JP6553197B2 - アゴニスト性icos結合タンパク質 - Google Patents
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Description
本明細書で使用する場合、「ICOS」は、任意の誘導性T細胞補助刺激タンパク質を意味する。ICOS(Inducible T-cell COStimulator)の仮称として、AILIM;CD278;CVID1、JTT−1またはJTT−2、MGC39850、または8F4が含まれる。ICOSは、活性化されたT細胞で発現されるCD28スーパーファミリー補助刺激分子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、CD28およびCTLA−4細胞表面受容体ファミリーに属す。ICOSはホモ二量体を形成し、細胞間シグナル伝達、免疫応答、および細胞増殖の調節に重要な役割を果たす。ヒトICOSのアミノ酸配列を以下に配列番号10として示す。
CDRH1: DYAMH(配列番号1)
CDRH2: LISIYSDHTNYNQKFQG(配列番号2)
CDRH3: NNYGNYGWYFDV(配列番号3)
CDRL1: SASSSVSYMH(配列番号4)
CDRL2: DTSKLAS(配列番号5)
CDRL3: FQGSGYPYT(配列番号6)
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のヒト疾患の処置に使用するために医薬組成物中に組み込むことができる。1つの実施態様では、医薬組成物は、抗原結合タンパク質を場合により1種類以上の薬学上許容可能な担体および/または賦形剤と組み合わせて含んでなる。
抗原結合タンパク質は、いくつかの従来技術のいずれによって調製してもよい。例えば、抗原結合タンパク質は、それらを天然に発現する細胞から精製してもよく(例えば、抗体はそれを産生するハイブリドーマから精製することができる)、または組換え発現系で生産してもよい。
当技術分野で理解されるように、抗体のADCCおよび/またはCDC活性を増強する様々な技術が知られている。これらには、限定されるものではないが、Fc領域における様々な変異、コンプリジェントおよびポテリジェント技術が含まれる。本発明の1つの態様では、1以上のADCC/CDC増強技術が本発明のICOS結合タンパク質に適用されてよい。
また、特定の変異または残基Asn297のグリコシル化の変更を含むヒトIgG1定常領域もFc受容体への結合を増強するために記載されている。場合によっては、これらの変異がADCCおよびCDCを増強することも示されている、例えば、Kellner (2013)参照。
本発明の1つの実施態様では、キメラ重鎖定常領域を含んでなる抗原結合タンパク質、例えば、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するように、例えば、それが増強されたADCCもしくは増強されたCDC、または増強されたADCCとCDC機能を有するように、IgG3由来の少なくとも1つのCH2ドメインを有するキメラ重鎖定常領域を含んでなる抗原結合タンパク質が提供される。1つのこのような実施態様では、抗原結合タンパク質は、IgG3由来の1つCH2ドメインを含んでなり得るか、または両CH2ドメインがIgG3に由来し得る。
a)本明細書に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程、ここで、前記発現ベクターは、IgG1およびIgG3の両Fcドメインアミノ酸残基を有するFcドメインをコードする核酸配列を含んでなる;および
b)前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなる、本発明による抗原結合タンパク質の製造方法も提供される。
本発明はまた、
a)本明細書に記載の単離された核酸含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程、ここで、前記組換え宿主細胞ではα−1,6−フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている;および
b)前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなる、本発明による抗原結合タンパク質の製造方法も提供する。
a)本明細書に記載の単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養する工程、前記発現ベクターは、IgG1およびIgG3の両Fcドメインアミノ酸残基を有するキメラFcドメインをコードするFc核酸配列をさらに含んでなり、前記組換え宿主細胞ではα−1,6−フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている;および
b)前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなる、本明細書に記載の、本発明による抗原結合タンパク質の製造方法が提供される。
本発明の抗原結合タンパク質は、FcRnに対する定常ドメインまたはそのフラグメントの親和性を増強する1以上のアミノ酸改変を有してよい。これらは、これらのタンパク質の半減期の延長をもたらし得るKuoおよびAveson (2011)。治療用および診断用IgGおよびその他の生物活性分子の半減期の延長は、これらの分子の投与の量および/または頻度の低減を含む多くの利益を有する。よって、1つの実施態様では、これらのアミノ酸改変のうち1以上を有するIgG定常ドメインの全部もしくは一部(FcRn結合部分)およびこのような改変IgG定常ドメインにコンジュゲートされた非IgGタンパク質または非タンパク質分子を含んでなる、本明細書で提供される本発明による抗原結合または融合タンパク質が提供され、ここで、前記改変IgG定常ドメインの存在は、前記抗原結合タンパク質のin vivo半減期を延長する。
定常領域における置換は治療用IgG抗体の機能を有意に改善することができるが、厳格に保存された定常領域における置換には、ヒトでの免疫原性というリスクがあり、多様性の高い可変領域配列における置換は免疫原性が低い可能性がある。可変領域に関する報告では、抗原に対する結合親和性を改善するためのCDR残基の操作および安定性を改善し免疫原性リスクを低減するためのCDRおよびフレームワーク残基の操作が含まれる。知られているように、抗原に対する親和性の改善は、無作為化ライブラリーのファージまたはリボソームディスプレーを用いた親和性成熟により達成することができる。
タンパク質足場は、Ig配列などの天然配列と同じであってよく、または天然配列のフラグメントであってもよく、かつ、異なる供給源または合成に由来する、天然であり得る付加的配列を含んでもよく、それらは足場のN末端またはC末端に付加されてよい。このような付加的配列は、それらが、本明細書に定義されるものなどのエピトープ結合ドメインとタンパク質足場を連結する場合にはリンカーと見なされ得る。
少なくとも1×105M−1s−1の結合速度定数(kon);および6×10−5s−1未満の解離速度定数(koff);または
100nM未満の解離定数(Kd)
で結合し、高い親和性がBiacoreにより測定される。
mは、0〜6であり;
nは、0〜4であり;
Xは、OまたはS、好ましくは、Oであり;
Yは、OまたはNHであり;
Zは、OまたはHであり;
各R1、R2、R3は、C1−20アシルおよびC1−20アルキルからなる群から独立に選択され;
R4は、HまたはMeであり;
R5は、−H、−OH、−(Cl−C4)アルコキシ、−PO3R8R9、−OPO3R8R9、−SO3R8、−OSO3R8、−NR8R9、−SR8、−CN、−NO2、−CHO、−CO2R8、およびCONR8R9からなる群から独立に選択され、ここで、
各R8およびR9は、Hおよび(Cl−C4)アルキルから独立に選択され;かつ
各R6およびR7は独立に、HまたはPO3H2である。〕
本発明のICOS結合タンパク質、および
b)少なくとも1種類の抗新生物薬
を投与することを含んでなる方法が提供される。
本発明のICOS結合タンパク質、および
b)少なくとも1種類の第2の免疫調節薬
を投与することを含んでなる方法が提供される。
本発明のICOS結合タンパク質、および
b)少なくとも1種類の免疫刺激薬
を投与することを含んでなる方法が提供される。
一般に、固形腫瘍は、ICOSが抗腫瘍免疫応答を媒介するという理論と一致して、低レベルの浸潤性ICOS+T細胞を有すると思われる。種々の腫瘍組織学間のICOS発現分析は、The Cancer Genome Atlas(TCGA)およびその他のデータベースからの公開mRNA発現データセットを用いて作出した。表3は、いくらかの検出可能なレベルのICOS mRNA発現を示した各組織学からの腫瘍の総体的パーセンテージを示す。この分析は、他の癌免疫療法アプローチに感受性があることが知られる腫瘍組織学(黒色腫、RCC、NSCLC)を、検出可能なICOS+腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を有する腫瘍のパーセンテージが比較的高い(>10%)と識別し、一方、免疫原性が低いことが知られる腫瘍(前立腺、卵巣、および膵臓腫瘍)を、ICOS+ TILを有する腫瘍のパーセンテージが比較的低い(<10%)と識別する(表3)。興味深いことに、ウイルス感染および/または慢性炎症(H&N、胃、食道、および子宮頸部)に関連することが知られる腫瘍種は、最高パーセンテージのICOS+ TILを示す腫瘍種の中にあった。これらのmRNA発現分析から明らかでないものは、各個の腫瘍種においてICOSを発現するTILの部分集団である。ICOSは主として腫瘍浸潤Treg上で発現される場合もあり、ICOS+Tエフェクター細胞浸潤のレベルを示す場合もある。
原発性ヒトPBMCの単離
新鮮な血液を血液ドナーから取得し、フェノールレッド不含10%RPMI1640培地で1:1希釈した。希釈血液をUni−Sep Max 50mlコニカルチューブ内の密度媒体の上に重層し、室温にて20分間400xgでブレーキをオフにして遠心分離した。得られた白色単核層(バフィーコート)を、100μMセルストレーナーを通して新しい50mLコニカルチューブ中へ注意深く抽出した。等容量のフェノールレッド不含10%RPMI1640培地をバフィーコートに加え、室温にて10分間、300xgで遠心分離した。細胞ペレットを10mlの赤血球溶解溶液(Sigma Aldrich)に再懸濁させ、室温で5分間インキュベートした。細胞を培地で1回洗浄し、従前に記載したように遠心分離した。容量をフェノールレッド不含10%RPMI1640培地で40mlとし、Vicellセルカウンターおよびバイアビリティアナライザー(Beckman Coulter)を用いて細胞を計数した。
ヒトCD4+CD25細胞は、ヒトCD4+CD25+制御性T細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いる2工程の磁性ビーズに基づく単離手順によってPBMCからさらに精製した。まず、PBMC細胞を4℃で5分間ビオチン抗体カクテルとともにインキュベートし、次に、抗ビオチンマイクロビーズとともに10分間インキュベートした。この工程は非CD4+T細胞を標識するためのものであった。その後、細胞をMidiMACSセパレーターの磁場内でLDカラムに通した。流出液、すなわち、予め濃縮した非標識CD4+細胞画分を回収し、4℃で15分間CD25マイクロビーズとともにインキュベートした。標識細胞をMiniMACSセパレーターの磁場内でMSカラムに通した。非標識CD4−CD25−Tエフェクター細胞を含有するフロースルーを下流活性化アッセイのために回収した。
ヒトCD4+T細胞は、新鮮なヒト血液からヒトCD4+T細胞エンリッチメントカクテル(Stem Cell Technologies)を用いて直接単離した。RosetteSepヒトCD4+T細胞エンリッチメントカクテル(50μL/mL)を全血に加え、十分に混合した。室温で20分のインキュベーション後、等容量のPBS+2%FBSを穏やかに混合しながら加えた。この希釈サンプルを密度媒体の上に重層し、室温にて20分間1200xgfでブレーキをオフにして遠心分離した。密度媒体:血漿界面からの濃縮細胞を新しいコニカルチューブに注意深く注いだ。次に、赤血球を赤血球溶解バッファー(Sigma Aldrich)で溶解させ、濃縮細胞をPBS+2%FBSで2回洗浄した。CD4+T細胞を40mlのPBS+2%FBSに再懸濁させ、Vi−Cellセルカウンターで計数した。
ヒトCD4+CD25−Tエフェクター細胞in vitro活性化アッセイ−結合アッセイ
組織培養処理が施されていない96ウェル平底プレートを、1μg/mlの抗ヒトCD3抗体(eBioscience)および種々の供試抗体を含有する、100μl/ウェルのコーティングバッファー(Biolegend)で一晩コーティングした。翌日、これらのプレコーティングプレートを、10%FBS含有RPMI−1640培地で3回洗浄した。ヒトCD4+CD25−Tエフェクター細胞を単離し、記載のようにCFSEで標識し、これらのプレートに播種した。37℃で2.5日インキュベートした後、細胞を採取し、増殖および活性化マーカーの発現に関してフローサイトメトリーで分析した。また、細胞培養上清も、メソ・スケール・ディスカバリー(MSD)によるマルチプレックスサイトカイン測定のために回収した。
15mlのコニカルチューブにて、標識する細胞を1mlの予温PBSに終濃度1E7細胞/mLで再懸濁させた。1μlの2mM CFSE保存溶液(Life Technologies)を直接細胞に加えた後、均一な標識を確保するためにすぐに旋回させた。室温で5分間インキュベートした後、14mlの氷冷細胞培養培地を加えることにより染色をクエンチした。標識された細胞を氷冷培地で3回洗浄した。細胞を計数し、100IU/mlのIL−2(PeproTech)を添加したRPMI1640+10%FBSで1E6細胞/mlに調整し、抗CD3および供試抗体コーティングプレートに播種した。T細胞の活性化の後、細胞を採取し、PBS+0.5%BSAで1回洗浄し、その後、フローサイトメトリー分析のために多色染色工程を施した。
活性化T細胞を採取し、PBSで洗浄した。細胞をまず、販売者のプロトコールに従ってLIVE/DEAD Fixable Far Red細胞生体色素(Life Technologies)で染色した。色素を洗い流した後、異なる色を結合した検出抗体を4℃で30分間細胞とともにインキュベートした。染色細胞を氷冷FACS染色バッファー(PBS+0.5%BSA)で1回洗浄した後、FACS CantoまたはFACS Canto IIフローサイトメーターに流した。サイトメーターの性能はCytometer Setup & Trackingビーズ(BD Biosciences)を用いて毎日確認し、PMT電圧およびエリアスケーリングは非染色細胞に基づいて設定した。補正は、各蛍光色素を結合した検出抗体で個々に染色したOneCompまたはUltraCompビーズ(eBioscience)を用いて行った。
組織培養上清のIFN−γ、IL−10、IL−2およびTNF−αサイトカインレベルは、MSDヒトV−Plex特注キットを用いて決定した。まず、サンプルを希釈剤2で1:200希釈した。キットマニュアルに従い、キャリブレーターもまた希釈剤2で調製した。希釈サンプルおよびキャリブレーターを黒色MSDプレートに加えた後、粘着性プレートシールで封止し、振盪しながら室温で2時間インキュベートした。希釈剤2で新たに調製した25μLの検出抗体溶液を各ウェルに加えた後、プレートを再封止し、振盪しながら室温でさらに2時間インキュベートした。これらのプレートを150μL/ウェルのPBS+0.05%Tween−20で3回洗浄した後、新たに希釈した150μl/ウェルの2倍リードバッファーを加え、すぐにMESO QuickPlexリーダーで読み取った。データはMSD Workbenchソフトウエアを用いて分析した。
新たに単離したヒトCD4+T細胞を、抗CD3(1μg/ml)および抗CD28(3μg/ml)でコーティングした24ウェルプレートにて48時間、前刺激した。細胞を採取し、洗浄し、100IU/mlのIL−2(PeproTech)を添加したAIM−V培地中、抗CD3Dynaビーズ(Life Technologies)と1:1比で混合した。次に、細胞/ビーズ混合物を非コーティングの(可溶形式の場合)またはH2L5 hIgG4PEでコーティングした(結合形式の場合)96ウェル平底プレートに100k/ウェルで播種した。可溶形式の場合には、H2L5 hIgG4PEを細胞の播種時にウェルに加えた。37℃で3.5日インキュベートした後、MSDによるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を回収した。
新たに単離したヒトPBMCを、抗CD3(1μg/ml)および抗CD28(5μg/ml)でコーティングした24ウェルプレートにて48時間、前刺激した。CFSE染色細胞を調製し、100IU/mlのIL−2(PeproTech)を添加したAIM−V培地中、抗CD3Dynaビーズ(Life Technologies)を1:1比で混合した。次に、細胞/ビーズ混合物を、1μg/mlの抗CD3抗体でプレコーティングした96ウェルプレートに200k/ウェルで播種した。H2L5hIgG4PEおよび対照抗体をそれらの可溶型でこれらのウェルに直接加えた。37℃で3.5日インキュベートした後、MSDによるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を回収し、フローサイトメトリーによる増殖およびマーカー発現分析のために細胞を採取した。
フローサイトメトリーデータ分析
フローデータは、FlowJoソフトウエア(FlowJo LLC)により分析した。まず、LIVE/DEAD細胞生体色素染色に基づき死細胞にゲートをかけた。ダブレットにはFSC−H:FSC−W散布図でゲートをかけた。得られた生存単細胞をCD4+またはCD8+T細胞などの異なるT細胞部分集団内の活性化マーカー発現に関して分析し、親集団のパーセンテージまたは中央蛍光強度(MFI)として報告した。
CFSEデータもまたFlowjoにより分析した。死細胞およびダブレットを除外した後、非活性化T細胞に基づいて「増殖細胞」ゲートをかけた。いずれの所与のサンプルでもこのゲートに入る細胞を増殖細胞として計数した。データは、増殖のパーセンテージとして報告した。
細胞枯渇は、FlowJoにより分析した。まず、LIVE/DEAD細胞生体色素染色に基づいて生細胞ゲートを決定した。次に、ダブレットを従前に記載したようにゲートで除外した。細胞枯渇の指標として生CD4+またはCD8+T細胞部分集団のパーセンテージを計算した。
用量応答データをグラフパッド・プリズムソフトウエアにインポートし、対数スケールに変換した。データの曲線フィッティングおよびEC50値の生成のために、アゴニスト用量応答を様々な傾きモデルとともに使用した。フィッティング式を以下に挙げる。
Y=最小+(最大−最小)/(1+10^((LogEC50−X)ヒルの傾き))
主要マウス抗ヒトICOS抗体の同定
14のマウスmAbをヒトおよびカニクイザルICOS結合およびアゴニスト活性に関してスクリーニングした。12は再クローニング、配列決定、増幅、および機能研究に十分な量での精製が可能であった。BIAcoreを用い、総てを結合特性に関して試験した。2つは、極めて弱い結合剤/非結合剤であることが判明した。10の精製mAbを機能的「促進作用」分析によって試験した。複数の健康なヒトドナーで間の、T細胞の増殖およびIFN−γサイトカインの産生を誘導するそれらの能力に基づき、4つの最良のアゴニストmAb(以下の表で5422.2、279.1、314.8および88.2と呼称)が、ヒトIgG1キメラとして選択および作製された。314.8、88.2、92.17、145.1、および53.3のCDR配列は、PCT/EP2012/055735(WO2012/131004)に他のICOS mAbとともに示されている。
試験プロトコール
mRNAからの抗体可変遺伝子の回収およびキメラFc野生型抗体遺伝子の作出
全RNAを422.2ハイブリドーマ細胞ペレットから精製し、逆転写させてcDNAを作製し、それからPCRによりおよそ400bpの可変遺伝子産物が単離され、アガロースゲル電気泳動により精製された。
成熟マウス可変領域タンパク質配列を逆翻訳してDNAを得た後、コドンの最適化を行った。次に、そのVHおよびVL配列を、各末端に好ましい5つのプライム非翻訳領域および好ましいクローニング部位を含むように改変した。適合VH配列は、PCRに基づく戦略およびオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いてde novo構築し、その後、pTTベクター中に存在するヒトIgG1 Fc野生型またはFc無効型hIgG1(L235A、G237A)またはヒンジ安定化hIgG4(S228P、L235E)(IgG4PE)にグラフトした。適合VL配列は、PCRに基づく戦略およびオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いてde novo構築し、その後、pTT5ベクター中に存在するκ定常領域にグラフトした。
ヒト可変(V)遺伝子鋳型を、適当なインハウス・ヒト生殖細胞系重鎖および軽鎖データベースを、BLASTPを用いてCDRマスク422.2V領域で検索することにより、422.2のヒト化に関して選択した。上位BLASTPヒットから、422.2ヒト化のためのV遺伝子フレームワーク鋳型としてIGHV1−69およびIGKV3−11を選択した。IGHJ6およびIGKJ2ヒト生殖細胞系連結(J)遺伝子を、422.2のヒト化のために選択した。
構築された発現プラスミド
ハイブリドーマクローン422.2のマウス抗体可変遺伝子配列の再生に成功し、それらの配列をそれぞれ以下の配列番号19および20ならびに図8に示す。
H2L5 hIgG4PEの成熟タンパク質配列は、付加的標識とともに図9に含まれていた。H2L5 hIgG4PE重鎖および軽鎖のコード領域のDNA配列は、図10および11に含まれていた。
Fc受容体結合
ヒト化抗体H2L5は、抗原結合フラグメント(Fab)のアーム交換を防ぐため、ヒトIgG1アイソタイプから、変異S228P、L235E(EUナンバリング)を組み込んだ改変型ヒトIgG4アイソタイプへと改変した。ヒトIgG4PEはmAbの、活性化しているFcγ受容体およびC1qへの結合を低下させ、従って、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)または補体依存性細胞傷害性(CDC)によりICOS陽性細胞の枯渇を誘導するmAbの能力を低下させるので、ヒトIgG1よりも優ると選択された。加えて、ヒトIgG4PE(S228P、L235E)は、FcγRIIb(阻害性Fcγ受容体)への結合を保持する。FcγRIIbとの相互作用は、抗体架橋を可能とすることによるICOS抗体のアゴニスト活性に重要であり得る。FcγRIIbとの相互作用は、TNF−αファミリー受容体ならびにCD28を標的とする他の免疫調節抗体のアゴニスト活性に重要であることが示されている(Bartholomaeus P et al., “Cell contact-dependent priming and Fc interaction with CD32+ immune cells contribute to the TGN1412-triggered cytokine response.” J. Immunol., 192(5); 2091-8 (2014))。
422.2ヒト化変異体の機能評価
4つのICOSアゴニスト抗体をヒト化するために、マウスV領域とヒトIgG1 Fc部分の融合物であるマウス−ヒトキメラを作出した。これら4つのキメラ抗体を、プレート結合型としてのヒト全PBMC活性化アッセイで試験した。抗ICOSキメラ422.2は、結合型PBMC活性化アッセイで最良のアゴニスト活性を示した。結合データおよび生物物理学的特性と合わせて、422.2クローンをヒト化のために選択した。4つのヒト化422.2変異体をICOS結合および生物物理学的特徴に基づいて選択し(422.2 H2L0、H2L5、H5L0およびH5L5)、結合型ヒトPBMC活性化アッセイで試験した。H2L5変異体は、サイトカイン産生により評価したところ、他の変異体と比較して、同等またはより良好なT細胞の活性化を示した(図3)。
次に、422 H2L5 IgG1を、可溶型の種々の全PBMC活性化アッセイで試験した。この可溶形式は、全PBMCアッセイが同じウェルにリンパ球、単球および他の免疫細胞を含有するので、in vivo条件により関連すると思われる。しかしながら、422 H2L5 IgG1 mAbは、T細胞枯渇を思わせるT細胞集団の生存率の低下を一貫して示した。この結果は、11名の健康なドナーにおいて様々な程度で見られ、CD8+T細胞よりもCD4+T細胞で顕著であった。対照的に、422 H2L5抗体は、IgG4[PE]またはFc無効型アイソタイプのいずれかとして発現された場合、T細胞生存率に有意な低下を示さず、生存率の低下がFcγRに媒介される抗体依存性細胞傷害性(ADCC)によるものであった可能性があることを示唆した(図4)。
H2L5 hIgG4PEのT細胞活性化効果を定量するために、ヒト原発性CD4+T細胞を、まず、プレート結合型抗CD3(1μg/ml)/抗CD28(3μg/ml)により48時間前刺激してTエフェクター細胞集団の表面にICOS受容体のレベルを誘導し、次に、抗CD3DynaビーズおよびH2L5 hIgG4PEで再刺激した。前刺激したCD4+T細胞を、抗CD3Dynaビーズの存在下、一連の濃度の結合型または可溶型H2L5 hIgG4PEで処理することにより、10点用量応答曲線を作成した。結果は、結合型および可溶型H2L5 hIgG4PEの両方が、2名の別の健康なヒトドナーで用量依存的にIFN−γおよびTNF−αサイトカインの産生を増大させたことを示した(図5)。用量応答曲線フィッティング分析を行ってEC50値を得た。興味深いことに、H2L5 hIgG4PE処理は、T細胞培養の上清に可溶型タンパク質として加える場合と対照的に、抗体がプレートに固定された場合に有意に大きな規模のサイトカイン誘導をもたらした。
全ヒトPBMCex vivo培養でのH2L5 hIgG4PEの機能を試験するために、健康なヒトドナーからのPBMCを、プレート結合型抗CD3および抗CD28とともに48時間調製し、次いで、抗CD3 Dynaビーズの存在下(ビーズ:細胞=1:1比)で3.5日間、可溶型H2L5 hIgG4PE処理を行った。サイトカイン産生およびT細胞グランザイムB発現を、T細胞機能の読み出しとして調べた。3名のドナーからの結果を図6にまとめたが、そこからH2L5 hIgG4PEが健康ヒトドナーからの活性化PBMCにおいて増殖、サイトカイン産生および細胞傷害能の増強を誘導することを示唆する証拠が得られる(図6)。
PBMCがプレート結合型の抗CD3(クローンOKT3、1μg/ml)および抗CD28(クローンCD28.2、3μg/ml)により48時間前刺激されるPBMC前刺激アッセイでH2L5 hIgG4PEの活性を評価した。次に、最適な前刺激条件を特定するために、ヒトCD3 DynaビーズおよびCD3/CD28 Dynaビーズ(ThermoFisher)を種々のビーズ:細胞比で用いてPBMCを前刺激した。48時間の前刺激の後、細胞を採取し、ビーズを磁気的に除去した後、可溶型ICOS mAbの存在下または不在下で、抗CD3 Dynaビーズ(ビーズ:細胞比=1:1)で再刺激した。H2L5 hIgG4PE ICOSアゴニストmAbは、供試した総ての前刺激条件でアイソタイプ対照に比べてIFNγの誘導をもたらしたが、IFNγ産生の規模は前刺激の強度と逆相関した。
方法
機能的エンドポイントにおける濃度依存的変化は、健康なヒトPBMCを0.6μg/mLでの抗CD3抗体処理と同時に0.1μg/mL〜100μg/mLの範囲の濃度の固定化H2L5 hIgG4PEで処理することによって評価した。細胞表面活性化マーカーCD69、OX40およびCD25の発現の変化をフローサイトメトリーにより評価し、T細胞活性化の尺度とした。T細胞の増殖は、Ki67核染色の変化によって測定した。CD3会合の存在下でH2L5 hIgG4PE処理に応答した種々のTh1、Th2およびTh17サイトカインのレベルの変化を、MSDプラットフォームで評価した。初期サイトカイン変化ならびに後の時点で主として着目される増殖変化の両方の捕捉を確保するために、処理後24時間および48時間の時点を選択した。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の単離
液体ナトリウムヘパリン(Sagent終濃度10IU/mL)でコーティングしたシリンジを用い、健康なドナーから全血を採取し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1希釈した。希釈血液(35mL)を15mLフィコール密度勾配媒体(GE Healthcare)の上に重層し、室温にて20分間1200xgでブレーキを用いずに遠心分離した。白色の単核細胞層を新しい50mlチューブに注意深く移した。このチューブに等容量のPBSを加え、室温にて5分間400xgで遠心分離した。PBMCをPBSで1回洗浄し、従前に記載されたように遠心分離した。PBMCを50mL AIM−V培地に再懸濁させた。Vi−Cellセルカウンターおよびバイアビリティアナライザー(Beckman Coulter)を用いて細胞を計数した。
抗ヒトCD3抗体を終濃度0.6μg/mLとなるようにコーティングバッファーで希釈した。100μLの希釈抗体を96ウェル平底プレートに一晩4℃でコーティングした。翌日、10.1mg H2L5 hIgG4PEおよび7.9mg 抗RSV IgG4 PEアイソタイプ対照抗体の保存溶液をコーティングバッファーで1:2連続希釈して100〜0.1μg/mLの範囲の最終抗体濃度を得た。100μLの希釈抗体を室温で4時間、抗CD3コーティングプレートにコーティングした。
ヒトPBMC活性化アッセイ
H2L5 hIgG4PEを、抗CD3抗体を介したTCR会合とH2L5 hIgG4PEによるICOSの補助刺激が同時に起こるヒトPBMC活性化アッセイで試験し、活性化効果を活性化後24時間および48時間にモニタリングした。この試験を4名の異なるドナーからの血液を用いて4回繰り返した(n=4)。AIM−V培地中、200μLのPBMC(1×106細胞/mL)を、種々の濃度のH2L5 hIgG4PEまたはIgG4アイソタイプ対照を含む抗CD3抗体コーティングウェルに加えた。各アッセイ条件について3回のテクニカル反復を含めた。PBMCを37℃および5%CO2で、上記に示される種々の時間培養した。24時間および48時間の時点で上清を回収した後、MSDプラットフォームに分泌されるサイトカインの分析のために−80℃で保存した。24時間および48時間の両時点で細胞を96ディープウェルプレートに移し、1mL FACS染色バッファーで洗浄し、蛍光団を結合した抗体またはアイソタイプ対照で染色した。
細胞をまず、PBSで予め1:1000希釈した固定可能な生体色素eFluor 506で4℃、暗所にて30分間染色した。細胞を洗浄した後、種々の蛍光団と結合した、細胞表面マーカーに対する検出抗体ともに氷上にて30分間インキュベートした。細胞表面抗体で染色した後、内部移行マーカーに関して染色されないサンプルを氷冷FACS染色バッファーで1回洗浄した後、FACS Canto IIフローサイトメーターに流した。
細胞表面染色の後、細胞内マーカーの染色のために細胞を固定し、透過処理を施した。転写因子バッファーセットを用い、これを希釈バッファーで1:3希釈することにより、固定/透過バッファーを調製した。透過洗浄バッファーは、5倍Perm/洗浄バッファー保存液を脱イオン水で希釈することにより調製した。1mLの固定/透過バッファーを各サンプルに加え、これらのプレートをすぐにシェーカー上で旋回させた。これらのプレートを暗所、4℃で45分間インキュベートした。遠心分離後、全2回の洗浄に関して、1mLの透過/洗浄バッファーを加え、これらのプレートを混合し、遠心分離した。内部移行カクテルを、マーカー抗体を用いて調製した。100μLの内部移行抗体を適当なサンプルに加え、これらのプレートを暗所、4℃で30分間インキュベートした。サンプルを1mLの透過洗浄バッファーで2回洗浄し、250μLの流動バッファーに再懸濁させ、FACS Canto IIフローサイトメーターに流した。
サイトカインレベルを、MSDヒト特注9プレックスキットを用いて測定した。サンプルおよびキャリブレーターを希釈剤43で希釈した。サンプルを9プレックスアッセイの場合には1:10希釈、記載のIFNγアッセイの場合には1:200希釈し、0.250μLの希釈剤を2つの各キャリブレーターパネルに加えた。旋回させた後、キャリブレーターを氷上で少なくとも5分間インキュベートした。200μLの各キャリブレーターパネルを400μLの希釈剤に加えてキャリブレーターの最高濃度とし、1:4連続希釈を用いて、6つのさらなるキャリブレーター希釈液を調製した。希釈剤43をプレートバックグラウンドとして使用した。50μLの希釈サンプル(3反復)およびキャリブレーター(2反復)をMSDプレートに加えた。プレートを封止し、室温で振盪しながら2時間インキュベートした。プレートをキットの希釈MSD洗浄バッファー150μLで3回洗浄した。各プレートについて、9種類の各検出抗体60μLを希釈剤3で3mLとしたものを合わせることにより、検出抗体溶液を調製した。25μLの検出抗体溶液を加えた後、これらのプレートを封止し、室温、暗所で振盪しながら2時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。150μLの2倍リードバッファーをこれらのプレートに加え、それらをQuickPlexで読み取った。
サンプルおよびキャリブレーターを希釈剤2で希釈した。1mLの希釈剤をキャリブレーターに加えた。旋回した後、キャリブレーターを氷上で5分間インキュベートした。これをキャリブレーター1とする。1:4連続希釈を用い、6つのさらなるキャリブレーター希釈液を調製した。希釈剤2をプレートバックグラウンドとして使用した。50μLの希釈サンプル(3反復)およびキャリブレーター(2反復)をMSDプレートに加えた。プレートを封止し、室温で2時間振盪しながらインキュベートした。プレートをキットの希釈MSD洗浄バッファー150μLで3回洗浄した。検出抗体溶液を希釈剤3で調製した。各プレートについて、合計3mLの検出試薬に対して60μLの各検出抗体を希釈剤に加えた。25μLの検出抗体を加えた後、これらのプレートを封止し、室温、暗所で、振盪しながら2時間インキュベートした。プレートを3回洗浄した。リードバッファーをこれらのプレートに加え、それらをQuickPlexで読み取った。
サイトカインおよびフローサイトメトリーデータの分析
MSDサイトカインアッセイの結果を、MSDディスカバリー・ワークベンチソフトウエア、バージョン4.0(Meso−Scale)、マイクロソフト・エクセル、およびグラフパッド・プリズムを用いて分析した。フローサイトメトリーデータをDIVAにより分析し、グラフパッド・プリズムソフトウエアに数値をプロットした。
用量応答データをグラフパッド・プリズムソフトウエアにインポートし、対数スケールに変換した。データの分析およびEC50値の生成のために、アゴニスト用量応答を様々な傾きモデルとともに使用した。フィッティング式を以下に挙げる。
Y=最小+(最大−最小)/(1+10^((LogEC50−X)ヒルの傾き))
増殖試験におけるH2L5 hIgG4PE値とアイソタイプ抗体対照値の間の違いの統計的有意性を2対応のスチューデントのt検定によって分析した。
H2L5 hIgG4PEによるサイトカイン変化の評価
PBMCを抗CD3の存在下、固定化H2L5 hIgG4PEで処理すると、IFNγ、TNFαなどのTh1サイトカイン、Th2サイトカインであるIL−6およびIL−10、ならびにTh17サイトカインであるIL−17aの分泌が濃度依存的に様々な程度で誘導された。IL−4、IL−5およびIL−13などの毒呈した他のサイトカインも、H2L5 hIgG4PE刺激に対して、程度は低いが濃度依存的応答を示した。4名の異なるドナーからの結果を表7にまとめる。
不活性ヒトPBMC(n=4ドナー)における同時CD3刺激を伴うH2L5 hIgG4PE処理は、T細胞活性化マーカーに有意な変化を誘導した(表7および8))。ヒトIgG4同位体対照サンプルに比べてH2L5hIgG4PE処理サンプルで、CD25およびOX40陽性CD4およびCD8 T細胞のロバストな増加が見られた。CD69陽性CD4およびCD8 T細胞のパーセントも24時間および48時間の時点で濃度依存的に増加した。
同時的CD3の活性化を伴う固定化H2L5 hIgG4PE処理は、細胞内Ki67染色により測定したところ、CD4およびCD8の両T細胞の増殖に濃度依存的増加をもたらした(n=6ドナー)(表8)。H2L5 hIgG4PEはまた、CD4およびCD8 T細胞の合計で見られたものよりも程度は低いが、濃度依存的にCD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞の増殖を増大させた。H2L5 hIgG4PEによるT細胞増殖の促進は、48時間の時点でのみ見られた。制御性T細胞の増殖の増大は有意ではなかったが、CD4+細胞の増殖の濃度依存的増加(H2L5 hIgG4PEが0.4μg/mLより大きい濃度ではp<0.05)およびCD8+T細胞の増殖の濃度依存的増加(0.2〜1.6μg/mLの間の濃度ではp<0.05)は有意であった(表7参照)。
ICOSがT細胞の活性化とおよびTh1およびTh2サイトカインの両方の誘導に重要であることが十分に確認される。本研究では、H2L5 hIgG4PE(抗ICOSアゴニスト抗体)のin vitro活性が、T細胞の活性化およびサイトカインの誘導の種々の尺度を用いて実証された。測定した総てのT細胞活性化マーカー、CD25(IL−2受容体α鎖)、CD69(初期活性化マーカー)およびOX−40(補助刺激マーカー)は、CD3刺激とともにH2L5 hIgG4PEで処理した際にアップレギュレートされた。モニタリングした活性化マーカーの中で、CD69およびOX40を発現するT細胞のパーセントはH2L5 hIgG4PE処理によって強く増大された。CD69は初期活性化マーカーであり、ゆえに、その効果は24時間サンプルにおいて優勢である。もう1つの重要なT細胞活性化マーカーであるCD25は、H2L5 hIgG4PEで処理した際に両時点で増加し、H2L5hIgG4PEがT細胞の活性化の維持において重要な役割を果たすことを示唆する。Ki67は、細胞増殖に関連する核タンパク質である。Ki67細胞内染色を伴うフローサイトメトリーデータは、固定化H2L5 hIgG4PEがTCR会合の状況で、CD4およびCD8の両T細胞の増殖を有意に促進したことを示した。制御性T細胞の増殖もH2L5hIgG4PEによって増強されたが、その変化は統計的に有意でなかった。
曲線を示す。この情報は、使用する抗体の、最適な薬力学的応答のために最良の用量範囲を確かめる上で重要な成分である。
ヒト化プロトコール(実施例3)から36の重鎖および軽鎖変異体が生成され、これらをヒトおよびカニクイザルICOSとの結合に関してスクリーニングするととともに、それらがヒトCD28またはCTLA−4と結合しなかったことも確認した。H2L5変異体は、最小数の復帰変異を含みつつヒトおよびカニクイザルICOSに対して高い親和性(それぞれ1.34および0.95nM)を有するとして同定された。
ヒトICOSに対するH2L5 hIgG4PEの結合
ヒト化H2L5 hIgG4PE抗体の親和性の結合動態を、表面に捕捉したCM5チップ抗ICOS H2L5 hIgG4PEのFc2上でBIAcore T200抗ヒトIgGを用いて決定した。ウサギFcの非特異的結合を防ぐために、抗ヒトIgG表面を0.1mg/mL hIgG1で遮断した。ヒトおよびカニクイザルICOS(ウサギFc)を256nM、64nM、16nM、4nMおよび1nMで捕捉抗体に通した。バッファー単独を二重参照結合曲線のために使用した。表面を再生するためにMgCl2を使用した。流動は25℃で行った。T200評価ソフトウエアを用いて1:1モデルにデータを当てはめた。抗体濃度:2.5μg/mL
ヒトおよびカニクイザルICOSに対するH2L5 hIgG4PEの結合
ヒト化H2L5 hIgG4PE抗体の結合動態親和性を、BIAcore T200を用いて決定した。
実施例1に示されるように、マウスクローン422−2が主要抗ヒトICOSマウス抗体として同定された。この抗体のヒト化により36の重鎖および軽鎖変異体が得られ、これらをヒトおよびカニクイザルICOSとの結合に関してスクリーニングするととともに、それらがヒトCD28またはCTLA−4と結合しなかったことも確認した。H2L5変異体は、最小数の復帰変異を含みつつヒトおよびカニクイザルICOSに対して高い親和性(それぞれ1.34および0.95nM)を有するとして同定された。
方法
試験準備
CD3ネガティブ単離:
CD3+T細胞は幹細胞Rosette SepヒトT細胞濃縮キットからネガティング単離した:Rosette SepヒトT細胞濃縮: 100mLの新鮮な全血を、液体ナトリウムヘパリン(Sagentt終濃度10IU/mL)中でコーティングしたシリンジで採取した。各採取チューブからの血液をフラスコに合わせ、血液1mL当たり50μLのRosette SepヒトT細胞濃縮カクテル加えた(5mL/100mLドナー血液)。全血/Rosette Sep抗体カクテルを室温で20分間インキュベートした。次に、血液/Rosette Sep抗体カクテルを1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+2%FBS(ウシ胎児血清)で1:1希釈した。FBSは最終容量200mLに対する。次に、25mLの希釈血液/抗体カクテルをSepmateチューブ内の15mLのフィコール勾配上に重層した(各ドナーにつき合計9チューブ)。その後、Loaded Sepmateチューブを室温にて1200xgで20分間、ブレーキをオンにして遠心分離した。末梢血単核細胞(PBMC)界面に沈降した血漿の上層をピペットで取り出し、廃棄した。残った血漿およびバフィーコート界面をSepmateチューブから50mLコニカル遠沈管(合計4本)にデカントした。これらのチューブにPBS+2%FBSを最高レベルまで加えて50mLとした。細胞を室温にて400xgで10分間遠心分離した。上清を廃棄した。次に、各ドナーからのペレットを1本の50mLコニカルチューブに合わせ、これらのペレットを合計容量50mL PBS+2%FBSに再懸濁させた。細胞を室温にて400xgで5分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを2mLのRPMI完全培地(RPMI 1640+10%FCS+1mMピルビン酸ナトリウム+2mM L−グルタミン+ペニシリン100U/mL+ストレプトマイシン100μg/mL)に再懸濁させた。回収したCD3細胞をViCell装置で計数し、さらに希釈して1.2×106細胞/mLとした。T細胞単離の質を確認するために、1×106の回収細胞をCD3 PE−Cy7に対して染色した。
PBMC単離: 簡単に述べれば、100mLの新鮮な全血を、液体ナトリウムヘパリン(Sagentt終濃度10IU/mL)中でコーティングしたシリンジで各ドナーから採取した。血液を、2%FBSを含むPBSで希釈(1:1)し、最終容量200mLとした。25mLの希釈血液を、Sepmateチューブ(各ドナーにつき合計8本)中の15mLのフィコール勾配の上に重層した。次に、Loaded Sepmateチューブを室温にて1200xgで20分間、ブレーキをオンにして遠心分離した。PBMC界面に沈降した血漿の上層をピペットで取り出し、廃棄した。残った血漿およびバフィーコート界面をSepmateチューブから50mLコニカル遠沈管(合計4本)にデカントした。これらのチューブにPBS+2%FBSを最高レベルまで加えて50mLとした。細胞を室温にて400xgで10分間遠心分離した。上清を廃棄した。次に、各ドナーからのペレットを1本の50mlコニカルチューブに合わせ、合計容量50mL PBS+2%FBSに再懸濁させた。細胞を室温にて400xgで5分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを任意の容量の単離バッファー(T細胞キットに供される細胞ペレットのサイズに依存)に再懸濁させた。次に、単離されたPBMCをViCell装置で計数し、単離バッファーで終濃度1×108細胞/mLとした。
T75フラスコを、PBS中、1μg/ml CD3/CD28 4mLで、37℃にて2時間コーティングした。フラスコを12mLのPBSで2回洗浄した。25mLのRPMI完全培地中、30×106の細胞を各T75フラスコに加えた。活性化させるために、細胞を37℃、5%CO2で48時間インキュベートした。
ナイーブ型および活性化型の両CD3+T細胞でH2L5hIgG4PEの結合を評価した。0.00128から100μg/mLまで5倍希釈のH2L5hIgG4PEの8点タイトレーションを用いた。
細胞をフローサイトメトリーのために以下のカクテルで染色した:
細胞を500μlの1%ホルムアルデヒド(10mLの16倍濃縮ホルムアルデヒド+150mLの1倍PBS)に再懸濁させ、室温で20分間インキュベートした。次に、室温にて400xgで5分間遠心分離しつつ、細胞を1mLのFACSバッファーで2回洗浄した。その後、ペレットを265μlのFACSバッファーに再懸濁させ、96ウェル丸底プレートに移した。フローサイトメトリーによる分析まで、細胞を暗所にて4℃で保存した。
フローサイトメトリーは、FACS Fortessa X20またはFACS Canto IIのいずれかで、FACSDivaソフトウエア(バージョン8.0)を用いて行った。補正は、単一の染色eBioscience UltracompビーズとFACSDivasの補正ソフトウエアを用いて、取得の時点で行った。
データの取得および補正は、BD Diva(バージョン8.0)ソフトウエアを用い、BD FACS装置、LSR Fortessa X−20またはFACS Canto IIで行った。データ分析では、Flow Joソフトウエア(バージョン10.0.8r1)を使用した。結果は、MFI(中央蛍光強度)および全生細胞または適当な親集団の外側のヒトIgGκ軽鎖FITC染色陽性の細胞のパーセントの両方として報告する。EC50は、グラフパッド・プリズム5ソフトウエア(バージョン5.04)を、4パラメーターの変化する傾き(log(アゴニスト)対応答−−変化する傾き)を用いる変換データの非線形回帰(X=(log(X))とともに使用して決定した。
Rosette Sep CD3濃縮キットまたはDynabead UntouchedT細胞単離キットのいずれかを用いた新鮮な全ヒト血液からのT細胞の単離は、抗CD3 PeCy7を用いた染色によって確認した。ドナーはCD3細胞に対して68%〜97%陽性の間の範囲にあった。抗CD3/抗CD28活性化CD4+およびCD8+細胞集団からは、抗ヒトIgG1κ軽鎖FITC染色に関して評価した場合、H2L5hIgG4PE濃度依存曲線が得られた。H2L5hIgG4PE結合曲線を抗ヒトIgG1κ軽鎖FITC陽性パーセントとFITC中央蛍光強度(MFI)の両方として表す。IgG4アイソタイプ対照抗体とともにインキュベートしたT細胞からは、抗ヒトIgG1κ軽鎖FITC染色に関して評価した場合、濃度依存曲線は得られなかった。ナイーブCD4+またはCD8+細胞から完全な曲線は得られなかったが、0.1μg/mL〜100μg/mLで濃度依存的増加が見られた。
本研究は、H2L5hIgG4PE(抗ICOSアゴニスト抗体)が健康なヒトドナーからの活性化T細胞上のICOS受容体と結合することを示した。T細胞の細胞表面へのH2L5hIgG4PEの結合は、FITCで標識されたヒトIgGκ軽鎖に対する抗体を用いて検出した。
標的関連種におけるH2L5 hIgG4PEのin vivo特性を評価するために、カニクイザルで用量範囲探索試験を行った。この試験では、ビヒクル対照コホートに加えて3用量水準(0.3、3および30mg/kg)を検討した。それは初回用量の14日後に2回目の用量を投与する反復用量とした。1コホートにつき男性1名と女性1名を試験した。H2L5 hIgG4PEは、供試した異なる3用量でCmax(μg/mL)およびAUC(μg.h/mL)において用量依存的増加を示した。3用量水準の総てで、抗体は初回投与後2週間血漿中に検出された(図12A)。抗H2L5 hIgG4PE抗体は、単回投与後の3個体のサル(0.3mg/kgを投与した動物の両方ならびに3mg/kgを投与した雌)で検出された。抗H2L5 hIgG4PE抗体は、これらの動物において2回目の用量の投与後の血漿濃度の低下と相関があった(図12B)。2回目の用量の48時間後に総ての動物を犠牲にし、薬力学的活性の分析および組織病理学的分析のために組織を採取した。
試験準備
細胞株
Ba/F3−ICOS細胞はINSERM(パリ、フランス)から入手した。細胞を37℃、加湿インキュベーター内、5%CO2下、10%ウシ胎児血清(FBS)(Sigma−Aldrich、セントルイス、MO)、10ng/mL組換えマウスIL−3(R&D Systems、ミネアポリス、MN)、および1mg/mLジェネティシン(ThermoFisher、ウォールサム、MA)を添加した適当な培養培地で培養した。
細胞内シグナル伝達抗体アレイ
タンパク質溶解液を、PathScan(登録商標)細胞内シグナル伝達アレイキット(Cell Signaling Technologies)を製造者の説明書に従って用いてアッセイした。簡単に述べれば、IgG4−PE(20μg/mL)またはH2L5 hIgG4PE(0.2、2、または20μg/mL)で1、6、24、および48時間処理したBa/F3−ICOS細胞からの溶解液を、アレイ希釈バッファーで1μg/μLとなるように希釈し、抗体アレイ上、4℃で一晩インキュベートした。アレイの画像を、Odysseyイメージングソフトウエア(LI−COR Biosciences、リンカン、NE)を用いてキャプチャーした。
AKTのリン酸化を、Meso Scale Disocovery(MSD)ホスホ(Ser473)/全Akt全細胞溶解液キットおよびホスホ−Akt(Thr308)全細胞溶解液キットを製造者の説明書に従って用いて測定した。細胞を96ウェルU底プレート(BD Falcon)の適当な培養培地(100μL/ウェル)に0.25×106細胞/ウェルの細胞密度で播種した。細胞を、3倍希釈法(用量範囲:20.0〜0.03μg/mL)を用いた7種類の異なる濃度の対照抗体(IgG4 PE)、抗ICOS IgG1 Fc無効抗体、またはH2L5 hIgG4PEのいずれかで、2反復ウェルとして、1、2、4、6、24,または48時間処理した。ホスホ−AKT(Thr308)全細胞溶解液キットを用いる1つの試験では、細胞を、1濃度の3種類総ての抗体(10μg/mL)で、3反復のウェルとして処理した。各96ウェルプレートの一番下の列は細胞対照を含まず(2つのブランク2反復ウェル)、細胞は抗体で処理せずに残した。処理後、細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する30μLの氷冷溶解バッファーで溶解し、氷上で30分間インキュベートした後、25μLの溶解液をELISAプレートに移して4℃で一晩インキュベートした。
細胞内シグナル伝達抗体アレイのデンシトメトリー分析
デンシトメトリー分析を行って、抗体アレイ間のスポットの積分強度レベルを算出した。各スポットの強度をそのアレイ上の陽性対照の平均値に対して正規化し(式=サンプルウェル/陽性対照の平均値)、グラフパッド・プリズム6.0(ラホヤ、CA)を用いてグラフ化した。
リンタンパク質パーセントは、以下の計算:リンタンパク質%=((2×ホスホ−シグナル)/(ホスホ−シグナル+総タンパク質シグナル))×100を用い、各ウェルについて算出した。次に、この値を各時点の非処理細胞値に対して正規化し、マイクロソフト・エクセル2007で「対照%」としてグラフ化した。
従前の研究で、H2L5 hIgG4PE処理はBa/F3−ICOS細胞においてホスホ−AKT(S473)レベルを上昇させ、抗体暴露の30〜40分後の間に最大応答が見られたことが示された。ここで、上昇したリン酸化レベルが数日後に持続していたかどうかをみるために、以後の時点でホスホ−AKTレベルを測定した。加えて、ICOS活性化による他の細胞内シグナル伝達事象の調節も評価した。Ba/F3−ICOS細胞において、ホスホ−AKT(S473)レベルは、1時間および6時間の処理後にIgG4−PEアイソタイプ対照抗体処理細胞に比べてH2L5 HIGG4PE処理で上昇したが、この効果は24時間に失われた(図15)。興味深いことに、同様の効果が、細胞が抗体のFc領域が無効である抗ICOS抗体で処理された場合にも見られた。また、H2L5 hIgG4PEおよび抗ICOS IgG1 Fc無効抗体処理細胞でも、1時間の処理後にIgG4−PE(図15)アイソタイプ対照抗体処理細胞に比べてホスホ−AKT(T308)レベルの上昇が見られ、測定された最終時点であった48時間まで持続した。AKTの下流の他の2つのホスホ−タンパク質、すなわち、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3α(GSK3α)およびリボゾームタンパク質S6も、ICOS活性化時にそこそこ上昇したが、これらの効果は、ホスホ−AKTで見られたものほどロバストでなった。また、タンパク質溶解液も、リン酸化を測定する抗体アレイまたは細胞内シグナル伝達に関与する18のタンパク質の切断を用いて分析した。このアプローチを用いたところ、ホスホ−AKT(S473)、ホスホS6(S235/236)、およびホスホ−SAPK/JNK(T183/Y185)の3つのタンパク質だけが、ICOS活性化時にリン酸化に若干の増加を示した。
AKTシグナル伝達カスケードは、受容体型チロシンキナーゼ、インテグリン、BおよびT細胞受容体、サイトカイン受容体、Gタンパク質共役受容体およびPI3Kによるホスファチジルイノシトール(3,4,5)トリスホスフェート(PIP3)の産生を誘導するその他の刺激により活性化され得る[Carnero, 2008]。これらの脂質は、Aktおよびその上流アクチベーターPDK1のための原形質膜ドッキング部位として働く。膜において、PDK1は、Thr308でAKTをリン酸化してAktの部分的活性化をもたらす[Alessi, 1996]。mTORC2によるSer473でのAktのリン酸化は、完全な酵素活性を刺激する[Sarbassov, 2005]。
試験準備
初代ヒトPBMCの単離
新鮮な血液をGSKヘルスセンターの血液ドナーから入手し、フェノールレッド不含10%RPMI1640培地で1:1希釈した。希釈した血液をUni−Sep Max 50mlコニカルチューブ中の密度媒体の上に重層し、室温にて400xgで20分間、ブレーキをオフにして遠心分離した。得られた白色単核層(バフィーコート)を100μMセルストレーナーを通して新しい50mLコニカルチューブに注意深く抽出した。このバフィーコートに等容量のフェノールレッド不含10%RPMI1640培地を加え、室温にて300xgで10分間遠心分離した。この細胞ペレットを10mlの赤血球溶解溶液(Sigma Aldrich)に再懸濁させ、室温で5分間インキュベートした。細胞を培地で1回洗浄し、従前に記載したように遠心分離した。容量をフェノールレッド不含10%RPMI1640培地で40mlとし、ViCellセルカウンターおよびバイアビリティアナライザー(Beckman Coulter)を用いて細胞を計数した。
ヒト単球を、プラスチック接着法を用いて単離した。簡単に述べれば、2000万個の新たに単離したPBMCを、T−75組織培養フラスコ内のAIM−V培地(Thermo Fisher)中で3時間培養した。プラスチックに結合していない細胞を洗い流した。接着単球を37℃、5%CO2インキュベーター内の1000U/mlのヒトGM−CSF(カタログ番号300−03、PeproTech)および500U/mlのヒトIL−4(カタログ番号200−04)を添加したAIM−V培地中で培養した。7〜10日後に、iDC細胞を、同種異系混合リンパ球反応アッセイにおいて種々のドナー由来のT細胞と共培養するために採取した。
ヒトT細胞を、ヒトT細胞濃縮カクテル(Stem Cell Technologies)を用いて、新鮮なヒト血液から直接的に単離した。RosetteSepヒトT細胞濃縮カクテル(50μL/mL)を全血に加え、よく混合した。室温で20分のインキュベーション後、等容量のPBS+2%FBSを穏やかに混合しながら加えた。希釈サンプルを密度媒体の上に重層し、室温にて1200xgで20分間、ブレーキをオフにして遠心分離した。密度媒体から濃縮された細胞:血漿界面を新しいコニカルチューブに注意深く注いだ。次に、赤血球を赤血球溶解バッファー(Sigma Aldrich)で溶解させ、濃縮細胞をPBS+2%FBSで2回洗浄した。次に、T細胞を40mlのPBS+2%FBSに再懸濁させ、Vi−Cellセルカウンターで計数した。
ヒトPBMC前刺激アッセイ
新たに単離したヒトPBMCを、37℃、T−75組織培養フラスコ内の、100ng/mlのMCSFおよび100IU/mlのIL−2(PeproTech)を添加したAIM−V培地中、CD3/CD28 T細胞拡大Dynaビーズで、1:20のビーズ:細胞比にて前刺激した。48時間後、前刺激ビーズを磁気的に除去し、細胞を洗浄し、計数し、組織培養処理を施していない96ウェル丸底プレートにて、100IU/mlのIL−2(PeproTech)を添加したAIM−V培地中、抗CD3 Dynaビーズおよび治療用抗体で再刺激した。播種密度は100k細胞/100μl培地/ウェルであった。37℃で3.5日間インキュベートした後、MSDによるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を採取した。
健康なヒトボランティアからの単球由来iDCを、異なるドナーから新たに単離したヒトT細胞と1:10比(iDC:T)で混合し、37℃、AIM−V培地中、0.02μg/mlのCEFTペプチド混合物の存在下で24時間、プレインキュベートした。処理抗体の種々の群をこれらのウェルに直接加え、混合し、さらに4日間インキュベートした。MSD分析によるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を回収した。
組織培養上清におけるIFN−γ、IL−10、IL−2およびTNF−αサイトカインレベルを、MSDヒトV−Plex特注キットを用いて測定した。まず、サンプルを希釈剤2で1:200希釈した。キャリブレーターも、製造者の推奨に従い、希釈剤2で調製した。希釈サンプルおよびキャリブレーターを黒色MSDプレートに加えた後、粘着性プレートシールで封止し、振盪しながら室温で2時間インキュベートした。希釈剤2で新たに調製した25μLの検出抗体溶液を各ウェルに加えた後、プレートを再封止し、振盪しながら室温でさらに2時間インキュベートした。これらのプレートを150μL/ウェルのPBS+0.05%Tween−20で3回洗浄した後、新たに希釈した150μl/ウェルの2倍リードバッファーを加え、すぐにMESO QuickPlexリーダーで読み取った。データはMSD Workbenchソフトウエアを用いて分析した。
MSDデータ分析
MSDデータを、Disocovery Workbenchソフトウエア(MSD、バージョン4.0.9)で分析した。プレート特異的標準曲線を作成するために、製造者のキット内のキャリブレーターを各MSDプレートに含め、総ての場合でR2値は0.99であった。検出されたサイトカインの量を標準曲線に基づいて計算し直し、3回の生物学的反復からの平均値および標準偏差を用いてグラフを作成した。
各処理抗体の固有アイソタイプ対照の対数変換した変化倍率データに対して一元配置ANOVAを行った。異なるドナー間の単剤療法と組合せの両方を比較するためにダネットの多重比較検定を行った。P<0.05を統計的に有意と見なした。
PBMC前刺激アッセイの開発およびH2L5hIgG4PEとイピリムマブおよびペンブロリズマブとの組合せ活性の試験
前刺激の最適条件を決定するために、ヒト抗CD3 Dynaビーズおよび抗CD3/CD28 Dynaビーズ(Thermo Fisher)を種々のビーズ:細胞比で試験した。前刺激48時間後に、細胞を採取し、ビーズを磁気的に除去した後、抗ICOS抗体単独または抗CTLA−4もしくは抗PD1との組合せとともに抗CD3 Dynaビーズ(ビーズ:細胞比=1:1)で刺激した。H2L5 hIgG4PE単剤処理は、試験した総ての前刺激条件でアイソタイプ対照と比較して、IFN−γの誘導をもたらした。H2L5hIgG4PEにより誘導されたIFN−γの規模は、前刺激の強度と逆相関した。H2L5 hIgG4PEとイピリムマブの組合せは、弱く前刺激されたPBMCにおいて、H2L5 HIGG4PEまたはイピリムマブのいずれか単独に比べて、サイトカイン産生の増強を示した。この組合せ効果は、より強い前刺激条件と考えられるプレート結合型抗CD3/抗CD28前刺激条件下では失われた。これらの結果に基づき、抗CD3/抗CD28ビーズをビーズ:細胞比1:20で用いる前刺激条件を、その後の総てのPBMCアッセイのために選択した。4名の個々のドナーからの結果を抗CTLA−4組合せに関しては図16に、抗PD−1との組合せに関しては図17にまとめる。
H2L5 hIgG4PEの用量依存的活性を、1:20の所定ビーズ:細胞比ににて抗CD3/抗CD28ビーズで前刺激したヒトPBMCにおいて評価した。抗RSV IgG4PEおよび抗ICOS 422.2 IgG1 Fc無効型を対照として含めた。8濃度のH2L5 HIGG4PEを試験した(100、30、10、3、1、0.3、0.1、および0.03μg/ml)。IFN−γ、IL−10およびTNF−αを、PBMCサンプルの組織培養上清においてMSDにより評価した。H2L5 hIgG4PEは用量依存的にIFN−γ、IL−10およびTNF−α生産を誘導したが、アイソタイプ対照IgG4またはFc無効型422.2は誘導しなかった。これらの結果を用いて、組合せ試験で使用するH2L5 hIgG4PEの濃度を決定した。
ヒトMLRアッセイを最適化する試みにおいて、ヒトT細胞および異なるドナー由来の単球由来未熟DCの共培養に加えて、抗CD3ビーズも、細胞のプライミングを助けるよう基礎的TCR刺激を提供するためにウェルに加えた。結果は、抗CD3ビーズがIFN−γ誘導の範囲を大幅に増大したことを示した。イピリムマブ単独もまた抗CD3ビーズの不在下でIFN−γ生産を誘導し得るが、H2L5 hIgG4PE単独またはH2L5 HIGG4PE/イピリムマブの組合せのみが、抗CD3ビーズの存在下で、対応する対照を超えるIFN−γ生産の増強を示した。
H2L5 hIgG4PE単独またはイピリムマブとの組合せの免疫刺激活性を、同種異系ヒトMLRアッセイで試験し、ここでは、T細胞を、0.02μg/mlのCEFTペプチドの存在下、不一致ドナー由来の単球由来未熟DCとともに1日間プレインキュベートした。H2L5hIgG4PE/イピリムマブの組合せは、いずれかの薬剤単独に比べてIFN−γ産生bに有意な増強をもたらした。結果は、試験下3ペアのドナーで一致したが、ドナー間で若干の変動が見られた(図18)。
また、H2L5hIgG4PEとペンブロリズマブの組合せも、上記のヒト同種異系MLRアッセイで試験した。H2L5hIgG4PEを単独で、また10μg/mlのペンブロリズマブとの組合せで試験した。H2L5 hIgG4PEとペンブロリズマブの組合せは、いずれかの薬剤単独に比べてIFN−γの増大をもたらした。しかしながら、高いドナー変動と一部のドナーでの単剤抗PD−1処理の著明な活性のために統計的有意性には達しなかった(図19)。
ICOSは、ナイーブT細胞で弱く発現され、活性化CD4+およびCD8+T細胞では即座にアップレギュレートされる補助受容体である。ICOSのリガンドはICOS−L(B7h、B7RP−1、CD275)であり、このリガンドは、専門のAPCにより、また、TNF−α刺激後の末梢の上皮細胞および内皮細胞によって発現される。ICOS:ICOS−L経路は、T細胞の増殖および機能の重要な補助刺激シグナルを提供する。アゴニスト抗体によりICOSの標的化は、T細胞の活性化およびエフェクター機能の持続におけるその役割のために、抗腫瘍免疫を増強するためのもっともらしいアプローチとなり得る。
ヒトPBMCマウス腫瘍モデル
方法
試験準備
動物に関する総ての手順は、試験プロトコールの開始前にGSK所内動物実験委員会(GSK Institutional Animal Care and Use Committee)によって審査および承認された。
A2058はATCCプロトコールに従って増殖させた。
・A2058ヒト黒色腫細胞株:ATCC、カタログ番号CRL−11147、ロット番号59349362
・DPBS:ATCC、カタログ番号30−2200、ロット番号63357436
・ダルベッコの改変イーグル培地:ATCC、カタログ番号30−2002、ロット番号62596471 有効期限:2015年10月
・ウシ胎児血清:Sigma−Aldrich、カタログ番号12176c−1000ml、ロット番号13G180R0H1、有効期限:2018年7月
・0.25%(w/v)トリプシン−0.53mM EDTA:ATCC、カタログ番号30−2102、ロット番号62420300
・抗生物質−抗真菌剤(100X):Life Technologies、カタログ番号15240−062
・T175細胞培養フラスコ:Greiner bio−one、カタログ番号661175
・T75細胞培養フラスコ:Greiner bio−one、カタログ番号658175
・A2058完全増殖培地:ダルベッコの改変イーグル培地+10%FBS。培養条件:雰囲気:空気、95%;5%二酸化炭素(CO2);温度:37℃
・細胞の受領時:
・37℃の予温完全培地。
・細胞を37℃の湯浴中で急速解凍。チューブを70%エタノールで拭き、予温完全培地を満たした15mlチューブに細胞を移す。
・1200rpmで5分間遠心分離して細胞ペレットを回収する。
・予温完全培地を満たしたT75フラスコに細胞を戻し、37℃でインキュベートする。
・容量を75cm2フラスコ向けとする(T175cm2フラスコに対して、比例的に必要とされる解離および培養培地の量を調整する)。
・培養培地を取り出し、廃棄する。
・簡単に述べれば、細胞層をDPBSですすいで、トリプシン阻害剤を含有する総ての血清痕跡を除去する。
・2.0〜3.0mLのトリプシン−EDTA溶液をフラスコに加え、細胞層が分散するまで(2〜3分)倒立顕微鏡下で細胞を観察する。
・注:細胞が剥離するまで待つ間、フラスコが当たったりフラスコを振ったりすることで塊状物が細胞をかき回さないようにする。剥離困難な細胞は分散を助けるために37℃に置いてもよい。
・10mLの完全増殖培地および穏やかなピペット操作による吸引細胞を加える。
・1200rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収し、10mlの完全増殖培地を加える。
・細胞懸濁液の適当なアリコートを新しい培養容器に加える。37℃で培養物をインキュベートする。
・培地の更新:2〜3日ごと。
・細胞を1×DPBSで洗浄し、3ml 1×トリプシンを2〜3分加える。
・組織培養フード内で、完全増殖培地を加え、細胞懸濁液を無菌コニカル遠沈管に回収する。
・細胞を1200rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。
・細胞を1×DPBS溶液で洗浄し、1200rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。この洗浄を2回繰り返す。
・細胞数および生存判定用の血球算定器で細胞を計数する。
・細胞を氷冷PBSにIn Vivo接種のための濃度(A2058、2.5e7/ml、2.5e6/100μl/マウス)で再懸濁させる。
材料:
・マウス:NOD.Cg−Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ。Jackson Laboratory Stock:005557雌 齢:6週
・Attached Needle 25G5/8を備えた1mLツベルクリンシリンジ:Becton Dickinson、カタログ番号305554
・PDI(商標)Alcohol Prep Pads:Professional Disposables、カタログ番号B339
・PDI(商標)Povidone−Iodine Prep Pad:Professional Disposables
・カタログ番号B40600
・マウスの準備
・マウスは6週齢とする。
・マウスの到着後、3〜5日の馴化期間を設ける。
・マウスの右後方側腹部を剃毛する。
・マウスの接種領域をヨウ素パッド、次いで、エタノールパッドで清浄化および消毒する。
・1ccシリンジおよび25ゲージ針を使用する。
・プランジャーを抜き、細胞を混合し、100μlの細胞をシリンジに入れ、プランジャーを注意深く挿入する。
・細胞をマウスの右後方側腹部の皮下に(s.c.)注射する。
・腫瘍増殖評価
・腫瘍を測定するために、腫瘍辺縁を容易に見出せるように柔毛を70%エタノールで湿らせる。腫瘍サイズおよび体重を2〜3日ごとに測定する。
・腫瘍サイズをデジタルカリパスで測定し、体積を以下のように決定する:腫瘍体積(mm3)=(長さ)×(幅)2/2
・ヒトPBMCの静脈内投与
・ヒトPBMC投与は、腫瘍が平均体積およそ100mm3に達した際の1週間後に開始できる。
・新鮮なヒトPBMC:Allcells、カタログ番号C−PB102−3B2
・Attached Needle 25G5/8を備えた1mLツベルクリンシリンジ:Becton Dickinson、カタログ番号305554
・PDI(商標)Alcohol Prep Pads:Professional Disposables、カタログ番号 B339
・PDI(商標)Povidone−Iodine Prep Pad:Professional Disposables、カタログ番号B40600
・ガーゼスポンジ:Covidien、カタログ番号441211
・マウス・テール・イルミネーター・レストレーナー:Braintree scientific、カタログ番号MTI STD
・PBMCの調製
・新鮮なヒトPBMCは、一晩の輸送によりAllcellsから購入する。
・細胞を1400rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。
・細胞を1×DPBS溶液で洗浄し、1400rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。
・細胞を氷冷PBSにIn Vivo注射のための濃度(20e7/ml)で再懸濁させる。
・1ccシリンジおよび25ゲージ針を使用する。
・プランジャーを抜き、細胞を混合し、100μlの細胞をシリンジに入れ、プランジャーを注意深く挿入する。
・細胞を氷上で維持する。
・尾静脈注射
・マウスを白熱灯で温める。
・マウスをテール・イルミネーター・レストレーナーで拘束する。
・静脈を可視化するために尾をやや回転させる。
・注射部位をヨウ素パッド、次いで、エタノールパッドで清浄化および消毒する。
・針をやや角度をもって静脈に挿入し、細胞を注入する。
・針を抜き、出血が止まるまでガーゼスポンジで軽く圧迫する。
・動物をケージに戻し、出血が再開していないことを確認するために5〜10分間観察する。
・ヒトPBMC注射の1〜3日後に、マウスに腹腔内注射により抗体を投与する。
・完全ヒトIgG1アイソタイプ対照:Eureka therapeutics、カタログ番号ET−901(前臨床グレード) ロット番号15−726 有効期限:2017年2月
・イピリムマブ(ヤーボイ):Bristol−Myers Squibb NDC 0003−2327−11、ロット番号921873 有効期限:2015年4月;ロット番号4H69490、有効期限:2016年5月
・完全ヒトIgG4アイソタイプ対照:Eureka therapeutics、カタログ番号ET−904(前臨床グレード) ロット番号15−726 有効期限:2017年2月
・抗ヒトICOS H2L5 hIgG4PE
・ペンブロリズマブ(キートルーダ):Merck、NDC 0006−3026−02、ロット番号 L010592、有効期限:2016年4月26日
・腹腔内注射:
・投与する100μlをシリンジおよびニードルに吸い取る。
・針のベベルをシリンジ上の数字に揃える。
・利き腕でない手で動物を十分に拘束する。
・針の侵入点:膝のすぐ上の腹部を横切る仮想線を描き、この線に沿って動物の右側の正中付近に針を挿入する。これが雌の場合には、侵入点は最後の乳頭の頭側、やや中央よりであることが分かるであろう。
・マウスは、頭部がその後方末端より低くなるように、頭部がやや地面に向かうように傾斜させる。
・腹部に約30°の角度で針を挿入する。
・針のシャフトは約5ミリの深さまで侵入すべきである。
・注射後、針を抜き、マウスをケージに戻す。
・血液および腫瘍のサンプリング
・材料:
・Microvette CB300(血清):Braintree Scientific、カタログ番号MV−CB30016440
・Microvette CB300(血液学/カリウムEDTA):Braintree Scientific、カタログ番号MV−CB30016444
・血液:
・マウスは、週1回、尾静脈採血した。
・30μlの血液をフローサイトメトリー分析用にMicrovette CB300(血液学/カリウムEDTA)に採取した。
・さらに30μlの血液を血清用Microvette CB300に採取し、室温で2時間インキュベートして凝固させた後、血清を採取するために2000xgで遠心分離した。血清はさらなる分析まで−20で保存した。
・腫瘍サイズが2000mm3に達した際にマウスを安楽死させた。腫瘍を回収し、以下の手順で処理した。
試験は総て、上記に列挙された手順に従って準備した。
本試験は、A2058黒色腫を移植したヒトPBMC移植NSGマウスにおけるH2L5hIgG4PEの用量依存的活性を決定するように計画された。1群当たりマウス10個体の9群とマウス7個体の1つの対照群(腫瘍のみでPBMC無し)を各試験に割り付けた。ドナー番号7129由来のヒトPBMCを用いた用量応答の処置計画の概要を表11に示す。H2L5hIgG4PEは0.04、0.4、1.2および4mg/kgで投与した。イピリムマブは3mg/kgで投与し、抗ICOSアゴニストのFc無効変異体は1mg/kgで試験した。試験群をビヒクルおよびマッチするアイソタイプ対照群と比較して評価した。生存分析は49日目の試験の終了時に行った。
試験の目的:
H2L5hIgG4PE単剤療法の抗腫瘍活性を評価するために、0.04mg/kgおよび0.4mg/kgで投与した。
この試験は、A2058黒色腫モデルを用い、ヒトPBMC移植NSGマウスにおいて、マッチするアイソタイプ対照を用い、イピリムマブまたはペンブロリズマブと組み合わせたH2L5hIgG4PE(0.01および0.04mg/kgで投与)の抗腫瘍有効性を評価するように計画された。1群当たりマウス10個体の合計13群をこの試験に割り付けた。群2は、ヒト化IgG1およびIgG4のアイソタイプ対照を合わせたものであった。H2L5hIgG4PEは単剤として0.01mg/kg(群12)および0.04mg/kg(群13)で投与した。組合せ処置については、H2L5hIgG4PE(0.01および0.04mg/kg)とイピリムマブまたはIgG1(3mg/kg)またはH2L5hIgG4PE(0.01および0.04mg/kg)とペンブロリズマブまたはIgG4(5mg/kg)を投与した。H2L5hIgG4PEおよびイピリムマブならびにマッチするアイソタイプ対照は、週2回6用量を投与し、ペンブロリズマブおよびアイソタイプ対照は、H2L5hIgG4PE投与の終了まで5日ごとに投与した。ドナー番号4568由来のヒトPBMCを用いた処置群の概要を表13に示す。処置群は、ビヒクル群およびアイソタイプ対照群と比較して評価した。生存分析は、33日目の試験の終了時に結論付けた。
生存分析のイベントは、腫瘍体積>2000mm3、腫瘍の潰瘍化、マウス体重減少>20%、瀕死または死亡の発見のいずれか早いものとした。カットオフ体積までの正確な時間は、対数腫瘍体積と2回の観察日(カットオフ体積を超えた最初の観察およびカットオフ体積の直前の一観察)の間に直線を当てはめることによって評価した。所与の時点における異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー(KM)法を行った。エンドポイントまでの中央時間およびその対応する95%信頼区間を報告した。その後、任意の2群の間でKM生存曲線が統計的に異なるかどうかをログランク検定により検定した。
H2L5hIgG4PE用量応答(図20A)
腫瘍増殖阻害:
対照群:ヒトPBMC(ドナー7129)は、NSGマウスにおけるA2058腫瘍増殖に効果を示さなかった。ヒトPBMCを含むまたは含まないA2058担癌マウス、ビヒクルおよびアイソタイプ対照抗体で処置したヒトPBMCを含むA2058担癌マウスは、腫瘍を発達させ、予想通りの進行を示した(群番号1対群番号10、群番号1対群番号2、群番号1対群番号4、p=1)。
マウスにおける体重減少は試験中に見られ、試験の終了時ではおよそ20%であった。GvHDおよび腫瘍量の両方がマウスの体重の低下をもたらし得ることが報告されているが、PBMC移植が行われていない担癌マウス(群番号10)も同じ傾向を示したことから、本試験では、体重減少はA2058腫瘍により関連があると思われる。試験中に、アイソタイプ対照群を含め、複数の腫瘍で腫瘍の潰瘍化が見られた。
ほとんどのマウスは、腫瘍が体積>2000mm3に達した際に除かれた。3個体のマウスは、腫瘍の潰瘍化のために安楽死させ、また3個体のマウスは、>20%の体重減少のために安楽死させた。9個体のマウスは、ビヒクル群の2個体、およびアイソタイプ対照群の合計3個体を含め、群間にランダムに死亡が見られた。これらの死亡は移植片対宿主病の病態モデルの感受性に帰因するものであり、ビヒクルまたはアイソタイプ対照群に比べて処置群で何のパターンも見られなかったことから、処置に関連するものではなかった。
腫瘍増殖阻害:
対照群:ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体で処理したヒトPBMCを含むA2058担癌マウスは腫瘍を発達させ、予想通りに成長した。
3mg/kgでのイピリムマブ処理とIgG4の組合せ(群番号3)は、ビヒクル対照である群番号1に比べて有意な腫瘍増殖阻害(p<0.04)をもたらした。しかしながら、アイソタイプ対照である群番号2と比べた場合には、この統計的有意性は失われた(p<0.23)。
H2L5hIgG4PE(0.04または0.4mg/kg)とイピリムマブ(3mg/kg)の組合せ。群番号8および9は、イピリムマブ単独(群番号3)に比べて付加的な腫瘍増殖阻害を示さなかった。H2L5hIgG4PE(0.04または0.4mg/kg)とペンブロリズマブ(5mg/kg)組合せである群番号10および11は、ペンブロリズマブ単剤療法である群番号4、またはH2L5hIgG4PE単剤療法である群番号5および6に比べて、有意ではないがそこそこの腫瘍増殖阻害およびマウス生存期間を示した。
試験中に見られたマウスの体重減少はおよそ20%であった。腫瘍の潰瘍化は、試験中、大多数の群の複数の腫瘍で明らかであった。
160個体のうち合計100個体のマウスが、腫瘍体積が>2000mm3に達した際に安楽死された。29個体のマウスが腫瘍の潰瘍化のために安楽死され、18個体のマウスに死亡が見られ、12個体のマウスが体重減少>20%のために安楽死され、1個体のマウスは瀕死として安楽死された。マウスは、アイソタイプ対照である群番号2を含め、群にわたって死亡が見られた。これらの死亡は移植片対宿主病の病態モデルの感受性に帰因し、アイソタイプ対照群に比べて処置群で何のパターンも見られなかったことから、処置に関連するものではなかった。
腫瘍増殖遅延:
対照群:ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体で処理したヒトPBMCを含むA2058担癌マウスは腫瘍を発達させ、予想通りに成長した。
3mg/kgのイピリムマブ処置とIgG4の組合せ(群番号3)は、ビヒクル対照である群番号1に比べて、有意な腫瘍増殖阻害(p<0.02)および生存期間の有意な増大(p<0.01)を示した。しかしながら、アイソタイプ対照である群番号2に比べて、腫瘍増殖阻害は有意に達せず(p<0.13)、一方、マウス生存期間の有意な増大は維持された(p<0.04)。
H2L5hIgG4PEとイピリムマブの組合せ(0.01mg/kgおよびイピリムマブ3mg/kg;群番号8)は、観察可能な腫瘍増殖阻害およびマウス生存期間を示したが、統計的有意性には達し得なかった。H2L5hIgG4PEとイピリムマブの組合せ(0.04mg/kgおよびイピリムマブ3mg/kg;群番号9)は、ビヒクル対照である群番号1またはアイソタイプ対照である群番号2に比べて(p<0.02)、有意な腫瘍増殖阻害(p<0.00)および有意なマウス生存期間の増大(p<0.04)を示した。しかしながら、アイソタイプ対照と比べた場合には、生存期間は統計的有意性に達し得なかった。組合せ活性は、単剤療法イピリムマブの群番号3またはH2L5hIgG4PE単剤療法群に比べて、有意には達しなかった。
試験中に見られたマウスの体重減少はおよそ20%であった。試験中、大多数の群に腫瘍の潰瘍化が見られた。
合計91個体のマウスが>2000mm3の腫瘍サイズのために安楽死され、34個体のマウスが腫瘍の潰瘍化のために安楽死され、5個体のマウスに死亡が見られた。これらの死亡は、移植片対宿主病の病態モデルの感受性に帰因した。
単剤療法としての、またペンブロリズマブならびにイピリムマブとの組合せとしてのH2L5 hIgG4PEの有効性を、A2058黒色腫を有するヒトPBMC移植NSGマウスモデルで評価した。ヒトPBMCが生体免疫不全NSG(NOD/SCID/IL−2Rγnull)マウスに静注されるこのモデルは、Hu−PBMC NSGモデルとして知られる。それは移植片対宿主病(GvHD)を誘発し、エフェクターおよびメモリーT細胞の活性を調べるために用いられている。Hu−PBMC NSGモデルの皮下にヒト癌細胞株A2058を移植して、腫瘍増殖に対するヒト免疫療法抗体の効果を調べた。このモデルの制限には、GvHD症状の発症、体重の減少、および高頻度の腫瘍の潰瘍化が含まれ、同系マウス腫瘍モデルで可能な時間より長時間、生存期間の監視ができない。
CT26およびEMT6同系マウス腫瘍モデル
CT26マウス結腸癌腫マウス腫瘍モデル
方法
本試験は、試験の開始前にGSK所内動物実験委員会により承認されたプロトコール下で行われた。
本試験では、Harlan Sprague Dawleyからの164個体の雌BALB/cマウスを使用した。マウスは、接種を受けた試験開始時に6〜8週齢であった。
CT−26細胞(ATCC:CRL−2638)(3×106細胞;P−11)のバイアル1本を−140℃から解凍し、10%FBSを含むRPMIに播種した。細胞を10日にわたって3回継代培養した。継代培養の際、トリプシン/EDTAを用いて培養フラスコからの細胞の剥離を助けた。細胞を回収し、2回洗浄し、FBS不含のRPMIに5×105細胞/mlで再懸濁させた。マウスの右後方側腹部に0.1mlの細胞(5×104細胞/マウス)を皮下接種した。
15×106細胞/30ml培地=5×105細胞/ml。これは5×104細胞/100μlに等しい。
投与当日に、抗体をストックソースバイアルから無菌0.9%生理食塩水で目的の濃度に希釈した。抗ICOSアゴニストクローンC398.4は0.05mg/kgおよび0.5mg/kgで試験した。各用量はまた、抗PD1 10mg/kgおよび抗CTLA−4 1mg/kgの両方とともに試験した。
腫瘍のモニタリングおよび投与
0日目にマウスに接種した。11日目に体重および腫瘍体積を測定した。マウスを腫瘍サイズに基づき10個体/群で、表14に示される12の試験群に無作為化した。無作為化はStudylog Study Directorソフトウエアを用いて行った。試験計画チャートに基づき、無作為化日に開始して週2回マウスに投与を行い、合計6用量を継続した。投与は、100μl容量の0.9%生理食塩水ビヒクルで腹腔内(IP)とした。腫瘍体積および体重は、試験中、週3回測定した。
マウスは、腫瘍体積が2000mm3より大きくなった際に腫瘍量試験から除いた。腫瘍体積は、長さと幅のカリパス測定値を下式:TV=0.52*L*W2に当てはめることにより計算した。
生存分析のイベントは、腫瘍体積>2000mm3または腫瘍の潰瘍化のいずれか早いものとする。カットオフ体積までの正確な時間は、対数腫瘍体積と2回の観察日(カットオフ体積を超えた最初の観察およびカットオフ体積の直前の一観察)の間に直線を当てはめることによって評価した。所与の時点における異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー(KM)法を行った。エンドポイントまでの中央時間およびその対応する95%信頼区間を報告した。その後、任意の2群の間でKM生存曲線が統計的に異なるかどうかをログランク検定により検定した。
マウス運命の追跡は、その数のマウスが腫瘍量および腫瘍の潰瘍化のために試験から除かれたことを示した。腫瘍体積579.16mm3であるG7の1個体のマウスを除き、残ったマウスは総て、試験の61日目で腫瘍不含である。
併用療法群、特に、高用量の抗ICOSと抗PD1の組合せ(群12)は、単剤療法およびアイソタイプ対照群に比べて腫瘍増殖阻害および生存期間の増大を示したが、61日目に統計的有意性に達しなかった。群12に対するアイソタイプ対照は、ラットIgG2a+ハムスターIgGである群3であった。比較のための単剤療法群は、ICOS 10μg(群6)およびPD1 200μg(群8)である。群3の1個体、群6の1個体、および群8の1個体に比べて、群12では合計5個体のマウスが腫瘍不含として残った。生存利益は、各マウスが所定の試験エンドポイントのいずれかに達した日を考慮することにより定量化した。何個体かのマウスは、腫瘍量によるのではなく、開放腫瘍潰瘍のために試験から除かれた。
試験プロトコール
本明細書に記載される総ての手順および安楽死の基準は、IACUCプロトコールAUP0606に従う。動物の体重を測定し、右臀部にマウス当たり100μlの1×105EMT6腫瘍細胞を接種した。接種したマウスの数は、この試験に必要とされるものの少なくとも130%に相当する。30%の失敗率(試験の開始時に大きすぎるまたは小さすぎる)を仮定すると、目標は各群n=10とすることであった。腫瘍細胞の接種の後、腫瘍増殖および全体重を週3回、Fowler “ProMax”デジタルカリパスで4週間以上測定した。抗体は商業的販売者から入手し、0.9%生理食塩水で目的の濃度に希釈した。投与(i.p.)は、無作為化当日(0日目とする、この時、平均腫瘍体積はおよそ100mm3、接種およそ7〜8日後)に始し、週2回で合計6用量を行った。無作為化はStudylog Study Director Suiteソフトウエアを用いて行った。式(腫瘍体積=L*W2*0.52)を用いて腫瘍体積を決定するために、腫瘍の長さと幅を測定した。個々の動物で腫瘍測定値が2,000mm3より大きければ試験から除いた。また、マウスは、体重減少(>20%)、腫瘍の潰瘍化、または罹患による他のいずれかの正常なマウス活性の著明な阻害のために試験から除かれる場合がある。
動物
6〜8週齢の雌Balb/cマウスをHarlan Sprague Dawleyから受領し、IACUC標準に従って飼育した。
EMT6細胞を解凍し、細胞培養フラスコで、接種前8日間培養した。細胞はこの間、3回継代培養した。接種当日、細胞をフラスコから完全培地に採取した。細胞を遠心分離し、Weymouthの培地(15%FBS含有)に再懸濁させた。この工程を、FBS不含のWeymouthの培地で3回繰り返した。細胞密度および生存率をトリパンプルー排除によって確認した。次に、細胞を目的の密度(1×106細胞/mL)に希釈した。
総ての治療薬は、投与当日に0.9%塩化ナトリウムで目的の濃度に希釈し、30G針を用いてi.p.注射した。治療薬および対照希釈液を以下の表16に示す。
統計分析
生存分析のイベントは、腫瘍体積2000mm3または腫瘍の潰瘍化のいずれか早いものとした。カットオフ体積までの正確な時間は、対数腫瘍体積と2回の観察日(カットオフ体積を超えた最初の観察およびカットオフ体積の直前の一観察)の間に直線を当てはめることによって評価した。所与の時点における異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー(KM)法を行った。エンドポイントまでの中央時間およびその対応する95%信頼区間を報告した。その後、任意の2群の間でKM生存曲線が統計的に異なるかどうかをログランク検定により検定した。
Balb/cマウスに接種を行い、8日後に処置計画に基づいて10群に無作為化した。治療薬または対照の投与は無作為化当日(0日目)に開始、週2回、3週間続けた。
アイソタイプ対照は、生理食塩水ビヒクル群に比べて、平均腫瘍体積または全生存期間に著明な変化をもたらさなかったが、ハムスターIgG群(群4)およびハムスターIgGおよびラットIgG2a(群3)には、腫瘍増殖の遅延を示した個々の動物が存在した。ハムスターIgGとラットIgG2aアイソタイプ群では、1個体のマウスが最後の生理食塩水ビヒクルマウスを超えて生存し、36日目に、体積1156.56mm3と測定された腫瘍による潰瘍化のために犠牲にされた。ハムスターIgG群の2個体のマウスは、生理食塩水群より長期間生存した。1個体は36日目に腫瘍サイズのために、もう1個体は14日目に1899.28mm3の測定値を持つ潰瘍のために安楽死された。
以上に説明してきたように、本発明は以下の発明を包含する。
(1)配列番号1に示されるCDRH1;配列番号2に示されるCDRH2;配列番号3に示されるCDRH3;配列番号4に示されるCDRL1;配列番号5に示されるCDRL2および/もしくは配列番号6に示されるCDRL3、または前記CDR中に2つまでのアミノ酸置換を有する各CDRの直接的等価物のうちの1以上を含んでなる、ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(2)配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含んでなるV H ドメインおよび/または配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含んでなるV L ドメインを含んでなり、ヒトICOSと特異的に結合する、前記(1)に記載のICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(3)前記ICOS結合タンパク質がICOSアゴニストである、前記(1)または(2)に記載のICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(4)前記ICOS結合タンパク質が、ヒトICOSと、親和性がBIAcoreにより測定される場合に、
(i)少なくとも1×10 5 M −1 s −1 の結合速度定数(k on );および6×10 −5 s −1 未満の解離速度定数(k off );または(ii)約100nM未満の解離定数(K D )
で結合する、前記(1)〜(3)のいずれかに記載のICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(5)ICOS結合タンパク質が配列番号1;配列番号2;および配列番号3を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ、前記ICOS結合タンパク質が配列番号4;配列番号5;および配列番号6を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、前記(1)〜(4)のいずれかに記載のICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(6)配列番号7に示されるアミノ酸配列を含んでなるV H ドメインと、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含んでなるV L ドメインとを含んでなる、前記(1)〜(5)のいずれかに記載のICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(7)前記ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分が、ヒトIgG1アイソタイプまたはその変異体およびヒトIgG4アイソタイプまたはその変異体から選択される足場を含んでなる、前記(1)〜(6)のいずれかに記載のICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(8)前記ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分が、hIgG4PE足場を含んでなる、前記(1)〜(7)のいずれかに記載のICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(9)モノクローナル抗体である、前記(1)〜(8)のいずれかに記載のICOS結合タンパク質。
(10)ヒト化されている、前記(9)に記載のモノクローナル抗体。
(11)完全にヒト型である、前記(9)に記載のモノクローナル抗体。
(12)配列番号1;配列番号2;および配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDRと、配列番号4;配列番号5;および配列番号6に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDRとを含んでなる、前記(9)〜(11)のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
(13)ヒトICOSに対するアゴニストであり、かつ、IgG4アイソタイプ足場またはその変異体を含んでなる、前記(9)〜(12)のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
(14)hIgG4PE足場を含んでなる、前記(13)に記載のモノクローナル抗体。
(15)前記(1)〜(14)のICOS結合タンパク質のいずれか1つに比べて、ヒトICOSとの結合に関してICOS−リガンドと交差競合する、ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分。
(16)前記(1)〜(15)のいずれかに記載のICOS結合タンパク質またはモノクローナル抗体と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
(17)必要とするヒトにおいて癌、感染性疾患、または敗血症から選択される疾患を処置する方法であって、前記ヒトに、前記(16)に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
(18)前記ヒトに、少なくとも1種類の抗新生物薬、少なくとも1種類の第2の免疫調節薬、および/または少なくとも1つの免疫刺激性アジュバントを投与することをさらに含んでなる、前記(17)に記載の方法。
(19)前記第2の免疫調節薬が、抗CTLA4抗体、抗PD−1抗体、抗PDL1抗体および抗OX40抗体から選択される、前記(18)に記載の方法。
(20)必要とするヒトにおいて、癌、感染性疾患および/または敗血症の処置において使用するための、前記(16)に記載の医薬組成物。
Claims (20)
- 必要とするヒトにおいて癌および感染性疾患から選択される疾患を処置するための医薬組成物であって、ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分と薬学上許容可能な担体とを含んでなり、該ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分が、配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含んでなるVHドメインであって、配列番号7中の配列番号1、配列番号2および配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDRを保持しているV H ドメイン、および配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含んでなるVLドメインであって、配列番号8中の配列番号4、配列番号5および配列番号6に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを保持しているV L ドメインを含んでなるものであり、かつ、ヒトICOSと特異的に結合するものである、医薬組成物。
- 前記処置において、前記ヒトに、少なくとも1種類の抗新生物薬、少なくとも1種類の第2の免疫調節薬、および/または少なくとも1つの免疫刺激性アジュバントが投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記第2の免疫調節薬が、抗CTLA4抗体、抗PD−1抗体、抗PDL1抗体および抗OX40抗体から選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が癌である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、結腸直腸癌(CRC)、食道癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、黒色腫、腎細胞癌(RCC)、EC扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、中皮腫、および前立腺癌から選択される、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が感染性疾患である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記感染性疾患がHIVである、請求項6に記載の医薬組成物。
- ヒトにおいてT細胞増殖を刺激する、T細胞の活性化を誘導する、および/またはサイトカイン産生を誘導するための医薬組成物であって、ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分と薬学上許容可能な担体とを含んでなり、該ICOS結合タンパク質またはその抗原結合部分が、配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含んでなるVHドメインであって、配列番号7中の配列番号1、配列番号2および配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDRを保持しているV H ドメイン、および配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含んでなるVLドメインであって、配列番号8中の配列番号4、配列番号5および配列番号6に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを保持しているV L ドメインを含んでなるものであり、かつ、ヒトICOSと特異的に結合するものである、医薬組成物。
- 前記疾患が癌である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ICOS結合タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項10に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含んでなるVHドメインと、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含んでなるVLドメインとを含んでなる、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、ヒトIgG1アイソタイプまたはその変異体およびヒトIgG4アイソタイプまたはその変異体から選択される足場を含んでなる、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が足場を含んでなり、該足場がヒトIgG4アイソタイプであり、かつ、S228P変異およびL235E変異を含むFc領域を含んでなる、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記免疫刺激性アジュバントがTLR4アゴニストである、請求項2に記載の医薬組成物。
- TLR4アゴニストが、CRX−601:
- 抗PD−1抗体が、ペンブロリズマブまたはニボルマブである、請求項3に記載の医薬組成物。
- 抗PD−1抗体がペンブロリズマブである、請求項17に記載の医薬組成物。
- 抗CTLA4抗体がイピリムマブである、請求項3に記載の医薬組成物。
- 必要とするヒトにおいて癌を処置するための医薬組成物であって、ヒトICOSと特異的に結合するモノクローナル抗体と薬学上許容可能な担体とを含んでなり、前記モノクローナル抗体が、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含んでなるVHドメインと、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含んでなるVLドメインとを含んでなるものであり、前記抗体が足場を含んでなり、該足場がヒトIgG4アイソタイプであり、かつ、S228P変異およびL235E変異を含むFc領域を含んでなるものである、医薬組成物。
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