TWI717332B - Ｉｃｏｓ結合蛋白 - Google Patents

Ｉｃｏｓ結合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
TWI717332B
TWI717332B TW105102393A TW105102393A TWI717332B TW I717332 B TWI717332 B TW I717332B TW 105102393 A TW105102393 A TW 105102393A TW 105102393 A TW105102393 A TW 105102393A TW I717332 B TWI717332 B TW I717332B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
icos
binding protein
cells
cell
antibody
Prior art date
Application number
TW105102393A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201702267A (zh
Inventor
劉耀斌
雷達哈 帕瑪爾
派翠克 瑪雅斯
丹尼爾 奧利弗
Original Assignee
英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司
法國國家健康及醫學研究中心
尚波立及愛琳卡默茲中心
艾克斯 馬賽大學
法國國家研究科學中心
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司, 法國國家健康及醫學研究中心, 尚波立及愛琳卡默茲中心, 艾克斯 馬賽大學, 法國國家研究科學中心 filed Critical 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司
Publication of TW201702267A publication Critical patent/TW201702267A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI717332B publication Critical patent/TWI717332B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明是有關於一種ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，以及使用該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分來治療癌症、傳染病及/或敗血病的方法，該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分為人類ICOS的促效劑，但與T細胞在活體內接觸時不會誘發補體、ADCC或CDC。本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合部分與T細胞接觸時進一步能活化T細胞；與該T細胞接觸時刺激T細胞增生及/或與該T細胞接觸時誘發細胞激素生成。本發明是有關於ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含下列中的一或多者：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；及/或SEQ ID NO：6。

Description

ICOS結合蛋白
本發明大體上是有關於治療人類疾病並且降低與其相關之不良事件的免疫療法。更具體地，本發明是有關於ICOS結合蛋白(包括ICOS促效抗體)的用途及其作為免疫調節劑在治療癌症、傳染病及/或敗血病方面的用途。
對於癌症治療來說，增強抗腫瘤T細胞功能並且誘發T細胞增生是一種強力且新穎的方法。目前市面上有三種免疫腫瘤學抗體(例如免疫調節劑)。透過緩解已被引發且活化之腫瘤特異性T細胞的抑制性檢查點，抗CTLA-4(YERVOY/易普利單抗(ipilimumab))被認為會在T細胞啟動點處放大免疫反應而抗-PD-1抗體(OPDIVO/納武單抗(nivolumab)與KEYTRUDA/派姆單抗(pembrolizumab))被認為在局部腫瘤微環境中發生作用。
ICOS是一種與CD28/CTLA-4-Ig超家族在結構上及功能上相關的共刺激性T細胞受體(Hutloff,et al.,"ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28",Nature,397：263-266(1999))。ICOS是透過ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)結合而發生活化。B7-1或B7-2(CD28與CTLA4的配體)都不會結合或活化ICOS。但是，ICOS-L已顯示會微弱地結合至CD28與CTLA-4(Yao S et al.,“B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”,Immunity,34(5)；729-40(2011))。ICOS的表現似乎限於T細胞。 ICOS表現位準在不同的T細胞子集還有在T細胞活化狀態方面有所差異。在休止TH17、T濾泡性輔助(TFH)T細胞及調節T細胞(Treg)上已顯示ICOS表現；但是不同於CD28，在原有TH1與TH2效應T細胞群上並未高度表現(Paulos CM et al.,“The inducible costimulator(ICOS)is critical for the development of human Th17 cells”,Sci Transl Med,2(55)；55ra78(2010))。在透過TCR接合的活化之後，在CD4+與CD8+效應T細胞上的ICOS表現被高度誘發(Wakamatsu E,et al.,“Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells”,Proc Natal Acad Sci USA,110(3)；1023-8(2013))。經由ICOS受體的共刺激性訊號傳遞僅發生在接收同時TCR活化訊號的T細胞中(Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28 Superfamily”,Nat.Rev Immunol,2(2)；116-26(2002))。在活化的抗原特異性T細胞中，ICOS調節TH1與TH2細胞激素這兩者的生成，TH1與TH2細胞激素包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13與其他。ICOS也刺激效應T細胞增生，雖說比CD28的程度還低(Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28 Superfamily”,Nat.Rev Immunol,2(2)；116-26(2002))。
越來越多文獻贊同在CD4+與CD8+效應T細胞上活化ICOS具有抗腫瘤潛力的概念。在帶有SA-1(肉瘤)、MethA(纖維肉瘤)、EMT6(乳房)及P815(肥胖細胞瘤)及EL-4(漿細胞瘤)同基因腫瘤的小鼠中，ICOS-L-Fc融合蛋白會導致腫瘤生長延緩以及腫瘤完全根除，但在已知為免疫性不良的B16-F10(黑色素瘤)腫瘤模型中觀察到沒有活性(Ara G et al.,“Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors in syngeneic hosts”,Int.J Cancer,103(4)；501-7(2003))。ICOS-L-Fc的抗腫瘤活性取決於完整的免疫反應，因為在裸鼠體內生長的腫瘤中完全喪失活性。分析經ICOS-L-Fc處理的小鼠腫瘤分析證實，在腫瘤中CD4+與CD8+ T細胞浸潤對治療產生反應而明顯地增加，支持ICOS-L-Fc在這些模型中的免疫刺激性效用。
另一個使用ICOS-/-及ICOS-L-/-小鼠的報導證實，於B16/B16黑色素瘤同基因腫瘤模型中，ICOS訊號傳遞在媒介抗-CTLA4抗體的抗腫瘤活性時是必要的(Fu T et al.,“The ICOS/ICOSL pathway is required for optimal antitumor responses mediated by anti-CTLA-4 therapy”,Cancer Res,71(16)；5445-54(2011))。相較於野生型小鼠，缺乏ICOS或ICOS-L的小鼠在抗-CTLA4抗體治療之後的存活率明顯下降。在一個單獨研究中，轉導B16/B16腫瘤以過度表現重組鼠類ICOS-L。相較於轉導對照蛋白的B16/B16腫瘤細胞，發現這些腫瘤對於抗-CTLA4治療明顯更為敏感(Allison J et al.,“Combination immunotherapy for the treatment of cancer”,WO2011/041613 A2(2009))。這些研究提供了ICOS促效劑單獨以及與其他免疫調節性抗體組合的抗腫瘤潛力的證據。
來自經抗-CTLA4抗體治療之患者的新數據也指出，ICOS+效應T細胞在媒介抗腫瘤活性反應中的積極角色。帶有轉移性黑色素瘤(Giacomo AMD et al.,“Long-term survival and immunological parameters in metastatic melanoma patients who respond to ipilimumab 10mg/kg within an expanded access program”,Cancer Immunol Immunother.,62(6)；1021-8(2013))；泌尿道上皮癌(Carthon BC et al.,“Preoperative CTLA-4 blockade：Tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial”Clin Cancer Res.,16(10)；2861-71(2010))；乳癌(Vonderheide RH et al.,“Tremelimumab in combination with exemestane in patients with advanced breast cancer and treatment-associated modulation of inducible costimulator expression on patient T cells”,Clin Cancer Res.,16(13)；3485-94(2010))；及前列腺癌的患者(其循環與腫瘤浸潤CD4+ICOS+與CD8+ICOS+ T細胞的絕對計數在易普利單抗治療之後增加)比起觀察到絕對計數增加很少或沒有增加的患者有明顯更好的治療相關結果。重要的是，顯示易普利單抗改變了ICOS+ T效應子：Treg比 率，與治療後的Treg相對起來，反轉治療前Treg豐度相對於顯著T效應子豐度(Liakou CI et al.,“CTLA-4 blockade increases IFN-gamma producing CD4+ICOShi cells to shift the ratio of effector to regulatory T cells in cancer patients”,Proc Natl Acad Sci USA.105(39)；14987-92(2008))及(Vonderheide RH et al.,Clin Cancer Res.,16(13)；3485-94(2010))。因此，ICOS陽性T效應細胞是易普利單抗反應的正向預測生物標記，其表明了使用拮抗劑ICOS抗體活化這個細胞群的潛在優勢。
因而，對於在治療癌症時的額外T細胞增生誘發分子有需要。
在本發明的一個具體例中，提供ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含以下一或多者：如SEQ ID NO：1中所示CDRH1；如SEQ ID NO：2中所示CDRH2；如SEQ ID NO：3中所示CDRH3；如SEQ ID NO：4中所示CDRL1；如SEQ ID NO：5中所示CDRL2及/或如SEQ ID NO：6中所示CDRL3或每一CDR的直接等效物，其中直接等效物在該CDR中具有不超過兩個胺基酸置換。
在本發明的一個具體例中，提供ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分特異地結合至人類ICOS，其中該ICOS結合蛋白包含含有與如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列的VH域，及/或含有與如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列的VL域。
在一個具體例中，提供人類化單株抗體或其抗原結合部分，其包含具有如SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；與SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的重鏈CDR以及具有如SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；與SEQ ID NO：6中所示胺基酸序列的輕鏈CDR。在一個具體例中，提供人類化單株抗體，其包含hIgG4PE骨架；含有如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的VH域；以及含有如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列的VL域。本發明抗體與T細胞接觸時可刺激細胞激素生成。
在一個具體例中，提供ICOS結合蛋白，其與本發明之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分任一者競爭結合至人類ICOS。
在一個具體例中，提供使用ICOS結合蛋白或包含至少一種本發明ICOS結合蛋白的醫藥組成物以供治療癌症、傳染病及/或敗血病的方法。
圖1：CD4+CD25- T細胞的IFN-γ生產。
圖2：CD4+CD25- T細胞中的增生。
圖3：抗-ICOS 422.2的H2L5人類化變異體在PBMC細胞中顯示更佳的細胞激素生產。由健康人類供體新鮮分離人類PBMC，並且在經預先塗布抗-CD3(OKT3)以及四種可溶性抗ICOS 422.2人類化變異體之每一者的盤上予以活化。在處理歷時2.5天後，藉由MSD測量上清液中的IFN-γ(A)、IL-10(B)以及TFN-α(C)數量。
圖4：422 H2L5 IgG1引起T細胞成活力降低，而使用Fc失能型或hIgG4PE同型則不明顯。在經預先塗布抗-CD3(OKT3)以及具有不同Fc同型之可溶性人類化抗ICOS 422.2的盤上剛活化人類PBMC。在處理歷時2.5天後，藉由流動式細胞測量術測量活CD4+ T細胞的百分率。
圖5：在人類CD4+ T細胞中，H2L5 hIgG4PE誘發之促發炎性細胞激素誘導的劑量反應。經抗-CD3/CD28預先刺激歷時2天的人類健康供體CD4+ T細胞藉由抗-CD3(OKT3)加上連續濃度之呈盤結合型或可溶型形式的同型對照(Synagis IgG4PE)或H2L5 hIgG4PE mAb重新刺激。在處理3.5天後藉由MSD測量上清液中的(A)IFN-γ以及(B)TFN-α的濃度。
圖6：H2L5 hIgG4PE在健康人類供體的活化PBMC中誘發增生、細胞激素生 產以及細胞毒性效力增加。經抗-CD3/CD28預先刺激歷時2天的人類PBMC細胞藉由抗-CD3(OKT3)加上可溶性H2L5 hIgG4PE mAb或同型對照重新刺激。在處理2.5天後，藉由CFSE FACS分析測量T細胞增生(A)。藉由MSD測量上清液中的IFN-γ濃度(B)。藉由流動式細胞測量術測量CD4+ T細胞的胞內顆粒酶B表現(C)。
圖7：中尺度發現(Meso Scale Discovery,MSD)分析顯示因為H2L5 hIgG4PE而抑制ICOS-L結合至ICOS，指明H2L5 hIgG4PE結合至ICOS上與ICOS-L相同的表位並且競爭結合。
圖8：由融合瘤純系422.2的RNA回收的抗體VH與VL基因。
圖9：H2L5 hIgG4PE的重鏈及輕鏈的蛋白質序列加上訊號序列。
圖10：H2L5 hIgG4PE重鏈加上訊號序列之編碼區的DNA序列。
圖11：H2L5 hIgG4PE輕鏈加上訊號序列之編碼區的DNA序列。
圖12：H2L5 hIgG4PE在食蟹獼猴中的血漿濃度。在(A)第一個劑量或(B)第二個劑量(第15天)H2L5 hIgG4PE之後測定濃度。第二個劑量後48小時將動物犧牲用於組織樣品收集以及組織病理學分析。
圖13：從猴子的脾臟以及腋窩淋巴結偵測H2L5 hIgG4PE對CD4+ T細胞的結合。在第二個劑量後48小時收集組織(第17天)。
圖14：在食蟹獼猴的血液CD4+ T細胞中，H2L5 hIgG4PE的受體占用率。
(A)COS「游離受體」，如藉由用於流動式細胞測量術之抗-ICOS螢光標記抗體的陽性結合所測，只有當H2L5 hIgG4PE不存在時才會結合。
(B)周邊血液CD4+細胞上之受體結合型H2L5 hIgG4PE，如藉由螢光標記抗-人類IgG所測。
圖15(a)在經H2L5 hIgG4PE處理的Ba/F3-ICOS細胞中，磷酸-AKT(T308)的表現位準-細胞內訊號傳遞抗體陣列(b)在經H2L5 hIgG4PE處理的Ba/F3-ICOS細胞中，磷酸-AKT(S473)的表現位準-細胞內訊號傳遞抗體陣列。
圖16：相較於單一抗體治療，H2L5 hIgG4PE組合易普利單抗在PBM預先刺 激分析中使得促發炎性細胞激素生產增加。
圖17：相較於單一抗體治療，H2L5 hIgG4PE組合派姆單抗在PBMC預先刺激分析中使得促發炎性細胞激素生產增加。
圖18：在經修改MLR分析中使用CEFT肽並預先培育的情況下，H2L5 hIgG4PE加上易普利單抗組合誘發促發炎性細胞激素生產增加。
圖19：在經修改MLR分析中使用CEFT肽並預先培育的情況下，H2L5 hIgG4PE加上派姆單抗組合誘發促發炎性細胞激素生產增加。
圖20：在人類PBMC A2058黑色素瘤小鼠腫瘤模型中，H2L5 hIgG4PE抗-ICOS促效mAb單獨以及與派姆單抗組合造成腫瘤生長抑制。(A)H2L5 hIgG4PE劑量反應。(B)H2L5 hIgG4PE與易普利單抗及派姆單抗組合的效力研究。(C)評估H2L5 hIgG4PE組合易普利單抗或派姆單抗給藥的效力研究。
圖21：在CT26小鼠腫瘤模型中，抗-ICOS鼠類代用mAb與抗-PD1鼠類代用mAb組合造成明顯腫瘤生長抑制以及存活率增加。
圖22：在EMT6小鼠腫瘤模型中，抗-ICOS鼠類代用mAb與抗-PD1鼠類代用mAb組合造成明顯腫瘤生長抑制以及存活率增加。
定義
如本文所用，「ICOS」表示任一種可誘導型T細胞共刺激性蛋白。ICOS的簡名(可誘導型T細胞共刺激劑，Inducible T-cell COStimulator)的簡名包括AILIM；CD278；CVID1、JTT-1或JTT-2、MGC39850，或8F4。ICOS是表現在活化T細胞上的CD28超家族共刺激性分子。由這個基因編碼的蛋白質屬於CD28與CTLA-4細胞表面受體家族。其形成同型二聚體並且在細胞-細胞訊號傳遞、免疫反應以及調控細胞增生中扮演重要角色。人類ICOS的胺基酸序列在下文中如SEQ ID NO：10所示。
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTK GSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKM(SEQ ID NO：10)
如本文所用，「ICOS-L」以及「ICOS配體」可交替使用且意指人類ICOS的細胞膜結合型天然配體。ICOS配體在人類體內是一個由ICOSLG基因所編碼的蛋白質。ICOSLG也已命名為CD275(分化簇275)。ICOS-L的簡名包括B7RP-1及B7-H2。
如本文所用，術語「促效劑」意指一種抗原結合蛋白，例如一種ICOS結合蛋白，其在與ICOS接觸之後導致下列一或多者：(1)刺激或活化ICOS受體、(2)提高、增加或促進、誘發或延長ICOS的活性、功能或出現，及/或(3)提高、增加、促進或誘發ICOS的表現。促效劑活性可以在活體外透過各種技藝中已知分析來進行測量，已知分析為諸如(但不限於)測量細胞訊號傳遞、細胞增生、免疫細胞活化標記、細胞激素生成。促效劑活性也可以在活體內透過各種分析來進行測量，各種分析測量諸如(但不限於)以下的代用評估指標：測量T細胞增生或細胞激素生成。
如本文所用，術語「交叉競爭結合」意指與本發明任一ICOS結合蛋白競爭結合至ICOS的任一種ICOS結合蛋白。兩個分子之間競爭結合ICOS可以透過各種技藝中已知方法來進行測試，已知方法包括流動式細胞測量術、中尺度發現及ELISA。可直接測量結合，表示兩個或更多個結合蛋白可以與ICOS接觸且針對某一者或每一者測量結合。或者，感興趣分子的結合可以相對於結合或天然配體並且彼此定量比對來進行測試。
術語「ICOS結合蛋白」如本文所用意指抗體及其他蛋白建構物，諸如結構域，其能夠結合至ICOS。在一些情況下，ICOS是人類ICOS。術語「ICOS結合蛋白」可以與「ICOS抗原結合蛋白」交替使用。因此，如技藝中所理解，抗-ICOS抗體及/或ICOS抗原結合蛋白可被視為ICOS結合蛋白。如本文所用，「抗原結合蛋白」是任一種蛋白，包括(但不限於)本文所述的抗體、結構域及其他建構物，它們結合至諸如ICOS的抗原。如本文所用，ICOS結 合蛋白的「抗原結合部分」可包括能夠結合至ICOS的ICOS結合蛋白的任一部分，包括(但不限於)抗原結合抗體片段。
術語「抗體」如本文所用就最廣義來說意指具有免疫球蛋白樣結構域(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的分子，且包括單株、重組型、多株、嵌合、人類、人類化、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)以及異型結合物抗體；單可變域(例如VH、VHH、VL、域抗體(dAbTM))、抗原結合抗體片段、Fab、F(ab’)2、Fv、雙硫連結之Fv、單鏈Fv、雙硫連結之scFv、雙鏈抗體、TANDABSTM等，以及前述任一者的修飾形式。
替代性抗體形式包括替代性骨架，其中抗原結合蛋白的一或多個CDR可以被排列在非免疫球蛋白骨架或基本部分上，諸如親合體(affibody)、SpA骨架、LDL受體型A型域、高親和性多聚體(avimer)或EGF域。
術語「結構域」意指一種折疊的蛋白質結構，其保持其與蛋白質其餘部分無關的三級結構。結構域大體上是負責蛋白質的分離功能特性，而且在許多情況下可以被添加、移除或轉移至其他蛋白質而不喪失蛋白質及/或結構域其餘部分的功能。
術語「單可變域」意指一種折疊的多肽結構域，包含抗體可變域的序列特徵。其因而包括完全抗體可變域，諸如VH、VHH及VL與經修飾抗體可變域，例如其中一或多個環已被非抗體可變域特徵或者抗體可變域已被截斷或包含N-或C-末端延伸的序列所取代，還有至少維持全長結構域結合活性與特異性之可變域的折疊片段。單可變域能夠獨立地結合至不同可變區或結構域的抗原或表位。「域抗體」或「dAb(TM)」可被視為與「單可變域」相同。單可變域可以是人類單可變域，但亦包括其他物種的單可變域，其他物種為諸如齧齒類護士鯊與駱駝科VHH dAbTM。駱駝科VHH是免疫球蛋白單可變域多肽，其衍生自包括駱駝、駱馬、羊駝、單峰駱駝與原駝的物種，它們產成天生沒有輕鏈的重鏈抗體。此等VHH域可以依據技藝中可用標準技術予以人類化，且此等域被視為是「單可變域」。如本文所用，VH包括駱 駝科VHH域。
可藉由在非抗體蛋白骨架上排列一或多個CDR的方式提供抗原結合片段。「蛋白骨架」如本文所用包括(但不限於)免疫球蛋白(Ig)骨架，例如IgG骨架，其可為四鏈或雙鏈抗體，或其可僅只包含抗體的Fc區，或其可包含抗體的一或多個恆定區，該等恆定區可以是人類或靈長類動物來源的恆定區，或其可為人類與靈長類動物恆定區的人工嵌合體。
蛋白骨架可以是Ig骨架，例如IgG或IgA骨架。IgG骨架可包含抗體的一些或全部結構域(亦即CH1、CH2、CH3、VH、VL)。抗原結合蛋白可包含選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE的IgG骨架。例如，骨架可為IgG1。骨架可由抗體的Fc區組成或包含抗體的Fc區，或為其一部分。
蛋白骨架可以是選自由下列組成之群的骨架衍生物：CTLA-4、脂質運載蛋白(lipocalin)、衍生自蛋白質A的分子(諸如蛋白質A的Z-結構域(親合體，SpA)、A-結構域(Avimer/Maxibody))；熱休克蛋白，諸如GroEl與GroES；運鐵蛋白(轉運體，trans-body)；錨蛋白重複蛋白(ankyrin repeat protein，DARPin)；肽適體；C-型凝集素結構域(四連接素，Tetranectin)；人類γ-晶體蛋白與人類泛蛋白(affilin)；PDZ結構域；人類蛋白酶抑制劑的蠍毒素庫尼茲型結構域(scorpion toxin kunitz type domain)；以及纖維接合素(fibronectin)/纖連蛋白(adnectin)；其受到蛋白改造以結合至天然配體以外的抗原，諸如ICOS。
抗原結合位點意指在抗原節含蛋白上能夠特異地結合至抗原的位點，這可以是單可變域，或其可以是如同可在標準抗體中看到的成對VH/VL結構域。單鏈Fv(ScFv)域也可以提供抗原結合位點。術語「表位結合結構域」意指特異地結合至抗原之某個區域的結構域，而該區域已知為與表位不同之結構域。
術語多特異性抗結合蛋白意指抗原結合蛋白，其包含至少兩個不同的抗原結合位點。這些抗原結合位點的每一者將能夠結合至不同表位，這些 不同表位可存在於相同抗原上或是存在於不同抗原上。多特異性抗原結合蛋白將會對超過一種抗原(例如兩種抗原或三種抗原或四種抗原)具有特異性。
多特異性抗原結合蛋白的實例包括那些由抗體的Fc區或其一部分所構成、大體上由抗體的Fc區或其一部分所構成，直接或間接(例如經由連接子序列)在每一端連接至結合域。這樣的一個抗原結合蛋白可包含兩個被Fc區分隔的結合域或其部分。被分隔表示結合域不直接連接至另一者，且可位在Fc區的相反端(C端與N端)，或任一個其他骨架區。
抗原結合蛋白可包含兩個經由一個連接子直接或間接各自結合至兩個結合域的骨架區，例如在每一個骨架區的N端與C端處。每一個結合結構域可結合至不同抗原。
如本文所用，術語mAbdAb意指一個連結至又一個結合域的單株抗體，尤其是諸如域抗體的單可變域。一個mAbdAb具有至少兩個抗原結合位點，其中至少一者是來自域抗體，而至少一者是來自成對VH/VL結構域。
「dAbTM結合物」意指一種包含dAb的組成物，藥物藉由共價或非共價鍵聯以化學的方式結合至該dAb。較佳地，dAb及藥物可共價地連結。此等共價連結可以是透過肽鍵或其他諸如經由修飾側鏈的方式。非共價結合可以是直接(例如靜電交互作用、疏水性交互作用)或間接(例如透過互補結合夥伴的非共價結合，非共價夥伴為例如生物素與抗生物素蛋白，其中一個夥伴共價結合至藥物而互補結合夥伴共價結合至dAbTM)。當採用互補結合夥伴時，結合夥伴之一可共價地直接或透過適當的連接子部分結合至藥物，且互補結合夥伴可共價地直接結合至或透過適當的連接子部分結合至dAbTM。
如本文所用，「dAbTM融合物」意指一種融合蛋白，包含一個dAbTM以及一個多肽藥物(其可為dAbTM或mAb)。dAbTM與多肽藥物可做為單一連續多肽鏈的分離部分(part或moiety)存在。
在一個具體例中，本揭示內容的抗原結合蛋白顯示人類ICOS與另一物種之ICOS(諸如食蟹獼猴ICOS)之間的交叉反應性。在一個具體例中，本發明抗原結合蛋白特異地結合人類與食蟹獼猴ICOS。提供可結合人類與猴物種的藥物容許吾人在這些系統中測試結果並且使用相同藥物進行並行比對。預期在疾病模型中使用之其他物種(諸如狗或猴，尤其是猴)之間有交叉反應性。
ICOS結合蛋白與參考ICOS結合蛋白之間的競爭可以透過競爭MSD、ELISA、FMAT或BIAcore來進行測定。在一個具體例中，競爭分析是比對ICOS結合蛋白與ICOS配體結合來進行。關於這個競爭有數種可能原因：兩個蛋白質可結合至相同或重疊的表位，可能有結合位阻抑制，或第一個蛋白質的結合可能會引起抗原的構型改變，因而妨礙或降低了第二個蛋白質的結合。
術語「中和」如本說明書通篇所用，表示在活體外或活體內，相較於ICOS結合蛋白不存在時ICOS與ICOS-L的交互作用，在如本文所述抗原結合蛋白存在下ICOS與ICOS-L之間的交互作用降低。中和作用可能是因為ICOS對其配體的結合受到阻斷、妨礙ICOS被其配體活化、下調ICOS或其受體，或影響效應功能性中的一或多者。例如，在實例3與5中所述的配體結合競爭可用來評估ICOS結合蛋白的中和力。
ICOS結合蛋白對ICOS與ICOS-L之間交互作用的影響可能是局部或整體。相對於ICOS結合蛋白物不存在下的ICOS-ICOS-L交互作用，中和ICOS結合蛋白可以阻斷ICOS與ICOS-L的交互作用達至少20%、30%40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
中和作用可以使用具有通常技術者已知或如本文所述的一或多種分析來進行測定或測量。
親和力是一個分子(例如本發明的抗原結合蛋白)對另一個分子(例如其 目標抗原)在單一結合位點處的結合強度。抗原結合蛋白對其目標的結合親和力可以透過平衡方法(例如酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)或放射性免疫分析(RIA))，或動力學(例如BIACORETM分析)來進行測定。舉例來說，實例5中所述的BiacoreTM方法可用來測量結合親合力。
結合性是兩個分子在多個位點處結合至彼此的強度總和，例如考慮到交互作用的價數。
在一個具體例中，ICOS結合蛋白-ICOS交互作用的平衡解離常數(KD)為100nM或更低、10nM或更低、2nM或更低或1nM或更低。或者，KD可介於5與10nM；或介於1與2nM。KD可介於1pM與500pM；或介於500pM與1nM。習於技藝者將能理解到，KD數值越小，則結合越強。KD的倒數(亦即1/KD)為平衡締合常數(KA)，具有單位為M-1。習於技藝者將能理解，KA數值越大，則結合越強。
解離速率常數(kd)或「解離速率」說明ICOS結合蛋白ICOS複合體的穩定性，亦即每秒鐘衰變的複合體分數。例如，kd為0.01s-1等於每秒鐘1%的複合體衰變。在一個具體例中，解離速率常數(kd)為1x10-3s-1或更低、1x10-4s-1或更低、1x10-5s-1或更低、或1x10-6s-1或更低。Kd可介於1x10-5s-1與1x10-4s-1；或介於1x10-4s-1與1x10-3s-1。
締合速率常數(ka)或「締合速率」說明ICOS結合蛋白-ICOS複合體形成的速率。在一個具體例中，締合速率常數(ka)為約1.0 x 105M-1s-1。
「經分離」，意欲為從在自然界中所發現的環境中移出的分子，諸如抗原結合蛋白或核酸。例如，分子可以從與其一起正常地存在於自然界中的物質純化出來。舉例而言，在樣品中的分子質量可為總質量的95%。
術語「表現載體」如本文所用表示經分離核酸，其可用以將感興趣核酸引入至細胞(諸如真核細胞或原核細胞)或無細胞表現系統中，感興趣的核酸序列在其中以肽鏈(諸如蛋白質)形式表現。此等表現載體可以是(例如)包含感興趣核酸的黏粒、質體、病毒序列、轉位子，以及線性核酸。在表現 載體被引入細胞或無細胞表現系統(例如網狀紅血球溶解產物)中之後，由感興趣核酸所編碼的蛋白質是由轉錄/轉譯工具來生產。在揭示內容的範疇內，表現載體可提供用於真核或原核表現的必須要素且包括受病毒啟動子驅動的載體，諸如受CMV啟動子驅動的載體(例如pcDNA3.1、pCEP4與其衍生物)、桿狀病毒表現載體、果蠅表現載體，以及受哺乳動物基因啟動子驅動的表現載體(諸如人類Ig基因啟動子)。其他實例包括原核表現載體，諸如受T7啟動子驅動的載體(例如pET41)、受乳糖啟動子驅動的載體以及受阿拉伯糖基因啟動子驅動的載體。那些具有通常技術者應認知到有許多其他適當表現載體及表現系統。
術語「重組型宿主細胞」如本文所用表示包含感興趣核酸序列的細胞，感興趣核酸是在其引入細胞中之前被分離。例如，感興趣核酸序列可以在表現載體中，同時細胞可為原核或真核的。例示性真核細胞為哺乳動物細胞，諸如(但不限於)COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、NS0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤細胞或其任一種衍生細胞。最佳地，真核細胞為HEK293、NS0、SP2/0，或CHO細胞。大腸桿菌為例示性原核細胞。依據揭示內容，重組型細胞可以透過轉染、細胞融合、永生化，或技藝中所熟知的其他程序產生。被轉染至細胞中的感興趣核酸序列(諸如表現載體)可以是在染色體外或被穩定地併入細胞染色體中。
「嵌合抗體」意指一種類型的經改造抗體，其含有衍生自供體抗體的天然可變區(輕鏈與重鏈)，其與衍生自受體抗體的輕鏈及重鏈恆定區相締合。
「人類化抗體」意指一種類型的經改造抗體，其CDR是衍生自非人類供體免疫球蛋白，分子的其餘免疫球蛋白衍生部分是衍生自一或多種人類免疫球蛋白。此外，可改變骨架支撐殘基以保留結合親合力(參見，例如Queen et al.Proc.Natl Acad Sci USA,86：10029-10032(1989)，Hodgson,et al., Bio/Technology,9：421(1991))。適當的人類受體抗體可以是透過與供體抗體之核苷酸與胺基酸序列同源而選自習知知料庫，例如KABATTM資料庫、Los Alamos資料庫，以及Swiss Protein資料庫。特徵為與供體抗體之骨架區同源(基於胺基酸)的人類抗體適於提供重鏈恆定區及/或重鏈可變骨架區用以插入供體CDR。可以類似方式選出能夠捐出輕鏈恆定區或可變骨架區的適當受體抗體。應注意，受體抗體重鏈與輕鏈不必然是源於相同的受體抗體。先前技藝描述數種生產此等人類化抗體的方式，參見例如EP-A-0239400與EP-A-054951。
術語「完全人類抗體」包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白質序列之可變區及恆定區(若存在的話)的抗體。本發明的人類序列抗體可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白質序列所編碼的胺基酸殘基(例如透過隨機或定點誘變在活體外引入的突變或透過在活體內的體突變)。完全人類抗體包含僅由最終人類來源之多核苷酸所編碼的胺基酸序列或與此等序列相同的胺基酸序列。如本文所表示，由插入至小鼠基因體之編碼人類免疫球蛋白的DNA所編碼的抗體在基因轉殖小鼠體內產生完全人類抗體，因為它們最終是由人類來源的DNA所編碼。在這個情況下，編碼人類免疫球蛋白的DNA可以在小鼠體內重新排列(以編碼抗體)，而且也可能發生體突變。由在小鼠體內經歷這些改變之人類來源DNA所編碼的抗體如在本文中所表示為完全人類抗體。使用此等基因轉殖小鼠使得篩選對抗人類抗原之完全人類抗體成為可能。如技藝中所理解，完全人類抗體可以使用噬菌體展示技術來製造，其中人類DNA庫被插入至噬菌體中以產生包含人類生殖系DNA序列的抗體。
術語「供體抗體」意指一種對第一免疫球蛋白夥伴貢獻其可變區、CDR或其他功能片段或其類似物之胺基酸序列的抗體。因此，供體提供經改變的免疫球蛋白編碼區並且導致所表現的經改變抗體具有供體抗體之抗原特異性與中和活性特徵。
術語「受體抗體」意指一種與供體抗體異源的抗體，其對第一免疫球蛋白夥伴貢獻編碼其重鏈及/或輕鏈骨架區及/或其重鏈及/或輕鏈恆定區的全部(或任一部分)胺基酸序列。人類抗體可以是受體抗體。
術語「VH」及「VL」如本文所用分別意指抗原結合蛋白的重鏈可變區及輕鏈可變區。
「CDR」定義為一個抗原結合蛋白的互補決定區胺基酸序列。這些為免疫球蛋白重鏈與輕鏈的超變區。在免疫球蛋白的可變部分中有三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR(或CDR區)。因此，「CDR」如本文所用意指所有三個重鏈CDR、所有三個輕鏈CDR、所有重鏈與輕鏈CDR，或至少兩個CDR。
在通篇說明書中，依據Kabat編號慣例將可變域序列及全長抗體序列中的胺基酸殘基進行編號。同樣地，實例中所用的術語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」遵循Kabat編號慣例。關於更多資訊，參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1991)。
對於習於技藝者來說，在可變域及全長抗體序列中的胺基酸殘基方面，替代性編號慣例是顯而易見的。也有用於CDR序列的替代性編號慣例，例如Chothia et al.(1989)Nature 342：877-883中所列者。抗體的結構與蛋白質折疊可表示其他殘基被認為是CDR序列的一部分且為習於技藝者所理解。
習於技藝者可用之CDR序列的其他編號慣例包括「AbM」(University of Bath)與「接觸(contact)」(University College London)。可使用Kabat、Chothia、AbM與接觸法中至少兩者決定最小重疊區以提供「最小結合單元」。最小結合單元可以是CDR的次部分。
下表1表示各個CDR或結合單元使用每一種編號慣例的定義。Kabat編號方案在表1中用於將可變域胺基酸序列編號。應注意的是，CDR定義中的 一些可能隨著所用個別公開資料而改變。
Figure 105102393-A0305-02-0019-1
因此，提供ICOS結合蛋白，其包含下列CDR的任一者或組合：CDRH1：DYAMH(SEQ ID NO：1)
CDRH2：LISIYSDHTNYNQKFQG(SEQ ID NO：2)
CDRH3：NNYGNYGWYFDV(SEQ ID NO：3)
CDRL1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：4)
CDRL2：DTSKLAS(SEQ ID NO：5)
CDRL3：FQGSGYPYT(SEQ ID NO：6)
在本發明的一個具體例中，該ICOS結合蛋白在具有如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的重鏈可變區中包含CDRH1(SEQ ID NO：1)、CDRH2(SEQ ID NO：2)，以及CDRH3(SEQ ID NO：3)。包含如SEQ ID NO：7中所示人類化重鏈可變區的本發明ICOS結合蛋白命名為「H2」。在一些具體例中，本發明ICOS結合蛋白包含與SEQ ID NO：7具有至少90%序列一致性的重鏈可變區。本發明ICOS結合蛋白可包含與SEQ ID NO：7具有約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%之序列一致性的重鏈可變區。
人類化重鏈(VH)可變區(H2)：QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYAMHWVRQA PGQGLEWMGL ISIYSDHTNY NQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCGRNN YGNYGWYFDV WGQGTTVTVS S (SEQ ID NO：7)
在本發明的一個具體例中，ICOS結合蛋白在具有如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列之輕鏈可變區中包含CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)，以及CDRL3(SEQ ID NO：6)。包含如SEQ ID NO：8中所示人類化輕鏈可變區的本發明ICOS結合蛋白命名為「L5」。因此，包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區以及SEQ ID NO：8之輕鏈可變區的本發明ICOS結合蛋白在本文可被命名H2L5。
在圖9中適宜地顯示重鏈與輕鏈建構物的前導序列，且包括(但不限於)：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：11)。
在一些具體例中，本發明ICOS結合蛋白包含與SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變區。本發明ICOS結合蛋白可適當地包含與SEQ ID NO：8具有約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%序列一致性的輕鏈可變區。
人類化輕鏈(VL)可變區(L5)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASSSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDT SKLASGIPAR FSGSGSGTDY TLTISSLEPE DFAVYYCFQG SGYPYTFGQG TKLEIK(SEQ ID NO：8)
CDR或最小結合單元可透過至少一個胺基酸置換、刪除或添加予以修飾，其中變異體抗原結合蛋白基本上保有未修飾蛋白的生物特徵，諸如產自選殖株422.2的鼠類抗體或包含SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8的抗體。
了解CDR H1、H2、H3、L1、L2、L3中的每一者可單獨或與任何其他CDR組合任一種呈排列或組合的方式予以修飾。在一個具體例中，CDR是透過置換、刪除或添加至多3個胺基酸(例如1或2個胺基酸，例如1個胺基酸)予以修飾。修飾通常是置換，尤其是守恆置換，如下表2中所示。
表2
Figure 105102393-A0202-12-0019-5
舉例而言，在變異體CDR中，最小結合單元的胺基酸殘基可維持相同，但包含如Kabat或Chothia定義之一部分的CDR的側邊殘基可用一個守恆性胺基酸殘基予以置換。
此等包含經修飾CDR或最小結合單元的抗原結合蛋白如本文所述在本文中可稱為「功能性CDR變異體」或「功能性結合單元變異體」。在一個具體例中，適宜地提供ICOS結合蛋白，其包含一或多個具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5及/或6中所示胺基酸序列及/或其功能CDR變異體的CDR。
術語「表位」如本文所用意指抗原的一部分，其與抗原結合蛋白的特定結合結構域接觸。表位可以是線性或構型性/不連續。構型性或不連續表位包含被其他序列分隔開來的胺基酸殘基，亦即於抗原的一級序列中不在連續序列上。儘管殘基可能來自於肽鏈的不同區域，但是它們在抗原的三維結構中緊密相鄰。在多聚體抗原的情況下，構型性或不連續表位可包括來自不同肽鏈的殘基。包含在表位中的特定殘基可以透過電腦模型化程式或經由技藝中已知方法(諸如X-射線結晶學)經由三維結構來決定。
CDR L1、L2、L3、H1以及H2在結構上傾向於展現數量有限的主鏈構型。CDR的特定典型結構類型是由CDR長度還有環堆集(loop packing)來定義，其是由CDR與骨架區中位在關鍵位置處的殘基(結構決定殘基或SDR)來決定。Martin與Thornton(1996；J Mol Biol 263：800-815)已產生一種自動化方法來定義「關鍵殘基」標準模板。使用簇分析來定義CDR集合的標準類型，而標準模板接著是透過分析被包埋的疏水性、氫鍵結殘基以及守恆性 甘胺酸與脯胺酸來進行鑑別。抗體序列的CDR可以經由序列與關鍵殘基模板相比對並且使用一致性或相似性矩陣來對每一個模板計分而被分派標準類型。
按照CDR、按照對應CDR、按照結合單元、按照重鏈或輕鏈可變區、按照重鏈或輕鏈，以及按照抗原結合蛋白，有多個變異體CDR標準位置，且因而置換的任一種組合可存在於本發明的抗原結合蛋白中，前提是仍維持CDR的標準結構，以使得抗原結合蛋白能夠特異地結合ICOS。
如本文所論述，透過CDR與骨架區中位在關鍵位置處的殘基決定，CDR的特定標準結構類型是由CDR長度與環堆集這兩者所定義。
查詢核酸序列與主體核酸序列之間的「一致性百分率」為「一致性」數值，以百分率表示，當主體核酸序列與查詢核酸序列在執行成對BLASTN排比之後具有100%查詢涵蓋率，這個百分率是透過BLASTN排比來計算。查詢核酸序列與主體核酸序列之間的此等成對BLASTN排比是藉由使用National Center for Biotechnology Institute網頁上可供使用之BLASTN演算法的預設來執行，其中低複雜性區域的過濾器被關閉。重要的是，查詢核酸序列可以依照本文一或多個申請專利範圍中定義的核酸序列來說明。
查詢胺基酸序列與主體胺基酸序列之間的「一致性百分率」為「一致性」數值，以百分率表示，當主體核酸序列與查詢胺基酸序列在執行成對BLASTP排比之後具有100%查詢涵蓋率，則這個百分率是透過BLASTP排比來計算。查詢胺基酸序列與主體胺基酸序列之間的此等成對BLASTP排比是藉由使用National Center for Biotechnology Institute網頁上可供使用之BLASTP演算法的預設來執行，其中低複雜性區域的過濾器被關閉。重要的是，查詢胺基酸序列可以依照本文一或多個申請專利範圍中定義的胺基酸序列來說明。
查詢序列可以與主體序列100%一致，或其相比於主體序列可包括至多 某個整數值的胺基酸或核苷酸變化，以使得一致性%少於100%。例如，查詢序列與主體序列為至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%一致。此等改變包括至少一個胺基酸刪除、置換(包括守恆性與非守恆性置換)，或插入，且其中該等改變可發生在查詢序列的胺基端或羧基端位置，或是它們末端位置間的任一處、單獨地散布查詢序列的胺基酸或核苷酸中或在查詢序列的一或多個鄰接基團中。
一致性%可跨過整個查詢序列(包括CDR)的長度來決定。或者，一致性%可排除CDR，例如CDR與主體序列為100%一致，而在查詢序列的其餘部分為0%一致性變異，因此該CDR序列是固定的/完整的。
變異體序列基本上保有未修飾蛋白質(諸如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)的生物學特徵。
VH或VL序列可以是具有至多15個胺基酸置換、添加或刪除的變異體序列。舉例而言，變異體序列可具有至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸置換、添加或刪除。
序列變異可排除CDR，例如CDR與VH或VL(或HC或LC)序列相同且變化是在VH或VL(或HC或LC)序列的其餘部分，因此該CDR序列是固定的/完整的。
習於技藝者應理解到，在製造抗原結合蛋白(諸如抗體)之後可能會發生轉譯後修飾，尤其是取決於所使用的細胞株以及抗原結合蛋白的特定胺基酸序列。舉例來說，這可以包括切割某些前導序列、以各種糖化與磷酸化模式添加各種糖部分、去醯胺化、氧化、雙硫鍵拼湊、異構化、C端離胺酸修剪，以及N端麩醯胺酸環化。本發明含括抗原結合蛋白的用途，該抗原結合蛋白歷經，或已歷經一或多種轉譯後修飾。因此，本發明的「抗原結合蛋白」或「抗體」分別包括如先前定義已歷經轉譯後修飾(諸如本文所述)的「抗原結合蛋白」或「抗體」。
去醯胺化是一種酶促反應，主要是將天冬醯胺酸(N)轉換成比例大約為3：1的異天冬胺酸與天冬胺酸(D)。要達到更低程度的話，去醯胺化可以使用麩醯胺酸殘基以類似方式發聲。在CDR中的去醯胺化會造成分子電荷改變，但通常不會造成抗原結合改變，也不會對PK/PD造成衝擊。
氧化可以發生在生產與儲存(亦即在氧化條件下)期間並造成蛋白質的共價修飾，而共價修飾直接受到活性含氧物或間接受到與氧化壓力的二級副產物的反應所引起。氧化主要發生在甲硫胺酸殘基，但偶爾可能發生在色胺酸以及游離半胱胺酸殘基處。
雙硫鍵拼湊可能發生在生產與鹼性儲存條件期間。在某些情況下，雙硫鍵可能斷裂或不正確地形成，產生不成對半胱胺酸殘基(-SH)。這些游離(不成對)硫氫基(-SH)可促進改組。
異構化通常出現在生產、純化以及儲存(在酸性pH下)期間，且通常是在天冬胺酸透過化學過程轉換成異天冬胺酸時發生。
重鏈及/或輕鏈中的N端麩醯胺酸可能形成焦麩胺酸(pGlu)。多數pGlu形成發生在生產生物反應器中，但它也可能是以非酶促的方式形成，取決於製程的pH與溫度還有儲存條件。pGlu形成被認為是重組型mAb的主要降解路徑之一。
C端離胺酸修剪是一種由羧基肽酶所催化的酶促反應，而且通常是在重組型mAb中觀察到。這個過程的變化形式包括從一個或兩個重鏈移除離胺酸。離胺酸修剪似乎不會衝擊到生物活性並對mAb效應功能沒有影響。
於人類體內存在有可結合至蛋白質的天然自體抗體。自體抗體因而可結合至內源性蛋白質(存在於原個體中)還有被投與至個體供治療用的蛋白質或肽。對藥物治療反應而新形成的治療性蛋白質結合自體抗體以及抗體通稱為抗藥物抗體(ADA)。先前存在之針對諸如治療性蛋白質與肽的分子的抗體被投與至個體，可在受治療患者體內產生其效力並可產生投藥反應、 過敏、改變臨床反應並透過維持、消除或中和該分子而改變生物可利用性。提供療法用分子是有利的，該分子包含人類免疫球蛋白(抗體)單一可變域或dAbTM，其免疫原性降低(亦即當被投與給個體，尤其是人類個體時，結合至預先存在之ADA的能力降低)。
因此，在本發明的一個具體例中，提供一種經修飾dAbTM，相較於未修飾的等效分子，其結合至預先存在之抗體(ADA)的能力降低。結合能力降低表示著，經修飾分子以低親和力或低親和性結合至預先存在之ADA。該等經修飾dAbTM包含一或多個選自以下的修飾：(a)C端添加、延伸、刪除或標誌，及/或(b)一或多個胺基酸骨架置換。
本揭示內容的多肽與dAbTM及包含此等物質的促效劑可被調製成具有更大的流體動力學尺寸，例如透過附接PEG基團、血漿白蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或至少其運鐵蛋白結合部分、抗體Fc區，或透過接合至抗體結構域。例如，多肽dAbTM與促效劑可被調製成抗體的更大抗原結合片段或者是抗體(例如調製成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。
如本文所用，基於分子擴散通過水溶液，「流體動力學尺寸」意指分子(亦即抗原結合蛋白)的表觀尺寸。蛋白質擴散或運動通過溶液可以經過處理而推導出蛋白質的表觀尺寸，而尺寸是以「斯托克斯半徑」或蛋白質粒子的「流體動力學半徑」來提供。蛋白質的「流體動力學尺寸」取決於質量與外型(構型)，使得兩個具有相同分子量的蛋白質基於蛋白質的整體構型與電荷而可能有不同的流體動學尺寸。流體動力學尺寸增加可能使得腎廓清連帶降低，導致觀察到的半衰期(t1/2)增加。
本揭示內容之抗原結合蛋白(例如域抗體單體及多聚體)的流體動力學尺寸可使用技藝中所熟知的方法測定。舉例而言，凝膠過濾層析可用來測定抗原結合蛋白的流體動力學尺寸。用於測定抗原結合蛋白之流體動力學尺寸的適宜凝膠過濾基質(諸如交聯瓊脂糖基質)為已知且易於取得的。
抗原結合蛋白形式的尺寸(例如附接至域抗體單體的PEG部分)可以隨著所期望的應用而改變。例如，若抗原結合蛋白意欲要離開循環而進入周邊組織中，則希望保持ICOS結合蛋白的低流體動力學尺寸，好容易流出血流。或者，若意欲抗原結合蛋白留在全身性循環中歷時更久的時間期間，則抗原結合蛋白的尺寸可以增加，例如是透過調製作為Ig樣蛋白。
醫藥組成物
如本文所述抗原結合蛋白可被併入醫藥組成物中用於治療本文所述的人類疾病。在一個具體例中，醫藥組成物包含抗原結合蛋白，視情況與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑組合。
此等組成物包含已知且為可接受之醫藥顆粒的醫藥上可接受載劑。
醫藥組成物可透過注射或連續輸注(實例包括，但不限於靜脈內、腹膜內、皮內、皮下、肌肉內與門靜脈內)被投與。在一個具體例中，組成物適於靜脈內投與，醫藥組成物可適用於局部投與(其包括，但不限於表皮、吸入、鼻內或眼頭與)或腸投與(其包括，但不限於經口或直腸投與)。
醫藥組成物可包含0.5mg至10g的ICOS結合蛋白，例如介於5mg與1g的抗原結合蛋白。或者，組成物可包含5mg與500mg，例如介於5mg與50mg。用於製備此等醫藥組成物的方法為習於技藝者所熟知。若對投與模式還有所使用的特定蛋白質適合的話，可添加其他賦形劑至組成物中。不同賦形劑及其用途的實例說明於Lowe et al.,(2011)中。
用以投與抗原結合蛋白的有效劑量及治療方案可取決於數個因素，諸如患者的年齡、體重與健康狀態，以及待治療的疾病。這些因素是落在參予之臨床醫師的權限內。選定適當劑量的指引可在例如Bai et al.,(2012)中找到。
醫藥組成物可包含抗原結合蛋白之部分與其他藥物組合的套組，視情 況加上使用說明書。為方便起見，套組可包含呈預定量的藥劑以及使用說明書。
術語「個體(individual、subject)」以及「患者」在本文中可交替使用。在一個具體例中，個體為哺乳動物，諸如靈長類動物，例如狨猴或猴。在另一個具體例中，個體為人類。
本文所述抗原結合蛋白亦可用於治療方法中。治療可以是治療性、預防性或防止性。治療含括減輕、降低或防止疾病的至少一種態樣或症狀且含括防止或治癒本文所述疾病。
本文所述ICOS結合蛋白或其抗原結合部分呈有效量用於治療性、預防性或防止性治療。本文所述ICOS結合蛋白或其抗原結合部分的治療有效量是有效減輕或降低疾病的一或多種症狀或防止或治癒疾病的數量。
因此，在一個具體例中，提供本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合部分用於療法中。在一個具體例中，提供本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合部分用以治療癌症、傳染病及/或敗血病。本發明亦提供本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合部分在製造用以治療癌症、傳染病及/或敗血病之藥物的用途。
因此，本文提供經分離的ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，或包含該等經分離ICOS結合蛋白或其抗原結合部分的醫藥組成物，其等用於治療癌症、傳染病及/或敗血病。
製造方法
可以透過一些習知技術中的任一者來製備抗原結合蛋白。例如，抗原結合蛋白可以從天生表現抗原結合蛋白的細胞被純化出來(例如，抗體可以從生產抗體的融合瘤分離出來)，或者在重組型表現系統中製造。
可使用若干不同的表現系統與純化方案來產生本發明抗原結合蛋白。一般來說，宿主細胞經編碼所需抗原結合蛋白的重組型表現載體轉形。可採用寬廣範圍的宿主細胞，包括原核細胞(包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細 菌，例如大腸桿菌、桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬)，真核細胞(包括酵母(例如啤酒酵母、嗜甲醇酵母)、真菌(例如麴菌屬)，或高等真核細胞，包括昆蟲細胞以及哺乳動物來源的細胞株(例如CHO、Perc6、HEK293、HeLa)。
宿主細胞可以是經分離宿主細胞。宿主細胞通常不是多細胞生物(例如植物或動物)的一部分。宿主細胞可以是非人類宿主細胞。
關於使用於細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主的適當選殖與表現載體及選殖方法為技藝所知。
可在促進抗原結合蛋白表現的條件下培養細胞，並且透過習知蛋白質純化程序回收多肽。預期用於本文之抗原結合蛋白包括基本上均質抗原結合蛋白，其基本上不含汙染物質。
習於技藝者應理解，在生產抗原結合蛋白之後可能會發生轉譯後修飾，尤其是取決於使用的細胞株以及抗原結合蛋白的特定胺基酸序列。這可以包括切割某些前導序列、添加呈各種糖化模式的各種糖部分、去醯胺化(例如在天冬醯胺酸或麩醯胺酸殘基處)、氧化(例如在甲硫胺酸、色胺酸或游離半胱胺酸殘基處)、雙硫鍵拼湊、異構化(例如在天冬胺酸殘基處)、C端離胺酸修剪(例如從一個或兩個重鏈)，以及N端麩醯胺酸環化(例如在重鏈及/或輕鏈中)。本發明含括抗原結合蛋白的用途，該抗原節蛋白歷經，或已歷經一或多種轉譯後修飾。修飾可能發生在CDR、可變骨架區或恆定區內。修飾可造成分子電荷改變。修飾通常不會導致抗原結合、功能、生物活性改變，也不會衝擊ICOS結合蛋白的藥動學(PK)或藥效學(PD)特徵。
術語「效應功能」如本文所用表示一或多種抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性活性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性活性(CDC)媒介之反應、Fc媒介之吞噬作用或抗體依賴應細胞吞噬作用(ADCP)，還有經由FcRn受體的抗體回收。
咸信抗原結合蛋白之恆定區與各種Fc受體(FcR，包括FcγRI(CD64)、 FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16))間的交互作用會媒介抗原結合蛋白的效應功能。顯著的生物效應可能是效應功能性的結果。媒介效應功能的能力通常需要使抗原結合蛋白結合至抗原且不是所有抗原結合蛋白都會媒介每一種效應功能。
效應功能可以使用若干方式來進行測量，包括例如經由天然殺手細胞上的FcγRIII或經由單核細胞/巨噬細胞上的FcγRI的結合以測量ADCC/ADCP效應功能。例如，本發明抗原結合蛋白可在天然殺手細胞分析中評估ADCC效應功能。評估ADCC及/或CDC功能的實際方法可以在「Kellner C et al.,“Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions”,Methods,1；65(1)：105-13(2014)」中找到。
人類恆定區的一些同型(具體而言是IgG4與IgG2同型)的下列功能降低：a)透過經典路徑的補體活化；以及b)抗體依賴性細胞性細胞毒性。對於抗原結合蛋白之重鏈恆定區的各種修飾可以視所需效應子特性來執行。已個別說明過含有特定突變的IgG1恆定區會減少對Fc受體的結合並因而降低ADCC與CDC(Kellner C et al.,“Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions”,Methods,1；65(1)：105-13(2014))。
在本發明的一個具體例中，提供一種包含恆定區的抗原結合蛋白，以至該抗原結合蛋白的ADCC及/或補體活化或效應功能性降低。在一個這樣的具體例中，重鏈恆定區可包含天然失能型IgG2或IgG4同型恆定區或突變IgG1恆定區。一個實例包括在位置235與237處(EU指標編號)的丙胺酸殘基置換。
抗體的亞型在某種程度上決定次要效應功能，諸如補體活化或Fc受體(FcR)結合與抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)(Huber,et al.,Nature 229(5284)：419-20(1971)；Brunhouse,et al.,Mol Immunol 16(11)：907-17(1979))。在鑑定最佳抗體類型以供特定運用時，抗體的效應功能要納入考量。例如，hIgG1抗體的半衰期相對較長，在固定補體時相當有效，而且它們結合至FcγRI與FcγRII兩者。相對地，人類IgG4抗體的半衰期較短，不能固定補體且對FcR的親和力較低。在IgG4的Fc區中將絲胺酸228取代成脯胺酸(S228P)會降低使用hIgG4時觀察到的異質性並且延長血清半衰期(Kabat,et al.,“Sequences of proteins of immunological interest”5.sup.th Edition(1991)；Angal,et al.,Mol Immunol 30(1)：105-8(1993))。白胺酸235置換成麩胺酸(L235)的第二個突變會消除殘餘FcR結合以及補體結合活性(Alegre,et al.,J Immunol 148(11)：3461-8(1992))。具有這兩個突變的所得抗體被稱為IgG4PE。hIgG4胺基酸的編號是衍生自EU編號參考資料：G.M.et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969).PMID：5257969。在本發明的一個具體例中，包含含有取代S228P與L235E之IgG4 Fc區的ICOS抗原結合蛋白可命名IgG4PE。因此，具有重鏈可變區H2以及輕鏈可變區L5與IgG4PE Fc區的ICOS結合蛋白將被命名為H2L5 IgG4PE或同義為H2L5 hIgG4PE。
增強ADCC/CDC
如同技藝中所理解，已知各種會增加抗體之ADCC及/或CDC活性的技術。這些包括，但不限於Fc區中的各種突變，Complegent與Potelligent技術。在本發明的一個態樣中，一或多種ADCC/CDC增強技術可運用於本發明的ICOS結合蛋白。
突變
也已經說明過含有特定突變或在殘基Asn297上進行糖基化改變的人類IgG1恆定區，突變或糖基化改變會提高對Fc受體的結合。在一些情況中，已顯示這些突變會提高ADCC與CDC，參見例如Kellner(2013)。
在本發明的一個具體例中，這些突變在選自239、332及330(IgG1)的一 或多個位置中，或在其他IgG同型中的等效位置中。適當突變的實例包括S239D及I332E與A330L。在一些具體例中，在本文中說明的本發明抗原結合蛋白於位置239及332處突變，例如S239D及I332E，或在更多具體例中是在選自239及332與330的一或多個位置處突變(例如S239D及I332E與A330L)(EU索引編號)。
Complegent
在本發明的一個具體例中，提供一種包含嵌合重鏈恆定區的抗原結合蛋白，例如包含嵌合重鏈恆定區的抗原結合蛋白(帶有IgG3的至少一個CH2結構域)，以使得抗原結合蛋白的效應功能提高，例如其中ADCC提高或CDC提高，或ADCC與CDC功能提高。在一個這樣的具體例中，抗原結合蛋白可包含IgG3的一個CH2結構域或CH2結構域均是來自IgG3。
亦提供一種製造本發明抗原結合蛋白的方法，其包含以下步驟：a)培養包含一表現載體的重組型宿主細胞，該表現載體包含如本文所述之經分離核酸，其中該表現載體包含編碼具有IgG1與IgG3 Fc結構域胺基酸殘基之Fc結構域的核酸序列；以及b)回收該抗原結合蛋白。
例如可使用購自BioWa,Inc.(Princeton,NJ)及Kyowa Hakko Kogyo(目前為Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd.)Co.,Ltd.的COMPLEGENTTM技術系統實施此等製造抗原結合蛋白的方法。其中，表現包含一表現載體的重組型宿主細胞，而該表現載體中有編碼嵌合Fc結構域之核酸序列，該嵌合Fc結構域同時具有IgG1與IgG3 Fc結構域胺基酸殘基，以便產生補體依賴性細胞毒性(CDC)活性相對於在其他方面相同但缺少嵌合Fc結構域之抗原結合蛋白有增加之抗原結合蛋白。在WO2007011041與US20070148165中說明COMPLEGENTTM技術系統的態樣，其各自以引用的方式併入本文。在一個替代具體例中，可以透過將序列特異性突變引入IgG鏈的Fc區中來提高CDC 活性。技藝中具有通常技術者將會知道其他適當系統。
Potellignt
本發明亦提供一種用於生產本發明抗原結合蛋白的方法，該方法包含以下步驟：a)培養包含一表現載體的重組型宿主細胞，該表現載體包含如本文所述的經分離核酸，其中編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶的FUT8基因在該重組型宿主細胞中不活化；以及b)回收該抗原結合蛋白。
例如可使用購自BioWa,Inc.(Princeton,NJ)的POTELLIGENTTM技術系統實施此等製造抗原結合蛋白的方法。其中，缺少FUT8基因之功能副本的CHOK1SV細胞生產具有抗體依賴細胞媒介之細胞毒性(ADCC)活性提高的單株抗體，該活性相對於在帶有功能性FUT8基因的細胞中生產的相同單株抗體有所增加。在US7214775、US6946292，WO0061739與WO0231240中說明POTELLIGENTTM技術系統的態樣，其各自以引用的方式併入本文。技藝中具有通常技術者將會知道其他適當系統。
對於習於技藝者來說，這些修飾不但可以單獨使用，也可以彼此組合使用以便進一步增強效應功能是顯而易見的。
在本發明的此一具體例中，提供一種包含重鏈恆定區的抗原結合蛋白，該重鏈恆定區包含突變與嵌合重鏈恆定區，例如其中該抗原結合蛋白包含IgG3的至少一個CH2結構域以及IgG1的一個CH2結構域，其中IgG1CH2結構域在選自239與332與330的位置處有一或多個突變(例如突變可選自S239D與I332E與A330L)，使得該抗原結合蛋白的效應功能提高，例如其具有一或多個下列功能：ADCC提高或CDC提高，例如其中ADCC提高與CDC提高。在一個具體例中，IgG1 CH2結構域具有突變S239D及I332E。
在本發明的一個替代性具體例中，提供一種抗原結合蛋白，該抗原結 合蛋白包含嵌合重鏈恆定區且糖基化型態有所改變。在這樣的一個具體例中，該重鏈恆定區包含IgG3的至少一個CH2結構域以及IgG1的一個CH2結構域且糖基化模式改變，致使岩藻糖相對於甘露糖的比率為0.8：3或更少，例如其中該抗原結合蛋白經去岩藻糖基化，使得該抗原結合蛋白的效應功能比某個具有缺少該突變與糖基化型態改變之免疫球蛋白重鏈恆定區的相同抗原結合蛋白還要提高，例如其中該抗原結合蛋白具有一或多個下列功能：ADCC提高或CDC提高，例如其中ADCC提高與CDC提高。
在一個替代性具體例中，該抗原結合蛋白具有至少一個IgG3 CH2結構域以及IgG1的至少一個重鏈恆定域，其中IgG CH2結構域是依據本文所述的限制條件進行突變。
在本發明的一個態樣中，提供一種生產本文所述之本發明抗原結合蛋白的方法，其包含以下步驟：a)培養包含一表現載體的重組型宿主細胞，該表現載體含有如本文所述的經分離核酸，該表現載體進一步包含編碼嵌合Fc結構域的Fc核酸序列，且該嵌合Fc結構域同時帶有IgG1與IgG3 Fc結構域胺基酸殘基，而其中編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶的FUT8基因在該重組型宿主細胞中不活化；以及b)回收該抗原結合蛋白。
例如可使用購自BioWa,Inc.(Princeton,NJ)的ACCRETAMABTM技術系統結合POTELLIGENTTM與COMPLEGENTTM技術系統，來實施此等製造抗原結合蛋白的方法，以便相對於缺少嵌合Fc結構域且在寡醣上有岩藻糖的相同單株抗體生產出ADCC與CDC活性同時提高的抗原結合蛋白。
在本發明的另一個具體例中，提供一種包含突變與嵌合重鏈恆定區的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白的糖基化型態有所改變，使得該抗原結合蛋白的效應功能提高，例如其中該抗原結合蛋白具有一或多個下列功 能：ADCC提高或CDC提高。在一個具體例中，突變是選自於位置239與332與330，例如突變是選自S239D與I332E與A330L。在又一個具體例中，重鏈恆定區包含IgG3的至少一個CH2結構域以及IgG1的一個Ch2結構域。在一個具體例中，該重鏈恆定區的糖基化型態改變，致使岩藻糖相對於甘露糖的比率為0.8：3或更少，例如該抗原結合蛋白經去岩藻糖基化，使得該抗原結合蛋白的效應功能比某個等效非嵌合抗原結合蛋白或帶有缺少該突變與糖基化型態改變之免疫球蛋白重鏈恆定區還要提升。
有報導指出，IgG抗體的半衰期長是因為其結合至FcRn。因此，於Kuo and Aveson(2011)中，已廣泛地研究在pH 6.0下會增加IgG對FcRn的結合親合力，同時透過對恆定區進行改造來維持交互作用的pH依賴性的置換。
另一種修飾本發明抗原結合蛋白的方法牽涉到藉由修飾免疫球蛋白恆定域或FcRn(Fc受體新生兒)結合域來增加這些蛋白質的活體內半衰期。
在成年哺乳動物中，FcRn又已知為新生兒Fc受體，藉由充作保護性受體來結合IgG同型抗體並挽救其免於降解，進而在維持血清抗體含量方面扮演重要角色。內皮細胞內吞IgG分子，且若它們結合至FcRn，便再循環至循環中。相反來說，沒有結合至FcRn的IgG分子進入細胞並靶向至要被降解處的溶小體路徑。
咸信新生兒FcRn受體同時牽涉抗體廓清與胞移穿過組織Kuo and Aveson,(2011)。被認定會與人類FcRn直接交互作用的人類IgG1殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434以及His435。於本段落中，在這些位置中任一者的調換可能會增加本發明抗原結合蛋白的血清半衰期及/或效應特性改變。
透過增加對FcRn的親和力來增加半衰期的突變
本發明抗原結合蛋白可具有一或多個增加恆定域或其片段對FcRn之親和力的胺基酸修飾。這些可以造成這些蛋白質的半衰期增加Kuo and Aveson (2011)。增加治療用IgG與診斷用IgG及其他生物活性分子的半衰期有若干益處，包括降低這些分子的給藥數量及/或頻率。因此，在一個具體例中，提供一種本文所提供的本發明抗原結合或融合蛋白，其包含具有一或多個此等胺基酸修飾的IgG恆定域全部或一部分(FcRn結合部分)，以及結合至此一經修飾IgG恆定域的非IgG蛋白或非蛋白分子，其中存在有經修飾IgG恆定域會增加抗原結合蛋白的活體內半衰期。
已知一些方法會使得半衰期增加(Kuo and Aveson,(2011))，包括胺基酸修飾，其可透過包括丙胺酸掃描誘變、隨機誘變並篩選而產生的胺基酸修飾，以便評估對FcRn之結合及/或活體內行為的技術。電腦策略，接著是突變誘發也可以用來選出要突變的胺基酸突變之一。
因此，本發明提供一種抗原結合蛋白的變異體，其對FcRn的結合經過最佳化。在一個較佳具體例中，該抗原結合蛋白變異體在該抗原結合蛋白的Fc區中包含至少一個胺基酸修飾，其中該修飾在與親本多肽比對時是選自由以下組成之群：Fc區的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446以及447，其中Fc區中的胺基酸編號是Kabat的EU索引編號。
在本發明的又一態樣中，該等修飾為M252Y/S254T/T256E。
此外，參見例如Kontermann(2009)，多種公開文件描述用以獲得半衰 期經過修飾之生理活性分子的方法，其透過將FcRn結合多肽引入分子內或透過將分子與維持FcRn結合親和力但對其他Fc受體的親和力大幅降低的抗體融合或與抗體之FcRn結合域融合。
增加半衰期的pH切換技術
儘管在恆定區中的置換能夠明顯提升治療性IgG抗體的功能，但在嚴苛守恆恆定區中進行置換於人類體內有免疫原性風險，而在高度變異可變區序列中進行置換的免疫原性較低。關於可變區的報導包括對CDR殘基進行改造以提升對抗原的結合親和力，以及對CDR與骨架殘基進行改造以增進穩定性並降低免疫原性風險。已經知道可透過親和力成熟，使用隨機化庫的嗜菌體或核糖體展示來提升對抗原的親和力。
可基於序列與結構的合理設計來合理增進穩定性。可透過各種人類化方法學以及移除T細胞表位來降低免疫原性風險(去免疫化)，至於T細胞表位可以使用電腦技術來預測或透過活體外分析來決定。另外，可變區已被改造成具有較低的pI。相較於野生型抗體，儘管FcRn結合相當，但這些抗體觀察到有較長的半衰期。若抗原媒介的廓清機制通常會分解結合至抗原的抗體，便能縮短對具有pH依賴性抗原結合的抗體進行改造或篩選，以修飾抗體及/或抗原半衰期(例如IgG2抗體半衰期)。同樣，抗原：抗體複合體可能會影響抗原的半衰期，不論是因為保護抗原免於一般降解程序來延長半衰期，或是經由抗體媒介的降解來縮短半衰期。一個具體例是有關於在相較於胞內體pH(例如pH 5.5-6.0)，在pH 7.4下對抗原具有更高親和力的抗體，使得在pH5.5/pH 7.4下或在pH 6.0/pH 7.4下的KD比率為2或更高。舉例而言，為了要提升抗體的藥動學(PK)及藥效學(PD)特性，可以透過將組胺酸引入CDR殘基中改造對抗體的pH敏感性結合。
此外，也提供生產帶有生物半衰期降低之抗原結合蛋白的方法。His435突變成丙胺酸的變異體IgG會喪失FcRn結合的選擇性且血清半衰期明顯降 低(參見例如US6,165,745揭示一種生產抗原結合蛋白的方法，該抗原結合蛋白透過將突變引入編碼抗原結合蛋白的DNA區段中而降低生物半衰期)。突變包括在Fc樞紐域之位置253、310、311、433或434處的胺基酸置換。
連接子
蛋白質骨架可以與天然序列(諸如Ig序列，或天然序列的片段)相同，或者可包含額外序列(例如可以是天然的，來自不同來源或合成的，且其可被添加在骨架的N端或C端處)。若此等額外序列連接如本文定義之表位結合域以及蛋白質骨架，它們可能被認為是連接子。
在另一個態樣中，抗原結合建構物是由，或大體上是由抗體的Fc區或其一部分所組成，其在兩端直接或間接(例如經由連接子序列)連接至表位結合域。此一抗原結合建構物可包含2個被Fc區分隔開的表位結合域或其一部分。分隔開表示表位結合物與另一者不直接結合，且在一個態樣中是位在Fc區或任何其他骨架區的相反端(C端與N端)。
在一個態樣中，抗原結合建構物包含2個骨架區，以個別骨架區的N端與C端直接或經由連接子間接各自結合至2個表位結合域。
本發明之蛋白質骨架可透過使用連接子連結至表位結合域。適宜連接子的實例包括長度為1個胺基酸至150個胺基酸，或1個胺基酸至140個胺基酸，例如1個胺基酸至130個胺基酸，或1個胺基酸至120個胺基酸，或1個胺基酸至80個胺基酸，或1個胺基酸至50個胺基酸，或1個胺基酸至20個胺基酸，或1個胺基酸至10個胺基酸，或5至18個胺基酸的胺基酸序列。此等序列有自己的三級結構，例如本發明連接子可包含單一可變域。在一個具體例中，連接子的大小相當於單一可變域。適宜連接子的長度大小可為1至100Å，例如大小為20至80Å或例如大小可以是20至60Å，或例如少於40Å，或少於20Å，或少於5Å。
在本發明的一個具體例中提供ICOS結合蛋白，其包含以下一或多者： 如SEQ ID NO：1中所示的CDRH1；如SEQ ID NO：2中所示的CDRH2；如SEQ ID NO：3中所示的CDRH3；如SEQ ID NO：4中所示的CDRL1；如SEQ ID NO：5中所示的CDRL2；及/或如SEQ ID NO：6中所示的CDRL3，或各個CDR的直接等效物，其中直接等效物在該CDR中具有不超過兩個胺基酸置換。
在本發明的一個具體例中，提供特異地結合至人類ICOS的ICOS結合蛋白，其包含含有與SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列的VH域及/或與含有與SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序的VL域。在一個態樣中，本發明ICOS結合蛋白也結合至食蟹獼猴ICOS。在一個態樣中，它們不結合至鼠類ICOS。
在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白是ICOS促效劑。在一個態樣中，ICOS結合蛋白在T細胞存在時增加IFN-γ生產。在另一個態樣中，本發明ICOS結合蛋白刺激T細胞增生。
在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白結合至人類ICOS，其中締合速率常數(kon)為至少1X105M-1s-1；而解離速率常數(koff)為少於6X10-5s-1；或解離常數(Kd)少於100nM其中透過Biacore測量高親和力。
在一個具體例中，ICOS結合蛋白包含CDRH3(SEQ ID NO：3)或SEQ ID NO.3的變異體。在另一個具體例中，ICOS結合蛋白包含以下一或多者：CDRH1(SEQ ID NO：1)；CDRH2(SEQ ID NO：2)；CDRH3(SEQ ID NO：3)；CDRL1(SEQ ID NO：4)；CDRL2(SEQ ID NO：5)；及/或CDRL3(SEQ ID NO：6)。在一個具體例中，ICOS結合蛋白包含如SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；與SEQ ID NO：3中所示的重鏈CDR，以及如SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；與SEQ ID NO：6中所示的輕鏈CDR。
在一個具體例中，ICOS結合蛋白包含與如SEQ ID NO：7中所示胺基酸 序列具有90%序列一致性的VH域；以及與如SEQ ID NO：8胺基酸序列中所示胺基酸序列具有90%序列一致性的VL域。在一個態樣中，ICOS結合蛋白包含具有如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的VH域，以及具有如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列的VL域。在一個態樣中，ICOS結合蛋白包含由SEQ ID NO：7所組成的重鏈可變域。在一個態樣中，ICOS結合蛋白包含由SEQ ID NO：8所組成的輕鏈可變域。
在一個具體例中，本發明提供ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含與如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列具有至少90%一致性之胺基酸序列的VH域；以及與如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列具有至少90%一致性之胺基酸序列的VL域，其中該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分特異地結合至人類ICOS。在一個具體例中，ICOS結合蛋白或其抗原結合部分包含與如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列具有至少90%一致性之胺基酸序列的VH域；以及與如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列具有至少90%一致性之胺基酸序列的VL域，其中特異地結合至人類ICOS的該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分進一步包含具有如SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；與SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的重鏈CDR，以及具有如SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；與SEQ ID NO：6.中所示胺基酸序列的輕鏈CDR。在一個態樣中，ICOS結合蛋白或其抗原結合部分分包含含有如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的VH域；以及含有如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列的VL域。在一個具體例中，ICOS結合蛋白或其抗原結合部分是人類ICOS的促效劑。在一個態樣中，ICOS結合蛋白或其抗原結合部分進一步包含IgG4同型骨架或其變異體。在一個具體例中，ICOS結合蛋白或其抗原結合部分包含hIgG4PE骨架。
在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白是人類化單株抗體，包含與SEQ ID NO：23中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92,%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈胺基酸序列。
Figure 105102393-A0202-12-0038-6
(SEQ ID NO：23)
在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白是人類化單株抗體，包含與SEQ ID NO：24中所示胺基酸序列具有至少90%、91%、92,%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈胺基酸序列。
Figure 105102393-A0202-12-0038-7
Figure 105102393-A0202-12-0038-8
(SEQ ID NO：24)
在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白是人類化單株抗體，包含如SEQ ID NO：23中所示的重鏈胺基酸序列以及如SEQ ID NO：24中所示的輕鏈胺基酸序列。在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白進一步包含hIgGPE骨架。
在一個具體例中，提供ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該ICOS結合蛋白是人類化單株抗體。本發明也提供醫藥組成物，包含如申請專利範圍的ICOS結合蛋白或其抗原結合部分以及醫藥上可接受的載劑。
本發明提供在有需要的人類體內治療選自癌症、傳染病及/或敗血病之疾病的方法，該方法包含向該人類投與本發明醫藥組成物的步驟。在一個態樣中，該方法進一步包含向該人類投與至少一種抗贅瘤劑、至少一種第二免疫調節劑，及/或至少一種免疫刺激佐劑。在一個態樣中，該第二免疫 調節劑選自：抗-CTLA4抗體、抗-PD1抗體、抗-PDL1抗體及抗OX40抗體。在一個態樣中，抗-CTLA4抗體為易普利單抗(ipilimumab)。在一個態樣中，抗-PD-1抗體是選自派姆單抗(pembrolizumab)及/或納武單抗(nivolumab)。
在本發明的一個具體例中，提供用於在人類體內治療癌症的方法，包含向人類投與治療可接受量的ICOS結合蛋白或其抗原結合部分。在一些態樣中，癌症是選自結腸直腸癌(CRC)、食道癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎細胞癌(RCC)、EC鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、間皮瘤以及前列腺癌。
在一個具體例中，提供用於在人類體內治療傳染病的方法，包含向人類投與治療可接受量的ICOS結合蛋白或其抗原結合部分。在一個態樣中，傳染病為HIV。
在一個具體例中，提供用於在人類體內治療敗血病的方法，包含向人類投與治療可接受量的ICOS結合蛋白或其抗原結合部分。
在一個具體例中，提供用於在人類體內刺激T細胞增生、誘導T細胞活化及/或誘導細胞激素生產的方法，包含向該人類投與本發明醫藥組成物。
本發明亦提供編碼本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合蛋白的多核苷酸。在一個具體例中，提供包含編碼本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合部分之多核苷酸的宿主細胞。本發明亦提供製造ICOS結合蛋白或其抗原結合部分的方法，包含以下步驟：a)在適於表現本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合部分的條件下，培養包含編碼該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分之多核苷酸的宿主細胞；以及b)分離該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分。
本發明提供經分離人類化單株抗體，其包含含有如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的VH域；以及含有如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列的VL域；以及hIgG4骨架或其變異體。在一個態樣中，hIgG4骨架為hIgG4PE。
在一個具體例中，提供ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中ICOS結 合蛋白或其抗原結合部分與某一個參考抗體或其抗原結合部分交叉競爭結合人類ICOS，該參考抗體或其抗原結合部分含有如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的VH域；以及含有如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列的VL域。
在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白與T細胞接觸時會刺激T細胞增生。在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白與T細胞接觸時會誘發T細胞活化。T細胞活化可以透過某些活化標記的表現量百分率增加來測量，活化標記諸如是(但不限於)CD69、CD25及/或OX40。在一個具體例中，本發明ICOS結合蛋白與T細胞接觸時刺激細胞激素生產。ICOS結合蛋白結合至人類FcγRIIb但不結合至FcγRIIa或人類FcγRIIIa。此外，ICOS結合蛋白與ICOS表現T細胞接觸時，不會耗盡ICOS表現T細胞。在一些態樣中，ICOS結合蛋白當在第二細胞存在下與T細胞接觸時，會與第二細胞交叉連結T細胞。這個交叉連結可能是透過ICOS結合蛋白與第二細胞上的FcγR接合而發生。FcγR表現細胞包括，但不限於單核細胞、B淋巴細胞、濾泡性樹突狀細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、中性球、嗜伊紅白血球、嗜鹼性白血球與肥大細胞。因此，在一個具體例中，ICOS結合蛋白可被投與給哺乳動物，其中ICOS結合蛋白將充作為T細胞上之ICOS的促效劑，並且將會與第二細胞上的FcγR接合。
在一個具體例中，ICOS結合蛋白包含選自人類IgG1同型或其變異體，以及IgG4同型或其變異體的骨架。該骨架適宜地包含人類IgG4同型骨架或其變異體。在一個態樣中，該骨架包含hIgG4PE骨架。
在一個具體例中，ICOS結合蛋白為單株抗體。該ICOS結合蛋白適宜地為人類化單株抗體。在一個態樣中，本發明的單株抗體為完全人類單株抗體。
在另一個態樣中，ICOS結合蛋白為一個片段，其為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、迷你抗體、微抗體、經分離VH或經 分離VL。在一個具體例中，該ICOS結合蛋白為其抗原結合部分。
在一些態樣中，ICOS結合蛋白以強於0.6nM的親和力結合至人類ICOS。在一個態樣中，親和力為100nM或更強。在一個具體例中，ICOS結合蛋白對ICOS具有100nM的KD。適宜地，ICOS結合蛋白對ICOS的KD為100nM或更少、50nM或更少、25nM或更少、10nM或更少、2nM或更少或1nM或更少。
在一個具體例中，本發明提供人類化單株抗體，其為人類ICOS的促效劑。在一個具體例中，本發明提供人類化單株抗體，其包含具有如SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；與SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR，以及具有如SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；與SEQ ID NO：6中所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR。在一個態樣中，該人類化單株抗體與T細胞接觸時能夠刺激細胞激素生產及/或T細胞增生，同時不會誘發補體、ADCC或CDC。在一個具體例中，該人類化單株抗體具有變異體人類IgG1 Fc區。在一個具體例中，該人類化單株抗體具有變異體人類IgG4 Fc區或其變異體。在一個具體例中，該人類化單株抗體具有hIgG4PE Fc區。在一個態樣中，該人類化單株抗體包含含有與如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列的VH域；以及含有與如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列的VL域。在一個態樣中，該人類化單株抗體包含含有如SEQ ID NO：7中所示之胺基酸序列的VH域；以及含有如SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列的VL域。在一個態樣中，該人類化單株抗體包含hIgG4PE骨架。另外，本發明人類化單株抗體顯示當與CD4+或CD8+ T細胞接觸時會刺激T細胞增生。本發明人類化單株抗體顯示會誘發T細胞活化並刺激細胞激素生產。
在一個具體例中，該人類化單株抗體包含hIgG4PE骨架並包含含有如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的VH域；以及如SEQ ID NO：8中所示胺基酸 序列的VL域。本發明抗體當與T細胞接觸時可刺激細胞激素生產。
在一個具體例中，提供一種ICOS結合蛋白，其與任一本發明ICOS結合蛋白競爭結合ICOS。如技藝中所理解並在本文所述，藉由在存有一或多種ICOS結合蛋白的情況下比較對ICOS的配體結合競爭來測量結合競爭。在技藝中亦理解，ICOS表現在CD4+與CD8+ T細胞以及Treg細胞上。本發明ICOS結合蛋白充作T細胞上之ICOS的促效劑。它們也發揮作用阻斷ICOS-L與表現在T細胞及Treg細胞上的ICOS之間交互作用。因此，在一個具體例中，提供阻斷ICOS-L與Treg細胞上之ICOS交互作用的方法。可以在不同類型的腫瘤中發現到ICOS表現Treg細胞，包括液體腫瘤(諸如淋巴瘤)。因此，在本發明的一個態樣中，提供治療癌症的方法，其包含投與本發明的ICOS結合蛋白，其中該ICOS結合蛋白阻斷ICOS-L與Treg細胞上之ICOS交互作用。
本發明更進一步是醫藥組成物，其包含本文所述ICOS結合蛋白或單株抗體。在一個態樣中，本發明醫藥組成物更包含至少一種抗贅瘤劑。在一個態樣中，本發明醫藥組成物更包含至少一種第二免疫調節劑。在一個態樣中，本發明醫藥組成物更包含至少一種免疫調節佐劑。
在一個具體例中，提供在有需要的人類體內治療癌症及/或傳染病的方法，其中該方法包含向該人類投與本發明醫藥組成物的步驟。在一個具體例中，人類患有癌症。在一個具體例中，人類患有傳染病。在一個具體例中，人類患有HIV。在一個態樣中，該方法進一步包含向該人類投與至少一種抗贅瘤劑。在另一個態樣中，該方法進一步包含向該人類投與至少一種第二免疫調節劑。在又另一種態樣中，該方法進一步包含向該人類投與免疫刺激佐劑。
在一個態樣中，該人類患有實體腫瘤。在一個態樣中，該腫瘤選自頭頸癌、胃癌、黑色素瘤、腎細胞瘤(RCC)、食道癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌及胰臟癌。在一個態樣中，該人類患有以下一或 多者：結腸直腸癌(CRC)、食道癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎細胞癌(RCC)、EC鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、間皮瘤，以及前列腺癌。在另一個態樣中，該人類患有液體腫瘤，諸如瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、多發性骨髓瘤、慢性淋巴母細胞性白血病(CLL)、濾泡性淋巴瘤、急性骨髓性白血病及慢性骨髓性白血病。
本揭示內容也是關於一種用以治療或減輕選自以下癌症之嚴重程度的方法：腦癌(神經膠質瘤)、神經膠質母細胞瘤、Bannayan-Zonana症候群、Cowden氏症候群、Lhermitte-Duclos病、乳癌、發炎性乳癌、威爾姆氏腫瘤、Ewing氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、結腸癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨細胞腫瘤、甲狀腺癌、淋巴母細胞性T細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、急性淋巴母細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性嗜中性白血球白血病、急性淋巴母細胞性T細胞白血病、漿細胞瘤、免疫母細胞性大細胞白血病、套細胞白血病、多發性骨髓瘤巨核母細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性巨核母細胞性白血病、前髓細胞性白血病、紅血球性白血病、惡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴母細胞性T細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、神經母細胞瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎癌、間皮瘤、食道癌、唾腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、口部癌症，GIST(胃腸基質腫瘤)以及睪丸癌。
如本文所用，術語「治療」及其文法變化形式表示治療性療法。提到特定病況時，治療表示：藉由將病況的一或多種生物徵象消除或減少至偵測不到的程度，歷時一段被認為是徵象緩解狀態的時間而不需要額外治療的緩解期間，以(1)改善或預防病況的一或多種生物徵象的病況、(2)干擾(a)在生物學級聯中會造成病況或者是病況病因的一或多點，或(b)病況的一或 種生物徵象、(3)減輕或治療與病況相關的一或多個症狀、影響或副作用、(4)延緩病況進展或病況的一或多種生物徵象，及/或(5)治癒該病況或該病況的一或多種生物徵象。習於技藝者將能理解，持續時間被認為是緩解特定疾病或病況。從而也能推想到預防性療法。習於技藝者將能理解，「預防」不是絕對條件。在醫學上，「預防」被理解為是指預防性投與藥物好能實質上削弱病況或其生物病徵的可能性或嚴重程度，或延遲該病況或其生物徵象發生。例如當認為個體處於發生癌症的高度風險下(諸如當個體有極多家族癌症病史或當個體已暴露於致癌物時)，預防性療法是合宜的。
如本文所用，術語「癌症」、「贅瘤」以及「腫瘤」可呈單數型或複數型交替使用，意指經過使細胞變成對宿主生物具有病理性的惡性轉形的細胞。透過已建立的技術(尤其是組織學檢驗)，原發性癌細胞可輕易與非癌細胞區別。如本文所用，癌細胞的定義不但包括原發性癌細胞，也包括由前驅癌細胞衍生而來的任何細胞。這包括轉移癌細胞，以及衍生自癌細胞的活體外培養物與細胞株。當提到某個類型的癌症時，通常顯示為實體腫瘤，「臨床上可偵測到的」腫瘤是一種基於腫瘤塊而可偵測到的腫瘤；例如藉由諸如電腦斷層(CT)掃描、核磁共振成像(MRI)、X-射線、超音波或對身體檢查的觸診，及/或是因為表現一或多種癌症特異性抗原而可以在或自患者的樣品中偵測到。腫瘤可以是造血性(或血液學或血液或血液相關)癌，例如衍生自血球細胞或免疫細胞的癌症，它可以被稱為是「液體腫瘤」。以血液腫瘤為主之臨床病況的特定實例包括白血病，諸如慢性骨髓細胞性白血病、急性骨髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病以及急性淋巴細胞性白血病；漿細胞惡性病，諸如多發性骨髓瘤、MGUS以及瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)；淋巴瘤，諸如非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤；以及類似者。
癌症可以是任一種出現異常數量的母細胞或不樂見的細胞增生，或診 斷為血液癌(包括淋巴性與骨髓性惡性病)的癌症。骨髓性惡性病包括，但不限於急性骨髓性(或骨髓細胞性或骨髓性或骨髓母細胞性)白血病(未分化或已分化)、急性前髓性(或前髓細胞性或前髓性或前髓母細胞性)白血病、急性骨髓單核細胞性(或骨髓單核母細胞性)白血病、急性單核細胞性(或單核母細胞性)白血病、紅血球性白血病以及巨核細胞性(或巨核母細胞性)白血病。這些白血病可以統稱為急性骨髓性(或骨髓細胞性或骨髓性)白血病(AML)。骨髓性惡性病也包括骨髓增生性病症(MPD)，其包括(但不限於)慢性骨髓性(或骨髓)白血病(CML)、慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)、原發性血小板增多症(或血小板增多症)，以及真性紅血球增多症(PCV)。骨髓性惡性病也包括骨髓發育不良(或骨髓發育不良症候群或MDS)，其可稱為難治性貧血(RA)、有過量母細胞的難治性貧血(RAEB)，以及帶有過量轉形母細胞的難治性貧血(RAEBT)；以及帶有或沒有原因不明性髓性上皮化生的骨髓纖維化(MFS)。
造血癌症亦包括淋巴惡性病，其可能影響淋巴結、脾臟、骨髓、周邊血液及/或結外位點。淋巴癌包括B細胞惡性病，其包括(但不限於)B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。B-NHL可以是無痛(或低度)、中度(或侵襲性)或高度(很有侵襲性)。無痛B細胞淋巴瘤包括濾泡性淋巴瘤(FL)；小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)；邊緣區淋巴瘤(MZL)，包括結MZL、結外MZL、脾臟MZL以及帶有絨毛狀淋巴細胞的脾臟MZL；淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)；以及黏膜相關淋巴樣組織(MALT或結外邊緣區)淋巴瘤。中度B-NHL包括有或沒有涉及白血病的套細胞淋巴瘤(MCL)、瀰漫性大細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性大細胞(或第3級或第3B級)淋巴瘤，以及原發性縱膈淋巴瘤(PML)。高度B-NHL包括伯基特氏淋巴瘤(BL)、伯基特氏樣淋巴瘤、小無裂核細胞淋巴瘤(SNCCL)以及淋巴母細胞性淋巴瘤。其他B-NHL包括免疫母細胞性淋巴瘤(或免疫細胞瘤)、原發性滲出性淋巴瘤、HIV相關(或AIDS相關)淋巴瘤， 以及移植後淋巴增生性病症(PTLD)或淋巴瘤。B細胞惡性病亦包括，但不限於慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、前淋巴細胞性白血病(PLL)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、毛細胞白血病(HCL)、大顆粒淋巴細胞(LGL)白血病、急性淋巴樣(或淋巴細胞性或淋巴母細胞性)白血病與Castleman氏病。NHL也可以包括T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)，其包括(但不限於)未列名(NOS)的T細胞非霍奇金氏淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)、退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)、血管免疫母細胞性淋巴樣病(AILD)、鼻腔型天然殺手(NK)細胞/T細胞淋巴瘤、γ/δ淋巴瘤、皮膚型T細胞淋巴瘤、蕈狀肉芽腫(mycosis fungoides)以及Sezary症候群。
造血癌症亦包括霍奇金氏淋巴瘤(或疾病)，包括典型霍奇金氏淋巴瘤、結節硬化型霍奇金氏淋巴瘤、混合細胞型霍奇金氏淋巴瘤、淋巴細胞主要型(LP)霍奇金氏淋巴瘤、結節LP霍奇金氏淋巴瘤與淋巴細胞缺乏型霍奇金氏淋巴瘤。造血癌症也包括漿細胞疾病或癌症，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括和緩性MM、不典型(或未知或未明)單株球蛋白症(MGUS)、漿細胞瘤(骨、髓外)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、漿細胞白血病，以及原發性類澱粉變性(AL)。造血癌症亦可包括額外造血細胞的其他癌症，包括多型核白血球(或中性球)、嗜鹼性白血球、嗜伊紅白血球、樹突狀細胞、血小板、紅血球與天然殺手細胞。包括造血細胞的組織在本文稱為「造血細胞組織」，包括骨髓；周邊血液；胸腺；以及周邊淋巴樣組織，諸如脾臟、淋巴結、與黏膜有關的淋巴樣組織(諸如與腸有關淋巴樣組織)、扁桃腺、裴氏斑與闌尾，以及和其他黏膜有關的淋巴樣組織，例如支氣管內襯。
本發明ICOS結合蛋白、抗體及抗原結合片段亦可用來治癒、防止或治療感染及傳染病。ICOS結合蛋白可單獨使用或與疫苗組合使用，以便刺激對病原、毒素以及自身抗原的免疫反應。本發明ICOS結合蛋白可針對對人 類有傳染性的病毒刺激免疫反應，諸如，但不限於免疫缺乏症病毒、A型、B型及C型肝炎病毒、E-B病毒、人類細胞巨大病毒、人類乳突狀病毒、泡疹病毒。本發明ICOS結合蛋白可用於刺激針對細菌或真菌寄生物，與其他病原之感染的免疫反應。適宜地，本發明提供用於治療已暴露於特定毒素或病原之人類的方法。因此，本發明的另一個態樣提供一種在個體體內治療傳染病的方法，包含向個體投與ICOS結合蛋白或其抗原結合部分。
本發明ICOS結合蛋白可使用的傳染病實例包括，但不限於HIV、肝炎(A、B&C)、流感、泡疹、鞭毛蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌。病原性病毒引起感染，而這些感染可由本發明方法治療，病原性病毒的一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C)、泡疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II與CMV、E-B病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、腸道細胞病變性人類孤兒病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道融合性病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳突狀病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒以及蟲媒病毒性腦炎病毒。
病原性細菌引起感染，而這些感染可由本發明方法治療，病原性細菌的一些實例包括披衣菌、立克次體、分歧桿菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎球菌及柯諾球菌(conococci)、克雷伯氏菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、退伍軍人症桿菌、白喉桿菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂弧菌、破傷風菌、肉毒桿菌、炭疽菌、鼠疫菌、鉤端螺旋體病以及萊姆病菌。
病原性真菌引起感染，而這些感染可由本發明方法治療，病原性真菌的一些實例包括念珠菌屬(白色念珠菌、克魯斯念珠菌、平滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌、麴菌(薰煙色麴菌、黑麴菌等)、毛黴目(毛黴屬、犁頭黴屬、根黴屬)、申克氏孢子絲菌(Sporothrix Schenkii)、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和莢膜組織胞漿菌。
病原性寄生蟲引起感染，而這些感染可由本發明方法治療，病原性寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴、大腸纖毛蟲、變形纖毛蟲(Naegleria fowleri)、棘形變形蟲種、梨形鞭毛蟲、隱孢子蟲種、肺胞囊蟲、間日瘧原蟲、小鼠焦蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼體、弓蟲以及巴西鼠鉤蟲。
敗血病是一種潛在性致死醫學病況，特徵在於全身性發炎狀態(稱為全身性發炎性反應症候群或SIRS)以及存在已知或懷疑有感染。身體可能透過免疫系統對血液、尿液、肺、皮膚或其他組織中的微生物發展出發炎性反應。簡言之，敗血病是一種血液中毒，在下面更貼切應用的是敗血症(septicaemia)。嚴重敗血病是全身性發炎性反應加上感染，加上存在器官功能異常。
敗血症是一種醫學相關術語，指的是血液中存在會致使敗血病的病原性生物。這個術語未被明確定義。
敗血症與癌症有類似的免疫抑制性機制，包括T調節性細胞增加、骨髓衍生的抑制細胞增加、負向共刺激性分子的表現增加、單核細胞/巨噬細胞HLA-DR表現減少。敗血症與癌症是慢性發炎的原型病症。Chronic inflammation stimulates potent and sustained immunoregulatory responses,including expansion of T regulatory cells and up-regulation of PD-1 and other negative regulators on effector cells.Barouch D.H.and Deeks S.G.；Immunologic strategies for HIV-1 remission and eradication.Science 345：169-1742014。因此，在本發明的一個態樣中，提供用於在有需要的人類體內治療敗血症的方法，包含向該人類投與治療有效量的本發明ICOS抗原結合蛋白。Boomer,et al.JAMA 306：2594-2605(2011)；Meisel,et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to reverse sepsis-associated immunosuppression：a double-blind,randomized,placebo-controlled multicenter trial.Am J Respir Crit Care Med 180：640-648(2009)；以及Hall,et al.Immunoparalysis and nosocomial infection in children with multiple organ dysfunction syndrome.Intensive Care Med 37：525-532(2011)。
本發明ICOS結合蛋白可與其他重組形蛋白及/或肽(諸如腫瘤抗原或癌細胞)組合使用，以便提高對這些蛋白質的免疫反應(亦即在免疫接種程序中)。
舉例而言，藉由共投與至少一種ICOS結合蛋白以及感興趣抗原(例如疫苗)，其ICOS結合蛋白可用來刺激抗原特異性免疫反應。因此，在本發明的另一個態樣中，提供一種在個體體內提高對抗原之免疫反應的方法，包含向該個體投與：(i)抗原；以及(ii)本發明ICOS結合蛋白，致使在個體體內對抗原的免疫反應升高。抗原可以是例如腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或病原體抗原。此等抗原的非限制實例包括(但不限於)腫瘤抗原，或病毒、細菌或其他病原體的抗原。
要根除HIV的一個主要障礙在於，潛在感染細胞保持著不表現病毒抗原，並且逃過免疫監控。目前要消除病毒貯器的策略稱為「踢與殺(kick and kill)」策略，旨在重新活化HIV基因表現(「踢」)作為細胞活化，造成HIV再活化，並且清除重新活化的細胞(「殺」)。細胞活化受到表現於T細胞表面上的正向與負向調節因子平衡所管理。透過促進正向調節因子並拮抗負向調節因子來改變這個平衡，可促使HIV重新活化。
可誘導型T細胞共刺激因子(ICOS)是一種正向調節因子，它於CD4 T細胞上的表現會在刺激之後增加。ICOS具有促使T細胞增生、細胞激素生產以及分化的功能。一個表現高度PD-1以及ICOS的重要T細胞子集是T濾泡性輔助T細胞(Tfh)。Tfh細胞幫助B細胞經歷分化、類型轉換、體細胞突變，而且對於胚中心形成來說是必要的。Tfh細胞在HIV/SIV感染之後明顯擴增，且它們的功能失調在長期慢病毒感染期間是B細胞免疫性障礙的主因。已顯 示，經分選的Tfh在刺激之後比其他淋巴性CD4子集有更高含量的HIV DNA且觀察到病毒長成。Tfh駐留於胚中心並且暴露於被困在濾泡性樹突狀細胞上會促使其感染的HIV病毒顆粒。此外，CD8 T細胞對胚中心的接近有限，且濾泡性CD8細胞通常顯示會細胞毒性降低，因此Tfh細胞逃過抗病毒監視。因此，Tfh細胞是重要的受保護HIV貯器，而靶定PD-1與ICOS的策略會選擇性靶定Tfh細胞且是可用於HIV治癒方案的一部分。適宜地，提供用於治療感染HIV之人類的方法，包含投與本發明ICOS結合蛋白或其抗原結合部分。
如本文所用，「腫瘤抗原」是由腫瘤細胞產生的蛋白質，其會引起免疫反應，尤其是T細胞媒介的免疫反應。術語「腫瘤抗原」如本文所用包括腫瘤特異性抗原以及腫瘤相關抗原。腫瘤特異性抗原對於腫瘤細胞來說是獨一無二的，且不會出現在體內的其他細胞上。腫瘤相關抗原對腫瘤細胞來說不是獨一無二的且反而於無法誘發對抗原的免疫耐受性的條件下會表現在正常細胞上。腫瘤上的抗原表現發生在使免疫系統能夠對抗原反應的條件下。腫瘤相關抗原可以是胚發育期間表現在正常細胞上的抗原，當時免疫系統不成熟且無法反應或它們可能正常是極低含量存在於正常細胞上但在腫瘤細胞上以更高含量表現的抗原。
腫瘤抗原的非限制性實例包括下列：分化抗原，諸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2與腫瘤特異性多譜系抗原，諸如MAGE家族抗原，包括但不限於MAGE1、MAGE3、MAGE10、MAGE11、MAGE12、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB18、MAGEB6、MABEC1、MAGED2、MAGEE1、MAGEH1、MAGEL2、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；MEL4、黑色素瘤相關抗原100+、黑色素瘤gp 100、NRIP3、NYS48、OCIAD1、OFA-iLRP、OIP5、卵巢癌-相關抗原(OV632)、PAGE4、PARP9、PATE、 網素L、PRAME、前列腺特異性抗原、蛋白酶3、前列腺素(prostein)、Reg3a、RHAMM、ROPN1、SART2、SDCCAG8、SEL1L、SEPT1、SLC45A2、SPANX、SSX5、STXGALNAC1、STEAP4、生存素、TBC1D2、TEM1、TRP1、上皮來源的腫瘤抗原、XAGE1、XAGE2、WT-1；過度表現的胚抗原，諸如CEA；過度表現的致癌基因以及突變的腫瘤抑制因子基因，諸如p53、Ras、HER-2/neu；因為染色易位所致的獨特腫瘤抗原；諸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，諸如E-B病毒抗原EBVA與人類乳突狀病毒(HPV)抗原E6和E7。
其他腫瘤抗原包括，但不限於TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-鏈蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白/親環蛋白C相關蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、神經膠質瘤相關抗原、β-人類絨毛膜促性腺激素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺素、PSMA、Her2/neu、生存素與端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性球彈性蛋白酶、蝶素(ephrin)B2、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受體與間皮素。
典型地，在本發明中對被治療的易感性腫瘤具有活性的任何抗贅瘤劑 可以共同給藥以便治療癌症。這些藥劑的實例可參見V.T.Devita和S.Hellman(主編)的Cancer Principlesand Practice of Oncology，第6版(2001年2月15日)，Lippincott Williams & WilkinsPublishers。技藝中具有通常技術者將能夠基於藥物和涉及的癌症的具體特徵辨別哪種藥劑組合會有用。可用於本發明的典型抗贅瘤劑包括，但不限於抗微管劑，諸如二萜類和長春花生物鹼；鉑配位錯合物；烷化劑如氮芥、氧氮磷雜環己烷(oxazaphosphorine)、烷基磺酸酯、亞硝基脲和三氮烯；抗生素，諸如蒽環黴素、放線菌素和博來黴素；拓樸異構酶II抑制劑，諸如表鬼白毒素；抗代謝物，如嘌呤和嘧啶類似物及抗葉酸化合物；拓樸異構酶I抑制劑，諸如喜樹鹼；激素和激素類似物；信號傳遞路徑抑制劑；非受體酪胺酸激酶血管生成抑制劑；免疫治療劑；促細胞凋亡劑；及細胞週期信號傳遞抑制劑。
用於與本發明ICOS結合蛋白組合或共投與的更多活性成分的實例為抗贅瘤劑，包括任何化療劑、免疫調節性藥劑或免疫調節劑與免疫刺激性佐劑。
抗微管或抗有絲分裂劑是時相特異性藥劑(phase specific agent)，其在細胞週期中的M期或有絲分裂期對腫瘤細胞的微管具有活性。抗微管劑的實例包括但不限於二萜類和長春花生物鹼。
衍生自天然來源的二萜類是相位特異性的抗癌劑，其在細胞週期中的G2/M期起作用。咸信二萜類透過與該蛋白結合，使微管的β微管蛋白次單位穩定。然後使蛋白質的分解受到抑制，有絲分裂停止，接著發生細胞死亡。二萜類的實例包括但不限於太平洋紫杉醇及其類似物多西紫杉醇。
太平洋紫杉醇，5β,20-環氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六-羥基紫杉(tax)-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸2-苯甲酸13-酯與(2R,3S)-N-苯甲醯基-3-苯基異絲胺酸酯，其是從太平洋紫杉樹(Taxus brevifolia)中分離出來的天然二萜產物，且在商業上可取得的可注射溶液TAXOL®。其為萜類紫杉烷家族的成員。在1971年 由Wani等人首次分離出來(Wani et al.J.Am.Chem,Soc.,93：2325.1971)，並通過化學和X-射線結晶學方法對其結構進行特徵鑑定。其活性的機制之一是太平洋紫杉醇能夠結合微管蛋白，進而抑制癌細胞生長。Schiff et al.,Proc.Natl,Acad,Sci.USA,77：1561-1565(1980)；Schiff et al.,Nature,277：665-667(1979)；Kumar,J.Biol,Chem,256：10435-10441(1981)。有關某些太平洋紫杉醇衍生物的合成及抗癌活性的綜述，請參見：D.G.I.Kingston et al.,Studies in Organic Chemistry vol.26,entitled“New trends in Natural Products Chemistry 1986”,Attaur-Rahman,P.W.Le Quesne,Eds.(Elsevier,Amsterdam,1986)pp 219-235。
在美國，已經批准太平洋紫杉醇在臨床上用於治療難治型卵巢癌(Markman et al.,Yale Journal of Biology and Medicine,64：583,1991；McGuire et al.,Ann.lntem,Med.,111：273,1989)和用於治療乳癌(Holmes et al.,J.Nat.Cancer Inst.,83：1797,1991)。其為治療皮膚癌(Einzig et.al.,Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.,20：46)及頭頸癌(Forastire et.al.,Sem.Oncol.,20：56,1990)的可能的候選物。該化合物還顯示有治療多囊性腎病(Woo et.al.,Nature,368：750.1994)、肺癌與瘧疾的潛力。採用太平洋紫杉醇治療患者，導致骨髓抑制(多譜系Ignoff,R.J.et.al,Cancer Chemotherapy Pocket Guide,1998)，這與高於閾值濃度(50nM)的給藥持續時間有關(Kearns,C.M.et.al.,Seminars in Oncology,3(6)p.16-23,1995)。
多西紫杉醇，(2R,3S)-N-羧基-3-苯基異絲胺酸酯、N-第三丁酯、13-酯加上5β-20-環氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羥基紫杉-11-烯-9-酮4-乙酸酯2-苯甲酸酯，三水合物；是商業上可得到的可注射溶液TAXOTERE®。多西紫杉醇可用於治療乳癌。多西紫杉醇是紫杉醇的半合成衍生物，其是適量(q.v.)利用天然前驅物，即從歐洲紫杉樹的針葉中提取的10-去乙醯基漿果赤黴素III製備的。多西紫杉醇的劑量限制性毒性是嗜中性白細胞減少症。
長春花生物鹼是源於長春花植物的時相特異性抗贅瘤藥劑。長春花生物鹼透過特異性地結合至微管蛋白而在細胞週期的M期(有絲分裂)發生作用。因此，被結合的微管蛋白分子不能聚合成微管。咸信有絲分裂在中期被停止，隨後細胞死亡。長春花生物鹼的實例包括但不限於長春鹼、長春新鹼，及長春瑞濱。
長春鹼，長春花鹼硫酸鹽，在商業上可以VELBAN®可注射液購得。儘管已經表明其有可能作為各種實體瘤的第二線治療，但是其最初是用於治療睪丸癌和各種淋巴瘤，包括霍奇金氏病；淋巴細胞性和組織細胞性淋巴瘤。長春鹼的劑量限制性副作用是骨髓抑制。
長春新鹼，長春花鹼22-側氧基-硫酸鹽，在商業上可以ONCOVIN®可注射溶液購得。長春新鹼顯示可用於治療急性白血病，還發現用於治療霍奇金氏和非霍奇金氏惡性淋巴瘤。脫髮和神經學影響是長春新鹼最常見的副作用，並產生較小程度的骨髓抑制和胃腸黏膜炎。
長春瑞濱，3',4'-二去氫-4'-去氧-C'-去甲長春花鹼(norvincaleukoblastine)[R-(R*,R*)-2,3-二羥基丁二酸酯(1：2)(鹽)]，商業上可以長春瑞濱酒石酸鹽注射溶液(NAVELBINE®)購得，是半合成的長春花生物鹼。長春瑞濱可作為單獨的藥劑或與其它化學治療劑(諸如順鉑)組合用於治療各種實體瘤，特別是非小細胞肺癌、晚期乳癌及激素難治型前列腺癌。骨髓抑制是長春瑞濱最常見的劑量限制性副作用。
鉑配位錯合物是非時相特異性的抗癌劑，其與DNA交互作用。鉑錯合物進入腫瘤細胞，進行水合作用，並與DNA形成股內和股間交連，導致對腫瘤不利的生物學作用。鉑配位錯合物的實例包括但不限於順鉑和卡鉑。
順鉑，順式-二胺二氯鉑，商業上可以PLATINOL®注射溶液購得。順鉑主要用於治療轉移性睪丸癌和卵巢癌以及晚期膀胱癌。順鉑的主要劑量限制性副作用是腎毒性和耳毒性，所述腎毒性可通過水合和利尿來控制。
卡鉑，二胺[1,1-環丁烷-二羧酸根(2-)-O,O']鉑，在商業上可以PARAPLATIN®注射溶液購得。卡鉑主要用於晚期卵巢癌的一線和二線治療。骨髓抑制是卡鉑的劑量限制性毒性。
烷化劑是非時相抗癌特異性藥劑和強親電子劑。通常，烷化劑透過烷基化作用，經由DNA分子的親核部分(如磷酸根(phosphate)、胺基、巰基、羥基、羧基和咪唑基)與DNA形成共價鍵連。這種烷基化作用中斷核酸功能，導致細胞死亡。烷化劑的實例包括但不限於氮芥，諸如環磷醯胺、美法侖和苯丁酸氮芥；烷基磺酸酯，諸如白消安；亞硝基脲，諸如卡莫司汀；及三氮烯，諸如達卡巴嗪。
環磷醯胺，2-[雙(2-氯乙基)胺基]四氫-2H-1,3,2-氧氮磷雜環己烯2-氧化物單水合物，商業上可以CYTOXAN®注射溶液或錠劑購得。環磷醯胺可作為單獨藥劑或與其它化療劑組合，用於治療惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤和白血病。脫髮、噁心、嘔吐和白細胞減少症是環磷醯胺最常見的劑量限制性副作用。
美法侖，4-[雙(2-氯乙基)胺基]-L-苯丙胺酸，商業上可以ALKERAN®注射溶液或錠劑購得。美法侖可用於多發性骨髓瘤和不可切除的卵巢上皮癌的緩和治療。骨髓抑制是美法侖最常見的劑量限制性副作用。
苯丁酸氮芥，4-[雙(2-氯乙基)胺基]苯丁酸，商業上可以LEUKERAN®錠劑購得。苯丁酸氮芥可用於慢性淋巴細胞性白血病，與惡性淋巴瘤如淋巴肉瘤、巨濾泡性淋巴瘤，及霍奇金氏病)的緩和治療。骨髓抑制是苯丁酸氮芥最常見的劑量限制性副作用。
白消安，1,4-丁二醇二甲磺酸酯，商業上可以MYLERAN®錠劑購得。白消安用於慢性骨髓細胞性白血病的緩和治療。骨髓抑制是白消安最常見的劑量限制性副作用。
卡莫司汀，1,3-[雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲，商業上可以BiCNU®單瓶裝 的凍乾產物購得。卡莫司汀可作為單獨的藥劑或與其它藥劑組合，用於腦瘤、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病和非霍奇金氏淋巴瘤的緩和治療。延遲的骨髓抑制是卡莫司汀最常見的劑量限制性副作用。
達卡巴嗪，5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲醯胺，商業上可以DTIC-Dome®單瓶裝材料購得。達卡巴嗪可用於轉移性惡性黑色素瘤的治療，並且可與其它藥劑組合，用於霍奇金氏病的第二線治療。噁心、嘔吐和厭食是達卡巴嗪最常見的劑量限制性副作用。
抗生素類抗贅瘤劑是非時相特異性藥劑，其結合或嵌入DNA中。通常，這種作用導致穩定的DNA錯合物或股斷裂，破壞核酸的正常功能，導致細胞死亡。抗生素抗贅瘤藥劑的實例包括，但不限於放線菌素，諸如放線菌素；蒽環黴素，諸如柔紅黴素和多柔比星；及博來黴素。
放線菌素，也稱為放線菌素D，商業上可以COSMEGEN®注射形式購得。放線菌素可用於威爾姆氏腫瘤和橫紋肌肉瘤的治療。噁心、嘔吐和厭食是放線菌素最常見的劑量限制性副作用。
柔紅黴素，(8S-順)-8-乙醯基-10-[(3-胺基-2,3,6-二去氧-α-L-來蘇(lyxo)-己吡喃糖基))氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-1-甲氧基-5,12-稠四苯二酮鹽酸鹽，商業上可以DAUNOXOME®脂質體可注射形式或CERUBIDINE®可注射劑購得。柔紅黴素可在急性非淋巴細胞性白血病和晚期HIV相關的卡波西肉瘤的治療中用於誘導緩解。骨髓抑制是柔紅黴素最常見的劑量限制性副作用。
多柔比星，(8S,10S)-10-[(3-胺基-2,3,6-二去氧-α-L-來蘇-己吡喃糖基)氧基]-8-乙醇醯基-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-1-甲氧基-5,12-稠四苯二酮鹽酸鹽，商業上可以RUBEX®或ADRIAMYCINRDF®可注射形式購得。多柔比星主要用於急性淋巴母細胞性白血病和急性骨髓母細胞性白血病的治療，但也可用作治療某些實體腫瘤和淋巴瘤的組分。骨髓抑制是多柔比星最常見的劑量限制性副作用。
博來黴素，是從輪絲鏈黴菌(Streptomyces verticilus)菌株中分離出來的細胞毒素糖肽類抗生素的混合物，商業上可以BLENOXANE®購得。博來黴素可作為單獨藥劑或與其它藥劑組合，用於鱗狀細胞癌、淋巴瘤和睪丸癌的緩和治療。肺部和皮膚毒性是博來黴素最常見的劑量限制性副作用。
拓樸異構酶II抑制劑包括但不限於表鬼臼毒素。
表鬼白毒素是來源於曼德拉草(mandrake)植物的時相特異性的抗墜療藥劑。表鬼臼毒素通常透過與拓樸異構酶II和DNA形成三級錯合物，導致DNA股斷裂來影響細胞週期的S和G2期的細胞。股斷裂積聚，接著細胞死亡。表鬼臼毒素的實例包括但不限於依託泊苷和替尼泊苷。
依託泊苷，4'-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-0-(R)-亞乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，商業上可以VePESID®注射溶液或膠囊購得，並且常稱之為VP-16。依託泊苷可作為單獨的藥劑或與其它化療劑組合，用於治療睪丸癌和非小細胞肺癌。骨髓抑制是依託泊苷最常見的副作用。白血球減少症的發生率往往比血小板減少症更嚴重。
替尼泊苷，4'-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-0-(R)-噻吩亞基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，商業上可以VUMON®注射溶液購得，並且常稱為VM-26。替尼泊苷可作為單獨的藥劑或與其它化療劑組合，用於治療兒童急性白血病。骨髓抑制是替尼泊苷最常見的劑量限制性副作用。替尼泊苷可引起白血球減少症和血小板減少症。
抗代謝物抗贅瘤劑是時相特異性抗贅瘤劑，其作用於細胞週期的S期(DNA合成)，透過抑制DNA合成，或者通過抑制嘌呤或嘧啶鹼基合成進而限制DNA合成。因此，S期不能繼續，接著細胞死亡。抗代謝物抗贅瘤劑的實例包括但不限於氟尿嘧啶、胺甲喋呤、阿糖胞苷、巰嘌呤、硫鳥嘌呤以及吉西他濱。
5-氟尿嘧啶、5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮，商業上可以氟尿嘧啶購得。5-氟尿嘧啶的投與導致胸苷酸合成的抑制，並且還併入到RNA和DNA中。結果通常是細胞死亡。5-氟尿嘧啶可作為單獨的藥劑或與其它化療劑組合，用於治療乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌和胰臟癌。骨髓抑制和黏膜炎是5-氟尿嘧啶的劑量限制性副作用。其它的氟嘧啶類似物包括5-氟去氧尿嘧啶核苷(氟尿苷)和5-氟去氧尿核苷一磷酸。
阿糖胞苷，4-胺基-l-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2(1H)-嘧啶酮，商業上可以CYTOSAR-U®購得，並且常稱為Ara-C。咸信阿糖胞苷在S-期具有細胞時相專一性，其透過將阿糖胞苷末端併入到正在長成的DNA鏈中而抑制DNA鏈的延長。阿糖胞苷可作為單獨的藥劑或與其它化療劑組合，用於治療急性白血病。其它的胞苷類似物包括5-氮雜胞苷和2',2'-二氟去氧胞苷酸(吉西他濱)。阿糖胞苷引起白血球減少症、血小板減少症和黏膜炎。
巰嘌呤，1,7-二氫-6H-嘌呤-6-硫酮一水合物，商業上可以PURINETHOL®購得。巰嘌呤在S-期具有細胞時相專一性，其透過至今尚未清楚的機制抑制DNA合成。巰嘌呤可作為單獨的藥劑或與其它化療劑組合，用於治療急性白血病。骨髓抑制和胃腸黏膜炎是高劑量巰嘌呤的預期副作用。可使用的巰嘌呤類似物是硫唑嘌呤。
硫鳥嘌呤，2-胺基-1,7-二氫-6H-嘌呤-6-硫酮，商業上可以TABLOID®購得。硫鳥嘌呤在S-期具有細胞時相專一性，其透過至今尚未清楚的機制抑制DNA合成。硫鳥嘌呤可作為單獨的藥劑或與其它化療劑組合，用於治療急性白血病。骨髓抑制(包括白血球減少症、血小板減少症和貧血)是給與硫鳥嘌呤最常見的劑量限制性副作用。然而，還會發生胃腸副作用，而且該副作用可能是劑量限制性的。其它的嘌呤類似物包括噴司他丁、赤羥基壬基腺嘌呤、磷酸氟達拉濱和克拉屈濱。
吉西他濱，2'-去氧-2’,2'-二氟胞啶一鹽酸鹽(β-異構體)，商業上可以 GEMZAR®購得。吉西他濱透過阻斷細胞通過Gl/S邊界，在S-期展現細胞時相專一性。吉西他濱可與順鉑組合，用於治療局部的晚期非小細胞肺癌，也可以單獨地用於治療局部的晚期胰臟癌。骨髓抑制(包括白血球減少症、血小板減少症和貧血)是吉西他濱投藥最常見的劑量限制性副作用。
胺甲喋呤，N-[4[[(2,4-二胺基-6-喋啶基)甲基]甲基胺基]苯甲醯基]-L-麩胺酸，商業上可以胺甲喋呤鈉購得。胺甲喋呤在S-期具有細胞時相專一性，其透過抑制嘌呤核苷酸和胸苷酸所需的脫氫葉酸還原酶來抑制DNA的合成、修復和/或複製。胺甲喋呤可作為單獨的藥劑或與其它化療劑組合，用於治療絨毛膜癌、腦膜白血病、非霍奇金氏淋巴瘤，以及乳癌、頭癌、頸癌、卵巢癌和膀胱癌。骨髓抑制(白血球減少症、血小板減少症和貧血)及黏膜炎是胺甲喋呤投藥的預期副作用。
喜樹鹼，包括喜樹鹼和喜樹鹼衍生物，其可作為拓樸異構酶I抑制劑來使用或開發。咸信喜樹鹼細胞毒素活性與其拓樸異構酶I抑制活性相關。喜樹鹼的實例包括，但不限於伊立替康、托泊替康，及下述7-(4-甲基哌嗪基-亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20-喜樹鹼的各種光學形式。
伊立替康HC1，(4S)-4,11-二乙基-4-羥基-9-[(4-哌啶基哌啶基)羰基氧基]-1H-吡喃并[3',4',6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮鹽酸鹽，商業上可以可注射溶液購得。
伊立替康是喜樹鹼的衍生物，其與其活性代謝物SN-38一起結合至拓樸異構酶1-DNA錯合物。咸信由於雙股的斷裂不可修復，導致出現細胞毒性，所述斷裂是由拓樸異構酶1：DNA：伊立替康或SN-38三元錯合物與複製酶之間的相互作用引起的。伊立替康可用於治療結腸或直腸的轉移癌。伊立替康HCl的劑量限制性副作用是骨髓抑制，包括中性球減少症，以及包括腹瀉的GI效應。
托泊替康HC1，(S)-10-[(二甲基胺基)甲基]-4-乙基-4,9-二羥基-1H-吡喃 并[3’,4’,6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮一鹽酸鹽，商業上可以HYCAMTIN®可注射溶液購得。托泊替康是喜樹鹼的衍生物，其與拓樸異構酶1-DNA錯合物結合，並阻止單股斷裂的再連接，所述單股斷裂是拓樸異構酶I回應DNA分子的扭曲張力所引起的。托泊替康用於卵巢轉移癌和小細胞肺癌的第二線治療。托泊替康HCl的劑量限制性副作用是骨髓抑制，主要是中性球減少症。
利妥昔單抗是一種嵌合單株抗體，其以RITUXAN®和MABTHERA®販售。利妥昔單抗結合至B細胞上的CD20並引起細胞凋亡。利妥昔單抗是靜脈內投藥，並經核准用於類風濕性關節炎和B細胞非霍奇金氏淋巴瘤的治療。
歐發圖單抗(Ofatumumab)是完全人類單株抗體，其以ARZERRA®銷售。歐發圖單抗結合至B細胞上的CD20並用於治療氟達拉濱(Fludara)和阿侖單抗(Campath)治療難治的成人慢性淋巴細胞性白血病(CLL；一種白細胞癌)。
曲妥珠單抗(HEREPTIN®)是一種人類化單株抗體，結合至HER2受體。其原先用於HER2陽性乳癌。
西妥昔單抗(ERBITUX®)是一種嵌合小鼠人類抗體，其抑制上皮生長因子受體(EGFR)。
mTOR抑制劑包括但不限於雷帕黴素(FK506)及其衍生物(rapalog)、RADOO1或依維莫司(Afinitor)、CC1-779或西羅莫司、AP23573、AZD8055、WYE-354、WYE-600、WYE-687和Ppl21。
貝沙羅汀以Targretin®銷售，且是選擇性活化類視色素X受體(RXR)的類視色素亞類中的一員。這些類視色素受體的生物學作用不同於視黃酸受體(RAR)。化學名為4-[1-(5,6,7,8-四氫-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸。貝沙羅汀用於治療患者的皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL，一種皮膚癌)，該患者的疾病不能用至少一種其它藥物成功治療。
索拉非尼，以Nexavar®銷售，是一類稱為多激酶抑制劑的藥物。其化學名為4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]胺基甲醯基胺基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-甲醯胺。索拉非尼用於治療晚期腎細胞癌(一種始於腎臟的癌症)。索拉非尼也用於治療不可切除的肝細胞癌(一種不能透過外科手術治療的肝癌)。
ErbB抑制劑的實例包括拉帕替尼、厄洛替尼和吉非替尼。拉帕替尼，N-(3-氯-4-{[(3-氟苯基)甲基]氧基}苯基)-6-[5-({[2-(甲磺醯基)乙基]胺基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺(如式II所示，作為例示)，是erbB-1和erbB-2(EGFR和HER2)酪胺酸激酶的一種強效口服小分子雙重抑制劑，經核准聯合卡培他濱用於治療HER2陽性的轉移性乳癌。
Figure 105102393-A0202-12-0061-10
式(II)化合物的遊離鹼、鹽酸鹽和二甲苯磺酸鹽可依據1999年7月15日的W099/35146和2002年1月10日公開的W002/02552中所揭示的程序製備。
厄洛替尼，N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二{[2-(甲基氧基)乙基]氧基}-4-喹唑啉胺(以商品名Tarceva購得)，如下面所示的式III所示：
Figure 105102393-A0202-12-0061-11
厄洛替尼的游離鹼和鹽酸鹽可根據U.S.5,747,498實施例20製備。
吉非替尼，N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-4-嗎啉)丙氧基]4-喹唑啉胺，如下面所示的式IV所示
Figure 105102393-A0202-12-0062-12
吉非替尼，以商品名IRESSA®(Astra-Zenenca)購得，是一種erbB-1抑制劑，適用於鉑類和多西紫杉醇化療療法均失敗的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌的單一療法。吉非替尼的游離鹼、鹽酸鹽和雙鹽酸鹽可根據1996年4月23日提申的國際專利申請第PCT/GB96/00961號(且在1996年10月31日，公開號為W096/33980)的程序製備。
還有意義的是具有下面式A的喜樹鹼衍生物，其目前正在開發之中，包括外消旋混合物(R,S)形式，以及R和S對映異構體：
Figure 105102393-A0202-12-0062-14
 已知的化學名稱是「7-(4-甲基哌嗪基-亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(R,S)-喜樹鹼(外消旋混合物)或者「7-(4-甲基哌嗪基-亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(R)-喜樹鹼(R對映異構體)或者「7-(4-甲基哌嗪基-亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼(S對映異構體)。在美國專利第號所述化合物和相關的化合物包括其製備方法，在美國專利第6,063,923號；第5,342,947號；第5,559,235號；第5,491,237號與1997年11月24日提申的待審查美國專利申請案第08/977217號中說明所述此等化合物及相關化合物，包括製造方法。
激素和激素類似物是治療癌症有用的化合物，其中在激素與癌症的生長及/或缺乏生長之間存在關聯。可用於癌症治療的激素和激素類似物的實 例包括但不限於腎上腺皮質類固醇，諸如潑尼松和潑尼松龍，其可用於治療惡性淋巴瘤和兒童急性白血病；胺魯米特和其它芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑、來曲唑、伏羅唑，及依西美坦，其可用於治療腎上腺皮質癌和包含雌激素受體的激素依賴性乳癌；助孕素，諸如醋酸甲地孕酮，可用於治療激素依賴性乳癌和子宮內膜癌；雌激素、雄激素，及抗雄激素，諸如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、醋酸環丙孕酮和5α-還原酶，諸如非那雄胺和度他雄胺，可用於治療前列腺癌和良性前列腺肥大；抗雌激素，諸如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬，依度昔芬(iodoxyfene)，以及選擇性雌激素受體調節劑(SERMS)，如美國專利第5,681,835號、第5,877,219號與第6,207,716號中所述的那些，可用於治療激素依賴性乳癌及其它易感癌症；及促性腺激素釋放激素(GnRH)及其類似物，其刺激用於治療前列腺癌的黃體化激素(LH)及/或促卵泡激素(FSH)的釋放，例如LHRH促效劑和拮抗劑，諸如醋酸戈舍瑞林和亮丙瑞林。
信號轉導路徑抑制劑是阻斷或抑制引起細胞內變化的化學過程的抑制劑。這裡所述的變化是指細胞增生或分化。可用於本發明的信號轉導抑制劑包括受體酪胺酸激酶、非受體酪胺酸激酶、SH2/SH3域阻斷劑、絲胺酸/蘇胺酸激酶、磷脂醯肌醇-3激酶、肌醇信號傳遞和Ras致癌基因的抑制劑。
若干蛋白質酪胺酸激酶催化細胞生長的調節中所涉及的各種蛋白質中的特定酪胺醯基殘基的磷酸化。這種蛋白質酪胺酸激酶可以廣義地分為受體激酶或非受體激酶。
受體酪胺酸激酶是跨膜蛋白，其具有細胞外配體結合域、跨膜域和酪胺酸激酶域。受體酪胺酸激酶與細胞生長的調節有關，並且通常稱為生長因子受體。已經顯示，這些激酶中很多不適當和不受控活化，即異常的激酶生長因子受體活性，例如由過度表現或突變引起的上述活化，會導致細胞生長不受控制。因此，這種激酶的異常活性已經和惡性組織生長聯繫在 一起。因此，這種激酶的抑制劑可提供癌症治療方法。舉例來說，生長因子受體包括表皮生長因子受體(EGFr)、血小板來源的生長因子受體(PDGFr)、erbB2、erbB4、血管內皮生長因子受體(VEGFr)、具有類免疫球蛋白和表皮生長因子同源域的酪胺酸激酶(TIE-2)、胰島素生長因子-1(IGFI)受體、巨噬細胞集落刺激因子(Cfms)、BTK、ckit、cmet、纖維母細胞生長因子(FGF)受體、Trk受體(TrkA、TrkB和TrkC)、蝶素(eph)受體，及RET原癌基因。正在開發若干生長因子受體的抑制劑，且包括配體拮抗劑、抗體、酪胺酸激酶抑制劑和反義寡核苷酸。例如在Kath,John C.,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(6)：803-818；Shawver et al DDT Vol 2,No.2 February 1997；and Lofts,F.J.et al,“Growth factor receptors as targets”,New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy,ed.Workman,Paul and Kerr,David,CRC press 1994,London中描述生長因子受體以及抑制生長因子受體功能的藥劑。
酪胺酸激酶，不是生長因子受體激酶，稱為非受體酪胺酸激酶。可用於本發明作為抗癌藥物的目標或潛在目標之非受體酪胺酸激酶包括cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(黏著斑激酶)、布魯頓酪胺酸激酶，及Bcr-Abl。在Sinh,S.and Corey,S.J.,(1999)Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8(5)：465-80；and Bolen,J.B.,Brugge,J.S.,(1997)Annual review of Immunology.15：371-404中說明這些非受體激酶和抑制非受體酪胺酸激酶功能的藥物。
SH2/SH3域阻斷劑是破壞結合於各種酶或轉接蛋白(adaptor)中的SH2或SH3域的藥劑，所述酶或轉接蛋白包括PI3-K p85次單元、Src家族激酶、轉接蛋白(She、Crk、Nek、Grb2)，及Ras-GAP。在Smithgall,T.E.(1995),Journal of Pharmacological and Toxicological Methods.34(3)125-32中討論SH2/SH3域作為抗癌藥物目標。
絲胺酸/蘇胺酸激酶的抑制劑包括MAP激酶級聯阻斷劑(其包括Raf激酶(rafk)的阻斷劑)、促細胞分裂原或胞外調節激酶(MEK)，及胞外調節激酶(ERK)；及蛋白激酶C家族成員阻斷劑，包括PKC(a、β、γ、ε、μ、λ、
Figure 105102393-A0202-12-0065-117
、ζ)的阻斷劑、IkB激酶家族(IKKa、IKKb)、PKB家族激酶、AKT激酶家族成員，及TGFβ受體激酶。在Yamamoto,T.,Taya,S.,Kaibuchi,K.,(1999),Journal of Biochemistry.126(5)799-803；Brodt,P,Samani,A.,and Navab,R.(2000),Biochemical Pharmacology,60.1101-1107；Massague,J.,Weis-Garcia,F.(1996)Cancer Surveys.27：41-64；Philip,P.A.,and Harris,A.L.(1995),Cancer Treatment and Research.78：3-27，Lackey,K.et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,(10),2000,223-226；U.S.專利第6,268,391號；以及Martinez-Iacaci,L.,et al,Int.J.Cancer(2000),88(1),44-52中說明這些絲胺酸/蘇胺酸激酶及其抑制劑。
本發明中還可以使用磷脂醯肌醇-3激酶家族成員的抑制劑，包括PI3-激酶、ATM、DNA-PK和Ku的阻斷劑。在Abraham,R.T.(1996),Current Opinion in Immunology.8(3)412-8；Canman,C.E.,Lim,D.S.(1998),Oncogene 17(25)3301-3308；Jackson,S.P.(1997),International Journal of Biochemistry and Cell Biology.29(7)：935-8；以及Zhong,H.et al,Cancer res,(2000)60(6),1541-1545中討論這些激酶。
可用於本發明中的還有肌醇信號傳遞抑制劑，諸如磷脂酶C阻斷劑和肌醇類似物。在Powis,G.,and Kozikowski A.,(1994 New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed.,Paul Workman and David Kerr,CRC press 1994,London中說明此等信號抑制劑。
另一類信號轉導路徑抑制劑為Ras致癌基因的抑制劑。這類抑制劑包括法尼基轉移酶、香葉基-香葉基轉移酶和CAAX蛋白酶的抑制劑，以及反義寡核苷酸、核糖核酸酶與免疫療法。已經顯示，這些抑制劑會阻斷包含野 生型突變體ras的細胞中的ras活化，因而可充當抗增生劑。在Scharovsky,O.G.,Rozados,V.R.,Gervasoni,S.I.Matar,P.(2000),Journal of Biomedical Science.7(4292-8；Ashby,M.N.(1998),Current Opinion in Lipidology.9(2)99-102；and Bennett,C.F.and Cowsert,L.M.BioChim.Biophys.Acta,(1999)1489(1)：19-30中討論ras致癌基因抑制。
如上所述，受體激酶配體結合的抗體拮抗劑同樣可以充當信號轉導抑制劑。這類信號轉導途徑抑制劑包括將人類化抗體用於受體酪胺酸激酶的胞外配體結合域。例如，Imclone C225 EGFR特異性抗體(參見Green,M.C.et al,Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors,Cancer Treat.Rev.,(2000),26(4,269-286)；Herceptin® erbB2抗體(參見Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer：erbB Family Receptor Tyrosine Kniases,Breast cancer Res.,2000,2(3),176-183)；以及2CB VEGFR2特異性抗體(參見Brekken,R.A.et al,Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice,Cancer Res.(2000)60,5117-5124。
非受體激酶血管生成抑制劑也可用於本發明。與血管生成有關的VEGFR和TIE2抑制劑，已在上面關於信號轉導抑制劑中討論過(二者的受體均為受體酪胺酸激酶)。血管生成通常與erbB2/EGFR信號傳遞相關聯，因為已顯示erbB2和EGFR的抑制劑會抑制血管生成，主要是VEGF表現。因此，erbB2/EGFR抑制劑可與血管生成抑制劑組合。因此，非受體酪胺酸激酶抑制劑可與本發明EGFR/erbB2抑制劑組合使用。例如，抗-VEGF抗體不能識別VEGFR(受體酪胺酸激酶)，但卻與配體結合；整聯蛋白(αv、β3)的小分子抑制劑將抑制血管生成；也證實了內皮抑制素和血管抑制素(非-RTK)可與公開的erb家族抑制劑組合使用(參見Bruns CJ et al(2000),Cancer Res.,60：2926-2935；Schreiber AB,Winkler ME,and Derynck R.(1986),Science,232：1250-1253；Yen L et al.(2000),Oncogene 19：3460-3469)。
免疫治療方案中使用的藥劑也可與式(I)化合物組合使用。有大量的免疫策略用來產生對抗erbB2或EGFR的免疫反應。這些策略一般屬於腫瘤疫苗接種領域。透過用小分子抑制劑組合抑制erbB2/EGFR信號傳遞路徑，可以大大地增強免疫方法的效力。在Reilly RT et al.(2000),Cancer Res.60：3569-3576；以及Chen Y,HuD,Eling DJ,Robbins J,and Kipps TJ.(1998),Cancer Res.58：1965-1971中有抗erbB2/EGFR的免疫/腫瘤疫苗方法的討論。
用於促細胞凋亡方案的藥劑(例如bcl-2反義寡核苷酸)也可用於本發明的組合中。蛋白質Bcl-2家族的成員阻斷細胞凋亡。因此，bcl-2上調與藥物抗性相聯繫。研究顯示，表皮生長因子(EGF)刺激bcl-2家族的抗細胞凋亡成員(即mcl-1)。因此，設計下調bcl-2在腫瘤中的表現的策略現已證實在第II/III期中有益，即Genta’s G3139bcl-2反義寡核苷酸。在Water JS et al.(2000),J.Clin.Oncol.18：1812-1823；及Kitada S et al.(1994,Antisense Res.Dev.4：71-79中討論這些利用bcl-2的反義寡核苷酸策略的促細胞凋亡策略。
曲妥珠單抗(HEREPTIN®)是一種人類化單株抗體，結合至HER2受體。其原先用於HER2陽性乳癌。
曲妥珠單抗(商標名Kadcyla)是一種抗體-藥物結合物，由單株抗體曲妥珠(Herceptin)連接至細胞毒性劑美坦新(mertansine，DM1)所組成。單獨曲妥珠單抗會透過結合至HER2/neu受體來中止癌細胞生長，而美坦新進入細胞並透過結合至微管蛋白來摧毀細胞。因為單株抗體靶定HER2，且HER2只會在癌細胞中過度表現，因此結合物遞送對腫瘤細胞有專一性的毒素。結合物簡稱為T-DM1。
西妥昔單抗(ERBITUX®)是一種嵌合小鼠人類抗體，其抑制上皮生長因子受體(EGFR)。
帕妥珠單抗(又稱為2C4，商標名Omnitarg)是一種單株抗體。在一系列被稱為「HER二聚化抑制劑」的類別中的第一個。透過結合至HER2，其抑 制HER2與其他HER受體的二聚化，假設會造成腫瘤生長減緩。於2001年1月4日公開的WO01/00245中描述曲妥珠單抗。
利妥昔單抗是一種嵌合單株抗體，其以RITUXAN®和MABTHERA®販售。利妥昔單抗結合至B細胞上的CD20並引起細胞凋亡。利妥昔單抗是靜脈內投藥，並經核准用於類風濕性關節炎和B細胞非霍奇金氏淋巴瘤的治療。
歐發圖單抗是完全人類單株抗體，其以ARZERRA®銷售。歐發圖單抗結合至B細胞上的CD20並用於治療氟達拉濱(Fludara)和阿侖單抗(Campath)治療難治的成人慢性淋巴細胞性白血病(CLL；一種白細胞癌)。
細胞週期信號傳遞抑制劑會抑制細胞週期控制中所涉及的分子。稱作細胞週期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)的蛋白激酶家族，及其與稱作細胞週期蛋白的蛋白質家族的交互作用，透過真核細胞週期控制進展。對於正常通過細胞週期而言，不同細胞週期蛋白/CDK複合物的配位活化和不活化是必要的。若干細胞週期信號傳遞抑制劑正在開發中。例如，包括CDK2、CDK4和CDK6的細胞週期蛋白依賴性蛋白激酶的實例及其抑制劑描述於Rosania et al,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(2)：215-230。
如本文所用，「免疫調節劑」意指任一種影響免疫系統的物質，包括單株抗體。本發明ICOS結合蛋白可被認為是免疫調節劑。免疫調節劑可用作為抗贅瘤劑以供治療癌症。例如，免疫調節劑包括，但不限於抗-CTLA-4抗體，諸如易普利單抗(YERVOY)以及抗-PD-1抗體(Opdivo/納武單抗與Keytruda/派姆單抗)。其他免疫調節劑包括，但不限於OX-40抗體、PD-L1抗體、LAG3抗體、TIM-3抗體、41BB抗體以及GITR抗體。
Yervoy(易普利單抗)是一種由Bristol Myers Squibb販售的完全人類CTIA-4抗體。於美國專利第6,984,720號與第7,605,238號中描述易普利單抗的蛋白質結構及使用方法。
Opdivo/納武單抗是一種由Bristol Myers Squibb販售的完全人類單株抗體，具有免疫增強活性對抗負向免疫調節性人類細胞表面受體PD-1(程式化死亡-1或程式化細胞死亡-1/PCD-1)。透過配體PD-L1與PD-L2，納武單抗結合至PD-1並阻斷PD-1的活化，PD-1是一種Ig超家族穿膜蛋白，造成T細胞及細胞媒介的免疫反應活化來對抗腫瘤細胞或病原體。活化的PD-1透過壓抑P13k/Akt路徑活化來負向地調節T細胞活性以及效應功能。納武單抗的其他名稱包括：BMS-936558、MDX-1106，以及ONO-4538。在美國專利第8,008,449號中揭示納武單抗的胺基酸序列及使用與製造方法。
KEYTRUDA/派姆單抗是一種由Merck販售的抗-PD-1抗體，用於治療肺癌。在美國專利第8,168,757號中揭示派姆單抗的胺基酸序列及使用方法。
CD134，亦已知為OX40，是受體TNFR超家族的一個成員，其並非如同CD28般會組成性地表現於休止原生T細胞上。OX40是次要共刺激性分子，在活化24至72小時後表現；其配體OX40L也不在休止的抗原呈現細胞上表現，而是在其活化之後表現。OX40的表現有賴於T細胞的完全活化；在沒有CD28的情況下，OX40的表現延遲且位準低了四倍。在美國專利第US7,504,101號；第7,758,852號；第7,858,765號；第7,550,140號；第7,960,515號；WO2012027328；WO2013028231中揭示OX-40抗體、OX-40融合蛋白，及使用它們的方法。.
PD-L1(又稱為CD274或B7-H1)的抗體以及使用方法揭示於美國專利第7,943,743號；美國專利第8,383,796號；US20130034559、WO2014055897、美國專利第8,168,179號；以及美國專利第7,595,048號。PD-L1抗體正在開發中，作為用以治療癌症的免疫調節性藥劑。
如本文所用，「免疫刺激性藥劑」指的是任一種可以刺激免疫系統的藥劑。如本文所用，免疫刺激性藥劑包括但不限於疫苗佐劑。
胺基烷基葡萄胺糖苷磷酸(AGP)已知用作為免疫佐劑以及免疫刺激性 藥劑，用於刺激細胞激素生產、活化巨噬細胞、促進先天性免疫反應，並且在經免疫的動物體內放大抗體生產。烷基烷基葡萄胺糖苷磷酸(AGP)是類鐸受體4(TLR4)的合成配體。AGP及其經由TLR4的免疫調節效用揭示於專利公開案中，諸如WO 2006/016997、WO 2001/090129及/或美國專利第6,113,918號，且已在文獻中報導過。其他AGP衍生物揭示於美國專利第7,129,219號、美國專利第6,525,028號以及美國專利第6,911,434號。某些AGP充當TLR4的促效劑，而其他則經識別為TLR4拮抗劑。
本發明中所採用的胺基烷基葡萄胺糖苷磷酸化合物具有如下式1中所示的結構：
Figure 105102393-A0202-12-0070-15
其中m為0至6n為0至4；X為O或S，較佳為O；Y為O或NH；Z為O或H；各R1、R2、R3獨立地選自由C1-20醯基與C1-20烷基組成之群；R4為H或Me；R5獨立地選自由-H、-OH、-(C1-C4)烷氧基、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、 -SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8以及-CONR8R9組成之群，其中R8與R9各自獨立地選自H及(C1-C4)烷基；以及各R6及R7獨立地選自H或PO3H2。
在式1中，正常脂肪醯基殘基(亦即二級醯基氧基或烷氧基殘基，例如R1O、R2O及R3O)附接之3’立體源中心的構型為R或S，較佳為R(依據Cahn-Ingold-Prelog優先規律來標明)。R4與R5附接之糖苷配基立體源中心的構型可以是R或S。其所有立體異構體、對映異構體與非對映異構體，及混合物被認為落在本發明範疇內。
雜原子X與糖苷配基氮原子之間的碳原子數目是由變數「n」決定，其可以是0至4的整數，較佳為0至2的整數。
正常脂肪酸R1、R2與R3的鏈長可為約6至約12個碳，較佳約9至約14個碳。鏈長可以相同或不同。一些較佳具體例包括R1、R2與R3的鏈長為6或10或12或14。
式1含括L/D-絲胺醯基、-蘇胺醯基、-半胱胺醯基醚或酯脂質AGP，均為促效劑與拮抗劑，及其同系物(n=1-4)，還有各種羧酸生物同電子排列體(亦即R5為能夠形成鹽的酸性基團；磷酸根可以在葡萄糖胺單元的4-或6-位上，但較佳在4-位中)。
在本發明採用式1之AGP化合物的一個較佳具體例中，n為0，R5為O2H，R6為PO3H2，且R7為H。這個較佳AGP化合物為如下面式1a中的結構：
Figure 105102393-A0202-12-0072-16
其中X為O或S；Y為O或NH；Z為O或H；各R1、R2、R3獨立地選自由C1-20醯基與C1-20烷基組成之群；且R4為H或甲基。
在式1中，正常脂肪醯基殘基(亦即二級醯基氧基或烷氧基殘基，例如R1O、R2O及R3O)附接之3’立體源中心的構型為R或S，較佳為R(依據Cahn-Ingold-Prelog優先規律來標明)。R4與CO2H附接之糖苷配基立體源中心的構型可以是R或S。其所有立體異構體、對映異構體與非對映異構體，及混合物被認為落在本發明範疇內。
式1a含括L/D-絲胺醯基、-蘇胺醯基、-半胱胺醯基醚或酯脂質AGP，均為促效劑與拮抗劑。
在式1及式1a中，Z為被雙鍵或兩個各自附接一個單鍵之氫原子附接的O。也就是說，當Z=Y=O，該化合物為酯連接型；當Z=O且Y=NH為醯胺連接型；而當Z=H/H且Y=O為醚連接型。
式1的尤佳化合物稱為CRX-601與CRX-527。其結構如下所示：
Figure 105102393-A0202-12-0073-18
Figure 105102393-A0202-12-0073-19
此外，另一個較佳具體例採用具有所示結構的CRX 547。
CRX547
Figure 105102393-A0202-12-0074-20
又其他具體例包括AGP，諸如CRX 602或CRX 526，對具有較短二級醯基或烷基鏈的AGP提供增加的穩定性。
Figure 105102393-A0202-12-0074-22
Figure 105102393-A0202-12-0075-23
在一個具體例中，提供用於在有需要的哺乳動物體內治療癌症的方法，其包含向該哺乳動物投與治療有效量的下列：本發明之ICOS結合蛋白，以及b)至少一種抗贅瘤藥劑。
在一個具體例中，提供用於在有需要的哺乳動物體內治療癌症的方法，其包含向該哺乳動物投與治療有效量的下列：本發明之ICOS結合蛋白，以及b)至少一種第二免疫調節性藥劑。
在一個具體例中，該第二免疫調節性藥劑是選自由下列組成之群：抗-CTLA4抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-OX40抗體、抗-GITR抗體，與抗-41BB抗體、抗-LAG3抗體以及抗-TIM3抗體。
在一個具體例中，提供用於在有需要的哺乳動物體內治療癌症的方法，其包含向該哺乳動物投與治療有效量的下列：本發明之ICOS結合蛋白， 以及b)至少一種免疫刺激性藥劑。
在一個具體例中，免疫刺激性藥劑為TLR4促效劑。在一個具體例中，免疫刺激性藥劑為AGP。在一個態樣中，免疫刺激性藥劑為式I化合物。在一個態樣中，免疫刺激性藥劑為式1a化合物。在一個態樣中，免疫刺激性藥劑是選自由CRX-601、CRX-547、CRX-602、CRX-527以及CRX-526組成之群。
實例
下列實例說明本發明的各種非限制性態樣。
實例1：癌症中的ICOS表現
一般來說，實體腫瘤似乎具有低度的浸潤性ICOS+ T細胞，與ICOS會媒介抗腫瘤免疫反應的理論相符。使用公眾可取自The Cancer Genome Atlas(TCGA)的mRNA表現數據集以及其他數據庫產生橫跨不同腫瘤組織學的ICOS表現分析。表3顯示各個組織學之表現可偵測含量ICOS mRNA表現的腫瘤的相對百分率。這個分析鑑別出已知對其他癌症免疫療法具有敏感性的腫瘤組織學(黑色素瘤、RCC、NSCLC)，因為它們有相對較高的腫瘤百分率(>10%)，具有可偵測到的ICOS+腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，而已知免疫原性較差的腫瘤類型(前列腺癌、卵巢癌以及胰臟癌)有相對較低的腫瘤百分率，其具有ICOS+ TIL(<10%)(表3)。有趣的是，在顯示具有ICOS+ TIL百分率最高的腫瘤類型中，已經知道與病毒感染及/或慢性發炎有關的腫瘤類型(H&N、胃癌、食道癌與子宮頸癌)。從這些mRNA表現分析尚不清楚在每一種個別腫瘤類型中會表現ICOS的TIL亞群。在一些情況下，ICOS主要表現在腫瘤浸潤性Treg上，但在其他情況下ICOS可表示ICOS+ T細胞浸潤程度。
表3. 在不同腫瘤類型間的ICOS mRNA表現
Figure 105102393-A0202-12-0077-24
在原發性人類非小細胞肺癌(NSCLC)、三陰性乳癌(TNBC)、結腸直腸癌(CRC)、前列腺癌、胰臟癌、卵巢癌、腎細胞癌(RCC)與黑色素瘤中，透過免疫組織化學(IHC)進行ICOS表現分析，好能更為了解在不同腫瘤類型中，哪些TIL子集與ICOS表現有關(表4)。與在mRNA表現分析中所觀察到的相同，ICOS+ TIL的含量相對地低，即使是存在大量CD4+、CD8+及/或FoxP3+ TIL的個別腫瘤中。同樣地，黑色素瘤、腎細胞癌(RCC)及非小細胞肺癌(NSCLC)組織學具有最高腫瘤百分率，其中有一些程度的可測得ICOS+浸潤(表4，第2列)。相反地，前列腺、卵巢及胰臟腫瘤顯示幾乎沒有ICOS+ TIL(表4)。這些分析清楚顯示，實體腫瘤具有低的ICOS+ TIL基線位準且可能受惠於這個細胞群的擴增及功能性誘導。未來的研究使用流動式細胞測量術及雙色免疫組織化學來分析原發性人類腫瘤，有助於決定哪些特異性T細胞子集會表現ICOS。
表4
Figure 105102393-A0202-12-0078-25
實例2：篩選ICOS抗體促效劑 分離初代PBMC
由血液供體取得新鮮血液並且用無酚紅-10% RPMI1640培養基進行1：1稀釋。於Uni-Sep Max 50ml錐形管中將經稀釋血液層加至密度介質的頂部並且在室溫下以400xg不中斷離心20分鐘。透過100μM細胞濾器將所得白色單核層(膚色血球層)小心萃取至一個新的50mL錐形管中。將等體積無酚紅-10% RPMI1640培養基添加至膚色血球層並在室溫下以300xg離心10分鐘。將細胞丸粒再懸浮於10ml紅血球溶解溶液(Sigma Aldrich)中並在室溫下培育5分鐘。用培養基洗滌細胞一次且如前述進行離心。用無酚紅-10% RPMI1640培養基將體積補至40ml且使用Vicell細胞計數器與成活力分析儀 (Beckman Coulter)來計數細胞。
分離初代人類CD4+CD25- T效應細胞
經由兩步驟基於磁珠的分離程序，使用人類CD4+CD25+調節T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)，從PBMC進一步純化人類CD4+CD25細胞。首先，在4℃下將PBMC細胞與生物素抗體混合物一起培育歷時5分鐘且接著與抗-生物素微珠一起培育歷時10分鐘。這個步驟是要標記非CD4+ T細胞。之後於MidiMACS分離儀的磁場中使細胞通過LD管柱。收集本身是未標記並經預先增富的CD4+細胞溶離份的流出物並且在4℃下與CD25微珠一起培育歷時15分鐘。於MidiMACS分離儀的磁場中使經標記細胞通過MS管柱。收集含有未標計CD4-CD25- T效應細胞的溢流用於下游活化分析。
從血液分離初代人類CD4+ T細胞
使用人類CD4+ T細胞增富混合物(Stem Cell Technologies)直接從人類血液分離人類CD4+ T細胞。將RosetteSep人類CD4+ T細胞增富混合物(50μL/mL)添加至全血並充分混合。在室溫下培育20分鐘之後，添加等體積的PBS+ 2% PBS同時輕柔混合。將經稀釋樣品添加至密度介質的頂部並且在室溫下以1200xg不中斷離心20分鐘。將來自密度介質：血漿介面的增富細胞小心倒入一個新錐形管中。接著用紅血球溶解緩衝液(Sigma Aldrich)溶解紅血球，並且用PBS + 2% FBS洗滌經增富細胞兩次。將CD4+ T細胞再懸浮於40ml添加2% FBS的PBS中並且用Vi-Cell細胞計數器進行計數。
實驗程序 人類CD4+CD25- T效應細胞活體外活化分析-結合分析
將經非組織培養物處理的96孔平底盤塗覆100μl/孔的塗覆緩衝液(Biolegend)隔夜，塗覆緩衝液含有1μg/ml抗人類CD3抗體(eBioscience)以及各種測試抗體。次日，用含有10% FBS的RPMI-1640培養基洗滌經預先塗覆的盤三次。分離人類CD4+CD25- T效應細胞，並如所述用CFSE標記且接種 至盤上。在37℃下培育歷時2.5天後，收取細胞並藉由流動式細胞測量術分析增生及活化標記表現。也透過中尺度發現(MSD)收集細胞培養物上清液用於多重細胞激素測量。
CFSE增生分析
以最高1E7細胞/mL的最終濃度將待標記的細胞再懸浮於15ml錐形管的1ml預先溫熱PBS中。將一微升的2mM CFSE原液(Life Technologies)直接添加至細胞，然後立刻旋動以確保標記均勻。在室溫下培育歷時5分鐘之後，透過添加14ml的冰冷細胞培養基來淬滅染色。用冰冷培養基洗滌經標記細胞三次。計數細胞並在補充有100IU/ml IL-2(PeproTech)的RPMI1640 + 10% FBS中調整成1E6細胞/ml，且接種至經抗CD3與測試抗體塗覆的盤上。在T細胞活化之後，收取細胞並用PBS+0.5% BSA洗滌一次，然後進行多色染色步驟以供進行流動式細胞測量術分析。
多色流動式細胞測量術
收取經活化T細胞並用PBS洗滌。首先遵循販賣廠商的程序，用LIVE/DEAD可固定遠紅細胞成活力染色(Life Technologies)將細胞染色。在洗去染料之後，於4℃下將結合不同顏色的偵測抗體與細胞一起培育歷時30分鐘。用冰冷FACS染色緩衝液(PBS+0.5% BSA)洗滌經染色細胞一次，接著在FACS Canto或FACS Canto II流式細胞儀上進行測量。每天使用Cytometer Setup & Tracking珠粒(BD Biosciences)來檢驗細胞儀效能，且PMT電壓與區標定(area scaling)是基於未染色細胞來設定。使用OneComp或UltraComp珠粒(eBioscience)進行補償，這些珠粒用個別螢光染料結合的偵測抗體單獨染色。
MSD細胞激素分析
使用MSD人類V-Plex客製化套組來測定組織培養物上清液中的IFN-γ、IL-10、IL-2以及TNF-α細胞激素位準。首先在Diluent2中將樣品稀釋1：200。 遵循套組說明書，也在Diluent2中製備校正品。將經稀釋樣品與校正品加至黑色MSD盤，之後用黏著性盤密封帶將盤密封，且在室溫下培育同時振動歷時2小時。在添加25μL偵測抗體溶液(在Diluent2中新鮮製備)至各孔之後，重新密封盤並在室溫下培育同時振動歷時又再2小時。用150μL/孔的PBS加上0.05% Tween-20洗滌盤三次，然後添加150μl/孔剛稀釋好的2x讀取緩衝液並立刻在MESO QuickPlex讀取儀上讀取。使用MSD Workbench軟體分析數據。
人類CD4+ T細胞活體外活化分析-結合型及可溶型
在塗覆有抗CD3(1μg/ml)以及抗-CD28(3μg/ml)的24孔盤中預先刺激剛分離的人類CD4+ T細胞歷時48小時。收取細胞，洗滌並與抗-CD3 DynaBeads(Life Technologies)以1：1比率混合於補充有100IU/ml IL-2(PeproTech)的AIM-V培養基中。然後將細胞/珠粒混合物以100k/孔接種於96孔平底盤上，平底盤可以是未經塗覆(用於可溶型形式)或經H2L5 hIgG4PE塗覆(用於結合型形式)。關於可溶型形式，在細胞接種時將H2L5 hIgG4PE添加至孔。於37℃下培育歷時3.5天後，收集細胞培養物上清液用於按照MSD的多種細胞激素測量。
可溶型人類PBMC活體外活化分析
在塗覆有抗CD3(1μg/ml)以及抗-CD28(5μg/ml)的24孔盤中預先刺激剛分離的人類PBMC細胞歷時48小時。製備經CFSE染色的細胞，並與抗-CD3 DynaBeads(Life Technologies)以1：1比率混合於補充有100IU/ml IL-2(PeproTech)的AIM-V培養基中。然後將細胞/珠粒混合物以200k/孔接種於96孔盤上，該盤是經1μg/ml抗CD3抗體預先塗覆。H2L5 hIgG4PE以及對照抗體以其可溶型形式直接添加至孔中。於37℃下培育歷時3.5天後，收集細胞培養物上清液用於按照MSD的多種細胞激素測量，且收取細胞按照流動式細胞測量術用於增生與標記表現分析。
數據分析 流動式細胞測量術數據分析
藉由FlowJo軟體(FlowJo LLC)分析流動式細胞測量術數據。首先依據活/死細胞成活力染料染色將死細胞剔除在圈圍之外。在FSC-H：FSC-W散射圖上將雙重陽性剔除在圈圍之外。於不同T細胞亞群(諸如CD4+或CD8+細胞)中分析所得活單一細胞的活化標記表現，並報導為母群的百分率或中位螢光強度(MFI)。
CFSE增生分析
也藉由Flowjo分析CFSE數據。在排除死細胞與雙重陽性細胞之後，基於非活化T細胞拖曳「增生細胞」圈圍。在任一特定樣品中，將落在這個圈圍內的任何細胞計數為增生細胞。數據報導為增生的百分率。
依據FACS的細胞耗盡分析
藉由Flowjo分析細胞耗盡。首先，基於活/死細胞成活力染料染色來決定活細胞圈圍。然後如前述圈圍剔除雙重陽性。計算活CD4+或CD8+ T細胞亞群的百分率作為細胞耗盡指標。
抗體劑量反應曲線擬合分析
將劑量反應數據匯入GraphPad Prism軟體並轉換成log標度。使用各種斜率模型的促效劑劑量反應來對數據進行曲線擬合並且產生EC50值。下面列出擬合公式：Y=底部+(頂部-底部(1+10^((LogEC50-X)*希爾斜率))
結果 前導性鼠類抗人類ICOS抗體鑑定
針對人類與食蟹獼猴ICOS結合活性與促效劑活性篩選十四個鼠類mAb。十二個能夠重新選殖、定序、生長並純化至充分數量以供用於功能性研究。使用BIAcore測試所有的結合特徵。發現有兩個非常弱/非結合體。 依據功能性「促效作用」分析來測試十個經純化mAb。依據mAb在多個健康人類供體中誘導T細胞增生及IFN-γ細胞激素生產的能力，選出四個最佳促效劑mAb(在下表中命名為422.2、279.1、314.8以及88.2)，並且製造成為人類IgG1嵌合體。在PCT/EP2012/055735(WO 2012/131004)中顯示314.8、88.2、92.17、145.1，以及53.3連同其他ICOS mAb的CDR序列。
選殖株88.2的重鏈可變區在下面顯示為SEQ ID NO：13：QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQMFKDKATLTVDKSSNTAYMQLTSPTSEDSAVYYCTRWNLSYYFDNNYYLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：13)
選殖株88.2的輕鏈可變區在下面顯示為SEQ ID NO：14：QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLI GDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYNNHLVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：14)
Figure 105102393-A0202-12-0083-26
針對IFN-γ生產以及T細胞增生，使用以細胞為基礎的分析並且以劑量遞增設計相對於小鼠IgG1與EPR7114對照來測試最佳ICOS結合體中的八個。基於這些分析，選出命名為422.2的選殖株用於進行人類化。參見圖1與圖2。
實例3 抗體人類化 實驗程序 從mRNA回收抗體可變基因並且產生嵌合Fc野生型抗體
由422.2融合瘤細胞丸粒純化總RNA、自其逆轉錄生成cDNA，可變基因產物約400bp，透過PCR分離且透過瓊脂糖凝膠電泳純化。
經純化可變區片段被選殖到pTT5載體中並轉形至DH5α勝任細胞，該載體含有人類IgG1恆定區或人類κ恆定區。挑出群落並用來接種含有安比西林的L-肉湯。使用QuickLyse mini-prep套組從培養物分離質體DNA。對可變重鏈與輕鏈基因進行定序且透過資訊學比對序列數據，以便鑑定出可變重鏈與輕鏈基因序列。
選殖密碼子經最佳化的嵌合422.2抗體
將成熟鼠類可變區蛋白質序列逆轉譯成DNA，然後對密碼子進行最佳化。接著將VH與VL序列修飾成在各端含有偏好的5端非轉譯區以及偏好的選殖位點。使用以PCR為主的策略還有重疊寡核苷酸來重新建構經改造的VH序列，然後移植到存在於pTT載體中的人類IgG1 Fc野生型或Fc失能型hIgG1(L235A、G237A)或樞紐經穩定型hIgG4(S228P、L235E)(IgG4PE)上。使用以PCR為主的策略還有重疊寡核苷酸來重新建構經改造的VL序列，然後移植到存在於pTT5載體中的κ恆定區上。所得pTT質體用於HEK轉染，以製造嵌合抗體。
人類化422.2的可變域
透過搜尋適當的內部人類生殖系重鏈與輕鏈資料庫，利用經CDR遮蔽的422.2 V區，使用BLASTP選擇人類可變(V)基因模板用於人類化422.2。由前幾個BLASTP結果選出IGHV1-69以及IGKV3-11作為V基因骨架模板用於人類化422.2。選出IGHJ6以及IGKJ2人類生殖系接合(J)基因用於人類化422.2。
鑑定選定之人類生殖系基因與422.2序列之間的殘基差異，有助於挑選回復突變(將特定人類骨架殘基改成鼠類殘基的突變)。設計六個經人類化VH變異體以及六個經人類化VL變異體，將密碼子最佳化，然後修飾成包括偏好的5’與3’延伸。使用基於PCR的策略以及重疊寡核苷酸重新建構經改造 可變區序列，接著個別選殖至pTT載體中。
所得pTT質體用於HEK轉染中，以產生人類化抗體。對HEK2936E懸浮細胞進行計數，且使用補充有0.05%遺傳黴素(在一些實驗補充有1%普朗尼克F68)的Freestyle表現培養基293稀釋成1.5x106細胞/mL至2x106細胞/mL。將DNA與轉染試劑(Gemini或293-Fectin)添加至OptiMEM中並且在室溫下培育歷時20至30分鐘之前輕柔地進行均質。合併DNA-脂質複合體與細胞懸浮液且在37℃、5% CO2、125rpm下培育經轉染細胞。就一些轉染來說，在轉染之後24至48小時，添加胰化蛋白饋料(Freestyle表現培養基293，補充有1%普朗尼克與20% w/v酪蛋白胰化蛋白)至各個轉染物中。培育經轉染細胞懸浮液歷時5至8天，直到活細胞落至低於60%，然後進行離心(建構物依賴性)。收取上清液並過濾。
藉由使上清液通過1mL HiTrap Protein A HP管柱來純化抗體、透過用10mL PBS洗滌管柱並且用5mL IgG洗滌液(Pierce,21009)溶離，好能夠進行抗體捕捉。使用Millipore Centricon® Centrifugal Filter Units(30K截斷)將經純化蛋白進行緩衝交換至PBS中並在Nandrop分光光度計上進行量化。
結果 經建構的表現質體
成功回收融合瘤選殖株422.2的鼠類抗體可變基因序列，且序列在下面以及圖8中分別顯示為SEQ ID NO：19與20。
422 HC QVQLQQSGPELVRPGESVKISCMGSGYTFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGLISIYSDHTNYNQKFQGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCGRNNYGNYGWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO：19)
422 LC ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSITSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：20)
將回收的可變區選殖至選定pTT5載體中會產生編碼422.2之嵌合輕鏈序列以及hIgG1 Fc野生型、hIgG1 Fc失能型(L235A/G237A，EU編號)或hIgG4 PE(S228P/L235E，EU編號)之嵌合重鏈序列的質體。使用嵌合抗體來確認經選殖小鼠V區的功能性並且鑑定出最為適合的同型。
成功地進行建構編碼422.2之各種人類化變異體的重鏈與輕鏈的pTT哺乳動物表現質體。
表現、純化以及鑑定H2L5 hIgG4PE
H2L5 hIgG4PE的成熟蛋白質序列連同額外標記已納入圖9中。H2L5 hIgG4PE重鏈與輕鏈之編碼區的DNA序列已納入圖10與11中。
實例4：H2L5的功能分析 Fc受體結合
將經人類化抗體H2L5從人類IgG1同型修飾成經修飾人類IgG4同型，併入突變S228P、L235E(EU編號)以防止抗原結合片段(Fab)臂交換。選擇人類IgG4PE而非人類IgG1，是因為它會減少mAb結合以活化Fcγ受體與C1q，因而減少mAb誘發ICOS陽性細胞因為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)而導致耗盡的可能性。此外，人類IgG4PE(S228P、L235E)仍結合至FcγRIIb(抑制型Fcγ受體)。透過使抗體能夠交聯而與FcγRIIb交互作用，對於ICOS抗體的促效活性來說可能至為關鍵。與FcγRIIb交互作用已顯示對於其他免疫調節性抗體靶定TNF-α家族受體還有CD28的促效活性十分重要(Bartholomaeus P et al.,“Cell contact-dependent priming and Fc interaction with CD32+ immune cells contribute to the TGN1412-triggered cytokine response.”J.Immunol.,192(5)；2091-8(2014))。
進一步顯示，人類IgG4PE減少mAb結合，以活化Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIa與FcγRIIIa)與C1q，因而減少mAb誘發ICOS陽性細胞因為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)而導致耗盡的可能性。此外，人類IgG4PE(S228P、L235E)仍結合至FcγRIIb(抑制型Fcγ受體)(表6)。下面表6展示前驅H2L5作為hIgG1或hIG4PE抗體對於人類Fcγ受體的代表性結合親和力
表6：前驅人類化ICOS抗體作為hIgG1或hIG4PE抗體的代表性親和力
Figure 105102393-A0202-12-0087-27
NB=無結合
實驗程序 422.2人類化變異體的功能性評估
為了將四個候選ICOS促效抗體進行人類化，產生小鼠V區與人類IgG1 Fc部分之融合物的小鼠-人類嵌合體。在人類全PBMC活化分析中以盤結合型形式測試這四個嵌合體抗體。抗-ICOS嵌合體422.2在結合型PBMC活化分析爭顯示最好的促效活性。與結合數據以及生物物理特徵合併後，挑選422.2選殖株進行人類化。基於ICOS結合以及生物物理特徵選出四個人類化422.2變異體(422.2 H2L0、H2L5、H5L0以及H5L5)，並且在結合型人類PBMC活化分析中進行測試。相對於其他變異體，證實H2L5變異體與T細胞活化相當或更好，如透過細胞激素生產量測(圖3)。
H5變異體的重鏈(VH)可變區以及成熟重鏈在下面分別呈現為SEQ ID NO：15以及16。
H5 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWIGLISIYSDHTNYNQKFQGRATMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRNNYGNYGWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：15)
成熟H5重鏈
Figure 105102393-A0202-12-0087-28
Figure 105102393-A0202-12-0088-29
Figure 105102393-A0202-12-0088-30
(SEQ ID NO：16)
L0變異體的輕鏈(VL)可變區以及成熟輕鏈在下面分別呈現為SEQ ID NO：17以及18。
L0 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSGYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：17)
成熟L0輕鏈
Figure 105102393-A0202-12-0088-31
Figure 105102393-A0202-12-0088-32
(SEQ ID NO：18)
選擇IgG4[PE]作為同型
接著在各種全PBMC活化分析中以可溶型形式測試422 H2L5 IgG1。因為全PBMC分析在同一個孔內含有淋巴細胞、單核細胞以及其他免疫細胞，對於活體內條件來說，這個可溶型形式可能更為恰當。但是，422 H2L5 IgG1 mAb一樣顯示T細胞群的成活力降低，這讓人聯想到T細胞耗盡。在11個測試的健康供體中觀察到程度不等，且在CD4+ T細胞中比在CD8+ T細胞中更為明顯。相反地，422 H2L5抗體當以IgG4[PE]或Fc-失能型同型表現時，沒有顯示T細胞成活力明顯降低，暗示成活力降低可能是因為FcγR-媒介的抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)(圖4)。
H2L5 hIgG4PE在CD4+ T細胞活化分析中的劑量反應
為了量化H2L5 hIgG4PE的T細胞活化效用，首先藉由盤結合型抗CD3(1μg/ml)/抗-CD28(3μg/ml)預先刺激人類初代CD4+ T細胞歷時48小時，以誘發T效應細胞群表面上的ICOS受體位準，然後藉由以抗CD3 DynaBead以及H2L5 hIgG4PE再次刺激。在存在抗-CD3 DynaBead的情況下，藉由用連續濃度的結合型或可溶型H2L5 hIgG4PE處理經預先刺激的CD4+ T細胞，產生10點劑量反應曲線。結果顯示，結合型與可溶型H2L5 hIgG4PE會以劑量依賴性的方式在兩個個別健康人類供體中增加IFN-γ以及TNF-α細胞激素生產(圖5)。進行劑量反應曲線擬合分析以產生EC50值。有趣的是，當抗體是盤固定型時，H2L5 hIgG4PE處理使得細胞激素誘發有明顯更大的量級，與作為可溶型形式蛋白質被添加至T細胞培養物上清液相反。
H2L5 hIgG4PE在可溶型人類PBMC活化分析中的功能性測試
為了要測試H2L5 hIgG4PE在全人類PBMC離體培養物中的功能，使用盤結合型抗-CD3以及抗-CD28從健康人類供體製備PBMC歷時48小時，接著是在抗CD3 dynabead存在下(珠粒：細胞=1：1比率)進行可溶型H2L5 hIgG4PE處理歷時3.5天。測試細胞激素生產以及T細胞顆粒酶B表現作為T細胞功能的功能讀數。3名供體的結果歸納於圖6中，其提供證據暗示H2L5 hIgG4PE在健康人類供體的活化PBMC中會誘發增生、細胞激素生產以及細胞毒性潛力增加(圖6)。
對抗經預先刺激之人類PBMC的ICOS mAb活性
在PBMC預先刺激分析中評估H2L5 hIgG4PE的活性，其中透過盤結合型抗-CD3(選殖株OKT3，1μg/ml)以及抗CD28(選殖株CD28.2，3μg/ml)預先刺激PBMC歷時48小時。接著，為鑑定最佳化預先刺激條件，使用呈不同珠粒對細胞比率的人類CD3 Dynabead與CD3/CD28 Dynabead(ThermoFisher)來預先刺激PBMC。48小時預先培育之後，收取細胞並且在有或沒有可溶型ICOS mAb存在下用抗CD3 Dynabead(珠粒對細胞=1：1)重 新刺激之前以磁性移除珠粒。相較於同型對照，H2L5 hIgG4PE ICOS促效mAb在所有測試的預先刺激條件下會誘發IFNγ；但是，IFNγ生產量級與預先刺激的強度呈反向相關。
實例5-T細胞活化標記 方法
藉由用固定型H2L5 hIgG4PE在0.1μg/mL至100μg/mL的濃度範圍下處理健康人類PBMC，加上同時以0.6μg/mL的抗-CD3抗體處理，來評估功能性評估指標的濃度依賴性變化。透過流動式細胞測量術來評估T細胞表面活化標記CD69、OX40以及CD25的表現變化，並且認為是一種T細胞活化測量法。透過Ki67細胞核染色的變化來測量T細胞增生。在MSD平台上，於CD3接合存在的情況下評估各種Th1、Th2與Th17細胞激素對H2L5 hIgG4PE處理反應所做出的含量變化。選擇處理後24小時以及48小時時間點以確保取得早期細胞激素變化還有增生變化(在後期時間點明顯注意到)。
實驗準備 分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)
使用塗佈液體肝素鈉(Sagent 10IU/mL最終濃度)的注射器從健康供體收集全血，然後用磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)1：1稀釋。將經稀釋血液(35mL)層加至15mL Ficoll密度梯度介質(GE Healthcare)的頂部並且在室溫下以1200 x g不中斷離心20分鐘。將白色單核細胞層小心轉移至一個新的50ml管中。將等體積PBS添加至管並且在室溫下以400 x g離心5分鐘。用PBS洗滌PBMC一次並且如前述進行離心。將PBMC再懸浮於50mL AIM-V培養基中。使用Vi-Cell細胞計數器與成活力分析儀(Beckman Coulter)來計數細胞。
抗體塗布
在塗布緩衝液中將抗-人類CD3抗體稀釋至最終濃度0.6μg/mL。於4℃下將100μL經稀釋抗體塗覆在96孔平底盤中隔夜。次日，將10.1mg H2L5 hIgG4PE與7.9mg抗-RSV IgG4 PE同型對照抗體1：2連續稀釋於塗布緩衝液中，得到範圍在100至0.1μg/mL的最終抗體濃度。在室溫下將100μL經稀釋抗體塗布在經抗-CD3塗布的盤上歷時4小時。
實驗程序 人類PBMC活化分析
在人類PBMC活化分析中測試H2L5 hIgG4PE，其中同時發生經由抗-CD3抗體與TCR接合以及使用H2L5 hIgG4PE的ICOS共刺激，且在活化後24與48小時之時監測活化效用。使用四名不同供體的血液來重複這個實驗四次(n=4)。將AIM-V培養基中的兩百(200)μL PBMC(1x106細胞/mL)添加至經抗-CD3抗體塗布的孔中，而孔中有不同濃度的H2L5 hIgG4PE或IgG4同型對照。每個分析條件包括三個技術重複。在37℃以及5% CO2下培育PBMC歷時如上文指定的不同時間。在24與48小時時間點收集上清液，然後儲存於-80℃下以供用於在MSD平台上分析分泌的細胞激素。在24與48小時之時將細胞轉移至96深孔盤中並且用1mL FACS染色緩衝液(染有接合螢光染料的抗體或同型對照)洗滌兩次。
細胞表面染色
首先於4℃、暗處下用預先1：1000稀釋於PBS中的100μL可固定成活力染料eFluor 506將細胞染色歷時30分鐘。洗滌細胞然後用偵測抗體在冰上一起培育歷時30分鐘，使得細胞表面標記結合至不同螢光染料。用細胞表面抗體染色之後，用冰冷FACS染色緩衝液洗滌未被染上內化標記的樣品，然後在FACS Canto II流動式細胞測量術進行測量。
使用Cytometer Set-up以及Tracking珠粒每天適宜地評估細胞計數器性能。使用AbC抗小鼠Bead套組進行補償，而該套組個別用與每個螢光染料結合之偵測抗體染色。運行樣品並且使用上文提及之珠粒混合物查明經過適當補償設定之後取得的數據。
Foxp3以及Ki67的細胞內染色
在細胞表面染色之後，將細胞固定並通透化供用於進行細胞內標記染色。使用轉錄因子緩衝液組，藉由將固定/通透化緩衝液1：3稀釋於稀釋緩衝液中來製備固定/通透化緩衝液。藉由將5X Perm/Wash Buffer原液稀釋於去離子水中來製備Perm Wash Buffer。將一(1)mL的Fix/Perm Buffer添加至各個樣品，並且立即在震盪器上旋動盤。在暗處、4℃下培育盤歷時45分鐘。離心之後，添加1mL Fix/Perm Buffer，且混合盤並離心，總計洗滌兩次。使用標記抗體製備內化混合物。將100μL內化抗體添加至適當樣品，且在暗處、4℃下培育盤歷時30分鐘。用1mL Perm Wash Buffer洗滌樣品兩次，再懸浮於250μL流動緩衝液中並進行FACS Canto II流動式細胞測量術。
人類Special Order 9-重細胞激素分析
使用MSD Human Special 9-重套組測量細胞激素位準。將樣品及校正品稀釋於Diluent 43中。在0.250μL稀釋液中將樣品1：10稀釋用於9-重分析並1：200稀釋用於所述IFNγ分析，並添加至兩個校正品組的每一者中。旋動之後，在冰上培育校正品歷時至少5分鐘。兩百(200)μL的各個校正品組被添加至400μL稀釋液中，得到最高濃度的校正品，而1：4連續稀釋用於製備6個額外校正品稀釋。Diluent 43用作為盤背景。將50μL經稀釋樣品(三重複)以及校正品(二重複)添加至MSD盤。密封盤並在室溫下培育同時震動歷時2小時。用150μL之套組內的經稀釋MSD洗滌緩衝液洗滌盤3次。關於每個盤，藉由用Diluent 3將60μL的9個偵測抗體的每一者合併補足至3mL來製備偵測抗體溶液。在添加25μL偵測抗體溶液之後，密封盤並在室溫、暗處下培育同時震動歷時2小時。如上文洗滌盤。將150μL的2x讀取緩衝液添加至盤，且在QuickPlex上進行讀取。
人類IFNγ細胞激素分析
在Diluent 2中稀釋樣品以及校正品。將1mL稀釋液添加至校正品中。旋 動之後，在冰上培育校正品歷時5分鐘。這個是校正品1。使用1：4連續稀釋來製備6個額外校正品稀釋。Diluent 2用作為盤背景。五十(50)μL經稀釋樣品(三重複)及校正品(二重複)被添加至MSD盤。密封盤並在RT下培育同時震動歷時2小時。用150μL之套組內的經稀釋MSD洗滌緩衝液洗滌盤3次。關於每個盤，將60μL的每一個偵測抗體添加至稀釋劑中用於總計3mL的偵測試劑。在添加25μL偵測抗體之後，密封盤並在室溫、暗處下培育同時震動歷時2小時。洗滌盤3次。將讀取緩衝液添加至盤，且在QuickPlex上進行讀取。
細胞激素及流動式細胞測量術數據分析
使用MSD發現工作台軟體4.0版(中尺度)、Microsoft Excel與Graphpad Prism來分析MSD細胞激素分析的結果。藉由DIVA分析流動式細胞測量術數據，並在Graphpad Prism軟體中繪製數目。
抗體劑量反應曲線擬合分析
將劑量反應數據輸入Graphpad Prism軟體中並轉換成log量度。使用具有各種斜率模型的促效劑劑量反應來分析數據並產生EC50值。下面列出擬合公式：Y=底部+(頂部-底部)/(1+10^((LogEC50-X)*希爾斜率)
統計分析
在增生研究中，針對統計顯著性依據成對司徒頓t檢定分析H2L5 hIgG4PE與同型抗體對照值之間的差異。
結果 使用H2L5 hIgG4PE評估細胞激素變化
在抗-CD3存在的情況下，用固定型H2L5 hIgG4PE處理PBMC會以濃度依賴性的方式誘導Th1細胞激素、Th2細胞激素還有Th17細胞激素分泌達到不同程度，Th1細胞激素是諸如IFNγ、TNFα，Th2細胞激素是IL-6以及IL-10， 而Th17細胞激素是IL-17a。其他測量的細胞激素(諸如IL-4、IL-5以及IL-13)對H2L5 hIgG4PE刺激也顯示較低程度的濃度依賴性反應。四個個別供體的結果彙整於表7中。
依據流動式細胞測量術，H2L5 hIgG4PE活性對於T細胞活化之細胞表面標記的功能性評估
H2L5 hIgG4PE處理加上同時CD3刺激在未活化PBMC(n=4名供體)中會誘發T細胞活化標記明顯改變(表7與表8)。當與人類IgG4同型對照樣品比較時，在經H2L5 hIgG4PE處理的樣品中觀察到CD25與OX40陽性CD4及CD8 T細胞中有明確增加。CD69陽性CD4與CD8 T細胞的百分率在24小時及48小時時間點處以濃度依賴性的方式增加。
H2L5 hIgG4PE對T細胞增生之效用的特徵鑑定
固定型H2L5 hIgG4PE處理加上同時CD3活化在CD4與CD8 T細胞增生方面(n=6名供體)均造成以濃度依賴性的方式增加，如藉由細胞內Ki67染色所測量(表8)。H2L5 hIgG4PE也以濃度依賴性的方式增加CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞增生，但程度比總CD4與CD8 T細胞所觀察到的還低。只有在48小時時間點觀察到T細胞增生因為H2L5 hIgG4PE而增高。調節性T細胞的增生增加不明顯，而增生中CD4+細胞(濃度大於0.4μg/mL H2L5 hIgG4PE時，p<0.05)與CD8+ T細胞(濃度介於0.2與1.6μg/mL時，p<0.05)以濃度依賴性的方式明顯增加(參見表7)。
表7. 在人類PBMC活化分析中，H2L5 hIgG4PE的所有功能性評估指標的EC50值(μg/mL)。
Figure 105102393-A0202-12-0095-33
NA=無分析(因為曲線擬合不佳，EC50值不精準)。
NT=未測試。
Figure 105102393-A0202-12-0095-34
Figure 105102393-A0202-12-0096-35
討論
已經相當確定ICOS對於T細胞活化以及誘導Th1與Th2細胞激素至為重要。在這個研究中，使用T細胞活化以及細胞激素誘導的各種測量法來證明H2L5 hIgG4PE(抗-ICOS促效抗體)的活體外活性。在使用H2L5 hIgG4PE處理並且組合CD3刺激之後，所有測量的T細胞活化標記，CD25(IL-2受體α鏈)、CD69(早期活化標記)與OX-40(共刺激性標記)上調。在所監控的活化標記中，表現CD69與OX40的T細胞百分率因為H2L5 hIgG4PE處理而強烈增加。CD69是一個早期活化標記且因而在24小時樣品中的影響明顯。CD25是另一個重要的T細胞活化標記，在使用H2L5 hIgG4PE處理之後於兩個時間點均增加，暗示H2L5 hIgG4PE在維持T細胞活化方面扮演重要的角色。Ki67是與細胞增生有關的核蛋白。使用Ki67細胞內染色的流動式細胞測量術數據指出，固定型H2L5 hIgG4PE在TCR接合的情況下會明顯提高CD4與CD8 T細胞增生。儘管調節型T細胞的增生也會因為H2L5 hIgG4PE而增加， 但改變在統計上不顯著。
人類Th17細胞在調節抗腫瘤免疫性方面是一個關鍵角色[Nunez,S.,et al.,T helper type 17 cells contribute to anti-tumour immunity and promote the recruitment of T helper type 1 cells to the tumour.Immunology 2013；139：61-71]。研究顯示，ICOS參與人類Th17發育與功能[Kimura,A.,et al.,Regulator of Treg/Th17 balance.Eur.J.Immunol.2010；40：1830-1835；Paulos CM et al.The inducible costimulator(ICOS)is critical for the development of human Th17 cells.Sci Transl Med.(2010)2(55)；55ra78；Nelson,M.H.,et al.The inducible costimulator augments Tc17 cell responses to self and tumor tissue.J Immunol,2015；194：1737-1747]。在目前H2L5 hIgG4PE的功能性評估中，於抗-CD3以及H2L5 hIgG4PE刺激之後，在細胞培養物上清液中測得與發炎性以及免疫反應有關的大多數細胞激素。H2L5 hIgG4PE在人類PBMC中強烈誘發Th1細胞激素(IFN-γ與TNF-α)以及Th17細胞激素(IL-17a)分泌，暗示H2L5 hIgG4PE在抗腫瘤反應中扮演重要角色的可能性。IL-6還有TGF-β是從原生T細胞誘導Th17細胞發育的重要細胞激素。相反地，IL-6透過TGF-β抑制Treg分化[Kimura,A.,2010；Korn,T.,et al.,IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells.PNAS,2008；105：18460-18465]。在此研究中，發現H2L5 hIgG4PE會增加IL-6分泌，而IL-6會進一步提高Th17細胞發育。T細胞受體(諸如CD28與TNF受體家族成員)的促效抗體已顯示會產生鐘型劑量反應曲線[White,A.L.,et al.,Conformation of the Human Immunoglobulin G2 Hinge Imparts Superagonistic Properties to Immunostimulatory Anticancer Antibodies.Cancer Cell,2015,27：138-148；Luhder,F.,et al,Topological Requirements and Signaling Properties of T Cell-activating,Anti-CD28 Antibody Superagonists.J.Exp.Med.2003：955-966；Stebbings,R.,et al., “Cytokine Storm”in the Phase I Trial of Monoclonal Antibody TGN1412：Better Understanding the Causes to Improve PreClinical Testing of Immunotherapeutics J.Immunol.,2007,179：3325-3331；Rogers PR and Croft M,CD28,Ox-40,LFA-1,and CD4 Modulation of Th1/Th2 Differentiation Is Directly Dependent on the Dose of Antigen.J Immunol 2000 164：2955-2963；doi：10.4049/jimmunol.164.6.2955]。H2L5 hIgG4PE也證明有類似的雙曲線函數反應曲線。這個資訊在查明要用來最佳化藥效學反應的最佳抗體劑量範圍是重要的分量。
總結來說，H2L5 hIgG4PE與CD3刺激顯示會提高T細胞活化、增生與促發炎性細胞激素誘導，這與H2L5 hIgG4PE作為T細胞共刺激性受體之強力活化劑一致。
實例6：抗-ICOS抗體的結合
人類化程序(實例3)生成36個重鏈與輕鏈變異，針對人類以及食蟹獼猴ICOS的結合來進行篩選，同時也確認它們不會結合至人類CD28或CTLA-4。H2L5變異體鑑定為對人類與食蟹獼猴ICOS具有高親和力(分別為1.34與0.95nM)，且含有最少數目的回復突變。
由於H2L5 hIgG4PE對人類ICOS具有1.3nM的親和力，因而將422 H2L5的同型從IgG1改成IgG4PE並不會影響抗體的抗原結合。因為H2L5 hIgG4PE造成ICOS/ICOS-L結合的抑制顯示圖7中。
實驗程序 H2L5 hIgG4PE對人類ICOS的結合
使用BIAcore T200A抗-人類IgG在盎-ICOS H2L5 hIgG4PE捕獲於表面上之CM5晶片的Fc2來測定人類化H2L5 hIgG4PE抗體的結合動力學親和力。抗人類IgG表面用0.1mg/mL hIgG1對照予以阻斷，以便預防非特異性結合兔Fc。人類與食蟹獼猴ICOS(兔Fc)以256nM、64nM、16nM、4nM以及 1nM通過經捕獲表面。單獨緩衝液用作為雙重參考結合曲線。MgCl2用來刷新表面。在25℃下進行實驗。使用T200評估軟體將數據擬合至1：1模型。
抗體濃度：2.5μg/mL 結果 H2L5 hIgG4PE對人類與食蟹獼猴ICOS的結合
使用BIAcore T200測定人類化H2L5 hIgG4PE抗體的結合動力學親和力。
使用T200數據分析軟體將ICOS結合數據擬合至1：1動力學模型。
H2L5 hIgG4PE對人類ICOS的結合親和力是1.34nM，而對食蟹獼猴ICOS是0.95nM(參見表9)。這些數值相當，且一如預期顯示分子的Fc區改變不會影響對ICOS抗原的結合。
Figure 105102393-A0202-12-0099-37
討論
如實例1中所示，鼠類選殖株422-2經鑑別為前驅抗人類ICOS鼠類抗體。這個抗體的人類化產生36個重鏈與輕鏈變異體，針對人類與食蟹獼猴ICOS的結合來進行篩選，同時確保它們不會結合至人類CD28或CTLA-4。H2L5變異體鑑定為對人類與食蟹獼猴ICOS具有高親和力(分別為1.34與0.95nM)，且含有最少數目的回復突變。
將同型從IgG1改成IgG4PE並不會影響抗體對ICOS的結合。
實例7：H2L5 hIgG4PE對經活化人類T細胞的結合 方法 實驗準備 CD3陰性分離：
藉由幹細胞Rosette Sep人類T細胞增富套組以陰性的方式分離CD3+ T細胞幹細胞Rosette Sep人類T細胞增富：用塗覆液體肝素鈉(Sagent 10IU/mL最終濃度)的注射器收集100mL新鮮全血。將每一個收集管的血液合併至一個試管中，其中每ml血液添加50μL的Rosette Sep人類T細胞增富混合物(5mL/100mL供體血液)。在室溫(RT)培育下全血/Rosette Sep抗體混合物歷時20分鐘。接著用1x磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)+2% FBS(胎牛血清)對全血/Rosette Sep抗體混合物進行1：1稀釋。用FBS將最終體積補至200mL。接下來，將25mL的經稀釋血液/抗體混合物層加至Sepmate管中的15mL Ficoll梯度上(每個供體總計8個管)。然後在1200 x g、RT下將經加載的Sepmate管以中斷的方式進行離心歷時20分鐘。用抽吸管將血漿頂層下至周邊血液單核細胞(PBMC)介面取出並丟棄。其餘血漿與膚色血球層介面從Sepmate管傾析至50mL錐形離心管(總計4個管)中。將管用PBS+2% FBS補至50mL。在400 x g、RT下離心細胞歷時10分鐘。丟棄上清液。然後將每個供體的丸粒合併至單一個50mL錐形管、將丸粒再懸浮於總體積為50mL的PBS+2% FBS中。在400 x g、室溫下離心歷時5分鐘。丟棄上清液並且將細胞丸粒再懸浮2mL的RPMI完全培養基(RPMI 1640 + 10% FCS + 1mM丙酮酸鈉+ 2mM L-麩醯胺酸+青黴素100U/mL +鏈黴素100μg/mL)中。在ViCell儀器上計數回收的CD3細胞並進一步稀釋至1.2x106細胞/mL。針對CD3 PE-Cy7將1x106的回收細胞染色，以確認T細胞分離的品質。藉由Invitrogen未接觸T細胞分離套組以陰性的方式分離CD3+ T細胞 PBMC分離：簡言之，用塗覆液體肝素鈉(Sagent 10IU/mL最終濃度)的注射器自各個供體收集100mL新鮮的全血。將血液用具有2%FBS的PBS稀釋(1：1)至最終體積為200mL。將二十五(25)mL的經稀釋血液層加至Sepmate管中的15mL Ficoll梯度上(每個供體總計8個管)。然後在1200 x g、RT下將經加載的Sepmate管以中斷的方式進行離心歷時20分鐘。用抽吸管將血漿頂層下至PBMC介面取出並丟棄。其餘血漿與膚色血球層介面從Sepmate管傾析至50mL錐形離心管(總計4個管)中。將管用PBS+2% FBS補至50mL。在400 x g、RT下離心細胞歷時10分鐘。丟棄上清液。然後將每個供體的丸粒合併至單一個50mL錐形管、將丸粒再懸浮於總體積為50mL的PBS+2% FBS中。在400 x g、RT下離心細胞歷時5分鐘。丟棄上清液並且將細胞丸粒再懸浮於任意體積的分離緩衝液(取決於細胞丸粒的大小)(由Invitrogen未接觸T細胞套組提供)。然後在ViCell儀器上計數回收的PBMC並在分離緩衝液中稀釋至1x108細胞/mL。Invitrogen Dynabead未接觸人類T細胞分離：將2x108經分離PBMC(2mL)、400μl FBS然後Invitrogen未接觸T細胞套組的400μl抗體混合物添加至每一個15mL管中並在4℃下培育歷時20分鐘。用10mL的分離緩衝液洗滌細胞並且在350 x g、4℃下離心歷時8分鐘。丟棄上清液並且將丸粒再懸浮於2mL的分離緩衝液中。接著，將2mL經預先洗滌的耗盡Dynabead添加至各管。在室溫下將細胞與珠粒培育歷時15分鐘同時輕柔傾斜與旋轉。在珠粒培育之後，添加10mL的分離緩衝液並且上下抽吸細胞/珠粒懸浮液10分鐘。於室溫下將管放在磁鐵中歷時2分鐘。在不擾亂磁化珠粒的情況下，收集含有未接觸T細胞的上清液。用10mL分離緩衝液洗滌珠粒1次並於室溫下再次放置在磁鐵中歷時2分鐘，且收集清除珠粒的緩衝液。在室溫下以400 x g離心收集的細胞歷時5分鐘。丟棄上清液，並且將細胞丸粒再懸浮於任意體積的RPMI完全培養基(2至35mL)(取決於細胞珠粒大小)。然後在ViCell上計數回 收的CD3+細胞並進一步在RPMI完全培養基中達到1.2x106細胞/mL的濃度。CD3確認染色：於4℃、暗處下用5μl抗-CD3 PE-Cy7或5μl IgG1 Pe-Cy7同型將1x106經回收細胞染色歷時40分鐘，然後在含有0.1% Tween的冰冷PBS中洗滌細胞兩次、在400 x g、4℃下離心歷時5分鐘。經染色細胞再懸浮於1%甲醛中並且在4℃、暗處下培育歷時20分鐘。然後在含有0.1% Tween20的冰冷PBS中洗滌細胞兩次、在400 x g、4℃下離心歷時5分鐘，並且再懸浮於275μl含有0.1% Tween20的冰冷PBS中。經固定細胞儲存在4℃、暗處中直到進行流動式細胞測量術來確認T細胞分離品質。
活化經分離人類T細胞：
在37℃下，將T75燒瓶塗覆4mL於PBS中的1μg/ml CD3/CD28歷時2小時。用12mL的PBS洗滌燒瓶兩次。每個T75燒瓶添加於25mL RPMI完全培養基中的30x106細胞。在37℃、5% CO2下培育細胞歷時48小時以容許發生活化。
抗-ICOS(H2L5 hIgG4PE)的結合：
在原生以及經活化CD3+ T細胞中評估H2L5 hIgG4PE的結合。採用8個從0.00128至100μg/mL H2L5 hIgG4PE的滴定點加上5倍稀釋。
將原生及/或經活化CD3+ T細胞再懸浮於具有0.1% BSA的PBS(FACS緩衝液)中，其含有2x106細胞/mL的人類FcR阻斷溶液(5μl FcR阻斷溶液+ 950μl FACS緩衝液/1mL)。在2x105細胞/孔的濃度下，將100μl細胞置放在2mL 96孔分析板並且在室溫下培育歷時15分鐘。在培育期間。以2x濃度製備結合抗體抗-ICOS(H2L5 hIgG4PE)或IgG4同型對照抗體的滴定。在FcR阻斷的培育之後，將每孔100μl的2x濃縮結合抗體添加至每孔100μl的Fc阻斷T細胞，以達到最終1x濃度的抗-ICOS(H2L5 hIgG4PE)或IgG4同型對照抗體(從從0.00128至100μg/mL最終濃度)。在室溫下培育細胞與抗體歷時20分鐘。在結合培育之後，在1mL FACS緩衝液中洗滌細胞兩次、在400 x g、室溫下離心歷時5分鐘。
原生或經活化T細胞在抗-ICOS(H2L5 hIgG4PE)結合之後的染色： 將細胞染色用於使用下列混合物的流動式細胞測量術： 染色混合物：
Figure 105102393-A0202-12-0103-39
同型混合物：
Figure 105102393-A0202-12-0103-40
 在與H2L5 hIgG4PE或對照抗體的結合培育之後，將原生或經活化Fc阻斷T細胞再懸浮於80μl FACS緩衝液中，每孔添加20μl染色混合物或同型混合物。在室溫、暗處下將細胞染色歷時20分鐘。在染色培育之後，於1mL FACS緩衝液中洗滌細胞兩次、在400 x g、室溫下離心歷時5分鐘。
經染色細胞的固定：
將細胞再懸浮於500μl的1%甲醛(10mL的16x濃縮甲醛+ 150mL的1x PBS)中，並在室溫下培育歷時20分鐘。然後用1mL FACS緩衝液洗滌細胞兩次、在400 x g、室溫下離心歷時5分鐘。接著將丸粒再懸浮於265μl的FACS緩衝液中，並轉移至96孔圓底盤。將細胞儲存在在4℃、暗處下直到藉由流動式細胞測量術進行分析。
流動式細胞測量術：
在FACS Fortessa X20或FACS Canto II上使用FACSDiva軟體(Version 8.0)進行流動式細胞測量術。在擷取時間之時使用單一經染色eBioscience Ultracomp珠粒與FACSDiva中的補償軟體進行補償。
數據分析
在BD FACS儀器、LSR Fortessa X-20或FACS Canto II上使用BD Diva(ver.8.0)軟體進行數據擷取以及補償。數據分析採用Flow Jo軟體(ver.10.0.8r1)。結果報導為MFI(中位螢光強度)與從總活細胞或適當母群染出為IgGκ輕鏈FITC陽性細胞的百分率。使用Graphpad Prism 5軟體(ver.5.04)決定EC50，其中經轉換數據的非線性回歸(X=(log(X))使用了具有4個參數的可變斜率(log(促效劑)vs.反應-可變斜率)。
結果
使用Rosette Sep CD3增富套組或Dynabead未接觸T細胞分離套組，藉由使用抗-CD3 PeCy7染色，而從新鮮的人類全血分離T細胞。供體的陽性CD3細胞範圍介於68%與97%之間。當針對抗-人類IgG1 κ輕鏈FITC染色進行評估時，抗-CD3/抗-CD28活化CD4+與CD8+細胞群產生H2L5 hIgG4PE濃度依賴性曲線。H2L5 hIgG4PE結合曲線呈現為抗-人類IgG1 κ輕鏈FITC陽性與FITC中位螢光強度(MFI)的百分率。當針對抗-人類IgG1 κ輕鏈FITC染色進行評估時，T細胞與IgG4同型對照抗體一起培育不會產生濃度依賴性曲線。原生CD4+或CD8+細胞不會產生完整曲線；但是從0.1μg/mL增加至100μg/mL觀察到以濃度依賴性的方式增加。
CD4+ FITC MFI的中位(範圍)EC50值為1.04μg/mL(0.628-1.31μg/mL)，而CD8+FITC MFI為0.652μg/mL(0.27-0.74μg/mL)。CD4+百分率IgG κ輕鏈FITC陽性的中位(範圍)EC50值為0.834μg/mL(0.45-0.965μg/mL)，而CD8+百分率IgG κ輕鏈FITC陽性為0.583μg/mL(0.371-1.23μg/mL)(表10)。
表10：422 H2L5 hIgG4PE對活化人類T細胞之結合EC50值的歸納
Figure 105102393-A0202-12-0105-38
討論
這個研究證明，H2L5 hIgG4PE(抗-ICOS促效抗體)結合至來自健康人類供體之活化T細胞上的ICOS受體。使用針對經FITC標記之IgG κ輕鏈的抗體來偵測H2L5 hIgG4PE對T細胞表面的結合。
透過流動式細胞測量術，使用CD3 Pe-Cy3染色成功進行CD3+ T細胞的分離。十位供體中有九位在分離之後的CD3+ T細胞超過89%。但是，供體# 2100M39在分離後僅有68.6% CD3+。在供體#2100M39中純度降低的原因未知。由供體#2100M39圈選之CD4+與CD8+群產生的EC50值似乎沒有異常且被納入概括中位值。
在以陰性的方式分離的人類T細胞中針對H2L5 hIgG4PE決定結合EC50。當經分離T細胞因為暴露於1μg/mL盤結合型CD3/CD28抗體48小時，產生結合曲線。考慮將來自CD4+與CD8+活化T細胞的IgG κ輕鏈FITC陽性細胞百分率與FITC MFI數據進行統計分析。當計算成FITC陽性細胞百分率或FITC MFI值時，中位CD4+ EC50值相似，分別是1.04與0.834μg/mL。當計算成FITC陽性細胞百分率或FITC MFI時，中位CD8+ EC50值也相似，分 別是0.652與0.583μg/mL。
T細胞與IgG4 PE同型對照一起培育不會在抗人類IgG κ輕鏈FITC結合時以濃度依賴性的方式增加，不管用的分析方法是MFI或陽性細胞百分率。
在測試的0.00128至100μg/mL H2L5 hIgG4PE範圍內，無法由原生或未活化，以陰性方式分離的T細胞獲得完全曲線。但是，從0.1至100μg/mL H2L5 hIgG4PE在供體中觀察到結合是以濃度依賴性的方式增加。無法計算出EC50，因為原生T細胞的曲線不完整。H2L5 hIgG4PE在低濃度下不能結合至原生或未活化細胞，預期是因為ICOS僅會在休止Th17、T濾泡性輔助(TFH)與調節性T(Treg)細胞上微弱地表現。TCR接合以及活化是誘發ICOS表現所必須。因此，在原生或未活化細胞上表現的ICOS受體可能非常少，且因此H2L5 hIgG4PE結合最低。
實例8：食蟹獼猴劑量範圍搜尋(Dose-Range Finding，DRF)研究的TK/PD結果
為了要評估H2L5 hIgG4PE在目標相關物種體內的活體內特徵，在食蟹獼猴體內進行一個劑量範圍搜尋研究。除了媒劑對照組以外，研究測試3個劑量位準(0.3、3與30mg/kg)。在第一個劑量之後14天投與第二個劑量來進行重複給藥。每組測試一隻雄性以及一隻雌性。在3個不同的測試劑量中，H2L5 hIgG4PE於Cmax(μg/mL)以及AUC(μg.h/mL)方面表現劑量依賴性增加。在所有三個劑量位準下，在第一個劑量之後偵測血漿中的抗體歷時兩週(圖12A)。在第一個劑量之後，於猴子中的3隻體內偵測到抗-H2L5 hIgG4PE抗體，均為給予0.3mg/kg d的動物還有給予3mg/kg的雌性。於投與第二個劑量之後，在這些動物體內的抗-H2L5 hIgG4PE抗體與血漿濃度降低有關連(圖12B)。第二個劑量之後四十八小時，犧牲所有動物以收集組織用於分析藥效學活性以及組織病理學分析。
在來自所有研究動物的脾臟以及腋窩淋巴結的CD4+ T細胞中，測量 H2L5 hIgG4PE受體佔用率(RO)。觀察到在這兩種組織中，所有測試劑量位準的H2L5 hIgG4PE結合以劑量依賴性的方式增加(圖13)。
也在研究猴子的周邊血液的CD4+ T細胞上測量受體佔用率。在5個時間點抽血(第1天(給藥前)、第3天、第8天、第15天(第二次給藥前)以及第17天)。在這個分析中使用兩種不同測量法來決定RO。第一個是「游離受體」分析形式，在有或沒有H2L5 hIgG4PE存在下，測定用於流動式細胞測量術偵測的抗-ICOS mAb結合，而H2L5 hIgG4PE顯示會競爭ICOS結合。因此，依據FACS，抗-ICOS訊號不存在是H2L5 hIgG4PE佔據受體的代用品，而相反地，抗-ICOS陽性表示「游離受體」，其不被H2L5 hIgG4PE所結合。圖14-A顯示無ICOS受體以劑量依賴性還有時間依賴性的方式降低。兩隻猴子(250與300)顯示出無法解釋的「游離受體」訊號，且可能是因為在這些猴子體內產生了抗-H2L5 hIgG4PE抗體。此外，也在周邊血液CD4+細胞中藉由上述在脾臟與淋巴結中使用的相同分析來測定RO。一如預期，依據這個讀數，0mg/kg劑量顯示無RO(圖14-B)。有趣的是，在整個處理時間時序中，3.0與30mg/kg劑量位準下的若干猴子顯示時間依賴性增加H2L5 hIgG4PE結合型CD4+細胞數。具體而言，動物350在第3天與第17天之間表現藥物結合型循環CD4+細胞增加(>5倍)(圖14-B)。CD4+ICOS+細胞數增加很可能是因為H2L5 hIgG4PE誘導這個群體增生。
實例9：H2L5 hIgG4PE對結合產生反應而誘導細胞內訊號傳遞改變 實驗準備 細胞株
Ba/F3-ICOS細胞是得自INSERM(巴黎，法國)。於37℃下在5% CO2的濕化培養箱中，將細胞培養在補充有10%胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10ng/mL重組型鼠類IL-3(R&D Systems,Minneapolis,MN)，以及1mg/mL遺傳黴素(ThermoFisher,Waltham,MA)的適當培養基中。
實驗程序 細胞內訊號傳遞抗體陣列
依據製造商的說明書，使用PathScan®細胞內訊號傳遞陣列分析套組(Cell Signaling Technologies)來分析蛋白質溶解產物。簡言之，用IgG4-PE(20μg/mL)或H2L5 hIgG4PE(0.2、2，或20μg/mL)處理歷時1、6、24與48小時的Ba/F3-ICOS細胞溶解產物在陣列稀釋緩衝液中被稀釋成1μg/μL，且在℃ 4下於抗體陣列上培育隔夜。使用Odyssey成像軟體(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)捕捉陣列的影像。
磷酸-AKT酶連結免疫吸附分析(ELISA)
依據製造商的說明書，使用中尺度發現(MSD)磷酸(Ser473)/總Akt全細胞溶解產物套組以及磷酸-Akt(Thr308)全細胞溶解產物套組來分析AKT的磷酸化。以0.25 x 106細胞/孔的細胞密度將細胞種植在96孔U底盤(BD Falcon)的適當培養基(100μL/孔)中。以二重複的方式，7種不同濃度、3倍稀釋方案(劑量範圍：20.0-0.03μg/mL)的對照抗體(IgG4 PE)、抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗體，或H2L5 hIgG4PE處理細胞歷時1、2、4、6、24或48小時。就一個使用磷酸-AKT(Thr308)全細胞溶解產物套組的實驗來說，用一個濃度(10μg/mL)的所有三種抗體在三重複孔中來處理細胞。每一個96孔盤的下方列含有無細胞對照(兩個空白二重複孔)以及未經任何抗體處理的細胞。在處理之後，用含有蛋白酶與磷酸酶抑制劑的30μL冰冷溶解緩衝液溶解細胞，在冰上培育歷時30分鐘，然後將25μL溶解產物轉移至ELISA盤中，以在4℃下培育隔夜。
數據分析 細胞內訊號傳遞抗體陣列的密度測定法分析
進行密度測定法分析以計算出整個抗體陣列中的點的積分強度位準。每個點的強度相對於陣列上的陽性對照平均值進行常規化(公式=樣品孔/陽 性對照平均值)並且用GraphPad Prism 6.0(La Jolla,CA)繪圖。
MSD ELISA數據的分析
使用下列計算式來計算每一孔的磷酸蛋白百分率：磷酸蛋白%=((2 x磷酸-訊號)/(磷酸-訊號+總蛋白訊號))x 100。然後這個數值相對於在每個時間點的未經處理細胞值進行常規化並在Microsoft Excel 2007中畫成「對照%」。
結果
先前研究證實，H2L5 hIgG4PE處理會在Ba/F3-ICOS細胞中增加磷酸-AKT(S473)位準，其中觀察到的最大反應在抗體暴露之後30-40分鐘之間。在此，在比較晚的時間點測量磷酸-AKT位準，好看看在數天之後磷酸化增加的位準能否持續。此外，評估透過ICOS活化調節的其他細胞內訊號傳導事件。在Ba/F3-ICOS細胞中，於處理一與六小時之後，相較於IgG4-PE同型對照抗體處理的細胞，磷酸-AKT(S473)位準在用H2L5 HIGG4PE處理時會增加，但是這個效果在24小時後消失(圖15)。有趣的是，當細胞用抗-ICOS抗體(其中抗體Fc區失能)處理時，觀察到有類似的效用。相較於經IgG4-PE(圖15)同型對照抗體處理的抗體，在經H2L5 hIgG4PE與抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗體處理的細胞中也觀察到磷酸-AKT(T308)位準在處理一小時後增加並且持續至多48小時，而48小時是最後一個測量時間點。AKT下游的兩個其他磷酸蛋白，肝醣合成酶激酶3α(GSK3α)與核糖體蛋白S6，在ICOS活化之後也略為增加，但影響不如在磷酸-AKT所見般確定。也使用抗體陣列來分析蛋白溶解產物，該抗體陣列測量18個涉入細胞內訊號傳遞的蛋白質的磷酸化或裂解。使用這個方法，僅三個蛋白質顯示磷酸化在ICOS活化之後略為增加：磷酸-AKT(S473)、磷酸S6(S235/236)，以及磷酸-SAPK/JNK(T183/Y185)。
為了使用容許直接定量的分析形式來測量AKT磷酸化的變化，隨著時 間用某一個劑量範圍的對照抗體(IgG4 PE)、抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗體或H2L5 hIgG4PE處理Ba/F3-ICOS細胞並透過ELISA進行監控。在經抗-ICOS IgG1 Fc失能型抗體處理或經H2L5 hIgG4PE-處理的抗體中，磷酸-AKT(S473)位準增加同時是劑量依賴性以及時間依賴性的。如先前所觀察到的，在處理1小時後發生最大磷酸-AKT(S473)活化。在2小時後磷酸訊號略微減少並且持續至多到6小時，但最後在24小時後消失。在此也測試一種測量磷酸AKT(T308)位準的ELISA，但是使用這個ELISA套組沒有觀察到活化是可再現的。
討論
AKT訊號傳遞級聯可被受體酪胺酸激酶、整合素、B與T細胞受體、細胞激素受體、G蛋白偶合受體以及其他因為PI3K誘發磷脂酸肌醇(3,4,5)三磷酸(PIP3)生成的刺激所活化[Carnero,2008]。這些脂質充作Akt與其上游活化因子PDK1的細胞膜錨定位點。在細胞膜上，PDK1在Thr307處磷酸化AKT，使得Akt部分活化[Alessi,1996]。Akt在Ser473處因為mTORC2導致的磷酸化會刺激完全酶促活性[Sarbassov,2005]。
ICOS在活化效應以及調節性CD4+ T細胞的功能方面，藉由促進T細胞存活、增生與記憶而扮演重要角色。因為ICOS在維持T細胞活化與效應功能的角色，用促效抗體靶定ICOS可能是一個貌似合理的方法來提高抗腫瘤免疫性。在本研究中，吾人觀察到，透過H2L5 hIgG4PE活化ICOS在Ba/F3-ICOS中會致使AKT磷酸化改變。因此，AKT下游的蛋白質，諸如GSK3α(AKT的直接受質)與核糖體蛋白S3也被磷酸化。這個數據與最近使用這個模型系統所進行的研究成果相符，也與外界公開的數據一致[Fos,2008]。
實例10：單獨可溶性H2L5 hIgG4PE以及與抗-PD1和抗-CTLA-4抗體組合在人類PBMC分析中的功能性效用 實驗準備 分離初代人類PBMC
由GSK健康中心血液供體獲得新鮮血液並且用無酚紅-10% RPMI1640培養基1：1稀釋。於Uni-Sep Max 50ml錐形管中將經稀釋血液層加至密度介質的頂部並且在室溫下以400xg同時不中斷離心20分鐘。使用100μM細胞濾器將所得白色單核層(膚色血球層)小心萃取至新的50mL錐形管中。將等體積無酚紅-10% RPMI1640培養基添加至膚色血球層並在室溫下以300xg離心10分鐘。將細胞丸粒再懸浮於10ml的紅血球溶解溶液(Sigma Aldrich)中並在室溫下培育5分鐘。用培養基洗滌細胞一次且如前述進行離心。用無酚紅-10% RPMI1640培養基將體積補至40ml且使用Vicell細胞計數器與成活力分析儀(Beckman Coulter)來計數細胞。
單核細胞衍生的不成熟樹突狀細胞(iDC)的誘導
使用塑膠附著法來分離人類單核細胞。簡言之，將兩千萬個新鮮分離的PBMC培養於T-75組織培養燒瓶的AIM-V培養基(Thermo Fisher)中歷時3小時。洗去未結合至塑膠的細胞。於37℃的5% CO2培養箱中在AIM-V培養基內培養附著的單核細胞，AIM-V培養基補充有1000U/ml人類GM-CSF(Calt#300-03,PeproTech)以及500U/ml人類IL-4(cat#200-04)。7-10天後，收集iDC細胞用於與來自不同供體的T細胞在同種異體混合型淋巴細胞反應分析中進行共培養。
直接從血液分離初代人類T細胞
直接從新鮮人類血液使用人類T細胞增富混合物(Stem Cell Technologies)分離人類T細胞。將RosetteSep人類T細胞增富混合物(50μL/mL)添加至全血並充分混合。在室溫下培育20分鐘後，加入等體積PBS + 2% FBS並且輕柔混合。將經稀釋血液層加至密度介質的頂部並且在室溫下以1200xg、不中斷離心20分鐘。小心從密度介質：血漿介面將增富細胞倒入一個新的錐形管中。接著，用紅血球溶解緩衝液(Sigma Aldrich)溶解紅血 球並用PBS + 2% FBS洗滌經增富細胞兩次。然後將T細胞再懸浮於40ml PBS + 2% FBS中並且用Vi-Cell細胞計數器進行計數。
實驗程序 人類PBMC預先刺激分析
在37℃下，用CD3/CD28 T細胞擴增儀DynaBead以1：20的珠粒對細胞比率在T-75細胞培養燒瓶的AIM-V培養基中預先刺激經新鮮分離的人類PBMC，AIM-V培養基補充有100ng/ml的MCSF以及100IU/ml的IL-2(PeproTech)。48小時後，以磁性移除經預先刺激的珠粒並且洗滌、計數細胞，且用抗-CD3 DynaBead與治療性抗體在96孔非組織培養物處理圓底盤的AIM-V培養基中進行重新刺激，而AIM-V培養基補充有100IU/ml的IL-2(PeproTech)。種植密度為每孔每100μl培養基有100k個細胞。在37℃下培育歷時3.5天後，收集細胞培養物上清液依據MSD進行多重細胞激素測量。
人類MLR活化分析
將來自健康人類自願者之單核細胞衍生的iDC以1：10比率(iDC：T)與來自不同供體之新鮮分離的人類T細胞混合，並在0.02μg/ml CEFT肽混合物存在下於37℃下預先培育於AIM-V培養基中歷時24小時。將不同群的處理抗體直接添加至孔，混合並進一步培育又4天。收集細胞培養物上清液依據MSD分析進行多重細胞激素測量。
MSD細胞激素分析
使用MSD人類V-重客製化套組測定組織培養物上清液中的IFN-γ、IL-10、IL-2與TNF-α細胞激素位準。首先將樣品1：200稀釋於Diluent 2中。遵循製造商的建議，也在Diluent 2中製備校正品。將經稀釋樣品與校正品添加至MSD黑色盤，之後用黏著封帶予以密封並在室溫下培育同時震動歷時2小時。在將25μL偵測抗體溶液(於Diluent 2中新鮮製備)添加至各孔之後，重新密封盤並在室溫下培育同時震盪又2小時。在添加150μl/孔新鮮稀釋2x之 讀取緩衝液前，用150μL/孔PBS加上0.05% Tween-20洗滌盤3次，並立刻在MESO QuickPlex讀取儀上讀取。使用MSD工作台軟體分析數據。
數據分析 MSD數據分析
使用發現工作台軟體(Discovery Workbench software)(MSD,version 4.0.9)分析MSD數據。在每一個MSD盤中納入製造商套組的校正品，以便產生盤特異性標準曲線，在所有情況下的R2值超過0.99。偵測到的細胞激素數量是基於標準曲線回算，而三個生物重複實驗的平均以及標準差用來繪圖。
統計分析
對經log轉換，相對於每一個處理抗體本身之同型對照的倍數變化的數據進行單因子ANOVA。進行杜聶特氏多重比對檢定，以供在不同供體之間進行比較單一療法與組合。P<0.05被認為是有統計顯著性。
結果 關於H2L5 hIgG4PE與易普利單抗和派姆單抗之組合活性的PBMC預先刺激分析開發及測試
為了決定預先刺激的最佳條件，在不同珠粒對細胞比率下測試人類抗-CD3 Dynabead及抗-CD3/CD28 Dynabead(Thermo Fisher)。預先處理48小時後，收取細胞並在用抗-CD3 Dynabead(珠粒對細胞比率=1：1)與抗-ICOS抗體單獨或組合抗-CTLA-4或抗-PD1刺激之前用磁性移除珠粒。相較於同型對照，H2L5 hIgG4PE單劑處理使得IFN-γ在所有測試的預先刺激條件下會誘發。H2L5 hIgG4PE所誘導的IFN-γ量級與預先刺激強度為反向相關。相較於單獨H2L5 hIgG4PE或單獨易普利單抗，H2L5 hIgG4PE與易普利單抗的組合在經微弱預先刺激的PBMC中證明增加細胞激素生產。組合效用在盤結合型抗-CD3/抗-CD28預先刺激條件下消失，其被認為是一個更為強烈的預先刺激條件。依據這些結果，選出珠粒對細胞比率為1：20使用抗-CD3/抗-CD28 珠粒的預先刺激條件用於將來的所有PBMC分析。四個獨立供體的抗-CTLA-4組合結果歸納於圖16中，而與抗-PD-1組合的結果歸納於圖17中。
H2L5 hIgG4PE在PBMC預先刺激分析中造成劑量依賴性細胞激素誘導
在用抗-CD3/抗-CD28珠粒以預定珠粒對細胞比率1：20預先刺激的人類PBM中，評估H2L5 hIgG4PE的劑量依賴性活性。納入抗-RSV IgG4PE以及抗-ICOS 422.2 IgG1 Fc作為對照。測試八個濃度的H2L5 HIGG4PE(100、30、10、3、1、0.3、0.1以及0.03μg/ml)。藉由MSD在PBMC樣品的組織培養物上清液中評估IFN-γ、IL-10與TNF-α。H2L5 hIgG4PE會以劑量依賴性的方式誘導IFN-γ、IL-10以及TNF-α生成，但同型對照IgG4或Fc-失能型422.2不會。這些結果用來確定要在組合研究中使用的H2L5 hIgG4PE濃度。
人類MLR分析開發
嘗試要將人類MLR分析最佳化，除了共培養來自不同供體的人類T細胞與單核細胞衍生之不成熟DC以外，也將抗-CD3珠粒添加至孔中以提供基線TCR刺激，有助於為細胞做準備。結果證明，抗-CD3珠粒大幅增加IFN-γ誘導的範圍。雖然單獨易普利單抗就可以在沒有抗-CD3珠粒存在的情況下誘導IFN-γ生成，但單獨H2L5 hIgG4PE或H2L5 hIgG4PE/易普利單抗組合僅在抗-CD3珠粒存在下顯示IFN-γ生產提高更甚於對應對照。
H2L5 hIgG4PE與易普利單抗在人類MLR分析中的組合性活性
在同種異體人類MLR分析中測試單獨H2L5 hIgG4PE或與易普利單抗組合的免疫刺激活性，在該同種異體人類MLR分析中，T細胞在0.02μg/ml CEFT肽的存在下與來自不相配供體之單核細胞衍生的不成熟DC預先培育歷時1天。相較於單獨任一種藥劑，H2L5 hIgG4PE/易普利單抗組合使得在IFN-γ生產方面明顯提升。結果與三個測試的供體對相符，在供體之間觀察到變異性不大(圖18)。
H2L5 hIgG4PE與派姆單抗在人類MLR分析中的組合性活性
也在上述人類同種異體MLR分析中測試H2L5 hIgG4PE與派姆單抗的組合。測試單獨H2L5 hIgG4PE以及與呈10μg/ml的派姆單抗組合。相較於單獨任一種藥劑，H2L5 hIgG4PE與派姆單抗的組合使得IFN-γ增加。但是，因為供體變異性大且單一藥劑抗-PD-1處理在一些供體中的活性顯著，因此未達到統計顯著性(圖19)。
討論
ICOS是在原生T細胞上微弱表現並且在活化的CD4+與CD8+ T細胞中快速上調的共刺激性受體。ICOS的配體是ICOS-L(B7h、B7RP-1、CD275)，它是由專門APC以及由週邊上皮與內皮細胞在TNF-α刺激之後表現。ICOS：ICOS-L路徑為T細胞增生及功能提供一個關鍵性的共刺激訊號。因為它在維持T細胞活化以及效應功能中的角色，透過促效抗體來靶定ICOS可能是一種貌似合理的方法來增強抗腫瘤免疫性。
研究已顯示，在若干癌症模型中，透過易普利單抗阻斷CTLA-4後會增高ICOShi CD4+效應T細胞的發生率。此外，在CTLA-4阻斷之後，這個細胞群產生比ICOSlo CD4+ T細胞還要更高含量的INF-γ。事實上，COS+ CD4 T細胞的發生率增加在癌症患者體內已經被確認是易普利單抗治療的一種藥效學生物標記。在野生型C57BL/6小鼠中的研究證明，在CTL-4阻斷療法後有80至90%腫瘤排斥；但是，在ICOS或ICOSL剔除小鼠中，效力降低至少於50%。ICOS在CTLA-4阻斷有效性方面所扮演的重要角色暗示著，在抗-CTLA-4療法期間刺激ICOS路徑可能會增加治療效力。因此，進行設計來評估H2L5 hIgG4PE與易普利單抗的組合活性。
在2000年時，報導程式化細胞死亡-1(PD-1)是另一個免疫檢查點分子。可以在若干細胞類型中發現PD-L1(B7-H1)(其為PD-1的配體之一)的表現，細胞類型包括T細胞、上皮細胞、內皮細胞與腫瘤細胞。靶定PD-1/PD-L1軸的抗體在多種腫瘤類型中也顯示臨床反應。FDA最近核准派姆單抗與納 武單抗用來治療癌症，當作第二代免疫檢查點阻斷劑。Merck的派姆單抗已顯示在患有晚期黑色素瘤患者中的反應率為~37至38%，其中後續研究報導有進行性疾病的患者在先前易普利單抗治療之後有26%的整體反應率。納武單抗是BMS的抗-PD-1抗體，也顯示在轉移性黑色素瘤患者中有臨床效益，其中反應率為40%而1年整體存活率為72.9%。此外，納武單抗也是經FDA核准用於晚期或轉移型非小細胞肺癌。由於PD-1檢查點阻斷抗體在臨床上變成是主流癌症免疫療法，針對組合抗腫瘤活性來評估H2L5 hIgG4PE與抗-PD-1抗體組合會很重要。
之前，開發PBMC活化分析並用來評估一組抗ICOS促效抗體的T細胞刺激活性。由那些研究產生的數據支持選殖株422.2與IgG4PE同型的候選選定物作為H2L5 hIgG4PE。在先前分析中，用1μg/ml盤結合型抗-CD3抗體以及3μg/ml抗-CD28抗體預先刺激PBMC細胞歷時48小時，然後收取PBMC細胞並用抗-CD3與要研究的可溶性ICOS抗體重新刺激。H2L5 hIgG4PE顯示會以劑量依賴性的方式誘發IFN-γ生產。為了要決定預先刺激的最佳條件，已不同的珠粒對細胞比率測試人類抗-CD3 Dynabead以及抗-CD3/CD28 Dynabead(Thermo Fisher)。透過珠粒刺激被認為是更為生理學，且刺激強度更容易透過建構不同的珠粒對細胞比率來控制。預先刺激48小時後，收取細胞，並用抗-CD3 Dynabead(珠粒對細胞比率=1：1)與單獨抗-ICOS抗體或與抗-CTLA-4組合進行刺激之前利用磁性移除珠粒。結果顯示，相對於同型對照，H2L5 hIgG4PE單一藥劑治療在所有測試的預先刺激條件下會誘導IFN-γ。受到H2L5 hIgG4PE所誘發的IFN-γ量級與預先刺激強度呈反向相關。相較於單獨H2L5 hIgG4PE或易普利單抗，兩者的組合在經微弱預先刺激的PBMC中證明細胞激素生產提高。組合效用在盤結合型抗-CD3/抗CD28預先刺激條件下消失，而盤結合型抗-CD3/抗CD28預先刺激條件被認為是一個更強烈的預先刺激條件。基於這些結果，選出以珠粒對細胞比率為1：20 使用抗-CD3/抗-CD28的預先刺激條件用於所有未來的PBMC分析。H2L5 hIgG4PE與易普利單抗組合證明，IFN-γ生產相較於單獨任一種抗體處理有統計上顯著增加。
努力進行分析最佳化時，以珠粒對細胞比率固定在1：20的抗-CD3/抗-CD28刺激的情況下，於重新刺激步驟期間使用的抗-CD3珠粒從珠粒對細胞比率1：1下調至1：3和1：10。結果顯示，較低的重新刺激強度會使得因為H2L5 hIgG4PE所引起的IFN-γ誘導較低。H2L5 hIgG4PE與易普利單抗的組合效用在珠粒對細胞比率為1：3與1：10的重新刺激條件下完全喪失。因此，將來所有實驗維持重新刺激抗-CD3珠粒對細胞比率為1：1。
在預先刺激以及預先刺激條件最佳化的情況下，使用這個分析來評估H2L5 hIgG4PE的劑量反應。總共測試8個抗體濃度，其為100、30、10、3、1、0.3、0.1以及0.03μg/ml。抗-RSV IgG4PE與抗-ICOS 422.2 IgG1 Fc失能型、H2L5 hIgG4PE的Fc失能型形式用作為對照。結果顯示，H2L5 hIgG4PE以劑量依賴性的方式誘發IFN-γ、IL-10與TNF-α生產，而同型對照IgG4或Fc-失能型422.2不會。有趣的是，H2L5 hIgG4PE的Fc失能型形式表現出有限的細胞激素誘導反應，指出Fc受體接合對於H2L5 hIgG4PE的T細胞促效功能來說至為關鍵。這些結果也用來決定組合研究用的H2L5 hIgG4PE劑量。
也開發出混合淋巴細胞反應(MLR)分析來評估H2L5 hIg G4PE與檢查點阻斷抗體的組合效用。MLR分析是一種離體細胞免疫分析，其中初代單核細胞衍生的不成熟樹突狀細胞(iDC)與分離自不同供體的T細胞混合。iDC細胞表面上的主要組織相容性複合體(MHC)分子的失配可以在同種異體環境中引起T細胞刺激。在臨床上，MLR分析已知用來鑑定供體與受體之間的組織移植相容性。
為了要開發MLR分析，在補充有人類重組型GM-CSF以及IL-4的培養基中培養新鮮人類單核細胞歷時一週，以誘導不成熟DC表現型。然後分離不 同供體的新鮮人類T細胞並且與iDC細胞以10：1比率(T：iDC)混合。在抗-CD3珠粒存在或不存在的情況下，H2L5 hIg G4PE與易普利單抗單一療法或組合性治療可被加到T細胞/iDC共培養物。抗-CD3珠粒的用意是對輔助準備T細胞提供基線TCR刺激。結果顯示，抗-CD3珠粒在分析中大幅增加IFN-γ誘導的範圍。儘管單獨易普利單抗在抗-CD3珠粒不存在的情況下可誘導IFN-γ生產，但單獨H2L5 hIgG4PE或H2L5 hIgG4PE/易普利單抗組合顯示在抗-CD3珠粒存在下增強IFN-γ生產更甚於對應對照。這個結果暗示，在這個分析中，單單由DC細胞所引起的TCR刺激不足以誘發從PBMC新鮮分離之休止T細胞表面上的ICOS表現。為了要增進刺激，在添加治療性抗體之前增加一個24小時的iDC與T細胞預先培育步驟。也將CEFT肽混合物添加至分析程序中，以便能更充分地準備T細胞並引起抗原特異性反應。CEFT肽池是由27個從人類細胞巨大病毒(HHV-5；CMV)、E-B病毒(HHV-4；EBV)、A型流感病毒與破傷風桿菌選出限定HLA第I型與第II型限制型T細胞表位的肽組成。考量到在一般族群中對流行性感冒病毒與破傷風桿菌的免疫接種頻率高還有CMV與EBV的盛行率高，對大多數人類樣品來說，預期是召回抗原反應。結果顯示，當T細胞與iDC細胞預先培育歷時24小時，觀察到IFN-γ生產增加，而在將CEFT肽被添加至共培養系統中時IFN-γ生產更進一步增加。在同種異體人類MLR分析中測試單獨H2L5 hIgG4PE或與易普利單抗組合的免疫刺激活性，而在該人類MLR分析中，T細胞在0.02μg/ml CEFT肽存在下與不相配供體的單核細胞衍生之不成熟DC一起預先培育歷時1天。相較於單獨任一種藥劑，H2L5 hIgG4PE/易普利單抗組合使得IFN-γ生產明顯提高。結果與三個測試供體對相符；但是在供體之間觀察到變異性不大。
同樣地，也在上述人類同種異體MLR分析中測試H2L5 hIgG4PE與派姆單抗的組合。測試單獨H2L5 hIgG4PE以及與10μg/ml派姆單抗組合。相較於單獨任一種藥劑，H2L5 hIgG4PE與派姆單抗的組合使得IFN-γ增加。但 是，沒有達到統計顯著性，因為在一些供體中的供體變異性大且單一藥劑抗-PD-1治療有顯著活性。
歸納來說，相較於單一療法，這些研究證實H2L5 hIgG4PE與兩種經FDA核准的檢查點抑制劑(易普利單抗與派姆單抗)在兩種基於人類免疫細胞的分析中有優越的組合活性。在本文所報導的研究中，顯示H2L5 hIgG4PE會促進T細胞活化以及TH1偏差(例如IFN-γ生產)，其為有效抗腫瘤免疫反應的特徵。
實例11：單獨H2L5 hIgG4PE以及與抗-PD-1和抗-CTLA4抗體組合在活體內的功能性活性 人類PBMC小鼠腫瘤模型 方法 實驗準備
在開始研究程序之前，所有關於動物的程序是經過GSK動物試驗保護與使用委員會複審並核准。
細胞株的製備：
A2058是依據ATCC程序進行增殖。
材料
●A2058人類黑色素瘤細胞株：ATCC，Cat# CRL-11147，lot#59349362
●DPBS：：ATCC，Cat #30-2200，Lot#63357436
●杜貝可氏改良伊格氏培養基：ATCC，Cat # 30-2002，Lot# 62596471到期日：2015十月
●胎牛血清：Sigma-Aldrich，Cat#12176c-1000ml，lot # 13G180R0H1，到期日：2018七月
●0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA：ATCC，Cat #30-2102，Lot#62420300
●抗生素-抗黴劑(100X)：Life Technologies，Cat# 15240-062
●T175細胞培養燒瓶：Greiner bio-one，Cat# 661175
●T75細胞培養燒瓶：Greiner bio-one，Cat# 658175
培養基
●A2058完全生長培養基：杜貝可氏改良伊格氏培養基+ 10% FBS。培養條件：大氣：空氣，95%；5%二氧化碳(CO2)；溫度：37℃
●在收到細胞之後：
●在37℃下預先溫熱完全培養基。
●在37℃水浴中快速解凍細胞。用70%乙醇擦拭管，並且將細胞轉移至填充有經預先溫熱完全培養基的15ml管。
●在1200rpm下離心歷時5分鐘以收集細胞丸粒。
●將細胞回加至填充有經預先溫熱完全培養基的T75燒瓶並在37℃下培育。
細胞的繼代培養：
●依據一個75cm2燒瓶提供體積(關於T175cm2燒瓶，依比例需要調整解離與培養基數量)。
●移除並丟棄培養基。
●用DPBS大略沖洗細胞層，以移除含有胰蛋白酶抑制劑的所有微量血清。
●添加2.0至3.0mL胰蛋白酶-EDTA溶液到燒瓶中並且在倒立式顯微鏡下觀察細胞直到細胞層消散(2-3分鐘)。
●註記：為避免成塊，不要藉由碰撞或搖晃燒瓶來攪動細胞，同時等待直到細胞脫離。難以脫離的細胞可放在37℃下以促進分散。
●添加10mL完全生長培養基並藉由輕柔抽吸攪動細胞。
●在1200rpm下離心歷時5分鐘以收集細胞丸粒，添加10ml的完全生長培養基。
●添加適當分量的細胞懸浮液至新培養容器。在37℃下培育培養物。
●培養基換新：每2-3天。
由小鼠接種物製備腫瘤細胞：
●用1X DPBS洗滌細胞，添加3ml 1X胰蛋白酶歷時2-3分鐘。
●添加完整生長培養基並收集組織培養箱的無菌錐形離心管中的細胞懸浮液。
●在1200rpm下離心細胞歷時5分鐘以獲得細胞丸粒。
●用1X DPBS溶液洗滌細胞、在1200rpm下離心歷時5分鐘以獲得細胞丸粒。重複洗滌2次。
●藉由血球計數器計數細胞的細胞數目及成活力。
●以用於活體內接種的濃度將細胞再懸浮於冰冷PBS中(A2058，2.5e7/ml，2.5e6/100μl/小鼠)。
腫瘤細胞株接種至NSG小鼠 材料
●小鼠：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ。The Jackson Laboratory存貨：005557雌性 年齡：6週
●1mL結核菌素注射器加上附接針頭25 G 5/8：Becton Dickinson，Cat# 305554
●PDITM酒精片：專業拋棄式，Cat# B339
●PDITM碘酒片：專業拋棄式
●Cat# B40600
●小鼠的製備
●小鼠應為6週大
●在小鼠抵達之後容許有3-5天適應期
●在右後協將小鼠剃毛
注射的準備
●使用碘酒片以及酒精片將小鼠接種區進行清潔與殺菌
●使用1-cc注射器與25-規針頭
●拔出塞柱，混合細胞並將100μl細胞加到注射器的後部，小心塞入塞柱。
●將細胞皮下(s.c.)注射至小鼠的右後脇中。
●腫瘤生長評估
●為測量腫瘤，用70%酒精將毛弄濕，以便容易找出腫瘤邊界。每2-3天測量腫瘤尺寸與體重。
●用數位卡尺測量腫瘤尺寸，並且如下測量體積：腫瘤體積(mm3)=(長度)×(寬度)2/2
●人類PBMC靜脈內投與
●人類PBMC投與可以在腫瘤達到約100mm3的平均體積之後一週開始。
材料：
●新鮮人類PBMC：Allcells，cat#C-PB102-3B2
●1mL結核菌素注射器加上附接針頭25 G 5/8：Becton Dickinson，Cat# 305554
●PDITM酒精片：專業拋棄式，Cat# B339
●PDITM碘酒片：專業拋棄式，Cat# B40600
●紗布棉拭：Covidien，cat# 441211
●小鼠尾照明限位器：Braintree scientific，cat#MTI STD
●PBMC製備
●新鮮人類PBMC是經由隔夜運送購自Allcells。
●在1400rpm下離心細胞歷時5分鐘以獲得細胞丸粒。
●用1X DPBS溶液洗滌細胞、在1400rpm下離心歷時5分鐘以獲得細胞丸粒。
●以用於活體內接種的濃度(20e7/ml)將細胞再懸浮於冰冷PBS中。
●使用1-cc注射器與25-規針頭。
●拔出塞柱，混合細胞並將100μl細胞加到注射器的後部，小心塞入塞柱。
●將細胞維持於冰上。
●尾靜脈注射
●用白熾燈泡溫熱小鼠歷時5分鐘
●用尾照明限位器限制小鼠。
●將尾巴略為旋轉至可看到靜脈。
●使用碘酒片以及酒精片將小鼠接種區進行清潔與殺菌
●以小角度將針頭插入靜脈內並注射細胞。
●移出針頭並用紗布棉拭輕柔施加壓力直到停止出血。
●使動物返回其獸籠並觀察5-10分鐘，確認沒有繼續出血。
治療性抗體投與
●人類PBMC注射後1-3天，藉由腹膜內注射將抗體投與給小鼠。
材料
●完全人類IgG1同型對照：Eureka therapeutics，cat#ET-901(臨床前級)Lot#15-726到期日：2017二月
●易普利單抗(Yervoy)：Bristol-Myers Squibb NDC 0003-2327-11，lot#921873到期日：2015四月；lot#4H69490，到期日：2016五月
●完全人類IgG4同型對照：Eureka therapeutics，cat#ET-904(臨床前級)Lot#15-726到期日：2017二月
●抗人類ICOS H2L5 hIgG4PE
●派姆單抗(Keytruda)：Merck，NDC 0006-3026-02，lot# L010592，到期日：2016四月26日
●腹膜內注射：
●將待投與的100μl抽至注射器與針頭中。
●使針頭斜面與注射器數字對準。
●用非慣用手將動物充分限位。
●針頭插入點：畫一條假想線跨過膝蓋正下方的腹部，針頭沿著這條線插在動物右側並靠近中線。由於為雌性，可以看到插入點相對於最後一個乳頭為前方並略微內側。
●使小鼠的頭略往地板偏斜，使得頭比其後端還低。
●將針頭以30度角度插入腹部。
●針頭軸應進入約0.5公分的深度。
●注射後，抽出針頭並使小鼠回到其獸籠。
●血液與腫瘤取樣
●材料：
●採血管CB300(血清)：Braintree Scientific,Cat# MV-CB300 16440
●採血管CB300(血液學/EDTA鉀)：Braintree Scientific，Cat# MV-CB300 16444
●血液：
●一週對小鼠進行一次尾靜脈採血。
●在採血管CB300(Hematology/Potassium EDTA)中收集30μl血液用於流動式細胞測量術分析。
●在血清採血管CB300中收集另一30μl血液並在室溫下培育歷時2小時以容許凝血，接著在2000 x g下離心以收集血清。將血清儲存在-20下直到進一步分析。
腫瘤：
●當腫瘤尺寸達到2000mm3時將小鼠安樂死。收取腫瘤並依據下列程序進行處理。
實驗設計
所有研究室依據上列程序來進行製備。
H2L5 hIgG4PE劑量反應
設計這個研究來確認H2L5 hIgG4PE在移植有A2058黑色素瘤腫瘤的NSG小鼠中的劑量依賴性活性，該小鼠經移植人類PBMC。九組(每組10隻小鼠)以及1個具有7隻小鼠的對照組(僅腫瘤，無PBMC)被分派至每個研究中。關於劑量反應，使用供體#7129之人類PBMC的處理方案概要呈現於表11中。以0.04、0.4、1.2以及4mg/kg給予H2L5 hIgG4PE。以3mg/kg給予易普利單抗，並以1mg/kg測試抗-ICOS促效劑的Fc失能型變異體。相對於媒劑與相配對的同型對照組來評估測試組。在研究中止時的第49天做出存活率分析。
Figure 105102393-A0202-12-0125-41
Figure 105102393-A0202-12-0126-42
使用H2L5 hIgG4PE與易普利單抗和派姆單抗組合的效力以及藥效學(PD)活性研究 研究對象：
為了要評估H2L5 hIgG4PE單一療法的抗腫瘤活性，以0.04mg/kg與0.4mg/kg給藥。
為了要評估H2L5 hIgG4PE的抗腫瘤活性，與易普利單抗或派姆單抗組合以及匹配同型對照給藥。
收集組織用於將來H2L5 hIgG4PE的藥效學活性研究。總計22個治療組(每組10隻小鼠)被分派至這個研究。第1-16組是效力組而第17-22組是藥效學活性組。
關於組合治療，給予H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)以及易普利單抗或IgG1(3mg/kg)，或H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)以及派姆單抗或IgG4(5mg/kg)。每週給予H2L5 hIgG4PE與易普利單抗還有配對同型對照兩次，歷時6次給藥，每5天給予派姆單抗與同型對照直到H2L5 hIgG4PE給藥結束。關於藥效學組織收集組，以0.004、0.04、0.4以及1.2mg/kg給予H2L5 hIgG4PE。相對於媒劑與同型對照組評估治療組。採用供體編號#6711的人類PBMC，用於媒劑、同型與H2L5 hIgG4PE單獨還有與易普利單抗和派姆單抗組合的治療組顯示於表12中。在研究中止時的第59天做出存活率分析。
Figure 105102393-A0202-12-0127-43
Figure 105102393-A0202-12-0128-44
評估與易普利單抗或派姆單抗組合給藥的H2L5 hIgG4PE的效力研究
在使用A2058黑色素瘤腫瘤模型的NSG小鼠中，設計這個研究來評估H2L5 hIgG4PE(以0.01和0.04mg/kg給藥)與易普利單抗或派姆單抗組合加上匹配同型對照的抗腫瘤效力，該NSG小鼠移植有人類PBMC。總計13組(每組10隻小鼠)被分派至這個研究。第2組是人類化IgG1與IgG4的組合同型對照。以0.01mg/kg(第12組)以及0.04mg/kg(第13組)給予H2L5 hIgG4PE作為單一藥劑。關於組合治療，給予H2L5 hIgG4PE(0.01或0.4mg/kg)以及易普利單抗或IgG1(3mg/kg)，或H2L5 hIgG4PE(0.01或0.04mg/kg)以及派姆單抗或IgG4(5mg/kg)。每週給予H2L5 hIgG4PE與易普利單抗還有匹配同型對照兩次，歷時6次給藥，派姆單抗與同型對照每5天給藥直到H2L5 hIgG4PE給藥結束。採用供體#4568的人類PBMC的治療組概要顯示於表13中。相對於媒劑與同型對照組來評估治療組。在研究中止時的第33天做出存活率分析
表13：在A2058黑色素瘤腫瘤模型中，小鼠的治療組別
Figure 105102393-A0202-12-0129-45
統計分析
存活率分析的事件為腫瘤體積>2000mm3、腫瘤潰瘍、小鼠體重減輕>20%、垂死或發現死亡(無論何者先發生)。至截斷體積的確切時間是透過將兩個觀察結果之log腫瘤體積與天數間的線性線進行擬合來估算，第一個觀察結果是超過截斷體積而另一個觀察結果是就在截斷體積前。進行崁蘭-邁爾(Kaplan-Meier，KM)方法來估算不同治療組在某個給定時間下的存活率 可能性。報導至評估指標的中位時間及其對應95%信賴區間。無論任兩組之間的KM存活率曲線是否在統計學上有區別，接著進行log-秩檢定。
採用最後一天(亦即在任何動物安樂死之前)的腫瘤體積數據在不同治療組別之間進行腫瘤體積比較，其中每組有10隻動物。在分析之前，腫瘤體積經自然log轉換，因為不同治療組別間的變異數不等。然後對經log轉換的數據進行ANOVA以及成對比對。使用Graphpad Prism軟體來繪製腫瘤生長與體重數據的圖。
結果 H2L5 hIgG4PE劑量反應(圖20A) 腫瘤生長抑制：
對照組：人類PBMC(供體7129)顯示對NSG小鼠體內的A2058腫瘤生長沒有效用。帶有A2058腫瘤之有或沒有PBMC的小鼠、帶有A2058腫瘤之有經媒劑與同型對照抗體治療之人類PBMC的小鼠長出腫瘤，進展一如預期(組別#1 vs.組別#10、組別#1 vs.組別#2、組別#1 vs.組別#4，p=1)。3mg/kg的易普利單抗治療(組別#3)相較於對照組#1證明顯著抑制腫瘤生長(p<0.03)，但是與同型對照組#2相比時失去統計顯著性(p<0.22)。這指明同型抗體可能會影響腫瘤生長。相較於其他劑量，0.4mg/kg的H2L5 hIgG4PE治療證明腫瘤生長抑制趨勢且小鼠存活性增加，雖然與媒劑或同型對照相比時在統計上不顯著。
臨床觀察結果：
在研究期間觀察到小鼠體重喪失，在研究結束時為大約20%。已報導，GvHD與腫瘤負荷皆會使得小鼠體重下降，雖然在這個研究中，體重喪失似乎與A2058腫瘤更為有關，因為帶有腫瘤之不具PBMC移植(組別#10)的小鼠顯示有相同趨勢。在研究期間，於多個腫瘤中觀察到腫瘤潰瘍，包括同型對照組在內。
小鼠命運：
在腫瘤達到體積>2000mm3之後移除大多數小鼠。三隻小鼠因為腫瘤潰瘍而被安樂死，而三隻小鼠因為體重減少>20%而被安樂死。在所有組別中隨機發現到九隻小鼠死亡，包括媒劑組兩隻以及同型對照組總共三隻。這些死亡是模型對移植物抗宿主病狀態的敏感性，與治療無關，因為與媒劑組或同型對照組相比，治療組沒有觀察到這個模式。
H2L5 hIgG4PE與易普利單抗及派姆單抗組合的效力研究(圖20B) 腫瘤生長抑制：
對照組：帶有A2058腫瘤之有經媒劑或同型對照抗體治療之人類PBMC的小鼠長成腫瘤，一如預期生成。
單一療法：
3mg/kg易普利單抗治療組合IgG4(組別#3)相較於媒劑對照組別#1有顯著腫瘤生長抑制(p<0.04)。但是，當相較於同型對照組別#2，失去統計顯著性(p<0.23)。單獨2.5或5mg/kg的派姆單抗治療(組別#13、14)當與媒劑或同型對照組#12相比時顯示可觀察到的腫瘤生長抑制，但沒有統計顯著性。派姆單抗與IgG1組合(組別#4)顯示可觀察到的腫瘤生長抑制，沒有統計顯著性，但是觀察到相較於媒劑對照組#1的存活率顯著增加(p<0.04)。當相較於同型對照組#2時失去統計顯著性(p<0.4)。單獨0.4mg/kg的H2L5 hIgG4PE治療(組別#15)顯示可觀察到的腫瘤生長抑制，相較於媒劑或同型對照組#12沒有統計顯著性。0.04或0.4mg/kg的H2L5 hIgG4PE組合IgG1(組別#5與6)顯示可觀察到腫瘤進展延遲以及小鼠存活，但未達統計顯著性。
組合治療：
H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)與易普利單抗(3mg/kg)的組合。組別#8與#9 顯示相較於單獨易普利單抗(組別#3)，沒有額外腫瘤生長抑制。相較於派姆單抗單一療法(組別#4)或H2L5 hIgG4PE單一療法(組別#5與#6)，H2L5 hIgG4PE(0.04或0.4mg/kg)與派姆單抗(5mg/kg)的組合(組別#10以及#11)證明不大但顯著的腫瘤生長抑制與小鼠存活率。
臨床觀察結果：
在研究期間觀察到小鼠體重減少約20%。在研究期間，大多數組別有多個腫瘤的腫瘤潰瘍明顯。
小鼠命運：
當腫瘤體積達到2000mm3時，160隻小鼠中總計有100隻被安樂死。29隻小鼠因為腫瘤潰瘍被安樂死，18隻小鼠被發現死亡，12隻小鼠因為體重減少>20%而被安樂死，而一隻小鼠因為垂死而被安樂死。在包括同型對照的組別中發現小鼠死亡。組別#2. 這些死亡是因為模型對移植物對抗宿主病狀態的敏感度，而與治療無關，因為與同型對照組相比，治療組沒有觀察到這個模式。
評估H2L5 hIgG4PE組合易普利單抗或派姆單抗給藥的效力研究(圖20C) 腫瘤生長延遲：
對照組：帶有A2058腫瘤之有經媒劑或同型對照抗體治療之人類PBMC的小鼠長出腫瘤，一如預期生成。
單一療法：
相較於媒劑對照組#1，3mg/kg易普利單抗治療組合IgG4(組別#3)證明腫瘤生長抑制明顯(p<0.02)且存活率明顯增加(p<0.01)。但是，相較於同型對照組#2，腫瘤生長抑制未達到顯著(p<0.13)，但在小鼠存活率方面仍維持顯著增加(p<0.04)。相較於媒劑或同型對照組#2，5mg/kg派姆單抗治療與IgG1(組別#4)顯示腫瘤生長抑制，沒有統計顯著性。 相較於媒劑對照組#1，單獨0.01mg/kg或0.04mg/kg H2L5 hIgG4PE治療(組別#12與#13)顯示顯著腫瘤生長抑制(p<0.03)。相較於媒劑對照組#1，以0.04mg/kg給予的H2L5 hIgG4PE在小鼠存活率也顯示明顯增加(p<0.048)。但是，相較於同型對照組#2，組別#12與#13的腫瘤生長抑制及存活率沒有達到統計顯著性。相較於媒劑對照組#1，0.01mg/kg H2L5 hIgG4PE組合IgG1(組別#5)顯示明顯腫瘤生長抑制(p<0.03)及小鼠存活率(p<0.03)。但是，相較於同型對照組#2，腫瘤生長延遲及存活率未達統計顯著性。以0.04mg/kg給予H2L5 hIgG4PE與IgG1組合(組別#6)顯示可觀察到的腫瘤生長抑制及小鼠存活率，但是未達統計顯著性。
組合治療：
H2L5 hIgG4PE與易普利單抗的組合(0.01mg/kg加上易普利單抗3mg/kg；組別#8)顯示可觀察到的腫瘤生長抑制以及小鼠存活率，但未達到統計顯著性。相較於媒劑對照組#1或同型對照組#2(p<0.02)，H2L5 hIgG4PE與易普利單抗組合(0.04mg/kg加上易普利單抗3mg/kg；組別#9)證明顯著腫瘤生長抑制(p<0.00)以及小鼠存活率明顯增加(p<0.04)。但是，相較於同型對照，存活率未達統計顯著性。相較於單一療法易普利單抗組#3或H2L5 hIgG4PE單一療法組，組合活性未達到顯著性。
當相較於同型對照組#1，H2L5 hIgG4PE(0.01mg/kg或0.04mg/kg)組合派姆單抗(5mg/kg)(組別#10及#11)顯示明顯腫瘤生長抑制(p
Figure 105102393-A0202-12-0133-119
0.03)與觀察到的小鼠存活率明顯增加(p<0.03)。當相較於同型對照組#2，腫瘤生長抑制顯著性維持在0.04mg/kg H2L5 hIgG4PE組合派姆單抗(p<0.03)。然而存活率益處無法達到統計顯著性。相較於單一療法治療組派姆單抗組#3或H2L5 hIgG4PE組#5或#6，該組合無法達到顯著性。因此，H2L5 hIgG4PE組合派姆單抗(0.01或0.04mg/kg加上派姆單抗5mg/kg)證明腫瘤生長抑制與小鼠存活率增加，但相對於同型對照或單一療法無法達到統計顯著性。
臨床觀察結果：
在研究期間觀察到小鼠體重減少約20%。在研究期間，於大多數組別觀察到腫瘤潰瘍。
小鼠命運： 總計有91隻小鼠因為腫瘤大小>2000mm3被安樂死。34隻小鼠因為腫瘤潰瘍被安樂死，還有5隻小鼠被發現死亡。這些死亡是因為模型對移植物對抗宿主病狀態的敏感性 討論
在帶有A2058黑色素瘤腫瘤之NSG小鼠模型中評估H2L5 hIgG4PE作為單一療法以及與派姆單抗還有易普利單抗組合的效力，該NSG小鼠模型移植人類PBMC。這個將人類PBMC靜脈內注射至成年免疫缺陷型NSG(NOD/SCID/IL-2Rγ無)小鼠中的模型已知為Hu-PBMC NSG模型。其誘發移植物對抗宿主病(GVHD)且已用來研究效應與記憶T細胞活性。Hu-PBMC NSG模型被皮下移植有人類癌細胞株A2058，以便研究人類免疫治療性抗體對腫瘤生長的效用。這個模型的限制包括GVHD症狀的開始、體重喪失，以及頻繁的腫瘤潰瘍，其避免了要長期存活率監控，因為使用同基因小鼠腫瘤模型是可行的。
評估H2L5 hIgG4PE劑量範圍並非在較低範圍之0.04mg/kg至4mg/kg的最初研究證明腫瘤生長抑制不低。雖然在統計上不顯著，但相較於同型對照組，在0.04至0.4mg/kg的給藥組中觀察到腫瘤進展延遲以及小鼠存活率增加。基於這些研究，選定H2L5 hIgG4PE劑量為0.04至0.4mg/kg，用以在具有兩個不同供體(供體編號4568與6711)之PBMC移植物的研究中進一步評估單獨和與派姆單抗及易普利單抗組合。在兩個實施的組合研究之一中觀察到，H2L5 hIgG4PE單一療法以及與派姆單抗組合有適度反應。使用PBMC供體4568(表13，圖20C)的組合研究證明了單一療法以及組合的抗腫瘤活 性，而使用PBMC供體6711(表12，圖20B)的研究並未顯示明顯抗腫瘤效用，可能是因為研究之間的供體PBMC差異性，這反映出在臨床上可能會看到患者反應變異性。在使用PBMC供體4568的第二個組合研究中，相較於各個藥劑單獨，於組合組別中觀察到腫瘤生長抑制提高且小鼠存活性增加，雖然這個差異在統計上不顯著。雖然觀察到組合綜效，但因為H2L5 hIgG4PE 0.04mg/kg劑量與派姆單抗5mg/kg組合會導致腫瘤體積相對於同型對照組在第一次給藥之後十天有統計上顯著降低且存活性增加(p
Figure 105102393-A0202-12-0135-121
0.05)，而單一療法卻沒有。事實上，H2L5 hIgG4PE與派姆單抗組合組別中有50%小鼠在研究進行中的第33天前仍活著，但因為腫瘤潰瘍而被移除。僅有四隻小鼠因為腫瘤體積而從這個組合組別被移除，同時在派姆單抗與同型組中有8至9隻小鼠從研究被移除。
抗-PD1療法在這個模型中未證明有統計上顯著的活性，如同看到使用派姆單抗處理組相較於同型對照組所見腫瘤生長的改變有限且存活率有限。易普利單抗單一療法顯示有腫瘤生長抑制的趨勢，雖然不多但在兩個研究中均優於派姆單抗，且其在存活率方面顯示相較於同型在使用反應性PBMC均贈者4568的第二個組合研究中顯示統計上顯著增加(p
Figure 105102393-A0202-12-0135-120
0.04)。H2L5 hIgG4PE 0.01mg/kg劑量與易普利單抗3mg/kg的組合顯示在存活率方面相較於易普利單抗有顯著增加(p
Figure 105102393-A0202-12-0135-122
0.02)，但相較於H2L5 hIgG4PE單一療法則無。在這個模型中，相較於個別單一藥劑，H2L5 hIgG4PE與易普利單抗的組合對於腫瘤體積沒有觀察到額外的顯著效用。如在命運表中報導，所有治療組(包括媒劑以及同型對照組)的小鼠均發現有死亡。這些死亡是因為模型對於移植物對抗宿主病狀態的敏感性，與治療無關。
實例12：抗鼠類ICOS促效抗體單獨以及與抗-PD1和抗-CTLA-4抗體組合在活體內的功能性活性 CT26及EMT6同基因小鼠腫瘤模型 CT26鼠類結腸癌小鼠腫瘤模型 方法
按照GSK動物試驗保護與使用委員會在研究開始之前核准的程序進行這個研究。
動物
在這個研究中，有164隻Harlan Sprague Dawley的BALB/c雌性小鼠。在研究開始，小鼠要接種時為6至8週大。
細胞培養及接種
將一瓶CT-26細胞(ATCC：CRL-2638)(3x106細胞；P-11)從-140℃解凍並且置於有10% FBS的RPMI中。在10天內將細胞繼代培養3次。在繼代培養期間，用胰蛋白酶/EDTA來促進細胞從培養燒瓶脫落。收集細胞、洗滌兩次，並且以5x105細胞/ml再懸浮於沒有FBS的RPMI中。在右後脇處將小鼠皮下接種0.1ml細胞(5x104細胞/小鼠)。在細胞收集以及接種當天，在Beckman Coulter Vi-cell XR上完成細胞計數並且藉由血球計數器進行檢查。用胰蛋白酶/EDTA使細胞脫離燒瓶且洗滌兩次，第一次用RPMI + 10% FBS而第二次僅用RPMI，並再懸浮於10ml RPMI中。在20ml RPMI中收集的178x106細胞有98.8%成活力。1.685ml細胞懸浮液(總計15x106細胞)被加到28.315ml RPMI。15x106細胞/30ml培養基=5x105細胞/ml。這相當於5x104細胞/100μl。
抗體調配及製備
在給藥當天，在無菌0.9%食鹽水中將抗體從原液瓶稀釋至所需濃度。以0.05mg/kg與0.5mg/kg測試抗-ICOS促效劑選殖株C398.4。每次給藥也測試抗-PD1 10mg/kg以及抗-CTLA-4 1mg/kg。
實驗程序 腫瘤監控及給藥
在第0天將小鼠接種。在第11天測量體重與腫瘤體積。基於腫瘤大小將小鼠隨機分配至表14中所示的12個研究組中，其中每組有10隻小鼠。隨機分配是使用Studylog Study Director軟體來完成。根據研究設計圖對小鼠給藥，每週兩次，從隨機分組當天開始並持續總計6次給藥。給藥為腹膜內(IP)，在100μl體積的0.9%食鹽水媒劑中。在研究期間，每週測量腫瘤體積及體重3次。
評估指標
當腫瘤體積大於2000mm3時，基於腫瘤負荷將小鼠移出研究。藉由將長度與寬度卡尺測量值代入下式而計算出腫瘤體積：TV=0.52*L*W2。
另外，當腫瘤長成開放性潰瘍時，將小鼠移出研究。在實驗過程中觀察到潰瘍，但是僅僅潰瘍上的斑點並不是一個評估指標，除非斑點形成開口。
儘管未應用在這個研究中的任一隻小鼠，但在研究開始時建立的第三個評估指標是體重減少20%。
藥物與材料
Figure 105102393-A0202-12-0137-47
 所有抗體在0.9%食鹽水中稀釋至所需濃度且食鹽水用作為媒劑對照。
數據分析
存活率分析的事件為2000mm3的腫瘤或腫瘤潰瘍，無論何者先發生。至截斷體積的確切時間是透過將兩個觀察結果的log腫瘤體積及天數間的線性線擬合來進行估算，第一個觀察結果為超過截斷體積而第二個觀察結果為剛好在截斷體積之前。進行崁蘭-邁爾(KM)方法來估算不同治療組在某個 給定時間下的存活率可能性。報導至評估指標的中位時間及其對應95%信賴區間。無論任兩組之間的KM存活率曲線是否在統計學上有區別，接著進行log-秩檢定。
在初始投藥之後，比較兩個不同治療組在第17天時的腫瘤體積。在分析之前，腫瘤體積經自然log轉換，因為不同治療組別間的變異數不等。然後對經log轉換的數據進行ANOVA以及成對比對。
Figure 105102393-A0202-12-0138-46
在治療組別之間，從至存活率分析事件的天數比較，還有在第10天經log轉換腫瘤體積之比較的原始p值，以及經偽發現率(FDR)調整的p值顯示於上表中。使用經FDR調整的p值≦0.05的比較，表示為統計上顯著的。
結果
小鼠命運歷程顯示因為腫瘤負荷以及腫瘤潰瘍而移出研究的小鼠數目。在研究第61天時，所有存活下來的小鼠沒有腫瘤，除了G7中有1隻小鼠的腫瘤體積為579.16mm3。
關於存活率(至評估指標的時間)，組別9與12顯示存活率相較於媒劑對照組明顯增加(分別為p=0.008與p=0.001)。相較於組2、4及5，組12顯示在統 計上明顯延長存活率(p=0.006、0.001、0.02)。但是，沒有組合組別顯示存活率明顯增加勝過任何單一療法(p<0.05)(圖21)。
討論
組合療法組別(尤其是高劑量抗-ICOS以及抗-PD1組合(組別12))證明腫瘤生長抑制以及存活率增加勝過單一療法以及同型對照組。儘管在第61天未達到統計顯著性。組別12的同型對照為大鼠IgG2a +倉鼠IgG組別3。比對用單一療法組為ICOS 10μg(組別6)以及PD1 200μg(組別8)。相較於組別3中的1隻，組別6中的1隻還有組別8中的1隻，組別12中總計有5隻小鼠存活下來且沒有腫瘤。存活益處是藉由將每隻小鼠達到任一種預定研究評估指標所耗天數予以量化。一些小鼠因為開放性腫瘤潰瘍但不是因為腫瘤負荷而移出研究。
在高劑量ICOS + CTLA-4組合組別(組別10)中，在第31天前因為腫瘤潰瘍而移除的小鼠數目增加，可能會模糊了這個組合提供的存活率以及抗腫瘤益處。在這個組別中，5隻小鼠因為腫瘤潰瘍而被移除而僅有2隻的腫瘤負荷達到2000mm3。因為腫瘤潰瘍而移除的所有腫瘤在離開研究時仍為中等大小，但預期腫瘤潰瘍是因為療法在這些小鼠體內誘發的抗腫瘤免疫反應。在這組中有三隻小鼠直到第61天都沒有腫瘤。因為腫瘤負荷而移除的2隻小鼠在所有組別中因為腫瘤負荷而移除的小鼠數目為最低。
EMT6乳癌小鼠腫瘤模型 實驗程序
本文件中所述的全部程序以及安樂死標準符合IACUC程序AUP0606。將動物秤重且每隻小鼠接種100μl的1x105 EMT6腫瘤細胞在右後四分之一。小鼠接種的數目等於至少研究所需的130%。假定有30%失敗率(在研究開始之時過大或過小)，每組的目標為=10。接種腫瘤細胞之後，用Fowler「ProMax」數位卡尺一週測量腫瘤生長及總體重3次，歷時4週或更久。從 商葉賣家取得抗體並在0.9%食鹽水中稀釋至所需濃度。每兩週給藥(i.p.)，歷時總計6次給藥並在隨機分組當天開始，那一天指定為第0天，平均腫瘤體積約100mm3，接種後大約7至8天。使用Studylog Study Director Suite軟體進行隨機分組。測量腫瘤的長度與寬度以使用下式決定腫瘤體積(腫瘤體積=L * W2 * 0.52)。個別動物的腫瘤測量值超過2,000mm3要移出研究。小鼠也可能因為體重喪失(>20%)、腫瘤潰瘍或任何其他因為發病而明顯抑制正常小鼠活性被移出研究。
在這個研究中，總計191隻動物接種EMT6細胞以產生足夠帶有所需大小範圍之腫瘤的小鼠，13組各有10隻小鼠如表15中所示。注射食鹽水媒劑的小鼠以及同型對照組充作為ICOS、PD1與CTLA-4 mAb治療小鼠的對照。 以10μg單獨給予ICOS的同型對照(倉鼠IgG)並與同型組合用於CTLA-4(小鼠IgG2b)或PD-1(大鼠IgG2a)。單一療法治療組的每隻小鼠分別以20與200μg給予抗-CTLA-4(9D9)以及抗-PD-1(RMP1-14)並與ICOS同型對照組合進行評估。ICOS促效劑的C398.4選殖株以每隻小鼠10及1μg給藥。也以每隻小鼠10及1μg組合抗-CTLA-4或抗-PD-1來評估ICOS促效劑的效力。另外納入一組呈預定濃度的PD-1以及CTLA-4作為陽性對照比較組。在隨機分組後第13天進行腫瘤體積的統計分析。存活性分析納入正在研究中到第60天的小鼠。
Figure 105102393-A0202-12-0140-48
Figure 105102393-A0202-12-0141-49
藥物及材料 動物
由Harlan Sprague Dawley收到6至8週大的雌性Balb/c小鼠並且依據IACUC規範予以豢養。
EMT6細胞
將EMT6細胞解凍並且在接種之前培養於細胞培養燒瓶中歷時八天。在這段時間將細胞繼代3次。接種當天，由燒瓶的完全培養基收取細胞。將細胞離心並再懸浮於韋茅斯氏(Weymouth’s)(具有15% FBS)中。在沒有FBS的情況下於韋茅斯氏培養基中重複這個步驟3次。經由錐蟲藍排除法檢核細胞密度與成活力。接著將細胞稀釋至所需密度(每mL 1x106個細胞)。
免疫治療劑
在給藥當天將所有治療劑於0.9%氯化鈉中稀釋至所需濃度，並且使用30G針頭i.p.注射。治療劑稀釋液與對照稀釋液如表16中所呈現。
Figure 105102393-A0202-12-0141-50
數據分析 統計學分析
存活率分析的事件為2000mm3的腫瘤或腫瘤潰瘍，無論何者先發生。至截斷體積的確切時間是透過將兩個觀察結果的log腫瘤體積及天數間的線性線擬合來進行估算，第一個觀察結果為超過截斷體積而第二個觀察結果為剛好在截斷體積之前。進行崁蘭-邁爾(KM)方法來估算不同治療組在某個給定時間下的存活率可能性。報導至評估指標的中位時間及其對應95%信賴區間。無論任兩組之間的KM存活率曲線是否在統計學上有區別，接著進行log-秩檢定。
在初始投藥之後13天時，比較兩個不同治療組的腫瘤體積。在分析之前，腫瘤體積經自然log轉換，因為不同治療組別間的變異數不等。然後對經log轉換的數據進行ANOVA以及成對比對。採用SAS 9.3以及R 3.0.2分析軟體。
結果
將Balb/c小鼠接種並在八天後依據治療方案隨機分配至每組有十隻小鼠的組別中。在隨機分組日(第0天)開始投與治療劑或對照並持續一週兩次，歷時3週。
相對於先前的EMT-6研究，經食鹽水治療的組別以預期速率長出腫瘤。因為在第30天之前的腫瘤大小或潰瘍之故，將所有食鹽水媒劑對照組中的小鼠安樂死。在平均腫瘤生長或存活率方面，使用單獨倉鼠IgG或與大鼠IgG2a或小鼠IgG2b組合治療相較於食鹽水媒劑組沒有產生統計顯著變化。
在隨機分組後第13天時，ICOS單一療法組證明，在平均腫瘤生長方面可觀察到的改變相較同型對照來說很少。但是，高劑量ICOS治療組(10μg)證明比低劑量組有更為明顯的腫瘤生長抑制趨勢。觀察到與CTLA-4單一療 法活性相當的效用。在第13天，使用PD-1 mAb的單一療法治療也會產生一些可觀察到，但在統計上不明顯的平均腫瘤體積減少。然而，就像使用ICOS以及CTLA-4單一療法般，當與適當同型組相比時，這樣不會造成存活率增加。使用抗-PD-1與呈10μg劑量的抗-ICOS抗體選殖株C398.4組合治療時，相較於對照以及單一療法治療組有相當高的腫瘤生長抑制(圖22)。這個組合組別中的三隻小鼠達到完全腫瘤消退，有相當大的增進甚過於對照或單一療法治療組。但是，由於所使用的統計學標準，在存活率方面沒有達到統計上顯著改善。相較於食鹽水媒劑對照(p<0.05)以及1與10μg的ICOS單一療法(p<0.05)，抗-PD-1與1μg ICOS促效抗體選殖株C398.4的組合在第13天確實會造成平均腫瘤生長有統計上顯著減少。這個治療方案中有四隻小鼠達到完全腫瘤消退，產生明顯增加存活率的趨勢，但未達到統計顯著性。
相較用ICOS抗體或抗-CTLA-4抗體的單一療法，兩種劑量的ICOS抗體與抗-CTLA-4組合證明在腫瘤生長抑制以及存活率方面可觀察到的益處不多。
討論
儘管相較於食鹽水媒劑組，同型對照在平均腫瘤體積以及整體存活率方面沒有明顯改變，但在倉鼠IgG組(第4組)以及倉鼠IgG與大鼠IgG2a(第3組)中的個別動物證明會延遲腫瘤生長。在倉鼠IgG &大鼠IgG2a同型組中，一隻小鼠存活超過最後一隻食鹽水媒劑小鼠，該食鹽水媒劑小鼠在第36天因為潰瘍加上腫瘤測得體積為1156.56mm3而被犧牲。倉鼠IgG組中的兩隻倉鼠活得比食鹽水組更久。一隻倉鼠在第36天因為腫瘤尺寸被安樂死，而另一隻在第41天因為潰瘍加上測量值為1899.28mm3被安樂死。
抗-PD-1加上10μg抗-ICOS促效劑的給藥方案產生可觀察到的腫瘤生長抑制，在第13天相較於同型對照的腫瘤體積減少，儘管這個差異與抗-PD-1單一療法相比時不那麼明顯。但是，這個組合使得總共五隻動物存活超過 抗-PD-1單一療法中的任一隻動物，其中三隻小鼠經歷完全腫瘤消退，相較於抗-PD-1單一療法組中沒有一者有完全腫瘤消退。
相較於同型對照以及個別單一療法組，將抗-PD-1與1μg劑量ICOS促效抗體配對在第13天會產生平均腫瘤尺寸有可觀察到的減少。當與食鹽水媒劑對照(p<0.05)以及1μg ICOS單一療法組(p<0.05)相比時，這個減少是統計上顯著的。四隻小鼠經歷完全腫瘤消退並且存活超過PD-1單一療法組中的任一小鼠。
相對於對照，在第60天前未發現使用ICOS + PD1組合組別所觀察到的存活益處達到統計顯著性。但是，ICOS + PD1組合治療組的腫瘤生長抑制以及存活率益處與使用PD1 + CTLA-4組合組所觀察到的活性相當，而PD1 + CTLA-4組合組在這個研究中被認為是抗腫瘤活性的陽性對照。這暗示著，ICOS與PD1抗體的組合可能具有類似於CTLA-4與PD1組合的益處，其在一些腫瘤類型中證明有明顯臨床活性。
在本研究中所徵召的130隻小鼠中，在第60天時有12隻仍活著，其中11隻達到完全腫瘤消退。118隻符合研究移除評估標準的小鼠中，有111隻因為腫瘤尺寸達到2000mm3而被移除。其餘七隻小鼠因為腫瘤上的潰瘍而被安樂死。潰瘍的發生率在組別中分散開來。第1組(食鹽水)、第3組(倉鼠IgG &大鼠IgG2a)、第4組(倉鼠IgG)、第6組(1μg ICOS)以及第10組(CTLA-4加上1μg ICOS)全都有一隻小鼠因潰瘍而被移除。第13組(CTLA-4 + PD-1)顯示兩隻小鼠因為潰瘍而被犧牲。其餘組別沒有動物因潰瘍而被移除。
<110> 葛蘭素史克智慧財產發展有限公司/Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited 法國國家健康及醫學研究中心/Inserm 尚波立及愛琳卡默茲中心/Institut Jean Paoli & Irene Calmettes 艾克斯-馬賽大學/Universite dAix-Marseille 法國國家研究科學中心/Centre National De La Recherche Scientifique
<120> ICOS結合蛋白 ICOS BINDING PROTEINS
<150> 62/247,355
<151> 2015-10-28
<150> 62/192,331
<151> 2015-07-14
<150> 62/108,605
<151> 2015-01-28
<160> 24
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 1
Figure 105102393-A0305-02-0148-35
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 2
Figure 105102393-A0305-02-0148-36
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 3
Figure 105102393-A0305-02-0148-38
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 4
Figure 105102393-A0305-02-0149-39
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 5
Figure 105102393-A0305-02-0149-40
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 6
Figure 105102393-A0305-02-0149-42
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 7
Figure 105102393-A0305-02-0149-43
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 8
Figure 105102393-A0305-02-0150-44
<210> 9
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 9
Figure 105102393-A0305-02-0150-45
Figure 105102393-A0305-02-0151-2
<210> 10
<211> 168
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Figure 105102393-A0305-02-0151-48
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Figure 105102393-A0305-02-0152-49
<210> 12
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 12
Figure 105102393-A0305-02-0152-50
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 13
Figure 105102393-A0305-02-0152-51
Figure 105102393-A0305-02-0153-52
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 14
Figure 105102393-A0305-02-0153-53
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 15
Figure 105102393-A0305-02-0153-55
<210> 16
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 16
Figure 105102393-A0305-02-0154-56
Figure 105102393-A0305-02-0155-3
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 17
Figure 105102393-A0305-02-0155-59
<210> 18
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 18
Figure 105102393-A0305-02-0155-62
Figure 105102393-A0305-02-0156-63
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 19
Figure 105102393-A0305-02-0156-64
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠類
<400> 20
Figure 105102393-A0305-02-0156-66
<210> 21
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 21
Figure 105102393-A0305-02-0156-67
Figure 105102393-A0305-02-0157-69
<210> 22
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 22
Figure 105102393-A0305-02-0157-71
<210> 23
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 23
Figure 105102393-A0305-02-0157-74
Figure 105102393-A0305-02-0158-73
<210> 24
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 24
Figure 105102393-A0305-02-0158-75
Figure 105102393-A0305-02-0159-33

Claims (28)

  1. 一種ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：1中所示CDRH1；SEQ ID NO：2中所示CDRH2；SEQ ID NO：3中所示CDRH3；SEQ ID NO：4中所示CDRL1；SEQ ID NO：5中所示CDRL2及SEQ ID NO：6中所示CDRL3。
  2. 如請求項1之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含含有與SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列的VH域，及含有與SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列的VL域，其中該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分特異地結合至人類ICOS。
  3. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分為ICOS促效劑。
  4. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分以下列結合至人類ICOS(i)締合速率常數(kon)為至少1x105M-1s-1；而解離速率常數(koff)為少於6x10-5s-1；或(ii)解離常數(K D)少於約100nM，其中透過BIAcore測量親和力。
  5. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含含有SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的VH域；以及含有SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列的VL域。
  6. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含與SEQ ID NO：23中所示胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：24中所示胺基酸序列具有至少90%序列一致性的輕鏈胺基酸序列。
  7. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：23中所示的重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：24中所示的輕鏈胺基酸序列。
  8. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分包含選自人類IgG1同型以及人類IgG4同型的骨架。
  9. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分包含hIgG4PE骨架。
  10. 如請求項1或2之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分是單株抗體。
  11. 如請求項10之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該單株抗體為人類化單株抗體。
  12. 如請求項10之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該單株抗體為完全人類單株抗體。
  13. 如請求項10之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其為人類ICOS的促效劑並包含IgG4同型骨架。
  14. 如請求項13之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其中該抗體包含hIgGPE骨架。
  15. 一種核酸序列，其編碼如請求項1至14中任一項之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分。
  16. 一種表現載體，其包含如請求項15之核酸序列。
  17. 一種重組型宿主細胞，其包含如請求項15之核酸序列或如請求項16之表現載體。
  18. 一種ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，其係由如請求項17之重組型宿主細胞表現。
  19. 一種製造如請求項1至14或18中任一項之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分的方法，其包含以下步驟：(i)在表現該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分之適當的條件下，培養如請求項17之重組型宿主細胞；以及(ii)分離該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分，藉此製造包含該ICOS結合蛋白或其抗原結合部分之多肽。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至14或18中任一項之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分及醫藥上可接受的載劑。
  21. 一種如請求項1至14或18中任一項之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分或如請求項20之醫藥組成物用於製造供在有需要的人類體內治療癌症、傳染病或敗血病的醫藥的用途。
  22. 如請求項21之用途，其中至少一種抗贅瘤劑、至少一種第二免疫調節性藥劑，及/或至少一種免疫刺激性佐劑係投予至該人類。
  23. 如請求項22之用途，其中該至少一種抗贅瘤劑為化療劑。
  24. 如請求項22之用途，其中該至少一種抗贅瘤劑係選自：多西紫杉醇、胺甲喋呤、太平洋紫杉醇、吉西他濱、氟尿嘧啶、卡鉑以及順鉑。
  25. 如請求項22之用途，其中該第二免疫調節性藥劑是選自：抗-CTLA4抗體、抗-PD-1抗體、抗-PDL1抗體以及抗-OX40抗體。
  26. 如請求項22之用途，其中該至少一種免疫刺激性佐劑為TLR4促效劑。
  27. 如請求項26之用途，其中該TLR4促效劑為CRX-601。
  28. 如請求項1至2、11至14或18中任一項之ICOS結合蛋白或其抗原結合部分或如請求項20之醫藥組成物，其用於在有需要的人類體內治療癌症、傳染病及/或敗血病。
TW105102393A 2015-01-28 2016-01-26 Ｉｃｏｓ結合蛋白 TWI717332B (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562108605P 2015-01-28 2015-01-28
US62/108,605 2015-01-28
US201562192331P 2015-07-14 2015-07-14
US62/192,331 2015-07-14
US201562247355P 2015-10-28 2015-10-28
US62/247,355 2015-10-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201702267A TW201702267A (zh) 2017-01-16
TWI717332B true TWI717332B (zh) 2021-02-01

Family

ID=55262868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105102393A TWI717332B (zh) 2015-01-28 2016-01-26 Ｉｃｏｓ結合蛋白

Country Status (27)

Country Link
US (9) US20180030136A1 (zh)
EP (3) EP3575324A1 (zh)
JP (3) JP6553197B2 (zh)
KR (1) KR102315160B1 (zh)
CN (1) CN107667117B (zh)
AU (3) AU2016210867B2 (zh)
BR (1) BR112017016336A2 (zh)
CA (1) CA2974910A1 (zh)
CL (1) CL2017001921A1 (zh)
CO (1) CO2017007665A2 (zh)
CR (1) CR20170351A (zh)
DO (1) DOP2017000171A (zh)
EA (1) EA036335B1 (zh)
ES (1) ES2913871T3 (zh)
IL (1) IL253508B (zh)
JO (1) JO3745B1 (zh)
MA (3) MA41414A (zh)
MX (1) MX2017009758A (zh)
MY (1) MY185845A (zh)
PE (1) PE20180120A1 (zh)
PH (1) PH12017501347B1 (zh)
SG (1) SG11201705829TA (zh)
TW (1) TWI717332B (zh)
UA (1) UA124613C2 (zh)
UY (1) UY36539A (zh)
WO (1) WO2016120789A1 (zh)
ZA (1) ZA201704818B (zh)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2482849T3 (pl) 2009-09-30 2018-11-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Skojarzona immunoterapia w leczeniu nowotworu
EP2691419B1 (en) * 2011-03-31 2016-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos and uses thereof
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
CN105308457B (zh) 2013-03-14 2018-07-10 斯坦福大学托管董事会 检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EA035037B1 (ru) 2013-12-12 2020-04-21 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9822186B2 (en) 2014-03-28 2017-11-21 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EA201791139A1 (ru) 2014-11-26 2018-04-30 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
ES2845727T3 (es) * 2015-02-06 2021-07-27 Heat Biologics Inc Vector que coexpresa una vacuna y moléculas coestimuladoras
ME03819B (me) 2015-03-23 2021-04-20 Jounce Therapeutics Inc Antitela za icos
WO2017025871A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies
TW201723190A (zh) 2015-10-22 2017-07-01 永斯醫療股份有限公司 用於測定icos表現之基因印記
US10527613B2 (en) * 2015-11-10 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same
EP3387013B1 (en) 2015-12-07 2022-06-08 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
NZ745957A (en) 2016-04-07 2020-07-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Heterocyclic amides useful as protein modulators
AU2017247806B2 (en) 2016-04-07 2019-11-14 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides useful as protein modulators
RU2767357C2 (ru) 2016-06-14 2022-03-17 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
WO2017220990A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018025221A1 (en) 2016-08-04 2018-02-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
EP3497128A2 (en) 2016-08-09 2019-06-19 Kymab Limited Anti-icos antibodies
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018045110A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20230130174A (ko) * 2016-08-30 2023-09-11 젠코어 인코포레이티드 공자극 및 체크포인트 수용체에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
WO2018085698A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Aximmune, Inc. Beta-alethine, immune modulators, and uses thereof
JP7181878B2 (ja) * 2017-01-13 2022-12-01 タイチョウ ハンチョン バイオファーマシューティクス インコーポレイテッド Ｐｄ－１に対するモノクローナル抗体及びその適用
WO2018140644A1 (en) * 2017-01-25 2018-08-02 Musc Foundation For Research Development Modified t cells and uses thereof
JP2020509009A (ja) * 2017-02-27 2020-03-26 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ キナーゼ阻害剤としての複素環式アミド
WO2018176144A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Sunnybrook Research Institute Engineered t-cell modulating molecules and methods of using same
US20200024351A1 (en) * 2017-04-03 2020-01-23 Jounce Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Cancer
TWI788340B (zh) * 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CA3066048A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
JP2020522541A (ja) 2017-06-09 2020-07-30 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 癌を治療するためのｉｃｏｓアゴニストおよびｏｘ４０アゴニストでの組み合わせ療法
BR112019025257A2 (pt) 2017-06-09 2020-09-29 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited método para tratar câncer, e, anticorpo anti-icos ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo anti-ox40 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
SG11202001479RA (en) 2017-08-31 2020-03-30 Io Therapeutics Inc Rar selective agonists in combination with immune modulators for cancer immunotherapy
CN111094353A (zh) * 2017-09-14 2020-05-01 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 用于癌症的组合治疗
WO2019069269A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited INTERFERON GENE STIMULATOR MODULATORS USEFUL IN THE TREATMENT OF HIV
CA3077337A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modulators of stimulator of interferon genes (sting)
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
US11629189B2 (en) 2017-12-19 2023-04-18 Kymab Limited Bispecific antibody for ICOS and PD-L1
TW202000891A (zh) * 2018-03-07 2020-01-01 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 純化抗體之方法
US11242393B2 (en) 2018-03-23 2022-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
MX2020010910A (es) 2018-04-18 2021-02-09 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas dirigidas a pd-1 que contienen proteinas de fusion il-15 / il-15ra fc y dominios de union al antigeno pd-1 y usos de los mismos.
JP2021520829A (ja) 2018-04-18 2021-08-26 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＴＩＭ−３抗原結合ドメインを含む、ＴＩＭ−３標的化ヘテロ二量体融合タンパク質
GB201807924D0 (en) 2018-05-16 2018-06-27 Ctxt Pty Ltd Compounds
BR112020023451A2 (pt) 2018-05-31 2021-02-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited terapia combinada
BR112020023459A2 (pt) * 2018-05-31 2021-02-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited terapia combinada com proteínas de ligação a icos e inibidores de arginina metiltransferase
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
CN110734493B (zh) * 2018-07-20 2021-12-17 厦门大学 抗pd-1抗体及其用途
WO2020031087A1 (en) 2018-08-06 2020-02-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
US20210324081A1 (en) 2018-10-22 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
JP2022533194A (ja) 2019-05-16 2022-07-21 スティングセラ インコーポレイテッド ベンゾ［ｂ］［１，８］ナフチリジン酢酸誘導体および使用方法
CN114302875A (zh) 2019-05-16 2022-04-08 斯汀塞拉股份有限公司 氧代吖啶基乙酸衍生物及使用方法
EP3976831A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
JP2022534981A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在化シグネチャーおよび組み合わせ治療
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
GB201910304D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
GB201910305D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
WO2021018941A1 (en) * 2019-07-31 2021-02-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treating cancer
WO2021043961A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and chemotherapy
WO2021046293A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and tremelimumab
CA3171597A1 (en) 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
WO2021209357A1 (en) 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer involving anti-icos and anti-pd1 antibodies, optionally further involving anti-tim3 antibodies
AU2021256925A1 (en) 2020-04-14 2022-11-03 Ares Trading S.A. Combination treatment for cancer based upon an ICOS antibody and a PD-L1 antibody TGF-beta-receptor fusion protein
US20230151098A1 (en) * 2020-04-20 2023-05-18 Jounce Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for Vaccination and the Treatment of Infectious Diseases
GB202007099D0 (en) 2020-05-14 2020-07-01 Kymab Ltd Tumour biomarkers for immunotherapy
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
MX2023001962A (es) 2020-08-19 2023-04-26 Xencor Inc Composiciones anti-cd28.
IL300916A (en) 2020-08-31 2023-04-01 Bristol Myers Squibb Co Cell localization signature and immunotherapy
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
IL303648A (en) 2020-12-28 2023-08-01 Bristol Myers Squibb Co Antibody preparations and methods of using them
CA3196999A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Masano HUANG Methods of treating tumors
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
CA3219336A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
KR20240144422A (ko) 2022-03-15 2024-10-02 컴퓨젠 엘티디. 암 치료의 단독치료법 및 병용치료법에서 il-18bp 길항제 항체 및 이의 용도
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024030956A2 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 Mozart Therapeutics, Inc. Cd39-specific binding agents and methods of using the same
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
WO2024196952A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Tumor subtype assessment for cancer therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011041613A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
WO2014089113A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5559235A (en) 1991-10-29 1996-09-24 Glaxo Wellcome Inc. Water soluble camptothecin derivatives
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5342947A (en) 1992-10-09 1994-08-30 Glaxo Inc. Preparation of water soluble camptothecin derivatives
US5681835A (en) 1994-04-25 1997-10-28 Glaxo Wellcome Inc. Non-steroidal ligands for the estrogen receptor
US5491237A (en) 1994-05-03 1996-02-13 Glaxo Wellcome Inc. Intermediates in pharmaceutical camptothecin preparation
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
KR100259828B1 (ko) * 1995-09-11 2000-06-15 히라타 다다시 인체 인터루킨 5 수용체 알파-사슬에 대한 항체
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
US7259247B1 (en) 1997-09-23 2007-08-21 Bundersrespublik Deutschaland Letztvertreten Durch Den Direktor Des Robert-Koch-Institutes Anti-human T-cell costimulating polypeptide monoclonal antibodies
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
JP2003532370A (ja) 1998-10-07 2003-11-05 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規なＴｈ２特異的分子およびその使用方法
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
IL146954A0 (en) 1999-06-25 2002-08-14 Genentech Inc HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3597140B2 (ja) * 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP5004261B2 (ja) 2000-05-19 2012-08-22 コリクサ コーポレイション 単糖類及び二糖類に基づく化合物を用いた感染症及び他の疾患の予防的並びに治療的な処置
CZ299561B6 (cs) 2000-06-30 2008-09-03 Glaxo Group Limited Chinazolinaminový derivát a farmaceutický prostredek
AU8100101A (en) 2000-08-04 2002-02-18 Corixa Corp New immunoeffector compounds
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6374470B1 (en) 2000-10-06 2002-04-23 Milliken & Company Face plate for spun-like textured yarn
AU2002308267A1 (en) 2001-01-16 2002-10-03 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human icos v protein
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
US20050202442A1 (en) 2003-12-15 2005-09-15 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
AU2002357427A1 (en) 2001-12-04 2003-06-17 Tegenero Ag Peptide or protein containing a c'-d loop of the cd28 receptor family
US6911434B2 (en) 2002-02-04 2005-06-28 Corixa Corporation Prophylactic and therapeutic treatment of infectious and other diseases with immunoeffector compounds
US6525028B1 (en) 2002-02-04 2003-02-25 Corixa Corporation Immunoeffector compounds
US20040029226A1 (en) 2002-03-06 2004-02-12 John Alsobrook Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
IL164376A0 (en) 2002-04-03 2005-12-18 Applied Research Systems Ox4or binding agents, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
CA2489004C (en) 2002-06-13 2013-01-08 Crucell Holland B.V. Agonistic binding molecules to the human ox40 receptor
WO2004003544A1 (en) 2002-06-26 2004-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of demyelinating inflammatory disorders
JP4409430B2 (ja) 2002-07-03 2010-02-03 小野薬品工業株式会社 免疫賦活組成物
EP2322201A3 (en) 2002-10-29 2011-07-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
EP2314676A1 (en) 2002-11-26 2011-04-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
PL378879A1 (pl) 2002-12-30 2006-05-29 Amgen Inc. Terapia skojarzona z czynnikami kostymulującymi
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CN117534755A (zh) 2005-05-09 2024-02-09 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
KR101888321B1 (ko) 2005-07-01 2018-08-13 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
WO2007011041A1 (ja) 2005-07-22 2007-01-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え抗体組成物
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
EP1938104A2 (en) 2005-10-17 2008-07-02 Institute for Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
US8058402B2 (en) * 2006-08-28 2011-11-15 Kyowa Hakko Kirin Antagonistic human LIGHT-specific human monoclonal antibodies
US20080279851A1 (en) 2007-05-07 2008-11-13 Medlmmune, Llc Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
WO2009052431A2 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Seattle Genetics, Inc. Cd19 binding agents and uses thereof
BRPI0820875B1 (pt) 2007-12-14 2021-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Molécula de ligação isolada, anticorpo monoclonal humano, composição, molécula de ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
US9931386B2 (en) 2008-06-16 2018-04-03 Atsuo Ochi Recombinant multiple domain fusion protein mitogens and use thereof for inducing enhancement or repression of antigen-specific immunity
BRPI0921845A2 (pt) 2008-11-12 2019-09-17 Medimmune Llc formulação aquosa estéril estável, forma de dosagem unitária farmacêutica, seringa pré-carregada, e, métodos para tratar uma doença ou distúrbio, para tratar ou prevenir rejeição, para esgotar células t que expressam icos em um paciente humano, e para interromper arquitetura central germinal em um órgão linfóide secundário de um primata
WO2011020024A2 (en) 2009-08-13 2011-02-17 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
MX359551B (es) 2009-11-24 2018-10-02 Medimmune Ltd Agentes de union diana contra b7-h1.
BR112012013736A2 (pt) * 2009-12-07 2018-08-14 Univ Leland Stanford Junior processo para intesificação de terapia com anticorpos antitumor
EP2531216B1 (en) * 2010-02-04 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
TWI508273B (zh) 2010-03-19 2015-11-11 Xintec Inc 影像感測元件封裝構件及其製作方法
US20120121633A1 (en) 2010-07-16 2012-05-17 Sudhir Paul Hiv cd4 binding site based covalent immunogen compositions
WO2013028231A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
MX339964B (es) 2010-08-23 2016-06-17 Board Of Regents The Univ Of Texas System * Anticuerpos anti-ox40 y metodos para usarlos.
EP2691419B1 (en) 2011-03-31 2016-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos and uses thereof
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
EP2892928B1 (en) 2012-09-03 2018-05-30 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos for treating graft-versus-host disease
CN107892719B (zh) 2012-10-04 2022-01-14 达纳－法伯癌症研究所公司 人单克隆抗-pd-l1抗体和使用方法
JOP20200094A1 (ar) * 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
CN106999583A (zh) * 2014-11-17 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
MA41414A (fr) 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
WO2017025871A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies
WO2018025221A1 (en) * 2016-08-04 2018-02-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
CN111094353A (zh) * 2017-09-14 2020-05-01 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 用于癌症的组合治疗
US20210395367A1 (en) * 2018-10-22 2021-12-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing
US20210324081A1 (en) * 2018-10-22 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing
CA3171597A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
AU2021256925A1 (en) * 2020-04-14 2022-11-03 Ares Trading S.A. Combination treatment for cancer based upon an ICOS antibody and a PD-L1 antibody TGF-beta-receptor fusion protein
WO2021209357A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer involving anti-icos and anti-pd1 antibodies, optionally further involving anti-tim3 antibodies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011041613A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
WO2014089113A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia et al., "Heavily Isotype-Dependent Protective Activities of Human Antibodies against Vaccinia Virus Extracellular Virion Antigen B5", J Virol. 2009 Dec;83(23):12355-67. Epub 2009 Sep 30. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180002593A (ko) 2018-01-08
MA47323A (fr) 2019-11-27
US9738718B2 (en) 2017-08-22
US10351627B2 (en) 2019-07-16
JP7062704B2 (ja) 2022-05-17
JP6553197B2 (ja) 2019-07-31
US20180334503A1 (en) 2018-11-22
US20180030136A1 (en) 2018-02-01
CN107667117A (zh) 2018-02-06
US20200140551A1 (en) 2020-05-07
US20170174767A1 (en) 2017-06-22
JP2020079252A (ja) 2020-05-28
PE20180120A1 (es) 2018-01-18
CR20170351A (es) 2018-01-22
UA124613C2 (uk) 2021-10-20
JP2019167355A (ja) 2019-10-03
ES2913871T3 (es) 2022-06-06
JO3745B1 (ar) 2021-01-31
AU2016210867B2 (en) 2018-11-08
CN107667117B (zh) 2021-12-28
EA201791706A1 (ru) 2018-04-30
MA41414A (fr) 2017-12-05
JP6653782B2 (ja) 2020-02-26
KR102315160B1 (ko) 2021-10-19
CO2017007665A2 (es) 2017-10-20
AU2020294301A1 (en) 2021-02-25
IL253508B (en) 2021-12-01
MX2017009758A (es) 2018-03-07
US11130811B2 (en) 2021-09-28
US20170313777A1 (en) 2017-11-02
IL253508A0 (en) 2017-09-28
CL2017001921A1 (es) 2018-03-16
AU2019200751B2 (en) 2020-12-03
PH12017501347A1 (en) 2017-12-11
JP2018505177A (ja) 2018-02-22
EA036335B1 (ru) 2020-10-28
ZA201704818B (en) 2019-01-30
US9771424B2 (en) 2017-09-26
MY185845A (en) 2021-06-13
CA2974910A1 (en) 2016-08-04
US20220064299A1 (en) 2022-03-03
US20160215059A1 (en) 2016-07-28
US20200123257A1 (en) 2020-04-23
TW201702267A (zh) 2017-01-16
AU2019200751A1 (en) 2019-02-21
WO2016120789A1 (en) 2016-08-04
SG11201705829TA (en) 2017-08-30
AU2016210867A1 (en) 2017-08-03
EP3572432A1 (en) 2019-11-27
PH12017501347B1 (en) 2017-12-11
MA47386A (fr) 2019-12-04
BR112017016336A2 (pt) 2018-03-27
US20160362494A1 (en) 2016-12-15
EP3250603B1 (en) 2022-03-30
DOP2017000171A (es) 2017-10-31
EP3575324A1 (en) 2019-12-04
UY36539A (es) 2016-08-31
EP3250603A1 (en) 2017-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI717332B (zh) Ｉｃｏｓ結合蛋白
US20210155903A1 (en) Combination Therapy
US11649289B2 (en) Anti-ICOS and anti-PD-1 antibody combination therapy
JP2022539178A (ja) Ｉｌ１ｒａｐ結合タンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees