мышиное суррогатное mAb против ICOS приводит к значительному ингибированию роста опухолей и увеличенной выживаемости в комбинации с мышиным суррогатным mAb против PD1 в модели опухоли ЕМТ6 на мышах.
Подробное описание изобретения
Определения
В рамках изобретения ICOS обозначает любой индуцируемый костимулирующий Т-клетки белок. Другие обозначения для ICOS (Inducible T-cell COStimulator (индуцируемый костимулятор Т-клеток)) включают в себя AILIM; CD278; CVID1, JTT-1 или JTT-2, MGC39850 или 8F4. ICOS представляет собой костимулирующую молекулу суперсемейства CD28, которая экспрессируется на активированных Тклетках. Белок, кодируемый этим геном, принадлежит к семейству рецепторов поверхности клеток CD28 и CTLA-4. Он формирует гомодимеры и играет важную роль в передаче сигналов клетка-клетка, иммунных ответах и регуляции пролиферации клеток. Аминокислотная последовательность ICOS человека показана ниже как SEQ ID NO:10.
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGG
QILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVS FFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTL
TGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKM (SEQ ID NO:10)
В рамках изобретения ICOS-L и лиганд ICOS используют взаимозаменяемо, и они относятся к связанному с мембраной природному лиганду ICOS человека. Лиганд ICOS представляет собой белок, кодируемый у человека геном ICOSLG. ICOSLG обозначают также как CD275 (кластер дифференцировки 275). Другие обозначения для ICOS-L включают в себя B7RP-1 и В7-Н2.
В рамках изобретения термин агонист относится к антигенсвязывающему белку, например к связывающему ICOS белку, который при контакте с ICOS вызывает одно или несколько из следующего: (1)
- 3 036335 стимулирует или активирует рецептор ICOS, (2) усиливает, увеличивает или стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие ICOS и/или (3) усиливает, увеличивает, стимулирует или индуцирует экспрессию ICOS. Агонистическую активность можно измерять in vitro посредством различных анализов, известных в данной области, таких как, но без ограничения, измерение передачи сигналов в клетках, пролиферации клеток, маркеров активации иммуноцитов, продукции цитокинов. Агонистическую активность можно также измерять in vivo посредством различных анализов, измеряющих суррогатные конечные точки, таких как, но без ограничения, измерение пролиферации Т-клеток или продукции цитокинов.
В рамках изобретения, термин перекрестная конкуренция за связывание относится к любому связывающему ICOS белку, который может конкурировать за связывание с ICOS с любым из связывающих ICOS белков по настоящему изобретению. Конкуренцию за связывание с ICOS между двумя молекулами можно тестировать различными способами, известными в данной области, включая проточную цитометрию, Meso Scale Discovery и ELISA. Связывание можно измерять напрямую, что означает, что два или более связывающих белка можно приводить в контакт с ICOS, и связывание можно измерять для одного или для каждого. Альтернативно, можно тестировать связывание представляющей интерес молекулы против связывания природного лиганда и количественно сравнивать друг с другом.
Термин связывающий ICOS белок в рамках изобретения относится к антителам и другим белковым конструкциям, таким как домены, способным связывать ICOS. В некоторых случаях, ICOS представляет собой ICOS человека. Термин связывающий ICOS белок можно использовать взаимозаменяемо с антигенсвязывающий белок для ICOS. Таким образом, как известно в данной области, антитела против ICOS и/или антигенсвязывающие белки для ICOS рассматривают как связывающие ICOS белки. В рамках изобретения, антигенсвязывающие белок представляет собой любой белок, включая, но без ограничения, антитела, домены и другие конструкции, описанные в настоящем документе, которые связываются с антигеном, таким как ICOS. В рамках изобретения, антигенсвязывающая часть связывающего ICOS белка может включать любую часть связывающего ICOS белка, способную связывать ICOS, включая, но без ограничения, антигенсвязывающий фрагмент антитела.
Термин антитело используют в настоящем описании в самом широком смысле для обозначения молекул с иммуноглобулиноподобным доменом (например, IgG, IgM, IgA, IgD или IgE), и он включает в себя моноклональные, рекомбинантные, поликлональные, химерные, человеческие, гуманизированные, мультиспецифические антитела, включая биспецифические антитела, и гетероконъюгированные антитела; антитело с одиночным вариабельным доменом (например, VH, VHH, VL (dAb™)), антигенсвязывающие фрагменты антител, Fab, F(ab')2, Fv, связанные дисульфидными связями Fv, одноцепочечные Fv, связанные дисульфидными связями scFv, диатела, TANDABS™ и т.д. и модифицированные варианты любого из вышеуказанного.
Альтернативные форматы антител включают альтернативные кракасы, в которых один или несколько CDR антигенсвязывающего белка могут быть аранжированы в подходящем каркасе или скелете не относящегося к иммуноглобулинам белка, такого как аффитело, каркас SpA, домен рецептора LDL класса А, авимер или домен EGF.
Термин домен относится к свернутой белковой структуре, которая сохраняет свою третичную структуру независимо от остальной части белка. Как правило, домены являются ответственными за отдельные функциональные свойства белков, и во многих случаях их можно добавлять, удалять или переносить в другие белки без потери функции остального белка и/или домена.
Термин одиночный вариабельный домен относится к свернутому полипептидному домену, содержащему последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Таким образом, он включает полные вариабельные домены антител, такие как VH, VHH и VL, и модифицированные вариабельные домены антител, например домены, в которых одна или несколько петель заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые были укорочены или содержат N- или С-концевые удлинения так же, как свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, активность и специфичность связывания полноразмерного домена. Одиночный вариабельный домен является способным связывать антиген или эпитоп независимо от другой вариабельной области или домена. Доменное антитело или dAb(™) можно рассматривать так же, как одиночный вариабельный домен. Одиночный вариабельный домен может представлять собой человеческий одиночный вариабельный домен, но также включает одиночные вариабельные домены из других видов, таких как грызуны, акула-нянька и VHH dAb™ верблюдовых. VHH верблюдовых представляют собой полипептиды одиночного вариабельного домена иммуноглобулинов, полученные из видов, включая верблюда, ламу, альпаку, дромадера и гуанако, которые продуцируют тяжелую цепь антитела, естественным образом лишенную легких цепей. Такие домены VHH можно гуманизировать в соответствии со стандартными способами, доступными в данной области, и такие домены рассматривают как являющиеся одиночными вариабельными доменами. В рамках изобретения VH включает домены VHH верблюдовых.
Антигенсвязывающий фрагмент можно предоставлять посредством способов аранжировки одной
- 4 036335 или нескольких CDR в не относящихся к антителам белковых остовов. Белковый остов в рамках изобретения включает, без ограничения, иммуноглобулиновый (Ig) остов, например остов IgG, который может представлять собой антитело из четырех цепей или двух цепей, или который может содержать только область Fc антитела, или который может содержать одну или несколько константных областей антитела, где константные области могут происходить из человека или приматов, или который может представлять собой искусственную химеру константных областей человека и примата.
Белковый остов может представлять собой остов Ig, например остов IgG или остов IgA. Остов IgG может содержать некоторые или все домены антитела (т.е. CH1, CH2, СН3, VH, VL). Антигенсвязывающий белок может содержать остов IgG, выбранный из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или IgG4PE. Например, остов может представлять собой IgG1. Остов может состоять из области Fc антитела или содержать ее, или являться ее частью.
Белковый остов может представлять собой производное остова, выбранного из группы, состоящей из CTLA-4, липокалина, полученных из белка молекул, таких как Z-домен белка (Affibody, SpA), Адомен (Avimer/Maxibody); белки теплового шока, такие как GroEl и GroES; трансферрин (трансантитело); белок с анкириновым повтором (DARPin); пептидный аптамер; лектиновый домен С-типа (тетранектин); γ-кристаллин человека и убиквитин человека (аффилины); домены PDZ; токсин скорпиона, домены ингибиторов протеазы человека типа доменов Куница; и фибронектин/аднектин; которые подвергали модификации белка, чтобы получить связывание с антигеном, таким как ICOS, отличным от природного лиганда.
Антигенсвязывающий участок относится к участку антигенсвязывающего белка, способному специфически связывать антиген, который может представлять собой одиночный вариабельный домен, или может представлять собой спаренные домены VH/VL, как можно обнаружить в стандартном антителе. Одноцепочечные домены Fv (ScFv) могут также предоставлять антигенсвязывающие участки. Термин эпитопсвязывающий домен относится к домену, который специфически связывается с областью антигена, известной, как эпитоп, независимо от другого домена.
Термин мультиспецифический антигенсвязывающий белок относится к антигенсвязывающим белкам, содержащим по меньшей мере два различных антигенсвязывающих участка. Каждый из этих антигенсвязывающих участков способен связываться с различным эпитопом, которые могут присутствовать на одном и том же антигене или на различных антигенах. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок может обладать специфичностью для более чем одного антигена, например для двух антигенов, или для трех антигенов, или для четырех антигенов.
Примеры мультиспецифических антигенсвязывающих белков включает белки, которые состоят, или в основном состоят из области Fc антитела, или ее части, связанной с каждого конца, напрямую или опосредовано (например, через линкерную последовательность), со связывающим доменом. Такой антигенсвязывающий белок может содержать два связывающих домена, разделенных областью Fc, или ее частью. Под разделением понимают, что связывающие домены не связаны непосредственно друг с другом, и могут быть локализованы на противоположных концах (С- и N-конце) области Fc, или любой другой каркасной области.
Антигенсвязывающий белок может содержать две каркасных области, где каждая связана с двумя связывающими доменами, например, на N- и С-конце каждой каркасной области, либо напрямую, либо опосредовано через линкер. Каждый связывающий домен может связываться с различным антигеном.
В рамках изобретения, термин mAbdAb относится к моноклональному антителу, связанному с дополнительным связывающим доменом, в частности одиночным вариабельным доменом, таким как доменное антитело. mAbdAb обладает по меньшей мере двумя антигенсвязывающими участками, по меньшей мере один из которых происходит из доменного антитела и по меньшей мере один происходит из спаренного домена VH/VL.
Конъюгат dAb™ относится к композиции, содержащей dAb, с которым лекарственное средство химически конъюгировано посредством ковалентной или нековалентной связи.
Предпочтительно dAb и лекарственное средство связаны ковалентно. Такое ковалентное связывание можно проводить через пептидную связь или другими способами, например через модифицированную боковую связь. Нековалентное связывание может являться непосредственным (например, электростатическое взаимодействие, гидрофобное взаимодействие) или опосредованным (например, через нековалентное связывание комплементарных партнеров по связыванию (например, биотина и авидина), где один партнер ковалентно связан с лекарственным средством, и комплементарный партнер по связыванию ковалентно связан с dAb™). Когда используют комплементарных партнеров по связыванию, один из партнеров по связыванию может являться ковалентно связанным с лекарственным средством напрямую или посредством подходящей линкерной группы, и комплементарный партнер по связыванию может являться ковалентно связанным с dAb™ напрямую или посредством подходящей линкерной группы.
В рамках изобретения, слитый с dAb™ белок относится к слитому белку, который содержит dAb™ и полипептидное лекарственное средство (которое может представлять собой dAb™ или mAb). dAb™ и полипептидное лекарственное средство присутствуют в качестве отдельных частей (групп) од
- 5 036335 ной непрерывной полипептидной цепи.
В одном варианте осуществления, антигенсвязывающие белки по настоящему описанию проявляют перекрестную реакционную способность между ICOS человека и ICOS из других видов, таких как ICOS яванского макака. В одном варианте осуществления, антигенсвязывающие белки по изобретению специфически связывают ICOS человека и яванского макака. Предоставление лекарственного средства, которое может связывать молекулы человека и обезьян, позволяет тестировать результаты в этой системе и проводить параллельное сравнение данных с использованием одного и того же лекарственного средства. Предусматривают перекрестную реакционную способность между другими видами, используемыми в моделях заболевания, такими как собака или обезьяна, особенно обезьяна.
Конкуренцию между связывающим ICOS белком и эталонным связывающим ICOS белком можно определять посредством анализа конкуренции MSD, ELISA, FMAT или BIAcore. В одном варианте осуществления, анализ конкуренции проводят посредством сравнения связывания связывающего ICOS белка со связыванием лиганда ICOS. Существует несколько возможных причин для этой конкуренции: два белка могут связывать одинаковые или перекрывающиеся эпитопы, может присутствовать стерическое ингибирование или связывание первого белка может индуцировать конформационное изменение антигена, которое предотвращает или уменьшает связывание второго белка.
Термин нейтрализует, как используют на протяжении настоящего описания, означает, что взаимодействие между ICOS и ICOS-L уменьшено в присутствии антигенсвязывающего белка, как описано в настоящем описании, по сравнению с взаимодействием ICOS и ICOS-L в отсутствие связывающего ICOS белка, in vitro или in vivo. Нейтрализация может происходить из-за одного или нескольких из блокирования связывания ICOS с его лигандом, предотвращения активации ICOS посредством его лиганда, понижающей регуляции ICOS или его рецептора, или влияния на функциональность эффектора. Например, конкуренцию с лигандом за связывание, описанную в примерах 3 и 5, можно использовать для оценки нейтрализующей способности связывающего ICOS белка.
Эффект связывающего ICOS белка на взаимодействие между ICOS и ICOS-L может быть частичным или полным. Нейтрализация связывающего ICOS белка может блокировать взаимодействие ICOS с ICOS-L по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% относительно взаимодействий ICOS - ICOS-L в отсутствие связывающего ICOS белка.
Нейтрализацию можно определять или измерять с использованием одного или нескольких анализов, как известно специалисту в данной области или как описано в настоящем описании.
Аффинность представляет собой силу связывания одной молекулы, например антигенсвязывающего белка по изобретению, с другим, например его антигеном-мишенью, в одном участке связывания. Аффинность связывания антигенсвязывающего белка с его мишенью можно определять посредством способов на основании равновесия (например, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммунного анализа (RIA)) или анализа кинетики (например, анализа BIACORE™). Например, способы Biacore™, описанные в примере 5, можно использовать для измерения аффинности связывания.
Авидность представляет собой общую сумму силы связывания двух молекул друг с другом в многих участках, например, принимая во внимание валентность взаимодействия.
В одном варианте осуществления, равновесная константа диссоциации (KD) взаимодействия связывающий ICOS белок-ICOS составляет 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 2 нМ или менее или 1 нМ или менее. Альтернативно, KD может составлять между 5 и 10 нМ; или между 1 и 2 нМ. KD может составлять между 1 и 500 пМ или между 500 пМ и 1 нМ. Специалисту в данной области понятно, что чем меньше числовое значение KD, тем сильнее связывание. Обратная величина KD (т.е. 1/KD) представляет собой равновесную константу связывания (KA), имеющего единицы М-1. Специалисту в данной области понятно, что чем больше числовое значение KA, тем сильнее связывание.
Константа скорости диссоциации (kd) или скорость диссоциации описывает стабильность комплекса связывающего ICOS белка с ICOS, т.е. долю комплексов, распадающихся за 1 с.
Например, kd 0,01 с-1 эквивалентно 1% комплексов, распадающихся за 1 с. В одном варианте осуществления константа скорости диссоциации (kd) составляет 1х 10-3 с-1 или менее, 1х 10-4 с-1 или менее, 1 х 10-5 с-1 или менее или 1 х 10-6 с-1 или менее, kd может составлять между 1 х 10-5 с-1 и 1 х 10-4 с-1 или между 1 х 10-4 с-1 и 1 х 10-3 с-1. Константа скорости связывания (ka) или скорость связывания описывает скорость формирования комплекса связывающий ICOS белок-ICOS. В одном варианте осуществления константа скорости связывания (ka) составляет приблизительно 1,0х105 М-1 с-1.
Под выделенной подразумевают, что молекула, такая как антигенсвязывающий белок или нуклеиновая кислота, удалена из окружения, в котором ее можно обнаружить в природе. Например, молекула может являться очищенной от веществ, с которыми она в норме может существовать в природе. Например, масса молекулы в образце может составлять 95% от суммарной массы.
Термин экспрессирующий вектор в рамках изобретения обозначает выделенную нуклеиновую кислоту, которую можно использовать для введения представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетку, такую как эукариотическая клетка или прокариотическая клетка, или в бесклеточную экспрессирующую систему, где представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты экспрессиру
- 6 036335 ют в форме пептидной цепи, такой как белок. Такие экспрессирующие векторы могут представлять собой, например, космиды, плазмиды, вирусные последовательности, транспозоны и линейные нуклеиновые кислоты, содержащие представляющую интерес нуклеиновую кислоту. После введения экспрессирующего вектора в клетку или в бесклеточную экспрессирующую систему (например, лизат ретикулоцитов), белок, кодируемый представляющий интерес нуклеиновой кислотой, продуцируется посредством аппарата трнскрипции/трансляции. Экспрессирующие векторы в объеме описания могут предоставлять необходимые элементы для эукариотической или прокариотической экспрессии и включают векторы, управляемые вирусным промотором, такие как векторы, управляемые промотором CMV, например pcDNA3.1, pCEP4, и их производные, бакуловирусные экспрессирующие векторы, экспрессирующие векторы для Drosophila, и экспрессирующие векторы, управляемые промоторами генов млекопитающих, такими как промоторы генов Ig человека. Другие примеры включают прокариотические экспрессирующие векторы, такие как векторы, управляемые промотором Т7, например рЕТ41, векторы, управляемые промотором лактозы, и векторы, управляемые промотором арабинозы. Специалисту в данной области известны многие другие пригодные экспрессирующие векторы и экспрессирующие системы.
Термин рекомбинантная клетка-хозяин в рамках изобретения обозначает клетку, содержащую представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, которая была выделена перед ее введением в клетку. Например, представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты может находиться в экспрессирующем векторе, в то время как клетка может являться прокариотической или эукариотической. Иллюстративные эукариотические клетки представляют собой клетки млекопитающих, такие как, но без ограничения, клетки COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, СНО, BSC-1, HepG2, 653, SP2/0, NS0, 293, HeLa, миеломы, лимфомы или любое их производное. Наиболее предпочтительно эукариотическая клетка представляет собой клетку HEK293, NS0, SP2/0 или СНО. Е. coli представляет собой иллюстративную прокариотическую клетку. Рекомбинантную клетку, в соответствии с описанием, можно получать посредством трансфекции, слияния клеток, иммортализации или других способов, хорошо известных в данной области. Представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты, такая как экспрессирующий вектор, трансфицированный в клетку, может являться внехромосомной или стабильно интегрированной в хоромосому клетки.
Химерное антитело относится к типу сконструированного антитела, которое содержит природные вариабельные области (легкой цепи и тяжелой цепи), полученные из донорного антитела в ассоциации с константными областями легкой и тяжелой цепей, полученными из акцепторного антитела.
Гуманизированное антитело относится к типу сконструированного антитела, обладающего CDR, полученными из не относящегося к человеку донорного иммуноглобулина, где оставшиеся полученные из иммуноглобулинов части молекулы получены из одного или нескольких человеческого иммуноглобулина(иммуноглобулинов). Кроме того, каркасные поддерживающие остатки можно изменять для сохранения аффинности связывания (см., например, Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson, et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Пригодное человеческое акцепторное антитело может представлять собой антитело, выбранное из общепринятой базы данных, например базы данных KABAT™, базы данных Los Alamos и базы данных Swiss Protein, по гомологии с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями донорного антитела.
Человеческое антитело, характеризуемое гомологией с каркасными областями донорного антитела (на основании аминокислот), может являться пригодным для предоставления константной области тяжелой цепи и/или каркасной области вариабельной части тяжелой цепи для вставки донорных CDR. Пригодное акцепторное антитело, способное предоставлять константную область или каркасные области вариабельной части легкой цепи, можно выбирать сходным образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не обязательно должны происходить из одного и того же акцепторного антитела. В предшествующей области техники описано несколько способов получения таких гуманизированных антител, см., например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.
Термин полностью человеческое антитело включает антитела, обладающие вариабельными и константными областями (если присутствуют), полученные из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулинов. Человеческие последовательности антител по изобретению могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими зародышевыми последовательностями иммуноглобулинов (например, мутации, введенные посредством случайного или сайтспецифического мутагенеза in vitro или посредством соматических мутаций in vivo). Полностью человеческие антитела содержат аминокислотные последовательности, кодируемые только посредством полинуклеотидов, в конечном итоге имеющими человеческое происхождение, или аминокислотные последовательности, идентичные таким последовательностям. Как понимают в рамках изобретения, антитела, кодируемые ДНК, кодирующей человеческие иммуноглобулины, вставленной в мышиный геном, продуцированные в трансгенной мыши, являются полностью человеческими антителами, поскольку они кодированы ДНК, в конечном итоге имеющей человеческое происхождение. В этой ситуации, ДНК, кодирующая человеческие иммуноглобулины, может подвергаться реаранжировке (для кодирования антитела) в организме мыши, и могут происходить также соматические мутации. Антитела, кодируемые исходно человеческой ДНК, подвергнутые таким изменениям в организме мыши, являются полностью челове- 7 036335 ческими антителами, как понимают в рамках изобретения. Применение таких трансгенных мышей обеспечивает возможность отбора полностью человеческих антител против антигена человека. Как понимают в данной области, полностью человеческие антитела можно получать с использованием технологии фагового дисплея, где библиотеку ДНК человека вставляют в фаг для получения антител, содержащих человеческую зародышевую последовательность ДНК.
Термин донорное антитело относится к антителу, вносящему вклад аминокислотных последовательностей своих вариабельных областей, CDR или других функциональных фрагментов или их аналогов в первого иммуноглобулинового партнера. Донор, таким образом, обеспечивает измененную кодирующую область иммуноглобулина, и в результате экспрессируется измененное антитело с антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, характерной для донорного антитела.
Термин акцепторное антитело относится к антителу, гетерологичному по отношению к донорному антителу, вносящему вклад всех (или любой части) аминокислотных последовательностей, кодирующих каркасные области своей тяжелой и/или легкой цепи и/или константные области своей тяжелой и/или легкой цепи, в первого иммуноглобулинового партнера. Человеческое антитело может являться акцепторным антителом.
Термины VH и VL используют в настоящем описании для обозначения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи соответственно антигенсвязывающего белка.
CDR определяют как аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей антигенсвязывающего белка. Существуют гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Существует три CDR (или области CDR) тяжелой цепи и три CDR (или области CDR) легкой цепи в вариабельной части иммуноглобулина. Таким образом, CDR в рамках изобретения относится ко всем трем CDR тяжелой цепи, всем трем CDR легкой цепи, ко всем CDR тяжелой и легкой цепей или по меньшей мере к двум CDR.
На протяжении этого описания, аминокислотные остатки в последовательностях вариабельных доменов и в последовательностях полноразмерных антител пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat. Подобным образом, термины CDR, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, CDRH3, используемые в примерах, следуют системе нумерации Kabat. Дополнительную информацию см. в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health и Human Services, National Institutes of Health (1991).
Специалисту в данной области очевидно, что существуют альтернативные системы нумерации для аминокислотных остатков в последовательностях вариабельных доменов и в последовательностях полноразмерных антител. Существуют также альтернативные системы нумерации для последовательностей CDR, например системы, описанные в Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883. Структура и сворачивание белка антитела могут означать, что другие остатки следует рассматривать как часть последовательности CDR, и наличие этого может понять специалист в данной области.
Другие системы нумерации для последовательностей CDR, доступные специалисту в данной области, включают способ AbM (University of Bath) и контактный способ (University College London). Минимальную перекрывающуюся область с использованием по меньшей мере двух из способов Kabat, Chothia, AbM и контактного способа можно определять как предоставляющую минимальную единицу связывания. Минимальная единица связывания может являться субфрагментом CDR.
В табл. 1 ниже представлено одно определение с использованием каждой системы нумерации для каждой CDR или единицы связывания. Схема нумерации Kabat использована в табл. 1 для нумерации домен аминокислотной последовательности вариабельного домена. Следует отметить, что некоторые из определений CDR могут меняться в зависимости от индивидуальных использованных публикаций.
Таблица 1
CDR по Kabat CDR по Chothia CDR по AbM Контактная CDR Минимальная единица связывания
H1 31-35/35А/ 35В 26-32/33/34 2635/35А/35В 3035/35А/35В 31-32
Н2 50-65 52-56 50-58 47-58 52-56
НЗ 95-102 95-102 95-102 93-101 95-101
L1 24-34 24-34 24-34 30-36 30-34
L2 50-56 50-56 50-56 46-55 50-55
L3 89-97 89-97 89-97 89-96 89-96
Соответственно представлены связывающие ICOS белки, содержащие любую одну или комбинацию из следующих CDR:
CDRHl: DYAMH (SEQ ID NO:1)
CDRH2: LISIYSDHTNYNQKFQG (SEQ ID NO: 2 )
CDRH3: NNYGNYGWYFDV (SEQ ID NO:3)
CDRL1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO:4)
CDRL2: DTSKLAS (SEQ ID NO:5)
CDRL3: FQGSGYPYT (SEQ ID NO:6)
В одном варианте осуществления настоящего изобретения связывающий ICOS белок содержит CDRH1 (SEQ ID NO:1), CDRH2 (SEQ ID NO:2) и CDRH3 (SEQ ID NO:3) в вариабельной области тяже- 8 036335 лой цепи, обладающей аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:7. Связывающие ICOS белки по настоящему изобретению, содержащие гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO:7, обозначены как Н2. В некоторых вариантах осуществления связывающие ICOS белки по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:7. Подходящим образом, связывающие ICOS белки по настоящему изобретению могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, обладающую приблизительно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:7.
Вариабельная область (VH) гуманизированной тяжелой цепи (Н2)
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYAMHWVRO PGQGLEWMGL
ISIYSDHTNY NQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCGRNN YGNYGWYFDV WGQGTTVTVS S (SEQ ID NO:7)
В одном варианте осуществления настоящего изобретения связывающий ICOS белок содержит CDRL1 (SEQ ID NO:4), CDRL2 (SEQ ID NO:5) и CDRL3 (SEQ ID NO:6) в вариабельной области легкой цепи, обладающей аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:8. Связывающие ICOS белки по настоящему изобретению, содержащие гуманизированную вариабельную область легкой цепи, указанную в SEQ ID NO:8, обозначены как L5. Таким образом, связывающий ICOS белок по настоящему изобретению, содержащий вариабельную область тяжелой цепи из SEQ ID NO:7 и вариабельную область легкой цепи из SEQ ID NO:8, можно обозначать в настоящем описании как H2L5.
Подходящая лидерная последовательность для конструкций вариабельной тяжелой цепи и легкой цепи показана на фиг. 9 и включает, но без ограничения:
MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:11)
В некоторых вариантах осуществления, связывающие ICOS белки по настоящему изобретению содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:8. Подходящим образом, связывающие ICOS белки по настоящему изобретению могут содержать вариабельную область легкой цепи, обладающую приблизительно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:8.
Вариабельная область (VL) гуманизированной легкой цепи (L5)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASSSVS YMHWYOQKPG OAPRLLIYDT
SKLASGIPAR FSGSGSGTDY TLTISSLEPE DFAVYYCFQG SGYPYTFGOG TKLEIK (SEQ ID NO:8)
CDR или минимальные единицы связывания можно модифицировать посредством по меньшей мере одной аминокислотной замены, делеции или добавления, где вариант антигенсвязывающего белка в основном сохраняет биологические характеристики немодифицированного белка, такого как мышиное антитело, продуцированное из клона 422.2, или антитело, содержащее SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.
Следует понимать, что каждую из CDR H1, Н2, Н3, L1, L2, L3 можно модифицировать отдельно или в комбинации с любой другой CDR, в любой пермутации или комбинации. В одном варианте осуществления CDR является модифицированной посредством замены, делеции или добавления вплоть до 3 аминокислот, например 1 или 2 аминокислот, например 1 аминокислоты. Как правило, модификация представляет собой замену, в частности консервативную замену, например, как показано в табл. 2 ниже.
Таблица 2
Например, в варианте CDR, аминокислотные остатки минимальной единицы связывания могут оставаться такими же, но фланкирующие остатки, содержащиеся в CDR как части определения(определений) Kabat или Chothia, могут быть заменены на консервативный аминокислотный остаток.
Такие антигенсвязывающие белки, содержащие модифицированные CDR или минимальные единицы связывания, как описано выше, можно обозначать в настоящем описании как функциональные варианты CDR или функциональные варианты единицы связывания. Подходящим образом, в одном варианте осуществления представлены связывающие ICOS белки, содержащие одну или несколько CDR, обладающие аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и/или 6, и/или функциональный вариант их CDR.
Термин эпитоп в рамках изобретения относится к той части антигена, которая вступает в контакт с конкретным связывающим доменом антигенсвязывающего белка. Эпитоп может быть линейным или конформационным/не непрерывным. Конформационный или не непрерывный эпитоп содержит аминокислотные остатки, разделенные другими последовательностями, т.е. не в непрерывной последовательности в первичной последовательности антигена. Хотя остатки могут происходить из различных облас- 9 036335 тей пептидной цепи, они находятся в тесном соседстве в трехмерной структуре антигена. В случае мультимерных антигенов, конформационный или не непрерывный эпитоп может включать в себя остатки из различных пептидных цепей. Конкретные остатки, содержащиеся в эпитопе, можно определять посредством программ для компьютерного моделирования или посредством трехмерных структур, полученных способами, известными в данной области, такими как рентгеновская кристаллография.
CDR L1, L2, L3, H1 и Н2 проявляют тенденцию к структурному проявлению одной из ограниченного количества конформаций основной цепи. Конкретный класс канонической структуры CDR определяется как длиной CDR, так и упаковкой петель, определяемых остатками, локализованными как в CDR, так и в каркасных областях (определяющими структуру остатками или SDR). Martin and Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815) разработали автоматизированный способ для определения канонических матриц ключевых остатков. Кластерный анализ используют для определения канонических классов для наборов CDR, и затем идентифицируют канонические матрицы посредством анализа замаскированных гидрофобных, связывающих водород остатков, и консервативных остатков глицина и пролина. CDR из последовательностей антитела можно приписывать к каноническим классам посредством сравнения последовательностей с матрицами ключевых остатков и оценки каждой матрицы с использованием матриц идентичности или сходства.
Может существовать множество вариантов канонических положений CDR для CDR, для соответствующей CDR, для единицы связывания, для вариабельной области тяжелой или легкой цепи, для тяжелой или легкой цепи и для антигенсвязывающего белка, и таким образом, любая комбинация замен может присутствовать в антигенсвязывающем белке по изобретению, при условии, что сохраняется каноническая структура CDR, так что антигенсвязывающий белок является способным специфически связывать ICOS.
Как обсуждают выше, конкретный класс канонической структуры CDR определяется как длиной CDR, так и упаковкой петель, определяемых остатками, локализованными как в CDR, так и в каркасных областях.
Процент идентичности между запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты и рассматриваемой последовательностью нуклеиновой кислоты представляет собой значение идентичности, выраженное как процент, которое рассчитано посредством алгоритма BLASTN, когда рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты обладает 100% перекрыванием с запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты после проведения попарного выравнивания BLASTN. Такие попарные выравнивания BLASTN между запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты и рассматриваемой последовательностью нуклеиновой кислоты проводят с использованием параметров по умолчанию алгоритма BLASTN, доступного на веб-сайте National Center for Biotechnology Institute, с отключенным фильтром для областей низкой сложности. Важно, что запрашиваемую последовательность нуклеиновой кислоты можно описать посредством последовательности нуклеиновой кислоты, идентифицированной в одном или нескольких пунктах формулы изобретения в настоящем описании.
Процент идентичности между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваемой аминокислотной последовательностью представляет собой значение идентичности, выраженное как процент, которое рассчитано посредством алгоритма BLASTP, когда рассматриваемая аминокислотная последовательность обладает 100% перекрыванием с запрашиваемой аминокислотной последовательностью после проведения попарного выравнивания BLASTP. Такие попарные выравнивания BLASTP между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваемой аминокислотной последовательностью проводят с использованием параметров по умолчанию алгоритма BLASTP, доступного на веб-сайте National Center for Biotechnology Institute, с отключенным фильтром для областей низкой сложности. Важно, что запрашиваемую аминокислотную последовательность можно описать посредством аминокислотной последовательности, идентифицированной в одном или нескольких пунктах формулы изобретения в настоящем описании.
Запрашиваемая последовательность может являться на 100% идентичной рассматриваемой последовательности, или она может включать вплоть до определенного целого количества изменений аминокислот или нуклеотидов по сравнению с рассматриваемой последовательностью, так что % идентичности составляет менее 100%. Например, запрашиваемая последовательность является по меньшей мере на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной рассматриваемой последовательности. Такие изменения включают делецию, замену (включая консервативную и неконсервативную замену) или вставку по меньшей мере одной аминокислоты, и при этом такие изменения могут происходить в амино- или карбоксиконцевых положениях запрашиваемой последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, могут быть распределены либо индивидуально среди аминокислот или нуклеотидов в запрашиваемой последовательности, либо в одной или нескольких непрерывных группах внутри запрашиваемой последовательности.
% идентичности можно определять на протяжении полной длины запрашиваемой последовательности, включая CDR (несколько CDR). Альтернативно, % идентичности может исключать CDR (несколько CDR), например CDR (несколько CDR) является на 100% идентичной рассматриваемой последовательности, и изменение % идентичности происходит в остальной части запрашиваемой последовательности,
- 10 036335 так что последовательность CDR является фиксированной/интактной.
Вариант последовательности, по существу, сохраняет биологические характеристики немодифицированного белка, такого как SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.
Последовательность VH или VL может представлять собой вариант последовательности с вплоть до 15 замен, добавлений или делеций аминокислот. Например, вариант последовательности может иметь замену(замены), добавление(добавления) или делецию (делеций) вплоть до 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислот.
Вариант последовательности может исключать CDR (несколько CDR), например CDR (несколько CDR) является такой же, как в последовательности VH или VL (или НС или LC), и вариант присутствует в остальной части последовательности VH или VL (или НС или LC), так что последовательность CDR является фиксированной/интактной.
Специалисту в данной области понятно, что при продукции антигенсвязывающего белка, такого как антитело, в частности, в зависимости от используемой линии клеток и конкретной аминокислотной последовательности антигенсвязывающего белка могут происходить пост-трансляционные модификации. Например, они могут включать в себя отщепление конкретных лидерных последовательностей, добавление различных сахарных групп в различных паттернах гликозилирования и фосфорилирования, дезамидирование, окисление, преобразование дисульфидных связей, изомеризация, отщепление С-концевого лизина и циклизацию N-концевого глутамина. Настоящее изобретение относится к применению антигенсвязывающих белков, которые являются объектом или подвергнуты одной или нескольким посттрансляционным модификациям. Таким образом, антигенсвязывающий белок или антитело по изобретению включает антигенсвязывающий белок или антитело соответственно, как определено ранее, подвергнуты одной или нескольким пост-трансляционным модификациям, таким как описано в настоящем описании.
Дезамидирование представляет собой ферментативную реакцию, в первую очередь превращающую аспарагин (N) в изо-аспарагиновую кислоту и аспарагиновую кислоту (D) в соотношении приблизительно 3:1. В намного меньшей степени, дезамидирование может происходить с остатками глутамина сходным образом.
Дезамидирование в CDR приводит к изменению заряда молекулы, но, как правило, как не приводит к изменению связывания антигена, так и не влияет на PK/PD.
Окисление может происходить в ходе продукции и хранения (т.е. в присутствии окисляющих условий) и приводит к ковалентной модификации белка, индуцированной либо напрямую посредством реакционноспособных видов кислорода, либо опосредованно посредством реакции с вторичными побочными продуктами окислительного стресса. Окисление происходит в первую очередь на остатках метионина, но в редких случаях может происходить на остатках триптофана и свободного цистеина.
Преобразование дисульфидных связей может происходить в ходе продукции и хранения в основных условиях. В конкретных условиях, дисульфидные связи могут разрушаться или формироваться неправильно, что приводит к неспаренным остаткам цистеина (-SH). Эти свободные (неспаренные) сульфгидрилы (-SH) могут стимулировать перетасовку.
Изомеризация как правило, происходит в ходе продукции, очистки и хранения (при кислом рН) и обычно происходит, когда аспарагиновая кислота превращается в изоаспарагиновую кислоту посредством химического процесса.
N-концевой глутамин в тяжелой цепи и/или легкой цепи, вероятно, формирует пироглутамат (pGlu). Большая часть формирования pGlu происходит в биореакторе для продукции, но он может образовываться не ферментативным образом, в зависимости от рН и температуры переработки и условий хранения. Образование pGlu рассматривают как один из принципиальных путей деградации для рекомбинантных mAb.
Отщепление С-концевого лизина представляет собой ферментативную реакцию, катализируемую карбоксипептидазами, и его обычно наблюдают в рекомбинантных mAb. Варианты этого процесса включают удаление лизина из одной или обеих тяжелых цепей. Отщепление лизина, по-видимому, не влияет на биоактивность и не оказывает эффекта на эффекторную функцию mAb.
У человека существуют природные аутоантитела, которые могут связываться с белками. Аутоантитела могут, таким образом, связываться с эндогенными белками (присутствующими у наивных субъектов) так же, как с белками или пептидами, которые вводят субъекту для лечения. Связывающие терапевтический белок аутоантитела и антитела, заново сформированные в ответ на лекарственное средство, вместе называют антителами против лекарственного средства (ADA). Предсуществующие антитела против таких молекул, как терапевтические белки и пептиды, введенные субъекту, могут влиять на их эффективность и могут приводить к реакциям на введение, гиперчувствительности, измененному клиническому ответу у подвергнутых лечению пациентов и измененной биодоступности посредством удержания, уничтожения или нейтрализации молекулы. Может обеспечивать преимущества предоставление для терапии молекулы, содержащей одиночные вариабельные домены или dAb™ человеческого иммуноглобулина (антитела), обладающие уменьшенной иммуногенностью (т.е. уменьшенной способностью связываться с предсуществующими AD) при введении субъекту, в частности субъекту-человеку.
- 11 036335
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения представлены модифицированные dAb™ с уменьшенной способностью связываться с предсуществующими антителами (ADA) по сравнению с эквивалентной немодифицированной молекулой. Под уменьшенной способностью связывания понимают, что модифицированная молекула связывается с предсуществующими AD с уменьшенной аффинностью или уменьшенной авидностью. Такие модифицированные dAb™ содержат одну или несколько модификаций, выбранных из: (а) С-концевого добавления, удлинения, делеции или присоединения метки, и/или (b) замены одной или нескольких каркасных аминокислот.
Полипептиды и dAb™ по описанию и содержащие их агонисты можно форматировать так, чтобы они имели больший гидродинамический размер, например, посредством присоединения группы PEG, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его связывающей трансферрин-части, области Fc антитела, или посредством конъюгации с доменом антитела. Например, полипептиды dAb™ и агонисты можно форматировать в форме большего антигенсвязывающего фрагмента антитела или в форме антитела (например, в формате Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv).
В рамках изобретения гидродинамический размер относится к кажущемуся размеру молекулы (например, антигенсвязывающего белка) на основании диффузии молекулы через водный раствор. Диффузию или движение белка через раствор можно обрабатывать для выведения кажущегося размера белка, где размер получают по радиусу Стокса или гидродинамическому радиусу частицы белка. Гидродинамический размер белка зависит как от массы, так и от формы (конформации), так что два белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, могут обладать различными гидродинамическими размерами на основании общей конформации и заряда белка. Увеличение гидродинамического размера может приводить к ассоциированному уменьшению выведения через почки, приводящего к наблюдаемому увеличению времени полужизни (t1/2).
Гидродинамический размер антигенсвязывающих белков (например, мономеров и мультимеров доменного антитела) по описанию можно определять с использованием способов, хорошо известных в данной области. Например, гель-фильтрационную хроматографию можно использовать для определения гидродинамического размера антигенсвязывающего белка. Пригодные смолы для гель-фильтрации для определения гидродинамических размеров антигенсвязывающих белков, такие как смолы на основе перекрестно сшитой агарозы, хорошо известны и легко доступны.
Размер антигенсвязывающего белка в определенном формате (например, размер группы PEG, присоединенной к мономеру доменного антитела) можно менять в зависимости от желательного применения. Например, когда антигенсвязывающий белок предназначен, чтобы покидать кровоток и входить в периферические ткани, является желательным сохранять небольшой гидродинамический размер связывающего ICOS белка для облегчения выхода из кровотока. Альтернативно, когда является желательным оставлять антигенсвязывающий белок в системном кровотоке на более длительный период времени, размер антигенсвязывающего белка можно увеличивать, например, посредством получения в формате подобного Ig белка.
Фармацевтические композиции
Антигенсвязывающий белок, как описано в настоящем описании, можно включать в фармацевтические композиции для применения в лечении заболеваний человека, описанных в настоящем описании. В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит антигенсвязывающий белок, необязательно, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями.
Такие композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель, как известно и необходимо для приемлемой фармацевтической практики.
Фармацевтические композиции можно вводить посредством инъекции или непрерывной инфузии (примеры включают, но без ограничения, внутривенную, внутрибрюшинную, внутрикожную, подкожную, внутримышечную и интрапортальную). В одном варианте осуществления, композиция является пригодной для внутривенного введения. Фармацевтические композиции могут являться пригодными для местного введения (которое включает, но без ограничения, накожное введение, введение посредством ингаляции, интраназальное введение или введение в глаз) или энтеральное введение (которое включает, но без ограничения, пероральное или ректальное введение).
Фармацевтические композиции могут содержать между 0,5 мг и 10 г связывающего ICOS белка, например между 5 мг и 1 г антигенсвязывающего белка. Альтернативно, композиция может содержать между 5 и 500 мг, например между 5 и 50 мг.
Способы получения таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области. Другие наполнители можно добавлять в композицию, как приемлемо для используемых способа введения и конкретного белка. Примеры различных наполнителей и их применений описаны в Lowe et al., (2011).
Эффективные дозы и режимы лечения для введения антигенсвязывающего белка могут зависеть от таких факторов, как возраст, масса и состояние здоровья пациента, и заболевание, подлежащее лечению. Такие факторы находятся в компетенции лечащего врача. Руководство для выбора подходящих доз мож- 12 036335 но обнаружить, например, в Bai et al., (2012).
Фармацевтическая композиция может содержать комплект составляющих антигенсвязывающего белка вместе с другими лекарственными средствами, необязательно, с инструкциями для применения.
Для удобства, набор может содержать реагенты в предопределенных количествах с инструкциями для применения.
Термины индивидуум, субъект и пациент используют в настоящем описании взаимозаменяемо. В одном варианте осуществления, субъект представляет собой млекопитающего, такого как примат, например игрунку или обезьяну. В другом варианте осуществления, субъект представляет собой человека.
Антигенсвязывающий белок, описанный в настоящем описании, можно также использовать в способах лечения. Лечение может являться терапевтическим, профилактическим или предотвращающим. Лечение включает облегчение, уменьшение или предотвращение по меньшей мере одного аспекта или симптома заболевания и включает предотвращение или излечение заболеваний, описанных в настоящем описании.
Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающую часть, описанные в настоящем описании, используют в эффективном количестве для терапевтического, профилактического или предотвращающего лечения. Терапевтически эффективное количество связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части, описанных в настоящем описании, представляет собой количество, эффективное для облегчения или уменьшения одного или нескольких симптомов заболевания, или для предотвращения или излечения, заболевания.
Таким образом, в одном варианте осуществления представлены связывающие ICOS белки или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению для применения в терапии. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающим ICOS белкам или их антигенсвязывающим частям по настоящему изобретению для применения в терапии злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса. Настоящее изобретение также относится к применению связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению в получении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса.
Таким образом, изобретение относится к выделенным связывающим ICOS белкам или их антигенсвязывающим частям, или фармацевтическим композициям, содержащим указанные выделенные связывающие ICOS белки или их антигенсвязывающие части, для применения в лечении злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса.
Способы получения
Антигенсвязывающие белки можно получать любым из ряда обычных способов. Например, антигенсвязывающие белки можно очищать из клеток, экспрессирующих их естественным образом (например, антитело можно очищать из продуцирующей его гибридомы), или получать в рекомбинантных экспрессирующих системах.
Ряд различных экспрессирующих систем и режимов очистки можно использовать для получения антигенсвязывающего белка по изобретению. Как правило, клетки-хозяева трансформируют рекомбинантным экспрессирующим вектором, кодирующим желательный антигенсвязывающий белок. Можно применять широкий диапазон клеток-хозяев, включая прокариоты (включая грамотрицательные или грамположительные бактерии, например Escherichi coli, виды Bacilli, виды Pseudomonasr виды Corynebacterium), эукариоты, включая дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae, Pichi pastoris), грибы (например, виды Aspergilus) или высшие эукариоты, включая клетки насекомых и линии клеток, происходящих из млекопитающих (например, СНО, Perc6, HEK293, HeLa).
Клетка-хозяин может представлять собой выделенную клетку-хозяина. Клетка-хозяин, как правило, не является частью многоклеточного организма (например, растения или животного). Клетка-хозяин может представлять собой не относящуюся к человеку клетку-хозяина.
Подходящие клонирующие и экспрессирующие векторы для применения с клеточными хозяевами из бактерий, грибов, дрожжей и млекопитающих и способы клонирования известны в данной области.
Клетки можно культивировать в условиях, способствующих экспрессии антигенсвязывающего белка, и выделять полипептид общепринятыми способами очистки белка. Антигенсвязывающие белки, предусмотренные для применения в настоящем описании, включают, по существу, гомогенные антигенсвязывающие белки, в основном свободные от загрязняющих материалов.
Специалисту в данной области понятно, что при продукции антигенсвязывающего белка могут происходить пост-трансляционные модификации, в частности, в зависимости от используемой линии клеток и конкретной аминокислотной последовательности антигенсвязывающего белка. Они могут включать в себя отщепление конкретных лидерных последовательностей, добавление различных сахарных групп в различных паттернах гликозилирования, дезамидирование (например, остатка аспарагина или глутамина), окисление (например, остатка метионина, триптофана или свободного цистеина), преобразование дисульфидных связей, изомеризацию (например, остатка аспарагиновой кислоты), отщепление С-концевого лизина (например, от одной или обеих тяжелых цепей) и циклизацию N-концевого глутами- 13 036335 на (например, в тяжелой и/или легкой цепи). Настоящее изобретение относится к применению антител, которые являются объектом или подвергнуты одной или нескольким пост-трансляционным модификациям. Модификациия может присутствовать в CDR, вариабельной каркасной области или константной области. Модификация может приводить к изменению заряда молекулы. Модификация, как правило, как не приводит к изменению связывания антигена, функции, биоактивности, так и не влияет на фармакокинетические (PK) или фармакодинамические (PD) характеристики связывающего ICOS белка.
Термин эффекторная функция в рамках изобретения предназначен для обозначения одного или нескольких из ответов антителозависимой опосредованной клетками цитотоксической активности (ADCC), комплементзависимой цитотоксической активности (CDC), опосредованного Fc фагоцитоза или антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP) и рециклизации антитела посредством рецептора FcRn.
Считают, что взаимодействие между константной областью антигенсвязывающего белка и различными рецепторами Fc (FcR), включая FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16), опосредует эффекторные функции антигенсвязывающего белка. Значительные биологические эффекты могут быть следствием эффекторной функциональности. Как правило, способность опосредовать эффекторную функцию требует связывания антигенсвязывающего белка с антигеном, и не все антигенсвязывающие белки могут опосредовать каждую эффекторную функцию.
Эффекторную функцию можно измерять рядом способом, включая, например, связывание с FcyRIII на клетках естественных киллерах или с FcyRI на моноцитах/макрофагах для измерения эффекторной функции ADCC/ADCP. Например, можно оценивать эффекторную функцию в ADCC антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению в анализе клеток естественных киллеров. Практические способы для оценки функции ADCC и /или CDC можно обнаружить в (Kellner С. et al., Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions, Methods, 1; 65 (1): 105-13 (2014)).
Некоторые изотипы человеческих константных областей, в частности изотипы IgG4 и IgG2, обладают уменьшенной функцией а) активации комплемента по классическому пути; и b) антителозависимой клеточной цитотоксичности. Можно осуществлять различные модификации константной области тяжелой цепи антигенсвязывающих белков в зависимости от желательных эффекторных свойств. Отдельно описано, что константные области IgG1, содержащие конкретные мутации, уменьшают связывание с рецепторами Fc и таким образом, уменьшают ADCC и CDC. (Kellner С. et al., Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions, Methods, 1; 65 (1): 105-13 (2014)).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлен антигенсвязывающий белок, содержащий такую константную область, что антигенсвязывающий белок обладает уменьшенной ADCC и/или активацией комплемента, или эффекторной функциональностью. В одном таком варианте осуществления константная область тяжелой цепи может содержать естественным образом лишенную функциональности константную область изотипа IgG2 или IgG4, или мутантную константную область IgG1. Один пример включает замену остатков аланина в положениях 235 и 237 (нумерация по индексу EU).
Подкласс антитела частично определяет вторичные эффекторные функции, такие как активация комплемента или связывание с рецептором Fc (FcR) и антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) (Huber, et al., Nature 229(5284): 419-20 (1971); Brunhouse, et al., Mol Immunol 16(11): 907-17 (1979)). При идентификации оптимального типа антитела для конкретного применения, эффекторные функции антител можно принимать во внимание. Например, антитела hIgG1, обладающие относительно долгим временем полужизни, являются очень эффективными в фиксации комплемента, и они связывают как FcyRI, так и FcyRII. В отличие от этого, человеческие антитела IgG4 обладают более коротким временем полужизни, не фиксируют комплемент и обладают более низкой аффинностью для FcR. Замена серина 228 на пролин (S228P) в области Fc IgG4 уменьшает гетерогенность, наблюдаемую для hIgG4, и продлевает время полужизни в сыворотке (Kabat, et al., Sequences of proteins of immunological interest 5.sup.th Edition (1991); Angal, et al., Mol Immunol 30(1): 105-8 (1993)). Вторая мутация, заменяющая лейцин 235 на глутаминовую кислоту (L235E), исключает остаточную активность связывания FcR и связывания комплемента (Alegre, et al., J Immunol 148(11): 3461-8 (1992)). Полученное антитело с обеими мутациями обозначают как IgG4PE. Нумерация аминокислот hIgG4 получена из ссылки на нумерацию EU: Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. uSa, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие белки для ICOS, содержащие область Fc IgG4, содержащую замены S228P и L235E, могут иметь обозначение IgG4PE. Таким образом, связывающий ICOS белок, обладающий вариабельной областью тяжелой цепи Н2 и вариабельной областью легкой цепи L5, и областью Fc IgG4PE, можно обозначать как H2L5 IgG4PE, или синонимично, как H2L5 hIgG4PE.
Усиление ADCC/CDC.
Как известно в данной области, известны различные способы, увеличивающие активность ADCC и/или CDC антитела. Они включают, но без ограничения, различные мутации в области Fc, технологии Complegent и Potelligent. В одном аспекте настоящего изобретения один или несколько способов усиления ADCC/CDC можно применять для связывающих ICOS белков по настоящему изобретению.
- 14 036335
Мутация.
Описано также, что человеческие константные области IgGI, содержащие конкретные мутации или измененное гликозилирование остатка Asn297, усиливают связывание с рецепторами Fc. В некоторых случаях, показано также, что эти мутации усиливают ADCC и CDC, см., например, Kellner (2013).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, такие мутации присутствуют в одном или нескольких положениях, выбранных из 239, 332 и 330 (IgG1), или в эквивалентных положениях в других изотипах IgG. Примерами подходящих мутаций являются S239D и I332E, и A330L. В одном варианте осуществления в антигенсвязывающий белок по изобретению, описанный в настоящем описании, вносят мутации в положениях 239 и 332, например S239D и I332E, или в следующем варианте осуществления, в него вносят мутации в трех или более положениях, выбранных из 239 и 332, и 330, например S239D и I332E, и A330L (нумерация по индексу EU).
Complegent.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлен антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи, например антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи по меньшей мере с одним доменом СН2 из IgG3, такой, что антигенсвязывающий белок обладает усиленной эффекторной функцией, например, когда он обладает усиленной функцией ADCC или усиленной функцией CDC, или усиленными функциями ADCC и CDC.
В одном таком варианте осуществления, антигенсвязывающий белок может содержать один домен СН2 из IgG3, или оба домена СН2 могут происходить из IgG3.
Представлен также способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, включающий в себя стадии:
a) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем описании, где экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую домен Fc, обладающий аминокислотными остатками домена Fc как IgG1, так и IgG3; и
b) выделения антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков можно осуществлять, например, с использованием системы технологий COMPLEGENT™, доступной из BioWa, Inc. (Princeton, NJ) и Kyow Hakko Kogyo (в настоящее время, Kyow Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd., в которой рекомбинантная клеткахозяин содержит экспрессирующий вектор, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный домен Fc, обладающий аминокислотными остатками домена Fc как IgG1, так и IgG3, экспрессируется для получения антигенсвязывающего белка, обладающего усиленной активностью комплементзависимой цитотоксичности (CDC), увеличенной по сравнению с идентичным в ином отношении антигенсвязывающим белком, лишенным такого химерного домена Fc. Аспекты системы технологий COMPLEGENT™ описаны в WO2007011041 и US20070148165, содержание каждого из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. В альтернативном варианте осуществления активность CDC можно увеличивать посредством введения специфических для последовательности мутаций в область Fc цепи IgG. Специалисту в данной области известны также другие подходящие системы.
Potelligent.
Настоящее изобретение также относится к способу получения антигенсвязывающего белка по изобретению, включающему в себя стадии:
a) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем описании, где ген FUT8, кодирующий альфа-1,6-фукозилтрансферазу, инактивирован в рекомбинантной клетке-хозяине; и
b) выделения антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков можно осуществлять, например, с использованием системы технологий POTELLIGENT™, доступной из BioWa, Inc. (Princeton, NJ), в которой клетки CHOK1SV, лишенные функциональной копии гена FUT8, продуцируют моноклональные антитела, обладающие усиленной активностью антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC), увеличенной по сравнению с идентичным моноклональным антителом, продуцированным в клетке с функциональным геном FUT8. Аспекты системы технологий POTELLIGENT™ описаны в US7214775, US6946292, WO0061739 и WO0231240, содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Специалисту в данной области известны также другие подходящие системы.
Специалисту в данной области очевидно, что такие модификации можно использовать не только отдельно, но можно использовать в комбинации друг с другом для дополнительного усиления эффекторной функции.
В одном таком варианте осуществления настоящего изобретения представлен антигенсвязывающий белок, содержащий константную область тяжелой цепи, который содержит мутантную и химерную константную область тяжелой цепи, например, где антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере
- 15 036335 один домен СН2 из IgG3 и один домен СН2 из IgG1, где домен СН2 IgG1 обладает одной или несколькими мутациями в положениях, выбранных из 239 и 332, и 330 (например, мутации могут быть выбраны из S239D и I332E и A330L), так что антигенсвязывающий белок обладает усиленной эффекторной функцией, например, где он обладает одной или несколькими из следующих функций, усиленной ADCC или усиленной CDC, например где он обладает усиленной ADCC и усиленной CDC. В одном варианте осуществления домен СН2 IgG1 обладает мутациями S239D и I332E.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения представлен антигенсвязывающий белок, который содержит химерную константную область тяжелой цепи и который обладает измененным профилем гликозилирования. В одном таком варианте осуществления константная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере один домен СН2 из IgG3 и один домен СН2 из IgG1, и обладает измененным профилем гликозилирования, таким что отношение фукозы к маннозе составляет 0,8:3 или менее, например, где антигенсвязывающий белок является дефукозилированным, так что указанный антигенсвязывающий белок обладает усиленной эффекторной функцией по сравнению с эквивалентным антигенсвязывающим белком с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, лишенной указанных мутаций и измененного профиля гликозилирования, например, где он обладает одной или несколькими из следующих функций, усиленной ADCC или усиленной CDC, например, где он обладает усиленной ADCC и усиленной CDC В альтернативном варианте осуществления антигенсвязывающий белок обладает по меньшей мере одним доменом СН2 IgG3 и по меньшей мере одним константным доменом тяжелой цепи из IgG1, где в оба домена СН2 IgG внесены мутации в соответствии с ограничениями, описанными в настоящем описании.
В одном аспекте по изобретению представлен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, описанного в настоящем описании, включающий в себя стадии:
a) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем описании, где указанный экспрессирующий вектор дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты Fc, кодирующую химерный домен Fc, обладающий аминокислотными остатками домена Fc как IgG1, так и IgG3, и где ген FUT8, кодирующий альфа-1,6-фукозилтрансферазу, инактивирован в рекомбинантной клеткехозяине; и
b) выделения антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков можно осуществлять, например, с использованием системы технологий ACCRETAMAB™, доступной из BioWa, Inc. (Princeton, NJ), в которой скомбинированы системы технологий POTELLIGENT™ и COMPLEGENT™ для получения антигенсвязывающего белка, обладающего усиленной активностью как ADCC, так и CDC, увеличенной по сравнению с идентичным в ином отношении моноклональным антителом, лишенным химерного домена Fc и обладающим фукозой на олигосахариде.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлен антигенсвязывающий белок, содержащий мутантную и химерную константную область тяжелой цепи, где указанный антигенсвязывающий белок обладает измененным профилем гликозилирования, таким что антигенсвязывающий белок обладает усиленной эффекторной функцией, например, где он обладает одной или несколькими из следующих функций, усиленной ADCC или усиленной CDC. В одном варианте осуществления мутации выбраны из положений 239 и 332, и 330, например мутации выбраны из S239D и I332E, и A330L. В следующем варианте осуществления константная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере один домен СН2 из IgG3 и один домен Ch2 из IgG1. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи обладает измененным профилем гликозилирования, таким что отношение фукозы к маннозе составляет 0,8:3 или менее, например антигенсвязывающий белок является дефукозилированным, так что указанный антигенсвязывающий белок обладает усиленной эффекторной функцией по сравнению с эквивалентным нехимерным антигенсвязывающим белком или с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, лишенной указанных мутаций и измененного профиля гликозилирования.
Опубликовано, что длительное время полужизни антител IgG зависит от его связывания с FcRn. Таким образом, замены, увеличивающие аффинность связывания IgG с FcRn при рН 6,0 при сохранении зависимости взаимодействия от рН посредством конструирования константной области, интенсивно изучали в Kuo and Aveson (2011).
Другие способы модификации антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению включают увеличение времени полужизни таких белков посредством модификации константного домена или связывающего FcRn (неонатальный рецептор Fc) домена иммуноглобулина.
У взрослых млекопитающих, FcRn, известный также как неонатальный рецептор Fc, играет ключевую роль в поддержании уровней антител в сыворотке посредством действия в качестве защитного рецептора, который связывает и спасает антитела изотипа IgG от деградации. Молекулы IgG подвергаются эндоцитозу посредством эндотелиальных клеток, и если они связываются с FcRn, они подвергаются рециклизации в кровоток. В отличие от этого, молекулы IgG, которые не связываются с FcRn, входят в клетки и являются мишенью для лизосомального пути, где они подвергаются деградации.
- 16 036335
Считают, что неонатальный рецептор FcRn вовлечен как в выведение антител, так и в трансцитоз антител через ткани, Kuo and Aveson, (2011). Остатки человеческого IgG1, как определено, взаимодействующие непосредственно с FcRn человека, включают Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435. Переключение в одном из этих положений, описанных в этом разделе, может обеспечивать увеличенное время полужизни в сыворотке и/или измененные эффекторные свойства антигенсвязывающих белков по изобретению.
Мутации для увеличения времени полужизни посредством увеличения аффинности для FcRn.
Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут обладать модификациями одной или нескольких аминокислот, которые увеличивают аффинность константного домена или его фрагмента для FcRn. Это может приводить к увеличенному времени полужизни этих белков, Kuo and Aveson (2011). Увеличение времени полужизни терапевтических и диагностических IgG и других биоактивных молекул обладает множеством преимуществ, включая уменьшенные количество и/или частоту дозирования этих молекул. В одном варианте осуществления, таким образом, представлен антигенсвязывающий белок по изобретению, представленный в настоящем описании, или слитый белок, содержащий весь или часть (связывающую FcRn часть) константного домена IgG, обладающего одной или несколькими модификациями аминокислот, и не относящуюся к IgG белковую или небелковую молекулу, конъюгированную с таким модифицированным константным доменом IgG, где присутствие модифицированного константного домена IgG увеличивает время полужизни in vivo антигенсвязывающего белка.
Известен ряд способов, которые могут приводить к увеличенному времени полужизни (Kuo and Aveson (2011)), включая модификации аминокислот, которые можно получать способами, включающими в себя аланиновый сканирующий мутагенез, случайный мутагенез и скрининг для оценки связывания с FcRn и/или поведения in vivo. Вычислительные способы после мутагенеза также можно использовать для выбора одной из мутаций аминокислот для введения.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к варианту антигенсвязывающего белка с оптимизированным связыванием с FcRn. В предпочтительном варианте осуществления, указанный вариант антигенсвязывающего белка содержит модификацию по меньшей мере одной аминокислоты в области Fc указанного антигенсвязывающего белка, где указанная модификация выбрана из группы, состоящей из 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322,
325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369,
370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401
403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443,
444, 445, 446 и 447 области Fc, по сравнению с указанным исходным полипептидом, где нумерация аминокислот в области Fc представляет собой нумерацию по индексу EU в Kabat.
В следующем аспекте по изобретению модификации представляют собой M252Y/S254T/T256E.
Кроме того, в различных публикациях описаны способы получения физиологически активных молекул, время полужизни которых модифицировано, см., например, Kontermann (2009), либо посредством введения связывающего FcRn полипептида в молекулы, либо посредством слияния молекул с антителами, аффинность связывания которых с FcRn сохранена, но аффинность которых для других рецепторов Fc сильно уменьшена, либо посредством слияния со связывающими FcRn доменами антител.
Способ переключения посредством рН для увеличения времени полужизни.
Хотя замены в константной области способны значительно улучшать функции терапевтических антител IgG, замены в строго консервативной константной области в сумме обладают риском иммуногенности, и замены в высоко разнообразной последовательности вариабельной области могут являться менее иммуногенными. Сообщения относительно вариабельной области включают конструирование остатков CDR для улучшения аффинности связывания с антигеном и конструирование остатков CDR и каркасных остатков для улучшения стабильности и уменьшения риска иммуногенности. Как известно, улучшенной аффинности для антигена можно достигать посредством аффинного созревания с использованием фагового или рибосомного дисплея рандомизированной библиотеки.
Улучшенную стабильность можно достигать рациональным образом посредством рационального дизайна на основе последовательности и структуры. Уменьшенного риска иммуногенности (деиммунизации) можно достигать посредством различных способов гуманизации и удаления Т-клеточных эпитопов, которые можно предсказывать с использованием способов in silico или определять посредством анализов in vitro. Кроме того, были сконструированы вариабельные области для снижения pI. Более длительное время полужизни наблюдали для этих антител по сравнению с антителами дикого типа, несмотря на сравнимое связывание FcRn. Антитела с зависимым от рН связыванием антигена конструируют или отбирают для модификации времени полужизни антитела и/или антигена, например время полужизни антитела IgG2 может быть укорочено, если механизмы опосредованного антигеном выведения в норме осуществляют деградацию антитела при связывании с антигеном. Подобным образом, комплекс антиген:антитело может влиять на время полужизни антигена, либо продлевая время полужизни посредством защиты антигена от типичных процессов деградации, либо сокращая время полужизни посредством опосредованной антителом деградации. Один вариант осуществления относится к антителам с более высо- 17 036335 кой аффинностью для антигена при рН 7,4 по сравнению с эндосомальным рН (т.е. рН 5,5-6,0), так что отношение KD при рН 5,5/7,4 или при рН 6,0/7,4 составляет 2 или более. Например, для улучшения фармакокинетических (РК) и фармакодинамических (PD) свойств антитела можно модифицировать чувствительное к рН связывание антитела посредством введения остатков гистидина в остатки CDR.
Кроме того, представлены также способы получения антигенсвязывающего белка с уменьшенным биологическим временем полужизни. Вариант IgG, в котором His435 подвергают мутации до аланина, обеспечивает избирательную потерю связывания FcRn и значительно уменьшает время полужизни в сыворотке (см., например, US6165745, где описан способ получения антигенсвязывающего белка с уменьшенным биологическим временем полужизни посредством введения мутации в фрагмент ДНК, кодирующей антигенсвязывающий белок. Мутация включает замену аминокислоты в положении 253, 310, 311, 433 или 434 шарнирного домена Fc.
Линкеры.
Белковые остовы могут являться такими же, как природные последовательности, такие как последовательности Ig, или могут представлять собой фрагменты природных последовательностей, и могут содержать дополнительные последовательности, которые могут являться природными, происходящими из другого источника, или синтетическими, и которые можно добавлять на N- или С-конце остова. Такие дополнительные последовательности можно рассматривать как линкеры, когда они связывают эпитопсвязывающий домен и белковый остов, такие, как определено в настоящем описании.
В другом аспекте антигенсвязывающая конструкция состоит из, или в основном состоит из области Fc антитела, или его части, связанной с каждого конца, напрямую или опосредовано (например, посредством линкерной последовательности), с эпитопсвязывающим доменом. Такая антигенсвязывающая конструкция может содержать 2 эпитопсвязывающих домена, разделенных областью Fc, или ее частью. Под разделением понимают, что эпитопсвязывающие домены не являются напрямую связанными друг с другом, и в одном аспекте локализованы на противоположных концах (С- и N-конце) области Fc, или любой другой каркасной области.
В одном аспекте антигенсвязывающая конструкция содержит 2 каркасных области, где каждая связана с 2 эпитопсвязывающими доменами, например, на N- и С-конце каждой каркасной области, либо напрямую, либо опосредовано через линкер.
Белковые остовы по настоящему изобретению можно связывать с эпитопсвязывающими доменами посредством использования линкеров. Примеры пригодных линкеров включают аминокислотные последовательности, которые могут иметь длину от 1 до 150 аминокислот, или от 1 до 140 аминокислот, например от 1 до 130 аминокислот, или от 1 до 120 аминокислот, или от 1 до 80 аминокислот, или от 1 до 50 аминокислот, или от 1 до 20 аминокислот, или от 1 до 10 аминокислот, или от 5 до 18 аминокислот. Такие последовательности могут обладать своей собственной третичной структурой, например линкер по настоящему изобретению может содержать одиночный вариабельный домен. Размер линкера в одном варианте осуществления является эквивалентным одиночному вариабельному домену. Пригодные линкеры могут иметь размер от 1 до 100 ангстрем, например могут иметь размер от 20 до 80 ангстрем или, например, могут иметь размер от 20 до 60 ангстрем или, например, менее 40 ангстрем, или менее 20 ангстрем, или менее 5 ангстрем в длину.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающим ICOS белкам, содержащим один или несколько из CDRH1, как указано в SEQ ID NO:1; CDRH2, как указано в SEQ ID NO:2; CDRH3, как указано в SEQ ID NO:3; CDRL1, как указано в SEQ ID NO:4; CDRL2, как указано в SEQ ID NO:5, и/или CDRL3, как указано в SEQ ID NO:6 или прямого эквивалента каждой CDR, где прямой эквивалент имеет не более двух замен аминокислот в указанной CDR.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представленные связывающие ICOS белки, которые специфически связываются с ICOS человека, содержащие домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:7, и/или домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:8. В одном аспекте связывающие ICOS белки по настоящему изобретению, связывают также ICOS яванского макака. В одном аспекте они не связывают мышиный ICOS.
В одном варианте осуществления связывающие ICOS белки по изобретению являются агонистами ICOS. В одном аспекте связывающие ICOS белки увеличивают продукцию IFN-γ в присутствии Тклеток. В другом аспекте связывающие ICOS белки по настоящему изобретению стимулируют пролиферацию Т-клеток.
В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок по изобретению связывается с ICOS человека с константой скорости связывания (kon) по меньшей мере 1x105 М-1с-1 и константой скорости диссоциации (koff) менее 6х10-5 с-1 или константой диссоциации (Kd) менее 100 нМ, где высокую аффинность измеряют посредством Biacore.
В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок содержит CDRH3 (SEQ ID NO:3) или вариант SEQ ID NO. 3. В другом варианте осуществления связывающие ICOS белки содержат один или
- 18 036335 несколько из CDRH1 (SEQ ID NO:1); CDRH2 (SEQ ID NO:2); CDRH3 (SEQ ID NO:3); CDRL1 (SEQ ID
NO:4); CDRL2 (SEQ ID NO:5) и/или CDRL3 (SEQ ID NO:6). В одном варианте осуществления связывающие ICOS белки содержат CDR тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 и SEQ ID
NO:3, и CDR легкой цепи, как указано в SEQ ID NO:4; SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO:6.
В одном варианте осуществления связывающие ICOS белки содержат домен VH, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:7; и домен VL, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:8. В одном аспекте связывающие ICOS белки содержат домен VH, обладающий аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO.7, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO:8. В одном аспекте связывающие ICOS белки содержат вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO:7. В одном аспекте связывающий ICOS белок содержит вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO:8.
В одном варианте осуществления изобретение относится к связывающему ICOS белку или его антигенсвязывающей части, содержащим домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:7; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, как указано в SEQ ID NO:8, где указанный связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть специфически связывается с ICOS человека. В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть, содержащие домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:7; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, как указано в SEQ ID NO:8, где указанный связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть, специфически связывающиеся с ICOS человека, дополнительно содержит CDR тяжелой цепи, обладающие аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, и CDR легкой цепи, обладающие аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6. В одном аспекте связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:7; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:8. В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть является агонистом ICOS человека. В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть дополнительно содержит остов изотипа IgG4 или его вариант. В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть содержит остов hIgG4PE.
В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:23.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSOKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGLISIYSDHTN
YNQKFQGRVTITADKS T S TAYMELS S LRSEDTAVYYCGRNNYGNYGWYFDVWGOGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO:23)
В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:24.
EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYOQKPGOAPRLLIYDTSKLASGIPA
RFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCFOGSGYPYTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEO
LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:24)
В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO:23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, указанную в SEQ ID NO:24. В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок по настоящему изобретению дополнительно содержит остов hIgGPE.
- 19 036335
В одном варианте осуществления, представлен связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть, где указанный связывающий ICOS белок представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающую часть в соответствии с формулой изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания, выбранного из злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса у нуждающегося в этом человека, где способ включает стадию введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению указанному человеку. В одном аспекте, способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного антинеопластического средства, по меньшей мере одного второго иммуномодулирующего средства и/или по меньшей мере одного иммуностимулирующего адъюванта указанному человеку. В одном аспекте, второе иммуномодулирующее средство выбрано из: антитела против CTLA4 и антитела против PD-1, антитела против PDL1 и антитела против OX40. В одном аспекте антитело против CTLA4 представляет собой ипилимумаб. В одном аспекте, антитело против PD-1 выбрано из пембролизумаба и/или ниволумаба.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли у человека, включающим введение терапевтически приемлемого количества связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части человеку. В некоторых аспектах злокачественная опухоль выбрана из колоректального рака (CRC), рака пищевода, шейки матки, мочевого пузыря, молочной железы, головы и шеи, яичников, меланомы, почечноклеточного рака (RCC), плоскоклеточной ЕС, немелкоклеточной карциномы легких, мезотелиомы и рака предстательной железы.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения инфекционного заболевания у человека, включающим введение терапевтически приемлемого количества связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части человеку. В одном аспекте инфекционное заболевание представляет собой HIV.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения сепсиса у человека, включающим введение терапевтически приемлемого количества связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части человеку.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам стимуляции пролиферации Т-клеток, включая активацию Т-клеток и/или индукцию продукции цитокинов у человека, включающим введение фармацевтической композиции по изобретению указанному человеку.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды, кодирующие связывающие ICOS белки или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам получения связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части, включающим стадии а) культивирования клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению, в подходящих условиях для экспрессии указанного связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части; и b) выделения указанного связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части.
Настоящее изобретение относится к выделенному гуманизированному моноклональному антителу, содержащему домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:7; домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:8; и остов hIgG4 или его вариант. В одном аспекте остов hIgG4 представляет собой hIgG4PE.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающим ICOS белкам или их антигенсвязывающим частям, где связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть проявляют перекрестную конкуренцию за связывание с ICOS человека с эталонным антителом или его антигенсвязывающей частью, содержащими домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:7; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:8.
В одном варианте осуществления связывающие ICOS белки по изобретению стимулируют пролиферацию Т-клеток при приведении в контакт с Т-клетками. В одном варианте осуществления связывающие ICOS белки по изобретению индуцируют активацию Т-клеток при приведении в контакт с Тклетками. Активацию Т-клеток можно измерять по увеличению в процентах уровней экспрессии конкретных маркеров активации, таких как, но без ограничения, CD69, CD25 и/или ОХ40. В одном варианте осуществления связывающие ICOS белки по настоящему изобретению стимулируют продукцию цитокинов при приведении в контакт с Т-клетками.
Связывающие ICOS белки связываются с FcYRIIb человека, но не связываются с FcyRII человека или с FcYRIIIa человека. Кроме того, связывающие ICOS белки подходящим образом не истощают экспрессирующие ICOS Т-клетки при приведении в контакт с экспрессирующими ICOS Т-клетками. В некоторых аспектах, связывающие ICOS белки перекрестно связывают Т-клетку с второй клеткой при приведении в контакт с указанной Т-клеткой в присутствии второй клетки. Это перекрестное связывание мо- 20 036335 жет происходить посредством привлечения связывающего ICOS белка с помощью FcyR на второй клетке. Экспрессирующие FcyR клетки включают, но без ограничения, моноциты, В-лимфоциты, фоликулярные дендритные клетки, клетки естественные киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки.
Таким образом, в одном варианте осуществления связывающие ICOS белки можно вводить млекопитающему, где связывающий ICOS белок может действовать как агонист ICOS на Т-клетки и может также привлекать FcyR на второй клетке.
В одном варианте осуществления связывающие ICOS белки содержат остов, выбранный из изотипа IgG1 человека или его варианта и изотипа IgG4 человека или его варианта. Подходящим образом, остов содержит изотип IgG4 человека или его вариант. В одном аспекте остов содержит остов hIgG4PE.
В одном варианте осуществления, связывающий ICOS белок представляет собой моноклональное антитело. Пригодный связывающий ICOS белок представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. В одном аспекте моноклональные антитела по настоящему изобретению могут являться полностью человеческими.
В другом аспекте связывающий ICOS белок представляет собой фрагмент, представляющий собой Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диатело, триотело, тетратело, миниантитело, минитело, выделенный VH или выделенный VL. В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок представляет собой его антигенсвязывающую часть.
В некоторых аспектах связывающий ICOS белок связывается с ICOS человека с аффинностью сильнее чем 0,6 нМ. В одном аспекте аффинность составляет 100 нМ или сильнее. В одном варианте осуществления связывающий ICOS белок обладает KD 100 нМ для ICOS. Подходящим образом, KD связывающего ICOS белка для ICOS составляет 100, 50, 25, 10, 2 или 1 нМ или менее.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированным моноклональным антителам, являющимися агонистами для ICOS человека. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированным моноклональным антителам, содержащим CDR вариабельной области тяжелой цепи, обладающие аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, и CDR вариабельной области легкой цепи, обладающие аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6. В одном аспекте гуманизированное моноклональное антитело является способным стимулировать продукцию цитокинов и/или пролиферацию Т-клеток при приведении в контакт с Т-клетками, в то же время не индуцируя комплемент, ADCC или CDC. В одном варианте осуществления гуманизированное моноклональное антитело обладает вариантом области Fc IgG1 человека. В одном варианте осуществления гуманизированное моноклональное антитело обладает областью Fc IgG4 человека или ее вариантом. В одном варианте осуществления гуманизированное моноклональное антитело обладает областью Fc hIgG4PE Fc. В одном аспекте гуманизированное моноклональное антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, как указано в SEQ ID NO:7; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, как указано в SEQ ID NO:8. В одном аспекте, гуманизированное моноклональное антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, указанной в SEQ ID NO:7; и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO:8. В одном аспекте гуманизированное моноклональное антитело содержит остов hIgG4PE. Более того, показано, что гуманизированные моноклональные антитела по настоящему изобретению стимулируют пролиферацию Т-клеток при приведении в контакт с CD4+ или CD8+ Т-клетками. Показано, что гуманизированные моноклональные антитела по настоящему изобретению индуцируют активацию Т-клеток и стимулируют продукцию цитокинов.
В одном варианте осуществления гуманизированное моноклональное антитело содержит остов hIgG4PE и содержит VH домен, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:7 и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:8. Антитела по настоящему изобретению могут стимулировать продукцию цитокинов при приведении в контакт с Т-клетками.
В одном варианте осуществления представлен связывающий ICOS белок, конкурирующий за связывание с ICOS с любым из связывающих ICOS белков по изобретению. Как понятно в данной области и описано в настоящем описании, конкуренцию за связывание можно измерять посредством сравнения конкуренции со связыванием лиганда с ICOS в присутствии одного или нескольких связывающих ICOS белков. Как также известно в данной области, ICOS экспрессируется на CD4+ и CD8+ Т-клетках так же, как на клетках Трег. Связывающие ICOS белки по настоящему изобретению действуют как агонист ICOS на Т-клетки. Они действуют также для блокирования взаимодействия между ICOS-L и ICOS, экспрессированных как на Т-клетках, так и на клетках Трег. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам блокирования взаимодействия ICOS-L с ICOS на клетках Трег. Экспрессирующие ICOS клетки Трег можно обнаружить на различных типах опухолей, включая гемобластозы, такие как лимфома. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к
- 21 036335 способам лечения злокачественных опухолей, включающим введение связывающего ICOS белка по изобретению, где связывающий ICOS белок блокирует взаимодействие ICOS-L с ICOS на клетках Трег.
Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим связывающий ICOS белок или моноклональное антитело, описанные в настоящем описании. В одном аспекте фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одно антинеопластическое средство. В одном аспекте фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одно второе иммуномодулирующее средство. В одном аспекте фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один иммуностимулирующий адъювант.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли и/или инфекционного заболевания у человека, где указанный способ включает стадию введения фармацевтической композиции по изобретению указанному человеку. В одном варианте осуществления человек имеет злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления человек имеет инфекционное заболевание. В одном варианте осуществления человек имеет HIV. В одном аспекте способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного антинеопластического средства указанному человеку. В другом аспекте способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного второго иммуномодулирующего средства указанному человеку. В другом аспекте способ дополнительно включает введение иммуностимулирующего адъюванта указанному человеку.
В одном аспекте человек имеет солидную опухоль. В одном аспекте опухоль выбрана из рака головы и шеи, рака желудка, меланомы, почечноклеточного рака (RCC), рака пищевода, немелкоклеточной карциномы легких, рака предстательной железы, колоректального рака, рака яичника и рака поджелудочной железы. В одном аспекте человек имеет одно или несколько из следующего: колоректального рака (CRC), рака пищевода, шейки матки, мочевого пузыря, молочной железы, головы и шеи, яичников, меланомы, почечноклеточного рака (RCC), плоскоклеточной ЕС, немелкоклеточной карциномы легких, мезотелиомы и рака предстательной железы. В другом аспекте человек имеет гемобластоз, такой как диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (DLBCL), множественная миелома, хронический лимфобластный лейкоз (CLL), фолликулярная лимфома, острый миелоидный лейкоз и хронический миелогенный лейкоз.
Настоящее описание относится также к способу лечения или уменьшения тяжести злокачественной опухоли, выбранной из злокачественных опухолей головного мозга (глиом), глиобластом, синдрома Банаяна-Зонана, болезни Каудена, болезни Лермитта-Дюкло, рака молочной железы, воспалительного рака молочной железы, опухоли Вильмса, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы, эпендимомы, медуллобластомы, злокачественных опухолей толстой кишки, головы и шеи, почки, легкого, печени, меланомы, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, саркомы, остеосаркомы, гигантоклеточной опухоли кости, рака щитовидной железы, лимфобластного Т-клеточного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического нейтрофильного лейкоза, острого лимфобластного Т-клеточного лейкоза, плазмацитомы, иммунобластного крупноклеточного лейкоза, лейкоза из клеток мантийной зоны, множественной миеломы, мегакариобластного лейкоза, множественной миеломы, острого мегакариобластного лейкоза, промиелоцитарного лейкоза, эритролейкоза, злокачественной лимфомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, лимфобластной Т-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, фолликулярной лимфомы, нейробластомы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака, рака легкого, рака женских наружных половых органов, рака шейки матки, рака эндометрия, рака почки, мезотелиомы, рака пищевода, злокачественной опухоли слюнных желез, печеночноклеточного рака, рака желудка, назофарингеального рака, злокачественной опухоли щеки, злокачественной опухоли ротовой полости, GIST (стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта) и рака яичка.
Под термином лечение и его грамматическими вариантами в рамках изобретения понимают терапевтическое лечение. По отношению к конкретному состоянию лечение означает: (1) облегчение или предотвращение состояния или одного или нескольких биологических проявлений состояния, (2) создание помех для (а) одной или нескольких точек в биологическом каскаде, приводящем к состоянию или ответственном за состояние, или (b) одного или нескольких биологических проявлений состояния, (3) облегчение одного или нескольких из симптомов, эффектов или побочных эффектов, ассоциированных с состоянием или его лечением, (4) замедление прогрессирования состояния или одного или нескольких биологических проявлений состояния, и/или (5) излечение указанного состояния или одного или нескольких биологических проявлений состояния посредством прекращения или уменьшения до не поддающихся детекции уровней одного или нескольких биологических проявлений состояния на период времени, рассматриваемый как состояние ремиссии для этого проявления без дополнительного лечения в течение периода ремиссии. Специалисту в данной области понятна продолжительность времени, которое можно рассматривать как ремиссию для конкретного заболевания или состояния. Профилактическое лечение также предусматривают таким образом. Специалисту в данной области понятно, что предотвращение не является абсолютным термином. В медицине предотвращение понимают как относящееся к профилактическому введению лекарственного средства для значительного уменьшения вероятности или
- 22 036335 тяжести состояния или его биологического проявления, или для задержки начала такого состояния или его биологического проявления. Профилактическое лечение является пригодным, например, когда субъекта считают подверженным высокому риску развития злокачественной опухоли, например, когда субъект имеет отягощенный семейный анамнез злокачественных опухолей или когда субъект подвергается воздействию канцерогена.
В рамках изобретения термины злокачественная опухоль, неоплазия и опухоль используют взаимозаменяемо и, в форме либо единственного, либо множественного числа, они относятся к клеткам, подвергнутым злокачественной трансформации, что делает их патологическими для организма-хозяина. Первичные клетки злокачественных опухолей можно легко отличать от незлокачественных клеток посредством хорошо разработанных способов, в частности гистологического исследования.
Определение клетки злокачественной опухоли в рамках изобретения включает не только клетку злокачественной опухоли, но и любую клетку, происходящую из предшественника клеток злокачественных опухолей. Они включают метастазирующие клетки злокачественных опухолей и культуры и линии клеток in vitro, происходящие из клеток злокачественных опухолей. По отношению к типу злокачественных опухолей, которые обычно проявляются как солидные опухоли, поддающаяся клинической детекции опухоль представляет собой опухоль, которую можно детектировать на основании массы опухоли; например, такими способами, как сканирование компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), рентгеновский анализ, ультразвуковое исследование или пальпация при физическом обследовании, и/или которую можно детектировать благодаря экспрессии одного или нескольких специфических для злокачественной опухоли антигенов в образце, который можно получать от пациента. Опухоли могут представлять собой гематопоэтические (или гематологические, или связанные с кровью) злокачественные опухоли, например злокачественные опухоли, происходящие из клеток крови или иммуноцитов, которые можно обозначать как гемобластозы. Конкретные примеры клинических состояний, основанных на гематологических опухолях, включают лейкозы, такие как хронический миелоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз и острый лимфоцитарный лейкоз; злокачественные новообразования плазматических клеток, такие как множественная миелома, MGUS и макроглобулинемия Вальденстрема; лимфомы, такие как неходжскинская лимфома, лимфома Ходжкина; и т.п.
Злокачественная опухоль может представлять собой любую злокачественную опухоль, в которой присутствует аномальное количество бластных клеток или нежелательная пролиферация клеток, или которая диагностирована как гематологическая злокачественная опухоль, включая как лимфоидные, так и миелоидные злокачественные новообразования. Миелоидные злокачественные новообразования включают, но без ограничения, острый миелоидный (или миелоцитарный или миелогенный или миелобластный) лейкоз (недифференцированный или дифференцированный), острый промиелоидный (или промиелоцитарный или промиелогенный или промиелобластный) лейкоз, острый миеломоноцитарный (или миеломонобластный) лейкоз, острый моноцитарный (или монобластный) лейкоз, эритролейкоз и мегакариоцитарный (или мегакариобластный) лейкоз. Эти лейкозы вместе можно обозначать как острый миелоидный (или миелоцитарный, или миелогенный) лейкоз (AML). Миелоидные злокачественные новообразования включают также миелопролиферативные нарушения (MPD), включающие в себя, но без ограничения, хронический миелогенный (или миелоидный) лейкоз (CML), хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML), эссенциальную тромбоцитемию (или тромбоцитоз) и истинную полицитемию (PCV). Миелоидные злокачественные новообразования включают также миелодисплазию (или миелодиспластический синдром, или MDS), которую можно обозначать как невосприимчивую анемию (RA), невосприимчивую анемию с избытком бластов (RAEB) и невосприимчивую анемию с избытком бластов на стадии трансформации (RAEBT); так же как миелофиброз (MFS) в присутствии или в отсутствие агногенной миелоидной метаплазии.
Гематопоэтические злокачественные опухоли включают также лимфоидные злокачественные новообразования, которые могут поражать лимфатические узлы, селезенку, костный мозг, периферическую кровь и/или экстранодальные участки. Лимфоидные злокачественные опухоли включают В-клеточные злокачественные новообразования, включающие в себя, но без ограничения, В-клеточные неходжскинские лимфомы (B-NHL). B-NHL могут являться индолентными (или обладать низкой степенью злокачественности), обладать промежуточной степенью злокачественности (или являться агрессивными) или обладать высокой степенью злокачественности (являться очень агрессивными). Индолентные Вклеточные лимфомы включают фолликулярную лимфому (FL); мелколимфоцитарную лимфому (SLL); лимфому маргинальной зоны (MZL) включая нодальную MZL, экстранодальную MZL, MZL селезенки и MZL селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами; лимфоплазматическую лимфому (LPL) и лимфому лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой (MALT или экстранодальную лимфому маргинальной зоны). B-NHL промежуточной степени злокачественности включают лимфому из клеток мантийной зоны (MCL) с вовлечением или без вовлечения лейкоза, диффузную крупноклеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную крупноклеточную лимфому (или лимфому степени 3 или степени 3В) и первичную медиастинальную лимфому (PML). B-NHL высокой степени злокачественности включают лимфому Беркитта (BL), лимфому, подобную лимфоме Беркитта, мелкоклеточную лимфому с нерассечен- 23 036335 ными ядрами (SNCCL) и лимфобластную лимфому. Другие B-NHL включают иммунобластную лимфому (или иммуноцитому), первичную выпотную лимфому, ассоциированные с HIV (или связанные со СПИД) лимфомы, и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD) или лимфому. В-клеточные злокачественные новообразования включают также, но без ограничения, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), пролимфоцитарный лейкоз (PLL), макроглобулинемию Вальденстрема (WM), волосатоклеточный лейкоз (HCL), лейкоз больших гранулярных лейкоцитов (LGL), острый лимфоидный (или лимфоцитарный или лимфобластный) лейкоз и болезнь Кастлмана. NHL могут включать в себя также Т-клеточные неходжскинские лимфомы (T-NHL), которые включают, но без ограничения, неуточненную Т-клеточную неходжскинскую лимфому (NOS), периферическую Т-клеточную лимфому (PTCL), анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), ангиоиммунобластное лимфоидное нарушение (AILD), лимфому клеток естественных киллеров (NK)/Т-клеток носовой полости, лимфому гамма/дельта-Т-клеток, Т-клеточную лимфому кожи, фунгоидный микоз и синдром Сезари.
Гематопоэтические злокачественные опухоли включают также лимфому (или болезнь) Ходжкина, включая классическую лимфому Ходжкина, нодулярную склерозирующую лимфому Ходжкина, смешанно-клеточную лимфому Ходжкина, лимфому Ходжкина с преобладанием лимфоцитов (LP), нодулярную LP лимфому Ходжкина и лимфому Ходжкина с лимфоидным истощением. Гематопоэтические злокачественные опухоли включают также заболевания или злокачественные опухоли плазматических клеток, такие как множественная миелома (ММ), включая вялотекущую ММ, моноклональная гаммопатия неопределенного (или неизвестного, или неясного) генеза (MGUS), плазмацитома (кости, экстрамедуллярную), лимфоплазматическая лимфома (LPL), макроглобулинемия Вальденстрема, лейкоз плазматических клеток и первичный амилоидоз (AL). Гематопоэтические злокачественные опухоли могут включать в себя также другие злокачественные опухоли дополнительных гематопоэтических клеток, включая полиморфноядерные лейкоциты (или нейтрофилы), базофилы, эозинофилы, дендритные клетки, тромбоциты, эритроциты и клетки естественные киллеры. Ткани, включающие гематопоэтические клетки, обозначенные в настоящем описании как ткани гематопоэтических клеток, включают костный мозг; периферическую кровь; тимус; и периферические лимфоидные ткани, такие как ткани селезенки, лимфатические узлы, лимфоидные ткани, ассоциированные со слизистыми оболочками (такие как лимфоидные ткани, ассоциированные с кишечником), ткани миндалин, пейеровых бляшек и аппендикса, и лимфоидные ткани, ассоциированные с другими слизистыми оболочками, например выстилкой бронхов.
Связывающие ICOS белки, антитела и антигенсвязывающие фрагменты по изобретению можно также использовать для излечения, предотвращения или лечения инфекций и инфекционных заболеваний. Связывающие ICOS белки можно использовать отдельно или в комбинации с вакцинами, для стимуляции иммунного ответа на патогены, токсины и собственные антигены. Связывающие ICOS белки по настоящему изобретению можно использовать для стимуляции иммунного ответа на вирусы, инфекционные для человека, такие как, но без ограничения, вирусы иммунодефицита человека, вирусы гепатита класса А, В и С, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус человека, вирусы папилломы человека, вирусы герпеса. Связывающие ICOS белки по настоящему изобретению можно использовать для стимуляции иммунного ответа на инфекции бактериальными или грибковыми паразитами и другими патогенами. Подходящим образом, настоящее изобретение относится к способам лечения людей, подвергшихся воздействию конкретных токсинов или патогенов. Соответственно другой аспект изобретения относится к способу лечения инфекционного заболевания у субъекта, включающему в себя введение субъекту связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части.
Примеры инфекционного заболевания, при котором можно использовать связывающие ICOS белки по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, HIV, гепатит (А, В, и С), грипп, герпес, инфекцию жиардия, малярию, инфекцию Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa. Некоторые примеры патогенных вирусов, вызывающих инфекции, которые можно лечить способами по изобретению, включают HIV, гепатит (А, В или С), вирус герпеса (например, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, и CMV, вирус Эпштейна-Барр), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус Коксаки, коронавирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус свинки, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус осповакцины, вирус HTLV, вирус Денге, папилломавирус, вирус моллюска, вирус полиомиелита, вирус бешенства, вирус JC и вирус арбовирусного энцефалита.
Некоторые примеры патогенных бактерий, вызывающих инфекции, которые можно лечить способами по изобретению, включают хламидии, риккетсиозные бактерии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и гонококки, клебсиеллу, протей, серратию, псевдомонады, легионеллы, бактерии, вызывающие дифтерию, сальмонеллы, бациллы, бактерии, вызывающие холеру, столбняк, ботулизм, сибирскую язву, чуму, лептоспироз и болезнь Лайма.
Некоторые примеры патогенных грибов, вызывающих инфекции, которые можно лечить способами по изобретению, включают Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis и т.д.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger и т.д.), род Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Histoplasm capsulatum.
Некоторые примеры патогенных паразитов, вызывающих инфекции, которые можно лечить способами по изобретению, включают Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, виды Acan- 24 036335 thamoeba, Giardia lambia, виды Cryptosporidium, Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti,
Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi и Nippostrongylus brasiliensis.
Сепсис представляет собой потенциально смертельное медицинское состояние, характеризующееся воспалительным состоянием всего организма (называемым синдромом системного воспалительного ответа или SIRS) и присутствием известной или предполагаемой инфекции. Организм посредством иммунной системы может развивать этот воспалительный ответ на микроорганизмы в крови, моче, легких, коже или других тканях. Просторечным термином для сепсиса является заражение крови, более точно соответствующее септицемии, ниже. Тяжелый сепсис представляет собой системный воспалительный ответ, плюс инфекция, плюс присутствие дисфункции органов.
Септицемия является родственным медицинским термином, относящимся к присутствию патогенных организмов в кровотоке, приводящему к сепсису. Термин не является строго определенным.
Сепсис и злокачественная опухоль разделяют сходные иммуносупрессивные механизмы, включая увеличение количества регуляторных Т-клеток, увеличение количества супрессорных клеток миелоидного происхождения, увеличение экспрессии молекул для отрицательной костимуляции, уменьшение экспрессии HLA-DR на моноцитах/макрофагах. Сепсис и злокачественная опухоль являются прототипическими нарушениями для хронического воспаления. Chronic inflammation stimulates potent and sustained immunoregulatory responses, including expansion of T regulatory клетки and up-regulation of PD-1 and other negative regulators on effector клетки. Barouch D.H. and Deeks S.G.; Immunologic strategies for HIV-1 remission and eradication. Science 345:169-174 2014. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения представлены способы лечения сепсиса у нуждающегося в этом человека, включающие в себя введение терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка для ICOS по настоящему изобретению указанному человеку; Boomer, et al. JAM 306:2594-2605 (2011); Meisel, et al. Granulocytemacrophage colony-stimulating factor to reverse sepsis-associated immunosuppression: a double-blind, randomized, placebo-controlled multicenter trial. Am J Respir Crit Care Med 180:640-648 (2009) и Hall, et al. Immunoparalysis and nosocomial infection in children with multiple organ dysfunction syndrome. Intensive Care Med 37:525-532 (2011).
Связывающие ICOS белки по изобретению можно использовать в сочетании с другими рекомбинантными белками и/или пептидами (такими как антигены опухолей или клетки злокачественных опухолей) для увеличения иммунного ответа на эти белки (т.е. в протоколе вакцинации).
Например, связывающие ICOS белки можно использовать для стимуляции антигенспецифических иммунных ответов посредством совместного введения по меньшей мере одного связывающего ICOS белка с представляющим интерес антигеном (например, вакциной).
Соответственно в другом аспекте изобретение относится к способу усиления иммунного ответа на антиген у субъекта, включающему в себя введение субъекту: (i) антигена и (ii) связывающего ICOS белка по изобретению, так что иммунный ответ на антиген у субъекта усиливается. Антиген может представлять собой, например, антиген опухоли, вирусный антиген, бактериальный антиген или антиген из патоген. Неограничивающие примеры таких антигенов включают, без ограничения, антигены опухолей или антигены из вирусов, бактерий или других патогенов.
Основной трудностью для уничтожения HIV является сохранение латентно инфицированных клеток, не экспрессирующих вирусные антигены, и избегающих иммунного надзора. Современный способ уничтожения латентных вирусных резервуаров, обозначенный как способ разбудить и уничтожить, имеет целью реактивировать экспрессию гена HIV (разбудить), поскольку активация клеток приводит к реактивации HIV, и вывести реактивированные клетки (уничтожить). Активация клеток управляется равновесием положительных и отрицательных регуляторов, экспрессированных на поверхности Тклеток. Изменение этого равновесия посредством агонизма положительных регуляторов и антагонизма отрицательных регуляторов может облегчать реактивацию HIV.
Индуцируемый костимулятор Т-клеток (ICOS) является положительным регулятором, экспрессия которого увеличивается на CD4 Т-клетках после стимуляции. ICOS функционирует для стимуляции пролиферации Т-клеток, продукции цитокинов и дифференцировки Т-клеток. Одной важной подгруппой Тклеток, которые экспрессируют высокие уровни PD-1 и ICOS, являются фолликулярные Т-клеткипомощники (Tfh). Клетки Tfh помогают В-клеткам подвергаться дифференцировке, переключению классов, соматической гипермутации, и являются необходимыми для формирования зародышевого центра. Клетки Tfh значительно размножаются после инфекции HIV/SIV, и их дисрегуляция в ходе хронической лентивирусной инфекции вносит вклад в нарушенный В-клеточный иммунитет. Показано, что отсортированные клетки Tfh содержат более высокие уровни ДНК HIV, чем другие лимфоидные подгруппы CD4, и наблюдают увеличение количества вируса после стимуляции. Клетки Tfh содержатся в зародышевых центрах и подвергаются воздействию вирионов HIV, удерживаемых на фолликулярных дендритных клетках, которые могут облегчать их инфекцию. Кроме того, CD8 Т-клетки имеют ограниченный доступ к зародышевым центрам, и фолликулярные CD8 клетки часто обладают уменьшенной цитотоксичностью, таким образом, оберегая клетки Tfh от противовирусного надзора. Таким образом, клетки Tfh являются важным защищенным резервуаром HIV, и способы, нацеленные на PD-1 и ICOS, могут избира- 25 036335 тельно нацеливаться на клетки Tfh и являются полезными в качестве части режима лечения HIV. Подходящим образом, представлены способы лечения человека, инфицированного HIV, включающие в себя введение связывающего ICOS белка или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению.
В рамках изобретения антигены опухолей представляют собой белки, продуцируемые клетками опухолей, вызывающие иммунный ответ, в частности опосредованные Т-клетками иммунные ответы. Термин антиген опухоли в рамках изобретения включает как опухолеспецифические антигены и опухолеассоциированные антигены. Опухолеспецифические антигены являются уникальными для клеток опухолей и не встречаются на других клетках организма. Опухолеассоциированные антигены не являются уникальными для клеток опухоли, и вместо этого, экспрессируются также на нормальных клетках в условиях, которые не могут индуцировать состояние иммунологической толерантности к антигену. Экспрессия антигена на опухоли может происходить в условиях, позволяющих иммунной системе отвечать на антиген. Опухолеассоциированные антигены могут представлять собой антигены, экспрессируемые на нормальных клетках в ходе развития плода, когда иммунная система является незрелой и неспособной отвечать, или они могут представлять собой антигены, которые в норме присутствуют на необычайно низких уровнях на нормальных клетках, но которые экспрессируются на намного более высоких уровнях на клетках опухолей.
Неограничивающие примеры антигенов опухолей включают следующие: антигены дифференцировки, такие как MART-1/Melan (MART-I), gp100 (Pmel 17), тирозиназа, TRP-1, TRP-2 и опухолеспецифические мультилинейные антигены, такие как антигены семейства MAGE, включая, но без ограничения, MAGE1, MAGE3, MAGE10, MAGE11, MAGE12, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB18, MAGEB6, МАВЕС1, MAGED2, MAGEE1, MAGEH1, MAGEL2, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; MEL4, ассоциированный с меланомой антиген 100+, антиген меланомы gp100, NRIP3, NYS48, OCIAD1, OFA-iLRP, OIP5, ассоциированный с карциномой яичников антиген (OV632), PAGE4, PARP9, РАТЕ, пластин L, PRAME, простатспецифический антиген, протеаза 3, простеин, Reg3a, RHAMM, R0PN1, SART2, SDCCAG8, SEL1L, SEPT1, SLC45A2, SPANX, SSX5, STXGALNAC1, STEAP4, сурвивин, TBC1D2, ТЕМ1, TRP1, антигены опухолей эпителиального происхождения, XAGE1, XAGE2, WT-1; сверхэкспрессированные эмбриональные антигены, такие как СЕА; сверхэкспрессированные онкогены и мутантные гены супрессоров опухолей, такие как р53, Ras, HER-2/neu; уникальные антигены опухолей, возникающие в результате хромосомных транслокаций; такие как BCR-ABL, E2A-PRL, H4RET, IGH-IGK, MYL-RAR; и вирусные антигены, такие как антигены вируса Эпштейна-Барр EBV и антигены Е6 и Е7 папилломавируса человека (HPV).
Другие антигены опухолей включают, но без ограничения, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, С 19-9, С 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, бета-катенин, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, альфа-фетопротеин, бета-HCG, BCA225, BTAA, С 125, С 15-3/C 27,29/BCAA, С 195, С 242, CA-50, CAM43, CD68/P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733/EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, M0V18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, ТА-90/связывающий Mac-2 белок/ассоциированный с циклофилином С белок, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, ассоциированный с глиомой антиген, β-субъединицу хорионического гонадотропина человека, альфафетопротеин (AFP), реакционноспособный по отношению к лектину AFP, тиреоглобулин, RAGE-1, MN-C IX, обратную транскриптазу теломеразы человека, RU1, RU2 (AS), карбоксилэстеразу кишечника, mut hsp70-2, M-CSF, простазу, простатспецифический антиген (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, р53, простеин, PSMA, Her2/neu, сурвивин и теломеразу, антиген-1 опухоли карциномы предстательной железы (РСТА-1), ELF2M, эластазу нейтрофилов, эфрин В2, CD19, CD20, CD22, rOr1, CD33/IL3Ra, с-Met, PSMA, гликолипид F77, EGFRvIII, GD-2, инсулиновый фактор роста (IGF)-I, IGF-II, рецептор IGF-I и мезотелин.
Как правило, любое антинеопластическое средство, обладающее активностью против чувствительной опухоли, подвергаемой лечению, можно вводить совместно при лечении злокачественной опухоли по настоящему изобретению. Примеры таких средств можно обнаружить в Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Специалист в данной области способен различать, какие комбинации средств можно использовать на основании конкретных характеристик рассматриваемых лекарственных средств и злокачественных опухолей. Типичные антинеопластические средства, который можно использовать по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, средства против микротрубочек, такие как дитерпеноиды и алкалоиды барвинка; координационные комплексы платины; алкилирующие средства, такие как азотистые иприты, оксазафосфорины, алкилсульфонаты, нитрозомочевина и триазены; средства антибиотики, такие как антрациклины, актиномицины и блеомицины; ингибиторы топоизомеразы II, такие как эпиподофиллотоксины; антиметаболиты, такие как аналоги пурина и пиримидина и антифолатные соединения; ингибиторы топоизомеразы I, такие как камптотецины; гормоны и аналоги гормонов; ингибиторы путей передачи сигнала; ингибиторы связанных с ангиогенезом нерецепторных тирозинкиназ; иммунотерапевтические средства; проапоптотические средства; и ингибиторы передачи сигналов клеточного цикла.
Примерами дополнительного активного ингредиента или ингредиентов для применения в комбина- 26 036335 ции или для совместного введения с настоящим связывающим ICOS белком являются антинеопластические средства, включая любые химиотерапевтические средства, иммуномодулирующие средства или иммуномодуляторы и иммуностимулирующие адъюванты.
Средства против микротрубочек или антимитотические средства представляют собой специфические для фазы средства, активные против микротрубочек клеток опухолей в ходе фазы М или фазы митоза клеточного цикла. Примеры средств против микротрубочек включают, но без ограничения, дитерпеноиды и алкалоиды барвинка.
Дитерпеноиды, происходящие из природных источников, представляют собой специфические для фазы противораковые средства, действующие в фазах G2/M клеточного цикла. Считают, что дитерпеноиды стабилизируют β-субъединицу тубулина микротрубочек посредством связывания с этим белком. Затем разборка белка, по-видимому, ингибируется с арестом митоза и последующей гибелью клеток. Примеры дитерпеноидов включают, но без ограничения, паклитаксел и его аналог доцетаксел.
Паклитаксел, 5β, 20-эпокси-1, 2α, 4, 7β, 10β, 13а-гекса-гидрокситакс-11-ен-9-он-4,10-диацетат-2бензоат-13-эфир с (2R,3S)-N-бензоил-3-фенилизосерином, представляет собой природный дитерпеновый продукт, выделенный из тиса тихоокеанского Taxus brevifoli, и является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора ТАКСОЛ®. Он является членом таксанового семейства терпенов. Он впервые выделен в 1971 г. Wani et al. J. Am. Chem, Soc, 93:2325, 1971, охарактеризовавшими его структуру химическими и рентгенокристаллографическими способами. Один из механизмов для его активности относится к способности паклитаксела связывать тубулин, таким образом ингибируя рост клеток злокачественных опухолей; Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980); Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979); Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981). Обзор синтеза и противораковой активности некоторых производных паклитаксела см. в D.G.I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, озаглавленной New trends in Natural Products Chemistry 1986, Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235.
Паклитаксел одобрен для клинического применения для лечения невосприимчивого рака яичника в Соединенных Штатах (Markm et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. Intern, Med., 111:273, 1989) и для лечения рака молочной железы (Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797, 1991). Он является потенциальным кандидатом для лечения неоплазий кожи (Einzig et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46) и карцином головы и шеи (Forastire et al., Sem. Oncol., 20:56, 1990). Для соединения показан также потенциал для лечения поликистоза почек (Woo et al., Nature, 368:750, 1994, рака легкого и малярии. Лечение пациентов паклитакселом приводит к подавлению костного мозга (множество линий клеток, Ignoff, R.J. et al., Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998), связанной с продолжительностью дозирования выше пороговой концентрации (50 нМ) (Kearns, C.M. et al., Seminars in Oncology, 3(6), p. 16-23, 1995).
Доцетаксел, (2R,3S)-N-карбокси-3-фенилизосерин, N-трет-бутиловый эфир, 13-эфир с 5β-20эпокси-1,2а, 4, 7β, 10β, 13а-гексагидрокситакс-11-ен-9-он-4-ацетат-2-бензоатом, тригидратом, является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора как ТАКСОТЕР®. Доцетаксел рекомендован для лечения рака молочной железы. Доцетаксел является полусинтетическим производным паклитаксела q.v., полученного с использованием природного предшественника, 10-деацетил-баккатина III, экстрагированного из игл европейского тиса. Ограничивающая дозу токсичность доцетаксела представляет собой нейтропению.
Алкалоиды барвинка представляют собой специфические для фазы антинеопластические средства, полученные из растения барвинка. Алкалоиды барвинка действуют в фазе М (митоза) клеточного цикла посредством специфического связывания с тубулином. Следовательно, связанная молекула тубулина неспособна полимеризоваться в микротрубочки. Считают, что происходит арест митоза в метафазе с последующей гибелью клеток. Примеры алкалоидов барвинка включают, но без ограничения, винбластин, винкристин и винорелбин.
Винбластин, сульфат винкалейкобластина, является коммерчески доступным как ВЕЛБАН® в форме пригодного для инъекций раствора. Хотя для него возможны рекомендации в качестве терапии второй линии для различных солидных опухолей, он в первую очередь рекомендован для лечения рака яичка и различных лимфом, включая болезнь Ходжкина; и лимфоцитарную и гистиоцитарную лимфомы. Миелосупрессия является ограничивающим дозу побочным эффектом винбластина.
Винкристин, винкалейкобластин, 22-оксо-, сульфат, является коммерчески доступным как ОНКОВИН® в форме пригодного для инъекций раствора. Винкристин рекомендован для лечения острых лейкозов и также находит применение в режимах лечения злокачественной лимфомы Ходжкина и неходжскинских злокачественных лимфом. Алопеция и неврологические эффекты являются наиболее распространенным побочным эффектом винкристина, и в меньшей степени встречаются эффекты миелосупрессии и мукозита желудочно-кишечного тракта.
Винорелбин, 3',4'-дидегидро-4'-дезокси-С'-норвинкалейкобластина [.-(.*,.*)-2,3-дигидроксибутандиоат (1:2)(соль)], коммерчески доступный в форме пригодного для инъекций раствора тартрата винорелбина (НАВЕЛБИН®), представляет собой полусинтетический алкалоид барвинка. Винорелбин
- 27 036335 рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатин, для лечения различных солидных опухолей, в частности немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы на поздних стадиях и невосприимчивого к гормонам рака предстательной железы. Миелосупрессия является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом винорелбина.
Координационные комплексы платины являются не специфическими для фазы противораковыми средствами, взаимодействующими с ДНК. Комплексы платины входят в клетки опухолей, подвергаются гидратации и формируют внутри- и межцепьевые поперечные сшивки с ДНК, вызывающие неблагоприятные для опухоли биологические эффекты. Примеры координационных комплексов платины включают, но без ограничения, цисплатин и карбоплатин.
Цисплатин, цис-диаминдихлорплатина, является коммерчески доступным как ПЛАТИНОЛ® в форме пригодного для инъекций раствора. Цисплатин в первую очередь рекомендован для лечения метастазирующего рака яичка и рака яичника, и рака мочевого пузыря на поздних стадиях. Важнейшими ограничивающими дозу побочными эффектами цисплатина являются нефротоксичность, которую можно контролировать посредством гидратации и диуреза, и ототоксичность.
Карбоплатин, диамин[1,1-циклобутан-дикарбоксилат(2-)-О,О'] платины, является коммерчески доступным как ПАРАПЛАТИН® в форме пригодного для инъекций раствора. Карбоплатин в первую очередь рекомендован для терапии первой и второй линий карциномы яичников на поздней стадии. Подавление костного мозга представляет собой ограничивающую дозу токсичность карбоплатина.
Алкилирующие средства представляют собой не специфические для фазы противораковые средства и сильные электрофилы. Как правило, алкилирующие средства формируют ковалентные связи посредством алкилирования с ДНК через нуклеофильные группы молекулы ДНК, такие как фосфатная группа, аминогруппа, сульфгидрильная, гидроксильная, карбоксильная и имидазольная группы. Такое алкилирование нарушает функцию нуклеиновой кислоты, приводя к гибели клеток. Примеры алкилирующих средств включают, но без ограничения, азотистые иприты, такие как циклофосфамид, мелфалан и хлорамбуцил; алкилсульфонаты, такие как бусульфан; нитрозомочевины, такие как кармустин; и триазены, такие как декарбазин.
Циклофосфамид, моногидрат 2-оксида 2-[бис-(2-хлорэтил)амино]тетрагидро-2Н-1,3,2-оксазафосфорина, является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора или таблеток как ЦИТОКСАН®. Циклофосфамид рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами, для лечения злокачественных лимфом, множественной миеломы и лейкозов. Алопеция, тошнота, рвота и лейкопения являются наиболее распространенными ограничивающими дозу побочными эффектами циклофосфамида.
Мелфалан, 4-[бис-(2-хлорэтил)амино]-Е-фенилаланин, является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора или таблеток как АЛКЕРАН®. Мелфалан рекомендован для паллиативного лечения множественной миеломы и неоперабельной эпителиальной карциномы яичников. Подавление костного мозга является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом мелфалана.
Хлорамбуцил, 4-[бис-(2-хлорэтил)амино]бензолбутановая кислота, является коммерчески доступным как таблетки ЛЕЙКЕРАН®. Хлорамбуцил рекомендован для паллиативного лечения хронического лимфатического лейкоза, и злокачественных лимфом, таких как лимфосаркома, гигантоклеточная фолликулярная лимфома и болезнь Ходжкина. Подавление костного мозга является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом хлорамбуцила.
Бусульфан, 1,4-бутандиолдиметансульфонат, является коммерчески доступным как таблетки МИЛЕРАН®. Бусульфан рекомендован для паллиативного лечения хронического миелогенного лейкоза. Подавление костного мозга является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом бусульфана.
Кармустин, 1,3-[бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина, является коммерчески доступным в форме отдельных ампул с лиофилизированным материалом как BiCNU®. Кармустин рекомендован для паллиативного лечения в качестве отдельного средства или в комбинации с другими средствами при опухолях мозга, множественной миеломе, болезни Ходжкина и неходжскинских лимфом. Отсроченная миелосупрессия является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом кармустина.
Декарбазин, 5-(3,3-диметил-1-триазено)имидазол-4-карбоксамид, является коммерчески доступным в форме отдельных ампул с материалом как DTIC-Dome®. Декарбазин рекомендован для лечения метастазирующей злокачественная меланома и в комбинации с другими средствами для терапии второй линии болезни Ходжкина.
Тошнота, рвота, и анорексия являются наиболее распространенными ограничивающими дозу побочными эффектами декарбазина.
Антинеопластические антибиотики являются не специфическими для фазы средствами, связывающими ДНК или интеркалирующими в ДНК. Как правило, такое действие приводит к образованию стабильных комплексов ДНК или к разрыву цепи, что нарушает обычное функционирование нуклеиновых
- 28 036335 кислот, приводя к гибели клеток. Примеры антинеопластических антибиотических средств включают, но без ограничения, актиномицины, такие как дактиномицин, антрациклины, такие как даунорубицин и доксорубицин; и блеомицины.
Дактиномицин, известный также как актиномицин D, является коммерчески доступным в пригодной для инъекций форме как КОСМЕГЕН®. Дактиномицин рекомендован для лечения опухоли Вильмса и рабдомиосаркомы. Тошнота, рвота и анорексия являются наиболее распространенными ограничивающими дозу побочными эффектами дактиномицина.
Даунорубицин, гидрохлорид ^-цис-)-8-ацетил-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-а-Б-ликсогексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-5,12-нафтацендиона, является коммерчески доступным в липосомной пригодной для инъекций форме как ДАУНОКСОМ® или в пригодной для инъекций форме как ЦЕРУБИДИН®. Даунорубицин рекомендован для индукции ремиссии при лечении острого нелимфоцитарного лейкоза и ассоциированной с HIV саркомы Капоши на поздних стадиях. Миелосупрессия является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом даунорубицина.
Доксорубицин, гидрохлорид (8S,10S)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсогексаnиранозил)окси]-8-гликолоил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-5,12-нафтацендиона, является коммерчески доступным в пригодной для инъекций форме как РУБЕКС® или АДРИАМИЦИН RDF®. Доксорубицин в первую очередь рекомендован для лечения острого лимфобластного лейкоза и острого миелобластного лейкоза, но является также полезным компонентом лечения некоторых солидных опухолей и лимфом.
Миелосупрессия является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом доксорубицина.
Блеомицин, смесь цитотоксических гликопептидных антибиотиков, выделенных из штамма Streptomyces verticillus, является коммерчески доступным как БЛЕНОКСАН®. Блеомицин рекомендован для паллиативного лечения в качестве отдельного средства или в комбинации с другими средствами при плоскоклеточной карциноме, лимфомах и карциномах яичка. Легочная и кожная токсичность являются наиболее распространенными ограничивающими дозу побочными эффектами блеомицина.
Ингибиторы топоизомеразы II включают, но без ограничения, эпиподофиллотоксины.
Эпиподофиллотоксины представляют собой специфические для фазы антинеопластические средства, полученные из растения мандрагоры. Эпиподофиллотоксины, как правило, поражают клетки в фазах S и G2 клеточного цикла посредством формирования тройного комплекса с топоизомеразой II и ДНК, вызывая разрывы цепей ДНК. Разрывы цепей накапливаются, и за этим следует гибель клеток. Примеры эпиподофиллотоксинов включают, но без ограничения, этопозид и тенипозид.
Этопозид, 4'-деметилэпиподофиллотоксин-9[4,6-0-(К)-этилиден-вЮ-глюкопиранозид], является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора или капсул как Вепезид® и является общеизвестным как VP-16. Этопозид рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами для лечения рака яичка и немелкоклеточного рака легкого. Миелосупрессия является наиболее распространенным побочным эффектом этопозида. Заболеваемость лейкопенией проявляет тенденцию к большей тяжести, чем тромбоцитопенией.
Тенипозид, 4'-деметилэпиподофиллотоксин-9[4,6-0-(К)-тенилиден-вЮ-глюкопиранозид], является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора как ВУМОН® и является общеизвестным как VM-26. Тенипозид рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами для лечения острого лейкоза у детей. Миелосупрессия является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом тенипозида. Тенипозид может индуцировать как лейкопению, так и тромбоцитопению.
Антиметаболитные антинеопластические средства представляют собой специфические для фазы антинеопластические средства, которые действуют в фазе S (синтеза ДНК) клеточного цикла посредством ингибирования синтеза ДНК или посредством ингибирования синтеза пуриновых или пиримидиновых оснований и таким образом, ограничивают синтез ДНК. Следовательно, отсутствует прохождение фазы S, и за этим следует гибель клеток. Примеры антиметаболитных антинеопластических средств включают, но без ограничения, фторурацил, метотрексат, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин и гемцитабин.
5-Фторурацил, 5-фтор-2,4-(1Н,3Н) пиримидиндион, является коммерчески доступным как фторурацил. Введение 5-фторурацила приводит к ингибированию синтеза тимидилата, и он также включается как в РНК, так и в ДНК. Результатом, как правило, является гибель клеток. 5-фторурацил рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами для лечения карцином молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, желудка и поджелудочной железы. Миелосупрессия и мукозит являются ограничивающими дозу побочными эффектами 5-фторурацила. Другие аналоги фторпиримидина включают 5-фтор дезоксиуридин (флоксуридин) и монофосфат 5фтордезоксиуридина.
Цитарабин, 4-амино-1-вЮ-арабинофуранозил-2-(1Н)-пиримидинон, является коммерчески доступ- 29 036335 ным как ЦИТОЗАР-U® и является общеизвестным как Ara-С. Считают, что цитарабин проявляет специфичность для фазы клеток в S-фазе посредством ингибирования элонгации цепи ДНК посредством терминирующего включения цитарабина в растущую цепь ДНК. Цитарабин рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами для лечения острого лейкоза. Другие аналоги цитидина включают 5-азацитидин и 2',2'-дифтордезоксицитидин (гемцитабин). Цитарабин индуцирует лейкопению, тромбоцитопению и мукозит.
Меркаптопурин, моногидрат 1,7-дигидро-6Н-пурин-6-тиона, является коммерчески доступным как ПУРИНТОЛ®. Меркаптопурин проявляет специфичность для фазы клеток в S-фазе посредством ингибирования синтеза ДНК по одному из еще не установленных механизмов. Меркаптопурин рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами для лечения острого лейкоза. Миелосупрессия и желудочно-кишечный мукозит являются ожидаемыми побочными эффектами меркаптопурина в высоких дозах. Полезным аналогом меркаптопурина является азатиоприн.
Тиогуанин, 2-амино-1,7-дигидро-6Н-пурин-6-тион, является коммерчески доступным как TABLOID®. Тиогуанин проявляет специфичность для фазы клеток в S-фазе посредством ингибирования синтеза ДНК по одному из еще не установленных механизмов. Тиогуанин рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами для лечения острого лейкоза. Миелосупрессия, включая лейкопению, тромбоцитопению и анемию, является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом введения тиогуанина. Однако возникают побочные эффекты на желудочно-кишечный тракт, и они могут являться ограничивающими дозу. Другие аналоги пурина включают пентостатин, эритрогидроксинониладенин, фосфат флударабина и кладрибин.
Гемцитабин, моногидрохлорид 2'-дезокси-2',2'-дифторцитидина (β-изомер), является коммерчески доступным как ГЕМЗАР®. Гемцитабин проявляет специфичность для фазы клеток в S-фазе посредством блокирования прохождения клетками границы G1/S. Гемцитабин рекомендован в комбинации с цисплатином для лечения местнораспространенного немелкоклеточного рака легкого и отдельно для лечения местнораспространенного рака поджелудочной железы. Миелосупрессия, включая лейкопению, тромбоцитопению и анемию, является наиболее распространенным ограничивающим дозу побочным эффектом введения гемцитабина.
Метотрексат, №[4[[(2,4-диамино-6-птеридинил)метил]метиламино]бензоил]-Е-глутаминовая кислота, является коммерчески доступным как метотрексат натрия. Метотрексат оказывает эффекты на фазу клеток, специфически в S-фазе, посредством ингибирования синтеза, репарации и/или репликации ДНК посредством ингибирования редуктазы дигидрофолиевой кислоты, необходимой для синтеза пуриновых нуклеотидов и тимидилата. Метотрексат рекомендован в качестве отдельного средства или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами для лечения хориокарциномы, менингеального лейкоза, неходжскинской лимфомы и карцином молочной железы, головы, шеи, яичников и мочевого пузыря. Миелосупрессия (лейкопения, тромбоцитопения и анемия) и мукозит являются ожидаемыми побочными эффектами введения метотрексата.
Камптотецины, включая камптотецин и производные камптотецина, доступны или находятся в разработке как ингибиторы топоизомеразы I. Считают, что цитотоксическая активность камптотецинов связана с их активностью ингибирования топоизомеразы I. Примеры камптотецинов включают, но без ограничения, иринотекан, топотекан и различные оптические формы 7-(4-метилпиперазинометилен)-10,11этилендиокси-20-камптотецина, описанные ниже.
Иринотекан HCl, гидрохлорид (4S)-4,11-диэтил-4-гидрокси-9-[(4-пиперидинопиперидино)карбонилокси]-1Н-пирано [3',4',6,7]индолизино ЦД-ЭДхинолин^М-^^^Щдиона, является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора КАМПТОСАР®.
Иринотекан представляет собой производное камптотецина, которое связывается, наряду со своим активным метаболитом SN-38, с комплексом топоизомераза I - ДНК. Считают, что цитотоксичность возникает в результате неподдающихся репарации двухцепочечных разрывов, вызванных взаимодействием тройного комплекса топоизомераза I: ДНК: иринотекан или SN-38 с ферментами репликации. Иринотекан рекомендован для лечения метастазирующих злокачественных опухолей толстой или прямой кишки.
Ограничивающими дозу побочными эффектами иринотекана HCl являются миелосупрессия, включая нейтропению, и эффекты на ЖКТ, включая диарею.
Топотекан HCl, моногидрохлорид ^)-10-[(диметиламино)метил]-4-этил-4,9-дигидрокси-1Н-пирано [3',4',6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-3,14-(4Н,12Н)диона, является коммерчески доступным в форме пригодного для инъекций раствора ГИКАМТИН®. Топотекан представляет собой производное камптотецина, которое связывается с комплексом топоизомераза I-ДНК и предотвращает повторное лигирование одноцепочечных разрывов, вызванных топоизомеразой I в ответ на скручивающее усилие по отношению к молекуле ДНК. Топотекан рекомендован для терапии второй линии для метастазирующей карциномы яичников и мелкоклеточного рака легкого. Ограничивающим дозу побочным эффектом топотекана HCl является миелосупрессия, в первую очередь нейтропения.
Ритуксимаб представляет собой химерное моноклональное антитело, продаваемое как
- 30 036335
РИТУКСАН® и МАБТЕРА®. Ритуксимаб связывается с CD20 на В-клетках и вызывает апоптоз клеток.
Ритуксимаб вводят внутривенно, и он одобрен для лечения ревматоидного артрита и В-клеточной неходжскинской лимфомы.
Офатумумаб представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, продаваемое как АРЗЕРРА®. Офатумумаб связывается с CD20 на В-клетках, и его используют для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза CLL (типа злокачественной опухоли лейкоцитов) у взрослых, невосприимчивых к лечению флударабином (Флудара) и алемтузумабом (Кампат).
Трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН®) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с рецептором HER2. Исходным показанием для него является положительный по HER2 рак молочной железы.
Цетуксимаб (ЭРБИТУКС®) представляет собой химерное мышиное-человеческое антитело, которое ингибирует рецептор эпидермального фактора роста (EGFR).
Ингибиторы mTOR включают, но без ограничения, рапамицин (FK506) и рапалоги, RAD001 или эверолимус (Афинитор), CCI-779 или темсиролимус, АР23573, AZD8055, WYE-354, WYE-600, WYE-687 и Рр121.
Бексаротен продают как Таргретин®, и он является членом подкласса ретиноидов, избирательно активирующих рецепторы ретиноида X (RXR). Эти рецепторы ретиноида обладают биологической активностью, отличной от активности рецепторов ретиноевой кислоты (RAR). Химическим наименованием является 4-[1-(5,6,7,8-тетрагидро-3,5,5,8,8-пентаметил-2-нафталенил)этенил]бензойная кислота. Бексаротен используют для лечения Т-клеточной лимфомы кожи CTCL (типа рака кожи) у людей, заболевание которых невозможно было успешно лечить с использованием по меньшей мере одного другого лекарственного средства.
Сорафениб, поставляемый на рынок как Нексавар®, представляет собой класс лекарственных средств, называемых мультикиназными ингибиторами. Его химическим наименованием является 4-[4[[4-хлор-3-(трифторметил) фенил] карбамоиламино]фенокси]^-метилпиридин-2-карбоксамид. Сорафениб используют для лечения почечноклеточного рака на поздних стадиях (типа злокачественной опухоли, возникающей в почках). Сорафениб используют также для лечения неоперабельной печеночноклеточной карциномы (типа рака печени, который невозможно вылечить с помощью хирургии).
Примеры ингибиторов erbB включают лапатиниб, эрлотиниб и гефитиниб. Лапатиниб, Ν-(3-χλορ-4{[(3-фторфенил)метил]окси}фенил)-65-({[2-(метилсульфонил)этил]амино}метил)-2-фуранил]-4-хиназолинамин (представленный формулой II, как проиллюстрировано), представляет собой активный, вводимый перорально, низкомолекулярный, двойной ингибитор тирозинкиназ erbB-1 и erbB-2 (EGFR и HER2), одобренный в комбинации с капецитабином для лечения положительного по HER2-метастазирующего рака молочной железы.
Свободное основание, соли с HCl и дитозилатные соли соединения формулы (II) можно получать в соответствии со способом, описанным в WO 99/35146, опубликованной 15 июля 1999 г.; и WO 02/02552, опубликованной 10 января 2002 г.
Эрлотиниб, №(3-этинилфенил)-6,7-бис-{[2-(метилокси)этил]окси}-4-хиназолинамин, коммерчески доступный под торговым наименованием Тарцева), представлен формулой III, как проиллюстрировано
III
Свободное основание и соль с HCl эрлотиниба можно получать, например, в соответствии с U.S. 5747498, пример 20.
- 31 036335
Гефитиниб, 4-хиназолинамин^-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-4-морфолин)пропокси] представлен формулой IV, как проиллюстрировано
Гефитиниб, который является коммерчески доступным под торговым наименованием ИРЕССА® (Astra-Zenenca), представляет собой ингибитор erbB-1, рекомендованный в качестве монотерапии для лечения пациентов с местнораспространенным или метастазирующим немелкоклеточным раком легкого после неудачного применения как химиотерапевтических средств на основе платины и доцетаксела. Свободное основание, соли с HCl и соли с diHCl гефитиниба можно получать в соответствии со способами из Международной патентной заявки No. PCT/GB96/00961, поданной 23 апреля 1996 г., и опубликованной как WO 96/33980 31 октября 1996 г.
Представляет интерес также производное камптотецина следующей формулы А, находящееся в настоящее время в разработке, включая форму рацемической смеси (R,S) так же, как энантиомеры R и S:
известное под химическим наименованием 7-(4-метилпиперазинометилен)-10,11-этилендиокси20^^)-камптотецин (рацемическая смесь) или 7-(4-метилпиперазинометилен)-10,11-этилендиокси20^)-камптотецин (R энантиомер) или 7-(4-метилпиперазинометилен)-10,11-этилендиокси-20^)камптотецин (S энантиомер). Такое соединение так же, как родственные соединения, описаны, включая способы получения, в патентах США No. 6063923; 5342947; 5559235; 5491237 и в рассматриваемой патентной заявке США No. 08/977217, поданной 24 ноября 1997 г.
Гормоны и аналоги гормонов являются полезными соединениями для лечения злокачественных опухолей, для которых существует связь между гормоном(гормонами) и ростом и/или отсутствием роста злокачественной опухоли. Примеры гормонов и аналогов гормонов, которые можно использовать для лечения злокачественных опухолей, включают, но без ограничения, адренокортикостероиды, такие как преднизон и преднизолон, которые можно использовать в лечении злокачественной лимфомы и острого лейкоза у детей; аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол, летразол, воразол и экземестан, которые можно использовать для лечения адренокортикальной карциномы и гормонзависимой карциномы молочной железы, содержащей рецепторы эстрогенов; прогестрины, такие как ацетат мегестрола, который можно использовать для лечения гормонзависимого рака молочной железы и карциномы эндометрия; эстрогены, андрогены и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, ацетат ципротерона и 5а-редуктазы, такие как финастерид и дутастерид, который можно использовать для лечения карциномы предстательной железы и доброкачественной гипертрофии предстательной железы; антиэстрогены, такие как тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, иодоксифен, так же как избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERMS), такие как описанные в патентах США No. 5681835, 5877219 и 6207716, которые можно использовать для лечения гормонзависимой карциномы молочной железы и других чувствительных злокачественных опухолей; и высвобождающий гонадотропин гормон (GnRH) и его аналоги, которые стимулируют высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) и/или фолликулостимулирующий гормон (FSH) для лечения карциномы предстательной железы, например агонисты и антагонисты LHRH, такие как ацетат гозерелина и лейпролид.
Ингибиторы путей передачи сигнала представляют собой ингибиторы, которые блокируют или ингибируют химический процесс, вызывающий внутриклеточное изменение, в рамках изобретения это изменение представляет собой пролиферацию или дифференцировку клеток. Ингибиторы передачи сигнала, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают ингибиторы рецепторных тирозинкиназ, нерецепторных тирозинкиназ, блокаторы домена SH2/SH3, серин/треонинкиназы, фосфотидилинозитол-3-киназы, передачи сигналов миоинозитола и онкогенов Ras.
Несколько протеинтирозинкиназ катализируют фосфорилирование специфических остатков тирозила в различных белках, вовлеченых в регуляцию клеточного роста. Такие протеинтирозинкиназы можно в широком смысле классифицировать как рецепторные или нерецепторные киназы.
Рецепторные тирозинкиназы представляют собой трансмембранные белки, обладающие внеклеточным лигандсвязвающим доменом, трансмембранным доменом и тирозинкиназным доменом. Рецепторные тирозинкиназы вовлечены в регуляцию роста клеток, и их в общем называют рецепторами факторов
- 32 036335 роста. Показано, что неприемлемая или неконтролируемая активация многих из этих киназ, т.е. аномальная активность рецепторной киназы фактора роста, например, посредством сверхэкспрессии или мутации приводит к неконтролируемому росту клеток. Соответственно аномальная активность таких киназ связана с ростом злокачественной ткани. Следовательно, ингибиторы таких киназ могут обеспечивать способы лечения злокачественных опухолей. Рецепторы факторов роста включают, например, рецептор эпидермального фактора роста (EGFr), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFr), erbB2, erbB4, рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFr), тирозинкиназа с доменами, гомологичными иммуноглобулиноподобному и эпидермальному фактору роста (TIE-2), рецептор инсулинового фактора ростаI (IGFI), рецепторы макрофагального колониестимулирующего фактора Cfms), BTK, ckit, cmet, фактора роста фибробластов (FGF), рецепторы Trk (TrkA, TrkB, и TrkC), рецепторы эфрина (eph) и протоонкоген RET. Некоторые ингибиторы рецепторов роста находятся в разработке и включают антагонисты лигандов, антитела, ингибиторы тирозинкиназы и антисмысловые олигонуклеотиды. Рецепторы факторов роста и средства, ингибирующие функцию рецепторов факторов роста, описаны, например, в Kath, John С., Ехр. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6): 803-818; Shawver et al. DDT Vol. 2, No. 2 February 1997 и Lofts, F.J. et al., Growth factor receptors as targets, New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. Workman, Paul and Kerr, David, CRC press 1994, London.
Тирозинкиназы, не являющиеся рецепторными киназами факторов роста, названы нерецепторными тирозинкиназами. Нерецепторные тирозинкиназы, которые можно использовать по настоящему изобретению, которые являются мишенями или потенциальными мишенями противораковых лекарственных средств, включают cSrc, Lck, Fyn, Yes, Jak, cAbl, FAK (киназу фокальной адгезии), тирозинкиназу Брутона и Bcr-Abl. Такие нерецепторные киназы и средства, ингибирующие функцию нерецепторных тирозинкиназ, описаны в Sinn, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80 и Bolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404.
Блокаторы доменов SH2/SH3 представляют собой средства, нарушающие связывание домена SH2 или SH3 во множестве ферментов или адаптерных белков, включая субъединицу р85 PI3-K, киназы семейства Src, адаптерные молекулы (She, Crk, Nek, Grb2) и Ras-GAP. Домены SH2/SH3 в качестве мишеней для противораковых лекарственных средств обсуждают в Smithgall, Т.Е. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32.
Ингибиторы серин/треонинкиназ, включая блокаторы каскада киназы MAP, включают блокаторы киназы Raf (rafk), регулируемых митогенами или внеклеточными стимулами киназ (MEK) и регулируемых внеклеточными стимулами киназ (ERK); и блокаторы членов семейства протеинкиназы С, включая блокаторы PKC (альфа, бета, гамма, эпсилон, мю, лямбда, йота, зета), киназы семейства IkB (IKKa, IKKb), киназы семейства PKB, члены семейства киназы AKT и рецепторные киназы TGF-бета. Такие серин/треонинкиназы и их ингибиторы описаны в Yamamoto, Т., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P., Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60, 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226; патент США No. 6268391 и Martinez-Iacaci, L., et al., Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52.
Ингибиторы членов семейства фосфотидилинозитол-3-киназы, включая блокаторы PI3-киназы, ATM, ДНК-PK и Ku, также можно использовать по настоящему изобретению. Такие киназы обсуждают в Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 29 (7): 935-8 и Zhong, H. et al., Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545.
По настоящему изобретению можно использовать также ингибиторы передачи сигналов посредством миоинозитола, такие как блокаторы фосфолипазы С и аналоги миоинозитола. Такие ингибиторы передачи сигналов описаны в Powis, G., and Kozikowski A., (1994 New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, London).
Другую группу ингибиторов путей передачи сигнала представляют собой ингибиторы онкогена Ras. Такие ингибиторы включают ингибиторы фарнезилтрансферазы, геранил-геранилтрансферазы и протеазы СААХ так же, как антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы и иммунотерапевтические средства. Показано, что такие ингибиторы блокируют активацию ras в клетках, содержащих мутантный ras и ras дикого типа, таким образом действуя как антипролиферативные средства.
Ингибирование онкогена Ras обсуждают в Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4 292-8; Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99102; и Bennett, C.F. и Cowsert, L.M. BioChim. Biophys. Acta, (1999) 1489 (1):19-30.
Как упомянуто выше, антитела - антагонисты связывания лиганда рецепторной киназы могут также служить ингибиторами передачи сигнала. Эта группа ингибиторов пути передачи сигнала включает применение гуманизированных антител против внеклеточного лигандсвязывающего домена рецепторных тирозинкиназ. Например, специфическое для EGFR антитело Imclone С225 (см. Green, M.C. et al., Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4, 269-286); антитело против erbB2 Герцептин® (см. Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183); и специфическое для VEGFR2 антитело 2Св (см. Brekken, R.A. et al.,
- 33 036335
Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice,
Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124.
Ингибиторы связанных с ангиогенезом нерецепторных тирозинкиназ также могут находить применение по настоящему изобретению. Ингибиторы связанных с ангиогенезом VEGFR и TIE2 обсуждают выше в отношении ингибиторов передачи сигнала (оба рецептора являются рецепторными тирозинкиназами). Ангиогенез в общем связан с передачей сигнала erbB2/EGFR, поскольку показано, что ингибиторы erbB2 и EGFR ингибируют ангиогенез, в первую очередь экспрессию VEGF. Таким образом, имеет смысл комбинация ингибитора erbB2/EGFR с ингибитором ангиогенеза. Соответственно ингибиторы нерецепторных тирозинкиназ можно использовать в комбинации с ингибиторами EGFR/erbB2 по настоящему изобретению. Например, для антител против VEGF, которые не узнают VEGFR (рецепторную тирозинкиназу), но связываются с лигандом; низкомолекулярных ингибиторов интегрина (альфау beta3), которые могут ингибировать ангиогенез; эндостатина и ангиостатина (не-RTK), можно также доказать полезность применения в комбинации с описанными ингибиторами семейства erb (см. Bruns C.J. et al. (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935; Schreiber A.B., Winkler M.E., and Derynck R. (1986), Science, 232: 12501253; Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469).
Средства, применяемые в режимах иммунотерапии, также можно использовать в комбинации с соединениями формулы (I). Существует ряд иммунологических способов для получения иммунного ответа против erbB2 или EGFR. Эти способы в основном относятся к области вакцинации против опухолей. Эффективность иммунологических способов можно сильно увеличить посредством комбинированного ингибирования путей передачи сигнала erbB2/EGFR с использованием низкомолекулярного ингибитора. Обсуждение иммунологического способа/способа вакцинации против опухолей против erbB2/EGFR обнаружено в Reilly R.T. et al. (2000), Cancer Res. 60: 3569-3576 и Chen Y., Hu D., Eling D.J., Robbins J., and Kipps T.J. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971.
Средства, используемые в проапоптотических режимах (например, антисмысловые олигонуклеотиды против bcl-2), также можно использовать в комбинации по настоящему изобретению. Члены семейства белков Bcl-2 блокируют апоптоз. Повышающая регуляция bcl-2, таким образом, связана с устойчивостью к химическим средствам. Исследования показали, что эпидермальный фактор роста (EGF) стимулирует антиапоптотических членов семейства bcl-2 (т.е. mcl-1). Таким образом, для способов, разработанных для понижающей регуляции экспрессии bcl-2 в опухолях, показано клиническое преимущество, и они в настоящее время проходят исследования фазы II/III, а именно антисмысловой олигонуклеотид для bcl-2 G3139 от Genta. Такие проапоптотические способы с использованием способа антисмысловых олигонуклеотидов для bcl-2 обсуждают в Water J.S. et al. (2000), J. Clin. Oncol. 18: 1812-1823 и Kitada S. et al. (1994, Antisense Res. Dev. 4: 71-79).
Трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН®) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с рецептором HER2. Исходным показанием для него является положительный по HER2 рак молочной железы.
Трастузумаб эмтанзин (торговое наименование кадсила) представляет собой конъюгат антителолекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела трастузумаба (герцептина), связанного с цитотоксическим средством мертанзином (DM1). Трастузумаб отдельно останавливает рост клеток злокачественных опухолей посредством связывания с рецептором HER2/neu, в то время как мертанзин входит в клетки и разрушает их посредством связывания с тубулином. Поскольку моноклональное антитело нацелено на HER2, и HER2 сверхэкспрессирован только в клетках злокачественных опухолей, конъюгат доставляет токсин специфически к клеткам опухолей. Конъюгат кратко обозначают как TDM1.
Цетуксимаб (ЭРБИТУКС®) представляет собой химерное мышиное-человеческое антитело, ингибирующее рецептор эпидермального фактора роста (EGFR).
Пертузумаб (называемый также 2С4, торговое наименование Омнитарг) представляет собой моноклональное антитело, первое из его класса в линии средств, называемых ингибиторами димеризации HER. Посредством связывания с HER2, он ингибирует димеризацию HER2 с другими рецепторами HER, что по выдвинутой гипотезе приводит к замедлению роста опухолей. Пертузумаб описан в WO01/00245, опубликованной 4 января 2001 г.
Ритуксимаб представляет собой химерное моноклональное антитело, продаваемое как РИТУКСАН® и МАБТЕРА®. Ритуксимаб связывается с CD20 на В-клетках и вызывает апоптоз клеток. Ритуксимаб вводят внутривенно, и он одобрен для лечения ревматоидного артрита и В-клеточной неходжскинской лимфомы.
Офатумумаб представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, продаваемое как АРЗЕРРА®. Офатумумаб связывается с CD20 на В-клетках и его используют для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL; типа злокачественной опухоли лейкоцитов) у взрослых, невосприимчивых к лечению флударабином (флудара) и алемтузумабом (кампат).
Ингибиторы передачи сигналов клеточного цикла ингибируют молекулы, вовлеченные в контроль клеточного цикла. Семейство протеинкиназ, называемых циклинзависимыми киназами (CDK), и его вза
- 34 036335 имодействие с семейством белков, называемых циклинами, контролирует продвижение по эукариотическому клеточному циклу. Координация активации и инактивации различных комплексов циклин/CDK является необходимой для нормального продвижения по клеточному циклу. Несколько ингибиторов передачи сигналов клеточного цикла находятся в разработке. Например, примеры циклинзависимых киназ, включая CDK2, CDK4 и CDK6, и их ингибиторы, описаны, например, в Rosani et al., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10 (2):215-230.
В рамках изобретения иммуномодуляторы относятся к любому веществу, включая моноклональные антитела, которое действует на иммунную систему. Связывающие ICOS белки по настоящему изобретению можно рассматривать как иммуномодуляторы.
Иммуномодуляторы можно использовать в качестве антинеопластических средств для лечения злокачественных опухолей. Например, иммуномодуляторы включают, но без ограничения, антитела против CTLA-4, такие как ипилимумаб (ЕРВОЙ) и антитела против PD-1 (опдиво/ниволумаб и кейтруда/пембролизумаб). Другие иммуномодуляторы включают, но без ограничения, антитела против ОХ-40, антитела против PD-L1, антитела против LAG3, антитела против TIM-3, антитела против 41ВВ и антитела против GITR.
Ервой (ипилимумаб) представляет собой полностью человеческое антитело против CTLA-4, поставляемое на рынок Bristol Myers Squibb. Белковая структура ипилимумаба и способы его применения описаны в патентах США No. 6984720 и 7605238.
Опдиво/ниволумаб представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, поставляемое на рынок Bristol Myers Squibb, нацеленное против осуществляющего отрицательную иммунорегуляцию рецептора PD-1 поверхности клеток человека (белка-1 программируемой гибели или белка-1 программируемой гибели клеток/PCD-1), с иммуностимулирующей активностью. Ниволумаб связывается с PD-1 и блокирует активацию PD-1, трансмембранного белка суперсемейства Ig, посредством его лигандов PD-L1 и PD-L2, что приводит к активации Т-клеток и опосредованным клетками иммунным ответам против клеток опухолей или патогенов. Активированный PD-1 осуществляет отрицательную регуляцию активации Т-клеток и эффекторной функции посредством супрессии активации пути P13k/Akt. Другие наименования для ниволумаба включают BMS-936558, MDX-1106 и ONO-4538. Аминокислотная последовательность ниволумаба и способы его применения и получения описаны в патенте США No. US 8008449.
КЕЙТРУДА/пембролизумаб представляет собой антитело против PD-1, поставляемое на рынок Merck для лечения рака легкого, аминокислотная последовательность пембролизумаба и способы его применения описаны в патенте США No. 8168757.
CD134, известный также как ОХ40, является членом суперсемейства рецепторов TNFR, который конститутивно не экспрессируется на покоящихся наивных Т-клетках, в отличие от CD28. OX40 представляет собой вторичную костимулирующую молекулу, экспрессирующуюся через 24-72 ч после активации; его лиганд, OX40L, также не экспрессируется на покоящихся антигенпредставляющих клетках, но экспрессируется после их активации. Экспрессия OX40 зависит от полной активации Т-клеток; без CD28, экспрессия OX40 замедляется и происходит в четыре раза более низком уровне. Антитела против ОХ-40, слитые с ОХ-40 белки и способы их применения описаны в патентах США No US 7504101; US 7758852; US 7858765; US 7550140; US 7960515; WO2012027328; WO2013028231.
Антитела против PD-L1 (обозначенные также как CD274 или В7-Н1) и способы их применения описаны в патенте США No. 7943743; патенте США No. 8383796; US20130034559, WO2014055897, патенте США No. 8168179 и патенте США No. 7595048. Антитела против PD-L1 находятся в разработке как иммуномодулирующие средства для лечения злокачественных опухолей.
В рамках изобретения иммуностимулирующее средство относится к любому средству, которое может стимулировать иммунную систему. В рамках изобретения иммуностимулирующие средства включают, но без ограничения, адъюванты для вакцин.
Известно, что аминоалкилглюкозаминидфосфаты (AGP) можно использовать в качестве адъювантов для вакцин и иммуностимулирующих средств для стимуляции продукции цитокинов, активации макрофагов, стимуляции врожденного иммунного ответа, и усиления продукции антител у иммунизированных животных. Аминоалкилглюкозаминидфосфаты (AGP) являются синтетическими лигандами Tollподобного рецептора 4 (TLR4). AGP и их иммуномодулирующие эффекты посредством TLR4 описаны в патентных публикациях, таких как WO 2006/016997, WO 2001/090129, и/или в патенте США No. 6113918 и опубликованы в литературу. Дополнительные производные AGP описаны в патенте США No. 7129219, патенте США No. 6525028 и патенте США No 6911434. Конкретные AGP действуют как агонисты TLR4, в то время как другие известны как антагонисты TLR4.
- 35 036335
Соединения аминоалкилглюкозаминидфосфата, применяемые по настоящему изобретению, обладают структурой, указанной в следующей формуле 1:
О—R
Х ί (Формула 1) где m составляет от 0 до 6;
n составляет от 0 до 4;
X представляет собой О или S, предпочтительно О;
Y представляет собой О или NH;
Z представляет собой О или Н;
каждый из R1, R2, R3 независимо выбран из группы, состоящей из С1_20 ацила и С1_20 алкила;
R4 представляет собой Н или Me;
R5 независимо выбран из группы, состоящей из -Н, -ОН, -(С1-С4) алкокси, -PO3R8R9, -OPO3R8R9, -SO3R8, -OSO3R8, -NR8R9, -SRe, -CN, -NO2, -CHO, -CO2R8 и -CONR8R9, где каждый из R8 и R9 независимо выбран из Н и (C1-C4) алкила; и каждый из R6 и R7 независимо представляет собой Н или РО3Н2.
В формуле 1 конфигурация 3'-стереогенных центров, к которым в норме присоединены остатки жирного ацила (то есть остатки вторичного ацилокси или алкокси, например R1O, R2O и R3O), представляет собой R или S, предпочтительно R (как обозначено по правилам старшинства Кана-ИнгольдаПрелога). Конфигурация агликоновых стереогенных центров, к которым присоединены R4 и R5, может представлять собой R или S. Все стереоизомеры, как энантиомеры, так и диастереомеры и их смеси, считают входящими в объем настоящего изобретения.
Количество атомов углерода между гетероатомом X и агликоновым атомом азота определяют по меняющемуся n, который может представлять собой целое число от 0 до 4, предпочтительно собой целое число от 0 до 2.
Длина цепи нормальных жирных кислот R1, R2 и R3 может составлять от приблизительно 6 до приблизительно 16 атомов углерода, предпочтительно от приблизительно 9 до приблизительно 14 атомов углерода. Длина цепей может являться одинаковой или различной. Некоторые предпочтительные варианты осуществления включают длину цепей, где R1, R2 и R3 составляют 6 или 10 или 12 или 14.
Формула 1 включает L/D-сериловые, -треониловые, цистеиниловые эфирные и сложноэфирные липидные AGP, как агонисты, так и антагонисты, и их гомологи (n=1-4), так же как различные биоизостеры карбоновой кислоты (т.е. R5 представляет собой кислую группу, способную формировать соль; фосфат может находиться либо в 4-, либо в 6-положении глюкозаминового звена, но предпочтительно находится в 4-положении).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения с использованием соединения AGP формулы 1 n составляет 0, R5 представляет собой СО2Н, R6 представляет собой РО3Н2 и R7 представляет собой Н. Это предпочтительное соединение AGP указано как структура в следующей формуле 1а:
(Формула 1а) где X представляет собой О или S;
Y представляет собой О или NH;
Z представляет собой О или Н;
каждый из R1, R2, R3 независимо выбран из группы, состоящей из С1-20 ацила и С1-20 алкила; и
R4 представляет собой Н или метил.
В формуле 1а конфигурация 3'-стереогенных центров, к которым в норме присоединены остатки
- 36 036335 жирного ацила (то есть остатки вторичного ацилокси или алкокси, например R1O, R2O, и R3O), представляет собой R или S, предпочтительно R (как обозначено по правилам старшинства Кана-ИнгольдаПрелога). Конфигурация агликоновых стереогенных центров, к которым присоединены R4 и СО2Н, может представлять собой R или S. Все стереоизомеры, как энантиомеры, так и диастереомеры и их смеси, считают входящими в объем настоящего изобретения.
Формула 1а включает L/D-сериловые, -треониловые, цистеиниловые эфирные или сложноэфирные липидные AGP, как агонисты, так и антагонисты.
В формуле 1 и формуле 1a Z представляет собой О, присоединенный посредством двойной связи, или два атома водорода, каждый из которых присоединен посредством одинарной связи. То есть соединение обладает сложноэфирной связью, когда Z=Y=O; амидной связью, когда Z=O и Y=NH; и эфирной связью, когда Z=H/H и Y=0.
Особенно предпочтительные соединения формулы 1 обозначены как CRX-601 и CRX-527. Их структуры указаны следующим образом:
Кроме того, в другом предпочтительном варианте осуществления применяют CRX 547, обладающие показанной структурой.
- 37 036335
Другие варианты осуществления включают такие AGP, как CRX 602 или CRX 526, обеспечивающие увеличенную стабильность AGP, обладающих более короткими цепями вторичного ацила или алкила.
В одном варианте осуществления представлены способы лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, включающие в себя введение такому млекопитающему терапевтически эффективного количества:
связывающего ICOS белка по настоящему изобретению и
b) по меньшей мере одного антинеопластического средства.
В одном варианте осуществления представлены способы лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, включающие в себя: введение такому млекопитающему терапевтически эффективного количества:
связывающего ICOS белка по настоящему изобретению и
b) по меньшей мере одного второго иммуномодулирующего средства.
В одном варианте осуществления указанное второе иммуномодулирующее средство выбрано из группы из антитела против CTLA4, антитела против PD-1, антитела против PD-L1, антитела против OX40, антитела против GITR и антитела против 41ВВ, антитела против LAG3 и антитела против TIM3.
В одном варианте осуществления представлены способы лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, включающие в себя введение такому млекопитающему терапевтически эффективного количества:
связывающего ICOS белка по настоящему изобретению и
b) по меньшей мере одного иммуностимулирующего средства.
В одном варианте осуществления иммуностимулирующее средство представляет собой агонист TLR4. В одном варианте осуществления иммуностимулирующее средство представляет собой AGP. В одном аспекте иммуностимулирующее средство представляет собой соединение формулы I. В одном аспекте оно представляет собой соединение формулы 1а. В одном аспекте иммуностимулирующее средство выбрано из группы, состоящей из CRX-601, CRX-547, CRX-602, CRX-527 и CRX-526.
Примеры
Следующие примеры иллюстрируют различные неограничивающие аспекты этого изобретения.
Пример 1. Экспрессия ICOS в злокачественных опухолях.
Как правило, солидные опухоли, по-видимому, обладают низкими уровнями инфильтрующих ICOS+ Т-клеток, что согласуется с теорией, что ICOS опосредует противоопухолевые иммунные ответы.
- 38 036335
Разработаны анализы экспрессии ICOS для различных видов гистологии опухолей с использованием публично доступных наборов данных экспрессии мРНК из The Cancer Genome Atlas (TCGA) и других баз данных. В табл. 3 показан относительный процент опухолей для каждого вида гистологии, для которых показан некоторый поддающийся детекции уровень экспрессии мРНК ICOS. Этот анализ идентифицирует виды гистологии опухолей, как известно, чувствительных к другим способам иммунотерапии злокачественных опухолей (меланома, RCC, NSCLC), как обладающие относительно высоким процентом опухолей (>10%), обладающим поддающимся детекции количеством ICOS+ инфильтрующих опухоль лимфоцитов (TIL), в то время как типы опухолей, как известно, слабо иммуногенные (опухоли предстательной железы, яичников и поджелудочной железы), обладают относительно более низким процентом опухолей, обладающих ICOS+ TIL (<10%) (табл. 3). Интересно, что типы опухолей, как известно, ассоциированные с вирусной инфекцией и/или хроническим воспалением (опухоли головы и шеи, желудка, пищевода и шейки матки), находились среди типов опухолей, для которых показан наивысший процент ICOS+ TIL. Что является неясным из этих анализов экспрессии мРНК, это субпопуляция TIL, которая экспрессирует ICOS в каждом соответствующем типе опухолей. В некоторых случаях ICOS может предпочтительно экспрессироваться на инфильтрующих опухоль Трег, в то время как в других случаях он может указывать на уровень инфильтрации ICOS+ эффекторных Т-клеток.
Таблица 3
Экспрессия мРНК ICOS в различных типах опухолей
Тип опухоли Суммарное N ICOS+(N) ICOS+ (процент)
головы и шеи 426 157 36, 9%
желудка 285 75 26, 3%
пищевода 70 17 24,3%
меланома (М) 295 69 23, 4%
NSCLC(AD) 501 112 22,4%
NSCLC(SCC) 489 85 17,4%
шейки матки 185 32 17,3%
молочной железы 1048 162 15,5%
мочевого пузыря 244 35 14,3%
RCC 522 64 12,3%
меланома (Р) 82 7 8,5%
поджелудочной железы 85 7 8,2%
ТОЛСТОЙ кишки 446 34 7, 6%
щитовидной железы 498 34 6, 8%
нес 191 11 5,8%
саркома 103 4 3, 9%
яичников 412 13 3,2%
предстательной железы 336 10 3, 0%
эндометриальная 532 15 2,8%
прямой кишки 163 4 2,5%
GBM 156 0 0, 0%
Анализ экспрессии ICOS посредством иммуногистохимии (IHC) при первичной немелкоклеточной карциноме легких (NSCLC) человека, трижды отрицательном раке молочной железы (TNBC), колоректальном раке (CRC), раке предстательной железы, поджелудочной железы, яичников, почечноклеточном раке (RCC) и меланоме проводили для лучшего понимания того, какие подгруппы TIL ассоциированы с экспрессией ICOS в различных типах опухолей (табл. 4). Подобно тому, что наблюдали в анализе экспрессии мРНК, количество ICOS+ TIL являлось относительно низким, даже в индивидуальных опухолях, где в ином случае присутствовало большое количество CD4+, CD8+ и/или FoxP3+ TIL. И снова, гистологические образцы меланомы, почечноклеточного рака (RCC) и немелкоклеточной карциномы легких (NSCLC) обладали наивысшим процентом опухолей с некоторым поддающимся детекции уровнем ICOS+ инфильтрата (табл. 4, столбец 2). И наоборот, для опухолей предстательной железы, яичников и поджелудочной железы почти не показано ICOS+ TIL (табл. 4). Эти анализ ясно показывают, что солидные опухоли обладают низкими исходными уровнями ICOS+ TIL, и можно получать преимущество от размножения и функциональной индукции этой популяции клеток. Дальнейшие исследования с исполь- 39 036335 зованием проточной цитометрии и двухцветной иммуногистохимии для анализа первичных опухолей человека могут помочь определить, какие подгруппы специфических Т-клеток экспрессируют ICOS.
Таблица 4
Объект Количество образцов ICOS Среднее количество положительных клеток (диапазон)
ICOS CD3 CD4 CD8 FOXp3
NSCLC (плоскоклеточ ная) п=17 - 0 11 (0-74) 2 (0-9) 20 (0-147) 10 (0-28)
п=23 + 3 (0-25) 38 (2-143) 8 (0-26) 39 (5-188) 18 (0-75)
NSCLC (аденокарцино ма) п=15 - 0 36 (0-157) 4 (0-20) 71 (5-238) 10 (1-41)
п=25 + 2 (0-7) 56 (0-181) 6 (0-39) 69 (10-201) 19 (0-55)
TNBC п=24 - 0 14 (0-91) 9 (0-132) 17 (0-95) 6 (0-25)
п=11 + 5 (0-20) 85 (3-259) 13 (0-45) 113 (2-393) 30 (2-81)
CRC п=22 - 0 12 (0-47) 14 (0-44) 20 (0-83) 14 (2-52)
п=23 + 2 (0-13) 31 (5-101) 22 (5-48) 53 (4-151) 24 (5-43)
Рак предстательно й железы п=29 - 0 10 (0-78) 17 (1-96) 23 (1-176) 5 (0-25)
п=1 + 1 30 48 55 11
Рак поджелудочной железы п=11 - 0 15 (1-32) 17 (3-71) 20 (3-81) 6 (0-21)
п=4 + 0 (0-1) 31 (7-85) 17 (6-31) 17 (2-51) 4 (0-9)
Рак яичников п=15 - 0 13 (0-105) 14 (1-78) 13 (0-83) 2 (0-12)
п=5 + 1 (0-3) 19 (6-35) 13 (6-19) 32 (10-76) 7 (4-13)
RCC п=3 - 0 50 (14-104) 58 (38-85) 56 (24-119) 4 (0-9)
п=7 + 5 (1-16) 45 (10-130) 65 (26-164) 71 (12-232) 15 (3-28)
Меланома п=7 - 0 42 (1-155) 12 (1-31) 35 (0-156) 5 (0-10)
п=12 + 7 (0-21) 84 (13-222) 32 (13-70) 89 (28-179) 19 (6-40)
Пример 2. Скрининг агонистических антител против ICOS.
Выделение первичных РВМС человека.
Свежую кровь получали от доноров крови и разводили 1:1 не содержащей фенола красного 10% средой RPMI1640. Среды с градиентом плотности в 50 мл конической пробирке Uni-Sep Max и центрифугировали при 400xg в течение 20 мин при комнатной температуре с отключенным тормозом. Полученный слой белых мононуклеарных клеток (лейкоцитарную пленку) осторожно переносили в новую 50мл коническую пробирку через клеточное сито 100 мкм. Равный объем не содержащей фенола красного 10% среды RPMI1640 добавляли к лейкоцитарной пленке и центрифугировали при 300 xg в течение 10 мин при комнатной температуре. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл раствора для лизиса эритроцитов (Sigma Aldrich) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Клетки промывали один раз средой и центрифугировали, как описано ранее. Объем доводили до 40 мл с использованием не содержащей фенола красного 10% среды RPMI1640, и клетки подсчитывали с использованием счетчика клеток и анализатора жизнеспособности Vicell (Beckman Coulter).
Выделение первичных CD4+CD25- эффекторных Т-клеток человека.
Клетки CD4+CD25 человека дополнительно очищали из РВМС посредством двухстадийного способа выделения на основе магнитных бусин с использованием набора для выделения CD4+CD25+ регуляторных Т-клеток человека (Miltenyi Biotec). Сначала клетки РВМС инкубировали с со смесью биотинаантитела при 4°С в течение 5 мин и затем инкубировали с микробусинами против биотина в течение 10 мин. Эту стадию проводили для мечения не относящихся к CD4+ Т-клеток. Затем клетки пропускали через колонку LD в магнитном поле сепаратора MidiMACS. Эффлюент, представляющий собой немеченную предварительнно обогащенную фракцию CD4+ клеток, собирали и инкубировали с бусинами CD25 MicroBeads при 4°С в течение 15 мин. Меченые клетки пропускали через колонку MS в магнитном поле сепаратора MiniMACS. Проскок, содержащий немеченные CD4-CD25- эффекторные Т-клетки, собирали для анализов нижестоящей активации.
- 40 036335
Выделение первичных CD4+ Т-клеток человека непосредственно из крови.
CD4+ Т-клетки человека выделяли непосредственно из свежей крови человека с использованием смеси для обогащения CD4+ Т-клеток человека (Stem Cell Technologies). Смесь для обогащения CD4+ Тклеток человека RosetteSep (50 мкл/мл) добавляли к цельной крови и хорошо перемешивали. После 20 мин инкубации при комнатной температуре, равный объем PBS+2% FBS добавляли с осторожным перемешиванием. Разведенный образец наслаивали поверх среды с градиентом плотности и центрифугировали в течение 20 мин при 1200xg при комнатной температуре с отключенным тормозом. Обогащенные клетки с границы раздела среда с градиентом плотности: плазма осторожно переливали в новую коническую пробирку. Затем эритроциты лизировали с использованием буфера для лизиса эритроцитов (Sigma Aldrich), и обогащенные клетки промывали с использованием PBS+2% FBS дважды. CD4+ Т-клетки ресуспендировали в 40 мл PBS+2% FBS и подсчитывали в счетчике клеток Vi-Cell.
Экспериментальные способы.
Анализ активации in vitro CD4+CD25- эффекторных Т-клеток человека - анализ в связанном формате.
Не обработанные для культивирования клеток 96-луночные плоскодонные планшеты покрывали с использованием 100 мкл/лунку буфера для покрытия (Biolegend), содержащего 1 мкг/мл антитела против CD3 человека (eBioscience) и различные тестируемые антитела, в течение ночи. На следующие сутки, предварительно покрытые планшеты промывали три раза содержащей 10% FBS средой RPMI-1640. CD4+CD25- эффекторные Т-клетки человека выделяли и метили с использованием CFSE, как описано, и рассевали в планшеты. После инкубации при 37°С в течение 2,5 суток, клетки собирали и анализировали посредством проточной цитометрии по экспрессии маркеров пролиферации и активации. Супернатанты культур клеток также собирали для мультиплексного измерения цитокинов посредством Meso Scale Discovery (MSD).
Анализ пролиферации CFSE.
Клетки, подлежащие мечению, ресуспендировали в 1 мл предварительно нагретого PBS при конечной концентрации вплоть до 1Е7 клеток/мл в 15 мл конической пробирке. Один микролитр 2 мМ исходного раствора CFSE (Life Technologies) добавляли непосредственно к клеткам с последующим немедленным перемешиванием на встряхивателе для обеспечения равномерного мечения. После инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин, окрашивание останавливали добавлением 14 мл ледяной среды для культивирования клеток. Меченые клетки промывали три раза ледяной средой. Клетки подсчитывали и доводили до 4E6 клеток/мл в RPMI1640+10% FBS, дополненной 100 МЕ/мл IL-2 (PeproTech) и рассевали в планшеты, покрытые антителами против CD3 и тестируемыми антителами. После активации Тклеток клетки собирали и промывали PBS+0,5% BSA один раз до перехода к стадии многоцветного окрашивания для анализа проточной цитометрии.
Многоцветная проточная цитометрия.
Активированные Т-клетки собирали и промывали PBS. Клетки сначала окрашивали с использованием чувствительного к жизнеспособности клеток фиксируемого красителя дальнего красного спектра LIVE/DEAD (Life Technologies), в соответствии с протоколом поставщика. После отмывки красителя антитела для детекции, конъюгированные с различными красителями, инкубировали с клетками при 4°С в течение 30 мин. Окрашенные клетки промывали один раз ледяным буфером для окрашивания FACS (PBS+0,5% BSA) перед обработкой на проточном цитометре FACS Canto или FACS Canto II. Рабочие характеристики цитометра проверяли ежесуточно с использованием бусин для установки и проверки цитометра (BD Biosciences), и масштабирование напряжения РМТ и площади проводили на основании неокрашенных клеток. Компенсацию выполняли с использованием бусин OneComp или UltraComp (eBioscience), индивидуально окрашенных с использованием антител для детекции, конъюгированных с флуорохромом.
Анализ цитокинов MSD.
Уровень цитокинов IFN-γ, IL-10, IL-2 и TNF-α в супернатанте культуры клеток определяли с использованием изготовленного на заказ набора MSD human V-Plex. Образцы сначала разводили 1:200 в разбавителе 2. Калибратор также подготавливали в разбавителе 2 в соответствии с инструкцией к набору. Разведенные образцы и калибраторы добавляли в черный планшет MSD, который затем герметично закрывали клейкой пленкой для планшетов и инкубировали при комнатной температуре с встряхиванием в течение 2 ч. После добавления 25 мкл раствора антитела для детекции, свежеприготовленного в разбавителе 2, в каждую лунку, планшет снова герметично закрывали и инкубировали при комнатной температуре с встряхиванием в течение следующих 2 ч. Планшеты промывали 3 раза с использованием 150 мкл/лунку PBS плюс 0,05% Tween-20 перед добавлением 150 мкл/лунку свежеразведенного 2х буфера для считывания, и немедленно считывали на считывателе MESO QuickPlex. Данные анализировали с использованием программного обеспечения MSD Workbench.
Анализ активации CD4+ Т-клеток человека in vitro - в связанном и растворимом формате.
Свежевыделенные CD4+ Т-клетки человека подвергали предварительной стимуляции в 24луночных планшетах с использованием антител против CD3 (1 мкг/мл) и антител против CD28 (3
- 41 036335 мкг/мл) в течение 48 ч. Клетки собирали, промывали и смешивали с DynaBeads против CD3 (Life Technologies) в соотношении 1:1 в среде AIM-V, дополненной 100 МЕ/мл IL-2 (PeproTech). Затем смесь клеток/бусин рассевали при 100000 на лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты, либо без покрытия (для растворимого формата), либо с покрытием H2L5 hIgG4PE (для связанного формата). Для растворимого формата H2L5 hIgG4PE добавляли в лунки на время рассева клеток. После инкубации при 37°С в течение 3,5 суток супернатанты культур клеток собирали для мультиплексного измерения цитокинов посредством MSD.
Анализ in vitro активации РВМС человека в растворе.
Свежевыделенные РВМС человека подвергали предварительной стимуляции в 24-луночных планшетах, покрытых антителами против CD3 (1 мкг/мл) и антителами против CD28 (5 мкг/мл) в течение 48 ч. Окрашенные CFSE клетки получали и смешивали с DynaBeads против CD3 (Life Technologies) в соотношении 1:1 в среде AIM-V, дополненной 100 МЕ/мл IL-2 (PeproTech). Затем смесь клеток/бусин рассевали при 200000 на лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты, предварительно покрытые 1 мкг/мл антитела против CD3. H2L5 hIgG4PE и контрольное антитело добавляли непосредственно в лунки в их растворимой форме. После инкубации при 37°С в течение 3,5 суток супернатанты культур клеток собирали для мультиплексного измерения цитокинов посредством MSD, и клетки собирали для анализа пролиферации и экспрессии маркеров посредством проточной цитометрии.
Анализ данных.
Анализ данных проточной цитометрии.
Данные проточной цитометрии анализировали посредством программного обеспечения FlowJo (FlowJo LLC). Сначала мертвые клетки отбирали на основании окрашивания чувствительным к жизнеспособности клеток красителем LIVE/DEAD. Дублеты отсекали на диаграмме рассеяния FSC-H: FSC-W. Полученные в результате живые отдельные клетки анализировали по экспрессии маркеров активации в различных субпопуляциях Т-клеток, таких как CD4+ или CD8+ Т-клетки, и выражали как процент от исходной популяции или медианную интенсивность флуоресценции (MFI).
Анализ пролиферации CFSE.
Данные CFSE анализировали также посредством Flowjo. После исключения мертвых клеток и дублетов, окно пролиферировавших клеток определяли на основании неактивированных Т-клеток. Любые клетки, попавшие в это окно в любом данном образце, считали пролиферировавшими клетками. Данные регистрировали как процент пролиферации.
Анализ истощения клеток посредством FACS.
Истощение клеток анализировали посредством FlowJo. Сначала окно для живых клеток определяли на основании окрашивания чувствительным к жизнеспособности клеток красителем LIVE/DEAD. Затем дублеты отсекали, как описано ранее. Проценты субпопуляций живых CD4+ или CD8+ Т-клеток рассчитывали в качестве показателя истощения клеток.
Анализ подбора кривой ответа в зависимости от дозы антител
Данные ответа в зависимости от дозы импортировали в программное обеспечение GraphPad Prism и трансформировали в логарифмической шкале. Ответ в зависимости от дозы агониста в моделях с различным углом наклона кривой использовали для подбора кривой, соответствующей данным, и получения значений ЕС50. Формула подбора приведена ниже
У=нижнее+(верхнее-нижнее)/(1 + 1074 ((LogEC50-X)*угол наклона))
Результаты
Идентификация наилучших мышиных антител против ICOS человека.
Проводили скрининг четырнадцати мышиных mAb по связыванию ICOS человека и яванского макака и агонистической активности. Двенадцать было возможно переклонировать, секвенировать, вырастить и очистить в достаточных количествах для функциональных исследований. Все тестировали по характеристикам связывания с использованием BIAcore. Обнаружили, что два связывались очень слабо/не связывались. Десять очищенных mAb тестировали посредством функционального анализа агонизма. Четыре наилучших агониста mAb (обозначенные как 422.2, 279.1, 314.8 и 88.2 в табл. 5 ниже), на основании их способности индуцировать пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокина IFN-γ у множества здоровых доноров-людей, отбирали и получали в форме химер с человеческими IgG1. Последовательности CDR для 314.8, 88.2, 92.17, 145.1 и 53.3 показаны вместе с другими mAb против ICOS в РСТ/ЕР2012/055735 (WO 2012/131004).
Вариабельная область тяжелой цепи для клона 88.2 представлена ниже как SEQ ID NO:13
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTN
YNQMFKDKATLTVDKSSNTAYMQLTSPTSEDSAVYYCTRWNLSYYFDNNYYLDYWGQGTTLTVS
S (SEQ ID NO:13)
Вариабельная область легкой цепи для клона 88.2 представлена ниже как SEQ ID NO:14
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPG
VPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYNNHLVFGGGTKLTVL (SEQ ID
NO:14)
- 42 036335
Таблица 5
Связывание и конкуренция mAb против ICOS
Клон # mAb против ICOS Biacore ДЛЯ человека (нМ) Biacore ДЛЯ яванског о макака (нМ) Реакционное пособные по отношению к CD28/CTLA4 Ингибирова ние связывания ICOS-L Конкуренция против 314.8 Конкуренци я против 121.4
53.3 30.4 19.7 - ++ + +
88.2 31 23 - + + +
92.17 27.5 18.8 - ++ + +
145.1 49.5 43.5 - ++ + +
314.8 17 9.3 - +++ + +
121.4 15 58 - - -/+ -/ +
202.24 46 19 - + + +
279.1 39 33 - + + +
293.1 7.6 10 - ++ + +
422.2 5.7 4.46 - ++ ++ +
Восемь из лучших связывающих ICOS клонов тестировали по продукции IFN-γ и пролиферации Тклеток с использованием анализа на основе клеток в дизайне повышения дозы по сравнению с контрольными мышиными IgG1 и EPR7114. На основании этих анализов, клон, обозначенный 422.2, выбран для гуманизации; см. фиг. 1 и 2.
Пример 3. Гуманизация антител.
Экспериментальный способ(ы).
Выделение вариабельных генов антитела из мРНК и получение химерного антитела с Fc дикого типа.
Тотальную РНК очищали из осадка клеток гибридомы 422.2, подвергали обратной транскрипции для получения кДНК, из которой продукты вариабельных генов, приблизительно 400 п.о., выделяли посредством ПЦР и очищали посредством электрофореза в агарозном геле.
Очищенные фрагменты вариабельной области клонировали в векторы рТТ5, содержащие либо константную область IgG1 человека, либо константную область каппа человека, и трансформировали ими компетентные клетки DH5a. Колонии отбирали и использовали для инокуляции L-среды, содержащей ампициллин. Плазмидную ДНК выделяли из культур с использованием набора для выделения в минимасштабе QuickLyse. Гены вариабельной тяжелой и легкой цепей секвенировали, и данные о последовательности выравнивали способами информатики для идентификации последовательностей генов вариабельной тяжелой и легкой цепей.
Клонирование химерных антител 422.2 с оптимизацией кодонного состава.
Зрелые белковые последовательности мышиной вариабельной области подвергали обратной трансляции в ДНК, затем оптимизации кодонного состава. Затем последовательности VH и VL модифицировали для включения предпочтительной пять-штрих-нетранслируемой области и предпочтительных участков для клонирования с любого конца. Адаптированную последовательность VH конструировали de novo с использованием способа на основе ПЦР, и затем перекрывающиеся олигонуклеотиды прививали в IgG1 человека с Fc дикого типа или в hIgG1 с инактивированным Fc (L235A, G237A), или в hIgG4 со стабилизированной шарнирной областью (S228P, L235E) (IgG4PE), присутствующие в векторах рТТ. Адаптированную последовательность VL конструировали de novo с использованием способа на основе ПЦР, и затем перекрывающиеся олигонуклеотиды прививали в kappa константную область каппа, присутствующую в векторе рТТ5.
Полученные плазмиды рТТ использовали для трансфекций НЕК для получения химерных антител.
Гуманизация вариабельных доменов 422.2.
Матрицы вариабельных (V) генов выбирали для гуманизации 422.2 посредством поиска в подходящих базах данных собственной разработки для зародышевой тяжелой и легкой цепей с использованием V областей 422.2 с замаскированными CDR с использованием BLASTP. IGHV1-69 и IGKV3-11 выбрали из наилучших совпадений в BLASTP в качестве матриц каркасной области V гена для гуманизации 422.2. Человеческие зародышевые соединительные (J) гены IGHJ6 и IGKJ2 выбраны для гуманизации 422.2.
Различия остатков между человеческих зародышевыми генами и последовательности 422.2 идентифицировали, чтобы способствовать выбору обратных мутаций (мутаций, введенных для изменения специфического остатка человеческой каркасной области на мышиный остаток). Шесть гуманизированных вариантов VH и шесть гуманизированных вариантов VL разработали, подвергли оптимизации кодонного состава и затем модифицировали для включения предпочтительных 5'- и 3'-удлинений. Адаптированные последовательности вариабельной области конструировали de novo с использованием способа на основе ПЦР, и затем перекрывающиеся олигонуклеотиды соответственно клонировали в векторы рТТ.
Полученные плазмиды рТТ использовали в трансфекциях НЕК для получения гуманизированных антител. Клетки HEK2936E в суспензии подсчитывали и разводили до 1,5х106 клеток/мл - 2х106 клеток/мл с использованием среды для экспрессии 293 Freestyle, дополненной 0,05% генетицином, и для некоторых экспериментов, дополненной 1% плюроником F68. ДНК и реагент для трансфекции (Gemini или 293-Fectin) добавляли к OptiMEM и осторожно гомогенизировали перед инкубацией в течение 20-30
- 43 036335 мин при комнатной температуре. Затем ДНК-липидные комплексы объединяли с суспензиями клеток, и трансфицированные клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2, 125 об/мин. Для некоторых трансфекций питательную среду с триптоном (среду для экспрессии 293 Freestyle, дополненную 1% плюроником F68 и 20% мас./об. казеинового триптона) добавляли в среду для трансфекции через 24-48 ч после трансфекции. Суспензии трансфицированных клеток инкубировали в течение 5-8 суток, пока количество жизнеспособных клеток не падало ниже 60%, затем центрифугировали (в зависимости от конструкции). Супернатанты собирали и фильтровали.
Антитела очищали посредством пропускания супернатантов через 1 мл колонку HiTrap HP с белком А для обеспечения связывания антитела, промывки колонки посредством 10 мл PBS и элюции с использованием 5 мл IgG Elute (Pierce, 21009). Очищенный белок подвергали обмену буфера на PBS с использованием фильтрующих центрифугируемых единиц Millipore Centricon® (отсечение 30000) и оценивали количественно на спектрофотометре Nandrop.
Результаты
Сконструированные экспрессирующие плазмиды.
Последовательности вариабельного гена мышиного антитела из клона гибридомы 422.2 успешно выделяли, и последовательности показаны ниже как SEQ ID NO: 19 и 20 соответственно так же, как на фиг. 8.
422 НС
QVQLQQSGPELVRPGESVKISCMGSGYTFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGLISIYSDHTN
YNQKFQGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCGRNNYGNYGWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:19)
422 LC
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSITSPKLWIYDTSKLASGVPG
RFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:20)
Клонирование выделенных вариабельных областей в избранные векторы рТТ5 привело в результате к получению плазмид, кодирующих последовательность химерной легкой цепи 422.2 и последовательности химерной тяжелой цепи в hIgG1 с Fc дикого типа, hIgG1 с инактивированным Fc (L235A/G237A, нумерация по EU) или в hIgG4 PE (S228P/L235E, нумерация EU). Химерные антитела использовали для подтверждения функциональности клонированных мышиных областей V и для идентификации наиболее пригодного изотипа.
Конструирование экспрессирующих плазмид рТТ для млекопитающих, кодирующих тяжелые и легкие цепи различных гуманизированных вариантов 422.2, проведено успешно.
Экспрессия, очистка и идентификация H2L5 hIgG4PE.
Последовательности зрелого белка H2L5 hIgG4PE включены в фиг. 9 с дополнительными обозначениями. Последовательности ДНК кодирующих областей тяжелых и легких цепей H2L5 hIgG4PE включены в фиг. 10 и 11.
Пример 4. Функциональный анализ H2L5.
Связывание рецептора Fc.
Гуманизированное антитело H2L5 модифицировали от изотипа IgG1 человека до модифицированного изотипа IgG4 человека, включающего мутации S228P, L235E (нумерация EU) для предотвращения обмена антигенсвязывающими фрагментами (Fab). IgG4PE человека выбран вместо IgG1 человека, поскольку он уменьшает связывание mAb с активирующими рецепторами Fcy и C1q, таким образом, уменьшая потенциал mAb индуцировать истощение положительных по ICOS клеток посредством антителозависимой цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, IgG4PE человека (S228P, L235E) сохраняет связывание с FcYRIIb (ингибирующим рецептором Fcy).
Взаимодействие с FcYRIIb может быть критическим для агонистической активности антител против ICOS посредством обеспечения перекрестного связывания антител. Показано, что взаимодействие с FcYRIIb является критическим для агонистической активности других иммуномодулирующих антител, нацеленных на рецепторы семейства TNF-α, так же, как на CD28 (Bartholomaeus P. et al., Cell contactdependent priming and Fc interaction with CD32+ immune cells contribute to the TGN1412-triggered cytokine response. J. Immunol., 192(5); 2091-8 (2014)).
Кроме того, показано, что IgG4PE человека уменьшает связывание mAb с активирующими рецепторами FcY (FcYRI, FcYRIIa и FcYRIIIa) и C1q, таким образом уменьшая потенциал mAb индуцировать истощение положительных по ICOS клеток посредством антителозависимой цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, IgG4PE (S228P, L235E) человека сохраняет связывание с FcYRIIb (ингибирующим рецептором FcY) (табл. 6).
В табл. 6 ниже показана репрезентативная аффинность связывания с рецепторами FcY человека наилучшего H2L5 в форме антитела либо hIgG1, либо hIgG4PE.
Таблица 6 Репрезентативная аффинность наилучшего гуманизированного антитела
- 44 036335 против ICOS, в форме либо hIgGI, либо hIgG4PE, для рецепторов Fcy человека
Антитела FcyR I FcyR Ila H131 FcyR Ila R131 FcyR IIb FcyR Illa V158 FcyR Illa F158
KD (нМ) KD (нМ) KD (нМ) KD (нМ) KD (нМ) KD (нМ)
422 H2L5 IgGl WT 60,8 405 662 1340 281 862
422 H2L5 h!gG4PE (H2L5 IgG4PE) 645 NB 2500 1470 NB NB
КВ=отсутствие связывания.
Экспериментальный способ.
Функциональная оценка гуманизированных вариантов 422.2.
Для гуманизации четырех кандидатов на агонистические антитела против ICOS, получали мышиные-человеческие химеры, представляющие собой слитые белки из мышиной области V и части Fc IgG1 человека. Эти четыре химерных антитела тестировали в анализе активации суммарных РВМС человека в связанной с планшетом форме. Для химеры 422.2 против ICOS показана наилучшая агонистическая активность в анализе активации связанных РВМС. По объединенным данным связывания и биофизическим свойствам клон 422.2 выбрали для гуманизации. Четыре гуманизированных варианта 422.2 выбрали на основании связывания с ICOS и биофизических характеристик (422.2 H2L0, H2L5, H5L0 и H5L5) и тестировали в анализах активации связанных РВМС. Для варианта H2L5 показали сравнимую или лучшую активацию Т-клеток, как измерено по продукции цитокинов, относительно других вариантов (фиг. 3).
Вариабельная область тяжелой цепи (VH) и зрелая тяжелая цепь для варианта Н5 представлены ниже как SEQ ID NO:15 и 16 соответственно.
H5 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWIGLISIYSDHTN YNQKFQGRATMTVDKS TS TAYMELS SLRSEDTAVYYCGRNNYGNYGWYFDVWGQGT TVTVS S (SEQ ID NO:15) Зрелая тяжелая цепь Н5
OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYAMHWVROAPGOGLEWIGLISIYSDHTN YNQKFOGRATMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRNNYGNYGWYFDVWGOGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:16)
Вариабельная область легкой цепи (VL) и зрелая легкая цепь для варианта L0 представлены ниже как SEQ ID NO:17 и 18 соответственно.
L0 Vl
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPA
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSGYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:17)
Зрелая легкая цепь L0
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPA
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSGYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:18)
Выбор IqG4[PE] в качестве изотипа.
Затем 422 H2L5 IgG1 тестировали в различных анализах активации суммарных РВМС в растворимой форме. Этот растворимый формат, по-видимому, более соответствует состоянию in vivo, поскольку в анализах суммарных РВМС лимфоциты, моноциты и другие иммуноциты содержатся в одной и той же лунке. Однако для 422 H2L5 IgG1 mAb постоянно показывали уменьшенную жизнеспособность популяций Т-клеток, напоминающую истощение Т-клеток. Этот результат наблюдали в различной степени для 11 здоровых доноров, которых тестировали, и он был более выражен для CD4+ Т-клеток, чем для CD8+ Т-клеток. В отличие от этого, для антитела 422 H2L5 не показано значительного уменьшения жизнеспособности Т-клеток при экспрессии в форме либо изотипа IgG4[PE], либо изотипа с инактивированным Fc, что позволяет предполагать, что уменьшенная жизнеспособность может быть обусловлена опосредованной FcyR антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) (фиг. 4).
Зависимый от дозы H2L5 hIqG4PE ответ в анализе активации CD4+ Т-клеток.
Для количественной оценки эффектов активации Т-клеток посредством H2L5 hIgG4PE первичные CD4+ Т-клетки человека сначала подвергали предварительной стимуляции посредством связанного с
- 45 036335 планшетом антитела против CD3 (1 мкг/мл)/антитела против CD28 (3 мкг/мл) в течение 48 ч для повышения уровня рецептора ICOS на поверхности популяций эффекторных Т-клеток, с последующей повторной стимуляцией с использованием DynaBeads против CD3 и H2L5 hIgG4PE. 10-Точечную кривую зависимости ответа от дозы получали посредством обработки предварительно стимулированных CD4+ Т -клеток с использованием серийных концентраций связанного или растворимого H2L5 hIgG4PE в присутствии DynaBeads против CD3. Результаты показали, что как связанное, так и растворимое H2L5 hIgG4PE увеличивало продукцию цитокинов IFN-γ и TNF-α зависимым от дозы образом у двух отдельных здоровых доноров-людей (фиг. 5). Анализ подбора кривой ответа в зависимости от дозы проводили для получения значений ЕС50. Интересно, что обработка H2L5 hIgG4PE приводила к значительно большему диапазону индукции цитокинов, когда антитело являлось фиксированным на планшете, в отличие от добавления в форме растворимого белка в супернатант культур Т-клеток.
Функциональное тестирование H2L5 hIqG4PE в анализе активации РВМС человека в растворе.
Для тестирования функции H2L5 hIgG4PE в культуре суммарных РВМС человека ex vivo РВМС от здоровых доноров-людей подготавливали с помощью связанных с планшетом антител против CD3 и антител против CD28 в течение 48 ч, с последующей обработкой растворимым H2L5 hIgG4PE в присутствии dynabeads против CD3 (соотношение бусины:клетки=1:1) в течение 3,5 суток. Продукцию цитокинов и экспрессию гранзима В Т-клетками проверяли в качестве функциональных показателей функции Тклеток. Результаты от 3 доноров обобщены на фиг. 6, предоставляя доказательство для предположения, что H2L5 hIgG4PE индуцирует пролиферацию, продукцию цитокинов и увеличенный цитотоксический потенциал в активированных РВМС от здоровых доноров-людей (фиг. 6).
Активность mAb против ICOS по отношению к предварительно стимулированным РВМС человека.
Активность H2L5 hIgG4PE оценивали в анализе предварительной стимуляции РВМС, в котором РВМС подвергали предварительной стимуляции посредством связанного с планшетом антитела против CD3 (клон ОКТЗ, 1 мкг/мл) и антитела против CD28 (клон CD28.2, 3 мкг/мл) в течение 48 ч. Затем, для идентификации оптимальных условий предварительной стимуляции, Dynabeads CD3 и Dynabeads CD3/CD28 для человека (ThermoFisher) в различных соотношениях бусин к клеткам использовали для предварительной стимуляции РВМС. После 48 час предварительной стимуляции, клетки собирали, и бусины удаляли с помощью магнита перед повторной стимуляцией с использованием Dynabeads против CD3 (соотношение бусин к клеткам=1:1) в присутствии или в отсутствие растворимого mAb против ICOS. Агонистическое mAb против ICOS H2L5 hIgG4PE приводило к индукции IFNy по сравнению с контролем для изотипа во всех тестированных условиях предварительной стимуляции; однако диапазон продукции IFNy обратно коррелировал с силой предварительной стимуляции.
Пример 5. Маркеры активации Т-клеток.
Способы.
Зависимые от концентрации изменения функциональных конечных точек оценивали посредством обработки РВМС здоровых людей иммобилизованным H2L5 hIgG4PE в диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл параллельно с обработкой антителом против CD3 при 0,6 мкг/мл. Изменения экспрессии поверхностных маркеров активации Т-клеток CD69, ОХ40 и CD25 оценивали посредством проточной цитометрии и рассматривали как измерение активации Т-клеток. Пролиферацию Т-клеток измеряли по изменению окрашивания ядер Ki67. Изменение уровней различных цитокинов Th1, Th2 и Th17 оценивали на платформе MSD в ответ на обработку H2L5 hIgG4PE в присутствии обработки CD3. Временные точки через 24 и 48 ч после обработки выбирали для обеспечения фиксации ранних изменений уровней цитокинов так же, как изменений пролиферации, которые преимущественно отмечают в более поздних временных точках.
Экспериментальный препарат(ы).
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) человека.
Цельную кровь отбирали у здоровых доноров с использованием шприцов, покрытых жидким гепарином натрия (Sagent, конечная концентрация 10 МЕ/мл), и затем разводили 1:1 фосфатно-солевым буфером (PBS). Разведенную кровь (35 мл) наслаивали поверх 15 мл среды с градиентом плотности фиколла (GE Healthcare) и центрифугировали 1200xg в течение 20 мин при комнатной температуре (RT) с отключенным тормозом. Слой белых мононуклеарных клеток осторожно переносили в новую 50-мл пробирку. Равный объем PBS добавляли в пробирку и центрифугировали при 400xg в течение 5 мин при RT. РВМС промывали один раз с использованием PBS и центрифугировали, как описано ранее. РВМС ресуспендировали в 50 мл среды AIM-V. Клетки подсчитывали с использованием счетчика клеток и анализатора жизнеспособности Vi-Cell (BeckmanCoulter).
Покрытие антителом.
Антитело против CD3 человека разводили в буфере для покрытия до конечной концентрации 0,6 мкг/мл. С использованием 100 мкл разведенного антитела покрывали 96-луночный, плоскодонный планшет в течение ночи при 4°С. На следующие сутки, исходные растворы 10,1 мг H2L5 hIgG4PE и 7,9 мг антитела против RSV, контрольного для изотипа IgG4 РЕ, серийно разводили 1:2 в буфере для покрытия для получения конечных концентраций антитела в диапазоне от 100 до 0,1 мкг/мл. С использованием
- 46 036335
100 мкл разведенных антител покрывали планшет, покрытый антителом против CD3 в течение 4 ч при комнатной температуре.
Экспериментальный способ(ы).
Анализ активации РВМС человека.
H2L5 hIgG4PE тестировали в анализе активации РВМС человека, где привлечение TCR посредством антитела против CD3 и костимуляция ICOS с H2L5 hIgG4PE происходит одновременно, и эффекты активации мониторировали через 24 и 48 ч после активации. Этот эксперимент повторяли четыре раза (n=4) с кровью от четырех различных доноров. 200 мкл РВМС (1 х 106 клеток/мл) в среде AIM-V добавляли в покрытые антителом против CD3 лунки с различными концентрациями H2L5 hIgG4PE или контроля для изотипа IgG4. Три технических повтора включали для каждых условий анализа. РВМС культивировали при 37°С и 5% СО2 в течение различных периодов времени, как указано выше. Супернатанты собирали во временных точках 24 и 48 ч и затем сохраняли при -80°С для анализа секретированных цитокинов на платформе MSD.
Клетки переносили в 96-луночный планшет с глубокими лунками через 24 и 48 ч и промывали дважды с использованием 1-мл буфера для окрашивания для FACS, окрашенного с использованием конъюгированных с флуорофором антител или контроля для изотипов.
Окрашивание поверхности клеток.
Клетки сначала окрашивали 100 мкл фиксируемого красителя для определения жизнеспособности eFluor 506, предварительно разведенного 1:1000 в PBS в течение 30 мин в темноте при 4°С. Клетки промывали и затем инкубировали с антителами для детекции поверхностных маркеров клеток, конъюгированными с различными флуорофорами, на льду в течение 30 мин. После окрашивания антителами против клеточной поверхности образцы, не подлежащие окрашиванию по маркерам интернализации, промывали один раз ледяным буфером для окрашивания для FACS перед анализом на проточном цитометре FACS Canto II.
Рабочие характеристики цитометра проверяли ежесуточно с использованием бусин для установки и проверки цитометра. Компенсацию выполняли с использованием набора бусин AbC против антител мыши, индивидуально окрашенных антителами для детекции, конъюгированными с каждым флуорохромом. Образцы анализировали, и данные, полученные после установки подходящей компенсации, подтверждали с использованием смеси бусин, упомянутых выше.
Внутриклеточное окрашивание Foxp3 и Ki67.
После поверхностного окрашивания клеток, клетки фиксировали и пермеабилизировали для окрашивания внутриклеточных маркеров. С использованием набора буферов для факторов транскрипции буфер для фиксации/пермеабилизации подготавливали посредством его разведения 1:3 в буфереразбавителе. Буфер для пермеабилизации/промывки подготавливали посредством разведения 5Х исходного раствора буфера для пермеабилизации/промывки в деионизированной воде. 1 мл буфера для фиксации/пермеабилизации добавляли к каждому образцу, и планшеты немедленно перемешивали с встряхиванием на встряхивателе. Планшеты инкубировали в темноте при 4°С в течение 45 мин. После центрифугирования, добавляли 1 мл буфера для пермеабилизации/промывки, и содержимое планшетов перемешивали, и планшеты центрифугировали в течение всего двух промывок. Получали смесь для интернализации с маркерными антителами. 100 мкл антител для интернализации добавляли к соответствующим образцам, и планшеты инкубировали в темноте при 4°С в течение 30 мин. Образцы промывали дважды с использованием 1 мл буфера для пермеабилизации/промывки, ресуспендировали в 250 мкл буфера для проточной цитометрии и анализировали в проточном цитометре FACS Canto II.
Разработанный на заказ 9-плексный анализ цитокинов человека Уровни цитокинов измеряли с использованием разработанного на заказ 9-плексного набора MSD для человека. Образцы и калибраторы разводили в разбавителе 43. Образцы, разведенные 1:10 для 9-плексного анализа и 1:200 для описанного анализа IFNy, в 0,250 мкл разбавителя, добавляли к каждой из двух панелей калибраторов. После встряхивания калибраторы инкубировали на льду в течение по меньшей мере 5 мин. 200 мкл каждой панели калибраторов добавляли к 400 мкл разбавителя для получения наивысшей концентрации калибратора, и серийное разведение 1:4 использовали для получения 6 дополнительных разведений калибраторов. Разбавитель 43 использовали в качестве фона для планшета. 50 мкл разведенных образцов (в трех повторах) и калибраторов (в двух повторах) добавляли в планшет MSD. Планшеты герметично закрывали и инкубировали при RT с встряхиванием в течение 2 ч. Планшеты промывали 3 раза с использованием 150 мкл разведенного буфера для промывки из набора MSD. Для каждого планшета, раствор антитела для детекции получали посредством объединения 60 мкл каждого из 9 антител для детекции, доведенных до 3 мл разбавителем 3. После добавления 25 мкл раствора антитела для детекции, планшеты герметично закрывали и инкубировали при комнатной температуре, в темноте, с встряхиванием в течение 2 ч. Планшеты промывали, как выше. 150 мкл 2х буфера для считывания добавляли в планшеты, и их считывали в QuickPlex.
Анализ цитокина IFNy человека.
Образцы и калибраторы разводили в разбавителе 2. 1 мл разбавителя добавляли к калибратору. По
- 47 036335 сле встряхивания, калибратор инкубировали на льду в течение 5 мин. Это представляло собой калибратор 1. Серийное разведение 1:4 использовали для получения 6 дополнительных разведений калибраторов. Разбавитель 2 использовали в качестве фона для планшета. Пятьдесят (50) мкл разведенных образцов (в трех повторах) и калибраторов (в двух повторах) добавляли в планшет MSD. Планшеты герметично закрывали и инкубировали при RT с встряхиванием в течение 2 ч. Планшеты промывали 3 раза с использованием 150 мкл разведенного буфера для промывки из набора MSD. Раствор антитела для детекции получали в разбавителе 3. Для каждого планшета, 60 мкл каждого из антител для детекции добавляли к разбавителю для получения всего 3 мл реагента для детекции. После добавления 25 мкл антител для детекции, планшеты герметично закрывали и инкубировали при комнатной температуре, в темноте, с встряхиванием в течение 2 ч. Планшеты промывали 3 раза. Буфер для считывания добавляли в планшеты, и их считывали в QuickPlex.
Анализ данных.
Анализ данных анализа цитокинов и проточной цитометрии Результаты анализа цитокинов MSD assay анализировали с использованием программного обеспечения MSD Discovery Workbench, версии 4.0 (Meso-Scale), Microsoft Excel и Graphpad Prism. Данные проточной цитометрии анализировали посредством DIVA, и количества наносили на график в программном обеспечении GraphPad Prism.
Анализ подбора кривой ответа в зависимости от дозы антител.
Данные ответа в зависимости от дозы импортировали в программное обеспечение GraphPad Prism и трансформировали в логарифмической шкале. Ответ в зависимости от дозы агониста в моделях с различным углом наклона кривой использовали для анализа данных и получения значений ЕС50. Формула подбора приведена ниже
Υ= нижнее+(верхнее-нижнее)/(1+10л((LogEC50-X)*угол наклона))
Статистические анализы.
Статистическую значимость различий между значениями для H2L5 hIgG4PE и контрольного антитела для изотипа в анализе пролиферации анализировали посредством двустороннего t-критерия Стьюдента.
Результаты.
Оценка изменений уровня цитокинов с использованием H2L5 hIqG4PE.
Обработка РВМС иммобилизованным H2L5 hIgG4PE в присутствии антитела против CD3 индуцировала секрецию, до различной степени, цитокинов Th1, таких как IFNy, TNFa, цитокинов Th2, IL-6 и IL10, так же как цитокина Th17 IL-17a зависимым от концентрации образом. Для других измеренных цитокинов, таких как IL-4, IL-5 и IL-13, показана также меньшая степень зависимого от концентрации ответа на стимуляцию H2L5 hIgG4PE. Результаты для четырех отдельных доноров обобщены в табл. 7.
Функциональная оценка активности H2L5 hIqG4PE по отношению к поверхностным маркерам активации Т-клеток посредством проточной цитометрии.
Обработка H2L5 hIgG4PE с параллельной стимуляцией CD3 в неактивированных РВМС человека (n=4 донора) индуцировала значимые изменения маркеров активации Т-клеток (табл. 7 и 8)). Сильное увеличение CD4 и CD8 Т-клеток, положительных по CD25 и OX40, наблюдали в обработанных H2L5 hIgG4PE образцах по сравнению с образцами, контрольными для изотипа IgG4 человека. Процент CD4 и CD8 Т-клеток, положительных по CD69, также увеличивался во временных точках 24 и 48 ч зависимым от концентрации образом.
Характеризация эффекта H2L5 hIgG4PE на пролиферацию Т-клеток.
Обработка иммобилизованным H2L5 hIgG4PE с параллельной активацией CD3 приводила к зависимому от концентрации увеличению пролиферации как CD4, так и CD8 Т-клеток (n=6 доноров), как измеряли посредством окрашивания внутриклеточного Ki67 (табл. 8). H2L5 hIgG4PE усиливало также пролиферацию регуляторных CD4+CD25+Foxp3+ Т-клеток зависимым от концентрации образом, но в меньшей степени, чем наблюдали для суммарных CD4 и CD8 Т-клеток. Усиление пролиферации Тклеток посредством H2L5 hIgG4PE наблюдали только во временной точке 48 ч. Усиление пролиферации регуляторных Т-клеток не являлось значимым, в то время как зависимое от концентрации усиление пролиферации CD4+ клеток (р< 0,05 для концентрации более 0,4 мкг/мл H2L5 hIgG4PE) и CD8+ Т-клеток (р < 0,05 для концентраций между 0,2 и 1,6 мкг/мл) являлось значимым (см. табл. 7).
- 48 036335
Таблица 7
Значения ЕС50 (мкг/мл) для всех функциональных конечных точек для H2L5 hIgG4PE в анализе активации РВМС человека
Donor_1136F50 Donor_185M45 Donor_1124F36 Donor_1149M52
24 час 48 час 24 час 48 час 24 час 48 час 24 час 48 час
IL-10 1,7 1,3 0,7 0,8 0,7 0,6 0,5 0,6
IFN-γ 0,4 1,5 0,3 0,7 0,3 0,5 0,2 0,6
IL-17a 1,4 1,6 0,8 1,1 0,6 0,8 0,7 1,0
IL-6 0,7 1,1 0,7 0,8 NA NA 0,2 0,3
TNF-α ΝΑ 0,3 NA 0,5 NA 0,3 NA 0,2
CD4+CD69+ 0,5 0,4 0,8 NA 1,1 1,1 0,5 0,4
CD4+CD25+ 0,3 0,6 2,4 0,5 0,6 0,6 0,6 0,4
CD4+OX40+ 0,2 0,4 1,6 NA 0,6 1,2 0,6 0,4
CD8+CD69+ 0,5 0,6 1,2 0,5 0,8 1,1 0,6 0,4
CD8+CD25+ 0,4 0,7 2 0,5 0,6 0,5 1,0 0,4
CD8+OX40+ 0,3 0,5 1,6 NA 2,4 0,5 1,5 0,3
CD4+K167+ NT NT NA 0,6 NA 0,8 NA 0,5
CD8+K167+ NT NT NA 0,4 NA 0,7 NA 0,3
NA=hc анализировали (значения ЕС50 неточные из-за плохого соответствия кривых).
NT=не тестировали.
Таблица 8
Процент CD4 или CD8 Т-клеток, положительных по CD25, Foxp3 и Ki67, в РВМС человека после стимуляции H2L5 hIgG4PE в присутствии антител против CD3 в течение 48 ч
Концентр ация антитела H2LA h!gG4PE (% от CD4 или CD8 Т-клеток) Контроль для изотипа (% CD4 или CD8 Т-клеток) ткритерий
мкг/мл Донор 185М45 Донор 1124F36 Донор 1149М52 Донор 185М45 Донор 1124F36 Донор 1149М52 (значение Р)
%Tper CD4 T- клеток 0 10,2 3,8 6,1 10,2 3,8 6,1 0,415
0,1 12,4 4,2 7,6 8,6 3,6 6, 6 0,220
0,2 11,8 4,5 9,8 8,5 3,2 7,1 0,054
0,4 14,3 5,2 11,3 8,6 3,4 7,4 0,076
0,8 18,6 6, 9 14,3 8,4 3,4 7,3 0,069
1,6 21,4 7,5 15,9 7,7 3,8 7,2 0,095
3,1 20,8 7,9 15,0 10,4 3,9 7,1 0,058
6, 3 18,7 8,3 14,7 10,3 3,6 8,3 0,026
12,5 20,2 7,6 15,1 9, 6 4,0 8,1 0,072
25 19,5 7,6 13,9 11,5 5,1 8,3 0,079
50 20,0 7,9 13,3 9, 6 5,0 9,7 0,143
100 18,7 7,9 13,3 11,5 5,6 8,8 0,080
% ΚΪ67+ CD4 Тклеток 0 7,2 1,2 2,3 7,2 1,2 2,3 0,693
0,1 9,6 1,5 2,9 6, 1 0,9 2,1 0,219
0,2 9,0 2,1 4,4 5, 0 0,9 2,4 0,098
0,4 11,9 3,9 7,5 6, 8 1,0 2,7 0,025
0,8 18,2 7,1 12,4 7,6 1,3 2,5 0,028
1,6 19,5 8,9 15,9 5,4 0,8 3,2 0,024
3,1 21,1 10,7 14,4 9, 1 1,2 2,9 0,005
6,3 18,7 12,6 17,1 8,1 1,1 3,2 0,007
12,5 22,2 12,2 16,5 7,4 1,5 3,4 0,008
25 20,7 11,6 16, 1 9,3 1,7 5,2 0,002
50 21,2 12,8 14,3 7,5 2,4 7,3 0,034
100 21,8 12,0 14,0 9,4 2,8 4,7 0,010
% ΚΪ67+ CD8 Тклеток 0 11,0 4,4 2,7 11,0 4,4 2,7 0,841
0,1 15,2 8,3 4,8 9, 6 5,3 2,3 0,061
0,2 13,5 10,9 7,8 8,2 3,8 2,9 0,014
0,4 17,4 14,4 11,3 10,1 3,4 4,3 0,023
0,8 20,7 19,6 13,8 14,2 4,5 2,0 0,047
1,6 22,2 22,8 16, 1 10,7 4,0 3,7 0,025
3,1 21,8 26,7 13,6 14,5 4,4 3,0 0,099
6,3 20,2 29,8 16, 0 10,8 3,3 5,0 0,103
12,5 21,7 29,6 15,6 10,7 4,1 3,4 0,074
25 20,0 28,7 14,6 10,4 6, 1 5,0 0,084
50 19,0 31,4 13,5 7,6 5,1 5,5 0,114
100 19,2 27,4 13,4 7,9 7,1 3,5 0,051
%ΚΪ67+ Трег клеток 0 29,7 10,2 11,3 29,7 10,2 11,3 0,920
0,1 32,8 12,5 14,4 32,4 10,0 12,3 0,127
0,2 33,0 14,8 19,0 30,3 8,3 13,4 0,051
0,4 33,6 22,2 22,2 28,4 10,8 14,1 0,044
0,8 37,0 26, 3 26,3 36, 7 8,5 14,4 0,191
1,6 35,0 27,7 28,4 26, 8 7,7 16,3 0,061
3,1 38,3 30,2 27,2 33,9 9,6 17,4 0,135
6,3 33,9 32,5 26, 1 36,7 8,7 16,5 0,315
12,5 37,3 36, 8 26,2 31,2 15,1 17,2 0,125
25 36,3 33,0 28,6 33,3 13,7 28,1 0,326
50 37,7 33,6 24,2 32,9 21,1 29,5 0,518
100 40,1 35,8 28,6 36,3 21,5 26,4 0,216
- 49 036335
Обсуждение.
Хорошо известно, что ICOS является важным для активации Т-клеток и индукции как Th1, так и Th2 цитокинов. В этом исследовании показана активность in vitro H2L5 hIgG4PE (агонистического антитела против ICOS) с различными измерениями активации Т-клеток и индукции цитокинов. Все измеренные маркеры активации Т-клеток, CD25 (альфа-цепь рецептора IL-2), CD69 (ранний маркер активации) и ОХ-40 (маркер костимуляции) подвергались повышающей регуляции при обработке H2L5 hIgG4PE в сочетании со стимуляцией CD3. Среди мониторированных маркеров активации процент Т-клеток, экспрессирующих CD69 и OX40, сильно увеличивался посредством обработки H2L5 hIgG4PE. CD69 представляет собой ранний маркер активации, и таким образом эффекты преобладали в образцах через 24 ч. Количество CD25, другого важного маркера активации Т-клеток, увеличивалось при обработке H2L5 hIgG4PE в обеих временных точках, что позволяет предполагать, что H2L5 hIgG4PE играет важную роль в поддержании активации Т-клеток. Ki67 представляет собой ядерный белок, ассоциированный с пролиферацией клеток. Данные проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием Ki67 показали, что иммобилизованный H2L5 hIgG4PE значимо усиливал пролиферацию как CD4, так и CD8 Т-клеток в контексте привлечения TCR. Хотя пролиферация регуляторных Т-клеток также увеличивалась посредством H2L5 hIgG4PE, изменения не были статистически значимыми.
Th17 клетки человека играют ключевую роль в регуляции противоопухолевого иммунитета [Nunez, S., et al., Т helper type 17 cells contribute to anti-tumour immunity and promote the recruitment of T helper type 1 cells to the tumour. Immunology 2013; 139: 61-71]. Исследования показали, что ICOS вовлечен в развитие и функционирование Th17 человека [Kimura, A., et al., Regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 2010; 40: 1830-1835; Paulos C.M. et al. The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells. Sci Transl Med. (2010) 2(55); 55ra78; Nelson, M.H., et al. The inducible costimulator augments Tc17 cell responses to self and tumor tissue. J Immunol, 2015; 194: 1737-1747]. При настоящей функциональной оценке H2L5 hIgG4PE большинство цитокинов, связанных с воспалительными и иммунными ответами, измеряли в супернатанте культур клеток после стимуляции антителами против CD3 и H2L5 hIgG4PE. H2L5 hIgG4PE сильно индуцирует секрецию цитокинов Th1, IFN-γ и TNF-α, и цитокина Th17, IL-17a, в РВМС человека, что позволяет предполагать, что H2L5 hIgG4PE обладает потенциалом играть важную роль в противоопухолевых ответах. IL-6, вместе с TGF-β, является важным цитокином для индукции развития клеток Th17 из наивных Т-клеток. В отличие от этого, IL-6 ингибирует дифференцировку Трег, индуцированную TGF-β [Kimura, A., 2010; Korn, Т., et al., IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells. PNAS, 2008; 105: 1846018465]. В этом исследовании обнаружено, что H2L5 hIgG4PE увеличивает секрецию IL-6, которая может дальше усиливать развитие ^П-клеток. Показано, что агонистические антитела против Т-клеточных рецепторов, таких как CD28 и члены семейства рецепторов TNF, образуют колоколообразную кривую зависимости ответа от дозы [White, A.L., et al., Conformation of the Human Immunoglobulin G2 Hinge Imparts Superagonistic Properties to Immunostimulatory Anticancer Antibodies. Cancer Cell, 2015, 27: 138-148; Luhder, F., et al., Topological Requirements and Signaling Properties of T Cell-activating, Anti-CD28 Antibody Superagonists. J. Exp. Med. 2003: 955-966; Stebbings, R., et al., Cytokine Storm in the Phase I Trial of Monoclonal Antibody TGN1412: Better Understanding the Causes to Improve PreClinical Testing of Immunotherapeutics J. Immunol., 2007, 179: 3325-3331; Rogers P.R. and Croft M., CD28, Ox-40, LFA-1, and CD4 Modulation of Th1/Th2 Differentiation Is Directly Dependent on the Dose of Antigen. J Immunol 2000 164:2955-2963; doi:10,4049/jimaunol.164,6,2955]. Для H2L5 hIgG4PE также показана сходная гиперболическая кривая функционального ответа. Эта информация является важным компонентом обеспечения наилучшего диапазона доз подлежащего использованию антитела для оптимального фармакодинамического ответа.
В общем, показано, что H2L5 hIgG4PE, в сочетании со стимуляцией CD3, усиливает активацию, пролиферацию Т-клеток и индукцию провоспалительных цитокинов наряду с его ролью в качестве сильного активатора костимулирующего рецептора Т-клеток.
Пример 6. Связывание антител против ICOS.
Способом гуманизации (пример 3) получили 36 вариантов тяжелой и легкой цепей, для которых провели скрининг по связыванию с ICOS человека и яванского макака, в то же время убеждаясь также, что они не связываются с CD28 или CTLA-4 человека. Вариант H2L5 идентифицирован как обладающий высокой аффинностью для ICOS человека и яванского макака (1,34 и 0,95 нМ соответственно), в то же время содержащий минимальное количество обратных мутаций.
Изменение изотипа 422 H2L5 от IgG1 до IgG4PE не влияет на связывание антигена антителом, поскольку H2L5 hIgG4PE обладает аффинностью 1,3 нМ для ICOS человека. Зависимое от концентрации ингибирование связывания ICOS/ICOS-L посредством H2L5 hIgG4PE показано на фиг. 7.
Экспериментальные способы.
Связывание H2L5 hIgG4PE с ICOS человека.
Кинетику аффинности связывания гуманизированного антитела H2L5 hIgG4PE определяли с использованием BIAcore T200 с антителом против ICOS H2L5 hIgG4PE, связанным на поверхности с антителом против IgG человека в Fc2 чипа СМ5. Поверхность с антителами против IgG человека блокировали
- 50 036335 с использованием 0,1 мг/мл контрольного hIgGI для предотвращения неспецифического связывания Fc кролика. ICOS человека и яванского макака (Fc кролика) пропускали над связанными антителами при
256, 64, 16, 4 и 1 нМ. Буфер отдельно использовали для кривых связывания с двойным контролем. MgCl2 использовали для регенерации поверхности. Анализ проводили при 25°С. Данные подгоняли под модель
1:1 с использованием программного обеспечения Т200 для оценки. Концентрация антитела: 2,5 мкг/мл.
Результаты.
Связывание H2L5 hIqG4PE с ICOS человека и яванского макака.
Кинетику аффинности связывания гуманизированного антитела H2L5 hIgG4PE определяли с использованием BIAcore T200.
Данные связывания ICOS подгоняли под модель кинетики 1:1 с использованием программного обеспечения Т200 для анализа данных.
Аффинность связывания H2L5 hIgG4PE для ICOS человека составляет 1,34 нМ, и для ICOS яванского макака составляет 0,95 нМ (см. табл. 9). Эти значения являются сравнимыми и показывают, как ожидалось, что изменение в области Fc молекулы не влияет на связывание с антигеном ICOS.
В табл. 9 показаны Ka/Kd/KD для связывания гуманизированного 422 (H2L5) IgG4PE с ICOS человека и яванского макака.
Таблица 9
Связывание с ICOS человека
Образец Мишень Ка(1/Мс) Kd (1/с) KD (М)
422 H2L5 IgG4PE ICOS человека -Ес 2,97Е+05 3,96Е-04 1,34Е-09
422 H2L5 IgG4PE ICOS яванского макака -Ес 3,91Е+05 3,71Е-04 9,49Е-10
Обсуждение.
Как показано в примере 1, мышиный клон 422-2 идентифицировали как наилучшее мышиное антитело против ICOS человека. При гуманизации этого антитела получили 36 вариантов тяжелой и легкой цепей, для которых провели скрининг по связыванию с ICOS человека и яванского макака, в то же время убеждаясь также, что они не связываются с CD28 или CTLA-4 человека. Вариант H2L5 идентифицирован как обладающий высокой аффинностью для ICOS человека и яванского макака (1,34 и 0,95 нМ соответственно), в то же время содержащий минимальное количество обратных мутаций.
Изменение изотипа от IgG1 до IgG4PE не влияет на связывание антитела с ICOS.
Пример 7. Связывание H2L5 hIqG4PE с активированными Т-клетками человека.
Способы.
Экспериментальный препарат(ы).
Выделение с отрицательным отбором по CD3.
CD3+ Т-клетки выделяли с отрицательным отбором посредством набора для обогащения Т-клеток человека Stemcell Rosette Sep.
Обогащение Т-клеток человека посредством Rosette Sep: 100 мл свежей, цельной крови отбирали с использованием шприцов, покрытых жидким гепарином натрия (Sagent, конечная концентрация 10 МЕ/мл). Кровь из каждой пробирки для сбора переносили в пробирку, куда 50 мкл смеси для обогащения Т-клеток человека Rosette Sep добавляли на 1 мл крови (5 мл/100 мл крови доноров).
Цельную кровь/смесь антител Rosette Sep инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре (RT). Затем кровь/смесь антител Rosette Sep разводили 1:1 1х фосфатно-солевым буфером (PBS)+2% FBS(эмбриональная бычья сыворотка) до конечного объема 200 мл. Затем 25 мл разведенной крови/смеси антител наслаивали поверх 15 мл градиента фиколла в пробирках Sepmate (всего 8 пробирок для каждого донора). Затем загруженные пробирки Sepmate центрифугировали при 1200xg в течение 20 мин при RT с включенным тормозом. Верхний слой плазмы ниже границы раздела с мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) отбирали с помощью пипетки и отбрасывали. Оставшуюся плазму и границу раздела с лейкоцитарной пленкой декантировали из пробирок Sepmate в 50 мл конические пробирки для центрифугирования (всего 4 пробирки). Пробирки дополняли до 50 мл с использованием PBS+2% FBS. Клетки центрифугировали при 400xg в течение 10 мин при RT. Супернатанты отбрасывали. Затем осадки для каждого донора объединяли в одну 50-мл коническую пробирку, ресуспендировали осадки в суммарном объеме 50 мл PBS+2% FBS. Клетки центрифугировали при 400xg в течение 5 мин при RT. Супернатанты отбрасывали, и осадки клеток ресуспендировали в 2 мл полной среды RPMI (RPMI 1640+10% FCS+1 мМ пируват натрия+2 мМ L-глутамин+пенициллин 100 Ед./мл+стрептомицин 100 мкг/мл). Выделенные CD3 клетки подсчитывали в устройстве ViCell и дополнительно разводили до 1,2 х106 клеток/мл. 1х106 выделенных клеток окрашивали по CD3 РЕ-Су7 для подтверждения качества выделения Т-клеток.
CD3+ Т-клетки выделяли с отрицательным отбором посредством набора для выделения интактных Т-клеток от Invitrogen.
- 51 036335
Выделение РВМС.
Кратко, 100 мл свежей, цельной крови отбирали от каждого донора с использованием шприцов, покрытых жидким гепарином натрия (Sagent, конечная концентрация 10 МЕ/мл). Кровь разводили (1:1) до конечного объема 200 мл с использованием PBS с 2%FBS. 25 мл разведенной крови наслаивали поверх 15 мл градиента фиколла в пробирках Sepmate (всего 8 пробирок для каждого донора). Затем загруженные пробирки Sepmate центрифугировали при 1200xg в течение 20 мин при RT с включенным тормозом. Верхний слой плазмы ниже границы раздела с РВМС отбирали с помощью пипетки и отбрасывали. Оставшуюся плазму и границу раздела с лейкоцитарной пленкой декантировали из пробирок Sepmate в 50 мл конические пробирки для центрифугирования (всего 4 пробирки). Пробирки дополняли до 50 мл с использованием PBS + 2% FBS. Клетки центрифугировали при 400xg в течение 10 мин при RT. Супернатанты отбрасывали. Затем осадки для каждого донора объединяли в одну 50-мл коническую пробирку и ресуспендировали осадки в суммарном объеме 50 мл PBS + 2% FBS. Клетки центрифугировали при 400xg в течение 5 мин при RT. Супернатанты отбрасывали, и осадки клеток ресуспендировали в произвольном объеме буфера для выделения (в зависимости от размера осадка клеток), представленного в наборе для выделения интактных Т-клеток от Invitrogen. Затем выделенные РВМС подсчитывали в устройстве ViCell и доводили до конечной концентрации 1х 108 клеток/мл в буфере для выделения.
Выделение интактных Т-клеток человека на Dynabead от Invitrogen.
2x 108 выделенных РВМС (2 мл), 400 мкл FBS и затем 400 мкл смеси антител из набора для выделения интактных Т-клеток от Invitrogen добавляли в каждую 15 мл пробирку и инкубировали в течение 20 мин при 4°С. Клетки промывали с использованием 10 мл буфера для выделения и центрифугировали при 350xg в течение 8 мин при 4°С. Супернатанты отбрасывали, и осадки ресуспендировали в 2 мл буфера для выделения. Затем 2 мл предварительно промытых Dynabeads для истощения добавляли в каждую пробирку. Клетки инкубировали с бусинами в течение 15 мин при комнатной температуре с осторожным покачиванием и вращением. После инкубации бусин, добавляли 10 мл буфера для выделения, и суспензии клеток/бусин пипетировали вверх и вниз 10 раз. Пробирки помещали на магнит на 2 минуты при комнатной температуре. Не затрагивая намагниченные бусины, супернатанты, содержащие интактные Тклетки собирали. Бусины промывали 1 раз с использованием 10 мл буфера для выделения и снова помещали на магнит на 2 минуты при комнатной температуре, и очищенный от бусин буфер собирали. Собранные клетки центрифугировали при 400xg в течение 5 мин при RT. Супернатанты отбрасывали, и осадки клеток ресуспендировали в произвольном объеме полной среды RPMI, в зависимости от размера осадка клеток (2-35 мл). Затем выделенные CD3+ клетки подсчитывали в ViCell и доводили до концентрации 1,2х 106 клеток/мл в полной среде RPMI.
Подтверждающее окрашивание CD3.
х 106 выделенных клеток окрашивали с использованием 5 мкл антител против CD3 с РЕ-Су7 или 5 мкл антител против изотипа IgG1 с Ре-Су7 в течение 40 мин при 4°С в темноте. Затем клетки промывали дважды ледяным PBS с 0,1% Tween 20, центрифугируя при 400xg в течение 5 мин при 4°С. Окрашенные клетки ресуспендировали в 1% формальдегиде и инкубировали при 4°С в течение 20 мин в темноте. Затем клетки промывали дважды ледяным PBS с 0,1% Tween 20, центрифугируя при 400xg в течение 5 мин при 4°С, и ресуспендировали в 275 мкл PBS с 0,1% Tween 20. Фиксированные клетки сохраняли при 4°С в темноте до проведения проточной цитометрии для подтверждения качества выделения Т-клеток.
Активация выделенных Т-клеток человека.
Флаконы Т75 покрывали с использованием 4 мл 1 мкг/мл CD3/CD28 в PBS в течение 2 ч при 37°С. Флаконы промывали дважды с использованием 12 мл PBS. 30x106 клеток в 25 мл полной среды RPMI добавляли на флакон Т75. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С, 5% СО2, чтобы обеспечить возникновение активации.
Связывание антитела против ICOS (H2L5 hIqG4PE).
Связывание H2L5 hIgG4PE оценивали как для наивных, так и для активированных CD3+ Т-клеток. Использовали 8-точечное титрование от 0,00128 до 100 мкг/мл H2L5 hIgG4PE с 5-кратными разведениями.
Наивные и/или активированные CD3+ Т-клетки ресуспендировали в PBS с 0,1% BSA (буфер для FACS), содержащем блокирующий раствор для FcR человека при 2x106 клеток/мл (5 мкл блокирующего раствора для FcR+950 мкл буфера для FACS на 1 мл). В концентрации 2x105 клеток/лунку, 100 мкл клеток высевали в 2 мл 96-луночные блоки для анализа и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Во время инкубации раститровку связывающих антител антитела против ICOS (H2L5 hIgG4PE) или контрольного антитела для изотипа IgG4 подготавливали в 2x концентрации. После инкубации с блокирующим раствором для FcR, 100 мкл на лунку 2x концентрированных связывающих антител добавляли к 100 мкл Т-клеток с блокированным Fc на лунку для достижения конечной 1x концентрации антитела против ICOS (H2L5 hIgG4PE) или контрольного антитела для изотипа IgG4 от 0,00128 до 100 мкг/мл. Клетки инкубировали с антителами в течение 20 мин при комнатной температуре. После инкубации для связывания клетки промывали дважды в 1 мл буфер для FACS, центрифугируя при 400xg в
- 52 036335 течение 5 мин при комнатной температуре.
Окрашивание наивных или активированных Т-клеток после связывания антитела против ICOS (H2L5 hIgG4PE).
Клетки окрашивали для проточной цитометрии с использованием следующих смесей.
Смесь для окрашивания.
Смесь для изотипов.
Наивные или активированные, Т-клетки с блокированным Fc ресуспендировали в 80 мкл буфера для FACS после инкубации для связывания с антителами H2L5 hIgG4PE или контрольными антителами. В лунку добавляли 20 мкл на лунку либо смеси для окрашивания, либо смеси для изотипов. Клетки окрашивали в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. После инкубации для окрашивания клетки промывали дважды в 1 мл буфера для FACS, центрифугируя при 400xg в течение 5 мин при комнатной температуре.
Фиксация окрашенных клеток.
Клетки ресуспендировали в 500 мкл 1% формальдегида (10 мл 16x концентрированного формальдегида+150 мл 1x PBS) и инкубировали при комнатной температуре 20 мин. Затем клетки промывали дважды с использованием 1 мл буфера для FACS, центрифугируя при 400xg в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем осадки ресуспендировали в 265 мкл буфера для FACS и переносили в 96-луночный круглодонный планшет. Клетки сохраняли при 4°С в темноте до анализа посредством проточной цитометрии.
Проточная цитометрия.
Проточную цитометрию проводили либо в либо в FACS Fortessa Х20, либо в FACS Canto II с использованием программного обеспечения FACSDiva (версии 8.0). Компенсацию выполняли во время сбора данных с использованием бусин eBioscience Ultracomp с одним красителем и программного обеспечения для компенсации в FACSDiva.
Анализ данных.
Сбор данных и компенсацию проводили в устройствах для FACS BD, LSR Fortessa X-20 или FACS Canto II с использованием программного обеспечения BD Diva (вер. 8.0). Для анализа данных использовали программное обеспечение Flow Jo (вер. 10.0.8r1). Результаты регистрировали как MFI (медианную интенсивность флуоресценции) и процент клеток, положительных по окрашиванию FITC легкой цепи каппа IgG человека из общего количества жизнеспособных клеток или соответствующей исходной популяции. ЕС50 определяли с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 5 (вер. 5.04) с нелинейной регрессией трансформированных данных (Х (log(X)) с использованием изменяемого наклона кривой с 4 параметрами (^(агонист) против ответа - изменяемый наклон кривой).
Результаты.
Выделение Т-клеток из свежей, цельной крови человека с использованием либо набора для обогащения по CD3 Rosette Sep, либо наборов для выделения интактных Т-клеток с Dynabead подтверждали посредством окрашивания с использованием антител против CD3 с РеСу7. Образцы доноров лежали в диапазоне между 68 и 97% положительных по CD3 клеток. Для популяций CD4+ и CD8 + клеток, активированных антителом против CD3/антителом против CD28, получали кривые зависимости от концентрации H2L5 hIgG4PE при оценке окрашивания антителом против легкой цепи каппа IgG1 человека с FITC. Кривые связывания H2L5 hIgG4PE представлены в форме процента клеток, положительных по антителам против легкой цепи каппа IgG1 человека с FITC и в форме медианной интенсивности флуоресценции (MFI) FITC. Для Т-клеток, инкубированных с контрольным антителом для изотипа IgG4, не получено кривых зависимости от концентрации при оценке по окрашиванию антителам против легкой цепи каппа IgG1 человека с FITC. Для наивных CD4+ или CD8+ клеток не получено полных кривых; однако наблюдали зависимое от концентрации увеличение от 0,1 до 100 мкг/мл.
Медианы (диапазоны) значений ЕС50 составляли 1,04 мкг/мл (0,628-1,31 мкг/мл) для CD4+ FITC MFI и 0,652 мкг/мл (0,27-0,74 мкг/мл) для CD8+FITC MFI соответственно. Медианы (диапазоны) значений ЕС50 составляли 0,834 мкг/мл (0,45-0,965 мкг/мл) для процента CD4+, положительных по антителам против легкой цепи каппа IgG с FITC, и 0,583 мкг/мл (0,371-1,23 мкг/мл) для процента CD8+, положительных по антителам против легкой цепи каппа IgG с FITC (табл. 10).
- 53 036335
Таблица 10
Обобщение значений ЕС50 для связывания 422 H2L5 hIgG4PE с активированными Т-клетками человека
Активированные CD4 Т-клетки Активированные CD8 Т-клетки
Донор # MFI Процент положительных MFI Процент положительных
1124F36 0,628 0,45 0,564 0,619
1149М52 1,31 0,882 0,74 0,547
1173F42 0,636 0,612 0,27 0,371
1123F59 1,04 0,853 Не проводили Не проводили
1141F45 1,27 0,965 Не проводили Не проводили
2100М39 Не подобрана кривая 0,814 Не подобрана кривая 1,23
191F39 Не подобрана кривая Не подобрана кривая Не подобрана кривая Не подобрана кривая
1155F49 Не подобрана кривая Не подобрана кривая Не проводили Не проводили
1156F64 Не подобрана кривая Не подобрана кривая Не проводили Не проводили
Медиана 1,04 0,834 0,652 0,583
Среднее 0,977 0,763 0,525 0,692
Станд. откл. 0,331 0,193 0,237 0,374
Обсуждение.
В этом исследовании показано, что H2L5 hIgG4PE (агонистическое антитело против ICOS) связывалось с рецептором ICOS на активированных Т-клетках от здоровых доноров-людей. Связывание H2L5 hIgG4PE с клеточной поверхностью Т-клеток детектировали с использованием антитела против легкой цепи каппа IgG человека, меченного FITC.
Успешное выделение CD3+ Т-клеток подтверждали посредством проточной цитометрии с окрашиванием антителом против CD3 с Ре-Су7. Для девяти из десяти доноров получили более 89% CD3+ Тклеток после выделения. Однако для донора # 2100М39 получено только 68,6% CD3+ после выделения. Причина этой сниженной чистоты выделения Т-клеток для донора # 2100М39 неизвестна. Значения ЕС50, полученные для ограниченных по CD4+ и CD8+ популяций от донора # 2100М39, не выглядят аномальными и включены в обобщенные медианные значения.
ЕС50 для связывания определяли для H2L5 hIgG4PE на выделенных с отрицательным отбором Тклетках человека. Кривые связывания получали, когда выделенные Т-клетки активировали посредством 48 ч воздействия связанных с планшетом при 1 мкг/мл антител против CD3/CD28. Как процент положительных по окрашиванию FITC легкой цепи каппа IgG человека, так и данные MFI FITC для активированных CD4+ и CD8+ Т-клеток рассматривали в статистических анализах. Медианные значения ЕС50 для CD4+ являлись сходными при расчете в форме процента положительных по FITC клеток или MFI FITC, 1,04 и 0,834 мкг/мл соответственно. Медианные значения ЕС50 для CD8+ также являлись сходными при расчете в форме процента положительных по FITC клеток или MFI FITC, 0,652 и 0,583 мкг/мл соответственно.
Для Т-клеток, инкубированных с контрольным антителом для изотипа IgG4 с РЕ, не получили зависимого от концентрации увеличения связывания антител против легкой цепи каппа IgG человека с FITC, независимо от применяемого способа анализа, по MFI или проценту положительных клеток.
Полных кривых не удалось получить для наивных или неактивированных, выделенных с отрицательным отбором Т-клеток в тестированном диапазоне 0,00128-100 мкг/мл H2L5 hIgG4PE. Однако зависимое от концентрации увеличение связывания наблюдали у доноров для 0,1-100 мкг/мл H2L5 hIgG4PE. EC50 невозможно было рассчитать, поскольку кривые для наивных Т-клеток являлись неполными. Неспособность H2L5 hIgG4PE связываться в низких концентрациях с наивными или неактивированными клетками являлась ожидаемой, поскольку ICOS только слабо экспрессируется на покоящихся Th17 клетках, фолликулярных Т-клетках-помощниках (TFH) и регуляторных Т-клетках (Трег). Привлечение и активация TCR необходимы для индукции экспрессии ICOS. Таким образом, вероятно, присутствовало очень небольшое количество рецептора ICOS, экспрессированного на наивных или неактивированных клетках, и следовательно, минимальное связывание H2L5 hIgG4PE.
Пример 8. Результаты TK/PD из исследования по подбору диапазона доз (DRF) у яванского макака.
Для оценки характеристик in vivo H2L5 hIgG4PE в соответствующих по мишени видах исследование по подбору диапазона доз проводили на яванских макаках. В исследовании тестировали 3 уровня доз (0,3, 3 и 30 мг/кг) в дополнение к контрольной когорте носителя. Дозирование было повторяющимся, где вторую дозу вводили через 14 суток после первой. Тестировали одного самца и одну самку на когорту. Для H2L5 hIgG4PE показано зависимое от дозы увеличение Смакс (мкг/мл) и AUC (мкг-ч/мл) для 3 различных тестированных доз. При всех трех уровнях доз антитело детектировали в плазме в течение двух недель после первой дозы (фиг. 12А). Антитела против H2L5 hIgG4PE детектировали у 3 обезьян после однократной дозы, для обоих животных после дозы 0,3 мг/кг, так же, как для самки после дозы 3 мг/кг. Антитела против H2L5 hIgG4PE коррелировали с уменьшенными концентрациями в плазме после введения второй дозы этим животным (фиг. 12В). Через 48 ч после второй дозы всех животных умерщвляли
- 54 036335 для сбора тканей для анализа фармакодинамической активности и гистопатологического анализа.
Занятость рецептора H2L5 hIgG4PE (RO) измеряли на CD4+ Т-клетках из селезенки и подмышечных лимфатических узлов всех животных в исследовании. Зависимое от дозы увеличение связывания
H2L5 hIgG4PE наблюдали для тестированных уровней доз в обеих тканях (фиг. 13).
Занятость рецептора измеряли также на CD4+ Т-клетках из периферической крови обезьян в исследовании. Кровь отбирали в 5 временных точках (сутки 1 (перед дозированием), сутки 3, сутки 8, сутки 15 (перед вторым дозированием) и сутки 17). Два различных показателя использовали в этом анализе для определения RO. Первый представляет собой формат анализа свободного рецептора, в котором связывание mAb против ICOS, использованного для детекции при проточной цитометрии, определяли в присутствии или в отсутствие H2L5 hIgG4PE, как показано, конкурирующего за связывание с ICOS. Таким образом, отсутствие сигнала антител против ICOS в FACS являлось суррогатным для занятости рецептора H2L5 hIgG54PE, и наоборот, положительность по антителам против ICOS указывала на свободный рецептор, не связанный с H2L5 hIgG4PE. На фиг. 14-А показано, что количество свободного рецептора ICOS уменьшалось зависимым от дозы и зависимым от времени образом. Для двух обезьян (250 и 300) показаны сигналы свободного рецептора, которые невозможно объяснить, и которые могут быть обусловлены продукцией антител против H2L5 hIgG4PE у этих обезьян. Кроме того, RO также измеряли в CD4+ клетках периферической крови посредством того же самого анализа, который использовали для селезенки и лимфатических узлов, описанного выше. Как можно было ожидать, для дозы 0 мг/кг не показано RO при этом считывании (фиг. 14-В). Интересно, что для некоторых обезьян при уровнях доз 3,0 и 30 мг/кг показано зависимое от времени увеличение количества CD4+ клеток со связанным H2L5 hIgG4PE на протяжении периода времени обработки. В частности, для животного 350 показано увеличение (в >5 раз) связанных с лекарственным средством циркулирующих CD4+ клеток между сутками 3 и 17 (фиг. 14-В). Возможно, что это увеличение количества CD4+ICOS+ клеток может быть обусловлено индуцированной H2L5 hIgG4PE пролиферацией этой популяции.
Пример 9. H2L5 hIqG4PE индуцирует изменение внутриклеточной передачи сигналов в ответ на связывание.
Экспериментальный препарат(ы).
Линии клеток.
Клетки Ba/F3-ICOS получали из INSERM (Paris, France). Клетки культивировали в подходящей культуральной среде, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), 10 нг/мл рекомбинантным мышиным IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN) и 1 мг/мл генетицина (ThermoFisher, Waltham, MA) при 37°С в увлажненных инкубаторах под 5% СО2.
Экспериментальный способ(ы).
Массив антител для внутриклеточной передачи сигналов.
Белковые лизаты анализировали с использованием набора с массивом для внутриклеточной передачи сигналов PathScan® (Cell Signaling Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. Кратко, лизаты клеток Ba/F3-ICOS, обработанные IgG4-PE (20 мкг/мл) или H2L5 hIgG4PE (0,2, 2, или 20 мкг/мл) в течение 1, 6, 24, и 48 ч, разводили до 1 мкг/мкл в буфере-разбавителе для массива и инкубировали в течение ночи на массивах антител при 4°С. Изображения массивов получали с использованием программного обеспечения для получения изображений (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) фосфо-AKT.
Фосфорилирование АКТ измеряли с использованием Meso Scale Discovery (MSD) с набором для анализа фосфо(Ser473)/общего Akt в лизате цельных клеток и набором для анализа фосфо-Akt (Thr308) в лизате цельных клеток в соответствии с инструкциями изготовителя. Клетки высевали при плотности клеток 0,25x106 клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD Falcon) в подходящей культуральной среде (100 мкл/лунку). Клетки обрабатывали в течение 1, 2, 4, 6, 24 или 48 ч контрольным антителом (IgG4 РЕ), IgG1 против ICOS с инактивированным Fc или H2L5 hIgG4PE в 7 различных концентрациях с использованием схемы 3-кратного разведения (диапазон доз: 20,0-0,03 мкг/мл) в двух повторах лунок. Для одного эксперимента с использованием набора для анализа фосфо-AKT (Thr308) в лизате цельных клеток клетки обрабатывали одной концентрацией всех трех антител (10 мкг/мл) в трех повторах лунок. Нижний ряд каждого 96-луночного планшета содержал контроль без клеток (две пустых лунки в двух повторах) и клетки, оставленные без обработки каким-либо антителом. После обработки клетки лизировали с использованием 30 мкл ледяного буфера для лизиса, содержащего ингибиторы протеазы и фосфатазы, инкубировали на льду в течение 30 мин и затем 25 мкл лизата переносили в планшет для ELISA для инкубации в течение ночи при 4°С.
Анализ данных.
Денситометрический анализ массива антител для внутриклеточной передачи сигналов.
Денситометрический анализ проводили для расчета уровней интегральной интенсивности пятен в массиве антител. Интенсивность для каждого пятна нормализовали по среднему для положительного контроля в массиве (формула=лунка с образцом/среднее для положительного контроля) и наносили на график с использованием GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA).
- 55 036335
Анализ данных MSD ELISA.
Процент фосфобелка рассчитывали для каждой лунки с использованием следующего расчета: % фосфобелка=((2х сигнал фосфобелка)/(сигнал фосфобелка+сигнал общего белка))х100.
Затем это значение нормализовали по значению для необработанных клеток в каждой временной точке и наносили на график как % от контроля в Microsoft Excel 2007.
Результаты.
Предшествующие исследования показали, что обработка H2L5 hIgG4PE увеличивала уровни фосфо-AKT (S473) в клетках Ba/F3-ICOS, где максимальный ответ наблюдали через 30-40 мин после воздействия антитела. В настоящем исследовании уровни фосфо-AKT измеряли в более поздних временных точках, чтобы наблюдать, сохраняются ли увеличенные уровни фосфорилирования через несколько суток. Кроме того, оценивали регуляцию других событий внутриклеточной передачи сигналов посредством активации ICOS. В клетках Ba/F3-ICOS, уровни фосфо-AKT (S473) увеличивались при обработке H2L5 HIGG4PE по сравнению с клетками, обработанными контрольным антителом для изотипа IgG4-PE, после 1 и 6 ч обработки, но этот эффект был утрачен через 24 ч (фиг. 15). Интересно, что сходный эффект наблюдали, когда клетки обрабатывали антителом против ICOS, когда область Fc антитела инактивирована. Увеличенные уровни фосфо-AKT (Т308) также наблюдали в клетках, обработанных H2L5 hIgG4PE и антителом IgG1 против ICOS с инактивированным Fc, по сравнению с клетками, обработанными контрольным антителом для изотипа IgG4-PE (фиг. 15), после 1 ч обработки, и он сохранялся вплоть до 48 ч, представляющих собой последнюю измеренную временную точку. Количество других фосфобелков ниже AKT, киназы 3 альфа гликогенсинтазы (GSK3a) и рибосомального белка S6 также умеренно увеличивались при активации ICOS, но эффекты не были настолько сильными, как наблюдаемые для фосфоAKT. Белковые лизаты анализировали также с использованием массива антител, измеряющих фосфорилирование или расщепление 18 белков, вовлеченных в внутриклеточную передача сигналов. С использованием этого способа только для трех белков показано небольшое увеличение фосфорилирования при активации ICOS: фосфо-AKT (S473), фосфо S6 (S235/236) и фосфо-SAPK/JNK (T183/Y185).
Для измерения изменений фосфорилирования AKT с использованием формата анализа, позволяющего прямое количественное определение, клетки Ba/F3-ICOS обрабатывали с использованием диапазона доз контрольного антитела (IgG4 РЕ), антитела IgG1 против ICOS с инактивированным Fc или H2L5 hIgG4PE с течением времени и мониторировали посредством ELISA. Увеличенные уровни фосфо-AKT (S473) являлись как зависимыми от дозы, так и зависимыми от времени, в клетках, обработанных антителом IgG1 против ICOS с инактивированным Fc, или обработанных H2L5 hIgG4PE. Как описано ранее, максимальная активация фосфо-AKT (S473) происходила после 1 ч обработки. Сигнал фосфорилирования немного уменьшался через 2 ч и сохранялся вплоть до 6 ч, однако в конечном счете был утрачен через 24 ч. Проводили также тесты ELISA, измеряющего уровни фосфо-AKT (Т308), однако невозможно было наблюдать воспроизводимой активации с использованием этого набора для ELISA.
Обсуждение.
Каскад передачи сигнала AKT можно активировать посредством рецепторов тирозинкиназ, интегринов, В- и Т-клеточных рецепторов, рецепторов цитокинов, сопряженных с G-белком рецепторов и других стимулов, индуцирующих продукцию фосфатидилинозитол(3,4,5)трифосфатов (PIP3) посредством PI3K [Carnero, 2008]. Эти липиды служили участками причаливания на плазматической мембране для Akt и его вышестоящего активатора PDK1. На мембране, PDK1 фосфорилирует AKT на Thr308, приводя к частичной активации Akt [Alessi, 1996]. Фосфорилирование Akt на Ser473 посредством mTORC2 стимулирует полную ферментативную активность [Sarbassov, 2005].
ICOS играет ключевую роль в функционировании активированных эффекторных и регуляторных CD4+ Т-клеток посредством стимуляции выживаемости, пролиферации и памяти Т-клеток. Благодаря его роли в длительной активации и эффекторных функциях Т-клеток, нацеливание на ICOS с использованием агонистического антитела может являться оправданным способом усиления противоопухолевого иммунитета. В этом исследовании авторы настоящего изобретения наблюдали, что активация ICOS посредством H2L5 hIgG4PE вызывала изменения фосфорилирования АКТ в клетках Ba/F3-ICOS. Следовательно, белки ниже AKT, такие как GSK3a (непосредственный субстрат AKT) и рибосмальный белок S6 также являлись фосфорилированными. Эти данные согласуются с исследованием, проведенным недавно в этой модельной системе, и наряду с данными, опубликованными для внешнего использования [Fos, 2008].
Пример 10. Функциональные эффекты растворимого H2L5 hIqG4PE отдельно и в комбинации с антителом против PD1 и антителом против CTLA-4 в анализе РВМС человека.
Экспериментальный препарат(ы).
Выделение первичных РВМС человека.
Свежую кровь получали от доноров крови GSK Health Center и разводили 1:1 не содержащей фенола красного 10% средой RPMI1640. Среды с градиентом плотности в 50-мл конической пробирке Uni-Sep Max и центрифугировали при 400xg в течение 20 мин при комнатной температуре с отключенным тормозом. Полученный слой белых мононуклеарных клеток (лейкоцитарную пленку) осторожно переносили
- 56 036335 в новую 50-мл коническую пробирку через клеточное сито 100 мкм. Равный объем, не содержащей фенола красного 10% среды RPMI1640, добавляли к лейкоцитарной пленке и центрифугировали при 300xg в течение 10 мин при комнатной температуре. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл раствора для лизиса эритроцитов (Sigma Aldrich) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Клетки промывали один раз средой и центрифугировали, как описано ранее. Объем доводили до 40 мл с использованием не содержащей фенола красного 10% среды RPMI1640, и клетки подсчитывали с использованием счетчика клеток и анализатора жизнеспособности Vicell (Beckman Coulter).
Индукция незрелых дендритных клеток моноцитарного происхождения (iDC).
Моноциты человека выделяли с использованием способа адгезии к пластику. Кратко, 20 млн свежевыделенных РВМС культивировали в флаконе Т-75 для культвирования клеток в среде AIM-V (Thermo Fisher) в течение 3 ч. Клетки, которые не связываются с пластиком, отмывали. Адгерентные моноциты культивировали при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 в среде AIM-V, дополненной 1000 ед./мл GM-CSF человека (кат.#300-03, PeproTech) и 500 ед./мл IL-4 человека (кат. #200-04). Через 7-10 суток клетки iDC собирали для совместного культивирования с Т-клетками от другого донора в анализе реакций в аллогенной смешанной культуре лимфоцитов.
Выделение первичных Т-клеток человека непосредственно из крови.
Т-клетки человека выделяли непосредственно из свежей крови человека с использованием смеси для обогащения Т-клеток человека (Stem Cell Technologies). Смесь для обогащения Т-клеток человека RosetteSep (50 мкл/мл) добавляли к цельной крови и хорошо перемешивали. После 20 мин инкубации при комнатной температуре равный объем PBS+2% FBS добавляли с осторожным перемешиванием. Разведенный образец наслаивали поверх среды с градиентом плотности и центрифугировали в течение 20 мин при 1200xg при комнатной температуре с отключенным тормозом. Обогащенные клетки с границы раздела среда с градиентом плотности:плазма осторожно переливали в новую коническую пробирку. Затем эритроциты лизировали с использованием буфера для лизиса эритроцитов (Sigma Aldrich), и обогащенные клетки промывали с использованием PBS+2% FBS дважды. Затем Т-клетки ресуспендировали в 40 мл PBS+2% FBS и подсчитывали в счетчике клеток Vi-Cell.
Экспериментальные способы.
Анализ предварительной стимуляции РВМС человека.
Свежевыделенные РВМС человека подвергали предварительной стимуляции с использованием увеличивающих объем Т-клеток DynaBeads CD3/CD28 в соотношении бусин к клеткам 1:20 в флаконе Т75 для культивирования клеток в среде AIM-V, дополненной 100 нг/мл MCSF и 100 МЕ/мл IL-2 (PeproTech) при 37°С. Через 48 ч бусины для предварительной стимуляции удаляли с помощью магнитного поля, и клетки промывали, подсчитывали и повторно стимулировали с использованием DynaBeads против CD3 и терапевтических антител в среде AIM-V, дополненной 100 МЕ/мл IL-2 (PeproTech) в 96луночном круглодонном планшете, не обработанном для культивирования клеток. Плотность рассева составляла 100000 клеток на 100 мкл среды на лунку. После инкубации при 37°С в течение 3,5 суток супернатанты культур клеток собирали для мультиплексного измерения цитокинов посредством MSD.
Анализ активации MLR человека.
iDC моноцитарного происхождения от здорового добровольца-человека смешивали в соотношении 1:10 (iDC: T) со свежевыделенными Т-клетками человека от другого донора и предварительно инкубировали при 37°С в среде AIM-V в присутствии 0,02 мкг/мл смеси пептидов CEFT в течение 24 ч. Различные группы антител для обработки добавляли непосредственно в лунки, перемешивали и далее инкубировали в течение дополнительных 4 суток. Супернатанты культур клеток собирали для мультиплексного измерения цитокинов посредством анализа MSD.
Анализ цитокинов MSD.
Уровни цитокинов IFN-γ, IL-10, IL-2 и TNF-α в супернатанте культур клеток определяли с использованием сконструированных на заказ наборов для MSD V-Plex человека. Образцы сначала разводили 1:200 в разбавителе 2. Калибраторы также подготавливали в разбавителе 2, следуя рекомендациям изготовителя. Разведенные образцы и калибраторы добавляли в черные планшеты MSD, которые затем герметично закрывали с использованием адгезивной пленки для планшетов и инкубировали при комнатной температуре с встряхиванием в течение 2 ч. После добавления 25 мкл раствора антитела для детекции, свежеприготовленного в разбавителе 2, в каждую лунку, планшет повторно закрывали и инкубировали при комнатной температуре с встряхиванием в течение других 2 ч. Планшеты промывали 3 раза с использованием 150 мкл/лунку PBS плюс 0,05% Tween-20 перед добавлением 150 мкл/лунку свежеразведенного 2х буфера для считывания и немедленно считывали в считывателе MESO QuickPlex. Данные анализировали с использованием программного обеспечения MSD Workbench.
Анализ данных.
Анализ данных MSD.
Данные MSD анализировали с использованием программного обеспечения Discovery Workbench (MSD, версии 4.0.9). Калибраторы из набора изготовителя включали в каждый планшет для MSD для получения специфических для планшетов стандартных кривых с значением R2 более 0,99 во всех случа- 57 036335 ях. Количество детектированных цитокинов определяли посредством обратных вычислений на основании стандартной кривой, и среднее и стандартное отклонение для трех биологических повторов использовали для получения графиков.
Статистический анализ.
Однофакторный ANOVA проводили для логарифмически преобразованных данных изменения кратности по сравнению с собственным контролем изотипа для каждого антитела для обработки. Тест множественного сравнения Даннетта проводили для сравнения обоих видов монотерапии по сравнению с комбинацией для различных доноров. Р<0,05 считали статистически значимым.
Результаты.
Разработка анализа предварительной стимуляции РВМС и теста комбинированной активности H2L5 hIgG4PE с ипилимумабом и пембролизумабом.
Для определения оптимальных условий для предварительной стимуляции, Dynabeads против CD3 человека и Dynabeads против CD3/CD28 человека (Thermo Fisher) тестировали при различном соотношении бусин к клеткам. После 48 ч предварительной стимуляции, клетки собирали, и бусины удаляли посредством магнитного поля перед стимуляцией с использованием Dynabeads против CD3 (соотношение бусин к клеткам=1:1) вместе с антителом против ICOS отдельно или в комбинации с антителом против CTLA-4 или антителом против PD1. Монотерапия H2L5 hIgG4PE приводила к индукции IFN-γ по сравнению с контролем для изотипа во всех тестированных условиях предварительной стимуляции. Диапазон уровня IFN-γ, индуцированный посредством H2L5 hIgG4PE, обратно коррелировал с силой предварительной стимуляции. Для комбинации H2L5 hIgG4PE вместе с ипилимумабом показана увеличенная продукция цитокинов по сравнению либо с H2L5 HIGG4PE, либо с ипилимумабом отдельно, в РВМС, которые слабо подвергались предварительной стимуляции. Комбинированный эффект был утрачен в условиях предварительной стимуляции связанными с планшетом антителами против CD3/антителами против CD28, что рассматривали как более сильные условия предварительной стимуляции. На основании этих результатов условия предварительной стимуляции с использованием бусин с антителами против CD3/антителами против CD28 в соотношении бусин к клеткам 1:20 выбраны для всех будущих анализов РВМС. Результаты для четырех индивидуальных доноров обобщены для комбинации антител против CTLA-4 на фиг. 16 и для комбинации с антителом против PD-1 на фиг. 17.
H2L5 hIqG4PE приводит к зависимой от дозы индукции цитокинов в анализе предварительной стимуляции РВМС.
Зависимую от дозы активность H2L5 hIgG4PE оценивали в РВМС человека, подвергнутых предварительной стимуляции с использованием бусин с антителами против CD3/антителами против CD28 в предопределенном соотношении бусин к клеткам 1:20. Антитело против RSV IgG4PE и IgG1 422.2 против ICOS с инактивированным Fc включали в качестве контроля. Тестировали восемь концентраций H2L5 HIGG4PE (100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл). IFN-γ, IL-10 и TNF-α оценивали посредством MSD в культуральных супернатантов образцов РВМС. H2L5 hIgG4PE, но не контроль для изотипа IgG4 или 422.2 с инактивированным Fc, индуцировало продукцию IFN-γ, IL-10 и TNF-α зависимым от дозы образом. Эти результаты использовали для определения концентрации H2L5 hIgG4PE для использования в комбинационных исследованиях.
Разработка анализа MLR человека.
В попытке оптимизировать анализ MLR человека, в дополнение к совместному культивированию Т-клеток человека и незрелых DC моноцитарного происхождения от другого донора, бусины с антителами против CD3 также добавляли в лунки для обеспечения фоновой стимуляции TCR, чтобы способствовать примированию клеток. Результаты показали, что бусины с антителами против CD3 сильно увеличивали диапазон индукции IFN-γ. Хотя ипилимумаб отдельно может индуцировать продукцию IFN-γ в отсутствие бусин с антителами против CD3, для H2L5 hIgG4PE отдельно или для комбинации H2L5 HIGG4РЕ/ипилимумаба показана увеличенная продукция IFN-γ по сравнению с соответствующим контролем только в присутствии бусин с антителами против CD3.
Комбинированная активность H2L5 HIGG4PE и ипилимумаба в анализе MLR человека.
Иммуностимулирующую активность H2L5 hIgG4PE отдельно или в комбинации с ипилимумабом тестировали в аллогенном анализе MLR человека, в котором Т-клетки предварительно инкубировали с незрелыми DC моноцитарного происхождения от несовпадающего донора в присутствии 0,02 мкг/мл пептидов CEFT в течение 1 суток. Комбинация H2L5 hIgG4PE/ипилимумаба приводила к значимому увеличению продукции IFN-γ по сравнению с любым из средств отдельно. Результаты согласовывались среди трех тестированных пар доноров; однако наблюдали умеренную изменчивость между донорами (фиг. 18).
Комбинированная активность H2L5 hIqG4PE и пембролизумаба в анализе MLR.
Комбинацию H2L5 hIgG4PE и пембролизумаба тестировали также в аллогенном анализе MLR человека, описанном выше. H2L5 hIg G4PE тестировали отдельно и в комбинации с пембролизумабом при 10 мкг/мл. Комбинация H2L5 hIg G4PE и пембролизумаба приводила к увеличению продукции IFN-γ по сравнению с любым из средств отдельно. Однако статистической значимости не достигали из-за измен- 58 036335 чивости между донорами и значительной активности монотерапии антителом против PD-1 у некоторых доноров (фиг. 19).
Обсуждение.
ICOS представляет собой костимулирующий рецептор, который слабо экспрессируется на наивных Т-клетках и быстро подвергается повышающей регуляции в активированных CD4+ и CD8+ Т-клетках. Лигандом для ICOS является ICOS-L (B7h, B7RP-1, CD275), который экспрессируется профессиональными АРС и периферическими эпителиальными и эндотелиальными клетками после стимуляции TNF-α. Путь ICOS:ICOS-L предоставляет ключевой костимулирующий сигнал для пролиферации и функционирования Т-клеток. Благодаря его роли в длительной активации и эффекторных функциях Т-клеток, нацеливание на ICOS с использованием агонистических антител может являться оправданным способом усиления противоопухолевого иммунитета.
Исследования показали увеличение частоты ICOS™3 CD4 + эффекторных Т-клеток после блокирования CTLA-4 посредством ипилимумаба в нескольких моделях злокачественных опухолей. Кроме того, после блокирования CTLA-4, эта популяция клеток продуцировала более высокие уровни INF-γ, чем ICOS™3 CD4+ Т-клетки. Фактически, увеличение частоты ICOS+ CD4 Т-клеток идентифицировано в качестве фармакодинамического биомаркера для лечения ипилимумабом пациентов со злокачественными опухолями. Исследования у мышей C57BL/6 дикого типа, показали 80-90% отторжение опухоли после терапии с блокированием CTLA-4; однако у мышей с нокаутом ICOS или ICOSL эффективность уменьшалась до менее 50%. Важная роль, которую ICOS играет в эффективности блокирования CLTA-4, позволяет предполагать, что стимуляция пути ICOS в ходе терапии антителом против CTLA-4 может увеличивать терапевтическую эффективность. Таким образом, авторы настоящего изобретения разработали оценку комбинированной активности H2L5 hIgG4PE и ипилимумаба.
В 2000 г. опубликовано, что белок-1 программируемой гибели клеток (PD-1) является другой молекулой иммунной контрольной точки. Экспрессию PD-L1 (В7-Н1), который является одним из лигандов PD-1, можно обнаружить на множестве типов клеток, включая Т-клетки, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и клетки опухолей. Во множестве типов опухолей показаны также клинические ответы на антитела, нацеленные против оси PD-1/PD-L1. В FDA недавно одобрены пембролизумаб и ниволумаб в качестве второго поколения блокаторов иммунных контрольных точек для лечения злокачественных опухолей. Показано, что пембролизумаб от Merck приводит к частоте ответов ~37-38% у пациентов с меланомой на поздних стадиях, где в последующем исследовании опубликована общая частота ответов 26% у пациентов, имеющих прогрессирующее заболевание после предшествующей терапии ипилимумабом. Для ниволумаба антитела против PD-1 от BMS, также показано клиническое преимущество для пациентов с метастазирующей меланомой с частотой ответов 40% и частотой общей выживаемости 72,9% за 1 год. Кроме того, ниволумаб также одобрен FDA при находящемся на поздних стадиях или метастазирующем немелкоклеточном раке легкого. Поскольку антитела против PD-1, блокирующие контрольную точку, становятся преобладающей иммунотерапией злокачественных опухолей в клинике, может являться важной оценка H2L5 hIgG4PE в комбинации с антителом против PD-1 по их комбинированной противоопухолевой активности.
Ранее, анализ активации РВМС разработали и использовали для оценки активности стимуляции Тклеток для панели агонистических антител против ICOS. Данные, полученные в этих исследованиях, поддерживают отбор клона 422.2 в качестве кандидата с изотипом IgG4PE в форме H2L5 hIgG4PE. В предшествующем анализе, клетки РВМС подвергали предварительной стимуляции с использованием связанных с планшетом антитела против CD3 при 1 мкг/мл и антитела против CD28 при 3 мкг/мл в течение 48 ч перед тем, как их собирали и повторно стимулировали с использованием антител против CD3 и растворимых антител против ICOS, которые исследовали. Показано, что H2L5 hIgG4PE индуцировало продукцию IFN-γ зависимым от дозы образом. Для определения оптимальных условий для предварительной стимуляции, Dynabeads против CD3 человека и Dynabeads против CD3/CD28 человека (Thermo Fisher) тестировали при различном соотношении бусин к клеткам. Стимуляцию посредством бусин считают более физиологической, и силу стимуляции можно более просто контролировать посредством разработки различного соотношения бусин к клеткам. После 48 ч предварительной стимуляции, клетки собирали, и бусины удаляли посредством магнитного поля перед стимуляцией с использованием Dynabeads против CD3 (соотношение бусин к клеткам=1:1) вместе с антителом против ICOS отдельно или в комбинации с антителом против CTLA-4. Результаты показали, что монотерапия H2L5 hIgG4PE приводила к индукции IFN-γ по сравнению с контролем для изотипа во всех тестированных условиях предварительной стимуляции. Диапазон уровня IFN-γ, индуцированный посредством H2L5 hIgG4PE, обратно коррелировал с силой предварительной стимуляции. Для комбинации H2L5 hIgG4PE вместе с ипилимумабом показана увеличенная продукция цитокинов по сравнению либо с H2L5 hIgG4PE, либо с ипилимумабом отдельно, в РВМС, которые слабо подвергались предварительной стимуляции. Комбинированный эффект был утрачен в условиях предварительной стимуляции связанными с планшетом антителами против CD3/антителами против CD28, что рассматривали как более сильные условия предварительной стимуляции. На основании этих результатов условия предварительной стимуляции с использованием
- 59 036335 бусин с антителами против СЭЗ/антителами против CD28 в соотношении бусин к клеткам 1:20 выбраны для всех будущих анализов РВМС. Для комбинации H2L5 hIgG4PE и ипилимумаба показано статистически значимое увеличение продукции IFN-γ по сравнению с обработкой любым из антител отдельно.
В попытке оптимизировать анализ с соотношением бусин к клеткам при стимуляции антителами против CD3/антителами против CD28, фиксированным на 1:20, количество бусин с антителами против CD3, используемых на стадии повторной стимуляции, титровали с понижением соотношения бусин к клеткам от 1:1 до 1:3 и 1:10. Результаты показали, что снижение силы повторной стимуляции приводило к снижению индукции IFN-γ посредством H2L5 hIgG4PE. Комбинированный эффект H2L5 hIgG4PE и ипилимумаба был полностью утрачен при повторной стимуляции с соотношением бусин к клеткам 1:3 и 1:10. Таким образом, для повторной стимуляции антителами против CD3 соотношение бусин к клеткам 1:1 сохраняли для будущих экспериментов.
С оптимизированными условиями предварительной стимуляции и повторной стимуляции этот анализ использовали для оценки ответа в зависимости от дозы H2L5 hIgG4PE. Всего тестировали 8 концентраций антител, которые составляли 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл. Антитело против RSV IgG4PE и IgG1 против ICOS 422.2 с инактивированным Fc, вариант H2L5 hIgG4PE с инактивированным Fc, использовали в качестве контроля. Результаты показали, что H2L5 hIgG4PE, но не контроль для изотипа IgG4 или 422.2 с инактивированным Fc, индуцировало продукцию IFN-γ, IL-10 и TNF-α зависимым от дозы образом. Интересно, что для варианта H2L5 hIg G4PE с инактивированным Fc показан ограниченный ответ индукции цитокинов, указывающий на то, что привлечение рецептора Fc является критическим для агонистической функции H2L5 hIg G4PE по отношению к Т-клеткам. Эти результаты использовали также для определения дозы H2L5 hIg G4PE для комбинированных исследований.
Анализ реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR) также разработали для оценки комбинированного эффекта H2L5 hIg G4PE и блокирующих контрольную точку антител. Анализ MLR представляет собой иммунный анализ клеток ex vivo, в котором первичные незрелые дендритные клетки (iDC) моноцитарного происхождения смешивали с Т-клетками, выделенными от другого донора. Несовпадение молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности клеток iDC может инициировать стимуляцию Т-клеток в аллогенных условиях. В клинике, анализ MLR хорошо известен для идентификации совместимости трансплантатов тканей между донорами и реципиентами.
Для разработки анализа MLR свежие моноциты человека культивировали в среде, дополненной рекомбинантными GM-CSF и IL-4 человека в течение недели для индукции фенотипа незрелых DC. Затем свежие Т-клетки человека от другого донора выделяли и смешивали с клетками iDC в соотношении 10:1 (T:iDC). Монотерапевтическую обработку или комбинированную обработку H2L5 hIg G4PE и ипилимумабом добавляли к совместному культивированию Т-клеток/iDC в присутствии или в отсутствие бусин с антителами против CD3. Предназначением бусин с антителами против CD3 являлось обеспечение фонового стимула TCR, чтобы способствовать примированию Т-клеток. Результаты показали, что бусины с антителами против CD3 сильно увеличивали диапазон индукции IFN-γ в анализе. Хотя ипилимумаб отдельно может индуцировать продукцию IFN-γ в отсутствие бусин с антителами против CD3, для H2L5 hIgG4PE отдельно или для комбинации H2L5 hIgG4РЕ/ипилимумаба показано увеличение продукции IFN-γ по сравнению с соответствующим контролем в присутствии бусин с антителами против CD3. Этот результат позволяет предполагать, что в этом анализе, стимуляция TCR только посредством клеток DC может являться недостаточной для индукции экспрессии ICOS на поверхности покоящихся Т-клеток, свежевыделенных из РВМС. Для улучшения ситуации, стадию 24-часовой предварительной инкубации с iDC и Т-клетками добавляли перед добавлением терапевтических антител. Смесь пептидов CEFT также добавляли к процедуре анализа для лучшего примирования Т-клеток и для стимуляции антигенспецифического ответа. Пул пептидов CEFT состоит из 27 пептидов, выбранных из рестрицированных по определенным HLA классов I и II Т-клеточных эпитопов из цитомегаловируса человека (HHV-5; CMV), вируса Эпштейна-Барр (HHV-4; EBV), вируса гриппа А и Clostridium tetani. Принимая во внимание высокую частоту вакцинации против гриппа и Clostridium tetani, и высокую встречаемость CMV и EBV в общей популяции, повторные ответы на антиген являлись ожидаемыми для большинства образцов человека. Результаты показали, что увеличенную продукцию IFN-γ наблюдали, когда Т-клетки предварительно инкубировали с клетками iDC в течение 24 ч, и продукция IFN-γ дополнительно увеличивалась, когда пептиды CEFT добавляли в систему совместного культивирования. Иммуностимулирующую активность H2L5 hIgG4PE отдельно или в комбинации с ипилимумабом тестировали в аллогенном анализе MLR человека, в котором Т-клетки предварительно инкубировали с незрелыми DC моноцитарного происхождения от несовпадающего донора в присутствии 0,02 мкг/мл пептидов CEFT в течение 1 суток. Комбинация H2L5 hIgG4РЕ/ипилимумаба приводила к значимому увеличению продукции IFN-γ production по сравнению с любым из средств отдельно. Результаты согласовывались среди трех тестированных пар доноров; однако наблюдали умеренную изменчивость между донорами.
Подобным образом, комбинацию H2L5 hIgG4PE и пембролизумаба тестировали также в аллогенном анализе MLR человека, описанном выше. H2L5 hIgG4PE тестировали отдельно и в комбинации с пембролизумабом при 10 мкг/мл. Комбинация H2L5 hIgG4PE и пембролизумаба приводила к увеличе- 60 036335 нию уровня IFN-γ по сравнению с любым из средств отдельно. Однако статистическая значимость не была достигнута из-за высокой изменчивости между донорами и значительной активности монотерапии антителом против PD-1 у некоторых доноров.
В общем, эти исследования показали превосходную комбинированную активность H2L5 hIgG4PE с двумя одобренными FDA-ингибиторами контрольных точек, ипилимумабом и пембролизумабом, по сравнению с монотерапией в двух анализах на основе иммуноцитов человека. В исследованиях, опубликованных в настоящем описании, показано, что H2L5 hIgG4PE стимулирует активацию Т-клеток и сдвиг в сторону ТН1 (например, продукцию IFN-γ), которые являются характерными для продуктивных противоопухолевых иммунных ответов.
Пример 11. Функциональная активность H2L5 hIqG4PE отдельно и в комбинации с антителами против PD1 и против CTLA-4 In vivo.
Модель опухоли РВМС человека на мышах.
Способы.
Экспериментальные препараты.
Все процедуры на животных проверены и одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных GSK до начала протокола исследований.
Получение линий клеток.
А2058 размножали в соответствии с протоколом АТСС.
Материалы:
линия клеток меланомы человека А2058: АТСС, кат. # CRL-11147, партия #59349362,
DPBS: ATCC, кат. #30-2200, партия #63357436.
Модифицированная по способу Дульбекко среда Игла: АТСС, кат. # 30-2002, партия # 62596471, истечение срока действия: октябрь 2015 г.
Эмбриональная бычья сыворотка: Sigma-Aldrich, кат. #12176с-1000 ml, партия # 13G180R0H1, истечение срока действия: July-2018.
0,25% (мас./об.) Трипсин-0,53 мМ ЭДТА: АТСС, кат. #30-2102, партия #62420300.
Антибиотик-противогрибковое средство (100Х): Life, Technologies, кат. # 15240-062.
Флакон для культивирования клеток Т175: Greiner bio-one, кат. # 661175.
Флакон для культивирования клеток Т75: Greiner bio-one, кат. # 658175.
Среда.
Полная среда для роста А2058: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла+10% FBS. Условия культивирования: атмосфера: воздух, 95%; 5% диоксид углерода (СО2); температура: 37°С.
При получении клеток:
предварительно нагреть полную среду при 37°С, быстро разморозить клетки при 37°С в водяной бане. Протереть пробирку 70% этанолом и перенести клетки в 15-мл пробирку, заполненную предварительно нагретой полной средой, центрифугировать при 1200 об/мин в течение 5 мин для сбора осадка клеток, перенести клетки обратно в Т75 флакон, заполненный предварительно нагретой полной средой, и инкубировать при 37°С.
Субкультивирование клеток.
Объемы приведены для флакона 75 см2 (для флакона Т175 см2, пропорционально изменить количество необходимой среды для диссоциации и культивирования).
Удалить и отбросить культуральную среду.
Быстро промыть слой клеток DPBS для удаления всех следов сыворотки, содержащей ингибитор трипсина.
Добавить 2,0-3,0 мл раствора трипсина-ЭДТА на флакон и наблюдать клетки под инвертированным микроскопом до диспергирования слоя клеток (2-3 мин).
Примечание: чтобы избежать слипания, не перемешивать клетки постукиванием или встряхиванием флакона во время ожидания открепления клеток. Клетки, которые трудно открепить, можно помещать при 37°С для облегчения диспергирования.
Добавить 10 мл полной среды для роста и отобрать клетки осторожным пипетированием.
Центрифугировать при 1200 об/мин в течение 5 мин для сбора осадка клеток, добавить 10 мл полной среды для роста.
Добавить соответствующие аликвоты суспензии клеток в новые культуральные флаконы. Инкубировать культуры при 37°С.
Обновление среды: каждые 2-3 суток.
Подготовка клеток опухолей для инокуляции мышам.
Промыть клетки 1X DPBS, добавить 3 мл 1X трипсина на 2-3 мин.
Добавить полную среду для роста и собрать суспензию клеток в стерильные конические пробирки для центрифугирования в ламинарном шкафу для культивирования клеток.
Центрифугировать клетки при 1200 об/мин в течение 5 мин для получения осадка клеток.
- 61 036335
Промыть клетки 1X раствором DPBS, центрифугировать при 1200 об/мин в течение 5 мин для получения осадка клеток. Повторить промывку 2 раза.
Подсчитать клетки посредством гемоцитометра для определения количества и жизнеспособности клеток.
Ресуспендировать клетки в ледяном PBS в концентрации для инокуляции in vivo (A2058, 2,5е7/мл, 2,5е6/100 мкл/мышь).
Инокуляция линии клеток опухоли мышам NSG.
Материалы.
Мыши: NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ. The Jackson Laboratory, исходная колония: 005557, самки в возрасте 6 недель.
Шприцы с 1 мл туберкулина с присоединенной иглой 25 G 5/8: Becton Dickinson, кат. # 305554.
Спиртовые салфетки PDI™: Professional Disposables, кат. # В339.
Салфетки с повидоном-иодом PDI™: Professional Disposables, кат. # В40600.
Подготовка мышей.
Возраст мышей должен составлять 6 недель.
Обеспечить период акклиматизации 3-5 суток после прибытия мышей.
Побрить нижнюю часть правого бока мышей.
Подготовка инъекции.
Очистить и стерилизовать область инокуляции у мышей с использованием салфетки с иодом, затем салфетки с этанолом.
Использовать шприц 1 см3 и иглу 25 калибра.
Вынуть поршень, перемешать клетки и добавить 100 мкл клеток в заднюю часть шприца, осторожно вставить поршень.
Инъецировать клетки подкожно (s.c.) into the нижнюю часть правого бока мышей.
Оценка роста опухолей.
Для измерения опухоли увлажнить мех 70% этанолом, чтобы упростить обнаружение границ опухоли. Измерять размер опухоли и массу тела каждые 2-3 суток.
Размер опухоли измеряют с использованием цифрового штангенциркуля, и объем определяют следующим образом: объем опухоли (мм3)=(длина)х(ширина)2/2.
Внутривенное введение РВМС человека.
Введение РВМС человека можно начинать через 1 неделю после того, как опухоли достигнут среднего размера приблизительно 100 мм3.
Материалы.
Свежие РВМС человека: Allcells, кат. # С-РВ102-3В2.
Шприцы с 1 мл туберкулина с присоединенной иглой 25 G 5/8: Becton Dickinson, кат. # 305554.
Спиртовые салфетки PDI™: Professional Disposables, кат. # В339.
Салфетки с повидоном-иодом PDI™: Professional Disposables, кат. # В40600.
Марлевые тампоны: Covidien, кат. # 441211.
Фиксатор хвоста мышей с подсветкой: Braintree scientific, cat#MTI STD.
Подготовка РВМС.
Свежие РВМС человека закупают в Allcells с доставкой в течение ночи.
Центрифугировать клетки при 1400 об/мин в течение 5 мин для получения осадка клеток.
Промыть клетки 1X раствором DPBS, центрифугировать при 1400 об/мин в течение 5 мин для получения осадка клеток.
Ресуспендировать клетки в ледяном PBS в концентрации для инокуляции in vivo (20е7/мл).
Использовать шприц 1 см3 и иглу 25 калибра.
Вынуть поршень, перемешать клетки и добавить 100 мкл клеток в заднюю часть шприца, осторожно вставить поршень.
Сохранять клетки на льду.
Инъекция в хвостовую вену.
Согреть мышей с помощью лампы накаливания 5 мин.
Фиксировать мышей с использованием фиксатора хвоста мышей с подсветкой.
Медленно поворачивать хвост для визуализации вены.
Очистить и стерилизовать область инъекции с использованием салфетки с иодом, затем салфетки с этанолом.
Вставить иглу в вену под небольшим углом и инъецировать клетки.
Удалить иглу и приложить осторожное нажатие с использованием марлевого тампона до остановки кровотечения.
Вернуть животных в их клетки и наблюдать в течение 5-10 мин, чтобы убедиться, что кровотечение не возобновилось.
Введение терапевтического антитела.
- 62 036335
Через 1-3 суток после инъекции РВМС человека мышам вводили антитела посредством внутрибрюшинной инъекции.
Материалы.
Контроль изотипа для полностью человеческого IgG1: Eureka therapeutics, кат. #ЕТ-901 (квалификации для доклинических исследований) партия #15-726, истечение срока действия: февраль 2017 г.
Ипилимумаб (ервой): Bristol-Myers Squibb NDC 0003-2327-11, партия #921873, истечение срока действия: апрель 2015 г.; партия #4Н69490, истечение срока действия: май 2016 г.
Контроль изотипа для полностью человеческого IgG4: Eureka therapeutics, кат. #ЕТ904(квалификации для доклинических исследований) партия #15-726 истечение срока действия: февраль 2017 г.
Антиитело против ICOS человека H2L5 hIgG4PE.
Пембролизумаб (кейтруда): Merck, NDC 0006-3026-02, партия # L010592, истечение срока действия: 26 апреля 2016 г.
Внутрибрюшинная инъекция.
Набрать, в шприц и иглу, 100 мкл подлежащего введению материала.
Выровнять скос иглы со шкалой шприца.
Достаточно сильно фиксировать животное своей не ведущей рукой.
Ввести кончик иглы: провести воображаемую линию поперек живота непосредственно над коленями, иглу следует вводить по этой линии с правой стороны животного и близко к средней линии. Поскольку это самка, можно видеть, что точка ввода находится по направлению к голове и немного к середине от последнего соска.
Наклонить мышь головой немного к полу, чтобы ее голова была ниже ее крестца.
Вставить иглу в брюшную полость под углом приблизительно 30°.
Стержень иглы должен войти на глубину приблизительно полсантиметра.
После инъекции, извлечь иглу и вернуть мышь в ее клетку.
Отбор образцов крови и опухоли.
Материалы.
Microvette CB300 (для сыворотки): Braintree Scientific, кат. # MV-CB300 16440.
Microvette CB300 (для гематологии/ЭДТА калия): Braintree Scientific, кат. # MV-CB300 16444. Кровь.
У мышей отбирали кровь из хвостовой вены один раз в неделю.
мкл крови собирали в Microvette CB300 (для гематологии/ЭДТА калия) для анализа проточой цитометрии.
Другие 30 мкл крови собирали в Microvette CB300 для сыворотки и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре для обеспечения свертывания крови с последующим центрифугированием при 2000xg для сбора сыворотки. Сыворотку сохраняли при -20° до дальнейшего анализа.
Опухоль.
Мышей подвергали эвтаназии, когда размер опухоли достигал 2000 мм3. Опухоли собирали и перерабатывали следующим способом.
Дизайн эксперимента.
Все исследования подготавливали в соответствии со способами, перечисленными выше.
Ответ в зависимости от дозы H2L5 hIqG4PE.
Это исследование разработано для определения зависимой от дозы активности H2L5 hIgG4PE у мышей NSG с трансплантацией РВМС человека, с имплантацией опухолей меланомы А2058. 9 групп из 10 мышей на группу и 1 контрольную группу (только опухоль без РВМС) из 7 мышей назначали для каждого исследования. Обобщение режима обработки для ответа в зависимости от дозы с использованием РВМС человека от донора #7129 представлено в табл. 11. H2L5 hIgG4PE вводили в дозах 0,04, 0,4, 1,2 и 4 мг/кг. Ипилимумаб вводили в дозе 3 мг/кг, и вариант агонистического антитела против ICOS с инактивированным Fc тестировали при 1 мг/кг. Тестируемые группы оценивали относительно контрольных групп носителя и совпадающих по изотипу контрольных групп. Анализ выживаемости проводили на сутки 49 при завершении исследования.
- 63 036335
Таблица 11
Обобщение режима обработки для ответа в зависимости от дозы H2L5 hIgG4PE у мышей
Группы Обработка 1 Обработка 2 # мышей/ группу Дозирование
1 Опухоль+huPBMC (донор #7129) Носитель 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
2 Опухоль+huPBMC (донор #7129) IgGl человека Isotype (Змг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
3 Опухоль+huPBMC (донор #7129) Ипилимума б(Змг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
4 Опухоль+huPBMC (донор #7129) IgG4 человека (4 мг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
5 Опухоль+huPBMC (донор #7129) H2L5 hIgG4PE (0,04 мг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
6 Опухоль+huPBMC (донор #7129) H2L5 hIgG4PE (0,4 мг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
7 Опухоль+huPBMC (донор #7129) H2L5 hIgG4PE (1,2 мг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
8 Опухоль+huPBMC (донор #7129) H2L5 hIgG4PE (4 мг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
9 Опухоль+huPBMC (донор #7129) Антитела против ICOS с инактивированным Ес (1мг/кг) 10 Дважды в неделю в течение 3 недель
10 Опухоль (по РВМС) (донор #7129) Без обработки 7 Дважды в неделю в течение 3 недель
Исследование эффективности и фармакодинамической (PD) активности с использованием H2L5 hIqG4PE в комбинации с ипилимумабом и пембролизумабом.
Цели исследования.
Оценка противоопухолевой активности монотерапии H2L5 hIgG4PE, введенной в дозах 0,04 и 0,4 мг/кг.
Для оценки противоопухолевой активности вводили дозы H2L5 hIgG4PE в комбинации с ипилимумабом или пембролизумабом с совпадающим по изотипу контролем.
Сбор ткани для дальнейшего исследования фармакодинамической активности H2L5 hIgG4PE. Всего 22 группы обработки из 10 мышей на группу назначали для этого исследования. Группы 1-16 представляли собой когорты эффективности и 17-22 представляли собой когорты фармакодинамической активности.
Для комбинированной обработки вводили дозы H2L5 hIgG4PE (0,04 или 0,4 мг/кг) и ипилимумаба или IgG1 (3 мг/кг), или H2L5 hIgG4PE (0,04 или 0,4 мг/кг) и пембролизумаба или IgG4 (5 мг/кг). Дозы H2L5 hIgG4PE и ипилимумаба так же, как совпадающего по изотипу контроля, вводили дважды в неделю до 6 доз, дозы пембролизумаба и контроля для изотипа вводили каждые 5 суток до окончания дозирования H2L5 hIgG4PE. В когортах сбора тканей для фармакодинамического исследования H2L5 hIgG4PE вводили в дозах 0,004, 0,04, 0,4 и 1,2 мг/кг. Группы обработки оценивали относительно контрольных групп носителя и совпадающих по изотипу контрольных групп. Группы обработки для носителя, изотипов и H2L5 hIgG4PE, отдельно и в комбинации с ипилимумабом и пембролизумабом с использованием РВМС человека от донора номер #6711 показаны в табл. 12. Анализ завершали на сутки 59 при завершении исследования.
- 64 036335
Таблица 12
Группы обработки мышей в модели опухоли меланомы А2058
Группа Обработка 1 Обработка 2 # мышей/ группу Дозирование
1 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Носитель 10 Дважды в неделю до 6 доз
2 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Контроль для изотипа (IgGl 3 мг/кг+1д64 5 мг/кг) 10 IgGl дважды в неделю до 6 цоз. IgG4 каждые 5 суток цо окончания дозирования ICOS
3 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Ипилимумаб 3 мг/кг+1д64 5 мг/кг 10 Дважды в неделю до 6 доз IgG4 каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
4 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Пембролизумаб 5 мг/кг +IgGl 3 мг/кг 10 IgGl дважды в неделю до 6 цоз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания цозирования ICOS
5 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/кг +IgGl 3 мг/кг 10 IgGl и ICOS Дважды в неделю до 6 доз
6 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,4 мг/кг+IgGl 3 мг/кг 10 IgGl и ICOS дважды в неделю до 6 доз
7 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Ипилимумаб 3 мг/кг +пембролизумаб 5 мг/кг 10 Ипилимумаб дважды в неделю цо 6 доз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
8 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/кг +Ипилимума б 3 мг/кг 10 Ипилимумаб и ICOS дважды в неделю до 6 доз
9 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,4 мг/кг +ипилимума б 3 мг/кг 10 Ипилимумаб и ICOS дважды в неделю до 6 доз
10 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/кг+пембролизу маб 5 мг/кг 10 ICOS дважды в неделю до 6 цоз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания цозирования ICOS
11 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,4 мг/кг +пембролизумаб 5 мг/кг 10 ICOS дважды в неделю до 6 доз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
12 Опухоль+huPBMC (донор #6711) IgG4 5мг/кг 10 Дважды в неделю до 6 доз
13 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Пембролизумаб 2,5 мг/кг 10 Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
14 Опухоль+huPBMC Пембролизумаб 5 10 Пембролизумаб каждые 5
- 65 036335
(донор #6711) мг/ кг суток до окончания дозирования ICOS
15 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,4 мг/кг 10 ICOS дважды в неделю до 6 доз
16 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,4 мг/кг+пембролизу маб 5 мг/кг+Ipi 10 ICOS дважды в неделю до 6 доз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
17 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Носитель 10 Цважды в неделю для оценки фармакодинамической активности, образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 2-й дозы, и образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 4-й дозы
18 Опухоль+huPBMC (донор #6711) Контроль для изотипа (IgG4) 1,2 мг/кг 10 Цважды в неделю для оценки фармакодинамической активности, образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 2-й дозы, и образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 4-й дозы
19 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,004 мг/кг 10 Цважды в неделю для оценки фармакодинамической активности, образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 2-й дозы, и образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 4-й дозы
20 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/кг 10 Цважды в неделю для оценки фармакодинамической активности, образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 2-й дозы, и образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 4-й дозы
21 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 0,4 мг/кг 10 Цважды в неделю для оценки фармакодинамической активности, образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 2-й дозы, и образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 4-й дозы
22 Опухоль+huPBMC (донор #6711) H2L5 hIgG4PE 1,2 мг/ кг 10 Цважды в неделю для оценки фармакодинамической активности, образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 2-й дозы, и образцы от 5 мышей собирали через 24 час после 4-й дозы
Исследование эффективности, оценивающее H2L5 hIqG4PE, дозированное в комбинации с ипилимумабом или пембролизумабом.
Это исследование разработано для оценки противоопухолевой эффективности H2L5 hIgG4PE (введенного в дозах 0,01 и 0,04 мг/кг) в комбинации с ипилимумабом или пембролизумабом с совпадающим по изотипу контролем, у мышей NSG с трансплантацией РВМС человека с использованием модели опухоли меланомы А2058. Всего 13 групп из 10 мышей на группу назначали для этого исследования. Группа 2 представляла собой комбинированный контроль изотипа для гуманизированных IgG1 и IgG4. H2L5 hIgG4PE вводили в дозах 0,01 мг/кг (группа 12) и 0,04 мг/кг (группа 13) в качестве монотерапии. Для комбинированной обработки вводили дозы H2L5 hIgG4PE (0,01 и 0,04 мг/кг) и ипилимумаба или IgG1 (3 мг/кг) или H2L5 hIgG4PE (0,01 и 0,04 мг/кг) и пембролизумаба или IgG4 (5 мг/кг). Дозы H2L5 hIgG4PE и ипилимумаба так же, как совпадающего по изотипу контроля, вводили дважды в неделю до 6 доз, дозы пембролизумаба и контроля для изотипа вводили каждые 5 суток до окончания дозирования H2L5 hIgG4PE. Обобщение групп обработки с использованием РВМС человека от донора # 4568 представлено в табл. 13. Группы обработки оценивали относительно контрольных групп носителя и контрольных групп для изотипа. Анализ выживаемости проводили на сутки 33 при завершении исследования.
- 66 036335
Таблица 13
Группы обработки мышей в модели опухоли меланомы А2058
Группа Обработка 1 Обработка 2 # мышей/ группу Дозирование
1 Опухоль+huPBMC (донор #4568) Носитель 10 Дважды в неделю до 6 доз
2 Опухоль+huPBMC (донор #4568) Контроль для изотипа (IgGl 3 мг/кг+ IgG4 5 мг/кг) 10 IgGl дважды в неделю до 6 доз. IgG4 каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
3 Опухоль+huPBMC (донор #4568) Ипилимумаб Змг/кг+1д64 5 мг/кг 10 Дважды в неделю до 6 доз. IgG4 каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
4 Опухоль+huPBMC (донор #4568) Пембролизумаб 5 мг/кг+IgGl 3 мг/кг 10 IgGl дважды в неделю до 6 доз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
5 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,01 мг/кг+IgGl Змг/кг 10 IgGl и ICOS дважды в неделю до 6 доз
6 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/кг+IgGl 3 мг/кг 10 IgGl и ICOS дважды в неделю до 6 доз
7 Опухоль+huPBMC (донор #4568) Ипилимумаб 3 мг/кг+пембролизумаб 5 мг/кг 10 Ипилимумаб дважды в неделю до 6 доз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
8 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,01 мг/кг+ипилимумаб Змг/кг 10 Ипилимумаб и ICOS дважды в неделю до 6 доз
9 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/кг+ипилимумаб 3 мг/кг 10 Ипилимумаб и ICOS дважды в неделю до 6 доз
10 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,01 мг/кг+пембролизумаб 5 мг/кг 10 ICOS Дважды в неделю до 6 доз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
11 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/кг+пембролизумаб 5 мг/кг 10 ICOS дважды в неделю до 6 доз. Пембролизумаб каждые 5 суток до окончания дозирования ICOS
12 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,01 мг/кг 10 Дважды в неделю до 6 доз
13 Опухоль+huPBMC (донор #4568) H2L5 hIgG4PE 0,04 мг/ кг 10 Дважды в неделю до 6 доз
Статистический анализ.
Событием для анализа выживаемости являлось объем опухоли >2000 мм3, изъязвление опухоли, потеря массы тела мыши > 20%, агония или обнаружение мертвой, в зависимости от того, что наступало раньше. Точное время для отсекаемого объема определяли посредством подбора линейного графика между log объема опухоли и сутками двух наблюдений, первого наблюдения, где превышен отсекаемый объем, и одного наблюдения, непосредственно предшествующего отсекаемому объему. Способ КапланаМейера (KM) осуществляли для оценки вероятности выживаемости в различных группах обработки на данное время. Регистрировали медианное время до конечной точки и соответствующий ему 95% доверительный интервал. Затем тестировали, существуют или нет статистические различия кривых выживаемости KM между любыми двумя группами, посредством логарифмического рангового критерия.
Данные объема опухолей за последние сутки, на которые присутствовало 10 животных на группу (т.е. до эвтаназии каких-либо животных), использовали для проведения сравнений объема опухолей между различными группами обработки. Перед анализом объем опухоли преобразовывали в натуральный логарифм из-за непропорциональности изменчивости в различных группах обработки. Затем проводили ANOVA с последующим попарным сравнением для подвергнутых логарифмическому преобразованию данных.
Программное обеспечение Graphpad Prism использовали для нанесения на график данных роста опухолей и массы тела.
Результаты.
Ответ в зависимости от дозы H2L5 hIgG4PE (фиг. 20А).
- 67 036335
Ингибирование роста опухолей.
Контрольная группа.
Для РВМС человека (донор 7129) не показано эффекта на рост опухолей А2058 у мышей NSG. У мышей, несущих опухоль А2058 в присутствии или в отсутствие РВМС человека, у мышей, несущих опухоль А2058 в присутствии РВМС человека, обработанных носителем и контрольными для изотипа антителами, развивались опухоли, которые прогрессировали, как ожидалось (группа #1 по сравнению с группой #10, группа #1 по сравнению с группой #2, группа #1 по сравнению с группой #4, Р=1).
Для обработки ипилимумабом при 3 мг/кг (группа #3) показано значимое ингибирование роста опухолей (р<0,03) по сравнению с контрольной группой носителя #1, однако статистическая значимость утрачивалась (р<0,22) при сравнении с контрольной для изотипа группой #2. Это указывает на то, что изотип антитела может влиять на рост опухоли.
Для обработки H2L5 hIgG4PE при 0,4 мг/кг показана тенденция к ингибированию роста опухолей и увеличенной выживаемости мышей по сравнению с другими дозами, хотя эффекты не являлись статистически значимыми при сравнении либо с контролем-носителем, либо с контролем для изотипа.
Клинические наблюдения.
В ходе исследования наблюдали потерю массы тела у мышей, которая составляла приблизительно 20% при окончании исследования. Опубликовано, что как GvHD, так и опухолевая нагрузка может приводить к падению массы тела у мышей, хотя в этом исследовании потеря массы тела, по-видимому, была больше связана с опухолью А2058, поскольку для мышей, несущих опухоль, без трансплантации РВМС (группа #10), показана такая же тенденция. Изъязвление опухоли наблюдали для множества опухолей в ходе исследования, включая контрольную группу для изотипа.
Исходы для мышей.
Большинство мышей удаляли по достижению объемов опухолей >2000 мм3. Трех мышей подвергли эвтаназии из-за изъязвления опухолей, и трех мышей подвергли эвтаназии из-за потери массы тела >20%. Девять мышей обнаружены мертвыми со случайным распределением между группами, включая двух в группе носителя и всего трех в контрольных группах для изотипа. Эти смерти приписали чувствительности модели к состоянию реакции трансплантат против хозяина, и не связывали с обработкой, поскольку не наблюдали паттерна для групп обработки по сравнению с контрольными группами носителя или с контрольными группами для изотипа.
Исследование эффективности для H2L5 hIgG4PE в комбинации с ипилимумабом и пембролизумабом (фиг. 20В).
Ингибирование роста опухолей.
Контрольная группа.
У мышей, несущих опухоль А2058 в присутствии РВМС человека, обработанных носителем и контрольными для изотипа антителами, развивались опухоли, которые росли, как ожидалось.
Монотерапия.
Обработка ипилимумабом при 3 мг/кг в комбинации с IgG4 (группа #3) приводила к значимому ингибированию роста опухолей (р<0,04) по сравнению с контрольной группой носителя #1. Однако при сравнении с контрольной для изотипа группой #2 статистическая значимость утрачивалась (р<0,23).
Для обработки пембролизумабом отдельно при 2,5 или 5 мг/кг (группа #13, 14) показано поддающееся наблюдению ингибирование роста опухолей без статистической значимости при сравнении с контрольной группой носителя или с контрольной для изотипа группой #12. Для пембролизумаба в комбинации с IgG1 (группа #4) показано поддающееся наблюдению ингибирование роста опухолей без статистической значимости, однако наблюдали значимое увеличение выживаемости (р<0,04) по сравнению с контрольной группой носителя #1. Статистическая значимость утрачивалась (р<0,4) при сравнении с контрольной для изотипа группой #2.
Для обработки H2L5 hIgG4PE отдельно при 0,4 мг/кг (группа #15) показано поддающееся наблюдению ингибирование роста опухолей без статистической значимости по сравнению с носителем или с контрольной для изотипа группой #12. Для H2L5 hIgG4PE при 0,04 или 0,4 мг/кг в комбинации с IgG1 (группа #5 и 6) показано поддающееся наблюдению замедление прогрессирования опухолей и продление выживаемости мышей, но это не достигало статистической значимости.
Комбинированная обработка.
Для комбинации H2L5 hIgG4PE (0,04 или 0,4 мг/кг) с ипилимумабом (3 мг/кг) в группах #8 и #9 не показано дополнительное ингибирование роста опухолей по сравнению с ипилимумабом отдельно (группа #3). Для комбинации H2L5 hIgG4PE (0,04 или 0,4 мг/кг) с пембролизумабом (5 мг/кг) в группах #10 и #11 показано умеренное, но не значимое ингибирование роста опухолей и увеличение выживаемости мышей по сравнению с монотерапией пембролизумабом, группа #4, или с монотерапией H2L5 hIgG4PE, группы #5 и #6.
Клинические наблюдения.
Потеря массы тела у мышей, наблюдаемая в ходе исследования, составляла приблизительно 20%. Изъязвление опухоли наблюдали для множества опухолей в ходе исследования в большинстве групп.
- 68 036335
Исходы для мышей.
Всего 100 из 160 мышей подвергли эвтаназии, когда объемы опухолей достигли >2000 мм3. 29 подвергли эвтаназии из-за изъязвления опухолей, 18 мышей обнаружены мертвыми, 12 мышей подвергли эвтаназии из-за потери массы тела >20% и одну мышь подвергли эвтаназии из-за агонии. Мышей обнаруживали мертвыми среди групп, включая контрольную группу для изотипа #2. Эти смерти приписали чувствительности модели к состоянию реакции трансплантат против хозяина, и не связывали с обработкой, поскольку не наблюдали паттерна для групп обработки по сравнению с контрольной группой для изотипа.
Исследование эффективности, оценивающее H2L5 hIgG4PE, дозированное в комбинации с ипилимумабом или пембролизумабом (фиг. 20С).
Замедление роста опухолей.
Контрольная группа: У мышей, несущих опухоль А2058 в присутствии РВМС человека, обработанных носителем или контрольными для изотипа антителами, развивались опухоли, которые росли, как ожидалось.
Монотерапия.
Для обработки ипилимумабом при 3 мг/кг в комбинации с IgG4 (группа #3) показано значимое ингибирование роста опухолей (р<0,02) и значимое увеличение выживаемости (р<0,01) по сравнению с контрольной группой носителя #1. Однако при сравнении с контрольной для изотипа группой #2, ингибирование роста опухолей не достигало значимости (р<0,13), в то время как значимое увеличение выживаемости мышей сохранялось (р<0,04).
Для обработки пембролизумабом при 5 мг/кг в комбинации с IgG1 (группа #4) показано ингибирование роста опухолей без статистической значимости по сравнению с носителем или с контрольной для изотипа группой #2.
Для обработки H2L5 hIgG4PE отдельно при 0,01 или 0,04 мг/кг (группа #12 и #13) показано значимое ингибирование роста опухолей (р<0,03) по сравнению с контрольной группой носителя #1. Для H2L5 hIgG4PE, введенного в дозе 0,04 мг/кг, также показано значимое увеличение выживаемости мышей (р<0,048) по сравнению с контрольной группой носителя #1. Однако по сравнению с контрольной для изотипа группой #2 ингибирование роста опухолей и увеличение выживаемости не достигали статистической значимости для групп #12 и #13. Для H2L5 hIgG4PE при 0,01 мг/кг в комбинации с IgG1 (группа #5) показано значимое ингибирование роста опухолей (р<0,03) и увеличение выживаемости мышей (р<0,03) по сравнению с контрольной группой носителя #1. Однако по сравнению с контрольной для изотипа группой #2 замедление роста опухолей и увеличение выживаемости не достигали статистической значимости. Для H2L5 hIgG4PE при 0,04 мг/кг в комбинации с IgG1 (группа #6) показано поддающееся наблюдению ингибирование роста опухолей и увеличение выживаемости мышей, но это не достигало статистической значимости.
Комбинированная обработка.
Для комбинации H2L5 hIgG4PE с ипилимумабом (0,01 мг/кг плюс ипилимумаб 3 мг/кг; группа #8) показано поддающееся наблюдению ингибирование роста опухолей и увеличение выживаемости мышей, но это не достигало статистической значимости. Для комбинации H2L5 hIgG4PE с ипилимумабом (0,04 мг/кг плюс ипилимумаб 3 мг/кг; группа #9) показано значимое ингибирование роста опухолей (р<0,00) и значимое увеличение выживаемости мышей (р<0,04) по сравнению с контрольной группой носителя #1 или с контрольной для изотипа группой #2 (р<0,02). Однако по сравнению с контролем для изотипа увеличение выживаемости не достигало статистической значимости. Комбинированная активность не достигала значимости по сравнению с монотерапией ипилимумабом, группа #3, или с группами монотерапии H2L5 hIgG4PE.
Для комбинации H2L5 hIgG4PE (0,01 или 0,04 мг/кг) с пембролизумабом (5 мг/кг), группы #10 и #11, показано значимое ингибирование роста опухолей (р< 0,03) и наблюдали значимое увеличение выживаемости мышей (р<0,03) по сравнению с контрольной группой носителя #1. При сравнении с контрольной для изотипа группой #2 значимость ингибирования роста опухолей сохранялась в комбинации 0,04 мг/кг H2L5 hIgG4PE с пембролизумабом (р<0,03). Однако преимущество для выживаемости не достигало статистической значимости. Для комбинации не достигали статистической значимости по сравнению с любой из групп монотерапии пембролизумабом, группа #3, или H2L5 hIgG4PE, группы #5 или #6. Таким образом, для H2L5 hIgG4PE в комбинации с пембролизумабом (0,01 или 0,04 мг/кг плюс пембролизумаб 5 мг/кг) показано увеличение ингибирования роста опухолей и выживаемости мышей, но это не достигало статистической значимости при сравнении с контролем для изотипа или видами монотерапии.
Клинические наблюдения.
Потеря массы тела у мышей, наблюдаемая в ходе исследования, составляла приблизительно 20%. Изъязвление опухоли наблюдали в большинстве групп в ходе исследования.
Исходы для мышей.
Всего 91 мышь подвергли эвтаназии из-за объемов опухолей >2000 мм3, 34 мыши подвергли эвтаназии из-за изъязвления опухолей и 5 мышей обнаружены мертвыми. Эти смерти приписали чувствительности модели к состоянию реакции трансплантат против хозяина.
- 69 036335
Обсуждение.
Эффективность H2L5 hIgG4PE в качестве монотерапии и в комбинации с пембролизумабом так же, как с ипилимумабом, оценивали в модели опухолей меланомы А2058 на мышах NSG с трансплантацией РВМС человека. Эта модель, где РВМС человека внутривенно инъецируют взрослым иммунодефицитным мышам NSG (NOD/SCID/IL-2RYnull), известна как модель Hu-PBMC NSG. Она индуцирует реакцию трансплантат против хозяина (GvHD), и ее используют для исследования активности эффекторных Тклеток и Т-клеток памяти. В модели Hu-PBMC NSG подкожно имплантировали линию клеток злокачественной опухоли человека А2058 для исследования эффекта человеческих иммунотерапевтических антител на рост опухолей. Ограничения этой модели включают начало симптомов GvHD, потерю массы тела и частое изъязвление опухолей, не позволяющие мониторирование выживаемости в течение более длительного периода времени, как это возможно для моделей сингенных опухолей на мышах.
Первоначальные исследования, оценивающие H2L5 hIgG4PE в дозах, лежащих в диапазоне от 0,04 до 4 мг/кг, показали, что для доз в более низком диапазоне показано умеренное ингибирование роста опухолей. Замедление прогрессирования опухолей и увеличение выживаемости мышей наблюдали в группах доз в диапазоне от 0,04 до 0,4 мг/кг, хотя это не являлось статистически значимым при сравнении с контрольными для изотипа группами. На основании этих исследований дозы H2L5 hIgG4PE 0,040,4 мг/кг выбраны для дальнейшей оценки, отдельно и в комбинации с пембролизумабом и ипилимумабом, в двух исследованиях с трансплантацией РВМС от двух различных доноров (доноров номер 4568 и 6711). Умеренные ответы для монотерапии H2L5 hIgG4PE и комбинации с пембролизумабом наблюдали в одном из двух проведенных комбинированных исследованиях. В комбинированном исследовании с использованием РВМС донора 4568 (табл. 13, фиг. 20С) показана противоопухолевая активность монотерапии и комбинации, в то время как в исследовании с использованием РВМС донора 6711 (табл. 12, фиг. 20В) не показано значимого противоопухолевого эффекта, что, вероятно, являлось результатом различий РВМС доноров между исследованиями, которые отражают изменчивость ответов пациентов, которую можно наблюдать в клинике. В этом втором комбинированном исследовании с РВМС донора 4568 увеличение ингибирования роста опухолей и увеличенную выживаемость мышей наблюдали в комбинированной группе при сравнении с любым средством отдельно, хотя это различие не являлось статистически значимым. Однако наблюдали синергизм для комбинаций, поскольку H2L5 hIgG4PE в дозе 0,04 мг/кг в комбинации с пембролизумабом при 5 мг/кг приводили к статистически значимому уменьшению объема опухоли через десять суток после первой дозы и к увеличенной выживаемости по сравнению с контрольной для изотипа группой (р < 0,05), в то время как монотерапия не приводила к этому. Фактически 50% мышей в группе комбинации H2L5 hIgG4PE и пембролизумаба оставались в исследовании на сутки 33, но были удалены из-за изъязвления опухолей. Только четыре мыши были удалены из исследования из-за объемов опухолей в этой комбинированной группе, в то время как от 8 до 9 мышей были удалены из исследования в группах пембролизумаба и контроля изотипа.
Для терапии антителом против PD1 не показано статистически значимой активности в этой модели, как наблюдали по ограниченному изменению роста опухолей и выживаемости, наблюдаемых в когорте обработки пембролизумабом по сравнению с когортой обработки контролем для изотипа. Для монотерапии ипилимумабом показана тенденция к умеренно лучшему ингибированию роста опухолей, чем для пембролизумаба, в обоих исследованиях, и показано статистически значимое увеличение выживаемости по сравнению с контролем для изотипа во втором комбинированном исследовании с использованием способного к ответу донора РВМС 4568 (р< 0,04). Для H2L5 hIgG4PE в дозе 0,01 мг/кг в комбинации с ипилимумабом при 3 мг/кг показано значимое увеличение выживаемости по сравнению с ипилимумабом (р< 0,02), но не по сравнению с монотерапией H2L5 hIgG4PE. He присутствовало дополнительных значимых эффектов на объем опухоли, наблюдаемых для комбинации H2L5 hIgG4PE и ипилимумаба в этой модели по сравнению с любым средством отдельно. Мышей из всех групп обработки, включая группы носителя и группы контроля для изотипа, обнаруживали мертвыми, как зарегистрировано в таблицах исходов. Эти смерти приписали чувствительности модели к состоянию реакции трансплантат против хозяина и не связывали с обработкой.
Пример 12. Функциональная активность агонистического антитела против ICOS мыши отдельно и в комбинации с антителами против PD1 и против CTLA-4 in vivo.
СТ26 и ЕМТ6 - модели сингенных опухолей на мышах.
СТ26 - модель мышиной карциномы толстой кишки на мышах.
Способы.
Это исследование проводили по протоколу, одобренному Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных GSK до начала исследований.
Животные.
В это исследование включены 164 самки машей BALB/c mice из Harlan Sprague Dawley. Мыши находились в возрасте 6-8 недель на начало исследования, когда их подвергали инокуляции.
Культура клеток и инокуляция.
Один флакон клеток СТ-26 (АТСС: CRL-2638) (3x106 клеток; Р-11) размораживали от -140°С и рас- 70 036335 севали в RPMI с 10% FBS. Клетки субкультивировали 3 раза в течение 10 суток. Трипсин/ЭДТА использовали для облегчения открепления клеток от культурального флакона в ходе субкультивирования.
Клетки собирали, промывали дважды и ресуспендировали в RPMI без FBS при 5x105 клеток/мл. Мышам инокулировали подкожно 0,1 мл клеток (5x104 клеток/мышь) в нижнюю часть правого бока.
На сутки сбора клеток и инокуляции подсчет клеток выполняли в Beckman Coulter Vi-cell XR и проверяли посредством гемоцитометра. Клетки открепляли от флакона с использованием трипсина/ЭДТА и промывали дважды, первый раз с использованием RPMI+10%FBS и второй раз с использованием только RPMI, и ресуспедировали в 10 мл RPMI. 178x106 клеток с 98,8% жизнеспособностью собирали в 20 мл RPMI. 1,685 мл суспензии клеток (всего 15x 106 клеток) добавляли к 28,315 мл RPMI.
15x 106 клеток/30 мл среды=5х105 клеток/мл. Это эквивалентно 5x104 клеток/100 мкл.
Составление и подготовка антител.
Антитела разводили из флаконов с источником антител для хранения до желательных концентраций в стерильном 0,9% солевом растворе на сутки дозирования. Клон С398.4 агонистического антитела против ICOS тестировали при 0,05 и 0,5 мг/кг. Каждую дозу тестировали также с антителом против PD1 при 10 мг/кг и с антителом против CTLA-4 при 1 мг/кг.
Экспериментальный способ(ы).
Мониторирование опухолей и дозирование.
Мышей подвергали инокуляции на сутки 0. На сутки 11 измеряли массу тела и объем опухолей. Мышей случайным образом распределяли на 12 групп исследования, показанных в табл. 14, по 10 мышей/группу на основании размера опухолей. Случайное распределение проводили с использованием программного обеспечения Studylog Study Director. Мышам вводили дозы на основании графика дизайна исследования дважды в неделю, начиная на сутки случайного распределения и продолжая всего до 6 доз. Дозирование было внутрибрюшинным (IP) в объеме 100 мкл носителя - 0,9% солевого раствора. Объем опухолей и массу тела измеряли 3 раза в неделю на протяжении исследования.
Конечные точки.
Мышей удаляли из исследования из-за опухолевой нагрузки, когда объем опухоли превышал 2000 мм3. Объем опухоли рассчитывали с применением измерений штангенциркулем длины и ширины по следующей формуле: TV=0,52-L-W2.
Кроме того, мышей удаляли из исследования, когда в опухолях развивались открытые изъязвления. Изъязвления наблюдали на протяжении эксперимента, однако только зарубцевавшиеся изъязвления не являлись конечной точкой, если они не формировали открытых отверстий.
Хотя это не было применимо ни к одной мыши в этом исследовании, третьей конечной точкой, установленной в начале исследования, являлось уменьшение массы тела на 20%.
Лекарственные средства и материалы.
Антитело Поставщик Каталожный # Партия Клон
ICOS Biolegend 93108 B205973 C398,4
PD1 BioXcell BE0146 5792-10/0815B RMP1-14
CTLA-4 BioXcell BE0164 5632-4/0715 9D9
IgG2b мыши BioXcell BE0086 4700/1014 MCP-11
IgG2a крысы BioXcell BE0089 5679-6/0815 2 АЗ
IgG хомяка Biolegend 92257 B205974 НТК888
Все антитела разводили до желательной концентрации в 0,9% солевом растворе, и солевой раствор использовали в качестве контроля-носителя.
Анализ данных.
Событием для анализа выживаемости являлись объем опухоли 2000 мм3 или изъязвление опухоли в зависимости от того, что наступало раньше. Точное время для отсекаемого объема определяли посредством подбора линейного графика между log объема опухоли и сутками двух наблюдений, первого наблюдения, где превышен отсекаемый объем, и одного наблюдения, непосредственно предшествующего отсекаемому объему. Способ Каплана-Мейера (KM) осуществляли для оценки вероятности выживаемости в различных группах обработки на данное время. Регистрировали медианное время до конечной точки и соответствующий ему 95% доверительный интервал. Затем тестировали, существуют или нет статистические различия кривых выживаемости KM между любыми двумя группами, посредством логарифмического рангового критерия.
Объемы опухолей через 17 суток после начала дозирования сравнивали между различными группами обработки. Перед анализом объем опухоли преобразовывали в натуральный логарифм из-за непропорциональности изменчивости в различных группах обработки. Затем проводили ANOVA с последующим попарным сравнением для подвергнутых логарифмическому преобразованию данных.
- 71 036335
Таблица 14
Группы исследований
No. группы Обработка
1 Солевой раствор
2 IgG2b мыши 20 мкг+IgG хомяка 10 мкг
3 IgG2a крысы 200 мкг+IgG хомяка 10 мкг
4 IgG хомяка 10 мкг
5 ICOS 1мкг
6 ICOS 10 мкг
7 CTLA-4 20 мкг
8 PD1 200 мкг
9 ICOS 1 мкг+СТЬА-4 20 мкг
10 ICOS 10 мкг+СТЬА-4 20 мкг
11 ICOS 1 мкг+PDl 200 мкг
12 ICOS 10 мкг+PDl 200 мкг
Необработанное значение р так же, как значения р с коррекцией по уровню ложноположительных результатов (FDR) для сравнений суток до событий в анализе выживаемости и сравнений логарифмически преобразованного объема опухолей на сутки 10 между группами обработки показаны в вышеуказанной таблице. Сравнения с использованием значений р с коррекцией по FDR < 0,05 объявляли статистически значимыми.
Результаты.
Отслеживание исходов для мышей показало, что ряд мышей удаляли из исследования из-за опухолевой нагрузки и изъязвления опухоли. Все оставшиеся мыши были свободными от опухолей на сутки исследования 61, за исключением 1 мыши в G7, обладающей объемом опухоли 579,16 мм3.
Для выживаемости (времени до конечных точек) для групп 9 и 12 показано значимое увеличение выживаемости по сравнению с контрольной группой носителя (р=0,008 и р=0,001 соответственно). Для группы 12 показано статистически значимое увеличение выживаемости по сравнению с группами 2, 4 и 5 (р=0,006, 0,001, 0,02). Однако ни для каких комбинированных групп не показано статистически значимого увеличения выживаемости (р<0,05) по сравнению с какой-либо монотерапией (фиг. 21).
Обсуждение.
Для групп комбинированной терапии, в частности, с высокой дозой комбинации антител против ICOS и антител против PD1 (группа 12) показано ингибирование роста опухолей и увеличенная выживаемость по сравнению с группами монотерапии и контроля для изотип, хотя статистической значимости не достигали на сутки 61. Контроль для изотипа для группы 12 представлял собой IgG2a крысы+IgG хомяка из группы 3. Группы монотерапии для сравнения представляют собой ICOS 10 мкг (группа 6) и PD1 200 мкг (группа 8). Всего 5 мышей оставались свободными от опухолей в группе 12 по сравнению с 1 в группе 3, 1 в группе 6 и 1 в группе 8. Преимущество для выживаемости оценивали количественно посредством получения суток, на которые каждая мышь достигала любой из предопределенных конечных точек исследования. Ряд мышей удаляли из исследования из-за открытых изъязвлений опухолей, а не изза опухолевой нагрузки.
В группе с высокой дозой комбинации ICOS+CTLA-4 (группа 10) увеличенное количество мышей удаляли из-за изъязвления опухолей на сутки 31, что, вероятно, маскировало выживаемость и противоопухолевые преимущества, обеспечиваемые этой комбинацией. В этой группе 5 мышей удаляли из-за изъязвления опухолей и только 2 из-за опухолевой нагрузки, достигшей 2000 мм3. Все опухоли, удаленные из-за изъязвления опухолей, все еще имели умеренный размер при удалении из исследования, и ожидали, что изъязвление опухоли может являться результатом индуцированного терапией противоопухолевого иммунного ответа у этих мышей. Три мыши оставались свободными от опухолей в этой группе на сутки 61. 2 мыши, удаленные из-за опухолевой нагрузки, составляли самое низкое количество мышей, удаленных из-за опухолевой нагрузки из всех групп.
Модель на мышах опухоли карциномы молочной железы ЕМТ6.
Экспериментальный способ(ы).
Все процедуры и критерии эвтаназии, описанные в этом документе, соответствуют протоколу IACUC AUP0606. Животных взвешивали и инокулировали в правую заднюю часть 100 мкл 1х105 клеток опухолей ЕМТ6 на мышь. Количество инокулированных мышей эквивалентно по меньшей мере 130% от количества, необходимого для исследования. Принимая 30% неудач (либо слишком большой, либо слишком маленький размер на время начала исследования), целью являлось наличие n=10 для каждой группы. После инокуляции клеток опухоли рост опухолей и общую массу тела измеряли 3 раза в неделю с использованием цифрового штангенциркцуля Fowler ProMax в течение 4 недель или дольше. Антитела получали от коммерческого поставщика и разводили до желательной концентрации в 0,9% солевом растворе. Дозирование (i.p.) проводили два раза в неделю, всего до 6 доз и начинали на сутки случайного распределения, обозначенные как сутки 0, когда средний объем опухоли приближался к 100 мм3, приблизительно через 7-8 суток после инокуляции. Случайное распределение проводили с использованием программного обеспечения Studylog Study Director Suite. Длину и ширину опухолей измеряли для определения объема опухолей с использованием формулы (объема опухоли ПШ2-0,52). Измерение опухоли
- 72 036335 более 2000 мм3 для индивидуального животного приводило к удалению из исследования. Мышей могли также удалять из исследования из-за потери массы (>20%), изъязвления опухолей или любого другого очевидного подавления нормальной активности мышей из-за осложнений.
В этом исследовании, всего 191 животным инокулировали клетки ЕМТ6 для получения достаточного количества мышей с опухолями в желательном диапазоне размеров для 13 групп из 10 мышей, как показано в табл. 15. Группа мышей с инъекцией носителя-солевого раствора и группа для контроля изотипа служили в качестве контроля для мышей, обработанных mAb против ICOS, PD1 и CTLA-4. Контроль изотипа для ICOS (IgG хомяка) вводили в дозах 10 мкг отдельно и в комбинации с изотипом для CTLA-4 (IgG2b мыши) или PD-1 (IgG2a крысы). В группах монотерапевтической обработки антитело против CTLA-4 (9D9) и антитело против PD-1 (RMP1-14) вводили в дозах 20 и 200 мкг на мышь соответственно и оценивали в комбинации с контролем изотипа для ICOS. Клон С398.4 агониста ICOS вводили в дозах 10 и 1 мкг на мышь. Эффективность агониста ICOS оценивали также в дозах 10 и 1 мкг на мышь в комбинации с антителом против CTLA-4 или антителом против PD-1. Дополнительную группу PD-1 и CTLA-4 в предопределенных концентрациях включали в качестве сравнительной группы положительного контроля. Статистический анализ объема опухолей проводили на сутки 13 после случайного распределения. В анализ жизнеспособности включали мышей, находящихся в исследовании до суток 60.
Таблица 15
Группы исследования
Дозирование Обработка 1 Обработка 2 п=
Группа 1: 1х105 клеток солевой раствор 10
Группа 2: 1х105 клеток IgG хомяка 10 мкг mIgG2b 20 мкг 10
Группа 3: 1х105 клеток IgG хомяка 10 мкг rIgG2a 200 мкг 10
Группа 4: 1х105 клеток IgG хомяка 10 мкг 10
Группа 5: 1х105 клеток ICOS 10 мкг 10
Группа 6: 1х105 клеток ICOS 1 мкг 10
Группа 7: 1х105 клеток CTLA4 20 мкг IgG хомяка 10 мкг 10
Группа 8: 1х105 клеток PD-1 200 мкг IgG хомяка 10 мкг 10
Группа 9: 1х105 клеток ICOS 10 мкг CTLA4 20 мкг 10
Группа 10: 1х105 клеток ICOS 1 мкг CTLA4 20 мкг 10
Группа 11: 1х105 клеток ICOS 10 мкг PD-1 200 мкг 10
Группа 12: 1х105 клеток ICOS 1 мкг PD-1 200 мкг 10
Группа 13: 1х105 клеток CTLA4 20 мкг PD-1 200 мкг 10
Лекарственные средства и материалы.
Животные.
Самок мышей Balb/c в возрасте от 6 до 8 недель получали из Harlan Sprague Dawley и содержали в соответствии со стандартами IACUC.
Клетки ЕМТ6.
Клетки ЕМТ6 размораживали и культивировали в культуральных флаконах в течение восьми суток до инокуляции. Клетки пассировали 3 раза за это время. На сутки инокуляции клетки собирали из флакона в полной среде. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в среде Веймаута (с 15% FBS). Эту стадию повторяли 3 раза в среде Веймаута без FBS. Плотность и жизнеспособность клеток проверяли посредством исключения трипанового синего. Затем клетки разводили до желательной плотности (1 х 106 клеток на 1 мл).
Иммунотерапевтические средства.
Все лекарственные средства разводили до желательной концентрации в 0,9% хлориде натрия на сутки дозирования и инъецировали i.p. с использованием иглы 30 G. Разведения лекарственных средств и контроля представлены ниже в табл. 16.
Таблица 16
Разведения лекарственных средств
Rx исходная конц., мг/мл желател ьная конц., мг/мл разведе ние 1: доза/ МЫШЬ f мг количес гво мышей необход имый объем, мл добавл енный исходи ый раство р, мл общее количес тво разбави теля, мл общий объем, мл
IgG2b мыши 4,46 о,1 44,6 0, 02 10 2 0,10 4,36 4,46
IgG2a крысы 6, 92 1 6, 92 0,2 10 2 0,40 2,37 2,77
IgG хомяка 1,47 0,05 29,4 0, 01 50 10 0,40 11,36 11,76
CTLA4 6, 1 0,1 61 0, 02 40 8 0,15 9 9,15
PD-1 7,44 1 7,44 0,2 40 8 1,30 8,372 9,672
ICOS 5 0,05 100 0, 01 30 6 0,10 9,9 10
ICOS 0,05 0,005 10 0, 001 30 6 1,00 9 10
Анализ данных.
Статистический анализ.
Событием для анализа выживаемости являлись объем опухоли 2000 мм3 или изъязвление опухоли,
- 73 036335 в зависимости от того, что наступало раньше. Точное время для отсекаемого объема определяли посредством подбора линейного графика между log объема опухоли и сутками двух наблюдений, первого наблюдения, где превышен отсекаемый объем, и одного наблюдения, непосредственно предшествующего отсекаемому объему. Способ Каплана-Мейера (KM) осуществляли для оценки вероятности выживаемости в различных группах обработки на данное время. Регистрировали медианное время до конечной точки и соответствующий ему 95% доверительный интервал. Затем тестировали, существуют или нет статистические различия кривых выживаемости KM между любыми двумя группами посредством логарифмического рангового критерия.
Объемы опухолей через 13 суток после начала дозирования сравнивали между различными группами обработки. Перед анализом объем опухоли преобразовывали в натуральный логарифм из-за непропорциональности изменчивости в различных группах обработки. Затем проводили ANOVA с последующим попарным сравнением для подвергнутых логарифмическому преобразованию данных.
Использовали программное обеспечение для анализа SAS 9.3 и R 3.0.2.
Результаты.
Мышей Balb/c подвергали инокуляции и случайным образом распределяли на группы по десять на основании режима лечения через 8 суток. Введение лекарственных средств или контроля начинали на сутки случайного распределения (сутки 0) и продолжали дважды в неделю в течение 3 недель.
В группе обработки солевым раствором опухоли росли с ожидаемой скоростью относительно предшествующих исследований ЕМТ-6. Всех мышей в группе носителя - солевого раствора подвергали эвтаназии из-за размера или изъязвлений опухолей на сутки 30. Обработка с использованием IgG хомяка отдельно или в комбинации с IgG2a крысы или IgG2b мыши не приводила к статистически значимому изменению среднего роста опухоли или выживаемости по сравнению с группой носителя - солевого раствора.
Через 13 суток после случайного распределения в группах монотерапии против ICOS показано небольшое поддающееся наблюдению изменение среднего роста опухоли по сравнению с контролем для изотипа. Однако в группе обработки высокой дозой ICOS (10 мкг) показана очевидная тенденция к большему ингибированию роста опухолей, чем в группе низкой дозы. Наблюдали эффект, сравнимый с активностью монотерапии против CTLA-4. Обработка монотерапией mAb против PD-1 также приводила к поддающемуся наблюдению до некоторой степени, но статистически не значимому уменьшению среднего объема опухолей на сутки 13. Однако как и для монотерапии против ICOS и CTLA-4, это не приводило к увеличению выживаемости по сравнению с группами соответствующих изотипов. Обработка с использованием комбинации антитела против PD-1 и антитела против ICOS клона С398.4 в дозе 10 мкг приводила к существенному ингибированию роста опухолей по сравнению с группами обработки контроля и монотерапии (фиг. 22). Для трех мышей в этой комбинированной группе достигли полной регрессии опухолей, существенного улучшения по сравнению с группами обработки контроля или монотерапии. Однако из-за использованных статистических критериев, статистически значимого улучшения выживаемости не достигали. Комбинация антитела против PD-1 с 1 мкг агонистического антитела против ICOS клона С398.4 приводила к статистически значимому уменьшению среднего роста опухолей на сутки 13 по сравнению с контрольной группой носителя - солевого раствора (р<0,05) и группой монотерапии ICOS (p<0,05) при 1 и 10 мкг. Для четырех мышей для этого режима обработки достигли полной регрессии опухолей, что привело к значительной тенденции к увеличению выживаемости, не достигшей статистической значимости.
Для антитела против ICOS в обеих дозах в комбинации с антителом против CTLA-4 показано небольшое поддающееся наблюдению преимущество ингибирования роста опухолей или увеличения выживаемости по сравнению с монотерапевтической обработкой любым антителом.
Обсуждение.
В то время как контроль для изотипа не приводил к очевидным изменениям среднего объема опухолей или общей выживаемости при сравнении с группой носителя - солевого раствора, присутствовали индивидуальные животные в группе IgG хомяка (группа 4) и в группе IgG хомяка и IgG2a крысы (группа 3), для которых показано замедление роста опухолей. В группе изотипа IgG хомяка и IgG2a крысы одна из мышей выжила дольше последней мыши в группе носителя - солевого раствора, ее подвергли умерщвлению на сутки 36 из-за изъязвления, с опухолью, объем которой измерен как 1156,56 мм3. Две мыши в группе IgG хомяка выжили дольше, чем в группе солевого раствора. Одно животное подвергли эвтаназии из-за размера опухоли на сутки 36, и второе - на сутки 41 из-за изъязвления с измерением 1899,28 мм3.
Режим дозирования антитела против PD-1 с 10 мкг агонистического антитела против ICOS приводил к поддающемуся наблюдению ингибированию роста опухолей, приведшему к уменьшению объема опухолей на сутки 13 по сравнению с контролем для изотипа, хотя это различие являлось менее очевидным по сравнению с монотерапией антителом против PD-1. Однако комбинация приводила к присутствию всего пяти животных, выживших дольше любого животного в группе монотерапии антителом против PD-1, где три мыши испытывали полную регрессию опухолей по сравнению с отсутствием таких мышей в группе монотерапии антителом против PD-1.
- 74 036335
Сочетание антитела против PD-1 с дозой 1 мкг агонистического антитела против ICOS приводило к поддающемуся наблюдению уменьшению среднего размера опухолей на сутки 13 по сравнению с контрольными группами для изотипов и соответствующими группами монотерапии. Это уменьшение являлось статистически значимым по сравнению с контрольной группой носителя - солевого раствора (р<0,05) и группой монотерапии 1 мкг ICOS (p<0,05). Четыре мыши испытывали полную регрессию опухолей и выжили дольше любого животного в группе монотерапии PD-1.
Преимущество для выживаемости, наблюдаемое для группы комбинации ICOS+PD1, не достигло статистической значимости по сравнению с контролем на сутки 60. Однако ингибирование роста опухолей и преимущество для выживаемости в группе комбинированной обработки ICOS+PD1 являлись сравнимыми с активностью, наблюдаемой для группы комбинации PD1+CTLA-4, которую рассматривали в качестве положительного контроля для противоопухолевой активности в этом исследовании. Это позволяет предполагать, что комбинация антител против ICOS и PD1 может обеспечивать преимущество, подобно комбинациям CTLA-4 и PD1, для которых показана значительная клиническая активность в некоторых типах опухолей.
Из 130 мышей, включенных в это исследование, 12 оставались живыми на сутки 60, где 11 достигли полной регрессии опухолей. Из 118 мышей, достигших конечных точек для удаления из исследования, 111 удалили из-за достижения размера опухоли 2000 мм3. Остальных семь мышей подвергали эвтаназии из-за изъязвления опухолей. Встречаемость изъязвления была распределена среди групп. Группы 1 (солевого раствора), 3 (IgG хомяка и IgG2a крысы), 4 (IgG хомяка), 6 (1 мкг ICOS) и 10 (CTLA-4 с 1 мкг ICOS) все содержали по одному животному, удаленному из-за изъязвления. В группе 13 (CTLA-4 + PD1) показаны два животных, умерщвленных из-за изъязвления. Остальные группы не содержали животных, удаленных из-за изъязвления.

Claims (19)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Связывающий индуцируемый костимулятор Т-клеток (ICOS) белок или его антигенсвязывающая часть, содержащие CDRH1, как указано в SeQ ID NO:1; CDRH2, как указано в SEQ ID NO:2; CDRH3, как указано в SEQ ID NO:3; CDRL1, как указано в SEQ ID NO:4; CDRL2, как указано в SEQ ID NO:5; и CDRL3, как указано в SEQ ID NO:6.
  2. 2. Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:7, и/или домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:8, где указанный связывающий ICOS белок специфически связывается с ICOS человека.
  3. 3. Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть по п.1 или 2, где указанный связывающий ICOS белок является агонистом ICOS.
  4. 4. Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-3, где указанный связывающий ICOS белок связывается с ICOS человека с:
    (i) константой скорости связывания (kon) по меньшей мере 1х105 М-1с-1 и константой скорости диссоциации (koff) менее 6х10-5 с-1 или (ii) константой диссоциации (KD) менее приблизительно 100 нМ, где аффинность измеряют посредством BIAcore.
  5. 5. Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-4, где связывающий ICOS белок содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, и где указанный связывающий ICOS белок содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.
  6. 6. Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-5, содержащие домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:7, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO:8.
  7. 7. Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-6, где указанный связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть содержит каркасную область, выбранную из изотипа IgG1 человека или его варианта и изотипа IgG4 человека или его варианта.
  8. 8. Связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-7, где указанный связывающий ICOS белок или его антигенсвязывающая часть содержит каркасную область hIgG4PE.
  9. 9. Связывающий ICOS белок по любому из пп.1-8, где указанный связывающий ICOS белок представляет собой моноклональное антитело.
  10. 10. Моноклональное антитело по п.9, где моноклональное антитело является гуманизированным.
  11. 11. Моноклональное антитело по п.9, где моноклональное антитело является полностью человеческим.
  12. 12. Моноклональное антитело по пп.9-11, содержащее CDR тяжелой цепи, обладающие аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, и CDR лег-
    - 75 036335 кой цепи, обладающие аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:4; SEQ ID
    NO:5 и SEQ ID NO:6.
  13. 13. Моноклональное антитело по любому из пп.9-12, которое является агонистом ICOS человека и содержит каркасную область изотипа IgG4 или его варианта.
  14. 14. Моноклональное антитело по п.13, где указанное антитело содержит каркасную область hIgG4PE.
  15. 15. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса, содержащая связывающий ICOS белок или моноклональное антитело по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
  16. 16. Способ лечения заболевания, выбранного из злокачественной опухоли, инфекционного заболевания или сепсиса, у человека, включающий стадию введения фармацевтической композиции по п.15 указанному человеку.
  17. 17. Способ по п.16, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного антинеопластического средства, по меньшей мере одного второго иммуномодулирующего средства и/или по меньшей мере одного иммуностимулирующего адъюванта указанному человеку.
  18. 18. Способ по п.17, где указанное второе иммуномодулирующее средство выбрано из антитела к CTLA4, антитела к PD-1, антитела к PDL1 и антитела к ОХ40.
  19. 19. Применение фармацевтической композиции по п.15 для лечения злокачественной опухоли, инфекционного заболевания и/или сепсиса у человека.
EA201791706A 2015-01-28 2016-01-26 Связывающие icos белки EA036335B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562108605P 2015-01-28 2015-01-28
US201562192331P 2015-07-14 2015-07-14
US201562247355P 2015-10-28 2015-10-28
PCT/IB2016/050383 WO2016120789A1 (en) 2015-01-28 2016-01-26 Agonistic icos binding proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791706A1 EA201791706A1 (ru) 2018-04-30
EA036335B1 true EA036335B1 (ru) 2020-10-28

Family

ID=55262868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201791706A EA036335B1 (ru) 2015-01-28 2016-01-26 Связывающие icos белки

Country Status (27)

Country Link
US (9) US20180030136A1 (ru)
EP (3) EP3575324A1 (ru)
JP (3) JP6553197B2 (ru)
KR (1) KR102315160B1 (ru)
CN (1) CN107667117B (ru)
AU (3) AU2016210867B2 (ru)
BR (1) BR112017016336A2 (ru)
CA (1) CA2974910A1 (ru)
CL (1) CL2017001921A1 (ru)
CO (1) CO2017007665A2 (ru)
CR (1) CR20170351A (ru)
DO (1) DOP2017000171A (ru)
EA (1) EA036335B1 (ru)
ES (1) ES2913871T3 (ru)
IL (1) IL253508B (ru)
JO (1) JO3745B1 (ru)
MA (3) MA41414A (ru)
MX (1) MX2017009758A (ru)
MY (1) MY185845A (ru)
PE (1) PE20180120A1 (ru)
PH (1) PH12017501347B1 (ru)
SG (1) SG11201705829TA (ru)
TW (1) TWI717332B (ru)
UA (1) UA124613C2 (ru)
UY (1) UY36539A (ru)
WO (1) WO2016120789A1 (ru)
ZA (1) ZA201704818B (ru)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2482849T3 (pl) 2009-09-30 2018-11-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Skojarzona immunoterapia w leczeniu nowotworu
EP2691419B1 (en) * 2011-03-31 2016-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos and uses thereof
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
CN105308457B (zh) 2013-03-14 2018-07-10 斯坦福大学托管董事会 检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EA035037B1 (ru) 2013-12-12 2020-04-21 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9822186B2 (en) 2014-03-28 2017-11-21 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EA201791139A1 (ru) 2014-11-26 2018-04-30 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
ES2845727T3 (es) * 2015-02-06 2021-07-27 Heat Biologics Inc Vector que coexpresa una vacuna y moléculas coestimuladoras
ME03819B (me) 2015-03-23 2021-04-20 Jounce Therapeutics Inc Antitela za icos
WO2017025871A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies
TW201723190A (zh) 2015-10-22 2017-07-01 永斯醫療股份有限公司 用於測定icos表現之基因印記
US10527613B2 (en) * 2015-11-10 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same
EP3387013B1 (en) 2015-12-07 2022-06-08 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
NZ745957A (en) 2016-04-07 2020-07-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Heterocyclic amides useful as protein modulators
AU2017247806B2 (en) 2016-04-07 2019-11-14 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides useful as protein modulators
RU2767357C2 (ru) 2016-06-14 2022-03-17 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
WO2017220990A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018025221A1 (en) 2016-08-04 2018-02-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
EP3497128A2 (en) 2016-08-09 2019-06-19 Kymab Limited Anti-icos antibodies
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018045110A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20230130174A (ko) * 2016-08-30 2023-09-11 젠코어 인코포레이티드 공자극 및 체크포인트 수용체에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
WO2018085698A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Aximmune, Inc. Beta-alethine, immune modulators, and uses thereof
JP7181878B2 (ja) * 2017-01-13 2022-12-01 タイチョウ ハンチョン バイオファーマシューティクス インコーポレイテッド Ｐｄ－１に対するモノクローナル抗体及びその適用
WO2018140644A1 (en) * 2017-01-25 2018-08-02 Musc Foundation For Research Development Modified t cells and uses thereof
JP2020509009A (ja) * 2017-02-27 2020-03-26 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ キナーゼ阻害剤としての複素環式アミド
WO2018176144A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Sunnybrook Research Institute Engineered t-cell modulating molecules and methods of using same
US20200024351A1 (en) * 2017-04-03 2020-01-23 Jounce Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Cancer
TWI788340B (zh) * 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CA3066048A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
JP2020522541A (ja) 2017-06-09 2020-07-30 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 癌を治療するためのｉｃｏｓアゴニストおよびｏｘ４０アゴニストでの組み合わせ療法
BR112019025257A2 (pt) 2017-06-09 2020-09-29 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited método para tratar câncer, e, anticorpo anti-icos ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo anti-ox40 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
SG11202001479RA (en) 2017-08-31 2020-03-30 Io Therapeutics Inc Rar selective agonists in combination with immune modulators for cancer immunotherapy
CN111094353A (zh) * 2017-09-14 2020-05-01 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 用于癌症的组合治疗
WO2019069269A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited INTERFERON GENE STIMULATOR MODULATORS USEFUL IN THE TREATMENT OF HIV
CA3077337A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modulators of stimulator of interferon genes (sting)
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
US11629189B2 (en) 2017-12-19 2023-04-18 Kymab Limited Bispecific antibody for ICOS and PD-L1
TW202000891A (zh) * 2018-03-07 2020-01-01 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 純化抗體之方法
US11242393B2 (en) 2018-03-23 2022-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
MX2020010910A (es) 2018-04-18 2021-02-09 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas dirigidas a pd-1 que contienen proteinas de fusion il-15 / il-15ra fc y dominios de union al antigeno pd-1 y usos de los mismos.
JP2021520829A (ja) 2018-04-18 2021-08-26 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＴＩＭ−３抗原結合ドメインを含む、ＴＩＭ−３標的化ヘテロ二量体融合タンパク質
GB201807924D0 (en) 2018-05-16 2018-06-27 Ctxt Pty Ltd Compounds
BR112020023451A2 (pt) 2018-05-31 2021-02-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited terapia combinada
BR112020023459A2 (pt) * 2018-05-31 2021-02-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited terapia combinada com proteínas de ligação a icos e inibidores de arginina metiltransferase
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
CN110734493B (zh) * 2018-07-20 2021-12-17 厦门大学 抗pd-1抗体及其用途
WO2020031087A1 (en) 2018-08-06 2020-02-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
US20210324081A1 (en) 2018-10-22 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
JP2022533194A (ja) 2019-05-16 2022-07-21 スティングセラ インコーポレイテッド ベンゾ［ｂ］［１，８］ナフチリジン酢酸誘導体および使用方法
CN114302875A (zh) 2019-05-16 2022-04-08 斯汀塞拉股份有限公司 氧代吖啶基乙酸衍生物及使用方法
EP3976831A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
JP2022534981A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在化シグネチャーおよび組み合わせ治療
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
GB201910304D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
GB201910305D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
WO2021018941A1 (en) * 2019-07-31 2021-02-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treating cancer
WO2021043961A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and chemotherapy
WO2021046293A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and tremelimumab
CA3171597A1 (en) 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
WO2021209357A1 (en) 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer involving anti-icos and anti-pd1 antibodies, optionally further involving anti-tim3 antibodies
AU2021256925A1 (en) 2020-04-14 2022-11-03 Ares Trading S.A. Combination treatment for cancer based upon an ICOS antibody and a PD-L1 antibody TGF-beta-receptor fusion protein
US20230151098A1 (en) * 2020-04-20 2023-05-18 Jounce Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for Vaccination and the Treatment of Infectious Diseases
GB202007099D0 (en) 2020-05-14 2020-07-01 Kymab Ltd Tumour biomarkers for immunotherapy
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
MX2023001962A (es) 2020-08-19 2023-04-26 Xencor Inc Composiciones anti-cd28.
IL300916A (en) 2020-08-31 2023-04-01 Bristol Myers Squibb Co Cell localization signature and immunotherapy
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
IL303648A (en) 2020-12-28 2023-08-01 Bristol Myers Squibb Co Antibody preparations and methods of using them
CA3196999A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Masano HUANG Methods of treating tumors
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
CA3219336A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
KR20240144422A (ko) 2022-03-15 2024-10-02 컴퓨젠 엘티디. 암 치료의 단독치료법 및 병용치료법에서 il-18bp 길항제 항체 및 이의 용도
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024030956A2 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 Mozart Therapeutics, Inc. Cd39-specific binding agents and methods of using the same
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
WO2024196952A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Tumor subtype assessment for cancer therapy

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008137915A2 (en) * 2007-05-07 2008-11-13 Medimmune, Llc Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
WO2011041613A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
WO2012131004A2 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies directed against icos and uses thereof
WO2014089113A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5559235A (en) 1991-10-29 1996-09-24 Glaxo Wellcome Inc. Water soluble camptothecin derivatives
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5342947A (en) 1992-10-09 1994-08-30 Glaxo Inc. Preparation of water soluble camptothecin derivatives
US5681835A (en) 1994-04-25 1997-10-28 Glaxo Wellcome Inc. Non-steroidal ligands for the estrogen receptor
US5491237A (en) 1994-05-03 1996-02-13 Glaxo Wellcome Inc. Intermediates in pharmaceutical camptothecin preparation
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
KR100259828B1 (ko) * 1995-09-11 2000-06-15 히라타 다다시 인체 인터루킨 5 수용체 알파-사슬에 대한 항체
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
US7259247B1 (en) 1997-09-23 2007-08-21 Bundersrespublik Deutschaland Letztvertreten Durch Den Direktor Des Robert-Koch-Institutes Anti-human T-cell costimulating polypeptide monoclonal antibodies
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
JP2003532370A (ja) 1998-10-07 2003-11-05 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規なＴｈ２特異的分子およびその使用方法
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
IL146954A0 (en) 1999-06-25 2002-08-14 Genentech Inc HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3597140B2 (ja) * 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP5004261B2 (ja) 2000-05-19 2012-08-22 コリクサ コーポレイション 単糖類及び二糖類に基づく化合物を用いた感染症及び他の疾患の予防的並びに治療的な処置
CZ299561B6 (cs) 2000-06-30 2008-09-03 Glaxo Group Limited Chinazolinaminový derivát a farmaceutický prostredek
AU8100101A (en) 2000-08-04 2002-02-18 Corixa Corp New immunoeffector compounds
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6374470B1 (en) 2000-10-06 2002-04-23 Milliken & Company Face plate for spun-like textured yarn
AU2002308267A1 (en) 2001-01-16 2002-10-03 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human icos v protein
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
US20050202442A1 (en) 2003-12-15 2005-09-15 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
AU2002357427A1 (en) 2001-12-04 2003-06-17 Tegenero Ag Peptide or protein containing a c'-d loop of the cd28 receptor family
US6911434B2 (en) 2002-02-04 2005-06-28 Corixa Corporation Prophylactic and therapeutic treatment of infectious and other diseases with immunoeffector compounds
US6525028B1 (en) 2002-02-04 2003-02-25 Corixa Corporation Immunoeffector compounds
US20040029226A1 (en) 2002-03-06 2004-02-12 John Alsobrook Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
IL164376A0 (en) 2002-04-03 2005-12-18 Applied Research Systems Ox4or binding agents, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
CA2489004C (en) 2002-06-13 2013-01-08 Crucell Holland B.V. Agonistic binding molecules to the human ox40 receptor
WO2004003544A1 (en) 2002-06-26 2004-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of demyelinating inflammatory disorders
JP4409430B2 (ja) 2002-07-03 2010-02-03 小野薬品工業株式会社 免疫賦活組成物
EP2322201A3 (en) 2002-10-29 2011-07-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
EP2314676A1 (en) 2002-11-26 2011-04-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
PL378879A1 (pl) 2002-12-30 2006-05-29 Amgen Inc. Terapia skojarzona z czynnikami kostymulującymi
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CN117534755A (zh) 2005-05-09 2024-02-09 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
KR101888321B1 (ko) 2005-07-01 2018-08-13 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
WO2007011041A1 (ja) 2005-07-22 2007-01-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え抗体組成物
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
EP1938104A2 (en) 2005-10-17 2008-07-02 Institute for Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
US8058402B2 (en) * 2006-08-28 2011-11-15 Kyowa Hakko Kirin Antagonistic human LIGHT-specific human monoclonal antibodies
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
WO2009052431A2 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Seattle Genetics, Inc. Cd19 binding agents and uses thereof
BRPI0820875B1 (pt) 2007-12-14 2021-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Molécula de ligação isolada, anticorpo monoclonal humano, composição, molécula de ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
US9931386B2 (en) 2008-06-16 2018-04-03 Atsuo Ochi Recombinant multiple domain fusion protein mitogens and use thereof for inducing enhancement or repression of antigen-specific immunity
BRPI0921845A2 (pt) 2008-11-12 2019-09-17 Medimmune Llc formulação aquosa estéril estável, forma de dosagem unitária farmacêutica, seringa pré-carregada, e, métodos para tratar uma doença ou distúrbio, para tratar ou prevenir rejeição, para esgotar células t que expressam icos em um paciente humano, e para interromper arquitetura central germinal em um órgão linfóide secundário de um primata
WO2011020024A2 (en) 2009-08-13 2011-02-17 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
MX359551B (es) 2009-11-24 2018-10-02 Medimmune Ltd Agentes de union diana contra b7-h1.
BR112012013736A2 (pt) * 2009-12-07 2018-08-14 Univ Leland Stanford Junior processo para intesificação de terapia com anticorpos antitumor
EP2531216B1 (en) * 2010-02-04 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
TWI508273B (zh) 2010-03-19 2015-11-11 Xintec Inc 影像感測元件封裝構件及其製作方法
US20120121633A1 (en) 2010-07-16 2012-05-17 Sudhir Paul Hiv cd4 binding site based covalent immunogen compositions
WO2013028231A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
MX339964B (es) 2010-08-23 2016-06-17 Board Of Regents The Univ Of Texas System * Anticuerpos anti-ox40 y metodos para usarlos.
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
EP2892928B1 (en) 2012-09-03 2018-05-30 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos for treating graft-versus-host disease
CN107892719B (zh) 2012-10-04 2022-01-14 达纳－法伯癌症研究所公司 人单克隆抗-pd-l1抗体和使用方法
JOP20200094A1 (ar) * 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
CN106999583A (zh) * 2014-11-17 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
MA41414A (fr) 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
WO2017025871A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies
WO2018025221A1 (en) * 2016-08-04 2018-02-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
CN111094353A (zh) * 2017-09-14 2020-05-01 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 用于癌症的组合治疗
US20210395367A1 (en) * 2018-10-22 2021-12-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing
US20210324081A1 (en) * 2018-10-22 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing
CA3171597A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
AU2021256925A1 (en) * 2020-04-14 2022-11-03 Ares Trading S.A. Combination treatment for cancer based upon an ICOS antibody and a PD-L1 antibody TGF-beta-receptor fusion protein
WO2021209357A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer involving anti-icos and anti-pd1 antibodies, optionally further involving anti-tim3 antibodies

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008137915A2 (en) * 2007-05-07 2008-11-13 Medimmune, Llc Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
WO2011041613A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
WO2012131004A2 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies directed against icos and uses thereof
WO2014089113A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. FOS, A. SALLES, V. LANG, F. CARRETTE, S. AUDEBERT, S. PASTOR, M. GHIOTTO, D. OLIVE, G. BISMUTH, J. A. NUNES: "ICOS Ligation Recruits the p50� PI3K Regulatory Subunit to the Immunological Synapse", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, US, vol. 181, no. 3, 1 August 2008 (2008-08-01), US, pages 1969 - 1977, XP055255651, ISSN: 0022-1767, DOI: 10.4049/jimmunol.181.3.1969 *
PRIYA SAKTHIVEL, GEREKE MARCUS, BREITHAUPT ANGELE, FUCHS DIETMAR, GIGLIOTTI LUCA, GRUBER ACHIM, DIANZANI UMBERTO, BRUDER DUNJA, GU: "Attenuation of Immune-Mediated Influenza Pneumonia by Targeting the Inducible Co-Stimulator (ICOS) Molecule on T Cells", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, vol. 9, no. 7, 16 July 2014 (2014-07-16), pages e100970, XP055255507, DOI: 10.1371/journal.pone.0100970 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180002593A (ko) 2018-01-08
TWI717332B (zh) 2021-02-01
MA47323A (fr) 2019-11-27
US9738718B2 (en) 2017-08-22
US10351627B2 (en) 2019-07-16
JP7062704B2 (ja) 2022-05-17
JP6553197B2 (ja) 2019-07-31
US20180334503A1 (en) 2018-11-22
US20180030136A1 (en) 2018-02-01
CN107667117A (zh) 2018-02-06
US20200140551A1 (en) 2020-05-07
US20170174767A1 (en) 2017-06-22
JP2020079252A (ja) 2020-05-28
PE20180120A1 (es) 2018-01-18
CR20170351A (es) 2018-01-22
UA124613C2 (uk) 2021-10-20
JP2019167355A (ja) 2019-10-03
ES2913871T3 (es) 2022-06-06
JO3745B1 (ar) 2021-01-31
AU2016210867B2 (en) 2018-11-08
CN107667117B (zh) 2021-12-28
EA201791706A1 (ru) 2018-04-30
MA41414A (fr) 2017-12-05
JP6653782B2 (ja) 2020-02-26
KR102315160B1 (ko) 2021-10-19
CO2017007665A2 (es) 2017-10-20
AU2020294301A1 (en) 2021-02-25
IL253508B (en) 2021-12-01
MX2017009758A (es) 2018-03-07
US11130811B2 (en) 2021-09-28
US20170313777A1 (en) 2017-11-02
IL253508A0 (en) 2017-09-28
CL2017001921A1 (es) 2018-03-16
AU2019200751B2 (en) 2020-12-03
PH12017501347A1 (en) 2017-12-11
JP2018505177A (ja) 2018-02-22
ZA201704818B (en) 2019-01-30
US9771424B2 (en) 2017-09-26
MY185845A (en) 2021-06-13
CA2974910A1 (en) 2016-08-04
US20220064299A1 (en) 2022-03-03
US20160215059A1 (en) 2016-07-28
US20200123257A1 (en) 2020-04-23
TW201702267A (zh) 2017-01-16
AU2019200751A1 (en) 2019-02-21
WO2016120789A1 (en) 2016-08-04
SG11201705829TA (en) 2017-08-30
AU2016210867A1 (en) 2017-08-03
EP3572432A1 (en) 2019-11-27
PH12017501347B1 (en) 2017-12-11
MA47386A (fr) 2019-12-04
BR112017016336A2 (pt) 2018-03-27
US20160362494A1 (en) 2016-12-15
EP3250603B1 (en) 2022-03-30
DOP2017000171A (es) 2017-10-31
EP3575324A1 (en) 2019-12-04
UY36539A (es) 2016-08-31
EP3250603A1 (en) 2017-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019200751B2 (en) Agonistic ICOS binding proteins
US20210155903A1 (en) Combination Therapy
US11649289B2 (en) Anti-ICOS and anti-PD-1 antibody combination therapy
JP2022539178A (ja) Ｉｌ１ｒａｐ結合タンパク質