ES2913871T3 - Proteínas de unión a ICOS agonistas - Google Patents

Abstract

Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma que comprende CDRH1 tal como se expone en SEQ ID NO: 1; CDRH2 tal como se expone en SEQ ID NO: 2; CDRH3 tal como se expone en SEQ ID NO: 3; CDRL1 tal como se expone en SEQ ID NO: 4; CDRL2 tal como se expone en SEQ ID NO: 5 y CDRL3 tal como se expone en SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a ICOS agonistas

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia en el tratamiento de enfermedades humanas y a la reducción de acontecimientos adversos relacionados con las mismas. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de proteínas de unión a ICOS incluyendo anticuerpos agonistas de ICOS y a su uso como imunomoduladores en el tratamiento de cáncer, enfermedades infecciosas y/o síndrome séptico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La potenciación de la función de células T antitumorales y la inducción de la proliferación de células T es un enfoque nuevo y poderoso para el tratamiento del cáncer. Actualmente se comercializan tres anticuerpos de inmunooncología (por ejemplo, inmunomoduladores). Se cree que el anticuerpo anti-CTLA-4 (YERVOY/ipilimumab) aumenta las respuestas inmunitarias en el punto de sensibilización de células T y se cree que los anticuerpos anti-PD-1 (OPDIVO/nivolumab y KEYTRUDA/pembrolizumab) actúan en el microentorno tumoral local, aliviando un punto de control inhibidor en células T específicas de tumor que ya se han sensibilizado y activado.

ICOS es un receptor de células T coestimulador con relación estructural y funcional con la superfamilia de CD28/CTLA-4-Ig (Hutloff, et al., “ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28”, Nature, 397: 263-266 (1999)). La activación de ICOS se produce a través de la unión por ICOS-L (B7RP-1/B7-H2). Ni B7-1 ni B7-2 (ligandos para CD28 y CTLA4) se unen a o activan ICOS. Sin embargo, se ha mostrado que ICOS-L se une débilmente tanto a c D28 como a CTLA-4 (Yao S et al., “B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”, Immunity, 34(5); 729­ 40 (2011)). La expresión de ICOS parece estar restringida a células T. Los niveles de expresión de ICOS varían entre diferentes subconjuntos de células T y según el estado de activación de células T. Se ha mostrado expresión de ICOS en células TH17, células auxiliares foliculares T (TFH) y células T reguladoras (Treg) en reposo; sin embargo, a diferencia de CD28; no se expresa de manera elevada en poblaciones de células T efectoras TL1 y TH2 sin tratamiento previo (Paulos CM et al., “The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells”, Sci Transl Med, 2(55); 55ra78 (2010)). La expresión de ICOS se induce de manera elevada en células T efectoras CD4+ y CD8+ tras la activación a través del acoplamiento a TCR (Wakamatsu E, et al., “Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells”, Proc Natal Acad Sci USA, 110(3); 1023-8 (2013)). La señalización coestimuladora a través del receptor ICOS solo se produce en células T que reciben una señal de activación de TCR simultánea (Sharpe AH y Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002)). En células T específicas de antígeno activadas, ICOS regula la producción de citocinas tanto TL1 como T^h2 incluyendo IFN-y, TNF-a, IL-10, IL-4, IL-13 y otras. ICOS también estimula la proliferación de células T efectoras, aunque en un menor grado que CD28 (Sharpe AH y Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002)).

Un conjunto creciente de referencias bibliográficas apoya la idea de que la activación de ICOS en células T efectoras CD4+ y CD8+ tiene potencial antitumoral. Una proteína de fusión de ICOS-L-Fc provocó un retraso en el crecimiento tumoral y la erradicación completa del tumor en ratones con tumores singénicos SA-1 (sarcoma), Met A (fibrosarcoma), EMT6 (mama) y P815 (mastocitoma) y EL-4 (plasmacitoma), mientras que no se observó actividad en el modelo de tumor B16-F10 (melanoma) que se sabe que es escasamente inmunogénico (Ara G et al., “Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors in syngeneic hosts”, Int. J Cancer, 103(4); 501-7 (2003)). La actividad antitumoral de ICOS-L-Fc era dependiente de una respuesta inmunitaria intacta, ya que se perdió completamente la actividad en tumores que crecieron en ratones desnudos. El análisis de los tumores de los ratones tratados con ICOS-L-Fc demostró un aumento significativo en la infiltración de células T CD4+ y CD8+ en tumores sensibles al tratamiento, apoyando el efecto inmunoestimulador de ICOS-L-Fc en estos modelos.

Otro informe que usó ratones ICOS'/' y ICOS-L’7’ demostró el requisito de señalización de ICOS para la mediación en la actividad antitumoral de un anticuerpo anti-CTLA4 en el modelo de tumor singénico de melanoma B16/B16 (Fu T et al., “The ICOS/ICOSL pathway is required for optimal antitumor responses mediated by anti-CTLA-4 therapy”, Cancer Res, 71(16); 5445-54 (2011)). Los ratones que carecían de ICOS o ICOS-L tenían tasas de supervivencia significativamente disminuidas en comparación con ratones de tipo natural tras el tratamiento con anticuerpo anti-CTLA4. En un estudio separado, se transdujeron células tumorales B16/B16 para que sobrexpresaran ICOS-L murino recombinante. Se encontró que estos tumores eran significativamente más sensibles al tratamiento anti-CTLA4 en comparación con células tumorales B16/B16 transducidas con una proteína de control (Allison J et al., “Combination Immunotherapy for the treatment of cancer”, documento WO2011/041613 A2 (2009)). Estos estudios proporcionan pruebas del potencial antitumoral de un agonista de ICOS, tanto solo como en combinación con otros anticuerpos inmunomoduladores.

Nuevos datos de pacientes tratados con anticuerpos anti-CTLA4 también apuntan al papel positivo de células T efectoras ICOS+ en la mediación en una respuesta inmunitaria antitumoral. Pacientes con melanoma metastásico (Giacomo AMD et al., “Long-term survival and immunological parameters in metastatic melanoma patients who respond to ipilimumab 10 mg/kg within an expanded access program”, Cancer Immunol Immunother., 62(6); 1021-8 (2013)); cáncer urotelial (Carthon BC et al., “Preoperative CTLA-4 blockade: Tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial” Clin Cancer Res., 16(10); 2861-71 (2010)); de mama (Vonderheide RH et al., “Tremelimumab in combination with exemestane in patients with advanced breast cancer and treatment-associated modulation of inducible costimulator expression on patient T cells”, Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010)); y de próstata que tienen recuentos absolutos aumentados de células T CD4+ICOS+ y CD8+ICOS+ circulantes e infiltrantes en el tumor después del tratamiento con ipilimumab tienen desenlaces relacionados con el tratamiento significativamente mejores que pacientes donde se observaron pocos o ningún aumento. De manera importante, se mostró que ipilimumab cambia la razón de Treg:T efectoras ICOS+, revirtiendo una abundancia de Treg antes del tratamiento a una abundancia significativa de T efectoras frente a Treg tras el tratamiento (Liakou CI et al., “CTLA-4 blockade increases IFN-gamma producing CD4+ICOShi cells to shift the ratio of effector to regulatory T cells in cancer patients”, Proc Natl Acad Sci u Sa . 105(39); 14987-92 (2008)) y (Vonderheide RH et al., Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010)). Por tanto, las células T efectoras positivas para ICOS son un biomarcador predictivo positivo de la respuesta a ipilimumab que apunta a la ventaja potencial de activar esta población de células con un anticuerpo frente a ICOS agonista.

El documento WO2011/041613 da a conocer agonistas para ICOS en combinación con un agente bloqueante para un receptor inhibidor de células T (por ejemplo, CTLA-4, PD-L1) para el tratamiento de tumores.

Por tanto, existe la necesidad de moléculas inductoras de la proliferación de células T adicionales en el tratamiento del cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En una realización de la presente invención, se proporcionan proteínas de unión a ICOS o porciones de unión a antígeno de las mismas que comprenden CDRH1 tal como se expone en SEQ ID NO: 1; CDRH2 tal como se expone en SEQ ID NO: 2; CDRH3 tal como se expone en SEQ ID NO: 3; CDRL1 tal como se expone en SEQ ID NO: 4; c Dr L2 tal como se expone en SEQ ID NO: 5 y CDRL3 tal como se expone en SEQ ID NO: 6.

En una realización de la presente invención, se proporcionan proteínas de unión a ICOS o porciones de unión a antígeno de las mismas que se unen específicamente a ICOS humano, en las que dicha proteína de unión a ICOS comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8.

En una realización, se proporcionan anticuerpos monoclonales humanizados o porciones de unión a antígeno de los mismos que comprenden CDR de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 1; s Eq ID NO: 2; y SEQ ID NO: 3 y c Dr de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y s Eq ID NO: 6. En una realización, se proporcionan anticuerpos monoclonales humanizados que comprenden un armazón de hIgG4PE; un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; y un dominio V^l que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. Los anticuerpos de la presente invención pueden estimular la producción de citocinas cuando se ponen en contacto con una célula T.

En una realización, se proporcionan proteínas de unión a ICOS que compiten por la unión a ICOS humano con una cualquiera de las proteínas de unión a ICOS o porciones de unión a antígeno de las mismas de la invención.

En una realización, se proporcionan métodos para tratar cáncer, enfermedades infecciosas y/o síndrome séptico con una proteína de unión a ICOS o una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de unión a ICOS de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Producción de IFN-y a partir de células T CD4+CD25-.

Figura 2: Proliferación en células T CD4+CD25-.

Figura 3: La variante humanizada H2L5 de 422.2 anti-ICOS muestra una mejor producción de citocinas en células PBMC.

Figura 4: 422 H2L5 IgG1 indujo una disminución de la viabilidad de células T que no era evidente con los isotipos de hIgG4PE o deshabilitado en Fc.

Figura 5: La respuesta a la dosis de H2L5 hIgG4PE indujo la inducción de citocinas proinflamatorias en células T CD4+ humanas.

Figura 6: H2L5 hIgG4PE induce proliferación, producción de citocinas y potencial citotóxico aumentado en PBMC activadas de donantes humanos sanos.

Figura 7: Ensayo de descubrimiento de mesoescala (MSD) que muestra la inhibición de la unión de ICOS-L a ICOS por H2L5 hIgG4PE, lo que indica que se une al mismo epítopo en ICOS que ICOS-L y compite por la unión.

Figura 8: Genes de VH y VL de anticuerpos recuperados a partir de ARN del clon de hibridoma 422.2.

Figura 9: Secuencias de proteínas de cadenas pesadas y ligeras de H2L5 hIgG4PE con secuencia señal.

Figura 10: Secuencia de ADN de la región codificante de la cadena pesada de H2L5 hIgG4PE con secuencia señal. Figura 11: Secuencia de ADN de la región codificante de la cadena ligera de H2L5 hIgG4PE con secuencia señal. Figura 12: Concentraciones en plasma de H2L5 hIgG4PE en monos cynomolgus. Se determinaron las concentraciones después de la (A) primera o (B) segunda dosis (día 15) de H2L5 hIgG4PE. Se sacrificaron los animales 48 horas después de la segunda dosis para la recogida de muestras tisulares y el análisis de histopatología.

Figura 13: Detección de la unión de H2L5 hIgG4PE a células T CD4+ de los ganglios linfáticos axilares y del bazo de los monos. Se recogió el tejido 48 horas después de la segunda dosis (día 17).

Figura 14: Ocupación del receptor de H2L5 hIgG4PE en células T CD4+ sanguíneas de monos cynomolgus.

(A) “Receptor ICOS libre” tal como se mide mediante unión positiva del anticuerpo anti-ICOS marcado fluorescentemente usado para la citometría de flujo, que se une solo cuando no está presente H2L5 hIgG4PE. (B) H2L5 hIgG4PE unido al receptor en células CD4+ de sangre periférica tal como se mide mediante anticuerpo anti-IgG humana marcado fluorescentemente.

Figura 15 (a) Niveles de expresión de Fosfo-AKT (T308) en células Ba/F3-ICOS tratadas con H2L5 hIgG4PE - matriz de anticuerpos de señalización intracelular (b) niveles de expresión de Fosfo-AKT (S473) en células Ba/F3-ICOS tratadas con H2L5 hIgG4PE - matriz de anticuerpos de señalización intracelular.

Figura 16: H2L5 hIgG4PE en combinación con ipilimumab da como resultado un aumento de la producción de citocinas proinflamatorias en comparación con el tratamiento con un solo anticuerpo en el ensayo de preestimulación de PBMC. Figura 17: H2L5 hIgG4PE en combinación con pembrolizumab da como resultado un aumento de la producción de citocinas proinflamatorias en comparación con el tratamiento con un solo anticuerpo en el ensayo de preestimulación de PBMC.

Figura 18: La combinación de H2L5 hIgG4PE más ipilimumab induce un aumento de la producción de citocinas proinflamatorias en un ensayo de MLR modificado con péptido CEFT y preincubación.

Figura 19: La combinación de H2L5 hIgG4PE más pembrolizumab induce un aumento de la producción de citocinas proinflamatorias en un ensayo de MLR modificado con péptido CEFT y preincubación.

Figura 20: El AcM agonista anti-ICOS H2L5 hIgG4PE solo y en combinación con pembrolizumab da como resultado la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de tumor de ratón de melanoma A2058 de PBMC humanas. Figura 21: El AcM sustituto murino anti-ICOS da como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y un aumento de la supervivencia en combinación con un AcM sustituto murino anti-PD 1 en el modelo de tumor de ratón CT26.

Figura 22: El AcM sustituto murino anti-ICOS da como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y un aumento de la supervivencia en combinación con un AcM sustituto murino anti-PD 1 en el modelo de tumor de ratón EMT6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

DEFINICIONES

Tal como se usa en el presente documento, “ICOS” significa cualquier proteína coestimuladora de células T inducible. Los pseudónimos de ICOS (coestimulador de células T inducible, Inducible cell T COStimulator) incluyen AILIM; CD278; CVID1, JTT-1 o JTT-2, MGC39850 o 8F4. ICOS es una molécula coestimuladora de la superfamilia de CD28 que se expresa en células T activadas. La proteína codificada por este gen pertenece a la familia de receptores de superficie celular CD28 y CTLA-4. Forma homodímeros y desempeña un importante papel en la señalización célulacélula, respuestas inmunitarias y regulación de la proliferación celular. La secuencia de aminoácidos de ICOS humano se muestra a continuación como SEQ ID NO: 10.

MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTV

SIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAF

VWCILGCILICWLTKKM (SEQIDNO:10)

Tal como se usa en el presente documento “ICOS-L” y “ligando de ICOS” se usan indistintamente y se refieren al ligando natural unido a la membrana de ICOS humano. El ligando de ICOS es una proteína que, en seres humanos, está codificada por el gen ICOSLG. ICOSLG se ha designado también como CD275 (grupo de diferenciación 275). Los pseudónimos de ICOS-L incluyen B7RP-1 y B7-H2.

Tal como se usa en el presente documento, el término “agonista” se refiere a una proteína de unión a antígeno, por ejemplo una proteína de unión a ICOS, que, tras el contacto con ICOS provoca uno o más de los siguientes (1) estimula o activa el receptor ICOS, (2) potencia, aumenta o promueve, induce o prolonga una actividad, función o presencia de ICOS y/o (3) potencia, aumenta, promueve o induce la expresión del ICOS. La actividad agonista puede medirse in vitro mediante diversos ensayos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, medición de la señalización celular, proliferación celular, marcadores de activación de células inmunitarias, producción de citocinas. La actividad agonista puede medirse también in vivo mediante diversos ensayos que miden criterios de valoración sustitutos tales como, pero sin limitarse a, la medición de la proliferación de células T o la producción de citocinas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “compite de manera cruzada por la unión” se refiere a cualquier proteína de unión a ICOS que competirá por la unión a ICOS con cualquiera de las proteínas de unión a ICOS de la presente invención. La competencia por la unión entre dos moléculas para ICOS puede someterse a prueba mediante diversos métodos conocidos en la técnica incluyendo citometría de flujo, descubrimiento de mesoescala y ELISA. La unión puede medirse directamente, lo que significa que dos o más proteínas de unión pueden ponerse en contacto con ICOS y la unión puede medirse para una o cada una. Alternativamente, la unión de moléculas o interés puede someterse a prueba frente al ligando de unión o natural y compararse cuantitativamente entre sí.

El término “proteína de unión a ICOS” tal como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos y otros constructos proteicos, tales como dominios, que son capaces de unirse a ICOS. En algunos casos, el ICOS es ICOS humano. El término “proteína de unión a ICOS” puede usarse indistintamente con “proteína de unión a antígeno de ICOS”. Por tanto, tal como se entiende en la técnica, los anticuerpos anti-ICOS y/o las proteínas de unión a antígeno de ICOS se considerarían proteínas de unión a ICOS. Tal como se usa en el presente documento, “proteína de unión a antígeno” es cualquier proteína, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos, dominios y otros constructos descritos en el presente documento, que se une a un antígeno, tal como ICOS. Tal como se usa en el presente documento “porción de unión a antígeno” de una proteína de unión a ICOS incluiría cualquier porción de la proteína de unión a ICOS capaz de unirse a ICOS, incluyendo pero sin limitarse a, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno.

El término “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido más amplio para referirse a moléculas con un dominio de tipo inmunoglobulina (por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE) e incluye anticuerpos monoclonales, recombinantes, policlonales, quiméricos, humanos, humanizados, multiespecíficos, incluyendo anticuerpos biespecíficos, y anticuerpos heteroconjugado; un dominio variable individual (por ejemplo, V^h, V^hh, VL, anticuerpo de dominio (dAb™)), fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, Fab, F(ab’)², Fv, Fv unido por disulfuros, Fv de cadena sencilla, scFv unido por disulfuros, diacuerpos, TANDABS™, etc. y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores.

Los formatos de anticuerpos alternativos incluyen armazones alternativos en los que una o más CDR de la proteína de unión a antígeno pueden disponerse sobre un esqueleto o armazón proteico distinto de inmunoglobulina adecuado, tal como un aficuerpo, un armazón de SpA, un dominio de clase A de receptor de LDL, un avímero o un dominio EGF.

El término “dominio” se refiere a una estructura proteica plegada que conserva su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales diferenciadas de las proteínas y, en muchos casos, pueden añadirse, retirarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio.

El término “dominio variable individual” se refiere a un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpos. Por tanto, incluye dominios variables de anticuerpos completos tales como VH, VHH y VL y dominios variables de anticuerpos modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles se han reemplazado por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos, o dominios variables de anticuerpos que se han truncado o comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos la actividad de unión y especificidad del dominio de longitud completa. Un dominio variable individual es capaz de unirse a un antígeno o epítopo independientemente de un dominio o región variable diferente. Un “anticuerpo de dominio” o “dAb(TU)” puede considerarse el mismo que un “dominio variable individual”. Un dominio variable individual puede ser un dominio variable individual humano, pero también incluye dominios variables individuales de otras especies tales como dAb™ de V^hh de roedor, tiburón nodriza y camélido. VHH de camélido son polipéptidos de dominio variable individual de inmunoglobulina que se derivan de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada carentes de manera natural de cadenas ligeras. Tales dominios VHH pueden humanizarse según técnicas convencionales disponibles en la técnica, y tales dominios se considera que son “dominios variables individuales”. Tal como se usa en el presente documento, VH incluye dominios VHH de camélido.

Un fragmento de unión a antígeno puede proporcionarse por medio de la disposición de una o más CDR en armazones proteicos distintos de anticuerpos. “Armazón proteico” tal como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, un armazón de inmunoglobulina (Ig), por ejemplo un armazón de IgG, que puede ser un anticuerpo de cuatro cadenas o dos cadenas, o que puede comprender solo la región Fc de un anticuerpo, o que puede comprender una o más regiones constantes de un anticuerpo, regiones constantes que pueden ser de origen humano o de primate, o que pueden ser una quimera artificial de regiones constantes humanas y de primate.

El armazón proteico puede ser un armazón de Ig, por ejemplo un armazón de IgG o IgA. El armazón de IgG puede comprender algunos o todos los dominios de un anticuerpo (es decir, CH1, CH2, CH3, VH, VL). La proteína de unión a antígeno puede comprender un armazón de IgG seleccionado de IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgG4PE. Por ejemplo, el armazón puede ser IgG 1. El armazón puede consistir en, o comprenden, la región Fc de un anticuerpo, o es una parte de la misma.

El armazón proteico puede ser un derivado de un armazón seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4, lipocalina, moléculas derivadas de proteína A tales como dominio Z de proteína A (aficuerpo, SpA), dominio A (avímero/maxicuerpo); proteínas de choque térmico tales como GroEl y GroES; transferrina (transcuerpo); proteína de repetición de anquirina (DARPin); aptámero peptídico; dominio de lectina de tipo C (tetranectina); Y-cristalina humana y ubiquitina humana (afilinas); dominios PDZ; dominios de tipo kunitz de toxina de escorpión de inhibidores de proteasas humanas; y fibronectina/adnectina; que se ha sometido a ingeniería de proteínas con el fin de obtener la unión a un antígeno, tal como ICOS, distinto del ligando natural.

Sitio de unión a antígeno se refiere a un sitio en una proteína de unión a antígeno que es capaz de unirse específicamente a un antígeno, este puede ser un dominio variable individual, o pueden ser dominios VH/VL emparejados tal como puede encontrarse en un anticuerpo convencional. Los dominios Fv de cadena sencilla (ScFv) pueden proporcionar también sitios de unión a antígeno. El término “dominio de unión a epítopo” se refiere a un dominio que se une específicamente a una región de un antígeno conocida como epítopo independientemente de un dominio diferente.

El término proteína de unión a antígeno multiespecífica se refiere a proteínas de unión a antígeno que comprenden al menos dos sitios de unión a antígeno diferentes. Cada uno de estos sitios de unión a antígeno será capaz de unirse a un epítopo diferente, que puede estar presente en el mismo antígeno o antígenos diferentes. La proteína de unión a antígeno multiespecífica tendrá especificidad por más de un antígeno, por ejemplo dos antígenos, o por tres antígenos, o por cuatro antígenos.

Los ejemplos de proteínas de unión a antígeno multiespecíficas incluyen las que consisten en, o consisten esencialmente en, una región Fc de un anticuerpo, o una parte de la misma, unida en cada extremo, directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de una secuencia de ligador) a un dominio de unión. Una proteína de unión a antígeno de este tipo puede comprender dos dominios de unión separados por una región Fc, o parte de la misma. Por separado quiere decirse que los dominios de unión no están unidos directamente entre sí, y pueden estar ubicados en extremos opuestos (extremos C y N terminales) de una región Fc, o cualquiera otra región de armazón.

La proteína de unión a antígeno puede comprender dos regiones de armazón, cada una unida a dos dominios de unión, por ejemplo en los extremos N y C terminales de cada región de armazón, o bien directamente o bien indirectamente por medio de un ligador. Cada dominio de unión puede unirse a un antígeno diferente.

Tal como se usa en el presente documento, el término mAbdAb se refiere a un anticuerpo monoclonal unido a un dominio de unión adicional, en particular un dominio variable individual tal como un anticuerpo de dominio. Un mAbdAb tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos uno de los cuales es de un anticuerpo de dominio, y al menos uno es de un dominio VH/VL emparejado.

Un “conjugado de dAb™” se refiere a una composición que comprende un dAb al que se conjuga químicamente un fármaco por medio de una unión covalente o no covalente. Preferiblemente, el dAb y el fármaco se unen covalentemente. Tal unión covalente podría ser a través de un enlace peptídico u otros medios tales como por medio de una cadena lateral modificada. Una unión no covalente puede ser directa (por ejemplo, interacción electrostática, interacción hidrófoba) o indirecta (por ejemplo, a través de unión no covalente de parejas de unión complementarias (por ejemplo, biotina y avidina), en la que una pareja se une covalentemente al fármaco y la pareja de unión complementaria se une covalentemente al dAb™). Cuando se emplean parejas de unión complementarias, una de las parejas de unión puede unirse covalentemente al fármaco directamente o a través de un resto ligador adecuado, y la pareja de unión complementaria puede unirse covalentemente al dAb™ directamente o a través de un resto ligador adecuado.

Tal como se usa en el presente documento, “fusión de dAb™” se refiere a una proteína de fusión que comprende un dAb™ y un fármaco polipeptídico (que podría ser un dAb™ o AcM). El dAb™ y el fármaco polipeptídico están presentes como partes diferenciadas (restos) de una sola cadena polipeptídica continua.

En una realización, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación muestran reactividad cruzada entre ICOS humano e ICOS de otras especies, tales como ICOS de cynomolgus. En una realización, las proteínas de unión a antígeno de la invención se unen específicamente a ICOS humano y de cynomolgus. La provisión de un fármaco que puede unirse a especies de monos y humana permite que se sometan a prueba los resultados en estos sistemas y se realicen comparaciones de datos lado a lado usando el mismo fármaco. Se prevé reactividad cruzada entre otras especies usadas en modelos de enfermedad tales como perro o mono, en particular mono.

La competencia entre una proteína de unión a ICOS y una proteína de unión a ICOS de referencia puede determinarse mediante MSD, ELISA, FMAT o BIAcore de competencia. En una realización, el ensayo de competencia se lleva a cabo mediante comparación de una proteína de unión a ICOS con la unión al ligando de ICOS. Hay varios posibles motivos para esta competencia: las dos proteínas pueden unirse a los mismos epítopos o epítopos solapantes, puede haber inhibición estérica de la unión o la unión de la primera proteína puede inducir un cambio conformacional del antígeno que impide o reduce la unión de la segunda proteína.

El término “neutraliza” tal como se usa en toda la presente memoria descriptiva significa que la interacción entre ICOS e ICOS-L se reduce en presencia de una proteína de unión a antígeno tal como se describe en el presente documento en comparación con la interacción de ICOS e ICOS-L en ausencia de la proteína de unión a ICOS, in vitro o in vivo. La neutralización puede deberse a uno o más de bloqueo de la unión de ICOS a su ligando, prevención de la activación de ICOS por su ligando, regulación por disminución de ICOS o su receptor, o afectación de la funcionalidad efectora. Por ejemplo, puede usarse la competencia por la unión al ligando descrita en los ejemplos 3 y 5 para evaluar la capacidad de neutralización de una proteína de unión a ICOS.

El efecto de una proteína de unión a ICOS sobre la interacción entre ICOS e ICOS-L puede ser parcial o total. Una proteína de unión a ICOS neutralizante puede bloquear la interacción de ICOS con ICOS-L en al menos el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 82 %, el 84 %, el 86 %, el 88 %, el 90 %, el 92 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % en relación con las interacciones ICOS - ICOS-L en ausencia de la proteína de unión a ICOS.

La neutralización puede determinarse o medirse usando uno o más ensayos conocidos por el experto en la técnica o tal como se describe en el presente documento.

La afinidad es la fuerza de unión de una molécula, por ejemplo una proteína de unión a antígeno de la invención, a otra, por ejemplo su antígeno diana, en un sitio de unión individual. La afinidad de unión de una proteína de unión a antígeno a su diana puede determinarse mediante métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)), o cinética (por ejemplo, análisis BIACORe ™). Por ejemplo, los métodos Biacore™ descritos en el ejemplo 5 pueden usarse para medir la afinidad de unión.

La avidez es la suma total de la fuerza de unión de dos moléculas entre sí en múltiples sitios, por ejemplo teniendo en cuenta la valencia de la interacción.

En una realización, la constancia de disociación (KD) de equilibrio de la interacción de proteína de unión a ICOS-ICOS es de 100 nM o menos, 10 nM o menos, 2 nM o menos o 1 nM o menos. Alternativamente, la KD puede ser de entre 5 y 10 nM; o entre 1 y 2 nM. La KD puede ser de entre 1 pM y 500 pM; o entre 500 pM y 1 nM. Un experto en la técnica apreciará que cuanto menor sea el valor numérico de KD, más fuerte será la unión. La inversa de KD (es decir, 1/KD) es la constante de asociación (KA) de equilibrio que tiene las unidades M-1. Un experto en la técnica apreciará que cuanto mayor es el valor numérico de KA, más fuerte será la unión.

La constante de velocidad de disociación (kd) o “constante de disociación” describe la estabilidad del complejo de proteína de unión a ICOS-ICOS, es decir, la fracción de complejos que se descomponen por segundo. Por ejemplo, una kd de 0,01 s-1 equivale a una descomposición del 1 % de los complejos por segundo. En una realización, la constante de velocidad de disociación (kd) es de 1x10-3 s-1 o menos, 1x10-4 s-1 o menos, 1x10-5 s-1 o menos, o 1x10-6 s-1 o menos. La kd puede ser de entre 1x10-5 s-1 y 1x10-4 s-1; o entre 1x10-4 s-1 y 1x10-3 s-1.

La constante de velocidad de asociación (ka) o “constante de asociación” describe la velocidad de formación del complejo de proteína de unión a ICOS-ICOS. En una realización, la constante de velocidad de asociación (ka) es de aproximadamente 1,0 x 105 M-1s-1.

Por “aislado” se entiende que la molécula, tal como una proteína de unión a antígeno o ácido nucleico, se retira del entorno en el que puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, la molécula puede purificarse de las sustancias con las que existiría normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, la masa de la molécula en una muestra puede ser el 95 % de la masa total.

El término “vector de expresión” tal como se usa en el presente documento significa un ácido nucleico aislado que puede usarse para introducir un ácido nucleico de interés en una célula, tal como una célula eucariota o célula procariota, o un sistema de expresión libre de células donde la secuencia de ácido nucleico de interés se expresa como una cadena peptídica tal como una proteína. Tales vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, cósmidos, plásmidos, secuencias virales, transposones y ácidos nucleicos lineales que comprenden un ácido nucleico de interés. Una vez que el vector de expresión se introduce en una célula o sistema de expresión libre de células (por ejemplo, lisado de reticulocitos), se produce la proteína codificada por el ácido nucleico de interés mediante la maquinaria de transcripción/traducción. Los vectores de expresión dentro del alcance de la divulgación pueden proporcionar los elementos necesarios para la expresión eucariota o procariota e incluyen vectores dirigidos por promotores virales, tales como vectores dirigidos por promotores de CMV, por ejemplo, pcDNA3.1, pCEP4, y sus derivados, vectores de expresión de Baculovirus, vectores de expresión de Drosophila y vectores de expresión que están dirigidos por promotores de genes de mamíferos, tales como promotores de genes de Ig humana. Otros ejemplos incluyen vectores de expresión procariotas, tales como vectores dirigidos por promotores de T7, por ejemplo, pET41, vectores dirigidos por promotor de lactosa y vectores dirigidos por promotor de gen de arabinosa. Los expertos habituales en la técnica reconocerán muchos otros vectores de expresión y sistemas de expresión adecuados.

El término “célula huésped recombinante” tal como se usa en el presente documento significa una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico de interés que se aisló antes de su introducción en la célula. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de interés puede estar en un vector de expresión mientras que la célula puede ser procariota o eucariota. Células eucariotas a modo de ejemplo son células de mamífero, tales como, pero sin limitarse a, células COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, HepG2, 653, SP2/0, NS0, 293, HeLa, de mieloma, linfoma o cualquier derivado de las mismas. Lo más preferiblemente, la célula eucariota es una célula HEK293, NS0, SP2/0 o CHO. E. coli es una célula procariota a modo de ejemplo. Una célula recombinante según la divulgación puede generarse mediante transfección, fusión celular, inmortalización u otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Una secuencia de ácido nucleico de interés, tal como un vector de expresión, transfectada en una célula, puede ser extracromosómica o estar integrada de manera estable en el cromosoma de la célula.

Un “anticuerpo quimérico” se refiere a un tipo de anticuerpo modificado por ingeniería genética que contiene una región variable que se produce de manera natural (cadena ligera y cadenas pesadas) derivada de un anticuerpo donador en asociación con regiones constantes de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo aceptor.

Un “anticuerpo humanizado” se refiere a un tipo de anticuerpo modificado por ingeniería genética que tiene sus CDR derivadas de una inmunoglobulina donadora no humana, derivándose las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de una o más inmunoglobulinas humanas. Además, los residuos de soporte de entramado pueden alterarse para conservar la afinidad de unión (véanse, por ejemplo, Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson, et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Un anticuerpo aceptor humano adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT™, la base de datos Los Alamos y la base de datos Swiss Protein, por homología con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donador. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones de entramado del anticuerpo donador (basándose en los aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o una región de entramado variable de cadena pesada para la inserción de las CDR del donador. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones de entramado variables o constantes de cadena ligera puede seleccionarse de manera similar. Debe indicarse que no se requiere que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor se originen del mismo anticuerpo aceptor. La técnica anterior describe varios modos de producción de tales anticuerpos humanizados, véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-0239400 y EP-A-054951.

El término “anticuerpo completamente humano” incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos de secuencia humana de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Los anticuerpos completamente humanos comprenden secuencias de aminoácidos codificadas solo por polinucleótidos que son, en última instancia, de origen humano o secuencias de aminoácidos que son idénticas a tales secuencias. Tal como quiere decirse en el presente documento, los anticuerpos codificados por ADN que codifica inmunoglobulina humana insertado en un genoma de ratón producidos en un ratón transgénico son anticuerpos completamente humanos ya que están codificados por ADN que es, en última instancia, de origen humano. En esta situación, el ADN que codifica inmunoglobulina humana puede reordenarse (para codificar un anticuerpo) dentro del ratón, y también pueden producirse mutaciones somáticas. Los anticuerpos codificados por ADN originalmente humano que ha experimentado tales cambios en un ratón son anticuerpos completamente humanos tal como quiere decirse en el presente documento. El uso de tales ratones transgénicos hace posible seleccionar anticuerpos completamente humanos contra un antígeno humano. Tal como se entiende en la técnica, pueden prepararse anticuerpos completamente humanos usando tecnología de presentación en fagos en la que se inserta una biblioteca de ADN humano en un fago para la generación de anticuerpos que comprenden una secuencia de ADN de línea germinal humana.

El término “anticuerpo donador” se refiere a un anticuerpo que aporta las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDR u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a una primera pareja de inmunoglobulina. El donador, por tanto, proporciona a la región codificante de inmunoglobulina alterada y al anticuerpo alterado expresado resultante la especificidad antigénica y la actividad neutralizantes características del anticuerpo donador.

El término “anticuerpo aceptor” se refiere a un anticuerpo que es heterólogo con respecto al anticuerpo donador, que aporta todas (o cualquier porción) de las secuencias de aminoácidos que codifican sus regiones de entramado de cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera a la primera pareja de inmunoglobulina. Un anticuerpo humano puede ser el anticuerpo aceptor.

Los términos “VH” y “VL” se usan en el presente documento para referirse a la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera, respectivamente, de una proteína de unión a antígeno.

Las “CDR” se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de una proteína de unión a antígeno. Estas son las regiones hipervariables de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Hay tres CDR de cadena pesada y tres de cadena ligera (o regiones CDR) en la porción variable de una inmunoglobulina. Por tanto, “CDR” tal como se usa en el presente documento se refiere a las tres CDR de cadena pesada, las tres CDR de cadena ligera, a todas las CDR de cadena pesada y ligera o al menos dos CDR.

En toda esta memoria descriptiva, los residuos de aminoácido en secuencias de dominio variable y secuencias de anticuerpos de longitud completa se numeran según la convención de numeración de Kabat. De manera similar, los términos “CDR”, “CDRL1”, “CDRL2”, “CDRL3”, “CDRH1”, “CDRH2”, “CDRH3” usados en los ejemplos siguen la convención de numeración de Kabat. Para más información, véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1991).

Resultará evidente para los expertos en la técnica que existen convenciones de numeración alternativas para residuos de aminoácido en secuencias de dominio variable y secuencias de anticuerpos de longitud completa. Existen también convenciones de numeración alternativas para secuencias de CDR, por ejemplo las establecidas en Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883. La estructura y el plegamiento de la proteína del anticuerpo puede significar que otros residuos se consideren parte de la secuencia de CDR y así lo entendería un experto en la técnica.

Otras convenciones de numeración para secuencias de CDR disponibles para un experto en la técnica incluyen los métodos “AbM” (Universidad de Bath) y “contact” (University College London). Puede determinarse la región de solapamiento mínima usando al menos dos de los métodos de Kabat, Chothia, AbM y contact para proporcionar la “unidad de unión mínima”. La unidad de unión mínima puede ser una subporción de una CDR.

La tabla 1 a continuación representa una definición usando cada convención de numeración para cada CDR o unidad de unión. En la tabla 1 se usa el esquema de numeración de Kabat para numerar la secuencia de aminoácidos del dominio variable. Debe indicarse que algunas de las definiciones de CDR pueden variar dependiendo de la publicación individual usada.

Tabla 1

Por consiguiente, se proporcionan proteínas de unión a ICOS, que comprenden una cualquiera o una combinación de las siguientes CDR:

CDRH1: DYAMH (SEQ ID NO: 1)

CDRH2: LISIYSDHTNYNQKFQG (SEQ ID NO: 2)

CDRH3: NNYGNYGWYFDV (SEQ ID NO: 3)

CDRL1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 4)

CDRL2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 5)

CDRL3: FQGSGYPYT (SEQ ID NO: 6)

En una realización de la presente invención, la proteína de unión a ICOS comprende CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2) y CDRH3 (SEQ ID NO: 3) en la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. Las proteínas de unión a ICOS de la presente invención que comprenden la región variable de cadena pesada humanizada expuesta en SEQ ID NO: 7 se designan como “H2”. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a ICOS de la presente invención comprenden una región variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7. Adecuadamente, las proteínas de unión a ICOS de la presente invención pueden comprender una región variable de cadena pesada que tiene aproximadamente el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7.

Región variable (H2) de cadena pesada (V ^h ) humanizada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYAMHWVRQAPGQGLEWMGL ISIYSDHTNY

NQKFQGRVTI TADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCGRNN YGNYGWYFDVWGQGTTVTVS S

(SEQ ID NO:7)

En una realización de la presente invención, la proteína de unión a ICOS comprende CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5) y CDRL3 (SEQ ID NO: 6) en la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SeQ ID NO: 8. Las proteínas de unión a ICOS de la presente invención que comprenden la región variable de cadena ligera humanizada expuesta en SEQ ID NO: 8 se designan como “L5”. Por tanto, una proteína de unión a ICOS de la presente invención que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8 puede designarse como H2L5 en el presente documento.

Adecuadamente, en la figura 9 se muestra una secuencia líder para los constructos de cadena ligera y cadena pesada variables e incluye, pero no se limita a: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 11).

En algunas realizaciones, las proteínas de unión a ICOS de la presente invención comprenden una región variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. Adecuadamente, las proteínas de unión a ICOS de la presente invención pueden comprender una región variable de cadena ligera que tiene aproximadamente el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8.

Región variable (L5) de cadena ligera (V ^l ) humanizada

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASSSVS YMHWYQQKPGQAPRLLIYDT SKLASGIPAR

FSGSGSGTDYTLTISSLEPE DFAVYYCFQG SGYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:8)

Las CDR o unidades de unión mínimas pueden modificarse mediante al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácido, en la que la proteína de unión a antígeno variante conserva sustancialmente las características biológicas de la proteína sin modificar, tal como un anticuerpo murino producido a partir del clon 422.2 o un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

Se apreciará que cada una de CDR H1, H2, H3, L1, L2, L3 puede modificarse sola o en combinación con cualquier otra CDR, en cualquier permutación o combinación. En una realización, una CDR se modifica mediante la sustitución, deleción o adición de hasta 3 aminoácidos, por ejemplo 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo 1 aminoácido. Normalmente, la modificación es una sustitución, particularmente una sustitución conservativa, por ejemplo tal como se muestra en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Por ejemplo, en una CDR variante, los residuos de aminoácido de la unidad de unión mínima pueden permanecer iguales, pero los residuos flanqueantes que comprenden la CDR como parte de la(s) definición/definiciones de Kabat o Chothia pueden sustituirse por un residuo de aminoácido conservativo.

Tales proteínas de unión a antígeno que comprenden o unidades de unión mínimas o CDR modificadas tal como se describió anteriormente pueden denominarse en el presente documento “variantes de CDR funcionales” o “variantes de unidades de unión funcionales”. Adecuadamente, en una realización, se proporcionan proteínas de unión a ICOS que comprenden una o más CDR que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, y/o 6 y/o una variante de CDR funcional de las mismas.

El término “epítopo” tal como se usa en el presente documento se refiere a la porción del antígeno que entra en contacto con un dominio de unión particular de la proteína de unión a antígeno. Un epítopo puede ser lineal o conformacional/discontinuo. Un epítopo conformacional o discontinuo comprende residuos de aminoácido que están separados por otras secuencias, es decir, no están en una secuencia continua en la secuencia primaria del antígeno. Aunque los residuos pueden ser de diferentes regiones de la cadena peptídica, están en proximidad estrecha en la estructura tridimensional del antígeno. En el caso de antígenos multiméricos, un epítopo conformacional o discontinuo puede incluir residuos de diferentes cadenas peptídicas. Los residuos particulares comprendidos dentro de un epítopo pueden determinarse a través de programas de modelado informático o por medio de estructuras tridimensionales obtenidas a través de métodos conocidos en la técnica, tales como cristalografía de rayos X.

Las CDR L1, L2, L3, HI y H2 tienden a presentar estructuralmente una de un número finito de conformaciones de cadena principal. La clase de estructura canónica particular de una CDR se define tanto por la longitud de la CDR como por el empaquetamiento de bucles, determinado por residuos ubicados en posiciones clase tanto en las CDR como las regiones de entramado (residuos estructuralmente determinantes o SDR). Martin y Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815) han generado un método automático para definir los moldes canónicos de “residuos clave”. Se usa análisis de conglomerados para definir las clases canónicas para conjuntos de CDR, y se identifican entonces los moldes canónicos analizando residuos hidrófobos, de unión a hidrógeno enterrados, y glicinas y prolinas conservadas. Las CDR de secuencias de anticuerpos pueden asignarse a las clases canónicas comparando las secuencias con los moldes de residuos clave y puntuando cada molde usando matrices de identidad o similitud.

Puede haber múltiples posicionas canónicas de CDR variantes por CDR, por CDR correspondiente, por unidad de unión, por región variable de cadena pesada o ligera, por cadena pesada o ligera y por proteína de unión a antígeno, y por tanto puede estar presente cualquier combinación de sustitución en la proteína de unión a antígeno de la invención, siempre que se mantenga la estructura canónica de la CDR de manera que la proteína de unión a antígeno sea capaz de unirse específicamente a ICOS.

Tal como se comentó anteriormente, la clase de estructura canónica particular de una CDR se define tanto por la longitud de la CDR como por el empaquetamiento de bucles, determinado por residuos ubicados en posiciones clave en tanto las CDR como las regiones de entramado.

“Identidad en porcentaje” entre una secuencia de ácido nucleico de consulta y una secuencia de ácido nucleico sujeto es el valor de “identidades”, expresado como porcentaje, que se calcula mediante el algoritmo BLASTN cuando una secuencia de ácido nucleico sujeto tiene una cobertura de consulta del 100 % con una secuencia de ácido nucleico de consulta después de que se realice una alineación de BLASTN por parejas. Tales alineaciones de BLASTN por parejas entre una secuencia de ácido nucleico de consulta y una secuencia de ácido nucleico sujeto se realizan usando los parámetros por defecto del algoritmo BLASTN disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Institute con el filtro para regiones de baja complejidad desactivado. De manera importante, una secuencia de ácido nucleico de consulta puede describirse mediante una secuencia de ácido nucleico identificada en una o más reivindicaciones en el presente documento.

“Identidad en porcentaje” entre una secuencia de aminoácidos de consulta y una secuencia de aminoácidos sujeto es el valor de “identidades”, expresado como porcentaje, que se calcula mediante el algoritmo BLASTP cuando una secuencia de aminoácidos sujeto tiene una cobertura de consulta del 100 % con una secuencia de aminoácidos de consulta después de que se realice una alineación de BLASTP por parejas. T ales alineaciones de BLASTP por parejas entre una secuencia de aminoácidos de consulta y una secuencia de aminoácidos sujeto se realizan usando los parámetros por defecto del algoritmo BLASTP disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Institute con el filtro para regiones de baja complejidad desactivado. De manera importante, una secuencia de aminoácidos de consulta puede describirse mediante una secuencia de aminoácidos identificada en una o más reivindicaciones en el presente documento.

La secuencia de consulta puede ser el 100 % idéntica a la secuencia sujeto, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos o nucleótidos en comparación con la secuencia sujeto de manera que el % de identidad es menor del 100 %. Por ejemplo, la secuencia de consulta es al menos el 50, el 60, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 % idéntica a la secuencia sujeto. Tales alteraciones incluyen al menos una deleción, sustitución (incluyendo sustitución conservativa y no conservativa) o inserción de aminoácido, y en las que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia de consulta o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de consulta o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de consulta.

El % de identidad puede determinarse a través de toda la longitud de la secuencia de consulta, incluyendo la(s) CDR. Alternativamente, el % de identidad puede excluir la(s) CDR, por ejemplo, la(s) CDR es/son el 100 % idéntica(s) a la secuencia sujeto y la variación del % de identidad está en la porción restante de la secuencia de consulta, de modo que la secuencia de CDR está fija/intacta.

La secuencia variante conserva sustancialmente las características biológicas de la proteína sin modificar, tal como SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

La secuencia de VH o VL puede ser una secuencia variante con hasta 15 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia variante puede tener hasta 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustitución/sustituciones, adición/adiciones o deleción/deleciones de aminoácidos.

La variación de secuencia puede excluir la(s) CDR, por ejemplo, la(s) CDR es/son la(s) misma(s) que la secuencia de VH o VL (o HC o LC) y la variación está en la porción restante de la secuencia de VH o VL (o HC o LC), de modo que la secuencia de CDR está fija/intacta.

El experto apreciará que, tras la producción de una proteína de unión a antígeno tal como un anticuerpo, en particular dependiendo de la línea celular usada y la secuencia de aminoácidos particular de la proteína de unión a antígeno, pueden producirse modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, esto puede incluir la escisión de ciertas secuencias líder, la adición de diversos restos de azúcar en diversos patrones de glicosilación y fosforilación, desamidación, oxidación, mezclado de enlaces disulfuro, isomerización, recorte de lisinas C-terminales y ciclación de glutaminas N-terminales. La presente invención abarca el uso de proteínas de unión a antígeno que se han sometido a, o han experimentado, una o más modificaciones postraduccionales. Por tanto, una “proteína de unión a antígeno” o “anticuerpo” de la invención incluye una “proteína de unión a antígeno” o “anticuerpo”, respectivamente, tal como se definió anteriormente que ha experimentado una modificación postraduccional tal como se describe en el presente documento.

La desamidación es una reacción enzimática que convierte principalmente la asparagina (N) es ácido iso-aspártico y ácido aspártico (D) en una proporción de aproximadamente 3:1. En un grado mucho menor, la desamidación puede producirse con residuos de glutamina de una manera similar. La desamidación en una CDR da como resultado un cambio en la carga de la molécula, pero normalmente no da como resultado un cambio en la unión al antígeno, ni tiene un impacto sobre PK/PD.

La oxidación puede producirse durante la producción y el almacenamiento (es decir, en presencia de condiciones oxidantes) y da como resultado una modificación covalente de una proteína, inducida o bien directamente mediante especies reactivas de oxígeno o bien indirectamente mediante reacción con subproductos secundarios de estrés oxidativo. La oxidación sucede principalmente con residuos de metionina, pero ocasionalmente puede producirse en residuos de triptófano y cisteína libre.

El mezclado de enlaces disulfuro puede producirse durante las condiciones de producción y almacenamiento básicas. En ciertas circunstancias, los enlaces disulfuro pueden romperse o formarse incorrectamente, dando como resultado residuos de cisteína (-SH) desapareados. Estos sulfhidrilos libres (desapareados) (-SH) pueden promover el barajado.

La isomerización se produce normalmente durante la producción, la purificación y el almacenamiento (a pH ácido) y habitualmente se produce cuando el ácido aspártico se convierte en ácido isoaspártico a través de un proceso químico.

Es probable que la glutamina N-terminal en la cadena pesada y/o cadena ligera forme piroglutamato (pGlu). La mayor parte de la formación de pGlu sucede en el biorreactor de producción, pero puede formarse de manera no enzimática, dependiendo del pH y la temperatura de las condiciones de procesamiento y almacenamiento. La formación de pGlu se considera como una de las principales rutas de degradación de AcM recombinantes.

El recorte de lisinas C-terminales es una reacción enzimática catalizada por carboxipeptidasas, y se observa comúnmente en AcM recombinantes. Las variantes de este proceso incluyen la eliminación de lisina de una o ambas cadenas pesadas. El recorte de lisinas no parece tener un impacto sobre la bioactividad y no tiene efecto sobre la función efectora de AcM.

Existen autoanticuerpos que se producen de manera natural en seres humanos que pueden unirse a proteínas. Los autoanticuerpos, por tanto, pueden unirse a proteínas endógenas (presentes en sujetos sin tratamiento previo) así como a proteínas o péptidos que se administran a un sujeto para el tratamiento. Los autoanticuerpos y anticuerpos que se unen a proteínas terapéuticas recién formados en respuesta al tratamiento farmacológico se denominan colectivamente anticuerpos anti-fármaco (ADA). Los anticuerpos preexistentes contra moléculas tales como proteínas y péptidos terapéuticos, administrados a un sujeto, pueden afectar a su eficacia y podrían dar como resultado reacciones en la administración, hipersensibilidad, respuesta clínica alterada en pacientes tratados y biodisponibilidad alterada al mantener, eliminar o neutralizar la molécula. Podría ser ventajoso proporcionar moléculas para terapia que comprendan dominios variables individuales de inmunoglobulina humana (anticuerpo) o dAbs™ que tienen inmunogenicidad reducida (es decir, capacidad reducida para unirse a ADA preexistentes cuando se administran a un sujeto, en particular un sujeto humano.

Por tanto, en una realización de la presente invención, se proporciona un dAb™ modificado que tiene capacidad reducida para unirse a anticuerpos preexistentes (ADA) en comparación con la molécula sin modificar equivalente. Por capacidad reducida para unirse quiere decirse que la molécula modificada se une con una afinidad reducida o avidez reducida a un ADA preexistente. Dicho dAb™ modificado comprende una o más modificaciones seleccionadas de: (a) una adición, extensión, deleción o etiqueta C-terminal, y/o (b) una o más sustituciones del entramado de aminoácidos.

Pueden formatearse los polipéptidos y dAb™ de la divulgación y agonistas que comprende estos para que tengan una mayor tamaño hidrodinámico, por ejemplo, mediante unión de un grupo PEG, albúmina sérica, transferrina, receptor de transferrina o al menos la porción de unión a transferrina del mismo, una región Fc de anticuerpo, o mediante conjugación con un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, los polipéptidos dAb™ y agonistas pueden formatearse como un fragmento de unión a antígeno más grande de un anticuerpo o como un anticuerpo (por ejemplo, formateado como un Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, IgG, scFv).

Tal como se usa en el presente documento, “tamaño hidrodinámico” se refiere al tamaño aparente de una a molécula (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno) basado en la difusión de la molécula a través de una disolución acuosa. La difusión o el movimiento de una proteína a través de una disolución puede procesarse para derivar un tamaño aparente de la proteína, donde el tamaño viene dado por el “radio de Stokes” o “radio hidrodinámico” de la partícula proteica. El “tamaño hidrodinámico” de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de manera que dos proteínas que tienen la misma masa molecular pueden tener tamaños hidrodinámicos diferentes basándose en la conformación y carga globales de la proteína. Un aumento del tamaño hidrodinámico puede dar una disminución asociada del aclaramiento renal que conduce a un aumento observado en la semivida (t1/2).

El tamaño hidrodinámico de las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, monómeros y multímeros de anticuerpos de dominio) de la divulgación puede determinarse usando métodos que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de filtración en gel para determinar el tamaño hidrodinámico de una proteína de unión a antígeno. Se conocen bien matrices de filtración en gel adecuadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de las proteínas de unión a antígeno, tales como matrices de agarosa reticuladas, y están fácilmente disponibles.

El tamaño de un formato de proteína de unión a antígeno (por ejemplo, el tamaño de un resto de PEG unido a un monómero de anticuerpo de dominio) puede variar dependiendo de la aplicación deseada. Por ejemplo, cuando se pretende que la proteína de unión a antígeno deje la circulación y entre en los tejidos periféricos, es deseable mantener bajo el tamaño hidrodinámico de la proteína de unión a ICOS para facilitar la extravasación del torrente sanguíneo. Alternativamente, cuando se desea que la proteína de unión a antígeno permanezca en la circulación sistémica durante un periodo de tiempo más prolongado, el tamaño de la proteína de unión a antígeno puede aumentarse, por ejemplo, formateándola como una proteína similar a Ig.

Composiciones farmacéuticas

La proteína de unión a antígeno tal como se describe en el presente documento puede incorporarse en composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de las enfermedades humanas descritas en el presente documento. En una realización, la composición farmacéutica comprende una proteína de unión a antígeno opcionalmente en combinación con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Tales composiciones comprenden un portador farmacéuticamente aceptable tal como se conoce y requiere la práctica farmacéutica aceptable.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante inyección o infusión continua (los ejemplos incluyen, pero no se limita a, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intramuscular e intraportal). En una realización, la composición es adecuada para administración intravenosa. Las composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para administración tópica (que incluye, pero no se limita a, administración epicutánea, inhalada, intranasal u ocular) o administración entérica (que incluye, pero no se limita a, administración oral o rectal).

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender entre 0,5 mg y 10 g de proteína de unión a ICOS, por ejemplo entre 5 mg y 1 g de proteína de unión a antígeno. Alternativamente, la composición puede comprender entre 5 mg y 500 mg, por ejemplo entre 5 mg y 50 mg.

Los expertos en la técnica conocen bien métodos para la preparación de tales composiciones farmacéuticas. Pueden añadirse otros excipientes a la composición según sea apropiado para el modo de administración y la proteína particular usada. Se describen ejemplos de diferentes excipientes y sus usos en Lowe et al., (2011).

Las dosis eficaces y los regímenes de tratamiento para administrar la proteína de unión a antígeno puede depender de factores tales como la edad, el peso y el estado de salud del paciente y la enfermedad que va a tratarse. Tales factores están dentro del ámbito del médico encargado. Puede encontrarse orientación para seleccionar las dosis apropiadas en, por ejemplo, Bai et al., (2012).

La composición farmacéutica puede comprender un kit de partes de la proteína de unión a antígeno junto con otros medicamentos, opcionalmente con instrucciones para su uso. Por conveniencia, el kit puede comprender los reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para su uso.

Los términos “individual”, “sujeto” y “paciente” se usan en el presente documento indistintamente. En una realización, el sujeto es un mamífero, tal como un primate, por ejemplo un tití o un mono. En otra realización, el sujeto es un ser humano.

La proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento puede usarse también en métodos de tratamiento. El tratamiento puede ser terapéutico, profiláctico o preventivo. El tratamiento abarca el alivio, la reducción o la prevención de al menos un aspecto o síntoma de una enfermedad y abarca la prevención o cura de las enfermedades descritas en el presente documento.

La proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma descrita en el presente documento se usa en una cantidad eficaz para el tratamiento terapéutico, profiláctico o preventivo. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma descrita en el presente documento es una cantidad eficaz para mejorar o reducir uno o más síntomas de, o para prevenir o curar, la enfermedad.

Por tanto, en una realización, las proteínas de unión a ICOS o porciones de unión a antígeno de las mismas de la presente invención se proporcionan para su uso en terapia. En una realización, las proteínas de unión a ICOS o porciones de unión a antígeno de las mismas de la presente invención se proporcionan para su uso en el tratamiento de cáncer, enfermedad infecciosa y/o síndrome séptico. La presente invención también proporciona el uso de una proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, enfermedad infecciosa y/o síndrome séptico.

Por tanto, se proporcionan en el presente documento proteínas de unión a ICOS aisladas o porciones de unión a antígeno de las mismas o las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas de unión a ICOS aisladas o porciones de unión a antígeno de las mismas para su uso en el tratamiento de cáncer, enfermedad infecciosa y/o síndrome séptico.

Métodos de producción

Pueden prepararse proteínas de unión a antígeno mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden purificarse proteínas de unión a antígeno a partir de células que las expresan de manera natural (por ejemplo, un anticuerpo puede purificarse a partir de un hibridoma que lo produce), o producirse en sistemas de expresión recombinante.

Pueden usarse varios sistemas de expresión y regímenes de purificación diferentes para generar la proteína de unión a antígeno de la invención. Generalmente, se transforman células huésped con un vector de expresión recombinante que codifica la proteína de unión a antígeno deseada. Puede emplearse una amplia gama de células huésped, incluyendo procariotas (incluyendo bacterias Gram-negativas o Gram-positivas, por ejemplo Escherichia coli, Bacilli sp., Pseudomonas sp., Corynebacterium sp.), eucariotas incluyendo levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichiapastoris), hongos (por ejemplo Aspergilus sp.) o eucariotas superiores incluyendo células de insecto y líneas celulares de origen de mamífero (por ejemplo, CHO, Perc6, HEK293, HeLa).

La célula huésped puede ser una célula huésped aislada. La célula huésped habitualmente no forma parte de un organismo multicelular (por ejemplo, planta o animal). La célula huésped puede ser una célula huésped no humana.

En la técnica se conocen vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero y métodos de clonación.

Las células pueden cultivarse en condiciones que promueven la expresión de la proteína de unión a antígeno, y el polipéptido recuperado mediante procedimientos de purificación de proteínas convencionales. Las proteínas de unión a antígeno contempladas para su uso en el presente documento incluyen proteínas de unión a antígeno sustancialmente homogéneas sustancialmente libres de materiales contaminantes.

El experto apreciará que, tras la producción de la proteína de unión a antígeno, en particular dependiendo de la línea celular usada y la secuencia de aminoácidos particular de la proteína de unión a antígeno, pueden producirse modificaciones postraduccionales. Esto puede incluir la escisión de ciertas secuencias líder, la adición de diversos restos de azúcar en diversos patrones de glicosilación, desamidación (por ejemplo en un residuo de asparagina o glutamina), oxidación (por ejemplo en un residuo de metionina, triptófano o cisteína libre), mezclado de enlaces disulfuro, isomerización (por ejemplo en un residuo de ácido aspártico), recorte de lisinas C-terminales (por ejemplo de una o ambas cadenas pesadas) y ciclación de glutaminas N-terminales (por ejemplo en la cadena pesada y/o ligera). La presente invención abarca el uso de anticuerpos que se han sometido a, o han experimentado, una o más modificaciones postraduccionales. La modificación puede producirse en una CDR, la región de entramado variable o la región constante. La modificación puede dar como resultado un cambio en la carga de la molécula. La modificación, normalmente, no da como resultado un cambio en la unión al antígeno, función, bioactividad, ni tiene un impacto sobre las características farmacocinéticas (PK) o farmacodinámicas (PD) de la proteína de unión a ICOS.

El término “función efectora” tal como se usa en el presente documento pretende referirse a una o más de las respuestas mediadas por actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC), fagocitosis mediada por Fc o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y reciclaje de anticuerpos por medio del receptor FcRn.

Se cree que la interacción entre la región constante de una proteína de unión a antígeno y diversos receptores de Fc (FcR) incluyendo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) media en las funciones efectoras de la proteína de unión a antígeno. Los efectos biológicos significativos pueden ser una consecuencia de la funcionalidad efectora. Habitualmente, la capacidad para mediar en la función efectora requiere la unión de la proteína de unión a antígeno a un antígeno y no todas las proteínas de unión a antígeno mediarán en cada función efectora.

La función efectora puede medirse de varios modos incluyendo, por ejemplo, por medio de la unión del FcyRIII sobre células citolíticas naturales o por medio de FcyRI sobre monocitos/macrófagos para medir la función efectora de ADCC/ADCP. Por ejemplo, una proteína de unión a antígeno de la presente invención puede evaluarse para determinar la función de ADCC en un ensayo de células citolíticas naturales. Pueden encontrarse enfoques prácticos para evaluar la función de ADCC y/o CDC en (Kellner C et al., “Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions”, Methods, 1;65(1): 105-13 (2014))

Algunos isotipos de regiones constantes humanas, en particular los isotipos de IgG4 e IgG2, tienen una función reducida de a) activación del complemento por la ruta clásica; y b) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Pueden llevarse a cabo diversas modificaciones en la región constante de cadena pesada de proteínas de unión a antígeno dependiendo de la propiedad efectora deseada. Se ha descrito por separado que las regiones constantes de IgG1 que contienen mutaciones específicas reducen la unión a receptores de Fc y, por tanto, reducen la ADCC y CDC. (Kellner C et al., “Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions”, Methods, 1 ;65(1): 105-13 (2014))

En una realización de la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de manera que la proteína de unión a antígeno tiene ADCC y/o activación del complemento o funcionalidad efectora reducida. En una realización de este tipo, la región constante de cadena pesada puede comprender una región constante deshabilitada de manera natural de isotipo de IgG2 o IgG4 o una región constante IgG1 mutada. Un ejemplo comprende las sustituciones de residuos de alanina en las posiciones 235 y 237 (numeración de índice EU).

La subclase de un anticuerpo determina, en parte, las funciones efectoras secundarias, tales como activación del complemento o unión al receptor de Fc (FcR) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Huber, et al., Nature 229(5284): 419-20 (1971); Brunhouse, et al., Mol Immunol 16(11): 907-17 (1979)). Al identificar el tipo óptimo de anticuerpo para una aplicación particular, pueden tenerse en cuenta las funciones efectoras de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos hIgG1 tienen una semivida relativamente larga, son muy eficaces en la fijación del complemento y se unen tanto a FcyRI como a FcyRII. Por el contrario, los anticuerpos IgG4 humanos tienen una semivida más corta, no fijan el complemento y tienen una afinidad inferior por los FcR. El reemplazo de la serina 228 por una prolina (S228P) en la región Fc de IgG4 reduce la heterogeneidad observada con hIgG4 y prolonga la semivida sérica (Kabat, et al., “Sequences of proteins of immunological interest” 5a edición (1991); Angal, et al., Mol Immunol 30(1): 105-8 (1993)). Una segunda mutación que reemplaza la leucina 235 por un ácido glutámico (L235E) elimina las actividades residuales de unión a FcR y unión al complemento (Alegre, et al., J Immunol 148(11): 3461-8 (1992)). El anticuerpo resultante con ambas mutaciones se denomina IgG4pE. La numeración de los aminoácidos de hlgG4 se derivó de la referencia de numeración EU: Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969. En una realización de la presente invención, las proteínas de unión a antígeno de ICOS que comprenden una región Fc de IgG4 que comprenden el reemplazo S228P y L235E pueden tener la designación IgG4PE. Por tanto, una proteína de unión a ICOS que tiene la región variable de cadena pesada H2 y la región variable de cadena ligera L5 y una región Fc de IgG4PE se designará H2L5 IgG4PE o de manera sinónima H2L5 hIgG4PE.

ADCC/CDC potenciada

Tal como se entiende en la técnica, se conocen diversas técnicas que aumentarán la actividad de ADCC y/o la de CDC de un anticuerpo. Estas incluyen, pero no se limitan a, diversas mutaciones en la región Fc, tecnologías Complegent y Potelligent. En un aspecto de la presente invención, pueden aplicarse una o más tecnologías de potenciación de ADCC/CDC a las proteínas de unión a ICOS de la presente invención.

Mutación

También se ha descrito que regiones constantes de IgG1 humana que contienen mutaciones específicas o glicosilación alterada en el residuo Asn297 potencian la unión a receptores de Fc. En algunos casos, se ha mostrado también que estas mutaciones potencian ADCC y CDC, véase, por ejemplo, Kellner (2013).

En una realización de la presente invención, tales mutaciones están en una o más de las posiciones seleccionadas de 239, 332 y 330 (IgG1), o las posiciones equivalentes en otros isotipos de IgG. Ejemplos de mutaciones adecuadas son S239D e I332E y A330L. En una realización, la proteína de unión a antígeno de la invención descrita en el presente documento está mutada en las posiciones 239 y 332, por ejemplo S239D e I332E o en una realización adicional está mutada en tres o más posiciones seleccionadas de 239 y 332 y 330, por ejemplo S239D y I332E y A330L (numeración de índice EU).

Complegent

En una realización de la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada quimérica, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada quimérica con al menos un dominio CH2 de IgG3 de manera que la proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada, por ejemplo, en la que tiene funciones de ADCC potenciada o CDC potenciada, o de ADCC y CDC potenciadas. En una realización de este tipo, la proteína de unión a antígeno puede comprender un dominio CH2 de IgG3 o ambos dominios CH2 pueden ser de IgG3.

También se proporciona un método de producción de una proteína de unión a antígeno según la invención que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado tal como se describe en el presente documento, en el que el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio Fc que tiene residuos de aminoácido de dominio Fc de tanto IgG1 como IgG3; y

b) recuperar la proteína de unión a antígeno.

Tales métodos para la producción de proteínas de unión a antígeno pueden realizarse, por ejemplo, usando el sistema de tecnología COMPLEGENT™ disponible de BioWa, Inc. (Princeton, NJ) y Kyowa Hakko Kogyo (ahora, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd., en el que una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión en el que se expresa una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio Fc quimérico que tiene residuos de aminoácido de dominio Fc de tanto IgG 1 como IgG3 para producir una proteína de unión a antígeno que tiene actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) potenciada que está aumentada en relación con una proteína de unión a antígeno por lo demás idéntica que carece de un dominio de Fc quimérico de este tipo. Se describen aspectos del sistema de tecnología COMPLEGe Nt ™ en los documentos WO2007011041 y US20070148165, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia. En una realización alternativa, la actividad de CDC puede aumentarse introduciendo mutaciones específicas de secuencia en la región Fc de una cadena de IgG. Los expertos habituales en la técnica reconocerán también otros sistemas apropiados.

Potelligent

La presente invención también proporciona un método para la producción de una proteína de unión a antígeno según la invención que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado tal como se describe en el presente documento, en el que el gen de FUT8 que codifica alfa-1,6-fucosiltransferasa se ha inactivado en la célula huésped recombinante; y

b) recuperar la proteína de unión a antígeno.

Tales métodos para la producción de proteínas de unión a antígeno puede realizarse, por ejemplo, usando el sistema de tecnología POTELLIGENT™ disponible de BioWa, Inc. (Princeton, NJ), en el que células CHOK1SV que carecen de una copia funcional del gen de FUT8 producen anticuerpos monoclonales que tienen actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) potenciada que está aumentada en relación con un anticuerpo monoclonal idéntico producido en una célula con un gen de FUT8 funcional. Se describen aspectos del sistema de tecnología POTELLIGENT™ en los documentos US7214775, US6946292, WO0061739 y WO0231240, todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Los expertos habituales en la técnica también reconocerán otros sistemas apropiados.

Resultará evidente para los expertos en la técnica que tales modificaciones no solo pueden usarse solas, sino que también pueden usarse en combinación entre sí con el fin de potenciar adicionalmente la función efectora.

En una realización de este tipo de la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada que comprende una región constante de cadena pesada mutada y quimérica, por ejemplo, en la que una proteína de unión a antígeno que comprende al menos un dominio CH2 de IgG3 y un dominio CH2 de IgG1, en la que el dominio CH2 de IgG 1 tiene una o más mutaciones en posiciones seleccionadas de 239 y 332 y 330 (por ejemplo, las mutaciones pueden seleccionarse de S239D e I332E y A330L) de manera que la proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada, por ejemplo en la que tiene una o más de las siguientes funciones, ADCC potenciada o CDC potenciada, por ejemplo en la que tiene ADCC potenciada y CDC potenciada. En una realización, el dominio CH2 de IgG1 tiene las mutaciones S239D y I332E.

En una realización alternativa de la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada quimérica y que tiene un perfil de glicosilación alterado. En una realización de este tipo, la región constante de cadena pesada comprende al menos un dominio CH2 de IgG3 y un dominio CH2 de IgG1 y tiene un perfil de glicosilación alterado de manera que la razón de fucosa con respecto a manosa es de 0,8:3 o menos, por ejemplo, en la que la proteína de unión a antígeno está desfucosilada de modo que dicha proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada en comparación con una proteína de unión a antígeno equivalente con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que carece de dichas mutaciones y un perfil de glicosilación alterado, por ejemplo, en la que tiene una o más de las siguientes funciones, ADCC potenciada o CDC potenciada, por ejemplo en la que tiene ADCC potenciada y CDC potenciada.

En una realización alternativa, la proteína de unión a antígeno tiene al menos un dominio CH2 de IgG3 y al menos un dominio constante de cadena pesada de IgG1 en la que ambos dominios CH2 de IgG están mutados según las limitaciones descritas en el presente documento.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método de producción de una proteína de unión a antígeno según la invención descrita en el presente documento que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula huésped recombinante que contiene un vector de expresión que contiene un ácido nucleico aislado tal como se describe en el presente documento, comprendiendo además dicho vector de expresión una secuencia de ácido nucleico de Fc que codifica un dominio Fc quimérico que tiene residuos de aminoácido de dominio Fc de tanto IgG 1 como IgG3, y en el que el gen de FUT8 que codifica alfa-1,6-fucosiltransferasa se ha inactivado en la célula huésped recombinante; y

b) recuperar la proteína de unión a antígeno.

Tales métodos para la producción de proteínas de unión a antígeno puede realizarse, por ejemplo, usando el sistema de tecnología ACCRETAMAB™ disponible de BioWa, Inc. (Princeton, NJ) que combina los sistemas de tecnología POTELLIGENT™ y COMPLEGENT™ para producir una proteína de unión a antígeno que tiene actividad potenciada de tanto ADCC como CDC que está aumentada en relación con un anticuerpo monoclonal por lo demás idéntico que carece de un dominio Fc quimérico y que tiene fucosa en el oligosacárido.

En aún otra realización de la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada mutada y quimérica en la que dicha proteína de unión a antígeno tiene un perfil de glicosilación alterado de manera que la proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada, por ejemplo, en la que tiene una o más de las siguientes funciones, ADCC potenciada o CDC potenciada. En una realización, las mutaciones se seleccionan de las posiciones 239 y 332 y 330, por ejemplo las mutaciones se seleccionan de S239D e I332E y A330L. En una realización adicional, la región constante de cadena pesada comprende al menos un dominio CH2 de IgG3 y un dominio Ch2 de IgG1. En una realización, la región constante de cadena pesada tiene un perfil de glicosilación alterado de manera que la razón de fucosa con respecto a manosa es de 0,8:3 o menos, por ejemplo, la proteína de unión a antígeno está desfucosilada, de modo que dicha proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada en comparación con una proteína de unión a antígeno no quimérica equivalente o con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que carece de dichas mutaciones y un perfil de glicosilación alterado.

Se notifica que semivida prolongada de los anticuerpos de IgG es dependiendo de su unión a FcRn. Por tanto, Kuo y Aveson (2011) han estudiado de manera extensa sustituciones que aumentan la afinidad de unión de IgG a FcRn a pH 6,0 al tiempo que se mantiene la dependencia del pH de la interacción mediante modificación por ingeniería genética de la región constante.

Otro medio de modificar proteínas de unión a antígeno de la presente invención implica aumentar la semivida in vivo de tales proteínas mediante modificación del dominio constante de inmunoglobulina o dominio de unión a FcRn (receptor de Fc de recién nacido).

En mamíferos adultos, FcRn, también conocido como receptor de Fc neonatal, desempeña un papel clave en el mantenimiento de los niveles de anticuerpos séricos al actuar como receptor protector que se une a anticuerpos del isotipo de IgG y los salva de la degradación. Las moléculas de IgG experimentan endocitosis por células endoteliales, y si se unen a FcRn, se reciclan a la circulación. En cambio, las moléculas de IgG que no se unen a FcRn entran en las células y se dirigen a la ruta lisosómica donde se degradan.

Se cree que el receptor de FcRn neonatal está implicado tanto en el aclaramiento de anticuerpos como en la transcitosis entre tejidos, Kuo y Aveson, (2011). Los residuos de IgG1 humana que se determina que interaccionan directamente con FcRn humano incluyen Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435. Cambios en cualquiera de estas posiciones descritas en esta sección pueden permitir una semivida sérica aumentada y/o propiedades efectoras alteradas de las proteínas de unión a antígeno de la invención.

Mutaciones para aumentar la semivida aumentando la afinidad por FcRn

Las proteínas de unión a antígeno de la presente invención pueden tener una o más modificaciones de aminoácidos que aumentan la afinidad del dominio constante o fragmento del mismo por FcRn. Esto puede dar como resultado una semivida aumentada de estas proteínas, Kuo y Aveson (2011). El aumento de la semivida de IgG terapéuticas y de diagnóstico y otras moléculas bioactivas puede tener muchos beneficios incluyendo la reducción de la cantidad y/o frecuencia de dosificación de estas moléculas. En una realización, se proporciona por tanto una unión a antígeno según la invención proporcionada en el presente documento o una proteína de fusión que comprende la totalidad o una porción (una porción de unión a FcRn) de un dominio constante de IgG que tiene una o más de estas modificaciones de aminoácidos y una proteína distinta de IgG o molécula no proteica conjugada con un dominio constante de IgG modificado de este tipo, en el que la presencia del dominio constante de IgG modificado aumenta la semivida in vivo de la proteína de unión a antígeno.

Se conocen varios métodos que pueden dar como resultado una semivida aumentada (Kuo y Aveson, (2011)), incluyendo modificaciones de aminoácidos que pueden generarse a través de técnicas que incluyen mutagénesis de exploración de alanina, mutagénesis al azar y cribado para evaluar la unión a FcRn y/o el comportamiento in vivo. Pueden usarse también estrategias informáticas seguidas por mutagénesis para seleccionar una de las mutaciones de aminoácidos para mutar.

La presente invención, por tanto, proporciona una variante de una proteína de unión a antígeno con unión optimizada a FcRn. En una realización preferida, dicha variante de una proteína de unión a antígeno comprende al menos una modificación de aminoácido en la región Fc de dicha proteína de unión a antígeno, en la que dicha modificación se selecciona del grupo que consiste en 226, 227, 228, 230, 231,233, 234, 239, 241,243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291,292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 y 447 de la región Fc en comparación con dicho polipéptido original, en la que la numeración de los aminoácidos en la región Fc es la del índice EU en Kabat.

En un aspecto adicional de la invención, las modificaciones son M252Y/S254T/T256E.

Adicionalmente, diversas publicaciones describen métodos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas semividas están modificadas, véase, por ejemplo, Kontermann (2009), o bien introduciendo un polipéptido de unión a FcRn en las moléculas o fusionando las moléculas con anticuerpos cuyas afinidades de unión a FcRn están conservadas pero las afinidades por otros receptores de Fc se han reducido enormemente o bien fusionando con dominios de unión a FcRn de anticuerpos.

Tecnología de cambio de pH para aumentar la semivida

Aunque las sustituciones en la región constante son capaces de mejorar significativamente las funciones de anticuerpos de IgG terapéuticos, las sustituciones en la región constante estrictamente conservada tienen el riesgo de inmunogenicidad en el ser humano y la sustitución en la secuencia de región variable sumamente diversa podría ser menos inmunogénica. Informes referentes a la región variable incluyen la modificación por ingeniería genética de los residuos de CDR para mejorar la afinidad de unión al antígeno y la modificación por ingeniería genética de los residuos de CDR y entramado para mejorar la estabilidad y disminuir el riesgo de inmunogenicidad. Tal como se conoce, puede lograrse una afinidad mejorada por el antígeno mediante maduración de la afinidad usando la presentación en fagos o ribosomas de una biblioteca aleatorizada.

Puede obtenerse racionalmente una estabilidad mejorada a partir del diseño racional basado en secuencias y estructuras. Puede lograrse una disminución del riesgo de inmunogenicidad (desinmunización) mediante diversas metodologías de humanización y la eliminación de epítopos de células T, que pueden predecirse usando tecnologías in silico o determinarse mediante ensayos in vitro. Adicionalmente, se han modificado por ingeniería genética regiones variables para disminuir el pI. Se observó una semivida más prolongada para estos anticuerpos en comparación con anticuerpos de tipo natural a pesar de la unión a FcRn comparable. La modificación por ingeniería genética o la selección de anticuerpos con unión a antígeno dependiente del pH para modificar la semivida del anticuerpo y/o antígeno, por ejemplo, la semivida del anticuerpo de IgG2 puede acortarse si los mecanismos de aclaramiento mediados por antígenos degradan normalmente el anticuerpo cuando se une al antígeno. De manera similar, el complejo de antígeno:anticuerpo puede tener un impacto sobre la semivida del antígeno, o bien prolongando la semivida al proteger el antígeno de los procesos de degradación típicos, o bien acortando la semivida por medio de degradación mediada por anticuerpos. Una realización se refiere a anticuerpos con afinidad superior por el antígeno a pH 7,4 en comparación con el pH endosómico (es decir, pH 5,5-6,0) de manera que la razón de KD a pH 5,5/pH 7,4 o a pH 6,0/pH 7,4 es de 2 o más. Por ejemplo, para potenciar las propiedades farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD) del anticuerpo, es posible modificar por ingeniería genética la unión sensible al pH del anticuerpo introduciendo histidinas en residuos de CDR.

Adicionalmente, también se proporcionan métodos de producción de una proteína de unión a antígeno con una semivida biológica disminuida. Una IgG variante en la que la His435 está mutada a alanina da como resultado la pérdida selectiva de la unión a FcRn y una semivida sérica significativamente reducida (véase, por ejemplo, el documento US6.165.745 que da a conocer a método de producción de una proteína de unión a antígeno con una semivida biológica disminuida introduciendo una mutación en el segmento de ADN que codifica la proteína de unión a antígeno. La mutación incluye una sustitución de aminoácido en la posición 253, 310, 311, 433 o 434 del dominio bisagra de Fc.

Ligadores

Los armazones proteicos pueden ser los mismos que las secuencias que se producen de manera natural, tales como secuencias de Ig, o ser fragmentos de secuencias que se producen de manera natural, y pueden contener secuencias adicionales que pueden producirse de manera natural, ser de una fuente diferente o sintéticas y que pueden añadirse al extremo N o C terminal del armazón. Tales secuencias adicionales pueden considerarse que son ligadores cuando unen un dominio de unión a epítopo y un armazón proteico, tales como los definidos en el presente documento.

En otro aspecto, el constructo de unión a antígeno consiste en, o consiste esencialmente en, una región Fc de un anticuerpo, o una parte de la misma, unida en cada extremo, directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de una secuencia de ligador) a un dominio de unión a epítopo. Un constructo de unión a antígeno de este tipo puede comprender 2 dominios de unión a epítopo separados por una región Fc, o parte de la misma. Por separado quiere decirse que los dominios de unión a epítopo no están directamente unidos entre sí, y en un aspecto están ubicados en extremos opuestos (extremo C y N terminal) de una región Fc, o cualquier otra región del armazón.

En un aspecto, el constructo de unión a antígeno comprende 2 regiones del armazón, cada una unida a 2 dominios de unión a epítopo, por ejemplo en los extremos N y C terminales de cada región del armazón, o bien directa o bien indirectamente por medio de un ligador.

Los armazones proteicos de la presente invención pueden unirse los dominios de unión a epítopo mediante el uso de ligadores. Los ejemplos de ligadores adecuados incluyen secuencias de aminoácidos que pueden tener desde 1 aminoácido hasta 150 aminoácidos de longitud, o desde 1 aminoácido hasta 140 aminoácidos, por ejemplo, desde 1 aminoácido hasta 130 aminoácidos, o desde 1 hasta 120 aminoácidos, o desde 1 hasta 80 aminoácidos, o desde 1 hasta 50 aminoácidos, o desde 1 hasta 20 aminoácidos, o desde 1 hasta 10 aminoácidos, o desde 5 hasta 18 aminoácidos. Tales secuencias pueden tener su propia estructura terciaria, por ejemplo, un ligador de la presente invención puede comprender un dominio variable individual. El tamaño de un ligador en una realización es equivalente a un dominio variable individual. Los ligadores adecuados pueden ser de un tamaño de desde 1 hasta 100 angstroms, por ejemplo, pueden ser de un tamaño de desde 20 hasta 80 angstroms o, por ejemplo, pueden ser de un tamaño de desde 20 hasta 60 angstroms o, por ejemplo, menor de 40 angstroms, o menor de 20 angstroms, o menor de 5 angstroms de longitud.

En una realización de la presente invención, se proporcionan proteínas de unión a ICOS que comprenden: CDRH1 tal como se expone en SEQ ID NO: 1; CDRH2 tal como se expone en SEQ ID NO: 2; CDRH3 tal como se expone en SEQ ID NO: 3; CDRL1 tal como se expone en SEQ ID NO: 4; CDRL2 tal como se expone en SEQ ID NO: 5 y CDRL3 tal como se expone en SEQ ID NO: 6.

En una realización de la presente invención, se proporcionan proteínas de unión a ICOS que se unen específicamente a ICOS humano que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. En un aspecto, las proteínas de unión a ICOS de la presente invención también se unen a ICOS de cynomolgus. En un aspecto, no se unen a ICOS murino.

En una realización, las proteínas de unión a ICOS de la invención son agonistas de ICOS. En un aspecto, las proteínas de unión a ICOS aumentan la producción de IFN-gamma en presencia de células T. En otro aspecto, las proteínas de unión a ICOS de la presente invención estimulan la proliferación de células T.

En una realización, la proteína de unión a ICOS de la invención se une a ICOS humano con una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 1X105 M-1s-1; y una constante de velocidad de disociación (koff) de menos de 6X10-5 s-1; o

una constante de disociación (Kd) de menos de 100 nM

en la que la alta afinidad se mide mediante Biacore.

En una realización, la proteína de unión a ICOS comprende CDRH3 (SEQ ID NO: 3) o una variante de SEQ ID NO. 3. En otra realización las proteínas de unión a ICOS comprenden CDRH1 (SEQ ID NO: 1); CDRH2 (SEQ ID NO: 2); CDRH3 (SEQ ID NO: 3); CDRL1 (SEQ ID NO: 4); CDRL2 (SEQ ID NO: 5); y CDRL3 (SEQ ID NO: 6). En una realización, las proteínas de unión a ICOS comprenden CDR de cadena pesada tal como se exponen en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; y SEQ ID NO: 3 y CDR de cadena ligera tal como se exponen en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.

En una realización, las proteínas de unión a ICOS comprenden un dominio VH que tiene el 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; y un dominio Vl que tiene el 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. En un aspecto, las proteínas de unión a ICOS comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 7 y el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8. En un aspecto, las proteínas de unión a ICOS comprenden un dominio variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 7. En un aspecto, la proteína de unión a ICOS comprende un dominio variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 8.

En una realización, la invención proporciona una proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8, en la que dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma se une específicamente a ICOS humano. En una realización, la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; y un dominio Vl que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8, en la que dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma se une específicamente a ICOS humano comprende además CDR de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; y SEQ ID NO: 3 y CDR de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SeQ ID NO: 6.

En un aspecto, la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma comprende un dominio Vh que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; y un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. En una realización, la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma es un agonista para ICOS humano. En una realización, la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma comprende además un armazón de isotipo de IgG4 o una variante del mismo. En una realización, la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma comprende un armazón de hIgG4PE.

En una realización, la proteína de unión a ICOS de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92, %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 23.

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGLISIYSDHTNYNQKFQGRVTITADKS

TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRNNYGNYGWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV

KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGP

PCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST

YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO:23)

En una realización, la proteína de unión a ICOS de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92, %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24.

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDYTLTIS

SLEPEDFAVYYCFQGSGYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID

NO:24)

En una realización, la proteína de unión a ICOS de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 23 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 24. En una realización, la proteína de unión a ICOS de la presente invención comprende además un armazón de hIgGPE.

En una realización, la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma en la que dicha proteína de unión a ICOS es un anticuerpo monoclonal humanizado. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según la reivindicación y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se dan a conocer métodos de tratamiento de una enfermedad seleccionada de cáncer, enfermedad infecciosa y/o síndrome séptico en un ser humano que lo necesita, método que comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica de la presente invención a dicho ser humano. En un aspecto, el método comprende además administrar al menos un agente antineoplásico, al menos un segundo agente inmunomodulador y/o al menos un adyuvante inmunoestimulador a dicho ser humano. En un aspecto, el segundo agente inmunomodulador se selecciona de: un anticuerpo anti-CTLA4 y anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDLl y un anticuerpo anti-OX40. En un aspecto, el anticuerpo anti-CTLA4 es ipilimumab. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona de pembrolizumab y/o nivolumab.

Se dan a conocer métodos para tratar el cáncer en un ser humano que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente aceptable de la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma a un ser humano. En algunos aspectos, el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal (CRC), esofágico, de cuello uterino, de vejiga, de mama, de cabeza y cuello, de ovario, melanoma, carcinoma de células renales (RCC), de células escamosas EC, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, mesotelioma y cáncer de próstata.

Se dan a conocer métodos para tratar una enfermedad infecciosa en un ser humano que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente aceptable de la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma a un ser humano. En un aspecto, las enfermedades infecciosas son VIH.

Se dan a conocer métodos para tratar el síndrome séptico en un ser humano que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente aceptable de la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma a un ser humano.

Se dan a conocer métodos para estimular la proliferación de células T, inducir la activación de células T y/o inducir la producción de citocinas en un ser humano que comprenden administrar una composición farmacéutica de la invención a dicho ser humano.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma de la presente invención. En una realización, se proporcionan células huésped que comprenden polinucleótidos que codifican las proteínas de unión a ICOS o porciones de unión a antígeno de las mismas de la presente invención. La presente invención también proporciona métodos de preparación de una proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma que comprenden las etapas de a) cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma de la presente invención en condiciones adecuadas para expresar dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma; y b) aislar dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma.

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado aislado que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; un dominio V^l que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; y un armazón de hIgG4 o una variante del mismo. En un aspecto, el armazón de hIgG4 es hIgG4PE.

En una realización, se proporcionan proteínas de unión a ICOS o porciones de unión a antígeno de las mismas, en las que la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma compite de manera cruzada por la unión a ICOS humano con un anticuerpo de referencia o porción de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio V^h que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; y un dominio V^l que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8.

En una realización, las proteínas de unión a ICOS de la invención estimulan la proliferación de células T cuando se ponen en contacto con una célula T. En una realización, las proteínas de unión a ICOS de la invención inducen la activación de células T cuando se ponen en contacto con una célula T. La activación de células T puede medirse mediante un aumento en los niveles de expresión en porcentaje de ciertos marcadores de activación tales como, pero sin limitarse a, CD69, CD25 y/o OX40. En una realización, las proteínas de unión a ICOS de la presente invención estimulan la producción de citocinas cuando se ponen en contacto con una célula T. Las proteínas de unión a ICOS se unen a FcYRIIb humano pero no se unen a FcYRIIa humano o FcYRIIIa humano. Adicionalmente, las proteínas de unión a ICOS no agotan adecuadamente células T que expresan ICOS cuando se ponen en contacto con células T que expresan ICOS. En algunos aspectos, las proteínas de unión a ICOS reticulan una célula T con una segunda célula cuando se ponen en contacto con dicha célula T en presencia de una segunda célula. Esta reticulación puede producirse a través del acoplamiento de la proteína de unión a ICOS con un FcyR en la segunda célula. Las células que expresan FcyR incluyen, pero no se limitan a, monocitos, linfocitos B, células dendríticas foliculares, células citolíticas naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos. Por tanto, en una realización, las proteínas de unión a ICOS pueden administrarse a un mamífero en el que la proteína de unión a ICOS actuará como agonista para ICOS en una célula T y también se acoplará a un FcyR en una segunda célula.

En una realización, las proteínas de unión a ICOS comprenden un armazón seleccionado de isotipo de IgG1 humana o variante del mismo e isotipo de IgG4 humana o variante del mismo. Adecuadamente, el armazón comprende un armazón de isotipo de IgG4 humana o variante del mismo. En un aspecto, el armazón comprende un armazón de hIgG4PE.

En una realización, la proteína de unión a ICOS es un anticuerpo monoclonal. Adecuadamente, la proteína de unión a ICOS es un anticuerpo monoclonal humanizado. En un aspecto, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser completamente humanos.

En otro aspecto, la proteína de unión a ICOS es un fragmento que es un Fab, Fab’, F(ab’)², Fv, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, minianticuerpo, minicuerpo, VH aislado o VL aislado. En una realización, la proteína de unión a ICOS es una porción de unión a antígeno del mismo.

En algunos aspectos, la proteína de unión a ICOS se une a ICOS humano con una afinidad más fuerte de 0,6 nM. En un aspecto, la afinidad es 100 nM o más fuerte. En una realización, la proteína de unión a ICOS tiene una KD de 100 nM para ICOS. Adecuadamente, la KD de la proteína de unión a ICOS para ICOS es de 100 nM o menos, 50 nM o menos, 25 nM o menos, 10 nM o menos, 2 nM o menos o 1 nM o menos.

En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales humanizados que son agonistas para ICOS humano. En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales humanizados que comprenden CDR de región variable de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; y SEQ ID NO: 3 y CDR de región variable de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6. En un aspecto, el anticuerpo monoclonal humanizado es capaz de estimular la producción de citocina y/o la proliferación de células T cuando se ponen en contacto con una célula T al tiempo que no inducen el complemento, ADCC o CDC. En una realización, el anticuerpo monoclonal humanizado tiene una región Fc de IgG1 humana variante. En una realización, el anticuerpo monoclonal humanizado tiene una región Fc de IgG4 humana o variante de la misma. En una realización, el anticuerpo monoclonal humanizado tiene una región Fc de hIgG4PE. En un aspecto, el anticuerpo monoclonal humanizado comprende un dominio Vh que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 7; y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8. En un aspecto, el anticuerpo monoclonal humanizado comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7; y un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8. En un aspecto, el anticuerpo monoclonal humanizado comprende un armazón de hIgG4PE. Además, se muestra que los anticuerpos monoclonales humanizados de la presente invención estimulan la proliferación de células T cuando se ponen en contacto con una célula T CD4+ o CD8+. Se muestra que los anticuerpos monoclonales humanizados de la presente invención inducen la activación de células T y estimulan la producción de citocinas.

En una realización, el anticuerpo monoclonal humanizado comprende un armazón de hIgG4PE y comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. Los anticuerpos de la presente invención pueden estimular la producción de citocinas cuando se ponen en contacto con una célula T.

En una realización, se proporciona una proteína de unión a ICOS que compite por la unión a ICOS con una cualquiera de las proteínas de unión a ICOS de la invención. Tal como se entiende en la técnica y se describe en el presente documento, la competencia por la unión puede medirse comparando la competencia por la unión del ligando a ICOS en presencia de una o más proteínas de unión a ICOS. Tal como se entiende también en la técnica, ICOS se expresa en células T CD4+ y CD8+ así como en células Treg. Las proteínas de unión a ICOS de la presente invención actúan como agonista para ICOS en células T. También actúan bloqueando la interacción entre ICOS-L e ICOS expresado tanto en células T como en células Treg. Por tanto, en una realización, se proporcionan métodos para bloquear la interacción de ICOS-L con ICOS en células Treg. Pueden encontrarse células Treg que expresan ICOS en diversos tipos de tumores incluyendo tumores líquidos tales como linfoma. Por tanto, en un aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos de tratamiento de un cáncer que comprenden administrar una proteína de unión a ICOS de la invención en los que la proteína de unión a ICOS bloquea la interacción de ICOS-L con ICOS en células Treg.

Además de la invención, se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a ICOS o un anticuerpo monoclonal. En un aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención comprende además al menos un agente antineoplásico. En un aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención comprende además al menos un segundo agente inmunomodulador. En un aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención comprende además al menos un adyuvante inmunoestimulador.

En una realización, se proporcionan métodos para tratar cáncer y/o enfermedad infecciosa en un ser humano que lo necesita, en los que dicho método comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica de la invención a dicho ser humano. En una realización, el ser humano tiene cáncer. En una realización, el ser humano tiene una enfermedad infecciosa. En una realización, el ser humano tiene VIH. En un aspecto, el método comprende además administrar al menos un agente antineoplásico a dicho ser humano. En otro aspecto, el método comprende además administrar al menos un segundo agente inmunomodulador a dicho ser humano. En aún otro aspecto, el método comprende además administrar un adyuvante inmunoestimulador a dicho ser humano.

En un aspecto, el ser humano tiene un tumor sólido. En un aspecto, el tumor se selecciona de cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, melanoma, carcinoma de células renales (RCC), cáncer esofágico, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de ovario y cáncer pancreático. En un aspecto, el ser humano tiene uno o más de los siguientes: cáncer colorrectal (CRC), esofágico, de cuello uterino, de vejiga, de mama, de cabeza y cuello, de ovario, melanoma, carcinoma de células renales (RCC), de células escamosas EC, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, mesotelioma y cáncer de próstata. En otro aspecto, el ser humano tiene un tumor líquido tal como linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), mieloma múltiple, leucemia linfoblástica crónica (CLL), linfoma folicular, leucemia mieloide aguda y leucemia mielógena crónica.

La presente divulgación también se refiere a un método para tratar o disminuir la gravedad de un cáncer seleccionado de: cerebro (gliomas), glioblastomas, síndrome de Bannayan-Zonana, enfermedad de Cowden, enfermedad de Lhermitte-Duclos, cáncer de mama, de mama inflamatorio, tumor de Wilm, enfermedad de Ewing. sarcoma, rabdomiosarcoma, ependimoma, meduloblastoma, colon, cabeza y cuello, riñón, pulmón, hígado, melanoma, ovario, pancreático, próstata, sarcoma, osteosarcoma, tumor de células gigantes del hueso, tiroides, leucemia linfoblástica de células T, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, tricoleucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia neutrofílica crónica, leucemia linfoblástica aguda de células T, plasmacitoma, leucemia inmunoblástica de células grandes, leucemia de células del manto, mieloma múltiple, leucemia megacarioblástica, mieloma múltiple, leucemia megacariocítica aguda, leucemia promielocítica, eritroleucemia, linfoma maligno, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma linfoblástico de células T, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, neuroblastoma, cáncer de vejiga, cáncer urotelial, cáncer de pulmón, cáncer de vulva, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer renal, mesotelioma, cáncer de esófago, cáncer de glándulas salivales, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer nasofaríngeo, cáncer bucal, cáncer de la boca, GIST (tumor estromal gastrointestinal) y cáncer testicular.

Por el término “tratar” y variaciones gramaticales del mismo tal como se usan en el presente documento, quiere decirse terapia terapéutica. En referencia a una afección particular, tratar significa: (1) mejorar o prevenir la afección de una o más de las manifestaciones biológicas de la afección, (2) interferir con (a) uno o más puntos en la cascada biológica que conduce o es responsable de la afección o (b) una o más de las manifestaciones biológicas de la afección, (3) aliviar uno o más de los síntomas, efectos o efectos secundarios asociados con la afección o el tratamiento de la misma, (4) ralentizar la progresión de la afección o una o más de las manifestaciones biológicas de la afección y/o (5) curar dicha afección o una o más de las manifestaciones biológicas de la afección al eliminar o reducir hasta niveles indetectables una o más de las manifestaciones biológicas de la afección durante un período de tiempo que se considera que es un estado de remisión para esa manifestación sin tratamiento adicional a lo largo del período de remisión. Un experto en la técnica entenderá la duración del tiempo que se considera remisión para una enfermedad o afección particular. De ese modo, también se contempla la terapia profiláctica. El experto en la materia apreciará que “prevención” no es un término absoluto. En medicina, se entiende que “prevención” se refiere a la administración profiláctica de un fármaco para disminuir sustancialmente la probabilidad o gravedad de una afección o manifestación biológica de la misma, o para retrasar la aparición de tal afección o manifestación biológica de la misma. La terapia profiláctica es apropiada, por ejemplo, cuando se considera que un sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar cáncer, tal como cuando un sujeto tiene un fuerte historial familiar de cáncer o cuando un sujeto ha estado expuesto a un carcinógeno.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “cáncer”, “neoplasia” y “tumor” se usan indistintamente y, en forma o bien singular o bien plural, se refieren a células que han experimentado una transformación maligna que las vuelve patológicas para el organismo huésped. Las células cancerosas primarias pueden distinguirse fácilmente de las células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, particularmente examen histológico. La definición de una célula cancerosa, tal como se usa en el presente documento, incluye no solo una célula cancerosa primaria, sino cualquier célula derivada de un ancestro de una célula cancerosa. Esto incluye células cancerosas metastatizadas y cultivos in vitro y líneas celulares derivadas de células cancerosas. Cuando se hace referencia a un tipo de cáncer que se manifiesta normalmente como un tumor sólido, un tumor “detectable clínicamente” es uno que es detectable basándose en la masa tumoral; por ejemplo, mediante procedimientos tales como exploración por tomografía computarizada (CT), obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), rayos X, ultrasonidos o palpación en el examen físico, y/o que es detectable debido a la expresión de uno o más antígenos específicos de cáncer en una muestra que puede obtenerse de un paciente. Los tumores pueden ser un cáncer hematopoyético (o hemático o hematológico o relacionado con la sangre), por ejemplo, cánceres derivados de células sanguíneas o células inmunitarias, que pueden denominarse “tumores líquidos”. Los ejemplos específicos de afecciones clínicas basadas en tumores hematológicos incluyen leucemias tales como leucemia mielocítica crónica, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y leucemia linfocítica aguda; tumores malignos de células plasmáticas tales como mieloma múltiple, MGUS y macroglobulinemia de Waldenstrom; linfomas tales como linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin; y similares.

El cáncer puede ser cualquier cáncer en el que esté presente un número anómalo de blastocitos o una proliferación celular no deseada o que se diagnostique como cáncer hematológico, incluyendo tumores malignos tanto linfoides como mieloides. Los tumores malignos mieloides incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide (o mielocítica, mielógena o mieloblástica) aguda (indiferenciada o diferenciada), leucemia promieloide (o promielocítica, promielógena o promieloblástica) aguda, leucemia mielomonocítica (o mielomonoblástica) aguda, leucemia monocítica (o monoblástica) aguda, leucemia, eritroleucemia y leucemia megacariocítica (o megacarioblástica). Estas leucemias pueden denominarse juntas leucemia mieloide (o mielocítica o mielógena) aguda (AML). Los tumores malignos mieloides también incluyen trastornos mieloproliferativos (MPD) que incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena (o mieloide) crónica (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), trombocitemia esencial (o trombocitosis) y policitemia vera (PCV). Los tumores malignos mieloides también incluyen mielodisplasia (o síndrome mielodisplásico o MDS), que puede denominarse anemia refractaria (RA), anemia refractaria con exceso de blastos (RAEB) y anemia refractaria con exceso de blastos en transformación (RAEBT); así como mielofibrosis (MFS) con o sin metaplasia mieloide agnogénica.

Los cánceres hematopoyéticos también incluyen tumores malignos linfoides, que pueden afectar a los ganglios linfáticos, el bazo, la médula ósea, la sangre periférica y/o sitios extraganglionares. Los cánceres linfoides incluyen tumores malignos de células B, que incluyen, pero no se limitan a, linfomas no Hodgkin de células B (B-NHL). Los B-NHL pueden ser indolentes (o de bajo grado), de grado intermedio (o agresivos) o de alto grado (muy agresivos). Los linfomas de células B indolentes incluyen linfoma folicular (FL); linfoma linfocítico pequeño (SLL); linfoma de la zona marginal (MZL) que incluye MZL ganglionar, MZL extraganglionar, MZL esplénico y MZL esplénico con linfocitos vellosos; linfoma linfoplasmacítico (LPL); y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT o zona marginal extraganglionar). Los B-NHL de grado intermedio incluyen el linfoma de células del manto (MCL) con o sin implicación leucémica, linfoma de células grandes difuso (DLBCL), el linfoma folicular de células grandes (o grado 3 o grado 3B) y linfoma mediastínico primario (LMP). Los B-NHL de alto grado incluyen linfoma de Burkitt (BL), linfoma similar a Burkitt, linfoma de células pequeñas no escindidas (SNCCL) y linfoma linfoblástico. Otros B-NHL incluyen linfoma inmunoblástico (o inmunocitoma), linfoma de efusión primaria, linfomas asociados con el VIH (o relacionados con el SIDA) y trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante (PTLD) o linfoma. Los tumores malignos de células B también incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia prolinfocítica (PLL), macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), tricoleucemia (HCL), leucemia de linfocitos granulares grandes (LGL), leucemia linfoide aguda (o linfocítica o linfoblástica) y enfermedad de Castleman. El NHL también puede incluir linfoma no Hodgkin de células T (T-NHL), que incluye, pero no se limita a, linfoma no Hodgkin de células T no especificado de otra forma (NOS), linfoma periférico de células T (PTCL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), trastorno linfoide angioinmunoblástico (AILD), linfoma nasal de células citolíticas naturales (NK)/células T, linfoma gamma/delta, linfoma cutáneo de células T, micosis fungoide y síndrome de Sezary.

Los cánceres hematopoyéticos también incluyen linfoma (o enfermedad) de Hodgkin, incluyendo linfoma de Hodgkin clásico, linfoma de Hodgkin esclerosante nodular, linfoma de Hodgkin de celularidad mixta, linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos (LP), linfoma de Hodgkin con LP nodular y linfoma de Hodgkin con agotamiento de linfocitos. Los cánceres hematopoyéticos también incluyen enfermedades o cánceres de células plasmáticas tales como mieloma múltiple (MM), incluyendo MM latente, gammapatía monoclonal de significación indeterminada (o desconocida o poco clara) (MGUS), plasmocitoma (óseo, extramedular), linfoma linfoplasmacítico (LPL), macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia de células plasmáticas y amiloidosis primaria (AL). Los cánceres hematopoyéticos también pueden incluir otros cánceres de células hematopoyéticas adicionales, incluyendo leucocitos polimorfonucleares (o neutrófilos), basófilos, eosinófilos, células dendríticas, plaquetas, eritrocitos y células citolíticas naturales. Los tejidos que incluyen células hematopoyéticas denominados en el presente documento “tejidos de células hematopoyéticas” incluyen médula ósea; sangre periférica; timo; y tejidos linfoides periféricos, tales como bazo, ganglios linfáticos, tejidos linfoides asociados con la mucosa (tales como los tejidos linfoides asociados con el intestino), amígdalas, placas de Peyer y apéndice, y tejidos linfoides asociados con otras mucosas, por ejemplo, los revestimientos bronquiales.

Las proteínas de unión a ICOS, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de la invención también pueden usarse para curar, prevenir o tratar infecciones y enfermedades infecciosas. Las proteínas de unión a ICOS pueden usarse solas o en combinación con vacunas para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y autoantígenos. Las proteínas de unión a ICOS de la presente invención pueden usarse para estimular la respuesta inmunitaria a virus infecciosos para seres humanos, tales como, pero sin limitarse a, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis de clase A, B y C, virus de Eppstein Barr, citomegalovirus humano, virus del papiloma humano, virus del herpes. Las proteínas de unión a ICOS de la presente invención pueden usarse para estimular la respuesta inmunitaria a la infección con parásitos bacterianos o fúngicos y otros patógenos. Adecuadamente, la presente invención proporciona métodos para tratar seres humanos que han estado expuestos a toxinas o patógenos particulares. Por consiguiente, otro aspecto de la invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de unión a ICOS, o la porción de unión a antígeno de la misma.

Los ejemplos de enfermedades infecciosas para las que las proteínas de unión a ICOS de la presente invención pueden ser útiles incluyen, pero no se limitan a, VIH, hepatitis (A, B y C), influenza, herpes, Giardia, malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Algunos ejemplos de virus patógenos que provocan infecciones que pueden tratarse con los métodos de la invención incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, VHS-1, VHA-6, VHS-II y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus VLTH, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, virus de la poliomielitis, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que provocan infecciones que pueden tratarse mediante los métodos de la invención incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumococos, meningococos y conococos, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, difteria, Salmonella, bacilos, bacterias del cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y de la enfermedad de Lymes.

Algunos ejemplos de hongos patógenos que provocan infecciones que pueden tratarse mediante los métodos de la invención incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), género Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que provocan infecciones que pueden tratarse mediante los métodos de la invención incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi y Nippostrongilus brasiliensis.

El síndrome séptico es una afección médica potencialmente mortal que se caracteriza por un estado inflamatorio en todo el cuerpo (denominado síndrome de respuesta inflamatoria sistémica o SIRS) y la presencia de una infección conocida o sospechada. El cuerpo puede desarrollar esta respuesta inflamatoria por el sistema inmunitario frente a microbios en la sangre, orina, pulmones, piel u otros tejidos. Un término común para el síndrome séptico es envenenamiento de la sangre, más acertadamente aplicado a septicemia, a continuación. El síndrome séptico grave es la respuesta inflamatoria sistémica, más la infección, más la presencia de disfunción orgánica.

Septicemia es un término médico relacionado que se refiere a la presencia de organismos patógenos en el torrente sanguíneo, lo que conduce a síndrome séptico. El término no se ha definido claramente.

El síndrome séptico y el cáncer comparten mecanismos inmunosupresores similares incluyendo aumento de células T reguladoras, aumento de células supresoras derivadas de tejido mieloide, aumento de la expresión de moléculas coestimuladoras negativas, disminución de la expresión de HLA-DR en monocitos/macrófagos. El síndrome séptico y el cáncer son trastornos prototípicos de inflamación crónica. La inflamación crónica estimula respuestas inmunorreguladoras potentes y sostenidas, incluyendo la expansión de células T reguladoras y la regulación por incremento de PD-1 y otros reguladores negativos en células efectoras. Barouch D.H. y Deeks S.G.; Immunologic strategies for HIV-1 remission and eradication. Science 345:169-1742014. Por tanto, en un aspecto de las presentes invenciones, se proporcionan métodos para tratar el síndrome séptico en un ser humano que lo necesita que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno de ICOS de la presente invención a dicho ser humano. Boomer, et al. JAMA 306:2594-2605 (2011); Meisel, et al. Granulocytemacrophage colony-stimulating factor to reverse sepsis-associated immunosuppression: a double-blind, randomized, placebo-controlled multicenter trial. Am JRespir Crit Care Med 180:640-648 (2009); y Hall, et al. Immunoparalysis and nosocomial infection in children with multiple organ dysfunction syndrome. Intensive Care Med 37:525-532 (2011).

Las proteínas de unión a ICOS de la invención pueden usarse conjuntamente con otras proteínas y/o péptidos recombinantes (tales como antígenos tumorales o células cancerosas) con el fin de aumentar una respuesta inmunitaria a estas proteínas (es decir, en un protocolo de vacunación).

Por ejemplo, pueden usarse proteínas de unión a ICOS de las mismas para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígeno mediante coadministración de al menos una proteína de unión a ICOS con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un método de potenciación de una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) una proteína de unión a ICOS de la invención, de manera que se potencia una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitativos de tales antígenos incluyen, sin limitación, antígenos tumorales, o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos.

Un obstáculo importante para la erradicación del VIH es el mantenimiento de células infectadas de manera latente que no expresan antígenos virales, y escapan de la vigilancia inmunitaria. Las estrategias actuales para eliminar el reservorio viral latente, denominadas estrategia de “golpear y matar”, tienen como objetivo reactivar la expresión génica del VIH (“golpear”) ya que la activación celular conduce a la reactivación del VIH, y eliminar las células reactivadas (“matar”). La activación celular está regida por un equilibrio de reguladores positivos y negativos expresados en la superficie de las células T. La alteración de este equilibrio por el agonismo de reguladores positivos y el antagonismo de los negativos puede facilitar la reactivación del VIH.

El coestimulador de células T inducible (ICOS) es un regulador positivo cuya expresión aumenta en las células T CD4 tras la estimulación. ICOS funciona promoviendo la proliferación de células T, la producción de citocinas y la diferenciación. Un subconjunto importante de células T que expresa altos niveles de PD-1 e ICOS son las células T auxiliares foliculares (Tfh). Las células Tfh ayudan a las células B a que experimenten diferenciación, cambio de clase, hipermutación somática y son necesarias para la formación de centros germinales. Las células Tfh se expanden significativamente después de la infección por VIH/VIS y su desregulación durante la infección lentiviral crónica contribuye al deterioro de la inmunidad de células B. Se ha demostrado que las células Tfh clasificadas contienen niveles más altos de ADN de VIH que otros subconjuntos de CD4 linfoides y se observa recrecimiento del virus después de la estimulación. Las células Tfh residen en los centros germinales y se exponen a los viriones del VIH atrapados en células dendríticas foliculares que pueden facilitar su infección. Además, las células T CD8 tienen acceso limitado a los centros germinales y las células CD8 foliculares a menudo muestran una citotoxicidad reducida, ocultando las células Tfh a la vigilancia antiviral. Por tanto, las células Tfh son un importante reservorio de VIH protegido y las estrategias que seleccionan como diana PD-1 e ICOS pueden seleccionar como diana selectivamente a las células Tfh y tener utilidad como parte de un régimen de cura del VIH. Adecuadamente, se proporcionan métodos para tratar a un ser humano infectado con VIH que comprenden administrar una proteína de unión a ICOS o la porción de unión a antígeno de la misma de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, los “antígenos tumorales” son proteínas producidas por células tumorales que provocan una respuesta inmunitaria, particularmente respuestas inmunitarias mediadas por células T. El término “antígeno tumoral”, como se usa en el presente documento, incluye tanto antígenos específicos de tumores como antígenos asociados a tumores. Los antígenos específicos de tumor son exclusivos de las células tumorales y no se producen en otras células del cuerpo. Los antígenos asociados a tumores no son exclusivos de una célula tumoral y, en su lugar, también se expresan en una célula normal en condiciones que no logran inducir un estado de tolerancia inmunológica al antígeno. La expresión del antígeno en el tumor puede producirse en condiciones que permitan que el sistema inmunitario responda al antígeno. Los antígenos asociados a tumores pueden ser antígenos que se expresan en células normales durante el desarrollo fetal cuando el sistema inmunitario es inmaduro e incapaz de responder o pueden ser antígenos que normalmente están presentes a niveles extremadamente bajos en células normales pero que se expresan a niveles mucho más altos en células tumorales.

Los ejemplos no limitativos de antígenos tumorales incluyen los siguientes: antígenos de diferenciación tales como MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos de múltiples linajes específicos de tumores tales como antígenos de la familia MAGE incluyendo pero sin limitarse a MAGE1, MAGE3, MAGE10, MAGE11, MAGE12, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB18, MAGEB6, MABEC1, MAGED2, MAGEE1, MAGEH1, MAGEL2, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; MEL4, antígeno asociado a melanoma 100+, gp100 de melanoma, n R iP3, NYS48, OCIAD1, OFA-iLRP, OIP5, antígeno asociado a carcinoma de ovario (OV632), PAGE4, PARP9, PATE, plastina L, PRAME, antígeno específico de la próstata, proteinasa 3, prosteína, Reg3a, RHAMM, ROPN1, SART2, SDCCAG8, SEL1L, SEPT1, SLC45A2, SPANX, SSX5, STXGALNAC1, STEAP4, survivina, TBC1D2, TEM1, TRP1, antígenos tumorales de origen epitelial, XAGE1, XAGE2, WT-1; antígenos embrionarios sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorales únicos que resultan de translocaciones cromosómicas; tal como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MIL-RAR; y antígenos virales, tales como los antígenos del virus de Epstein Barr EBVA y los antígenos del virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7.

Otros antígenos tumorales incluyen, pero no se limitan a, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, beta-catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfafetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, antígeno asociado a glioma, gonadotropina coriónica humana b, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva con lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilo esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno específico de la próstata (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, Her2/neu, survivina y telomerasa, antígeno tumoral de carcinoma de próstata (PCTA-1), ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrina B2, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, glicolípido F77, EGFRvlII, GD-2, factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina.

Normalmente, cualquier agente antineoplásico que tenga actividad frente a un tumor susceptible que está tratándose puede coadministrarse en el tratamiento de cáncer en la presente invención. Pueden encontrarse ejemplos de tales agentes en Cancer Principles and Practice of Oncology de V.T. Devita y S. Hellman (editores), 6a edición (15 de febrero de 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Un experto habitual en la técnica sería capaz de discernir qué combinaciones de agentes serían útiles basándose en las características particulares de los fármacos y el cáncer implicado. Los agente antineoplásicos típicos útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, agentes antimicrotúbulos tales como diterpenoides y alcaloides de la vinca; complejos de coordinación de platino; agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno, oxazafosforinas, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triazenos; agentes antibióticos tales como antraciclinas, actinomicinas y bleomicinas; inhibidores de topoisomerasa II tales como epipodofilotoxinas; antimetabolitos tales como análogos de purina y pirimidina y compuestos antifolato; inhibidores de topoisomerasa I tales como camptotecinas; hormonas y análogos hormonales; inhibidores de rutas de transducción de señales; inhibidores de la angiogénesis de tirosina cinasa no receptora; agentes inmunoterapéuticos; agentes proapoptóticos; e inhibidores de la señalización del ciclo celular.

Los ejemplos de un principio o principios activos adicionales para su uso en combinación o coadministrados con la presente proteína de unión a ICOS son agentes antineoplásicos incluyendo cualquier agente quimioterápico, agente inmunomodulador o inmunomoduladores y adyuvantes inmunoestimuladores.

Agentes antimicrotúbulos o antimitóticos son agentes específicos de fase activos contra los microtúbulos de células tumorales durante la fase M o de mitosis del ciclo celular. Los ejemplos de agentes antimicrotúbulos incluyen, pero no se limitan a, diterpenoides y alcaloides de la vinca.

Los diterpenoides, que se derivan de fuentes naturales, son agentes anticancerígenos específicos de fase que funcionan en las fases G2/M del ciclo celular. Se cree que los diterpenoides estabilizan la subunidad de tubulina b de los microtúbulos, al unirse con esta proteína. El desensamblaje de la proteína parece entonces inhibirse deteniéndose la mitosis y siguiendo muerte celular. Los ejemplos de diterpenoides incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel y su análogo docetaxel.

Paclitaxel, 4,10-diacetato, 2-benzoato, 13-éster de 5p,20-epoxi-1,2a,4,7p,10p,13a-hexa-hidroxitax-11-en-9-ona con (2R,3S)-N-benzoil-3-fenilisoserina; es un producto diterpénico natural aislado del tejo del Pacífico Taxus brevifolia y está disponible comercialmente como una disolución inyectable TAXOL®. Es un miembro de la familia de taxano de terpenos. Se aisló por primera vez en 1971 por Wani et al. J. Am. Chem, Soc., 93:2325. 1971), que caracterizó su estructura por métodos químicos y cristalográficos de rayos X. Un mecanismo de su actividad se refiere a la capacidad del paclitaxel para unirse a la tubulina, inhibiendo de ese modo el crecimiento de células cancerosas. Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980); Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979); Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981). Para una revisión de la síntesis y actividad anticancerígena de algunos derivados de paclitaxel, véase: D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, titulado “New trends in Natural Products Chemistry 1986”, Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Ámsterdam, 1986) págs. 219-235.

El paclitaxel se ha aprobado para uso clínico en el tratamiento de cáncer de ovario refractario en los Estados Unidos (Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. Intern, Med., 111:273,1989) y para el tratamiento de cáncer de mama (Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991). Es un posible candidato para el tratamiento de neoplasias en la piel (Einzig et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46) y carcinomas de cabeza y cuello (Forastire et al., Sem. Oncol., 20:56, 1990). El compuesto también muestra potencial para el tratamiento de enfermedad renal poliquística (Woo et al., Nature, 368:750. 1994), cáncer de pulmón y malaria. El tratamiento de pacientes con paclitaxel da como resultado supresión de la médula ósea (múltiples linajes celulares, Ignoff, R.J. et al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998) relacionada con la duración de la dosificación por encima de una concentración umbral (50 nM) (Kearns, C.M. et al., Seminars in Oncology, 3(6) págs. 16-23, 1995).

Docetaxel, (2R,3S)-N-carboxi-3-fenilisoserina, éster N-terc-butílico, 13-éster con 4-acetato, 2-benzoato de 5p-20-epoxi-1,2a,4,7p,10p,13a-hexahidroxitax-11-en-9-ona, trihidratado; está disponible comercialmente como disolución inyectable como TAXOTERE®. El docetaxel está indicado para el tratamiento de cáncer de mama. El docetaxel es un derivado semisintético de paclitaxel a demanda, preparado usando un precursor natural, 10-desacetil-bacatina III, extraído de la aguja del tejo europeo. La toxicidad limitante de la dosis de docetaxel es neutropenia.

Los alcaloides de la vinca son agentes antineoplásicos específicos de fase derivados de la planta vincapervinca. Los alcaloides de la vinca actúan en la fase M (mitosis) del ciclo celular uniéndose específicamente a la tubulina. En consecuencia, la molécula de tubulina unida es incapaz de polimerizarse en microtúbulos. Se cree que la mitosis se detiene en la metafase siguiendo muerte celular. Los ejemplos de alcaloides de la vinca incluyen, pero no se limitan a, vinblastina, vincristina y vinorelbina.

La vinblastina, sulfato de vincaleucoblastina, está disponible comercialmente como VELBAN® como una disolución inyectable. Aunque tiene una posible indicación como terapia de segunda línea de diversos tumores sólidos, está indicada principalmente en el tratamiento de cáncer testicular y diversos linfomas, incluyendo enfermedad de Hodgkin; y linfomas linfocíticos e histiocíticos. La mielosupresión es el efecto secundario limitante de la dosis de vinblastina.

La vincristina, vincaleucoblastina, 22-oxo-, sulfato, está disponible comercialmente como ONCOVIN® como una disolución inyectable. La vincristina está indicada para el tratamiento de leucemias agudas y también ha encontrado uso en regímenes de tratamiento para linfomas malignos de Hodgkin y no Hodgkin. La alopecia y los efectos neurológicos son los efectos secundarios más comunes de la vincristina y, en menor medida, se producen efectos de mielosupresión y mucositis gastrointestinal.

La vinorelbina, 3’,4’-dideshidro-4’-desoxi-C’-norvincaleucoblastina [R-(R*,R*)-2,3-dihidroxibutanodioato (1:2)(sal)], comercialmente disponible como una disolución inyectable de tartrato de vinorelbina (NAVELBINE®), es un alcaloide de la vinca semisintético. La vinorelbina está indicada como agente individual o en combinación con otros agentes quimioterápico, tales como cisplatino, en el tratamiento de diversos tumores sólidos, particularmente cánceres de pulmón de células no pequeñas, de mama avanzado y de próstata refractario a hormonas. La mielosupresión es el efecto secundario limitante de la dosis más común de la vinorelbina.

Los complejos de coordinación de platino son agentes anticancerígenos no específicos de fase, que interaccionan con el ADN. Los complejos de platino entran en las células tumorales, experimentan acuación y forman reticulaciones intra e intercatenarias con el ADN, provocando efectos biológicos adversos para el tumor. Los ejemplos de complejos de coordinación de platino incluyen, pero no se limitan a, cisplatino y carboplatino.

El cisplatino, cis-diaminodicloroplatino, está disponible comercialmente como PLATINOL® como una disolución inyectable. El cisplatino está indicado principalmente en el tratamiento de cáncer de ovario y testicular metastásico y de cáncer de vejiga avanzado. Los principales efectos secundarios limitantes de la dosis del cisplatino son nefrotoxicidad, que puede controlarse mediante hidratación y diuresis, y ototoxicidad.

El carboplatino, platino, diamina [1,1-ciclobutano-dicarboxilato(2-)-O,O’], está disponible comercialmente como PARAPLATIN® como una disolución inyectable. El carboplatino está indicado principalmente en el tratamiento de primera y segunda línea de carcinoma de ovario avanzado. La supresión de la médula ósea es la toxicidad limitante de la dosis de carboplatino.

Los agentes alquilantes son agentes específicos anticancerígenos no de fase y electrófilos fuertes. Normalmente, los agentes alquilantes forman uniones covalentes, por alquilación, con el ADN a través de restos nucleofílicos de la molécula de ADN tales como grupos fosfato, amino, sulfhidrilo, hidroxilo, carboxilo e imidazol. Tal alquilación altera la función del ácido nucleico conduciendo a muerte celular. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen, pero no se limitan a, mostazas de nitrógeno tales como ciclofosfamida, melfalán y clorambucilo; sulfonatos de alquilo tales como busulfano; nitrosoureas tales como carmustina; y triazenos tales como dacarbazina.

La ciclofosfamida, 2-óxido de 2-[bis(2-cloroetil)amino]tetrahidro-2H-1,3,2-oxazafosforina monohidratado, está disponible comercialmente como una disolución inyectable o comprimidos como CYTOXAN®. La ciclofosfamida está indicada como agente individual o en combinación con otros agentes quimioterápicos, en el tratamiento de linfomas malignos, mieloma múltiple y leucemias. La alopecia, las náuseas, los vómitos y la leucopenia son los efectos secundarios limitantes de la dosis más comunes de la ciclofosfamida.

El melfalán, 4-[bis(2-cloroetil)amino]-L-fenilalanina, está disponible comercialmente como una disolución inyectable o comprimidos como ALKERAN®. El melfalán está indicado para el tratamiento paliativo del mieloma múltiple y del carcinoma epitelial de ovario no resecable. La supresión de la médula ósea es el efecto secundario limitante de la dosis más común del melfalán.

El clorambucilo, ácido 4-[bis(2-cloroetil)amino]bencenobutanoico, está disponible comercialmente como comprimidos LEUKERAN®. El clorambucilo está indicado para el tratamiento paliativo de leucemia linfática crónica y linfomas malignos tales como linfosarcoma, linfoma folicular gigante y enfermedad de Hodgkin. La supresión de la médula ósea es el efecto secundario limitante de la dosis más común del clorambucilo.

El busulfano, dimetanosulfonato de 1,4-butanodiol, está disponible comercialmente como COMPRIMIDOS MYLERAN®. El busulfano está indicado para el tratamiento paliativo de leucemia mielógena crónica. La supresión de la médula ósea es el efecto secundario limitante de la dosis más común del busulfano.

La carmustina, 1,3-[bis(2-cloroetil)-1 -nitrosourea, está disponible comercialmente como viales individuales de material liofilizado como BiCNU®. La carmustina está indicada para el tratamiento paliativo como agente individual o en combinación con otros agentes para tumores cerebrales, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin y linfomas no Hodgkin. La mielosupresión retardada es el efecto secundario limitante de la dosis más común de la carmustina.

La dacarbazina, 5-(3,3-dimetil-1-triazeno)-imidazol-4-carboxamida, está disponible comercialmente como viales individuales de material como DTIC-Dome®. La dacarbazina está indicada para el tratamiento del melanoma maligno metastásico y en combinación con otros agentes para el tratamiento de segunda línea de la enfermedad de Hodgkin. Las náuseas, los vómitos y la anorexia son los efectos secundarios limitantes de la dosis más comunes de la dacarbazina.

Los antibióticos antineoplásicos son agentes no específicos de fase, que se unen o se intercalan con el ADN. Por lo general, dicha acción da como resultado complejos de ADN estables o roturas de cadenas, lo que interrumpe la función ordinaria de los ácidos nucleicos y conduce a la muerte celular. Los ejemplos de agentes antibióticos antineoplásicos incluyen, pero no se limitan a, actinomicinas tales como dactinomicina, antrociclinas tales como daunorrubicina y doxorrubicina; y bleomicinas.

La dactinomicina, también conocida como actinomicina D, está disponible comercialmente en forma inyectable como COSMEGEN®. La dactinomicina está indicada para el tratamiento de tumor de Wilms y rabdomiosarcoma. Las náuseas, los vómitos y la anorexia son los efectos secundarios limitantes de la dosis más comunes de la dactinomicina.

La daunorubicina, clorhidrato de (8S-cis-)-8-acetil-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexopiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-1-metoxi-5,12-naftacenodiona está disponible comercialmente como forma inyectable liposomal como DAUNOXOME® o como inyectable como CERUBIDINE®. La daunorubicina está indicada para la inducción de la remisión en el tratamiento de leucemia no linfocítica aguda y sarcoma de Kaposi asociado a VIH avanzado. La mielosupresión es el efecto secundario limitante de la dosis más común de la daunorubicina.

La doxorubicina, (8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexopiranosil)oxi]-8-glicoloílo, clorhidrato de 7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-1-metoxi-5,12-naftacenodiona, está disponible comercialmente como forma inyectable como RUBEX® o ADRIAMYCIN RDF®. La doxorubicina está indicada principalmente para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloblástica aguda, pero también es un componente útil en el tratamiento de algunos tumores sólidos y linfomas. La mielosupresión es el efecto secundario limitante de la dosis más común de la doxorrubicina.

La bleomicina, una mezcla de antibióticos glicopeptídicos citotóxicos aislados de una cepa de Streptomyces verticillus, está disponible comercialmente como BLENOXANE®. La bleomicina está indicada como tratamiento paliativo, como agente individual o en combinación con otros agentes, de carcinoma de células escamosas, linfomas y carcinomas testiculares. Las toxicidades pulmonares y cutáneas son los efectos secundarios limitantes de la dosis más comunes de la bleomicina.

Los inhibidores de la topoisomerasa II incluyen, pero no se limitan a, epipodofilotoxinas.

Las epipodofilotoxinas son agentes antineoplásicos específicos de fase derivados de la planta de mandrágora. Las epipodofilotoxinas afectan normalmente a las células en las fases S y G2 del ciclo celular formando un complejo ternario con la topoisomerasa II y el ADN, lo que provoca roturas en las hebras de ADN. Las roturas en las hebras se acumulan y sigue muerte celular. Los ejemplos de epipodofilotoxinas incluyen, pero no se limitan a, etopósido y tenipósido.

El etopósido, 9[4,6-0-(R)-etiliden-p-D-glucopiranósido] de 4’-desmetil-epipodofilotoxina, está disponible comercialmente como una disolución inyectable o cápsulas como VePESID® y se conoce comúnmente como VP-16. El etopósido está indicado como agente individual o en combinación con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de cánceres testiculares y de pulmón de células no pequeñas. La mielosupresión es el efecto secundario más común del etopósido. La incidencia de leucopenia tiende a ser más grave que la de trombocitopenia.

El tenipósido, 9[4,6-0-(R)-teniliden-b-D-glucopiranósido] de 4’-desmetil-epipodofilotoxina, está disponible comercialmente como una disolución inyectable como VUMON® y se conoce comúnmente como VM-26. El tenipósido está indicado como agente individual o en combinación con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de la leucemia aguda en niños. La mielosupresión es el efecto secundario limitante de la dosis más común del tenipósido. El tenipósido puede inducir tanto leucopenia como trombocitopenia.

Los agentes neoplásicos antimetabolitos son agentes antineoplásicos específicos de fase que actúan en la fase S (síntesis de ADN) del ciclo celular inhibiendo la síntesis de ADN o inhibiendo la síntesis de bases de purina o pirimidina y, de ese modo, limitando la síntesis de ADN. En consecuencia, la fase S no se realiza y sigue muerte celular. Los ejemplos de agentes antineoplásicos antimetabolitos incluyen, entre otros, fluorouracilo, metotrexato, citarabina, mecaptopurina, tioguanina y gemcitabina.

El 5-fluorouracilo, 5-fluoro-2,4-(1H,3H)pirimidindiona, está disponible comercialmente como fluorouracilo. La administración de 5-fluorouracilo conduce a la inhibición de la síntesis de timidilato y también se incorpora tanto al ARN como al ADN. El resultado, normalmente, es la muerte celular. El 5-fluorouracilo está indicado como agente individual o en combinación con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de carcinomas de mama, colon, recto, estómago y páncreas. La mielosupresión y la mucositis son efectos secundarios limitantes de la dosis de 5-fluorouracilo. Otros análogos de fluoropirimidina incluyen 5-fluorodesoxiuridina (floxuridina) y monofosfato de 5-fluorodesoxiuridina.

La citarabina, 4-amino-1-b-D-arabinofuranosil-2(1H)-pirimidinona, está disponible comercialmente como CYTOSAR-U® y se conoce comúnmente como Ara-C. Se cree que la citarabina presenta especificidad de fase celular en la fase S al inhibir el alargamiento de la cadena de ADN mediante la incorporación terminal de citarabina en la cadena de ADN en crecimiento. La citarabina está indicada como agente individual o en combinación con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de la leucemia aguda. Otros análogos de citidina incluyen 5-azacitidina y 2’,2’-difluorodesoxicitidina (gemcitabina). La citarabina induce leucopenia, trombocitopenia y mucositis.

La mercaptopurina, 1,7-dihidro-6H-purina-6-tiona monohidratada, está disponible comercialmente como PURINETHOL®. La mercaptopurina presenta especificidad de fase celular en la fase S al inhibir la síntesis de ADN mediante un mecanismo aún no especificado. La mercaptopurina está indicada como agente individual o en combinación con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de leucemia aguda. La mielosupresión y la mucositis gastrointestinal son efectos secundarios esperados de la mercaptopurina a dosis altas. Un análogo de mercaptopurina útil es la azatioprina.

La tioguanina, 2-amino-1,7-dihidro-6H-purina-6-tiona, está disponible comercialmente como TABLOID®. La tioguanina presenta especificidad de fase celular en la fase S al inhibir la síntesis de ADN mediante un mecanismo aún no especificado. La tioguanina está indicada como agente individual o en combinación con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de leucemia aguda. La mielosupresión, incluyendo leucopenia, trombocitopenia y anemia, es el efecto secundario limitante de la dosis más común de la administración de tioguanina. Sin embargo, se producen efectos secundarios gastrointestinales que pueden limitar la dosis. Otros análogos de purina incluyen pentostatina, eritrohidroxiniladenina, fosfato de fludarabina y cladribina.

La gemcitabina, monoclorhidrato de 2’-desoxi-2’,2’-difluorocitidina (isómero b), está disponible comercialmente como GEMZAR®. La gemcitabina presenta especificidad de fase celular en la fase S y al bloquear la progresión de las células a través del límite G1/S. La gemcitabina está indicada en combinación con cisplatino en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas localmente avanzado y sola en el tratamiento de cáncer de páncreas localmente avanzado. La mielosupresión, incluyendo leucopenia, trombocitopenia y anemia, es el efecto secundario limitante de la dosis más común de la administración de gemcitabina.

El metotrexato, ácido N-[4[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]metilamino]benzoil]-L-glutámico, está disponible comercialmente como metotrexato sódico. El metotrexato presenta efectos de fase celular específicamente en la fase S al inhibir la síntesis, reparación y/o replicación del ADN a través de la inhibición del ácido dihidrofólico reductasa, que se requiere para la síntesis de nucleótidos de purina y timidilato. El metotrexato está indicado como agente individual o en combinación con otros agentes de quimioterapia en el tratamiento de coriocarcinoma, leucemia meníngea, linfoma no Hodgkin y carcinomas de mama, cabeza, cuello, ovario y vejiga. La mielosupresión (leucopenia, trombocitopenia y anemia) y la mucositis son efectos secundarios esperados de la administración de metotrexato.

Las camptotecinas, que incluyen camptotecina y derivados de camptotecina, están disponibles o en desarrollo como inhibidores de la topoisomerasa I. Se cree que la actividad citotóxica de las camptotecinas está relacionada con su actividad inhibidora de la topoisomerasa I. Los ejemplos de camptotecinas incluyen, pero no se limitan a, irinotecán, topotecán y las diversas formas ópticas de 7-(4-metilpiperazino-metilen)-10,11-etilendioxi-20-camptotecina descritas a continuación.

Irinotecán HCl, clorhidrato de (4S)-4,11-dietil-4-hidroxi-9-[(4-piperidinopiperidino)carboniloxi]-1H-pirano[3’,4’,6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-3,14(4H,12H)-diona, está disponible comercialmente como la disolución inyectable CAMPTOSAR®.

El irinotecán es un derivado de la camptotecina que se une, junto con su metabolito activo SN-38, al complejo de topoisomerasa I - ADN. Se cree que la citotoxicidad se produce como resultado de roturas bicatenarias irreparables provocadas por la interacción de la topoisomerasa I : ADN : irintecán o el complejo ternario de SN-38 con enzimas de replicación. El irinotecán está indicado para el tratamiento de cáncer metastásico de colon o recto. Los efectos secundarios limitantes de la dosis del clorhidrato de irinotecán son mielosupresión, incluyendo neutropenia, y efectos gastrointestinales, incluyendo diarrea.

Topotecán HCl, clorhidrato de (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-dihidroxi-1H-pirano[3’,4’,6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-3,14-(4H,12H)-diona, está disponible comercialmente como la disolución inyectable HYCAMTIN®. El topotecán es un derivado de la camptotecina que se une al complejo de topoisomerasa I - ADN e impide que se vuelvan a ligar las roturas monocatenarias causadas por la topoisomerasa I en respuesta a la tensión torsional de la molécula de ADN. El topotecán está indicado para el tratamiento de segunda línea de carcinoma metastásico de ovario y cáncer de pulmón de células pequeñas. El efecto secundario limitante de la dosis de topotecán HCl es la mielosupresión, principalmente neutropenia.

Rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que se comercializa como RITUXAN® y MABTHERA®. Rituximab se une a CD20 en células B y provoca apoptosis celular. Rituximab se administra por vía intravenosa y está aprobado para el tratamiento de artritis reumatoide y linfoma no Hodgkin de células B.

Ofatumumab es un anticuerpo monoclonal completamente humano que se comercializa como ARZERRA®. Ofatumumab se une a CD20 en células B y se usa para tratar la leucemia linfocítica crónica CLL; un tipo de cáncer de los glóbulos blancos, en adultos refractarios al tratamiento con fludarabina (Fludara) y alemtuzumab (Campath).

Trastuzumab (HEREPTIN®) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une al receptor HER2. Su indicación original es cáncer de mama positivo para HER2.

Cetuximab (ERBITUX®) es un anticuerpo quimérico de ratón-ser humano que inhibe el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Los inhibidores de mTOR incluyen, pero no se limitan a, rapamicina (FK506) y rapálogos, RAD001 o everolimús (Afinitor), CCI-779 o temsirolimús, AP23573, AZD8055, WYE-354, WYE-600, WYE-687 y Pp121.

Bexaroteno se comercializa como Targretin® y es miembro de una subclase de retinoides que activan selectivamente los receptores X de retinoides (RXR). Estos receptores de retinoides tienen una actividad biológica distinta de la de los receptores de ácido retinoico (RAR). El nombre químico es ácido 4-[1-(5,6,7,8-tetrahidro-3,5,5,8,8-pentametil-2-naftalenil)etenil]benzoico. El bexaroteno se usa para tratar linfoma cutáneo de células T, CTCL, un tipo de cáncer de piel, en personas cuya enfermedad no pudo tratarse con éxito con al menos otro medicamento.

Sorafenib, comercializado como Nexavar®, pertenece a una clase de medicamentos denominados inhibidores de múltiples cinasas. Su nombre químico es 4-[4-[[4-cloro-3-(trifluorometil)fenil]carbamoilamino]fenoxi]-W-metilpiridin-2-carboxamida. El sorafenib se usa para tratar carcinoma de células renales avanzado (un tipo de cáncer que comienza en los riñones). El sorafenib también se usa para tratar carcinoma hepatocelular irresecable (un tipo de cáncer de hígado que no puede tratarse con cirugía).

Los ejemplos de inhibidores de erbB incluyen lapatinib, erlotinib y gefitinib. Lapatinib, W-(3-cloro-4-{[(3-fluorofenil)metil]oxi}fenil)-6-[5-({[2-(metilsulfonil)etil]amino}metil)-2-furanil]-4-quinazolinamina (representado por la fórmula II, tal como se ilustra), es un inhibidor dual potente, oral, de molécula pequeña de las tirosina cinasas erbB-1 y erbB-2 (EGFR y HER2) que está aprobado en combinación con capecitabina para el tratamiento de cáncer de mama de mama mestastásico positivo para HER2.

La base libre, las sales de HCl y las sales ditosilato del compuesto de fórmula (II) pueden prepararse según los procedimientos dados a conocer en el documento WO 99/35146, publicado el 15 de julio de 1999; y el documento WO 02/02552 publicado el 10 de enero de 2002.

Erlotinib, W-(3-etinilfenil)-6,7-bis{[2-(metiloxi)etil]oxi}-4-quinazolinamina, disponible comercialmente con el nombre comercial Tarceva, está representado por la fórmula III, tal como se ilustra:

La base libre y la sal de HCl de erlotinib pueden prepararse, por ejemplo, según el documento U.S. 5.747.498, ejemplo 20.

Gefitinib, 4-quinazolinamina, N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-[3-4-morpholin)propoxi], está representado por la fórmula IV, tal como se ilustra:

Gefitinib, que está disponible comercialmente con el nombre comercial IRESSA® (Astra-Zenenca), es un inhibidor de erbB-1 que está indicado como monoterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico o localmente avanzado tras el fracaso de las quimioterapias tanto basadas en platino como con docetaxel. La base libre, las sales de HCl y las sales de diHCl de gefitinib pueden prepararse según los procedimientos de la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB96/00961, presentada el 23 de abril de 1996, y publicada como documento WO 96/33980 el 31 de octubre de 1996.

También es de interés el derivado de camptotecina de fórmula A siguiente, actualmente en desarrollo, que incluye la forma de mezcla racémica (R,S) así como los enantiómeros R y S:

conocido por el nombre químico “7-(4-metilpiperazino-metilen)-10,11-etilendioxi-20(R,S)-camptotecina (mezcla racémica) o “7-(4-metilpiperazino-metilen)-10,11-etilendioxi-20(R)-camptotecina (enantiómero R) o “7-(4-metilpiperazino-metilen)-10,11-etilendioxi-20(S)-camptotecina (enantiómero S). Tal compuesto, así como compuestos relacionados, se describen, incluyendo métodos de preparación, en las patentes estadounidenses n.os 6.063.923; 5.342.947; 5.559.235; 5.491.237 y 6.100.273.

Las hormonas y los análogos hormonales son compuestos útiles para tratar cánceres en los que existe una relación entre la(s) hormona(s) y el crecimiento y/o la falta de crecimiento del cáncer. Los ejemplos de hormonas y análogos hormonales útiles en el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, adrenocorticosteroides tales como prednisona y prednisolona que son útiles en el tratamiento de linfoma maligno y leucemia aguda en niños; aminoglutetimida y otros inhibidores de aromatasa tales como anastrozol, letazol, vorazol y exemestano, útiles en el tratamiento de carcinoma adrenocortical y carcinoma de mama hormonodependiente que contiene receptores de estrógeno; progestrinas tales como acetato de megestrol útiles en el tratamiento de cáncer de mama hormonodependiente y carcinoma endometrial; estrógenos, andrógenos y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona y 5a-reductasas tales como finasterida y dutasterida, útiles en el tratamiento de carcinoma prostático e hipertrofia prostática benigna; antiestrógenos tales como tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, así como moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERMS) tales como los descritos en las patentes estadounidenses n.os 5.681.835, 5.877.219 y 6.207.716, útiles en el tratamiento de carcinoma de mama hormonodependiente y otros cánceres susceptibles; y hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) y análogos de la misma que estimulan la liberación de hormona luteinizante (LH) y/o hormona foliculoestimulante (fSh ) para el tratamiento de carcinoma de próstata, por ejemplo, agonistas y antagonistas de LHRH tales como acetato de goserelina y luprolida.

Los inhibidores de rutas de transducción de señales son aquellos inhibidores que bloquean o inhiben un proceso químico que provoca un cambio intracelular. Tal como se usa en el presente documento, este cambio es proliferación o diferenciación celular. Los inhibidores de la transducción de señales útiles en la presente invención incluyen inhibidores de tirosina cinasas receptoras, tirosina cinasas no receptoras, bloqueantes de dominios SH2/SH3, serina/treonina cinasas, fosfotidilinositol-3 cinasas, señalización de mioinositol y oncogenes Ras.

Varias proteínas tirosina cinasas catalizan la fosforilación de residuos de tirosilo específicos en diversas proteínas implicadas en la regulación del crecimiento celular. Tales proteínas tirosina cinasas pueden clasificarse ampliamente como cinasas receptoras o no receptoras.

Las tirosina cinasas receptoras son proteínas transmembrana que tienen un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio tirosina cinasa. Las tirosina cinasas receptoras están implicadas en la regulación del crecimiento celular y, generalmente, se denominan receptores de factores de crecimiento. Se ha demostrado que la activación inapropiada o descontrolada de muchas de estas cinasas, es decir, la actividad aberrante de receptores de factores de crecimiento de cinasa, por ejemplo, por sobreexpresión o mutación, da como resultado un crecimiento celular descontrolado. En consecuencia, la actividad aberrante de tales cinasas se ha vinculado con el crecimiento de tejido maligno. En consecuencia, los inhibidores de tales cinasas podrían proporcionar métodos de tratamiento del cáncer. Los receptores de factores de crecimiento incluyen, por ejemplo, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr), receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFr), erbB2, erbB4, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFr), tirosina cinasa con dominios de homología de factor de crecimiento epidérmico y similar a inmunoglobulina (TIE-2), receptor del factor de crecimiento de insulina I (IGFI), factor estimulante de colonias de macrófagos (Cfms), BTK, ckit, cmet, receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), receptores de Trk (TrkA, TrkB y TrkC), receptores de efrina (eph) y el protooncogén RET. Varios inhibidores de receptores de crecimiento están en desarrollo e incluyen antagonistas de ligandos, anticuerpos, inhibidores de tirosina cinasa y oligonucleótidos antisentido. Se describen receptores de factores de crecimiento y agentes que inhiben la función de receptores de factores de crecimiento, por ejemplo, en Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818; Shawver et al DDT vol. 2, n.° 2 febrero de 1997; y Lofts, F. J. et al, “Growth factor receptors as targets”, New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. Workman, Paul y Kerr, David, CRC press 1994, Londres.

Las tirosina cinasas, que no son cinasas receptoras de factores de crecimiento, se denominan tirosina cinasas no receptoras. Las tirosina cinasas no receptoras útiles en la presente invención, que son diana o posibles dianas de fármacos anticancerígenos, incluyen cSrc, Lck, Fyn, Yes, Jak, cAbl, FAK (cinasa de adhesión focal), tirosina cinasa de Brutons y Bcr-Abl. Tales cinasas no receptoras y agentes que inhiben la función de tirosina cinasas no receptoras se describen en Sinh, S. y Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research ⁸ (5): 465 - 80; y Bolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404.

Los bloqueantes de dominios SH2/SH3 son agentes que alteran la unión de dominios SH2 o SH3 en una variedad de enzimas o proteínas adaptadoras incluyendo la subunidad p85 de PI3-K, cinasas de la familia Src, moléculas adaptadoras (Shc, Crk, Nck, Grb2) y Ras-GAP. Los dominios SH2/SH3 como dianas para fármacos anticancerígenos se comentan en Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32.

Los inhibidores de serina/treonina cinasas, incluyendo bloqueantes de la cascada de MAP cinasa incluyen bloqueantes de Raf cinasas (rafk), cinasa regulada por mitógeno o extracelular (MEK) y cinasas reguladas extracelulares (ERK); y bloqueantes de miembros de la familia de proteína cinasa C incluyendo bloqueantes de PKC (alfa, beta, gamma, épsilon, mu, lambda, iota, zeta). Familia de cinasas IkB (IKKa, IKKb), cinasas de la familia PKB, miembros de la familia de cinasas AKT y cinasas receptoras de TGF beta. Tales serina/treonina cinasas e inhibidores de las mismas se describen en Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P, Samani, A., y Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A., y Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226; patente estadounidense n.° 6.268.391; y Martinezlacaci, L., et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52.

Inhibidores de miembros de la familia de fosfotidilinositol-3 cinasa, incluyendo bloqueantes de PI3-cinasa, ATM, DNA-PK y Ku, también son útiles en la presente invención. Tales cinasas se comentan en Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. ⁸ (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8; y Zhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545.

También son útiles en la presente invención inhibidores de la señalización de mioinositol tales como bloqueantes de fosfolipasa C y análogos de mioinositol. Tales inhibidores de señales se describen en Powis, G., y Kozikowski A., (1994 New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman y David Kerr, CRC press 1994, Londres).

Otro grupo de inhibidores de rutas de transducción de señales son inhibidores del oncogén Ras. Tales inhibidores incluyen inhibidores de farnesiltransferasa, geranil-geranil transferasa y proteasas CAAX así como oligonucleótidos antisentido, ribozimas e inmunoterapia. Se ha demostrado que tales inhibidores bloquean la activación de ras en células que contienen ras mutante de tipo natural, actuando de ese modo como agentes antiproliferación. La inhibición del oncogén Ras se comenta en Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4292-8; Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99 - 102; y Bennett, C.F. y Cowsert, L.M. BioChim. Biophys. Acta, (1999) 1489(1): 19-30.

Tal como se mencionó anteriormente, antagonistas de anticuerpos frente a la unión de ligandos a cinasas receptoras pueden servir también como inhibidores de la transducción de señales. Este grupo de inhibidores de rutas de transducción de señales incluye el uso de anticuerpos humanizados frente al dominio de unión a ligando extracelular de tirosina cinasas receptoras. Por ejemplo, anticuerpo específico de EGFR Imclone C225 (véase Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4, 269-286); anticuerpo frente a erbB2 Herceptin® (véase Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183); y anticuerpos específicos de VEGFR22CB (véase Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117­ 5124.

Los inhibidores de la angiogénesis de cinasas no receptoras también pueden encontrar uso en la presente invención. Los inhibidores de VEGFR y TIE2 relacionados con la angiogénesis se comentaron anteriormente con respecto a los inhibidores de la transducción de señales (ambos receptores son tirosina cinasas receptoras). La angiogénesis, en general, está vinculada con la señalización de erbB2/EGFR, ya que se ha demostrado que los inhibidores de erbB2 y EGFR inhiben la angiogénesis, principalmente la expresión de VEGF. Por tanto, la combinación de un inhibidor de erbB2/EGFR con un inhibidor de la angiogénesis tiene sentido. En consecuencia, pueden usarse inhibidores de tirosina cinasas no receptoras en combinación con los inhibidores de EGFR/erbB2 de la presente invención. Por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, que no reconocen el VEGFR (la tirosina cinasa receptora), pero se unen al ligando; inhibidores de molécula pequeña de integrina (alfav beta3) que inhibirán la angiogénesis; endostatina y la angiostatina (no RTK) también pueden resultar útiles en combinación con los inhibidores de la familia erb dados a conocer. (Véanse Bruns CJ et al (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935; Schreiber AB, Winkler ME y Derynck R. (1986), Science, 232: 1250­ 1253; Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469).

Los agentes usados en regímenes inmunoterapéuticos también pueden ser útiles en combinación con los compuestos de fórmula (I). Existe una serie de estrategias inmunológicas para generar una respuesta inmunitaria contra erbB2 o EGFR. Estas estrategias están generalmente en el ámbito de las vacunas contra tumores. La eficacia de los enfoques inmunológicos puede potenciarse en gran medida a través de la inhibición combinada de las rutas de señalización de erbB2/EGFR usando un inhibidor de molécula pequeña. La discusión sobre el enfoque inmunológico/de vacunas contra tumores contra erbB2/EGFR se encuentra en Reilly RT et al. (2000), Cancer Res. 60: 3569-3576; y Chen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J y Kipps TJ. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971.

Los agentes usados en regímenes proapoptóticos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido de bcl-2) también pueden usarse en la combinación de la presente invención. Los miembros de la familia de proteínas Bcl^{- 2} bloquean la apoptosis. Por tanto, se ha vinculado la regulación por incremento de bcl-2 con la quimiorresistencia. Estudios han demostrado que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimula a miembros antiapoptóticos de la familia de bcl-2 (es decir, mcl-1). Por tanto, estrategias diseñadas para regular por disminución la expresión de bcl-2 en tumores han demostrado un beneficio clínico y ahora se encuentran en ensayos de fase II/IN, concretamente, el oligonucleótido antisentido de bcl-2 G3139 de Genta. Tales estrategias proapoptóticas que usan la estrategia de oligonucleótidos antisentido para bcl-2 se comentan en Water JS et al. (2000), J. Clin. oncol. 18: 1812-1823; y Kitada S. et al. (1994, Antisense Res. Dev. 4: 71-79).

Trastuzumab (HEREPTIN®) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une al receptor HER2. Su indicación original es cáncer de mama positivo para HER2.

Trastuzumab emtansina (nombre comercial Kadcyla) es un conjugado de anticuerpo-fármaco que consiste en el anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin) unido al agente citotóxico mertansina (DM1). Trastuzumab solo detiene el crecimiento de las células cancerosas al unirse al receptor HER2/neu, mientras que la mertansina entra en las células y las destruye al unirse a la tubulina. Debido a que el anticuerpo monoclonal selecciona como diana HER2, y HER2 solo se sobreexpresa en las células cancerosas, el conjugado suministra la toxina específicamente a las células tumorales. El conjugado se abrevia T-DM1.

Cetuximab (ERBITUX®) es un anticuerpo quimérico de ratón-ser humano que inhibe el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Pertuzumab (también denominado 2C4, nombre comercial Omnitarg) es un anticuerpo monoclonal. El primero de su clase en una línea de agentes denominados “inhibidores de la dimerización de HER”. Al unirse a HER2, inhibe la dimerización de HER2 con otros receptores HER, lo que se supone que da como resultado una ralentización del crecimiento tumoral. Pertuzumab se describe en el documento WO01/00245 publicado el 4 de enero de 2001.

Rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que se comercializa como RITUXAN® y MABTHERA®. Rituximab se une a CD20 en células B y provoca apoptosis celular. Rituximab se administra por vía intravenosa y está aprobado para el tratamiento de la artritis reumatoide y linfoma no Hodgkin de células B.

Ofatumumab es un anticuerpo monoclonal completamente humano que se comercializa como ARZERRA®.

Ofatumumab se une a CD20 en células B y se usa para tratar la leucemia linfocítica crónica (CLL, un tipo de cáncer de los glóbulos blancos) en adultos que son refractarios al tratamiento con fludarabina (Fludara) y alemtuzumab (Campath).

Los inhibidores de la señalización del ciclo celular inhiben las moléculas implicadas en el control del ciclo celular. Una familia de proteína cinasas denominadas cinasas dependientes de ciclina (CDK) y su interacción con una familia de proteínas denominadas ciclinas controla la progresión a través del ciclo celular eucariota. La activación e inactivación coordinadas de diferentes complejos de ciclina/CDK es necesaria para la progresión normal a través del ciclo celular. Están en desarrollo varios inhibidores de la señalización del ciclo celular. Por ejemplo, se describen ejemplos de cinasas dependientes de ciclina, incluyendo CDK2, CDK4 y CDK⁶ e inhibidores de las mismas, por ejemplo, en Rosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230.

Tal como se usan en el presente documento, “inmunomoduladores” se refieren a cualquier sustancia que incluya anticuerpos monoclonales que afecte al sistema inmunitario. Las proteínas de unión a ICOS de la presente invención pueden considerarse inmunomoduladores. Los inmunomoduladores pueden usarse como agentes antineoplásicos para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, los inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-CTLA-4 tales como ipilimumab (YERVOY) y anticuerpos anti-PD-1 (Opdivo/nivolumab y Keytruda/pembrolizumab). Otros inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos frente a OX-40, anticuerpos frente a PD-L1, anticuerpos frente a LAG3, anticuerpos frente a TIM-3, anticuerpos frente a 41BB y anticuerpos frente a GITR.

Yervoy (ipilimumab) es un anticuerpo frente a CTLA-4 completamente humano comercializado por Bristol Myers Squibb. La estructura proteica de ipilimumab y los métodos que se usan se describen en las patentes estadounidenses n.os 6.984.720 y 7.605.238.

Opdivo/nivolumab es un anticuerpo monoclonal completamente humano comercializado por Bristol Myers Squibb dirigido contra el receptor de superficie celular humano inmunorregulador negativo PD-1 (muerte programada-1 o muerte celular programada-¹ /PCD-¹) con actividad de inmunopotenciación. Nivolumab se une a y bloquea la activación de PD-1, una proteína transmembrana de la superfamilia de Ig, por sus ligandos PD-L1 y PD-L2, dando como resultado la activación de células T y respuestas inmunitarias mediadas por células contra células tumorales o patógenos. PD-1 activado regula negativamente la activación de células T y la función efectora a través de la supresión de la activación de la ruta de P13k/Akt. Otros nombres para nivolumab incluyen: BMS-936558, MDX-1106 y ONO-4538. La secuencia de aminoácidos de nivolumab y los métodos de uso y preparación se describen en la patente estadounidense n.° US 8.008.449.

KEYTRUDA/pembrolizumab es un anticuerpo anti-PD-1 comercializado por Merck para el tratamiento del cáncer de pulmón. La secuencia de aminoácidos de pembrolizumab y los métodos de uso se dan a conocer en la patente estadounidense n.° 8.168.757.

CD134, también conocido como OX40, es un miembro de la superfamilia de receptores TNFR que no se expresa constitutivamente en células T sin tratamiento previo en reposo, a diferencia de CD28. OX40 es una molécula coestimuladora secundaria, expresada después de 24 a 72 horas tras la activación; su ligando, OX40L, tampoco se expresa en células presentadoras de antígeno en reposo, sino que sigue a su activación. La expresión de OX40 depende de la activación completa de la célula T ; sin CD28, la expresión de OX40 se retrasa y tiene niveles cuatro veces menores. Los anticuerpos frente a OX-40, las proteínas de fusión de OX-40 y los métodos de uso de los mismos se dan a conocer en las patentes estadounidenses n.os; US 7.504.101; US 7.758.852; US 7.858.765; US 7.550.140; US 7.960.515; WO2012027328; WO2013028231.

Los anticuerpos frente a PD-L1 (también denominado CD274 o B7-H1) y los métodos de uso se dan a conocer en la patente estadounidense n.° 7.943.743; la patente estadounidense n.° 8.383.796; los documentos US20130034559, WO2014055897, la patente estadounidense n.° 8.168.179; y la patente estadounidense n.° 7.595.048. Los anticuerpos frente a PD-L1 están en desarrollo como agentes inmunomoduladores para el tratamiento del cáncer.

Tal como se usa en el presente documento, “agente inmunoestimulador” se refiere a cualquier agente que pueda estimular el sistema inmunitario. Tal como se usan en el presente documento, los agentes inmunoestimuladores incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de vacunas.

Se sabe que los fosfatos de aminoalquilglucosaminida (AGP) son útiles como adyuvantes de vacunas y agentes inmunoestimuladores para estimular la producción de citocinas, activar macrófagos, promover la respuesta inmunitaria innata y aumentar la producción de anticuerpos en animales inmunizados. Los fosfatos de aminoalquilglucosaminida (AGP) son ligandos sintéticos del receptor de tipo Toll 4 (TLR4). Los AGP y sus efectos inmunomoduladores por medio de TLR4 se dan a conocer en publicaciones de patentes tales como WO 2006/016997, WO 2001/090129 y/o la patente estadounidense n.° 6.113.918 y se han notificado en la bibliografía. Se dan a conocer derivados de AGP adicionales en la patente estadounidense n.° 7.129.219, la patente estadounidense n.° 6.525.028 y la patente estadounidense n.° 6.911.434. Ciertos AGP actúan como agonistas de TLR4, mientras que otros se reconocen como antagonistas de TLR4.

Los compuestos de fosfato de aminoalquilglucosaminida empleados en la presente invención tienen la estructura expuesta en la fórmula ¹ tal como sigue:

en la que

m es de ⁰ a ⁶

n es de 0 a 4;

X es O o S, preferiblemente O;

Y es O o NH;

Z es O o H;

cada R¹, R², R³ se selecciona independientemente del grupo que consiste en un acilo C^1-20 y un alquilo C¹-²⁰;

R⁴ es H o Me;

R⁵ se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -alcoxi (C¹-C⁴), -PO³ R⁸R⁹, -OPO³R⁸R⁹, -SO³R⁸, -OSO³ R⁸, -NR⁸R⁹, -SR8, -CN, -NO², -CHO, -CO²R⁸ y-CONR⁸R⁹, en los que R8 y R⁹ se seleccionan cada uno independientemente de H y alquilo (C¹-C⁴); y cada R⁵ y R⁷ es independientemente H o PO³H².

En la fórmula 1, la configuración de los centros estereogénicos 3’ a los que están unidos los residuos de acilos grasos normales (es decir, los residuos de aciloxilo o alcoxilo secundarios, por ejemplo, R¹O, R²O y R³O) es R o S, preferiblemente R (tal como se designa mediante las reglas de prioridad de Cahn-Ingold-Prelog). La configuración de los centros estereogénicos de aglicón a los que están unidos R⁴ y R⁵ puede ser R o S. Todos los estereoisómeros, tanto enantiómeros como diastereómeros, y mezclas de los mismos, se considera que se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

El número de átomos de carbono entre el heteroátomo X y el átomo de nitrógeno del aglicón está determinado por la variable “n”, que puede ser un número entero de desde 0 hasta 4, preferiblemente un número entero de desde 0 hasta 2.

La longitud de cadena de los ácidos grasos normales R¹, R² y R³ puede ser de desde aproximadamente ⁶ hasta aproximadamente 16 carbonos, preferiblemente desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 14 carbonos. Las longitudes de cadena pueden ser iguales o diferentes. Algunas realizaciones preferidas incluyen longitudes de cadena en donde R1, R2 y R3 son ⁶ o 10 o 12 o 14.

La fórmula 1 abarca AGP de lípidos de L/D-seril, -treonil, -cisteinil éter y éster, tanto agonistas como antagonistas y sus homólogos (n=1-4), así como diversos bioisoésteres de ácido carboxílico (es decir, R⁵ es un grupo ácido capaz de formar sales; el fosfato puede estar o bien en la posición 4 o bien en la ⁶ de la unidad de glucosamina, pero preferiblemente está en la posición 4).

En una realización preferida de la invención que emplea un compuesto de AGP de fórmula 1, n es 0, R⁵ es CO²H, R⁶ es PO³H² y R⁷ es H. Este compuesto de AGP preferido se expone como la estructura en la fórmula 1a tal como sigue:

en la que X es O o S; Y es O o NH; Z es O o H; cada R¹, R², R³ se selecciona independientemente del grupo que consiste en un acilo C^1-20 y un alquilo C¹-²⁰; y R⁴ es H o metilo.

En la fórmula 1 a, la configuración de los centros estereogénicos 3’ a los que están unidos los residuos de acilos grasos normales (es decir, los residuos de aciloxilo o alcoxilo secundarios, por ejemplo, R¹O, R²O y R³O) es R o S, preferiblemente R (tal como se designa mediante las reglas de prioridad de Cahn-Ingold-Prelog). La configuración de los centros estereogénicos de aglicón a los que están unidos R⁴ y CO²H puede ser R o S. Todos los estereoisómeros, tanto enantiómeros como diastereómeros, y mezclas de los mismos, se considera que se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

La fórmula 1a abarca AGP de lípidos de L/D-seril, -treonil, -cisteinil éter o éster, tanto agonistas como antagonistas.

En tanto la fórmula 1 como la fórmula 1a, Z es O unido por un doble enlace o dos átomos de hidrógeno que están unidos cada uno por un enlace sencillo. Es decir, el compuesto está unido a éster cuando Z=Y=O; unido a amida cuando Z =O e Y=NH; y unido a éter cuando Z=H/H e Y=O.

Los compuestos de fórmula 1 especialmente preferidos se denominan CRX-601 y CRX-527. Sus estructuras se exponen tal como sigue:

Ċ

5 Adicionalmente, otra realización preferida emplea CRX 547 que tiene la estructura mostrada.

Todavía otras realizaciones incluyen AGP tales como CRX 602 o CRX 526 que proporcionan estabilidad aumentada a los AGP que tienen cadenas de acilo o alquilo secundarias más cortas.

En una realización, se proporcionan métodos para tratar el cáncer en un mamífero que lo necesita, que comprenden: administrar a tal mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de:

una proteína de unión a ICOS de la presente invención,

y b) al menos un agente antineoplásico.

En una realización, se proporcionan métodos para tratar el cáncer en un mamífero que lo necesita, que comprenden: administrar a tal mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de:

una proteína de unión a ICOS de la presente invención,

y b) al menos un segundo agente inmunomodulador.

En una realización, dicho segundo agente inmunomodulador se selecciona del grupo de: un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-GITR y anticuerpo anti-41BB, un anticuerpo anti-LAG3 y un anticuerpo anti-TIM3.

En una realización, se proporcionan métodos para tratar el cáncer en un mamífero que lo necesita, que comprenden: administrar a tal mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de:

una proteína de unión a ICOS o la presente invención,

y b) al menos un agente inmunoestimulador.

En una realización, el agente inmunoestimulador es un agonista de TLR4. En una realización, el agente inmunoestimulador es un AGP. En un aspecto, el agente inmunoestimulador es un compuesto de fórmula I. En un aspecto, es un compuesto de fórmula 1a. En un aspecto, el agente inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste en: CRX-601, CRX-547, CRX-602, CRX-527 y CRX-526.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos no limitativos de esta invención.

Ejemplo 1: Expresión de ICOS en cáncer

En general, los tumores sólidos parecen tener bajos niveles de células T ICOS+ infiltrantes, consecuente con la teoría de que ICOS media en respuestas inmunitarias antitumorales. Se generaron análisis de la expresión de ICOS a través de diversas histologías de tumores usando conjuntos de datos de expresión de ARNm disponibles públicamente de The Cáncer Genome Atlas (TCGA) y otras bases de datos. La tabla 3 muestra el porcentaje relativo de tumores de cada histología que mostró algún nivel detectable de expresión de ARNm de ICOS. Este análisis identifica histología de tumores que se sabe que son sensibles a otros enfoques de inmunoterapia contra el cáncer (melanoma, RCC, NSCLC) al tener un porcentaje relativamente más alto de tumores (>10 %) que tienen linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) ICOS+ detectables, mientras que los tipos de tumores que se sabe que son escasamente inmunogénicos (próstata, ovario y pancreático) tienen un porcentaje relativamente más bajo de tumores que tienen TIL ICOS+ (<10 %) (tabla 3). De manera interesante, los tipos de tumores que se sabe que están asociados con infección viral y/o inflamación crónica (de cabeza y cuello, gástrico, esofágico y de cuello uterino) estaban entre los tipos de tumores que mostraban el porcentaje más alto de TIL ICOS+. Lo que no queda claro a partir de estos análisis de la expresión de ARNm es la subpoblación de TIL que expresan ICOS en cada tipo de tumor respectivo. En algunos casos, ICOS puede expresarse predominantemente en Treg infiltrantes de tumores, mientras que en otros puede indicar el nivel de infiltración de células T efectoras ICOS+.

Tabla 3. Expresión de ARNm de ICOS a través de diferentes tipos de tumores

Se realizó el análisis de la expresión de ICOS mediante inmunohistoquímica (IHC) en carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) humano primario, cáncer de mama triple negativo (TNBC), cáncer colorrectal (CRC), cáncer de próstata, pancreático, de ovario, de células renales (RCC) y melanoma para entender mejor qué subconjuntos de TIL están asociados con la expresión de ICOS en diferentes tipos de tumores (tabla 4). Similar a lo que se observó en el análisis de expresión de ARNm, la abundancia de TIL ICOS+ era relativamente baja, incluso en tumores individuales donde estaban presentes por lo demás grandes números de TIL CD4+, CD⁸ + y/o FoxP3+. De nuevo, las histologías de melanoma, carcinoma de células renales (RCC) y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tenían el porcentaje más alto de tumores con algún nivel de infiltrado de ICOS+ detectable (tabla 4, columna ² ). A la inversa, los tumores de próstata, de ovario y pancreático casi no mostraron TIL ICOS+ (tabla 4). Estos análisis muestran claramente que los tumores sólidos tienen bajos niveles basales de TIL ICOS+ y pueden beneficiarse de la expansión e inducción funcional de esta población de células. Futuros estudios usando citometría de flujo e inmunohistoquímica de dos colores para analizar tumores humanos primarios ayudarán a determinar qué subconjuntos específicos de células T expresan ICOS.

Tabla 4

Ejemplo 2: Cribado de agonista de anticuerpos frente a ICOS

Aislamiento de PBMC humanas primarias

Se obtuvo sangre reciente de donantes de sangre y se diluyó 1:1 con medio RPMI1640 al 10 % libre de rojo de fenol. Se estratificó la sangre diluida encima del medio de densidad en un tubo cónico de 50 ml Uni-Sep Max y se centrifugó a 400 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. La capa mononuclear blanca resultante (capa leucoplaquetaria) se extrajo cuidadosamente en un nuevo tubo cónico de 50 ml a través de un tamiz de células de 100 gM. Se añadió un volumen igual de medio RPMI1640 al 10 % libre de rojo de fenol a la capa leucoplaquetaria y se centrifugó a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se resuspendió el sedimento celular en 10 ml de disolución de lisis de glóbulos rojos (Sigma Aldrich) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las células una vez con medio y centrifugaron tal como se describió anteriormente. Se llevó el volumen a 40 ml con medio RPMI1640 al 10 % libre de rojo de fenol y se contaron las células usando un contador de células Vicell y un analizador de viabilidad (Beckman Coulter).

Aislamiento de células T efectoras CD4+CD25- humanas primarias

Se purificaron adicionalmente células CD4+CD25 humanas a partir de PBMC por medio de un procedimiento de aislamiento basado en perlas magnéticas de dos etapas usando el kit de aislamiento de células T reguladoras CD4+CD25+ humanas (Miltenyi Biotec). En primer lugar, se incubaron células PBMC con cóctel de biotina-anticuerpo a 4 °C durante 5 minutos y posteriormente se incubaron microperlas anti-biotina durante 10 minutos. Esta etapa era para marcar las células T no CD4+. Entonces se hicieron pasar las células a través de una columna LD en el campo magnético de un separador MidiMACS. Se recogió el efluente, que es la fracción de células CD4+ preenriquecida sin marcar, y se incubó con microperlas de CD25 a 4 °C durante 15 minutos. Las células marcadas se hicieron pasar a través de una columna MS en el campo magnético de un separador MiniMACS. La fracción no retenida que contenía las células T efectoras CD4-CD25- sin marcar se recogió para ensayos de activación posteriores.

Aislamiento de células T CD4+ humanas primarias directamente de la sangre

Se aislaron células T CD4+ humanas directamente de sangre humana reciente usando un cóctel de enriquecimiento de células T CD4+ humanas (Stem Cell Technologies). Se añadió cóctel de enriquecimiento de células T CDR+ humanas RosetteSep (50 gl/ml) a sangre completa y se mezcló bien. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió un volumen igual de PBS FBS al 2 % con mezclado suave. Se estratificó la muestra diluida encima del medio de densidad y se centrifugó durante ²⁰ minutos a ¹²⁰⁰ x g a temperatura ambiente con el freno desactivado. Las células enriquecidas de la superficie de contacto de medio de densidad:plasma se vertieron cuidadosamente en un nuevo tubo cónico. A continuación, se lisaron los glóbulos rojos con tampón de lisado de glóbulos rojos (Sigma Aldrich) y se lavaron las células enriquecidas con PBS FBS al 2 % dos veces. Se resuspendieron las células T CD4+ en 40 ml de PBS FBS al 2 % y se contaron con un contador de células Vi-Cell.

P ro to c o lo s e x p e r im e n ta le s

E n s a yo d e a c tiv a c ió n in vitro d e c é lu la s T e fe c to ra s C D 4 C D 25 - h u m a n a s - e n s a y o u n ido .

Se recubrieron placas de fondo plano de 96 pocillos no tratadas para cultivo tisular con 100 gl/pocillo de tampón de recubrimiento (Biolegend) que contenía anticuerpo anti-CD3 humano 1 gg/ml (eBioscience) y diversos anticuerpos de prueba durante la noche. El día siguiente, se lavaron las placas recubiertas previamente tres veces con medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10 %. Se aislaron células T efectoras CD4+CD25- humanas y se marcaron con CFSE tal como se describió y se sembraron sobre las placas. Después de incubar a 37 °C durante 2,5 días, se recogieron las células y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la proliferación y la expresión de marcadores de activación. Se recogieron también sobrenadantes de cultivo celular para la medición de citocinas múltiplex mediante descubrimiento de mesoescala (MSD).

E n s a yo d e p ro life ra c ió n d e C F S E

Las células que iban a marcarse se resuspendieron en 1 ml de PBS precalentado a una concentración final de hasta 1E7 células/ml en un tubo cónico de 15 ml. Se añadió directamente un microlitro de disolución de CFSE madre 2 mM (Life Technologies) a las células seguido por agitación con vórtex inmediatamente para garantizar un marcaje uniforme. Después de incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, se extinguió la tinción añadiendo 14 ml de medio de cultivo celular enfriado con hielo. Se lavaron las células marcadas tres veces con medio enfriado con hielo. Se contaron las células y se ajustaron a 1E6 células/ml en RPMI1640 FBS al 10 % suplementado con 100 Ul/ml de IL-2 (PeproTech) y se sembraron sobre placas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y de prueba. Tras la activación de células T, se recogieron las células y se lavaron con PBS+BSA al 0,5 % una vez antes de proceder a la etapa de tinción multicolor para el análisis de citometría de flujo.

C ito m e tr ía d e f lu jo m u ltic o lo r

Se recogieron células T activadas y se lavaron con PBS. Las células se tiñeron en primer lugar con tinte de viabilidad de glóbulos rojos LIVE/DEAD Fixable Far (Life Technologies) siguiendo el protocolo del proveedor. Tras eliminar por lavado el tinte, se incubaron anticuerpos de detección conjugados con diferentes colores con las células a 4 °C durante 30 minutos. Se lavaron las células teñidas una vez con tampón de tinción de FACS enfriado con hielo (PBS BSA al 0,5 %) antes de procesarlas en un citómetro de flujo FACS Canto o FACS Canto II. Se comprobó diariamente el rendimiento del citómetro usando perlas de configuración y seguimiento del citómetro (BD Biosciences) y se establecieron los voltajes de PMT y el escalado del área basándose en las células no teñidas. Se realizaron compensaciones usando perlas OneComp o UltraComp (eBioscience) que se tiñeron individualmente con anticuerpos de detección conjugados con cada fluorocromo.

A n á lis is d e c ito c in a s p o r M S D

Se determinaron los niveles de citocinas de IFN-^y , IL-10, IL-2 y TNF-^a en el sobrenadante de cultivo celular usando el kit personalizado V-Plex humano de MSD. Las muestras se diluyeron en primer lugar 1:200 en diluyente 2. Se prepararon también calibradores en diluyente 2 siguiendo el manual del kit. Se añadieron las muestras y los calibradores diluidos a una placa de MSD negra que posteriormente se selló con un sello de placa adhesivo y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante 2 horas. Después de añadir 25 gl de disolución de anticuerpo de detección que se preparó de manera reciente en diluyente ² a cada pocillo, volvió a sellarse la placa y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante otras 2 horas. Se lavaron las placas 3 veces con 150 gl/pocillo de PBS más Tween-20 al 0,05 % antes de añadir 150 gl/pocillo de tampón de lectura 2x recién diluido y se leyeron inmediatamente en un lector MESO QuickPlex. Se analizaron los datos usando el software MSD Workbench.

E n s a yo d e a c tiv a c ió n in vitro d e c é lu la s T C D 4+ h u m a n a s - u n id o y s o lu b le

Se preestimularon células T CD4+ humanas recién aisladas en placas de 24 pocillos recubiertas con anticuerpo anti-CD3 (1 gg/ml) y anti-CD28 (3 gg/ml) durante 48 horas. Se recogieron las células, se lavaron y se mezclaron con DynaBeads anti-CD3 (Life Technologies) a una razón 1:1 en medio AIM-V suplementado con 100 UI/ml de IL-2 (PeproTech). Entonces se sembró la mezcla de células/perlas a 100 k por pocillo sobre placas de fondo plano de 96 pocillos o bien no recubiertas (para el formato soluble) o bien recubiertas con H2L5 hIgG4PE (para el formato unido). Para el formato soluble, se añadió H2L5 hIgG4PE a los pocillos en el momento de la siembra de células. Después de incubar a 37 °C durante 3,5 días, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular para la medición de citocinas múltiplex mediante MSD.

E n s a yo d e a c tiv a c ió n in vitro d e P B M C h u m a n a s s o lu b le s

Se preestimularon PBMC humanas recién aisladas en placas de 24 pocilios recubiertas con anticuerpo anti-CD3 (1 pg/ml) y anti-CD28 (5 pg/ml) durante 48 horas. Se prepararon células teñidas con CFSE y se mezclaron con DynaBeads anti-CD3 (Life Technologies) a una razón 1:1 en medio AIM-V suplementado con 100 Ul/ml de IL-2 (PeproTech). Entonces se sembró la mezcla de células/perlas a 200 k por pocillo sobre placas de 96 pocillos que se recubrieron previamente con 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD3. Se añadieron H2L5 hIgG4PE y anticuerpo de control directamente a los pocillos en su forma soluble. Después de incubar a 37 °C durante 3,5 días, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular para la medición de citocinas múltiplex mediante MSD, y se recogieron las células para el análisis de proliferación y expresión de marcadores mediante citometría de flujo.

Análisis de datos

Análisis de datos de citometría de flujo

Se analizaron los datos de flujo mediante el software FlowJo (FlowJo LLC). Se separaron en primer lugar las células muertas basándose en la tinción con tinte de viabilidad celular LIVE/DEAD. Se separaron los dobletes en el gráfico de dispersión FSC-H:FSC-W. Las células individuales vivas resultantes se analizaron para determinar la expresión de marcadores de activación dentro de diferentes subpoblaciones de células T tales como células T CD4+ o CD⁸ + y se notificaron como porcentaje de la población original o mediana de la intensidad fluorescente (MFI).

Análisis de proliferación de CFSE

Se analizaron también los datos de CFSE mediante Flowjo. Después de excluir las células muertas y los dobletes, se trazó una compuerta de “células proliferadas” basándose en células T no activadas. Cualquier célula que se encuentre en esta compuerta en cualquier muestra dada se contó como célula proliferada. Se notificaron los datos como porcentaje de proliferación.

Análisis de agotamiento de células mediante FACS

Se analizó el agotamiento de células mediante FlowJo. En primer lugar, se determinó una compuerta de células vivas basándose en la tinción con tinte de viabilidad celular LIVE/DEAD. Entonces se separaron los dobletes tal como se describió anteriormente. Se calcularon los porcentajes de la subpoblación de células T CD4+ o CD⁸ + vivas como indicador del agotamiento de células.

Análisis de ajuste de la curva de respuesta a la dosis de anticuerpo

Los datos de respuesta a la dosis se importaron al software GraphPad Prism y se transformaron a la escala logarítmica. Se usó la respuesta a la dosis de agonista con diversos modelos de pendiente para ajustar a la curva los datos y generar valores de CE50. La fórmula de ajuste se enumera a continuación:

Y = Inferior (Superior-Inferior)/(1+10A((LogCE50-X)*pendiente de Hill))

RESULTADOS

Identificación de anticuerpos anti-ICOS humano murinos principales

Se examinaron catorce AcM murinos para determinar su actividad agonista y de unión a ICOS humano y de cynomolgus. Doce pudieron volver a clonarse, secuenciarse, hacerse crecer y purificarse en cantidades suficientes para estudios funcionales. Todos se sometieron a prueba para determinar las características de unión usando BIAcore. Se encontró que dos eran muy débiles / no se unían. Diez AcM purificaron se sometieron a prueba mediante análisis de “agonismo” funcional. Los cuatro mejores AcM agonistas (designados como 422.2, 279.1, 314.8 y 88.2 en la tabla 5 a continuación), basándose en su capacidad para inducir la proliferación de células T y la producción de citocinas de IFN-^y a través de múltiples donantes humanos sanos, se seleccionaron y se produjeron como quimeras de IgG1 humana. Las secuencias de CDR para 314.8, 88.2, 92.17, 145.1 y 53.3 se muestran con otros AcM frente a ICOS en el documento PCT/EP2012/055735 (WO 2012/131004).

La región variable de cadena pesada para el clon 88.2 se presenta a continuación como SEQ ID NO: 13:

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQMFKDKATLTVDKS

SNTAYMQLTSPTSEDSAVYYCTRWNLSYYFDNNYYLDYWGQGTTLTVSS (SEQIDNO:13)

La región variable de cadena ligera para el clon 88.2 se presenta a continuación como SEQ ID NO: 14:

QAWTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAAL

TITGAQTEDEAIYFCALWYNNHLVFGGGTKLTVL (SEQIDNO:14)

Tabla 5: Unión y competencia de AcM frente a ICOS

Ocho de los que mejor se unían a ICOS se sometieron a prueba para determinar la producción de IFN-^y y la proliferación de células T usando un ensayo basado en células en un diseño de aumento de la dosis contra controles de EPR7114 e IgG1 de ratón. Basándose en estos ensayos, se seleccionó el clon designado como 422.2 para la humanización. Véanse las figuras 1 y 2.

Ejemplo 3 Humanización de anticuerpos

Protocolo(s) experimental(es)

Recuperación de genes variables de anticuerpos a partir de ARNm y generación de anticuerpo de tipo natural de Fc quimérico

Se purificó ARN total a partir del sedimento celular del hibridoma 422.2, se transcribió de manera inversa para generar ADNc a partir del cual se aislaron los productos génicos variables, aproximadamente 400 pb, mediante PCR y se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

Los fragmentos de región variable purificados se clonaron en vectores pTT5 que contenían o bien la región constante de IgG1 humana o bien la región constante Kappa humana y se transformaron en células competentes DH5a. Se recogieron colonias y se usaron para inocular el caldo L que contenía ampicilina. Se aisló ADN de plásmido de los cultivos usando un kit mini-prep QuickLyse. Se secuenciaron los genes de cadena pesada y ligera variables y se alinearon los datos de secuencias informáticamente para identificar las secuencias de genes de cadena pesada y ligera variables.

Clonación de anticuerpos 422.2 quiméricos con codones optimizados

Las secuencias proteicas de regiones variables murinas maduras se tradujeron de manera inversa a ADN, luego se optimizaron los codones. Las secuencias de Vh y Vl se modificaron entonces para incluir las cinco regiones no traducidas principales preferidas y sitios de clonación preferidos en cada extremo. La secuencia de Vh adaptada se construyó de novo usando una estrategia basada en PCR y luego se injertaron oligonucleótidos solapantes sobre hIgG1 deshabilitada en Fc o de tipo natural para Fc de IgG1 humana (L235A, G237A) o hIgG4 estabilizada con bisagra (S228P, L235E) (IgG4PE) presente en vectores pTT. La secuencia de Vl adaptada se construyó de novo usando una estrategia basada en PCR y luego se injertaron oligonucleótidos solapantes sobre una región constante kappa presente en un vector pTT5.

Los plásmidos pTT resultantes se usaron en transfecciones de HEK para producir los anticuerpos quiméricos

Humanización de los dominios variables de 422.2

Se eligieron moldes de genes variables (V) humanos para la humanización de 422.2 mediante búsqueda en bases de datos de cadenas pesadas y ligeras de línea germinal humana internas apropiadas con regiones V de 422.2 con CDR enmascaradas usando BLASTP. Se eligieron IGHV1-69 e IGKV3-11 a partir de los principales aciertos de BLASTP como moldes de entramado de genes V para la humanización de 422.2. Se eligieron genes de unión (J) de línea germinal humana de IGHJ⁶ e IGKJ2 para la humanización de 422.2.

Se identificaron las diferencias de residuos entre los genes de línea germinal humana elegidos y la secuencia de 422.2 para ayudar en la selección de retromutaciones (mutaciones realizadas para cambiar el residuo de entramado humano específico al residuo murino). Se diseñaron seis variantes de VH humanizadas y seis variantes de VL humanizadas, se optimizaron los codones y luego se modificaron para incluir extensiones en 5’ y 3’ preferidas. Las secuencias de regiones variables adaptadas se construyeron de novo usando una estrategia basada en PCR y luego se clonaron respectivamente oligonucleótidos solapantes en vectores pTT.

Los plásmidos pTT resultantes se usaron en transfecciones de HEK para producir los anticuerpos humanizados. Se contaron células en suspensión HEK2936E y se diluyeron hasta de 1,5x10⁶ células/ml a 2x10⁶ células/ml usando medio de expresión Freestile 293 suplementado con geneticina al 0,05 % y para algunos experimentos suplementado con pluronic F⁶⁸ al 1 %. Se añadieron ADN y reactivo de transfección (Gemini o 293-Fectin) a OptiMEM y se homogeneizaron suavemente antes de la incubación durante de 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se combinaron los complejos de ADN-lípido con las suspensiones de células y se incubaron las células transfectadas a 37 °C, el 5 % de CO2, 125 rpm. Para algunas transfecciones, se añadió una alimentación de triptona (medio de expresión Freestile 293 suplementado con pluronic F⁶⁸ al 1 % y triptona de caseína al 20 % p/v) a cada transfección de 24 a 48 horas después de la transfección. Se incubaron las suspensiones de células transfectadas durante de 5 a ⁸ días hasta que las células viables cayeron por debajo del 60 %, luego se centrifugaron (dependiendo del constructo). Se recogieron los sobrenadantes y se filtraron.

Se purificaron los anticuerpos haciendo pasar los sobrenadantes a través de una columna de proteína A HP HiTrap de ¹ ml para permitir la captura de anticuerpos, lavanco la columna con ¹⁰ ml de PBS y eluyendo con 5 ml de IgG Elute (Pierce, 21009). Se intercambió el tampón de la proteína purificada a PBS usando las unidades de filtro centrífugo Centricon® de Millipore (corte de 30 K) y se cuantificó en el espectrofotómetro Nandrop.

RESULTADOS

Plásmidos de expresión construidos

Las secuencias de genes variables de anticuerpos murinos del clon de hibridoma 422.2 se recuperaron con éxito y las secuencias se muestran a continuación como SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente, así como en la figura ⁸.

HC de 422

QVQLQQSGPELVRPGESVKISCMGSGYTFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGLISIYSDHTNYNQKFQGKATMTVDKS

SSTAYMELARLTSEDSAIYYCGRNNYGNYGWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQIDNO:19)

LC de 422

ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSITSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTIS

SMEAEDVATYYCFQGSGYPYTFGGGTKLEIKR (SEQIDNO:20)

La clonación de las regiones variables recuperadas en vectores pTT5 seleccionados dio como resultado la generación de plásmidos que codifican la secuencia de cadena ligera quimérica de 422.2 y las secuencias de cadenas pesadas quiméricas en hIgG1 Fc de tipo natural, hIgG1 deshabilitada en Fc (L235A/G237A, numeración EU) o una hIgG4 PE (S228P/L235E, numeración EU). Los anticuerpos quiméricos se usaron para confirmar la funcionalidad de las regiones V de ratón clonadas y para identificar el isotipo más adecuado.

La construcción de plásmidos de expresión de mamíferos pTT que codifican las cadenas pesadas y ligeras de las diversas variantes humanizadas de 422.2 se llevó a cabo con éxito.

Expresión, purificación e identificación de H2L5 hIgG4PE

Las secuencias proteicas maduras de H2L5 hIgG4PE se han incluido con marcaje adicional en la figura 9. Las secuencias de ADN de las regiones codificantes de cadenas pesadas y ligeras de H2L5 hIgG4PE se han incluido en las figuras ¹⁰ y ¹¹.

Ejemplo 4: Análisis funcional de H2L5

Unión al receptor de Fc

Se modificó el anticuerpo humanizado H2L5 a partir de un isotipo de IgG1 humana a un isotipo de IgG4 humana modificado que incorpora las mutaciones S228P, L235E (numeración EU) para impedir el intercambio de brazos del fragmento de unión a antígeno (Fab). Se seleccionó IgG4PE humana son respecto a IgG1 humana ya que disminuye la unión del AcM a receptores de Fcy activantes y C1q, por tanto, reduciendo el potencial del AcM para inducir el agotamiento de células positivas para ICOS mediante citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Además, IgG4PE humana (S228P, L235E) conserva la unión a FcyRIIb (receptor de Fcy inhibidor). La interacción con FcYRIIb puede ser crítica para la actividad agonista de anticuerpos frente a ICOS al permitir la reticulación de anticuerpo. Se ha mostrado que la interacción con FcyRIIb es crítica para la actividad agonista de otros anticuerpos inmunomoduladores que seleccionan como diana receptores de la familia de TNF-a así como CD28 (Bartholomaeus P et al., “Cell contact-dependent priming and Fc interaction with CD32+ immune cells contribute to the TGN1412-triggered cytokine response”. J. Immunol., 192(5); 2091-8 (2014)).

Se mostró además que IgG4PE humana disminuye la unión del AcM a receptores de Fcy activantes (FcyRI, FcYRIIa y FcYRIIIa) y C1q, reduciendo por tanto el potencial del AcM para inducir el agotamiento de células positivas para ICOS mediante citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Además, IgG4PE humana (S228P, L235E) conserva la unión a FcyRIIb (receptor de Fcy inhibidor) (tabla ⁶ ).

La tabla ⁶ a continuación muestra afinidades de unión representativas a receptores de Fcy humanos de1H2L5 principal como o bien un anticuerpo hIgG1 o uno hIgG4PE.

Tabla 6: Afinidades representativas del anticuerpo frente a ICOS humanizado principal, como o bien una hIgGI o bien una hIgG4PE, por receptores de Fcy humanos

Protocolo experimental

Evaluación funcional de variantes humanizadas de 422.2

Para humanizar los cuatro anticuerpos agonistas de ICOS candidatos, se generaron quimeras de ratón-ser humano, que son fusiones de región V de ratón y porción Fc de IgG1 humana. Estos cuatro anticuerpos quiméricos se sometieron a prueba en un ensayo de activación de PBMC completas humanas como forma unida a la placa. La quimera anti-ICOS 422.2 mostró la mejor actividad agonista en el ensayo de activación de PBMC unidas. En combinación con los datos de unión y las propiedades biofísicas, se eligió el clon 422.2 para la humanización. Se seleccionaron cuatro variantes de 422.2 humanizadas basándose en la unión a ICOS y las características biofísicas (422.2 H2L0, H2L5, H5L0 y H5L5) y se sometieron a prueba en ensayos de activación de PBMC humanas unidas. La variante H2L5 demostró una activación de células T comparable o mejor tal como se midió mediante la producción de citocina en relación con otras variantes (figura 3).

La región variable de cadena pesada (Vh) y la cadena pesada madura para la variante H5 se presentan a continuación como SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente.

VH de H5

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWIGLISIYSDHTNYNQKFQGRATMTVDKS

TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRNNYGNYGWYFDVWGQGTTVTVSS (SEQIDNO:15)

Cadena pesada de H5 madura

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWIGLISIYSDHTNYNQKFQGRATMTVDKS

TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRNNYGNYGWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV

KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNWHKPSNTKVDKKVEPKSCD

KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALpAplEKTISKAKGQpREpQVYTLppsRDELTKNQVSLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K (SEQIDNO:16)

La región variable de cadena ligera (Vl) y la cadena ligera madura para la variante L0 se presentan a continuación como SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente.

VL de L0

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTIS

SLEPEDFAVYYCFQGSGYPYTFGQGTKLEIK (SEQIDNO:17)

Cadena ligera de L0 madura

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTIS

SLEPEDFAVYYCFQGSGYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKYQWKVD

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID

NO:18)

Selección de IgG4rPE1 como isotipo

La 422 H2L5 IgG1 se sometió a prueba posteriormente en diversos ensayos de activación de PBMC completas en forma soluble. Es probable que este formato soluble sea más relevante para la condición in vivo ya que los ensayos de PBMC completas contienen linfocitos, monocitos y otras células inmunitarias también. Sin embargo, el AcM 422 H2L5 IgG1 mostró de manera constante una disminución de la viabilidad de poblaciones de células T que es reminiscente del agotamiento de células T. Este resultado se observó en diferentes grados en 11 donantes sanos que se sometieron a prueba y fue más prominente en células T CD4+ que en células T CD⁸ +. En cambio, el anticuerpo 422 H2L5 no mostró una disminución significativa en la viabilidad de células T cuando se expresó como o bien un isotipo de IgG4[PE] o bien deshabilitado en Fc, lo que sugiere que la disminución de la viabilidad puede haberse debido a citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediada por Fc^y R (figura 4).

Respuesta a la dosis de H2L5 hIgG4PE en ensayo de activación de células T CD4+

Para cuantificar los efectos de activación de células T de H2L5 hIgG4PE, en primer lugar se preestimularon células T CD4+ primarias humanas mediante anticuerpo anti-CD3 (1 pg/ml)/anti-CD28 (3 pg/ml) unido a la placa durante 48 horas para inducir niveles de receptor de ICOS en la superficie de poblaciones de células T efectoras, seguido por reestimulación con DynaBeads anti-CD3 y H2L5 hIgG4PE. Se generó una curva de respuesta a la dosis de 10 puntos tratando las células T CD4+ preestimuladas con concentraciones en serie de H2L5 hIgG4PE unida o soluble en presencia de DynaBeads anti-CD3. Los resultados mostraron que tanto H2L5 hIgG4PE unida como soluble aumentaron la producción de citocinas IFN-^y y TNF-^a de manera dependiente de la dosis en dos donantes humanos sanos diferenciados (figura 5). Se realizó un análisis de ajuste de la curva de dosis-respuesta para generar valores de CE50. De manera interesante, el tratamiento con H2L5 hIgG4PE dio como resultado una magnitud significativamente mayor de inducción de citocinas cuando el anticuerpo estaba fijado a la placa en contraposición a añadirlo como una proteína soluble al sobrenadante de los cultivos de células T.

Pruebas funcionales de H2L5 hIgG4PE en ensayo de activación de PBMC humanas solubles

Con el fin de someter a prueba la función de H2L5 hIgG4PE en cultivo ex vivo de PBMC humanas completas, se prepararon PBMC de donantes humanos sanos con anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28 unido a la placa durante 48 horas, seguido por tratamiento con H2L5 hIgG4PE soluble en presencia de dynabeads anti CD3 (razón perla:célula = 1:1) durante 3,5 días. Se examinó la producción de citocinas y la expresión de granzima B por células T como lecturas funcionales para la función de células T. Los resultados de 3 donantes se resumen en la figura ⁶ , que proporcionan pruebas que sugieren que H2L5 hIgG4PE induce proliferación, producción de citocinas y potencial citotóxico aumentado en PBMC activadas de donantes humanos sanos (figura ⁶ ).

Actividad de AcM frente a ICOS contra PBMC humanas preestimuladas

Se evaluó la actividad de H2L5 hIgG4PE en un ensayo de preestimulación de PBMC en el que las PBMC se preestimularon mediante anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3, 1 pg/ml) y anti-CD28 (clon CD28.2, 3 pg/ml) unido a la placa durante 48 horas. A continuación, con el fin de identificar las condiciones de preestimulación óptimas, se usaron Dynabeads de CD3 y Dynabeads de CD3/CD28 humanos (ThermoFisher) a diferentes razones de perlas con respecto a células para preestimular las PBMC. Después de 48 h de preestimulación, se recogieron las células y se retiraron magnéticamente las perlas antes de la reestimulación con Dynabeads anti-CD3 (razón de perlas con respecto a células = 1:1) en presencia o ausencia de AcM frente a ICOS soluble. El AcM agonista de ICOS de H2L5 hIgG4PE dio como resultado inducción de IFNy en comparación con el control de isotipo en todas las condiciones de preestimulación sometidas a prueba; sin embargo, la magnitud de la producción de IFNy se correlacionaba inversamente con la intensidad de la preestimulación.

Ejemplo 5 - Marcadores de activación de células T

Métodos

Se evaluaron cambios dependientes de la concentración en criterios de valoración funcionales tratando PBMC humanas sanas con H2L5 hIgG4PE inmovilizada a concentraciones que oscilaban entre 0,1 pg/ml y 100 pg/ml simultáneamente con el tratamiento con anticuerpo anti-CD3 a 0,6 pg/ml. Se evaluaron cambios en la expresión de los marcadores de activación de superficie de células T CD69, OX40 y CD25 mediante citometría de flujo y se consideraron una medida de la activación de células T. Se midió la proliferación de células T mediante los cambios en la tinción nuclear Ki67. Se evaluaron cambios en los niveles de diversas citocinas Th1, Th2 y Th17 en la plataforma de MSD en respuesta al tratamiento con H2L5 hIgG4PE en presencia de acoplamiento a CD3. Se seleccionaron los puntos de tiempo de 24 y 48 horas después del tratamiento para garantizar la captura de tanto cambios tempranos en las citocinas así como cambios en la proliferación que se notan predominantemente en puntos de tiempo posteriores.

Preparación/preparaciones experimental(es)

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas

Se recogió sangre completa de donantes sanos con jeringas recubiertas con heparina sódica líquida (Sagent, concentración final de 10 UI/ml) y posteriormente se diluyó 1:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se estratificó la sangre diluida (35 ml) encima de 15 ml de medio de gradiente de densidad Ficoll (GE Healthcare) y se centrifugó a 1200 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA) sin frenos. La capa de glóbulos blancos mononucleados se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo de 50 ml. Se añadió un volumen igual de PBS al tubo y se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos a TA. S lavaron las PBMC una vez con PBS y se centrifugaron tal como se describió anteriormente. Se resuspendieron las PBMC en 50 ml de medio AIM-V. Se contaron las células usando un contador de células Vi-Cell y un analizador de viabilidad (BeckmanCoulter).

Recubrimiento con anticuerpos

Se diluyó un anticuerpo anti-CD3 humano en tampón de recubrimiento hasta una concentración final de 0,6 pg/ml. Se recubrió una placa de fondo plano de 96 pocillos con 100 pl de anticuerpo diluido durante la noche a 4 °C. El día siguiente, se diluyeron en serie 1:2 disoluciones madre de 10,1 mg de H2L5 hIgG4PE y 7,9 mg de anticuerpo de control de isotipo de IgG4 PE anti-RSV en tampón de recubrimiento para dar concentraciones finales de anticuerpo que oscilaban entre 100 y 0,1 pg/ml. Se recubrió una placa recubierta con anticuerpo anti-CD3 con 100 pl de anticuerpos diluidos durante 4 horas a temperatura ambiente.

Protocolo(s) experimental(es)

Ensayo de activación de PBMC humanas

Se sometió a prueba H2L5 hIgG4PE en un ensayo de activación de PBMC humanas donde se produjeron simultáneamente el acoplamiento a TCR por medio de anticuerpo anti-CD3 y coestimulación de ICOS con H2L5 hIgG4PE, y se monitorizaron los efectos activación a las 24 y 48 horas tras la activación. Se repitió este experimento cuatro veces (n=4) con sangre de cuatro donantes diferentes. Se añadieron doscientos (^{20 0} ) pl de PBMc (¹ x ¹⁰⁶ células/ml) en medio AIM-V a pocillos recubiertos con anticuerpo anti-CD3 con diversas concentraciones de H2L5 hIgG4PE o control de isotipo de IgG4. Se incluyeron tres réplicas técnicas para cada condición de ensayo. Se cultivaron las PBMC a 37 °C y el 5 % CO² durante diversos tiempos tal como se indicó anteriormente. Se recogieron los sobrenadantes a los puntos de tiempo de 24 y 48 horas y entonces se almacenaron a -80 °C para el análisis de las citocinas secretadas en la plataforma de MSD. Se transfirieron las células a una placa de 96 pocillos profundos tanto a las 24 como a las 48 horas y se lavaron dos veces con 1 ml de tampón de tinción de FACS teñido con anticuerpos conjugados con fluoróforos o controles de isotipo.

Tinción de la superficie celular

En primer lugar, se tiñeron las células con 100 gl de tinte de viabilidad fijable eFluor 506 prediluido 1:1000 en PBS durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C. Se lavaron las células y luego se incubaron con anticuerpos de detección frente a marcadores de superficie celular conjugados con diferentes fluoróforos sobre hielo durante 30 minutos. Tras la tinción con anticuerpos de superficie celular, las muestras que no iban a teñirse para marcadores de internalización se lavaron una vez con tampón de tinción de FACS enfriado con hielo antes de procesarse en un citómetro de flujo FACS Canto II.

El rendimiento del citómetro se evaluó apropiadamente usando las perlas de configuración y seguimiento del citómetro. Se realizaron compensaciones usando el kit de perlas anti-ratón AbC que se tiñeron individualmente con anticuerpos de detección conjugados con cada fluorocromo. Se procesaron las muestras y se adquirieron datos después de que se determinara la configuración de compensación apropiada con una mezcla de perlas mencionada anteriormente.

Tinción intracelular para Foxp3 y Ki67

Tras la tinción de la superficie celular, se fijaron las células y se permeabilizaron para la tinción de marcadores intracelulares. Usando el conjunto de tampones de factores de transcripción, se preparó el tampón de fijación/permeabilización diluyendo esto 1:3 en tampón diluyente. Se preparó el tampón de lavado permanente diluyendo la disolución madre de tampón de lavado permanente 5X en agua desionizada. Se añadió un (1) ml de tampón de fijación/permanente a cada muestra, y se agitaron con vórtex las placas inmediatamente en el agitador. Se incubaron las placas en la oscuridad a 4 °C durante 45 minutos. Tras la centrifugación, se añadió 1 ml de tampón permanente/de lavado, y se mezclaron las placas y se centrifugaron durante un total de dos lavados. Se preparó el cóctel de internalización con anticuerpos marcadores. Se añadieron 100 gl de los anticuerpos de internalización a las muestras apropiadas, y se incubaron las placas en la oscuridad a 4 °C durante 30 minutos. Se lavaron las muestras dos veces con 1 ml de tampón de lavado permanente, se resuspendieron en 250 gl de tampón de flujo y se procesaron en un citómetro de flujo FACS Canto II.

Ensayo de citocinas Human Special Order 9-plex

Se midieron los niveles de citocinas usando el kit Human Special Order 9-Plex de MSD. Se diluyeron las muestras y los calibradores en diluyente 43. Se diluyeron las muestras 1:10 para el ensayo 9-plex y 1^{: 200} para el ensayo de IFN^y descrito en 0,250 gl del diluyente que se añadió a cada uno de dos paneles de calibradores. Tras agitar con vórtex, se incubaron los calibradores sobre hielo durante al menos 5 minutos. Se añadieron doscientos (200) gl de cada panel de calibradores a 400 gl de diluyente para producir la concentración superior de calibrador, y se usó una dilución en serie 1:4 para preparar las ⁶ diluciones de calibradores adicionales. Se usó diluyente 43 como fondo de la placa. Se añadieron 50 gl de muestras diluidas (por triplicado) y calibradores (por duplicado) a la placa de MSD. Se sellaron las placas y se incubaron a TA con agitación durante 2 horas. Se lavaron las placas 3 veces con 150 gl de tampón de lavado de MSD diluido del kit. Para cada placa, se preparó una disolución de anticuerpos de detección combinando 60 gl de cada uno de los 9 anticuerpos de detección que se llevaron hasta 3 ml con diluyente 3. Tras la adición de 25 gl de disolución de anticuerpos de detección, se sellaron las placas y se incubaron a temperatura ambiente, en la oscuridad, con agitación durante 2 horas. Se lavaron las placas como anteriormente. Se añadieron 150 gl de tampón de lectura 2x a las placas, y se leyeron en el instrumento QuickPlex.

Ensayo de citocina IPNv humana

Se diluyeron muestras y calibradores en diluyente 2. Se añadió 1 ml del diluyente al calibrador. Tras agitar con vórtex, se incubó el calibrador sobre hielo durante 5 minutos. Este es el calibrador 1. Se usó una dilución en serie 1:4 para preparar las ⁶ diluciones de calibradores adicionales. Se usó diluyente 2 como fondo de la placa. Se añadieron cincuenta (50) gl de muestras diluidas (por triplicado) y calibradores (por duplicado) a la placa de MSD. Se sellaron las placas y se incubaron a TA con agitación durante 2 horas. Se lavaron las placas 3 veces con 150 gl de tampón de lavado de MSD diluido del kit. Disolución de anticuerpos de detección preparada en diluyente 3. Para cada placa, se añadieron 60 gl de cada uno de los anticuerpos de detección al diluyente para un total de 3 ml de reactivo de detección. Tras la adición de 25 gl de anticuerpos de detección, se sellaron las placas y se incubaron a temperatura ambiente, en la oscuridad, con agitación durante 2 horas. Se lavaron las placas 3 veces. Se añadió el tampón e lectura a las placas y se leyeron en el instrumento QuickPlex.

Análisis de datos

Análisis de datos de citocinas y citometría de flujo

Los resultados del ensayo de citocinas de MSD se analizaron usando el software MSD Discovery Workbench, versión 4.0 (Meso-Scale), Microsoft Excel y Graphpad Prism. Se analizaron los datos de citometría de flujo mediante DIVA, y los números de representaron gráficamente en el software GraphPad Prism.

Análisis de ajuste de la curva de respuesta a la dosis de anticuerpo

Los datos de respuesta a la dosis se importaron al software GraphPad Prism y se transformaron a la escala logarítmica. Se usó la respuesta a la dosis de agonista con diversos modelos de pendiente para analizar los datos y generar valores de CE50. La fórmula de ajuste se enumera a continuación:

Y = Inferior (Superior-inferior)/(1+10A((LogCE50-X)*pendiente de Hill))

Análisis estadísticos

Se analizaron las diferencias entre los valores de H2L5 higG4PE y de control de anticuerpo de isotipo en el estudio de proliferación para determinar la significación estadística mediante prueba de la t de Student emparejada.

RESULTADOS

Evaluación de cambios de citocinas con H2L5 hIgG4PE

El tratamiento de PBMC con H2L5 higG4PE inmovilizada en presencia de anticuerpo anti-CD3 incluye la secreción, en diferentes grados, de citocinas Th1 tales como IFN^y , TNFa, las citocinas Th2, IL^{- 6} e IL-10, así como la citocina Th17 IL-17a de manera dependiente de la concentración. Otras citocinas medidas tales como IL-4, IL-5 e IL-13 también mostraron un menor grado de respuesta dependiente de la concentración a la estimulación con H2L5 hIgG4PE. Los resultados de cuatro donantes diferenciados se resumen en la tabla 7.

Evaluación funcional de la actividad de H2L5 hIgG4PE sobre marcadores de superficie celular de activación de células T mediante citometría de flujo

El tratamiento con H2L5 hIgG4PE con estimulación de CD3 simultánea en PBMC humanas inactivadas (n=4 donantes) indujo cambios significativos en marcadores de activación de células T (tabla 7 y ⁸ )). Se observaron aumentos robustos en células T CD4 y CD⁸ positivas para CD25 y OX40 en muestras tratadas con H2L5 hIgG4PE en comparación con las muestras de control de isotipo de IgG4 humana. El porcentaje de células T CD4 y CD⁸ positivas para CD69 también aumentó en el punto de tiempo de 24 y 48 horas de manera dependiente de la concentración.

Caracterización del efecto de H2L5 hIgG4PE sobre la proliferación de células T

El tratamiento con H2L5 hIgG4PE inmovilizada con activación de CD3 simultánea dio como resultado un aumento dependiente de la concentración de la proliferación de células T tanto CD4 como CD⁸ (n^{= 6} donantes) tal como se mide mediante tinción de Ki67 intracelular (tabla ⁸ ). H2L5 hIgG4PE también aumento la proliferación de células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ de manera dependiente de la concentración pero en un menor grado que el observado con células T CD4 y CD⁸ totales. La potenciación de la proliferación de células T por H2L5 hIgG4PE se observó solo en el punto de tiempo de 48 horas. El aumento de la proliferación de las células T reguladoras no fue significativo mientras que el aumento dependiente de la concentración en la proliferación de células CD4+ (p< 0,05 para concentraciones mayores de 0,4 gg/ml de H2L5 hIgG4PE) y células T CD⁸ + (p < 0,05 para concentraciones de entre 0,2 y 1^{, 6} gg/ml) fue significativo (véase la tabla 7).

Tabla 7. Valores de CE50 (gg/ml) de todos los criterios de valoración funcionales para H2L5 hIgG4PE en el ensayo de activación de PBMC humanas.

Tabla 8. Porcentaje de células T CD4 o CD8 positivas para CD25, Foxp3 y Ki67 en PBMC humanas tras la estimulación con H2L5 hIgG4PE en presencia de anticuerpo anti-CD3 durante 48 horas

D IS C U S IÓ N

Está bien establecido que ICOS es importante para la activación de células T y la inducción de citocinas tanto Th1 como Th2. En este estudio, se demostró la actividad in vitro de H2L5 hIgG4PE (anticuerpo agonista anti-ICOS) con diversas medidas de activación de células T e inducción de citocinas. Todos los marcadores de activación de células T medidos, CD25 (cadena alfa del receptor de IL-2), CD69 (marcador de activación temprana) y OX-40 (marcador coestimulador) estaban regulados por incremento tras el tratamiento con H2L5 hIgG4PE conjuntamente con la estimulación con CD3. Entre los marcadores de activación monitorizados, el porcentaje de células T que expresan CD69 y OX40 aumentó fuertemente por el tratamiento con H2L5 hIgG4PE. CD69 es un marcador de activación temprana y, por tanto, los efectos son predominantes en las muestras de 24 horas. CD25, otro importante marcador de activación de células T, aumentó tras el tratamiento con H2L5 hIgG4PE en ambos puntos de tiempo, lo que sugiere que H2L5 hIgG4PE desempeña un papel importante en el mantenimiento de la activación de las células T. Ki67 es una proteína nuclear asociada con la proliferación celular. Los datos de citometría de flujo con tinción intracelular de Ki67 indicaron que H2L5 hIgG4PE inmovilizado potenciaba significativamente la proliferación de células T tanto CD4 como CD⁸ en el contexto de acoplamiento a TCR. Aunque H2L5 hIgG4PE también aumentó la proliferación de células T reguladoras, los cambios no fueron estadísticamente significativos.

Las células Th17 humanas son un actor clave en la regulación de la inmunidad antitumoral [Nunez, S., et al., T helper type 17 cells contribute to anti-tumour immunity and promote the recruitment of T helper type 1 cells to the tumour. Immunology 2013; 139: 61-71]. Estudios muestran que ICOS está implicado en el desarrollo y la función de Th17 humanas [Kimura, A., et al., Regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 2010; 40: 1830-1835; Paulos CM et al. The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells. Sci Transl Med. (2010) 2(55); 55ra78; Nelson, M. H., et al. The inducible costimulator augments Tc17 cell responses to self and tumor tissue. J Immunol, 2015; 194: 1737-1747]. En la evaluación funcional actual de H2L5 hIgG4PE, la mayoría de las citocinas relacionadas con respuestas inmunitarias e inflamatorias se midieron en el sobrenadante de cultivos celulares tras la estimulación con anticuerpo anti-CD3 y H2L5 hIgG4PE. H2L5 hIgG4PE induce fuertemente la secreción de citocinas Th1, IFN-^y y TNF-a y citocinas Th17, IL-17a, en PBMC humanas, lo que sugiere que H2L5 hIgG4PE tiene el potencial de desempeñar un importante papel en respuestas antitumorales. iL-⁶ , junto con TGF-p, es una citocina importante para la inducción del desarrollo de células Th17 a partir de células T sin tratamiento previo. En cambio, IL^{- 6} inhibe la diferenciación de Treg inducida por TGF-p [Kimura, A., 2010; Korn, T., et al., IL^{- 6} controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells. PNAS, 2008; 105: 18460-18465]. En este estudio, se encontró que H2L5 hIgG4PE aumentaba la secreción de IL-⁶ , lo que puede potenciar adicionalmente el desarrollo de células Th17. Se ha mostrado que anticuerpos agonistas de receptores de células T tales como miembros de la familia de receptores de CD28 y TNF producen una curva de respuesta a la dosis en forma de campana [White, A. L., et al., Conformation of the Human Immunoglobulin G2 Hinge Imparts Superagonistic Properties to Immunostimulatory Anticancer Antibodies. Cancer Cell, 2015, 27: 138-148; Luhder, F., et al, Topological Requirements and Signaling Properties of T Cell-activating, Anti-CD28 Antibody Superagonists. J. Exp. Med. 2003: 955-966; Stebbings, R., et al., “Cytokine Storm” in the Phase I Trial of Monoclonal Antibody TGN1412: Better Understanding the Causes to Improve PreClinical Testing of Immunotherapeutics J. Immunol., 2007, 179: 3325-3331; Rogers PR y Croft M, CD28, Ox-40, LFA-1, and CD4 Modulation of Th1/TlÍ2 Differentiation is Directly Dependent on the Dose of Antigen. J Immunol 2000 164:2955-2963; doi:10.4049/jimmunol.164.62955]. H2L5 hIgG4PE también demuestra una curva de respuesta funcional hiperbólica similar. Esta información es un componente importante para determinar el mejor intervalo de dosis del anticuerpo que va a usarse para lograr una respuesta farmacodinámica óptima.

Globalmente, se mostró que H2L5 hIgG4PE, conjuntamente con la estimulación de CD3, potenciaba la activación, proliferación de células T y la inducción de citocinas proinflamatorias en línea con su papel como potente activador de un receptor coestimulador de células T.

Ejemplo 6: Unión de anticuerpos anti-ICOS

El protocolo de humanización (ejemplo 3) produjo 36 variantes de cadena pesada y ligera que se examinaron para determinar la unión a ICOS humano y de cynomolgus al tiempo que también se garantizaba que no se unían a CTLA-4 o CD28 humano. Se identificó la variante H2L5 como la que tenía alta afinidad por ICOS humano y de cynomolgus (1,34 y 0,95 nM respectivamente) al tiempo que contenía el número mínimo de retromutaciones.

El cambio del isotipo de 422 H2L5 de IgG1 a IgG4PE no afecta a la unión al antígeno del anticuerpo ya que H2L5 hIgG4PE tiene una afinidad de 1,3 nM por ICOS humano. En la figura 7 se muestra la inhibición basada en la concentración de la unión de ICOS/ICOS-L por H2L5 hIgG4PE.

Protocolos experimentales

Unión de H2L5 hIgG4PE a ICOS humano

La afinidad de la cinética de unión del anticuerpo H2L5 hIgG4PE humanizado se determinó usando el instrumento BIAcore T200. Anti-IgG humana en Fc2 de un chip CM5. H2L5 hIgG4PE anti-ICOS capturado en la superficie. Se bloqueó la superficie anti-IgG humana con control de hIgG 10,1 mg/ml para prevenir la unión inespecífica de Fc de conejo. Se hicieron pasar ICOS de cyno y humano (Fc de conejo) sobre los anticuerpos capturados a 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM y 1 nM. Se usó tampón solo para las curvas de unión de doble referencia. Se usó MgCl² para regenerar la superficie. Procesamiento realizado a 25 °C. Datos ajustados a un modelo 1:1 usando el software de evaluación T200. Concentración de anticuerpo: 25 pg/ml.

RESULTADOS

Unión de H2L5 hIgG4PE a ICOS humano y de cynomolgus

La afinidad de la cinética de unión del anticuerpo H2L5 hIgG4PE humanizado se determinó usando el instrumento BIAcore T200.

Los datos de unión a ICOS se ajustaron a un modelo de cinética 1:1 usando el software de análisis de datos T200. La afinidad de unión de H2L5 hIgG4PE por ICOS humano es de 1,34 nM y por ICOS de cynomolgus es de 0,95 nM (véase la tabla 9). Estos valores son comparables y muestran, tal como se esperaba, que un cambio en la región Fc de la molécula no ha afectado a la unión al antígeno ICOS.

La tabla 9 muestra Ka/Kd/KD para 422 (H2L5) IgG4PE humanizado para ICOS humano y de cynomolgus.

Tabla 9 Unión a ICOS humano

DISCUSIÓN

Tal como se muestra en el ejemplo 1, se identificó el clon murino 422-2 como anticuerpo murino anti-ICOS humano principal. La humanización de este anticuerpo produjo 36 variantes de cadenas pesadas y ligeras que se examinaron para determinar su unión a ICOS humano y de cynomolgus al tiempo que también se garantizaba que no se unían a CTLA-4 o CD28 humano. Se identificó la variante H2L5 como la que tenía alta afinidad por ICOS humano y de cynomolgus (1,34 y 0,95 nM respectivamente) al tiempo que contenía el número mínimo de retromutaciones.

El cambio del isotipo de IgG1 a IgG4PE no afecta a la unión del anticuerpo a ICOS.

Ejemplo 7: Unión de H2L5 hIgG4PE a células T activadas humanas

MÉTODOS

Preparación/preparaciones experimental(es)

Aislamiento negativo de CD3:

Se aislaron negativamente células T CD3+ mediante el kit de enriquecimiento de células T humanas Stemcell Rosette Sep, enriquecimiento de células T humanas con Rosette Sep: Se recogieron 100 ml de sangre completa reciente con jeringas recubiertas con heparina sólida líquida (Sagent, concentración final de 10 UI/ml). La sangre de cada tubo de recogida se combinó en un matraz donde se añadieron 50 gk de cóctel de enriquecimiento de células T humanas Rosette Sep por ml de sangre. (5 ml/100 ml de sangre del donante). El cóctel de sangre completa/anticuerpo Rosette Sep se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA). Entonces se diluyó el cóctel de sangre/anticuerpo Rosette Sep 1:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x FBS (suero bobino fetal) al 2 %. FBS para un volumen final de 200 ml. A continuación, se estratificaron entonces 25 ml de cóctel de sangre/anticuerpo diluido sobre 15 ml de gradiente de Ficoll en tubos Sepmate ^{( 8} tubos en total para cada donante). Entonces se centrifugaron los tubos Sepmate cargados a 1200 x g durante 20 minutos TA con los frenos activados. La capa superior de plasma hasta la superficie de contacto de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se retiró con una pipeta y se desechó. El plasma restante y la superficie de contacto de capa leucoplaquetaria se decantaron de los tubos Sepmate a tubos de centrífuga cónicos de 50 ml (4 tubos en total). Los tubos se completaron hasta 50 ml con PBS FBS al 2 %. Se centrifugaron las células a 400 x g durante 10 minutos a TA. Se desecharon los sobrenadantes. Entonces se combinaron los sedimentos de cada donante en un solo tubo cónico de 50 ml, resuspendiendo los sedimentos en un volumen total de 50 ml de PBS FBS al 2 %. Se centrifugaron las células a 400 x g durante 5 minutos a TA. Se desecharon los sobrenadantes y se resuspendieron los sedimentos celulares en 2 ml de medio completo RPMI (RPMI 1640 FCS al 10 % piruvato de sodio 1 mM L-glutamina 2 mM penicilina 100 U/ml estreptomicina 100 gg/ml). Se contaron las células CD3 recuperadas en el instrumento ViCell y se diluyeron adicionalmente hasta 1,2x10⁶ células/ml. Se tiñeron 1x10⁶ células recuperadas para CD3 PE-Cy7 para confirmar la calidad del aislamiento de células T.

Se aislaron negativamente células T CD3+ mediante el kit de aislamiento de células T Untouched de Invitrogen

Aislamiento de PBMC: Brevemente, se recogieron 100 ml de sangre completa reciente de cada donante con jeringas recubiertas con heparina sódica líquida (Sagent, concentración final de 10 UI/ml). La sangre se diluyó (1:1) hasta un volumen final de 200 ml con PBS con FBS al 2 %. Se estratificaron veinticinco (25) ml de sangre diluida sobre 15 ml de gradiente de Ficoll en tubos Sepmate ^{( 8} tubos en total para cada donante). Entonces se centrifugaron los tubos Sepmate cargados a 1200 x g durante 20 minutos a TA con los frenos activados. La capa superior de plasma hasta la superficie de contacto de PBMC se retiró con una pipeta y se desechó. El plasma restante y la superficie de contacto de capa leucocitaria se decantaron de los tubos Sepmate a tubos de centrífuga cónicos de 50 ml (4 tubos en total). Los tubos se completaron hasta 50 ml con PBS FBS al 2 %. Se centrifugaron las células a 400 x g durante 10 minutos a TA. Se desecharon los sobrenadantes. Entonces se combinaron los sedimentos de cada donante en un solo tubo cónico de 50 ml y se resuspendieron en un volumen total de 50 ml de PBS 2 % de FBS. Se centrifugaron las células a 400 x g durante 5 minutos a TA. Se desecharon los sobrenadantes y se resuspendieron los sedimentos celulares en un volumen arbitrario de tampón de aislamiento (dependiendo del tamaño del sedimento celular) proporcionado en el kit de células T Untouched de Invitrogen. Entonces se contaron las PBMC aisladas en el instrumento ViCell y se llevaron a una concentración final de 1 x 10⁸ células/ml en tampón de aislamiento.

Aislamiento de células T humanas con Dynabead Untouched de Invitrogen: Se añadieron 2x10⁸ PBMC aisladas (2 ml), 400 gl de FBS y luego 400 gl de mezcla de anticuerpos del kit de células T Untouched de Invitrogen a cada tubo de 15 ml y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Se lavaron las células con 10 ml de tampón de aislamiento y se centrifugaron a 350 x g durante ⁸ minutos a 4 °C. Se desecharon los sobrenadantes y se resuspendieron los sedimentos en 2 ml de tampón de aislamiento. A continuación, se añadieron a cada tubo 2 ml de Dynabeads Depletion lavadas previamente. Se incubaron las células con las perlas durante 15 minutos a temperatura ambiente con una suave inclinación y rotación. Después de la incubación con las perlas, se añadieron 10 ml de tampón de aislamiento y las suspensiones de células/perlas se pipetearon hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Se colocaron los tubos en un imán durante 2 minutos a temperatura ambiente. Sin alterar las perlas magnetizadas, se recogieron los sobrenadantes que contenían las células T intactas. Se lavaron las perlas 1 vez con 10 ml de tampón de aislamiento y se colocaron nuevamente en el imán durante 2 minutos a temperatura ambiente, y se recogió el tampón despejado de perlas. Se centrifugaron las células recogidas a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se desecharon los sobrenadantes y se resuspendieron los sedimentos celulares en un volumen arbitrario de medio completo RPMI dependiendo del tamaño del sedimento celular (de 2 a 35 ml). Entonces se contaron las células CD3+ recuperadas en el instrumento ViCell y se llevaron a una concentración de 1,2 x 10⁶ células/ml en medio completo RPMI.

Tinción de confirmación de CD3: Se tiñeron 1x10⁶ células recuperadas con 5 gl de anticuerpo anti-CD3 PE-Cy7 o 5 gl de isotipo de IgG1 Pe-Cy7 durante 40 minutos a 4 °C en la oscuridad. Entonces se lavaron las células dos veces en PBS enfriado con hielo con Tween20 al 0,1 %, centrifugando a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se resuspendieron las células teñidas en formaldehído al 1 % y se incubaron a 4 °C durante 20 minutos en la oscuridad. Entonces se lavaron las células dos veces en PBS enfriado con hielo con Tween20 al 0,1 %, centrifugando a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C, y se resuspendieron en 275 gl de PBS con Tween20 al 0,1 %. Se almacenaron las células fijadas a 4 °C en la oscuridad hasta que se realizó citometría de flujo para confirmar la calidad del aislamiento de células T.

Activación de células T humanas aisladas:

Se recubrieron matraces T75 con 4 ml de CD3/CD281 pg/ml en PBS durante 2 horas a 37 °C. Se lavaron los matraces dos veces con 12 ml de PBS. Se añadieron 30x106 células en 25 ml de medio completo RPMI por matraz T75. Se incubaron las células durante 48 horas a 37 °C, el 5 % de CO² para permitir que se produjera la activación.

Unión de anticuerpo anti-ICOS (H2L5 hIgG4PE):

Se evaluó la unión de H2L5 hIgG4PE en células T CD3+ tanto sin tratamiento previo como activadas. Se empleó una titulación de ⁸ puntos de desde 0,00128 hasta 100 mg/ml de H2L5 hIgG4PE con diluciones de 5 veces.

Las células T CD3+ o bien sin tratamiento previo y/o bien activadas se resuspendieron en PBS con BSA al 0,1 % (tampón FACS) que contenía disolución de bloqueo de FcR humano a 2x10⁶ células/ml (5 ml de disolución de bloqueo de FcR 950 ml de tampón FACS por 1 ml). A una concentración de 2x10⁵ células/pocillo, se colocaron 100 ml de células en bloques de ensayo de 96 pocillos de 2 ml y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, se preparó una titulación de los anticuerpos de unión, anti-ICOS (H2L5 hIgG4PE) o control de isotipo de IgG4 como una concentración de 2x. Después de la incubación del bloqueo de FcR, se añadieron 100 ml por pocillo de los anticuerpos de unión concentrados 2x a los 100 ml de células T con Fc bloqueado por pocillo para lograr una concentración final 1X de anticuerpo anti-ICOS (H2L5 hIgG4PE) o control de isotipo de IgG4 de desde 0,00128 hasta 100 mg/ml de concentración final. Se incubaron las células con anticuerpos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de unión, se lavaron las células dos veces en 1 ml de tampón FACS y se centrifugaron a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Tinción de células T sin tratamiento previo o activadas tras la unión de anticuerpo anti-ICOS (H2L5 hIgG4PE):

Se tiñeron las células para citometría de flujo con los siguientes cócteles:

Cóctel de tinción:

Cóctel de isotipo:

Se resuspendieron células T con Fc bloqueado, sin tratamiento previo o activadas, en 80 pl de tampón de FACS tras la incubación de unión con H2L5 hIgG4PE o anticuerpos de control. Se añadieron 20 pl por pocillo de cualquiera del cóctel de tinción o de isotipo por pocillo. Se tiñeron las células durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la incubación de tinción, se lavaron las células dos veces en 1 ml de tampón de FACS, centrifugando a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Fijación de células teñidas:

Se resuspendieron las células en 500 pl de formaldehído al 1 % (10 ml de formaldehído concentrado 16x 150 ml de PBS 1 x) y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces se lavaron las células dos veces con 1 ml de tampón de FACS, centrifugando a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se resuspendieron los sedimentos en 265 pl de tampón de FACS y se transfirieron a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se almacenaron las células a 4 °C en la oscuridad hasta el análisis por citometría de flujo.

Citometría de flujo:

Se realizó la citometría de flujo en cualquiera de los instrumentos FACS Fortessa X20 o FACS Canto II usando el software FACSDiva (versión 8.0). Se realizó la compensación en el momento de la adquisición usando perlas eBioscience Ultracomp teñidas individualmente y el software de compensación en FACSDiva.

Análisis de datos

Se realizaron la adquisición de datos y la compensación en instrumentos BD FACS, LSR Fortessa X-20 o FACS Canto II usando el software BD Diva (ver. 8.0). El análisis de datos empleó el software Flow Jo (ver. 10.0.8r1). Los resultados se notifican tanto como MFI (mediana de la intensidad de fluorescencia) como porcentaje de células positivas para la tinción con FITC de cadena ligara kappa de IgG humana con respecto a las células vivas totales o la población original apropiada. Se determinaron las CE50 usando el software Graphpad Prism 5 (ver. 5.04) con regresión no lineal de los datos transformados (X=(log(X)) usando una pendiente variable con 4 parámetros (log(agonista) frente a respuesta -­ pendiente variable).

RESULTADOS

El aislamiento de células T a partir de sangre humana completa reciente, usando o bien el kit de enriquecimiento de CD3 Rosette Sep o bien el kit de aislamiento de células T Dynabead Untouched, se confirmó tiñendo con anticuerpo anti-CD3 PeCy7. Los donantes oscilaban entre el ⁶⁸ % y el 97 % de positividad para células CD3. Las poblaciones de células CD4+ y CD⁸ + activadas con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28 generaron curvas dependientes de la concentración de H2L5 hIgG4PE cuando se evaluaron para determinar la tinción con FITC de anticuerpo anti-cadena ligera kappa de IgG1 humana. Se presentan curvas de unión de H2L5 hIgG4PE tanto como porcentaje de positividad de FITC de anticuerpo anti-cadena ligera kappa de IgG1 humana como mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de FITC. Las células T incubadas con el anticuerpo de control de isotipo de IgG4 no produjeron curvas dependientes de la concentración cuando se evaluaron para determinar la tinción de FITC de anticuerpo anti-cadena ligera kappa de IgG 1 humana. Células CD4+ o CD⁸ + sin tratamiento previo no produjeron curvas completas; sin embargo, se observaron aumentos dependientes de la concentración desde ^{0 ,1} pg/ml hasta ¹⁰⁰ pg/ml.

Las medianas (intervalo) de los valores de CE50 fueron 1,04 pg/ml (0,628-1,31 pg/ml) para CD4+ FITC MFI y 0,652 pg/ml (0,27-0,74 pg/ml) para CD⁸ +FITC MFI, respectivamente. Las medianas (intervalo) de los valores de CE50 fueron 0,834 pg/ml (0,45-0,965 pg/ml) para el porcentaje de positividad de FITC de cadena ligera kappa de IgG CD4+ y 0,583 pg/ml (0,371 -1,23 pg/ml) para el porcentaje de FITC de cadena ligera capa de IgG CD⁸ +. (Tabla 10)

Tabla 10: Resumen de los valores de CE50 de la unión de 422 H2L5 hIgG4PE a células T humanas activadas

DISCUSIÓN

Este estudio demostró que H2L5 hIgG4PE (anticuerpo agonista anti-ICOS) se unía al receptor ICOS en células T activadas de donantes humanos sanos. La unión de H2L5 hIgG4PE a la superficie celular de las células T se detectó usando un anticuerpo contra la cadena ligera kappa de IgG humana marcado con FITC.

El aislamiento exitoso de las células T CD3+ se confirmó a través de citometría de flujo con tinción de anti-CD3 Pe-Cy7. Nueve de diez donantes dieron como resultado más del 89 % de células T CD3+ después del aislamiento. Sin embargo, el donante n.° 2100M39 tenía solo un ^{68 , 6} % de CD3+ después del aislamiento. Se desconoce la causa de esta disminución de la pureza en el aislamiento de células T del donante n.° 2100M39. Los valores de CE50 generados a partir de poblaciones CD4+ y CD⁸ + separadas del donante n.° 2100M39 no parecen ser aberrantes y se incluyeron en las medianas de los valores resumidos.

Se determinaron las CE50 de unión para H2L5 hIgG4PE en células T humanas aisladas negativamente. Se generaron curvas de unión cuando las células T aisladas se activaron mediante una exposición de 48 horas a 1 pg/ml de anticuerpos frente a CD3/CD28 unidos a la placa. Tanto el porcentaje de células positivas para FITC de cadena ligera kappa de IgG como los datos de MFI de FITC de células T activadas CD4+ y CD⁸ + se consideraron en los análisis estadísticos. Las medianas de los valores de CE50 de CD4+ fueron similares cuando se calcularon como porcentaje de células positivas para FITC o MFI de FITC, 1,04 y 0,834 mg/ml, respectivamente. Las medianas de los valores de CE50 de CD⁸ + también fueron similares cuando se calcularon como porcentaje de células positivas para FITC o MFI de FITC, 0,652 y 0,583 mg/ml, respectivamente.

Las células T incubadas con el control de isotipo de IgG4 PE no dieron como resultado aumentos dependientes de la concentración en la unión de FITC a cadena ligera kappa anti-IgG humana independientemente del método de análisis empleado, MFI o porcentaje de células positivas.

No pudieron obtenerse curvas completas a partir de células T aisladas negativamente, sin tratamiento previo o inactivadas, en el intervalo de 0,00128 a 100 mg/ml de H2L5 hIgG4PE sometido a prueba. Sin embargo, se observó un aumento de la unión dependiente de la concentración en donantes desde 0,1 hasta 100 mg/ml de H2L5 hIgG4PE. Las CE50 no pudieron calcularse porque las curvas de las células T sin tratamiento previo estaban incompletas. Se esperaba la incapacidad de H2L5 hIgG4PE para unirse a bajas concentraciones a células sin tratamiento previo o inactivadas, ya que ICOS solo se expresa débilmente en células Th17 en reposo, células T auxiliares foliculares (TFH) y células T reguladoras (Treg). Se requiere el acoplamiento a y la activación de TCR para inducir la expresión de ICOS. Por tanto, probablemente había muy poco receptor ICOS expresado en células sin tratamiento previo o inactivadas y, en consecuencia, una unión mínima de H2L5 hIgG4PE.

E je m p lo 8: R e s u lta d o s d e T K /P D a p a rtir d e l e s tu d io d e b ú s q u e d a d el in te rv a lo d e d o s is (Dose-Range Finding, D R F ) en cvn o

Para acceder a las características in vivo de H2L5 hIgG4PE en una especie objetivo relevante, se realizó un estudio de búsqueda del intervalo de dosis en monos cynomolgus. El estudio sometió a prueba 3 niveles de dosis (0,3, 3 y 30 mg/kg) además de una cohorte de control del vehículo. Era una dosis repetida con la segunda dosis administrada 14 días después de la primera. Se sometieron a prueba un macho y una hembra por cohorte. H2L5 hIgG4PE presentó un aumento dependiente de la dosis en Cmáx. (mg/ml) y AUC (mg.h/ml) en las 3 dosis diferentes que se sometieron a prueba. En los tres niveles de dosis, se detectó anticuerpo en el plasma durante dos semanas después de la primera dosis (figura 12A). Se detectaron anticuerpos anti-H2L5 hIgG4PE en 3 de los monos después de una sola dosis, tanto de los animales que recibieron una dosis de 0,3 mg/kg como de la hembra que recibió una dosis de 3 mg/kg. Los anticuerpos anti-H2L5 hIgG4PE se correlacionaron con concentraciones en plasma disminuidas después de la administración de la segunda dosis en estos animales (figura 12B). Cuarenta y ocho horas después de la segunda dosis, se sacrificaron todos los animales para recoger tejido para el análisis de la actividad farmacodinámica y el análisis histopatológico.

Se midió la ocupación del receptor (RO) de H2L5 hIgG4PE en células T CD4+ de los bazos y los ganglios linfáticos axilares de todos los animales del estudio. Se observó un aumento dependiente de la dosis en la unión de H2L5 hIgG4PE en los niveles de dosis sometidos a prueba en ambos tejidos (figura 13).

También se midió la ocupación del receptor en células T CD4+ de la sangre periférica de los monos del estudio. Se extrajo sangre en 5 puntos de tiempo (día 1 (antes de la dosis), día 3, día ⁸ , día 15 (antes de la segunda dosis) y día 17). En este ensayo, se usaron dos medidas diferentes para determinar la RO. La primera era un formato de ensayo de “receptor libre” en el que se determinó la unión del AcM anti-ICOS usado para la detección por citometría de flujo en presencia o ausencia de H2L5 hIgG4PE que se mostró que competía por la unión a ICOS. Por tanto, la ausencia de señal anti-ICOS por FACS fue un sustituto del receptor ocupado por H2L5 hIgG54PE y, por el contrario, la positividad anti-ICOS indicó “receptor libre” que no estaba unido con H2L5 hIgG4PE. La figura 14-A muestra que el receptor libre de ICOS disminuyó de manera dependiente de la dosis y dependiente del tiempo. Dos monos (250 y 300) demostraron señales de “receptor libre” que no pudieron explicarse y que pueden deberse a la producción de anticuerpos anti-H2L5 hIgG4PE en estos monos. Además, la RO también se midió en células CD4+ de sangre periférica mediante el mismo ensayo usado en el bazo y los ganglios linfáticos descrito anteriormente. Tal como se esperaba, la dosis de 0 mg/kg no mostró RO en esta lectura (figura 14-B). De manera interesante, algunos monos a los niveles de dosis de 3,0 y 30 mg/kg mostraron un aumento dependiente del tiempo en el número de células CD4+ unidas a H2L5 hIgG4PE a lo largo del transcurso temporal del tratamiento. En particular, el animal 350 presentó un aumento (>5 veces) en las células CD4+ circulantes unidas al fármaco entre los días 3 y 17 (figura 14-B). Es posible que este aumento en el número de células CD4+ICOS+ pueda deberse a la proliferación inducida por H2L5 hIgG4PE de esta población.

Ejemplo 9: H2L5 hIgG4PE induce cambios en la señalización intracelular en respuesta a la unión

Preparación/preparaciones experimental(es)

Líneas celulares

Se obtuvieron células Ba/F3-ICOS de INSERM (París, Francia). Se cultivaron las células en el medio de cultivo apropiado suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), IL-3 murina recombinante 10 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) y geneticina 1 mg/ml (ThermoFisher, Waltham, MA) a 37 °C en incubadores humidificados bajo el 5 % de CO².

Protocolo(s) experimental(es)

Matriz de anticuerpos de señalización intracelular

Se sometieron a ensayo lisados proteicos con el kit de matriz de señalización intracelular PathScan® (Cell Signaling Technologies) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se diluyeron lisados de células Ba/F3-ICOS tratadas con IgG4-PE (20 pg/ml) o H2L5 hIgG4PE (0,2, 2 o 20 pg/ml) durante 1, ⁶ , 24 y 48 horas hasta 1 pg/pl en tampón diluyente de la matriz y se incubaron durante la noche sobre las matrices de anticuerpos a 4 °C. Se capturaron imágenes de las matrices usando el software de obtención de imágenes Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) de Fosfo-AKT

Se midió la fosforilación de AKT usando el kit de lisado de células completas de fosfo(Ser473)/Akt total y el kit de lisado de células completas de Fosfo-Akt (Thr308) de descubrimiento de mesoescala (MSD) según las instrucciones del fabricante. Se sembraron las células a una densidad celular de 0,25 x 10⁶ células/pocillo en placas con fondo de U de 96 pocillos (BD Falcon) en los medios de cultivo apropiados (100 pl/pocillo). Se trataron las células durante 1,2, 4, ⁶ , 24 o 48 horas con o bien el anticuerpo de control (IgG4 PE), anticuerpo deshabilitado en Fc de IgG 1 anti-ICOS o bien H2L5 hIgG4PE a 7 concentraciones diferentes usando un esquema de dilución de 3 veces (intervalo de dosis: 20,0 - 0,03 pg/ml) en pocillos duplicados. Para un experimento usando el kit de lisado de células completas de Fosfo-AKT (Thr308), se trataron las células con una concentración de los tres anticuerpos (10 pg/ml) en pocillos triplicados. La fila inferior de cada placa de 96 pocillos contenía un control sin células (dos pocillos duplicados de blanco) y células que se dejaron sin tratar con ningún anticuerpo. Tras el tratamiento, se lisaron las células con 30 pl de tampón de lisis enfriado con hielo que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa, se incubaron en hielo durante 30 minutos y luego se transfirieron 25 pl de lisado a la placa de ELISA para incubar durante la noche a 4 °C.

Análisis de datos

Análisis de densitometría de la matriz de anticuerpos de señalización intracelular

Se realizó el análisis de densitometría para calcular los niveles de intensidad integrados de los puntos a través de la matriz de anticuerpos. Las intensidades de cada punto se normalizaron al promedio de los controles positivos en la matriz (fórmula = pocillo de muestra/promedio de controles positivos) y se representaron gráficamente usando GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA).

Análisis de datos de ELISA de MSD

Se calculó el porcentaje de fosfoproteína para cada pocillo usando el siguiente cálculo: % de fosfoproteína = ((2 x señal fosfo)/(señal fosfo+señal de proteína total)) x 100. Este valor se normalizó entonces al valor de las células sin tratar a cada punto de tiempo y se representó gráficamente como “% de control” en Microsoft Excel 2007.

RESULTADOS

Estudios anteriores demostraron que el tratamiento con H2L5 hIgG4PE aumentó los niveles de fosfo-AKT (S473) en células Ba/F3-ICOS con la respuesta máxima observada entre 30 y 40 minutos después de la exposición al anticuerpo. En este caso, se midieron los niveles de fosfo-AKT en puntos de tiempo posteriores para ver si los niveles de fosforilación aumentados persistían después de varios días. Además, se evaluó la regulación de otros eventos de señalización intracelular por la activación de ICOS. En las células Ba/F3-ICOS, los niveles de fosfo-AKT (S473) aumentaron con el tratamiento con H2L5 HIGG4PE en comparación con las células tratadas con anticuerpo de control de isotipo de IgG4-PE después de una y seis horas de tratamiento, pero este efecto se perdió después de 24 horas (figura 15). De manera interesante, se observó un efecto similar cuando se trataron las células con un anticuerpo anti­ ICOS en donde la región Fc del anticuerpo está deshabilitada. También se observaron niveles elevados de fosfo-AKT (T308) en células tratadas con H2L5 hIgG4PE y anticuerpo IgG 1 anti-ICOS deshabilitado en Fc en comparación con células tratadas con anticuerpo de control de isotipo de IgG4-PE (figura 15) después de una hora de tratamiento y persistió hasta 48 horas, que fue el último punto de tiempo medido. Otras dos fosfoproteínas aguas abajo de AKT, glucógeno sintasa cinasa 3 alfa (GSK3a) y proteína ribosómica S⁶ , también aumentaron modestamente tras la activación de ICOS, pero los efectos no fueron tan robustos como los observados con fosfo-AKT. También se analizaron lisados proteicos usando una matriz de anticuerpos que mide la fosforilación o escisión de 18 proteínas implicadas en la señalización intracelular. Usando este enfoque, solo tres proteínas mostraron ligeros aumentos en la fosforilación tras la activación de ICOS: fosfo-AKT (S473), fosfo S⁶ (S235/236) y fosfo-SAPK/JNK (T183/Y185).

Para medir los cambios en la fosforilación de AKT usando un formato de ensayo que permitiría la cuantificación directa, se trataron células Ba/F3-ICOS con un intervalo de dosis de anticuerpo de control (IgG4 PE), anticuerpo IgG1 anti­ ICOS deshabilitado en Fc o H2L5 hIgG4PE a lo largo del tiempo y se monitorizaron por ELISA. El aumento de los niveles de fosfo-AKT (S473) fue tanto dependiente de la dosis como dependiente del tiempo en las células tratadas con anticuerpo IgG1 anti-ICOS deshabilitado en Fc o tratadas con H2L5 hIgG4PE. Tal como se observó anteriormente, la activación máxima de fosfo-AKT (S473) se produjo después de 1 hora de tratamiento. La señal de fósforo disminuyó ligeramente después de 2 horas y persistió hasta ⁶ horas, pero finalmente se perdió después de 24 horas. También se sometió a prueba en el presente documento un ELISA que mide los niveles de fosfo-AKT (T308), pero no pudo observarse una activación reproducible con este kit de ELISA.

DISCUSIÓN

La cascada de señalización de AKT puede activarse por tirosina cinasas receptoras, integrinas, receptores de células B y T, receptores de citocinas, receptores acoplados a proteína G y otros estímulos que inducen la producción de fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfatos (PIP3) por PI3K [Carnero, 2008]. Estos lípidos sirven como sitios de acoplamiento de la membrana plasmática para Akt y su activador aguas arriba PDK1. En la membrana, PDK1 fosforila AKT en Thr308 conduciendo a la activación parcial de Akt [Alessi, 1996]. La fosforilación de Akt en Ser473 por mTORC2 estimula la actividad enzimática completa [Sarbassov, 2005].

ICOS desempeña un papel clave en la función de las células T CD4+ reguladoras y efectoras activadas al promover la supervivencia, proliferación y memoria de células T. Debido a su papel en el mantenimiento de la activación de las células T y las funciones efectoras, la selección como diana de ICOS con un anticuerpo agonista podría ser un enfoque plausible para potenciar la inmunidad antitumoral. En este estudio, se observó que la activación de ICOS por H2L5 hIgG4PE provocó cambios en la fosforilación de AKT en células Ba/F3-ICOS. Posteriormente, también se fosforilaron proteínas aguas abajo de AKT, tales como GSK3a (un sustrato directo de AKT) y la proteína ribosómica S⁶. Estos datos son consecuentes con el trabajo realizado recientemente con este sistema modelo y están en línea con los datos publicados externamente [Fos, 2008].

Ejemplo 10: Efectos funcionales de H2L5 hIgG4PE soluble solo y en combinación con anticuerpo anti-PD1 y anti-CTLA-4 en ensayo de PBMC humanas

Preparación/preparaciones experimental(es)

Aislamiento de PBMC humanas primarias

Se obtuvo sangre reciente de donantes de sangre del GSK Health Center y se diluyó 1:1 con medio RPMI1640 al 10 % libre de rojo de fenol. Se estratificó la sangre diluida encima del medio de densidad en un tubo cónico de 50 ml Uni-Sep Max y se centrifugó a 400 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. Se extrajo cuidadosamente la capa mononuclear blanca resultante (capa leucoplaquetaria) a un nuevo tubo cónico de 50 ml a través de un filtro celular de 100 pM. Se añadió un volumen igual de medio RPMI1640 al 10 % libre de rojo de fenol a la capa leucoplaquetaria y se centrifugó a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se resuspendió el sedimento celular en 10 ml de disolución de lisis de glóbulos rojos (Sigma Aldrich) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las células una vez con medio y se centrifugó tal como se describió anteriormente. Se llevó el volumen a 40 ml con medio RPMI1640 al 10 % libre de rojo de fenol y se contaron las células usando un contador de células Vicell y un analizador de viabilidad (Beckman Coulter).

Inducción de células dendríticas inmaduras (iDC) derivadas de monocitos

Se aislaron monocitos humanos usando el método de adherencia a plástico. Brevemente, se cultivaron 20 millones de PBMC recién aisladas en un frasco de cultivo tisular T-75 en medio AIM-V (Thermo Fisher) durante 3 horas. Las células que no se unieron al plástico se eliminaron por lavado. Se cultivaron los monocitos adherentes en un incubador a 37 °C y el 5 % de CO² en medio AIM-V suplementado con 1000 U/ml de GM-CSF humano (n.° de cat. 300-03, PeproTech) y 500 U/ml de IL-4 humana (n.° de cat. 200-04). Después de 7-10 días, se recogieron las células iDC para el cocultivo con células T de un donante diferente en los ensayos de reacción de linfocitos mixtos alogénicos.

Aislamiento de células T humanas primarias directamente de la sangre

Se aislaron células T humanas directamente de sangre humana reciente usando un cóctel de enriquecimiento de células T humanas (Stem Cell Technologies). Se añadió el cóctel de enriquecimiento de células T humanas RosetteSep (50 pl/ml) a sangre completa y se mezcló bien. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió un volumen igual de PBS FBS al 2 % con mezclado suave. Se estratificó la muestra diluida encima del medio de densidad y se centrifugó durante ²⁰ minutos a ¹²⁰⁰ x g a temperatura ambiente con el freno desactivado. Las células enriquecidas de la superficie de contacto del medio de densidad:plasma se vertieron cuidadosamente en un tubo cónico nuevo. A continuación, se lisaron los glóbulos rojos con tampón de lisado de glóbulos rojos (Sigma Aldrich) y se lavaron las células enriquecidas con PBS FBS al 2 % dos veces. Entonces se resuspendieron las células T en 40 ml de PBS FBS al 2 % y se contaron con un contador de células Vi-Cell.

Protocolos experimentales

Ensayo de preestimulación de PBMC humanas

Se preestimularon PBMC humanas recién aisladas con el expansor de células T CD3/CD28 DynaBeads a una razón de perlas con respecto a células de 1:20 en un frasco de cultivo tisular T-75 en medio AIM-V suplementado con 100 ng/ml de MCSF y 100 Ul/ml de IL-2 (PeproTech) a 37 °C. Después de 48 horas, se retiraron magnéticametne las perlas de preestimulación y se lavaron las células, se contaron y se reestimularon con DynaBeads anti-CD3 y anticuerpos terapéuticos en medio AIM-V suplementado con 100 Ul/ml de IL-2 (PeproTech) en una placa de fondo redondo no tratada para cultivo tisular de 96 pocillos. La densidad de siempre fue de 100 k células por 100 pl de medio por pocillo. Después de incubar a 37 °C durante 3,5 días, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular para la medición de citocinas múltiplex mediante MSD.

Ensayo de activación de MLR humano

Se mezclaron iDC derivadas de monocitos de un voluntario humano sano a una razón 1:10 (iDC:T) con células T humanas recién aisladas de un donante diferente y se preincubaron a 37 °C en medio AIM-V en presencia de 0,02 pg/ml de una mezcla de péptidos CEFT durante 24 horas. Se añadieron diferentes grupos de anticuerpos de tratamiento directamente a los pocillos, se mezclaron y se incubaron adicionalmente durante 4 días adicionales. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular para la medición de citocinas múltiples mediante análisis de MSD.

Análisis de citocinas de MSD

Los niveles de citocinas IFN-^y , IL-10, IL-2 y TNF-^a en el sobrenadante de cultivo celular se determinaron usando kits personalizados V-Plex humanos de MSD. En primer lugar, se diluyeron las muestras 1:200 en diluyente 2. También se prepararon calibradores en diluyente 2 siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se añadieron las muestras y los calibradores diluidos a placas de MSD negras que se sellaron posteriormente con un sello de placas adhesivo y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 2 horas. Tras añadir 25 pl de la disolución de anticuerpos de detección, que se preparó de manera reciente en diluyente ² a cada pocillo, la placa volvió a sellarse y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante otras 2 horas. Se lavaron las placas 3 veces con 150 pl/pocillo de PBS más Tween-20 al 0,05 % antes de añadir 150 pl/pocillo de tampón de lectura 2x recién diluido y se leyeron inmediatamente en un lector MESO QuickPlex. Se analizaron los datos usando el software MSD Workbench.

Análisis de datos

MSD análisis de datos

Se analizaron los datos de MSD con el software Discovery Workbench (MSD, versión 4.0.9). Se incluyeron los calibradores del kit del fabricante en cada placa de MSD para generar curvas patrón específicas de placa con un valor de R² por encima de 0,99 en todos los casos. Las cantidades de citocinas detectadas se calcularon de nuevo basándose en la curva patrón y se usaron la media y desviación estándar de tres réplicas biológicas para generar los gráficos.

Análisis estadístico

Se realizó ANOVA de una vía sobre los datos transformados logarítmicamente, de cambio en veces sobre el propio control de isotipo de cada anticuerpo de tratamiento. Se realizó una prueba de comparaciones múltiples de Dunnett para comparar ambas monoterapias frente a la combinación a través de diferentes donantes. P<0,05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS

Desarrollo del ensayo de preestimulación de PBMC y prueba de actividad combinatoria de H2L5 hIgG4PE con ipilimumab y pembrolizumab.

Con el fin de determinar las condiciones óptimas para la preestimulación, se analizaron Dynabeads anti-CD3 y Dynabeads anti-CD3/CD28 humanas (Thermo Fisher) a diferentes razones de perlas con respecto a células. Después de 48 horas de preestimulación, se recogieron las células y se retiraron las perlas magnéticamente antes de la estimulación con Dynabeads anti-CD3 (razón de perlas con respecto a células = 1:1) junto con anticuerpo anti-ICOS solo o en combinación con anti-CTLA-4 o anti-PD1. El tratamiento de un solo agente con H2L5 hIgG4PE dio como resultado la inducción de IFN-g en comparación con el control de isotipo en todas las condiciones de preestimulación sometidas a prueba. La magnitud de IFN-g inducido por H2L5 hIgG4PE se correlacionó inversamente con la fuerza de la preestimulación. La combinación de H2L5 hIgG4PE junto con ipilimumab demostró una producción de citocinas potenciada en comparación con o bien H2L5 HIGG4PE o bien ipilimumab solo en PBMC que se preestimularon débilmente. El efecto de la combinación se perdió en condiciones de preestimulación con anti-CD3/anti-CD28 unido a la placa, lo que se considera una condición de preestimulación más fuerte. Basándose en estos resultados, se eligió la condición de preestimulación usando perlas anti-CD3/anti-CD28 a una razón de perlas con respecto a células de 1:20 para todos los futuros ensayos de PBMC. Los resultados de cuatro donantes individuales se resumen para la combinación de anti-CTLA-4 en la figura 16 y la combinación con anti-PD-1 en la figura 17.

H2L5 hIgG4PE da como resultado una inducción de citocinas dependiente de la dosis en un ensayo de preestimulación de PBMC

La actividad dependiente de la dosis de H2L5 hIgG4PE se evaluó en PBMC humanas preestimuladas con perlas anti-CD3/anti-CD28 a una razón predeterminada de perlas con respecto a células de 1:20. El IgG4PE anti-RSV y 422.2 IgG1 anti-ICOS deshabilitado en Fc se incluyeron como controles. Se sometieron a prueba ocho concentraciones de H2L5 HIGG4PE (100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 y 0,03 mg/ml). MSD evaluó IFN-g, IL-10 y TNF-a en los sobrenadantes de cultivo tisular de muestras de PBMC. H2L5 hIgG4PE, pero no el control de isotipo de IgG4 o 422.2 deshabilitado en Fc, indujo la producción de IFN-g, IL-10 y TNF-a de una manera dependiente de la dosis. Estos resultados se usaron para determinar la concentración de H² L⁵ hIgG4PE que va a usarse en estudios de combinación.

Desarrollo del ensayo de MLR humano

En un esfuerzo por optimizar un ensayo de MLR humano, además del cocultivo de células T humanas y DC inmaduras derivadas de monocitos de un donante diferente, también se añadieron perlas anti-CD3 a los pocillos para proporcionar un estímulo de TCR basal para ayudar a sensibilizar las células. Los resultados demostraron que las perlas anti-CD3 aumentaron enormemente el intervalo de inducción de IFN-g. Aunque ipilimumab solo puede inducir la producción de IFN-g en ausencia de perlas anti-CD3, H2L5 hIgG4PE solo o la combinación de H2L5 HIGG4PE/ipilimumab solo mostró una producción de IFN-g potenciada con respecto a los controles correspondientes en presencia de perlas anti-CD3.

Actividad combinatoria de H2L5 HIGG4PE e ipilimumab en un ensayo de MLR humano

La actividad inmunoestimuladora de H2L5 hIgG4PE solo o en combinación con ipilimumab se sometió a prueba en un ensayo de MLR humano alogénico en el que las células T que se preincubaron con DC inmaduras derivadas de monocitos de un donante no coincidente en presencia de péptidos CEFT 0,02 mg/ml durante 1 día. La combinación de H2L5 hIgG4PE/ipilimumab dio como resultado una potenciación significativa en la producción de IFN-g en comparación con cualquier agente solo. Los resultados fueron consecuentes en los tres pares de donantes sometidos a prueba; sin embargo, se observó una variabilidad modesta entre los donantes (figura 18).

Actividad combinatoria de H2L5 hIgG4PE y pembrolizumab en un ensayo de MLR humano

La combinación de H2L5 hIgG4PE y pembrolizumab también se sometió a prueba en el ensayo de MLR alogénico humano descrito anteriormente. H2L5 hIg G4PE se sometió a prueba solo y en combinación con pembrolizumab a 10 mg/ml. La combinación de H2L5 hIg G4PE y pembrolizumab dio como resultado un aumento de IFN-g en comparación con cualquier agente solo. Sin embargo, no se alcanzó la significación estadística debido a la alta variabilidad de donantes y la actividad significativa del tratamiento con anti-PD-1 de un solo agente en algunos donantes (figura 19).

DISCUSIÓN

ICOS es un receptor coestimulador que se expresa débilmente en las células T sin tratamiento y se regula por incremento rápidamente en células T CD4+ y CD8+ activadas. El ligando de ICOS es ICOS-L (B7h, B7RP-1, CD275), que se expresa por APC profesionales y en células endoteliales y epiteliales periféricas después de la estimulación con TNF-a. La ruta de ICOS:ICOS-L proporciona una señal coestimuladora clave para la proliferación y función de las células T. Debido a su papel en el mantenimiento de las funciones efectoras y la activación de células T, la selección como diana de ICOS por parte de anticuerpos agonistas podría ser un enfoque plausible para potenciar la inmunidad antitumoral.

Los estudios han demostrado un aumento en la frecuencia de células T efectoras CD4+ ICOShi tras el bloqueo de CTLA-4 por ipilimumab en varios modelos de cáncer. Además, tras el bloqueo de CTLA-4, esta población celular produjo mayores niveles de INF-g que células T CD4+ ICOSl(\ De hecho, el aumento en la frecuencia de células T CD4 ICOS+ se ha identificado como un biomarcador farmacodinámico del tratamiento con ipilimumab en pacientes con cáncer. Estudios, en ratones C57BL/6 de tipo natural, demostraron un rechazo tumoral del 80 al 90 % después de la terapia de bloqueo de CTLA-4; sin embargo, en ratones deficientes en ICOS o ICOSL, la eficacia disminuyó hasta menos del 50 %. El importante papel desempeñado por ICOS en la eficacia del bloqueo de CLTA-4 sugiere que la estimulación de la ruta de ICOS durante la terapia anti-CTLA-4 podría aumentar la eficacia terapéutica. Por tanto, se propuso evaluar la actividad de combinación de H2L5 hIgG4PE e ipilimumab.

En el año 2000, se notificó que la muerte celular programada-1 (PD-1) era otra molécula de punto de control inmunitario. La expresión de PD-L1 (B7-H1), que es uno de los ligandos de PD-1, puede encontrarse en muchos tipos de células incluyendo células T, células epiteliales, células endoteliales y células tumorales. Anticuerpos que seleccionan como diana el eje PD-1/PD-L1 también han mostrado respuestas clínicas en múltiples tipos de tumores. La FDA aprobó recientemente pembrolizumab y nivolumab como bloqueantes de puntos de control inmunitarios de segunda generación para el tratamiento del cáncer. Se demostró que pembrolizumab de Merck conduce a tasas de respuesta de ~37 al 38 % en pacientes con melanoma avanzado, notificando un estudio posterior una tasa de respuesta global del 26 % en pacientes que tenían enfermedad progresiva después del tratamiento previo con ipilimumab. Nivolumab, el anticuerpo anti-PD-1 de BMS, también mostró un beneficio clínico en pacientes con melanoma metastásico con una tasa de respuesta del 40 % y una tasa de supervivencia global del 72,9 % a 1 año. Además, la FDA también aprobó nivolumab para el cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado o metastásico. A medida que los anticuerpos de bloqueo del punto de control de PD-1 se conviertan en la inmunoterapia contra el cáncer dominante en la práctica clínica, será importante evaluar H2L5 hIgG4PE en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 para determinar su actividad antitumoral combinada.

Anteriormente, se desarrolló y se usó un ensayo de activación de PBMC para evaluar la actividad de estimulación de células T de un panel de anticuerpos agonistas anti-ICOS. Los datos generados a partir de esos estudios respaldaron la selección de candidatos del clon 422.2 con un isotipo de IgG4PE como H2L5 hIgG4PE. En el ensayo previo, las células PBMC se preestimularon con anticuerpo anti-CD3 unido a la placa a 1 mg/ml y anticuerpo anti-CD28 a 3 mg/ml durante 48 horas antes de que se recogieran y se reestimularan con anticuerpos anti-CD3 y frente a ICOS solubles que estaban investigándose. Se demostró que H2L5 hIgG4PE induce la producción de IFN-g de manera dependiente de la dosis. Con el fin de determinar las condiciones óptimas para la preestimulación, se sometieron a prueba Dynabeads anti-CD3 y Dynabeads anti-CD3/CD28 humanos (Thermo Fisher) a diferentes razones de perlas con respecto a células. La estimulación mediante perlas se considera más fisiológica y la fuerza de la estimulación puede controlarse más fácilmente construyendo diferentes razones de perlas con respecto a células. Después de 48 horas de preestimulación, se recogieron las células y se retiraron las perlas magnéticamente antes de la estimulación con Dynabeads anti-CD3 (razón de perlas con respecto a células = 1:1) junto con anticuerpo anti-ICOS solo o en combinación con anti-CTLA-4. Los resultados mostraron que el tratamiento de un solo agente con H2L5 hIgG4PE dio como resultado la inducción de IFN-g en relación con el control de isotipo en todas las condiciones de preestimulación sometidas a prueba. La magnitud de IFN-g inducido por H2L5 hIgG4PE se correlacionó inversamente con la fuerza de la estimulación previa. La combinación de H2L5 hIgG4PE junto con ipilimumab demostró una producción de citocinas potenciada en comparación con o bien H2L5 hIgG4PE o bien ipilimumab solo en PBMC que se preestimularon débilmente. El efecto de la combinación se perdió en condiciones de preestimulación con anti-CD3/anti-CD28 unido a la placa, lo que se considera una condición de preestimulación más fuerte. Basándose en estos resultados, se eligió la condición de preestimulación usando anti-CD3/anti-CD28 a una razón de perlas con respecto a células de 1:20 para todos los futuros ensayos de PBMC. La combinación de H2L5 hIgG4PE e ipilimumab demostró un aumento estadísticamente significativo en la producción de IFN-g en comparación con cualquiera de los tratamientos con anticuerpos solos.

En el esfuerzo de optimización del ensayo, con una razón de perlas de estimulación anti-CD3/anti-CD28 con respecto a células fijada en ¹ :^{2 0} , las perlas anti-CD3 usadas durante la etapa de reestimulación se titularon hacia abajo desde razones de perlas con respecto a células de 1:1 a 1:3 y 1:10. Los resultados mostraron que cuanto menor era la fuerza de reestimulación, menor era la inducción de IFN-g por parte de H2L5 hIgG4PE. El efecto de combinación por H2L5 hIgG4PE e ipilimumab se perdió totalmente con la reestimulación a una razón de perlas con respecto a células de 1:3 y 1:10. Por tanto, la razón de perlas anti-CD3 de reestimulación con respecto a células de 1:1 se mantuvo para todos los experimentos futuros.

Con las condiciones de preestimulación y reestimulación optimizadas, se usó este ensayo para evaluar la respuesta a la dosis de H2L5 hIgG4PE. Se sometió a prueba un total de ⁸ concentraciones de anticuerpos, que fueron 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 y 0,03 mg/ml. El IgG4PE anti-RSV y el 422.2 IgG1 anti-ICOS deshabilitado en Fc, la versión deshabilitada en Fc de H2L5 hIgG4PE, se usaron como controles. Los resultados mostraron que H2L5 hIgG4PE, pero no el control de isotipo de IgG4 o 422.2 deshabilitado en Fc, indujo la producción de IFN-g, IL-10 y TNF-a de una manera dependiente de la dosis. Es interesante que la versión deshabilitada en Fc de H2L5 hIg G4PE mostró una respuesta de inducción de citocinas limitada, lo que indica que el acoplamiento del receptor de Fc es crucial para la función agonizante de células T de H2L5 hIg G4PE. Estos resultados también se usaron para determinar la dosis de H2L5 hIg G4PE para estudios de combinación.

También se desarrolló un ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR) para evaluar el efecto combinado de H2L5 hIg G4PE y anticuerpos bloqueantes de puntos de control. El ensayo de MLR es un ensayo ex vivo de inmunidad celular en el que se mezclaron células dendríticas inmaduras (iDC) derivadas de monocitos primarios con células T aisladas de un donante diferente. El desapareamiento de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de las células iDC puede iniciar la estimulación de las células T en un entorno alogénico. En la práctica clínica, se sabe bien que el ensayo de MLR identifica la compatibilidad de trasplantes de tejido entre donantes y receptores.

Con el fin de desarrollar el ensayo de MLR, se cultivaron monocitos humanos recientes en medio suplementado con GM-CSF recombinante humano e IL-4 durante una semana para inducir un fenotipo de DC inmaduro. Luego se aislaron células T humanas recientes de un donante diferente y se mezclaron con las células iDC a una razón de 10:1 (T:iDC). Se añadieron tratamientos de combinación o monoterapia con H2L5 hIg G4PE e ipilimumab al cocultivo de células T/iDC en presencia o ausencia de perlas anti-CD3. El propósito de las perlas anti-CD3 era proporcionar un estímulo de TCR basal para ayudar a sensibilizar las células T. Los resultados mostraron que las perlas anti-CD3 aumentaron enormemente el intervalo de inducción de IFN-g en el ensayo. Aunque ipilimumab solo puede inducir la producción de IFN-g en ausencia de perlas anti-CD3, H2L5 hIgG4PE solo o la combinación de H2L5 hIgG4PE/ipilimumab mostró una producción de IFN-g potenciada con respecto a los controles correspondientes en presencia de microesferas anti-CD3. Este resultado sugiere que, en este ensayo, el estímulo de TCR por parte de células DC solas puede no ser suficiente para inducir la expresión de ICOS en la superficie de células T en reposo que se aislaron de manera reciente de las PBMC. Con el fin de mejorar la situación, se añadió una etapa de preincubación de iDC y células T de 24 horas antes de la adición de anticuerpos terapéuticos. La mezcla de péptidos CEFT también se añadió al procedimiento de ensayo para sensibilidad mejor las células T y provocar una respuesta específica de antígeno. El conjunto de péptidos CEFT consiste en 27 péptidos seleccionados de epítopos de células T restringidos por HLA de clase I y II definidos de citomegalovirus humano (HHV-5; CMV), virus de Epstein-Barr (HHV-4; VEB), influenza A y Clostridium tetani. Considerando la alta frecuencia de vacunación contra influenza y Clostridium tetani y la alta prevalencia de CMV y EBV en la población general, se esperaban respuestas de recuerdo de antígeno para la mayoría de las muestras humanas. Los resultados mostraron que se observó una producción de IFN-g potenciada cuando las células T se preincubaron con células iDC durante 24 horas, y la producción de IFN-g aumentó adicionalmente cuando se añadieron péptidos CEFT al sistema de cocultivo. La actividad inmunoestimuladora de H2L5 hIgG4PE solo o en combinación con ipilimumab se sometió a prueba en el ensayo de MLR humano alogénico en el que las células T que se preincubaron con DC inmaduras derivadas de monocitos de un donante no coincidente en presencia de péptidos CEFT 0,02 mg/ml durante 1 día. La combinación de H2L5 hIgG4PE/ipilimumab dio como resultado una potenciación significativa en la producción de IFN-g en comparación con cualquier agente solo. Los resultados fueron consecuentes en los tres pares de donantes sometidos a prueba; sin embargo, se observó una variabilidad modesta entre los donantes.

De manera similar, la combinación de H2L5 hIgG4PE y pembrolizumab también se sometió a prueba en el ensayo de MLR alogénico humano descrito anteriormente. H2L5 hIgG4PE se sometió a prueba solo y en combinación con pembrolizumab a 10 mg/ml. La combinación de H2L5 hIgG4PE y pembrolizumab dio como resultado un aumento de IFN-g en comparación con cualquier agente solo. Sin embargo, no se alcanzó la significación estadística debido a la alta variabilidad de donantes y la actividad significativa del tratamiento con anti-PD-1 de un solo agente en algunos donantes.

En resumen, estos estudios demostraron la actividad de combinación superior de H2L5 hIgG4PE con dos inhibidores de puntos de control aprobados por la FDA, ipilimumab y pembrolizumab, en comparación con monoterapias en dos ensayos basados en células inmunitarias humanas. En los estudios informados en el presente documento, se demostró que H2L5 hIgG4PE promueve la activación de células T y el sesgo de Th1 (por ejemplo, producción de IFN-g) que es característico de respuestas inmunitarias antitumorales productivas.

Ejemplo 11: Actividad funcional de H2L5 hIgG4PE solo y en combinación con anticuerpos anti-PD1 y anti-CTLA-4 in vivo

Modelo de tum or de ratón de PBMC humanas

MÉTODOS

Preparaciones experimentales

Todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de GSK antes del inicio del protocolo de los estudios.

Preparación de líneas celulares:

Se propagaron A2058 según el protocolo de la ATCC.

Materiales:

• Línea celular de melanoma humano A2058: ATCC, n.° de cat. CRL-11147, n.° de lote 59349362

• DPBS: ATCC, n.° de cat. 30-2200, n.° de lote 63357436

• Medio de Eagle modificado por Dulbecco: ATCC, n.° de cat. 30-2002, n.° de lote 62596471, caducidad:

octubre de 2015

• Suero bovino fetal: Sigma-Aldrich, n.° de cat. 12176c-1000ml, n.° de lote 13G180R0H1, caducidad: julio de 2018

• Tripsina al 0,25 % (p/v) - EDTA 0,53 mM: ATCC, n.° de cat. 30-2102, n.° de lote 62420300

• Antibiótico antimicótico (100X): Life Technologies, n.° de cat. 15240-062

• Frasco de cultivo celular T175 : Greiner bio-one, n.° de cat. 661175

• Frasco de cultivo celular T75: Greiner bio-one, n.° de cat. 658175

Medio:

• Medio de crecimiento completo de A2058: Medio de Eagle modificado por Dulbecco FBS al 10 %.

Condiciones de cultivo: Atmósfera: aire, 95 %; 5 % de dióxido de carbono (CO2); temperatura: 37 °C • Tras la recepción de las células:

• Precalentar el medio completo a 37 °C.

• Descongelar las células rápidamente en un baño de agua a 37 °C. Limpiar el tubo con etanol al 70 % y transferir las células a un tubo de 15 ml lleno de medio completo precalentado.

• Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos para recoger el sedimento celular.

• Añadir las células de nuevo a un frasco T75 lleno de medio completo precalentado e incubar a 37 °C. Subcultivo de las células:

• Los volúmenes se dan para un frasco de 75 cm2 (para el frasco de T175 cm2, ajustar la cantidad de medio de cultivo y disociación necesarios proporcionalmente).

• Retirar y desechar el medio de cultivo.

• Enjuagar brevemente la capa de células con DPBS para eliminar todas las trazas de suero que contiene inhibidor de tripsina.

• Añadir de 2,0 a 3,0 ml de disolución de tripsina-EDTA al frasco y observar las células bajo un microscopio invertido hasta que la capa de células se dispersa (2-3 minutos).

• Nota: Para evitar la formación de grumos, no agitar las células golpeando o agitando el frasco mientras se espera que las células se desprendan. Las células que son difíciles de desprender pueden colocarse a 37 °C para facilitar la dispersión.

• Añadir 10 ml de medio de crecimiento completo y aspirar las células pipeteando suavemente.

• Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos para recoger el sedimento celular, añadir 10 ml de medio de crecimiento completo

• Añadir alícuotas apropiadas de la suspensión celular nuevos recipientes de cultivo. Incubar los cultivos a 37 °C.

• Renovación del medio: Cada de 2 a 3 días

Preparación de células tumorales para su inoculación en ratones:

• Lavar las células con 1X DPBS, añadir 3 ml de 1X tripsina durante 2-3 minutos.

• Añadir medio de crecimiento completo y recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga cónico estéril en la campana de cultivo tisular.

• Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 minutos para obtener el sedimento celular.

• Lavar las células con disolución de 1X DPBS, centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos para obtener el sedimento celular. Repetir el lavado 2 veces.

• Contar las células mediante un hemocitómetro para determinar el número de células y la viabilidad.

• Resuspender las células en PBS enfriado con hielo a concentraciones para la inoculación in vivo (A2058, 2,5 e7/ml, 2,5 e6/100 pl/ratón).

Inoculación de la línea celular tumoral en ratones NSG

Materiales:

• Ratón: NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wjl/SzJ. Reserva de The Jackson Laboratory: 005557 hembra, edad: 6 semanas

• Jeringas de tuberculina de 1 ml con aguja acoplada de 25 G 5/8: Becton Dickinson, n.° de cat. 305554 • Almohadillas de preparación con alcohol PDI™: Professional Disposables, n.° de cat. B339

• Almohadilla de preparación con povidona yodada PDI™: Professional Disposables, n.° de cat. B40600 • Preparación de los ratones

• Ratones deben tener 6 semanas de edad.

• Permitir un periodo de aclimatación de 3-5 días después de la llegada de los ratones.

• Afeitar el costado trasero derecho de los ratones

Preparación de la inyección

• Limpiar y esterilizar el área de inoculación de los ratones con yodo seguido por la almohadilla con etanol • Usar una jeringa de 1 cc y una aguja de calibre 25

• Sacar el émbolo, mezclar las células y añadir 100 pl de células en la parte posterior de la jeringa, insertar cuidadosamente el émbolo.

• Inyectar las células por vía subcutánea (s.c.) en el costado trasero derecho del ratón.

• Evaluación del crecimiento tumoral

• Para medir un tumor, humedecer el pelaje con etanol al 70 % para que sea más fácil encontrar los márgenes del tumor.

Medir el tamaño tumoral y el peso corporal cada 2-3 días.

• El tamaño tumoral se mide con un calibre digital, y el volumen se determina tal como sigue: Volumen tumoral (mm3) = (longitud) x (anchura)2/2

• Administración intravenosa de PBMC humanas

• La administración de PBMC humanas puede comenzar 1 semana después de que los tumores hayan alcanzado un volumen promedio de aproximadamente 100 mm3.

Materiales:

• PBMC humanas recientes: Allcells, n.° de cat. C-PB102-3B2

• Jeringas de tuberculina de 1 ml con aguja acoplada de 25 G 5/8: Becton Dickinson, n.° de cat. 305554 • Almohadillas de preparación con alcohol PDI™: Professional Disposables, n.° de cat. B339

• Almohadilla de preparación con povidona yodada PDI™: Professional Disposables, n.° de cat. B40600 • Esponjas de gasa: Covidien, n.° de cat. 441211

• Restringidor del iluminador de la cola de ratón: Braintree scientific, n.° de cat. MTI STD

• Preparación de PBMC

• Se adquieren PBMC humanas recientes de Allcells por envío durante la noche.

• Centrifugar las células a 1400 rpm durante 5 minutos para obtener el sedimento celular.

• Lavar las células con disolución de 1X DPBS, centrifugar a 1400 rpm durante 5 minutos para obtener el sedimento celular.

• Resuspender las células en PBS enfriado con hielo a concentraciones para la inyección in vivo (20 e7/ml).

• Usar una jeringa de 1 cc y una aguja de calibre 25.

• Sacar el émbolo, mezclar las células y añadir 100 gl de células en la parte posterior de la jeringa, insertar cuidadosamente el émbolo.

• Mantener las células en hielo.

• Inyección en la vena de la cola

• Calentar los ratones con una lámpara incandescente durante 5 minutos

• Restringir los ratones con el restringidor del iluminador de la cola.

• Girar la cola ligeramente para visualizar la vena.

• Limpiar y esterilizar el sitio de inyección con yodo seguido por la almohadilla con etanol

• Injertar la aguja en la vena con un ligero ángulo e inyectar las células.

• Retirar la aguja y aplicar compresión suave con esponjas de gasa hasta que se haya detenido la hemorragia.

• Devolver a los animales a su jaula y observar durante 5-10 minutos para asegurarse de que no se haya reanudado la hemorragia.

Administración de anticuerpos terapéuticos

• 1-3 días tras la inyección de PBMC humanas, se administraron a los ratones anticuerpos mediante inyección intraperitoneal.

Materiales:

• Control de isotipo de IgG1 completamente humano: Eureka therapeutics, n.° de cat. ET-901 (calidad preclínica), n.° de lote 15-726, caducidad: febrero de 2017

• Ipilimumab (Yervoy): Bristol-Myers Squibb NDC 0003-2327-11, n.° de lote 921873, caducidad: abril de 2015;

n.° de lote 4H69490, caducidad: mayo de 2016

• Control de isotipo de IgG4 completamente humano: Eureka therapeutics, n.° de cat. ET-904 (calidad preclínica), n.° de lote 15-726, caducidad: febrero de 2017

• H2L5 hIgG4PE anti-ICOS humano

• Pembrolizumab (Keytruda): Merck, NDC 0006-3026-02, n.° de lote L010592, caducidad: 26 de abril de 2016 • Inyección intraperitoneal:

• Extraer, en la jeringa y la aguja, 100 pl de lo que va a administrarse.

• Alinear el bisel de la aguja con los números en la jeringa.

• Restringir suficientemente el animal con la mano no dominante.

• Punto de entrada de la aguja: Dibujar una línea imaginaria a través del abdomen justo por encima de las rodillas, la aguja se insertará a lo largo de esta línea en el lado derecho del animal y cerca de la línea media. Puesto que es una hembra, puede observarse que el punto de entrada es craneal y ligeramente medial respecto al último pezón.

• Inclinar el ratón con su cabeza ligeramente hacia el suelo de modo que su cabeza quede más baja que su extremidad trasera.

• Insertar la aguja en el abdomen a aproximadamente un ángulo de 30 grados.

• El eje de la aguja debe entrar hasta una profundidad de aproximadamente medio centímetro.

• Tras la inyección, retirar la aguja y devolver el ratón a su jaula.

• Toma de muestras de sangre y tumor

• Materiales:

• Microvette CB300 (suero): Braintree Scientific, n.° de cat. MV-CB30016440

• Microvette CB300 (hematología/EDTA de potasio): Braintree Scientific, n.° de cat. MV-CB30016444

• Sangre:

• Se extrajo sangre de la vena de la cola de los ratones una vez a la semana.

• Se recogieron 30 pl de sangre en Microvette CB300 (hematología/EDTA de potasio) para el análisis de citometría de flujo.

• Se recogieron otros 30 pl de sangre en Microvette CB300 de suero y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente para permitir la coagulación, seguido por centrifugación a 2000 x g con el fin de recoger el suero. Se almacenó el suero a -20 hasta su análisis adicional.

Tumor:

• Se sacrificó a los ratones cuando el tamaño tumoral alcanzó 2000 mm3. Se recogieron los tumores y se procesaron en el siguiente procedimiento.

Diseño experimental

Todos los estudios se prepararon según los procedimientos enumerados anteriormente.

Respuesta a la dosis de H2L5 hIgG4PE

Este estudio se diseñó para determinar la actividad dependiente de la dosis de H2L5 hIgG4PE en ratones NSG con injerto de PBMC humanas en los que se implantaron tumores de melanoma A2058. Nueve grupos con 10 ratones por grupo y 1 grupo de control (tumor solo sin PBMC) con 7 ratones se asignaron a cada estudio. En la tabla 11 se presenta un resumen del régimen de tratamiento para la respuesta a la dosis usando PBMC humanas del donante n.° 7129. Se dosificó H2L5 hIgG4PE a 0,04, 0,4, 1,2 y 4 mg/kg. Se dosificó ipilimumab a 3 mg/kg y se sometió a prueba una variante deshabilitada en Fc del agonista anti-ICOS a 1 mg/kg. Se evaluaron los grupos de prueba en relación con el vehículo y grupos de control de isotipo coincidente. El análisis de supervivencia concluyó el día 49 a la terminación del estudio.

Tabla 11: Resumen del régimen de tratamiento para la respuesta a la dosis de H2L5 hIgG4PE en ratones

Estudio de eficacia y actividad farmacodinámica (PD) con H2L5 hhG4PE en combinación con ipilimumab y pembrolizumab

Objetivos del estudio:

Evaluar la actividad antitumoral de la monoterapia con H2L5 hIgG4PE dosificado a 0,04 mg/kg y 0,4 mg/kg.

Evaluar la actividad antitumoral de H2L5 hIgG4PE dosificado en combinación con ipilimumab o pembrolizumab con controles de isotipo coincidentes.

Recogida de tejido para estudio de actividad farmacodinámica futura de H2L5 hIgG4PE. Un total de 22 grupos de tratamiento con 10 ratones por grupo se asignaron a este estudio. Los grupos 1-16 fueron las cohortes de eficacia y 17-22 fueron las cohortes de actividad farmacodinámica.

Para los tratamientos de combinación, se dosificaron H2L5 hIgG4PE (0,04 o 0,4 mg/kg) e ipilimumab o IgG1 (3 mg/kg) o H2L5 hIgG4PE (0,04 o 0,4 mg/kg) y pembrolizumab o IgG4 (5 mg/kg). Se dosificaron H2L5 hIgG4PE e ipilimumab así como los controles de isotipo coincidente dos veces a la semana durante 6 dosis, se dosificaron pembrolizumab y el control de isotipo cada 5 días hasta el final de la dosis de H2L5 hIgG4PE. Para las cohortes de recogida de tejido para farmacodinámica, se dosificó H2L5 hIgG4PE a 0,004, 0,04, 0,4 y 1,2 mg/kg. Los grupos de tratamiento se evaluaron en relación con los grupos de vehículo y de control de isotipo. Los grupos de tratamiento para el vehículo, los isotipos y H2L5 hIgG4PE solo y en combinación con ipilimumab y pembrolizumab usando PBMc humanas del número de donante n.° 6711 se muestran en la tabla 12. El análisis concluyó el día 59 a la terminación del estudio.

Tabla 12: Grupos de tratamiento de ratones en el modelo de tum or de melanoma A2058

Tabla 12: Grupos de tratamiento de ratones en el modelo de tum or de melanoma A2058

Estudio de eficacia que evalúa H2L5 hIgG4PE dosificado en combinación con ipilimumab o pembrolizumab

Este estudio se diseñó para evaluar la eficacia antitumoral de H2L5 hIgG4PE (dosificado a 0,01 y 0,04 mg/kg) en combinación con ipilimumab o pembrolizumab con controles de isotipo coincidente en el ratón n Sg con injerto de PBMC humanas usando el modelo de tumor de melanoma A2058. Un total de 13 grupos con 10 ratones por grupo se asignaron al estudio. El grupo 2 era el control de isotipo combinado de IgG 1 e IgG4 humanizadas. Se dosificó H2L5 hIgG4PE a 0,01 mg/kg (grupo 12) y 0,04 mg/kg (grupo 13) como agente individual. Para los tratamientos de combinación, se dosificaron H2L5 hIgG4PE (0,01 y 0,04 mg/kg) e ipilimumab o IgG 1 (3 mg/kg) o H2L5 hIgG4PE (0,01 y 0,04 mg/kg) y pembrolizumab o IgG4 (5 mg/kg). H2L5 hIgG4PE e ipilimumab así como los controles de isotipo coincidente se dosificaron dos veces a la semana durante 6 dosis, pembrolizumab y el control de isotipo se dosificaron cada 5 días hasta el final de la dosis de H2L5 hIgG4PE. En la tabla 13 se presenta un resumen de los grupos de tratamiento, usando PBMC humanas del donante n.° 4568. Los grupos de tratamiento se evaluaron en relación con los grupos de vehículo y de control de isotipo. El análisis de supervivencia se concluyó el día 33 a la terminación del estudio.

Tabla 13: Grupos de tratamiento de ratones en el modelo de tum or de melanoma A2058

Análisis estadístico

El evento para el análisis de supervivencia fue un volumen tumoral >2000 mm3, ulceración del tumor, pérdida de peso corporal del ratón >20 %, moribundo o hallado muerto, lo que ocurriera primero. El tiempo exacto hasta el volumen de corte se estimó ajustando una línea lineal entre el logaritmo del volumen tumoral y el día de dos observaciones, la primera observación que superó el volumen de corte y la observación que precedió inmediatamente al volumen de corte. Se llevó a cabo el método de Kaplan-Meier (KM) para estimar la probabilidad de supervivencia de diferentes grupos de tratamiento en un momento dado. Se notificó la mediana del tiempo hasta el criterio de valoración y su correspondiente intervalo de confianza del 95%. Si las curvas de supervivencia de KM son o no estadísticamente diferentes entre dos grupos cualquiera, se sometió entonces a prueba mediante la prueba de rangos logarítmicos.

Los datos de volumen tumoral desde el último día en el que había 10 animales por grupo (es decir, antes de que se sacrificara cualquier animal) se utilizaron para hacer comparaciones del volumen tumoral entre los diferentes grupos de tratamiento. Antes del análisis, el volumen del tumor se transformó logarítmicamente de manera natural debido a la desigualdad de la varianza en los diferentes grupos de tratamiento. Luego se llevó a cabo ANOVA seguido por una comparación por parejas en los datos transformados logarítmicamente.

Se usó el software Graphpad Prism para representar gráficamente los datos de crecimiento tumoral y de peso corporal.

RESULTADOS

Respuesta a la dosis de H2L5 hIgG4PE (figura 20A)

Inhibición del crecim iento tumoral:

Grupo de control: Las PBMC humanas (donante 7129) no mostraron ningún efecto sobre el crecimiento del tumor A2058 en ratones NSG. Los ratones que llevaban tumor A2058 con o sin PBMC humanas, los ratones que llevaban tumor A2058 con PBMC humanas tratados con vehículo y anticuerpos de control de isotipo desarrollaron tumores que progresaron tal como se esperaba (grupo n.° 1 frente a grupo n.° 10, grupo n.° 1 frente a grupo n.° 2, grupo n.° 1 frente a grupo n.° 4, p=1).

El tratamiento con ipilimumab a 3 mg/kg (grupo n.° 3) demostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0,03) en comparación con el grupo n.° 1 de control del vehículo; sin embargo, se perdió la significación estadística (p<0,22) en comparación con el grupo n.° de control de isotipo 2. Esto indicó que el anticuerpo de isotipo puede afectar al crecimiento tumoral.

El tratamiento con H2L5 hIgG4PE a 0,4 mg/kg demostró una tendencia de inhibición del crecimiento tumoral y un aumento de la capacidad de supervivencia de los ratones en comparación con otras dosis, aunque los efectos no fueron estadísticamente significativos en comparación con o bien el vehículo o bien el control de isotipo.

Observaciones clínicas:

Se observó una pérdida de peso corporal en los ratones durante el estudio, que fue de aproximadamente un 20 % al final del estudio. Se ha notificado que tanto la GvHD como la carga tumoral pueden dar como resultado una caída del peso corporal de los ratones, aunque en este estudio la pérdida de peso corporal parecía estar más relacionada con el tumor A2058, ya que los ratones que llevaban tumores sin injerto de PBMC (grupo n.° 10) mostraron la misma tendencia. Se observó ulceración tumoral en múltiples tumores durante el estudio, incluyendo el grupo de control de isotipo.

Destinos de los ratones:

La mayoría de los ratones se sometieron a extirpación cuando los tumores alcanzaron volúmenes >2000 mm3. Tres ratones se sacrificaron debido a ulceración tumoral, y tres ratones se sacrificaron debido a una pérdida de peso corporal de >20%. Se encontraron nueve ratones muertos al azar en los grupos, incluyendo dos en el grupo de vehículo y tres en total en los grupos de control de isotipo. Estas muertes se atribuyeron a la susceptibilidad del modelo a un estado de enfermedad de injerto contra huésped, y no están relacionadas con el tratamiento, ya que no se observó ningún patrón con los grupos de tratamiento en comparación con los grupos de control de vehículo o de isotipo. Estudio de eficacia con H2L5 hIgG4PE en combinación con ipilimumab y pembrolizumab (figura 20B) Inhibición del crecim iento tumoral:

Grupo de control: Ratones que llevaban tumores A2058 con PBMC humanas tratados con vehículo o anticuerpos de control de isotipo desarrollaron tumores que crecieron tal como se esperaba.

Monoterapia

El tratamiento con ipilimumab a 3 mg/kg combinado con IgG4 (grupo n.° 3) dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0,04) en comparación con el grupo n.° 1 de control de vehículo. Sin embargo, en comparación con el grupo n.° 2 de control de isotipo, se perdió la significación estadística (p<0,23).

El tratamiento con pembrolizumab solo a 2,5 o 5 mg/kg (grupo n.° 13, 14) mostró una inhibición observable del crecimiento tumoral sin significación estadística en comparación con el grupo de control de vehículo o isotipo n.° 12. Pembrolizumab combinado con IgG 1 (grupo n.° 4) mostró una inhibición observable del crecimiento tumoral sin significación estadística, sin embargo, se observó un aumento significativo en la supervivencia (p<0,04) en comparación con el grupo n.° 1 de control de vehículo. Se perdió la significación estadística (p<0,4) cuando se comparó con el grupo n.° 2 de control de isotipo.

El tratamiento con H2L5 hIgG4PE solo a 0,4 mg/kg (grupo n.° 15) mostró una inhibición observable del crecimiento tumoral sin significación estadística en comparación con el grupo de control de vehículo o isotipo n.° 12. H2L5 hIgG4PE a 0,04 o 0,4 mg/kg combinado con IgG 1 (grupo n.° 5 y 6) mostró un retraso observable en la progresión del tumor y la supervivencia de los ratones, pero no alcanzó significación estadística.

Tratamiento combinado:

Combinación de H2L5 hIgG4PE (0,04 o 0,4 mg/kg) con ipilimumab (3 mg/kg). Los grupos n.° 8 y n.° 9 no mostraron inhibición adicional del crecimiento tumoral en comparación con ipilimumab solo (grupo n.° 3).

Combinación de H2L5 hIgG4PE (0,04 o 0,4 mg/kg) con pembrolizumab (5 mg/kg). Los grupos n.° 10 y n.° 11, demostraron una inhibición modesta pero insignificante del crecimiento tumoral y la supervivencia de los ratones en comparación con la monoterapia con pembrolizumab, grupo n.° 4, o la monoterapia con H2L5 hIgG4PE, grupos n.° 5 y n.° 6.

Observaciones clínicas:

La pérdida de peso corporal de los ratones observada durante el estudio fue de aproximadamente un 20 %. Fue evidente ulceración tumoral en múltiples tumores durante el estudio en la mayoría de los grupos.

Destinos de los ratones:

Un total de 100 de 160 ratones se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron > 2000 mm3.29 ratones se sacrificaron debido a ulceración tumoral, 18 ratones se encontraron muertos, 12 ratones se sacrificaron debido a una pérdida de peso corporal > 20% y un ratón se sacrificó ya que estaba moribundo. Se encontraron ratones muertos en todos los grupos, incluyendo el grupo de control de isotipo n.° 2. Estas muertes se atribuyeron a la susceptibilidad del modelo a un estado de enfermedad de injerto contra huésped y no están relacionadas con el tratamiento, ya que no se observó ningún patrón con los grupos de tratamiento en comparación con el grupo de control de isotipo.

Estudio de eficacia que evalúa H2L5 hIgG4PE dosificado en combinación con ipilimumab o pembrolizumab (figura 20C)

Retraso del crecim iento tumoral:

Grupo de control: Los ratones que llevaban tumores A2058 con PBMC humanas tratados con vehículo o anticuerpos de control de isotipo desarrollaron tumores que crecieron tal como se esperaba.

Monoterapia:

El tratamiento con ipilimumab a 3 mg/kg combinado con IgG4 (grupo n.° 3) demostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0,02) y un aumento significativo de la supervivencia (p<0,01) en comparación con el grupo n.° 1 de control de vehículo. Sin embargo, en comparación con el grupo de control de isotipo n.° 2, la inhibición del crecimiento tumoral no alcanzó significación (p<0,13), mientras que permanecía un aumento significativo en la supervivencia de los ratones (p<0,04).

El tratamiento con pembrolizumab a 5 mg/kg combinado con IgG 1 (grupo n.° 4) mostró una inhibición del crecimiento tumoral sin significación estadística en comparación con el grupo n.° 2 de control de isotipo o vehículo.

El tratamiento con H2L5 hIgG4PE solo a 0,01 mg/kg o 0,04 mg/kg (grupo n.° 12 y n.° 13) demostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0,03) en comparación con el grupo de control de vehículo n.° 1. H2L5 hIgG4PE dosificado a 0,04 mg/kg también mostró una aumento significativo en la supervivencia de los ratones (p<0,048) en comparación con el grupo de control de vehículo n.° 1. Sin embargo, en comparación con el grupo de control de isotipo n.° 2, la inhibición del crecimiento tumoral y la supervivencia no alcanzaron significación estadística para los grupos n.° 12 y n.° 13. H2L5 hIgG4PE a 0,01 mg/kg combinado con IgG1 (grupo n.° 5) mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0,03) y la supervivencia de ratones (p<0,03) en comparación con el grupo de control de vehículo n.° 1. Sin embargo, en comparación con el grupo de control de isotipo n.° 2, el retraso en el crecimiento tumoral y la supervivencia no alcanzaron significación estadística. H2L5 hIgG4PE a 0,04 mg/kg combinado con IgG1 (grupo n.° 6) mostró una inhibición observable del crecimiento tumoral y la supervivencia de los ratones, pero no alcanzó significación estadística.

Tratamiento de combinación:

La combinación de H2L5 hIgG4PE con ipilimumab (0,01 mg/kg más ipilimumab 3 mg/kg; grupo n.° 8) mostró una inhibición observable del crecimiento tumoral y la supervivencia de los ratones, pero no alcanzó significación estadística. La combinación de H2L5 hIgG4PE con ipilimumab (0,04 mg/kg más ipilimumab 3 mg/kg; grupo n.° 9) demostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0,00) y un aumento significativo en la supervivencia de los ratones (p<0,04) en comparación con el grupo de control de vehículo n.° 1 o grupo control de isotipo n.° 2 (p<0,02). Sin embargo, en comparación con el control de isotipo, la supervivencia no pudo alcanzar la significación estadística. La actividad de la combinación no alcanzó significación en comparación con el grupo n.° 3 de monoterapia de ipilimumab o los grupos de monoterapia de H2L5 hIgG4PE.

La combinación de H2L5 hIgG4PE (0,01 mg/kg o 0,04 mg/kg) con pembrolizumab (5 mg/kg), grupos n.° 10 y n.° 11, mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p< 0,03) y se observó un aumento significativo de la supervivencia de los ratones (p<0,03) en comparación con el grupo de control de vehículo n.° 1. En comparación con el grupo de control de isotipo n.° 2, la significación de la inhibición del crecimiento tumoral se mantuvo en la combinación de H2L5 hIgG4PE 0,04 mg/kg con pembrolizumab (p<0,03). Sin embargo, el beneficio de supervivencia no pudo alcanzar la significación estadística. La combinación no pudo alcanzar la significación en comparación con o bien el grupo de tratamiento de monoterapia con pembrolizumab, grupo n.° 3, o el grupo de H2L5 hIgG4PE n.° 5 o n.° 6. Por tanto, H2L5 hIgG4PE combinado con pembrolizumab (0,01 o 0,04 mg/kg más pembrolizumab 5 mg/kg) demostró un aumento en la inhibición del crecimiento tumoral y la supervivencia de los ratones, pero no pudo alcanzar la significación estadística frente al control de isotipo o las monoterapias.

Observaciones clínicas:

La pérdida de peso corporal de los ratones observada durante el estudio fue de aproximadamente un 20 %. Se observó ulceración tumoral en la mayoría de los grupos durante el estudio.

Destinos de los ratones:

Un total de 91 ratones se sacrificaron debido al tamaño tumoral > 2000 mm3, 34 ratones se sacrificaron debido a ulceraciones tumorales y 5 ratones se encontraron muertos. Estas muertes se atribuyeron a la susceptibilidad del modelo a un estado de enfermedad de injerto contra huésped.

DISCUSIÓN

La eficacia de H2L5 hIgG4PE como monoterapia y en combinación con pembrolizumab así como ipilimumab se evaluó en el modelo de ratón NSG con injerto de PBMC humanas con tumores de melanoma A2058. Este modelo, donde se inyectan PBMC humanas por vía intravenosa en ratones adultos NSG inmunodeficientes (NOD/SCID/IL-2Rynull) se conoce como modelo Hu-PBMC NSG. Induce una enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) y se ha usado para estudiar la actividad de células T efectoras y de memoria. En el modelo Hu-PBMC NSG se implantó la línea celular de cáncer humano A2058 por vía subcutánea para investigar el efecto de anticuerpos inmunoterapéuticos humanos sobre el crecimiento tumoral. Las limitaciones de este modelo incluyen la aparición de síntomas de GvHD, pérdida de peso corporal y ulceraciones tumorales frecuentes que impiden la monitorización de la supervivencia durante un período de tiempo más prolongado de lo que es posible con modelos de tumores de ratones singénicos.

Estudios iniciales que evaluaron H2L5 hIgG4PE en dosis que oscilaron entre 0,04 mg/kg y 4 mg/kg mostraron que las dosis en el intervalo más bajo demostraron una modesta inhibición del crecimiento tumoral. Se observó un retraso en la progresión del tumor y un aumento de la supervivencia de los ratones en grupos de dosis que oscilaron entre 0,04 y 0,4 mg/kg, aunque no fue estadísticamente significativo en comparación con los grupos de control de isotipo. Basándose en estos estudios, se seleccionaron dosis de H2L5 hIgG4PE de 0,04 a 0,4 mg/kg para una evaluación adicional solo y en combinación con pembrolizumab e ipilimumab en dos estudios con injertos de PBMC de dos donantes diferentes (donantes número 4568 y 6711). Se observaron respuestas modestas para la monoterapia con H2L5 hIgG4PE y la combinación con pembrolizumab en uno de los dos estudios de combinación realizados. El estudio de combinación que usó el donante de PBMC 4568 (tabla 13, figura 20C) demostró actividad antitumoral de la monoterapia y la combinación, mientras que el estudio que usó el donante de PBMC 6711 (tabla 12, figura 20B) no mostró un efecto antitumoral significativo, lo que probablemente era un resultado de las diferencias de PBMC de donantes entre los estudios, que reflejan la variabilidad de la respuesta de los pacientes que puede observarse en la práctica clínica. En este segundo estudio de combinación con el donante de PBMC 4568, se observó una inhibición potenciada del crecimiento tumoral y un aumento de la capacidad de supervivencia de los ratones en el grupo de combinación en comparación con cualquier agente solo, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Sin embargo, se observó una sinergia de la combinación, ya que la dosis de 0,04 mg/kg de H2L5 hIgG4PE en combinación con pembrolizumab 5 mg/kg dio como resultado una disminución estadísticamente significativa en el volumen del tumor diez días después de la primera dosis y un aumento de la capacidad de supervivencia frente al grupo de control de isotipo (p < 0,05), mientras que las monoterapias no lo hicieron. De hecho, el 50 % de los ratones del grupo de combinación H2L5 hIgG4PE y pembrolizumab permanecían en el estudio para el día 33, pero se retiraron debido a ulceraciones tumorales. Solo cuatro ratones se retiraron del estudio debido al volumen tumoral de este grupo de combinación, mientras que de 8 a 9 ratones se retiraron del estudio en los grupos de pembrolizumab y de isotipo.

La terapia anti-PD1 no demostró una actividad estadísticamente significativa en este modelo, tal como se observa con el cambio limitado en el crecimiento tumoral y la supervivencia observado con la cohorte tratada con pembrolizumab en comparación con la cohorte tratada con isotipo. La monoterapia con ipilimumab mostró una tendencia de inhibición del crecimiento tumoral modestamente mejor que pembrolizumab en ambos estudios, y mostró un aumento estadísticamente significativo en la supervivencia frente al isotipo en el segundo estudio de combinación con el donante de PBMC 4568 que respondía (p< 0,04). La dosis de 0,01 mg/kg de H2L5 hIgG4PE en combinación con ipilimumab 3 mg/kg mostró un aumento significativo de la supervivencia frente a ipilimumab (p< 0,02), pero no frente a la monoterapia con H2L5 hIgG4PE. No se observaron efectos significativos adicionales sobre el volumen del tumor con la combinación de H2L5 hIgG4PE e ipilimumab en este modelo en comparación con cualquier agente solo. Los ratones de todos los grupos de tratamiento, incluyendo los grupos de control de vehículo e isotipo, se encontraron muertos tal como se notificó en las tablas de destino. Estas muertes se atribuyeron a la susceptibilidad del modelo a un estado de enfermedad de injerto contra huésped y no estaban relacionadas con el tratamiento.

Ejemplo 12: Actividad funcional de anticuerpo agonista anti-ICOS murino solo y en combinación con anticuerpos anti-PD1 y anti-CTLA-4 in vivo

Modelos de tumores de ratones singénicos CT26 y EMT6

Modelo de tumor de ratón de carcinoma de colon murino CT26

MÉTODOS

Este estudio se realizó bajo un protocolo que fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de GSK antes del comienzo del estudio.

Animales

En este estudio, 164 ratones BALB/c hembra de Harlan Sprague Dawley. Los ratones tenían 6-8 semanas de edad al comienzo del estudio cuando se inocularon.

Cultivo celular e inoculación

Se descongeló un vial de células CT-26 (ATCC: CRL-2638) (3x106 células; P-11) a partir de -140 °C y se sembraron en placa en RPMI con FBS al 10 %. Se subcultivaron las células 3 veces a lo largo de 10 días. Se usó tripsina/EDTA para facilitar el desprendimiento de las células del frasco de cultivo durante el subcultivo. Se recogieron las células, se lavaron dos veces y se resuspendieron en RPMI sin FBS a 5x105 células/ml. Se inocularon los ratones por vía subcutánea con 0,1 ml de células (5x104 células/ratón) en el costado trasero derecho.

El día de la recogida de células e inoculación, se realizaron recuentos de células en un instrumento Beckman Coulter Vi-cell XR y se comprobaron mediante un hemocitómetro. Se desprendieron las células del matraz con tripsina/EDTA y se lavaron dos veces, en primer lugar con RPMI FBS al 10 %y en segundo lugar con RPMI solo y se resuspendieron en 10 ml de RPMI. Se recogieron 178x106 células en 20 ml de RPMI con una viabilidad del 98,8 %. Se añadieron 1,685 ml de suspensión de células (15x106 células en total) a 28,315 ml de RPMI.

15x106 células/30 ml de medio = 5x105 células/ml. Esto es igual a 5x104 células/100 |ul.

Formulación y preparación de anticuerpos

Los anticuerpos se diluyeron a partir de los viales fuente madre hasta las concentraciones deseadas en solución salina al 0,9 % estéril el día de la dosificación. Se sometió a prueba el clon agonista anti-ICOS C398.4 a 0,05 mg/kg y 0,5 mg/kg. Cada dosis también se sometió a prueba con tanto anti-PD1 10 mg/kg como anti-CTLA-41 mg/kg.

Protocolo(s) experimental(es)

Monitorización y dosificación de tumores

Se inoculó a los ratones el día 0. El día 11, se midieron el peso corporal y el volumen tumoral. Se aleatorizaron los ratones en los 12 grupos de estudio mostrados en la tabla 14 con 10 ratones/grupo basándose en el tamaño tumoral. La aleatorización se realizó usando el software Studilog Study Director. Se dosificó a los ratones basándose en el gráfico de diseño del estudio dos veces a la semana comenzado el día de la aleatorización y continuando durante 6 dosis totales. La dosificación fue interperitoneal (IP) en 100 |ul de volumen de vehículo de solución salina al 0,9 %. Se midieron el volumen tumoral y el peso corporal 3 veces a la semana a lo largo de todo el estudio.

Criterios de valoración

Los ratones se retiraron del estudio por la carga tumoral cuando el volumen tumoral era mayor de 2000 mm3. Se calculó el volumen tumoral aplicando mediciones con calibre de longitud y anchura a la siguiente fórmula: TV=0,52*L*W2.

Adicionalmente, los ratones se retiraron del estudio cuando los tumores desarrollaron ulceraciones abiertas. Se observaron ulceraciones a lo largo de todo el experimento, sin embargo, ulceraciones con costras solas no fueron un criterio de valoración a menos que formaran agujeros abiertos.

Aunque no se aplicó a ningún ratón en este estudio, un tercer criterio de valoración establecido al comienzo del estudio fue una disminución del 20 % del peso corporal.

Fármacos y materiales

Análisis de datos

El evento para el análisis de supervivencia es un volumen tumoral de 2000 mm3 o ulceración tumoral, lo que ocurriera primero. El tiempo exacto hasta el volumen de corte se estimó ajustando una línea lineal entre el logaritmo del volumen tumoral y el día de dos observaciones, la primera observación que superó el volumen de corte y la observación que precedió inmediatamente al volumen de corte. Se llevó a cabo el método de Kaplan-Meier (KM) para estimar la probabilidad de supervivencia de diferentes grupos de tratamiento en un momento dado. Se notificó la mediana del tiempo hasta el criterio de valoración y su correspondiente intervalo de confianza del 95%. Si las curvas de supervivencia de KM son o no estadísticamente diferentes entre dos grupos cualquiera, se sometió a prueba mediante la prueba de rangos logarítmicos.

Se compararon los volúmenes tumorales a los 17 días después de la dosificación inicial entre los diferentes grupos de tratamiento. Antes del análisis, el volumen tumoral se transformó logarítmicamente de manera natural debido a la desigualdad de la varianza en los diferentes grupos de tratamiento. Luego se llevó a cabo ANOVA seguido por una comparación por parejas en los datos transformados logarítmicamente.

Tabla 14: Grupos de estudio

El valor de p sin procesar, así como los valores p ajustados a la tasa de falsos descubrimientos (FDR), a partir de las comparaciones de días con respecto a eventos por análisis de supervivencia y las comparaciones del volumen tumoral transformado logarítmicamente el día 10 entre los grupos de tratamiento se muestran en la tabla anterior. Las comparaciones, usando valores de p ajustados a FDR < 0,05, se declara que son estadísticamente significativas.

RESULTADOS

El seguimiento del destino de los ratones mostró el número de ratones que se retiraron del estudio por carga tumoral y ulceración tumoral. Todos los ratones restantes están libres de tumores el día 61 del estudio, excepto 1 ratón en G7 que tiene un volumen tumoral de 579,16 mm3.

Para la supervivencia (tiempo hasta los criterios de valoración), los grupos 9 y 12 mostraron un aumento significativo de la supervivencia en comparación con el grupo de control con vehículo (p=0,008 y p=0,001 respectivamente). El grupo 12 mostró una supervivencia prolongada estadísticamente significativa en comparación con los grupos 2, 4 y 5 (p = 0,006, 0,001, 0,02). Sin embargo, ningún grupo de combinación mostró un aumento de la supervivencia estadísticamente significativo (p<0,05) sobre cualquiera de las monoterapias. (Figura 21).

DISCUSIÓN

Los grupos de terapia de combinación, particularmente la combinación de anti-ICOS y anti-PD1 a dosis alta (grupo 12), demostraron inhibición del crecimiento tumoral y aumento de la supervivencia en comparación con los grupos de monoterapia y control de isotipo, aunque no se alcanzó significación estadística el día 61. El control de isotipo para el grupo 12 era el grupo 3 de IgG2a de rata IgG de hámster. Los grupos de monoterapia para la comparación son; ICOS 10 mg (grupo 6) y PD1 200 mg (grupo 8). Un total de 5 ratones permanecieron sin tumor en el grupo 12 en comparación con 1 en el grupo 3, 1 en el grupo 6 y 1 en el grupo 8. El beneficio de supervivencia se cuantificó tomando el día en que cada ratón alcanzó cualquiera de los criterios de valoración predeterminados del estudio. Varios ratones se retiraron del estudio por ulceraciones tumorales abiertas y no debido a la carga tumoral.

En el grupo de combinación de ICOS CTLA-4 a dosis alta (grupo 10), se retiró un mayor número de ratones debido a ulceración tumoral el día 31, lo que probablemente enmascaró la supervivencia y el beneficio antitumoral que proporcionó esta combinación. En este grupo, se retiraron 5 ratones por ulceraciones tumorales y solo 2 por carga tumoral que alcanzaba 2000 mm3. Todos los tumores extirpados debido a ulceración tumoral aún tenían un tamaño modesto cuando se retiraron del estudio, y se espera que la ulceración tumoral pueda haber sido el resultado de una respuesta inmunitaria antitumoral inducida por la terapia en estos ratones. Tres ratones permanecieron sin tumores en este grupo hasta el día 61. Los 2 ratones retirados por carga tumoral fueron el número más bajo de ratones retirados por carga tumoral de todos los grupos.

Modelo de tum or de ratón de carcinoma mamario EMT6

Protocolo(s) experimental(es)

Todos los procedimientos y criterios de eutanasia descritos en este documento están de acuerdo con el protocolo AUP0606 de IACUC. Los animales se pesan y se inoculan en el cuarto trasero derecho con 100 ml de 1x105 células tumorales EMT6 por ratón. El número de ratones inoculados es igual a, al menos, el 130% de lo que se necesitaba para el estudio. Suponiendo una tasa de fracaso del 30 % (o bien demasiado grande o bien demasiado pequeña en el momento del inicio del estudio), el objetivo era tener n = 10 para cada grupo. Después de la inoculación de células tumorales, se midió el crecimiento tumoral y el peso corporal total 3 veces a la semana con un calibre digital Fowler “ProMax” durante 4 semanas o más. Los anticuerpos se adquirieron de un proveedor comercial y se diluyeron hasta la concentración deseada en solución salina al 0,9%. La dosificación (i.p.) se realizó cada dos semanas, durante un total de 6 dosis y se inició el día de la aleatorización, designado como día 0, cuando el volumen tumoral promedio se aproximaba a 100 mm3, aproximadamente de 7 a 8 días después de la inoculación. La aleatorización se realizó usando el software Studylog Study Director Suite. Se midió la longitud y la anchura de los tumores con el fin de determinar el volumen tumoral usando la fórmula (volumen tumoral = L * W2 * 0,52). La medición de un tumor mayor de 2.000 mm3 para un animal individual dio como resultado su retirada del estudio. Los ratones también pueden retirarse del estudio debido a pérdida de peso (> 20 %), ulceración tumoral o cualquier otra inhibición obvia de la actividad normal del ratón debido a la morbilidad.

En este estudio, se inoculó un total de 191 animales con células EMT6 con el fin de generar suficientes ratones con tumores en el intervalo de tamaño deseado para 13 grupos de 10 ratones cada uno, tal como se muestra en la tabla 15. Los ratones en los que se inyectó vehículo de solución salina y los grupos de control de isotipo sirvieron como controles para ratones tratados con AcM frente a ICOS, PD1 y CTLA-4. El control de isotipo para ICOS (IgG de hámster) se dosificó a 10 mg solo y en combinación con el isotipo para CTLA-4 (IgG2b de ratón) o PD-1 (IgG2a de rata). Los grupos de tratamiento de monoterapia para anti-CTLA-4 (9D9) y anti-PD-1 (RMP1-14) se dosificaron a 20 y 200 mg por ratón, respectivamente, y se evaluaron en combinación con el control de isotipo de ICOS. El clon C398.4 del agonista de ICOS se dosificó a 10 y 1 mg por ratón. La eficacia del agonista de ICOS también se evaluó a 10 y 1 mg por ratón dosificado en combinación con anti-CTLA-4 o anti-PD-1. Se incluyó un grupo adicional de PD-1 y CTLA-4 a las concentraciones descritas anteriormente como grupo de comparación de control positivo. El análisis estadístico del volumen tumoral se realizó el día 13 después de la aleatorización. El análisis de la capacidad de supervivencia incluyó ratones en estudio hasta el día 60.

Tabla 15: Grupos de estudio

Fármacos y materiales

Animales

Se recibieron ratones Balb/c hembra de desde 6 hasta 8 semanas de edad de Harían Sprague Dawley y se alojaron según las normas de IACUC.

Células EMT6

Se descongelaron células EMT6 y se cultivaron en frascos de cultivo celular durante ocho días antes de la inoculación. Se realizaron 3 pases de las células en este tiempo. El día de la inoculación, se recogen las células del frasco en medio completo. Las células se centrifugan y se resuspenden en medio de Weymouth (con FBS al 15%). Esta etapa se repite 3 veces en medio de Weymouth sin FBS. La densidad y la viabilidad celulares se comprueban mediante exclusión con azul trípano. Luego, se diluyen las células hasta la densidad deseada (1 x 106 células por ml).

Productos inmunoterapéuticos

Todos los productos terapéuticos se diluyeron hasta las concentraciones deseadas en cloruro de sodio al 0,9 % el día de la dosificación y se inyectaron por vía i.p. usando una aguja de 30G. Las diluciones terapéuticas y de control se presentan a continuación en la tabla 16.

Tabla 16: Diluciones terapéuticas

Análisis de datos

Análisis estadístico

El evento para el análisis de supervivencia fue un volumen tumoral de 2000 mm3 o ulceración tumoral, lo que ocurriera primero. El tiempo exacto hasta el volumen de corte se estimó ajustando una línea lineal entre el logaritmo del volumen tumoral y el día de dos observaciones, la primera observación que superó el volumen de corte y la observación que precedió inmediatamente al volumen de corte. Se llevó a cabo el método de Kaplan-Meier (KM) para estimar la probabilidad de supervivencia de diferentes grupos de tratamiento en un momento dado. Se notificó la mediana del tiempo hasta el criterio de valoración y su correspondiente intervalo de confianza del 95%. Si las curvas de supervivencia de KM eran o no estadísticamente diferentes entre dos grupos cualquiera, se sometió a prueba mediante la prueba de rangos logarítmicos.

Se compararon los volúmenes tumorales 13 días después de la dosificación inicial entre los diferentes grupos de tratamiento. Antes del análisis, el volumen tumoral se transformó logarítmicamente de manera natural debido a la desigualdad de la varianza en los diferentes grupos de tratamiento. Luego se llevó a cabo ANOVA seguido por una comparación por pajeras en los datos transformados logarítmicamente. Se utilizó el software de análisis SAS 9.3 y R 3.0.2.

RESULTADOS

Se inoculó a los ratones Balb/c y se aleatorizaron en grupos de diez basándose en el régimen de tratamiento 8 días después. La administración de productos terapéuticos o controles comenzó el día de la aleatorización (día 0) y continuó dos veces por semana durante 3 semanas.

El grupo tratado con solución salina desarrolló tumores a la velocidad esperada en relación con estudios previos de EMT-6. Todos los ratones en el grupo de vehículo de solución salina se sacrificaron debido a tamaño tumoral o ulceración el día 30. El tratamiento con IgG de hámster sola o en combinación con IgG2a de rata o IgG2b de ratón no dio como resultado un cambio estadísticamente significativo en el crecimiento tumoral promedio o la supervivencia en comparación con el grupo de vehículo de solución salina.

A los 13 días tras la aleatorización, los grupos de monoterapia con ICOS demostraron pocos cambios observables en el crecimiento tumoral promedio en comparación con los controles de isotipo. Sin embargo, el grupo de tratamiento con ICOS a dosis alta (10 mg) demostró una tendencia evidencia hacia una mayor inhibición del crecimiento tumoral que el grupo de dosis baja. Se observó un efecto que era comparable a la actividad de la monoterapia de CTLA-4. El tratamiento de monoterapia con AcM frente a PD-1 también dio como resultado una reducción observable, pero no estadísticamente significativa, en el volumen tumoral promedio el día 13. Sin embargo, como con la monoterapia con ICOS y CTLA-4, esto no dio como resultado un aumento de la supervivencia en comparación con la de los grupos de isotipos apropiados. El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-PD-1 y anti-ICOS, clon C398.4, a la dosis de 10 mg dio como resultado una considerable inhibición del crecimiento tumoral en comparación con los grupos de tratamiento de monoterapia y de control (figura 22). Tres ratones en este grupo de combinación lograron una regresión tumoral completa, una mejora considerable con respecto a los grupos de tratamiento de control o monoterapia. Sin embargo, debido a los criterios estadísticos utilizados, no se alcanzó una mejora estadísticamente significativa en la supervivencia. La combinación de anti-PD-1 con 1 mg de anticuerpo agonista de ICOS, clon C398.4, dio como resultado una disminución estadísticamente significativa en el crecimiento tumoral promedio el día 13 en comparación con los grupos de control de vehículo de solución salina (p<0,05) y monoterapia con ICOS (p< 0,05) de 1 y 10 mg. Cuatro ratones de este régimen de tratamiento lograron una regresión tumoral completa, lo que dio como resultado una tendencia significativa hacia un aumento de la supervivencia que no pudo alcanzar la significación estadística.

El anticuerpo frente a ICOS a ambas dosis en combinación con anti-CTLA-4 demostró un pequeño beneficio observable en la inhibición del crecimiento tumoral o la supervivencia en comparación con el tratamiento de monoterapia con cualquier anticuerpo.

DISCUSIÓN

Aunque los controles de isotipo no dieron como resultado un cambio obvio en el volumen tumoral promedio o la supervivencia global en comparación con el grupo de vehículo de solución salina, hubo animales individuales en el grupo de IgG de hámster (grupo 4) y el de IgG de hámster e IgG2a de rata (grupo 3) que demostraron retraso del crecimiento tumoral. En el grupo de isotipo IgG de hámster e IgG2a de rata, un ratón sobrevivió más allá del último ratón con vehículo de solución salina, sacrificándose el día 36 debido a ulceración con un tumor que medía 1156,56 mm3 de volumen. Dos ratones en el grupo de IgG de hámster sobrevivieron más tiempo que el grupo de solución salina. Un animal se sacrificó debió al tamaño tumoral el día 36 y el segundo el día 41 debido a ulceración con una medición de 1899,28 mm3.

El régimen de dosificación de anti-PD-1 con 10 mg de agonista anti-ICOS condujo a una inhibición observable del crecimiento tumoral, que dio como resultado una disminución del volumen tumoral el día 13 en comparación con los controles de isotipo, aunque esta diferencia fue menos obvia en comparación con la monoterapia con anti-PD-1. Sin embargo, la combinación dio como resultado un total de cinco animales que sobrevivieron más allá que cualquiera en el grupo de monoterapia con anti-PD-1, experimentado tres ratones una regresión tumoral completa en comparación con ninguno en el grupo de monoterapia con anti-PD-1.

El emparejamiento de anti-PD-1 con una dosis de 1 mg de anticuerpo agonista de ICOS condujo a una disminución observable en el tamaño tumoral promedio el día 13 en comparación con los controles de isotipo y los grupos de monoterapia respectivos. Esta disminución fue estadísticamente significativa en comparación con el control de vehículo de solución salina (p<0,05) y el grupo de monoterapia con 1 mg de ICOS (p<0,05). Cuatro ratones experimentaron regresión tumoral completa y sobrevivieron más allá que cualquiera en el grupo de monoterapia con PD-1.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   i . Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma que comprende CDRH1 tal como se expone en SEQ ID NO: 1; CDRH2 tal como se expone en SEQ ID NO: 2; Cd Rh 3 tal como se expone en s Eq ID NO: 3; CDRL1 tal como se expone en SEQ ID NO: 4; CDRL2 tal como se expone en SEQ ID NO: 5 y CDRL3 tal como se expone en SEQ ID NO: 6.
2. 2. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según la reivindicación 1, que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8 en la que dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma se une específicamente a ICOS humano.
3. 3. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma es un agonista para ICOS humano.
4. 4. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína de unión a ICOS se une a ICOS humano con

   (i) una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 1x105 M 'V 1; y una constante de velocidad de disociación (koff) de menos de 6x10-5 s-1; o

   (ii) una constante de disociación (KD) de menos de aproximadamente 100 nM,

   en la que la afinidad se mide mediante BIACORE.
5. 5. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8.
6. 6. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma comprende un armazón seleccionado de isotipo de IgG1 humana e isotipo de IgG4 humana.
7. 7. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma comprende un armazón de hIgG4PE.
8. 8. Proteína de unión a ICOS según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha proteína de unión a ICOS es un anticuerpo monoclonal.
9. 9. Proteína de unión a ICOS según la reivindicación 8, en la que el anticuerpo monoclonal está humanizado.
10. 10. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende al menos el 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende al menos el 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24.
11. 11. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada tal como se expone en SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera tal como se expone en SEQ ID NO: 24.
12. 12. Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. 13. Vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 12.
14. 14. Célula huésped que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 12 o el vector de expresión según la reivindicación 13.
15. 15. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma expresada por la célula huésped según la reivindicación 14.
16. 16. Método para la producción de una proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o 15, que comprende las etapas de:

    a) cultivar la célula huésped tal como se define en la reivindicación 14 en condiciones adecuadas para expresar dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma; y

    b) aislar dicha proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma, mediante lo cual se produce un polipéptido que comprende la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma.
17. 17. Composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o 15 y un portador farmacéuticamente aceptable.
18. 18. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o 15, o composición farmacéutica según la reivindicación 17 para su uso en el tratamiento de cáncer, enfermedad infecciosa y/o síndrome séptico en un ser humano que lo necesita.
19. 19. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en la que la proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma, o la composición farmacéutica se usa en combinación o se coadministra con al menos un agente antineoplásico, al menos un segundo agente inmunomodulador y/o al menos un adyuvante inmunoestimulador a dicho ser humano.
20. 20. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 19, en la que dicho al menos un agente antineoplásico es un agente quimioterápico.
21. 21. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 19, en la que el al menos un agente antineoplásico es docetaxel, metotrexato, paclitaxel, gemcitabina, fluorouracilo, carboplatino o cisplatino.
22. 22. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma, o composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que dicho segundo agente inmunomodulador se selecciona de: un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL1 y un anticuerpo anti-OX40.
23. 23. Proteína de unión a ICOS o porción de unión a antígeno de la misma o composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en la que el adyuvante inmunoestimulador es un agonista de TLR4, opcionalmente CRX-601.