WO2023074712A1 - Ｔ細胞を評価する方法及びｔ細胞を評価するための組成物 - Google Patents

Ｔ細胞を評価する方法及びｔ細胞を評価するための組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2023074712A1
WO2023074712A1 PCT/JP2022/039807 JP2022039807W WO2023074712A1 WO 2023074712 A1 WO2023074712 A1 WO 2023074712A1 JP 2022039807 W JP2022039807 W JP 2022039807W WO 2023074712 A1 WO2023074712 A1 WO 2023074712A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
cells
gene
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/039807
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
新 金子
洋平 河合
佳奈 山口
勇一 熊木
達 二見
Original Assignee
国立大学法人京都大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人京都大学 filed Critical 国立大学法人京都大学
Publication of WO2023074712A1 publication Critical patent/WO2023074712A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes

Definitions

  • the present invention provides a method for evaluating T cells, a composition for evaluating T cells, a pharmaceutical composition containing high-quality T cells obtained by the method for evaluating T cells, and a cancer using the pharmaceutical composition. It relates to the prevention or treatment method of
  • T cells antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL) related to the disease
  • CTL cytotoxic T-lymphocytes
  • T cells unmodified T cells
  • Expectations are high for cancer immunotherapy, which treats cancer by returning cells to the original patient.
  • Patent Document 1 describes a method of inducing CD8 ⁇ + ⁇ + CTL by culturing CD4 + CD8 + T cells in a medium containing interleukin 7 and a TCR (T cell receptor) activator.
  • T cell quality evaluation items include, for example, expression analysis of differentiation markers expressed at each stage of T cells, analysis of the amount of cytokines produced after TCR stimulation, proliferation ability, cytotoxic activity, Examples include cancer cell suppressing activity in animal experiments.
  • the quality of T cells is comprehensively evaluated by these items, but such evaluations are often complicated and require a long period of time. Furthermore, since the cost of evaluation is high, there is a demand for a method that can evaluate the quality of T cells more simply and in a short period of time.
  • Non-Patent Document 1 As a method for evaluating the quality of such T cells, for example, it has been found that there is a relationship between the expression level of PD-1, lag3, etc. and the exhaustion of T cells (Non-Patent Document 1). , using these proteins as T cell exhaustion markers, a method of evaluating T cell exhaustion based on the expression level thereof.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and provides a T cell evaluation method capable of evaluating the quality of relatively young T cells using a new index, and a T cell evaluation reagent used therein. for the purpose.
  • secretome secretome
  • high-quality T cells high-quality T cells
  • low-quality T cells T cells with relatively low proliferative potential
  • PCA principal component analysis
  • the quality of T cells can be evaluated by using a gene encoding a polypeptide containing the amino acid sequence of the protein as a marker for evaluating the quality of T cells and using the expression thereof as an index. Furthermore, since these genes are genes that are expressed in a relatively early stage when the number of TCR stimulations of T cells is small, it was found that the quality of relatively young T cells can also be evaluated by using their expression as an index. was completed.
  • a method for evaluating T cells comprising: (I) a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 (II) one or more of the amino acid sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 70% or more of the amino acid sequence described in any one of gene (III) SEQ ID NOS: 1 to 54 encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added A gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the identity of
  • the detection step detects the expression product using a probe molecule that specifically binds to the expression product of at least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III)
  • the method according to [1] which is a step.
  • the expression product is a polypeptide encoded by any one of the genes (I) to (III), and the probe molecule specifically binds to the polypeptide
  • the method of [2] which is an antibody and/or an aptamer.
  • At least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III) is at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I') to (III') The method according to any one of [1] to [4], which is a gene.
  • At least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III) is at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I'') to (III'') The method according to any one of [1] to [5], which is a species gene.
  • At least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III) is selected from the group consisting of the following genes (I''') to (III''') The method according to any one of [1] to [6], which is at least one gene.
  • a T cell evaluation reagent containing a probe molecule that specifically binds to an expression product containing at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I) to (III)
  • a T cell evaluation reagent containing a probe molecule that specifically binds to an expression product containing at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I) to (III)
  • the expression product is a polypeptide encoded by any one of the genes (I) to (III), and the probe molecule specifically binds to the polypeptide
  • the reagent of [8] which is an antibody and/or an aptamer.
  • At least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III) is at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I') to (III')
  • At least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III) is at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I'') to (III'')
  • At least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III) is selected from the group consisting of the following genes (I''') to (III''')
  • [17] A method of treating or preventing cancer, comprising administering the pharmaceutical composition of [14] to a subject who has or is at risk of having cancer.
  • a method of treating or preventing cancer comprising administering T cells to a subject who has cancer or is at risk of having cancer, wherein the following (I) to (III) in the T cells ) detecting the expression of at least one gene selected from the group consisting of genes; an evaluation step of evaluating the quality of T cells using the expression of the gene as an index;
  • a method including (I) a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 (II) one or more of the amino acid sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 70% or more of the amino acid sequence described in any one of gene (III) SEQ ID NOS: 1 to 54 encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added A gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the identity of
  • a method for producing T cells comprising a detection step of detecting expression of at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I) to (III) in the T cells; an evaluation step of evaluating the quality of T cells using the expression of the gene as an index;
  • a method of producing a T cell comprising: (I) a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 (II) one or more of the amino acid sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 70% or more of the amino acid sequence described in any one of gene (III) SEQ ID NOS: 1 to 54 encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added A gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the identity of
  • the present invention it is possible to provide a T cell evaluation method that can evaluate the quality of T cells using a new index, and a T cell evaluation reagent used for the method.
  • FIG. 3 is a scatter diagram obtained by performing principal component analysis (PCA) on all 800 types of secretome data in 24 types of T cell lines.
  • PCA principal component analysis
  • the method for evaluating T cells of the present invention comprises a detection step of detecting the expression of at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I) to (III) in T cells; an evaluation step of evaluating the quality of T cells using the expression of the gene as an index; (hereinafter sometimes simply referred to as "the method of the present invention").
  • the T cell in the present invention means a cell expressing an antigen receptor called T cell receptor (TCR) on the surface, alpha beta ( ⁇ ) T cells and gamma delta ( ⁇ ) containing T cells.
  • TCR T cell receptor
  • T cells in the present invention include, for example, helper T cells, cytotoxic T cells, regulatory T cells, natural killer T cells, naive T cells, memory T cells (e.g., stem cell memory T cells (TSCM), central memory T cells). cells (TCM), effector memory T cells, etc.), antigen-stimulated memory T cells, or terminal effector T cells, combinations thereof, or subpopulations thereof.
  • helper T cells cytotoxic T cells
  • regulatory T cells e.g., regulatory T cells, natural killer T cells, naive T cells
  • memory T cells e.g., stem cell memory T cells (TSCM), central memory T cells).
  • TCM stem cell memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • TCM central memory T cells
  • Helper T cells are CD4-positive cells, and are further classified into Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells, etc. according to the cytokines they express (e.g., J Allergy Clin. Immunol., 135(3): 626-635, 2012).
  • Th1 cells include, for example, cells expressing IFN- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ , and the like.
  • Th2 cells include, for example, cells expressing IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, and the like.
  • Th17 cells include, for example, cells expressing IL-17 or IL-6.
  • Cytotoxic T cells are CD8-positive cells, and like helper T cells, are further classified into Tc1 cells, Tc2 cells, etc. according to the cytokines they express.
  • Tc1 cells include cells expressing IFN- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ , and the like.
  • Tc2 cells include cells that express IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, and the like.
  • Regulatory T cells preferably include, for example, CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) cells.
  • Naive T cells include, for example, CD4 (+) CD45RA (+) CD62L (+) CCR7 (+) cells, CD8 (+) CD45RA (+) CD62L (+) CCR7 (+) cells, CD4 (+) CCR7 ( +)CD45RA(+)CD95(-)CD45RO(-) cells or CD8(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(-)CD45RO(-) cells are preferred.
  • Stem cell memory T cells include, for example, CD4 (+) CD45RA (+) CD62L (+) CCR7 (+) CD95 (+) cells, CD8 (+) CD45RA (+) CD62L (+) CCR7 (+) CD95 (+) ) cells, CD4(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(+)CD45RO(+) cells or CD8(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(+)CD45RO(+) cells are preferred. be done.
  • Central memory T cells include, for example, CD4 (+) CD45RA (-) CD62L (+) CCR7 (+) CD95 (+) cells, CD8 (+) CD45RA (-) CD62L (+) CCR7 (+) CD95 (+) ) cells, CD4(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+) cells, CD8(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+) cells, and the like are preferable.
  • effector memory T cells include preferably CD4(+) CCR7(-) CD45RA(-) CD45RO(+) cells or CD8(+) CCR7(-) CD45RA(-) CD45RO(+) cells.
  • Terminal effector T cells preferably include, for example, CD4(+)CD45RA(+)CD62L(-) cells or CD8(+)CD45RA(+)CD62L(-) cells.
  • T cells differentiated from pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells); T cells differentiated from somatic stem cells such as hematopoietic stem cells; It may be a T cell.
  • pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells)
  • ES cells differentiated from somatic stem cells such as hematopoietic stem cells; It may be a T cell.
  • T cells are isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC: Peripheral Blood Monoclear Cells) isolated from peripheral blood using conventionally known methods or commercially available kits. It can be isolated.
  • PBMC peripheral blood mononuclear Cells
  • T cells include T cells that have not been artificially genetically modified (hereinafter sometimes referred to as “unmodified T cells”), as well as artificial genes in the unmodified T cells. Also included are “genetically modified T cells” that have been modified.
  • artificial genetic modification includes modification of T cell functions by gene transfer to T cells or gene editing of T cells. The artificial genetic modification may be modification of the gene itself possessed by T cells, deletion of the gene itself possessed by T cells, or modification resulting from the introduction of a foreign gene. A combination of two or more types may also be used.
  • the method of artificial genetic modification includes conventionally known methods and methods based thereon, and is not particularly limited.
  • Gene introduction into T cells includes, for example, the gene itself (DNA, mRNA, miRNA, antagomir, ODN (oligodeoxyribonucleotide), etc.) that modifies the function of T cells, or a vector into which the gene is inserted (lentiviral vector , ⁇ - or ⁇ -retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, herpes viral vectors, equine encephalitis viral vectors, non-viral vectors such as transposon vector piggyBac (registered trademark) to T cells
  • Gene editing of T cells includes, for example, gene editing of T cells using site-specific nucleases (meganuclease, zinc finger nuclease, TALEN, PPR (Pentatricpeptide repeat), CRISPR-Cas, etc.) (genome editing).
  • Examples of the gene that modifies the function of T cells include proteins secreted from T cells; fusion proteins containing proteins expressed on the surface of T cells and at least one intracellular signaling domain; proteins expressed on the surface of T cells; Fusion proteins comprising at least one co-stimulatory domain and at least one intracellular signaling domain include, more specifically, cell surface enzymes, cell adhesion factors, receptors (e.g., chimeric antigen receptors), and these and subunits that make up the
  • Detection process (target gene)
  • the expression of at least one gene selected from the group consisting of genes (I) to (III) below is detected in T cells.
  • a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 (II) one or more of the amino acid sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-54 70% or more of the amino acid sequence described in any one of gene (III) SEQ ID NOS: 1 to 54 encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added
  • the gene (I), the gene (II), and the gene (III) are independently of each other. Two or more types may be used.
  • the polypeptide encoded by any one of the genes (I) to (III) is preferably contained in the T cell-derived secretome.
  • secretome refers to proteins that are secreted from cells or that are exposed outside the cells through cell membranes, and include embodiments in which all or part of these proteins are endogenous to cells.
  • secretomes that are secreted from T cells and present in the supernatant of cell culture medium are preferred from the viewpoint of being detectable by a method that is non-invasive to cells.
  • the gene whose expression is to be detected (hereinafter sometimes referred to as "target gene"), if derived from human, is typically "(I) any one of SEQ ID NOS: 1 to 54 A gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence described in .
  • Tables 1 to 3 below show the SEQ ID NO and GenBank Accession No. of each amino acid sequence for the amino acid sequences described in SEQ ID NOS: 1 to 54. (GenBank No.); SEQ ID NO of a typical nucleotide sequence of a gene encoding a polypeptide consisting of each amino acid sequence, its open reading frame (ORF position), and GenBank Accession No.
  • the present inventors have identified proteins that can be used as markers for quality evaluation of T cells by KeyMolnet analysis (KM Data) of high-quality T cells and low-quality T cells using a correlation search method.
  • KM Data KeyMolnet analysis
  • the present inventors analyzed the secretome (protein), in high-quality T cells and low-quality T cells, the PC1 score obtained by principal component analysis (PCA) for protein expression levels and the quality of T cells It was found that there is a high correlation with the PC1 score, and that the closer the absolute value of the principal component loading of the first principal component is to 1, the more the protein contributes to the quality of T cells.
  • PCA principal component analysis
  • secretomes whose expression level ratio (expression level ratio between cell groups with different cell quality) is small or large (i.e., the above When proteins with large differences in expression level were identified, these proteins had a high contribution rate to the first principal component (specifically, the absolute value of the principal component loading with respect to the first principal component of the expression level was 0 0.4 or more, preferably 0.8 or more).
  • the polypeptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1-54 and the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 55-108, which are described in Tables 1 to 3, are included in the proteins thus selected.
  • the expression of a gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 54, which contributes highly to the first principal component, is an index for evaluating the quality of T cells.
  • the gene described as "up” indicates that the protein corresponding to the polypeptide consisting of the amino acid sequence encoded by the gene corresponds to the average expression value and low quality of the protein in the high-quality T cell group by secretome analysis.
  • the expression level is significantly higher in high-quality T cells when compared with the average expression value of the protein in the T cell group, and the expression level increases in high-quality T cells.
  • the gene described as "down” indicates that the protein corresponding to the polypeptide consisting of the amino acid sequence encoded by the gene corresponds to the average expression value of the protein in the high-quality T cell group and the low-quality T cell group in the secretome analysis.
  • Low-quality T cells show significantly higher expression
  • high-quality T cells show decreased expression levels when compared to the average expression of the protein.
  • homologous genes e.g., counterpart genes in organisms other than humans
  • (I) a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 54
  • the target gene can also be the target gene.
  • the nucleotide sequence of a gene can be mutated in nature (that is, non-artificially) due to mutation thereof, etc., such natural mutants can also be used as the target gene in the present invention. can.
  • a person skilled in the art can modify the nucleotide sequence and modify the function, although it is different from the amino acid sequence that codes for it. Since proteins can also be prepared, such variants may also be used as the target gene.
  • amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and/or added means an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted, or added, or It shows that the amino acid sequence is a combination of two or more of Further, “plurality” means, for example, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 is preferably an integer of, but not limited to.
  • One or more amino acid residues is preferably 1 to 10 amino acid residues, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3, particularly preferably 2 or less. is.
  • (IV) hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 1 to 54 Also included are “nucleotide sequences”.
  • Hybridization reactions are typically performed under stringent conditions to isolate homologous genes.
  • stringent conditions means that the washing operation of the membrane after hybridization is carried out at a high temperature in a low-salt solution. 2 ⁇ SSC) in 0.5% (w/v) SDS solution at 60° C. for 20 minutes.
  • hybridization can be carried out, for example, according to the method described in the instructions attached to the known ECL direct DNA/RNA labeling/detection system (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • ECL direct DNA/RNA labeling/detection system manufactured by GE Healthcare Bioscience.
  • these conditions are only examples, and the required stringency can be achieved by appropriately combining DNA concentration, DNA length, hybridization reaction time, and the like.
  • proteins encoded by homologous genes obtained by such methods usually have a high degree of identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 1-54. Therefore, in the embodiment of the target gene according to the present invention, "(III) encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 54 Also includes “genes”. Amino acid sequence identity can be determined, for example, using the BLASTP program (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 1990, p. 403-410).
  • identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 54 is typically preferably 70% or more, more preferably 75% or more, 80% or more, 85% or more. % or more, 90% or more, 95% or more (eg, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the target gene is preferably at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I') to (III') among the genes shown in Tables 1 to 3.
  • (I') according to any one of SEQ ID NOs: 4, 7, 8, 17, 20 and 38 (more preferably SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 20 and 38; more preferably SEQ ID NOs: 4 and 17)
  • Gene (II') SEQ ID NO: 4, 7, 8, 17, 20 and 38 (more preferably SEQ ID NO: 4, 8, 17, 20 and 38; more preferably SEQ ID NO: 4 and A gene (III') encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and/or added to the amino acid sequence according to any one of 17) the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 4, 7, 8, 17, 20 and 38 (more preferably SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 20 and 38; more preferably SEQ ID NOs: 4 and 17) and 70
  • detecting gene expression includes both detection of the presence or absence of gene expression and detection of the degree of expression.
  • the expression of the target gene is detected.
  • the gene expression level can be grasped as an absolute amount or as a relative amount. When grasping the relative amount, for example, it can be judged by comparing with the gene expression level of a prepared standard sample.
  • a "standard sample” refers to a sample for which it has been specified in advance whether or not the target gene is expressed, and if so, the amount of expression. For example, T cells that have been previously identified as having good or bad quality can be used as the standard sample.
  • “expression of a gene” means both transcription and translation of a gene. Therefore, “detection of gene expression” in the present invention includes detection at the transcription level (mRNA level) and detection at the translation level (protein level) (that is, detection of the polypeptide encoded by the gene). both are included.
  • splicing occurs in which introns in the pre-mRNA are removed and the exons before and after are recombined (splicing). In some cases, this produces different mature mRNAs. In turn, various proteins are translated thereby. Various mRNAs and proteins resulting from such splicing differences are called "splicing variants". Therefore, detection of gene expression in the present invention includes detection of the splicing variant as long as it is specifically recognized by the following probe molecule.
  • a known technique or a technique based thereon can be used as appropriate.
  • at least one gene selected from the group consisting of the genes (I) to (III) that is, the target gene
  • the expression product is detected using a probe molecule that
  • the expression product of the target gene is mRNA transcribed from the target gene (hereinafter sometimes referred to as "target polynucleotide").
  • the target polynucleotide also includes cDNA using the mRNA as a template.
  • Detection methods include, for example, Northern blotting, dot blotting, and RNase protection assay using oligonucleotide probes designed to hybridize to appropriate positions in the base sequence of the target polynucleotide as the probe molecule. , DNA microarray analysis, in situ hybridization, and the like to detect the target polynucleotide.
  • the oligonucleotide probe one labeled with a labeling substance is used, a signal corresponding to the labeling substance is detected, and the detected signal amount is the amount of the target polynucleotide (i.e., expression level of the target gene).
  • labeling substances at this time include FITC (fluorescein isothiocyanate), FAM (fluorescein amidite), DEAC (7-(diethylamino)coumarin), R6G (rhodamine 6G), Texas Red, Cy5, and BODIPY FL (trade name).
  • luminescence substances such as luminol, luciferin, and lucigenin.
  • the "signal” includes coloration (coloration), reflected light, luminescence, quenching, fluorescence, radiation from a radioactive isotope, and the like, and in addition to those that can be confirmed with the naked eye, depending on the type of signal It also includes those that can be confirmed by measuring methods and equipment.
  • oligonucleotide primers designed to sandwich appropriate positions in the target polynucleotide are used, PCR method, RT-PCR method, TRC (Transcription Reverse Transcription Concerned) method, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method, TMA (Transcription-Mediated Amplification) method, or the like may also be used to amplify and detect the target polynucleotide.
  • a signal (fluorescence) obtained by intercalating the obtained amplification product with a fluorescent dye e.g., ethidium bromide, SYBR Green (trade name), SYTO63 (trade name), etc.
  • a fluorescent dye e.g., ethidium bromide, SYBR Green (trade name), SYTO63 (trade name), etc.
  • the detected signal amount fluorescence intensity
  • detection may be performed in combination with the oligonucleotide probe (double dye probe method, etc.).
  • the amount of the target polynucleotide may be determined by directly subjecting a sample containing the target polynucleotide to a sequencer for analysis.
  • oligonucleotide probes and oligonucleotide primers can be designed by a person skilled in the art based on the sequence of the target polynucleotide by a known method or a method based thereon.
  • the length of the oligonucleotide probe and oligonucleotide primer are each independently preferably at least 15 bases, usually 15 to 100 bases, preferably 17 to 30 bases, more preferably 20-25 bases.
  • the oligonucleotide probes and oligonucleotide primers can be synthesized by, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • nucleotides deoxyribonucleotides and/or ribonucleotides
  • PNA polyamide nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • ENA registered trademark, 2'- O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids
  • the expression product of the target gene is a polypeptide encoded by the target gene (hereinafter sometimes referred to as "target polypeptide"). More specifically, it is a polypeptide encoded by any one of the genes (I) to (III), that is, selected from the group consisting of the following polypeptides (i) to (iii) is a polypeptide that is (i) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 1-54; (ii) one or more amino acid residues in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 1-54; is a substituted, deleted, inserted, and / or added amino acid sequence (iii) an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 1 to 54 A polypeptide comprising:
  • polypeptides (i) to (iii) are each independently one species alone, may be two or more.
  • polypeptides (i) to (iii) include polypeptides encoded by any one of the genes (I') to (III'), that is, the following (i' ) to (iii') are preferably selected from the group consisting of polypeptides.
  • polypeptides (ii′) according to any one of SEQ ID NOs: 4, 7, 8, 17, 20 and 38 (more preferably SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 20 and 38; more preferably SEQ ID NOs: 4 and 17) Any of the polypeptides (ii′) SEQ ID NOs: 4, 7, 8, 17, 20 and 38 (more preferably SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 20 and 38; more preferably SEQ ID NOs: 4 and 17) comprising an amino acid sequence or a polypeptide (iii') SEQ ID NOS: 4, 7, 8, 17, 20 and 38 (more preferably SEQ ID NOs: 4, 8, 17, 20 and 38; more preferably SEQ ID NOs: 4 and 17) having 70% or more identity with the amino acid sequence set forth in any one A polypeptide containing a sequence.
  • polypeptides (i') to (iii') each independently It may be one type alone or two or more types.
  • these target polypeptides to be detected are preferably the above secretomes (T cell-derived secretomes).
  • detection methods for detection at the translation level include detection using anti-polypeptide antibodies and/or aptamers, and detection using labeled amino acids.
  • Detection methods for detection at the translation level include, for example, antibodies that specifically bind to the target polypeptide (hereinafter sometimes referred to as “anti-polypeptide antibodies”) and/or aptamers (hereinafter , In some cases, simply referred to as "aptamer”), immune cell staining method, imaging cytometry, flow cytometry, ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method, radioimmunoassay, immunoprecipitation method, immunoblotting (Western blotting method etc.), methods of detection using antibodies such as antibody arrays and in vivo imaging (immunological techniques); methods of detection using aptamers instead of the antibodies.
  • the immunological method uses an enzyme immunoassay device such as AIA-900 (manufactured by Tosoh Corporation) or a chemiluminescent enzyme immunoassay device such as AIA-CL2400 (manufactured by Tosoh Corporation) after preparing necessary reagents. can be done automatically.
  • AIA-900 manufactured by Tosoh Corporation
  • AIA-CL2400 manufactured by Tosoh Corporation
  • an “antibody” may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a functional fragment of an antibody.
  • “Antibody” also includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • a “functional fragment” of an antibody refers to a portion (partial fragment) of an antibody that specifically recognizes the polypeptide encoded by the target gene in the present invention. Specifically, Fab, Fab′, F(ab′) 2 , variable region fragment (Fv), disulfide-bonded Fv, single-chain Fv (scFv), sc(Fv) 2 , diabody, multispecific antibodies, short-chain antibodies, and polymers thereof.
  • the anti-polypeptide antibody according to the present invention is a polyclonal antibody
  • an immunized animal is immunized with an antigen (target polypeptide, its partial peptide, or cells expressing these, etc.), and the antiserum is obtained by conventional means ( Salting out, centrifugation, dialysis, column chromatography, etc.) can be appropriately purified and obtained.
  • Monoclonal antibodies can also be produced by the hybridoma method or recombinant DNA method.
  • the hybridoma method includes, for example, Kohler and Milstein's method (Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)), and the recombinant DNA method includes, for example, the DNA encoding the anti-polypeptide antibody. It is cloned from B cells or the like, incorporated into an appropriate vector, introduced into host cells (mammalian cell lines, E. coli, yeast cells, insect cells, plant cells, etc.), and the anti-polypeptide antibody is produced as a recombinant antibody. (For example, P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY; P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; Vandamme AM et al., Eur.J. Biochem. 192:767-775 (1990)).
  • the anti-polypeptide antibody and the aptamer are each labeled with a labeling substance, the signal corresponding to the labeling substance is detected, and the amount of the detected signal is calculated as the amount of the target polypeptide. (that is, the expression level of the target gene).
  • the labeling substance at this time is not particularly limited as long as it can bind to the anti-polypeptide antibody or aptamer and can be detected by a chemical or optical method.
  • fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and rhodamine isothiocyanate (RITC)
  • enzymes such as peroxidase, ⁇ -D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase, and radioactive substances.
  • the anti-polypeptide antibody and/or aptamer When the anti-polypeptide antibody and/or aptamer is used, a method of using a secondary antibody bound with the labeling substance, or a method of using a polymer binding the secondary antibody and the labeling substance. Indirect detection methods such as can also be used.
  • the "secondary antibody” is an antibody that exhibits specific binding to the anti-polypeptide antibody and/or aptamer.
  • an anti-rabbit IgG antibody can be used as the secondary antibody.
  • Labeled secondary antibodies that can be used for antibodies derived from various species such as rabbits, goats, and mice are commercially available. Antibodies can be selected and used.
  • protein G for example, derived from Streptococcus spp.
  • protein A for example, derived from Staphylococcus aureus
  • protein L derived from Peptostreptococcus magnus
  • Detection with labeled amino acids include, for example, a method of culturing T cells in a medium supplemented with a labeled amino acid and detecting a target polypeptide labeled with the labeled amino acid.
  • T cell labeling medium refers to a medium containing at least labeling amino acids for culturing and labeling T cells.
  • essential amino acids for T cell proliferation refers to amino acids essential for T cell proliferation, more specifically, valine, isoleucine, leucine, methionine, lysine, phenylalanine, tryptophan, threonine, histidine.
  • the T cell labeling medium contains a labeled amino acid in which the amino acid is labeled instead of at least one of the essential amino acids, that is, does not contain at least one of the essential amino acids and the essential amino acid that is not contained Contains labeled amino acids, where the amino acids are labeled amino acids.
  • "Containing no essential amino acids” means that the T cell labeling medium does not substantially contain the essential amino acids. More specifically, the content of the essential amino acids in the T cell labeling medium is is 1 ⁇ 10 ⁇ 3 mmol/L or less, preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 4 mmol/L.
  • the essential amino acids excluded from the T cell labeling medium may be any one of the above or a combination of two or more of them. Among them, methionine is preferred from the viewpoint of efficient incorporation into the protein synthesis pathway.
  • the "labeled amino acid” refers to an essential amino acid partially modified while maintaining the structure of the essential amino acid, and detectable based on the modification.
  • the above-mentioned “detectable” includes those that can be directly confirmed by visual observation such as coloring (color development), quenching, reflected light, luminescence, and fluorescence, as well as those that can be confirmed by a specific measuring method or measuring device.
  • labeled amino acids examples include isotope-labeled amino acids in which some of the atoms of the amino acid are substituted with pulse stable isotopes (e.g., 2 H, 13 C, 15 N); Examples include structural analogs of amino acids modified by modifying groups such as groups, and corresponding to the essential amino acids, any one of them or a combination of two or more of them good.
  • the labeling amino acid contained in the T cell labeling medium instead of methionine may be, for example, one of the atoms constituting methionine.
  • HPG L-Homopropargylglycine
  • HOG L-homoallylglycine
  • the content of the labeled amino acids includes the T cell uptake efficiency, the culture efficiency, the T cell It can be determined as appropriate in consideration of the toxicity etc., and is not particularly limited. Preferably, it is 0.001 to 0.02 mmol/L. More specifically, for example, when the labeled amino acid is AHA, it is preferably 0.0005 to 0.03 mmol/L, more preferably 0.001 to 0.03 mmol/L. More preferably 0.002 to 0.03 mmol/L, even more preferably 0.005 to 0.02 mmol/L.
  • the cells tend to weaken or die, whereas when the content is less than the lower limit, the polypeptide labeled with the labeled amino acid is secreted or exposed outside the cell. As a result, the number of cells to be detected tends to decrease, and the detection accuracy of the polypeptide tends to decrease.
  • the T cell labeling medium further contains common ⁇ -chain family cytokines.
  • a "common ⁇ chain family cytokine” refers to a cytokine that acts via a receptor containing a common ⁇ chain ( ⁇ subunit). More specifically, interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 7 (IL-7), interleukin 9 (IL-9), interleukin 15 (IL-15) , and interleukin 21 (IL-21), any one of which may be used in combination.
  • interleukin 7, interleukin 15, interleukin 21, and combinations of two or more of these are more preferable from the viewpoint of better maintenance of cell survival and growth.
  • the content of the common ⁇ -chain family cytokine (when there are two or more common ⁇ -chain family cytokines, the total content thereof; the same shall apply hereinafter) is determined according to the properties of T cells, etc. Although it is not limited to this, it is preferably 1 to 1000 ng/mL, more preferably 5 to 100 ng/mL, and 5 to 20 ng/mL. It is even more preferable to have When the content of the common ⁇ -chain family cytokine exceeds the upper limit, the effect of containing the common ⁇ -chain family cytokine tends to decrease or cell proliferation tends to be inhibited. The number of cells that secrete or extracellularly expose a polypeptide labeled with a labeled amino acid tends to decrease, resulting in a decrease in the detection accuracy of the polypeptide.
  • the T cell labeling medium preferably does not contain serum or, if it does contain serum, is dialyzed serum from which the essential amino acids have been removed.
  • the T cell labeling medium may also contain cytoprotective additives such as serum albumin and ITS (insulin-transferrin-sodium selenite); scaffolding agents such as ECM (extracellular matrix) components.
  • T cell labeling media or their basal media are not particularly limited as long as they do not contain the desired essential amino acids, and are DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), ⁇ MEM ( ⁇ -modified basal medium such as Eagle minimum essential medium); AIM V TM medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) which is a serum-free medium exclusively for T cells; PRIME-XV T cell Expansion XSFM (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical) or a commercially available medium for T cells can be used as appropriate.
  • DMEM Disbecco's Modified Eagle Medium
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium
  • ⁇ MEM ⁇ -modified basal medium such as Eagle minimum essential medium
  • AIM V TM medium manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • PRIME-XV T cell Expansion XSFM manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical
  • a commercially available medium for T cells
  • T cells are cultured in the T cell labeling medium.
  • the labeled amino acid is taken up by T cells, and a polypeptide labeled with the labeled amino acid (T cell-derived polypeptide) is secreted from the T cells or exposed outside the cells.
  • the culture method in the labeling step is not particularly limited, and known T cell proliferation culture conditions can be appropriately adopted, and the characteristics and concentration of T cells can be taken into consideration and adjusted as appropriate.
  • the culture temperature is 35 to 37.5° C., preferably 36 to 37° C.
  • the culture time is 2 to 48 hours, preferably 8 to 24 hours.
  • the culture apparatus for the labeling step is not particularly limited, and examples thereof include plates, dishes, columns, flasks, culture bags, and the like. Ejection means (sensors, valves, pumps, tanks, etc.) may also be provided.
  • the T cell-derived polypeptide that is labeled with the labeling amino acid and is secreted or exposed outside the cell is detected.
  • the detection step A may be performed simultaneously (in real time) with the labeling step.
  • a detection method in the detection step A a detection method suitable for the type of the labeled amino acid can be appropriately employed.
  • Such a detection method is not particularly limited, and a known method or a method based thereon can be appropriately employed.
  • the labeled amino acid is an isotope-labeled amino acid or a structural analogue of an amino acid
  • the medium after the labeling step or during the labeling step that is, during the culture
  • gas isotope ratio mass spectrometry By performing mass spectrometry such as infrared spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS/MS), a signal corresponding to the labeled amino acid is detected, and the amount of the detected signal is the amount of the target polypeptide (i.e. , expression level of the target gene).
  • the labeled amino acid when it is a structural analogue of an amino acid, it can be detected by staining the modified group specifically.
  • the modifying group is an azide group (such as AHA)
  • the azide group can be stained with a fluorescent reagent such as Click-iT TM Alexa Fluor 488 sDIBO Alkyne (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • a fluorescent reagent such as Click-iT TM Alexa Fluor 488 sDIBO Alkyne (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • a signal color development, fluorescence, etc.
  • the amount of the detected signal is the amount of the target polypeptide (i.e., the amount of the target gene). expression level).
  • detection methods for detection at the translation level include, for example, a method of recognizing and detecting the sugar chain of the target polypeptide. Such methods include, for example, methods using commercially available reagents such as Click-iT TM (manufactured by Thermo Fisher Scientific). The detection method for detection at the translation level may be used in combination with other methods as appropriate.
  • detection of the expression of the gene is preferably detection at the translation level (detection of the target polypeptide) from the viewpoint of convenience. Methods that detect polypeptides are preferred.
  • the quality of T cells is evaluated using the presence or absence or the expression level of the target gene detected in the detection step as an index.
  • the quality of T cells to be evaluated in the present invention includes proliferative ability and cancer cytotoxic activity.
  • the method of the present invention is preferable as a method for evaluating the proliferative ability of T cells. More specifically, the term "proliferative ability" indicates the ability to activate T cells and increase cells having cytotoxic activity in vitro or in vivo by TCR stimulation or antigen stimulation.
  • T cells can be confirmed, for example, by stimulating the TCR of T cells with TCR-stimulating magnetic beads by the method shown in the Examples below and comparing the cell count before stimulation to the cell count 14 days after stimulation. can, but is not limited to.
  • the evaluation criteria for the quality of the T cells may be appropriately set according to the purpose, and are not particularly limited.
  • the quality of the T cells may be evaluated as good (or bad), and if the expression level of the target gene above a certain threshold is detected, the quality of the T cells is good (or bad). can be evaluated.
  • the expression levels of multiple target genes may be combined to assess T cell quality. For example, when the expression level of the gene described as "up” in Tables 1 to 3 is high and the expression level of the gene described as "down” in Tables 1 to 3 is low, the quality of the T cells is considered to be good. For example, the higher the expression levels of multiple genes described as "up” in Tables 1 to 3, the better the quality of T cells can be evaluated.
  • the quality of T cells may be evaluated according to the expression level of the target gene. For example, a certain value or more, or the expression level of the target gene relative to the expression level of the target gene detected in a standard sample such as T cells that have been specified in advance to have high (or low) proliferative ability If the signal amount is 4 SD or more, 3 SD or more, or 2 SD or more of the average value of , the proliferative ability is high (or low), that is, the quality may be evaluated as good (or bad).
  • the T cell evaluation reagent of the present invention is a reagent (composition) for use in the T cell evaluation method of the present invention, and is at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I) to (III).
  • a reagent containing a probe molecule that specifically binds to an expression product of a gene of a species hereinafter sometimes simply referred to as "the reagent of the present invention”).
  • the genes (I) to (III) and the expression products of the genes are as described in the method of the present invention, including preferred embodiments thereof.
  • probe molecules related to the reagent of the present invention include oligonucleotide probes, oligonucleotide primers, anti-polypeptide antibodies, and aptamers mentioned in the method of the present invention described above. in the method of the present invention.
  • the probe molecule may be one of these or a combination of two or more of them. Among them, the anti-polypeptide antibody and/or the aptamer are preferable, and the anti-polypeptide antibody is more preferable.
  • the reagent of the present invention may be liquid or solid such as powder. Additional ingredients may be included.
  • the kit for evaluating T cells of the present invention is a kit for use in the method of evaluating T cells of the present invention, and contains at least one gene selected from the group consisting of genes (I) to (III). It is a kit comprising a probe molecule that specifically binds to an expression product (hereinafter sometimes simply referred to as "the kit of the present invention").
  • the probe molecule according to the kit of the present invention is preferably the reagent of the present invention.
  • the kit of the present invention also contains a buffer, a solution for dilution or suspension such as physiological saline; a reagent for extracting and/or purifying DNA or protein; a blocking agent; a chelating agent; The labeling substance; the fluorescent dye; reagents necessary for the detection step; reagents such as pH adjusters; standard samples; instructions for use;
  • the present invention provides high-quality T cells obtained by the above T-cell evaluation method and pharmaceutical compositions containing the high-quality T cells as active ingredients.
  • the pharmaceutical composition containing T cells as an active ingredient of the present invention can be used to treat cancer patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by a method commonly used in the field of formulation technology, such as the method described in the Japanese Pharmacopoeia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain pharmaceutically acceptable additives. Examples of such additives include cell culture media, physiological saline, and suitable buffers (eg, phosphate buffers).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by suspending T cells in physiological saline, an appropriate buffer (eg, phosphate buffer), or the like. It is preferable to contain, for example, 1 ⁇ 10 7 cells or more in a single dose so as to achieve the desired therapeutic effect. It is more preferably 1 ⁇ 10 8 or more, still more preferably 1 ⁇ 10 9 or more.
  • the content of cells can be appropriately adjusted in consideration of the sex, age, weight, condition of the affected area, condition of cells, etc. of the subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain dimethylsulfoxide (DMSO), serum albumin, and the like for the purpose of protecting cells.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Antibiotics and the like may be added for the purpose of preventing bacterial contamination, and vitamins, cytokines, and the like may be included for the purpose of promoting activation and differentiation of cells.
  • other pharmaceutically acceptable components e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc. It may be included in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a pharmaceutical composition containing the T cells of the present invention as an active ingredient can be cryopreserved.
  • the temperature is not particularly limited as long as it is suitable for cell preservation. Examples include -20°C, -80°C and -120 to -196°C.
  • cells can be stored in suitable containers such as vials. Manipulations to minimize the risk of cell damage during freezing and thawing of T cells are well known to those of skill in the art.
  • T cells are collected from the culture medium, washed with buffer or culture medium, counted, concentrated by centrifugation, etc., and placed in a freezing medium (e.g., containing 10% DMSO). culture solution), and cryopreserved.
  • T cells can be made into a single lot by combining cells cultured in multiple culture vessels.
  • the pharmaceutical composition containing T cells of the present invention contains, for example, 5 ⁇ 10 4 to 9 ⁇ 10 10 T cells per container such as a vial. It can be changed according to the route or the like.
  • Examples of administration routes of the pharmaceutical composition containing the T cells of the present invention include infusion, intratumoral injection, arterial injection, portal vein injection, intraperitoneal administration, and the like.
  • the administration route is not limited to this as long as the T cells, which are the active ingredients in the pharmaceutical composition of the present invention, are delivered to the affected area.
  • Dosage schedules can be single doses or multiple doses. For the period of multiple administrations, for example, a method of repeating administration once every 2 to 4 weeks, a method of repeating administration once every six months to a year, or the like can be adopted.
  • the sex, age, body weight, disease state, etc. of the target patient can be taken into consideration.
  • cancer patients from whom T cells are collected or The non-cancer patient preferably has the same HLA type as the cancer patient to whom the pharmaceutical composition of the present invention is administered for cancer treatment. Moreover, it is more preferable that the cancer patient to whom the pharmaceutical composition of the present invention is administered and the cancer patient from whom T cells are collected are the same person. That is, cancer treatment by autologous transplantation is more preferable than allogeneic transplantation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for prevention or treatment of cancer.
  • Cancers include ovarian cancer, hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, renal cell carcinoma, breast cancer, malignant melanoma, non-small cell lung cancer, cervical cancer, and glioblastoma. including, but not limited to, blastoma, prostate cancer, neuroblastoma, chronic lymphocytic leukemia, papillary thyroid cancer, colorectal cancer, and B-cell non-Hodgkin's lymphoma.
  • the timing of administration of the pharmaceutical composition and cancer vaccine of the present invention is not limited,
  • the pharmaceutical composition of the present invention and cancer vaccine may be administered to the subject at the same time or at different times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention and cancer vaccine may be formulated separately, or may be a combination drug in which both are mixed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition and cancer vaccine of the present invention may conform to the dosage used clinically, and can be appropriately selected depending on the disease, administration subject, administration route, combination with drugs, and the like.
  • the present invention provides a method for treating or preventing cancer, comprising administering T cells to a subject who has cancer or is at risk of having cancer, wherein the T cells have the following (I A detection step of detecting expression of at least one gene selected from the group consisting of genes from ) to (III); an evaluation step of evaluating the quality of T cells using the expression of the gene as an index; A method ((I) a gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOS: 1-54, comprising , gene (III) encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added amino acid according to any one of SEQ ID NOS: 1 to 54 A gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having greater than 70% identity with the sequence.).
  • a subject in the present invention is a vertebrate.
  • the vertebrate is a mammal.
  • Such mammals include, but are not limited to, farm animals (eg, cows), sport animals, pet/companion animals (eg, cats, dogs, and horses), primates, mice, and rats.
  • the mammal is human.
  • the present invention provides a method for producing T cells, comprising a detection step of detecting the expression of at least one gene selected from the group consisting of the following genes (I) to (III) in the T cells; an evaluation step of evaluating the quality of T cells using the expression of the gene as an index;
  • a method for producing T cells ((I) a gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOS: 1-54 (II) according to any one of SEQ ID NOS: 1-54
  • Any one of gene (III) SEQ ID NOS: 1 to 54 encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of A gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence described in .).
  • T cells 1. Evaluation of quality (proliferation ability) of T cells (1) Thaw 14 types of T cell lines shown in Table 7 below and prepare medium A (15% (w/v) fetal bovine serum (FBS, BioWest) in a 96-well plate. , 5 ng/mL interleukin 7 (IL-7), and 5 ng/mL interleukin 15 (IL-15) added to ⁇ MEM ( ⁇ modified Eagle minimal essential medium)) at 1 ⁇ 10 6 cells/well, respectively. sown.
  • medium A 15% (w/v) fetal bovine serum (FBS, BioWest) in a 96-well plate.
  • IL-7 interleukin 7
  • IL-15 interleukin 15
  • T cell receptor (TCR) stimulation Magnetic beads (Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation (manufactured by Thermo Fisher Scientific) are used to stimulate the TCR of the seeded T cells. , and cultured for 14 days under conditions of 5% CO 2 and 37° C. while replacing the medium with medium A as appropriate.
  • TTL cytotoxic T cells
  • iPSC-T iPS cell-derived CTL
  • the classified groups are also shown in Table 7.
  • T cells of the same strain as the T cells classified into high-quality T cells (good: 7 types) and low-quality T cells (bad: 7 types) in 1 (3) above were stimulated using TCR-stimulating magnetic beads in the same manner as in 1 (1) to (2) above, and the medium was replaced with medium A at 5% CO 2 and 37°C. It was cultured under the conditions of
  • the genes (sequence data) decoded in (4) and (3) were mapped to the human genome sequence using TopHat2 (JOHNS HOPKINS University) and Bowtie2 (JOHNS HOPKINS University).
  • TopHat2 JOHNS HOPKINS University
  • Bowtie2 JOHNS HOPKINS University
  • BUILD GRCh38 published by NCBI (National Center for Biological Information) was used.
  • the expression level for each gene was determined in units of FPKM (fragments per kilobase of exon per million reads mapped) from the number of reads of each gene decoded by Cufflinks (University of Washington).
  • TCR TCR unstimulated
  • TCR TCR was stimulated using TCR-stimulating magnetic beads in the same manner as in (1) to (2) of 1 above, and cultured under the conditions of 5% CO 2 and 37° C. while exchanging the medium with medium A as appropriate.
  • Pathway analysis Transcriptome analysis results obtained in 2 (4) above (expression level for each mapped gene) and secretome analysis results obtained in 3 (5) above (quantitative value of the identified protein ) are integrated, and the six groups (A to F) classified in (3) of 1 above are compared in a round-robin manner (15 ways in total), and KeyMolnet analysis using the correlation search method (KM Data Co., Ltd. ), the signal transduction pathway to which the protein (secretome) identified in the secretome analysis belongs (signal with a large score calculated by the following formula transduction pathway; in the following formula, the molecule belonging to the pathway indicates a protein belonging to the signal transduction pathway).
  • the score is a value indicating the overall degree of involvement calculated by the following formula based on a statistical method (hypergeometric distribution), and the higher the value, the more significant the signal transduction pathway.
  • the secretome analysis results quantitative value (expression level) of the identified protein obtained in (5) of 3 above were compared between the groups A protein (secretome) with an expression level ratio of 0.67 or less or 1.5 or more and a T-test p value of 0.05 or less was extracted.
  • proteins extracted in (3) From the proteins extracted in (3), cytoskeleton, G proteins, and proteins involved in RNA/DNA synthesis and microtubule/membrane transport were excluded, and other proteins were selected.
  • the proteins (abbreviations), amino acid sequences, and genes shown in Tables 1 to 3 above are used for the selected proteins, their amino acid sequences, and genes encoding polypeptides comprising the same amino acid sequences, respectively.
  • the signal transduction pathway that appears frequently is the main signal transduction pathway that is caused by cell quality (proliferative ability).
  • T cells (E/F) derived from the same iPS cell clone it is possible to extract signal transduction pathways related to differences in cell quality caused by the culture system. Therefore, it can be said that the selected proteins are proteins (secretome) related to the signal transduction pathway whose expression varies between cells with different qualities.
  • T cells-2 (1) In addition to the 14 types of T cells shown in Table 7 above, the 10 types of T cells shown in Table 24 below are measured for the proliferation rate in the same manner as in (1) to (3) of 1 above. bottom. For all 24 types of T cells, T cells with a proliferation rate of 20 or more (T cells of cell Nos. 1 to 12 in Table 24) are classified as "high-quality T cells", and the same proliferation rate is less than 20. The T cells (T cells of cell Nos. 13 to 24 in Table 11) were each classified as "low-quality T cells”. Table 24 also shows the proliferation fold of each cell.
  • TCR TCR unstimulated
  • TCR TCR was stimulated using TCR-stimulating magnetic beads in the same manner as in (2), and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37° C. while exchanging the medium with medium A as appropriate.
  • the proteins extracted in (5) and (4) were subjected to amino acid sequence determination, protein identification, and quantification in the same manner as in 3 (4) to (5) above.
  • PCA Principal component analysis
  • proteins with a large principal component loading value of the first principal component are expressed in cells with a high PC1 score, that is, low-quality T cells, and proteins with a small principal component loading value of the first principal component are expressed in It was found to be expressed in cells with low PC1 score, ie high quality T cells.
  • the principal component loading of the first principal component was determined for the expression levels of the proteins selected in (4) of the pathway analysis in 4 above.
  • the obtained main component loading of the first main component is also shown in Tables 1 to 3 above.
  • Tables 1 to 3 in the proteins selected in the pathway analysis, the absolute value of the principal component loading for the first principal component obtained is all 0.4 or more, and 0.8 for most proteins. That was it. Therefore, it can be said that the proteins shown in Tables 1 to 3 above can be used as markers for evaluating the quality (proliferative potential) of T cells.
  • EEF1A1 Human EEF1A1 (Elongation factor 1-alpha 1) ELISA Kit (manufactured by MyBioSource) TPI1 (amino acid sequence number 7): Human TPI1 (Triosephosphate isomerase) ELISA Kit (manufactured by MyBioSource) ENO1 (amino acid sequence number 8): Human NNE (Non-Neuronal Enolase) ELISA Kit (manufactured by MyBioSource) TKT (amino acid sequence number 17): Human Transketolase, TK ELISA Kit (manufactured by MyBioSource) G6PD (amino acid sequence number 38): Human G6PD (Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase)
  • EEF1A1 amino acid SEQ ID NO: 4
  • TKT amino acid SEQ ID NO: 17
  • G6PD amino acid SEQ ID NO: 38
  • EEF1A1, ENO1, TKT, G6PD, and ALDOC have absolute values of correlation coefficients of 0.6 or more, and these five proteins are particularly preferred embodiments of markers capable of evaluating the quality of T cells. It can be said.
  • EEF1A1 and TKT have a correlation coefficient absolute value of 0.8 or more, and can be said to be particularly preferred embodiments of markers that can evaluate the quality of T cells.
  • the present invention it is possible to provide a T cell evaluation method that can evaluate the quality of T cells using a new index, and a T cell evaluation reagent used for the method.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、 を含む、Ｔ細胞の評価方法。 （Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子 （ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子 （ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。

Description

Ｔ細胞を評価する方法及びＴ細胞を評価するための組成物
　本発明は、Ｔ細胞を評価する方法、Ｔ細胞を評価するための組成物、Ｔ細胞の評価方法により得られた高品質Ｔ細胞を含有する医薬組成物及び該医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法等に関する。
　悪性腫瘍等のがんや慢性難治性感染症などの疾患に対する新しい治療方法として、当該疾患に関連する抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を用いた細胞免疫療法が知られている。近年では、がん治療に有効な手段として、患者からＴ細胞（未改変Ｔ細胞）を採取し、がん攻撃能力が高まるように遺伝子改変して遺伝子改変Ｔ細胞とした後、当該遺伝子改変Ｔ細胞を元の患者に戻してがんを治療するがん免疫療法が期待を集めている。
　また、患者から採取したＴ細胞では、細胞疲弊が起こりやすかったり、増殖培養（又は拡大培養）が困難であるといった課題を有していることから、用いることができる細胞数に制限のないｉＰＳ細胞に由来するＴ細胞を利用した、がん免疫療法の開発も進められている。例えば、特許文献１には、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、インターロイキン７及びＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）活性化剤を含む培地で培養し、ＣＤ８α＋β＋ＣＴＬを誘導する方法が記載されている。
　ｉＰＳ細胞に由来するＴ細胞では、ｉＰＳ細胞株や培養条件等によって品質が異なるため、得られたＴ細胞においては、その品質を評価して前記がん免疫療法に適したものを選択する必要がある。また、得られた遺伝子改変Ｔ細胞についても、その品質を評価して目的の遺伝子改変Ｔ細胞として適したものを選択する必要がある。このようなＴ細胞の品質評価項目としては、具体的に、例えば、Ｔ細胞の各段階で発現する分化マーカーの発現解析、ＴＣＲ刺激後に産生されるサイトカイン量の解析、増殖能、細胞傷害活性、動物実験でのがん細胞抑制活性等が挙げられる。Ｔ細胞の品質は、これらの項目によって総合的に評価されるが、かかる評価は、煩雑であったり長期間を要する場合が多い。さらに、評価にかかるコストも高額なことから、より簡便かつ短期間でＴ細胞の品質を評価できる方法が求められている。
　このようなＴ細胞の品質評価方法としては、例えば、ＰＤ－１やｌａｇ３等の発現量とＴ細胞の疲弊化との間に関係があることが見出されているため（非特許文献１）、これらのタンパク質をＴ細胞の疲弊化マーカーとして、その発現量によってＴ細胞の疲弊化を評価する方法が挙げられる。
国際公開第２０１８／１３５６４６号
Ｄａｎｉｅｌ　Ｌ．Ｂａｒｂｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，４３９，２００６年，ｐ．６８２－６８７
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、上記の疲弊化マーカーは、長期間培養によりかなりＴ細胞の疲弊化が進んでから発現する。そのため、ｉＰＳ細胞から分化誘導した直後のＴ細胞等、比較的若いＴ細胞の品質を評価するためには不向きであることを本発明者らは見出した。従来、このように比較的若いＴ細胞の品質も評価できるマーカーは特定されていない。
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、新たな指標によって比較的若いＴ細胞の品質も評価できるＴ細胞の評価方法、及びそれに用いるＴ細胞評価用試薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、増殖能が高いＴ細胞（高品質Ｔ細胞）及び増殖能が比較的低いＴ細胞（低品質Ｔ細胞）についてセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）解析及びトランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）解析を行なった。これらの解析で得られたデータを用い、前記高品質Ｔ細胞及び前記低品質Ｔ細胞において、相互関係検索法を用いたＫｅｙＭｏｌｎｅｔ解析（ＫＭデータ社）により、遺伝子の発現量の差が大きく、かつ、Ｔ細胞の品質（増殖能）に関連する可能性の高いシグナル伝達経路を特定した。さらに、セクレトーム解析データについて、前記高品質Ｔ細胞及び前記低品質Ｔ細胞における主成分解析（ＰＣＡ）を行なったところ、Ｔ細胞の品質（増殖能）と特定のタンパク質（セクレトーム）の発現量との間に、特定の関係があることを見出した。より具体的には、上記ＰＣＡで第一主成分の主成分負荷量の絶対値が１に近い遺伝子ほど、Ｔ細胞の品質に寄与することを見出した。かかる知見より、上記で特定したシグナル伝達経路に属するタンパク質の中からさらに、セクレトームであって、その発現量比（細胞品質が異なる細胞群間での発現量比）の値が小さい、又は大きくなる（すなわち、前記発現量の差が大きい）タンパク質を特定したところ、これらのタンパク質は、上記の第一主成分の主成分負荷量の絶対値が１に近いものであることが確認された。したがって、当該タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をＴ細胞の品質評価用のマーカーとし、その発現を指標とすることによって、Ｔ細胞の品質を評価することができる。さらに、これら遺伝子は、Ｔ細胞のＴＣＲ刺激回数の少ない比較的初期に発現する遺伝子であることから、その発現を指標とすることによって、比較的若いＴ細胞の品質も評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
　［１］　Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
を含む、Ｔ細胞の評価方法。
（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［２］　前記検出工程が、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現産物に特異的に結合するプローブ分子を用いて前記発現産物を検出する工程である、［１］に記載の方法。
　［３］　前記発現産物が、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子のうちのいずれか１つにコードされるポリペプチドであり、かつ、前記プローブ分子が、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はアプタマーである、［２］に記載の方法。
　［４］　前記評価工程が、前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の増殖能を評価する工程である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
　［５］　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’）～（ＩＩＩ’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
（Ｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［６］　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’）～（ＩＩＩ’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
（Ｉ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［７］　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’’）～（ＩＩＩ’’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
（Ｉ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［８］　［２］～［７］のいずれか一項に記載の方法に用いるための試薬であり、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現産物に特異的に結合するプローブ分子を含有する、Ｔ細胞評価用試薬。
（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［９］　前記発現産物が、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子のうちのいずれか１つにコードされるポリペプチドであり、かつ、前記プローブ分子が、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はアプタマーである、［８］に記載の試薬。
　［１０］　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’）～（ＩＩＩ’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［８］又は［９］に記載の試薬。
（Ｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［１１］　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’）～（ＩＩＩ’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［８］～［１０］のいずれか一項に記載の試薬。
（Ｉ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［１２］　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’’）～（ＩＩＩ’’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［８］～［１１］のいずれか一項に記載の試薬。
（Ｉ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
［１３］［１］～［７］のいずれかに記載のＴ細胞の評価方法により得られた高品質Ｔ細胞。
［１４］［１３］に記載の高品質Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
［１５］　がんの予防又は治療に使用するための［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］［１４］に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。
［１７］がんを有するかまたはがんを有する危険性のある被験者に、［１４］に記載の医薬組成物を投与することを含む、がんを治療または予防する方法。
［１８］
　がんを有するかまたはがんを有する危険性のある被験者に、Ｔ細胞を投与することを含む、がんを治療または予防する方法であって、該Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
を含む、方法。
（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
［１９］Ｔ細胞の製造方法であって、該Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
を含む、Ｔ細胞の製造方法。
（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
 
　本発明によれば、新たな指標によってＴ細胞の品質を評価できるＴ細胞の評価方法、及びそれに用いるＴ細胞評価用試薬を提供することが可能となる。
Ｔ細胞株２４種類における、全８００種のセクレトームのデータについて主成分分析（ＰＣＡ）を行なって得られた散布図である。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　＜Ｔ細胞の評価方法＞
　本発明のＴ細胞の評価方法は、
　Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
を含む方法（以下、場合により、単に「本発明の方法」という）である。
（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　［Ｔ細胞］
  本発明におけるＴ細胞とは、表面にＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞を意味し、アルファベータ(αβ)T細胞およびガンマデルタ(γδ)T細胞を含む。
  本発明におけるＴ細胞は、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞（例えば、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ））、エフェクターメモリーＴ細胞等）、抗原刺激されたメモリーＴ細胞、又はターミナルエフェクターＴ細胞、それらの組み合わせ、またはそれらの亜集団を含むが、これらに限定されることはない。
  ヘルパーＴ細胞はＣＤ４陽性細胞であり、更に発現するサイトカインによりＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞等に分類される（例えば、J Allergy Clin. Immunol., 135(3): 626-635,2012）。
  Ｔｈ１細胞としては、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｈ２細胞としては、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０又はＩＬ－１３等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｈ１７細胞としては、例えば、ＩＬ－１７又はＩＬ－６等を発現する細胞等が挙げられる。
  細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性細胞であり、ヘルパーＴ細胞同様に、更に発現するサイトカインによりＴｃ１細胞及びＴｃ２細胞等に分類される。
  Ｔｃ１細胞としては、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｃ２細胞としては、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３等を発現する細胞等が挙げられる。
  制御性Ｔ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ＦｏｘＰ３（＋）細胞が好ましく挙げられる。
  ナイーブＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（－）ＣＤ４５ＲＯ（－）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（－）ＣＤ４５ＲＯ（－）細胞等が好ましく挙げられる。
ステムセルメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（＋）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（＋）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
  セントラルメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
  エフェクターメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（－）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（－）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
  ターミナルエフェクターＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（－）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（－）細胞等が好ましく挙げられる。
　本発明において、Ｔ細胞の由来としては特に制限はなく、動物由来であっても、人由来であってもよく、健常者由来のＴ細胞であってもよいし、患者（例えば、免疫機能が低下している人又は動物や、悪性腫瘍、感染症又は自己免疫疾患を患っている人又は動物）由来のＴ細胞であってもよい。さらには、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞から分化誘導したＴ細胞；造血幹細胞等の体性幹細胞から分化誘導したＴ細胞；株化したＴ細胞であってもよい。
　人から採取されたＴ細胞の場合には、例えば、末梢血から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｅｌｌｓ）より、従来公知の方法や市販のキット等を用いてＴ細胞を単離することができる。
　また、本発明において、「Ｔ細胞」には、人為的な遺伝子改変がなされていないＴ細胞（以下、場合により「未改変Ｔ細胞」という）の他、前記未改変Ｔ細胞に人為的な遺伝子改変がなされた「遺伝子改変Ｔ細胞」も含む。なお、本発明において、「人為的な遺伝子改変」には、Ｔ細胞への遺伝子導入又はＴ細胞の遺伝子編集によりＴ細胞の機能を改変することを含む。前記人為的な遺伝子改変としては、Ｔ細胞が有する遺伝子そのものの改変であっても、Ｔ細胞が有する遺伝子そのものの欠損であっても、外来の遺伝子が導入された改変であっても、これらの２種以上を組み合わせたものであってもよい。
　前記人為的な遺伝子改変の方法としては、従来公知の方法やそれに準じた方法が挙げられ、特に限定されない。Ｔ細胞への遺伝子導入としては、例えば、Ｔ細胞の機能を改変させる遺伝子そのもの（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、ＯＤＮ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）等）、又は当該遺伝子を挿入したベクター（レンチウイルスベクター、γ－又はα－レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ウマ脳炎ウイルスベクター等のウイルスベクター、トランスポゾンベクターであるpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）の非ウイルスベクター）のＴ細胞への導入が挙げられ、Ｔ細胞の遺伝子編集としては、例えば、部位特異的ヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＰＰＲ（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ等）を用いたＴ細胞の遺伝子の編集（ゲノム編集）が挙げられる。本発明において、前記人為的な遺伝子改変の方法としては、これらの１種単独であっても２種以上を組み合わせたものであってもよい。
　前記Ｔ細胞の機能を改変させる遺伝子としては、例えば、Ｔ細胞より分泌されるタンパク質；Ｔ細胞表面に発現するタンパク質及び少なくとも１つの細胞内シグナリングドメインを含む融合タンパク質；Ｔ細胞表面に発現するタンパク質、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内シグナリングドメインを含む融合タンパク質が挙げられ、より具体的には、細胞表面酵素、細胞接着因子、受容体（例えば、キメラ抗原受容体）、及びこれらを構成するサブユニットが挙げられる。
　［検出工程］
　（標的遺伝子）
　本発明の方法に係る検出工程においては、Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する。
（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　ここで、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群において、（Ｉ）の遺伝子、（ＩＩ）の遺伝子、及び（ＩＩＩ）の遺伝子としては、それぞれ独立に、１種単独であっても２種以上であってもよい。
　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子のうちのいずれか１つにコードされるポリペプチドは、Ｔ細胞由来のセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に含まれることが好ましい。本発明において、「セクレトーム」とは、細胞から分泌される又は細胞膜の中から細胞外に露出されるタンパク質を示し、これらタンパク質の全部又は一部が細胞に内在する態様も含む。これらのセクレトームの中でも、細胞に非侵襲的な方法で検出可能な観点から、Ｔ細胞から分泌され、かつ、細胞培養液の上清中に存在する分泌タンパク質であることが好ましい。
　本発明において、発現が検出される遺伝子（以下、場合により「標的遺伝子」という）は、ヒト由来のものであれば、典型的には、「（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子」である。下記の表１～３に、配列番号１～５４に記載のアミノ酸配列について、各アミノ酸配列の配列番号及びＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．）；各アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の典型的なヌクレオチド配列の配列番号とそのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ位置）、及びＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．）；各アミノ酸配列からなるポリペプチドが対応するタンパク質の略称（タンパク質略称）を示す。さらに、下記の実施例の主成分分析（ＰＣＡ）により得られた各タンパク質の発現量の、第一主成分の主成分負荷量（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｌｏａｄｉｎｇ）も合わせて示す。また、下記の表４～６に、表１～３に記載の各タンパク質略称について、正式名（フルネーム）及び存在する場合には別名を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
 
 
　本発明者らは、Ｔ細胞の品質評価用のマーカーとして利用することが可能なタンパク質として、相互関係検索法を用いた高品質Ｔ細胞及び低品質Ｔ細胞のＫｅｙＭｏｌｎｅｔ解析（ＫＭデータ社）により、細胞品質が異なる細胞群間で発現量の差が大きい遺伝子がコードするタンパク質が属するシグナル伝達経路を特定した。また、本発明者らは、セクレトーム（タンパク質）の解析により、高品質Ｔ細胞及び低品質Ｔ細胞において、タンパク質の発現量についての主成分解析（ＰＣＡ）によって得られるＰＣ１スコアとＴ細胞の品質とＰＣ１スコアとの間には高い関連性があり、第一主成分の主成分負荷量の絶対値が１に近いタンパク質ほど、Ｔ細胞の品質に寄与することを見出した。かかる知見より、上記で特定したシグナル伝達経路に属するタンパク質の中からさらに、セクレトームであって、その発現量比（細胞品質が異なる細胞群間での発現量比）が小さい又は大きい（すなわち、前記発現量の差が大きい）タンパク質を特定したところ、これらタンパク質は、第一主成分への寄与率が高い（具体的には、発現量の第一主成分に対する主成分負荷量の絶対値が０．４以上、好ましくは０．８以上である）タンパク質であることが確認された。表１～３に記載の、配列番号１～５４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号５５～１０８で示されるヌクレオチド配列からなる遺伝子は、それぞれ、このように選出されたタンパク質に含まれるアミノ酸配列及び前記タンパク質をコードする遺伝子の典型的ヌクレオチド配列である。よって、これらの前記第一主成分への寄与率が高い、配列番号１～５４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、Ｔ細胞の品質評価の指標とすることができる。表１～３中、「ｕｐ」と記載の遺伝子は、その遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドが対応するタンパク質が、セクレトーム解析で高品質Ｔ細胞群における当該タンパク質の発現平均値と低品質Ｔ細胞群における当該タンパク質の発現平均値とを比較したときに高品質Ｔ細胞で発現量が有意に高いものであり、高品質Ｔ細胞で発現量が増加する。他方、「ｄｏｗｎ」と記載の遺伝子は、その遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドが対応するタンパク質が、セクレトーム解析で高品質Ｔ細胞群における当該タンパク質の発現平均値と低品質Ｔ細胞群における当該タンパク質の発現の平均値とを比較したときに低品質Ｔ細胞で発現が有意に高いものであり、高品質Ｔ細胞で発現量が減少する。
　本発明においては、前記「（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子」の相同遺伝子（例えば、ヒト以外の生物におけるカウンターパート遺伝子）を前記標的遺伝子とすることもできる。また、遺伝子のヌクレオチド配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得ることから、本発明においては、このような天然の変異体も、前記標的遺伝子とすることができる。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、前記（Ｉ）の遺伝子情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列とは異なるが、機能改変したタンパク質を調製することもできるため、このような改変体も、前記標的遺伝子としてよい。
　したがって、本発明に係る標的遺伝子の態様には、「（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子」も含まれる。ここで、「アミノ酸残基が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸残基が、置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、これらの２種以上の組み合わせがなされたアミノ酸配列であることを示す。また、「複数個」とは、例えば、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個の整数であることが好ましいが、これに制限されない。１若しくは複数個のアミノ酸残基とは、好ましくはアミノ酸残基が１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、特に好ましくは２個以下である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、前記（Ｉ）の遺伝子情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列に基づいて、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３－５１７，１９７５）や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）等により、他の生物や細胞から相同遺伝子を取得することが可能である。
　したがって、本発明に係る標的遺伝子の態様には、「（ＩＶ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列」も含まれる。相同遺伝子を単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下、低塩濃度溶液中で行なうことを示し、かかる条件としては、例えば、３０ｍＭクエン酸三ナトリウム及び３００ｍＭ塩化ナトリウム（２×ＳＳＣ）を含有する、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションは、例えば、公知であるＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス株式会社製）に添付の使用説明書に記載の方法にしたがって実施することができる。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、これらの条件は例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間等を適宜組み合わせることにより、必要な厳密性（ストリンジェンシー）を実現することが可能である。
　さらに、例えばこのような方法にて取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有する。したがって、本発明に係る標的遺伝子の態様には、「（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子」も含まれる。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，１９９０年、ｐ．４０３－４１０）を用いて決定することができる。また、配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列との同一性は、典型的には、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　本発明においては、好ましくは、標的遺伝子は、表１～３に記載の遺伝子のうち、下記（Ｉ’）～（ＩＩＩ’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である。
（Ｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８（より好ましくは配列番号４、８、１７、２０及び３８；さらに好ましくは配列番号４及び１７）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８（より好ましくは配列番号４、８、１７、２０及び３８；さらに好ましくは配列番号４及び１７）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８（より好ましくは配列番号４、８、１７、２０及び３８；さらに好ましくは配列番号４及び１７）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
ここで、前記（Ｉ’）～（ＩＩＩ’）の遺伝子からなる群において、（Ｉ’）の遺伝子、（ＩＩ’）の遺伝子、及び（ＩＩＩ’）の遺伝子としては、それぞれ独立に、１種単独であっても２種以上であってもよい。
　（遺伝子の発現の検出）
　本発明において、「遺伝子の発現を検出する」とは、遺伝子の発現の有無の検出及び発現の程度の検出の双方を含む意であり、本発明においては、前記標的遺伝子の発現を検出する。遺伝子の発現量は、絶対量として又は相対量として把握することができる。相対量を把握する場合には、例えば、用意した標準試料の遺伝子の発現量と比較して判断することができる。「標準試料」とは、標的遺伝子を発現しているか否か、又は発現している場合にはその量が事前に特定されている試料を示す。例えば、品質が良い又は悪いことが事前に特定されているＴ細胞を前記標準試料とすることができる。
　本発明において、「遺伝子の発現」とは、遺伝子の転写及び翻訳の双方を含む意である。したがって、本発明における「遺伝子の発現の検出」には、転写レベル（ｍＲＮＡレベル）での検出、及び翻訳レベル（タンパク質レベル）での検出（すなわち、前記遺伝子にコードされるポリペプチドの検出）の双方が含まれる。
　また、真核細胞では、遺伝子の転写過程で、ｍＲＮＡ前駆体中のイントロンを除去し、前後のエキソンを再結合する反応（スプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ））が生じるが、エキソンの再結合に多様性が生じる場合があり、これにより様々な成熟ｍＲＮＡが生産される。ひいては、それにより様々なタンパク質が翻訳される。このようなスプライシングの違いにより生じる多様なｍＲＮＡやタンパク質を「スプライシングバリアント（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｖａｒｉａｎｔ）」という。したがって、本発明における遺伝子の発現の検出には、下記のプローブ分子に特異的に認識される限り、当該スプライシングバリアントの検出も含まれる。
　本発明における遺伝子の発現の検出には、適宜公知の手法又はそれに準じた手法を用いることができる。中でも、本発明の方法に係る検出工程としては、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子（すなわち、前記標的遺伝子）の発現産物に特異的に結合するプローブ分子を用いて前記発現産物を検出することが好ましい。
　〔転写レベルでの検出（標的ポリヌクレオチドの検出）〕
　転写レベルでの検出において、前記標的遺伝子の発現産物は、当該標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ（以下、場合により「標的ポリヌクレオチド」という）である。前記標的ポリヌクレオチドには、前記ｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡも含む。この場合の検出方法としては、例えば、前記プローブ分子として、前記標的ポリヌクレオチドの塩基配列中の適切な位置にハイブリダイズするように設計したオリゴヌクレオチドプローブを用い、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等によって、前記標的ポリヌクレオチドを検出する方法が挙げられる。
　この場合には、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブとして、標識物質によって標識されたものを用い、当該標識物質に応じたシグナルを検出して、検出されたシグナル量を前記標的ポリヌクレオチドの量（すなわち、標的遺伝子の発現量）とすることができる。このときの標識物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＦＡＭ（フルオレセインアミダイト）、ＤＥＡＣ（７－（ジエチルアミノ）クマリン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ（商品名）等の蛍光物質；β－Ｄ－グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）等の酵素；３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体；ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質；ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。
　なお、本発明において、「シグナル」には、呈色（発色）、反射光、発光、消光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた測定方法・装置によって確認できるものも含まれる。
　また、例えば、前記プローブ分子として、前記標的ポリヌクレオチド中の適切な位置を挟み込むように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等によって、前記標的ポリヌクレオチドを増幅して検出する方法も挙げられる。
　この場合には、例えば、得られた増幅産物に蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（商品名）、ＳＹＴＯ６３（商品名）等）をインターカレートして得られたシグナル（蛍光）を検出して、検出されたシグナル量（蛍光強度）を、前記標的ポリヌクレオチドの量（すなわち、標的遺伝子の発現量）とすることができる。また、前記オリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて検出してもよい（ダブルダイプローブ法等）。さらに、前記標的ポリヌクレオチドを含む試料を直接シーケンサーに供して解析することにより、前記標的ポリヌクレオチドの量としてもよい。
　このようなオリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプライマーは、当業者であれば、前記標的ポリヌクレオチドの配列に基づいて、公知の方法又はそれに準じた方法で設計することができる。また、前記オリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、それぞれ独立に、少なくとも１５塩基であることが好ましく、通常は、１５～１００塩基であり、好ましくは１７～３０塩基であり、より好ましくは２０～２５塩基である。前記オリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成機により合成することができる。また、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド）のみから構成されていなくともよく、例えば、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）等の非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。
　〔翻訳レベルでの検出（標的ポリペプチドの検出）〕
　翻訳レベルでの検出において、前記標的遺伝子の発現産物は、当該標的遺伝子にコードされるポリペプチド（以下、場合により「標的ポリペプチド」という）である。より具体的には、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子のうちのいずれか１つにコードされるポリペプチドであり、すなわち、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドである。
（ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
　前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のポリペプチドからなる群において、（ｉ）のポリペプチド、（ｉｉ）のポリペプチド、及び（ｉｉｉ）のポリペプチドとしては、それぞれ独立に、１種単独であっても２種以上であってもよい。
　これらの中でも、前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のポリペプチドとしては、前記（Ｉ’）～（ＩＩＩ’）の遺伝子のうちのいずれか１つにコードされるポリペプチド、すなわち、下記（ｉ’）～（ｉｉｉ’）のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドであることが好ましい。
（ｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８（より好ましくは配列番号４、８、１７、２０及び３８；さらに好ましくは配列番号４及び１７）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８（より好ましくは配列番号４、８、１７、２０及び３８；さらに好ましくは配列番号４及び１７）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉｉｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８（より好ましくは配列番号４、８、１７、２０及び３８；さらに好ましくは配列番号４及び１７）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
　前記（ｉ’）～（ｉｉｉ’）のポリペプチドからなる群においても、（ｉ’）のポリペプチド、（ｉｉ’）のポリペプチド、及び（ｉｉｉ’）のポリペプチドとしては、それぞれ独立に、１種単独であっても２種以上であってもよい。
　また、本発明において、検出対象となるこれらの標的ポリペプチドとしては、上記のセクレトーム（Ｔ細胞由来セクレトーム）であることが好ましい。
　翻訳レベルでの検出の場合の検出方法の一例としては、抗ポリペプチド抗体及び／又はアプタマーによる検出や、標識アミノ酸による検出が挙げられる。
　〈抗ポリペプチド抗体及び／又はアプタマーによる検出〉
　翻訳レベルでの検出の場合の検出方法としては、例えば、前記プローブ分子として、前記標的ポリペプチドに特異的に結合する抗体（以下、場合により「抗ポリペプチド抗体」という）及び／又はアプタマー（以下、場合により、単に「アプタマー」という）を用い、免疫細胞染色法、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、イムノブロッティング（ウェスタンブロット法等）、抗体アレイ、ｉｎ　ｖｉｖｏ　イメージング等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）；前記抗体に代えてアプタマーを用いて検出する方法が挙げられる。また、前記免疫学的手法は、必要な試薬を調製した上で、ＡＩＡ－９００（東ソー社製）等のエンザイムイムノアッセイ装置やＡＩＡ－ＣＬ２４００（東ソー社製）等の化学発光酵素免疫測定装置を用いて自動的に行なってもよい。
　本発明において、「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、本発明においては、前記標的遺伝子にコードされるポリペプチドを特異的に認識するものを示す。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）、多特異性抗体、短鎖抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
　本発明に係る抗ポリペプチド抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（標的ポリペプチド、その部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、適宜精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、例えば、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられ、組換えＤＮＡ法としては、例えば、前記抗ポリペプチド抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、前記抗ポリペプチド抗体を組換え抗体として産生させる手法が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ；Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ；Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。
　この場合には、前記抗ポリペプチド抗体及びアプタマーとして、それぞれ、標識物質によって標識されたものを用い、当該標識物質に応じたシグナルを検出して、検出されたシグナル量を前記標的ポリペプチドの量（すなわち、標的遺伝子の発現量）とすることができる。このときの標識物質としては、前記抗ポリペプチド抗体又はアプタマーに結合することができ、化学的又は光学的方法で検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、フィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光物質や、ペルオキシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ等の酵素、放射性物質が挙げられる。
　また、前記抗ポリペプチド抗体及び／又はアプタマーを用いる場合には、前記標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や、二次抗体と前記標識物質とを結合させたポリマーを利用する方法などの間接的検出方法を利用することもできる。ここで、「二次抗体」とは、前記抗ポリペプチド抗体及び／又はアプタマーに特異的な結合性を示す抗体である。例えば、前記抗ポリペプチド抗体をウサギ抗体として調製した場合には、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、用いる抗ポリペプチド抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択し、使用することができる。また、二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来）、プロテインＡ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来）、プロテインＬ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ由来）等を用いることも可能である。
　〈標識アミノ酸による検出〉
　翻訳レベルでの検出の場合の検出方法としては、他にも例えば、標識アミノ酸を添加した培地でＴ細胞を培養し、前記標識アミノ酸で標識された標的ポリペプチドを検出する方法が挙げられる。このような方法としては、
　少なくとも１種のＴ細胞増殖用必須アミノ酸に代えてそのアミノ酸が標識された標識アミノ酸を含有し、かつ、共通γ鎖ファミリーサイトカインを含有するＴ細胞標識用培地でＴ細胞を培養する標識工程と、
　前記標識アミノ酸で標識されたＴ細胞由来ポリペプチドを検出する検出工程（以下、場合により「検出工程Ａ」ともいう）と、
を含む方法が好ましい。
　ここで、「Ｔ細胞標識用培地」とは、Ｔ細胞を培養して標識するための標識アミノ酸を少なくとも含有する培地のことを示す。また、「Ｔ細胞増殖用必須アミノ酸（以下、場合により単に「必須アミノ酸」という）」とは、Ｔ細胞が増殖するために必須のアミノ酸を示し、より具体的には、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、スレオニン、ヒスチジンである。
　前記Ｔ細胞標識用培地は、前記必須アミノ酸の少なくとも１種に代えてそのアミノ酸が標識された標識アミノ酸を含有する、すなわち、前記必須アミノ酸の少なくとも１種を含有せず、かつ、当該含有されない必須アミノ酸が標識されたアミノ酸である標識アミノ酸を含有する。「必須アミノ酸を含有しない」とは、前記Ｔ細胞標識用培地中に前記必須アミノ酸を実質的に含有しないことをいい、より具体的には、当該必須アミノ酸の含有量がＴ細胞標識用培地中に１×１０－３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることをいい、１×１０－４ｍｍｏｌ／Ｌ未満であることが好ましい。前記Ｔ細胞標識用培地から除かれる（すなわち、前記Ｔ細胞標識用培地に実質的に含有されない）必須アミノ酸としては、前記のいずれか１種であっても、２種以上の組み合わせであってもよいが、中でも、タンパク質合成経路への効率的な取り込みの観点から、メチオニンが好ましい。
　前記「標識アミノ酸」とは、前記必須アミノ酸の構造を維持したままでその一部が修飾され、その修飾に基づいて検出可能であるものを示す。前記「検出可能」には、呈色（発色）、消光、反射光、発光、蛍光等の目視で直接的に確認できるものの他、特定の測定方法や測定装置によって確認できることを含む。
　このような標識アミノ酸としては、例えば、アミノ酸の原子の一部をパルス安定同位体（例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ）に置換した同位体標識アミノ酸；アミノ酸の一部がアジド基、アルキン基等の修飾基によって修飾されたアミノ酸の構造的類似体（ａｎａｌｏｇ）が挙げられ、前記必須アミノ酸に対応して、これらのいずれか１種であっても、２種以上の組み合わせであってもよい。
　例えば、前記Ｔ細胞標識用培地が、前記必須アミノ酸のうちのメチオニンを含有しない場合、メチオニンに代えて前記Ｔ細胞標識用培地に含有される標識アミノ酸としては、例えば、メチオニンを構成する原子の一部を前記安定同位体に置換した同位体標識メチオニンである２Ｈ標識メチオニン、１３Ｃ標識メチオニン、１５Ｎ標識メチオニン；メチオニンの構造的類似体であるＬ－アジドホモアラニン（ＡＨＡ：Ｌ－Ａｚｉｄｏｈｏｍｏａｌａｎｉｎｅ）、Ｌ－ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ：Ｌ－Ｈｏｍｏｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、Ｌ－ホモアリルグリシン（ＨＡＧ：Ｌ－Ｈｏｍｏａｌｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）が挙げられ、これらのいずれか１種であっても、２種以上の組み合わせであってもよい。
　前記Ｔ細胞標識用培地において、前記標識アミノ酸の含有量（標識アミノ酸が２種以上である場合にはそれらの合計含有量、以下同じ）としては、Ｔ細胞の取り込み効率や培養効率、同Ｔ細胞への毒性等を考慮して適宜決定することができ、特に制限されないが、例えば、０．０００１～０．１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が挙げられ、０．００１～０．０５ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．００１～０．０２ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。より具体的に、例えば、前記標識アミノ酸がＡＨＡである場合には、０．０００５～０．０３ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．００１～０．０３ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．００２～０．０３ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましく、０．００５～０．０２ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらにより好ましい。前記標識アミノ酸の含有量が前記上限を超えると、細胞が弱ったり死滅し易くなる傾向にあり、他方、前記下限未満であると、前記標識アミノ酸で標識されたポリペプチドを分泌又は細胞外に露出する細胞数が少なくなり、ポリペプチドの検出精度が低下する傾向にある。
　前記Ｔ細胞標識用培地は、共通γ鎖ファミリーサイトカインをさらに含有する。これを含有することにより、前記標識アミノ酸で標識されたポリペプチドを発現する細胞を高効率で得ることが可能となる。「共通γ鎖ファミリーサイトカイン」とは、共通のγ鎖（ｃｏｍｍｏｎ　γ　ｃｈａｉｎ：γサブユニット）を含む受容体を介して作用するサイトカインを示す。より具体的には、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン９（ＩＬ－９）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、及びインターロイキン２１（ＩＬ－２１）が挙げられ、これらのいずれか１種であっても、２種以上の組み合わせであってもよい。中でも、細胞の生存及び増殖をより維持する観点からは、インターロイキン７、インターロイキン１５、インターロイキン２１、及びこれらの２種以上の組み合わせがより好ましい。
　前記Ｔ細胞標識用培地において、前記共通γ鎖ファミリーサイトカインの含有量（共通γ鎖ファミリーサイトカインが２種以上である場合にはそれらの合計含有量、以下同じ）としては、Ｔ細胞の性状等を考慮して適宜決定することができるため、これに限定されるものではないが、１～１０００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、５～１００ｎｇ／ｍＬであることがより好ましく、５～２０ｎｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。前記共通γ鎖ファミリーサイトカインの含有量が前記上限を超えると、共通γ鎖ファミリーサイトカインを含有させることの効果が低下したり細胞増殖を阻害する傾向にあり、他方、前記下限未満であると、前記標識アミノ酸で標識されたポリペプチドを分泌又は細胞外に露出する細胞数が少なくなり、ポリペプチドの検出精度が低下する傾向にある。
　前記Ｔ細胞標識用培地としては、前記必須アミノ酸を除くため、血清を含有しないか、含有する場合には前記必須アミノ酸が除かれた透析血清であることが好ましい。また、前記Ｔ細胞標識用培地としては、他に、血清アルブミンやＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム）などの細胞保護添加剤；ＥＣＭ（細胞外基質）成分等の足場剤等を含有していてもよい。これらのＴ細胞標識用培地又はその基礎培地としては、目的の必須アミノ酸を含有しない限り特に制限されず、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所培地）、αＭＥＭ（α改変型イーグル最小必須培地）等の基礎培地；Ｔ細胞専用の無血清培地であるＡＩＭ　ＶＴＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）；ＰＲＩＭＥ－ＸＶ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ＸＳＦＭ（富士フイルム和光純薬社製）等の公知や市販のＴ細胞用の培地を適宜採用することができる。
　前記標識工程では、前記Ｔ細胞標識用培地でＴ細胞を培養する。これにより、前記標識アミノ酸をＴ細胞に取り込ませ、Ｔ細胞から前記標識アミノ酸で標識されたポリペプチド（Ｔ細胞由来ポリペプチド）を分泌又は細胞外に露出させる。前記標識工程における培養方法としては、特に制限されず、公知のＴ細胞の増殖培養条件を適宜採用することができ、また、Ｔ細胞の性状や濃度等を考慮して適宜調整することができるが、例えば、培養温度３５～３７．５℃、好ましくは３６～３７℃において、培養時間２～４８時間、好ましくは８～２４時間の条件が挙げられる。前記標識工程の培養装置としては、特に制限されず、例えば、プレート、ディッシュ、カラム、フラスコ、培養バッグ等が挙げられ、前記Ｔ細胞標識用培地等を供給するための供給手段や排出するための排出手段（センサ、バルブ、ポンプ、タンク等）をさらに備えていてもよい。
　前記検出工程Ａでは、前記標識アミノ酸で標識され、分泌又は細胞外に露出されたＴ細胞由来ポリペプチドを検出する。前記検出工程Ａとしては、前記標識工程と同時（リアルタイム）で行なってもよい。前記検出工程Ａにおける検出方法としては、前記標識アミノ酸の種類に応じた検出方法を適宜採用することができる。このような検出方法としては、特に制限されず、適宜公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。前記標識アミノ酸が同位体標識アミノ酸又はアミノ酸の構造的類似体である場合には、例えば、前記標識工程後又は標識工程中（すなわち培養途中）の培地について、ガス同位体比質量分析、同位体比赤外分光、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）等の質量分析を行なうことによって、前記標識アミノ酸に応じたシグナルを検出し、検出されたシグナル量を前記標的ポリペプチドの量（すなわち、標的遺伝子の発現量）とすることができる。
　また、前記標識アミノ酸がアミノ酸の構造的類似体である場合には、前記修飾基に特異的な染色をすることによって検出することができる。例えば、前記修飾基がアジド基である場合（ＡＨＡ等）には、当該アジド基をＣｌｉｃｋ－ｉＴＴＭ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ｓＤＩＢＯ　Ａｌｋｙｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の蛍光試薬によって染色することができるため、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー等を用いて、前記標識アミノ酸に応じたシグナル（発色、蛍光等）を検出し、検出されたシグナル量を前記標的ポリペプチドの量（すなわち、標的遺伝子の発現量）とすることができる。
　また、翻訳レベルでの検出の場合の検出方法としては、他にも例えば、標的ポリペプチドの糖鎖を認識して検出する方法も挙げられる。このような方法としては、例えば、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の市販の試薬を用いる方法が挙げられる。前記翻訳レベルでの検出の場合の検出方法は、適宜他の方法と組み合わせて用いてもよい。
　本発明において、前記遺伝子の発現の検出としては、簡便性の観点から、翻訳レベルでの検出（前記標的ポリペプチドの検出）であることが好ましく、特に、前記抗ポリペプチド抗体を用いて前記標的ポリペプチドを検出する方法が好ましい。
　［評価工程］
　本発明の方法に係る評価工程においては、前記検出工程で検出された標的遺伝子の発現の有無又はその発現量を指標として、Ｔ細胞の品質を評価する。本発明において評価されるＴ細胞の品質としては、増殖能、がん細胞傷害活性が挙げられ、中でも、本発明の方法は、Ｔ細胞の増殖能を評価する方法として好ましい。「増殖能」とは、より具体的には、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はＩｎ　ｖｉｖｏにおいて、ＴＣＲ刺激又は抗原刺激によってＴ細胞が活性化し、細胞傷害活性を有する細胞が増加する能力を示す。Ｔ細胞の増殖能は、例えば、下記の実施例に示す方法でＴ細胞のＴＣＲをＴＣＲ刺激磁性ビーズで刺激し、刺激前の細胞数と刺激から１４日後の細胞数との比で確認することができるが、これに制限されない。
　本発明においては、前記検出工程で検出された、表１～３に示す標的遺伝子のうち、「ｕｐ」と記載の遺伝子は、その発現量が多いほど、増殖能が高い、すなわち品質が良いと評価することができる。他方、表１～３に示す標的遺伝子のうち、「ｄｏｗｎ」と記載の遺伝子は、その発現量が多いほど、増殖能が低い、すなわち品質が悪いと評価することができる。前記Ｔ細胞の品質の評価基準としては、目的に応じて適宜設定すればよく、特に限定されるものではない。例えば、前記検出工程で、前記標的遺伝子の発現レベル（標的遺伝子の転写レベルや翻訳レベル）に応じた標的遺伝子の発現が少しでも検出されれば、すなわち、前記標的ポリヌクレオチドや前記標的ポリペプチドが少しでも検出されれば、Ｔ細胞の品質が良い（又は悪い）と評価してもよく、一定の閾値以上の標的遺伝子の発現量が検出されれば、Ｔ細胞の品質が良い（又は悪い）と評価してもよい。さらに、複数の標的遺伝子の発現量を組み合わせてＴ細胞の品質を評価してもよい。例えば、表１～３において「ｕｐ」と記載の遺伝子の発現量が多く、かつ、表１～３において「ｄｏｗｎ」と記載の遺伝子の発現量が少ない場合には、Ｔ細胞の品質が良いと評価することができ、また、例えば、表１～３において「ｕｐ」と記載の複数の遺伝子の発現量が多いほど、Ｔ細胞の品質がよいと評価することができる。
　また、前記標的遺伝子の発現量に応じて、Ｔ細胞の品質（例えば、増殖能の度合い）を評価してもよい。例えば、増殖能が高い（又は低い）ことが事前に特定されているＴ細胞等の標準試料で検出される前記標的遺伝子の発現量に対して、一定の値以上、又は当該標的遺伝子の発現量の平均値の４ＳＤ以上、３ＳＤ以上、若しくは２ＳＤ以上のシグナル量であれば、増殖能が高い（又は低い）、すなわち品質が良い（又は悪い）と評価してもよい。
　＜Ｔ細胞評価用試薬、Ｔ細胞評価用キット＞
　本発明のＴ細胞評価用試薬は、前記本発明のＴ細胞の評価方法に用いるための試薬（組成物）であり、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現産物に特異的に結合するプローブ分子を含有する試薬（以下、場合により、単に「本発明の試薬」という）である。
（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
　本発明の試薬において、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子、及び前記遺伝子の発現産物としては、その好ましい態様も含めて、上記の本発明の方法において述べたとおりである。本発明の試薬に係るプローブ分子としては、上記の本発明の方法において挙げた、オリゴヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプライマー、抗ポリペプチド抗体、及びアプタマーが挙げられ、それぞれ、その好ましい態様も含めて、上記の本発明の方法において述べたとおりである。前記プローブ分子としては、これらのいずれか１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。中でも、前記抗ポリペプチド抗体及び／又は前記アプタマーが好ましく、前記抗ポリペプチド抗体がより好ましい。
　本発明の試薬は、液体であっても粉末状等の固体であってもよく、前記プローブ分子に加えて、緩衝液、生理食塩水、安定剤、保存剤、防腐剤、培地等の他の成分がさらに含有されていてもよい。
　本発明のＴ細胞評価用キットは、前記本発明のＴ細胞の評価方法に用いるためのキットであり、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現産物に特異的に結合するプローブ分子を備えるキット（以下、場合により、単に「本発明のキット」という）である。
　本発明のキットに係るプローブ分子としては、前記本発明の試薬であることが好ましい。また、本発明のキットは、前記プローブ分子に加えて、緩衝液、生理食塩水等の希釈又は懸濁用液；ＤＮＡ又はタンパク質を抽出及び／又は精製するための試薬；ブロッキング剤；キレート剤；前記標識物質；前記蛍光色素；前記検出工程に必要な試薬；ｐＨ調整剤等の試薬；標準試料；使用説明書；安全データシート（Ｓａｆｅｔｙ　Ｄａｔａ　Ｓｈｅｅｔ）等をさらに備えていてもよい。
　本発明は、前記のＴ細胞の評価方法により得られた高品質Ｔ細胞および該高品質Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
　本発明の、T細胞を有効成分として含む医薬組成物は、がん治療対象を処置するために使用することができる。本発明の医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。該添加剤としては、例えば、細胞培養液、生理食塩水や適当な緩衝液（例えば、リン酸系緩衝液）等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、T細胞を生理食塩水や適当な緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁することによって製造することができる。所望の治療効果が発揮されるように、一回投与分の量として、例えば1×10７個以上の細胞を含有させることが好ましい。より好ましくは１×108個以上、さらに好ましくは１×109個以上である。細胞の含有量は、適用対象の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態等を考慮して適宜調整することができる。本発明の医薬組成物には、T細胞の他、細胞を保護する目的でジメチルスルフォキシド（DMSO）および血清アルブミン等を含有させてもよい。また、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等ならびに細胞の活性化および分化を促す目的でビタミン類やサイトカイン等を含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等）を本発明の医薬組成物に含有させてもよい。
　本発明のT細胞を有効成分として含む医薬組成物は、低温凍結保存することができる。低温凍結保存する場合、温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－20℃、－80℃および－120～－196℃が挙げられる。低温凍結保存する場合、細胞は、バイアル等の適切な容器中で保存することができる。T細胞の凍結時および解凍時の細胞損傷リスクを最小限にするための操作は、当業者には周知である。
　T細胞の冷凍保存においては、T細胞を培養液から回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数し、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、10% DMSOを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存する。T細胞は、複数の培養容器で培養した細胞を合わせ、単一ロットにすることができる。本発明のT細胞を含む医薬組成物は、バイアル等の容器当たり、例えば、5×104個～9×1010個のT細胞を含むが、対象とするがんの種類、投与対象、投与経路等に応じて変更することができる。
　本発明のT細胞を含む医薬組成物の投与経路としては、例えば、輸注、腫瘍内注射、動注、門脈注、腹腔内投与等が挙げられる。但し、本発明の医薬組成物中の有効成分であるT細胞が患部に送達される限り、投与経路はこれに限られるものではない。投与スケジュールとしては、単回投与または複数回投与とすることができる。複数回投与の期間は例えば、２～４週間に１回投与を繰り返す方法または半年から１年に１回投与を繰り返す方法等を採用することができる。投与スケジュールの作成においては、対象患者の性別、年齢、体重、病態等を考慮することができる。
　本発明のT細胞を含む医薬組成物を、がんの予防または治療に使用する場合において、他家移植である場合、拒絶反応を起こしにくいという観点から、T細胞を採取されるがん患者または非がん患者は、がん治療のために、本発明の医薬組成物を投与されるがん患者と、HLAの型が一致していることが好ましい。また、本発明の医薬組成物が投与されるがん患者と、T細胞を採取されるがん患者とは同一人であることがより好ましい。すなわち、他家移植より自家的な移植によるがん治療がより好ましい。
　本発明の医薬組成物は、がんの予防または治療のために用いられる。がんとしては、卵巣がん、肝芽腫、肝細胞がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がん、およびB細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
　がんの予防または治療のために、本発明のT細胞を含む医薬組成物とがんワクチンとを組み合わせて使用する場合、本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与時期は限定されず、本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与を、投与対象に対し、同時に投与してもよく、また時間差をおいて投与してもよい。本発明の医薬組成物とがんワクチンとは別々に製剤化されていてもよく、また両者が混合された合剤であってもよい。本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、疾患、投与対象、投与経路、薬物との組み合わせ等により適宜選択することができる。
　本発明は、がんを有するかまたはがんを有する危険性のある被験者に、Ｔ細胞を投与することを含む、がんを治療または予防する方法であって、該Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
を含む、方法
（（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。）を提供する。
　本発明における被験者は、脊椎動物である。特定の実施形態では、該脊椎動物は、哺乳動物である。該哺乳動物には、家畜(例えば、ウシ)、スポーツ動物、ペット/コンパニオン動物(例えば、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
　本発明は、Ｔ細胞の製造方法であって、該Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
を含む、Ｔ細胞の製造方法
（（Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
（ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。）を提供する。
 
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　１．Ｔ細胞の品質（増殖能）評価
　（１）下記の表７に示すＴ細胞株１４種類を解凍し、９６ｗｅｌｌプレートの培地Ａ（１５％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＢｉｏＷｅｓｔ社製）、５ｎｇ／ｍＬインターロイキン７（ＩＬ－７）、及び５ｎｇ／ｍＬインターロイキン１５（ＩＬ－１５）を添加したαＭＥＭ（α改変型イーグル最小必須培地））に、それぞれ１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。
　（２）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８　ｆｏｒ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて、播種したＴ細胞のＴＣＲをそれぞれ刺激後、培地Ａで適宜培地交換しながら、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１４日間培養した。
　（３）培養１４日目の刺激後の各Ｔ細胞を血球算定盤を用いて計数し、次式：
　　増殖倍率＝ＴＣＲ刺激後の１４日間培養後のＴ細胞数／ＴＣＲ刺激前のＴ細胞数
により、各Ｔ細胞における増殖倍率（Ｆｏｌｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を算出した。結果を下記の表７に合わせて示す。細胞種（ナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ｉＰＳ細胞由来ＣＴＬ（ｉＰＳＣ－Ｔ）細胞）毎に、相対的に増殖倍率の値が高いＴ細胞を「高品質Ｔ細胞（ｇｏｏｄ）」に、相対的に増殖倍率が低いＴ細胞を「低品質Ｔ細胞（ｂａｄ）」に、それぞれ分類した。具体的には、下記Ａ～Ｆの群：
Ａ：高品質ナイーブＴ細胞（ｇｏｏｄ）からなる群
Ｂ：高品質細胞傷害性Ｔ細胞（ｇｏｏｄ）からなる群
Ｃ：低品質ナイーブＴ細胞（ｂａｄ）からなる群
Ｄ：低品質細胞傷害性Ｔ細胞（ｂａｄ）からなる群
Ｅ：高品質ｉＰＳ細胞由来ＣＴＬ（ｇｏｏｄ）からなる群
Ｆ：低品質ｉＰＳ細胞由来ＣＴＬ（ｂａｄ）からなる群
に分類した。分類した群も合わせて表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　２．Ｔ細胞のトランスクリプトーム解析
　（１）上記１の（３）で高品質Ｔ細胞（ｇｏｏｄ：７種類）及び低品質Ｔ細胞（ｂａｄ：７種類）に分類したＴ細胞と同じ株のＴ細胞（ＴＣＲ未刺激）について、それぞれ、上記１の（１）～（２）と同様にしてＴＣＲ刺激磁性ビーズを用いてＴＣＲを刺激し、培地Ａで適宜培地交換しながら、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
　（２）ＴＣＲ刺激後７日目の細胞を回収し、先ず、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。次いで、抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡ　１０ｎｇから、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ　ｖ４　Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｉｎｐｕｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成・増幅した。
　（３）（２）で得られたｃＤＮＡ　１ｎｇ分を使用して、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）及びＮｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ｖ２　Ｉｎｄｅｘ　Ｋｉｔ　Ｓｅｔ　Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いてライブラリー調製を行ない、Ｎｅｘｔ－ｓｅｑ５００（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、リード長：７５ｂｐ、ｓｉｎｇｌｅ　ｅｎｄ　ｒｅａｄの条件でシークエンス解析を行なうことにより、１試料あたり５００万リード以上の遺伝子を解読した。
　（４）（３）で解読した遺伝子（シークエンスデータ）をＴｏｐＨａｔ２（ＪＯＨＮＳ　ＨＯＰＫＩＮＳ大学）及びＢｏｗｔｉｅ２（ＪＯＨＮＳ　ＨＯＰＫＩＮＳ大学）を用いて、ヒトゲノム配列にマップした。なお、ヒトゲノム配列情報及びヒト遺伝子情報には、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）より公開されているＢＵＩＬＤ　ＧＲＣｈ３８を使用した。マップした遺伝子について、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学）によって、解読した各遺伝子のリード数から、ＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ　ｒｅａｄｓ　ｍａｐｐｅｄ）を単位とする遺伝子ごとの発現量を求めた。
　３．Ｔ細胞のセクレトーム解析－１
　（１）上記１の（３）で高品質Ｔ細胞（ｇｏｏｄ：７種類）及び低品質Ｔ細胞（ｂａｄ：７種類）に分類したＴ細胞と同じ株のＴ細胞（ＴＣＲ未刺激）について、それぞれ、上記１の（１）～（２）と同様にしてＴＣＲ刺激磁性ビーズを用いてＴＣＲを刺激し、培地Ａで適宜培地交換しながら、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
　（２）ＴＣＲ刺激後７日目の細胞をそれぞれ１×１０６ｃｅｌｌｓ回収し、１５％（ｗ／ｖ）透析ＦＢＳ、４ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－グルタミン、ＩＴＳ（インシュリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム）サプリメント（×１）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１５を添加したαＭＥＭ（α改変型イーグル最小必須培地、メチオニン不含有）で懸濁して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間培養後、０．００６２５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－アジドホモアラニン（ＡＨＡ）、１５％（ｗ／ｖ）透析ＦＢＳ、４ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－グルタミン、ＩＴＳ（インシュリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム）サプリメント（×１）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１５を添加したαＭＥＭ（メチオニン不含有）培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
　（３）培養後、培養上清０．４ｍＬを回収し、培養上清に分泌された、ＡＨＡで標識されたタンパク質（セクレトーム）を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ｋｉｔ，ｆｏｒ　ｃｌｉｃｋ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｚｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、前記ＡＨＡのアジド基をアルキンアガロース樹脂に捕捉させることで抽出した。
　（４）（３）で抽出したタンパク質をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　ＲＳＬＣｎａｎｏ及びＱ　Ｅｘａｃｔｉｖｅ、いずれもＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で解析した。解析データから、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（ｖｅｒ．２．２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、抽出したタンパク質のアミノ酸配列を抽出した。
　（５）Ｍａｓｃｏｔソフトウェア（ｖｅｒ．２．５、Ｍａｔｒｉｘ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　社製）を用い、下記（Ａ）～（Ｃ）に記載のアミノ酸配列を組み合わせて構築したデータベースと照合することで、決定したアミノ酸配列からタンパク質を同定した。なお、有意なタンパク質の同定は、同定のスコア閾値を、Ｆａｌｓｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ（ＦＤＲ）が１％になるように調整して行なった。同定したタンパク質は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　２．２のＬａｂｅｌ　Ｆｒｅｅ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＦＱ）を用いて定量した。
（Ａ）ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）２０１８＿１１版に登録されているヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）由来のタンパク質エントリー（計２０４１３件）；
（Ｂ）ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）２０１８＿１１版に登録されているウシ（Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ）由来のタンパク質エントリー（計５９９２件）；
（Ｃ）Ｔｈｅ　Ｇｌｏｂａｌ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ｃｒａｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から取得した、ヒト由来及びウシ由来以外のタンパク質汚染物のアミノ酸配列（計４６件）。
　４．パスウェイ解析
　（１）上記２の（４）で得られたトランスクリプトーム解析結果（マップした遺伝子ごとの発現量）及び上記３の（５）で得られたセクレトーム解析結果（同定したタンパク質の定量値）を統合し、上記１の（３）で分類した６つの群（Ａ～Ｆ）について、総当り（全１５通り）で群間比較し、相互関係検索法を用いたＫｅｙＭｏｌｎｅｔ解析（ＫＭデータ社）により、比較した群間で発現量の差が大きかった遺伝子がコードするタンパク質であって、前記セクレトーム解析で同定したタンパク質（セクレトーム）が属するシグナル伝達経路（下記式で算出されるスコアが大きいシグナル伝達経路；下記式中、パスウェイに属している分子とは、シグナル伝達経路に属しているタンパク質を示す）を特定した。前記スコアは、統計学的手法(超幾何分布)に基づいて下記式で算出される総合的な関与度を示す値であり、値が大きいほどそのシグナル伝達経路が有意であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
  
　（１）各群（Ｇｒｏｕｐ）間の比較において、パスウェイ解析により得られたスコアが大きい順に、第１位～１０位のシグナル伝達経路及びそのスコア（Ｓｃｏｒｅ）をそれぞれ下記の表８～２２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  
　（２）表８～２２に示す経路の中から、ＴＣＲ刺激によって直接惹起されるシグナルであるＣａＭＫシグナルの伝達経路、及び遊走骨格系シグナルである中間系フィラメントシグナルの伝達経路を除外し、増殖倍率の異なる群間の総当たり比較において、登場回数の多いシグナル経路（３回以上登場）、高品質ｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞（Ｅ）と低品質ｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞（Ｆ）との比較（Ｅ／Ｆ）において有意であるシグナル伝達経路（上位１０位まで、表２２）を選出基準として、Ｔ細胞の品質（増殖能）に関連する可能性が高いといえるシグナル伝達経路を選定した。選定したシグナル伝達経路を下記の表２３に示す。表２３には、表８～２２に記載の各比較群におけるスコア順位も合わせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
　（３）（２）で選定したシグナル伝達経路に属するタンパク質の中から、上記３の（５）で得られたセクレトーム解析結果（同定したタンパク質の定量値（発現量））において、比較した群間で発現量比が０．６７以下又は１．５以上となり、かつ、Ｔ検定でｐ値が０．０５以下となったタンパク質（セクレトーム）を抽出した。
　（４）（３）で抽出したタンパク質から、細胞骨格、Ｇタンパク質、並びに、ＲＮＡ・ＤＮＡ合成及び微小管・膜輸送に関わるタンパク質を除外し、それ以外のタンパク質を選出した。選出したタンパク質、そのアミノ酸配列、及び同アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ、上記の表１～３に示したタンパク質（略称）、アミノ酸配列、及び遺伝子である。
　上記パスウェイ解析で増殖倍率の異なる群間を総当たりで比較することで、登場回数の多いシグナル伝達経路が細胞品質（増殖能）に起因する主なシグナル伝達経路であるといえる。一方で、同一のｉＰＳ細胞のクローンに由来するＴ細胞間（Ｅ／Ｆ）で比較することで、培養系に起因する細胞品質の差異に関わるシグナル伝達経路を抽出することができる。そのため、選出されたタンパク質は、品質の異なる細胞間で発現が変動する当該シグナル伝達経路に関連するタンパク質（セクレトーム）であるといえる。
　５．Ｔ細胞のセクレトーム解析－２
　（１）上記の表７に示す１４種類のＴ細胞に加えて、下記の表２４に示す１０種類のＴ細胞について、上記１の（１）～（３）と同様にして、増殖倍率を測定した。全２４種類のＴ細胞について、増殖倍率が２０以上となったＴ細胞（表２４の細胞Ｎｏ．１～１２のＴ細胞）を「高品質Ｔ細胞」に、同増殖倍率が２０未満となったＴ細胞（表１１の細胞Ｎｏ．１３～２４のＴ細胞）を「低品質Ｔ細胞」に、それぞれ分類した。表２４には、各細胞の増殖倍率も合わせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
　（２）（１）で高品質Ｔ細胞（１２種類）及び低品質Ｔ細胞（１２種類）に分類したＴ細胞と同じ株のＴ細胞（ＴＣＲ未刺激）について、それぞれ、上記１の（１）～（２）と同様にしてＴＣＲ刺激磁性ビーズを用いてＴＣＲを刺激し、培地Ａで適宜培地交換しながら、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
　（３）ＴＣＲ刺激後６日目の細胞をそれぞれ１×１０６ｃｅｌｌｓ回収し、１５％（ｗ／ｖ）透析ＦＢＳ、４ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－グルタミン、ＩＴＳ（インシュリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム）サプリメント（×１）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１５を添加したαＭＥＭ（α改変型イーグル最小必須培地、メチオニン不含有）で懸濁して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間培養後、０．００６２５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－アジドホモアラニン（ＡＨＡ）、１５％（ｗ／ｖ）透析ＦＢＳ、４ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－グルタミン、ＩＴＳ（インシュリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム）サプリメント（×１）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１５を添加したαＭＥＭ（メチオニン不含有）培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
　（４）培養後、培養上清０．４ｍＬを回収し、培養上清に分泌された、ＡＨＡで標識されたタンパク質（セクレトーム）を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ｋｉｔ，ｆｏｒ　ｃｌｉｃｋ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｚｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、前記ＡＨＡのアジド基をアルキンアガロース樹脂に捕捉させることで抽出した。
　（５）（４）で抽出したタンパク質について、上記３の（４）～（５）と同様にして、アミノ酸配列の決定、タンパク質の同定、及びその定量を行なった。
　６．主成分分析（ＰＣＡ）
　上記５のセクレトーム解析の（５）より、８００の同定タンパク質及びそれらの発現量のデータが得られた。ただし、前記タンパク質数には、低発現又は無発現のタンパク質を含めていない。各Ｔ細胞（２４種類）におけるこれらデータについて、主成分分析（ＰＣＡ）を行なった。ＰＣＡで得られた散布図を図１に示す。
　図１に示したように、細胞の品質（この場合、増殖能）とＰＣ１スコアとの間に高い関連性が認められ、高品質Ｔ細胞（図１中では白丸で表記）では第一主成分（ＰＣ１）スコアが低く、低品質Ｔ細胞（図１中では黒丸で表記）ではＰＣ１スコアが高くなった。ＰＣＡでは、主成分スコアの係数と主成分負荷量の値とはほぼ比例するため、第一主成分の主成分負荷量の値が（正に）大きい変数（この場合、変数は各タンパク質の発現量）は、第一主成分の正方向に寄与し、第一主成分の主成分負荷量の値が低い（負値の）変数は、第一主成分の負方向に寄与する。そのため、第一主成分の主成分負荷量の値が大きいタンパク質は、ＰＣ１スコアが高い細胞、すなわち、低品質Ｔ細胞で発現し、第一主成分の主成分負荷量の値が小さいタンパク質は、ＰＣ１スコアが低い細胞、すなわち、高品質Ｔ細胞で発現することがわかった。
　そこで、前記ＰＣＡより、上記４のパスウェイ解析の（４）で選出したタンパク質の発現量について、第一主成分の主成分負荷量（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｌｏａｄｉｎｇ）をそれぞれ求めた。得られた第一主成分の主成分負荷量を上記の表１～３に合わせて示す。表１～３に示すように、前記パスウェイ解析で選出したタンパク質において、得られた第一主成分に対する主成分負荷量の絶対値はいずれも０．４以上であり、ほとんどのタンパク質において０．８以上であった。したがって、上記の表１～３に示したタンパク質は、Ｔ細胞の品質（増殖能）評価用のマーカーとして利用することが可能であるといえる。
　７．Ｔ細胞の品質（増殖能）とマーカータンパク質の発現との相関性（その１）
　「６．主成分分析」の結果、第一主成分への寄与率が高い遺伝子の中から、ＥＥＦ１Ａ１（アミノ酸配列番号４）、ＴＰＩ１（アミノ酸配列番号７）、ＥＮＯ１（アミノ酸配列番号８）、ＴＫＴ（アミノ酸配列番号１７）、及びＧ６ＰＤ（アミノ酸配列番号３８）を選択し、これら遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現量とＴ細胞の品質との相関性を確認した。
（１）ＴＣＲ刺激前の細胞（ｄａｙ０）試料調製
（１－１）１０種類のＴ細胞株（表２４に示す細胞Ｎｏ．５、１０、１１、１３、１５、１６、１８、１９、２２、２４）を解凍し、９６ｗｅｌｌプレートの培地Ａ（１５％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ社製）、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１５を添加したαＭＥＭ）に、それぞれ５×１０６～７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。
（１－２）播種した細胞を２４時間培養後、培養上清を回収し、－８０℃で保存した。これを「刺激前上清試料」とした。
　（２）ＴＣＲ刺激後の細胞（ｄａｙ２）試料調製
（２－１）（１－１）と同じ１０種類のＴ細胞株を解凍し、９６ｗｅｌｌプレートの培地Ａに、それぞれ５×１０６～７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。
（２－２）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８　ｆｏｒ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて、播種したＴ細胞のＴＣＲをそれぞれ刺激後、培地Ａで適宜培地交換しながら、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２日間培養した。
（２－３）２日間培養し、上清をすべて除去後、新しい培地Ａを添加し、さらに２４時間培養した。培養上清を回収後、－８０℃で保存し、これを「刺激後上清試料」とした。
　（３）タンパク質発現量測定
　（１）で調製した刺激前上清試料、および（２）で調製した刺激後上清試料について、下記市販のキットを用いて、ＥＬＩＳＡ法による各タンパク質発現量測定を行なった。
ＥＥＦ１Ａ１（アミノ酸配列番号４）：Ｈｕｍａｎ　ＥＥＦ１Ａ１（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１－ａｌｐｈａ　１）ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）
ＴＰＩ１（アミノ酸配列番号７）：Ｈｕｍａｎ　ＴＰＩ１（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）
ＥＮＯ１（アミノ酸配列番号８）：Ｈｕｍａｎ　ＮＮＥ（Ｎｏｎ－Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｅｎｏｌａｓｅ）ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）
ＴＫＴ（アミノ酸配列番号１７）：Ｈｕｍａｎ　Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ、ＴＫ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）
Ｇ６ＰＤ（アミノ酸配列番号３８）：Ｈｕｍａｎ　Ｇ６ＰＤ（Ｇｌｕｃｏｓｅ　６　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）。
　（４）相関係数算出
　前記５つのタンパク質（ＥＥＦ１Ａ１、ＴＰＩ１、ＥＮＯ１、ＴＫＴ、及びＧ６ＰＤ）について、増殖能（対数値）と前記タンパク質発現量（対数値）との相関係数を算出した。結果を下記の表２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
  
　８．Ｔ細胞の品質（増殖能）とマーカータンパク質の発現との相関性（その２）
　「６．主成分分析」の結果、第一主成分への寄与率が高い遺伝子の中から、ＡＬＤＯＣ（アミノ酸配列番号２０）を選択し、当該遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現量とＴ細胞の品質との相関性を確認した。
　（１）１８種類のＴ細胞株（表２４に示す細胞Ｎｏ．５、８～２４）を０．５×１０７～１×１０７ｃｅｌｌｓ取得し、当該細胞を、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（－）１ｍＬに懸濁し凍結融解を３回繰り返す操作、又はＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　３（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）１ｍＬ添加する操作により、溶解して「刺激後上清試料」とした。
　（２）（１）の細胞溶解液をタンパク質量が３０μｇとなるようにそろえた後、抗体アレイ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ、Ｆｕｌｌ　Ｍｏｏｎ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製）に添加し、付属のプロトコールにしたがってＡＬＤＯＣタンパク質発現量測定を行なった。
　（３）７．（４）と同様の方法で相関係数を算出した。結果を下記の表２６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
  
　表２５及び表２６では、相関係数の絶対値が０．５以上であれば「相関性あり」と判断した。表２５及び表２６に示したように、刺激前上清試料（ｄａｙ０）では、ＥＥＦ１Ａ１（アミノ酸配列番号４）、ＴＰＩ１（アミノ酸配列番号７）、ＥＮＯ１（アミノ酸配列番号８）、及びＡＬＤＯＣ（アミノ酸配列番号２０）で増殖能とタンパク質の発現量との相関を確認した。このことから、ＥＥＦ１Ａ１、ＴＰＩ１、ＥＮＯ１、及びＡＬＤＯＣは、定常状態のときにＴ細胞の品質を評価できるマーカーといえる。一方、刺激後上清試料（ｄａｙ２）では、ＥＥＦ１Ａ１（アミノ酸配列番号４）、ＴＫＴ（アミノ酸配列番号１７）、及びＧ６ＰＤ（アミノ酸配列番号３８）で増殖能とタンパク質の発現量との相関を確認した。このことから、ＥＥＦ１Ａ１、ＴＫＴ、及びＧ６ＰＤは、ＴＣＲによる細胞刺激後の状態のときにＴ細胞の品質を評価できるマーカーといえる。
　また、これらの中でも、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＮＯ１、ＴＫＴ、Ｇ６ＰＤ、及びＡＬＤＯＣは、相関係数の絶対値が０．６以上であり、これら５つのタンパク質は、Ｔ細胞の品質を評価できるマーカーの特に好ましい態様といえる。さらに、ＥＥＦ１Ａ１及びＴＫＴは、相関係数の絶対値が０．８以上であり、Ｔ細胞の品質を評価できるマーカーの特により好ましい態様といえる。
　本発明によれば、新たな指標によってＴ細胞の品質を評価できるＴ細胞の評価方法、及びそれに用いるＴ細胞評価用試薬を提供することが可能となる。

Claims (19)

  1. 　Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
    　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
    を含む、Ｔ細胞の評価方法。
    （Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  2. 　前記検出工程が、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現産物に特異的に結合するプローブ分子を用いて前記発現産物を検出する工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記発現産物が、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子のうちのいずれか１つにコードされるポリペプチドであり、かつ、前記プローブ分子が、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はアプタマーである、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記評価工程が、前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の増殖能を評価する工程である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’）～（ＩＩＩ’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
    （Ｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  6. 　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’）～（ＩＩＩ’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
    （Ｉ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  7. 　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’’）～（ＩＩＩ’’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
    （Ｉ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  8. 　請求項２～７のいずれか一項に記載の方法に用いるための試薬であり、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現産物に特異的に結合するプローブ分子を含有する、Ｔ細胞評価用試薬。
    （Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  9. 　前記発現産物が、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子のうちのいずれか１つにコードされるポリペプチドであり、かつ、前記プローブ分子が、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はアプタマーである、請求項８に記載の試薬。
  10. 　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’）～（ＩＩＩ’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項８又は９に記載の試薬。
    （Ｉ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ’）配列番号４、７、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  11. 　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’）～（ＩＩＩ’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の試薬。
    （Ｉ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ’’）配列番号４、８、１７、２０及び３８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  12. 　前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が、下記（Ｉ’’’）～（ＩＩＩ’’’）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の試薬。
    （Ｉ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ’’’）配列番号４及び１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  13. 　請求項１～７のいずれか一項に記載のＴ細胞の評価方法により得られた高品質Ｔ細胞。
  14. 　請求項１３に記載の高品質Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
  15. 　がんの予防又は治療に使用するための請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　請求項１４に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。
  17. 　がんを有するかまたはがんを有する危険性のある被験者に、請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含む、がんを治療または予防する方法。
  18. 　がんを有するかまたはがんを有する危険性のある被験者に、Ｔ細胞を投与することを含む、がんを治療または予防する方法であって、該Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
    　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
    を含む、方法。
    （Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
  19. 　Ｔ細胞の製造方法であって、該Ｔ細胞における、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を検出する検出工程と、
    　前記遺伝子の発現を指標としてＴ細胞の品質を評価する評価工程と、
    を含む、Ｔ細胞の製造方法。
    （Ｉ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子
    （ＩＩＩ）配列番号１～５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子。
PCT/JP2022/039807 2021-10-27 2022-10-26 Ｔ細胞を評価する方法及びｔ細胞を評価するための組成物 WO2023074712A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-175127 2021-10-27
JP2021175127A JP2023064789A (ja) 2021-10-27 2021-10-27 Ｔ細胞を評価する方法及びｔ細胞を評価するための組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023074712A1 true WO2023074712A1 (ja) 2023-05-04

Family

ID=86158026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/039807 WO2023074712A1 (ja) 2021-10-27 2022-10-26 Ｔ細胞を評価する方法及びｔ細胞を評価するための組成物

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2023064789A (ja)
WO (1) WO2023074712A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008275397A (ja) * 2007-04-26 2008-11-13 Medeinetto:Kk γδＴ細胞培養前の増殖能判定方法、該判定方法のためのキット
US20170233808A1 (en) * 2014-10-17 2017-08-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of t-cell exhaustion using cd39 biomarkers and modulators

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008275397A (ja) * 2007-04-26 2008-11-13 Medeinetto:Kk γδＴ細胞培養前の増殖能判定方法、該判定方法のためのキット
US20170233808A1 (en) * 2014-10-17 2017-08-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of t-cell exhaustion using cd39 biomarkers and modulators

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEORGE ELIAS; BENSON OGUNJIMI; VIGGO VAN TENDELOO: "Tracking Dye‐Independent Approach to Identify and Isolate In Vitro Expanded T Cells", CYTOMETRY A, vol. 95, no. 10, 29 July 2019 (2019-07-29), Hoboken, USA, pages 1096 - 1107, XP072332516, ISSN: 1552-4922, DOI: 10.1002/cyto.a.23867 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023064789A (ja) 2023-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6259012B2 (ja) 脱毛症の治療方法
Delconte et al. CIS is a potent checkpoint in NK cell–mediated tumor immunity
US8574903B2 (en) Method for expanding monocytes
JP6416131B2 (ja) 濃縮された腫瘍反応性ｔ細胞集団を腫瘍から作製する方法
Levitsky et al. Systemic immunoregulatory and proteogenomic effects of tacrolimus to sirolimus conversion in liver transplant recipients
EP3045468B1 (en) Novel peptides and their use in diagnosis and treatment
Chi et al. Involvement of T helper type 17 and regulatory T cell activity in tumour immunology of bladder carcinoma
CN103975078A (zh) 治疗和诊断膀胱癌的方法和组合物
US11566226B2 (en) Natural killer cells
Peligero-Cruz et al. IL18 signaling promotes homing of mature Tregs into the thymus
US20230330145A1 (en) Natural killer cells
CN114929752A (zh) 嵌合细胞因子受体
Crispim et al. Frequency of insertion/deletion polymorphism in exon 8 of HLA‐G and kidney allograft outcome
Davies et al. Robust production of merkel cell polyomavirus oncogene specific T cells from healthy donors for adoptive transfer
Flinn et al. Thymopoiesis, alterations in dendritic cells and Tregs, and reduced T cell activation in successful extracorporeal photopheresis treatment of GVHD
Crispim et al. Interferon-γ+ 874 polymorphism in the first intron of the human interferon-γ gene and kidney allograft outcome
WO2023074712A1 (ja) Ｔ細胞を評価する方法及びｔ細胞を評価するための組成物
WO2023074711A1 (ja) Ｔ細胞の評価方法及びｔ細胞評価用の組成物
WO2023074713A1 (ja) Ｔ細胞の品質評価方法、および当該方法に用いる試薬
US20120004124A1 (en) Markers of regulatory t cell activation
US9678062B2 (en) Methods and compositions for expanding cells and improving engraftment
US20240156901A1 (en) Gal3bp polypeptide compositions and methods for treatment of cancer and determining treatment responsiveness
WO2023131323A1 (en) Novel personal neoantigen vaccines and markers
Nakano et al. Impact of vaccine therapy using nuclear histone H1 on allograft survival in experimental organ transplantation
US20230002732A1 (en) Natural killer cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22887038

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1