JP2014500249A - 脱毛症の治療方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、JAK/STAT阻害剤を投与することにより被験体における脱毛症を治療するための方法を提供する。
【選択図】 図１

Description

本出願は、2010年11月2日に出願された米国特許仮出願第61/409,509号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
本明細書で引用される全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本出願に組み入れられる。
本特許の開示は、著作権保護を受ける材料を含む。著作権者は、米国特許商標庁の特許出願または記録に現れるため、特許文献または特許開示の誰かによる複製に異議を唱えるものではないが、別の面では任意かつ全ての著作権を有する。
(特許に係る政府の権利)
本発明は、National Institutes of Health/National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseasesにより授与されたRO1 AR56016の下での政府の支援で為されたものである。米国政府は、本発明に対する特定の権利を有する。
(技術分野)
本発明は、脱毛症の治療方法に関する。
円形脱毛症(AA)は、毛包の免疫特権の崩壊およびその後の自己免疫破壊に起因する脱毛をもたらす、最も高頻度の自己免疫疾患の1つである。AAは、頭皮および他の場所での脱毛をもたらす皮膚疾患である。いくつかの重篤な事例では、それは頭部または身体上の毛髪の完全な喪失にまで進行し得る。円形脱毛症は自己免疫によって引き起こされると考えられるが、遺伝子レベルでの診断および治療はほとんど報告されていない。AAの遺伝的基礎はほとんど不明である。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症(抜け毛障害)を治療する方法であって、サイトカインシグナリングに関与するタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の阻害剤を被験体に投与することを含む、前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤はJak1および/またはJak2阻害剤である。一実施形態においては、阻害剤は、Stat1および/またはStat2阻害剤である。さらなる実施形態においては、阻害剤は、INCB 018424である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が、阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Jak1もしくはJak2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Jak1もしくはJak2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。別の実施形態においては、阻害剤は、Stat1もしくはStat2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Stat1もしくはStat2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。一実施形態においては、小分子は、AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、またはCEP-701である。別の実施形態においては、小分子は、WP-1034(Faderlら、Anticancer Res. 2005 May-Jun; 25(3B):1841-50)、フルダラビン(Fludara、Berlex、CA)、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、またはハイパーフォリンである。別の実施形態においては、siRNAは、配列番号2、4、6または8を含むヒト核酸配列に対するものである。いくつかの実施形態においては、Jak1遺伝子に対するsiRNAは、表11に列挙される配列のいずれか1つである。他の実施形態においては、Stat1遺伝子に対するsiRNAは、表12に列挙される配列のいずれか1つである。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、サイトカインシグナリングに関与するタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の阻害剤の有効量を被験体に投与することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤はJak/Stat阻害剤である。他の実施形態においては、阻害剤はINCB018424である。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた、毛髪増殖を阻害することができ、かくして、それを多毛症などの毛髪増殖障害の治療のために用いることができる。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Jak1もしくはJak2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Jak1もしくはJak2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。別の実施形態においては、阻害剤は、Stat1もしくはStat2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Stat1もしくはStat2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。一実施形態においては、小分子は、AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、またはCEP-701である。別の実施形態においては、小分子は、WP-1034(Faderlら、Anticancer Res. 2005 May-Jun; 25(3B):1841-50)、フルダラビン(Fludara、Berlex、CA)、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、またはハイパーフォリンである。別の実施形態においては、siRNAは、配列番号2、4、6または8を含むヒト核酸配列に対するものである。いくつかの実施形態においては、Jak1遺伝子に対するsiRNAは、表11に列挙される配列のいずれか1つである。他の実施形態においては、Stat1遺伝子に対するsiRNAは、表12に列挙される配列のいずれか1つである。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Jak1阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は配列番号1に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Jak1タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Jak1タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。一実施形態においては、小分子は、AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、またはCEP-701である。別の実施形態においては、siRNAは配列番号2を含むヒト核酸配列に対するものである。いくつかの実施形態においては、Jak1遺伝子に対するsiRNAは、表11に列挙される配列のいずれか1つである。
本発明の別の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のJak1阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号1を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた、毛髪増殖を阻害することができ、かくして、それを多毛症などの毛髪増殖障害の治療のために用いることができる。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Jak1タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Jak1タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。一実施形態においては、小分子は、AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、またはCEP-701である。別の実施形態においては、siRNAは配列番号2を含むヒト核酸配列に対するものである。いくつかの実施形態においては、Jak1遺伝子に対するsiRNAは、表11に列挙される配列のいずれか1つである。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Jak2阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は配列番号3に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Jak2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Jak2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。一実施形態においては、小分子は、AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、またはCEP-701である。別の実施形態においては、siRNAは配列番号4を含むヒト核酸配列に対するものである。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のJak2阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号3を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた、毛髪増殖を阻害することができ、かくして、それを多毛症などの毛髪増殖障害の治療のために用いることができる。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Jak2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Jak2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。一実施形態においては、小分子は、AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、またはCEP-701である。別の実施形態においては、siRNAは配列番号4を含むヒト核酸配列に対するものである。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Stat1阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は配列番号5に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Stat1タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Stat1タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。別の実施形態においては、小分子は、WP-1034(Faderlら、Anticancer Res. 2005 May-Jun; 25(3B):1841-50)、フルダラビン(Fludara、Berlex、CA)、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、またはハイパーフォリンである。別の実施形態においては、siRNAは配列番号6を含むヒト核酸配列に対するものである。他の実施形態においては、Stat1遺伝子に対するsiRNAは、表12に列挙される配列のいずれか1つである。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のStat1阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号5を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた、毛髪増殖を阻害することができ、かくして、それを多毛症などの毛髪増殖障害の治療のために用いることができる。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Stat1タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Stat1タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。別の実施形態においては、小分子は、WP-1034(Faderlら、Anticancer Res. 2005 May-Jun; 25(3B):1841-50)、フルダラビン(Fludara、Berlex、CA)、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、またはハイパーフォリンである。別の実施形態においては、siRNAは配列番号6を含むヒト核酸配列に対するものである。他の実施形態においては、Stat1遺伝子に対するsiRNAは、表12に列挙される配列のいずれか1つである。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Stat2阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は配列番号7に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Stat2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Stat2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。別の実施形態においては、小分子は、WP-1034(Faderlら、Anticancer Res. 2005 May-Jun; 25(3B):1841-50)、フルダラビン(Fludara、Berlex、CA)、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、またはハイパーフォリンである。別の実施形態においては、siRNAは配列番号8を含むヒト核酸配列に対するものである。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のStat2阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号7を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた、毛髪増殖を阻害することができ、かくして、それを多毛症などの毛髪増殖障害の治療のために用いることができる。一実施形態においては、前記方法はさらに、投与された阻害剤が阻害剤を用いる治療前の被験体の毛髪増殖と比較して、脱毛症に罹患した被験体における毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)を含む。一実施形態においては、阻害剤は、Stat2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Stat2タンパク質をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である。別の実施形態においては、小分子は、WP-1034(Faderlら、Anticancer Res. 2005 May-Jun; 25(3B):1841-50)、フルダラビン(Fludara、Berlex、CA)、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、またはハイパーフォリンである。別の実施形態においては、siRNAは配列番号8を含むヒト核酸配列に対するものである。
さらなる実施形態において、投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈内注射；輸液；経口、経鼻もしくは局所送達；またはその組合せを含む。いくつかの実施形態においては、投与は毎日、毎週、週に2回、毎月、月に2回、または毎年行う。
AAの臨床徴候の写真画像を示す図である。上パネル(図1A〜B)では、患者は多発性円形脱毛症を有する。図1Bにおいては、患者は再増殖期にある。全身性脱毛症を有する患者については、体毛および頭髪が完全に欠如しているが(図1C)、完全脱毛症を有する患者は頭髪のみを欠如している(図1D)。図1Dにおいては、毛髪の再増殖が頭頂部領域で観察されるが、後頭部または側頭部領域では再増殖が明らかではない。 円形脱毛症(AA)の原因となる炎症応答を示す図である。 円形脱毛症(AA)の原因となる炎症応答を示す図である。 AAに罹患したC3Hマウス(上)および対照マウス(下)から単離されたリンパ節および脾臓の写真である。 CD8およびTh1細胞を担持するNKG2DがマウスAA皮膚リンパ節において増殖されるというFACS分析の結果を示す図である。 対照マウスと比較したAAに罹患したC3Hマウスにおけるサイトカイン産生細胞数の6倍の増加を示す棒グラフである。 C3Hマウスにおける脱毛皮膚のRNAの特徴を示す図である。ヒートマップは、上位20個の未調節遺伝子のうちの16個がインターフェロン応答遺伝子であることを示す。上位20個の上方調節される遺伝子のうちの16個がインターフェロン応答性遺伝子である(I型IFNではなくIFN-γが上昇する)。 AA皮膚の転写プロフィールを示す図である。作製された一覧から拾った単一遺伝子のqPCRは、3回の実験にわたる平均の倍数変化を示す。 AAにおける標的を示す図である。 インターフェロンγ経路を示す図である。 2つの遺伝子マッピング手法を示す図である。図8Aは、家族における連鎖分析を示す。図8Bは、集団コホートにおける関連分析を示す。 図８Ａの続きである。 AAにおけるゲノムワイド関連研究(GWAS)を示す図である。 危険シグナル：対照個体(図10A)とAA患者(図10B)の両方における毛包中でのULBP3発現を示す図である。 AAが「ハチの群れ」：NKG2DLにより誘引されたキラーCD8 T細胞により引き起こされることを示す図である。図11Aは、AAにおける「プレ-2010」ハチの群れを示す。図11Bは、「2012」ハチの同定を示す((m)CD8の染色；(n)NKG2Dの染色；ならびに(o)NKG2DおよびCD8の同時局在化)。 AAの原因となる炎症応答を示す図である。 INCB18424-202：Th1およびTh17転写マーカーならびにケラチン16が局所INCB18424、JAK1およびJAK2阻害剤を用いる治療により減少することを示す図である。 INCB18424-203に関する重要総病変スコア(Key Total Lesion Score)の結果を示す図である。その結果は、全用量群について総病変スコアがビヒクルよりも2倍以上低下し、多重度の制御後に有意性を達成することを示す。 INCB018424を用いる治療が表皮肥厚および皮膚炎症を顕著に減少させることを示す図である。病的皮膚菲薄化は観察されない。 図１５Ａの続きである。 AA発症を阻害するための前臨床戦略がCD8 T細胞の誘導およびエフェクター機能の阻害を目的とするものであり、INF-γシグナルの遮断を含むことを示す図である。 CD8+NKG2D+T細胞がマウスとヒトの両方においてAA毛包に浸潤することを示す図である。上パネル：ヒト円形脱毛症(Pethukovaら、2010, Nature, 466(7302):113-7)；下パネル：C3H/HeJ円形脱毛症。 脱毛症のC3HマウスCD8αβ+NKG2D+T細胞中のCD8+NKG2D+T細胞が脱毛症のC3Hマウスの皮膚、リンパ節および血液中で大量に増殖することを示す図である(NKG2D+γδT細胞は罹患した皮膚と罹患していない皮膚の両方に存在する)。 脱毛症のC3Hマウス中のCD8+NKG2D+T細胞を示す図である。ゲート化LN CD8α+NKG2D+集団の免疫表現型は、それらが均一にCD8αβ+CD44+CXCR3+DX5+NKG2A/C/E+IFN-γ産生記憶T細胞であることを示す。 皮膚およびLNにおけるC3H T細胞のスペクトル型分析を示す図である：全皮膚および選別されたCD8+NKG2D+LN T細胞により同様のTCRレパートリーが共有され、これらのものは関連エフェクターと同定される。 IFN-γ産生CD8 T細胞がヒトおよびマウスのAAで優位であることを示す図である。図21A：ヒト：AA皮膚生検からのT細胞クロールアウト(crawl-out)から得られたT細胞は、均一にCD8+NKG2D+であり、PMA/ロノマイシン刺激の際にINF-γを産生する。図21B：マウス：脱毛症マウスからのC3H/HeJ刺激リンパ節細胞は、罹患していないマウスよりも3倍多いIFN-γ産生CD8およびCD4 T細胞を含有する。 図２１Ａの続きである。 I型およびII型IFNがC3HマウスのAA皮膚において上方調節されることを示す図である：インターフェロンのシグナリングおよび応答のqPCRアレイ(Stellarray Lonza、カタログ番号00189608)を用いる、3匹の罹患および3匹の非罹患C3H/HeJマウスの間でのインターフェロン遺伝子の発現の倍数変化(18Sに対して正規化)。 ヒトAAにおける血清ケモカインおよびサイトカインの上昇を示すグラフである。インターフェロン-γおよびIFN誘導性ケモカイン(例えば、IP-10/CXCL10)はヒトAAの血清中で上昇し、いくつかの事例では疾患の重篤度と相関する、すなわち、斑状脱毛症(AAP)と全身性脱毛症(AU)。 ヒトAA被験者の血清中でのIL-13の上昇を示すルミネックス分析(luminex analysis)を示す図であり、いくつかの事例では疾患の重篤度と相関する、すなわち、斑状脱毛症(AAP)と全身性脱毛症(AU)。 30分のコラゲナーゼ消化後に2cmのパッチの脱毛症皮膚により0.5cmから遊離したC3H皮膚細胞の全集団を染色するために1本のチューブ中で以下のmAbを用いてLSRII上で集めたフローサイトメトリーのデータを示す図である：(MHC II、CD11b、CD11c、CD19、120G8、CD3、CD4、CD8、DX5、NKG2D)。γδNKG2D陽性細胞およびCD8+DX5+NKG2D+集団が同定される。これらの細胞はまた、CD3+でもあり、γδCD3発現はCD8+NK+T細胞中で認められるものよりも100倍高い。95%を超える全CD3陽性細胞が計数された。 4人のAA被験者からのPBMCの評価を示すグラフである。NKG2D発現は、リンパ球のサブセットで増加した。 C3H-HeJマウスにおけるスペクトル型を示す図である。RNAを皮膚生検から、ならびにC3H-HeJマウスの皮膚リンパ節に由来する選別されたNKG2D-およびNKG2D+CD8+ T細胞から単離した。スペクトル型分析は、いくつかのVβファミリーにおいてCDR3長偏向を示す。歪んだVβファミリーのいくつかは皮膚とNKG2D+リンパ節CD8+ T細胞集団(例えば、Vβ2、Vβ5.2、Vβ20)との間で共有されるが、さらなるVβファミリーは皮膚において偏向している(CD4+ T細胞集団を反映している)。 対照またはAAに罹患した個体から得られたヒト頭皮を用いて、皮膚および毛包内の個々の細胞集団の一次培養物を確立することができることを示す図である。 パンチ皮膚生検から得られた培養ヒト真皮をフローサイトメトリー分析のための原料として用いるT細胞「クロールアウト」アッセイを示す図である。6mm皮膚生検の三等分した皮膚パンチ生検を、脱毛症の病変および非病変領域から取得する。脂肪を除去した後、微細に刻んだ皮膚をCellfoamマトリックス中で穏やかに圧迫した後、皮膚側を上にして、IL-2(6ng/ml)およびIL-15(10ng/ml)を含む2mlのSkin T培地を含有する24穴プレートのウェルに移す。3日後にマトリックスを除去した後のT細胞クロールアウトを図29Aに示す。これらの細胞のフローサイトメトリー(図29B〜C)およびスペクトル型(図29D)も示す。 図２９Ａの続きである。 図２９Ｂの続きである。 ヒト末梢血単核細胞(PBMC)(上パネル)またはマウス脾臓細胞を高用量のIL-2(1000/ml)中で培養して、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞を生成したことを示す図である。CFSE緑色蛍光標識されたLAK細胞を、ヒト毛包器官培養物(上パネル)または非病変領域(下の左2つ)または病変に由来するマウス毛包培養物(下パネル)と共にインキュベートした。 C3H-HeJマウスにおける罹患していない、および罹患したAA皮膚の免疫組織化学(IHC)染色を示す図である。
本発明は、Jak1およびJak2、Stat1およびStat2などのJak/Stat経路の阻害剤を用いて脱毛症(例えば、円形脱毛症(AA)、一般的な自己免疫形態の脱毛)を治療する方法を提供する。AAにおける臨床研究は、この遺伝子が関与する、そのより厳重に調査された「シスター」自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウマチ(RA)、1型糖尿病(T1D)、多発性硬化症(MS))の後塵を拝してきた。本発明は、AAおよび関連する疾患におけるこの経路の臨床的関連を知らせることができる、AAにおいては以前に試験されていない治療を提供する。
外皮および有毛細胞の概説
外皮(または皮膚)は、身体の最大の器官であり、身体の外表面を覆う高度に複雑な器官である。それは様々な身体の開口部で、消化管および他の管の粘膜と融合する。外皮は、体温および水分損失を調節することによる一定の内部環境の維持；汗腺による排出などのいくつかの必須機能を実行するが、より深部の組織に対する物理的、化学的および生物学的因子の作用に対する保護障壁として主に作用する。皮膚は伸縮性があり、足裏、手のひら、および耳などのいくつかの領域を除いて、下層組織に緩く結合している。また、それはまぶたでは厚さ0.5mm(0.02インチ)(薄い皮膚)から、手のひらおよび足裏では4mm(0.17インチ)以上(厚い皮膚)まで変化する(Ross MH, Histology: A text and atlas、第3版、Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HGら、Wheater's Functional Histology、第3版、Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9)。
皮膚は2つの層：a)表皮およびb)真皮から構成される。表皮は外側の層であり、比較的薄い(0.1mm)。それは数個の細胞の厚さであり、5層：基底層、有棘層、顆粒層、透明層(薄い皮膚に限られる)、および角質層から構成される。最も外側の表皮層(角質層)は、表面から絶えず脱落し、基底層と呼ばれる単一の細胞基底層により下から置き換わる死んだ細胞からなる。表皮は、主にケラチノサイトから構成され、これは細胞集団の95%以上を占める。基底層(表皮基底層)のケラチノサイトは絶えず分裂しており、続いて娘細胞が上方および外側に向かって移動し、そこでそれらは分化期間を経て、最終的には表面から脱落する。表皮の残りの細胞集団は、ランゲルハンス細胞およびメラノサイトなどの樹状細胞を含む。表皮は本質的には、ケラチノサイトの基底層の下にあるコラーゲンおよび他のタンパク質の層を除いて、細胞外マトリックスをほとんど含有しない、細胞性および非血管性のものである(Ross MH, Histology: A text and atlas、第3版、Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HGら、Wheater's Functional Histology、第3版、Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9)。
真皮は、皮膚の内部層であり、コラーゲン細胞外物質、血管、神経、および伸縮性線維のネットワークから構成される。真皮内には、関連する皮脂腺(毛包脂腺単位として集合的に知られる)および汗腺を有する毛包がある。表皮と真皮との間の境界面は、薄い皮膚内を除いて、非常に不規則であり、平坦ではない。表皮-真皮境界面に沿った基底表皮細胞の下に、特殊化された細胞外マトリックスが異なる構造中に組織化され、これは基底膜と呼ばれる(Ross MH, Histology: A text and atlas、第3版、Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HGら、Wheater's Functional Histology、第3版、Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9)。
哺乳動物の毛髪繊維は、角質化された細胞から構成され、毛包から発達する。毛包は、表皮の下方への増殖から誘導されるペグであり、皮膚表面のすぐ下にある。毛包の末梢部は、外部の皮膚表皮と直接続いている。小さい構造物であるが、毛包は、同心シリーズに配置された明確に異なる層の高度に組織化された系を含む。活発な毛包は真皮、皮下組織(結合組織の緩い層である)を通して下に、ならびに脂質または脂肪層に伸長する(Ross MH, Histology: A text and atlas、第3版、Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HGら、Wheater's Functional Histology、第3版、Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9)。
活発な毛包の基部には、毛球がある。毛球は、表皮マトリックスとして知られる表皮細胞の反転したカップ中に含有される、真皮乳頭として知られる皮膚細胞の集団からなる。毛包の型に関係なく、この表皮マトリックスのまさに基底部にある胚芽表皮細胞は、いくつかの支持表皮層と共に、毛髪繊維を産生する。最下部の真皮鞘は乳頭基底柄と接触しており、そこから鞘が組織の薄い覆いとして全ての毛髪マトリックス表皮層の周囲に外側に曲がる。次いで、真皮鞘の最下部は毛包の長さにわたってスリーブまたは管として続く(Ross MH, Histology: A text and atlas、第3版、Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HGら、Wheater's Functional Histology、第3版、Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9)。
毛包および羽嚢などの皮膚付属器官の発達は、皮膚の2つの層である表皮と真皮との相互作用に依存する。胚発生においては、これらの2つの層の間での上方の連続的交換は、複雑な一連の形態学的プロセスを支援し、成熟毛包構造の形成をもたらす。しかしながら、一般的な真皮および表皮細胞とは対照的に、特定の毛包細胞集団は、成熟後に、その胚型相互作用、誘導、および生合成挙動を保持する。これらの特性は、循環生成毛包の非常に動的な性質から誘導することができ、組織再モデリングの反復には、胚発生にとって不可欠であり、他の形態の組織再構築において望ましい高レベルの真皮-表皮相互作用コミュニケーションを必要とする。
毛髪繊維は非常に速い速度で活発な毛包の基底部で生成される。例えば、毛包は、ヒトの頭皮では1日0.4mmの速度で、およびラットの鼻毛もしくはヒゲでは1日最大1.5mmの速度で毛髪繊維を生成し、これは毛包表皮中での細胞増殖が成体組織において最も速い順位を占めることを意味する(Malkinson FDおよびJT Kearn, Int J Dermatol 1978, 17:536-551)。毛髪は周期的に増殖する。毛髪成長期は増殖期であり、最大90%の毛包が成長期にあると言われている；毛髪退行期は、退縮期または退行期であり、毛包の約1〜2%を占める；および毛髪休止期は、周期の休止期または休眠期であり、毛包の約10〜14%を占める。周期の長さは、身体の異なる部分で変化する。
毛包の形成および循環は、阻害シグナルと刺激シグナルとの平衡によって制御される。シグナリングの合図は、TGFβ-BMPファミリーのメンバーである増殖因子によって促進される。TGFβ-BMPファミリーのメンバーの有名なアンタゴニストは、フォリスタチンである。フォリスタチンは、様々なBMP(BMP-2、-4、-7および-11など)およびアクチビンに結合することによって前記タンパク質の作用を阻害する分泌タンパク質であり、毛包の発達において役割を果たしているらしい(Nakamura Mら、FASEB J, 2003, 17(3):497-9; Patel K Intl J Biochem Cell Bio, 1998, 30:1087-93; Ueno Nら、PNAS, 1987, 84:8282-86; Nakamura Tら、Nature, 1990, 247:836-8; Iemura Sら、PNAS, 1998, 77:649-52; Fainsod Aら、Mech Dev, 1997, 63:39-50; Gamer LWら、Dev Biol, 1999, 208:222-32)。
局所真皮-表皮相互作用が活発な繊維増殖を駆動する、深部に埋まった終末小体は、真皮乳頭(DP)と呼ばれる間葉細胞(mesencgymal cell)の塊を含む毛包のシグナリング中心である。この同じ領域は、成長期と退行期の間の毛髪繊維または付属器官の正確な変化に関与する組織再モデリングおよび発達変化の中心でもある。DPは、これらの活性の中心的存在であり、原始的な胚芽表皮細胞源からの毛髪繊維形成を特徴付ける分化の複雑なプログラムを指揮すると考えられる(Oliver RF, J Soc Cosmet Chem, 1971, 22:741-755; Oliver RFおよびCA Jahoda, Biology of Wool and Hair (Rogerら(編)), 1971, Cambridge University Press:51-67; Reynolds AJおよびCA Jahoda, Development, 1992, 115:587-593; Reynolds AJら、J Invest Dermatol, 1993, 101:634-38)。
最下部の真皮鞘(DS)は乳頭の基底柄の下に生じ、そこからそれは外側および上側に曲がる。次いで、この真皮鞘は、薄い組織層として表皮毛髪マトリックスの層を外部から包み込み、毛包の長さにわたって上側に続く。表皮由来外毛根鞘(ORS)もまた、毛包の長さにわたって続き、これは2つの層の間の真皮鞘のすぐ内側にあり、ガラス膜と呼ばれる特殊化された基底膜を形成する。外毛根鞘は、ほとんど同程度に毛包下側中の表皮単層を構成するが、それが表面に近づくにつれてますます厚くなる。内毛根鞘(IRS)は、発達中の毛幹のための鋳型を形成する。それは3つの部分を含む：Henley層、Huxley層、およびキューティクルを含み、キューティクルは毛幹に接触する最内部である。IRSキューティクル層は、単一細胞の厚さであり、毛髪繊維に隣接する。それは毛髪繊維のキューティクル層と密接に互いにかみ合う。Huxley層は最大4つの細胞の層を含み得る。IRS Henley層は、ORS層に隣接して走る単一細胞層である(Ross MH, Histology: A text and atlas、第3版、Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HGら、Wheater's Functional Histology、第3版、Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9)。
円形脱毛症
円形脱毛症(AA)は、あらゆる民族群にわたる男性および女性を含む米国だけでも約460万人が罹患している最も高頻度に見られる自己免疫疾患の1つであり、その生涯リスクは1.7%である(1)。AAにおいては、毛包に対する自己免疫が生じ、パッチとして開始し得る非瘢痕性の脱毛をもたらし、癒着および進行して頭皮全体に広がる(完全脱毛症、AT)か、または最終的には全身に広がる(全身性脱毛症、AU)(図1)。AAは、それが頭皮にわたってゆっくりと広がる際の曲がりくねった経路の脱毛に起因して、「ヘビ」を意味する用語「蛇行状脱毛症(ophiasis)」を用いて、紀元30年にCornelius Celsusによって初めて記載された。Hippocratesは初めてギリシャ語「alopekia」(キツネ疥癬)を使用し、現代用語「円形脱毛症(alopecia areata)」は、Sauvageによって、Lyons、Franceで1760年に発行された彼のNosologica Medicaにおいて初めて使用された。
奇妙なことに、AAは毛髪サイクルの成長期(増殖期)に有色素毛包に選択的に作用し、毛髪がAAのパッチ中で再増殖する時、それは白色または無色に戻って増殖することが多い。従って、「毛髪の突然の白化」の現象は急速に開始したAAのせいであり、深い悲しみ、ストレスまたは恐怖の時に数人の著名な個人を襲ったとして歴史を通じて文書化されている(2)。例としてはShahjahanが挙げられ、彼は1631年に彼の妻が死んだ際に毛髪の急速な白化を経験し、彼の悲しみのうちに彼女に敬意を表してTaj Mahalを建築した。Sir Thomas Moreは、Utopiaの著者であり、1535年の彼の処刑の前夜に、「顎髭と毛髪が両方とも白く」なったと言われている。毛髪の突然の白化は、有色素毛包に対する急性の攻撃の結果生じ、白髪を無傷のまま残すと考えられる。
AAのいくつかの臨床的態様は、依然として説明されていないが、発症の理解に向かう重要な手掛かりを保持することはできる。AAは毛包の基部の周囲の毛髪のみを攻撃し、そこはリンパ球の高密度の塊によって囲まれており、組織学上、病原性の「ハチの群れ」の状況をもたらす。これらの観察に基づいて、有色素の成長期毛包中でシグナルが放出され、毛包の下側末端に対する急性または慢性の免疫応答を誘発し、毛髪サイクルの動揺、急性毛髪脱落、毛幹異常および毛髪破壊をもたらす。毛包におけるこれらの劇的な動揺にも拘らず、永続的な器官破壊はなく、免疫特権を修復することができる場合には毛髪再増殖の可能性が残る。
歴史を通じて、AAは、ストレスもしくは不安により、または感染性因子もしくはさらにはホルモン機能障害の結果としてもたらされる神経疾患であると考えられてきたこともあった。AAの基礎として遺伝的に決定された自己免疫機構の概念は、複数の系列の証拠から20世紀の間に出現した。AAの毛包は、活性化Th、TcおよびNK細胞による免疫浸潤を示し(3、4)、抑制的(Th2)サイトカイン応答から自己免疫性(Th1)サイトカイン応答へのシフトがある。ドナーT細胞の導入は毛包またはヒトメラノーマホモジェネートと同時に培養した場合にのみ脱毛を引き起こすため(5、6)、AA患者の頭皮の免疫欠損SCIDマウスへの導入を含むAAのヒト化モデルは、この疾患の自己免疫的性質を示す。免疫寛容を維持するのに役立つ調節T細胞がより少ない数でAA組織中に観察され(7)、これらの細胞のC3H/HeJマウスへの導入はAAに対する耐性を誘導する(8)。AAは専らT細胞媒介性疾患として長く考えられてきたが、近年では、疾患のさらなる機構が前提とされている。毛包は、免疫細胞輸送を阻害するための細胞外マトリックス障壁の存在、抗原提示細胞の欠如、ならびに免疫抑制因子の局所産生およびMHCクラスI発現レベルの低下を介するNK細胞活性の阻害を特徴とする、体内の選ばれたいくつかの免疫特権部位の1つと定義される(9)。かくして、「免疫特権の崩壊」の概念は、AAが生じ得る機構の一部としても想起されている。AAの遺伝的基礎に関する支持が、一等親血縁者(10、11)、双子研究(12)において、および最も最近では、本発明者らの家族に基づく連鎖研究(13)の結果に由来する観察された遺伝性を含む、複数の系列の証拠から来ている。
脱毛症の治療
本発明は、公知の治療剤、例えば、JAK/STATタンパク質Jak1、Jak2、Stat1またはStat2などの、サイトカインシグナリングに関与するタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の阻害剤(例えば、INCB018424; Incyte)を、脱毛症の治療のために用いることができるという発見を提供する。脱毛症の非限定例としては、アンドロゲン性脱毛症、円形脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、完全脱毛症、および全身性脱毛症が挙げられる。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、サイトカインシグナリングに関与するタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は、Jak/Stat阻害剤である。さらなる実施形態においては、阻害剤は、INCB 018424である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、サイトカインシグナリングに関与するタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の阻害剤の有効量を被験体に投与することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、Jak/Stat阻害剤である。他の実施形態においては、阻害剤は、INCB 018424である。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた毛髪増殖を阻害することができ、かくして、多毛症などの毛髪増殖障害の治療に用いることができる。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Jak1阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号1に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のJak1阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号1を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた毛髪増殖を阻害することができ、かくして、多毛症などの毛髪増殖障害の治療に用いることができる。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Jak2阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号3に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のJak2阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号3を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた毛髪増殖を阻害することができ、かくして、多毛症などの毛髪増殖障害の治療に用いることができる。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Stat1阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号5に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のSta1阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号5を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた毛髪増殖を阻害することができ、かくして、多毛症などの毛髪増殖障害の治療に用いることができる。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Stat2阻害剤を被験体に投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号7に対する抗体または抗体断片である。別の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。
本発明の態様は、被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、有効量のStat2阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御することを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、阻害剤は、配列番号7を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、被験体は脱毛症に罹患している。他の実施形態においては、脱毛症は、アンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む。いくつかの実施形態においては、いくつかの実施形態においては、調節化合物はまた毛髪増殖を阻害することができ、かくして、多毛症などの毛髪増殖障害の治療に用いることができる。
DNAおよびアミノ酸の操作方法ならびにその精製
本発明は、当業者には利用可能な従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を利用する。そのような技術は当業者には周知であり、文献で完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(1982):「DNA Cloning: A Practical Approach」、Volumes I and II (D. N. Glover(編)、1985); 「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait(編)、1984);「Nucleic Acid Hybridization」(B. D. Hames & S. J. Higgins(編)、1985); 「Transcription and Translation」(B. D. Hames & S. J. Higgins(編)、1984);「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney(編)、1986); 「Immobilized Cells and Enzymes」(IRL Press, 1986): B. Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」(1984)、およびSambrookら、「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」(1989)を参照されたい。
当業者であれば、いくつかの方法でタンパク質を取得することができ、限定されるものではないが、生化学的手段によるタンパク質の単離または遺伝子操作方法による目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現などが挙げられる。
タンパク質は、核酸(例えば、ゲノムDNA、相補的DNA(cDNA)、合成DNA、ならびに任意の形態の対応するRNAなど)によってコードされる。例えば、それは遺伝子の組換え核酸によってコードされ得る。本発明のタンパク質は様々な起源から取得することができ、当業界で公知の様々な技術に従って製造することができる。例えば、タンパク質をコードする核酸は、DNAライブラリーをスクリーニングすることにより、または天然起源からの増幅により取得することができる。タンパク質は、断片またはその一部であってもよい。タンパク質をコードする核酸を、組換えDNA技術により製造することができ、そのような組換え核酸は従来の技術、例えば、化学的合成、遺伝子操作、酵素的技術、またはその組合せによって調製することができる。例えば、Jak1タンパク質は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドである。Jak1ポリペプチドの例は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。Jak2タンパク質は、配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドである。Jak2ポリペプチドの例は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する。例えば、Stat1タンパク質は、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドである。Stat1ポリペプチドの例は、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有する。Stat2タンパク質は、配列番号8に示されるヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドである。Stat2ポリペプチドの例は、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有する。
ヒトJak1のポリペプチド配列は、配列番号1に記載される。ヒトJak1のヌクレオチド配列は、配列番号2に示される。Jak1に関する配列情報は、GenBank受託番号NP_002218(タンパク質に関する)およびNM_002227.2(核酸に関する)により公共データベースでアクセスできる。
配列番号1は、Jak1に対応するヒト野生型アミノ酸配列である(残基1〜1154)。
Figure 2014500249
配列番号2は、Jak1に対応するヒト野生型ヌクレオチド配列(ヌクレオチド1〜5053)であり、下線付きの太字の「ATG」はオープンリーディングフレームの開始を示す。
Figure 2014500249
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ヒトJak2のポリペプチド配列は、配列番号3に記載される。ヒトJak2のヌクレオチド配列は、配列番号4に示される。Jak2に関する配列情報は、GenBank受託番号NP_004963(タンパク質に関する)およびNM_004972.3(核酸に関する)により公共データベースでアクセスできる。
配列番号3は、Jak2に対応するヒト野生型アミノ酸配列である(残基1〜1132)。
Figure 2014500249
配列番号4は、Jak2に対応するヒト野生型ヌクレオチド配列(ヌクレオチド1〜5285)であり、下線付きの太字の「ATG」はオープンリーディングフレームの開始を示す。
Figure 2014500249
Figure 2014500249
ヒトStat1のポリペプチド配列は、配列番号5に記載される。ヒトStat1のヌクレオチド配列は、配列番号6に示される。Stat1に関する配列情報は、GenBank受託番号ADA59516(タンパク質に関する)およびGU211347.1(核酸に関する)により公共データベースでアクセスできる。
配列番号5は、Stat1に対応するヒト野生型アミノ酸配列である(残基1〜750)。
Figure 2014500249
配列番号6は、Stat1に対応するヒト野生型ヌクレオチド配列(ヌクレオチド1〜2353)であり、下線付きの太字の「ATG」はオープンリーディングフレームの開始を示す。
Figure 2014500249
ヒトStat2のポリペプチド配列は、配列番号7に記載される。ヒトStat2のヌクレオチド配列は、配列番号8に示される。Stat2に関する配列情報は、GenBank受託番号AAA98760(タンパク質に関する)およびU18671.1(核酸に関する)により公共データベースでアクセスできる。
配列番号7は、Stat2に対応するヒト野生型アミノ酸配列である(残基1〜851)。
Figure 2014500249
配列番号8は、Stat2に対応するヒト野生型ヌクレオチド配列(ヌクレオチド1〜18648)であり、下線付きの太字の「ATG」はオープンリーディングフレームの開始を示す。
Figure 2014500249
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タンパク質変異体：タンパク質変異体はアミノ酸配列改変を含んでもよい。例えば、アミノ酸配列改変は3つのクラスのうちの1つ以上：置換、挿入または欠失変異体に分類される。挿入はアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合物ならびに1個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含んでもよい。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端融合物のものよりも小さい挿入であり、例えば、およそ1〜4個の残基である。欠失は、タンパク質配列からの1個以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするDNA中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発を行い、それによって、変異体をコードするDNAを作製し、その後組換え細胞培養物中で該DNAを発現させることによって調製される。
既知の配列を有するDNA中の所定の部位に置換突然変異を作製する技術は周知であり、例えば、M13プライマー突然変異誘発およびPCR突然変異誘発がある。アミノ酸置換は1個の残基であってもよいが、いくつかの異なる部位で同時に行ってもよい。1つの非限定的実施形態においては、挿入は約1〜約10アミノ酸残基であってよいが、欠失は約1〜約30残基の範囲であってよい。欠失または挿入は、隣接する対で行うことができる(例えば、約2残基の欠失または約2残基の挿入)。置換、欠失、挿入、またはその任意の組合せを組合せて、最終構築物に到達することができる。突然変異は、配列を読み枠の外側に置くことはできず、二次mRNA構造をもたらし得る相補領域を作るべきではない。置換変異体は、少なくとも1個の残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、(a)例えば、シートもしくはらせんコンフォメーションとしての、置換の領域でのポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位での分子の荷電もしくは疎水性または(c)側鎖の嵩の維持に対するその効果においてより有意に異なる残基を選択することにより行われる。タンパク質の特性における最大の変化をもたらし得る置換は、(a)親水性残基、例えば、セリルもしくはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルに(もしくは、により)置換されたもの；(b)システインもしくはプロリンが、任意の他の残基に(もしくは、により)置換されたもの；(c)電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルに(もしくは、により)置換されたもの；または(d)嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンに(もしくは、により)、この場合、(e)硫酸化および/もしくはグリコシル化のための部位数を増加させることにより置換されたものである。
本発明により、タンパク質のアミノ酸配列における少数の変異が提供される。アミノ酸配列における変異は、配列が配列番号1、3、5、または7に対して少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%の同一性を維持する場合であってよい。例えば、保存的アミノ酸置換を用いることができる。保存的置換は、側鎖の互換性が類似する側鎖を有する、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で行うものである。
遺伝的にコードされるアミノ酸は一般に、ファミリーに分けられる：(1)酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸である；(2)塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンである；(3)非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである；および(4)非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。他のファミリーのアミノ酸としては、(i)脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群、例えば、セリンおよびトレオニン；(ii)アミド含有側鎖を有するアミノ酸群、例えば、アスパラギンおよびグルタミン；(iii)脂肪族側鎖を有するアミノ酸群、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；(iv)芳香族側鎖を有するアミノ酸群、例えば、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；ならびに(v)硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群、例えば、システインおよびメチオニンが挙げられる。有用な保存的アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。
例えば、あるアミノ酸残基の、生物学的および/または化学的に類似する別のものへの置換は、保存的置換として当業者には公知である。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別のもの、またはある極性残基を別のものに置換することである。置換は、例えば、Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；およびPhe、Tyrなどの組合せを含む。置換または欠失突然変異誘発を用いて、N-グリコシル化(Asn-X-Thr/Ser)またはO-グリコシル化(SerもしくはThr)のための部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位、例えば、Argの欠失または置換は、例えば、塩基性残基の1つを欠失させるか、またはあるものをグルタミニルもしくはヒスチジル残基により置換することにより達成される。
細菌および酵母発現系：細菌系においては、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2などの遺伝子によりコードされる大量のタンパク質が抗体の誘導のために必要とされる場合、容易に精製される高レベルのタンパク質発現を指令するベクターを用いることができる。そのようなベクターの非限定例としては、多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクター、例えば、BLUESCRIPT(Stratagene)が挙げられる。pINベクターまたはpGEXベクター(Promega, Madison, Wis.)を用いて、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチド分子を発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着、次いで、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製することができる。そのような系で作製されたタンパク質を、ヘパリン、トロンビン、または第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計して、クローニングされた目的のポリペプチドをGST部分から自由自在に遊離させることができる。
植物および昆虫発現系：植物発現ベクターを用いる場合、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質をコードする配列の発現を、いくつかのプロモーターのいずれかによって駆動することができる。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを、単独で、またはTMVに由来するオメガリーダー配列と組合せて用いることができる。あるいは、RUBISCOまたは熱ショックプロモーターの小サブユニットなどの植物プロモーターを用いることもできる。これらの構築物を、直接DNA形質転換または病原体媒介性トランスフェクションにより植物細胞中に導入することができる。
また、昆虫系を用いてJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質を発現させることもできる。例えば、あるそのような系において、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして用いて、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞またはトリコプルシア(Trichoplusia)幼虫中で外来遺伝子を発現させる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2のポリペプチドをコードする配列を、ウイルスの非必須領域、例えば、ポリへドリン遺伝子中にクローニングし、ポリへドリンプロモーターの制御下に置くことができる。核酸配列、例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子などの遺伝子に対応する配列の挿入が成功すると、ポリへドリン遺伝子は不活性になり、外被タンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次いで、組換えウイルスを用いて、スポドプテラ・フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼虫に感染させ、その中でタンパク質またはその変異体を発現させることができる。
哺乳動物発現系：発現ベクターは、宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で少なくとも1つの調節配列に連結された、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかのウイルスに基づく発現系を用いて、哺乳動物宿主細胞中でJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはその変異体を発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、タンパク質をコードする配列を、プロモーターおよび三部分リーダー配列を含むアデノウイルス転写/翻訳複合体中にライゲーションすることができる。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域中への挿入を用いて、感染した宿主細胞中でJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質を発現する生きたウイルスを取得することができる。転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞中での発現を増加させることもできる。
調節配列は当業界で周知であり、これをGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載のような好適な宿主細胞中で目的のタンパク質またはポリペプチドの発現を指令するために選択することができる。調節配列の非限定例としては、ポリアデニル化シグナル、プロモーター(例えば、CMV、ASV、SV40、または他のウイルスプロモーター、例えば、ウシパピローマ、ポリオーマ、および2型アデノウイルスから誘導されたもの(Fiersら、1973, Nature 273:113; Hager GLら、Curr Opin Genet Dev, 2002, 12(2):137-41))、エンハンサー、ならびに他の発現制御エレメントが挙げられる。
非コードDNA領域中のプロモーター領域の上流または下流に見出される配列であるエンハンサー領域もまた、発現の最適化において重要であることが当業界で公知である。必要に応じて、ウイルス起源の複製起点を用いることができる、例えば、プラスミドDNAの導入には原核宿主が用いられる。しかしながら、真核生物では、染色体組込みがDNA複製のための一般的な機構である。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、少量の細胞が、導入されたDNAをそのゲノム中に組込むことができる。用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション方法は、組込み事象の成功に寄与する因子であり得る。所望のタンパク質の安定な増幅および発現のために、目的のタンパク質をコードするDNAを含有するベクターが真核細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えば、毛包の終末小体に由来する細胞)のゲノム中に安定に組込まれ、トランスフェクトされた遺伝子の安定な発現をもたらす。外因性核酸配列を、米国特許第5,641,670号(その内容は参照により本明細書に組み入れられる)に開示された相同組換えにより細胞(例えば、一次または二次細胞である哺乳動物細胞)中に導入することができる。
選択マーカー(例えば、抗生物質または薬剤、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、G418、およびヒグロマイシンに対する耐性)をコードする遺伝子を、目的の遺伝子と共に宿主細胞中に導入して、目的のタンパク質をコードする遺伝子を安定に発現するクローンを同定、選択することができる。選択マーカーをコードする遺伝子を、目的の遺伝子と同じプラスミド上で宿主細胞中に導入するか、または別のプラスミド上で導入することができる。目的の遺伝子を含有する細胞を薬剤選択により同定し、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は薬剤の存在下で生存することができる。選択マーカーの遺伝子を取り込まなかった細胞は死ぬ。次いで、生存している細胞を、所望のタンパク質分子(例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2などの遺伝子によりコードされたタンパク質)の産生についてスクリーニングすることができる。
細胞のトランスフェクション
真核発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトして、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を産生させることができる。哺乳動物細胞(例えば、毛球に由来する単離された細胞；例えば、真皮鞘細胞および真皮乳頭細胞)は、当業界で公知の方法により好適な宿主細胞中に発現ベクターを導入することによって発現ベクター(例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を含有するもの)を含有してもよい。
挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式でJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子などの遺伝子によりコードされる発現されたポリペプチドを加工するその能力について、宿主細胞株を選択することができる。ポリペプチドのそのような改変としては、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。「プレプロ」形態のポリペプチドを切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折畳みおよび/または機能を容易にすることもできる。翻訳後活性のための特異的細胞機構および特徴的機構を有する様々な宿主細胞(例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38)が、American Type Culture Collection(ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)から入手可能であり、外来タンパク質の正確な改変およびプロセッシングを確保するために選択することができる。
外因性核酸を、当業界で公知の様々な技術、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム沈降、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより細胞中に導入することができる。エレクトロポレーションは、DNA構築物の目的の細胞(毛包の終末小体の細胞、例えば、真皮乳頭細胞または真皮鞘細胞など)中への進入をもたらす好適な電圧およびキャパシタンスで実行される。他のトランスフェクション法はまた、リン酸カルシウム沈降改変法、ポリブレン沈降、リポソーム融合、および受容体媒介性遺伝子送達を含む。
遺伝子操作される細胞は、様々な組織から得られた一次および二次細胞であってよく、培養物中で維持および増殖することができる細胞型を含む。一次および二次細胞の非限定例としては、上皮細胞(たとえば、真皮乳頭細胞、毛包細胞、内毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、皮脂腺細胞、上皮マトリックス細胞)、神経細胞、内皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、筋肉細胞(筋芽細胞など)、ケラチノサイト、血液の形成されたエレメント(例えば、リンパ球、骨髄細胞など)、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられる。
脊椎動物組織を当業者には公知の方法、例えば、パンチ生検または目的の一次細胞型の組織源を取得する他の外科的方法により取得することができる。一実施形態においては、パンチ生検または除去を用いて、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、または間葉細胞(例えば、毛包細胞もしくは真皮乳頭細胞)の起源を取得することができる。別の実施形態においては、毛包の除去を用いて、線維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、または間葉細胞(例えば、毛包細胞もしくは真皮乳頭細胞)の起源を取得することができる。一次細胞の混合物を、移植または酵素的消化(例えば、プロナーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ジスパーゼおよびキモトリプシンなどの酵素を用いる)などの当業界で容易に実施される方法を用いて組織から取得することができる。生検法は、米国特許出願公開第2004/0057937号およびPCT出願公開WO2001/32840にも記載されており、それらは参照により本明細書に組み入れられるものとする。
遺伝子操作された一次または二次細胞を投与した個体から、一次細胞を獲得することができる。しかしながら、一次細胞を、同じ種のレシピエント以外のドナーから取得することもできる。この細胞を、別の種(例えば、ウサギ、ネコ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウマ、ウシ、鳥またはブタ)から取得することもできる。一次細胞はまた、組織培養基質(例えば、フラスコもしくは皿)に結合させて増殖させたか、または懸濁液中で増殖させた、単離された脊椎動物組織源に由来する細胞；組織から誘導された外植片中に存在する細胞；初めて塗布された上記細胞型の両方；およびこれらの塗布された細胞から誘導された細胞培養懸濁液を含んでもよい。二次細胞は、その後の継代に由来する細胞に加えて、培養基質から除去され、再塗布または継代された塗布された一次細胞であってもよい。二次細胞を1回以上継代することができる。これらの一次または二次細胞は、目的のタンパク質(例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはポリペプチド)をコードする遺伝子を有する発現ベクターを含んでもよい。
細胞培養
培養される宿主細胞に関して、様々な培養パラメータを用いることができる。哺乳動物細胞のための好適な培養条件は当業界で周知であり(Cleveland WLら、J Immunol Methods, 1983, 56(2): 221-234)、または当業者によって決定することができる(例えば、Animal Cell Culture: A Practical Approach、第2版、Rickwood, D.およびHames, B. D.(編)(Oxford University Press: New York, 1992)を参照されたい)。細胞培養条件は選択された宿主細胞の型に応じて変化し得る。市販の培地を用いることができる。培地の非限定例としては、例えば、最少必須培地(MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM, Sigma); HamのF10培地(Sigma); HyClone細胞培養培地(HyClone, Logan, Utah); RPMI-1640培地(Sigma); および様々な細胞型のために考案された化学規定(CD)培地、例えば、CD-CHO培地(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)が挙げられる。
細胞培養培地に、必要に応じて、補助構成要素または成分、例えば、任意構成要素を、必要に応じて、または所望の場合、好適な濃度または量で補給してもよい。細胞培養培地溶液は、以下のカテゴリーのうちの1つ以上に由来する少なくとも1つの構成要素を提供する:(1)通常はグルコースなどの炭水化物の形態にあるエネルギー源;(2)全必須アミノ酸、および通常は20種のアミノ酸とシステインの基本セット;(3)低濃度で必要とされるビタミンおよび/または他の有機化合物;(4)遊離脂肪酸または脂質、例えば、リノール酸;ならびに(5)微量元素(微量元素は非常に低濃度で必要とされ得る、通常はマイクロモル濃度の範囲の、無機化合物もしくは天然元素と定義される)。
また、培地に、以下のカテゴリーのいずれかに由来する1つ以上の構成要素を選択的に補給してもよい:(1)塩、例えば、マグネシウム、カルシウムおよびリン酸塩;(2)ホルモンおよび他の増殖因子、例えば、血清、インスリン、トランスフェリン、および上皮増殖因子;(3)タンパク質および組織加水分解物、例えば、精製されたゼラチン、植物材料、または動物の副生成物から取得することができるペプトンまたはペプトン混合物;(4)ヌクレオシドおよび塩基、例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン;(5)バッファー、例えば、HEPES;(6)抗生物質、例えば、ゲンタマイシンまたはアンピシリン;(7)細胞保護剤、例えば、プルロニックポリオール;ならびに(8)ガラクトース。一実施形態においては、可溶性因子を培養培地に添加することができる。
本発明と共に用いることができる哺乳動物細胞培養物は、培養される細胞の型にとって好適な培地中で調製される。一実施形態においては、細胞培養培地は、哺乳動物起源の血清(例えば、ウシ胎仔血清(FBS))を補給した以前に考察されたもののいずれか1つ(例えば、MEM)であってよい。別の実施形態においては、培地は、上皮細胞または毛包の毛球から得られた細胞(例えば、真皮乳頭細胞もしくは真皮鞘細胞)の増殖を持続させるための条件培地であってもよい。例えば、上皮細胞を、BarnesおよびMather、Animal Cell Culture Methods (Academic Press, 1998)(その全体が参照により本明細書に組み入れられる)に従って培養することができる。さらなる実施形態においては、上皮細胞または毛包細胞を、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはポリペプチド)をコードする遺伝子を含有するDNAベクターを用いてトランスフェクトすることができる。本発明の他の実施形態においては、細胞を有効量の酵素の存在下、懸濁培養(例えば、懸滴培養などの三次元培養)で増殖させ、この酵素基質は懸濁培養中の細胞外マトリックス分子である。例えば、酵素はヒアルロニダーゼであってよい。上皮細胞または毛包細胞を、当業界で実施される方法に従って、例えば、PCT出願公開WO2004/044188および米国特許出願公開第2005/0272150号に記載のように、またはHarris、Handbook in Practical Animal Cell Biology: Epithelial Cell Culture (Cambridge Univ. Press, Great Britain; 1996; Chapter 8を参照)(これらは参照により本明細書に組み入れられる)により記載されたように培養することができる。
懸濁培養は、細胞、または細胞の凝集物(DP細胞の凝集物など)が、液体培地中に懸濁される間に増殖する培養の型である。哺乳動物を含む懸濁培養を、接着しない細胞型の維持のために、または接着型には認められない特異的な細胞特徴を細胞が示すことができるように用いることができる。いくつかの型の懸濁培養は、三次元培養または懸滴培養を含んでもよい。懸滴培養は、培養しようとする材料を平坦な表面(カバーガラス、ガラススライド、ペトリ皿、フラスコなど)に付着した液体の液滴中に接種し、中空の表面上で反転させることができる培養である。懸滴中の細胞は、重力の結果として液滴の吊り中心に向かって凝集することができる。しかしながら、本発明の方法によれば、細胞外マトリックスを分解するタンパク質(コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼなど)の存在下で培養された細胞は、よりコンパクトになり、懸滴培養内に凝集し、ECMの分解については、少量のECMが存在するため、細胞を互いにより近くにすることができる。また、参照により本明細書に組み入れられる国際PCT公開第WO2007/100870号も参照されたい。
毛包の毛球から得られた細胞(真皮乳頭細胞または真皮鞘細胞など)を、懸滴培養において単一の均質な集団(例えば、DP細胞を含む)として培養して、DP細胞の凝集物を生成させることができる。また、細胞を懸滴培養において異種集団(例えば、DPおよびDS細胞を含む)として培養して、DPおよびDS細胞のキメラ凝集物を生成させることもできる。上皮細胞を、当業界で実施されるように集密まで単層として培養することができる。そのような培養方法は、本質的にはHandbook in Practical Animal Cell Biology: Epithelial Cell Culture (Cambridge Univ. Press, Great Britain; 1996)のChapter 8; Underhill CB, J Invest Dermatol, 1993, 101(6):820-6); ArmstrongおよびArmstrong, (1990) J Cell Biol 110:1439-55; またはAnimal Cell Culture Methods (Academic Press, 1998)(これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載の方法に従って実行することができる。
三次元培養物は、寒天(Geyの寒天など)、ヒドロゲル(マトリゲル、アガロースなど；Leeら(2004) Biomaterials 25: 2461-2466)または架橋されたポリマーから形成させることができる。これらのポリマーは、天然ポリマーおよびその誘導体、合成ポリマーおよびその誘導体、またはその組合せを含んでもよい。天然ポリマーは、陰イオン性ポリマー、陽イオン性ポリマー、両親媒性ポリマー、または中性ポリマーであってもよい。陰イオン性ポリマーの非限定例としては、ヒアルロン酸、アルギン酸(アルギナート)、カラゲナン、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、およびペクチンが挙げられる。陽イオン性ポリマーのいくつかの例としては、限定されるものではないが、キトサンまたはポリリシンが挙げられる(Peppasら(2006) Adv Mater. 18: 1345-60; Hoffman, A. S., (2002) Adv Drug Deliv Rev. 43: 3-12; Hoffman, A. S., (2001) Ann NY Acad Sci 944: 62-73)。両親媒性ポリマーの例としては、限定されるものではないが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、およびカルボキシメチルキチンが挙げられる。中性ポリマーの非限定例としては、デキストラン、アガロース、またはプルランが挙げられる(Peppasら(2006) Adv Mater. 18: 1345-60; Hoffman, A. S., (2002) Adv Drug Deliv Rev. 43: 3-12; Hoffman, A. S., (2001) Ann NY Acad Sci 944: 62-73)。
本発明の方法による培養にとって好適な細胞は、プラスミドなどの導入された発現ベクターを担持することができる。発現ベクター構築物を、形質転換、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、または感染を介して導入することができる。発現ベクターは、発現および産生のためのタンパク質をコードする、コード配列、またはその一部を含んでもよい。産生されるタンパク質およびポリペプチドをコードする配列、ならびに好適な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを、当業者には周知であり、当業者によって実施される方法を用いて作製することができる。これらの方法は、J. Sambrookら、2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.およびF. M. Ausubelら、1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載された合成技術、in vitro組換えDNA技術、およびin vivo遺伝子組換えを含む。
ポリペプチドの取得および精製
Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子などの遺伝子、またはその変異体によりコードされるポリペプチド分子を、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸配列のin vitroもしくはin vivoでの発現を介する、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質もしくはポリペプチドを発現するヒト細胞からの精製によって、または直接化学合成によって取得することができる。
ポリペプチド発現の検出：Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含有し、その後Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされたタンパク質を発現する宿主細胞を、当業者には公知の様々な手順によって同定することができる。これらの手順としては、限定されるものではないが、膜、溶液、または核酸もしくはタンパク質の検出および/もしくは定量のためのチップに基づく技術を含むDNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が挙げられる。例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の存在を、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸のプローブまたは断片を用いるDNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる。一実施形態においては、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子の核酸の断片は、配列番号2、4、6または8の少なくとも約8個の連続するヌクレオチドの任意の部分を包含してもよい。別の実施形態においては、前記断片は、配列番号2、4、6または8の少なくとも約10個の連続するヌクレオチド、少なくとも約15個の連続するヌクレオチド、少なくとも約20個の連続するヌクレオチド、または少なくとも約30個の連続するヌクレオチドを含んでもよい。断片は、約8〜約100ヌクレオチドの全ての可能なヌクレオチド長、例えば、約15〜約100ヌクレオチド長、または約20〜約100ヌクレオチド長を含んでもよい。核酸増幅に基づくアッセイは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む形質転換体を検出するためのJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドをコードする配列から選択されたオリゴヌクレオチドの使用を含む。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子などの遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を、該ポリペプチドに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて検出および測定するためのプロトコルはよく確立されている。非限定例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性化細胞選別(FACS)が挙げられる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子などの遺伝子によりコードされるポリペプチド上の2つの干渉しないエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル抗体に基づく免疫アッセイを用いるか、または競合結合アッセイを用いることができる。
標識およびコンジュゲーション技術は当業者には公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて用いることができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2などのタンパク質をコードする核酸配列と関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを製造する方法としては、限定されるものではないが、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が挙げられる。あるいは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子などの遺伝子によりコードされるポリペプチドをコードする核酸配列を、mRNAの産生のためのベクター中にクローニングすることができる。そのようなベクターは当業界で公知であり、市販されており、これを用いて、標識されたヌクレオチドおよびT7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼの添加により、in vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの手順は、様々な市販のキット(Amersham Pharmacia Biotech、Promega、およびUS Biochemical)を用いて行うことができる。検出を容易にするために用いることができる好適なリポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、および蛍光、化学発光剤、または発色剤、ならびに基質、コファクター、阻害剤、および/または磁気粒子が挙げられる。
ポリペプチドの発現および精製：Jak1、Jak2、Stat1またはStat2などのポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養物からのタンパク質の発現および回収にとって好適な条件下で培養することができる。形質転換された細胞により産生されたポリペプチドを、用いられる配列および/またはベクターに応じて細胞内に分泌させるか、または含有させることができる。Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2などのポリペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクターを、原核もしくは真核細胞膜を通じて、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子などの遺伝子、またはその変異体によりコードされた可溶性ポリペプチド分子の分泌を指令するか、またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子などの遺伝子、またはその変異体によりコードされた膜に結合させたポリペプチドの膜挿入を指令するシグナル配列を含むように設計することができる。
他の構築物を用いて、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2ポリペプチドをコードする遺伝子配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結することもできる。そのような精製を容易にするドメインとしては、限定されるものではないが、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAGS伸長/アフィニティ精製システム(Immunex Corp., Seatle, Wash.)中で用いられるドメインが挙げられる。精製ドメインと、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの間に切断可能なリンカー配列(すなわち、第Xa因子またはエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego, Calif.)に特異的なもの)を含有させることを用いて、精製を容易にすることもできる。あるそのような発現ベクターは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前の6個のヒスチジン残基を含有する融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる精製を容易にするが、エンテロキナーゼ切断部位は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされたポリペプチドを精製するための手段を提供する。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2ポリペプチドを、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質を発現する発現構築物でトランスフェクトされたものを含む、前記ポリペプチドを発現する任意のヒトまたは非ヒト細胞から精製することができる。精製されたJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質を、当業界で実施される方法を用いて、特定のタンパク質、炭水化物、または脂質などの、細胞中でJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質と通常は結合する他の化合物から分離することができる。非限定的方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および分取ゲル電気泳動が挙げられる。
化学的合成：ポリペプチドをコードする、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子などの遺伝子を含む核酸配列を、当業界で公知の化学的方法を用いて、全体的に、または部分的に合成することができる。あるいは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2などのポリペプチドを化学的方法を用いて製造して、固相技術を用いる直接ペプチド合成などによってそのアミノ酸配列を合成することができる。タンパク質合成は手動の技術を用いるか、または自動化によって実施することができる。自動化合成は、例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を用いて達成することができる。必要に応じて、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2ポリペプチドの断片を、化学的方法を用いて別々に合成し、組合せて、完全長分子を製造することができる。一実施形態においては、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子を含む核酸配列の断片は、配列番号2、4、6または8の少なくとも約8個の連続するヌクレオチドの任意の一部を包含してもよい。一実施形態においては、前記断片は、配列番号2、4、6、または8の少なくとも約10個のヌクレオチド、少なくとも約15個のヌクレオチド、少なくとも約20個のヌクレオチド、または少なくとも約30個のヌクレオチドを含んでもよい。断片は、約8〜約100ヌクレオチドの全ての可能なヌクレオチド長、例えば、約15〜約100ヌクレオチド長、または約20〜約100ヌクレオチド長を含む。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2断片は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2などのタンパク質の断片であってもよい。例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2断片は、配列番号1、3、5または7の少なくとも約8個の連続するアミノ酸の任意の一部を包含してもよい。前記断片は、配列番号1、3、5または7の少なくとも約10個の連続するアミノ酸、少なくとも約20個の連続するアミノ酸、少なくとも約30個の連続するアミノ酸、少なくとも約40個の連続するアミノ酸、少なくとも50個の連続するアミノ酸、少なくとも60個の連続するアミノ酸、少なくとも70個の連続するアミノ酸、または少なくとも75個の連続するアミノ酸を含んでもよい。断片は、約8〜約100アミノ酸の全ての可能なアミノ酸長、例えば、約10〜約100アミノ酸長、約15〜約100アミノ酸長、約20〜約100アミノ酸長、約35〜約100アミノ酸長、約40〜約100アミノ酸長、約50〜約100アミノ酸長、約70〜約100アミノ酸長、約75〜約100アミノ酸長、または約80〜約100アミノ酸長を含む。
合成ペプチドは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を介して実質的に精製することができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2の合成ポリペプチドの組成を、アミノ酸分析または配列決定により確認することができる。さらに、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質を含むアミノ酸配列の任意の一部を、直接合成の間に変化させ、および/または化学的方法を用いて他のタンパク質に由来する配列と組合せて、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を作製することができる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物の同定
本発明は、被験体における毛髪増殖(例えば、毛髪密度)または毛髪色素を制御および/または調節するために用いることができる化合物を同定する方法を提供する。本発明は脱毛症と関連する遺伝子としての本明細書に列挙された遺伝子の同定を提供したため、本発明はまた、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2の遺伝子および/またはタンパク質の発現または活性を調節する化合物を同定する方法も提供する。さらに、本発明は、脱毛症の治療に用いることができる化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、貧毛症(例えば、遺伝性先天性貧毛症(HHS))の治療に用いることができる化合物を同定する方法も提供する。脱毛症の非限定例としては、アンドロゲン性脱毛症、円形脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、完全脱毛症、および全身性脱毛症が挙げられる。前記方法は、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2によりコードされるポリペプチド分子に結合し、および/またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質の生物活性またはその発現に対する刺激または阻害効果を有する試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド(抗体もしくはその断片など)、小分子、核酸(siRNAもしくはアンチセンスRNA)、または他の薬剤)を同定した後、これらの化合物が被験体における毛髪増殖を調節することができるかどうか、またはin vivoアッセイ(すなわち、毛髪増殖の増加もしくは低下を試験する)において脱毛症と関連する症候に対する効果を有することができるかどうかを決定することを含んでもよい。
本明細書で用いられる「Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物」とは、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質もしくはポリペプチドと相互作用し、その活性および/またはその発現を調節する化合物を指す。前記化合物は、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を増加させることができる。逆に、前記化合物は、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を低下させることができる。前記化合物は、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2アゴニストまたはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2アンタゴニスト(例えば、Jak1阻害剤、Jak2阻害剤、Stat1阻害剤、もしくはStat2阻害剤)であってよい。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物のいくつかの非限定例としては、ペプチド(Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドを含むペプチド断片、または抗体もしくはその断片など)、小分子、および核酸(Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子を含む核酸に特異的なsiRNAまたはアンチセンスRNAなど)が挙げられる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質のアゴニストは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質に結合した場合、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性を増加または延長させる分子であってよい。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2アゴニストとしては、限定されるものではないが、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質を活性化するタンパク質、核酸、小分子、または任意の他の分子が挙げられる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質のアンタゴニストは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質に結合した場合、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性の量または持続期間を減少させる分子であってよい。アンタゴニストとしては、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性を低下させるタンパク質、核酸、抗体、小分子、または任意の他の分子が挙げられる。
本明細書に登場する用語「調節する」とは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2の遺伝子またはタンパク質の活性または発現の変化を指す。例えば、調節は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質のタンパク質活性、結合特性、または任意の他の生物学的、機能的もしくは免疫学的特性の増加または低下を引き起こし得る。
一実施形態においては、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物は、前記タンパク質に結合するJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質のペプチド断片であってよい。例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2ポリペプチドは、配列番号1、3、5または7の少なくとも約8個の連続するアミノ酸の任意の一部を包含してもよい。前記断片は、配列番号1、3、5または7の少なくとも約10個の連続するアミノ酸、少なくとも約20個の連続するアミノ酸、少なくとも約30個の連続するアミノ酸、少なくとも約40個の連続するアミノ酸、少なくとも50個の連続するアミノ酸、少なくとも60個の連続するアミノ酸、少なくとも70個の連続するアミノ酸、または少なくとも75個の連続するアミノ酸を含んでもよい。断片は、約8〜約100アミノ酸の全ての可能なアミノ酸長、例えば、約10〜約100アミノ酸長、約15〜約100アミノ酸長、約20〜約100アミノ酸長、約35〜約100アミノ酸長、約40〜約100アミノ酸長、約50〜約100アミノ酸長、約70〜約100アミノ酸長、約75〜約100アミノ酸長、または約80〜約100アミノ酸長を含む。これらのペプチド断片を商業的に取得するか、または液相もしくは固相合成法(Athertonら(1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England)により合成することができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2ペプチド断片を、天然起源から単離し、遺伝子操作するか、または化学的に調製することができる。これらの方法は当業界で周知である。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物は、タンパク質、例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体(モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラ、もしくは完全ヒト)、またはその結合断片であってよい。抗体断片は、完全長形態以外の抗体の形態であってもよく、遺伝子操作された抗体断片に加えて、完全長抗体内に存在する部分または構成要素を含む。抗体断片としては、限定されるものではないが、一本鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、Fv、および(Fab')2、トリアボディ、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組合せ、可変領域、テトラボディ、二官能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域などが挙げられる(Maynardら(2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402を参照されたい)。抗体を商業的に取得し、特注で作製するか、または当業界で確立された方法(Janewayら(2001) Immunobiology、第5版、Garland Publishing)に従って目的の抗原に対して合成することができる。一実施形態においては、抗体またはその結合断片は、配列番号1、3、5または7に対するものである。抗体を商業的に取得し、特注で作製するか、または当業界で確立された方法(Janewayら(2001) Immunobiology、第5版、Garland Publishing)に従って目的の抗原に対して合成することができる。例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2に対する抗体を、Abcam、Santa Cruz Biotechnology、Abnova Corp.、BD Biosciences、Antigenix America Inc.,などから商業的に取得することができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2に対するヒト抗体(モノクローナル、ヒト化、またはキメラ抗体など)は、ヒトにおける使用にとって有用な抗体治療剤であり得る。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドをコードするRNAの阻害は、RNAが転写されるJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子の発現を効率的に調節することができる。阻害剤は、siRNA;干渉RNAもしくはRNAi;dsRNA;RNAポリメラーゼIII転写されたDNA;リボザイム;およびRNA、DNAもしくは人工核酸であってよいアンチセンス核酸を含む群から選択される。
アンチセンスDNA、RNAおよびDNA/RNA分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化されたmRNAに結合し、タンパク質翻訳を防止することによりmRNAの翻訳を直接遮断するように作用する。例えば、少なくとも約15塩基の、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドをコードするDNA配列のユニークな領域と相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のホスホジエステル技術(Dallasら(2006) Med. Sci. Monit.12(4):RA67-74; Kalotaら(2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:173-96; Lutzelburgerら(2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:243-59)により合成することができる。アンチセンスヌクレオチド配列としては、限定されるものではないが、モルホリノ、2'-O-メチルポリヌクレオチド、DNA、RNAなどが挙げられる。
siRNAは、約15〜約50塩基対、例えば、約21〜約25塩基対を含有し、細胞内で発現される標的遺伝子と同一であるか、またはほぼ同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。siRNAは、標準的なワトソン-クリック塩基対形成相互作用によって一緒にアニーリングしたセンスRNA鎖および相補的アンチセンスRNA鎖を含む。センス鎖は、標的miRNA分子内に含まれる核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。標的mRNA内に含まれる標的配列と「実質的に同一である」とは、標的配列と約3%以下異なる核酸配列を指す。siRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、2つの相補的な一本鎖RNA分子を含むか、または2つの相補部分が塩基対形成し、一本鎖「ヘアピン」領域により共有結合した単一の分子を含んでもよい。また、McMnausおよびSharp (2002) Nat Rev Genetics, 3:737-47、ならびにSenおよびBlau (2006) FASEB J., 20:1293-99(これらの全開示は参照により本明細書に組み入れられる)も参照されたい。
siRNAは、1個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および/または変化により天然RNAと異なる変化したRNAであってよい。そのような変化は、siRNAの末端もしくはsiRNAの1個以上の内部ヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド材料の付加、またはsiRNAをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする改変、またはsiRNA中の1個以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換を含んでもよい。siRNAの一方または両方の鎖はまた、3'突出を含んでもよい。本明細書で用いられる3'突出とは、二本鎖RNAの3'末端から伸長する少なくとも1個の対形成していないヌクレオチドを指す。例えば、siRNAは、長さ1〜約6ヌクレオチド(リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含む)、または長さ1〜約5ヌクレオチド、または長さ1〜約4ヌクレオチド、または長さ約2〜約4ヌクレオチドの少なくとも1個の3'突出を含んでもよい。例えば、siRNAのそれぞれの鎖は、ジチミジル酸(「TT」)またはジウリジル酸(「uu」)の3'突出を含んでもよい。
siRNAは化学的もしくは生物学的に製造するか、または組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる(例えば、米国特許第7,294,504号および米国特許第7,422,896号(これらの全開示は参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい)。dsRNAまたはsiRNAを製造し、試験するための例示的方法は、Gewirtzの米国特許出願公開第2002/0173478号、Hannonらの米国特許出願公開第2007/0072204号、およびReichらの米国特許出願公開第2004/0018176号(これらの全開示は参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。
一実施形態においては、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子を含むヒト核酸配列に対するsiRNAを、配列番号2、4、6または8のいずれか1つに対して作製することができる。別の実施形態においては、Jak1遺伝子を含むヒト核酸配列に対するsiRNAは、表11に列挙される配列のいずれか1つを含んでもよい。別の実施形態においては、Stat1遺伝子を含むヒト核酸配列に対するsiRNAは、表12に列挙される配列のいずれか1つを含んでもよい。
別の実施形態においては、Jak1に対するsiRNAは、表11に列挙される。
Figure 2014500249
別の実施形態においては、Stat1に対するsiRNAは、表12に列挙される。
Figure 2014500249
RNAポリメラーゼIIIにより転写されるDNAは、プロモーター、例えば、U6プロモーターを含む。これらのDNAを、siRNAとして機能し得る細胞またはアンチセンスRNAとして機能し得る線状RNA中で小ヘアピンRNAを生成するように転写させることができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または標的RNAおよび/もしくは遺伝子が阻害されるような任意の好適な組合せを含んでもよい。さらに、これらの形態の核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖または四本鎖であってよい(例えば、Bass (2001) Nature, 411, 428 429; Elbashirら(2001) Nature, 411, 494 498; およびPCT公開第WO 00/44895号、第WO 01/36646号、第WO 99/32619号、第WO 00/01846号、第WO 01/29058号、第WO 99/07409号、第WO 00/44914号を参照されたい)。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質に結合し、その機能を破壊するか、または逆に、その機能を増強する小分子であってよい。小分子は、一般に低分子量を有する合成および天然物質の多様な群である。それらは天然起源(例えば、植物、菌類、微生物など)から単離することができる、商業的に取得する、および/もしくはライブラリーもしくは集団として入手可能である、または合成することができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質を調節する候補小分子を、コンビナトリアルライブラリーのin silicoスクリーニングまたは高効率(HTP)スクリーニングを介して同定することができる。アスピリン、ペニシリンおよび多くの化学療法剤などの多くの従来の薬剤は小分子であり、商業的に取得することができ、化学的に合成することができ、または以下に記載のようにランダムもしくはコンビナトリアルライブラリーから取得することができる(Wernerら(2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5(1):32-6)。
Jak1/Jak2阻害剤の非限定例としては、AG490 (Caceres-Cortes, Anticancer Agents Med Chem. 2008 Oct;8(7):717-22); CYT387 (Pardananiら、Leukemia. 2009 Aug;23(8):1441-5; Monaghanら、Leukemia. 2011 Jul 26. doi: 10.1038/leu.2011.175. [Epub ahead of print]); SB1518 (Williamら、J Med Chem. 2011 Jul 14;54(13):4638-58; Hartら、Leukemia. 2011 Jun 21. doi: 10.1038/leu.2011.148. [Epub ahead of print]); LY3009104 (INCB28050) (Incyte and Lilly); TG101348 (Wernigら、Cancer Cell. 2008 Apr;13(4):311-20; Pardananiら、J Clin Oncol. 2011 Mar 1;29(7):789-96); およびBMS-911543 (Purandareら、Leukemia. 2011 Oct 21. doi: 10.1038/leu.2011.292. [Epub ahead of print])が挙げられ、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
臨床開発中のJAK1/2阻害剤としては、a)INCB018424、局所および経口;5nM活性(Incyte); b)CEP-701(Cephalon); およびc)TG101348が挙げられる。
Figure 2014500249
Stat阻害剤の非限定例としては、WP-1034 (Faderlら、Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50)、フルダラビン(Fludara, Berlex, CA)、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、およびハイパーフォリンが挙げられる。Jak/Statシグナリングに対する他の化合物は、Ivanenkovら、Mini Rev Med Chem. 2011 Jan;11(1):55-78に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドなどの目的の分子の一次配列、およびその配列と既知の機能のタンパク質との類似性に関する知識は、アゴニストに加えて目的のタンパク質の阻害剤またはアンタゴニストに関する情報を提供することができる。アゴニストおよびアンタゴニストの同定およびスクリーニングは、例えば、X線結晶分析、中性子回折、核磁気共鳴分光法、および構造決定のための他の技術を用いてタンパク質の構造的特徴を決定することによってさらに容易になる。これらの技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの合理的設計または同定を提供する。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物などの試験化合物を、合成または天然化合物の大きいライブラリーからスクリーニングすることができる(Wangら(2007) Curr Med Chem, 14(2):133-55; Mannhold (2006) Curr Top Med Chem, 6 (10):1031-47; およびHensen (2006) Curr Med Chem 13(4):361-76を参照されたい)。糖、ペプチド、および核酸に基づく化合物の無作為合成および特異的合成のためにいくつかの手段が現在用いられている。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、AMRI (Albany, NY)、ChemBridge (San Diego, CA)、およびMicroSource (Gaylordsville, CT)から市販されている。レアケミカルライブラリーはAldrich(Milwaukee, Wis.)から入手可能である。あるいは、細菌、菌類、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、例えば、Pan Laboratories (Bothell, Wash.)もしくはMycoSearch (N.C.)から入手可能であるか、または容易に製造可能である。さらに、天然および合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に改変される(Blondelleら、(1996) Tib Tech 14:60)。
分子のライブラリーを調製するための方法は当業界で周知であり、多くのライブラリーが市販されている。本発明における目的のライブラリーとしては、ペプチドライブラリー、無作為化オリゴヌクレオチドライブラリー、合成有機コンビナトリアルライブラリーなどが挙げられる。縮重ペプチドライブラリーを、細菌鞭毛ペプチド展示ライブラリーまたはファージ展示ライブラリーとして固定された形態で溶液中で容易に調製することができる。ペプチドリガンドを、少なくとも1個のアミノ酸を含有するペプチドのコンビナトリアルライブラリーから選択することができる。ペプトイドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーを合成することができる。非ペプチド合成部分を含有し、その天然対応物と比較して酵素的分解をあまり受けないそのようなライブラリーをさらに合成することができる。例えば、ライブラリーとしては、限定されるものではないが、ペプチドオンプラスミドライブラリー、合成小分子ライブラリー、アプタマーライブラリー、in vitroでの翻訳に基づくライブラリー、ポリソームライブラリー、合成ペプチドライブラリー、神経伝達因子ライブラリー、および化学的ライブラリーも挙げられる。
化学的に合成されたライブラリーの例は、Fodorら(1991) Science 251:767-773; Houghtenら(1991) Nature 354:84-86; Lamら(1991) Nature 354:82-84; Medynski, (1994) BioTechnology 12:709-710; Gallopら(1994) J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyerら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erbら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghtenら(1992) Biotechniques 13:412; Jayawickremeら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmonら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; 1993年10月14日付のPCT公開第WO 93/20242号; およびBrennerら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383に記載されている。
ファージ展示ライブラリーの例は、Scottら(1990) Science 249:386-390; Devlinら(1990) Science, 249:404-406; Christianら(1992) J. Mol. Biol. 227:711-718; Lenstra, (1992) J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kayら(1993) Gene 128:59-65; およびPCT公開第WO 94/18318号に記載されている。
in vitroでの翻訳に基づくライブラリーとしては、限定されるものではないが、PCT公開第WO 91/05058号; およびMattheakisら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026に記載のものが挙げられる。
本明細書で用いられる用語「リガンド源」は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物のスクリーニングに用いることができる、本明細書に記載の任意の化合物ライブラリー、または生物系中の様々な器官から調製された組織抽出物であってよい。本明細書に列挙された化合物ライブラリー[その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2005/0009163号も参照されたい]のスクリーニングを、in vivo動物試験、以下に記載の機能的アッセイおよびシグナリングアッセイと共に用いて、毛髪増殖を調節するJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2調節化合物を同定するか、または脱毛症を治療することができる。
ライブラリーのスクリーニングを、任意の様々な一般的に知られる方法によって達成することができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献：ParmleyおよびSmith, (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; ScottおよびSmith, (1990) Science 249:386-390; Fowlkesら(1992) BioTechniques 13:422-427; Oldenburgら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yuら(1994) Cell 76:933-945; Staudtら(1988) Science 241:577-580; Bockら(1992) Nature 355:564-566; Tuerkら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellingtonら(1992) Nature 355:850-852; 米国特許第5,096,815号; 第5,223,409号; および第5,198,346号(全てLadnerら); Rebarら(1993) Science 263:671-673; ならびにPCT公開第WO 94/18318号を参照されたい。
小分子コンビナトリアルライブラリーを作製し、スクリーニングすることもできる。低分子有機化合物のコンビナトリアルライブラリーは、多様性の1つ以上の点で互いに異なり、多ステッププロセスを用いる有機技術により合成された密接に関連する類似体の集団である。コンビナトリアルライブラリーは、多数の低分子有機化合物を含む。ある型のコンビナトリアルライブラリーは、化合物アレイを作製するための平行合成法によって調製される。化合物アレイは、デカルト座標中のその空間アドレスにより同定可能であり、それぞれの化合物が共通の分子コアおよび1つ以上の可変構造多様性エレメントを有するように配置された化合物の集団であってよい。そのような化合物アレイ中の化合物は、別々の反応容器中で平行して産生され、それぞれの化合物はその空間アドレスによって同定および追跡される。平行合成混合物および平行合成法の例は、1994年1月5日に出願された米国特許出願第08/177,497号および1995年7月13日に公開されたその対応するPCT公開特許出願第WO95/18972号ならびに1998年1月27日に付与された米国特許第5,712,171号およびその対応するPCT公開特許出願第WO96/22529号(これらは参照により本明細書に組み入れられる)に提供されている。
1つの非限定例においては、ベンゾジアゼピンライブラリー(例えば、Buninら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712を参照されたい)などの非ペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる。ペプトイドライブラリー、例えば、Simonら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371に記載のものを用いることもできる。化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーを作製するためにペプチド中のアミド官能基が過メチル化された、用いることができるライブラリーの別の例は、Ostreshら(1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142により記載されている。
コンピュータモデリングおよび検索技術により、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の発現または活性を調節することができる化合物の同定、または既に同定された化合物の改良が可能になる。そのような化合物または組成物が同定されたら、続いてJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性部位または領域を、該化合物が結合する部位を試験することによって同定することができる。これらの部位はリガンド結合部位であってよく、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関連化合物もしくは組成物とその天然リガンドとの複合体の研究などから、当業界で公知の方法を用いて同定することができる。後者の場合、化学的方法またはX線結晶分析法を用いて、複合体化されたリガンドが認められる因子上の場所を見出すことにより、活性部位を発見することができる。
部位、例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの三次元幾何構造を、完全な分子構造を決定することができるX線結晶分析などの当業界で公知の方法によって決定することができる。固相または液相NMRを用いて、特定の分子内距離を決定することができる。構造決定の任意の他の実験方法を用いて、部分的な、または完全な幾何構造を取得することができる。決定された活性部位構造の正確性を増加させることができる、天然または人工の複合体化リガンドを用いて、幾何構造を測定することができる。
標的に結合するペプチドを調製または同定するための他の方法は、当業界で公知である。例えば、分子インプリンティングを、分子に結合するペプチドなどの大分子構造のde novoでの構築のために用いることができる。例えば、Kenneth J. Shea, Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites, TRIP Vol. 2, No. 5, May 1994; Mosbach, (1994) Trends in Biochem. Sci., 19(9); およびWulff, G., Polymeric Reagents and Catalysts (Ford, W. T.(編)) ACS Symposium Series No. 308, pp 186-230, American Chemical Society (1986)を参照されたい。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物の模倣体を調製するための1つの方法は、(i)所望の活性を示す既知の基質(鋳型)の周囲での機能的モノマーの重合;(ii)鋳型分子の除去;および次いで、(iii)鋳型の特性と類似する1つ以上の所望の特性を示す新しい分子を提供するための、鋳型により残された空隙中での第2のクラスのモノマーの重合のステップを含む。この様式でのペプチドの調製に加えて、多糖、ヌクレオシド、薬剤、核タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、糖タンパク質、ステロイド、脂質、および他の生物活性材料などの他の結合分子を調製することもできる。この方法は、その天然の対応物よりも安定である様々な生物学的模倣体の設計にとって有用であるが、これはそれらが機能的モノマーのフリーラジカル重合によって調製され、非生分解性骨格を有する化合物をもたらすからである。そのような分子を設計するための他の方法としては、例えば、いくつかの化合物の合成および評価ならびに分子モデリングを要する、構造活性関係に基づく薬剤設計が挙げられる。
スクリーニングアッセイ
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物：Jak1、Jak2、Stat1またはStat2化合物は、in vivoおよび/またはin vitroでのJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性および/または発現に影響する化合物であってよい。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストであってよく、発現を介して、翻訳後修飾を介して、または他の手段によってJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性に対してその効果を示す化合物であってよい。
Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質に結合する、および/またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質の活性もしくは発現に対する刺激もしくは阻害効果を有する試験化合物または薬剤を、2つの型のアッセイ：(a)細胞表面上にJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質またはその変異体を発現する細胞を用いる細胞に基づくアッセイ；または(b)単離されたJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質を使用することができる無細胞アッセイによって同定することができる。これらのアッセイは、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2の生物活性断片、完全長タンパク質、またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの全部もしくは一部を含む融合タンパク質を用いることができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質は、任意の好適な哺乳動物種(例えば、ヒト、ラット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ウマ、ウシまたはマウス)から取得することができる。このアッセイは、試験化合物の結合の直接または間接測定を含む結合アッセイであってよい。このアッセイはまた、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性の直接または間接測定を含む活性アッセイであってもよい。アッセイはまた、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の直接または間接測定を含む発現アッセイであってもよい。様々なスクリーニングアッセイを、被験体における脱毛症または脱毛疾患(例えば、アンドロゲン性脱毛症、円形脱毛症、完全脱毛症、もしくは全身性脱毛症)、被験体における毛髪色素の喪失、またはさらには貧毛症の症候に対する試験化合物の効果を測定することを含むin vivoアッセイと組合わせることができる。
in vivoアッセイはまた、欠損もしくは異常毛髪増殖表現型を示す既知の哺乳動物モデルまたは毛髪増殖の調節もしくは毛髪密度もしくは毛髪色素に影響するJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子を含む核酸配列のオープンリーディングフレーム(ORF)中に突然変異を含む哺乳動物における毛髪増殖の調節に対する試験化合物の効果を評価することを含んでもよい。一実施形態においては、毛髪増殖の制御は、被験体における毛髪増殖または密度の誘導を含んでもよい。ここで、毛髪増殖の調節における化合物の効果は、生物の物理的毛髪増殖または損失を試験することにより、または当業界で公知の方法を用いてタンパク質もしくはmRNA発現を評価することにより視覚的に観察することができる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質に結合するか、またはその活性を調節する試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを実行することもできる。試験化合物は、従来の化合物ライブラリーなどから任意の好適な手段によって取得することができる。膜結合型のJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質に結合する試験化合物の能力の決定を、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質を発現する細胞への試験化合物の結合を、複合体中の標識化合物を検出することにより測定することができるように、試験化合物と放射性アイソトープまたは酵素的標識とのカップリングを介して達成することができる。例えば、試験化合物を、直接的または間接的に、3H、14C、35S、または125Iで標識し、続いて放射性アイソトープを放射線放射の直接計測またはシンチレーション計測により検出することができる。あるいは、試験化合物を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識し、好適な基質の生成物への変換の決定によって酵素標識を検出することができる。
細胞に基づくアッセイは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2を発現する細胞と、試験物質とを接触させ、試験物質が膜に結合した分子の活性または発現を調節する(例えば、増加または減少させる)能力を決定することを含んでもよい。膜に結合したJak1、Jak2、Stat1またはStat2分子の活性を調節する試験物質の能力の決定は、そのような分子の活性を測定するのに好適な任意の方法、例えば、下流のシグナリング事象のモニタリングによって達成することができる(例えば、Youら、Ann N Y Acad Sci. 2008 Dec;1150:300-10; Posadasら、Expert Rev Clin Immunol. 2009 Jan;5(1):9-17; Korhonenら、Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2009 Apr;104(4):276-84; Vitalら、Ther Clin Risk Manag. 2006 Dec;2(4):365-75; MalekおよびCastro, Immunity. 2010 Aug 27;33(2):153-65; Chengら、Immunol Rev. 2011 May;241(1):63-76; Lanier, Nat Immunol. 2008 May;9(5):495-502; Lowell, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Mar 1;3(3). pii: a002352; Mocsaiら、Nat Rev Immunol. 2010 Jun;10(6):387-402; Bradshaw, Cell Signal. 2010 Aug;22(8):1175-84; Ivanenkovら、Mini Rev Med Chem. 2011 Jan;11(1):55-78; Himpeら、Biofactors. 2009 Jan-Feb;35(1):76-81(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる))。
Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質の標的を固定して、複合体化していない形態の一方または両方のタンパク質から複合体化形態のものの分離を容易にすることができる。試験化合物の存在下および非存在下での、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質またはその変異体への試験化合物の結合、またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質と標的分子との相互作用を、反応物質を含有させるのに好適な任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が挙げられる。一実施形態においては、一方または両方のタンパク質をマトリックスに結合させることができるドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる(例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical;St. Louis, Mo.)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができる)。
Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質、またはその変異体を、固相支持体への結合により固定することもできる。好適な固相支持体の非限定例としては、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、またはビーズ(限定されるものではないが、ラテックス、ポリスチレン、もしくはガラスビーズを含む)などの粒子が挙げられる。共有および非共有連結、または受動的吸収の使用を含む、当業界で公知の任意の方法を用いて、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2に対応するポリペプチドもしくはその変異体(もしくはポリヌクレオチド)に結合させるか、または試験化合物を固相支持体に結合させることができる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の発現をモニターすることもできる。例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の発現のための調節因子を、細胞と試験化合物とを接触させ、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列によりコードされるタンパク質の細胞中での発現を決定することにより同定することができる。試験化合物の存在下での、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列によりコードされるタンパク質の細胞中での発現レベルを、試験化合物の非存在下での前記タンパク質またはmRNAの発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づいてJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の発現の調節因子として試験化合物を同定することができる。例えば、細胞中でのJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列によりコードされるタンパク質の発現が、試験化合物の非存在下でよりもその存在下で統計的に、または有意により高い場合、試験化合物は、細胞中でのJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列によりコードされるタンパク質の発現の刺激因子/エンハンサーと同定される。この試験化合物は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物(アゴニストなど)であると言うことができる。
あるいは、細胞中でのJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列によりコードされるタンパク質の発現が、試験化合物の非存在下でよりもその存在下で統計的に、または有意により低い場合、該化合物は細胞中でのJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列によりコードされるタンパク質の発現の阻害剤と同定される。この試験化合物も、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物(アンタゴニストなど)であると言うことができる。細胞中でのJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2 mRNA核酸配列によりコードされるタンパク質の発現レベルは、以前に記載された方法により決定することができる。
結合アッセイについては、試験化合物はJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチド、またはその変異体の結合部位に結合し、それを占有する小分子であってよい。これにより、リガンド結合部位は基質に接近できなくなり、通常の生物活性は阻害される。そのような小分子の例としては、限定されるものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられる。結合アッセイにおいては、試験化合物またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドは、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、放射性アイソトープ標識、化学発光標識、または酵素標識(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼ)を含んでもよい。次いで、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合した試験化合物の検出を、放射線放射の直接計測を介して、シンチレーション計測により、または好適な基質の検出可能な生成物への変換を決定することにより決定することができる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質に結合する試験化合物の能力の決定は、リアルタイムBiamolecular Interaction Analysis (BIA)を用いて達成することもできる[McConnellら、1992 , Science 257, 1906-1912; Sjolander, Urbaniczky, 1991 , Anal. Chem. 63, 2338-2345]。BIAは、いずれの反応体も標識することなく、リアルタイムで生物特異的相互作用を試験するための技術である(例えば、BIA-core(商標))。光学現象表面プラズモン共鳴(SPR)の変化を、生物分子間のリアルタイム反応の目安として用いることができる。
Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質に結合するか、またはそれと相互作用し、その活性を調節する他のタンパク質を同定するために、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドを、当業界で実施される方法に従って2ハイブリッドアッセイまたは3ハイブリッドアッセイ(Szaboら、1995 , Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705; 米国特許第5,283,317号)における釣り餌タンパク質として用いることができる2ハイブリッド系は、分離可能なDNA結合および活性化ドメインからなる、多くの転写因子のモジュラー性質に基づくものである。
機能分析：試験化合物を、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質、またはその変異体の活性を増加または低下させる能力について試験することができる。活性は、精製されたJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質、細胞膜調製物、または無傷の細胞を、試験化合物と接触させた後に測定することができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または100%低下させる試験化合物は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性を低下させるための潜在的な因子、例えば、アンタゴニストと同定される。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または100%増加させる試験化合物は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質の活性を増加させるための潜在的な因子、例えば、アゴニストと同定される。
治療および予防
本発明はまた、被験体における脱毛症を治療または予防する方法も提供する。一実施形態においては、前記方法は、被験体からのサンプル中のJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子の変化の存在、脱毛症を示す変化の存在、または脱毛症に対する素因を検出すること、および脱毛症に対する治療的処置を必要とする被験体に投与することを含む。治療的処置は、薬剤投与(例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2核酸に対するsiRNAを含む医薬組成物)であってもよい。一実施形態においては、投与される治療分子は、配列番号1、3、5または7のアミノ酸配列の少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%を含む、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドを含み、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を低下させる機能を示す。これは、毛包または皮膚から誘導される細胞中での毛髪増殖を開始する能力を修復させることができる。別の実施形態においては、投与される治療分子は、配列番号2、4、6または8の核酸配列の少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%を含む、ポリペプチドをコードするJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子を含む核酸配列を含み、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を低下させる機能を有するポリペプチドをコードし、かくして、毛包または皮膚から誘導される細胞中での毛髪増殖を開始する能力を修復させる。
変化は、DNA、RNAまたはポリペプチドのレベルで決定することができる。必要に応じて、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、確認に基づくアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、対立遺伝子特異的増幅アッセイ、マイクロ配列決定アッセイ、融点曲線分析、変性高速液体クロマトグラフィー(DHPLC)アッセイ(例えば、Jonesら(2000) Hum Genet., 106(6):663-8を参照されたい)、またはその組合せを実施することにより、検出を決定することができる。別の実施形態においては、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子の全部もしくは一部を配列決定することにより、またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子の全部もしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは増幅により、検出が実施される。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子特異的増幅は、変化同定ステップの前に実行することができる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子により占有される染色体領域中の変化は、単独または様々な組合せの、遺伝子座のコード領域および/または非コード領域中の任意の形態の突然変異、欠失、再配置および/または挿入であってよい。突然変異は、点突然変異を含んでもよい。挿入は、遺伝子座のコード領域または非コード領域中の1または複数の残基の付加を包含してもよい。挿入は、遺伝子座中の1〜50塩基対の付加を含んでもよい。欠失は、遺伝子座のコード部分または非コード部分中の1、2個以上の残基の任意の領域、例えば、2個の残基から遺伝子もしくは遺伝子座全体までを包含してもよい。欠失は、より小さい領域、例えば、ドメイン(イントロン)または約50個未満の連続する塩基対の反復配列もしくは断片に作用してよいが、同様により大きい欠失を行ってもよい。再配置は、配列の逆転を含む。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子により占有される染色体領域中の変化は、アミノ酸置換、RNAスプライシングもしくはプロセッシング、生成物不安定性、停止コドンの生成、フレームシフト変異、および/またはトランケートされたポリペプチドの産生をもたらし得る。変化は、機能、安定性、標的化または構造が変化したJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの産生をもたらし得る。変化はまた、タンパク質発現の低下、またはさらには増加を引き起こすこともできる。一実施形態においては、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子により占有される染色体領域中の変化は、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子または対応する発現産物中の点突然変異、欠失、または挿入を含んでもよい。別の実施形態においては、変化は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子の欠失または部分的欠失であってもよい。変化は、DNA、RNAまたはポリペプチドのレベルで決定することができる。
別の実施形態においては、前記方法は、RNA発現の変化の存在を検出することを含んでもよい。RNA発現の変化は、RNA配列の変化の存在、RNAスプライシングもしくはプロセッシングの変化の存在、またはRNA量の変化の存在を含む。これらのものを、当業界で公知の様々な技術、例えば、RNAの全部もしくは一部の配列決定により、またはRNAの全部もしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは選択的増幅により検出することができる。さらなる実施形態においては、前記方法は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現の変化の存在を検出することを含んでもよい。ポリペプチド発現の変化は、ポリペプチド配列の変化の存在、ポリペプチド量の変化の存在、または組織分布の変化の存在を含む。これらのものを、当業界で公知の様々な技術、例えば、配列決定および/または特異的リガンド(抗体など)への結合により検出することができる。
限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション、配列決定、増幅、および/または特異的リガンド(抗体など)への結合を含む、当業界で公知の様々な技術を用いて、遺伝子もしくはRNA発現または核酸配列の変化を検出または定量することができる。他の好適な方法としては、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)、オリゴヌクレオチドライゲーション、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット(DNA用)、ノーザンブロット(RNA用)、一本鎖コンフォメーション分析(SSCA)、PFGE、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、ゲル移動、クランプ変性剤ゲル電気泳動、変性HPLC、融点曲線分析、ヘテロ二本鎖分析、RNase保護、化学的または酵素的ミスマッチ切断、ELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)および免疫酵素アッセイ(IEMA)が挙げられる。これらの手法のいくつか(SSCAおよびCGGEなど)は、配列の変化の存在の結果としての、核酸の電気泳動移動度の変化に基づくものである。これらの技術によれば、配列の変化は、ゲル上での移動度のシフトにより可視化される。次いで、断片を配列決定して、変化を確認することができる。いくつかの他の手法は、被験体に由来する核酸と、野生型または変化した遺伝子もしくはRNAに特異的なプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに基づくものである。プローブは、懸濁液中にあってもよいし、または基質上に固定されていてもよい。プローブを標識して、ハイブリッドの検出を容易にすることができる。これらの手法のいくつかは、ノーザンブロット、ELISAおよびRIAなどの、ポリペプチド配列または発現レベルを評価するために適している。これらのうちの後者は、ポリペプチドに特異的なリガンドの使用、例えば、特異的抗体の使用を必要とする。
配列決定：自動配列決定装置を用いて、当業界で周知の技術を用いて配列決定を実行することができる。配列決定は、完全なJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子上で、またはその特異的ドメイン、例えば、有害な突然変異もしくは他の変化を担持することが公知であるか、もしくは疑われるものの上で実施することができる。
増幅：増幅は、核酸複製を開始するのに役立つ相補的核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づく。増幅は、当業界で公知の様々な技術に従って、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)および核酸配列に基づく増幅(NASBA)により実施することができる。これらの技術は、市販の試薬およびプロトコルを用いて実施することができる。当業界における有用な技術は、リアルタイムPCR、対立遺伝子特異的PCR、またはPCR-SSCPを包含する。増幅は通常、反応を開始させるための特異的核酸プライマーの使用を要する。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子または遺伝子座に由来する配列を増幅させるのに有用な核酸プライマーは、該遺伝子座の標的領域にフランキングするJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイズすることができ、ここで標的領域は脱毛症を有する特定の被験体において変化している。一実施形態においては、増幅は配列番号2、4、6または8のヌクレオチド配列を含むフォワードおよびリバースPCRプライマーを用いることを含んでもよい。
本発明は、脱毛症を有する特定の被験体において変化したJak1、Jak2、Stat1またはStat2コード配列(例えば、遺伝子またはRNA)の一部と相補的であり、これに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プライマーを提供する。本発明のプライマーは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子またはRNA中の変化した配列に特異的であってよい。そのようなプライマーを用いることにより、増幅産物の検出は、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子の変化の存在またはそのような遺伝子の非存在を示唆する。また、プライマーを用いて、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子座中に、またはその周囲に位置する単一ヌクレオチド多型(SNP)を同定することもできる;SNPは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子中およびその周囲に単一のヌクレオチド変化、またはSNPのクラスターを含んでもよい。本発明のプライマーの例は、約5〜60ヌクレオチド長、または約8〜約25ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子であってよい。この配列は、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子の配列から直接誘導することができる。高い特異性を確保するには完全な相補性が有用である;しかしながら、特定の不一致が許容され得る。例えば、上記の核酸プライマーまたは核酸プライマー対を、被験体における脱毛症の存在またはそれに対する素因を検出するための方法において用いることができる。
増幅方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis(編), Academic Press, N.Y., 1990およびPCR STRATEGIES, 1995, Innis(編), Academic Press, Inc., N.Y.)、リガーゼ連鎖反応(LCR) (例えば、Wu, Genomics 4:560, 1989; Landegren, Science 241:1077, 1988; Barringer, Gene 89:117, 1990を参照されたい); 転写増幅(例えば、Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989を参照されたい); ならびに、自己持続型配列複製(例えば、Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990を参照されたい); Qβレプリカーゼ増幅(例えば、Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491, 1997を参照されたい)、自動化Qβレプリカーゼ増幅アッセイ(例えば、Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271, 1996を参照されたい)および他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario)が挙げられる; また、Berger, Methods Enzymol. 152:307-316, 1987; Sambrook; Ausubel; 米国特許第4,683,195号および第4,683,202号; Sooknanan, Biotechnology 13:563-564, 1995も参照されたい。本明細書を通じて、上記の参考文献は全て、その全体が参照により組み入れられるものとする。
選択的ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーション検出法は、核酸配列変化を検出するのに役立つ相補的核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づくものである。検出技術は、野生型または変化した遺伝子もしくはRNAに特異的な核酸プローブの使用、次いで、ハイブリッドの存在の検出を含む。プローブは、懸濁液中にあってもよいし、または基質もしくは支持体(例えば、核酸アレイもしくはチップ技術におけるような)上に固定されていてもよい。プローブを標識して、ハイブリッドの検出を容易にすることができる。例えば、被験体から得られたサンプルを、野生型Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子または変化したJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子に特異的な核酸プローブと接触させた後、ハイブリッドの形成を評価することができる。一実施形態においては、前記方法は、サンプルと、それぞれ野生型Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子および様々なその変化した形態に特異的であるプローブのセットとを同時に接触させることを含む。かくして、サンプル中のJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子中の様々な形態の変化の存在を直接検出することができる。また、様々な被験体に由来する様々なサンプルを、平行して処理することができる。
本発明によれば、プローブは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子またはRNA(の標的部分)と相補的であり、これと特異的にハイブリダイズすることができ、脱毛症の素因となるか、または脱毛症と関連するJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子(または複数の遺伝子)の対立遺伝子と関連するポリヌクレオチド多型を検出するのに好適であるポリヌクレオチド配列であってよい。有用なプローブは、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子、RNA、またはその標的部分と相補的であるものである。プローブは、8〜1000ヌクレオチド長、例えば、10〜800、15〜700、または20〜500ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含んでもよい。より長いプローブも同様に有用であり得る。本発明の有用なプローブは、変化を担持するJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子またはRNAの領域に特異的にハイブリダイズすることができる、8〜500ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。例えば、プローブはJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子により占有される染色体領域に対するものであってよい。
プローブの配列は、本明細書で提供されるJak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子およびRNAの配列から誘導することができる。ヌクレオチド置換、ならびにプローブの化学的改変を実施することができる。そのような化学的改変を達成して、ハイブリッドの安定性を増加させる(例えば、挿入基)か、またはプローブを標識することができる。標識のいくつかの例としては、限定されるものではないが、放射活性、蛍光、発光、および酵素標識が挙げられる。
核酸のハイブリダイゼーションに関する指針は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel(編)、John Wiley & Sons, Inc., New York, 1997; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, Elsevier(編), N.Y., 1993に見出される。
特異的リガンド結合
本明細書で考察される通り、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子により占有される染色体領域における変化またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子の発現における変化を、配列の変化またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現レベルの変化をスクリーニングすることによって検出することもできる。特異的抗体などの、様々な型のリガンドを用いることができる。一実施形態においては、サンプルを、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドに特異的な抗体と接触させた後、免疫複合体の形成を決定する。免疫複合体を検出するための様々な方法、例えば、ELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)および免疫酵素アッセイ(IEMA)を用いることができる。
例えば、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに実質的に同じ抗原特異性を有するその断片または誘導体であってよい。断片としては、Fab、Fab'2またはCDR領域が挙げられる。誘導体としては、一本鎖抗体、ヒト化抗体、または多官能性抗体が挙げられる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドに特異的な抗体は、そのようなポリペプチドに選択的に結合する抗体、すなわち、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはそのエピトープ含有断片に対して生じた抗体であってよい。他の抗原に対する非特異的結合が生じてもよいが、標的ポリペプチドへの結合はより高い親和性で生じ、非特異的結合とは確実に識別することができる。一実施形態においては、前記方法は、被験体から得られたサンプルと、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの野生型または変化した形態に特異的な抗体とを接触させ、免疫複合体の存在を決定することを含んでもよい。必要に応じて、サンプルを、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの野生型または変化した型に特異的な抗体で被覆された支持体に接触させることができる。一実施形態においては、サンプルを、野生型およびその様々な変化した形態などの、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドの異なる形態に特異的な様々な抗体と、同時に、または平行して、または連続的に接触させることができる。
遺伝子治療およびタンパク質置換法
生細胞中への核酸の送達を、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくはレトロウイルス)などのベクターの使用によりex vivo、in situもしくはin vivoで、または物理的DNA導入法(例えば、リポソームもしくは化学的処理)の使用によりex vivoで行うことができる。in vitroでの哺乳動物細胞中への核酸の導入にとって好適な非限定的技術としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、およびリン酸カルシウム沈降法が挙げられる(例えば、Anderson, Nature, supplement to vol. 392, no. 6679, pp. 25-20 (1998)を参照されたい)。本発明のポリペプチドをコードする核酸または遺伝子の導入は、染色体外基質(一過的発現)または人工染色体(安定発現)を用いて達成することもできる。また、細胞を本発明の治療用組成物の存在下でex vivoで培養して、そのような細胞に対する所望の効果またはそのような細胞中での活性を増加させるか、またはもたらすこともできる。次いで、処理された細胞を治療目的でin vivoで導入することができる。
核酸を、ベクター中に挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。パポバウイルス、例えば、SV40(Madzakら、1992)、アデノウイルス(Berkner, 1992; Berknerら、1988; GorzigliaおよびKapikian, 1992; Quantinら、1992; Rosenfeldら、1992; Wilkinsonら、1992; Stratford-Perricaudetら、1990)、ワクシニアウイルス(Moss, 1992)、アデノ随伴ウイルス(Muzyczka, 1992; Ohiら、1990)、HSVおよびEBVなどのヘルペスウイルス (Margolskee, 1992; Johnsonら、1992; Finkら、1992; BreakfieldおよびGeller, 1987; Freeseら、1990)、ならびに鳥類(BiandyopadhyayおよびTemin, 1984; Petropoulos et al., 1992)、マウス(Miller, 1992; Millerら、1985; Sorgeら、1984; MannおよびBaltimore, 1985; Millerら、1988)、およびヒト起源 (Shimadaら、1991; Helsethら、1990; Pageら、1990; BuchschacherおよびPanganiban, 1992)のレトロウイルスなどのいくつかのウイルスが遺伝子導入ベクターとして用いられてきた。in vivoでの遺伝子導入技術の非限定例としては、ウイルス(例えば、レトロウイルス)ベクターを用いるトランスフェクション(その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,252,479号を参照されたい)およびウイルス外被タンパク質-リポソーム媒介性トランスフェクション(全体が参照により組み入れられるDzauら、Trends in Biotechnology 11:205-210 (1993))が挙げられる。例えば、裸のDNAワクチンは一般に当業界で公知である；その全体が参照により組み入れられるBrower, Nature Biotechnology, 16:1304-1305 (1998)を参照されたい。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈内注射、局所投与(例えば、米国特許第5,328,470号を参照されたい)によるか、または定位注射(例えば、Chenら、1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照されたい)により、被験体に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容し得る希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達ビヒクルが埋込まれた遅延放出マトリックスを含んでもよい。あるいは、組換え細胞から無傷のまま完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを製造することができる場合、医薬調製物は遺伝子送達系を産生する1つ以上の細胞を含んでもよい。
遺伝子治療のプロトコルおよび方法の概説については、Andersonら、Science 256:808-813 (1992); 米国特許第5,252,479号、第5,747,469号、第6,017,524号、第6,143,290号、第6,410,010号、第6,511,847号; および米国特許出願公開第2002/0077313号および第2002/00069号(全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。遺伝子治療技術のさらなる概説については、Friedmann, Science, 244:1275-1281 (1989); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); Miller, Nature, 357: 455-460 (1992); Kikuchiら、J Dermatol Sci. 2008 May;50(2):87-98; Isakaら、Expert Opin Drug Deliv. 2007 Sep;4(5):561-71; Jagerら、Curr Gene Ther. 2007 Aug;7(4):272-83; Waehlerら、Nat Rev Genet. 2007 Aug;8(8):573-87; Jensenら、Ann Med. 2007;39(2):108-15; Herweijerら、Gene Ther. 2007 Jan;14(2):99-107; Eliyahuら、Molecules, 2005 Jan 31;10(1):34-64; およびAltarasら、Adv Biochem Eng Biotechnol. 2005;99:193-260(全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
タンパク質置換療法は、輸液により野生型または生物学的に機能的なタンパク質を外部から導入することによりタンパク質の量を増加させることができる。置換ポリペプチドは、公知の化学的技術に従って合成するか、または公知の分子生物学技術により製造および精製することができる。タンパク質置換療法は、様々な障害のために開発されている。例えば、野生型タンパク質を、組換え細胞発現系(例えば、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞- Desnickらの米国特許第5,580,757号; Seldenらの米国特許第6,395,884号および第6,458,574号; Calhounらの米国特許第6,461,609号; Miyamuraらの米国特許第6,210,666号; Seldenらの米国特許第6,083,725号; Rasmussenらの米国特許第6,451,600号; Rasmussenらの米国特許第5,236,838号およびGinnsらの米国特許第5,879,680号を参照されたい)、ヒト胎盤、または動物のミルク(Reuserらの米国特許第6,188,045号を参照されたい)、または当業界で公知の他の起源から精製することができる。輸液後、外因性タンパク質を非特異的または受容体媒介性機構を通じて組織により取得することができる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドを、制御放出系において送達することもできる。例えば、ポリペプチドを、静脈内輸液、埋込み可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて投与することができる。一実施形態においては、ポンプを用いることができる(Langer、上掲; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwaldら、Surgery 88:507 (1980); Saudekら、N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照されたい)。別の実施形態においては、ポリマー材料を用いることができる(Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)を参照されたい; また、Levyら、Science 228:190 (1985); Duringら、Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howardら、J. Neurosurg. 71:105 (1989)も参照されたい)。さらに別の実施形態においては、制御放出系を、治療標的の近くに置くことができ、かくして、ほんの少量の全身用量を必要とする(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release、上掲、vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい)。他の制御放出系は、Langerによる概説中で考察されている(Science 249:1527-1533 (1990))。
医薬組成物および治療のための投与
本発明のJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を被験体に1回投与することができる(例えば、単回注射または沈着物として)。あるいは、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を、約2〜約28日、または約7〜約10日の期間にわたって、それを必要とする被験体に1日1回または2回投与することができる。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を、年に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11回、またはその組合せの期間にわたって、被験体に1日1回または2回投与することもできる。さらに、本発明のJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を、別の治療剤と同時投与することができる。投薬レジメンが複数の投与を含む場合、被験体に投与されるJak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物の有効量は、全投薬レジメンにわたって投与される遺伝子産物の全量を含んでもよい。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を被験体の細胞、例えば、真皮、表皮、真皮乳頭細胞、または毛包細胞に送達するのに好適な任意の手段により、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を被験体に投与することができる。例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2タンパク質およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を、細胞をトランスフェクトするのに好適な方法によって投与することができる。真核細胞のためのトランスフェクション方法は当業界で周知であり、細胞の核または前核への拡散の直接注入；エレクトロポレーション；リポソーム導入または親油性材料により媒介される導入；受容体媒介性核酸送達、バイオバリスティックまたは粒子加速；リン酸カルシウム沈降、およびウイルスベクターにより媒介されるトランスフェクションが挙げられる。
本発明の組成物を製剤化および投与して、活性成分と、ヒトまたは動物(例えば、イヌ、ネコ、もしくはウマ)などの被験体の体内の薬剤の作用部位との接触をもたらす任意の手段により、脱毛症と関連する症候を低下させることができる。個々の治療活性成分として、治療活性成分の組合せ中で、医薬品と共に使用するために利用可能な任意の従来の手段によって、それらを投与することができる。それらを単独で投与することができるが、一般的には、選択された投与経路および標準的な製薬実務に基づいて選択された医薬担体と共に投与される。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物の治療上有効量は、当業者には公知のいくつかの因子に依存し得る。Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物の用量は、例えば、処理しようとする被験体またはサンプルの同一性、サイズ、および状態に応じて、さらに適用可能な場合、組成物を投与しようとする経路、およびJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物が本発明の核酸またはポリペプチドに対して有する医師が望む効果に応じて変化し得る。これらの量は当業者によって容易に決定することができる。本明細書に記載の任意の治療適用を、そのような治療を必要とする任意の被験体、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトなどの哺乳動物に適用することができる。
本発明に従う使用のための医薬組成物を、1つ以上の生理的に許容し得る担体または賦形剤を用いて従来の様式で製剤化することができる。本発明の治療用組成物を、全身および局所または局在化投与などの様々な投与経路のために製剤化することができる。技術および製剤は、一般的にRemmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa (第20版、2000)(この全開示は参照により本明細書に組み入れられる)に見出すことができる。全身投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下などの注射が有用である。注射のために、本発明の治療用組成物を、液体溶液、例えば、Hanks液またはRinger液などの生理的に適合するバッファー中で製剤化することができる。さらに、治療用組成物を、固体形態で製剤化し、使用の直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌され、発熱物質を含まないことを特徴とする。これらの医薬製剤は、ヒトでの使用および獣医学的使用のための製剤を含む。
本発明によれば、製薬上許容し得る担体は、医薬投与と適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含んでもよい。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当業界で周知である。活性化合物と適合する任意の従来の媒体または薬剤を用いることができる。補助活性化合物を組成物中に組み入れることもできる。
本発明はまた、使用のための説明書と共に包装された、製薬上許容し得る担体と、本発明のスクリーニングアッセイを用いて同定されたJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物とを含むキットを提供する。Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質の活性のアンタゴニストであるか、またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質の発現を低下させる調節因子のために、説明書は、哺乳動物の体表面(例えば、腕、脚、ビキニエリア、顔)上での毛髪の喪失を促進するための前記医薬組成物の使用を特定する。
Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質の活性のアゴニストであるか、またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされる1つ以上のタンパク質の発現を増加させるJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2調節化合物のために、説明書は毛髪増殖を調節するための前記医薬組成物の使用を特定する。一実施形態においては、説明書は、脱毛症の治療のための前記医薬組成物の使用を特定する。さらなる実施形態においては、説明書は、毛髪色素を修復させるための前記医薬組成物の使用を特定する。例えば、アゴニストの投与は、被験体における毛髪の白髪を減少させることができる。
Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物を含有する医薬組成物を、本明細書で考察される治療効果のいずれかのために、製薬上許容し得る担体と共に投与することができる。そのような医薬組成物は、例えば、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子を含む遺伝子、もしくはその変異体によりコードされるポリペプチドに対する抗体、またはJak1、Jak2、Stat1もしくはStat2遺伝子によりコードされるポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを含んでもよい。前記組成物を単独で、または限定されるものではないが、塩水、緩衝化塩水、デキストロース、および水などの任意の滅菌生体適合性医薬担体中で投与することができる少なくとも1種の他の薬剤、例えば、安定化化合物と共に投与することができる。前記組成物を、単独で、または他の薬剤、薬物またはホルモンと共に患者に投与することができる。
必要な量のJak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物(例えば、ポリペプチドまたは抗体)を、本明細書に列挙された成分の1つまたはその組合せと共に好適な溶媒中に組み入れた後、必要に応じて、濾過滅菌することにより、滅菌注射溶液を調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、基本となる分散媒体と、本明細書に列挙されるものに由来する必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み入れることにより調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、有用な調製方法の例は、活性成分と、予め滅菌濾過されたその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分との粉末をもたらす減圧乾燥および凍結乾燥である。
いくつかの実施形態においては、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2調節化合物は、経皮吸収のために活性化合物をゆっくりと放出する、経皮送達系を介して適用することができる。透過促進剤を用いて、条件化培地中の活性因子の経皮浸透を容易にすることができる。経皮パッチは、例えば、米国特許第5,407,713号; 米国特許第5,352,456号; 米国特許第5,332,213号; 米国特許第5,336,168号; 米国特許第5,290,561号; 米国特許第5,254,346号; 米国特許第5,164,189号; 米国特許第5,163,899号; 米国特許第5,088,977号; 米国特許第5,087,240号; 米国特許第5,008,110号; および米国特許第4,921,475号に記載されている。
皮下または筋肉内などの、様々な投与経路および様々な細胞埋込み部位を用いて、細胞の凝集した集団を好ましい部位に導入することができる。一度、被験体(マウス、ラット、またはヒト)に埋込まれたら、凝集した細胞は、導入部位での毛包の形成およびその後の毛髪構造の増殖を刺激することができる。別の実施形態においては、トランスフェクトされた細胞(例えば、Jak1、Jak2、Stat1またはStat2遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する細胞)を被験体に埋込んで、被験体内での毛包の形成を促進する。さらなる実施形態においては、トランスフェクトされた細胞は、毛包の終末小体に由来する細胞(真皮乳頭細胞または真皮鞘細胞)である。1回以上の継代にわたって維持された、凝集した細胞(例えば、懸滴培養中で増殖した細胞)またはトランスフェクトされた細胞(例えば、本明細書に記載のように製造された細胞)を被験体(ラット、マウス、イヌ、ネコ、ヒトなど)に導入する(または埋込む)ことができる。
「皮下」投与とは、皮膚のすぐ下(すなわち、真皮の下)への投与を指してよい。一般に、皮下組織は、より大きい血管および神経を保護する脂肪および結合組織の層である。この層の大きさは、身体を通じて、および人から人で変化する。皮下と筋肉層との間の境界面は、皮下投与によって包含され得る。
この様式の投与は、前記組成物中に存在する因子が投与の場所から移動または拡散し、毛髪形成を担う毛包細胞と接触することができる程度に皮下層が十分に薄い場合に実行可能であり得る。かくして、皮内投与が用いられる場合、投与される組成物のボーラスは皮下層の近くに位置する。
細胞凝集物(DPまたはDS凝集物など)の投与は、単一の経路に制限されないが、複数の経路による投与を包含してもよい。例えば、複数経路による投与の例としては、特に、皮内投与と筋肉内投与の組合せ、または皮内投与と皮下投与の組合せが挙げられる。複数投与は連続的または同時的であってよい。複数経路による他の様式の適用は、当業者には明らかである。
他の実施形態においては、この埋込み方法は、いくらかの被験体の1回治療である。本発明のさらなる実施形態においては、多細胞治療埋込みが必要である。いくつかの実施形態においては、埋込みに用いられる細胞は一般に、被験体特異的な遺伝子操作細胞である。別の実施形態においては、異なる種または同じ種の別の個体から得られた細胞を用いることができる。かくして、そのような細胞の使用は、埋込まれた細胞の拒絶を防止するための免疫抑制剤の投与を必要とし得る。そのような方法は、米国特許出願公開第2004/0057937号およびPCT出願公開WO 2001/32840にも記載されており、それらは参照により本明細書に組み入れられる。
阻害剤
サイトカインは、危険シグナルを互いに連絡し、炎症応答を拡散および増幅させるために近隣の細胞を活性化するために産生される。長年にわたって、遮断抗体を用いてこれらのサイトカインを中和する方法と、応答細胞中でのそのシグナリングを阻害する方法の両方が、両手法のために存在する小分子タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤FDA認可薬剤、例えば、サイトカインシグナリングを遮断するIL-2およびTNF遮断抗体ならびに小さい経口利用可能な分子Gleevec(商標)によって研究された。可能な場合はいつでも、中心は、全身毒性を制限しながら有効性を改善するべきである局所小分子製剤を追跡し(治療指数の改善)、生物製剤ピペリン中の他の小分子阻害剤のAAにおける臨床評価を促進する。
サイトカイン受容体のシグナリングを遮断するために、乾癬およびRAを有する患者において既に安全性および有効性が証明されている局所/経口JAK1/2阻害剤(Incyte)を用いることができる。
阻害剤は、ペプチド(抗体またはその断片など)、小分子、目的の遺伝子によりコードされるポリペプチド分子に結合することができる核酸(siRNAもしくはアンチセンスRNA、または他の薬剤など)および/または目的のタンパク質の生物活性もしくはその発現に対する阻害効果を有する分子を含んでもよい。
本明細書で用いられる「Jak1阻害剤」とは、Jak1遺伝子またはJak1タンパク質もしくはポリペプチドと相互作用し、その活性および/またはその発現を阻害する化合物を指す。この化合物は、Jak1によりコードされるタンパク質の活性または発現を低下させることができる。
一実施形態においては、Jak1阻害剤は、配列番号1を含むタンパク質に結合するペプチド断片であってよい。例えば、断片は、配列番号1の少なくとも8個の連続するアミノ酸の任意の一部を包含してもよい。断片は、配列番号1の少なくとも約10個の連続するアミノ酸、少なくとも約20個の連続するアミノ酸、少なくとも約30個の連続するアミノ酸、少なくとも約40個の連続するアミノ酸、少なくとも約50個の連続するアミノ酸、少なくとも約60個の連続するアミノ酸、または少なくとも約75個の連続するアミノ酸を含んでもよい。断片は、約8〜約100アミノ酸を含む全ての可能なアミノ酸長、例えば、約10〜約100アミノ酸長、約15〜約100アミノ酸長、約20〜約100アミノ酸長、約35〜約100アミノ酸長、約40〜約100アミノ酸長、約50〜約100アミノ酸長、約70〜約100アミノ酸長、約75〜約100アミノ酸長または約80〜約100アミノ酸長を含む。これらのペプチド断片は、商業的に取得するか、または液相もしくは固相合成法を介して合成することができる(Athertonら(1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England)。
本明細書で用いられる「Jak2阻害剤」とは、Jak2遺伝子またはJak2タンパク質もしくはポリペプチドと相互作用し、その活性および/またはその発現を阻害する化合物を指す。化合物は、Jak2によりコードされるタンパク質の活性または発現を低下させることができる。
一実施形態においては、Jak2阻害剤は、配列番号3を含むタンパク質に結合するペプチド断片であってよい。例えば、断片は、配列番号3の少なくとも約8個の連続するアミノ酸の任意の一部を包含してもよい。断片は、配列番号3の少なくとも約10個の連続するアミノ酸、少なくとも約20個の連続するアミノ酸、少なくとも約30個の連続するアミノ酸、少なくとも約40個の連続するアミノ酸、少なくとも約50個の連続するアミノ酸、少なくとも約60個の連続するアミノ酸、または少なくとも約75個の連続するアミノ酸を含んでもよい。断片は、約8〜約100アミノ酸を含むあらゆる可能なアミノ酸長、例えば、約10〜約100アミノ酸長、約15〜約100アミノ酸長、約20〜約100アミノ酸長、約35〜約100アミノ酸長、約40〜約100アミノ酸長、約50〜約100アミノ酸長、約70〜約100アミノ酸長、約75〜約100アミノ酸長、または約80〜約100アミノ酸長を含む。これらのペプチド断片を商業的に取得するか、または液相もしくは固相合成法を介して合成することができる(Athertonら(1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England)。
本明細書で用いられる「Stat1阻害剤」とは、Stat1遺伝子またはStat1タンパク質もしくはポリペプチドと相互作用し、その活性および/またはその発現を阻害する化合物を指す。化合物は、Stat1によりコードされるタンパク質の活性または発現を低下させることができる。
一実施形態においては、Stat1阻害剤は、配列番号5を含むタンパク質に結合するペプチド断片であってよい。例えば、断片は、配列番号5の少なくとも約8個の連続するアミノ酸の任意の一部を包含してもよい。断片は、配列番号5の少なくとも約10個の連続するアミノ酸、少なくとも約20個の連続するアミノ酸、少なくとも約30個の連続するアミノ酸、少なくとも約40個の連続するアミノ酸、少なくとも約50個の連続するアミノ酸、少なくとも約60個の連続するアミノ酸、または少なくとも約75個の連続するアミノ酸を含んでもよい。断片は、約8〜約100アミノ酸を含むあらゆる可能なアミノ酸長、例えば、約10〜約100アミノ酸長、約15〜約100アミノ酸長、約20〜約100アミノ酸長、約35〜約100アミノ酸長、約40〜約100アミノ酸長、約50〜約100アミノ酸長、約70〜約100アミノ酸長、約75〜約100アミノ酸長、または約80〜約100アミノ酸長を含む。これらのペプチド断片を商業的に取得するか、または液相もしくは固相合成法を介して合成することができる(Athertonら(1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England)。
本明細書で用いられる「Stat2阻害剤」とは、Stat2遺伝子またはStat2タンパク質もしくはポリペプチドと相互作用し、その活性および/またはその発現を阻害する化合物を指す。化合物は、Stat2によりコードされるタンパク質の活性または発現を低下させることができる。
一実施形態においては、Stat2阻害剤は、配列番号7を含むタンパク質に結合するペプチド断片であってよい。例えば、断片は、配列番号7の少なくとも約8個の連続するアミノ酸の任意の一部を包含してもよい。断片は、配列番号7の少なくとも約10個の連続するアミノ酸、少なくとも約20個の連続するアミノ酸、少なくとも約30個の連続するアミノ酸、少なくとも約40個の連続するアミノ酸、少なくとも約50個の連続するアミノ酸、少なくとも約60個の連続するアミノ酸、または少なくとも約75個の連続するアミノ酸を含んでもよい。断片は、約8〜約100アミノ酸を含むあらゆる可能なアミノ酸長、例えば、約10〜約100アミノ酸長、約15〜約100アミノ酸長、約20〜約100アミノ酸長、約35〜約100アミノ酸長、約40〜約100アミノ酸長、約50〜約100アミノ酸長、約70〜約100アミノ酸長、約75〜約100アミノ酸長、または約80〜約100アミノ酸長を含む。これらのペプチド断片を商業的に取得するか、または液相もしくは固相合成法を介して合成することができる(Athertonら(1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England)。
本明細書で用いられる「Jak/Stat阻害剤」とは、Jak1/Jak2/Sta1/Stat2遺伝子またはJak1/Jak2/Sta1/Stat2タンパク質もしくはポリペプチドと相互作用し、その活性および/またはその発現を阻害する化合物を指す。化合物は、Jak1/Jak2/Sta1/Stat2によりコードされるタンパク質の活性または発現を低下させることができる。
本発明の阻害剤は、配列番号1、3、5または7によりコードされるポリペプチドに対する、抗体(モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラ、もしくは完全ヒト)、またはその結合断片などのタンパク質であってよい。抗体断片は、完全長形態以外の形態の抗体であってよく、遺伝子操作された抗体断片に加えて、完全長抗体内に存在する部分または構成要素を含む。抗体断片としては、限定されるものではないが、一本鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、Fv、および(Fab')2、トリアボディ、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組合せ、可変領域、テトラボディ、二官能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域などが挙げられる(Maynardら(2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402を参照されたい)。抗体を商業的に取得し、特注で作製するか、または当業界で確立された方法(Janewayら(2001) Immunobiology、第5版、Garland Publishing)に従って目的の抗原に対して合成することができる。
また、本発明の阻害剤は、タンパク質に結合し、その機能を破壊する小分子であってもよい。小分子は、一般に低分子量を有する合成および天然物質の多様な群である。それらは天然起源(例えば、植物、菌類、微生物など)から単離することができる、商業的に取得する、および/もしくはライブラリーもしくは集団として入手可能である、または合成することができる。タンパク質を調節する候補小分子を、コンビナトリアルライブラリーのin silicoスクリーニングまたは高効率(HTP)スクリーニングを介して同定することができる。アスピリン、ペニシリンおよび多くの化学療法剤などの多くの従来の薬剤は小分子であり、商業的に取得することができ、化学的に合成することができ、またはランダムもしくはコンビナトリアルライブラリーから取得することができる(Wernerら(2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5(1):32-6)。いくつかの実施形態においては、薬剤は標的タンパク質またはRNAと結合し、相互作用するか、または会合する小分子である。そのような小分子は、標的が細胞内標的である場合、細胞の脂質二重層を貫通して標的と相互作用することができる有機分子であってよい。小分子としては、限定されるものではないが、毒素、キレート化剤、金属、および半金属化合物が挙げられる。小分子を標的化剤に結合またはコンジュゲートさせて、小分子を特定の細胞に特異的に誘導することができる。
医薬組成物および治療のための投与
本発明の阻害剤またはアゴニストを、投与にとって好適な医薬組成物、例えば、阻害剤および製薬上許容し得る担体中に組み入れることができる。
本発明によれば、製薬上許容し得る担体は、医薬の投与と適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含んでもよい。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当業界で周知である。活性化合物と適合する任意の従来の媒体または薬剤を用いることができる。補助活性化合物を組成物中に組み入れることもできる。
本明細書に記載の治療適用のいずれかを、そのような治療を必要とする任意の被験体、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトなどの哺乳動物に適用することができる。
本発明の医薬組成物を、本明細書で考察される治療効果のいずれかのために、製薬上許容し得る担体と共に投与することができる。そのような医薬組成物は、例えば、ポリペプチドに対する抗体を含んでもよい。組成物は単独で、または少なくとも1種の他の薬剤、例えば、限定されるものではないが、塩水、緩衝化塩水、デキストロースおよび水などの任意の滅菌された生体適合性医薬担体中で投与することができる安定化化合物と共に投与することができる。組成物を単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組合せて患者に投与することができる。
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の構成要素：注射用の水、塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗菌剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸もしくはリン酸などのバッファーおよび塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの等張性の調整のための薬剤を含んでもよい。pHは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物を、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入することができる。
注射可能な使用にとって好適な医薬組成物としては、滅菌水性溶液(水溶性の場合)または分散物および滅菌注射溶液または分散物の即興調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与については、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Cremophor EM(商標)(BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易な注射性が存在する程度で流体であるべきである。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、製薬上許容し得るポリオール様グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその好適な混合物を含有する、溶媒または分散物であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより、微生物の作用の防止を達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含有させることが有用であり得る。組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることにより、注射用組成物の吸収の延長をもたらすことができる。
必要な量の本発明の阻害剤(例えば、ポリペプチドもしくは抗体もしくは小分子)またはアゴニストを、必要に応じて本明細書に列挙された成分の1つまたは組合せを含む好適な溶媒中に含有させた後、滅菌濾過することにより、滅菌注射溶液を調製することができる。一般に、基本分散媒体および本明細書に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を含有させることにより、分散物が調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、有用な調製方法の例は、活性成分の粉末および予め滅菌濾過されたその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分をもたらす減圧乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤と共に含有させ、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態で用いることができる。経口組成物を、洗口液としての使用のための液体担体を用いて調製し、液体担体中の化合物を経口的に適用し、口の中で回し、吐き出すか、または飲み込む。
製薬上適合する結合剤、および/またはアジュバント材料を、組成物の一部として含有させることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えば、スターチもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogel、もしくはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテ(sterote)；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または香料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料を含有してもよい。
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によるものであってもよい。経粘膜または経皮投与のためには、障壁を透過させるのに好適な浸透剤が製剤中で用いられる。そのような浸透剤は、当業界で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与のためには、活性化合物は当業界で一般に公知の軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。
別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例示的方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと類似するか、または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることもできる。
当業者であれば、日常的な実験を超えるものではないものを用いて、本明細書に記載の特定の物質および手順に対するいくつかの等価物を認識または確認することができる。そのような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、以下の特許請求の範囲によって包含される。
本明細書に記載の全ての刊行物および他の参考文献は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または参考文献が具体的かつ個々に参照により組み入れられると示されたように、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。本明細書で引用される刊行物および参考文献は、従来技術であることを承認されるものではない。
(実施例)
本発明のより完全な理解を容易にするために、実施例が以下に提供される。以下の実施例は、本発明を作製し、実施する例示的様式を例示するものである。しかしながら、同様の結果を得るために代替的な方法を用いることができるので、本発明の範囲は、例示のためだけのものであるこれらの実施例に開示される特定の実施形態に限定されない。
インターフェロンγは、マウスAAにおける標的であることが示されている(Nakamuraら、2008, Am J Pathol, 172(3): 650-658を参照されたい; また、Freyschmidt-Paulら、Br J Dermatol., 155(3):515-521も参照されたい; また、Gilharら、Journal Invest. Dermatol., 124(1):288-289も参照されたい)。ヒトAAにおいては、AAのPBMCはTh1偏向を示し、AA皮膚はIFN特徴およびGWAS遺伝子(SOCS/IFN-g/)だけでなく、IL-2/6/13/21/26も示す。
インターフェロンγ経路(図7)は、標的HF細胞中でNKG2DLを誘導し、DCによる抗原提示を増強し、Th1細胞性自己免疫を促進し、NKおよびCTL媒介性細胞溶解を増加させる。
臨床開発中のJAK1/2阻害剤としては、a)局所および経口用のINCB018424;5nM活性(Incyte); b)CEP-701(Cephalon);およびc)TG101348が挙げられる。
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AAにおける臨床プログラムは、以下のものを含む:
・軽度から中程度のAA：局所JAK阻害剤を用いる、2/3期の乾癬および経口3期骨髄線維症。
National Alopecia Areata Registryを通じて確認された集団に基づくコホート評価事例対New York City Cancerプロジェクトを通じて確認された対照。それらをAIMSを用いてNorthern European血統について一致させた：
・事例：n=1080(全身性脱毛症=482;完全脱毛症=120;一過性円形脱毛症=176;斑状円形脱毛症=302)
・対照：n=1053。
図9は、円形脱毛症におけるゲノムワイド関連研究(GWAS)を提供する。
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標的器官におけるNKリガンドなどの他の自己免疫疾患との共通の経路としては以下のものが挙げられる：
・RAにおいては、滑膜細胞はMICリガンドを異常発現し、自己反応性T細胞刺激をもたらす。
・セリアック病においては、MICリガンドは活動性疾患の間に腸上皮中で過剰発現される。
・1型糖尿病においては、前糖尿病NODマウス中の島細胞はRAE-1リガンドを発現する。
遺伝的に素因のある個体におけるNK活性化リガンドの異常発現は疾患を誘導するか、または悪化させ得る。
新しい治療機会を提供するAAにおける候補経路としては、以下のものが挙げられる：
・T細胞活性化に対する相補効果を有し、そのバランスが免疫および自己免疫応答の全体の結果を制御する、共刺激受容体ファミリーのメンバー。
・NK細胞の細胞傷害応答を増強し；T細胞による前炎症サイトカインの産生を誘発し；およびCD4(+)T細胞のTh17細胞への分化を誘導する遺伝子。
・免疫寛容の維持に必要とされる調節T(Treg)細胞の生存および増殖を制御することにより適応免疫系を調節するのに中枢的な役割を果たす遺伝子。
・ナチュラルキラー(NK)細胞、NK1.1(+)T細胞、およびT細胞上で発現される活性化受容体。NKG2Dリガンドとしては、MHCクラスI鎖関連(MIC)A、MICBが挙げられる。
AAの治療のための候補化合物としては、Ivanenkovら、Mini Rev Med Chem. 2011 Jan;11(1):55-78(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されたJak/Statシグナリングに対する化合物が挙げられる。
以下の遺伝子研究を実施した：
・別の1000人のAA患者を用いる複製研究
・候補領域の大規模配列決定
・10,000人の患者の収集
・一般遺伝子試験T1D、CeOおよびAA。
NK活性化リガンドを用いる免疫学的研究を、ULBP3、ULBP6誘導性トランスジェニック、新規マウスモデルを用いて実施する。
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研究サンプル、遺伝子型、品質制御および集団層化
円形脱毛症(AA)は主要な医学的問題であり、米国における最も高頻度の自己免疫疾患(表8)であり、あらゆる民族群にわたって男性および女性を含む約460万人が罹患し、その生涯リスクは1.7%である(Kyriakis KP, Paltatzidou K, Kosma E, Sofouri E, Tadros A, Rachioti E. Alopecia areata prevalence by gender and age. J Eur Acad Dermatol Venereol. 23:572-3, 2009)。さらに、AAは、アンドロゲン性脱毛症に次いで2番目に最も一般的な形態のヒトの脱毛であり、罹患した個体の外観が有意に損なわれ、心理的苦痛を引き起こす(図1)。AAは、全身性エリテマトーデス(LE)、1型糖尿病(T1D)、乾癬、多発性硬化症(MS)および慢性関節リウマチ(RA)などの多くの他の自己免疫疾患を合わせたよりも多くの個人が罹患している(表8)。
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これらの他の症状とは全く対照的に、AAの発病およびその革新的治療の開発における研究は大きく遅れている。これは、AAが単に審美的障害であるという見識に一部起因するものであり得る。現実には、AAはあらゆる皮膚疾患の間、特に、自己の印象がその外見と密接に関連する子供および青年の間では最も高い負担の1つである(Bickers DR, Lim HW, Margolis D, Weinstock MA, Goodman C, Faulkner E, Gould C, Gemmen E, Dall T; American Academy of Dermatology Association; Society for Investigative Dermatology. The burden of skin diseases: 2004 a joint project of the American Academy of Dermatology Association and the Society for Investigative Dermatology. J Am Acad Dermatol. 55:490-5, 2006)。
その高い有病率にも拘らず、AAのためのエビデンスに基づく治療は存在しない。合計540人の参加者を含む17の無作為化臨床試験(RCT)の包括的コクラン分析評価は、AAの治療を証明しなかった(Delamere FM, Sladden MM, Dobbins HM, Leonardi-Bee J. Interventions for alopecia areata. Cochrane Database Syst Rev. 2:CD004413, 2008)。それぞれの臨床試験は、6〜85人の参加者を含み、局所および経口コルチコステロイド、局所シクロスポリン、光力学治療ならびに局所ミノキシジルを含む様々な介入を評価した。全体として、それらの介入はいずれも、プラセボと比較した場合、毛髪増殖に関して有意な治療利益を示さなかった。AAに関して有益である治療はわずかである(あったとしても)と証明されると結論付けられた。ジフェンシプロン、ジニトロクロロベンゼン、病変内コルチコステロイドまたはジトラノールの使用に関するRCTは見出されなかったが、これらの薬剤はAAの治療に一般的に用いられる。同様に、局所コルチコステロイドおよびミノキシジルは広く処方されており、安全であると考えられているが、それらが長期的に有益であるという説得力のある証拠はない。多くの臨床試験はあまり報告されておらず、および/または重要な臨床的利益が決定的でないほと少ない。これらの観察はAAの遺伝的基礎を規定し、その病因を決定する重要性を強調し、合理的な治療手法を開発することができ、翻訳研究を始めることができる。
円形脱毛症におけるJak/Stat標的化の前臨床評価
NKG2D受容体(NKG2D)は、危険シグナルを発する細胞を排除するように機能し、この認識プロセスの調節障害は自己免疫の発生を誘導することが多い。理論によって束縛されるものではないが、NKG2DL発現が転写レベルで阻害される場合、JAKおよびNF-kb阻害の影響が追求される。JAK1/JAK2阻害剤(po/局所)であるINCB18424は、筋増殖/筋線維障害および乾癬について第II相臨床試験中である。
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GWAS研究は、他の形態の自己免疫、例えば、慢性関節リウマチ(RA)、I型糖尿病(T1D)、セリアック病(CeD)、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症(MS)および乾癬(PS)と共に共有されるいくつかの危険遺伝子座、特に、CTLA-4、IL2/IL2RA、IL21およびTreg維持にとって重要な遺伝子を示した。
AAの遺伝的基礎は、AAの根本的な機構に基づく治療の探索手段を提供する。そのような治療は、他の形態の自己免疫と共通のT細胞サブセットおよび機構だけでなく、Jak1/Jak2および下流のエフェクターのシグナリング経路を含む独特の機構にも焦点を当てる。
AAにおける自己免疫の起源は、毛包自体にあり得る。本明細書に記載の研究は、AAの発症に寄与し得る毛包における推定危険シグナルの規定に焦点を当てたものである。AAの発症を誘導する免疫調節障害に寄与し得るMHC内に存在する病原対立遺伝子も同定される。これは、免疫系に対する新抗原としての危険シグナルの提示における抗原提示細胞(APC)の重要性に一部起因し得る。
Jak1/Jak2シグナリングの機構を調査し、疾患誘導の駆動因子としてのJak1/Jak2/Stat1/Stat2相互作用の重要性を評価する。Jak1/Jak2/Stat1/Stat2シグナリングを遮断する薬理学的手法を追跡する。
C3H IFN-γ欠損マウスは、AAの発生から保護される。IFNは培養ヒト皮膚ケラチノサイトおよび線維芽細胞中でNKG2DLを上方調節することができることが示されている。さらに、ｍNKG2D架橋は先天的NK、NKTおよびγδT細胞によるIFN-γ産生を誘導し、かくして、潜在的な正のフィードバックループを作製し、適応自己反応性免疫を駆動する。かくして、養子免疫伝達および抗体枯渇/遮断実験により、関与するNKG2D担持細胞が定義される。
CD8 NKG2D軸の遮断を目的とする薬理学的介入を試験する。NKG2DLの上方調節またはNKG2D担持細胞の活性化の阻害は両方とも、追跡される合理的な手法である。IFN→JAK/STAT経路はNKG2DL発現を誘導することができることが示されている。
IFN→JAK/STAT経路が正常および疾患皮膚におけるNKG2DL誘導にとって中枢的であるかどうかを評価する。IFN JAK/STATシグナリング経路を、乾癬において初期に臨床試験で成功した薬剤などの局所JAK1/JAK2阻害剤を用いて効率的に阻害することができる。I型インターフェロン応答がNKG2Dリガンド上方調節の基礎にある場合、JAK1/JAK2阻害剤はこの誘導を遮断し、ならびに適応免疫応答のIFN-γ依存的構成要素を遮断することができる。
参考文献
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円形脱毛症(AA)の基礎となる特定の自己免疫機構は依然として曖昧であるため、従って、AAの臨床調査は歴史的に他の自己免疫疾患に遅れを取っている。自己免疫における臨床評価に利用可能な多くの新しい生物治療剤があるにも拘らず、病変内または全身ステロイドが依然としてケアの標準であり、この十年で2つの小規模無作為化臨床試験だけが公開されている。GWAS遺伝子の探索により提供された見識は、機構的および治療的関連性の両方についてGWASにより同定された免疫学的経路を調査することによって、このギャップを埋めるためのロードマップを提供する。
円形脱毛症のマウスモデルにおける有効な臨床的に関連する治療の同定：正常な状態では、毛包(HF)は免疫特権(IP)を有する聖域であり、古典的HLAクラスI分子をほとんど、または全く発現しない。活発なAAにおいては、HLAクラスI発現およびNKG2Dリガンド発現が顕著に上方調節されるため、IP状態が失われる。NKG2Dリガンド座とヒトAAとの強い遺伝的関連を考慮すると、理論によって束縛されるものではないが、免疫エフェクター細胞上での異常なNKG2DL上方調節および持続的NKG2D活性化が、炎症的AAの開始および進行を駆動する。理論によって束縛されるものではないが、セリアック病に関してと同様、AAにおいても、IL-15は手当たり次第の「NK型」CD8細胞傷害性を可能にするCD8 T細胞エフェクター分化を駆動することができる。実際、局所HF IL-15/NKG2DL炎症シグナルは、IFNγ産生およびHF細胞傷害性を担う重要なAA免疫エフェクターと同様、NKマーカーを発現するCD8+T細胞の深い浸潤を伴う。ヒトおよびマウスの両方で行われたこれらの集合的観察は、治療的評価を招く。
関連するサイトカイン(IFN-γおよび関連する免疫受容体シグナリング経路(NKG2D))を用いて阻害することによるNK様再プログラミングおよび細胞傷害性の遮断の治療的可能性。全ての移植されたC3Hマウスが時宜を得た様式でAAを発症する脱毛症の移植モデルを12週内に用いる。C3H/HeJにおける自然疾患の防止/逆転の評価は、そうでなければ遅い開始(6ヶ月齢未満)および低い累積発生率(15%)を考慮すると実用的でないため、これは薬剤スクリーニングを大きく加速させる。潜在的な局所送達の利点を有する小分子手法と、優れた生物特異性を有する生物治療タンパク質(抗体)の両方が評価される。包括的な目標は、より臨床的に維持できる小分子局所手法により標的化することができる重要な免疫経路を確立するために生物治療剤を使用することである。
疾患関連AAバイオマーカーの同定およびC3Hマウスにおける有効な治療によるその逆転：例えば、GWASおよび転写プロファイリングを用いる手法、ならびに例えば、T細胞サブセットの免疫染色およびFACを用いる手法が、AAマウスの皮膚および血液中のいくつかの病因的AAバイオマーカーを同定するために取られた。これらのマウス研究は、ヒトAAにおける翻訳バイオマーカープラットフォームの開発を知らせるために継続する。皮膚においては、脱毛症のC3H/HeJマウスにおける研究により、HF関連INF-γ産生CXCR3+NKG2D担持CD8 T細胞エフェクターの深い浸潤の動員を担うようであるケモカインCXCL9〜11などのIFNにより誘導される遺伝子が劇的に上方調節されることが証明された。スペクトル型データは、これらの循環するNKG2D+CD8 T細胞エフェクターが、疾患の進行を増加させる真正の自己抗原駆動性エフェクターT細胞であることの顕著な証拠を提供する。治療の間のマウスにおけるこれらの血清学的、皮膚および細胞バイオマーカーの一時的評価により、治療の結果を予測し、臨床バイオマーカーの探索/利用を知らせる力学的な、機構的に重要な、予見的炎症バイオマーカーを同定することができる。
ex vivoでのAAヒト組織を用いる標的化手法の前臨床検証：AAマウスモデルにおける「概念実証」を証明する治療の臨床開発を促進するために、ヒトAA組織を標的検証および相関研究に用いる。「クロールアウト」系は、ヒトAAのT細胞生存/増殖/機能を効率的に阻害する、マウスAAを逆転させる薬剤がヒトに変換されることを検証するための都合の良いex vivoヒトバイオアッセイを提供する。
数千人の脱毛症被験者からのヒトDNAがヒト疾患におけるGWAS遺伝子および独特の見識を提供したのと全く同じように、AA被験者からのヒト組織、血液および皮膚を用いて、究極的には治療的利用性のために、これらの遺伝的に関与する免疫経路を調べることを継続する。概念的には、前臨床試験を提供する、このヒトでの追跡の円形脱毛症のマウスモデルは、円形脱毛症における治療手法のための基盤である。
自己免疫疾患は、米国においては見積もりで2300万人が罹患し(1)、AAの有病率は確立されていないが、それは最も高頻度の自己免疫疾患の1つである(2、3)。1999年〜2000年には、AAについて見積もりで240万人が診察に訪れ、その半分の患者が20歳代および30歳代である。AAは、罹患した個体の有意な外観の悪化および心理的苦痛を引き起こし、あらゆる皮膚疾患の間、特に、自己の印象がその外見と密接に関連する子供および青年の間では最も高い負担の1つである(4)。現在では、AAの予後は予測不可能であり、決定的な治療はない。現在の治療は、ステロイドおよび局所免疫治療を含み、患者の1/3においてのみ持続的な寛解を誘導する(5、6)。その高い有病率にも拘らず、包括的コクラン分析評価は、AAに関するエビデンスに基づく治療はないと結論付けている(7)。
他の自己免疫症状とは全く対照的に、AAの発病およびその革新的治療の開発における研究は大きく遅れている。標的化された免疫治療の時代には、AAにおけるタンパク質生物治療剤を評価する2つの臨床研究のみが報告されている(8、9)(両方ともT細胞輸送を標的化している)。部分的には、これは合理的な治療手法の評価を促進する特異的AA免疫経路の限定的理解に起因するものであった。AAの遺伝的および病因的基礎の新しい理解に基づいて、この疾患における前臨床概念実証データを取得することができる。
GWAS(10)研究は、RA、T1D、セリアック病(CeD)、SLE、MSおよびPSなどの他の形態の自己免疫により共有されるいくつかの危険遺伝子座、特に、CTLA4、IL2/IL2RA、IL21、NKG2DリガンドおよびTreg機能にとって重要な遺伝子(Eos)を示した。RA、T1DおよびCeDとの遺伝的共通性は、末端器官(滑膜、島、腸および皮膚)におけるNKリガンドの発現の病因的重要性、ならびにこれらの3つの疾患のそれぞれの病因におけるNKG2DL/NKG2D経路の関与を考慮すると特に注目すべきである(11、14)。皮膚における免疫治療研究の1つの利点は、標的器官へのアクセスの相対的容易性である。かくして、皮膚を試験する本明細書に記載の研究は、標的器官がアクセス可能ではないこれらの他の関連するヒト疾患の理解に影響する、NKG2DおよびIL-15により誘発されるCD8細胞傷害性、IFNにより誘発される損傷などにおける重要な見識を提供することができる。実際、共通の原因を有するこれらの自己免疫疾患のいずれか1つにおける積極的な研究は、一般的な治療のための基礎として役立ち得る。
AAの基礎となる特定の自己免疫機構は、それが毛包のT細胞媒介性攻撃の結果であるという支配的な見解を超えては依然として曖昧である。正常な状態では、毛包は古典的HLAクラスI分子をほとんどまたは全く発現せず、その代わりに阻害的HLAリガンドHLA-EおよびHLA-Gを発現し、かくして、さもなければ「自己喪失」(16、18〜21)に反応し得るNK細胞を負に調節しながら、クラスI制限されたCD8細胞による免疫認識を同時に回避する免疫特権(IP)を有する聖域(15〜17)である。活発なAAにおいては、HLAクラスI発現が顕著に上方調節されるため、正常な毛包のIP状態は稼働しない。以前の研究により、CD4およびCD8 T細胞の両方がマウスおよびヒトにおける皮膚の脱毛症領域中の毛包の周囲に浸潤することが指摘された(22、23)。実際、B細胞または血清ではなく、全T細胞の導入は、脱毛症のマウスまたはヒトから、正常なWT(24)またはSCIDマウス(25)に疾患を移動させ、病因細胞としてエフェクターT細胞を示唆する。しかしながら、部位特異的炎症の分子メディエーターは以前に同定されていない。GWASの知見および以前の免疫学的研究により導かれたように、この一般的な自己免疫障害における新しい見識が提供され、AAを有する患者の満たされない必要性を満たすための革新的な、合理的に標的化された治療の開発をもたらす。
GWAS研究により同定されたAAの免疫学的経路：円形脱毛症と関連することがわかった最も有意な遺伝子座を表10に示す(灰色の領域は「名目上有意な」遺伝子を示す)。これらの独創的研究を、異なる集団における確認研究において検証した。下線付きの遺伝子は、HFで発現される遺伝子であるが、太字の遺伝子は免疫細胞中で発現される遺伝子である。全体として、多くの疑わしい遺伝子座が他の組織特異的自己免疫状態により共有され、I型糖尿病は多くの顕著な重複を示す(右欄)。RA、T1DおよびCeDとの共通性は特に注目すべきであるが、これはNKG2Dがこれらの3つの疾患のそれぞれの発症において有意な役割を有することが示されているからである(11〜14)。かくして、これらの疾患/モデル系のいずれか1つにおける見識は、複数の自己免疫状態により共有される一般的な病因経路を明らかにするようである。同定された最も有意な対立遺伝子(HLA以外)は4つのNKG2Dリガンド(太字の斜体で示されたUBLP-3/UBLP-6/MICA/MICB)および1つの阻害的リガンド(HLA-G)であった。NKG2D受容体(NKG2D)は、危険シグナルを発する細胞を排除するように機能し、この認識プロセスの調節障害は自己免疫の発生を誘導することが多い(26)。危険に寄与する他のHF発現遺伝子としては、HLA、抗原プロセッシング遺伝子(TAP)およびPRDX/STX17が挙げられる。
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活性化されたNKG2Dを担持するCD8エフェクターによるIFN-γ産生は、免疫特権を逆転させ、炎症ループを永続させ得る。
IFN-γ関連経路は臨床調査の下で存在する治療剤により弱体化され、翻訳への道を促進し得る。この10年にわたって、タンパク質チロシンキナーゼのいくつかの小分子阻害剤(PTKi)が、経口および局所送達の両方のために上手く臨床開発されてきた。PTKi手法は、AAにおけるCD8媒介性炎症応答の遮断、すなわち、CD8エフェクターサイトカインIFN-γの下流にある、サイトカイン応答性を担う、JAK/STATシグナリングの阻害を追求する。
脱毛症マウスにおけるエフェクターT細胞応答を標的化する臨床的に関連する治療の同定
AA皮膚に由来する全細胞集団の免疫染色およびフローサイトメトリー分析を用いて、CD8+NKG2D+T細胞が毛包中に浸潤し(図17)、正常な皮膚ではなくAA中で増殖する(図18および図4A)ことがわかった。さらに、AAマウスは、AA皮膚リンパ節および血液の両方におけるCD8+NKG2D+集団の劇的な全身的増殖に少なくとも一部起因して、皮膚リンパ節症を示し、全LN細胞の全部で6±1%が全PBMCの2.4±1.3%であり、それぞれ正常なC3Hマウスにおいて認められるものよりも10倍以上高いことを示している。これらのCD8+NKG2D+T細胞は、HF真皮鞘細胞に対して強い細胞傷害性を示す（図21）。CD8+NKG2D+T細胞のさらなる免疫表現型分析により、この集団がT記憶マーカーCD44+および複数の「NKマーカー」、例えば、DX5、NKG2A/C/EおよびNKp46を発現することが示された(図19)。
循環するCD8+NKG2D+集団が真正の「AA特異的」エフェクター集団である証拠を提供するために、理論によって束縛されるものではないが、リンパ節に見出されるCD8+NKG2D+T細胞はAA皮膚に浸潤することがわかった全T細胞と類似するTCRレパートリーを発現することができる。図20は、CD8+NKG2D-リンパ節集団がCDR長の正常な分布、制限されないポリクローナルT細胞集団を反映するパターンを示すことを示している。対照的に、皮膚T細胞のTCRレパートリーは、少数のCDR長により支配されるほぼ全てのVβファミリーメンバーに関して高度に制限され、これは抗原により駆動されるT細胞のオリゴクローナル集団を示唆する。皮膚リンパ節細胞に由来するCD8+NKG2D+T細胞も高度に制限され、全皮膚T細胞と顕著に類似するパターンを示す。
これらのデータは、CD8+NKG2D+T細胞が皮膚に見出される多くのオリゴクローナルT細胞集団を含有することを確認する。さらに、皮膚およびリンパ節における一般的なオリゴクローナルT細胞の増殖に関する証拠は、これらのLN集団(またはさらにはマーカー)が炎症事象への反応プロセスとして増殖/活性化される可能性に反論する。例えば、Treg細胞(CD4+CD25+FoxP3+)の数もAAリンパ節においては増加するが、そのスペクトル型は多様であり、皮膚に存在するものとは異なるため、これは反応プロセスであるようである。いくらかのTCR/クローン、例えば、Vβ10は、流出する(draining)皮膚リンパ節ではなく、皮膚に見出されることに留意されたい。これらのものは、選別されたCD8+LN画分中に存在するのではなく、AA皮膚中に見出されるCD4+T細胞集団を含むようである。これらのデータは、CD8+NKG2D+T細胞がマウスAAにおける病因的NKG2D+エフェクターであることを確立し、マウスモデルとヒトAAとの類似点を確立している。
in vivoでの治療手法のための概念実証を確立するための前臨床AAモデル
C3H/HeJ皮膚移植モデル：円形脱毛症のC3H/HeJマウスモデルは、1994年に初めて報告されたこのモデルであるため、これを研究した(29、30、31)。円形脱毛症の他のマウスモデルも見出されてたが(32)、このモデルは依然として最も研究されており、当業界で今日でも用いられている。長年にわたってこのモデルを用いて様々な薬剤の試験が行われ(33)、様々なプロトコルが最適化されている(34)。
2〜3ヶ月齢の罹患していないC3H/HeJメスマウスへの脱毛症C3H/HeJマウスからの完全な厚さの皮膚移植は、全レシピエントにおいて移植の10週以内に斑状脱毛症をもたらし、20週で一般化された脱毛症に進行する。組織病理学者の伝統的訓練に基づいて様々な包括的および効率的な組織学的スコアリング系が用いられ、記述に用いられる形容詞(正常、0；軽度、1；中程度、2；重篤、3；および極度、4)は関連データベースへの輸入のための数値に変換される(マウス疾患情報系[またはMoDIS]: http://research.jax.org/faculty/sundberg/registration.php)(35、36)。このデータベースは、統計分析への輸入のためのExcelまたは他のソフトウェアプログラムを介して輸出できる。円形脱毛症は、重篤度、炎症細胞の位置、炎症細胞の型および相対数(顆粒球、マスト細胞、リンパ球)、毛包ジストロフィーなどに基づいて等級付けられる。分子RNAおよびタンパク質バイオマーカーは、このパネルに組み入れられ、この複数の変数データベースの作製および分析が行われる。
プロトコル番号1：予防設定においては、レシピエントマウスを移植後の第1週から開始して治療する。
プロトコル番号2：治療については、初期に確立されたAAを有する移植マウスを、AAの進行を逆転させるために治療する。
薬剤を、まずは予防モデルにおいて試験する。次いで、AAを上手く予防する薬剤を、確立された疾患の設定における二次的評価に前進させるが、最初の試験に失敗したものを除外し、他の革新的手法の登録を許可する。以下のものは、初期の治療的手法であり、特定の生物剤および小分子の両方を前臨床評価のために選択した。
Tエフェクター応答に関与する活性化経路を標的化する小分子JAKタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤(PTKi)を試験する。これらのPTKiは、既に第III相臨床試験にあり、翻訳および「NK型」T細胞標的化局所の潜在的な臨床開発を容易にする。
小分子PTKi介入を用いる治療的介入
局所送達は、全身曝露および毒性の制限において明らかな利点を有する。前臨床および臨床試験により、クリーム中の小分子PTKi送達が皮膚障壁を乗り越え、全身曝露の限定と共に真皮中の有効な局所濃度を達成することが示された(78)。AAにおけるエフェクターT細胞に対して中枢的な重要なPTK、すなわち、サイトカインIFNγが標的化される。
Jak1/2阻害によるIFNの標的化：インターフェロンは、HF免疫特権の排除および細胞性炎症応答の誘導などの炎症応答におけるいくつかのステップに参加するようであるので、魅力的な治療標的である。インターフェロンは毛包末端器官におけるいくつかの関連する前炎症分子、例えば、NKG2DL、接着分子(例えば、ICAM-1)、抗原プロセッシング/提示(TAP1/2、LMP、プロテオソーム、MHCIおよびII)を上方調節し、さらに免疫エフェクター応答を駆動する(Th1型応答、DC活性化およびIFN-γ媒介性細胞傷害性の増加)。AAのC3H-HeJマウスモデルにおいては、IFN-γが発症に必要であり(89、90)、インターフェロン-γの投与は疾患を加速する(91)。重要なことに、IFN-γ中和抗体の投与は、C3H-HeJマウスにおいてAAの発症を逆転させる(92、93)。同様に、ヒトにおいては、円形脱毛症はI型インターフェロン治療の副作用としていくつかのシリーズで注記されており(94〜104)、ヒトAA皮膚の転写プロフィールは病変生検におけるI型IFN応答(105)ならびに末梢血におけるTh1偏向およびIFN応答性サイトカイン/ケモカインの上昇(図22、23)(106〜110)を注記し、(111)に概説されている。AA皮膚生検外植片から得られたT細胞は、不均質なCD8+NKG2D+細胞であり、刺激した場合、IL-4またはIL-17ではなく、IFN-γを産生した(図21A)。全く対照的に、正常な皮膚外植片から得られた大部分のT細胞はCD4+である(112、113)。この状況はAAマウスにおいて類似しており、IFN-γ産生CD8 T細胞は皮膚リンパ節中で増殖する(図19、21)。皮膚においては、病変および非病変C3H皮膚から単離された全皮膚の本発明者らの転写プロフィール研究により、優勢な特徴としてインターフェロン応答が同定され、20個の上方調節される遺伝子のうちの17個がインターフェロン応答遺伝子である(図22)。実際、IFNは毛包標的上のNKG2DL発現を上方調節し、IFN媒介性発症サークルを閉じ、CD8エフェクターにより作られたIFN-γはCD8+NKG2D+活性化を誘導するHF NKG2Dリガンドを駆動する。
臨床的JAK1/2阻害剤：自己免疫におけるINF応答を標的化する遮断抗体(114、115)および小分子PTKiが両方とも、臨床開発下にある。IFNに誘導されるSTAT1/2活性化は、Jak1/Jak2/Tykキナーゼにより媒介され、いくつかの自己免疫症状、例えば、RAおよび乾癬における経口Jak1/Jak2 PTKを用いる臨床データが出現した。局所治療は、全身的免疫抑制の可能性を制限する治療指数の改善の追加の利点を有する。INCB018424は、Jak1およびJak2を阻害し(IC50=1nM)、現在臨床調査中の唯一の局所JAK阻害剤(78)であり、その安全性プロフィールは現在まで許容されている。経口送達に関する概念実証は、Jak依存的疾患(筋線維症)(116)および局所サイトカイン産生によって駆動される皮膚疾患(乾癬モデル)(78)において証明されている。乾癬被験者においては、局所INCB018424は、皮膚Th1/Th17サイトカイン応答の迅速な臨床応答および正規化を誘導した(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00820950からの非公開データ)。同時に、局所INCB018424は、INF特徴により支配される炎症状態である円形脱毛症において効果を有すると予測される安全な介入である。
手法：プロトコル番号1：INCB018424の全身送達：1日2回(90mg/kg)の経口胃強制投与は、良好な全身曝露を提供し、げっ歯類において3〜6時間のt1/2半減期を与えた。この様式で、本発明者らはJAK1/2阻害がAAの進行を防止するかどうかを評価することができる。
プロトコル番号2：INCB018424(1.5%)の局所送達：局所JAK1/JAK2阻害剤による斑状AAの逆転。移植の6〜10週後に出現し始める、移植マウスにおける新しく罹患した斑状領域に対して、毎日の局所治療(78)を開始する。局所治療は、毛繕い、舐めなどに由来する全身曝露を防止するための好適な包帯によりマウス皮膚の特定の領域に限定することができる。重要なことに、罹患した領域を治療することにより、本発明者らは、局所曝露がAAの進行を逆転させることができるかどうかの臨床的に関連する疑問を評価することができる。
臨床調査を知らせるAA疾患活性のマウスバイオマーカーの同定
これらの前臨床研究における治療結果に付随する免疫学的事象の同定は、提唱された作用機構を検証するため、およびAA患者におけるこれらの同じ治療の潜在的な臨床評価を知らせる有用なバイオマーカーを提供するための両方において重要である。臨床評価においては、生物標本は血液および皮膚サンプルに限定されるため、これらの部位から容易にサンプリングされるマウス中のマウスバイオマーカーに焦点が当てられる。例えば、GWASおよび転写プロファイリングを用いる手法、ならびに例えば、T細胞サブセットの免疫染色およびFACを用いる手法が、AAマウスの皮膚および血液中のいくつかの病因バイオマーカーを同定するために取られてきた。脱毛症のC3H/HeJマウスにおける研究は、IFN誘導遺伝子などの、AAにおいて上方調節されるいくつかの皮膚バイオマーカーを既に同定している(図22)。スペクトル型データ(図20)は、これらの循環NKG2D+CD8 T細胞エフェクターが真正の自己抗原駆動性エフェクターT細胞である顕著な証拠を提供した。治療を行った、および行わなかったマウスにおけるこれらの血清学的皮膚および細胞バイオマーカーの一時的評価により、治療結果を予測し、臨床バイオマーカーの探索/利用を知らせる、力学的な、機構的に重要な、予見的炎症バイオマーカーを同定することができる。
AAにおける循環免疫エフェクターの細胞バイオマーカー：「NK型」CD8 T細胞は、AAマウスにおける皮膚、血液およびリンパ節において増殖し、病因を調査するための価値ある道具である。さらに、前記細胞サブセットは、ヒト疾患と直接関連すると考えられる。
スペクトル型に基づく免疫モニタリング：NK型CD8 T細胞を、50μlの全血のフローサイトメトリーにより循環中でAAマウスにおいて同定する(図18)。このCD8+NKG2D+選別されたT細胞サブセットの総数およびスペクトル型を、移植後3週間毎に評価して、単一のマウス内のクローン優勢性/エピトープ拡散の進化をモニターする。スペクトル型分析を用いて、CD8+NKG2D+T細胞の免疫表現型喪失が、循環している脱毛症T細胞クローンの治療に関連する消失に起因することを確認する。この非侵襲的免疫モニタリング手法を用いて、全ての治療に関してマウスを追跡する。例えば、JAK1/2阻害剤INCB018424を用いる3週間の治療は行わなかった。理論によって束縛されるものではないが、JAK1/2阻害剤は、標的組織におけるT細胞由来エフェクターサイトカイン(IFN-γ、IL-17)の下流の炎症結果を無効化すると期待される。
血清中での免疫「プロテオミック」特徴：血清中のサイトカインおよびケモカインは、標的器官における炎症環境の兆候である。ヒトにおけるデータは、疾患の活性と相関するいくつかのサイトカインおよびケモカイン(例えば、IL-8)の上昇を示し、以前の研究の観察を拡張する(106、107、109)。AAの発症においてIL-15およびIFN-γが関与する本発明者らの全体の知見と一致して、IFN-γおよび周知のIFN-γ誘導性ケモカインIP-10(CXCL10)がヒトAA血清において上方調節されることが認められる。機能的に関連する炎症性サイトカイン/ケモカインバイオマーカーを、多分析物手法(Luminexプラットフォーム)を用いてAAマウスに由来する血清中で同定する。遺伝的均一性のほかに、マウスにおけるバイオマーカーの利点は、疾患進行の初期または後期に、および逆に治療応答と共に生じるバイオマーカーを同定するための比較的容易な長期的研究である。RNAレベルでは、C3Hマウス皮膚IFNマイクロアレイにより、I型IFN(IFNα1〜3、ε)およびII型IFN(IFN-γ)の両方ならびにいくつかのIFN関連ケモカイン(CXCL9〜11、CCL5)が上方調節されることが示された。サイトカイン/ケモカイン産生を、9種のケモカイン(CCL2〜5、CCL11、CXCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11)および14種のサイトカイン(IFNα、IFNγ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、TNF、GM-CSF)の血清レベルに包括的に取り組む特注の多分析物Luminexアッセイ(R&D)を用いて血清中で試験する。本発明者らは、NKG2DL(117)とIL-15Rαの血清レベルを検出するための抗体対を含有させる。
皮膚の転写プロファイリング：ヒトAAにおいて、少数の一連の患者の公開された研究は、病変生検(105)におけるI型IFN応答およびTh1偏向ならびに末梢血中でのIFN応答サイトカイン/ケモカインの上昇(106〜110)を注記し、(111)で概説している。これらのデータは、C3Hマウスの分析に反映される。脱毛症のマウス皮膚から単離されたRNAの転写プロファイリングにより、優勢なIFN応答が示された。AA皮膚における上位20種の上方調節される遺伝子のうちの18種がIFN応答遺伝子であり、これはリアルタイムPCRによって確認された(図22)。CD8+NKG2D+細胞もその共通のケモカイン受容体であるCXCR3(寿命が短い免疫エフェクター上で上方調節される受容体である)を均一に発現するため、IFN応答遺伝子CXCL9〜11の上方調節は注目すべきである(118〜120)。これらのケモカインもまた、ヒトAA被験者の血清中で上方調節され、かくして、皮膚(mRNA)および血液(タンパク質)中の機能的に関連するAA皮膚バイオマーカーであってよい。この領域での研究は、進行中の治療の前および間に収集された皮膚RNA特徴のデータベースの構築を継続し、これを用いて治療計画および治療応答の初期の指示因子として仕立てることができる。これらの目標に向かって、平行研究を、病変内ステロイドおよびCTLA4-Igの両方を用いて、ならびに治療的介入を用いて、マウスにおいて実施して、ヒト治療研究を相互参照するのに有用である転写プロフィールデータベースを提供する(研究間の比較ゲノミクス分析およびより新しい手法の潜在的な臨床開発のため)。
ヒト被験者
頭皮からの皮膚生検を、最少で100人の円形脱毛症患者および約100人の対照から収集する。被験者集団はAA患者および毛髪移植を受けている罹患していない対照被験者からなる。これらのサンプルの収集のための認可は、それらが廃棄される組織であるため、迅速な審査/免除を受けた。AA患者からの頭皮生検の収集のためのプロトコルは、準備中である。最少で100人のAA被験者を動員するが、100人を超える集団が有益であり、この手法の力を増大させる。
発現インタラクトームを生成するためのサンプル間の最大の均一性を達成するために、専らAAを有する中年の白人男性被験者から毛包を収集するが、それは一致する対照ドナーが最も一般にはこの群に由来するからである。従って、AAが民族的または性別的傾向を示さないという事実にも拘らず、この研究の目的のために対照に年齢および性別において一致させるようにAA患者を選択する(中年の白人男性)。活動的疾患(すなわち、毛包がいくらか残存している)を有する患者も選択して、毛包を効率的に顕微解剖することができるようにする。
脊椎動物
若いC3H/HeJマウス(2〜3ヶ月)および可視的脱毛を示している引退したブリーダーを、Jackson Labsから獲得する。動物を、動物施設中で標準的な条件下で保持する。
マウスに、全身注射により、または局所的に薬剤または抗体を投与する。局所適用については、マウスの皮膚に電気クリッパーを用いて背面の毛を剃る。毛を剃った1週間後、マウスに、ビヒクルとしてのアセトンまたは10%v/vプロピレングリコール中に溶解した化合物の局所適用を投与する。注射を腹腔内的または皮下的に与える。用量ならびに投与頻度は確立されたプロトコルに従って行う。治療期間を通じて苦痛の兆候についてマウスを毎日モニターする。
参考文献
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フロー選別された細胞のスペクトル型決定を用いて、脱毛症マウスのリンパ節および血液中で脱毛症エフェクターT細胞が同定された。血液に基づくアッセイは、治療の間のこれらの脱毛症T細胞をモニターするために開発された。細胞毒性アッセイは、ヒトおよびマウスの両方における、CTLとの毛包(HF)相互作用の機能的構成要素を評価するために開発された。
AA被験者から得られたヒト生物標本を用いて、循環T細胞が高レベルのNKG2Dを発現し、皮膚から得られた一次T細胞がCD8+NKG2D+IFN-γ産生細胞により支配され、マウスとヒト疾患との間で平行を確立することが示された。
免疫表現型決定および皮膚免疫学
生物標本中の経路を研究するためには、皮膚および血液中の異種細胞集団の分析が必要である。ヒト自己免疫の臨床調査において、円形脱毛症はその関連する微小環境中の病原性免疫エフェクターの研究/単離を可能にする末端器官の接近可能性のため、独特の機会を提供する。必要とされる分析道具および個人は、これらの正確な末端器官皮膚生物標本、および同じ個体から得られた血液中のその細胞/血清対応物の最適な研究を提供する。
生物標本の調製および分析
以下のものは、血液の分析を補助するために提供される：
i)血清サンプルからの多分析物サイトカイン/ケモカイン分析、
ii)AA被験者からのヒトPBMCのサイトカイン分析を含む、フローサイトメトリー免疫表現型決定、
iii)T細胞サブセットを用いて下流の適用のためのフロー選別(RNAプロファイリング、スペクトル型決定)。
以下のものは、皮膚の分析を補助するために提供される；
i)一次毛包と、機能的(細胞傷害性)および分析研究(T細胞クローニング、スペクトル型決定)のためのT細胞構成要素の両方の生細胞画分の調製/分析、
ii)全皮膚の免疫染色および転写プロファイリング、
iii)ヒトおよびマウスのAA皮膚に由来する真皮リンパ球のフローサイトメトリー免疫表現型決定。
科学実験
a.AA被験者の末梢血中の病原性HF特異的細胞サブセットを同定する。この目的のために、スペクトル型分析を、循環しているヒト脱毛症T細胞集団を同定するための道具として使用し、同様に全皮膚T細胞中に認められるスペクトル型と、同じ患者から得られた末梢血中の特異的に選別された末梢血T細胞サブセットのスペクトル型とを一致させることにより、マウスモデルについて行った。
b.ヒトAAにおけるTh1優位を確立し、Th1標的化治療のための論拠およびバイオマーカープラットフォームを開発する。疾患特異的Th経路の治療標的化は他のヒト皮膚炎症疾患において、最も顕著には、乾癬におけるプロトタイプTh17疾患において成功した。顕著なTh1疾患としてのAAのためのAA動物モデルにおける実質的なデータが存在する。浸潤する真皮AA T細胞のThプロフィールおよび血液中の関連する循環T細胞サブセットに、皮膚および血液からの多分析物、RNAプロファイリング、免疫染色および細胞内フローサイトメトリー分析などの、多面的手法を用いて対処する。
翻訳研究への統合的手法は、AAにおける標的化可能な経路を同定した後、前臨床モデルにおいてこれらの経路を治療的に試験する基礎研究、臨床試験における長期的バイオマーカー評価および遺伝子研究に基づく集団に基づく研究の追求から始まる。介入の前臨床治療効果を、移植されたAAマウスモデルにおいて評価し、炎症応答に対する治療効果を皮膚および血液中で評価し、ヒト生物標本をex vivoでの研究におけるヒトの関連性の検証のために提供する。
ヒトにおける皮膚中の免疫細胞と標的細胞との病因的相互作用のモニタリングには、一次ヒト組織および血液の精緻なプロセッシングおよび分析が必要である。
フローサイトメトリーは、特定のパラメータに従う細胞集団の同定のための主要な道具になっており、従って、ますます増加する生物医学の科学者によって用いられている。
皮膚の免疫生物学は特異的な特徴およびチャレンジを提供する；その障壁機能などの組織の特殊な構造、その関連する独特の免疫細胞集団および微生物叢とのその密接な近さ/相互作用、ならびに浸潤するリンパ球を単離する実際的な困難性は全て、皮膚の免疫疾患に対する手法において理解するのに必要な複雑性の一部である。組織プロセッシングおよび染色の補助、ならびに細胞単離、および高品質の一貫した結果を確保するための本質を提供するサービスが利用可能である。
フローサイトメトリーは、臨床研究者のための道具であり、その使用に関する操作知識は全ての翻訳免疫学者にとって必要である。2つの主力装置(FACs CantoおよびFACs Caliber)、6レーザーLSR IIおよび4レーザーBD Influxなどの4つのフローサイトメーターが利用可能である。LSR IIおよびBD Influxは、分析から分取選別への移行を容易にする比較可能なレーザー/検出器を有するように設計されたものである。LSR IIは、合計19色を同時に検出し、蛍光タンパク質(mBanana、GFP、BFP、RFP/dsRed、mCherry、mRasberry)と蛍光染料/化学蛍光色素の両方を検出する多用途性を提供することができる6個のレーザーを備える。LSR IIは、様々な有機および無機蛍光色素を用いて組織由来異種細胞集団内の多様な細胞型を分析することができる。これらのさらなる蛍光パラメータにより、混合集団中の特定の細胞型における協調的機能事象の検出(例えば、皮膚組織および流出リンパ節に由来するT細胞集団中での細胞内IFN-γ、IL-10産生およびホスホタンパク質の検出)が可能になる。基本的なLSR II装置は、3個のレーザー；青色(488nm)、赤色(633nm)、紫色(405nm)を備える。特注設計されたLSR IIはさらに、最大20色の検出を可能にする追加のレーザーおよび96穴プレートリーダーを含む。T細胞サブセット(例えば、Treg)、B細胞および単球のための「Leave one out」10色パネル設計は「赤色」Alexa 594に対する優れた感度を有する100Wの黄緑色594を利用するために設計された。かくして、研究者は「leave-one out」設計を導入して、Alexa 594コンジュゲート抗体を用いる染色によって目的の特異的マーカーの発現を高感度に試験することができる。
品質：ヒト末梢血中のリンパ球集団を免疫表現型決定するためのパネル開発および他の実験を行う。LSR IIの6レーザーシステムの能力のため、補償を必要とせずに用いることができる一般的な「使用が容易」な色のセットが確立された。蛍光補償を必要とせずに5/6色実験を行う能力は、スペクトルにおいて互いに遠くに位置し、それぞれのレーザー光線により独立に励起される蛍光色素としてのデータ分解能の増加をもたらす。これにより、補償が適用される場合に稀である何かを、集団が明確に分離する能力が可能になる。現在選択されている蛍光色素の組合せは、DAPI(DAPI陰性細胞上でゲート化)Pacific Blue、FITC、PE、Alexa Fluor 594およびAPCであるが、他の蛍光の組合せが現在試験され、用いられている。この5つの蛍光色素のセットは、さらなる蛍光色素を加えることができるパネルのための基本プラットフォームとして役立つ。概念実証実験において、5つの蛍光色素の使用が、補償を必要とせずに同時に示された。C57BL/6脾臓細胞を、CD8 Pacific Blue、CD3 FITC、CD45R (B220) PE、CD11b Bio+ストレプトアビジンAlexa Fluor 594、およびCD4 APCで染色した。
皮膚免疫生物学のための維持および品質制御：皮膚生検からのリンパ球の単離に用いられる手順を、生検を3次元タンタル皮膚セルフォームマトリックス上で培養して、生検からのT細胞の移動を促進するClarkおよびKupper(2)により開発された方法から適合させた。それぞれの単離された細胞集団のうち、小さい画分をCD45/CD3染色のために用いて、フローサイトメトリーにより白血球/Tリンパ球の数を評価した後、さらに研究するか、または冷凍保存する。再使用のために、マトリックスを10%漂白剤中に30min浸した後、水中で洗浄し、Enzyte酵素クリーナー(Decon Labs)の溶液中に移す。マトリックスを24h撹拌しながらホットプレート上でこの溶液中で放置し、蒸留水で洗浄し、オートクレーブの前に乾燥させる。
全皮膚分析技術(例えば、免疫染色)を提供する。以下のものを提供する：1)一次毛包と皮膚T細胞の両方の生細胞画分の調製/分析のための皮膚免疫生物学における重要な専門知識；2)多分析物分析(Luminex)および貴重な臨床生物標本(臨床試験に参加した被験者からの皮膚および血液)の転写プロファイリングを含む臨床生物標本のためのバイオマーカー開発能力。血液およびAA標的末端器官、皮膚の両方に由来する前臨床および臨床サンプルにおける生物学的プロセスを調査し、炎症AA機構をモニターするための道具を提供する。
マイクロアレイデータ分析および保存、配列および経路分析における能力が、本明細書に記載の研究に利用可能であり、調節ネットワークリバースエンジニアリングのための多くの最近のアルゴリズムまで幅広く拡張される。いくつかの広く用いられるデータベースが作られ、維持されている。さらに、全ての重要な配列および構造データベースが中心的に維持されている。これにより、カスタムアルゴリズムおよびクラスターコンピューティングを用いる必要がある場合に大規模検索を指令することができる。開発された研究方法の多くは、ソフトウェアアプリケーションおよびコンピュータサービスにパッケージされ、科学界で自由に利用可能である(http://www.c2b2.columbia.edu/page.php?pageid=10)。
以下のサービスが利用可能である：
1.免疫モニタリング：
a.血清サンプルからの多分析物サイトカインおよびケモカイン分析。
2つの手法が利用可能である：a)多重ビーズに基づく免疫アッセイ系(例えば、CBA/FlowCytomix)は少量(50μl)のサンプルの1回の読み取りで10種以上のサイトカイン/ケモカインを評価することができる多重分析を提供する。LSR II 96ウェル高効率能力は、効率と組合せた使用の容易性を提供する。ソフトウェア(「snap-to」ゲート化)がデータ分析のために社内で利用可能である。また、多重ビーズに基づくアッセイ系は、血清中の可溶性ヒトおよびマウスNKG2DLを定量するために開発され、そのための特異的抗体セットが市販されている。b)Luminexプラットフォームを用いる多重分析は、市販のマウスおよびヒトサイトカインおよびケモカインアレイの分析のためにCTSAにおいて利用可能である(図24)。Luminexアッセイは、試薬はユーザーが購入するが、無料サービスで提供される。一度、AA血清バイオマーカープラットフォームを決定したら、選択された分析物の大量購入がコストを節約できる。
フローサイトメトリーによる免疫表現型決定
CD8+NKG2D+細胞が、自然脱毛症を有するマウスの皮膚から収穫された真皮白血球集団で優位であることが、多パラメータフローを用いて確立された(図25)。ヒトでの状況に対処するために、3つのFACSチューブ(T細胞サブセットチューブ、CD4、CD8およびNK細胞のためのNKマーカーチューブならびに第3の非T細胞チューブ)を用いるNKおよびCD4およびCD8 T細胞集団に焦点を当てる30種のPBMCサブセットのいずれか；系列マーカー：CD3、CD4、CD8α、CD8β、CD14、CD19、CD20、CD56、CD64；T細胞サブセットマーカー：CD45Ra、CD45Ro、CD56、CD62L、CCR7、CD127、FoxP3、Helio；皮膚ケモカイン受容体分析：CCR4、CCR8、CCR10、CLA、EおよびP-セレクチン；NK免疫受容体ファミリーメンバー：阻害：KIR/CD158、CD94/NKG2A、LILR/ILT、LAIR1 NKR-P1 活性化：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、NKG2Dにおける量的変化を定義するためのフローパネルが開発された。4人のAA被験者からのPBMCの初期評価において、NKG2D発現の増加がCD56+CD8+T細胞およびNK細胞上で観察されたが、CD4+T細胞上では観察されなかった(図26)。
サイトカイン分析：新鮮に単離された軟膜末梢T細胞のPMA/イオノマイシンによる活性化は、循環記憶T細胞によるサイトカイン産生を駆動する。ブレフェルジンと共に4時間インキュベートした後、細胞を細胞表面マーカーで染色し、固定し、透過処理した後、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-17、およびFOXP3/helioについて細胞内染色する。表面マーカーCD3、CD4、CD8、CD25、CD56、CD62L、NKG2D、CD45Ra、CD45Ro、CLA/CCR4と共にこれらのサイトカイン/転写因子は、全および皮膚CD4/CD8ナイーブおよび記憶T細胞コンパートメント中のTh1/Th2/Th17/Tregの画分およびNKG2Dのその発現を説明する。理論によって束縛されるものではないが、1個のチューブからの多パラメータ試験を可能にするLSR IIを用いれば、この分析のためには200〜400万個のPBMCで十分である。これにより、他の目標を提供するための30ml採血から十分なPBMC(2000万個を超える細胞)が得られる。
T細胞サブセットを用いる下流の適用のためのフロー選別
目標は、下流の機能分析のための潜在的な脱毛症T細胞を提供することである。例えば、フロー選別されたT細胞サブセットは、RNAプロファイリング、例えば、NK型T細胞の転写プロファイリングのために提供される。バイオマーカー研究のためには、好適な細胞サブセット中でのホーニング(honing)は、さもなければ混合異種PBMC集団に由来するRNAの存在により希釈される分析の分解能を改善する。
AAマウスにおける研究は、脱毛症のT細胞(図24)が再循環し、容易に見出され、血液および皮膚リンパ節から単離することができることを示唆している。500万個を超えるCD8+NKG2D+T細胞を、単一のマウスの皮膚リンパ節からのフロー選別により単離することができる。これは、下流の研究のための印象的な数の新鮮な一次「病原性」T細胞であり、細胞収量の実質的な改善であり、脱毛症皮膚からの「クロールアウト」から回収することが期待される。AAヒト被験者の血液中の病原性T細胞サブセットの同定が科学的な目標である。フロー単離されたT細胞サブセットを、特異的T細胞サブセットの免疫病原的関連性の証拠を提供するためのバイオマーカー研究、機能研究およびスペクトル型決定などの下流の適用のために適用する。
i)TCRレパートリーのスペクトル型分析
組織または表現型で分離されたリンパ球サブセットからのRNAのスペクトル型決定またはTCRβ鎖長分布分析は、浸潤T細胞のTCRクローン型使用/レパートリーの定性的ポートレートを提供する。近年では、この技術は、サンプル中のクローン増殖したT細胞の割合を説明するための高感度かつ正確な方法として他者(5〜7)により用いられてきた。オリゴクローン性、TCRが制限されたT細胞のサブセットの増殖の証拠は、炎症プロセスにおける抗原駆動を示唆し、病原性T細胞クローンを同定するための第1のステップとして用いることができる。それぞれのTCR再配置は3つのヌクレオチドのうちの複数においてCDR3長が変化するため、T細胞の集団内のCDR3長の異種性を、TCR多様性の尺度として用いることができる。この技術の原理は、コンビナトリアルおよび接合VDJ連結により作製されたCDR3領域に共に広がる上流の特異的Vβファミリーメンバープライマーおよび下流の定常領域プライマーを用いてT細胞集団から得られたcDNAをPCR増幅することである。次いで、PCR産物を、蛍光標識された定常領域プライマーを用いるプライマー伸長(「ランオフ」)反応において蛍光色素標識する。次いで、前記産物をABI PRISM 3700 DNA分析装置上で泳動する。Gene Mapperソフトウェアを用いて、個別のCDR3に対応するピークのサイズを表示させ、分析することができる(図20および27)。データを輸出し、参照ポリクローナルレパートリーと比較し、Hamming距離などのオリゴクローン性の尺度を算出する。それぞれのヒストグラム中のピーク面積は、各ファミリー内の各CDR3長の発現頻度を反映する。皮膚におけるクローン増殖の優位性は、疾患の誘導における真皮抗原の主要な役割を示唆し、病原性T細胞の集中的調査を可能にする。対照的に、増殖しなかったクローンのポリクローナルレパートリーは、非クローン特異的ケモカイン受容体による動員を示唆する。同じ個体の非病変皮膚および血液におけるTCRレパートリーの比較は、クローン増殖された皮膚在住T細胞集団が循環中にも見出され得るかどうかを示唆する。同様に、選別されたT細胞サブセットを、レパートリー分析のための起源RNA材料のために用いることができる。例えば、図20および27は、C3Hマウスにおいて、オリゴクローン集団が、NKG2D陽性集団中で過剰に現れるが、陰性CD8リンパ節集団には現れないレパートリーである、病変皮膚中に見出されることを示す。これらのデータは、CD8+NKG2D+T細胞が皮膚中に見出されるオリゴクローンT細胞集団の多く(全てではないが)を含有することを確認する。いくつかのTCR/クローン、例えば、Vβ10は流出皮膚リンパ節中ではなく、皮膚中で見出されることに留意されたい。これらのものは、AA皮膚中に見出されるが、選別されたCD8+LN画分中に存在しないCD4+T細胞集団を含む可能性がある。この手法は、「抗原誘導」のための強力な証拠を提供し、ここで示されるようなフロー選別と共に、細胞の集団間の病原性T細胞サブセットを同定する。
クローン共有またはオリゴクローン性のこの証拠を、トポイソメラーゼに基づくクローニングを用いてPCR産物の細菌ライブラリーを調製し、記載のような96穴に基づく技術(5〜7)を用いる高効率様式で得られたクローンのTCRβ鎖を配列決定することにより、クローン型分解能のレベルでマウスおよびヒトサンプル中で調査および検証する。通常、48または96個のクローンを選択し、各PCR産物について配列決定する。この配列を輸出し、Geneious中で整列させ、VDJエレメントの使用および連結の微細構造をVquestを用いて決定する。これにより、異なる領域中での共通のクローンおよびリンパ球輸送の明確な同定、ならびにサンプルのクローン型組成の正確な列挙が可能になる。さらに、クローン型TCRを遺伝子形質導入研究のために用いて、T細胞および脱毛症TCRを発現するレトロジェニックマウスを作製することができる。この努力はまた、HLA02トランスジェニックマウスにおいてトランスジェニック発現されたヒト脱毛症TCRを用いる脱毛症の「ヒト化」トランスジェニックTCRモデルの開発を誘導することもできる。
ii)循環免疫細胞の転写バイオマーカー
侵襲性の薬剤難治性紅斑性狼瘡をマーキングする転写特徴を、全PBMCのRNAを用いた場合ではなく、CD8 T細胞コンパートメント内で同定することができる(8)。かくして、フロー選別と転写プロファイリングとの組合せは、分析能力に大きな力を与える。円形脱毛症においては、病原性細胞サブセットは、毛包を包み、両セリアック病(4、10)、I型糖尿病(11)および慢性関節リウマチ(12〜14)などの自己免疫において広く病原性に関連する(9)ものであり得るCD8+NKG2Dhi T細胞であると考えられる。セリアック病(4、10)におけるこれらの細胞の転写プロファイリングは、選別精製された循環および皮膚由来CD8 T細胞中で同様に評価されるこれらの細胞のNK様転写プログラミングを以前に記載した。これらの細胞集団の転写プロフィールに特異的に対処して、これらの細胞にとって中心的な生物経路を同定することが重要である。
Illuminaに基づくゲノム手法を用いて後成的に調節された自己免疫遺伝子を同定し、I型糖尿病、円形脱毛症およびセリアック病を有する患者から選別された自己免疫ヒトT細胞からDNAを取得した。CD3、PD-1およびFasLなどの重要な免疫調節遺伝子の発現を下方調節するプロモーター領域の過剰メチル化を同定した。
iii)細胞免疫学
活性化PBMCのフローサイトメトリー分析を、細胞内サイトカイン分析および/またはリン酸化タンパク質のシグナリング活性化のために用いることができる。古典的抗原特異的な、分裂促進反応または混合リンパ球反応を、CFSE染色されたT細胞またはチミジン取込みを用いて理解することができる。利用可能な装備としては、細胞収穫装置およびMicrobeta/Triluxプレートリーダー(チミジンに基づく増殖およびクロム放出細胞傷害アッセイのため)、ELISAプレートリーダー/ウォッシャー、ELISPOTリーダーが挙げられる。
皮膚免疫生物学
機能的(細胞傷害性)、分取(T細胞クローニング)および分析研究(スペクトル型決定、RNAプロファイリング)のための一次毛包およびT細胞構成要素の調製。研究上にあるAA患者からの生検標本は貴重であり、免疫染色および転写プロファイリングはこれらの2つの手法の実現性および情報力を考慮すると、最も高い優先度を取る。日常的にヒト頭皮皮膚を対照個体(毛髪移植ドナー)から入手して、皮膚および毛包内の個々の細胞集団の一次培養を確立する。
a)T細胞および毛包構成要素の培養、毛包器官培養ならびに皮膚器官培養
i)HF標的：対照またはAAに罹患した個体から入手したヒト頭皮皮膚を用いて、皮膚および毛包(図28)内の個々の細胞集団の一次培養を確立して、一次HF集団中でのNKG2DLの調節を研究し、CTLアッセイにおける標的としてHF集団を評価する。毛包内皮膚をジスパーゼ処理して、表皮および真皮構成要素を分離し、酵素処理してケラチノサイトおよび線維芽細胞の一次培養を確立する。毛包を顕微解剖して間葉構成要素を分離し、真皮鞘細胞(DSC)および真皮乳頭細胞(DPC)を培養するためにさらに用いる。KondoおよびPhilpottら(15)からのプロトコル後にモデル化された実験室中で確立された無血清毛包器官培養物(図30)を用いて、対照個体、ならびにAA患者に由来する病変(可能な場合)および対照皮膚に由来する個々の毛包を日常的に培養する。毛包を無血清増殖条件で培養すると、7〜10日間通常の成長期を示し、次いで、退行期に入り、マトリックスの崩壊を示す(16)。細胞傷害性アッセイのために、毛包を、4〜8h、細胞傷害性T細胞またはNK細胞(MyeloCult、Stemcell Technologies)を保持する培地に移す。皮膚外植片は正常な皮膚構造、ならびに免疫微小環境を維持し、機能研究に用いる(17)。
ii)T細胞エフェクター：酵素消化された/分散されたヒト皮膚からの十分な数のT細胞の単離は難しい場合がある；しかしながら、培養T細胞はClarkにより開発された真皮クロールアウト手法を用いて増殖された(2)。皮膚外植片を用いて、20%FCS、IL-2およびIL-15を含有するIMDM中で3週間、セルフォームマトリックス上で外植片を培養することにより、皮膚の在留T細胞集団を増殖させた。この技術により、4mmあたり0.3〜3.0 x 106個のT細胞が得られ、免疫表現型決定、T細胞クローニング、Thプロファイリング、および他の下流の適用(例えば、転写プロファイリング、細胞傷害性および他の機能的アッセイ)が可能になる。介入臨床試験上にあるAA患者については、十分なT細胞が増殖の3週間後に得られた場合(1x106個を超える)、それらを分割し、集団の半分をRNA単離/プロファイリングに使用し、他の半分をフロー免疫表現型決定/Thプロファイリングに使用する。収量が1x106未満の全細胞である場合、研究はRNAプロファイリングに限定される。研究上にないAA患者については、代替的な機能研究、例えば、細胞溶解アッセイおよび抗体遮断/小分子を用いる研究のためにクロールアウトT細胞および自己HF標的を用いるためのより高い自由度がある。T細胞の稀な臨床集団を分析する能力の一例として、図29は、パンチ皮膚生検から得られた培養ヒト真皮がフローサイトメトリー分析のための原料として用いられるT細胞「クロールアウト」アッセイを例示する。
AA皮膚生検から得られるT細胞は、正常な皮膚からのクロールアウトにおいて認められる予想されるポリクローナルCD4集団とは全く対照的に、オリゴクローナルIFN-γ産生CD8+NKD2D+T細胞であることに留意されたい(2、18)。
b)円形脱毛症モデルにおける皮膚と免疫構成要素との相互作用
本明細書に記載の研究のために皮膚-免疫相互作用を評価するための確立されたプロトコルが利用可能である。一次培養細胞、ならびに器官培養された毛包を、対照もしくは患者の末梢血リンパ球に由来する細胞傷害性T細胞、または皮膚から誘導されたものを用いる標的として用いることができる(図29)。免疫エフェクター細胞を、CFSE標識された標的細胞/毛包と同時培養し、LDH放出により細胞溶解を比色分析により測定するか、またはあるいは、死んだ細胞を7-AADで染色し、細胞数をフローサイトメトリーにより計数する。これらのアッセイを用いて、細胞傷害性などの、免疫エフェクターとHF標的との相互作用のための分子要件を決定することができる。例えば、本明細書に示される通り、細胞傷害性には、NKG2Dの関与ならびにNKG2DLの転写および表面発現を上方調節することが知られるサイトカイン/TLRリガンドを用いる標的の前もっての感作が必要である。
発症の皮膚バイオマーカーの評価：免疫染色および転写プロファイリング
AAはいくつかの自己免疫障害との高い相関を示し、毛包を、自己免疫の基本的機構を研究するための高度にアクセス可能な器官にする。発症の初期代用生物マーカーの同定における実質的な興味があった。そのようなものとして、AAは広範囲の疾患との関連性を有し得るバイオマーカー開発のためのモデル系である。ヒトおよびマウスの両方におけるAAの発生および治療に対する応答をモニターするために、以下のバイオマーカーが現在用いられている。
a)リンパ球浸潤に関する免疫組織化学染色：AAは毛包内、および毛包周囲免疫浸潤の存在と関連する。免疫組織化学のために、室温で8時間、PBS中の10%ホルマリン中で組織を固定し、パラフィン切片のために70%エタノール中で保存するか、または-80℃で保存された凍結切片のためにドライアイス上のCryomatrix(Shandon、Waltham、MA)中に直接埋込む。
パラフィン包埋組織ブロックを8μm切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を組織学的研究のために実行する。凍結された組織も8μmの厚さに切片化し、免疫蛍光染色のために4%パラホルムアルデヒド中で固定する。切片を蛍光標識された二次抗体で染色し、免疫蛍光画像化をZeiss Axioskop顕微鏡を用いて実行する。基本的免疫組織/蛍光染色は、CD3、CD4、CD8に対する一次抗体を用いる染色を含む。免疫染色の例として、MHC IおよびIIおよびICAM-1が、脱毛症HF中で大きく上方調節され、深いCD8優勢浸潤と関連することの証拠が提供される(図31)。
b)全皮膚RNAの単離および炎症マーカーに関する定量的PCR： IFN応答遺伝子などの、既に定義された炎症遺伝子転写物、および「NK型」CD8 T細部転写物などの、定義しようとする遺伝子特徴の評価のために、ヒトおよびマウス皮膚を試験する。RNeasy精製キット(Qiagen)を用いて、全RNAを皮膚から抽出する。DNaseで処理された全RNAを、SuperScript II逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて逆転写する。
SYBR Green Master MixおよびABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、RT-PCRを実施する。GAPDHおよびβ-アクチンを、内部正規化対照遺伝子として用いる。
本明細書に記載の研究の目標の1つは、選別された末梢血AA T細胞サブセットのスペクトル型と、同じ患者に由来する全皮膚T細胞中に見出されるものとを一致させることにより、循環AAエフェクター集団の表現型を確立することである。フローサイトメトリー選別技術をスペクトル型分析と組合せて、AA患者の循環中の病原性T細胞を同定する。この同じ手法をマウスモデルにおいて用いて、CD8+NKG2D+リンパ節細胞が、脱毛症の皮膚に見出されるT細胞クローンの大部分を含有することを示した。AA被験者においては、TCRレパートリーを同じ個体の病変および非病変皮膚および血液において比較して、クローン増殖された皮膚在留T細胞集団が循環中にも見出されるかどうかを同定する。循環T細胞サブセットからRNA原料を単離するための選別基準の進行的改良により、同じ患者に由来する全皮膚に見出されるTCRレパートリーを(少なくとも部分的に)一致させ、この方法で病原性CD4およびCD8 T細胞の免疫表現型マーカーを同定することができるべきである。病原性T細胞サブセットの同定は、臨床試験のモニタリング、バイオマーカーの改良にとって非常に価値があり、発症のベッドサイド・トゥー・ベンチ(bedside-to-bench)研究のための独特の細胞材料を提供する。
本明細書に記載の研究の別の目標は、真皮に浸潤し、末梢血中に循環するAA T細胞のThプロフィールを確立することである。病原性AA T細胞エフェクター分化/サイトカインプロフィール：特異的Th経路の治療標的化は他のヒト皮膚炎症疾患、最も注目すべきは乾癬および優勢Th1疾患において成功している(19〜23)。ヒトにおけるTh1優勢性を確立し、Th1標的化治療のための論拠およびバイオマーカープラットフォームを開発するために、浸潤する真皮AA T細胞のThプロフィールおよび血液中に関連する循環T細胞サブセットに、皮膚および血液に由来する多分析物、RNAプロファイリング、免疫染色および細胞内フローサイトメトリー分析などの多面的手法を用いて対処する。AAのCD4およびCD8 T細胞の免疫表現型マーカーの改良は勿論、ポリクローナル循環集団間の潜在的な脱毛症特異的T細胞のThプロフィールの検出を可能にする。
少数の被験者からのAA病変の転写プロファイリングはTh1型偏向を示唆するが(24)、理論によって束縛されるものではないが、AAは「1つの疾患」ではない。過敏症(25)(真皮)および他の自己免疫症状(26〜33)(本明細書に記載の研究を参照されたい)を含む共通の発症経路を有する疾患の素因となる根本的なTh2またはTh1/17の両方の偏りを反映する合併免疫症状のAA被験者における一般的な発生率は、Th2型のAAならびにTh1またはTh17型のAAが存在し得ることを示唆している。かくして、異なるThプロフィールを有するAAのサブセットを同定し得る多数の患者からの末梢由来およびAA病変組織外植片由来PBMCにおける機能的T細胞応答を同定し、これらの免疫機能バイオマーカーパラメータと関連するSNPの存在または非存在とを相関させることが重要である。
末梢T細胞および病変T細胞のT細胞免疫表現型を評価する。50人のAA患者および50人の正常対照を病歴を添付してGWASから研究する。全循環T細胞のThプロフィールの評価は容易であるが、究極的にはAA発症集団の免疫表現型マーカーの定義により支援されるように、多パラメータフローを、より粒状の(granular)評価のためにT細胞サブセットに適用する。酵素消化された/分散されたヒト皮膚からの十分な数のT細胞の単離は難しい場合があり、培養条件により変化し得る。全皮膚手法および顕微解剖された皮膚サンプルを用いて相関を転写プロファイリングと共に実施して、毛包鞘浸潤内ならびに毛包内上皮中の浸潤からのサイトカインプロフィールを記述する。
ヒト被験者
頭皮からの皮膚生検を、AA患者および毛髪移植を受けている罹患していない対照被験者からなる正常被験者から収集する。さらなる生検を、臨床試験上にある被験者から取得する。
研究材料の供給源は、AA患者および対照からの頭皮皮膚生検である。顕微解剖された毛包コンパートメントなどの小さい組織サンプルからのRNAを日常的に取得する。AA患者および対照に由来する組織生検を提供する。
脊椎動物
若いC3H/HeJマウス(2〜3ヶ月)および可視的脱毛を示している引退したブリーダーを、Jackson Labsから獲得する。それぞれの参加する基礎研究者により確立されたマウス株を、それぞれの動物飼育室で飼育する。マウスに水およびペレット食(5010げっ歯類用餌、LabDiet、PMI Nutrition International)を自由に与える。
個々の皮膚および毛包構成要素の一次細胞培養ならびに毛髪/皮膚器官培養を、野生型およびトランスジェニックまたはノックアウトマウスのために確立する。これらの研究は、毛包および皮膚組織の特性評価も含む。マウスを、獣医学的に認可され、広く推奨される方法であるCO2窒息、次いで頸部脱臼により安楽死させる。それは動物にとって苦痛もストレスもない最も速く、最も人道的な方法である。マウスの皮膚に電気クリッパーを用いて背面の毛を剃った後、皮膚組織を切り出す。皮膚および毛包の個々の細胞構成要素の単離スキームならびに皮膚外植片からのT細胞単離は、図25、28および29に記載される。また、皮膚サンプルをOCTおよびパラフィン中に埋込む。皮膚に加えて、脾臓および胸腺も動物から切り出し、フローサイトメトリーのためにさらに用いる。動物からの血清も、尾出血により採取し、サイトカインプロファイリングのために用いる。
参考文献
Figure 2014500249
Figure 2014500249
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Jak/Jak2を遮断するin vivoでの前臨床研究を、疾患の移植動物モデルであるC3H-HeJマウスにおいてINCB018424 Jak1/Jak2阻害剤を用いて実施した。0/5匹のマウスがINCB018424を用いる処理後に脱毛症を発症したが、2/5匹のプラセボ処理したマウスがAAを発症した。

Claims (14)

  1. 脱毛症の治療を必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Jak1および/またはJak2阻害剤を該被験体に投与することを含む、前記方法。
  2. 脱毛症の治療を必要とする哺乳動物被験体における脱毛症を治療する方法であって、Stat1および/またはStat2阻害剤を該被験体に投与することを含む、前記方法。
  3. 被験体における毛髪増殖を誘導する方法であって、
    (a)有効量のJak/Stat阻害剤を被験体に投与し、それによって被験体における毛髪増殖を制御すること、
    を含む、前記方法。
  4. 阻害剤が配列番号１、３、５または７を含むタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 被験体が脱毛症に罹患している、請求項３に記載の方法。
  6. 脱毛症がアンドロゲン性脱毛症、休止期脱毛、円形脱毛症、休止期脱毛、頭部白癬、完全脱毛症、貧毛症、遺伝性先天性貧毛症、または全身性脱毛症を含む、請求項１、２または５に記載の方法。
  7. 投与された阻害剤が、該阻害剤を用いる治療の前の脱毛症に罹患した被験体の毛髪増殖と比較して、該被験体において毛髪増殖を誘導したかどうかを決定するステップ(b)をさらに含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  8. 阻害剤が、Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスRNA；Jak1、Jak2、Stat1もしくはStat2をコードする遺伝子を特異的に標的化するsiRNA；または小分子である、請求項１、２または３に記載の方法。
  9. 阻害剤がINCB018424である、請求項１、２または３に記載の方法。
  10. 小分子がAG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、またはCEP-701である、請求項８に記載の方法。
  11. 小分子がフルダラビン、エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、またはハイパーフォリンである、請求項８に記載の方法。
  12. siRNAが配列番号２、４、６または８を含むヒト核酸配列に対するものである、請求項８に記載の方法。
  13. Jak1遺伝子に対するsiRNAが表１１に列挙された配列のいずれか1つである、請求項８に記載の方法。
  14. Stat1遺伝子に対するsiRNAが表１２に列挙された配列のいずれか1つである、請求項８に記載の方法。
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