JP2023549218A - ＭｉＲ－３７５－およびｍｉＲ－１制御コクサッキーウイルスＢ３は膵毒性および心毒性を持たないが、結腸直腸癌において強い抗腫瘍効率を有する - Google Patents

Abstract

本発明は、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のＣＶＢ３ゲノムＲＮＡ配列のｃＤＮＡと、組織特異的発現パターンを有する１つまたは複数のマイクロＲＮＡに相補的な少なくとも１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）とを含む、感染性相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）構築物であって、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ＣＶＢ３タンパク質コード配列の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに直接隣接して組み込まれていることを特徴とする、感染性ｃＤＮＡ構築物に関する。

Description

本発明は、医薬用途のための、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）Ｎａｎｃｙ株に由来する新規のｍｉＲ－３７５－およびｍｉＲ－１制御ＣＶＢ３株に関する。

腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、多くの異なるタイプのがんに対する新規の有効な治療法である。腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍有効性は、２つの異なる密接に関連した機序、腫瘍細胞におけるウイルス複製の結果としての腫瘍細胞溶解の誘導、およびその後の段階の免疫原性腫瘍細胞死をもたらす細胞傷害性抗腫瘍免疫応答の誘導に起因する。腫瘍溶解活性はいくつかのＤＮＡおよびＲＮＡウイルスについて示されており、それらのうちの３つ、Ｒｉｇｖｉｒ（Donina et al. 2015）、Ｏｎｃｏｒｉｎｅ（Garber 2006）およびＴ－Ｖｅｃ（Andtbacka et al. 2015）異なる国で承認され、異なる種類のがんの腫瘍溶解治療として商業的に利用可能である。これら以外に、いくつかの他の科のウイルスが既に治験で調べられており、それらのいくつかは近い将来、臨床用途で承認される見込みである。

ピコルナウイルスは、哺乳動物の様々な疾患におけるその重要性により最もよく調べられているウイルスの一つである。腫瘍溶解性ウイルス療法の近年の発達のため、これらのウイルスはがん治療の強力なツールとして利用されている。ピコルナウイルス科（Picornaviridae）のいくつかのメンバーは、前臨床試験および臨床試験で腫瘍溶解活性について評価が行われてきた。それらのうち、セネカバレーウイルス（Seneca Valley virus）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（Theiler's murine encephalomyelitis virus）およびメンゴウイルスは前臨床試験で分析されている。改変された腫瘍溶解性ポリオウイルスＰＶＳＲＩＰＯおよびコクサッキーウイルス（ＣＶ）Ａ２１は、治験で広範にテストされている。ピコルナウイルスは、がん療法での使用にいくつかの利点を有する。特に、その小さなサイズ、急速な複製（６～８時間以内）、多数の子孫、および強い免疫応答の誘導は全てがん療法に有益である。さらに、ピコルナウイルスは、＜１０ｋｂの比較的小さなＲＮＡゲノムを有し、インビトロで転写し、改変しやすい感染性ｃＤＮＡクローンの生成に使用することができる。一本鎖ＲＮＡウイルスであるコクサッキーウイルスグループＢ血清型３型（ＣＶＢ３）はピコルナウイルス科のメンバーであり、いくつかのマウス腫瘍モデルにおいてインビボでヒト肺、子宮内膜および結腸直腸癌の強力な腫瘍溶解活性を有することが近年示されている（例えば（Miyamoto et al. 2012;Hazini et al. 2018）。したがって、ＣＶＢ３は、多くの異なるタイプのがんに対する可能性のある新規の有効な治療法の有望な候補となる。ＣＶＢ３は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とそれに続く単シストロン性ポリタンパク質および３’ＵＴＲをコードする領域からなる、一本鎖ポジティブセンス７．４ｋｂ長のＲＮＡゲノムを有する（Fechner et al. 2011）。

ＣＶＢ３のような腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、正常な細胞を傷つけることなく腫瘍細胞で選択的に複製する、天然に存在するまたは改変されたウイルスと古典的に定義される。ＯＶの上述の定義は理論的な理想的状況を反映している。しかし、それとは全く対照的に、実際には、腫瘍溶解性ＣＶＢ３株の大部分が、それらのウイルスに感染した動物またはヒト対象においてインビボで副作用を誘発することが従来技術のいくつかの試験で見出されている。これは主に、非腫瘍細胞および天然の組織のようなオフターゲット部位のウイルスによる漏出感染（leaky infection）に起因すると思われる。

その結果、ウイルス感染によって引き起こされるウイルス－宿主相互作用および発病をよりよく理解するために、いくつかのＣＶＢ３株がそれらの組織向性および臓器毒性によって特徴付けられた。これらのＣＶＢ３株の中には、非常に心臓作用性の株、例えばＣＶＢ３ Ｈ３、３１－１－３１、Ｍ２、ＨＡまたはＨ３１０Ａ１があるのに対し、いくつかの他の株、例えば、Ｎａｎｃｙは、低心臓作用性であることが見出されている。肝臓に優先的に感染するＣＶＢ３株もある。さらに、ほとんど全ての既知のＣＶＢ３株は膵臓に感染することができる。有望なことには、本発明の発明者らのグループはごく最近、Ｎａｎｃｙ株に由来する実験室株ＣＶＢ３変異株ＰＤは、マウス試験においてインビボで膵臓または心臓に感染しないことが示されたものの、有望なことには確かな抗腫瘍活性を依然として示すことを実証した。しかし、異なる科学者の様々な異なる試験によって示されるように－ＣＶＢ３ ＰＤを例外として－ＣＶＢ３変異株は全て、マウスにおいてインビボでオフターゲット部位にある程度の副作用を引き起こした。これには特に、これらの天然の個々の非腫瘍臓器における軽度の複製および組織損傷から、膵臓および心臓の重度の炎症ならびに致命的疾患に及ぶ膵臓および心臓の感染が含まれた（Miyamoto et al. 2012;Hazini et al. 2018）。これらの観察は、マウスにおいて膵臓はＣＶＢ３に最も感受性の高い臓器であり、ウイルスが他の臓器、例えば心臓に広がっていくＣＶＢ３感染の原発部位であるという知見と一致する。ＣＶＢ３はヒト膵臓（膵炎および糖尿病様症状をもたらす）、および心臓（心筋炎および心筋症をもたらす）にも感染し得ることから、両臓器（膵臓および心臓）の感染は動物に限定されない。

ＣＶＢ３は、インビトロまたは前臨床実験セットアップで広く使用されている。ある特定のＣＶＢ３変異株（ＰＤ変異株はまだテストされなかった）に感染したヒト患者では、これらがインフルエンザ様症状を伴う軽度の疾患を発症することが報告されている。しかし、不幸なことに、ある特定の状況下では全身感染が生じ、心筋炎、膵炎および無菌性髄膜脳炎をもたらし得る。さらに、いくつかのＣＶＢ３は、ヒトにおける炎症性および拡張型心筋症の発症と関連している（Andreoletti et al. 2009）か、またはＣＶＢ３は子どもの重度の感染との関連で記載されている。したがって、ＣＶＢ３株が実際にどの程度安全なＯＶとみなされ得るのかは疑わしいように思われる。一般的に、異なるＣＶＢ３変異株を用いたこれら全ての異なるインビボ試験では、膵臓および心臓はオフターゲット部位として該ウイルスによって最も強く悪影響を受ける臓器である。したがって、選択性を改善し、それによって、それを必要とする対象を治療する医学的利用のためのそのようなＯＶの安全性も改善する大きな関心および必要性がある。

ＣＶＢ３のようなＲＮＡウイルスに関して、「ｍｉＲ媒介ウイルス脱標的化（miR-mediated virus detargeting）」は非常に有効な技術であり、主としてウイルス複製を極めて特異的に腫瘍に限定することができ、したがって腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍選択性を増大する（Kelly et al. 2008）。この方法は、マイクロＲＮＡ誘導ウイルスゲノムサイレンシングに基づく。ＭｉＲＮＡ（以下では「ｍｉＲ」と略す）は、不完全な約７０～８０ヌクレオチド（ｎｔ）ステムループ前駆体からプロセシングされる非コード、約２２ｎｔ二本鎖ＲＮＡ分子である。成熟ｍｉＲＮＡおよびその標的の多くの配列は、植物または動物の間で（進化的）保存されている。それらはいわゆる「種間保存」、例えばｍｉＲ－１およびｍｉＲ－３７５を示す。多くのｍｉＲは、組織または臓器特異的に発現される。これらの成熟ｍｉＲの一方の鎖、いわゆる「ガイド鎖」は、そのｍｉＲ－ＴＳを搭載するように遺伝子組換えされたウイルスのゲノム配列の骨格領域中で相補的塩基対合を通じて相補的な同族ｍｉＲ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）に結合する。配列相補性の程度、すなわち、ｍｉＲとその標的ｍｉＲ－ＴＳとの間でマッチする完全な塩基対（ｂｐ）の程度に応じて、ガイド鎖は、結合標的配列のタンパク質合成の転写後抑制（低いｂｐマッチ）かまたはその触媒分解（高いｂｐマッチ）のいずれかを誘導する。これは、相補的なマッチするウイルスＲＮＡ標的部位（ｍｉＲ－ＴＳ）に対するｍｉＲのガイド鎖を組み込むＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）をウイルスゲノムにガイドすることによって可能になる。この方法では、腫瘍では生じないかまたは腫瘍では不十分にしか発現されない／持続しない組織特異的発現マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列がウイルスゲノムに挿入される。多くのｍｉＲは細胞特異的に発現および組織特異的に発現され、これによりｍｉＲはそのようなゲノムサイレンシングアプローチの有望な候補となる。健康な組織では豊富に発現されるが、がん細胞では非存在であるかまたはあまり発現されない組織特異的発現ｍｉＲに対して相補的なｍｉＲ－ＴＳの挿入は、インビトロでおよび少数の既存の前臨床試験において正常な細胞／組織でのＯＶの望まれない複製を防ぐための強力なアプローチとして示されている。これらの試験ではｍｉＲをｍｉＲ－ＴＳに結合することによって、ウイルスゲノムは、ｍｉＲが発現され、したがってウイルス複製が停止される臓器でもっぱら分解された（高いｂｐマッチ）。ＣＶＢ３のようなプラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスにとって、この技術は特にうまく機能するように思われる。これは、対応するｍｉＲ－ＴＳがウイルスＲＮＡゲノムに挿入された後、ウイルスＲＮＡゲノムはｍｉＲ標的として直接使用されるという事実に基づき得る。

そのようなアプローチの有効性は、異なるウイルスに関する多くの試験によって報告されているとしても、ＣＶＢ３についてはこれまでに、例えば肺がん実体治療で、ウイルス安全性の向上のためにｍｉＲ－ＴＳ を使用するわずかな報告が知られているのみである。これらの試験は、ＣＶＢ３ Ｋａｎｄｏｌｆ（Ｎａｎｃｙ株クローン）ゲノムの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）へのｍｉＲ－１４３ＴＳおよびｍｉＲ－１４５ＴＳの挿入（Liu et al. 2020）、またはＣＶＢ３ Ｎａｎｃｙゲノムの５’もしくは３’ＵＴＲどちらかへのｍｉＲ－３４ａ／ｃ ＴＳの挿入（Jia et al. 2019）が、インビボマウス試験でウイルスの安全性の向上をもたらす一方、ウイルスは肺癌に対するその腫瘍溶解活性を保持することを示した。テストされたそれらのｍｉＲ（ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－３４ａ／ｃ）は、正常な細胞または少なくとも天然の肺組織では、非組織特異的様式で優先的に豊富に発現され、使用された肺腫瘍細胞株の標的化細胞では不十分にしか発現されない。心筋特異的ｍｉＲ－２０６およびｍｉＲ－１３３標的配列を挿入して、心臓での望ましくないＣＶＢ３複製を防止する取り組みが行われ、ある程度成功している（He et al. 2015）。

ｍｉＲ－ＴＳの安定性は、ｍｉＲ制御腫瘍溶解性ウイルスの安全性に寄与する重要な要因である（Kelly et al. 2008）。

さらに、以前に報告されているように、インビボでは感染後、ウイルス感染腫瘍から単離された個々のウイルスクローンがウイルス複製中にヌクレオチド置換を獲得する可能性がある。したがって、ｍｉＲ－ＴＳにおける変異の発生は、実際にはウイルス安全性の潜在的リスクを示す。さらに、例えば、ｍｉＲ－ＴＳ挿入のループ構造の起こり得る形成のため、ｍｉＲ－ＴＳの部分的または完全な欠失が複製中に起きる可能性があり、したがって、複製中にｍｉＲ－ＴＳの領域をスキップすることよりウイルス複製中に失われる可能性がある。複数の同一のまたは高度に同一のｍｉＲ－ＴＳコピー（タンデムリピート）を組み込む場合、ｍｉＲ－ＴＳ挿入のそのような二次ループ構造の形成確率が増加することになる。今度は、タンデムリピートの単一の組み込まれたｍｉＲ－ＴＳコピーから最大でｍｉＲ－ＴＳコピー全体のそのようなスキップ作用の確率は、不利には増加することになる。有害には、ｍｉＲ－ＴＳ内の変異が別のｍｉＲの結合部位を作り出す可能性があり、不要なおよびおそらく深刻な副作用をもたらし得ることも言及されるべきである。そのような事象はこれまで観察されていないにもかかわらず、さらなる調査および改善にはこのことが考慮されなければならない。そのようなリスクを低減するために可能性のある戦略は、ウイルス骨格中のｍｉＲ－ＴＳのコピー数を増やすことである。その理由は、これが、一部のコピー数をインタクトに発現させる確率を統計的に増加させるためである。一方、追加のｍｉＲ－ＴＳコピーはゲノムサイズを増やし、ウイルスパッケージングとそれによってウイルス複製を損ない、したがって最終的にはその腫瘍溶解活性、すなわちウイルスの抗腫瘍効力を損なう可能性がある。したがって、ｍｉＲ－ＴＳコピー数は、ゲノムサイズの増加と十分にバランスが取られなければならない。

これに関して、それらの腫瘍溶解性ＣＶＢ３の副作用の問題を解決しようとして、（Jia et al. 2019）はｍｉＲ－３４ａの標的配列（ｍｉＲ－３４ａＴＳ）の４つのタンデムコピーをＣＶＢ３ゲノムの５’または３’ＵＴＲに挿入した。この修飾の結果、ウイルスは、低下してはいるが依然として検出可能な毒性をマウスで示したが、ウイルス構築物の抗腫瘍有効性は依然として保持された。彼らはまた、ｍｉＲ－３４ａのそれぞれ４つのタンデムコピーを５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲに挿入した。この場合、ウイルス誘導毒性の低下が観察された。（Liu et al. 2020）による別の試験では、腫瘍抑制因子ｍｉＲ－１４５のｍｉＲ－ＴＳのコピー、および腫瘍抑制因子ｍｉＲ－１４３のコピーが別のＣＶＢ３変異株の５’ＵＴＲに挿入された。ウイルスは腫瘍増殖を低減することができたが、ウイルスの毒性は低下した。しかし、ウイルスは、有害には膵臓および心臓で依然として検出可能であり、すなわち、複製および持続していた。本発明の発明者らは、知る限りでは－その理論に束縛されるものではないが－その結果の根底にある理由として、全てのそれらのテストされたマイクロＲＮＡは腫瘍抑制因子マイクロＲＮＡであり、腫瘍抑制因子マイクロＲＮＡはより一般的には、それぞれのｍｉＲ－ＴＳと融合したウイルス構築物を排除するのに膵臓および心臓のような特定の組織では十分高度に発現されないようであるという事実に少なくとも一部分は基づき得ると考える。したがって、ＣＶＢ３変異株構築物中のそれらの腫瘍抑制因子マイクロＲＮＡのコピー数を拡張することなくウイルス複製を完全に阻害することは、それらの先行技術のアプローチでは実現不可能であるように思われる。コピー数の増加は今度はウイルス構築物の全体的な複製障害を引き起こし、したがって、不利なことに、それらのＣＶＢ３－ｍｉＲ－ＴＳ融合構築物の抗腫瘍有効性を損なう原因となる。

しかし、Liu et al., 2020のこれらの腫瘍試験において、ウイルス複製の阻害は膵臓および心臓では不完全でしかないことが見出された。さらに、ｍｉＲ－１４３ＴＳおよびｍｉＲ－１４５ＴＳは不安定であることが見出された。すなわち、それらは、ウイルス治療の過程でｍｉＲ－ＴＳで起こった欠失により、ウイルス治療経過中に失われた。したがって、ＣＶＢ３を含有するｍｉＲ－１４３／ｍｉＲ－１４５ＴＳを用いた治療後３５日および５６日目に死んだマウスの心臓および膵臓における心毒性および膵毒性ならびにポジティブＶＰ１染色のような重度の副作用が該試験で生じた。同様に、Jia et al., 2019の試験では、腫瘍抑制因子ｍｉＲ－３４ａまたはｍｉＲ－３４ｃ ＴＳのそれぞれ膵臓および心臓への挿入後に特定の毒性が生じた。８コピーのｍｉＲ－３４ａＴＳが５’ＵＴＲ（４コピー）および３’ＵＴＲ（４コピー）に挿入された場合、毒性は低かった。遺伝的ウイルス構築物中のｍｉＲ－ＴＳコピー数を増やすデメリットは、これが徐々にウイルス複製の妨害につながることのように思われる。（Jia et al. 2019）では、野生型ウイルスまたは４ ｍｉＲ－ＴＳを有するＣＶＢ３と比べて、ｍｉＲ－ＴＳコピー数を最大８個に増やすと、これはウイルス複製を妨害することが例えば示された（例えば、（Jia et al. 2019）の図４Ｃ）。したがって、それを必要とする対象の腫瘍の治療に適用される場合、ｍｉＲ－ＴＳコピー数を徐々に増やすことはウイルス複製にマイナスの影響を与え得るという推測が生じ、したがって、それらのＣＶＢ３－ｍｉＲ－ＴＳ融合構築物の抗腫瘍有効性に対して有害な結果を招くことにもなる。さらに、組み込まれたｍｉＲ－ＴＳのスキップ事象は、組み込まれた同一のｍｉＲ－ＴＳ配列（タンデムリピート）数の増加により統計的に増加し得る。したがって、がんの治療における先行技術のＯＶの、特に使用されるＯＶの効率および安全性に関する記載された短所を克服することが本発明の目的である。さらに、例えばＣＶＢ３株Ｎａｎｃｙなどの既知の株と比べて、腫瘍溶解効率が実質的に保持された、またはさらには腫瘍溶解効率が改善された、および安全性が改善されたＣＶＢ３の新規の変異株を提供することが本発明の目標である。

この目的は、請求項１に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物によって解決された。さらなる実施形態は、この新規に開発された感染性ｃＤＮＡ構築物の変形形態、およびその感染性ｃＤＮＡ構築物を含むウイルスベクター粒子に関する。さらに、前記感染性ｃＤＮＡ構築物または前記ウイルス粒子を含む医薬組成物、ならびにそれを必要とする対象におけるがんおよび／または転移性がんの治療で使用するための、前記感染性ｃＤＮＡ構築物または前記ウイルス粒子または前記医薬組成物の使用が提供される。

特に、述べられた目標を達成するために、本発明は：
－ コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のＣＶＢ３ゲノム配列と；
－ 組織特異的発現パターンを有する１つまたは複数のマイクロＲＮＡに相補的な少なくとも１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）と
を含む、感染性相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）構築物であって、
少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ＣＶＢ３タンパク質コード配列の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに直接隣接して組み込まれていることを特徴とする、感染性ｃＤＮＡ構築物を提供する。

本発明の意味において「感染性ｃＤＮＡ構築物」は、任意の逆転写ウイルス核酸（例えば、逆転写ウイルスＲＮＡゲノム）の完全な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）か、または前記構築物に感染したがん細胞での溶解反応の生成を可能にする、および／もしくは新たなウイルスの生成を可能にし、次いで細胞で溶解反応を引き起こし、さらに－時として－隣接細胞の感染に向けて放出できる状態にするのに十分なその部分を含むと理解することができる。

ＣＶＢ３のゲノムＲＮＡはプラス鎖ＲＮＡである。本発明の意味において用語「プラス鎖」は、ゲノム配列がコード配列の翻訳開始点に対して順向きに配置されることを意味する。したがって、感染性ｃＤＮＡ構築物の構築のために、この配列が逆転写され、ＰＣＲによって増幅されてＤＮＡ二本鎖を生成した。好ましくは、この二本鎖ｃＤＮＡは、感染性ｃＤＮＡ構築物においてｃＤＮＡバージョンのプラス鎖配列を受け取るようにプラスミドにクローニングされた。

本発明の意味において「ｍｉＲ配列に相補的な少なくとも１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）」は、少なくとも１つのまたはいくつかの異なるｍｉＲ鎖に相補的な同一の（１００％相補的）配列と理解されるべきであり、該配列は－それぞれの標的化組織特異的ｍｉＲが宿主組織細胞中の感染したオフターゲット部位で発現されるならば－宿主細胞のそれぞれの相補的ｍｉＲガイド鎖がｍｉＲ－ＴＳに結合し、したがって、ＲＮＡ干渉／ＲＮＡサイレンシング機構が作用し、したがって、ウイルス複製を妨げ得ることを可能にする。

本発明の代替の実施形態では、少なくとも１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）はｍｉＲ配列に「実質的に」相補的である。本発明の意味において「ｍｉＲ配列に実質的に相補的な」は、それぞれのヌクレオチド配列が、標的ｍｉＲ配列に少なくとも７０％または７５％相補的、８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、および最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相補的であり、両方ともワトソン＆クリック塩基対合によって互いに結合していると理解されるべきである。

本発明の意味において３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、翻訳停止コドンのすぐ下流（５’から３’）に続くメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡのｃＤＮＡのセクションであり、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｃＤＮＡ配列の開始コドンのすぐ上流（５’から３’）に続くメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡのｃＤＮＡのセクションである。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、感染性ｃＤＮＡ構築物は二本鎖環状分子の形態、好ましくはプラスミドの形態にある。プラスミドは有利には、感染性ｃＤＮＡ構築物の安定な複製可能なビヒクルを可能にする。

意図された目的、例えば、それを必要とする対象の腫瘍溶解性がん治療のために、典型的には腫瘍溶解性ウイルスのある特定の量が必要である。本発明とは対照的に先行技術は、治療目的のウイルスＲＮＡ／ＤＮＡを搭載したウイルス粒子を使用する。ＯＶを作製するための従来技術手順によれば、そのようなＣＶＢ３は、ある特定の修飾されたまたは天然に存在する核酸構築物を有している。該核酸構築物は１個のウイルスクローンに起源を持ち、例えば医療用に十分なＣＶＢ３粒子をインビトロで受け取るために標準的な手順によって増殖される。

一般に、ＣＶＢ３は高い変異率で複製し、最終的に十分なウイルス粒子をもたらすのに必要な複数の細胞感染事象としたがって、複製ラウンドがある。その結果、元々の出発ウイルスｃＤＮＡのコピーを有する主要なウイルスクローン変異株の隣に、同時に存在し増殖する個々のウイルス変異体が高い統計的確率で常にある。これは、治療処置を意図した回収されたＣＶＢ３ウイルス溶液が、意図する増殖した元々のウイルスクローンのコピーのみを含有する均一な溶液ではなく、むしろ、意図するクローンの隣に、増殖した遺伝的ウイルスクローン変異体のサブセットも含有する、おそらく非常に異なる遺伝的サブセットを有する不均一な混合物であるという有害な状況をもたらす。これらのウイルス変異体を注射することは、そのような不均一なウイルス溶液で治療される対象に、変異に応じて軽度から重度の有害作用を引き起こす可能性がある。さらに、複製全体はランダムに進むため、異なるウイルス溶液バッチは、主要なウイルス変異株に加えてウイルス粒子変異体の非常に異なる混合物を含有する可能性がある。これはさらに不利なことに、そのようなバッチを使用するそのような治療試験の有意性を下げる可能性がある。その理由は、対象の一部は、他の対象とは異なるバッチのウイルス溶液で治療される可能性が最も高くなる、すなわち、同じではない感染性出発物質を受け取る可能性があり、ウイルス溶液バッチが異なると意図する主要なウイルスのコピー量も関連して異なる可能性が最も高いためである。さらに、適用される治療レジメンに応じて、それを必要とする全く同一の対象が１回より多く治療されなければならないか、またはＣＶＢ３ウイルス溶液の複数回投与を受けなければならない必要があり得、ひいては全く同一のバッチからのウイルス溶液を受け取らない可能性があることを意味する。したがって、治療される対象は、言ってみれば極めて異なるウイルス集団の混合物を含む溶液を受け取ることになる。これはまた、それらの不均一なウイルスバッチ溶液を注射された対象において軽度から重度の有害な副作用を引き起こし、そのような臨床治療データの有意性を下げる可能性があるウイルスサブセットを受け取る確率も高める。

感染性ｃＤＮＡ構築物を有するウイルス粒子の利用およびエラーを起こしやすい増殖とは対照的に、本発明の発明者らは異なるアプローチを提供し、感染性ｃＤＮＡ構築物それ自体を利用する。

これは複数の利点をもたらす：古典的ＣＶＢ３ウイルスは通常、プラスの極性を有する単一プラスセンスＲＮＡ鎖を有する。すなわち、読み取り方向は細胞のｍＲＮＡの読み取り方向に対応する。核酸は、遺伝記憶としても翻訳の鋳型としても使用することができる。感染後、ＣＶＢ３はマイナス鎖ＲＮＡ中間体を生成し、該中間体から、宿主細胞での古典的ウイルス複製に必要とされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒されて、ウイルスプラス鎖ＲＮＡコピーの複数コピーが転写される。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡプルーフリーディング活性を欠き、したがって、コピーされたポリヌクレオチドに導入された誤りは修正されない。エラーの頻度は、１００００ヌクレオチドごとにおよそ単一ヌクレオチド挿入エラー（１×１０^－４）であり、ＣＶＢ３ ｖＲＮＡのおよその長さより少し少ない。したがって、新しく産生されたＣＶＢ３粒子のほぼ一つ一つが他のＣＶＢ３ウイルス粒子と異なるｖＲＮＡ配列を有する。古典的先行技術では、ＯＶを増殖するアプローチは、これらのウイルスマイナス鎖抗ゲノムｃＤＮＡを有するウイルス粒子を利用する。ＣＶＢ３が宿主細胞に感染した後、ｃＤＮＡは、宿主細胞ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）によって触媒されるウイルスのプラス鎖ＲＮＡの複数のコピーに転写される。これは、それぞれのデータソースにより約１×１０^－８～１０^－９から約１×１０^－１０～１０^－１２までの転写エラー率を有する。

対照的に、本発明によるｃＤＮＡクローンを注射するのに利用する場合：ここで、目的のｃＤＮＡクローンの必要な増殖は、当業者に周知の十分に確立された先行技術の方法を使用して高品質な基準下で容易に行うことができる。例えば、ｃＤＮＡ転写物は、例えば高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用して古典的ＰＣＲによって増幅させることができる。高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは、宿主細胞でのウイルス複製に必要とされる古典的な複製酵素と比べて非常に正確なプルーフリーディング機能を含有し、したがって、生じる複製エラーが明らかに少なく、したがって、正確に増殖された均一な感染性ウイルスのｃＤＮＡプールを保証する。

さらに、この手法は、インビトロで極めて複雑な、時間および試薬を費やすウイルス粒子ベースのＯＶの生成方法も簡略化する。これはまた、本発明の感染性ｃＤＮＡクローンが腫瘍細胞に腫瘍内注射され得るか、または既知のベクターウイルスによって腫瘍細胞に輸送され得る場合、医薬品の製造管理及び品質管理基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）ｓｔａｎｄａｒｄｓ）の遵守も簡略化する。さらに、感染性ｃＤＮＡ構築物を含むウイルス粒子を、感染した宿主腫瘍細胞で生成することによって、ウイルス粒子が宿主腫瘍細胞から放出されると、今度は他の腫瘍細胞、例えば直接隣接する腫瘍細胞を感染させることができる。別の利点は、前記古典的な従来技術方法と比べた場合、高価でない実験用試薬および材料が必要となることから、感染性ｃＤＮＡクローンの作製および使用はまたかなり安く、より環境に優しくなることである。

（He et al. 2015）は、ＣＶＢ３ゲノムへのｍｉＲ－ＴＳの挿入部位に関連するいくつかの重要な限界を同定した。実際、ｍｉＲ－ＴＳが翻訳開始のコドンに近い５’－ＵＴＲに挿入された場合、ウイルスは感染性ｃＤＮＡクローンからしか伝播することができなかった。ＩＲＥＳのコア配列の上流の５’－ＵＴＲ（ヌクレオチド２４９位）へのｍｉＲ－ＴＳの挿入、およびヌクレオチド７３８７位または７３５９～７３６０位の３’－ＵＴＲへのｍｉＲ－ＴＳの挿入は、ウイルスに許容されなかった。これらの観察に対する考えられる理由として（He et al. 2015）は、ｍｉＲ－ＴＳがウイルスゲノムの高次（二次）ＲＮＡ構造をおそらく妨害したことを示唆した（He et al. 2015）。少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ＣＶＢ３ポリタンパク質開始コドンのすぐ下流［（５＋）］か、またはＣＶＢ３ポリタンパク質の終止コドンのすぐ下流の３’ＵＴＲのどちらかに挿入される。あるいは、それらはポリタンパク質コード配列の開始コドンの前、すなわち５’ＵＴＲに挿入される。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、３Ｄポリメラーゼのコード配列の終止コドンとＣＶＢ３タンパク質コード配列の３’ＵＴＲとの間に組み込まれている。少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ＣＶＢ３タンパク質コード配列の３Ｄポリメラーゼのコード配列の終止コドンのすぐ下流、およびＣＶＢ３タンパク質コード配列の３’ＵＴＲの前に組み込まれていてもよい。さらに、またはあるいは、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ＣＶＢ３ポリタンパク質開始コドンの直前（５’から３’の上流）の５’ＵＴＲに挿入される。好ましくは、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ウイルスコード配列の３’ＵＴＲ、好ましくはＣＶＢ３コード配列の終止コドンのすぐ下流（５’から３’）およびＣＶＢ３コード配列の３’ＵＴＲの直前に組み込まれている。場合により、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、それぞれが少なくとも５～３０ｂｐ、少なくとも８～３０ｂｐ、または少なくとも１０～３０ｂｐからなる少なくとも１つのスタッファー配列と隣接していてもよい。少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、スタッファー配列と単一方向または両方向に隣接していてもよい。本発明の発明者らは、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが少なくとも１つのスタッファー配列と隣接しており、ｍｉＲ－ＴＳ＋スタッファー配列のこの融合配列が次いでウイルスコード配列の３’ＵＴＲの前、好ましくはＣＶＢ３コード配列の終止コドンのすぐ下流（５’から３’）およびＣＶＢ３コード配列の３’ＵＴＲの直前に組み込まれる場合、これがウイルス複製および再生にプラスの影響を与えるように思われることを確かに見出した。これは、例えばＰＤ－０およびｒＰＤのような、野生型と比べてより低い基本複製効率を示すＣＶＢ３ウイルス株に特に当てはまるように思われる。したがって、今度は、スタッファー配列の欠如がウイルス複製および再生にマイナスに影響し得ると推測することができる。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ヒト膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的であり、および／またはヒト心臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的である。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ヒト膵臓組織特異的発現ｍｉＲ：ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－６９０、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１６ａ、ｍｉＲ－２１６ｂ、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－１４１、および／またはヒト心臓組織特異的発現ｍｉＲ：ｍｉＲ－１、ｍｒｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６からなる群から選択されるｍｉＲ配列に相補的である。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ヒト膵臓組織特異的発現ｍｉＲ－３７５およびヒト心臓組織特異的発現ｍｉＲ－１からなる群から選択されるｍｉＲ配列に相補的である。ｍｉＲ－３７５ＴＳの核酸配列は、５’－ＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡ－３’（配列番号１）を含むまたはそれからなる。ｍｉＲ－１ＴＳの核酸配列は、５’－ＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ－３’（配列番号２）を含むまたはそれからなる。

好ましくは少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ウイルスコード配列の３’ＵＴＲ、好ましくは３’ＵＴＲの終止コドンのすぐ下流（５’から３’）に組み込まれている。本発明の発明者らは、ウイルスのポリタンパク質をコードする感染性ｃＤＮＡ構築物のｃＤＮＡ領域の３’ＵＴＲにｍｉＲ－ＴＳの挿入を有する該構築物を有するウイルスを腫瘍内に注射すると、全体的なＣＶＢ複製またはＣＶＢ３ウイルス増殖を著しく損なうことはないが、ｃＤＮＡ構築物に感染した腫瘍細胞増殖の抑制を可能にし、一方で膵臓または心臓組織細胞に影響を与えない（感染性ｃＤＮＡ構築物はごくわずかに測定されるかまたは測定できなかった）ことを見出した（図４参照）。

ウイルス粒子にパッキングされた、ヒト膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲに相補的なｍｉＲ－ＴＳ（ｍｉＲ－３７５ＴＳ）を含む感染性ｃＤＮＡ構築物を使用すると、本発明の発明者らは、結腸直腸腫瘍皮下移植マウスの天然の非腫瘍膵臓組織および心臓組織において、ウイルスがインビボで効率的に複製できないことを、それらの感染性ｃＤＮＡ構築物が有利には確保することを明白に示すことができた（例えば、図５Ｃ、Ｅ、Ｋ参照）。これらの観察は、マウスにおいて膵臓はＣＶＢ３に最も感受性の高い臓器であり、ウイルスが他の臓器、例えば心臓に広がっていくＣＶＢ３感染の原発部位であるという知見と一致する。したがって、ヒト膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲに相補的なｍｉＲ－ＴＳを含む本発明のｃＤＮＡ構築物を利用することによって、心臓組織もまたＣＶＢ３ウイルス複製から有益なことに保護され得る。

注目すべきことに、ウイルス複製から心臓組織を保護するこの効果は、ヒト膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的な少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳ、さらに、ヒト心臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的な少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳと同時に使用する場合に、さらにより顕著であることが有利には見出された（例えば、図５Ｅ、Ｈ参照）。

さらに、本発明者らは、ヒト膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲに相補的なｍｉＲ－ＴＳ、および／またはこれらのｍｉＲの低発現状態を示す、もしくはこれらのｍｉＲが欠けている宿主細胞のヒト心臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的なｍｉＲ－ＴＳを含む前記記載の裸の感染性ｃＤＮＡ構築物（ウイルスカプシドがない）を注射すると、これらはそれらの宿主細胞で複製し、前記感染性ｃＤＮＡ構築物を含む感染性ウイルス粒子を生成できることを示すことができた（図２参照、およびデータ未掲載）。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、二重、三重、四重、五重もしくはより多重の反復または反復カセットとして存在している。反復は「タンデムリピート」の形態であってもよい。タンデムリピートは、反復される単一反復単位を示す比較的短いヌクレオチド配列と理解されるべきであり、該反復単位は互いに直接隣接しているか、またはそれらを隔てる短いヌクレオチドスペーサー配列とのみ連結される。

本発明による「ｍｉＲ－ＴＳの反復カセット」は、１つのｍｉＲ－ＴＳの後に、別のｍｉＲに向けられる別の異なるｍｉＲ－ＴＳが続くことを意味する。本発明の意味において「続く（ｆｏｌｌｏｗｅｄ）」は、両方のｍｉＲ－ＴＳが互いに直接隣接して連結されるか、またはそれらを隔てる短いヌクレオチドスペーサー配列とのみ連結されることを本明細書では意味する。両方のｍｉＲ－ＴＳおよび結局は存在するスペーサー配列は、反復カセットの単位を共に構築する。本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の好ましい実施形態によれば、反復カセットは、ヒト膵臓組織特異的発現ｍｉＲ－ＴＳからなる群から選択されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ－３７５）に相補的なｍｉＲ－ＴＳと、それに続く、ヒト心臓組織特異的発現ｍｉＲ－ＴＳからなる群から選択されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ－１）に相補的なｍｉＲ－ＴＳによって構築される。本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の代替の好ましい実施形態によれば、反復カセットは、ヒト膵臓組織特異的発現ｍｉＲ－ＴＳからなる群から選択されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ－３７５）に相補的なｍｉＲ－ＴＳの二重反復と、それに続く、ヒト心臓組織特異的発現ｍｉＲ－ＴＳからなる群から選択されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ－１）の単一または二重反復によって構成される。

本発明によるスペーサー配列は、例えば１～１６ｎｔ、３～１０ｎｔ、３～１６ｎｔ、３～１５ｎｔ、４～８ｎｔ、４～６ｎｔまたは４～５ｎｔの短いヌクレオチド（ｎｔ）配列からなり得る（例えば、それぞれの図のキャプションと一緒に図１Ｂまたは図６Ｂを参照のこと）。各ｍｉＲ－ＴＳ間に挿入されたスペーサー配列は同族成熟ｍｉＲ結合を改善し、したがってＲＮＡサイレンシング効率を改善する可能性がある。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、少なくとも一重から最大四重、少なくとも二重から最大四重、または好ましくは少なくとも一重から最大三重として存在している。本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、少なくとも二重から最大三重の反復または反復カセットとして存在している。

上述のように、ｍｉＲ－ＴＳの安定性は、ｍｉＲ制御腫瘍溶解性ウイルスの安全性に寄与する重要な要素である。しかし、ｍｉＲ－ＴＳにおける変異の発生は、実際にはウイルス安全性の潜在的リスクとなる。本発明の発明者らは、長期感染後（初感染の３２日後）に、ｍｉＲ－３７５ＴＳの３つのコピーを含むＨ３Ｎ－３７５感染腫瘍、ならびにｍｉＲ－３７５ＴＳの２つのコピーおよびｍｉＲ－１ＴＳの２つのコピーを含むＨ３Ｎ－３７５／１感染腫瘍から単離された個々のウイルスクローンが、マウスのＯＶ治療中にインビボでヌクレオチド置換を獲得し得ることを見出した。しかし、ｍｉＲ－ＴＳ変異を有するそのような各ウイルスでは、１つのｍｉＲ－ＴＳおよびその１つのコピーしかこの種の変異によって影響を受けず、その結果、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳでは少なくとも２つのｍｉＲ－３７５ＴＳ、ならびにＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳでは少なくとも１つのｍｉＲ－３７５ＴＳおよび少なくとも１つのｍｉＲ－１ＴＳがインタクトなままであることが見出された。したがって、興味深いことに、ｍｉＲ－ＴＳの少なくとも二重反復は、膵臓および心臓におけるウイルス複製の防止をそれぞれ維持するのに明らかに十分であり、これは長期ＯＶ治療下でさえ十分であることを示している。すなわち、感染性ｃＤＮＡ構築物のｍｉＲ－ＴＳの遺伝的安定性を保証し、それによってウイルスの安全性を高め、一方で同時にウイルス粒子の遺伝子配列長を増やさず、したがってウイルス粒子複製に著しい影響を与えない。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、ウイルスコード配列をコードするｃＤＮＡの骨格の発現は：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴｐ）；癌胎児性抗原抗原（ＣＥＡ）およびチロシナーゼ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター（ＰＳＡ）、ＤＦ３／ＭＵＣ１プロモーター、Ｔｃｆ反応性プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ラットプロバシンプロモーター、ＩＡＩ．３Ｂプロモーター、オステオカルシンプロモーター、Ｌ－プラスチンプロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、ミッドカインプロモーター、Ｅ２Ｆ－１プロモーター、ＨＩＦ－１反応性プロモーター、エストロゲン－低酸素二重プロモーター（ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｈｙｐｏｘｉａ ｄｕａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）等からなる群から選択される腫瘍特異的プロモーターの制御下にある。これによって、感染性ｃＤＮＡ構築物の複製は、そのプロモーター利用のための転写因子を発現する腫瘍細胞にさらにより選択的に限定され、したがって、ＯＶの治療的安全性をさらに高めるであろう。

本発明の実施形態によれば、ｃＤＮＡ構築物は：多重クローニング部位、複製起源、および導入遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数の配列エレメントをさらに含み、これらのさらなる配列はｃＤＮＡ構築物の骨格に組み込まれている。導入遺伝子は、選択遺伝子または治療上興味深いｃＤＮＡまたは他の小さなＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ転写物を含んでもよく、それらは全て当業者に周知である。そのような導入遺伝子の例は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２４、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）のような免疫系刺激導入遺伝子または腫瘍毒性遺伝子である。

腫瘍毒性遺伝子は、腫瘍細胞で発現されるものの毒性を明らかにすると理解されるべきであり、ｐ５３、大腸腺腫症腫瘍抑制遺伝子およびＢＲＣＡ１のような腫瘍抑制遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）および単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）のような自殺遺伝子、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）およびＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）のようなアポトーシス誘導遺伝子、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびネオ抗原および血管新生阻害剤、例えばアンジオスタチン、トロンボスポンジン、血小板第４因子、ならびに肝細胞増殖因子アンタゴニストＮＫ４からなる群から選択される。別の実施形態によれば、本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物および／またはＣＶＢ３群ウイルスのゲノム配列は、複製コンピテントＣＶＢ３ウイルスおよび／またはベクター由来ウイルス粒子をコードする。

主として、本発明による「コクサッキーウイルスＢ３群（ＣＶＢ３）」は、既知のおよび分類されたＣＶＢ３ウイルスならびにまだ分類されていないＣＶＢ３ウイルスを含む任意のコクサッキーウイルスＢ３群ウイルスであってもよい。ＣＶＢ３は、両方のプロトタイプおよび臨床的に単離されたウイルスの両方からなる群から選択されてもよい。ＣＶＢ３は天然に存在していてもよく、または「その修飾形態」であってもよい。天然の供給源から単離することができ、実験室で意図的に修飾（「修飾形態」）されていない場合、コクサッキーＢ３群ウイルスは「天然に存在する」－例えば、ＣＶＢ３はヒト患者から得られてもよい。

国際公開第２０１９／０６３８３８号パンフレットでは本発明の発明者らは、ＣＶＢ３株ＰＤ－０がインビボでマウスに投与される場合、その抗腫瘍効率に関連しながら、心臓および膵臓を含むいずれのオフターゲット部位でも複製しないことから、ＣＶＢ３株ＰＤ－０を有望なＯＶと同定した。したがって、本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の好ましい実施形態によれば、ＣＶＢ３のゲノム配列は、公開されている参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０６３８３８号パンフレットに詳細に－例えばゲノム配列－記載されているＮａｎｃｙ株、ＰＤ、例えば、ｒＰＤ（組換えＰＤ－０ ｃＤＮＡクローン）またはその修飾形態に由来する弱毒化ＣＶＢ３群ウイルス株から選択される。ＣＶＢ ＰＤ－０は、ウイルスカプシドタンパク質１（ＶＰ１）のアミノ酸残基Ｋ７８、Ａ８０、Ａ９１、およびＩ９２、ならびにウイルスカプシドタンパク質３（ＶＰ３）のアミノ酸残基Ｍ３４およびＹ２３７の両方からなるアミノ酸残基の交換を含む。

本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の好ましい実施形態によれば、修飾ＣＶＢ３ ＰＤ－０形態のゲノム配列は、国際公開第２０１９／０６３８３８号パンフレットに詳細に記載されているｒＰＤ_ＨｉＦｉおよびｒＰＤ－ｅＧＦＰから選択される組換えｃＤＮＡクローンである。

抗腫瘍活性に関する異なるＣＶＢ３ウイルス株の不均一性を考慮すると、例えば、ｍｉＲ－３７５またはｍｉＲ－３７５／ｍｉＲ－１を搭載したｒＰＤは、Ｈ３ウイルスを使用する各ｍｉＲ－ＴＳを搭載したアプローチと比べて、腫瘍細胞傷害性を可能にすることに関して同等またはさらにより有効であることが驚くべきことに見出された。また、正常な組織において他の受容体指向性を有し、ＰＤより傷害性であるＣＶＢ３変異株もＯＶの潜在的候補であり、興味深い焦点となり得る。しかし、それらの複製能力は、膵炎および心筋炎および全体的なオフターゲット部位細胞感染ならびに溶解事象のリスクのため、本発明のｍｉＲ－ＴＳ戦略、例えばｍｉＲ－３７５ＴＳおよびｍｉＲ－１ＴＳ脱標的化を利用する例えばｍｉＲ脱標的化によって大幅に低減されなければならない。最近、本出願者の研究グループはその概念を証明することができた。さらに、本出願者の研究グループは、後者のコード配列がｍｉＲ－３７５ＴＳと融合される場合、ＰＤ－０（例えばｒＰＤ）は攻撃型Ｈ３ ＣＶＢ３変異株と同等の抗腫瘍効率を有し、膵臓におけるＨ３ウイルスの複製を停止し、したがって、腫瘍組織へのウイルスのさらなる余分な分布を停止することを発見した（（Hazini et al. 2021）参照）。したがって、本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の実施形態によれば、ＣＶＢ３のゲノム配列は、攻撃型ＣＶＢ３群ウイルス株ＰＤ、ｒＰＤ、Ｎａｎｃｙ、Ｈ３、３１－１－９３、ＲＤ、Ｐ ２０３５Ａ、２８、ＨＡおよびＧＡから選択され、ＣＶＢ３のゲノム配列は、それらの株のうちの１つのヌクレオチド配列、またはそれらのＣＶＢ３株のうちの１つのゲノム配列を含むヌクレオチド配列によって定義される。

非常に有望なことに本発明の発明者らは、ヒト結腸直腸癌のヌードマウスモデルにおいて膵臓特異的発現ｍｉＲ－３７５（３つのコピー－Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ）または別のアプローチでは膵臓特異的発現ｍｉＲ－３７５（２つのコピー）および心臓特異的発現ｍｉＲ－１（２つのコピー）（Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ／１ＴＳ）のｍｉＲ－ＴＳコピーをウイルスに搭載することによって、非常に毒性のＣＶＢ３株の病原性が予防され得ることを示すことができた。さらに、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ／１ＴＳアプローチの４匹のテスト腫瘍担持動物のうち３匹が、有望なことにウイルス血症を示し、１匹は血中ウイルス力価を全く示さなかった（図５Ｉ参照）。さらに、特に、３つのウイルス感染腫瘍の完全寛解のため、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ担持ウイルス粒子（ｍｉＲ－３７５ＴＳの３つのコピーを有する）で治療された４匹全ての試験動物のＨ３Ｎ－３７５ＴＳ力価は１つの腫瘍でのみ決定された。これは明らかに、意図された標的部位（腫瘍）でのこれらのｍｉＲ－ＴＳ担持組換えＨ３変異株のインビトロでの有望な強い選択的抗腫瘍活性を示すものであるが、同時にそれらは、全てのテスト非腫瘍組織がウイルスに著しく影響を受けない（ウイルス複製が検出されない、ウイルス媒介細胞傷害性が検出されない）ままであったことから、オフターゲット部位に影響しないかまたは著しくは影響しない。これらの知見とは著しく対照的に、親ＣＶＢ３株Ｈ３の単回投与は腫瘍内ウイルス投与の４日後にマウスが瀕死の状態になる原因となり、ｍｉＲ－ＴＳ搭載ウイルスＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの３回注射はウイルス誘発疾病を引き起こさなかった。重要なことには、ウイルスは長期治療後にインビボでのその腫瘍溶解性活性を保持し、予め移植された結腸直腸癌の増殖を効率的に低減した。

さらに、本発明の別の目的は、本発明によるｃＤＮＡ構築物を含む感染性ウイルス粒子の提供である。このウイルス粒子は、コクサッキーウイルス、特にＣＶＢ３ウイルスに由来してもよいが、任意の他の適切なベクターまたは担体ウイルスでもあってもよい。

本発明の意味において「感染性ウイルス粒子」またはウイルスは、ウイルス感染がん細胞での溶解反応の生成を可能にする、および／または新たな感染性ウイルスもしくはウイルス粒子の生成を可能にし、次いで細胞で溶解反応を引き起こし、放出されるとさらに－時として－隣接細胞を感染させることになる本発明に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物を含むと理解されるべきである。

さらなる別の態様によれば本発明は、本発明による感染性ｃＤＮＡおよび／または本発明によるウイルス粒子ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物に関する。

本発明の薬理学的組成物による適切な薬学的に許容される賦形剤、希釈剤および担体は、当業者に周知である。簡単には、薬学的に許容される担体または希釈剤の例は、脱塩水または蒸留水；生理食塩水；植物ベースの油、例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油（sesame oils）、ラッカセイ油、またはヤシ油；ポリシロキサン、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；鉱油、例えば流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクアラン；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース；低級アルカノール、例えばエタノールまたはイソプロパノール；低級アラルカノール（lower aralkanol）；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコールまたはグリセリン；脂肪酸エステル類、例えばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴムまたはアカシアゴム、およびワセリンである。典型的には、担体は、薬理学的組成物の１０～９９．９重量％を形成するであろう。

非経口投与可能な組成物を調製するための方法は当業者に明らかであり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.により詳細に記載されている。

経口使用のための適切な担体、希釈剤、賦形剤および補助剤のいくつかの例としては、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが挙げられる。さらに、これらの経口製剤は、適切な香味剤および着色剤を含有してもよい。カプセル形態で使用される場合、カプセルは、分解を遅らせる化合物、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルで被覆されてもよい。

薬理学的組成物は、任意の適切な界面活性剤、例えばアニオン、カチオンまたは非イオン界面活性剤、例えばソルビタンエステルもしくはそのポリオキシエチレン誘導体を包含してもよい。懸濁剤、例えば天然ゴム、セルロース誘導体または無機材料、例えば珪質シリカ（silicaceous silica）、および他の成分、例えばラノリンも含まれ得る。

本発明はさらに、少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳに相補的な組織特異的発現を含むｍｉＲ配列が、発現状態が低いかまたはないがんおよび／または転移性がんにおけるそれぞれの発現状態と比べて、前記組織でそれぞれ高度に発現される、がんおよび／または転移性がんの治療で使用するための、本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物、本発明の感染性ウイルス粒子または本発明の医薬組成物を包含する。

がんおよび／または転移性がんの治療で使用するための前記感染性ｃＤＮＡ構築物、感染性ウイルス粒子または医薬組成物の実施形態によれば、がんは、結腸直腸がん（大腸がん）、乳がん、肺がん、肝臓がんおよび／または上述のがんの対応する転移からなる群から選択される。

がんおよび／または転移性がんの治療で使用するための前記感染性ｃＤＮＡ構築物、感染性ウイルス粒子または医薬組成物の好ましい実施形態によれば、がんは、結腸直腸がんおよび対応する転移または肺がんおよび対応する転移からなる群から選択される。

本発明の別の実施形態によれば、ウイルス用量の範囲は、約５×１０^５～約１×１０^８プラーク形成単位（ＰＦＵ）、好ましくは約１０^６～約１×１０^７ＰＦＵ、および最も好ましくは約３×１０^６～約１×１０^７ＰＦＵである。腫瘍のサイズ、患者の応答、腫瘍退縮率およびまた患者の体重に応じて、ウイルス用量の適用が２回、３回、または４回投与されることも提供される。典型的には、７０ｋｇの患者に対して約４．５×１０^６ＰＦＵ／ｋｇの用量が検討されるべきである。

本発明による治療目的のため、前記感染性ｃＤＮＡ構築物、前記感染性ウイルス粒子または前記医薬組成物および上述の組合せは、単回投与かまたは複数回投与のどちらかでそれを必要とする対象に投与され得る。複数回投与は、同時にまたは連続的に投与されてもよい（例えば、数日間または数週間にわたって）。典型的には、治療的適用では、治療は疾患状態の継続期間中、例えば、少なくともそれぞれのがんが従来の手段によってもはや検出できなくなるまでとなろう。典型的な治療レジメンは先行技術で公知である。

本発明によれば「必要とする対象（subject in need）」は、本発明による治療を必要とする任意の哺乳動物であってもよい。対象は、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトを含む、社会的、経済的または研究上重要なヒトまたは任意の種の個体であってもよい。本発明の好ましい実施形態では、必要とする対象はヒトである。

それを必要とする前記対象への投与の様式は、経口、腫瘍内、腫瘍周辺、静脈内、腹腔内および／または筋肉内投与であってもよい。

本発明によれば、前記感染性ｃＤＮＡ構築物、前記感染性ウイルス粒子または前記医薬組成物および上述の組合せは、それを必要とする個々の対象のそれぞれのがんに投与され得る。異なる血清型および／または異なる株および／または異なる種および／または異なるＣＶＢ３ウイルスの属、例えば異なる種の動物由来のＣＶＢ３ウイルスの組合せも、代替的に使用され得る。所望であれば、ＣＶＢ３は、例えば、新生物への投与前のプロテアーゼ、例えばキモトリプシンまたはトリプシンによる処理によって、化学的または生化学的に前処理されてもよい。そのような前処理はウイルスの外皮の除去につながり、したがって、ウイルスの感染力の改善をもたらし得る。少なくとも２つの異なるウイルス粒子の組合せ、および少なくとも２つの異なる感染性ｃＤＮＡ構築物の組合せも投与することができる。また、少なくとも１つのウイルス粒子と前記少なくとも２つの異なる感染性ｃＤＮＡ構築物の組合せが投与されてもよい。そして、前記少なくとも２つの異なるウイルス粒子と、少なくとも１つの感染性ｃＤＮＡ構築物との組合せが投与されてもよい。感染性ＣＶＢ３ ｃＤＮＡ構築物および／またはＣＶＢ３ウイルス粒子は、他の追加のＣＶＢもしくはベクターウイルス、または異なる修飾ＣＶＢウイルスをコードする追加の感染性ｃＤＮＡ構築物と組合せて投与または適用されてもよい。

参考文献

結腸直腸がん細胞におけるｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１発現ならびにｍｉＲ－３４ａ発現、ならびにｍｉＲ－ＴＳウイルスの構造およびＨｅＬａ細胞におけるそれらの複製を示す図である。 Ａ．結腸直腸癌細胞におけるｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１の発現。示された結腸直腸癌細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、膵臓ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞および胚性マウス心筋細胞（ＥＭＣＭ）、ならびにマウス臓器におけるｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１の相対的発現レベル。発現レベルは定量ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。各ｍｉＲ発現レベルは、内因性Ｕ６ ｓｎＲＮＡ発現のレベルに対して正規化し、１に設定された膵臓のｍｉＲ－３７５レベル（左の図）および心臓のｍｉＲ－１発現レベル（右の図）と比べて示されている。データは、それぞれが３連の３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。 Ｂ．本発明のＣＶＢ３変異株Ｈ３、ｍｉＲ－ＴＳ担持ＣＶＢ３－Ｈ３変異株およびｍｉＲ－ＴＳ構築物配列の構造（それぞれの成熟同族ｍｉＲとの完全な塩基対合を示すＲＮＡコードで表された（図１Ｃ参照）；感染性ｃＤＮＡ構築物ではＵ（ウラシル）がＴ（チミン）によって置き換えられている）。上のパネル：ｍｉＲ－３７５番号（１および２）黒）、ｍｉＲ－１（番号（２）ライトグレー）およびｍｉＲ－３９（（３）白抜きのバー）の標的部位（ＴＳ）、ウイルス名ならびにウイルス用途の図。ｍｉＲ－ＴＳ配列は、３Ｄポリメラーゼの終止コドンのすぐ後、ＣＶＢ３変異株Ｈ３のウイルスゲノムの３’ＵＴＲ領域に挿入した。３つの異なるｍｉＲ－ＴＳ担持ＣＶＢ３変異株を作製した；ｍｉＲ－３７５の標的部位の３つのコピーを含有するＨ３Ｎ－３７５ＴＳ、ｍｉＲ－３７５の標的部位の２つのコピーおよびｍｉＲ－１の標的部位の２つのコピーを含有するＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ、ならびに哺乳動物細胞では発現されないｍｉＲ－３９の標的部位の３つのコピーを含有する対照ウイルスＨ３Ｎ－３９ＴＳ。下のパネル：それぞれのｍｉＲ－ＴＳの配列。各ｍｉＲ－ＴＳは下線が引かれ、大文字で書かれている。４～８個のヌクレオチドのスペーサー配列（イタリック体および小文字で示された）を各ｍｉＲ－ＴＳ間に挿入して、ｍｉＲ結合を改善した。各ｍｉＲ－ＴＳコピーの配列は、同族成熟ｍｉＲの完全長配列に対する１００％相同体を有する。下のパネル（ヌクレオチド配列）：（１）－配列番号３；（２）－配列番号４；（３）－配列番号５。 本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物の核酸配列は：５’－ＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｔａｔａＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｇｃｇｃＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＡＡＡ－３’（配列番号６、ｍｉＲ－３７５ＴＳ構築物）を含む核酸配列、または：５’－ＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｔａｔａＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｇｃｇｃＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡ－３’（配列番号７、スタッファー配列がないｍｉＲ－３７５ＴＳ構築物）を含む核酸配列、または：５’－ＡＧＣＧＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｔａｔａＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｇｃｇｃＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡａｇｇｃｃｔａｔＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ－３’（配列番号８；ｍｉＲ－３７５ＴＳ／ｍｉＲ－１ＴＳ構築物）を含む核酸配列、または：５’－ＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｔａｔａＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡｇｃｇｃＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡａｇｇｃｃｔａｔＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ－３’（配列番号９；スタッファー配列がないｍｉＲ－３７５ＴＳ／ｍｉＲ－１ＴＳ構築物）を含む核酸配列によって定義される。 配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９に関して：存在するとすればスタッファー配列はイタリック体で書かれる大文字を有する。各ｍｉＲ－ＴＳは下線が引かれ、大文字で書かれている。４～８個のヌクレオチドのスペーサー配列（イタリック体および小文字で示された）。配列番号８および配列番号９の最後のスペーサー配列（ａｇｇｃｃｔａｔ）は、ａｇｇｃａｔによって置き換えることもできる。配列番号６および配列番号７の最後のスペーサー配列（ｇｃｇｃ）は、（ｇｃｇｔ）によって置き換えることもできる。 本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物のコクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のゲノム配列は：

を含むＣＶＢ３ Ｈ３の核酸配列によって定義される。
あるいは、本発明の感染性ｃＤＮＡ構築物のコクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のゲノム配列は、ＣＶＢ３ ＰＤ－０、例えば：

を含むＣＶＢ３ ｒＰＤの核酸配列によって定義される。
Ｃ．ｍｉＲ－３７５とｍｉＲ－３７５ＴＳとの間、およびｍｉＲ－１とｍｉＲ－１ＴＳとの間の配列比較。ヌクレオチド配列：成熟ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５ － 配列番号１２；ｍｉＲ－３７５ＴＳ － 配列番号１３；成熟ｈｓａ－ｍｉＲ－１ － 配列番号１４；ｍｉＲ－１ＴＳ － 配列番号１５。
Ｄ．ＨｅＬａ細胞におけるｍｉＲ－ＴＳ搭載ウイルスの複製動態。ＨｅＬａ細胞をそれぞれのウイルスのＭＯＩ ０．１で感染させ、感染後（ｐ．ｉ．）４、２４、４８および７２時間で採取した細胞ライセートでプラークアッセイを行って、ウイルスの力価を決定した。データは、それぞれが３連の３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。
Ｅ．ＨｅＬａ細胞におけるｍｉＲ－ＴＳウイルスおよび親ＣＶＢ３－Ｈ３変異株のプラーク形態。全てのウイルスが類似したプラークサイズを示した。
Ｆ．ｍｉＲ－３４ａの発現レベル。様々なヒト結腸直腸癌細胞株（Ｃｏｌｏｎ－２６、Ｃａｃｏ－２、ＬＳ１７４Ｔ、Ｃｏｌｏ３２０、Ｃｏｌｏ６８０ｈ、ＤＬＤ１、Ｃｏｌｏ２０５）、マウス膵臓および心臓におけるｍｉＲ－３４ａの相対的発現レベル。定量化はｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した。各ｍｉＲ発現レベルを、同じ試料中のＵ６ ＲＮＡの発現レベルに対して正規化した。膵臓のｍｉＲ発現レベルを１に設定した。注記：心臓のｍｉＲ－１発現レベルおよび膵臓のｍｉＲ－３７５発現レベルと比べて、ｍｉＲ－３４ａの発現は両方の臓器でそれぞれ約１００分の１および３０分の１であった（結果未掲載）。
インビトロでのｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１によるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの阻害を示す図である。 Ａ．ｍｉＲ－３７５またはｍｉＲ－１を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるｍｉＲ－ＴＳ複製の阻害。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｍｉＲ－１もしくはｍｉＲ－３７５発現プラスミドまたはＧＦＰを発現する対照プラスミドをトランスフェクトした。２４時間後、細胞を０．１のＭＯＩでＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳまたはＨ３Ｎ－３９ＴＳに感染させた。２４時間後、細胞培養物の凍結および解凍によってウイルスを放出し、ウイルス子孫の生成をプラークアッセイによって決定した。 Ｂ．ｍｉＲ－３７５を内因的に発現するＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞におけるｍｉＲ－ＴＳ複製の阻害。ヒト膵臓ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞を１のＭＯＩでＨ３Ｎ－３９ＴＳ、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳまたはＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳに２４時間感染させ、Ａに記載したようにウイルスを放出し、プラークアッセイを実行した。 ヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ－１におけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの複製および細胞傷害性を示す図である。 Ａ．増殖動態。示されたウイルスのＭＯＩ １（上の図）または０．０１（下の図）でＤＬＤ－１細胞を感染させ、試料をｐ．ｉ．４時間、２４時間、４８時間および７２時間で採取し、ウイルス子孫の生成をプラークアッセイによって測定した。 Ｂ．感染後のＣＶＢ３ ＶＰ１および細胞ＣＶＢ３標的遺伝子の発現。左のパネル：ＤＬＤ－１細胞に示されたウイルスをＭＯＩ １０で接種した。２４時間後、ＣＶＢ３ ＶＰ１ならびに細胞タンパク質ｅＩＦ４Ｇ、切断型ｅＩＦ４Ｇ、カスパーゼ３、切断型カスパーゼ３、ＰＡＲＰおよび切断型ＰＡＲＰについてウエスタンブロッティングによって細胞を分析した。内部ローディング対照はγ－チューブリンであった。モック（Ｍｏｃｋ）：未処理細胞。右の図：示された遺伝子の発現の定量化は、ＩｍａｇｅＪデンシトメトリーソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij）を使用するデンシトメトリー分析によってγ－チューブリンの発現と比べて実行した。ａＵ、任意単位。 Ｃ．細胞傷害性。細胞を１、１０および１００のＭＯＩで示されたウイルスに感染させ、２４時間、４８時間および７２時間後、細胞生存率をＸＴＴアッセイで決定した。モック：未処理細胞。 Ａ．～Ｃ．：データは、３連（ＡおよびＣ）または２連の（Ｂ）のどちらかの２つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。 Ａ．、Ｃ．：有意性：ＣＶＢ３－Ｈ３で処理した細胞と比べた^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．、非有意。 皮下ＤＬＤ－１細胞腫瘍を有するマウスにおけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの生体内分布および複製を示す図である。 Ａ．異なるマウス組織およびＤＬＤ－１細胞腫瘍におけるｍｉＲ－ＴＳウイルスの複製。ＤＬＤ－１細胞腫瘍をＢａｌｂ／Ｃヌードマウス（各群ｎ＝４）の両側腹部で確立し、腫瘍が直径約０．５ｃｍに達したとき、示されたｍｉＲ－ＴＳウイルス３×１０^６ｐｆｕを腫瘍内注射した。感染後４日目で動物を屠殺した。ウイルス量を心臓、脾臓、肝臓、および脳ならびに注射腫瘍および非注射対側腫瘍のプラークアッセイによって決定した（左の図）。膵臓では、ｑＲＴ－ＰＣＲによってウイルスコピー数を決定した（右の図）。注記、分析の時点で、Ｈ３Ｎ－３９ＴＳ対照ウイルスに感染した動物全てが瀕死の状態であったのに対し、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ－およびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスで見られた有害作用はなかった。１匹の動物（Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳまたはＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ治療群の各々）の対側非注射腫瘍は発生しなかった。データは、動物ごとにおよび各群の中央値として示されている。 Ｂ．膵臓および心臓の組織学的検査。屠殺した動物の膵臓および心臓の組織試料をホルマリンで固定し、Ｈ＆Ｅで染色した。画像：示されているのは、各ウイルス感染群からの動物の代表的なスライドである。対照：未治療動物。トップが開いている矢印：ランゲルハンス島；トップが塗りつぶされた矢印：膵管；膵外分泌部の壊死断面；黒星、膵外分泌部インタクトな腺房細胞。図。膵臓および心臓の病理学的変化の程度は、０（なし）～５（高い）の範囲の採点システムによって決定した。データは動物ごとにおよび各群の平均値として示されている。膵臓の完全な破壊を示したＨ３Ｎ－３９ＴＳ治療マウスに関して、ウイルス感染マウスの膵臓の病理学的変化は検出されなかった。１匹のＨ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスの心臓でのみ組織損傷の辺縁徴候を有する組織が検出された。 ＤＬＤ－１細胞腫瘍を有するマウスの長期治療後のＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの安全性および腫瘍溶解効率を示す図である。ＤＬＤ－１細胞腫瘍をＢａｌｂ／Ｃヌードマウスの両側腹部で確立した。腫瘍サイズが直径約０．５ｃｍに達したとき、腫瘍の１つに３×１０^６ｐｆｕ Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ（ｎ＝４）またはＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ（ｎ＝４）を注射した。注射の２日後および４日後、３×１０^６ｐｆｕの同じウイルス用量を使用してウイルス注射を繰り返した。最初のウイルス注射の３５日後に動物を屠殺した。 Ａ．Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスの腫瘍増殖。対照：ＰＢＳ注射腫瘍；治療群：ウイルス注射腫瘍；未治療群、対側非注射腫瘍。データは、各群の平均値±ＳＥＭとして示されている。有意性：^＊＊Ｐ＜０．０１。 Ｂ．動物ごとに示されたＡ．のデータ。 Ｃ．Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳの生体内分布およびウイルス量。ウイルス量は心臓、脾臓、肝臓、および脳ならびに注射腫瘍および非注射対側腫瘍のプラークアッセイによって決定した（左の図）。膵臓では、ｑＲＴ－ＰＣＲによってウイルスコピー数を決定した（右の図）。データは、動物ごとにおよび各群の中央値として示されている。注記、３つのウイルス感染腫瘍の完全寛解のため、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ力価は１つの腫瘍でのみ決定した。 Ｄ．Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスの血中Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ力価。注記：Ｍ１（マウス＃１）、Ｍ２（マウス＃２）、Ｍ３（マウス＃３）、Ｍ４（マウス＃４）。ウイルスはＭ３およびＭ４の血中では検出されなかった。 Ｅ．Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスの膵臓および心臓の組織学的検査。組織試料は図４Ｂのように調製した。示された画像は、示された群からの動物の代表的な画像である。対照：未治療動物。ウイルス感染動物の膵臓または心臓のどちらでも検出された病理学的変化はなかった。 Ｆ．Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスの腫瘍増殖。対照：ＰＢＳ注射腫瘍；治療群：ウイルス注射腫瘍；未治療群、対側非注射腫瘍。データは、各群の平均値±ＳＥＭとして示されている。有意性：^＊Ｐ＜０．１、^＊＊Ｐ＜０．０１。 Ｇ．動物ごとに示されたＥのデータ。 Ｈ．Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳの生体内分布およびウイルス量。ウイルス量をＣのように決定し、示す。 Ｉ．Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスの血中Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ力価。Ｍ１（マウス＃１）、Ｍ２（マウス＃２）、Ｍ３（マウス＃３）、Ｍ４（マウス＃４）。ウイルスはＭ４の血中では検出されなかった。 Ｊ．カプラン・マイヤー生存曲線。有意性：Ｐ＝０．００４１。注記：Ｈ３Ｎ－３９ＴＳ感染マウスはウイルス注射後４日目で瀕死の状態であり、動物福祉ガイドラインに従って屠殺した。 Ｋ．Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ治療ＤＬＤ－１腫瘍マウスの画像。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ治療マウス：トップが塗りつぶされた矢印（写真の左側）は非注射腫瘍を示し、トップが開いている矢印（写真の右側）はウイルス注射腫瘍の部位を示す（注記：有望なことにこのマウスで検出された腫瘍はなかった）；未治療対照マウス：トップが塗りつぶされた矢印（写真の左側）は非注射腫瘍を示し、トップが開いている矢印（写真の右側）はＰＢＳを注射された腫瘍を示す。画像は、腫瘍細胞注射後２９日目に撮影された。 回収した腫瘍におけるＭｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１発現レベルならびにＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの遺伝的安定性。 Ａ．腫瘍接種後３５日目のＨ３Ｎ－３７５ＴＳ－およびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ注射ＤＬＤ－１腫瘍におけるｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１の発現レベル。 ｍｉＲ－１およびｍｉＲ－３７５の発現レベルは定量ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。発現レベルをＵ６ ｓｎＲＮＡ発現レベルに対して正規化した。データは、インビトロ培養ＤＬＤ－１細胞で決定した発現レベルと比べて示されている（設定＝１）。膵臓および心臓組織をＰＢＳ治療対照マウスから回収した。注記：調べた試料は、図４に記載された実験で使用した動物および図５に記載された実験で使用した動物由来である。 Ｂ．Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳにおけるｍｉＲ－ＴＳの遺伝子解析。ウイルスＲＮＡを回収した腫瘍ホモジネートから単離し、ｍｉＲ－ＴＳを含有する領域をＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、クローニングした。３つのクローンのＭｉＲ－ＴＳを配列決定し、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳを最初に挿入したｍｉＲ－ＴＳの配列（本明細書ではコンセンサスと呼ばれる）と比較した。ｍｉＲ－ＴＳは太字＋大文字で示され、ｍｉＲ－ＴＳ間のスペーサー配列はイタリック体および小文字で示されている。ヌクレオチド置換に下線が引かれている。５’ｍｉＲ－ＴＳコピーの上流のスタッファー配列はイタリック体および小文字（「スタッファー」によって示された）で示されている。配列の５’末端の第１の３個のヌクレオチドは、ウイルスのポリタンパク質コード配列のオープンリーディングフレームの終止コドンを表す。注記：調べた試料は、図５に記載された実験で使用した動物由来である。上のパネル（ヌクレオチド配列）：コンセンサスｍｉＲ－３７５ＴＳ構築物－配列番号１６；Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ、腫瘍ｐｉ（の移植後（ｐｏｓｔ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ））３２日：１．－配列番号１７；２．－配列番号１８；３．－配列番号１９。下のパネル（ヌクレオチド配列）：コンセンサスｍｉＲ－３７５ＴＳ／ｍｉＲ－１ＴＳ構築物－配列番号２０；Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ／１ＴＳ、腫瘍ｐｉ（の移植後）３２日：１．－配列番号２１；２．－配列番号２２；３．－配列番号２３。 Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの組織分布を示す図である。 ＤＬＤ１細胞腫瘍をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの両側腹部で確立した。腫瘍サイズが直径約０．５ｃｍに達したとき、腫瘍の１つに３×１０^６ｐｆｕ Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ（ｎ＝６）またはＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ（ｎ＝６）の単回投与を注射した。ウイルス注射の１０日後（Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ）および２０日後（Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ）に動物を屠殺した。 Ａ．ウイルス生体内分布。ウイルス量を心臓、脾臓、肝臓、および脳ならびに注射腫瘍および非注射対側腫瘍のプラークアッセイによって決定した。膵臓では、ｑＲＴ－ＰＣＲによってウイルスコピー数を決定した。データは、動物ごとにおよび各群の中央値として示されている。 Ｂ．膵臓および心臓の組織学的検査。画像：屠殺した動物の膵臓および心臓の組織試料をホルマリンで固定し、Ｈ＆Ｅで染色した。示されているのは、両方のウイルス感染群からの動物の代表的なスライドである。注記：心臓および膵臓からの上の画像は、病理学的変化のないインタクトな組織を示している。下の画像は、心臓に炎症性細胞（矢印）の浸潤を有する動物からのものである。図：膵臓および心臓の病理学的変化の程度は０（なし）～５（高い）の範囲の採点システムによって決定した。データは動物ごとにおよび各群の平均値として示されている。

以下の実施例は、前記実施例に本発明を限定することを意図することなく、意図したように本発明を実行する実行可能な方法を例示する。

細胞株
ＨｅＬａ細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、カールスルーエ、ドイツ）で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、１０％ ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸Ｎａを補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｂｉｏｗｅｓｔ、ダルムシュタット、ドイツ）で培養した。結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ－１を、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸Ｎａを補充したＲＰＭＩ １６４０で増殖させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）。ヒトインスリノーマＥｎｄｏｃ－βＨ１細胞を、以前に記載されているように培養した（Scharfmann et al. 2014）。胚性マウス心筋細胞（ＥＭＣＭ）を胎生１４日目にＣ５７ＢＬ／６マウスから得、以前に記載されているように培養した（Spur et al. 2016）。

ウイルス
ＣＶＢ３株Ｈ３は、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、ウォリントン、ＰＡ）を使用して、プラスミドｐＢＫ－ＣＭＶ－Ｈ３を含有するｃＤＮＡ（Ａｎｄｒｅａｓ Ｈｅｎｋｅ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｎａ、イェーナ、ドイツによる好意により供給された）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションによって生成した。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３９ＴＳの生成および作製は、以前に記載されている（Pinkert et al. 2020）；方法、２．１ならびに図２ならびにｍｉＲ－３７５ＴＳ構築物３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲ参照。さらに（Pryshliak et al. 2020）、材料および方法、プラスミドおよびウイルスパート参照）。それぞれｍｉＲ－３７５ＴＳ（５’－ＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡ－３’、配列番号１）およびｍｉＲ－１ＴＳ（５’－ＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ－３’、配列番号２）の２つのコピーをコードするＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳを、ｍｉＲ－３７５ＴＳの最後のコピーの代わりにｍｉＲ－１ＴＳの２つのコピーをＨ３Ｎ－３７５ＴＳゲノムの３’ＵＴＲに挿入して構築した。ｍｉＲ－１ＴＳセンスプライマー
（５’－ＴＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡＴＴＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴＧＡ－３’、配列番号２４；下線はｍｉＲ－１ＴＳセンスを示す）およびアンチセンスプライマー
（５'－ＴＡＴＡＴＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧＣＴＴＴＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴ－３'、配列番号２５；下線はｍｉＲ－１ＴＳアンチセンスを示す）を、オンラインＩｎｆｕｓｉｏｎプライマー設計ツール（タカラバイオ株式会社、日本）を使用して設計し、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳのｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＫＳ１－Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ（（Pinkert et al. 2020）；方法、２．１および図２参照）を使用して、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）により製造者の説明書に従ってクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＭＫＳ１－Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳと名付けた。インビトロＴ７転写キット（Ｒｏｂｏｋｌｏｎ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）を使用して、ｐＭＫＳ１－Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびｐＭＫＳ１－Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳからウイルスＲＮＡを得た。２μｇのウイルスＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、完全な細胞溶解が観察されたら細胞プレートを－８０℃で保管した。３回の凍結解凍サイクル後、細胞残屑を遠心分離によって清澄化した。より高い力価を得るために、全てのウイルスをＨｅＬａ細胞で増幅した。インビボ実験用にウイルスを精製し、以前に記載されているようにスクロース勾配で濃縮した（Pinkert et al. 2020）。

ウイルスプラークアッセイ
ウイルスプラークアッセイは、以前に記載されているように実行し（Fechner et al. 2008）。簡単には、ＨｅＬａ細胞をコンフルエントな単層として２４ウェル培養プレートで培養した。２４時間後、培地を除去し、ホモジナイズしたマウス臓器から回収した連続１０倍（－２～－８）希釈上清で細胞を覆い、その後３回の凍結／解凍サイクルを行い、次いで３７℃で３０分間インキュベートし、上清の除去後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）を含有する寒天で覆った。３日後、１×３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミドヨードテトラゾリウムクロライド（ＭＴＴ／ＩＮＴ）溶液で細胞を染色した。染色１時間後にプラークを計数してウイルス力価を決定した。

増殖曲線
ＨｅＬａ（１×１０^６）およびＤＬＤ－１（１×１０^６）を６ウェルプレートに完全コンフルエントに播種し、２４時間後、細胞を０．１（ＨｅＬａ細胞）のＭＯＩ（感染多重度）または１もしくは０．０１（ＤＬＤ－１細胞）のＭＯＩでそれぞれ１時間感染させた。その後、ウイルス溶液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。２ｍｌ新鮮培地を添加し、細胞プレートを３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。感染後（ｐ．ｉ．）４時間、２４時間、４８時間および７２時間に１００μｌ上清を採取して、ウイルス滴定のためにプラークアッセイを行った。

ＭｉＲ発現解析
細胞またはマウス組織からの全ＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＴＲＩＺＯＬ試薬を使用して製造者の説明書に従って単離した。全ＲＮＡをＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｐｅｑｌａｂ、エルランゲン、ドイツ）で消化し、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ、米国）を使用して逆転写した。ｍｉＲ－３７５（アッセイ ＩＤ；０００５６４）、ｍｉＲ－１（アッセイＩＤ；００２２２２）、ｍｉＲ－３４（アッセイＩＤ；０００４２６）およびｍｉＲ－１６（アッセイＩＤ；０００３９１）の発現レベルを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックスおよび特異的ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを利用して製造者の説明書に従って決定した。リアルタイムＰＣＲを、Ｃ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒと組み合わされたＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。ΔΔＣＴ方法を使用してデータを解析し、結果を細胞株および組織のＵ６ ｓｎＲＮＡ（アッセイＩＤ；００１９７３）レベルに対して正規化した。

ＭｉＲ－ＴＳの遺伝的安定性
ウイルスＲＮＡを、回収した腫瘍または組織ホモジネートから高いＰｕｒｅウイルス核酸キット（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を用いて製造者のプロトコールに従って単離した。ＤＮａｓｅ Ｉ消化（Ｐｅｑｌａｂ、エルランゲン、ドイツ）後、アンチセンスプライマー（５’－ＣＴＡＣＴＧＣＡＣＣＧＴＴＧＴＣＴＡＧ－３’、配列番号２６）を用いる高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、フォスターシティ、ＣＡ）を使用してウイルスＲＮＡを逆転写した。その後、センス（５’－ＣＣＡＴＡＧＡＴＧＣＧＴＣＴＴＴＧＣＴ－３’、配列番号２７）およびアンチセンスプライマー（５’－ＣＣＧＴＴＧＴＣＴＡＧＴＴＣＧＧＴＴ－３’、配列番号２８）を用いてＰＣＲを行って、ｍｉＲ－ＴＳを含有するウイルスゲノムのヌクレオチド６９２３～７３７４の領域を増幅した。ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造者のプロトコールに従ってＰＣＲ断片をプラスミドにサブクローニングした。配列決定は、プライマー：５’－ＣＡＧＧＡＧＣＧＴＣＣＣＡＧＴＴＧＧ－３’（配列番号２９）を利用した。

ウエスタンブロット
ウエスタンブロットは、以前に記載されているように（Pryshliak et al. 2020）実行した。簡単には、２０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、タウフキルヘン、ドイツ）および１％ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、ＣＡ、米国）を含有する緩衝液で細胞を溶解し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりを測定し、細胞抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。免疫ブロットを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製の一次抗ガンマチューブリン抗体および抗ｅＩＦ４Ｇ、切断型カスパーゼ３およびＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバーズ、ＭＡ、米国）製の抗ＰＡＲＢ抗体を用いて実行した。ＣＶＢ５株Ｆａｕｌｋｎｅｒ由来のＶＰ１に対するモノクローナル抗ＶＰ１抗体を生成した。遺伝子発現の相対的定量化を、ＩｍａｇｅＪデンシトメトリーソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij）を使用するデンシトメトリー分析によって実行した。

ｍｉＲをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるウイルスサイレンシング
６０％コンフルエントなＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＰＥＩ Ｍａｘトランスフェクション試薬を用いて８００ｎｇ ｍｉＲ発現プラスミド；ｍｉＲ－１を発現するｐＣＭＶ－ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－３７５を発現するｐＣＭＶ－ｍｉＲ－３７５、および対照としてＧＦＰのみを発現するｐＣＭＶ－ｍｉＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックビル、ＭＤ、米国）をトランスフェクトした。ＧＦＰシグナルを蛍光顕微鏡でトランスフェクション効率について監視した。トランスフェクション２４時間後に培地を捨て、細胞に３７℃で３０分間ウイルスを接種した（ＭＯＩ ０．１）。ウイルス溶液の除去後、新鮮培地を添加した。ウイルス感染２４時間後に細胞を３回の凍結／解凍サイクルに供し、細胞ライセートを遠心分離して細胞残屑を除去した。上清をプラークアッセイによるウイルス力価の決定に使用した。

細胞生存率
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ増殖Ｋｉｔ（ＸＴＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ、ヴァルドルフ、ドイツ）を使用して製造者の説明書に従って評価した。簡単には、細胞を９６ウェルプレート上に播種し、１、１０または１００のＭＯＩで感染させた。示された時点で、Ｖ－６５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｏｎ Ｉｎｃ．ミルウォーキー、ＷＩ、米国）を使用して吸光度レベルを測定した。陰性対照として、細胞を５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液で処理した。

組織病理学的分析
マウス組織および移植したヒト腫瘍を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。５μｍ厚組織切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して可視化し、細胞破壊および炎症を定量化した。膵臓および心臓の損傷を、以前に記載されているように（Wang et al. 2019）、臓器における免疫細胞による浸潤、壊死、病変領域、細胞空胞化および石灰化を含む採点システム（０－検出可能な病理学的変化なし～５－組織全体の広範囲の病理学的変化）によって決定した。

インビボ実験
動物実験は、実験用動物管理の指針および動物保護に関する全てのドイツの法律に従って行った。ヒト結腸直腸ＤＬＤ－１細胞（５×１０^６個細胞）を、６週齢メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右および左側腹部に皮下異種移植した。腫瘍量をハンドキャリパーで毎日測定した。腫瘍サイズが直径０．４～０．５ｃｍに達したとき、腫瘍の１つに３×１０^６ｐｆｕのウイルスを腫瘍内注射した。短期研究に関して動物はウイルスの単回投与を受け、ｐ．ｉ．４日、１０日または２０日に屠殺された。長期試験に関して、動物に０、２および４日目に３回注射し、最初のウイルス注射の３２日後に調べた。対照マウスにはＰＢＳを腫瘍内注射した。

統計解析
統計解析は、Ｇｒａｐｈ－Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ラホヤ、ＣＡ、米国）を用いて行った。結果は各群の平均値±ＳＥＭとして表す。細胞培養研究については対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、インビボ研究についてはマン・ホイットニーＵ検定を使用して統計的有意性を決定した。生存曲線を、カプラン・マイヤー法および（ログランク検定）によって決定した統計的有意性に従ってプロットした。差はｐ＜０．０５で有意とみなした。

実験の説明
適切なｍｉＲの決定は、適切なｍｉＲ脱標的化を達成するための極めて重要なステップである。最も重要なことに、ｍｉＲは、腫瘍では弱く発現されるかまたは欠けているが、望ましくないウイルス複製が起こる健康な臓器では豊富に発現されるはずである。最近、腫瘍抑制因子ｍｉＲであるｍｉＲ－３４ａはこの要件を満たし、対応するｍｉＲ－３４ａＴＳを有する改変ＣＶＢ３が、肺がんのマウスモデルで膵臓および心臓からうまく脱標的化されたことが示された（Jia et al., 2019）。しかし、がんの不均一性は、腫瘍抑制因子ｍｉＲの可変発現を引き起こす可能性がある。本発明の発明者らは、結腸直腸がんでのｍｉＲ－３４ａの高発現を見出した。さらに、ｍｉＲ－３４ａの発現レベルは、膵臓および心臓での発現レベルと類似しており（図１Ｆ）、膵臓および心臓だけでなく結腸直腸がん細胞でも脱標的化されることから、ｍｉＲ－３４ａ脱標的化戦略は結腸直腸がんに適さないものになる可能性が高い。したがって、本発明の発明者らは、膵臓および心臓からＣＶＢ３を脱標的化する別のアプローチを発見することを目標にした。本発明者らの以前の研究では、本発明者らは、ｍｉＲ－３７５に相補的なｍｉＲ－ＴＳを搭載されたＣＶＢ３に感染した結腸直腸がん細胞培養株がインビトロで高い複製を示し、腫瘍細胞傷害性を誘導したことを示すことができた。その程度は、ｍｉＲ－ＴＳがＣＶＢ３転写物のポリタンパク質コード領域の３’ＵＴＲで挿入された場合に５’ＵＴＲと比べてより顕著であり、ＭｉＲ－３７５は、ヒト膵臓組織で最も豊富に発現されるｍｉＲであるが、結腸直腸癌細胞株では弱く発現されることが見出された。（Pinkert et al. 2020）では、本発明者らは、ｍｉＲ－３７５に相補的なｍｉＲ－ＴＳを搭載されたＣＶＢ３がＮＭＲＩマウス（腫瘍移植関係が全くない）に腹腔内投与した場合、これらのマウスは膵臓感染をきたさないことを示すことができた。しかし、治療様式によっては、マウスは心臓ＣＶＢ３感染を発症し得た。これは、ＣＶＢ３を静脈内投与した場合に当てはまった：それぞれの動物は、心臓のウイルス感染に起因する中程度の心筋炎を発症した。心臓のウイルス力価は２．６×１０^４ｐｆｕ／ｇに達した。さらに、ＮＭＲＩマウスへのＨ３Ｎ－３７５ＴＳの静脈内適用は、心筋線維症および、ｍｉＲ－３７５ＴＳを有するＣＶＢ３ ＲＮＡゲノムの持続を特徴とする慢性心筋炎ももたらしたが、複製ウイルスの欠如は非常に有望であった。ウイルスを腹腔内投与した場合、さらにより有望なことに心筋炎は検出することができなかった。この仮説に束縛されるものではないが、この理由には以下が考えられる：マウスにおいて膵臓はＣＶＢ３に最も感受性の高い臓器であり、ウイルスが他の臓器に広がっていくＣＶＢ３感染の原発部位である。したがって、これらの以前の観察は、膵臓におけるウイルス複製のブロック（ＣＶＢ適用様式が腹腔内の場合）が心臓のような他の臓器の感染を防止し、治療用ＣＶＢ３の安全性を高める主な原因となることを示している。したがって、標的化される腫瘍細胞に特異的複製を限定するための追加の修飾を導入することによって、治療用ＣＶＢ３の安全性をさらに高める大きな関心がある。この戦略は理想的には、膵臓に加えて特に心臓のウイルス感染および心筋炎も特に予防するために、投与様式と無関係であるべきである。

[実施例１]
膵臓特異的ｍｉＲ－３７５および心臓特異的ｍｉＲ－１は結腸直腸がん細胞株で下方制御される
ｍｉＲ－ＴＳ搭載腫瘍溶解性ウイルスの選択的サイレンシングのために、対応するｍｉＲは、ウイルス複製が抑制されなければならない組織では高度に発現されるべきであるのに対し、標的化された腫瘍／がん細胞ではその発現は低いかまたは欠如しているべきである。ここで本発明者らは、膵臓特異的発現ｍｉＲ－３７５に注目した。安全対策をさらに強化し、感染性構築物が心臓組織を感染させないことを保証するために、心臓特異的発現ｍｉＲ－１発現もテストした。まず、両方のｍｉＲの膵臓および心臓発現を結腸直腸癌での発現レベルと比較するために、７つの結腸直腸癌細胞株、マウス膵臓および心臓組織、ならびに膵臓細胞株ＥｎｄｏＣ－βＨ１および胚性マウス心筋細胞（ＥＭＣＭ）をｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１の発現について調べた。定量ＲＴ－ＰＣＲを使用して、本発明者らは、ｍｉＲ－３７５が膵臓およびＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞で高度に発現され、結腸直腸癌細胞株、マウス心臓およびＥＭＣＭで弱く発現される（膵臓と比べて少なくとも２００分の１）ことを見出した。ＭｉＲ－１は、心臓で強く発現され、心臓と比べてＥＭＣＭで約４０倍弱く発現され、膵臓および結腸直腸癌細胞株で少なくとも４００倍より弱く発現された。本発明者らは、両方のｍｉＲがマウス脾臓、肝臓および脳で弱く発現されることも見出した。ＣＶＢ３はこれらの組織も感染させることができるため、これは重要である。さらに、ウイルス作製に使用されるＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１を非常に低レベルで発現した（図１Ａ）。したがって、ｍｉＲは両方とも、生物工学により作られた腫瘍溶解性ＣＶＢ３のサイレンサーとして使用するために不可欠な要件を満たした。マウス膵臓および心臓におけるｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１それぞれの高発現、ならびに結腸直腸癌細胞におけるこれらのｍｉＲの低発現または欠如をこの試験で確認した。したがって、ｍｉＲは両方ともＣＶＢ３複製の阻害剤として使用するために最も不可欠な要件を満たした。

[実施例２]
ｍｉＲ－ＴＳのＣＶＢ３ゲノムへの挿入はＨｅＬａ細胞でのウイルス複製に影響を与えない
この理論に束縛されるものではないが、マウスにおける以前の観察は、膵臓が、血流を介したウイルスの分布およびその後の心臓ＣＶＢ３感染に不可欠なＣＶＢ３複製の原発部位であることを示唆している。したがって、本発明者らは、膵臓でのウイルス複製が膵臓特異的ｍｉＲによって抑制される場合、膵臓、および心臓はＣＶＢ３感染から保護され得ると仮定した。これを証明するために本発明者らは、本発明者らのグループによって最近改変されたｍｉＲ－３７５ＴＳの３つのコピーを含有するＣＶＢ３株Ｈ３の変異株である、（Pinkert et al. 2020）に記載のＨ３Ｎ－３７５ＴＳを使用した。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ－３７５ＴＳの２つのコピーおよびｍｉＲ－１ＴＳの２つのコピーをＨ３骨格に含有するＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳを新たに開発した。本発明者らは、ｍｉＲ－１ＴＳの追加の挿入により、ある特定の状況では心臓でのウイルス複製が、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳの複製より強く阻害されると予想した。本発明者らおよび他の研究者はこの領域がｍｉＲ－ＴＳもよく許容することを見出したため、両ウイルスではＣＶＢ３ポリタンパク質コード配列の終止コドンのすぐ下流、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲにｍｉＲ－ＴＳを挿入した（図１Ｂ）。ｍｉＲ－３７５ＴＳおよびｍｉＲ－１ＴＳは両方とも、それぞれ仮説上のヌクレオチド塩基対合に関して、その対応するｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１に１００％相補的であった（図１Ｃ参照）。

ｍｉＲ－ＴＳ挿入が、改変されたウイルスの増殖それ自体に影響を与えるか評価するために、本発明者らは、高感受性のＨｅＬａ細胞におけるその増殖動態を７２時間にわたって決定し、それらをＣＶＢ３－Ｈ３および、哺乳動物細胞では発現されないｃｅｌ－ｍｉＲ－３９のｍｉＲ－ＴＳを有する対照ウイルスＨ３Ｎ－３９ＴＳの増殖動態と比較した。図１Ｄに示すように、有益なことにウイルス増殖に差はない。全てのウイルスは急速に増殖し、感染後２４時間までには既にプラトーに達した。さらに、ウイルスプラークサイズは全てのウイルスで類似していた（図１Ｅ）。これは、ｍｉＲ－ＴＳの挿入にもかかわらず、ウイルス複製がこの細胞株では影響を受けなかったことを明確に示すものである。

[実施例３]
Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳは同族ｍｉＲに感受性である
Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの複製が同族ｍｉＲによって阻害され得るか調べるために、本発明者らはまず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｍｉＲ－３７５発現対照プラスミド、ｍｉＲ－１発現対照プラスミドまたはＧＦＰ発現対照プラスミドをトランスフェクトし、２４時間後、細胞を０．０１ ＭＯＩのＨ３Ｎ－３７５ＴＳ、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳまたは対照ウイルスＨ３Ｎ－３９ＴＳに２４時間感染させた。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳは、ｍｉＲ－３７５をトランスフェクトした細胞で８．４倍阻害されたが、ｍｉＲ－１トランスフェクト細胞では影響を受けないままであったのに対し、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳは、ｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１トランスフェクト細胞の両方でそれぞれ１７．７倍および１１．３倍阻害された。Ｈ３Ｎ－３９ＴＳ複製は、ｍｉＲ－３７５トランスフェクト細胞でもｍｉＲ－１トランスフェクト細胞でも抑制されなかった（図２Ａ）。

一過性発現ｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１が、それぞれＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳを特異的に阻害することを実証したことから、本発明者らは次に、ｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１を内因的に発現する細胞ではウイルス複製も抑制されるかを調べた（図１Ａ）。したがって、ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞を、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳまたはＨ３Ｎ－３９ＴＳのＭＯＩ １で、およびＥＭＣＭをＭＯＩ ０．０１で感染させた。２４時間後、ウイルス力価をプラークアッセイによって測定した。ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞では、Ｈ３Ｎ－３９ＴＳは強く伝播し、約１０^７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価の生成をもたらしたのに対し、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの複製は有意により低く、約１０^１ｐｆｕ／ｍｌにしか達しなかった（図２Ｂ）。ＥＭＣＭでは、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ力価はＨ３Ｎ－３９ＴＳと比べて変わらなかった（約４．３×１０^４ｐｆｕ／ｍｌ）のに対し、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳの力価はほぼ２桁低かった（約６×１０^２ｐｆｕ／ｍｌ）（図２Ｃ）。ｍｉＲ－３７５トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比べて、ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞におけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの明らかに高い阻害は、前者では細胞の６０％のみが、それぞれｍｉＲ－３７５発現プラスミドをトランスフェクトされた（ＧＦＰレポーターによる決定）のに対し、ＥｎｄｏＣ－βＨ１では全ての細胞がｍｉＲ－３７５を内因的に発現するという事実によって説明することができる。したがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一部のみがウイルスに対して保護されたのに対し、非トランスフェクト細胞ではウイルスは自由に複製した。これは、ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞と比べて、ｍｉＲ－３７５トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるより高いウイルス力価およびウイルス複製のより低い阻害をもたらした。しかし、ｍｉＲ－１を内因的に発現するＥＭＣＭでのＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの同程度の低い阻害によって示されるように、細胞タイプ特異的差異も、ｍｉＲ誘導ウイルス阻害の強度の差を説明する上で役割を果たしている可能性がある。

まとめると、これらの結果は、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳが、同族ｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１を発現する細胞で効率的および特異的に抑制されることを明らかに実証している。

[実施例４]
ｍｉＲ－ＴＳの挿入は、結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ－１におけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの増殖および細胞傷害性をわずかに低減する
ヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ－１はＣＶＢ３－Ｈ３ １８に非常に感受性であり、ｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１を低レベルで発現する（図１Ａ）。これは、この細胞株を、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの腫瘍溶解性能力を実証するのに適したものにする。第一に、本発明者らは、これらの細胞で両ウイルスの増殖動態を決定し、それらをＨ３Ｎ－３９ＴＳおよびＣＶＢ３－Ｈ３対照ウイルスの増殖動態と比較した。図３Ａ（上の図）に示したように、高いＭＯＩ １では、全てのウイルスが急速に増殖し、４８～７２時間後にプラトー達し、類似した増殖曲線を示した。しかし、ウイルス用量がＭＯＩ ０．０１に低下すると（図３Ａ、下の図）、ウイルス複製動態の差は明白になった。実際、３つのＨ３Ｎ－ＴＳウイルスはＣＶＢ３－Ｈ３より低い増殖率を示した。ＤＬＤ－１細胞におけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの複製活性を、ウエスタンブロッティングによりＣＶＢ３ ＶＰ１およびＣＶＢ３標的遺伝子発現を調べて確認した。図３Ｂに示したように、ＶＰ１、切断型ｅＩＦＧ４、カスパーゼ３およびＰＡＲＰは、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ、Ｈ３Ｎ－３９ＴＳおよびＣＶＢ３－Ｈ３感染細胞で上方制御されたが、これらのタンパク質に関してウイルス間に有意差は認められなかった（図３Ｂ）。

細胞傷害性活性は、腫瘍溶解性ウイルスの第２の重要な特徴である。したがって、本発明者らは次に、ＤＬＤ－１細胞におけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ誘導細胞殺傷活性を調べた。ＤＬＤ－１細胞を１～１００ ＭＯＩのどちらかのウイルス、またはＨ３Ｎ－３９ＴＳおよびＣＶＢ３－Ｈ３に感染させ、ＸＴＴアッセイによって細胞生存率を７２時間にわたって決定した。各適用用量で感染後２４時間および４８時間、ならびに１ ＭＯＩのウイルス用量で感染後７２時間のウイルス誘発細胞傷害性に差は認められなかった。しかし、細胞をＭＯＩ １０で感染させた場合、ＣＶＢ３－Ｈ３と比べて全てのｍｉＲ－ＴＳウイルスの有意により低い細胞傷害性が７２時間で明白になった。細胞生存率は、親ＣＶＢ３－Ｈ３については１１％に達したのみであったのに対し、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳでは４２％、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳでは３９％、およびＨ３Ｎ－３９ＴＳでは２９％に達した（図３Ｃ）。

まとめると、ＣＶＢ３－Ｈ３のようなＣＶＢ３ウイルスのゲノムへのｍｉＲ－３７５ＴＳおよびｍｉＲ－１ＴＳの挿入は、有益なことに、ＤＬＤ－１結腸直腸癌細胞におけるウイルス複製、ウイルスと細胞標的との相互作用、およびウイルス誘発細胞傷害性をわずかに損なうにすぎないことを結果は示している。

さらに、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの本発明者らのインビトロ研究は、ｍｉＲ－ＴＳ同族ｍｉＲに対する両ウイルスの感受性を確認した。しかし、親ＣＶＢ３－Ｈ３株と比べて両ウイルスは、結腸直腸ＤＬＤ－１がん細胞においてわずかにより低い複製および細胞傷害性を示した。複製および細胞傷害性の低下はｍｉＲ－ＴＳ対照ウイルスを用いても見られたことから、本発明者らは、この細胞株において非常に低レベルで発現されるｍｉＲ－１および／またはｍｉＲ－３７によって誘導される特異的サイレンシング効果の結果というよりむしろ、ウイルスゲノムへのｍｉＲ－ＴＳの挿入それ自体がこれに関与していると仮定する。

[実施例５]
インビボでＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳは、同族ｍｉＲを発現するマウス組織から脱標的化される
Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳのインビボでの安全性および腫瘍溶解活性を調べるために、本発明者らはヌードマウスの両側腹部で皮下ＤＬＤ－１細胞腫瘍を確立し、腫瘍が約０．５ｃｍのサイズに達したとき、一方の腫瘍に３×１０^６ｐｆｕ Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳまたは対照ウイルスＨ３Ｎ－３９ＴＳを注射した。動物が瀕死の状態になったウイルス注射４日後に、Ｈ３Ｎ－３９ＴＳ感染マウスを屠殺した。予想した通り、マウスは心臓および膵臓、ならびに注射腫瘍および対側腫瘍に高量のウイルスを有した。さらに、中程度のＨ３Ｎ－３９ＴＳレベルが脾臓、肝臓および脳で見出された（図４Ａ）。組織学的検査は膵臓の完全な損傷を確認したのに対し、心臓（図４Ｂ）または他の臓器（結果未掲載）では病理学的変化を検出することができなかった。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ感染動物では、注射腫瘍および対側腫瘍のみが高いウイルス力価を示したが、これは、有望なことにＨ３Ｎ－３９ＴＳ感染マウスの約１０分の１～３０分の１であった。重要なことには、動物の膵臓はウイルスを含まず、心臓のウイルス力価はＨ３Ｎ－３９ＴＳ感染マウスの心臓よりはるかに低かった（約２，０００倍）。さらに、注目すべきことに、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳアプローチでは脾臓および肝臓もウイルスを含まず、４匹のうち１匹のみが脳で検出可能なウイルスを示した（図４Ａ）。Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスのウイルス分布および力価は、非常に有利には膵臓に次いで心臓もウイルスを含まない点を除いてＨ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスでのものと類似していた（図４Ａ）。したがって、非常に弱い心臓の炎症を示した１匹のＨ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスを除いて（結果未掲載）、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ－およびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスの心臓および膵臓、同様にこれらのマウスの他の臓器（結果未掲載）は、組織学的検査下でいずれの病理学的変化も示さなかった（図４Ｂ）。

したがって、これらのデータは、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳが腫瘍感染マウスの膵臓で、ならびにＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳは膵臓および心臓で特異的に抑制されることを実証するものである。さらに、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ複製の組織特異的ｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１媒介阻害は、非常に有望なことには、ｍｉＲ－３７５またはｍｉＲ－１を発現しない組織のウイルス量も低減した（図４Ａ参照）。

[実施例６]
インビボでＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳは、副作用を誘発することなくマウスにおける結腸直腸癌の増殖を効率的に阻害する
感染の直後のＤＬＤ－１腫瘍担持マウスの膵臓および心臓におけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ複製の阻害を示したことから、本発明者らは次に、長期治療アプローチでの両ウイルスの腫瘍溶解活性および安全性を調べた。腫瘍が約０．５ｃｍのサイズに達したとき、腫瘍担持マウスは腫瘍内ウイルス投与（１回投与あたり３×１０^６ｐｆｕ）を受け、最初の注射の２日後および４日後に再び投与を受けた。初回注射後３２日目に動物を屠殺した。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳによる治療は、４匹中３匹のマウスで注射腫瘍の完全な退縮をもたらし、残りの動物では部分退縮をもたらした（図５Ａ、Ｋ）。未治療対照動物の腫瘍と比べた場合、非注射対側腫瘍の増殖の有意な阻害も観察されたが、腫瘍増殖の阻害は感染腫瘍のものよりあまり顕著でなかった（図５Ｂ、Ｋ）。ウイルス量の分析は、４つの非注射対側腫瘍のうち３つで低いＨ３Ｎ－３７５ＴＳ力価を示したのに対し、１つのみは、注射腫瘍を増殖させ、正常な臓器はウイルスを含まなかった（図５Ｃ）。４匹中２匹はウイルス血症であった。ウイルス血症は、ウイルスが血流に入り、したがって身体の他の部分に到達する医学的状態である。しかし、前記２匹の血清力価は低かった（図５Ｄ）。興味深いおよび注目すべきことに：観察期間中、ウイルス関連有害作用は動物で観察されず、組織学的検査は心臓および膵臓の損傷および炎症をそれぞれ排除した（図５Ｅ）。

Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスは、注射腫瘍および対側非注射腫瘍の増殖の有意な阻害も示した。しかし、増殖阻害は、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスよりわずかに弱く、完全な腫瘍退縮は認められなかった（図５Ｆ、Ｇ）。注射腫瘍の全て、およびまた４つの非注射対側腫瘍のうちの２つはウイルス力価が低かった（図５Ｈ）。ウイルス血症は、４匹のうち３匹で検出された（図５Ｉ）が、力価はＨ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスにおけるよりわずかに高かった。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスで観察されたように、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ注射マウスもウイルス関連有害作用を示さず、膵臓および心臓は病理学的変化がなかった（図５Ｅ）。重要および有望なことに、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳに感染したマウスで死亡は認められず、その結果、対照ウイルスＨ３Ｎ－３９ＴＳのみを受け取ったマウスと比べて全生存期間は有意に延びた（図５Ｊ）。本発明者らはまた、それぞれ感染後（ｐ．ｉ．）１０日および２０日に分析したＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染動物も調べた。感染後３２日で得られたデータと一致して、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスは膵臓にウイルスが認められず、心臓での力価が低かったのに対し、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスでは膵臓および心臓のウイルス力価は検出できなかった（図７）。

全てのインビボ治療動物は、有益なことに腫瘍内ウイルス注射後３２日目の予定された実験終了まで生存し、ウイルス誘発疾病はこの期間中全く検出されなかった。ｍｉＲ－ＴＳ対照ウイルスは４日以内に動物を死滅させたことから、動物の生存の劇的な差は明白である。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの安全性は、明らかに膵臓および心臓でのウイルス複製を防いだことに起因した。実際、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳは両方の臓器で検出されず、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳの膵臓および心臓複製がｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１によってうまく阻害されたことを裏付けた。Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳも膵臓から除去されたが、興味深いことに、ウイルスがｍｉＲ－１に感受性でなくてもＨ３Ｎ－３７５ＴＳ力価は心臓でも低下した。同様に、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ－およびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染動物の脾臓、肝臓および脳は（ごくわずかな例外を除き）ウイルスを含まなかったのに対し、ｍｉＲ－ＴＳ対照ウイルスに感染した動物では高い力価が検出された。これらの臓器での低いｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１発現レベルに基づき、本発明者らは阻害の原因としてのｍｉＲ誘導阻害を排除した。両ウイルスはインビボでの有意な腫瘍溶解活性を示した。しかし、４つのＨ３Ｎ－３７５ＴＳ注射ＤＬＤ－１細胞腫瘍中３つは完全な退縮を示したのに対し、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳ注射動物では腫瘍クリアランスが見られなかった。これは、後者のより低い腫瘍溶解活性を示すものである。

[実施例７]
ＭｉＲ－１発現は、ＤＬＤ－１単層と比べてＤＬＤ－１腫瘍バルクで強く増加する
Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳとＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳとの間に、インビトロでのＤＬＤ－１細胞における増殖動態および細胞傷害性の差は認められなかった。これは、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳの内因活性がＨ３Ｎ－３７５ＴＳのものより低いことを除外するものである。上に示したようにＤＬＤ－１腫瘍破壊は、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳ感染マウスにおけるよりＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ感染マウスで低かった。これが、増殖している腫瘍のｍｉＲ－１レベルの増加と関連し得るかを解明するために、本発明者らは、最初のウイルス注射後３２日目に回収したＤＬＤ－１腫瘍バルクでのｍｉＲ－１発現を決定し、それをＤＬＤ－１細胞単層および心臓でのｍｉＲ－１発現と比較した。図６Ａに示したように、明らかにＤＬＤ－１単層より多いｍｉＲ－１がＤＬＤ－１腫瘍バルクで実際に発現され、未治療腫瘍での１２５倍から、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ注射腫瘍でのそれぞれ６７５倍および５４０倍に及んだ。しかし、最も高いｍｉＲ－１レベルでさえ、心臓で測定されたレベルより３桁をさらに超えて低かった。本発明者らは、ＤＬＤ－１腫瘍およびＤＬＤ－１単層でのｍｉＲ－３７５発現も調べた。３～５倍のごくわずかな増加が腫瘍で検出され、絶対ｍｉＲ－３７５レベルはマウス膵臓でのレベルより１００倍超低いままであった（図６Ａ）。したがって、他の可能性のある阻害因子を考慮して、本発明者らは、ｍｉＲ－１がＤＬＤ－１細胞培養物と比べてＤＬＤ－１細胞腫瘍で１２５倍強く誘導されたことを見出した。さらに、ウイルス感染ＤＬＤ－１腫瘍塊では、ｍｉＲ－１レベルは５００倍超上昇した。

これらのデータは、確立された腫瘍においてｍｉＲ－１は強く上方制御されたが、心臓でのその発現と比べて発現は低いままであったことを実証するものである。したがって、ＤＬＤ－１細胞腫瘍で内因的に上方制御されたｍｉＲ－１によるＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの選択的阻害が、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳと比べたＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳのインビボでの低い腫瘍溶解効力に対する最ももっともらしい説明であるように思われる。

[実施例８]
Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳは、搭載されたＣＶＢ３ ｃＤＮＡ構築物において両ｍｉＲ－ＴＳ配列の高い遺伝的安定性を示す
膵臓におけるＨ３Ｎ－３７５ＴＳ、ならびに膵臓および心臓におけるＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの有害作用の欠如および複製の欠如は、両ｍｉＲ－ＴＳウイルスの高い安定性を示唆している。このことを証明するために、本発明者らは、最初のウイルス注射後３２日目の注射腫瘍から単離したＨ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの各３つのクローンのｍｉＲ－ＴＳボックスをクローニングし、配列決定した。１つのＨ３Ｎ－３７５ＴＳクローンでは、ｍｉＲ－３７５ＴＳボックスは完全にインタクトであったのに対し、他の２つのクローンではそれぞれ４個および２個のヌクレオチドが、３つのｍｉＲ－ＴＳコピーのうちそれぞれ１つで変異していた。最も有望なことに、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳでは、１つのクローンの１つのｍｉＲ－１ＴＳに１個のヌクレオチド置換のみが検出されたのに対し、他のｍｉＲ－３７５ＴＳおよびｍｉＲ－１ＴＳコピーはインタクトであり（図６Ｂ）、高い遺伝的安定性を示した。

驚くべきことに、本発明の文脈においてこれらのデータは、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳが、搭載されたＣＶＢ３ ｃＤＮＡ構築物における両方の各ｍｉＲ－ＴＳ配列の高い遺伝的安定性を示し、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳはさらにより顕著なものであることを示している。

[実施例９]
インビトロおよびインビボデータ
マイクロＲＮＡの重要性を調べるために、２つのウイルス、ｍｉＲ－３７５ＴＳのみを含有するＨ３Ｎ－３７５ＴＳ、ならびにｍｉＲ－３７５ＴＳおよびｍｉＲ－１ＴＳを含有するＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳを上記のように改変した。インビトロでは、両ウイルスは、非標的化対照ウイルスＨ３Ｎ－３９ＴＳと同様に結腸直腸癌細胞で複製し、結腸直腸癌細胞を溶解したのに対し、対応するマイクロＲＮＡを一過性または内因的に発現する細胞株では強く減弱された。

インビボでは、対照ウイルスＨ３Ｎ－３９ＴＳは膵臓および心臓の強い感染を誘導し、単回腫瘍内ウイルス注射後４日以内に、結腸直腸ＤＬＤ－１細胞腫瘍を異種移植したマウスに致命的疾患をもたらした。対照的に、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳまたはＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳの３回の腫瘍内注射は、ウイルス誘発疾病を誘導しなかった。該動物において、両ウイルスは膵臓から完全に除去され、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳは心臓からも除去されたのに対し、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳの心臓力価は強く低下した。ＤＬＤ－１腫瘍モデルの長期研究は、Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ治療マウスにウイルス誘発有害作用がないことを確認した。死亡は認められず、膵臓および心臓に病理学的変化はなかった。治療効率に関して治療動物は、腫瘍における高い長期Ｈ３Ｎ－３７５ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳ持続性ならびに有意により遅い腫瘍増殖を示した。全体的な結論として、これらのデータは、インビボでのＨ３Ｎ－３７５／１ＴＳおよびＨ３Ｎ－３７５ＴＳの顕著な安全性を裏付けるものである。

重要なことには、搭載ウイルスは両方とも高い腫瘍溶解活性を示したが、Ｈ３Ｎ－３７５／１ＴＳよりＨ３Ｎ－３７５ＴＳのほうが、わずかに高かった。これらのデータは、ヒトでの抗腫瘍療法に適用するためのｍｉＲ－３７５ＴＳおよびｍｉＲ－１ＴＳを搭載されたＣＶＢ３の安全特性の改善を明らかに示している。さらに、これらのデータは、それぞれｍｉＲ－３７５およびｍｉＲ－１のような膵臓および心臓特異的ｍｉＲ－ＴＳの使用による組織脱標的化が、腫瘍溶解性ＣＶＢ３の部位外の毒性を防ぎ、腫瘍溶解性ＣＶＢ３の腫瘍選択性を増大する非常に有効な戦略であり、他の腫瘍溶解性ＣＶＢ３株での使用に適している可能性があることを有利に実証するものである。

Claims (15)

1. コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のゲノム配列と；
   組織特異的発現パターンを有する１つまたは複数のマイクロＲＮＡに相補的な少なくとも１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）と
   を含む、感染性相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）構築物であって、
   前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ＣＶＢ３タンパク質コード配列の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの隣に組み込まれていることを特徴とする、前記感染性ｃＤＮＡ構築物。
2. プラスミドの形態であることを特徴とする、請求項１に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
3. 前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、３Ｄポリメラーゼのコード配列の終止コドンとＣＶＢ３タンパク質コード配列の３’ＵＴＲとの間に組み込まれ、
   場合により前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳがスタッファー配列と隣接していることを特徴とする、請求項１または２に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
4. 前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ヒト膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的であり、および／またはヒト心臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
5. 前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ヒト膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ配列に相補的な第１のｍｉＲ－ＴＳ、およびヒト心臓組織で特異的に発現される第２のｍｉＲ配列を含むまたはそれらからなることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
6. 前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ヒト膵臓組織特異的発現ｍｉＲ：ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－６９０、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１６ａ、ｍｉＲ－２１６ｂ、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－１４１および／またはヒト心臓組織特異的発現ｍｉＲ：ｍｉＲ－１、ｍｒｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６からなる群から選択されるｍｉＲ配列に相補的であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
7. 前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ヒト膵臓組織特異的発現ｍｉＲ－３７５およびヒト心臓組織特異的発現ｍｉＲ－１からなる群から選択されるｍｉＲ配列に相補的であることを特徴とする、請求項５に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
8. 前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、二重、三重、四重、五重もしくはより多重の反復または反復カセット、好ましくは少なくとも二重から最大三重の反復または反復カセットとして存在していることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
9. 多重クローニング部位、複製起源、選択遺伝子、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および導入遺伝子（例えば、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）のような免疫系刺激導入遺伝子）または腫瘍毒性遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数の配列エレメントをさらに含み、これらのさらなる配列が前記ｃＤＮＡ構築物の骨格に組み込まれていることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
10. ＣＶＢ３群ウイルスのゲノム配列が、複製コンピテントウイルス、ベクターウイルスおよび／またはウイルス粒子をコードすることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
11. 前記ＣＶＢ３のゲノム配列が、弱毒化または攻撃型ＣＶＢ３群ウイルス株から選択され、好ましくは株、例えば、ＰＤ、ｒＰＤ、Ｎａｎｃｙ、Ｈ３、３１－１－９３、ＲＤ、Ｐ ２０３５Ａ、２８、ＨＡおよびＧＡからなる群から選択され、前記ＣＶＢ３のゲノム配列が、それらの株のうちの１つのヌクレオチド配列によって定義されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物。
12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のｃＤＮＡ構築物を含むウイルス粒子またはベクターウイルス。
13. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡおよび／または請求項１２のベクターウイルスもしくはウイルス粒子ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
14. 前記少なくとも１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳに相補的な組織特異的発現を含む前記ｍｉＲ配列が、発現状態が低いかまたはないがんおよび／または転移性がんにおけるそれぞれの発現状態と比べて、前記組織でそれぞれ高度に発現される、
    がんおよび／または転移性がんの治療で使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の感染性ｃＤＮＡ構築物、請求項１２に記載の感染性ウイルス粒子もしくはベクターウイルス、または請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 前記がんが、結腸直腸がん（大腸がん）、乳がん、肺がん、肝臓がんおよび／または上述のがんの対応する転移からなる群から選択される、請求項１４に記載のがんおよび／または転移性がんの治療で使用するための感染性ｃＤＮＡ構築物、ウイルス粒子または医薬組成物。