JP5901796B2 - 遺伝子サイレンシングに有用な変異パルボウイルス - Google Patents

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Description

本発明は、細胞内の対象遺伝子の発現を効率よくダウンレギュレートする方法に関する。この目的のために、本発明は、標的遺伝子をダウンレギュレートするための複製能力を有する変異げっ歯類パルボウイルスであって、前記パルボウイルスが発現可能標的特異性核酸、好ましくはshRNA発現カセット、を含むことを特徴とするものを提供する。本発明は、又、前記パルボウイルスを含む細胞と生物体も提供する。
RNA干渉（RNAi）は、新しい遺伝子の同定と機能的な特徴付けのプロセスを革新しただけでなく、ヒトの疾患、特に、ガンに対する有望な治療選択肢となっている(非特許文献１、非特許文献２)。この成功の理由は、従来の治療法では到達不可能な、標的遺伝子に対するRNA誘導分子の高い特異性と効力にある。マイクロRNA（miRNA）、又は小さな干渉性RNA（siRNA）等の小さなRNAは、相補的mRNA配列に結合してそれらの分解を誘因したり、それらの翻訳をブロックする（非特許文献１（１））。siRNAは、任意の遺伝子の発現をサイレンシングするように設計することができ、それによって、理論上ゲノム全体に対する介在（intervention）の可能性を拡大する。ガンについては、siRNA（及びmiRNA）は、既に、細胞シグナリング、増幅、分化、アポトーシス、及び老化を制御する遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに強力なツールであることが示されている（非特許文献１（１）、非特許文献２（２））。このリストには、更に、一般に従来のアプローチでは操作不能な転写因子が含まれる。細胞停止（cellular arrest）、及び／又はアポトーシスをもたらす、K-Ras, 変異p53m c-myc, Her2／neu, bcl-2, bcr-abl, サバイビン、及びヒトパピローマウイルス16 E6等の変異ガン遺伝子や抗アポトーシス遺伝子、の効果的なサイレンシングは、前臨床レベルでのガン治療におけるそのようなアポトーシスの少数の成功例にすぎない(非特許文献３（３）、非特許文献４（４）を参照)。
RNAi経路は、動物を含む多くの真核細胞において見られ、酵素ダイサー（Dicer）によって開始され、この酵素は、長い二本鎖RNA（dsRNA）分子をsiRNAと呼ばれる〜20ヌクレオチドの短いフラグメントに切断する。各siRNAは、二つの一本鎖ssRNA、即ち、パッセンジャー鎖、ガイド鎖へ解きほどかれる。そして、パッセンジャー鎖は分解され、ガイド鎖はRNA誘導型サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれる。最も良く研究されているその結果は、転写後遺伝子サイレンシングであって、これは前記ガイド鎖塩基がメッセンジャーRNA分子の相補配列と対合して、アルゴノート（Argonaute）、RISC複合体の触媒成分、による切断を誘導する。いくつかの生物体においては、このプロセスは、初期においてsiRNAの分子濃度が限られているにも関わらず、全身に広がることが知られている。
その大きな可能性にも関わらず、RNAiに基づく治療法を臨床的に成功裏に導入するためにはいくつかのハードルを克服しなければならない。これらには、不要なオフターゲット作用の回避、先天性免疫の活性化、ノックダウン能力が毎回の細胞分裂によって減少するsiRNA分子の短い半減期が含まれる（非特許文献５（５））。しかしながら、依然として、主要な障害は、RNAi誘因分子を標的細胞に安全かつ効率的に送達することであり、その結果生じる細胞内取り込み不良と、組織内の非特異的蓄積である（非特許文献２（２）、非特許文献５（５））。
短いヘアピンRNA（shRNA）は別のクラスのRNAiエフェクタである（非特許文献６（６））。shRNAは、通常、RNAポリメラーゼII（Pol II）又はIII （Pol III）プロモーターとヘアピンループを備える短い二本鎖DNA配列とから構成されるshRNA発現カセットを有する発現ベクターから核に転写される。次に、shRNA転写物は細胞質にエクスポートされ、すべてのsiRNAと同様にプロセシングされる（非特許文献５（５）、非特許文献６（６））。shRNAは、宿主細胞において絶えず合成され、それによってより持続性のある遺伝子サイレンシングが得られる。しかしながら、転写を通したshRNA発現ベクタの細胞間送達は、低効率であって、新たな送達方法が求められている（非特許文献６）。この目的のために、shRNA用の転写媒体（vehicle）としてのウイルスの開発に向けた研究が数多く行われている。これは、また、shRNAカセットは通常サイズが小さく、一般にウイルスのパッケージング能力に影響することなく、任意のウイルスゲノムに挿入することが可能である点でも有利である。この目的のために作成されたビリオンの具体例は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスをベースにしている（非特許文献７（７））。これらのウイルスは、通常は、ヒト病原体であり、従って、それらは、それらのゲノムの遺伝子変異によって複製欠損性にされる。これによって、それらは腫瘍を介して広がることができなくなる。shRNAカセットを挿入し遺伝子サイレンシングに使用される複製欠損レンチウイルスベクターがAbbas-Terki等によって記載されている（非特許文献１１（２４））。繁殖不能性は、遺伝子、及びガン療法に一般的に使用され、shRNAの送達用の候補として研究されているアデノ随伴ウイルス（AAV）にもみられる（非特許文献８（８）、非特許文献９（９））。Maxwell等は、遺伝子設計された（engineered）P4プロモーター発現ルシフェラーゼを有する複製欠損パルボウイルスLuIIIを記載している（非特許文献１２（２５））。それらのベクターは、P4プロモーターの変異、及び／又はパルボウイルスゲノムの他の部分を除去することによる異種導入遺伝子の発現、によって複製欠損性にされる。更に、上に挙げたウイルスルイスの多くの場合、ヒトが以前に保護中和抗体を顕在化させるウイルス感染に晒されたことによってそのウイルスに基づく処置が危うくなる可能性があるということを明記することも重要である（非特許文献１０）。
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従って、本発明の課題は、細胞又は生物体内における所望の遺伝子の発現を効率よくダウンレギュレートするための手段を提供することにある。
本発明に依れば、これは請求項に定義される発明内容を提供することによって達成される。
本発明は、shRNA発現カセットを坦持する第１の自律性（autonomous）パルボウイルス（H-1PV-サイレンサーと称する）を記載する。ラットパルボウイルスH-1PV、そのマウスホモログのマウス微小ウイルス（MVM）等のげっ歯類パルボウイルスは、これらはヒトに対して病原性でなく、腫瘍溶解性、及び腫瘍抑制性を有するので、それらの抗がん潜在能力のために注目を浴びている（１１）。ヒトは通常、げっ歯類パルボウイルス感染に晒されることはないので、これらウイルスについては既存の抗ウイルス免疫は通常問題とならない。パルボウイルスゲノムは、それぞれ、非構造（NS1、及びNS2）、及びカプシド（VP1、及びVP2）タンパク質の発現を調節する二つのプロモーターP4、及びP38を含む約5100塩基の一本鎖DNAからなる。PVライフサイクルにおいてP4プロモーターの活性化が重要な工程である。その後、P4プロモーターの活性は、それ自身の遺伝子産物NS1によって調節されるが、その最初の活性化は主として細胞サイクルのS期中に発現される宿主の細胞内因子に完全に依存する（１２）。この依存性と、更に、前記ウイルスは静止状態の細胞を刺激して増幅させることができないという事実とが、形質転換細胞又は悪性細胞を複製する時に優先的に増殖する前記ウイルスの腫瘍親和性（oncotropism）に寄与している。更に、パルボウイルス細胞毒性も腫瘍性形質転換に関連する細胞変化によって刺激される（１１、１３）。NS1は主要なウイルス性細胞毒タンパク質である（１３）。H-1PVはガン細胞においていくつかの細胞死経路を活性化することが示されている。詳しくは、細胞タイプと成長条件とに依存して、H-1PVはアポトーシス（１４〜１６）、細胞壊死（１７）又はカテプシンB-依存細胞死（１８）、を誘導することができる。PVの抗がん潜在能力は、多数の臨床前研究によって支持されているが、臨床応用においては有効性が限定要因となることを予測することができる。一部のがん細胞はウイルス治療を生き延びて腫瘍再発を引き起こす可能性がある。これらのウイルスが成長する腫瘍から単離されたという事実だけでは、それらがその成長を止める、又は、腫瘍性病変の完全な退行をもたらすには必ずしも十分に強力ではないということを示している（１３）。
本発明をもたらした実験中において、パルボウイルスゲノムの特定の部位にshRNAカセットを挿入することは、パルボウイルスのパッケージング能力と両立可能であり、ウイルス複製、及び細胞毒性に干渉しないことを証明することができた。前記ウイルスは高レベルのshRNAを発現し、遺伝子サイレンシングにおいて非常に高効率である。複製欠損ベクターとの比較におけるH-1PVサイレンサーの大きな利点は、増殖中の細胞、たとえば、がん細胞中におけるその複製し増殖する能力にある。理論的には、すべての感染/形質導入細胞が新しいウイルス粒子の産生体となりうる。子孫ビリオンは第2ラウンドの感染を通じて腫瘍を通して広がり、治療的shRNAを効率的に送達して発現することができる。このセッティングにおいて、サイレンシングシグナルを初期接種を超えて増幅することができる。同時に、パルボウイルスベースベクターとshRNA技術とは互いの限界を相殺する。即ち、パルボウイルスの本来の腫瘍親和性はshRNAに対して特異的かつ効果的に伝達されて、増殖する細胞、たとえば、ガン細胞におけるshRNAの形質導入を仲介する必要があり、他方、shRNAは、ウイルスの、ウイルスに対する感性が低い（ガン）細胞を殺す能力を与えなければならない。本発明は、げっ歯類パルボウイルスの強力な抗がん特性とRNAi誘因分子とを組み合わせた、ガン等の疾患を治療するための新規な治療戦略の開発のための道を切り拓くものである。
要約すると、本発明のげっ歯類パルボウイルスは、shRNAの送達/発現のために現在使用されている他のベクター（例えば、レンチウイルス又はAAVベースのベクター）と比較して、ガン細胞において複製し増殖するその能力を維持するものである。以下により詳細に説明するように、すべての感染／形質導入細胞が、理論的には、新しいウイルス粒子の産生体となりうる。子孫ビリオンは第2ラウンドの感染を介して腫瘍を通して広がり、治療的shRNAを効率的に送達して発現することができる。このセッティングにおいて、サイレンシングシグナルは初期接種を超えて増幅される。使用されているその他のベクター（（２４）、及び（２５）に記載されているベクターを含めて）では、それらは複製欠損であるがために、これは不可能である。本発明の最も重要な利点は、請求項に記載のげっ歯類パルボウイルスは、shRNAを高レベルで発現することができ、かつ、複製能力を有することにある。本発明のベクターにおいて、プロモーターは変異されず、及び／又はパルボウイルスゲノムの他の部分（たとえば、VP領域）を削除することによって異種導入遺伝子が発現される。本発明において、shRNA発現カセットは、パルボウイルスゲノムの他の要素を変えることなく、挿入される。野生型ウイルスと同様に、パッケージング、増殖、及びガン細胞において広がる能力を維持する新規なウイルスが作り出された。ウイルスのその他の特徴を失うことの無く、新規な機能（すなわち、shRNAを発現する能力）が作り出された。
shRNA発現カセットを含むpH-1PVサイレンサーの略図 RNAポリメラーゼIII H1プロモーターから成るRNAiカセットを、VP1、及びVP2カプシドタンパク質をコードするVP遺伝子の下流のゲノムの非コード領域に挿入した。ユニークなBamHI、及びNot I制限酵素をshRNAクローニングのために挿入した。パルボウイルスP4、及びP38プロモーターも図示されている。ITR、末端逆位配列。図は等尺ではない。 pH-1PVサイレンサーベクターを使用することによって達成される高効率な遺伝子サイレンシングHEK 293T細胞に図示のDNAとトランスフェクションした。12時間後、前記細胞をAd5-GFPで感染させ、GFP強度に対する蛍光顕微鏡検査による分析の前に、48時間生育させた。バーは、相対的標準偏差で三重に行われた典型的な実験の平均値を示している。GFP強度は、そのそれぞれが少なくとも200個の細胞を含む5つの異なる画像を使用してImage Jソフトウエアを利用して定量化された（２３）。 H-1PVサイレンサーの産生 ウイルスの産生。実施例１に記載のプロトコルに従ってウイルスを産生した。ウイルス精製後、ウイルス力価をリアルタイムqPCRとプラークアッセイとによって定量化した。 H-1PVサイレンサーの産生 感染を通したウイルス増幅の例。NB324K細胞を図示のウイルスに感染させた。5日後、細胞を溶解し、ウイルスを細胞抽出物から精製し、ウイルス力価をリアルタイムqPCRとプラークアッセイとによって定量化した。 H-1PVサイレンサーの産生 H-1PV wtとH-1PV-sil-GFPを使用したプラークアッセイの例。 内在H-1PV細胞毒性は、RNAiカセットの挿入後に損なわれない。NB324K細胞は、ウイルス感染に対する感受性をLDHアッセイによってテストされた。感染のためにウイルスはMOI 1、5、及び10で使用した。LDH測定は感染の72時間後に行った。 H-1PVサイレンサーを使用することによって達成された高効率遺伝子サイレンシング shRNA含有量。shRNAをウイルス感染、又はプラスミドトランスフェクション細胞から抽出し、mirVana miRNA検出キットを製造業者のマニュアルに従って使用して検出した。＋ ＝ ポジティブコントロール、pSilencer 3.1-GFPでトランスフェクトされた細胞、− ＝ ネガティブコントロール、sSilencer 3.1-controlでトランスフェクトされた細胞。 H-1PVサイレンサーを使用することによって達成された高効率遺伝子サイレンシング qRT-PCR。ウイルス感染細胞からの全RNAの単離とcDNA合成を実施例１に記載のプロトコルに従って行った。qRT-PCRをEGFPとGAPDH（ハウスキーピング遺伝子として使用）特異プライマセットを使用して行った。 H-1PVサイレンサーを使用することによって達成された高効率遺伝子サイレンシング 蛍光顕微鏡検査分析、代表的画像の一例。細胞を、H-1-sil-GFPとH-1-sil-controlで感染し、その後、Ad-GFPで重複感染させた。72時間後、細胞を蛍光顕微鏡GFPシグナルによって分析した。核可視化のためにヘキスト染色を使用した。 H-1PVサイレンサーを使用することによって達成された高効率遺伝子サイレンシング ウェスタンブロッティング分析。NB324K細胞を、指示されたMOIで、H-1-sil-GFPとH-1-sil-controlで感染させた。12時間後、細胞をAd-GFPで重複感染させた。EGFPタンパク質含有量を、これら細胞培養からの前記細胞抽出物に対するSDS-PAGEによって分析した。β-チューブリンをローディング・コントロールとして使用した。
このように、本発明は、細胞内における標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするためのげっ歯類パルボウイルスを提供するものであって、これは、前記細胞中のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーター、又はプロモーター領域の制御下で前記パルボウイルスゲノムの未翻訳領域に標的特異性核酸を含むことを特徴とし、ここで前記標的特異性核酸の転写物はRNAiである。
前記標的特異性核酸は、ウイルス複製、及び細胞毒性が影響されないように挿入される。
好ましくは、前記標的特異性核酸は、前記パルボウイルスのカプシドタンパク質をコードするパルボウイルスVP遺伝子の下流側に挿入される。
ここで使用される「パルボウイルス」という用語は、野生型ウイルス、複製ウイルス、及びそれらの変異複製可能派生体、CPG-armedウイルス、更には、それらの関連ウイルス、又は、それらのウイルス若しくは派生体をベースとするベクターを含む。治療に有用な、適当なパルボウイルス、派生体等は、過度の実験努力なしで当業者の技量の範囲内で容易に決定可能である。宿主細胞内で複製、及び増殖可能なウイルスが本発明において好適である。
ここで使用される「標的遺伝子」という用語は、動物、菌又は原生生物の細胞内に存在する任意の対象核酸を指すものと理解される。標的遺伝子は、生物活性RNAに転写可能であるか、もしくは、当該標的遺伝子は、その他の部分が生物活性RNAに転写されるより大きなRNA分子の一部であってもよい。前記標的遺伝子は、内在性遺伝子であってもよく、それはその細胞の先祖にヒトの介入を通じて導入された導入遺伝子であってもよく、あるいは、感染性又は病原性生物体によってその細胞に導入された遺伝子であってもよい。前記標的遺伝子は、更に、ウイルス起源のものであってもよい。更に、標的化される配列は、翻訳若しくは非翻訳領域、又はイントロン、又は好ましくは、エキソン領域、即ち、コード領域、又は、5’UTR若しくは3’UTR、又は、これらの内の任意のもの、又は全部の組み合わせであってもよい。
本発明において使用される前記標的遺伝子は、生物体中において疾患を引き起こすもの、又はその疾患を引き起こすことに関与するものとすることができ、それはその疾患を予防又は軽減するためにその特定遺伝子の発現の軽減が必要とされる遺伝子である。疾患によって影響され、特異遺伝子標的のダウンレギュレーションによって逆向可能な生物学的プロセスには、細胞増殖、細胞遊走、又は転移、アポトーシス、ストレスシグナリング、細胞接着が含まれる。前記標的遺伝子（単数、又は複数）は、酵素、転写因子、サイトカイン、成長因子、細胞接着又は運動因子、細胞周期因子、腫瘍サプレッサー、又は細胞周期インヒビターをコードするものとすることができる。
ここで使用される「標的特異性核酸」という用語は、前記標的遺伝子の転写ヌクレオチド配列の相補物に対して、少なくとも約75%、特に、少なくとも約80%、より具体的には少なくとも85%、更に具体的には少なくとも約90%、特に約95%の同一性を有する少なくとも15, 20, 25, 50, 100又は200の連続ntから成る核酸を指す。
本発明において、標的遺伝子は、イン・ヴィヴォ細胞又はイン・ヴィトロ細胞中でダウンレギュレートすることができる。前記細胞は、初代細胞、所定期間培養された細胞、又は培養細胞ラインからなる細胞から構成することができる。前記細胞は、ガン細胞や腫瘍等の疾患細胞、又はウイルスに感染した細胞等の疾患細胞から構成することができる。前記細胞は、始原細胞、すべての造血細胞系のより成熟した、及び完全に成熟した細胞を産生する幹細胞、特定の造血系を作り出す、関係付けられた（committed）始原細胞、Tリンパ球始原細胞、未熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、骨髄始原細胞、又は単球／マクロファージ細胞から構成することができる。前記細胞は、万能（omnipotent）、又は全能（totipotent）である幹細胞又は胚幹細胞から構成することが出来る。前記細胞は、神経細胞、神経系細胞、上皮細胞、筋細胞、心細胞、肝細胞、腎細胞、幹細胞、胚細胞又は胎児幹細胞あるいは孵化卵細胞から構成することができる。
従って、本発明の一好適実施例において、前記標的遺伝子は、病原遺伝子、たとえば、病原性動物ウイルス遺伝子、ガン関連遺伝子、ガン遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、腫瘍細胞成長、転移、血管新生、若しくは化学療法耐性のために重要な遺伝子、免疫調節遺伝子、又はサイトカイン、成長因子、酵素若しくは転写因子をコードする遺伝子である。
前記標的遺伝子は、たとえば、病原性動物ウイルス、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペスウイルス-1（HSV-1）、HSV-2、サイトメガロウイルス（CMV）、B型肝炎、C型肝炎又D型肝炎ウイルス等の肝炎ウイルス、パピローマウイルス、RNAウイルス、たとえば、ポリオウイルス、VSV、インフルエンザウイルス、モルビリウイルス、又はレオウイルス等の二本鎖RNAウイルスから構成することができる。前記ウイルスは、ヒト以外の動物に対して病原性のものから構成することができ、たとえば、口蹄疫ウイルス、牛疫ウイルス、ブルータングウイルス、ブタコレラウイルス、ブタサーコウイルス（circa virus）、カプリポックスウイルス、西ナイルウイルス、ヘニパウイルス（henipah virus）、マレック病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、トリインフルエンザウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病、水産養殖ウイルス、たとえば、イリドウイルス、パラミクソウイルス、又はホワイトスポット病ウイルスから構成することができる。
好ましくは、前記げっ歯類パルボウイルスは、薬用組成物として調製され、ここで、前記パルボウイルスは、有効投与量含まれ、かつ、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされる。「薬学的に許容可能な」とは、前記活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、投与される患者に対して毒性を持たない任意のキャリアを意味する。適当な薬学的に許容なキャリアは、周知であり、リン酸緩衝生理緩衝食塩溶液、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、種々の湿潤剤、無菌溶液等が含まれる。その他の薬学的許容可能キャリアは、前記パルボウイルス（治療剤）を含有する、ゲル、生物吸収マトリクス材、移植要素や、適当な賦形剤、送達若しくは分配手段、又は材（単数又は複数）を含むことができる。そのようなキャリアは、従来方法によって調製でき、有効投与量で対象体に投与することができる。
「有効投与量」とは、治療を行うのに十分な活性成分量をいう。「有効投与量」は、当業者に知られている方法を使用して決定することができる（たとえば、Fingl等、The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman、及びGilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp.1-46 (1975）を参照）。
前記パルボウイルスの投与は、様々な方法、たとえば、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、又は皮内投与によって行うことができる。もちろん、投与経路は、治療の種類に依存する。好適な投与経路は、静脈内（i.v.）、腫瘍内、又は気管支内投与である。血液脳関門を貫通する能力を有する感染性ウイルス粒子を使用する場合は、治療は、たとえば、H1ウイルスの静脈内注射によって行うか、又は少なくともそのような静脈内注射から始められる。
パルボウイルスの投与計画は、たとえば、投与される、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、特定の変異パルボウイルス等、投与時間と経路、間葉系腫瘍のタイプ、患者の一般的健康状態、その患者が受けるその他の薬剤療法等を含む、患者データ、観察、及びその他の臨床要因に基づいて担当医によって、当業者技量の範囲内において容易に決定可能である。
もう一つの特異的投与技術として、前記パルボウイルスは、患者に移植されたソースからその患者に投与することができる。例えば、シリコーンやその他の生物的適合性材から成るカテーテルを、たとえば、腫瘍除去中に、その患者内に設置された皮下埋没式リサーバー（Rickham reservoir容器）に接続することによって、あるいは、パルボウイルスが追加の外科的介入処置無く様々な機会に局所注射されることを可能にするための、別の処置によって、投与することができる。前記パルボウイルスは、定位的外科技術あるいは、神経ナビゲーションターゲティング技術によって腫瘍に注入することも可能である。
パルボウイルスの投与は、適当なポンプシステム、たとえば、蠕動式注入ポンプ、又は対流増加送達（convection enhanced delivery: CED）ポンプ等を使用して、低流速で移植されたカテーテルを通してウイルス粒子、又はウイルス粒子を含む流体を連続注入する等によって行うことも可能である。
パルボウイルスの更に別の投与方法は、パルボウイルスを所望の組織に分配するように構成／配置された移植装置から行うものである。例えば、前記パルボウイルス、たとえば、パルボウイルスH1をあらかじめ含ませたウエハを使用することができ、ここで、そのウエハは、外科的腫瘍除去の完了時に切除腔のエッジに取り付けられる。そのような治療介入において複数のウエハを使用するこができる。活発に前記パルボウイルス、たとえば、パルボウイルスH1を作り出す細胞を腫瘍細胞、又は腫瘍除去後に腫瘍腔に注入することができる。
本発明の別の好適実施例において、前記げっ歯類パルボウイルスは、パルボウイルスH1（H1PV）、又はLuIII、マウス微小ウイルス（MMV）、マウスパルボウイルス（MPV）、ラット微小ウイルス（RMV）、ラットパルボウイルス（RPV）、又はラットウイルス（RV）等の関連パルボウイルスである。
本発明の特に好適な実施例において、前記標的特異性核酸は、野生型H-1PVゲノムのヌクレオチド4683に挿入される。但し、パルボウイルスゲノムの他の領域での前記カセットの挿入、又はマイクロRNA等の他のRNAi誘因分子、及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチド等も考えられる。本発明の別の特に好適な実施例において、RNAポリメラーゼによって認識可能な前記プロモーター又はプロモーター領域は、たとえば、CMVやヒトユビキチンC等のRNAポリメラーゼII （Pol II）プロモーター、又は、U6、H1、7SK、及びtRNAなどのRNAポリメラーゼIII （Pol III）プロモーターである。特に好適なRNAポリメラーゼIII （Pol III）プロモーターの具体例は、RNAポリメラーゼIII H1プロモーターである。
本発明の別の特に好適な実施例において、前記標的特異性核酸はshRNAである。shRNAはRNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用可能なタイトなヘアピンターンを作り出すRNAの配列である小さなヘアピンRNA又は短いヘアピンRNAである。shRNAヘアピン構造は、前記細胞内機構によってsiRNAへと切断され、その後、これはRNA誘導型サイレンシング複合体（RISC）に結合する。この複合体はそれに結合したsiRNAにマッチするmRNAに結合し、これを切断する。
本発明の別の特に好適な実施例において、前記標的特異性核酸、たとえば、shRNA、は少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する。
本発明は、更に、病原性動物ウイルス遺伝子、ガン関連遺伝子、ガン遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、腫瘍細胞成長、転移、血管新生、若しくは化学療法耐性のために重要な遺伝子によって引き起こされる疾患、免疫調節遺伝子、又はサイトカイン、成長因子、酵素、若しくは転写因子をコードする遺伝子の異常発現に関連する疾患の治療用の上述の通り特徴付けられるげっ歯類パルボウイルスにも関する。
一好適実施例において、前記パルボウイルスは、腫瘍の治療、特に、脳腫瘍の治療に使用することができる。
別の好適実施例において、前記パルボウイルスは、その腫瘍の細胞が化学療法、及び／又は放射線療法に耐性であることを特徴とする腫瘍の治療に使用することができる。
本発明のパルボウイルスによって治療可能な患者は、ヒト、更に、ヒト以外の動物を含む。後者の具体例は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、及びネコ等の動物を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明は、更に、上述したように、パルボウイルスを含む、動物、菌、又は原生生物の細胞を提供する。一実施例において、前記細胞はイン・ヴィトロである。前記細胞は、好ましくは、動物細胞、単離ヒト細胞、イン・ヴィトロのヒト細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、魚細胞、家畜細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、非ヒト霊長動物細胞、線虫細胞、貝類細胞、エビ細胞、カニ細胞、ロブスタ細胞、昆虫細胞、ショウジョウバエ細胞、甲虫類細胞、双翅類細胞、鱗翅虫細胞、又は半翅虫細胞である。
最後に、本発明は、更に、上述したように、パルボウイルスを含む、トランスジェニック非ヒト動物、菌、又は原生生物を提供する。トランスジェニック動物は、前記パルボウイルスを、受精卵母細胞の前核へ注入によって、キメラ胚を作るため、細胞、好ましくは、未分化細胞を発達中の胚へ移植、組み換え細胞からの核の除核胚、又は活性化卵母細胞への移植等によって作り出すことができる。トランスジェニック動物の産生方法は、当該技術において十分確立されており、たとえば、米国特許第 4,873,191号に記載されている。
以下、本発明にについて更に詳細に説明する。
実施例１．材料、及び方法
（Ａ）細胞培養
NB324K、及びHEK293T細胞を、それぞれ最小必須培地（MEM）及びダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。なお、培地は、5%（MEM）、又は10%（DMEM）ウシ胎仔血清と、100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミン（すべてGibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germany製）とを添加したものである。すべての細胞は、5%CO2雰囲気、95%湿度で、37℃に維持された。
（Ｂ）プラスミド構築
Pol III H1 shRNA発現カセットをpSR19（１９）、及びΔpSR19（２０）プラスミドにクローニングした。前者は全H-1PV wtゲノムを含み、後者はヌクレオチド2022〜2135（パルボウイルスNS2タンパク質のC末端領域をコードする）を欠いた欠失バージョンである。前記HPAI制限酵素部位（NCBI参照配列NC_001358.1によるヌクレオチド4687〜4693）を前記クローニングに使用した。前記カセットを鋳型DNAとしてpSilencer 3.1ベクター（Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY, USA）と下記のプライマとを使用するPCRによって増幅した。
For H1 POL III
5'-GTTAACGAATTCATATTTGCATGT-3'、及び、
REV H1 POL III
5'-GTTAACGCGGCCGCGGATCCGAGTGGTCTCATACAGAAC-3'。
前記カセットは、前記shRNAをプラスミドに容易にクローニングするためのBamH1-Not Iユニーク制限部位を含む。前記二つのプラスミドを、ph-1PV-silencer 1とpH-1PV- silencer 2と命名した。前記shRNAのクローニングのために、下記のオリゴヌクレオチドの対を使用した。
shRNA EGFP上鎖
5'-GATCCGCTGGAGTACAACTACAACTTCAAGAGAGTTGTAGTTGTACT CCAGCTTTTTTGGAAGC-3' 、及び、
shRNA -EGFP下鎖
5'-GGCCGCTTCCAAAAAAGCTGGAGTACAACTACAACTCTCTTGAAGTTGTAGTTGTACTCCAG CG-3'、
shRNAネガティブコントロール上鎖
5'-GATCCACAGCAGAGCAGATCGTTCTTCAAGAGAGAACGATCTGCTCTGCTGTTTTTGGAAGC -3'、及び、
shRNAネガティブコントロール下鎖
5'-GGCCGCTTCCAAAAACAGCAGAGCAGATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATCTGCTCTGCTGTG -3'.
オリゴヌクレオチドを96℃でアニールし、予め消化させておいたBamH1-Not I pH-1PV silencer 1、及び2プラスミドに直接クローニングした。前記shRNAのpSilencer 3.1-H1 puroベクター（Ambion）へのクローニングにも同様のアプローチを使用した。このケースにおいて、前記BamH1/Hind III制限部位と下記の重複オリゴヌクレオチドを使用した。
shRNA-EGFP Ambion 上鎖
5'-GATCCGCTGGAGTACAACTACAACTTCAAGAGAGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTTTTTGGAAA-3'、及び、
shRNA-EGFP Ambion 下鎖
5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGGAGTACAACTACAACTCTCTTGAAGTTGTAGTTGTACTCCAGCG-3'。
shRNAネガティブコントロール上鎖Ambion
5'-GATCCACAGCAGAGCAGATCGTTCTTCAAGAGAGAACGATCTGCTCTGCTGTTTTTGGAAA-3' 、及び
shRNAネガティブコントロール下鎖Ambion
5'-AGCTTTTCCAAAAACAGCAGAGCAGATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATCTGCTCTGCTGTG-3'。
すべてのクローンをEscherichia coli 株SURE（Invitrogen, Darmstadt, Germany）中で増やし、DNAをシークエンシングによって確認した。
（ｃ）ウイルス産生と力価測定（titration）
すべてのウイルスをHEK293T細胞中で産生した。前記細胞は、T75培養フラスコ内で培養し、12.5%の培養密度のウイルスプラスミドの4〜10μg/フラスコで一過的に形質転換された。4日後、細胞をそれらの培地とともに収集し、3回の凍結、及び解凍サイクルで溶解させ、細胞残滓を遠心分離によって除去した。産生されたウイルスを、感染性NB324K細胞によって更に増幅し、イオジキサノール勾配遠心分離によって更に精製した（２１）。ウイルス力価測定を、（２２）に従って、qPCRとプラークアッセイによって行い、ウイルスゲノム（Vg）、又はプラーク形成単位（PFU）/mlで表した。
（Ｄ）ウイルスプラスミドトランスフェクション
図２に記載の実験において、HEK293T細胞を、10 cmディシュで増殖させ、その製造業者の指示に従ってFuGENE HD （Roche, Mannheim, Germany）を使用して約40%の培養密度でトランスフェクションした。2μgのDNAを無血清培地中で、20ng/μlの最終濃度にまで希釈し、その後、7.5μlのFugeneをその混合物に添加した。室温で30分間のインキュベーション後、前記混合物を細胞に液滴によって添加した。
（Ｅ）ウイルス感染
図４に記載の実験において、1.5×105のNB324K細胞を6-ウェルプレートに播種し、特に銘記されない限り、MOI 5 （PFU/細胞）で、H-1PV wt、H-1PV-silencer-GFP、又はH-1PV-silencer-controlで感染させる前に一晩インキュベーションした。感染の12時間後、細胞をMOI 80緑色蛍光トランスダクションユニット（GFU）細胞で使用されるEGFPタンパク質を発現するアデノウイルスで重複感染させ、プロセシング前に更に72時間増殖させた。
（Ｆ）LDHアッセイ
ウイルス細胞溶解活性を、その製造業者の指示に従ってLDHアッセイ（CytoTox 96: Promega, Mannheim, Germany）によって測定した。NB324K細胞を、96ウェルプレート（2,500細胞／ウェル）内で50μlの培地中に播種した。24時間後、細胞を、MOI 5（pfu／細胞）で前記ウイルスを含む追加の50μlの培地を添加することによって感染させた。感染の72時間後、細胞をLDH放出測定のために処理した。比色変化を、492nmでマイクロタイターリーダーを使用して測定した。
（Ｇ）shRNA抽出と検出
パルボウイルス感染NB324K細胞からのshRNA抽出を、その製造業者プロトコルに従ってmirVana miRNA単離キット（Ambion, Life technologies, Darmstadt, Germany）を使用して行った。shRNAの検出を、前記mirVana miRNA単離キット（Ambion）をそのインストラクションマニュアルに記載されているように使用して行った。
（Ｈ）RNA抽出とcDNA調製
全RNAをRNeasy Mini RNA精製キット（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して細胞から単離した。cDNA合成を、HotStartTaq DNA ポリメラーゼを添加して（+RT）又はその添加無しで（-RT）、ランダムヘキサマープライマ（Promega）を使用して、その製造業者のプロトコルに従ってQuantiTect Probe RT-PCR Kit （Qiagen）を使用して行った。
（Ｉ）定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）
Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems, Germany）を使用したTaqMan ABI Prism 7600 Sequence 検出システム（Applied Biosystems, Germany）を使用してQRT-PCRを行った。RNAコントロールの各サンプルを正規化するために、ハウスキーピング遺伝子GAPDHをコントロール遺伝子として使用した。PCRを下記のプライマを使用して行った。
GapdhFor 5'-AGCAACTCCCACTCTTCCACCTT-3',
GapdhRev 5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCAT-3',
EGFPFor 5'-CCACTACCTGAGCACCCAGTC-3',
EGFPRev 5'-CACGAACTCCAGCAGGACCA-3'
（Ｊ）ウェスタンブロッティング
H-1PV-sil-GFP, H-1PV-sil-コントロール、及びH-1PV野生型で感染された細胞を、トリプシン処理しPBSで二回洗浄した。前記細胞ペレットを、50mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 0.5% NP-40, 1mM DTT, 10%グリセロール、及びプロテアーゼインヒビターの混合物（Roche, Diagnostics, Mannheim Germany）から成る500μlの細胞溶解緩衝液中で細胞溶解し、氷上で20分間維持した。遠心分離（10,000 rpm×10分）後、上清を収集し、タンパク質量をBCAアッセイ（Perkin Elmer）により、その製造業者のマニュアルに従って使用して測定した。全細胞抽出物（30μg）を12% SDSゲル上でロード、及び分離し、ウエットブロッティング（Invitrogen, X-Cell Sure Lock）によってHypbond-Pメンブラン（GE Healthcare）上にトランスファーした。それらのメンブランを、PBS、0.05% Tween 20、5%ノンファットドライミルク中で室温にて1時間ブロッティングした。そのブロットを下記の一次抗体と一晩4℃でインキュベーションした。 GFPウサギ（Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg, Germany）、β-Tubulinマウス（Sigma Life Science, Hamburg, Germany）。メンブランの洗浄後、ペルキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギ、又はヤギ抗マウス抗体（Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany）を室温で1時間添加した。その後、メンブランを洗浄し、Western Lightning Plus-ECL検出キット（Perkin Elmer, Rodgan, Germany）で可視化した。
（Ｋ）蛍光顕微鏡分析
NB324K細胞を、6ウェルプレート中で成長させ、その後、上述したように感染させた。72時間後、細胞を1×PBSで二回洗浄し、4℃で4%のパラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、PBSで再び洗浄した。Hoechst 33342色素を使用して核染色を行った。固定された細胞を、Leica DMIL蛍光顕微鏡で調べた。GFP強度を、ImageJソフトウエア（２３）を使用して定量化した。
実施例２．shRNAの送達と発現のための複製可能H-1PVの構築
shRNA発現カセットを持つ（harbouring）複製可能H-1PVウイルスを作り出すための戦略が考えられた。shRNA発現のために、他のカセットの挿入に耐える可能性が最も低いと考えられるPV（最大で300bp）の制限されているDNAパッケージング能力により、前記RNAポリメラーゼIII H1プロモーター（総サイズ170〜180塩基）が使用された。挿入によってなんらかのウイルスORFが破壊されることを回避するために、前記カセットをVP遺伝子（カプシドタンパク質をコードする）の下流側のH-1PV未翻訳領域、即ち、ヌクレオチド4683（前記パルボウイルスゲノム内のHpaI制限酵素部位）に組み込むことを決定した。適当な突出を有するアニーリングされたオリゴヌクレオチド使用することによる前記カセットへのshRNAのクローニングを容易にするためにユニークな制限部位を導入した（図１）。前記カセットの挿入のために、二つの異なるパルボウイルスバックボーン、即ち、全長H-1PVゲノムを含むpSR19 （１９） と、ヌクレオチド2022〜2135を包含する（encompassing）欠失を含むH-1 dr（２０）を使用した。この欠失は、パルボウイルス複製とヒト細胞の感染に干渉せず、従って、外来導入遺伝子の挿入のためのわずかに大きな遺伝子空間を提供する。前記新規プラスミドを、pH-1PV Silencer 1とpH-1PV Silencer 2と命名した。ここで提示される結果は、pH-1PV Silencer 2（以下、pH-1silと略称する）に関するものであるが、他方のプラスミドも使用した場合も類似の結果が得られた。前記新規プラスミドの遺伝子サイレンシングを誘導する有効性をテストするために、高感度緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Florescent Protein （EGFP））（pH-1sil-GFP）をコードする遺伝子に対するshRNAとコントロールshRNA（既知の何れの遺伝子配列も認識しないスクランブルされたshRNA配列）（pH-1sil-control）を導入し、二つのプラスミドをHEK293T細胞に一過的にトランスフェクションした。ポジティブ、及びネガティブコントロールとして、市販のプラスミド、即ち、同じEGFP、又はスクランブルされたshRNAを有するpSilencer 3.1（Ambion, Austin, Texas, USA）を使用した。トランスフェクションの16時間後、細胞を、前記EGFP遺伝子を有する組み換えAd 5ウイルスで感染させた。その後、細胞を、蛍光顕微鏡下で分析した。前記pSilencer 3.1プラスミドと同様、pH-1sil-GFPはEGFPのサイレンシングにおいて非常に効率的であり、その発現を60%以上も低減した（図２）。
前記二つのpH-1silプラスミドを、実施例１に記載した手順に従って、親H-1PVプラスミド（wt）（pSR19）との比較において、パルボウイルス産生のために使用した。Wt、及び変異H-1PVウイルスが類似の力価で産生され、前記カセットの挿入がウイルスの全体の適応度（fitness）に干渉しないことが示された（図３Ａ）。NB324細胞に対するプラーク、及びLDHアッセイによって前記shRNA-含有ウイルスの複製能力、及び細胞溶解を誘導する能力を確認した（図３Ｂ〜Ｃ、及び図４）。これらの新しいウイルスは、H1PV-sil-GFP、及びH-1PV-sil-controlと命名された。
実施例３．H-1PV-silウイルスはshRNAを発現する
次に、H-1PV-silウイルスがshRNAを発現する能力を実証した。NB324K細胞を、H-1PV-sil-GFPとH-1PV wt（ネガティブコントロールとして使用）で感染させた。shRNA発現用のポジティブコントロールとして、前記細胞をpSilencer 3.1 shRNA-EGFPベクターでトランスフェクションした。72時間後、前記細胞のshRNA-GFP含有量を分析した。H-1PV-sil-GFP感染細胞において高レベルのshRNAが検出された（図５Ａ）。
実施例４．H-1PV-silウイルスはEGFP発現をノックダウンできる
次に、H-1PV-silencerのEGFP発現をノックダウンする能力を調べた。NB324K細胞をH-1PV-sil-GFP、又はH-1PV-sil-controlウイルスで感染させ、12時間後、EGFPタンパク質を発現するAd5で重複感染させた。RNA抽出のために処理される前に、更に72時間細胞を増殖させた。定量的リアルタイムPCRは、H-1-sil-GFPで感染された細胞におけるEGFPの発現が、コントロールウイルスに見られる発現と比較して80%以上劇的に低減したことを示した（図５Ｂ）。
タンパク質レベルでのサイレンシング有効性をチェックするために類似の実験を行った。免疫蛍光とウェスタンブロッティング分析との両方によって、コントロールウイルスではなく、H-1PV-silencer-GFPが、EGPF発現のサイレンシングにおいて非常に効率的であり、しかも、それは投与量に依存して効率的であることが確認された（図５ＣとＤ）。
これらのすべての結果は、H-1PV又はその派生体がshRNAの送達のための媒体として使用可能であるという概念の証拠を提供するものである。
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Claims (18)

  1. 細胞中の標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするためのげっ歯類パルボウイルスであって、前記細胞中のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域の制御下で前記パルボウイルスゲノムの未翻訳領域内に発現可能な標的特異性核酸を含み、ここで、前記標的特異性核酸の転写物がRNAiであり、そして、前記細胞中で複製及び増殖可能であることを特徴とするパルボウイルス。
  2. 前記標的遺伝子は、病原遺伝子である請求項１に記載のパルボウイルス。
  3. 前記病原遺伝子は、（ａ）動物に対する病原性を有するウイルス遺伝子、（ｂ）ヒトのガンの原因となる、または発ガンに関与している遺伝子、（ｃ）ガン遺伝子、（ｄ）抗アポトーシス遺伝子、（ｅ）腫瘍細胞成長、転移、血管新生、若しくは化学療法耐性に関係する遺伝子、（ｆ）免疫調節遺伝子、又は（ｇ）サイトカイン、成長因子、酵素、若しくは転写因子をコードする遺伝子である請求項２に記載のパルボウイルス。
  4. 宿主細胞中で複製、及び増殖する能力を有する請求項１〜３の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  5. LuIII、マウス微小ウイルス（MMV）、マウスパルボウイルス（MPV）、ラット微小ウイルス（RMV）、ラットパルボウイルス（RPV）、ラットウイルス（RV）、又はH1（H-1PV）である請求項１〜４の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  6. 前記標的特異性核酸は、パルボウイルスVP遺伝子の下流側の未翻訳領域に挿入される請求項１〜５の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  7. 前記標的特異性核酸は、野生型H-1PVゲノムのヌクレオチド4683に挿入される請求項６に記載のパルボウイルス。
  8. 前記細胞中のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域は、RNAポリメラーゼII（Pol II）、又はIII（Pol III）プロモーターである請求項１〜７の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  9. 前記RNAポリメラーゼ III（Pol III）プロモーターは、RNAポリメラーゼ III H1プロモーターである請求項８に記載のパルボウイルス。
  10. 前記標的特異性核酸は、shRNAである請求項１〜９の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  11. 前記標的特異性核酸は、少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する請求項１〜１０の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  12. （ａ）動物に対する病原性を有するウイルス遺伝子、（ｂ）ヒトのガンの原因となる、または発ガンに関与している遺伝子、（ｃ）ガン遺伝子、（ｄ）抗アポトーシス遺伝子、（ｅ）腫瘍細胞成長、転移、血管新生、若しくは化学療法耐性に関係する遺伝子によって引き起こされる疾患、又は（ｆ）免疫調節遺伝子、若しくは（ｇ）サイトカイン、成長因子、酵素、若しくは転写因子をコードする遺伝子の異常発現に関連する疾患の治療における使用のための請求項１〜１１の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  13. 前記使用は、腫瘍の治療のためである請求項１２に記載の使用のための請求項１〜１１の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  14. 前記使用は、脳腫瘍の治療のためである請求項１３に記載の使用のための請求項１〜１１の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  15. 前記腫瘍の細胞は、化学療法、及び／又は放射線療法耐性である請求項１３又は１４に記載の使用のための請求項１〜１１の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  16. 静脈内（i.v.）、腫瘍内、又は気管支内投与される請求項１２〜１５の何れか一項に記載の使用のための請求項１〜１１の何れか一項に記載のパルボウイルス。
  17. 請求項１〜１１の何れか一項に記載のパルボウイルスを含む細胞。
  18. 請求項１７に記載の細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物。
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