ES2966692T3 - Vectores de virus adenoasociados poliploides y métodos de fabricación y uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona una cápsida de virus adenoasociado (AAV) poliploide, en donde la cápsida comprende la proteína VP1 de la cápsida, en donde dicha proteína VP1 de la cápsida es de uno o más de un primer serotipo de AAV, en donde dicha proteína VP2 de la cápsida es de uno o más de un primer serotipo de AAV y proteína VP3 de la cápsida, en donde dicha proteína VP3 de la cápsida es de uno o más de un segundo serotipo de AAV y en donde al menos uno de dicho primer serotipo de AAV es diferente de al menos uno de dicho segundo serotipo de AAV y es diferente de al menos al menos uno de dicho tercer serotipo de AAV, en cualquier combinación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores de virus adenoasociados poliploides y métodos de fabricación y uso de los mismos
Solicitudes relacionadas
Declaración sobre la presentación electrónica de un listado de secuencias
Un Listado de secuencias en formato de texto ASCII, presentado según 37 C.F.R. § 1.821, titulado 5470-786WO_ST25.txt, 102,196 bytes de tamaño, generado el 15 de marzo de 2018 y archivado a través de EFS-Web, se proporciona en lugar de una copia en papel.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de cápside modificadas a partir de partículas de virus adenoasociados (AAV, por sus siglas en inglés), viriones, cápsides de virus y vectores de virus unidos con proteína de superficie para potenciar que comprenden las mismas. En particular, la invención se refiere a proteínas de la cápside de AAV modificadas y cápsides que comprenden las mismas que se pueden incorporar en vectores de virus para combinar la transducción y la antigenicidad reducida, tropismo y/u otras características fenotípicas deseables en el vector de virus.
Antecedentes de la invención
El vector del virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés) se ha utilizado en más de 100 ensayos clínicos con resultados prometedores, en particular, para el tratamiento de la ceguera y la hemofilia B. El AAV no es patógeno, tiene un amplio tropismo tisular y puede infectar células en división o no en división. Más importante aún, la transducción del vector AAV ha inducido la expresión transgénica terapéutica a largo plazo en ensayos preclínicos y clínicos. Actualmente hay 12 serotipos de AAV aislados para la administración de genes. Entre ellos, se ha demostrado que el AAV8 es el mejor para dirigirse al hígado de ratón. Debido a los extensos estudios en animales preclínicos con deficiencia de FIX, se han llevado a cabo ensayos clínicos de Fase VII utilizando AAV2 y AAV8 en pacientes con hemofilia B. Los resultados de estos ensayos son muy prometedores; sin embargo, la expresión de FIX de pacientes que recibieron AAV/FIX no fue proporcional a lo que se ha logrado en modelos animales a pesar de que se utilizó la misma dosis de vector/kg. Cuando se utilizaron 1X1011 partículas de FIX que codifica para AAV8 en ratones knock out de FIX para administración sistémica, se detectó un 160% de FIX de nivel normal en sangre. Sin embargo, cuando se administraron 2X1011 partículas de AAV8/FIX, solo el 40% de FIX se logró en primates y menos del 1% de FIX se encontró en humanos. La expresión inconsistente de FIX después de la transducción del vector AAV entre estas especies puede deberse a la alteración del tropismo de hepatocitos en diferentes especies. Otro hallazgo interesante de los ensayos clínicos AAV FIX es la respuesta de los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de la cápside que erradica los hepatocitos transducidos con AAV, lo que resulta en un fracaso terapéutico. Este fenómeno no se ha demostrado en modelos animales después de la administración de AAV, lo que señala otra variación entre los estudios preclínicos y clínicos. Cuando se utilizó una dosis mucho más alta de vector<a>A<v>/FIX, se detectó la expresión de FIX en ambos ensayos clínicos utilizando AAV2 o AAV8; sin embargo, el nivel de FIX en sangre disminuyó en la semana 4 o 9 después de la inyección, respectivamente. Otros estudios sugirieron que la infección por el vector AAV provocó una respuesta de CTL específica de la cápside, que parecía eliminar los hepatocitos transducidos con AAV. Por lo tanto, los resultados de estos ensayos clínicos resaltan la necesidad de explorar enfoques efectivos para mejorar la transducción de AAV sin aumentar la carga de la cápside del vector. Cualquier mejora del vector que reduzca el antígeno de la cápside de AAV también afectará las desalentadoras preocupaciones de producción de vectores y será una adición bienvenida al desarrollo de fármacos de terapia génica viables.
El virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés), un parvovirus no dependiente de patógenos que necesita virus auxiliares para una replicación eficiente, se utiliza como vector viral para la terapia génica debido a su seguridad y simplicidad. El AAV tiene un amplio tropismo de tipo de célula y huésped capaz de transducir tanto células en división como células que no se dividen. Hasta la fecha, se han identificado 12 serotipos de AAV y más de 100 variantes. Diferentes cápsides de serotipo tienen diferente infectividad en tejidos o células de cultivo, que dependen del receptor primario y los correceptores en la superficie celular o la propia vía de tráfico intracelular. Se han determinado los receptores primarios de algunos serotipos de AAV, tal como el proteoglicano de sulfato de heparina (HSPG) para AAV2 y AAV3, y el ácido siálico unido a N para AAV5, mientras que el receptor primario de AAV7 y AAV8 no se ha identificado. Curiosamente, la eficiencia de transducción del vector AAV en células cultivadas no siempre se puede traducir en la de los animales. Por ejemplo, AAV8 induce una expresión transgénica mucho mayor que otros serotipos en hígado de ratón, pero no en líneas celulares de cultivo.
De los 12 serotipos, varios serotipos y variantes de AAV se han utilizado en ensayos clínicos. Como la primera cápside caracterizada, el AAV2 se ha utilizado más ampliamente en la administración de genes, tal como el RPE 65 para la amaurosis congénita de Leber y el Factor IX (FIX) para la hemofilia B. Aunque se ha demostrado que la aplicación de vectores de AAV es segura y se ha logrado un efecto terapéutico en estos ensayos clínicos, uno de los principales desafíos del vector de AAV es su baja infectividad que requiere un número relativamente grande de genomas de virus. El vector AAV8 es otro vector que se ha utilizado en varios ensayos clínicos en pacientes con hemofilia B. Los resultados de la administración dirigida al hígado de AAV8/FIX han demostrado que existen diferencias distintas específicas de especie en la expresión transgénica entre ratones, primates no humanos y humanos. Si bien 1010 vg de AAV8 con el gen FIX podrían alcanzar niveles suprafisiológicos (>100%) de expresión de FIX en ratones knock-out de Fix, solo dosis altas (2 * 1012 vg/kg de peso corporal) podrían inducir la expresión de FIX detectable en humanos. Con base en estos resultados descritos anteriormente, aún es necesario el desarrollo de estrategias efectivas para mejorar la transducción de AAV.
La mayoría de las personas han estado expuestas de forma natural a los AAV. Como resultado, una gran parte de la población ha desarrollado anticuerpos neutralizantes (Nab) en la sangre y otros fluidos corporales contra los AAV. La presencia de Nab plantea otro desafío importante para aplicaciones más amplias de AAV en futuros ensayos clínicos. Se han explorado muchos enfoques para mejorar la transducción de AAV o evadir la actividad de Nab, especialmente la modificación genética de la cápside de AAV basada en el diseño racional y la evolución dirigida. Aunque varios mutantes de AAV han demostrado una alta transducciónin vitroo en modelos animales, junto con la capacidad de escapar de los Nab, la modificación de la composición de la cápside proporciona la capacidad de alterar los tropismos celulares de los AAV parentales.
Rabinowitz Joseph E. et al (1 de mayo de 2004) Vol 78, no. 9, pp4421-4432 describen el revestimiento cruzado del virión: la transcapsidación de los serotipos de virus adenoasociados define funcionalmente los subgrupos. Kohlbrenner, et ál (1 Dec 2005) Molecular Therapy, vol 12, no 6, pp 1217-1225 describe la producción exitosa de vectores rAAV pseudotipados utilizando un sistema de expresión de baculovirus modificado. Maria W. A. De Backer (3 de junio de 2010) en su tesis doctoral describe la optimización de la tecnología de vectores virales para estudiar la función génica en el hipotálamo.
La presente invención aborda una necesidad en la técnica de vectores de AAV con características deseables combinadas.
Breve descripción de la invención
La presente invención se define en y por las reivindicaciones adjuntas.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para crear un virión de virus adenoasociado (AAV) que comprende poner en contacto células, en condiciones para la formación de viriones de AAV, con una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde el virión de AAV se forma a partir de al menos la proteína viral 1 (VP1) de AAV8 y las proteínas estructurales virales de la proteína viral 3 (VP3) de AAV2, en donde el primer ácido nucleico codifica para VP1 del serotipo AAV8 solamente pero no es capaz de expresar VP3, y la segunda secuencia de ácido nucleico codifica para VP3 de un serotipo AAV2 solamente y además no es capaz de expresar VP1, y en donde, el virión de AAV comprende VP1 del serotipo AAV8 solamente y VP3 del serotipo AAV2 solamente, y en donde si se expresa la proteína viral 2 (VP2), es solo del serotipo AAV8.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una pluralidad de partículas de vector de AAV generadas por el método del primer aspecto.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una cápside de virus adenoasociado (AAV) que comprende una proteína viral 1 de AAV8 (VP1), proteína viral 2 de AAV8 (VP2) y proteína viral 3 de AAV2 (Vp 3), en donde la VP1 y VP2 en la cápside son solo de AAV8, y la VP3 en la cápside es solo de AAV2.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una partícula de vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende la cápside de AAV del tercer aspecto, y una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de repetición terminal, y que comprende opcionalmente una molécula de ácido nucleico heteróloga, en donde la molécula de ácido nucleico está encapsidada por la cápside de AAV.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona la partícula de vector de virus adenoasociado (AAV) del cuarto aspecto para su uso en un método de tratamiento.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende la proteína de la cápside de AAV del tercer aspecto y/o la partícula de vector de AAV del cuarto aspecto en un portador farmacéuticamente aceptable.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para elaborar un vector de virus adenoasociado (AAV), que comprende:
a) transfectar una célula hospedadora con uno o más plásmidos que proporcionan, en combinación, todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV, en donde las proteínas de la cápside están codificadas exclusivamente para uno o más plásmidos que expresan solo la proteína viral 1 de AAV8 y la proteína viral 2 (VP1/VP2) y la proteína viral 3 de AAV2 (VP3);
b) introducir una o más construcciones de ácido nucleico en una línea celular de envasado o línea celular productora para proporcionar, en combinación, todas las funciones y genes necesarios, incluidas las secuencias de virus auxiliar para ensamblar partículas de AAV, en donde las proteínas de la cápside están codificadas exclusivamente para una o más construcciones de ácido nucleico que expresan solo VP1/VP2 de AAV8 y solo VP3 de AAV2;
c) introducir en una célula hospedadora uno o más vectores de baculovirus recombinantes que proporcionan en combinación todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV, en donde las proteínas de la cápside están codificadas exclusivamente para uno o más plásmidos que expresan solo VP1/VP2 de AAV8 y solo VP3 de AAV2; y/o
d) introducir en una célula hospedadora uno o más vectores de herpesvirus recombinantes que proporcionan en combinación todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV, en donde las proteínas de la cápside están codificadas exclusivamente para uno o más plásmidos que expresan solo VP1/VP2 de AAV8 y solo VP3 de AAV2.
En realizaciones, la presente invención proporciona el método del séptimo aspecto en donde las secuencias de virus auxiliar son secuencias auxiliares de adenovirus o secuencias auxiliares de herpesvirus.
Nuestros estudios previos han demostrado que las cápsides de diferentes serotipos de AAV (AAV1 a AAV5) eran compatibles para ensamblar cápsides de AAV haploides y la mayoría de los anticuerpos monoclonales de AAV aislados reconocían varios sitios ubicados en diferentes subunidades de<a>A<v>. Además, los estudios de cápsides de AAV quiméricas demostraron que se puede lograr una mayor transducción con la introducción de un dominio para un receptor primario o dominio específico de tejido de otros serotipos. La introducción del receptor de glicano AAV9 en la cápside de AAV2 mejora la transducción de AAV2. La sustitución de un dominio de 100 aminoácidos (aa) de AAV6 en la cápside de AAV2 aumenta el tropismo muscular. Supusimos que los vectores de AAV poliploides que están compuestos por cápsides de dos o más serotipos de AAV podrían aprovechar las ventajas de los serotipos individuales para una mayor transducción, pero no eliminar el tropismo de los padres. Además, estos virus poliploides podrían tener la capacidad de escapar de la neutralización por los Nab, ya que la mayoría de los Nab reconocen epítopos conformacionales y los viriones poliploides pueden haber cambiado su estructura superficial.
AAV2 y AAV8 se han utilizado para la aplicación clínica. En este estudio, primero caracterizamos el virus AAV haploide de AAV2 y AAV8 para la eficiencia de transducciónin vitro e in vivo,así como la capacidad de escape de Nab. Encontramos que el rendimiento del virus del vector haploide no se vio comprometido y el perfil de unión a heparina se relacionó con la incorporación de proteínas de la subunidad de la cápside de AAV2. Los vectores haploides AAV2/8 iniciaron una mayor transducción en el músculo y el hígado del ratón. Cuando se aplicó a un modelo de ratón con deficiencia de FIX, se observó una mayor expresión de FIX y una mejor corrección fenotípica hemorrágica en ratones tratados con vector haploide en comparación con el grupo AAV8. Es importante destacar que el virus haploide AAV2/8 tenía baja afinidad de unión a A20 y pudo escapar de la neutralización del suero anti-AAV2. El siguiente virus haploide AAV2/8/9 se elaboró a partir de cápsides de tres serotipos (AAV2, 8 y 9). Se demostró que la capacidad de escape del anticuerpo neutralizante del AAV2/8/9 haploide mejoró significativamente contra los sueros inmunizados con serotipos parentales.
Por lo tanto, la presente descripción proporciona una cápside de virus adenoasociado (AAV), en donde la cápside comprende la proteína de la cápside VP1, en donde dicha proteína de la cápside VP1 es de un primer serotipo de AAV y la proteína de la cápside VP3, en donde dicha proteína de la cápside VP3 es de un segundo serotipo de AAV y en donde dicho primer serotipo de AAV es diferente de dicho segundo serotipo de AAV.
En algunas realizaciones, la cápside de la presente invención comprende la proteína VP2 de la cápside, en donde dicha proteína VP2 de la cápside es de un tercer serotipo de AAV, en donde dicho tercer serotipo de AAV es diferente de dicho segundo serotipo de AAV.
En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona un vector viral que comprende: (a) una cápside de AAV de la presente invención; y (b) un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de repetición terminal, en donde el ácido nucleico está encapsidado por la cápside de AAV. El vector viral puede ser una partícula de AAV y la proteína de la cápside, la cápside, el vector viral y/o la partícula de AAV de la presente invención pueden estar presentes en una composición que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
En la presente se proporciona además un método para fabricar una partícula de AAV que comprende la cápside de AAV de la invención, que comprende: (a) transfectar una célula hospedadora con uno o más plásmidos que proporcionan, en combinación, todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV; (b) introducir una o más construcciones de ácido nucleico en una línea celular de envasado o línea celular productora para proporcionar, en combinación, todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV; (c) introducir en una célula hospedadora uno o más vectores de baculovirus recombinantes que proporcionan en combinación todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV; y/o (d) introducir en una célula hospedadora uno o más vectores de herpesvirus recombinantes que proporcionan en combinación todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV.
Además, en la presente se proporciona la proteína de la cápside, cápside, vector de virus, partícula de AAV y/o composición de la presente invención para usarse como un medicamento en el tratamiento beneficioso de un trastorno o enfermedad.
Estos y otros aspectos se abordan con más detalle en la descripción que se expone a continuación.
Breve descripción de las figuras
Figura 1:El efecto potenciado del suero sobre la transducción de AAV.(a)El suero humano mejora la transducción de AAV de diferentes serotipos. Se incubaron 1*108 partículas del vector AAV/luc con suero diluido 1:500 o PBS durante 2 horas a 4 °C. La mezcla de vector AAV y sueros se utilizó para transducir 1*105 células Huh7 en una placa de 48 pocilios en presencia de adenovirus dl309 a una MOI de 5. Después de 24 h, se analizó la actividad luciferasa del lisado celular. El aumento en veces de la expresión transgénica de la incubación de sueros se calculó mediante comparación con PBS.(b)El efecto del tiempo de incubación de AAV con suero humano sobre la transducción mejorada. Se incubaron 1*108 partículas de AAV8/luc con 1: 100 sueros humanos diluidos o PBS durante diferentes períodos de tiempo a 4 °C en presencia de ad dl309. 24 horas después, se midió la expresión de luciferasa del lisado celular.(c)Transducción mejorada de AAV después de la administración sistémica. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV8/luc con suero humano a diferentes diluciones durante 2 horas a 4 °C. La mezcla se administró a ratones C57BL hembra adultos mediante inyección retroorbital. La imagenologia se realizó durante 5 minutos el día 3 después de la inyección de AAV. Panel superior: Imágenes bioluminiscentes de animales vivos representativas de perfiles de expresión transgénica de luciferasa. Panel inferior: Cuantificación de la expresión transgénica de luciferasa para mejorar la transducción de AAV de 6 ratones después de la administración sistémica.(d)Transducción mejorada de AAV después de la inyección muscular. La mezcla de AAV8/luc con suero humano de(c)se diluyó a 1*109 partículas/200 ul en PBS y se inyectó en el músculo de la pata trasera del ratón. En la semana 2 después de la inyección, la imagenología se tomó durante 5 minutos. Boca arriba: pierna izquierda-AAV8 sueros humanos, pierna derecha-AAV8 PBS. Panel superior: Imagenología representativa. Parte inferior: Datos de la transducción mejorada de AAV de 6 ratones después de la inyección muscular. El aumento en veces de la transducción se calculó mediante la transducción de AAV incubado con HSA con respecto al tratado con PBS.Figura 2:El efecto de la albúmina humana sobre la transducción de AAV8.(a)La mejora de la transducción está relacionada con la interacción directa de AAV con suero. Los virus AAV8/luc se incubaron con suero humano o PBS a 1: 100 durante 2 h a 4 °C, luego la mezcla se usó para transducir células Huh7 en medio con FBS, medio libre de suero o medio libre de suero más suero humano justo antes de la adición de AAV8 preincubado con PBS. 24 h después, se calculó el aumento en veces de la expresión transgénica.(b)Interacción de AAV8 con albúmina humana. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV8/luc con suero humano o PBS durante 2 horas a 4 °C, luego se aplicó la mezcla de virus y suero humano o PBS a la columna unida a pre-Ig. Después del lavado, las proteínas de unión a la columna se eluyeron para el análisis del número de copias del genoma de AAV8.(c)Transducción de AAV8 con suero reducido en albúmina. Se incubaron 1*108 partículas de AAV8/luc con suero humano o suero reducido en albúmina a diferentes diluciones o PBS durante 2 horas a 4 °C. Luego, la mezcla se usó para infectar células Huh7 en medio libre de suero. Dos días después, se detectó luciferasa en el lisado celular y se calculó el aumento en veces de la expresión transgénica en comparación con PBS.(d)La albúmina humana recombinante mejora la transducción de AAV8. AAV8/luc se incubó con albúmina humana recombinante (50 mg/ml) o suero humano a diferentes diluciones o PBS. La expresión transgénica se detectó 48 horas después y se calculó el aumento en veces de la expresión transgénica en comparación con PBS.
Figura 3:El efecto de la albúmina humana de grado clínico sobre la transducción de AAV8. (a) Transducción mejorada de AAV8 en células Huh7 de HSA de grado clínico. Se incubaron 1*108 partículas de AAV8/luc con HSA al 5% o suero humano a diferentes diluciones o PBS durante 2 horas a 4 °C. Luego, la mezcla se usó para transducir células Huh7; 48 horas después, se analizó la expresión de luciferasa.(b)Transducción mejorada de AAV8 de HSA de grado clínico después de la administración sistémica. Se incubaron 1x1010 partículas de AAV8/luc con HSA al 25% a diferentes diluciones y luego se inyectaron en ratones C57BL hembra adultos a través de retroorbital. Se tomó imagenología el día 7. Panel superior: Imagen animal representativa. Panel inferior: Datos de transducción de AAV mejorada de 6 ratones después de la administración sistémica.(c)Transducción mejorada de AAV de HSA de grado clínico después de la inyección muscular. Se incubaron 1*109 partículas de AAV8/luc con HSA al 25% a diferentes diluciones y luego se inyectaron en los músculos en ratones C57BL. Una semana después, se realizó la imagenología. Panel superior: Imagen animal representativa. Parte inferior: Datos de transducción de AAV mejorada de 6 o 7 ratones después de la inyección muscular.
Figura 4:La incubación del vector AAV con HSA antes de la congelación o después de la descongelación de los virus tiene un efecto mejorado similar.(a)Transducción mejorada en células Huh7. Se incubaron 1*108 partículas de AAV/luc con HSA de grado clínico a diferentes diluciones durante 2 horas a 4 °C antes de la congelación del virus o después de la descongelación del virus, y luego se adicionaron a las células Huh7. 48 h después, se midió la actividad de luciferasa en el lisado celular.(b)y(c)Transducción muscular mejorada. Se inyectaron directamente 1*109 partículas de AAV8/luc en los músculos de los ratones. En el día 7 después de la inyección, se llevó a cabo la obtención de imagenología del ratón(b)(panel izquierdo) y se calculó el aumento en veces(c)de la expresión del transgén (panel derecho, n=6). Boca arriba: pierna izquierda-HSA, pierna derecha-PBS.
Figura 5:La adición de HSA a la preparación del virus antes de la diálisis no compromete la mejora de la transducción. Los virus AAV8/luc purificados de CsCl o columna, se mezclaron con 1% de HAS al 25% y luego se aplicaron para diálisis contra PBS. Después de la diálisis, los virus AAV se congelaron; dos días después, se realizó el ensayo de transducciónin vivo.Para la transducción hepática, se administraron 1*1010 partículas de AAV/luc mediante inyección retroorbital; la imagenología se tomó el día 3 después de la inyección de AAV para 5 ratones(a).Para la transducción muscular, se utilizaron 1*109 partículas de AAV/luc; la imagenología se realizó el día 7 después de la inyección para 4 ratones(a).Boca arriba: pierna izquierda-HSA, pierna derecha-PBS. También se realizó la cuantificación de imagenología(b).
Figura 6:La albúmina humana aumenta la capacidad de unión a AAV.(a)HSA aumenta la unión del virus AAV a las células Huh7. Los virus AAV se incubaron con HSA durante 2 horas a 4 °C y luego se adicionaron a 1*106 células Huh7 durante 5 o 15 minutos a 4 °C. Después de lavar 5 veces, se extrajo el ADN total para el análisis del número de copias del genoma de AAV mediante q-PCR.(b)Imagenología de la transducción hepática. Se administraron 1X1011 partículas de AAV8/luc a ratones a través de la vena retroorbital. Veinticuatro horas después, se llevó a cabo la obtención de imagenología y se calculó la cuantificación de la imagenología(c).Cuarenta y ocho horas después, los ratones se sacrificaron y se recolectó tejido hepático; se midió la actividad luciferasa en el lisado de tejido hepático(d)y se analizó el número de copias del genoma de AAV(e).Durante las primeras 24 horas, se recolectó plasma de la sangre a los 15 minutos, 2 horas y 24 horas después de la inyección de AAV, y se analizó el número de copias del genoma de AAV(f).Los datos representaron el promedio de 4 ratones y las desviaciones estándar. (*) indica una diferencia estadísticamente significativa con p<0,05 cuando se comparó el número de copias del genoma de AAV en el hígado con el tratamiento con HSA con el de PBS.
Figura 7:La interacción de la albúmina humana con AAV no bloquea la actividad de Nab. El vector AAV8/luc se incubó primero con albúmina humana durante 2 horas a 4 °C, luego se adicionó IVIG humana a diferente dilución durante otras 2 horas a 4 °C. La mezcla se adicionó a las células Huh7. A las 48 horas, se midió la expresión transgénica del lisado celular y se calculó el título de Nab.(a)El efecto de la interacción de la albúmina humana con los viriones de AAV sobre la actividad de Nab.(b)El efecto de la IgIV en la potenciación de la transducción de AAV con albúmina humana.
Figura 8:Mejora de la corrección fenotípica de la hemofilia B utilizando el vector AAV incubado con albúmina humana. Se incubaron 2*109 partículas del vector AAV8/FIX-opt con HSA o PBS humano durante 2 h a 4 °C, luego se administró el vector AAV a ratones machos adultos con deficiencia de FIX mediante inyección en la vena de la cola. Después de la inyección de AAV, se recolectó sangre en los puntos de tiempo indicados para la expresión de FIX(a)y el ensayo de función(b).En la semana 6 después de la inyección de AAV, se aplicó a los ratones el ensayo de sangradoin vivo(c).(*) indica una diferencia estadísticamente significativa para la pérdida de sangre entre los ratones tratados con HSA y los ratones PBS con p<0,05. Los datos se basan en el promedio y las desviaciones estándar de 6 a 8 ratones.
Figura 9:El suero de ratón mejora la transducción de AAV8in vivo.(a)Transducción mejorada de AAV después de la administración sistémica. Se incubaron 1* 1010 partículas de AAV8/luc con suero de ratón a diferentes diluciones durante 2 horas a 4 °C. La mezcla se administró a ratones C57BL mediante inyección retroorbital. La imagenología se llevó a cabo durante 5 minutos el día 3 después de la inyección de AAV.(b)Transducción mejorada de AAV después de la inyección muscular. Se inyectaron 1*109 partículas de AAV8 incubadas con suero de ratón en el músculo de la pata trasera del ratón. En la semana 2 después de la inyección, se tomó la imagen durante 5 minutos. Boca arriba: pierna izquierda-AAV8 sueros humanos, pierna derecha-AAV8 PBS. El aumento en veces de la transducción se calculó mediante la transducción de AAV incubado con HSA al de uno tratado con PBS. Panel superior: imagenologia representativa. Parte inferior: Datos de transducción de AAV mejorada de 3 o 4 ratones.
Figura 10:Los sueros de perros y primates mejoran la transducción de AAV en células Huh7. Se incubaron 1*108 partículas de vector AAV/luc con sueros diluidos 1:500 de 6 perros(a),o 23 primates(b),o bovinos fetales(c),o PBS durante 2 horas a 4 °C. La mezcla de vector AAV y sueros se aplicó para transducir células Huh7 en presencia de adenovirus dl309. Después de 24 h, se analizó la actividad luciferasa del lisado celular. El aumento en veces de la expresión transgénica de la incubación de sueros se calculó mediante comparación con PBS.
Figura 11:Concentración de albúmina humana en suero reducido en albúmina.
Figura 12:rHSA mejora la transducción de AAV8in vivo.(a)Transducción mejorada de AAV8 de rHSA después de la administración sistémica. Se administraron 1 * 1010 partículas de AAV8 preincubadas con rHSA en ratones C57BL mediante inyección retroorbital. La imagen se tomó el día 3 después de la inyección.(b)Transducción mejorada de AAV de rHSA después de la inyección muscular. Se inyectaron 1*109 partículas de AAV8/luc incubadas con rHSA en los músculos de las patas traseras. En la semana 2 después de la inyección, se llevó a cabo la imagenología. Panel superior: imagenologia representativa. Parte inferior: Datos de transducción de AAV mejorada de 3 o 4 ratones.
Figura 13:Transducción de AAV mejorada a largo plazo con HSA de grado clínico. Después de la administración muscular de AAV8, se realizó imagenología en los puntos de tiempo indicados. Panel izquierdo: imagenologia representativa. Panel derecho: Datos de transducción de AAV mejorada de 3 o 4 ratones después de la inyección muscular.
Figura 14:El efecto del grado clínico de la albúmina humana en la transducción de AAV de otros serotipos.(a)HSA mejora la transducción de AAV2 en células Huh7. Se incubaron 1*108 partículas de AAV2/luc con suero humano o HSA de grado clínico al 5% a diferente dilución durante 2 horas a 4 °C y luego se adicionaron a Huh7. 48 horas después, se detectó actividad de luciferasa en el lisado celular.(b)HSA mejora la transducción de AAV9 en células Huh7(c)y(d).La HSA mejora la transducción hepática o muscular en ratones C57BL de AAV2 y AAV9. La imagenología de la transducción de AAV(c)y la cuantificación de la imagenología(d).Para la transducción hepática, se administraron 1 *1010 partículas de AAV/luc incubadas con 1 vez de HSA mediante inyección retroorbital (n=4), la imagenología se tomó el día 7 (AAV2) o el día 3 (AAV9) después de la inyección de AAV. Para la transducción muscular, se utilizaron 1*109 partículas de AAV/luc incubadas con 1 vez de HSA (n=3); la imagenologia se realizó el día 7 después de la inyección.
Figura 15:El efecto de LDL y transferrina en la transducción de AAVin vitro.Se incubaron 10000 partículas de vectores AAV8/luc por célula con LDL o transferencia a diferentes diluciones de concentración plasmática fisiológica normal durante 2 h a 4 °C, luego se adicionaron a células Huh7(A)o 293T(B)en una placa de 48 pocillos. Cuarenta y ocho horas después, las células se lisaron y el sobrenadante se cosechó para el análisis de la actividad de la luciferasa. Los datos representaron el promedio de tres experimentos independientes y desviaciones estándar.
Figura 16:Los receptores de bloqueo para LDL y transferrina afectan la transducción de AAV8 en ratones. A los ratones se les inyectaron 0,5 mg de LDL o 1 mg de lactoferrina a través de la vena retroorbital, y 5 minutos después, se administraron sistémicamente 1*1010 partículas del vector AAV8/luc. En la semana 1 después de la inyección de AAV, se tomaron imagenología de ratón(A)y se calculó la expresión transgénica en el hígado(B).Los datos representaron el promedio de 5 ratones y la desviación estándar.
Figura 17: El efecto de diferentes dosis de LDL o transferrina en la transducción hepática de AAV8. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV8/luc con LDL o transferrina a diferentes diluciones de la concentración fisiológica normal durante 2 h a 4 °C y luego se administraron a ratones C57BL mediante inyección retroorbital. En el día 3 después de la inyección de AAV, se tomó imagenología de los ratones(AyC)y se cuantificó la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(ByD).Los datos representaron el promedio y las desviaciones estándar de 5 ratones.
Figura 18:LDL y transferrina aumentan la capacidad de unión a AAV. Los virus AAV se incubaron con proteínas séricas durante 1 hora a 4 °C y luego se adicionaron a 1*106 células Huh7 o células 293 T durante 2 horas a 4 °C. Después de lavar 5 veces, se extrajo el ADN total para el análisis del número de copias del genoma de AAV mediante q-PCR.
Figura 19:La cinética de la eliminación del vector AAV en sangre después de la administración sistémica de AAV8 incubado con LDL o transferrina. Se incubaron 1*1011 partículas de AAV8/luc con 500 ug de LDL o 1 mg de transferrina durante 1 h a 4 °C y luego se administraron a ratones C57BL mediante inyección retroorbital. En el día 2 después de la inyección de AAV, se tomó imagenología de los ratones(A)y se realizó la cuantificación de la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B).En los puntos de tiempo indicados, se recolectó plasma de ratón y se detectó el número de copias del genoma de a AV mediante PCR cuantitativa(C).Los datos representaron el promedio de 5 ratones y las desviaciones estándar.
Figura 20:El efecto de LDL o transferrina en la biodistribución del vector AAV8. Los ratones de la Figura 5 se sacrificaron el día 5 después de la administración de AAV y los tejidos se recolectaron para el ensayo de actividad de luciferasain vitro(A)y el análisis del número de copias del genoma(B).
Figura 21:El efecto de la combinación de proteínas séricas sobre la transducción de AAVin vitro.Se incubaron 10000 partículas de vectores AAV8/luc por célula con la combinación de LDL o transferencia o albúmina con dos proteínas o tres proteínas durante 2 h a 4 °C, luego se aplicaron a células 293T o Huh7. Cuarenta y ocho horas después, se analizó el sobrenadante del lisado celular para determinar la actividad luciferasa. Los datos representaron el promedio de tres experimentos independientes y desviaciones estándar.
Figura 22:El efecto de la combinación de proteínas séricas sobre la transducción hepática de AAV en ratones. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV8/luc con proteína sérica individual, o en combinación de las tres proteínas (LDL, transferrina y albúmina), a una dilución de 100 veces de la concentración fisiológica durante 2 horas a 4 °C, y luego se inyectaron en ratones. El día 3 y el día 7 después de la inyección de AAV, se llevó a cabo la imagenología(A)y se analizó la expresión del transgén hepático(B).Los resultados representaron el promedio y las desviaciones estándar de 5 ratones.
Figura 23:Análisis de unión competitiva de proteínas séricas en viriones AAV8. Para el ensayo competitivo de albúmina(A), se incubaron 1*1010 partículas de vectores AAV8/luc con albúmina a diferentes diluciones y LDL, transferrina o ApoB a una dilución de 100 veces durante 1 h a 4 °C. A continuación, los anticuerpos específicos para ApoB y transferrina se adicionaron a los tubos correspondientes para la inmunoprecipitación. Después de la extracción, el título de virus se determinó mediante PCR cuantitativa. Para el ensayo de bloqueo(B),los vectores AAV8/luc se incubaron con albúmina a diferentes diluciones durante 30 minutos a 4 °C, luego se adicionó LDL, o transferrina, o ApoB a una dilución de 100 veces durante otra 1 hora. Después de desplegar, se determinó el título de virus. Los resultados representaron el promedio de tres experimentos individuales y la desviación estándar.
Figura 24:El fibrinógeno aumenta la transducción de AAV9. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV9/luc con 3 mg de fibrinógeno durante 2 h a 4 °C y luego se inyectaron en ratones C57BL a través de la vena retroorbital. En el día 7 después de la inyección de AAV, se tomó imagenología de los ratones (A) y se cuantificó la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B).Los datos representaron el promedio de 4 ratones y las desviaciones estándar.
Figura 25:Biodistribución del vector AAV después de la administración sistémica de AAV9 incubado con fibrinógeno. Los ratones de la Figura 1 se sacrificaron el día 10 después de la administración de AAV, y los tejidos se recolectaron para el ensayo de actividad de luciferasain vitro(A) y el análisis del número de copias del genoma(B).
Figura 26:El efecto de las dosis de fibrinógeno en la transducción de AAV9. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV9/luc con diferentes diluciones de fibrinógeno durante 2 h a 4 °C y luego se administraron a ratones C57BL mediante inyección retroorbital. En el día 5 después de la inyección de AAV, se tomó imagenología de los ratones(A)y se cuantificó la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B).Los datos representaron el promedio de 4 ratones y las desviaciones estándar.
Figura 27:La cinética de la eliminación del vector AAV en sangre después de la administración sistémica de AAV9 incubado con fibrinógeno. Se incubaron 2X1011 partículas de AAV9/luc con 1 mg de fibrinógeno durante 2 h a 4 °C y luego se administraron a ratones C57BL mediante inyección retroorbital. En el día 2 después de la inyección de AAV, se realizó imagenología de ratones(A)y se llevó a cabo la cuantificación de la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B).En los puntos de tiempo indicados, se recolectó plasma de ratón y se detectó el número de copias del genoma de AAV mediante PCR cuantitativa(C).Los datos representaron el promedio y las desviaciones estándar de 4 ratones.
Figura 28:Otras proteínas séricas mejoran la transducción hepática de AAV9. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV9/luc con diferentes proteínas a la dosis de concentración fisiológica durante 2 h a 4 °C y luego se inyectaron en ratones C57BL a través de la vena retroorbital. En el día 3 después de la inyección de AAV, se realizó imagenología de ratón(A)y se cuantificó la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B).Los datos representaron el promedio de 5 ratones y las desviaciones estándar.
Figura 29:Otras proteínas séricas mejoran la transducción cerebral de AAV9. Se tomaron imágenes de los ratones de la Figura 28 el día 7 después de la administración de AAV(A)y la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B)y se cuantificó el cerebro(C).Después de la imagenología, los ratones se sacrificaron. El número de copias del genoma de AAV se detectó en el hígado(D)y el cerebro(E).
Figura 30:El efecto de otras proteínas séricas a diferentes diluciones de concentración sanguínea fisiológica sobre la transducción de AAV9. 1*1010 partículas de AAV9/luc se incubaron con otras proteínas séricas a diferentes diluciones durante 2 h a 4 °C y luego se administraron a ratones C57BL mediante inyección retroorbital. En el día 3 después de la inyección de AAV, se tomó imagenología de los ratones(A)y se cuantificó la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B).Los datos representaron el promedio y las desviaciones estándar de 5 ratones.
Figura 31:Potenciación de la transducción de AAV9 por interacción con crioprecipitado. Se incubaron 1*1010 partículas de AAV9/luc con diferentes diluciones de crioprecipitado durante 2 h a 4 °C y luego se administraron sistémicamente a ratones C57BL. En el día 3 después de la inyección de AAV, se tomó imagenología de los ratones(A)y se cuantificó la expresión de luciferasa transgénica en el hígado(B).Los datos representaron el promedio de 5 ratones y las desviaciones estándar.
Figura 32:Efecto de la interacción de la albúmina con los viriones de AAV sobre la actividad de inhibición del anticuerpo neutralizante A20.
Figura 33:La estabilidad del complejo HSA/AAV.(A)La estabilidad del complejo en las diferentes concentraciones de NaCl.(B)La estabilidad del complejo en los diferentes pH.
Figura 34:El efecto de As2O3 y los inhibidores del proteasoma sobre la transducción de AAV2. Los ratones Balb/C recibieron 1*1011 partículas de AAV2/luc y 5 mg de As2O3/kg durante 5 días(A),o 0,5 mg de bortezomib/kg, 1 mg de carfilzomib/kg al mismo tiempo(B).La transducción se analizó mediante imagenología en vivo a los 7 días después de la inyección de AAV.
Figura 35:HSA mejora la transducción de AAV.(A)El resultado del análisis de espectrometría de masas.(B)Interacción de AAV2 con albúmina humana.(C)Disminución de la transducción de AAV con suero reducido en albúmina.(D)La albúmina humana recombinante mejora la transducción de AAV2 en células Huh7.(E)Transducción mejorada de AAV8 de rHSA en células Huh7.(F)Transducción hepática mejorada de AAV8 de rHSA después de la administración sistémica. Panel superior: imagenología. Panel inferior: Datos de la transducción mejorada de AAV después de la inyección sistémica.(G)Transducción mejorada de AAV8 de rHSA después de la inyección muscular. Panel superior: imagenología. Boca arriba: pierna izquierda-rHSA, pierna derecha-PBS. Panel inferior: Datos de la transducción mejorada de AAV después de la inyección muscular.
Figura 36:La presentación del antígeno de la cápside después de la transducción de AAVOVA responde ala dosis in vivo.Se inyectaron varias dosis de vector AAV2OVA/AAT por vía intravenosa en ratones C57BL/6 y 3 días después, se transfirieron células T OT-1 marcadas con CFSE. El día 10 después de la transferencia, se evaluó la proliferación de linfocitos T OT-1 en el bazo mediante citometría de flujo.(A)Histogramas representativos de citometría de flujo.(B)Promedio de proliferación de células T y desviación estándar de cuatro ratones.(C)Índice de proliferación promedio (IP) y desviación estándar. **p<0,01, *p<0,05 en comparación con los ratones de control sin tratamiento con AAV.
Figura 37:La cinética de la presentación del antígeno de la cápside después de la transducción de AAV8OVA en ratones. Las partículas del virus AAVOVA/AAT (1*1011) se inyectaron por vía intravenosa en ratones C57BL/6, y en los puntos de tiempo indicados, se transfirieron 5*106 células T OT-1 marcadas con CFSE. Diez días después de la transferencia, se midió la proliferación de células T CD8+ OT-1 mediante citometría de flujo.(A)Promedio de proliferación de células T y desviación estándar para cuatro ratones.(B)Índice de proliferación promedio (IP) y desviación estándar. **p<0,01, *p<0,05 en comparación con los ratones de control sin tratamiento con AAV.
Figura 38:Inhibición de la presentación del epítopo OVA por VIPR.
Figura 39:Mutantes aislados de hígado de ratón en presencia de IVIG.
Figura 40:Inhibición del péptido en la actividad de Nab. El ensayo de NAb se realizó mediante la incubación de una dilución predeterminada de A20 y plasma de ratones C57/BL o Balb/C inmunizados con AAV2 con péptidos, luego se incubaron con el vector AAV2/GFP Después de la transducción en células RC32, las células se cosecharon y se aplicaron para el análisis de citometría de flujo.
Figura 41:El efecto de la IVIG humana sobre la transducción hepática de AAV8. Se incubaron 1 * 1010 partículas de vectores AAV8/luc con diferentes concentraciones de IVIG o PBS, luego se administraron mediante inyección retroorbital en ratones C57BL/6. Una semana después, se realizó imagenología y se analizaron para determinar la expresión de luciferasa en la región hepática, (a) La imagenologia de la expresión de luciferasa de ratones (n=4). (b) Inhibición de la transducción sistémica de AAV8 usando IVIG humana. Los datos representan el promedio de cuatro ratones y la derivación estándar.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran realizaciones representativas de la invención. Sin embargo, esta invención puede realizarse de diferentes formas y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones establecidas en la presente. Más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta descripción sea exhaustiva y completa, y transmita completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología utilizada en la descripción de la invención en la presente tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitante de la invención.
La designación de todas las posiciones de aminoácidos en las proteínas de la cápside de AAV en la descripción de la invención y las reivindicaciones adjuntas es con respecto a la numeración de la subunidad de la cápside de VP1 (proteína de la cápside de VP1 de AAV2 nativa: N.° de acceso al GenBank AAC03780 o YP680426). Los expertos en la técnica entenderán que las modificaciones descritas en la presente si se insertan en el gencapde AAV pueden dar como resultado modificaciones en las subunidades de la cápside VP1, VP2 y/o VP3. Alternativamente, las subunidades de la cápside se pueden expresar independientemente para lograr la modificación en solo una o dos de las subunidades de la cápside (VP1, VP2, VP3, VP1 VP2, VP1 VP3 o VP2 VP3).
Definiciones
Los siguientes términos se utilizan en la descripción de la presente y en las reivindicaciones adjuntas:Las formas singulares "un", "una" y "el/la" pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Además, el término "aproximadamente", como se usa en la presente cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de la longitud de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, dosis, tiempo, temperatura y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0,5% o incluso ± 0,1% de la cantidad especificada.
También como se usa en la presente, "y/o" se refiere y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpreta de manera alternativa ("o").
Tal como se usa en la presente, la frase de transición "que consiste esencialmente en" significa que el alcance de una reivindicación debe interpretarse para abarcar los materiales o pasos especificados enumerados en la reivindicación, "y aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas" de la invención reivindicada.Ver, In re Herz,537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461,463 (CCPA 1976) (énfasis en el original);ver tambiénMPEP § 2111.03. Por lo tanto, el término "que consiste esencialmente en" cuando se usa en una reivindicación de esta invención no pretende interpretarse como equivalente a "que comprende". A menos que el contexto indique lo contrario, se pretende específicamente que las diversas características de la invención descritas en la presente se puedan utilizar en cualquier combinación.
Para ilustrar adicionalmente, si, por ejemplo, la especificación indica que un aminoácido particular se puede seleccionar de A, G, I, L y/o V, este lenguaje también indica que el aminoácido se puede seleccionar de cualquier subconjunto de estos aminoácidos, por ejemplo, A, G, I o L; A, G, I o V; A o G; solo L; etc., como si cada subcombinación se estableciera expresamente en la presente. Además, dicho lenguaje también indica que uno o más de los aminoácidos especificados pueden ser rechazados(porejemplo,por condición negativa). Por ejemplo, en ejemplos particulares, el aminoácido no es A, G o I; no es A; no es G o V; etc., como si cada uno de estos posibles descargos de responsabilidad se estableciera expresamente en la presente.
Tal como se usa en la presente, los términos "reducir", "reduce", "reducción" y términos similares significan una disminución de al menos aproximadamente 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o más.
Tal como se usa en la presente, los términos "potenciar", "potencia", "potenciación" y términos similares indican un aumento de al menos aproximadamente 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% o más.
El término "parvovirus", como se usa en la presente, abarca la familiaParvoviridae,que incluye parvovirus y dependovirus de replicación autónoma. Los parvovirus autónomos incluyen miembros de los génerosParvovirus, Eritrovirus, Densovirus, IteravirusyContravirus.Los parvovirus autónomos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, virus diminutos de ratón, parvovirus bovino, parvovirus canino, parvovirus de pollo, virus de panleucopenia felina, parvovirus felino, parvovirus de ganso, parvovirus H1, parvovirus de pato moscovita, virus B19 y cualquier otro parvovirus autónomo ahora conocido o descubierto posteriormente. Los expertos en la técnica conocen otros parvovirus autónomos.Ver, por ejemplo,BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capítulo 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).
Tal como se usa en la presente, el término "virus adenoasociado" (AAV) incluye, pero no se limita a, AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluidos los tipos 3A y 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AaV tipo 6 , AaV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino y cualquier otro AAV ahora conocido o descubierto posteriormente.Ver, por ejemplo,BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capítulo 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers). Se han identificado varios serotipos y clados de AAV relativamente nuevos(ver, por ejemplo,Gao et al., (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris et al., (2004) Virology 33-:375-383; y Tabla 3).
Las secuencias genómicas de varios serotipos de AAV y los parvovirus autónomos, así como las secuencias de las repeticiones terminales (TR) nativas, las proteínas Rep y las subunidades de la cápside son conocidas en la técnica. Dichas secuencias se pueden encontrar en la literatura o en bases de datos públicas como tal GenBank.Ver, por ejemplo,los números de acceso al GenBank NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852, AY530579; cuyas descripciones enseñan secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de parvovirus y AAV.Ver también, por ejeplo.,Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555; Chiarini et al., (1998) J. Virology 71:6823; Chiarini et al., (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al., (2004) Virology 33-:375- 383; publicaciones de patentes internacionales WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y la patente de los Estados Unidos n .° 6,156,303; cuyas descripciones enseñan secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de parvovirus y AAV.Ver tambiénla Tabla 1.
Las estructuras de la cápside de parvovirus autónomos y AAV se describen con más detalle en BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capítulos 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).Ver también ladescripción de la estructura cristalina de AAV2 (Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99:10405-10), AAV4 (Padron et al., (2005) J. Virol.
79: 5047-58), AAV5 (Walters et al., (2004) J. Virol. 78: 3361-71) y CPV (Xie et al., (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520 y Tsao et al., (1991) Science 251: 1456-64).
El término "tropismo", tal como se usa en la presente, se refiere a la entrada preferencial del virus en determinadas células o tejidos,opcionalmente seguida de la expresión (por ejemplo,transcripción y, opcionalmente, traducción) de una o más secuencias transportadas por el genoma viral en la célula,por ejemplo,para un virus recombinante, expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos de interés.
Como se usa en la presente, "tropismo sistémico" y "transducción sistémica" (y términos equivalentes) indican que la cápside del virus o el vector del virus exhibe tropismo y/o transduce tejidos en todo el cuerpo(por ejemplo,cerebro, pulmón, músculo esquelético, corazón, hígado, riñón y/o páncreas). En algunos casos, se observa la transducción sistémica del sistema nervioso central(por ejemplo,cerebro, células neuronales, etc.). En algunos casos, se logra la transducción sistémica de los tejidos musculares cardíacos.
Tal como se usa en la presente, "tropismo selectivo" o "tropismo específico" significa la administración de vectores de virus y/o la transducción específica de ciertas células diana y/o ciertos tejidos.
A menos que se indique lo contrario, "transducción eficiente" o "tropismo eficiente", o términos similares, se pueden determinar por referencia a un control adecuado(por ejemplo,al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500% o más de la transducción o tropismo, respectivamente, del control). En ejemplos, el vector de virus transduce de manera eficiente o tiene tropismo eficiente para células neuronales y cardiomiocitos. Los controles adecuados dependerán de una variedad de factores que incluyen el tropismo deseado y/o el perfil de transducción.
De manera similar, se puede determinar si un virus "no transduce de manera eficiente" o "no tiene tropismo eficiente" para un tejido diana, o términos similares, por referencia a un control adecuado. En ejemplos, el vector viral no transduce de manera eficiente(es decir,no tiene tropismo eficiente) para células hepáticas, renales, gónadas y/o germinales. En ejemplos, la transducción(porejemplo,transducción indeseable) de tejido(s)(por ejemplo,hígado) es 20% o menos, 10% o menos, 5% o menos, 1% o menos, 0,1% o menos del nivel de transducción del tejido(s) diana deseado(por ejemplo,músculo esquelético, músculo del diafragma, músculo cardíaco y/o células del sistema nervioso central).
Una partícula de AAV que comprende una cápside puede demostrar múltiples fenotipos de transducción eficiente de ciertos tejidos/células y niveles muy bajos de transducción(por ejemplo,transducción reducida) para ciertos tejidos/células, cuya transducción no es deseable.
Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido" abarca tanto péptidos como proteínas, a menos que se indique lo contrario.
Un "polinucleótido" es una secuencia de bases de nucleótidos, y puede ser secuencias híbridas de ARN, ADN o ADN-ARN (que incluyen nucleótidos tanto de origen natural como de origen no natural), pero en ejemplos representativos son secuencias de ADN de hebra individual o de doble hebra.
Como se usa en la presente, un polinucleótido "aislado"(por ejemplo,un "ADN aislado" o un "ARN aislado") significa un polinucleótido al menos parcialmente separado de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus de origen natural, por ejemplo, la célula o componentes estructurales virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos comúnmente encontrados asociados con el polinucleótido. En ejemplos representativos, un nucleótido "aislado" se enriquece en al menos aproximadamente 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10,000 veces o más en comparación con el material de partida.
Del mismo modo, un polipéptido "aislado" significa un polipéptido que está al menos parcialmente separado de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus de origen natural, por ejemplo, los componentes estructurales celulares o virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos que se encuentran comúnmente asociados con el polipéptido. En ejemplos representativos, un polipéptido "aislado" se enriquece en al menos aproximadamente 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10.000 veces o más en comparación con el material de partida.
Una "célula aislada" se refiere a una célula que está separada de otros componentes con los que normalmente se asocia en su estado natural. Por ejemplo, una célula aislada puede ser una célula en medio de cultivo y/o una célula en un portador farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, una célula aislada se puede administrar y/o introducir en un sujeto. En algunos ejemplos, una célula aislada puede ser una célula que se retira de un sujeto y se manipula como se describe en la presenteex vivoy luego se devuelve al sujeto.
Tal como se usa en la presente, por "aislar" o "purificar" (o equivalentes gramaticales) un vector de virus o partícula de virus o población de partículas de virus, se entiende que el vector de virus o partícula de virus o población de partículas de virus está al menos parcialmente separado de al menos algunos de los otros componentes en el material de partida. En ejemplos representativos, un vector de virus "aislado" o "purificado" o partícula de virus o población de partículas de virus se enriquece en al menos aproximadamente 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10.000 veces o más en comparación con el material de partida.
Un "polipéptido terapéutico" es un polipéptido que puede aliviar, reducir, prevenir, retrasar y/o estabilizar los síntomas que resultan de una ausencia o defecto en una proteína en una célula o sujeto y/o es un polipéptido que de otro modo confiere un beneficio a un sujeto,por ejemplo,efectos anticancerígenos o mejora en la supervivencia del trasplante o inducción de una respuesta inmunitaria.
Por los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento de" (y variaciones gramaticales de los mismos) se entiende que la gravedad de la afección del sujeto se reduce, mejora o estabiliza al menos parcialmente y/o que se logra algún alivio, mitigación, disminución o estabilización en al menos un síntoma clínico y/o hay un retraso en la progresión de la enfermedad o trastorno.
Los términos "prevenir", "previniendo" y "prevención" (y variaciones gramaticales de los mismos) se refieren a la prevención y/o retraso de la aparición de una enfermedad, trastorno y/o uno o más síntomas clínicos en un sujeto y/o una reducción en la gravedad de la aparición de la enfermedad, trastorno y/o uno o más síntomas clínicos en relación con lo que ocurriría en ausencia de los métodos de la presente descripción. La prevención puede ser completa,por ejemplo,la ausencia total de la enfermedad, trastorno y/o síntoma(s) clínico (s). La prevención también puede ser parcial, de modo que la aparición de la enfermedad, trastorno y/o síntoma(s) clínico (s) en el sujeto y/o la gravedad del inicio sea sustancialmente menor de lo que ocurriría en ausencia de la presente descripción.
Una cantidad "eficaz para el tratamiento" como se usa en la presente es una cantidad que es suficiente para proporcionar alguna mejora o beneficio al sujeto. Alternativamente, una cantidad "eficaz para el tratamiento" es una cantidad que proporcionará algún alivio, mitigación, disminución o estabilización en al menos un síntoma clínico en el sujeto. Los expertos en la técnica apreciarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre que se proporcione algún beneficio al sujeto.
Una cantidad "eficaz para la prevención" como se usa en la presente es una cantidad que es suficiente para prevenir y/o retrasar la aparición de una enfermedad, trastorno y/o síntomas clínicos en un sujeto y/o para reducir y/o retrasar la gravedad de la aparición de una enfermedad, trastorno y/o síntomas clínicos en un sujeto con respecto a lo que ocurriría en ausencia de los métodos de la descripción. Los expertos en la técnica apreciarán que el nivel de prevención no necesita ser completo, siempre y cuando se proporcione algún beneficio preventivo al sujeto.
Los términos "secuencia de nucleótidos heteróloga" y "molécula de ácido nucleico heteróloga" se usan indistintamente en la presente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico que no se produce de forma natural en el virus. Generalmente, la molécula de ácido nucleico heteróloga o secuencia de nucleótidos heteróloga comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido y/o ARN no traducido de interés(por ejemplo,para la administración a una célula y/o sujeto).
Como se usa en la presente, los términos "vector de virus", "vector" o "vector de suministro de genes" se refieren a una partícula de virus(por ejemplo,AAV) que funciona como un vehículo de suministro de ácido nucleico, y que comprende el genoma del vector(por ejemplo,ADN viral [ADNv) envasado dentro de un virión. Alternativamente, en algunos contextos, el término "vector" puede usarse para referirse al genoma del vector/ADNv solo.
Un "genoma de vector de rAAV" o "genoma de rAAV" es un genoma de AAV(es decir,ADNv) que comprende una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas. Los vectores de rAAV generalmente requieren solo la (s) repetición(es) terminal (es) (TR(s)) encispara generar virus. Todas las demás secuencias virales son prescindibles y pueden suministrarse entrans(Muzyczka, (1992)Curr. Temas Microbiol. Immunol.158:97). Habitualmente, el genoma del vector rAAV solo retendrá la una o más secuencias TR para maximizar el tamaño del transgén que puede ser envasado eficientemente por el vector. Las secuencias que codifican para proteínas estructurales y no estructurales pueden proporcionarse entrans(por ejemplo,a partir de un vector, tal como un plásmido, o integrando de forma estable las secuencias en una célula de envasado). En realizaciones de la invención, el genoma del vector rAAV comprende al menos una secuencia TR(porejemplo,secuencia TR de AAV), opcionalmente dos TR(por ejemplo,dos TR de AAV), que habitualmente estarán en los extremos 5' y 3' del genoma del vector y flanquearán el ácido nucleico heterólogo, pero no es necesario que sean contiguos a este. Las TR pueden ser iguales o diferentes entre sí.
El término "repetición terminal" o "TR" incluye cualquier repetición terminal viral o secuencia sintética que forma una estructura de horquilla y funciona como una repetición terminal invertida(es decir,media las funciones deseadas tal como replicación, envasado de virus, integración y/o rescate de provirus, y similares). El TR puede ser un TR AAV o un TR no AAV. Por ejemplo, una secuencia de TR no AAV tal como las de otros parvovirus(por ejemplo,parvovirus canino (CPV), parvovirus de ratón (MVM), parvovirus humano B-19) o cualquier otra secuencia de virus adecuada(por ejemplo,la horquilla de SV40 que sirve como el origen de la replicación de SV40) se puede utilizar como TR, que se puede modificar adicionalmente mediante truncamiento, sustitución, deleción, inserción y/o adición. Además, la TR puede ser parcial o completamente sintética, tal como la "secuencia doble D" como se describe en la patente de los Estados Unidos n .° 5.478.745 de Samulskiet al.
Una "repetición terminal de AAV" o "AAV TR" puede ser de cualquier AAV, que incluye, pero no se limita a, los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o cualquier otro AAV ahora conocido o descubierto posteriormente(ver, por ejemplo,la Tabla 1). Una repetición terminal de AAV no necesita tener la secuencia de repetición terminal nativa(por ejemplo,una secuencia TR de AAV nativa puede alterarse mediante inserción, deleción, truncamiento y/o mutaciones de sentido erróneo), siempre que la repetición terminal medie las funciones deseadas,por ejemplo,replicación, envasado de virus, integración y/o rescate de provirus, y similares.
Las proteínas de AAV VP1, VP2 y VP3 son proteínas de la cápside que interactúan conjuntamente para formar una cápside de AAV de simetría icosaédrica. VP1.5 es una proteína de la cápside de AAV descrita en la publicación de los Estados Unidos n .° 2014/0037585.
Los vectores de virus pueden ser además vectores de virus "dirigidos"(por ejemplo,que tienen un tropismo dirigido) y/o un parvovirus "híbrido"(es decir,en el que las TR virales y la cápside viral son de diferentes parvovirus) como se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28004 y Chao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619.
Los vectores de virus pueden ser además partículas de parvovirus dúplex como se describe en la publicación de patente internacional WO 01/92551. Los genomas de doble hebra (dúplex) se pueden envasar en las cápsides del virus.
Además, la cápside viral o los elementos genómicos pueden contener otras modificaciones, que incluyen inserciones, deleciones y/o sustituciones.
Una proteína de cápside "quimérica" como se usa en la presente significa una proteína de cápside de AAV que se ha modificado mediante sustituciones en uno o más (porejemplo,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína de cápside en relación con el tipo silvestre, así como inserciones y/o deleciones de uno o más(por ejemplo,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos en relación con el tipo silvestre. Los dominios completos o parciales, regiones funcionales, epítopos, etc., de un serotipo de AAV pueden reemplazar el dominio, región funcional, epítopo, etc. de tipo silvestre correspondiente de un serotipo de AAV diferente, en cualquier combinación, para producir una proteína de cápside quimérica. La producción de una proteína quimérica de la cápside se puede llevar a cabo de acuerdo con protocolos bien conocidos en la técnica y un gran número de proteínas quiméricas de la cápside se describen en la bibliografía, así como en la presente.
Tal como se usa en la presente, el término "aminoácido" abarca cualquier aminoácido de origen natural, formas modificadas del mismo y aminoácidos sintéticos.
Los aminoácidos levorrotatorios (L-) de origen natural se muestran en la Tabla 2.
Alternativamente, el aminoácido puede ser un residuo de aminoácido modificado (los ejemplos no limitantes se muestran en la Tabla 4) y/o puede ser un aminoácido que se modifica mediante modificación postraduccional (porejemplo,acetilación, amidación, formilación, hidroxilación, metilación, fosforilación o sulfatación).
Además, el aminoácido de origen no natural puede ser un aminoácido "no natural" como se describe por Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006). Estos aminoácidos no naturales se pueden utilizar ventajosamente para unir químicamente moléculas de interés a la proteína de la cápside de AAV.
Tal como se usa en la presente, el término "recombinación homóloga" significa un tipo de recombinación genética en la que las secuencias de nucleótidos se intercambian entre dos moléculas de ADN similares o idénticas. La recombinación homóloga también produce nuevas combinaciones de secuencias de ADN. Estas nuevas combinaciones de ADN representan la variación genética. La recombinación homóloga también se utiliza en la transferencia horizontal de genes para intercambiar material genético entre diferentes cepas y especies de virus.
Tal como se usa en la presente, el término "edición de genes", "modificación del genoma" o "modificación genética" significa un tipo de modificación genética en la que el ADN se inserta, elimina o reemplaza en el genoma de un organismo vivo usando nucleasas modificadas de forma genética o "tijeras moleculares". Estas nucleasas crean rupturas de doble hebra específicas del sitio (DSB) en las ubicaciones deseadas en el genoma.
Tal como se usa en la presente, el término "suministro de genes" significa un proceso mediante el cual el ADN extraño se transfiere a células hospedadoras para aplicaciones de terapia génica.
Tal como se usa en la presente, el término "CRISPR" significa Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas, que son el sello distintivo de un sistema de defensa bacteriano que forma la base de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9.
Tal como se usa en la presente, el término "dedo de zinc" significa un motivo estructural de proteína pequeña que se caracteriza por la coordinación de uno o más iones de zinc, con el fin de estabilizar el pliegue.
Proteínas de la cápside de AAV modificadas y cápsides de virus y vectores de virus con proteína unida a la superficie para mejorar la transducción y reducir la antigenicidad
La presente descripción se basa en el descubrimiento inesperado de que los viriones de AAV con proteína unida a la superficie tienen propiedades de transducción mejoradas y/o antigenicidad reducida. Por lo tanto, la descripción proporciona una partícula de virus adenoasociado (a Av ) que comprende una proteína unida a la superficie, en donde la proteína unida a la superficie de la partícula de AAV se selecciona del grupo que consiste en: (a) cadena alfa de fibrinógeno; (b) cadena beta de fibrinógeno; (c) cadena gamma de fibrinógeno; (d) fibronectina; (e) plasminógeno; (f) factor de von Willebrand; (g) glicoproteína alfa-1-ácido; (h) factor plaquetario 4; (i) crioprecipitado; (j) factor VIII; (k) factor XIII; (l) albúmina(por ejemplo,albúmina de suero humano y/o albúmina de cualquier otra especie tal como perro, caballo, vaca, cerdo, etc.); (m) apolipoproteína B (ApoB); (n) apolipoproteína E (ApoE); (o) transferrina; (p) lipoproteína de baja densidad; (q) cualquier proteína de suero de fusión que aumente la unión de AAV en la superficie celular o mejore el tráfico intracelular de AAV; y (r) cualquier combinación de (a)-(q) anterior.
La unión de las proteínas séricas a la partícula de AAV depende de la concentración de sal y el pH, como se ejemplifica en la sección de Ejemplos proporcionada en la presente.
La partícula de AAV puede ser un AAV de un serotipo o cualquier combinación de serotipos listados enla Tabla 10.
La partícula de AAV puede ser, individualmente o en cualquier combinación, AAV8, AAV9, AAV2, AAV2i8, AAV9.45 o cualquier mutante o variante de AAV descrito en la presente, ahora conocido o identificado posteriormente.
En algunas partículas de AAV, la proteína unida a la superficie de la partícula de AAV puede estar presente en la superficie de la partícula de AAV en una cantidad en un intervalo de aproximadamente 2000 moléculas de proteína por partícula de AAV a aproximadamente 4 * 107 moléculas de proteína por partícula de AAV (porejemplo,2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22.000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000, 30,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26.000, 27,000, 28,000, 29,000, 30,000, 31,000, 32,000, 33,000, 34,000, 35,000, 36,000, 37,000, 38,000, 39,000, 40,000, 41.000, 42,000, 43,000, 44,000, 45,000, 46,000, 47,000, 48,000, 49,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 1 * 106, 2 * 106, 3 * 106, 4 * 106, 5 * 106, 6 * 106, 7 * 106, 8 * 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, o 4 * 107, incluido cualquier número entre 2000 y 4 * 107 no expuestos explícitamente en la presente). El número de moléculas de proteína por partícula de AAV se puede determinar de acuerdo con protocolos conocidos en la técnica y como se ejemplifica en la sección de Ejemplos de la presente.
En algunos ejemplos, la partícula de AAV que comprende la proteína unida a la superficie tiene actividad de transducción mejorada y/o antigenicidad reducida en relación con una partícula de AAV que carece de la proteína unida a la superficie. Por consiguiente, la cantidad de moléculas de proteína unidas a la partícula de AAV puede ser una cantidad que mejore la actividad de transducción o reduzca la antigenicidad de la partícula de AAV con respecto a una partícula de AAV que carece de la proteína unida a la superficie.
En algunas realizaciones, la partícula de AAV de la presente invención puede comprender una molécula de ácido nucleico heteróloga.
La partícula de AAV puede ser un vector viral sintético diseñado para mostrar una gama de fenotipos deseables que son adecuados para diferentes aplicacionesin vitroein vivo.Una partícula de AAV puede comprender un virus adenoasociado (AAV).
La presente descripción proporciona una matriz de vectores virales sintéticos que muestran una variedad de fenotipos deseables que son adecuados para diferentes aplicacionesin vitroein vivo.En particular, la presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que la combinación de proteínas de la cápside de diferentes serotipos de AAV en una cápside individual permite el desarrollo de cápsides de AAV mejoradas que tienen múltiples fenotipos deseables en cada cápside individual. La presente invención proporciona una cápside de virus adenoasociado (AAV) que comprende una proteína viral 1 de AAV8 (VP1), proteína viral 2 de AAV8 (VP2) y proteína viral 3 de AAV2 (VP3), en donde la V<p>1 y, VP2, en la cápside son solo de AAV8, y la VP3 en la cápside es solo de AAV2. En la presente se describe un vector triploide AAV2/8/9, que se produce mediante cotransfección de plásmidos auxiliares de AAV de los serotipos 2, 8 y 9, tiene una transducción hepática de ratón mucho mayor que AAV2, similar a AAV8. Es importante destacar que el vector triploide AAV2/8/9 tiene una capacidad mejorada para escapar de los anticuerpos neutralizantes de los sueros inmunizados con serotipos parentales. Aunque AAV3 es menos eficiente en la transducción de todo el cuerpo del ratón después de la administración sistémica, los vectores haploides H-AAV83 o H-AAV93 o H-rh10-3 descritos en la presente, en los que VP3 es de AAV3 y VP1/VP2 de AAV8, 9 orrh10, inducen la transducción de todo el cuerpo, así como una transducción mucho mayor en el hígado y otros tejidos, en comparación con AAV3.
Una cápside de virus adenoasociado (AAV) puede comprender la proteína VP1 de la cápside, en donde dicha proteína VP1 de la cápside es de uno o más de un primer serotipo de AAV y la proteína VP3 de la cápside, en donde dicha proteína VP3 de la cápside es de uno o más de un segundo serotipo de AAV y en donde al menos uno de dicho primer serotipo de AAV es diferente de al menos uno de dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación.
Una cápside puede comprender la proteína VP2 de la cápside, en donde dicha proteína VP2 de la cápside es de uno o más de un tercer serotipo de AAV, en donde al menos uno de dicho uno o más de un tercer serotipo de AAV es diferente de dicho primer serotipo de AAV y/o dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación. La cápside de AAV descrita en la presente puede comprender la proteína de la cápside VP1.5. VP1.5 se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos n .° 2014/0037585 y la secuencia de aminoácidos de VP1.5 se proporciona en la presente.
Una cápside puede comprender la proteína de la cápside VP1.5, en donde dicha proteína de la cápside VP1.5 es de uno o más de un cuarto serotipo de AAV, en donde al menos uno de dicho uno o más de un cuarto serotipo de AAV es diferente de dicho primer serotipo de AAV y/o dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación. La proteína de la cápside de AAV descrita en la presente puede comprender la proteína de la cápside VP2.
Una cápside de AAV puede comprender la proteína VP1 de la cápside, en donde dicha proteína VP1 de la cápside es de uno o más de un primer serotipo de AAV y la proteína VP2 de la cápside, en donde dicha proteína VP2 de la cápside es de uno o más de un segundo serotipo de AAV y en donde al menos uno de dicho primer serotipo de AAV es diferente de al menos uno de dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación.
Una partícula de AAV puede comprender una cápside que comprende la proteína de la cápside VP3, en donde dicha proteína de la cápside VP3 es de uno o más de un tercer serotipo de AAV, en donde al menos uno de dicho uno o más de un tercer serotipo de AAV es diferente de dicho primer serotipo de AAV y/o dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación. Una cápside de AAV puede comprender la proteína de la cápside VP1.5.
Una partícula de AAV puede comprender una cápside de virus adenoasociado (AAV), en donde la cápside comprende la proteína VP1 de la cápside, en donde dicha proteína VP1 de la cápside es de uno o más de un primer serotipo de AAV y la proteína VP1.5 de la cápside, en donde dicha proteína VP1.5 de la cápside es de uno o más de un segundo serotipo de AAV y en donde al menos uno de dicho primer serotipo de AAV es diferente de al menos uno de dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación.
La cápside puede comprender la proteína VP3 de la cápside, en donde dicha proteína VP3 de la cápside es de uno o más de un tercer serotipo de AAV, en donde al menos uno de dicho uno o más de un tercer serotipo de AAV es diferente de dicho primer serotipo de AAV y/o dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación. La cápside de AAV descrita en la presente puede comprender la proteína de la cápside VP1.5.
Una cápside de virus adenoasociado (AAV) puede comprender la proteína de la cápside VP1, en donde dicha proteína de la cápside VP1 es de uno o más de un primer serotipo de AAV y la proteína de la cápside VP1.5, en donde dicha proteína de la cápside VP1.5 es de uno o más de un segundo serotipo de AAV y en donde al menos uno de dicho primer serotipo de AAV es diferente de al menos uno de dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación.
Una proteína VP3 de cápside de cápside de AAV, en donde dicha proteína VP3 de cápside es de uno o más de un tercer serotipo de AAV, en donde al menos uno de dicho uno o más de un tercer serotipo de AAV es diferente de dicho primer serotipo de AAV y/o dicho segundo serotipo de AAV, en cualquier combinación. Una proteína de la cápside de AAV puede comprender la proteína de la cápside VP2.
El uno o más de un primer serotipo de AAV, dicho uno o más de un segundo serotipo de AAV, dicho uno o más de un tercer serotipo de AAV y dicho uno o más de un cuarto serotipo de AAV se pueden seleccionar del grupo que consiste en los serotipos de AAV listados en laTabla 5,en cualquier combinación.
Una cápside de AAV puede carecer de la proteína VP2 de la cápside.
La acápside puede comprender una proteína VP1 quimérica de la cápside, una proteína VP2 quimérica de la cápside, una proteína VP3 quimérica de la cápside y/o una proteína VP1.5 quimérica de la cápside.
Una cápside de AAV puede ser AAV2/8/9, H-AAV82, H-AAV92, H-AAV82G9, AAV2/83:1, AAV2/81:1, AAV2/81:3 o AAV8/9, todos los cuales se describen en la sección de EJEMPLOS proporcionada en la presente.
Ejemplos no limitantes de proteínas de la cápside de AAV que se pueden incluir en la cápside en cualquier combinación con otras proteínas de la cápside descritas en la presente y/o con otras proteínas de la cápside ahora conocidas o desarrolladas posteriormente, incluyen LK3, LK01-19, AAV-d J, Olig001, rAAV2-retro, AAV-LiC, AAV0Kera1, AAV-Kera2, AAV-Kera3, AAV 7m8, AAV1,9, AAVr3.45, Clon AAV 32, Clon AAV 83, AAV-U87R7-C5, AAV ShH13, AAV ShH19, AAV L1-12, AAV HAE-1, AAV HAE-2, Variante de AAV ShH10, AAV2.5T, AAV LS1-4, AAV Lsm, AAV1289, AAVHSC 1-17, AAV2 Rec 1-4, AAV8BP2, AAV-B1, AAV-PHPB, AAV9.45, AAV9.61, AAV9.47, AAVM41, Péptidos exhibidos por AAV2, AAV2-GMN, Péptido AAV9 exhibido, Péptido AAV8 y AAV9 mostrado, AAVpo2.1, AAVpo4, AAVpo5, AAVpo6, AAV rh, AAV Hu, AAV-Go.1, AAV-mo.1, BAAV, AAAV, AAV8 K137R, AAV Anc80L65, AAV2G9, AAV2 265 inserción-AAV2/265D, AAV2.5, AAV3 SASTG, AAV2i8, AAV8G9, AAV2 mutantes de tirosina AAV2 Y-F, AAV8 Y-F, AAV9 Y-F, AAV6 Y-F, AAV6.2 y cualquier combinación de los mismos.
Como ejemplo no limitante, las proteínas de la cápside de AAV y el virus pueden ser quiméricos en el sentido de que pueden comprender la totalidad o una parte de una subunidad de la cápside de otro virus, opcionalmente otro parvovirus o AAV,por ejemplo,como se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28004.
Se entenderá que cualquier combinación de VP1 y VP3, y cuando esté presente, VP1.5 y VP2 de cualquier combinación de serotipos de AAV se puede emplear para producir cápsides de AAV. Por ejemplo, una proteína VP1 de cualquier combinación de serotipos de AAV se puede combinar con una proteína VP3 de cualquier combinación de serotipos de AAV y las respectivas proteínas VP1 pueden estar presentes en cualquier proporción de diferentes serotipos y las respectivas proteínas VP3 pueden estar presentes en cualquier proporción de diferentes serotipos y las proteínas VP1 y VP3 pueden estar presentes en cualquier proporción de diferentes serotipos. Se entendería además que, cuando está presente, una proteína VP1.5 y/o VP2 de cualquier combinación de serotipos de AAV se puede combinar con la proteína VP1 y VP3 de cualquier combinación de serotipos de AAV y las respectivas proteínas VP1.5 pueden estar presentes en cualquier proporción de diferentes serotipos y las respectivas proteínas VP2 pueden estar presentes en cualquier proporción de diferentes serotipos y las respectivas proteínas VP1 pueden estar presentes en cualquier proporción de diferentes serotipos y las respectivas proteínas VP3 pueden estar presentes en cualquier proporción de diferentes serotipos y las proteínas VP1.5 y/o VP2 pueden estar presentes en combinación con las proteínas VP1 y VP3 en cualquier proporción de diferentes serotipos.
Por ejemplo, las respectivas proteínas virales y/o los respectivos serotipos de AAV se pueden combinar en cualquier proporción, que puede ser una proporción de A:B, A:B:C, A:B:C:D, A:B:C:D:E, A:B:C:D:E:F, A:B:C:D:E:F:G, A:B:C:D:E:F:G:H, A:B:C:D:E:F:G:H:I or A:B:C:D:E:F:G:H:I:J, en donde A puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; B puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; C puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; D puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; E puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; F puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; G puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; H puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; I puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.; y J puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.
También se entendería que cualquiera de las proteínas de la cápside VP1, VP1.5, VP2 y/o VP3 puede estar presente en una cápside como una proteína de la cápside quimérica, en cualquier combinación y relación con respecto al mismo tipo de proteína y/o con respecto a las diferentes proteínas de la cápside.
En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona además un vector viral que comprende, consiste esencialmente en y/o consiste en (a) la cápside de AAV de esta invención; y (b) una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de repetición terminal, en donde la molécula de ácido nucleico está encapsidada por la cápside de AAV. En algunas realizaciones, el vector viral puede ser una partícula de AAV.
El vector viral de esta descripción puede tener tropismo sistémico o selectivo para el músculo esquelético, el músculo cardíaco y/o el músculo del diafragma. El vector del virus puede tener un tropismo reducido para el hígado.
La presente invención proporciona además una composición, que puede ser una formulación farmacéutica, que comprende la proteína de la cápside, la cápside, el vector viral, la composición de partículas de AAV y/o la formulación farmacéutica de esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Algunos ejemplos proporcionan proteínas de la cápside de AAV (VP1, VP1.5, VP2 y/o VP3) que comprenden una modificación en la secuencia de aminoácidos en el bucle 4 del eje triple (Opie et al., J. Viral. 77: 6995-7006 (2003)) y cápsides de virus y vectores de virus que comprenden la proteína de cápside de AAV modificada. Las modificaciones en este bucle pueden conferir una o más propiedades deseables a los vectores virales que comprenden la proteína de la cápside de AAV modificada que incluyen, pero no se limitan a (i) transducción reducida del hígado, (ii) movimiento mejorado a través de las células endoteliales, (iii) transducción sistémica; (iv) transducción mejorada del tejido muscular(por ejemplo,músculo esquelético, músculo cardíaco y/o músculo del diafragma), y/o (v) transducción reducida de los tejidos cerebrales(por ejemplo,neuronas). La presente invención aborda algunas de las limitaciones asociadas con los vectores AAV convencionales. Por ejemplo, los vectores basados en vectores AAV8 y rAAV9 son atractivos para la administración sistémica de ácidos nucleicos porque cruzan fácilmente la barrera celular endotelial; sin embargo, la administración sistémica de rAAV8 o rAAV9 da como resultado que la mayor parte del vector se administre al hígado, lo que reduce la transducción de otros tejidos diana importantes, tal como el músculo esquelético.
La transducción del músculo cardíaco y/o músculo esquelético (determinada sobre la base de un músculo esquelético individual, múltiples músculos esqueléticos o toda la gama de músculos esqueléticos) puede ser al menos aproximadamente cinco veces, diez veces, 50 veces, 100 veces, 1000 veces o más que los niveles de transducción en el hígado.
Las proteínas de la cápside de AAV modificadas pueden comprender una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos del bucle 4 del eje triple(por ejemplo,las posiciones de aminoácidos 575 a 600 [inclusive] de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 nativa o la región correspondiente de una proteína de la cápside de otro AAV). Tal como se usa en la presente, una "modificación" en una secuencia de aminoácidos incluye sustituciones, inserciones y/o deleciones, cada una de las cuales puede implicar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos. La modificación puede ser una sustitución. Por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos del bucle de eje triple 4 de un AAV se pueden sustituir en las posiciones de aminoácidos 575-600 de la proteína de la cápside de AAV2 nativa o las posiciones correspondientes de la proteína de la cápside de otro AAV. Sin embargo, las cápsides de virus modificadas no se limitan a cápsides de AAV en las que los aminoácidos de una cápside de AAV se sustituyen en otra cápside de AAV, y los aminoácidos sustituidos y/o insertados pueden ser de cualquier fuente, y además pueden ser de origen natural o parcial o completamente sintéticos.
Como se describe en la presente, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de las proteínas de la cápside de una cantidad de AAV son conocidas en la técnica. Por lo tanto, los aminoácidos "correspondientes" a las posiciones de aminoácidos 575 a 600 (inclusive) o las posiciones de aminoácidos 585 a 590 (inclusive) de la proteína de la cápside de AAV2 nativa se pueden determinar fácilmente para cualquier otro AAV (porejemplo,mediante el uso de alineamientos de secuencias).
Se puede producir una proteína de la cápside modificada modificando la proteína de la cápside de cualquier AAV ahora conocido o descubierto posteriormente. Además, la proteína de la cápside de AAV que se va a modificar puede ser una proteína de la cápside de AAV de origen natural(por ejemplo,una proteína de la cápside de AAV2, AAV3a o 3b, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 o AAV12 o cualquiera de los A<a>V que se muestran en la Tabla 3), pero no se limita a esta. Los expertos en la técnica entenderán que se conocen en la técnica una variedad de manipulaciones de las proteínas de la cápside de AAV y esto no se limita a modificaciones de proteínas de la cápside de Aa V de origen natural. Por ejemplo, la proteína de la cápside que se va a modificar ya puede tener alteraciones en comparación con AAV de origen natural(por ejemplo,se deriva de una proteína de la cápside de AAV de origen natural,por ejemplo,AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y/o AAV12 o cualquier otro AAV ahora conocido o descubierto posteriormente). Dichas proteínas de la cápside de AAV también están dentro del alcance de esta descripción.
Por ejemplo, la proteína de la cápside de AAV que se va a modificar puede comprender una inserción de aminoácidos directamente después del aminoácido 264 de la secuencia de la proteína de la cápside de AAV2 nativa(ver, por ejemplo,la publicación PCT WO 2006/066066) y/o puede ser un AAV con un bucle HI alterado como se describe en la publicación PCT WO 2009/108274 y/o puede ser un AAV que se modifica para contener una secuencia poli-His para facilitar la purificación. Como otro ejemplo ilustrativo, la proteína de la cápside de AAV puede tener una secuencia de direccionamiento peptídico incorporada en la misma como una inserción o sustitución. Además, la proteína de la cápside de AAV puede comprender un dominio grande de otro AAV que se ha sustituido y/o insertado en la proteína de la cápside.
Por lo tanto, la proteína de la cápside de AAV que se va a modificar puede derivar de un AAV de origen natural, pero comprende además una o más secuencias extrañas(porejemplo,que son exógenas al virus nativo) que se insertan y/o sustituyen en la proteína de la cápside y/o se han alterado mediante la eliminación de uno o más aminoácidos.
Por consiguiente, cuando se hace referencia en la presente a una proteína de la cápside de AAV específica(por ejemplo,una proteína de la cápside de AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 o AAV12 o una proteína de la cápside de cualquiera de los AAV mostrados en la Tabla 1,etc.),se pretende abarcar la proteína de la cápside nativa, así como las proteínas de la cápside que tienen alteraciones distintas de las modificaciones de la descripción. Dichas alteraciones incluyen sustituciones, inserciones y/o deleciones. La proteína de la cápside puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, menos de 20, menos de 30, menos de 40, menos de 50, menos de 60 o menos de 70 aminoácidos insertados en la misma en comparación con la secuencia de proteína de la cápside de AAV nativa. La proteína de la cápside puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, menos de 20, menos de 30, menos de 40, menos de 50, menos de 60 o menos de 70 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de proteína de la cápside de AAV nativa. La proteína de la cápside puede comprender una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, más de 20, más de 30, más de 40, más de 50, más de 60 o más de 70 aminoácidos en comparación con la secuencia de proteína de la cápside de AAV nativa.
Por lo tanto, por ejemplo, el término "proteína de la cápside de AAV2" incluye proteínas de la cápside de AAV que tienen la secuencia de proteína de la cápside de AAV2 nativa(verN.° de Acceso al GenBank AAC03780) así como aquellos que comprenden sustituciones, inserciones y/o deleciones (como se describe en el párrafo anterior) en la secuencia de la proteína de la cápside de AAV2 nativa.
La proteína de la cápside de AAV puede tener la secuencia de la proteína de la cápside de AAV nativa o puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% similar o idéntica a una secuencia de la proteína de la cápside de AAV nativa. Por ejemplo, una proteína de la cápside de "AAV2" abarca la secuencia de la proteína de la cápside de AAV2 nativa, así como secuencias que son al menos aproximadamente 75%, 80%< 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% similares o idénticas a la secuencia de la proteína de la cápside de AAV2 nativa.
Los métodos para determinar la similitud o identidad de secuencia entre dos o más secuencias de aminoácidos son conocidos en la técnica. La similitud o identidad de secuencia se puede determinar utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2,482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad de secuencia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48,443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (<g>A<p>, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984), o por inspección.
Otro algoritmo adecuado es el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) y Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993). Un programa BLAST particularmente útil es el programa W u -BLAST-2 que se obtuvo de Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, que opcionalmente se establecen en los valores predeterminados. Los parámetros son valores dinámicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular contra la cual se está buscando la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.
Además, un algoritmo útil adicional es Gapped BLAST según lo informado por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.
25, 3389-3402.
Se puede realizar una modificación en la región de las posiciones de aminoácidos 585 a 590 (inclusive) de la proteína de la cápside de AAV2 nativa (usando la numeración VP1) o las posiciones correspondientes de otro AAV (proteína de la cápside VP1 de AAV2 nativa: N.° de Acceso al GenBank AAC03780 o YP680426),es decir,en los aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos 585 a 590 (numeración VP1) de la proteína de la cápside de AAV2 nativa. Las posiciones de aminoácidos en otros serotipos de AAV o cápsides de AAV modificadas que "corresponden a" las posiciones 585 a 590 de la proteína de la cápside de AAV2 nativa serán evidentes para los expertos en la técnica y se pueden determinar fácilmente usando técnicas de alineación de secuencias(ver, por ejemplo,la Figura 7 de WO 2006/066066) y/o análisis de estructura cristalina (Padron et al., (2005) J. Virol. 79: 5047-58).
Para ilustrar, la modificación se puede introducir en una proteína de la cápside de AAV que ya contiene inserciones y/o deleciones de modo que la posición de todas las secuencias posteriores se desplace. En esta situación, las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos 585 a 590 en la proteína de la cápside de AAV2 aún serían fácilmente identificables para los expertos en la técnica. Para ilustrar, la proteína de la cápside puede ser una proteína de la cápside de AAV2 que contiene una inserción después de la posición de aminoácido 264(ver, por ejemplo,WO 2006/066066). Los aminoácidos encontrados en las posiciones 585 a 590(por ejemplo,RGNRQA (SEQ ID NO:1)) en la proteína de la cápside de AAV2 nativa) ahora estarían en las posiciones 586 a 591, pero aún serían identificables para los expertos en la técnica.
Una cápside de virus puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en las proteínas de cápside de AAV modificadas de esta descripción. La cápside del virus puede ser una cápside de parvovirus, que puede ser además una cápside de parvovirus autónoma o una cápside de dependovirus. Opcionalmente, la cápside del virus puede ser una cápside de AAV. La cápside de AAV puede ser un AAV1, AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 o cualquier otro AAV mostrado en la Tabla 1 o conocido de otro modo o descubierto posteriormente, y/o se deriva de cualquiera de los anteriores mediante una o más inserciones, sustituciones y/o deleciones.
Las cápsides de virus modificadas se pueden usar como "vehículos de cápside", como se ha descrito, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n .° 5,863,541. Las moléculas que pueden ser envasadas por la cápside del virus modificado y transferidas a una célula incluyen ADN heterólogo, ARN, polipéptidos, moléculas orgánicas pequeñas, metales o combinaciones de los mismos.
Las moléculas heterólogas se definen como aquellas que no se encuentran naturalmente en una infección por AAV,por ejemplo,aquellas que no codifican para un genoma de AAV de tipo silvestre. Además, las moléculas terapéuticamente útiles se pueden asociar con el exterior de la cápside del virus para la transferencia de las moléculas a las células hospedadoras diana. Dichas moléculas asociadas pueden incluir ADN, ARN, moléculas orgánicas pequeñas, metales, carbohidratos, lípidos y/o polipéptidos. Una molécula terapéuticamente útil puede unirse covalentemente (es decir,conjugarse o acoplarse químicamente) a las proteínas de la cápside. Los métodos de unión covalente de moléculas son conocidos por los expertos en la técnica.
Las cápsides de virus modificadas también pueden ser útiles para generar anticuerpos contra las nuevas estructuras de la cápside. Como alternativa adicional, se puede insertar una secuencia de aminoácidos exógena en la cápside de virus modificada para la presentación de antígenos a una célula,por ejemplo,para la administración a un sujeto para producir una respuesta inmunitaria a la secuencia de aminoácidos exógena.
Las cápsides de virus se pueden administrar para bloquear ciertos sitios celulares antes y/o simultáneamente con(por ejemplo,en cuestión de minutos u horas entre sí) la administración de un vector de virus que suministra un ácido nucleico que codifica para un polipéptido o ARN funcional de interés. Por ejemplo, las cápsides pueden administrarse para bloquear los receptores celulares en las células hepáticas y un vector de administración puede administrarse posterior o simultáneamente, lo que puede reducir la transducción de las células hepáticas y mejorar la transducción de otras dianas(por ejemplo,músculo esquelético, cardíaco y/o del diafragma).
Las cápsides de virus modificadas se pueden administrar a un sujeto antes y/o simultáneamente con un vector de virus modificado. Además, la invención proporciona composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden las cápsides de virus modificadas de la invención; opcionalmente, la composición también comprende un vector de virus modificado de la invención.
La descripción también proporciona moléculas de ácido nucleico (opcionalmente, moléculas de ácido nucleico aisladas) que codifican para las cápsides de virus modificadas y las proteínas de la cápside de la invención. Además, se proporcionan vectores, que comprenden las moléculas de ácido nucleico y células(in vivoo en cultivo), que comprenden las moléculas de ácido nucleico y/o vectores. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a,vectores virales (por ejemplo,adenovirus, AAV, herpesvirus, alfavirus, vaccinia, poxvirus, baculovirus y similares), plásmidos, fagos, YAC, BAC y similares. Dichas moléculas de ácido nucleico, vectores y células se pueden utilizar, por ejemplo, como reactivos(por ejemplo,construcciones de envasado auxiliares o células de envasado) para la producción de cápsides de virus modificadas o vectores de virus como se describe en la presente.
Las cápsides de virus se pueden producir usando cualquier método conocido en la técnica, porejemplo,mediante la expresión de un baculovirus (Brown et al., (1994) Virology 198:477-488).
Las modificaciones a una proteína de la cápside de AAV pueden ser modificaciones "selectivas". Este enfoque contrasta con el trabajo previo con intercambios de subunidades completas o dominios grandes entre serotipos de AAV(ver, por ejemplo,la publicación de patente internacional WO 00/28004 y Hauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774). Una modificación "selectiva" puede dar como resultado la inserción y/o sustitución y/o deleción de menos de aproximadamente 20, 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 aminoácidos contiguos.
Las proteínas de la cápside modificadas y las cápsides pueden comprender además cualquier otra modificación, ahora conocida o identificada posteriormente.
La cápside viral puede ser una cápside viral dirigida que comprende una secuencia de direccionamiento(por ejemplo,sustituida o insertada en la cápside viral) que dirige la cápside viral para que interactúe con las moléculas de la superficie celular presentes en uno o más tejidos diana deseados(ver, por ejemplo,la publicación de patente internacional n .° WO 00/28004 y Hauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774); Shi et al., Human Gene Therapy 17:353-361 (2006) [que describe la inserción del motivo de unión al receptor de integrina RGD en las posiciones 520 y/o 584 de la subunidad de la cápside de AAV]; y la patente de los Estados Unidos n .° 7,314,912 [que describe la inserción del péptido P1 que contiene un motivo RGD después de las posiciones de aminoácidos 447, 534, 573 y 587 de la subunidad de la cápside de AAV2]). Se conocen en la técnica otras posiciones dentro de la subunidad de la cápside de AAV que toleran inserciones(por ejemplo,las posiciones 449 y 588 descritas por Grifman et al., Molecular Therapy 3:964-975 (2001)).
Por ejemplo, algunas cápsides de virus tienen un tropismo relativamente ineficiente hacia la mayoría de los tejidos diana de interés(por ejemplo,hígado, músculo esquelético, corazón, músculo del diafragma, riñón, cerebro, estómago, intestinos, piel, células endoteliales y/o pulmones). Se puede incorporar ventajosamente una secuencia de direccionamiento en estos vectores de baja transducción para conferir así a la cápside del virus un tropismo deseado y, opcionalmente, un tropismo selectivo para uno o más tejidos particulares. Las proteínas de la cápside de AAV, las cápsides y los vectores que comprenden secuencias de direccionamiento se describen, por ejemplo, en la publicación de patente internacional WO 00/28004. Como otra posibilidad, uno o más aminoácidos de origen no natural como se describe por Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)) se puede incorporar en la subunidad de la cápside de AAV en un sitio ortogonal como un medio para redirigir un vector de baja transducción a uno o más tejidos diana deseados. Estos aminoácidos no naturales pueden usarse ventajosamente para unir químicamente moléculas de interés a la proteína de la cápside de AAV que incluyen, pero no se limitan a: glicanos (direccionamiento a células manosadendríticas); RGD, bombesina o un neuropéptido para el suministro dirigido a tipos específicos de células cancerosas; aptámeros o péptidos de ARN seleccionados de la presentación en fagos dirigidos a receptores específicos de la superficie celular, tal como receptores de factores de crecimiento, integrinas y similares. Los métodos de modificación química de aminoácidos son conocidos en la técnica(ver, por ejemplo,Greg T Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1a edición, Academic Press, 1996).
La secuencia de direccionamiento puede ser una secuencia de cápside de virus(porejemplo,una secuencia de cápside de parvovirus autónoma, secuencia de cápside de AAV o cualquier otra secuencia de cápside viral) que dirija la infección a un tipo o tipos celulares particulares.
Como otro ejemplo no limitante, un dominio de unión a heparina(por ejemplo,el dominio de unión a heparina del virus respiratorio sincitial) puede insertarse o sustituirse en una subunidad de la cápside que normalmente no se une a los receptores HS(porejemplo,AAV 4, AAV5) para conferir unión a heparina al mutante resultante.
B19 infecta células progenitoras eritroides primarias utilizando globósido como su receptor (Brown et al., (1993) Science 262:114). La estructura de B19 se ha determinado con resoluciones de 8 A (Agbandje-McKenna et al., (1994) Virology 203:106). La región de la cápside B19 que se une al globósido se ha mapeado entre los aminoácidos 399-406 (Chapman et al., (1993) Virology 194:419), una región en bucle entre las estructuras de barril p E y F. (Chipman et al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502). Por consiguiente, el dominio de unión al receptor de globósidos de la cápside B19 puede sustituirse en la proteína de la cápside de AAV para dirigirse a una cápside de virus o vector de virus que comprende la misma a células eritroides.
La secuencia de direccionamiento exógena puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que codifique un péptido que altere el tropismo de una cápside de virus o vector de virus que comprenda la proteína de cápside de AAV modificada. El péptido o proteína de direccionamiento puede ser de origen natural o, alternativamente, completa o parcialmente sintético. Las secuencias de direccionamiento de ejemplo incluyen ligandos y otros péptidos que se unen a receptores de superficie celular y glicoproteínas, tal como secuencias de péptidos RGD, bradiquinina, hormonas, factores de crecimiento peptídicos(por ejemplo,factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento similares a la insulina I y II,etc.),citocinas,hormona estimulante de melanocitos (por ejemplo,a, p o<y>), neuropéptidos y endorfinas, y similares, y fragmentos de los mismos que conservan la capacidad de dirigir células a sus receptores cognados. Otros péptidos y proteínas ilustrativos incluyen sustancia P, factor de crecimiento de queratinocitos, neuropéptido Y, péptido liberador de gastrina, interleucina 2, lisozima de clara de huevo de gallina, eritropoyetina, gonadoliberina, corticostatina, p-endorfina, leu-encefalina, rimorfina, a-neo-encefalina, angiotensina, neumadina, péptido intestinal vasoactivo, neurotensina, motilina y fragmentos de los mismos como se describió anteriormente. Como una alternativa adicional, el dominio de unión de una toxina(por ejemplo,toxina tetánica o toxinas de serpiente, tal como a-bungarotoxina, y similares) se puede sustituir en la proteína de la cápside como una secuencia de direccionamiento. La proteína de la cápside de AAV puede modificarse mediante la sustitución de un péptido señal de importación/exportación "no clásico"(porejemplo,factor de crecimiento de fibroblastos 1 y 2, interleucina 1, proteína Tat de VlH-1, proteína VP22 del virus del herpes y similares) como se describe por Cleves (Current Biology 7:R318 (1997)) en la proteína de la cápside de AAV. También se incluyen motivos peptídicos que dirigen la captación por células específicas,por ejemplo,un motivo peptídico FVFLP desencadena la captación por células hepáticas.
Se pueden utilizar técnicas de presentación en fagos, así como otras técnicas conocidas en la técnica, para identificar péptidos que reconozcan cualquier tipo de célula de interés.
La secuencia de direccionamiento puede codificar para cualquier péptido que se dirija a un sitio de unión a la superficie celular, que incluye receptores(porejemplo,proteína, carbohidrato, glicoproteína o proteoglicano). Los ejemplos de sitios de unión a la superficie celular incluyen, pero no se limitan a, sulfato de heparán, sulfato de condroitina y otros glicosaminoglicanos, porciones de ácido siálico que se encuentran en mucinas, glicoproteínas y gangliósidos, glicoproteínas del MHC I, componentes de carbohidratos que se encuentran en glicoproteínas de membrana, que incluyen manosa, N-acetilgalactosamina, N-acetil-glucosamina, fucosa, galactosa y similares.
Un dominio de unión a heparán sulfato (HS) o heparina puede sustituirse en la cápside del virus (por ejemplo, en un AAV que de otro modo no se une a HS o heparina). Se sabe en la técnica que la unión de HS/heparina está mediada por un "parche básico" que es rico en argininas y/o lisinas. Por ejemplo, una secuencia que sigue al motivo BXXB, donde "B" es un residuo básico y X es neutro y/o hidrófobo. Como ejemplo no limitativo, BXXB es RGNR. Por ejemplo, BXXB se sustituye por las posiciones de aminoácidos 262 a 265 en la proteína de la cápside de AAV2 nativa o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro AAV.
Otros ejemplos no limitantes de secuencias de direccionamiento adecuadas incluyen los péptidos que se dirigen a las células endoteliales de la arteria coronaria identificados por Müller et al., Nature Biotechnology 21:1040-1046 (2003) (secuencias consenso NSVRDLG/S (SEQ ID NO:2), PRSVTVP (SEQ ID NO:3), NSVSSXS/A (SEQ ID NO:4)); péptidos dirigidos a tumores como se describe por Grifman et al., Molecular Therapy 3:964-975 (2001)(por ejemplo,NGR, NGRAHA (SEQ ID NO:5)); secuencias de direccionamiento a pulmón o cerebro como se describe por Work et al., Molecular Therapy 13:683-693 (2006) (QPEHSST (SEQ ID NO:6), VNTANST (SEQ ID NO:7), HGPMQKS (SEQ ID NO:8), PHKPPLA (SEQ ID NO:9), IKNNEMW (SEQ ID NO:10), RNLDTPM (SEQ ID NO:11), VDSHRQS (SEQ ID NO:12), YDSKTKT (SEQ ID NO:13), SQLPHQK (SEQ ID NO:14), STMQQNT (SEQ ID NO:15), TERYMTQ (SEQ ID NO:16), QPEHSST (SEQ ID NO:6), DASLSTS (SEQ ID NO:17), DLPNKKT (SEQ ID NO:18), DLTAARL (SEQ ID NO:19), EPHQFNY (SEQ ID NO:20), EPQSNHT (SEQ ID NO:21), MSSWPSQ (SEQ ID NO:22), NPKHNAT (SEQ ID NO:23), PDGMRTT (SEQ ID NO:24), PNNNKTT (SEQ ID NO:25), QSTTHDS (SEQ ID NO:26), TGSKQKQ (SEQ ID NO:27), SLKHQAL (SEQ ID NO:28) y SPIDGEQ (SEQ ID NO:29)); las secuencias de direccionamiento vasculares descritas por Hajitou et al., TCM 16:80-88 (2006) (WIFPWIQL (SEQ ID NO:30), CDCRGDCFC (SEQ ID NO:31), CNGRC (SEQ ID NO:32), CPRECES (SEQ ID NO:33), GSL, CTTHWGFTLC (SEQ ID NO:34), CGRRAGGSC (SEQ ID NO:35), CKGGRAKDC (SEQ ID NO:36), y CVPELGHEC (SEQ ID NO:37)); péptidos de direccionamiento como se describe por Koivunen et al., J. Nucl. Med. 40:883-888 (1999) (CRRETAWAK (SEQ ID NO:38), KGD, VSWFSHRYSPFAVS (SEQ ID NO:39), GYRDGYAGPILYN (SEQ ID NO:40), XXXY*XXX [where Y* is phospho-Tyr] (SEQ ID NO:41), Y*E/MNW (SEQ ID NO:42), RPLPPLP (SEQ ID NO:43), APPLPPR (SEQ ID NO:44), DVFYPYPY ASGS (SEQ ID NO:45), MYWYPY (SEQ ID NO:46), DITWDQL WDLMK (SEQ ID NO:47), CWDDG/L WLC (SEQ ID NO:48), EWCEYLGGYLRCY A (SEQ ID NO:49), YXCXXGPXTWXCXP (SEQ ID NO:50), IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO:51), LWXXY/W/F/H (SEQ ID NO:52), XFXXYLW (SEQ ID NO:53), SSIISHFRWGLCD (SEQ ID NO:54), MSRPACPPNDKYE (SEQ ID NO:55), CLRSGRGC (SEQ ID NO:56), CHWMFSPWC (SEQ ID NO:57), WXXF (SEQ ID NO:58), CSSRLDAC (SEQ ID NO:59), CLPVASC (SEQ ID NO:60), CGFECVRQCPERC (SEQ ID NO:61), CVALCREACGEGC (SEQ ID NO:62), SWCEPGWCR (SEQ ID NO:63), YSGKWGW (SEQ ID NO:64), GLSGGRS (SEQ ID NO:65), LMI,PRAD (SEQ ID NO:66), CSCFRDVCC (SEQ ID NO:67), CRDVVSVIC (SEQ ID NO:68), CNGRC (<s>E<q>ID NO:32), and GSL); and tumor targeting peptides as described by Newton & Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, pages 145-163, Springer-Verlag, Berlin (2008) (MARSGL (SEQ ID NO:69), MARAKE (SEQ ID NO:70), MSRTMS (SEQ ID NO:71), KCCYSL (SEQ ID NO:72), WRR, WKR, WVR, WVK, WIK, WTR, WVL, WLL, WRT, WRG, WVS, WVA, MYWGDSHWLQYWYE (SEQ ID NO:73), MQLPLAT (SEQ ID NO:74), EWLS (SEQ ID NO:75), SNEW (SEQ ID NO:76), TNYL (SEQ ID NO:77), WIFPWIQL (SEQ ID NO:30), WDLAWMFRLPVG (SEQ ID NO:78), CTVALPGGYVRVC (SEQ ID NO:79), CVPELGHEC (SEQ ID NO:37), CGRRAGGSC (SEQ ID NO:35), CVAYCIEHHCWTC (SEQ ID NO:80), CVFAHNYDYL VC (SEQ ID NO:81), and CVFTSNYAFC (SEQ ID NO:82), VHSPNKK (SEQ ID NO:83), CDCRGDCFC (SEQ ID NO:31), CRGDGWC (SEQ ID NO:84), XRGCDX (SEQ ID NO:85), P:XXS/T (SEQ ID NO:86), CTTHWGFTLC (SEQ ID NO:34), SGKGPRQITAL (SEQ ID NO:87), A9A/Q)(N/A)(L/Y)(TN/M/R)(R/K) (SEQ ID NO:88), VYMSPF (SEQ ID NO:89), MQLPLAT (SEQ ID NO:74), ATWLPPR (SEQ ID NO:90), HTMYYHHYQHHL (SEQ ID NO:91), SEVGCRAGPLQWLCEKYFG (SEQ ID NO:92), CGLLPVGRPDRNVWRWLC (SEQ ID NO:93), CKGQCDRFKGLPWEC (SEQ ID NO:94), SGRSA (SEQ ID NO:95), WGFP (SEQ ID NO:96), LWXXAr [Ar=Y, W, F, H) (SEQ ID NO:97), XF:XXYLW (SEQ ID NO:98), AEPMPHSLNFSQYLWYT (SEQ ID NO:99), WAY(W/F)SP (SEQ ID NO:100), IELLQAR (SEQ ID NO:101), DITWDQLWDLMK (SEQ ID NO:102), AYTKCSRQWRTCMTTH (SEQ ID NO:103), PQNSKIPGPTFLDPH (SEQ ID NO:104), SMEPALPDWWWKMFK (SEQ ID NO:105), ANTPCGPYTHDCPVKR (SEQ ID NO:106), TACHQHVRMVRP (SEQ ID NO:107), VPWMEPAYQRFL (SEQ ID NO:108), DPRATPGS (SEQ ID NO:109), FRPNRAQDYNTN (SEQ ID NO:110), CTKNSYLMC (SEQ ID NO:111), C(R/Q)L/RT(G/N)XXG(AN)GC (SEQ ID NO:112), CPIEDRPMC (SEQ ID NO:113), HEWSYLAPYPWF (SEQ ID NO:114), MCPKHPLGC (SEQ ID NO:115), RMWPSSTVNLSAGRR (SEQ ID NO:116), SAKTAVSQRVWLPSHRGGEP (SEQ ID NO:117), KSREHVNNSACPSKRITAAL (SEQ ID NO:118), EGFR (SEQ ID NO:119), RVS, AGS, AGLGVR (SEQ ID NO:120), GGR, GGL, GSV, GVS, GTRQGHTMRLGVSDG (SEQ ID NO:121), IAGLATPGWSHWLAL (SEQ ID NO: 122), SMSIARL (SEQ ID NO: 123), HTFEPGV (SEQ ID NO: 124), NTSLKRISNKRIRRK (SEQ ID NO: 125), LRIKRKRRKRKKTRK (SEQ ID NO: 126), GGG, GFS, LWS, EGG, LLV, LSP, LBS, AGG, GRR, GGH y GTV).
Como una alternativa adicional, la secuencia de direccionamiento puede ser un péptido que se puede utilizar para el acoplamiento químico(por ejemplo,puede comprender residuos de arginina y/o lisina que se pueden acoplar químicamente a través de sus grupos R) a otra molécula que se dirige a la entrada en una célula.
Como otra opción, la proteína de la cápside de AAV o la cápside del virus puede comprender una mutación como se describe en WO 2006/066066. Por ejemplo, la proteína de la cápside puede comprender una sustitución de aminoácidos selectiva en la posición de aminoácidos 263, 705, 708 y/o 716 de la proteína de la cápside de AAV2 nativa o un cambio o cambios correspondientes en una proteína de la cápside de otro AAV. De manera adicional o alternativa, la proteína de la cápside, la cápside del virus o el vector comprende una inserción selectiva de aminoácidos directamente después de la posición del aminoácido 264 de la proteína de la cápside de AAV2 o un cambio correspondiente en la proteína de la cápside de otro AAV. Por "directamente después de la posición de aminoácido X" se entiende que la inserción sigue inmediatamente a la posición de aminoácido indicada (por ejemplo, "después de la posición de aminoácido 264" indica una inserción puntual en la posición 265 o una inserción más grande, por ejemplo, de las posiciones 265 a 268, etc.). Lo anterior se puede utilizar para administrar un ácido nucleico heterólogo a una célula o sujeto como se describe en la presente. Por ejemplo, el vector modificado se puede utilizar para tratar un trastorno de almacenamiento lisosómico tal como un trastorno de mucopolisacaridosis(por ejemplo,síndrome de Sly [p-glucuronidasa], síndrome de Hurler [a-L-iduronidasa], síndrome de Scheie [a-L-iduronidasa], síndrome de Hurler-Scheie [a-L-iduronidasa], síndrome de Hunter [iduronato sulfatasa], síndrome de Sanfilippo A [heparán sulfamidasa], B [N-acetilglucosaminidasa], C [acetil-CoA: aglucosaminida acetiltransferasa], D [N-acetilglucosamina 6-sulfatasa], síndrome de Morquio A [galactosa-6-sulfato sulfatasa], B [p-galactosidasa], síndrome de Maroteaux-Lamy [N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa],etc.),enfermedad de Fabry (a-galactosidasa), enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa) o un trastorno de almacenamiento de glucógeno(por ejemplo,enfermedad de Pompe; a-glucosidasa ácida lisosomal) como se describe en la presente.
Los expertos en la técnica apreciarán que para algunas proteínas de la cápside de AAV la modificación correspondiente será una inserción y/o una sustitución, dependiendo de si las posiciones de aminoácidos correspondientes están parcial o completamente presentes en el virus o, alternativamente, están completamente ausentes. Del mismo modo, cuando se modifica AAV que no sea AAV2, la (s) posición(es) de aminoácido específica (s) puede (n) ser diferente (s) de la posición en AAV2(ver, por ejemplo,la Tabla 3). Como se discute en otra parte de la presente, las posiciones de aminoácidos correspondientes serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica utilizando técnicas bien conocidas.
Por ejemplo, la inserción y/o sustitución y/o deleción en las proteínas de la cápside da como resultado la inserción, sustitución y/o reposicionamiento de un aminoácido que (i) mantiene la estructura de bucle hidrófilo en esa región; (ii) un aminoácido que altera la configuración de la estructura de bucle; (iii) un aminoácido cargado; y/o (iv) un aminoácido que puede fosforilarse o sulfatarse o adquirir de otro modo una carga mediante modificación postraduccional (porejemplo,glicosilación) después de 264 en una proteína de la cápside de AAV2 o un cambio correspondiente en una proteína de la cápside de otro AAV. Los aminoácidos adecuados para la inserción/sustitución incluyen ácido aspártico, ácido glutámico, valina, leucina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, glicina, alanina, prolina, asparagina, fenilalanina, tirosina o glutamina. Por ejemplo, se inserta o sustituye una treonina en la subunidad de la cápside. En la Tabla 3 (Posición 2) se muestran ejemplos no limitantes de posiciones correspondientes en una serie de otros AAV. Por ejemplo, la inserción o sustitución de aminoácidos es una treonina, ácido aspártico, ácido glutámico o fenilalanina (excepto AAV que tienen una treonina, ácido glutámico o fenilalanina, respectivamente, en esta posición).
Una proteína de la cápside de AAV puede comprender una inserción de aminoácidos después de la posición de aminoácido 264 en una o más proteínas de la cápside de AAV2, AAV3a o AAV3b o en la posición correspondiente en una proteína de la cápside de AAV2, AAV3a o AAV3b que se ha modificado para comprender secuencias que no son de AAV2, AAV3a o AAV3b, respectivamente, y/o se ha modificado mediante la eliminación de uno o más aminoácidos(es decir,se deriva de AAV2, AAV3a o AAV3b). El aminoácido correspondiente a la posición 264 en una o más subunidades de la cápside de AAV2 (o AAV3a o AAV3b) será fácilmente identificable en el virus de partida que se ha derivado de AAV2 (o AAV3a o AAV3b), que luego se puede modificar adicionalmente. Los aminoácidos adecuados para la inserción incluyen ácido aspártico, ácido glutámico, valina, leucina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, glicina, alanina, prolina, asparagina, fenilalanina, tirosina o glutamina.
La proteína de la cápside de AAV puede comprender una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 265 en una o más proteínas de la cápside de AAV1, en la posición de aminoácido 266 en una proteína de la cápside de AAV8, o una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 265 en una proteína de la cápside de AAV9 o en la posición correspondiente en una proteína de la cápside de AAV1, AAV8 o AAV9 que se ha modificado para comprender secuencias que no son de AAV1, que no son de AAV8 o que no son de AAV9, respectivamente, y/o se ha modificado mediante la eliminación de uno o más aminoácidos(es decir,se deriva de AAV1, AAV8 o AAV9). El aminoácido correspondiente a la posición 265 en una o más subunidades de la cápside de AAV1 y AAV9 y la posición 266 en la o las subunidades de la cápside de AAV8 serán fácilmente identificables en el virus de partida que se ha derivado de AAV1, AAV8 o AAV9, que luego se puede modificar adicionalmente. Los aminoácidos adecuados para la inserción incluyen ácido aspártico, ácido glutámico, valina, leucina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, glicina, alanina, prolina, asparagina, fenilalanina, tirosina o glutamina.
Una proteína de la cápside puede comprender una treonina, ácido aspártico, ácido glutámico o fenilalanina después de la posición de aminoácido 264 de la proteína de la cápside de AAV2(es decir,una inserción) o la posición correspondiente de otra proteína de la cápside.
Las proteínas de la cápside modificadas o las cápsides de virus pueden comprender una o más mutaciones como se describe en WO 2007/089632(por ejemplo,una mutación E7K en la posición de aminoácido 531 de la proteína de la cápside de AAV2 o la posición correspondiente de la proteína de la cápside de otro AAV).
Una proteína de cápside modificada o cápside puede comprender una mutación como se describe en WO 2009/108274.
Como otra posibilidad, la proteína de la cápside de AAV puede comprender una mutación como se describe por Zhong et al. (Virology 381: 194-202 (2008); Proc. Nat. Acad. Sci. 105: 7827-32 (2008)). Por ejemplo, la proteína de la cápside de AAV puede comprender una mutación YF en la posición de aminoácido 730.
Las modificaciones descritas anteriormente se pueden incorporar en las proteínas de la cápside o cápsides en combinación entre sí y/o con cualquier otra modificación ahora conocida o descubierta posteriormente.
La descripción también proporciona vectores de virus que comprenden las proteínas de la cápside modificadas y las cápsides de la invención. En ejemplos particulares, el vector de virus es un vector de parvovirus(por ejemplo,que comprende una cápside de parvovirus y/o genoma de vector), por ejemplo, un vector de AAV(porejemplo,que comprende una cápside de AAV y/o genoma de vector). En ejemplos representativos, el vector de virus comprende una cápside AA V modificada que comprende una subunidad de proteína de cápside modificada de la invención y un genoma de vector.
Por ejemplo, el vector viral comprende: (a) una cápside de virus modificada(porejemplo,una cápside de AAV modificada) que comprende una proteína de cápside modificada; y (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de repetición terminal(porejemplo,un TR de AAV), en donde el ácido nucleico que comprende la secuencia de repetición terminal está encapsidado por la cápside de virus modificada. El ácido nucleico puede comprender opcionalmente dos repeticiones terminales(por ejemplo,dos TR de AAV).
En ejemplos representativos, el vector de virus es un vector de virus recombinante que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido o ARN funcional de interés. Los vectores de virus recombinantes se describen con más detalle a continuación.
Los vectores de virus pueden (i) tener una transducción reducida del hígado en comparación con el nivel de transducción por un vector de virus sin las proteínas de la cápside modificadas; (ii) exhibir una transducción sistémica mejorada por el vector de virus en un sujeto animal en comparación con el nivel observado por un vector de virus sin las proteínas de la cápside modificadas; (iii) demostrar un movimiento mejorado a través de las células endoteliales en comparación con el nivel de movimiento por un vector de virus sin las proteínas de la cápside modificadas, y/o (iv) exhibir una mejora selectiva en la transducción de tejido muscular(por ejemplo,músculo esquelético, músculo cardíaco y/o músculo del diafragma), y/o (v) transducción reducida de tejidos cerebrales(por ejemplo,neuronas) en comparación con el nivel de transducción por un vector de virus sin las proteínas de la cápside modificadas. El vector viral puede tener transducción sistémica hacia el músculo,por ejemplo,transduce múltiples grupos de músculo esquelético en todo el cuerpo y opcionalmente transduce músculo cardíaco y/o músculo del diafragma.
Algunos vectores de virus modificados demuestran una transducción eficiente de los tejidos diana.
Los expertos en la técnica entenderán que las proteínas de cápside modificadas, cápsides de virus, vectores de virus y partículas de AAV de la invención excluyen aquellas proteínas de cápside, cápsides, vectores de virus y partículas de AAV que estarían presentes o se encontrarían en su estado nativo.
Métodos de producción de vectores virales
La presente invención proporciona además métodos para producir los vectores virales inventivos de esta invención como partículas de AAV. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para fabricar una partícula de AAV que comprende la cápside de AAV de esta invención, que comprende: (a) transfectar una célula hospedadora con uno o más plásmidos que proporcionan, en combinación, todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV; (b) introducir una o más construcciones de ácido nucleico en una línea celular de envasado o línea celular productora para proporcionar, en combinación, todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV; (c) introducir en una célula hospedadora uno o más vectores de baculovirus recombinantes que proporcionan en combinación todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV; y/o (d) introducir en una célula hospedadora uno o más vectores de herpesvirus recombinantes que proporcionan en combinación todas las funciones y genes necesarios para ensamblar partículas de AAV. Los ejemplos no limitantes de diversos métodos para elaborar los vectores virales de la presente invención se describen en Clement y Grieger ("Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors for clinical trials" Mol. Ther. Methods Clin Dev. 3:16002 (2016)) y en Grieger et al. ("Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells y continuous harvest of vector de the culture media for GMP FIX y FLT1 clinical vector" Mol Ther 24(2):287-297 (2016)).
La presente descripción proporciona un método para producir un vector viral, el método comprende proporcionar a una célula: (a) una plantilla de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia TR(por ejemplo,secuencia TR de AAV), y (b) secuencias de AAV suficientes para la replicación de la plantilla de ácido nucleico y la encapsidación en cápsides de AAV(por ejemplo,secuenciasrep de AAV y secuencias capde AAV que codifican para las cápsides de AAV de la descripción). Opcionalmente, el molde de ácido nucleico comprende además al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga. El molde de ácido nucleico puede comprender dos secuencias de ITR de AAV, que se ubican 5' y 3' con respecto a la secuencia de ácido nucleico heteróloga (si está presente), aunque no es necesario que sean directamente contiguas a esta.
El molde de ácido nucleico y las secuenciasrepycapde AAV se proporcionan en condiciones tales que el vector de virus que comprende el molde de ácido nucleico envasado dentro de la cápside de AAV se produce en la célula. El método puede comprender además el paso de recolectar el vector viral de la célula. El vector viral se puede recolectar del medio y/o mediante la lisis de las células.
La célula puede ser una célula que es permisiva para la replicación viral de AAV. Se puede emplear cualquier celda adecuada conocida en la técnica. La célula puede ser una célula de mamífero. Como otra opción, la célula puede ser una línea celular de envasado transcomplementaria que proporciona funciones eliminadas de un virus auxiliar de replicación defectuosa,por ejemplo,células 293 u otras células transcomplementarias de Ela.
Las secuencias de replicación y cápside de AAV pueden proporcionarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los protocolos actuales habitualmente expresan losgenes replcapde AAV en un plásmido individua. No es necesario que las secuencias de replicación y envasado de AAV se proporcionen conjuntamente, aunque puede ser conveniente hacerlo. Las secuenciasrepy/ocapde AAV pueden ser proporcionadas por cualquier vector viral o no viral. Por ejemplo, las secuenciasreplcappueden ser proporcionadas por un vector híbrido de adenovirus o herpesvirus(por ejemplo,insertado en las regiones Ela o E3 de un vector de adenovirus eliminado). Los vectores de EBV también se pueden emplear para expresar los genescapyrepde AAV. Una ventaja de este método es que los vectores EBV son episómicos, pero mantendrán un alto número de copias a lo largo de divisiones celulares sucesivas(es decir,se integran de forma estable en la célula como elementos extracromosómicos, designados como un "episoma nuclear basado en EBV", ver Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Inmun. 158:67).
Como alternativa adicional, las secuenciasreplcappueden incorporarse de forma estable en una célula. Habitualmente, lassecuenciasde replcap de AAV no estarán flanqueadas por las TR, para evitar el rescate y/o envasado de estas secuencias.
El molde de ácido nucleico se puede proporcionar a la célula usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el molde puede ser suministrado por un vector no viral(por ejemplo,plásmido) o viral. Por ejemplo, el molde de ácido nucleico es suministrado por un vector de herpesvirus o adenovirus(por ejemplo,insertado en las regiones Ela o E3 de un adenovirus suprimido). Como otra ilustración, Palombo et al., (1998) J. Virology 72:5025, describe un vector de baculovirus que porta un gen indicador flanqueado por los TR de AAV. También se pueden emplear vectores EBV para administrar el molde, como se describió anteriormente con respecto a los genesreplcap.
Por ejemplo, el molde de ácido nucleico es proporcionado por un virus rAAV replicante. Por ejemplo, un provirus de AAV que comprende el molde de ácido nucleico se integra de forma estable en el cromosoma de la célula.
Para mejorar los títulos de virus, se pueden proporcionar a la célula funciones de virus auxiliares(porejemplo,adenovirus o herpesvirus) que promueven una infección productiva por AAV. Las secuencias de virus auxiliares necesarias para la replicación de AAV son conocidas en la técnica. Habitualmente, estas secuencias serán proporcionadas por un adenovirus auxiliar o vector de herpesvirus. Alternativamente, las secuencias de adenovirus o herpesvirus pueden ser proporcionadas por otro vector no viral o viral,por ejemplo,como un miniplásmido de adenovirus no infeccioso que porta todos los genes auxiliares que promueven la producción eficiente de AAV como se describe por Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295, y las patentes de los Estados Unidos n .° 6.040.183 y 6.093.570.
Además, las funciones del virus auxiliar pueden ser proporcionadas por una célula de envasado con las secuencias auxiliares incrustadas en el cromosoma o mantenidas como un elemento extracromosómico estable. Generalmente, las secuencias de virus auxiliares no se pueden envasar en viriones de AAV,por ejemplo,no están flanqueadas por TR.
Los expertos en la técnica apreciarán que puede ser ventajoso proporcionar las secuencias de replicación y cápside de AAV y las secuencias de virus auxiliares(por ejemplo,secuencias de adenovirus) en una construcción auxiliar individual. Esta construcción auxiliar puede ser una construcción no viral o viral. Como una ilustración no limitante, la construcción auxiliar puede ser un adenovirus híbrido o un herpesvirus híbrido que comprende los genes replcapdeAAV.
Por ejemplo, las secuencias replcapdeAAV y las secuencias auxiliares de adenovirus son suministradas por un vector auxiliar de adenovirus individual. Este vector puede comprender además el molde de ácido nucleico. Las secuenciasreplcapde AAV y/o la plantilla de rAAV se pueden insertar en una región eliminada(por ejemplo,las regiones E1a o E3) del adenovirus.
En una realización adicional, las secuencias replcapdeAAV y las secuencias auxiliares de adenovirus son suministradas por un vector auxiliar de adenovirus individual. De acuerdo con esta realización, la plantilla de rAAV se puede proporcionar como una plantilla de plásmido.
En otra realización ilustrativa, las secuencias replcapdeAAV y las secuencias auxiliares de adenovirus son proporcionadas por un vector auxiliar de adenovirus individual, y el molde de rAAV se integra en la célula como un provirus. Alternativamente, la plantilla de rAAV es proporcionada por un vector de EBV que se mantiene dentro de la célula como un elemento extracromosómico(por ejemplo,como un episoma nuclear basado en EBV).
En una realización de ejemplo adicional, las secuencias replcap deAAVy las secuencias auxiliares de adenovirus son proporcionadas por un auxiliar de adenovirus individual. La plantilla de rAAV se puede proporcionar como un vector viral de replicación separado. Por ejemplo, la plantilla de rAAV puede ser proporcionada por una partícula de rAAV o una segunda partícula de adenovirus recombinante.
De acuerdo con los métodos anteriores, el vector de adenovirus híbrido comprende habitualmente las secuenciascis5' y 3' de adenovirus suficientes para la replicación y envasado de adenovirus(es decir,las repeticiones terminales de adenovirus y la secuencia PAC). Las secuenciasderemodelación de AAV y, si están presentes, la plantilla de rAAV están incrustadas en la estructura principal del adenovirus y están flanqueadas por las secuenciascis5' y 3', de modo que estas secuencias pueden envasarse en cápsides de adenovirus. Como se describió anteriormente, las secuencias auxiliares de adenovirus y las secuenciasreplcapde AAV generalmente no están flanqueadas por TR, de modo que estas secuencias no se envasan en los viriones de<a>A<v>.
Zhang et al., ((2001) Gene Ther. 18:704-12) describen un auxiliar quimérico que comprende tanto adenovirus como los genesrepycapde AAV.
El herpesvirus también se puede utilizar como un virus auxiliar en los métodos de envasado de AAV.
Los herpesvirus híbridos que codifican para la o las proteínas Rep de AAV pueden facilitar ventajosamente los esquemas de producción de vectores de AAV escalables. Se ha descrito un vector híbrido del virus del herpes simple tipo I (HSV-1) que expresa los genesrepycapde AAV-2 (Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986 y WO 00/17377.
Como alternativa adicional, los vectores de virus se pueden producir en células de insecto usando vectores de baculovirus para administrar los genesreplcapy la plantilla de rAAV como se describe, por ejemplo, por Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43.
Las existencias de vectores de AAV libres de virus auxiliares contaminantes se pueden obtener mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el AAV y el virus auxiliar se pueden diferenciar fácilmente en función del tamaño. El AAV también se puede separar del virus auxiliar en función de la afinidad por un sustrato de heparina (Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973). Se pueden utilizar virus auxiliares de replicación defectuosa suprimidos para que cualquier virus auxiliar contaminante no sea competente para la replicación. Como alternativa adicional, se puede emplear un adenovirus auxiliar que carezca de expresión génica tardía, ya que solo se requiere la expresión génica temprana del adenovirus para mediar en el envasado del virus AAV. Los mutantes de adenovirus defectuosos para la expresión génica tardía son conocidos en la técnica(porejemplo,mutantes de adenovirus ts100K y ts149).
Vectores de virus recombinantes
La presente descripción proporciona un método para administrar una molécula de ácido nucleico a una célula, donde el método comprende poner en contacto la célula con el vector viral, la partícula de AAV y/o la composición o formulación farmacéutica de esta descripción. La presente invención proporciona una partícula de vector AAV de la invención para usarse en un método de tratamiento. La presente invención también proporciona una composición que comprende la cápside de AAV de la invención y/o la partícula de vector de AAV de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona además un método para administrar un ácido nucleico a un sujeto, donde el método comprende administrar al sujeto el vector viral, la partícula de AAV y/o la composición o formulación farmacéutica de esta descri pción.
El sujeto puede ser humano, y el sujeto puede tener o puede estar en riesgo de un trastorno que puede tratarse mediante protocolos de terapia génica. Los ejemplos no limitantes de dichos trastornos incluyen una distrofia muscular que incluye distrofia muscular de Duchenne o Becker, hemofilia A, hemofilia B, esclerosis múltiple, diabetes mellitus, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, cáncer, artritis, atrofia muscular, enfermedad cardíaca que incluye insuficiencia cardíaca congestiva o enfermedad arterial periférica, hiperplasia de la íntima, un trastorno neurológico que incluye: epilepsia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer, una enfermedad autoinmunitaria, fibrosis quística, talasemia, síndrome de Hurler, síndrome de Sly, síndrome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo A, B, C, D, síndrome de Morquio, síndrome de Maroteaux-Lamy, enfermedad de Krabbe, fenilcetonuria, enfermedad de Batten, ataxia cerebral espinal, deficiencia del receptor de LDL, hiperamonemia, anemia, artritis, un trastorno degenerativo de la retina que incluye degeneración macular, deficiencia de adenosina desaminasa, un trastorno metabólico e incluyendo cánceres que forman tumores.
El vector viral, la partícula de AAV y/o la composición o formulación farmacéutica se pueden administrar al músculo esquelético, músculo cardíaco y/o músculo diafragmático.
En los métodos descritos en la presente, el vector viral, la partícula de AAV y/o la composición o formulación farmacéutica se pueden administrar/administrar a un sujeto a través de una vía sistémica(por ejemplo, porvía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, etc.). El vector y/o composición de virus se puede administrar al sujeto a través de una vía intracerebroventrical, intracisternal, intraparenquimatosa, intracraneal y/o intratecal. El vector de virus y/o la formulación farmacéutica se pueden administrar por vía intravenosa.
Los vectores de virus de la presente invención son útiles para la administración de moléculas de ácido nucleico a célulasin vitro, ex vivoein vivo.En particular, los vectores de virus se pueden emplear ventajosamente para administrar o transferir moléculas de ácido nucleico a células animales, que incluyen células de mamífero.
Cualquier secuencia o secuencias de ácido nucleico heterólogas de interés se pueden administrar en los vectores de virus de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico de interés incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para polipéptidos, incluyendo polipéptidos terapéuticos(porejemplo,para usos médicos o veterinarios) y/o inmunogénicos(por ejemplo,para vacunas).
Los polipéptidos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), distrofina (que incluye minidistrofinas y microdistrofinas,ver, por ejemplo,Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130; publicación de patente de los Estados Unidos n .° 2003/017131; publicación de patente internacional n .° WO/2008/088895, Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-13719 (2000); y Gregorevic et al., Mol. Ther.
16:657-64 (2008)), propéptido de miostatina, folistatina, receptor soluble de activina tipo II, IGF-1, polipéptidos antiinflamatorios tal como el mutante dominante I kappa B, sarcospan, utrofina (Tinsley et al., (1996) Nature 384:349), mini-utrofina, factores de coagulación(por ejemplo,Factor VIII, Factor IX, Factor X,etc.),eritropoyetina, angiostatina, endostatina, catalasa, tirosina hidroxilasa, superóxido dismutasa, leptina, el receptor de LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, p-globina, a-globina, espectrina, a1-antitripsina, adenosina desaminasa, hipoxantina guanina fosforribosil transferasa, glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa A lisosómica, cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, proteína RP65, citocinas(por ejemplo,a-interferón, p-interferón, interferón-Y, interleucina-2, interleucina-4, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, linfotoxina y similares), factores de crecimiento peptídicos, factores neurotróficos y hormonas(porejemplo, somatotropina,insulina, factores de crecimiento similares a la insulina 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico-3 y -4, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas morfogénicas óseas [incluyendo RANKL y VEGF], factor de crecimiento glial, factor de crecimiento transformante-a y -p, y similares), ácido lisosómico a-glucosidasa, a-galactosidasa A, receptores(por ejemplo,el receptor soluble del factor de crecimiento de necrosis tumoral-a), S100A1, parvalbúmina, adenilil ciclasa tipo 6, una molécula que modula el manejo del calcio(por ejemplo,SERCA2A, Inhibidor 1 de PP1 y fragmentos del mismo [porejemplo,WO 2006/029319 y WO 2007/100465]), una molécula que efectúa la interferencia genetica del receptor cinasa tipo 2 acoplado a la proteína G, tal como una bARKct constitutivamente activa truncada, factores antiinflamatorios tal como IRAP, proteínas antimiostatina, aspartoacilasa, anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de cadena individual; un Mab de ejemplo es el Mab Herceptin®), neuropéptidos y fragmentos de los mismos(por ejemplo, galanina,Neuropéptido Y(ver,Patente de los Estados Unidos No. 7,071,172), inhibidores de la angiogénesis tal como Vasohibinas y otros inhibidores de VEGF(por ejemplo,Vasohibina 2[ver,WO JP2006/073052]). Otras secuencias de ácido nucleico heterólogas ilustrativas codifican para productos génicos suicidas (por ejemplo,timidina cinasa, citosina desaminasa, toxina diftérica y factor de necrosis tumoral), proteínas que confieren resistencia a un fármaco utilizado en la terapia contra el cáncer, productos génicos supresores de tumores(por ejemplo,p53, Rb, Wt-1), TRAIL, ligando FAS y cualquier otro polipéptido que tenga un efecto terapéutico en un sujeto en necesidad del mismo. Los vectores de AAV también se pueden utilizar para administrar anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra miostatina(ver, por ejemplo,Fang et al., Nature Biotechnology 23:584-590 (2005)).
Las secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican para polipéptidos incluyen aquellas que codifican parapolipéptidos indicadores (por ejemplo,una enzima). Los polipéptidos indicadores son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa y gen de cloranfenicol acetiltransferasa.
Opcionalmente, la molécula de ácido nucleico heteróloga codifica para un polipéptido secretado(por ejemplo,un polipéptido que es un polipéptido secretado en su estado nativo o que ha sido modificado de forma genética para ser secretado, por ejemplo, mediante asociación operable con una secuencia señal secretora como se conoce en la técnica).
Alternativamente, la molécula de ácido nucleico heteróloga puede codificar para una molécula de ácido nucleico antisentido, una ribozima(por ejemplo,como se describe en la patente de los Estados Unidos n .° 5,877,022), ARN que efectúan elcorte y empalme en trans mediado por espliceosomas (ver,Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech.
17:246; patente de los Estados Unidos n .° 6.013.487; patente de los Estados Unidos n .° 6.083.702),<a>R<n>de interferencia (ARNi) que incluyen ARNip, ARNhc o miARN que median el silenciamiento génico(ver,Sharp et al., (2000) Science 287:2431) y otros ARN no traducidos, tal como ARN "guía" (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; patente de los Estados Unidos n .° 5,869,248 de Yuan et al.), y similares. Los ejemplos de ARN no traducidos incluyen ARNi contra un producto génico de resistencia a múltiples fármacos(MDR) (porejemplo,para tratar y/o prevenir tumores y/o para la administración al corazón para prevenir el daño por quimioterapia), ARNi contra miostatina(por ejemplo,para la distrofia muscular de Duchenne), ARNi contra VEGF(porejemplo,para tratar y/o prevenir tumores), a Rní contra fosfolambano(por ejemplo,para tratar enfermedades cardiovasculares,ver, por ejemplo,Andino et al., J. Gene Med. 10:132-142 (2008) y Li et al., Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005)); moléculas inhibidoras o dominantes negativas de fosfolambano tal como fosfolambano S16E(por ejemplo,para tratar enfermedades cardiovasculares,ver, por ejemplo,Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002)), ARNi a adenosina cinasa(por ejemplo,para epilepsia) e<a>R<ní>dirigida contra organismos y virus patógenos (por ejemplo,virus de la hepatitis B y/o C, virus de la inmunodeficiencia humana, CMV, virus del herpes simple, virus del papiloma humano, etc.).
Además, se puede administrar una secuencia de ácido nucleico que dirige el corte y empalme alternativo. Para ilustrar, una secuencia antisentido (u otra secuencia inhibidora) complementaria al sitio de corte y empalme 5' y/o 3' del exón 51 de distrofina se puede administrar junto con un promotor de ARN nuclear pequeño (sn) U1 o U7 para inducir la omisión de este exón. Por ejemplo, una secuencia de ADN que comprende un promotor de ARNpn U1 o U7 ubicado 5' con respecto a la secuencia o secuencias antisentido/inhibidoras puede envasarse y administrarse en una cápside modificada.
El vector de virus también puede comprender una molécula de ácido nucleico heteróloga que comparte homología con y se recombina con un locus en un cromosoma de célula hospedadora. Este enfoque se puede utilizar, por ejemplo, para corregir un defecto genético en la célula hospedadora.
La presente descripción también proporciona vectores de virus que expresan un polipéptido, péptido y/o epítopo inmunogénico,por ejemplo,para la vacunación. La molécula de ácido nucleico puede codificar para cualquier inmunógeno de interés conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, inmunógenos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS), virus de la influenza, VIH o proteínas gag del VIS, antígenos tumorales, antígenos del cáncer, antígenos bacterianos, antígenos virales y similares.
El uso de parvovirus como vectores de vacuna se conoce en la técnica(ver, por ejemplo,Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci usa 91:8507; patente de los Estados Unidos n .° 5.916.563 de Young et al., Patente de Estados Unidos No.
5,905,040 de Mazzara et al., patente de los Estados Unidos n .° 5,882,652 y patente de los Estados Unidos n .° 5,863,541 de Samulski et al.). El antígeno puede presentarse en la cápside del parvovirus. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede expresarse a partir de una molécula de ácido nucleico heteróloga introducida en un genoma de vector recombinante. Cualquier inmunógeno o antígeno de interés como se describe en la presente y/o como se conoce en la técnica puede ser proporcionado por el vector de virus.
Un polipéptido inmunogénico puede ser cualquier polipéptido, péptido y/o epítopo adecuado para provocar una respuesta inmunitaria y/o proteger al sujeto contra una infección y/o enfermedad, que incluye, pero no se limita a, infecciones y enfermedades microbianas, bacterianas, protozoarias, parasitarias, fúngicas y/o virales. Por ejemplo, el polipéptido inmunogénico puede ser un inmunógeno de ortomixovirus(porejemplo,un inmunógeno del virus de la influenza, tal como la proteína de superficie de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza o la nucleoproteína del virus de la influenza, o un inmunógeno del virus de la influenza equina) o un inmunógeno de lentivirus(por ejemplo,un inmunógeno del virus de la anemia infecciosa equina, un inmunógeno del virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) o un inmunógeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tal como la proteína GP160 de la envoltura del VIH o VIS, las proteínas de la matriz/cápside del VIH o VIS, y los productos génicosgag, p o lyenvdel VIH o VIS). El polipéptido inmunogénico también puede ser un inmunógeno de arenavirus(por ejemplo,inmunógeno del virus de la fiebre de Lassa, tal como la proteína de la nucleocápside del virus de la fiebre de Lassa y la glicoproteína de la envoltura de la fiebre de Lassa),un inmunógeno de poxvirus (por ejemplo,un inmunógeno del virus vaccinia, tal como los productos génicos L1 o L8 de vaccinia),un inmunógeno de flavivirus (por ejemplo,un inmunógeno del virus de la fiebre amarilla o un inmunógeno del virus de la encefalitis japonesa),un inmunógeno de filovirus (por ejemplo,un inmunógeno del virus del Ébola o un inmunógeno del virus de Marburg, tal como productos génicos NP y GP), un inmunógeno de bunyavirus(por ejemplo,inmunógenos del virus RVFV, CCHF y/o SFS), o un inmunógeno del coronavirus(por ejemplo,un inmunógeno del coronavirus humano infeccioso, tal como la glicoproteína de la envoltura del coronavirus humano, o un inmunógeno del virus de la gastroenteritis transmisible porcina, o un inmunógeno del virus de la bronquitis infecciosa aviar). El polipéptido inmunogénico puede ser además un inmunógeno de polio, un inmunógeno de herpes(porejemplo,inmunógenos de CMV, EBV, HSV), un inmunógeno de paperas, un inmunógeno de sarampión, un inmunógeno de rubéola, una toxina diftérica u otro inmunógeno de difteria, un antígeno de pertussis,un inmunógeno de hepatitis (por ejemplo,hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, etc.) y/o cualquier otro inmunógeno de vacuna ahora conocido en la técnica o identificado posteriormente como un inmunógeno.
Alternativamente, el polipéptido inmunogénico puede ser cualquier antígeno de células tumorales o cancerosas. Opcionalmente, el antígeno tumoral o canceroso se expresa en la superficie de la célula cancerosa. Los ejemplos de antígenos de células cancerosas y tumorales se describen en S.A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991)). Otros antígenos de cáncer y tumorales ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: Producto génico BRCA1, producto génico BRCA2, gp100, tirosinasa, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, p-catenina, MUM-1, Caspasa-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, antígenos tumorales de melanoma (Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :3515; Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347; Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124), MART-1, gp100 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P-15, tirosinasa (Brichard et al., (1993) J. Exp . Med. 178:489); producto génico HER-2/neu (patente de los Estados Unidos N .° 4,968,603), CA 125, LK26, F<b>S (endosialina), TAG 72, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN (antígeno sialil Tn), proteínas c-erbB-2, p Sa , L-CanAg, receptor de estrógeno, globulina grasa de la leche, proteína supresora de tumores p53 (Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); antígenos de mucina (Publicación de Patente Internacional No. WO 90/05142); telomerasas; proteínas de la matriz nuclear; fosfatasa ácida prostática; antígenos del virus del papiloma; y/o antígenos que ahora se sabe o se descubre posteriormente que están asociados con los siguientes cánceres: melanoma, adenocarcinoma, timoma, linfoma(por ejemplo,linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin), sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de colon, leucemia, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer cerebral y cualquier otro cáncer o condición maligna ahora conocida o identificada posteriormente(ver, por ejemplo,Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481- 91).
Como alternativa adicional, la molécula de ácido nucleico heteróloga puede codificar para cualquier polipéptido, péptido y/o epítopo que se produzca deseablemente en una célulain vitro, ex vivooin vivo.Por ejemplo, los vectores de virus se pueden introducir en células cultivadas y el producto génico expresado se puede aislar de estas.
Los expertos en la técnica entenderán que las moléculas de ácido nucleico heterólogas de interés pueden asociarse operativamente con secuencias de control apropiadas. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico heteróloga puede estar asociada operativamente con elementos de control de la expresión, tal como señales de control de la transcripción/traducción, orígenes de replicación, señales de poliadenilación, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), promotores y/o potenciadores, y similares.
Además, la expresión regulada de la o las moléculas de ácido nucleico heterólogas de interés se puede lograr a nivel postranscripcional, porejemplo,regulando el corte y empalme selectivo de diferentes intrones mediante la presencia o ausencia de un oligonucleótido, molécula pequeña y/u otro compuesto que bloquee selectivamente la actividad de corte y empalme en sitios específicos(por ejemplo,como se describe en WO 2006/119137).
Los expertos en la técnica apreciarán que se puede utilizar una variedad de elementos promotores/potenciadores dependiendo del nivel y la expresión específica del tejido deseada. El promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patrón de expresión deseado. El promotor/potenciador puede ser nativo o extraño y puede ser una secuencia natural o sintética. Por extraño, se entiende que la región de iniciación transcripcional no se encuentra en el huésped de tipo silvestre en el que se introduce la región de iniciación transcripcional.
Los elementos promotores/potenciadores pueden ser nativos de la célula diana o sujetos a tratar. El elemento promotor/potenciador puede ser nativo de la secuencia de ácido nucleico heteróloga.
El elemento promotor/potenciador se elige generalmente de modo que funcione en la (s) célula(s) diana de interés. Además, el elemento promotor/potenciador puede ser un elemento promotor/potenciador de mamífero. El elemento promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible.
Los elementos de control de la expresión inducible son habitualmente ventajosos en aquellas aplicaciones en las que es deseable proporcionar una regulación sobre la expresión de la o las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas. Los elementos promotores/potenciadores inducibles para la administración de genes pueden ser elementos promotores/potenciadores específicos de tejido o preferidos, e incluyen específicos o preferidos de músculo (incluyendo específicos o preferidos de músculo cardíaco, esquelético y/o liso), específicos o preferidos de tejido neural (incluyendo específicos o preferidos de cerebro), específicos o preferidos de ojo (incluyendo específicos de retina y específicos de córnea), específicos o preferidos de hígado, específicos o preferidos de médula ósea, específicos o preferidos de páncreas, específicos o preferidos de bazo y específicos o preferidos de pulmón o elementos promotores/potenciadores preferidos. Otros elementos promotores/potenciadores inducibles incluyen elementos inducibles por hormonas e inducibles por metales. Los ejemplos de promotores/elementos potenciadores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un elemento de activación/desactivación de Tet, un promotor inducible por RU486, un promotor inducible por ecdisona, un promotor inducible por rapamicina y un promotor de metalotioneína.
En los ejemplos en donde la o las secuencias de ácido nucleico heterólogas se transcriben y luego se traducen en las células diana, generalmente se incluyen señales de inicio específicas para la traducción eficiente de las secuencias que codifican para proteínas insertadas. Estas secuencias de control de la traducción exógenas, que pueden incluir el codón de iniciación aTg y secuencias adyacentes, pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos.
Los vectores de virus de acuerdo con la presente invención proporcionan un medio para administrar moléculas de ácido nucleico heterólogas en una amplia gama de células, que incluyen células en división y no en división. Los vectores de virus se pueden emplear para administrar una molécula de ácido nucleico de interés a una célulain vitro, por ejemplo,para producir un polipéptidoin vitroo para terapia génicaex vivooin vivo.Los vectores de virus son útiles adicionalmente en un método para administrar un ácido nucleico a un sujeto en necesidad del mismo,por ejemplo,para expresar un polipéptido inmunogénico o terapéutico o un ARN funcional. De esta manera, el polipéptido o ARN funcional se puede producirin vivoen el sujeto. El sujeto puede necesitar el polipéptido porque el sujeto tiene una deficiencia del polipéptido.
Además, el método puede ponerse en práctica debido a que la producción del polipéptido o ARN funcional en el sujeto puede impartir algún efecto beneficioso.
Los vectores de virus también se pueden utilizar para producir un polipéptido de interés o ARN funcional en células cultivadas o en un sujeto (porejemplo,utilizando el sujeto como un biorreactor para producir el polipéptido o para observar los efectos del ARN funcional en el sujeto, por ejemplo, en relación con los métodos de selección).
En general, los vectores de virus de la presente invención se pueden emplear para administrar una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para un polipéptido o ARN funcional para tratar y/o prevenir cualquier trastorno o estado de enfermedad para el cual es beneficioso administrar un polipéptido terapéutico o ARN funcional. Los estados de enfermedad ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: fibrosis quística (proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística) y otras enfermedades del pulmón, hemofilia A (Factor VIII), hemofilia B (Factor IX), talasemia (p-globina), anemia (eritropoyetina) y otros trastornos sanguíneos, enfermedad de Alzheimer (GDF; neprilisina), esclerosis múltiple (pinterferón), enfermedad de Parkinson (factor neurotrófico derivado de la línea celular glial [GDNF]), enfermedad de Huntington (ARNi para remover repeticiones), esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia (galanina, factores neurotróficos) y otros trastornos neurológicos, cáncer (endostatina, angiostatina, TRAIL, ligando FAS, citocinas que incluyen interferones; ARNi que incluye ARNi contra VEGF o el producto génico de resistencia a múltiples fármacos, mir-26a [porejemplo,para carcinoma hepatocelular]), diabetes mellitus (insulina), distrofias musculares que incluyen Duchenne (distrofina, minidistrofina, factor de crecimiento similar a la insulina I, un sarcoglicano [porejemplo,a, p,<y>], ARNi contra miostatina, propéptido de miostatina, folistatina, receptor soluble de activina tipo II, polipéptidos antiinflamatorios tal como el mutante dominante Ikappa B, sarcospano, utrofina, mini-utrofina, antisentido o ARNi contra uniones de empalme en el gen de distrofina para inducir omisión de exones[ver, por ejemplo,WO 2003/095647], antisentido contra ARNsn U7 para inducir omisión de exones[ver, por ejemplo,WO 2006/021724], y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra miostatina o propéptido de miostatina) y Becker, enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa), enfermedad de Hurler (a-L-iduronidasa), deficiencia de adenosina desaminasa (adenosina desaminasa), enfermedades de almacenamiento de glucógeno (porejemplo,,enfermedad de Fabry [a-galactosidasa] y enfermedad de Pompe [ácido lisosómico aglucosidasa]) y otros trastornos metabólicos, enfisema congénito (a1-antitripsina), síndrome de Lesch-Nyhan (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa), enfermedad de Niemann-Pick (esfingomielinasa), enfermedad de Tay Sachs (hexosaminidasa A lisosómica), enfermedad de la orina en jarabe de arce (cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada), enfermedades degenerativas de la retina (y otras enfermedades del ojo y la retina;por ejemplo,PDGF para la degeneración macular y/o vasohibina u otros inhibidores de VEGF u otros inhibidores de la angiogénesis para tratar/prevenir trastornos de la retina, porejemplo,en la diabetes tipo I), enfermedades de órganos sólidos tal como el cerebro (incluido el Parkinson Enfermedad [GDNF], astrocitomas [endostatina, angiostatina y/o ARNi contra VEGF], glioblastomas [endostatina, angiostatina y/o ARNi contra VEGF]), hígado, riñón, corazón, incluida la insuficiencia cardíaca congestiva o la enfermedad arterial periférica (PAD) (porejemplo,mediante la administración del inhibidor de la proteína fosfatasa I (I-1) y fragmentos del mismo(por ejemplo,IlC), serca2a, proteínas con dedos de zinc que regulan el gen fosfolamban, Barkct, receptor p2-adrenérgico, receptor p2-adrenérgico cinasa (BARK), fosfoinositida-3 cinasa (PI3 cinasa), S100A1S100A1, parvalbúmina, adenilil ciclasa tipo 6, una molécula que afecta la interferencia genética del receptor cinasa tipo 2 acoplado a la proteína G, tal como una bARKct constitutivamente activo truncado; calsarcina, ARNi contra fosfolambano; moléculas inhibidoras o dominantes negativas de fosfolambano tal como fosfolambano S16E, etc.), artritis (factores de crecimiento similares a la insulina), trastornos articulares (factor de crecimiento similar a la insulina 1 y/o 2), hiperplasia de la íntima (porejemplo,al administrar enos, inos), mejorar la supervivencia de los trasplantes de corazón (superóxido dismutasa), SIDA (CD4 soluble), atrofia muscular (factor de crecimiento similar a la insulina I), deficiencia renal (eritropoyetina), anemia (eritropoyetina), artritis (factores antiinflamatorios tal como IRAP y receptor soluble de TNFa), hepatitis (a-interferón), deficiencia del receptor de LDL (receptor de LDL), hiperamonemia (ornitina transcarbamilasa), enfermedad de Krabbe (galactocerebrosidasa), enfermedad de Batten, ataxias cerebrales espinales incluyendo SCA1, SCA2 y SCA3, fenilcetonuria (fenilalanina hidroxilasa), enfermedades autoinmunes y similares. La invención se puede utilizar además después del trasplante de órganos para aumentar el éxito del trasplante y/o para reducir los efectos secundarios negativos del trasplante de órganos o terapias complementarias (porejemplo, mediante la administración de agentes inmunosupresores o ácidos nucleicos inhibidores para bloquear la producción de citocinas). Como otro ejemplo, las proteínas morfogénicas óseas (incluyendo BNP 2, 7, etc., RANKL y/o VEGF) puede administrarse con un aloinjerto óseo, por ejemplo, después de una ruptura o extirpación quirúrgica en un paciente con cáncer.
Los vectores descritos también se pueden utilizar para producir células madre pluripotentes inducidas (iPS). Por ejemplo, se puede utilizar un vector de virus para administrar ácido(s) nucleico (s) asociado (s) a células madre en una célula no pluripotente, tal como fibroblastos adultos, células cutáneas, células hepáticas, células renales, células adiposas, células cardíacas, células neurales, células epiteliales, células endoteliales y similares. Los ácidos nucleicos que codifican para factores asociados con células madre son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de dichos factores asociados con las células madre y la pluripotencia incluyen Oct-3/4, la familia SOX (porejemplo,,SOX1, SOX2, SOX3 y/o SOX15), la familia Klf(porejemplo,Klf1, Klf2, Klf4 y/o Klf5), la familia Myc(porejemplo,C-myc, L-myc y/o N-myc), NA<n>O<g>y/o LIN28.
La invención también se puede practicar para tratar y/o prevenir un trastorno metabólico tal como diabetes (por ejemplo,insulina), hemofilia(por ejemplo,Factor IX o Factor VIII), un trastorno de almacenamiento lisosómico tal como un trastorno de mucopolisacaridosis(por ejemplo,síndrome de Sly [p-glucuronidasa], síndrome de Hurler [a-L-iduronidasa], síndrome de Scheie [a-L-iduronidasa], síndrome de Hurler-Scheie [a-L-iduronidasa], síndrome de Hunter [iduronato sulfatasa], síndrome de Sanfilippo A [heparán sulfamidasa], B [N-acetilglucosaminidasa], C [acetil-CoA: aglucosaminida acetiltransferasa], D [N-acetilglucosamina 6-sulfatasa], síndrome de Morquio A [galactosa-6-sulfato sulfatasa], B [p-galactosidasa], síndrome de Maroteaux-Lamy [N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa],etc.),enfermedad de Fabry (a-galactosidasa), enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa) o un trastorno de almacenamiento de glucógeno (porejemplo,,enfermedad de Pompe; a-glucosidasa ácida lisosomal).
La transferencia génica tiene un uso potencial sustancial para comprender y proporcionar terapia para estados de enfermedad. Hay una serie de enfermedades hereditarias en las que se conocen genes defectuosos y se han clonado. En general, los estados de enfermedad anteriores se dividen en dos clases: estados de deficiencia, generalmente de enzimas, que generalmente se heredan de manera recesiva, y estados desequilibrados, que pueden involucrar proteínas reguladoras o estructurales, y que generalmente se heredan de manera dominante. Para las enfermedades del estado de deficiencia, la transferencia génica se puede utilizar para llevar un gen normal a los tejidos afectados para la terapia de reemplazo, así como para crear modelos animales para la enfermedad utilizando mutaciones antisentido. Para estados de enfermedad desequilibrados, la transferencia génica se puede utilizar para crear un estado de enfermedad en un sistema modelo, que luego se puede utilizar en los esfuerzos para contrarrestar el estado de enfermedad. Por lo tanto, los vectores virales permiten el tratamiento y/o la prevención de enfermedades genéticas.
Los vectores de virus también se pueden emplear para proporcionar un ARN funcional a una célulain vitrooin vivo.La expresión del ARN funcional en la célula, por ejemplo, puede disminuir la expresión de una proteína diana particular por la célula. Por consiguiente, se puede administrar ARN funcional para disminuir la expresión de una proteína particular en un sujeto en necesidad del mismo. El ARN funcional también se puede administrar a célulasin vitropara regular la expresión génica y/o la fisiología celular, porejemplo, para optimizar los sistemas de cultivo celular o tisular o en métodos de selección.
Además, los vectores de virus encuentran uso en métodos de diagnóstico y detección, mediante los cuales un ácido nucleico de interés se expresa de forma transitoria o estable en un sistema de cultivo celular, o alternativamente, un modelo animal transgénico.
Los vectores de virus también se pueden utilizar para diversos fines no terapéuticos, que incluyen, de modo no taxativo, el uso en protocolos para evaluar el direccionamiento génico, la eliminación, la transcripción, la traducción,etc.,como sería evidente para un experto en la técnica. Los vectores de virus también se pueden utilizar con el fin de evaluar la seguridad (propagación, toxicidad, inmunogenicidad, etc.). Dichos datos, por ejemplo, son considerados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos como parte del proceso de aprobación regulatoria antes de la evaluación de la eficacia clínica.
Como un aspecto adicional, los vectores de virus se pueden utilizar para producir una respuesta inmunitaria en un sujeto. De acuerdo con este ejemplo, un vector de virus que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido inmunogénico se puede administrar a un sujeto, y el sujeto monta una respuesta inmunitaria activa contra el polipéptido inmunogénico. Los polipéptidos inmunogénicos son como se describieron anteriormente en la presente. En algunos ejemplos, se provoca una respuesta inmunitaria protectora.
Alternativamente, el vector de virus se puede administrar a una célulaex vivoy la célula alterada se administra al sujeto. El vector viral que comprende el ácido nucleico heterólogo se introduce en la célula y la célula se administra al sujeto, donde el ácido nucleico heterólogo que codifica el inmunógeno puede expresarse e inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto contra el inmunógeno. La célula puede ser una célula presentadora de antígeno(por ejemplo,una célula dendrítica).
Una "respuesta inmunitaria activa" o "inmunidad activa" se caracteriza por la "participación de tejidos y células huésped después de un encuentro con el inmunógeno. Implica la diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes en tejidos linforreticulares, que conducen a la síntesis de anticuerpos o al desarrollo de reactividad mediada por células, o ambos ". Herbert B. Herscowitz, Inmunofisiología: Función celular e interacciones celulares en la formación de anticuerpos, en INMUNOLOGÍA: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Indicado de manera alternativa, el huésped monta una respuesta inmunitaria activa después de la exposición a un inmunógeno mediante infección o vacunación. La inmunidad activa se puede contrastar con la inmunidad pasiva, que se adquiere a través de la "transferencia de sustancias preformadas (anticuerpo, factor de transferencia, injerto tímico e interleucina-2) de un huésped inmunizado activamente a un huésped no inmune".Id.
Una respuesta inmunitaria "protectora" o inmunidad "protectora" como se usa en la presente indica que la respuesta inmunitaria confiere algún beneficio al sujeto en el sentido de que previene o reduce la incidencia de la enfermedad. Alternativamente, una respuesta inmunitaria protectora o inmunidad protectora puede ser útil en el tratamiento y/o prevención de enfermedades, en particular cáncer o tumores (porejemplo, al prevenir el cáncer o la formación de tumores, al causar la regresión de un cáncer o tumor y/o al prevenir la metástasis y/o al prevenir el crecimiento de nódulos metastásicos). Los efectos protectores pueden ser completos o parciales, siempre que los beneficios del tratamiento superen cualquier desventaja del mismo.
El vector de virus o célula que comprende la molécula de ácido nucleico heterólogo se puede administrar en una cantidad inmunogénicamente eficaz, como se describe a continuación.
Los vectores de virus también se pueden administrar para inmunoterapia contra el cáncer mediante la administración de un vector de virus que expresa uno o más antígenos de células cancerosas (o una molécula inmunológicamente similar) o cualquier otro inmunógeno que produzca una respuesta inmunitaria contra una célula cancerosa. Para ilustrar, se puede producir una respuesta inmunitaria contra un antígeno de célula cancerosa en un sujeto mediante la administración de un vector viral que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica el antígeno de célula cancerosa, por ejemplo, para tratar a un paciente con cáncer y/o para prevenir el desarrollo de cáncer en el sujeto. El vector viral se puede administrar a un sujetoin vivoo mediante el uso de métodosex vivo,como se describe en la presente. Alternativamente, el antígeno de cáncer puede expresarse como parte de la cápside del virus o estar asociado de otro modo con la cápside del virus(por ejemplo,como se describió anteriormente).
Como otra alternativa, cualquier otro ácido nucleico terapéutico(por ejemplo,ARNi) o polipéptido (porejemplo,citocina) conocido en la técnica se puede administrar para tratar y/o prevenir el cáncer.
Tal como se usa en la presente, el término "cáncer" abarca cánceres formadores de tumores.
Del mismo modo, el término "tejido canceroso" abarca tumores. Un "antígeno de células cancerosas" abarca antígenos tumorales.
El término "cáncer" tiene su significado entendido en la técnica, por ejemplo, un crecimiento incontrolado de tejido que tiene el potencial de diseminarse a sitios distantes del cuerpo (esdecir,metastatizar). Los ejemplos de cánceres incluyen, de modo no taxativo, melanoma, adenocarcinoma, timoma, linfoma (porejemplo,linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin), sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de colon, leucemia, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer cerebral y cualquier otro cáncer o afección maligna ahora conocida o identificada posteriormente. Esta descripción proporciona un método para tratar y/o prevenir cánceres formadores de tumores.
El término "tumor" también se entiende en la técnica, por ejemplo, como una masa anormal de células indiferenciadas dentro de un organismo multicelular. Los tumores pueden ser malignos o benignos. Los métodos descritos en la presente se pueden utilizar para prevenir y tratar tumores malignos.
Por los términos "tratar el cáncer", "tratamiento del cáncer" y términos equivalentes se entiende que la gravedad del cáncer se reduce o al menos se elimina parcialmente y/o la progresión de la enfermedad se ralentiza y/o controla y/o la enfermedad se estabiliza. Estos términos indican que la metástasis del cáncer se previene o reduce o al menos se elimina parcialmente y/o que el crecimiento de nódulos metastásicos se previene o reduce o al menos se elimina parcialmente.
Por los términos "prevención del cáncer" o "prevención del cáncer" y términos equivalentes se pretende que los métodos eliminen o reduzcan al menos parcialmente y/o retrasen la incidencia y/o gravedad de la aparición del cáncer. Alternativamente, el inicio del cáncer en el sujeto puede reducirse en probabilidad o probabilidad y/o retrasarse.
Las células pueden extraerse de un sujeto con cáncer y ponerse en contacto con un vector de virus que expresa un antígeno de célula cancerosa. La célula modificada se administra luego al sujeto, mediante lo cual se provoca una respuesta inmunitaria contra el antígeno de la célula cancerosa. Este método se puede emplear ventajosamente con sujetos inmunocomprometidos que no pueden montar una respuesta inmunitaria suficientein vivo (es decir,no pueden producir anticuerpos potenciadores en cantidades suficientes).
Se sabe en la técnica que las respuestas inmunitarias pueden potenciarse mediante citocinas inmunomoduladoras (porejemplo,a-interferón, p-interferón, Y-interferón, w-interferón, T-interferón, interleucina-1a, interleucina-1p, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina-5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-9, interleucina-10, interleucina-11, interleucina-12, interleucina-13, interleucina-14, interleucina-18, factor de crecimiento de linfocitos B, ligando CD40, factor de necrosis tumoral-a, factor de necrosis tumoral-p, proteína quimiotractante de monocitos-1, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y linfotoxina). Por consiguiente, las citocinas inmunomoduladoras (preferentemente, citocinas inductoras de CTL) se pueden administrar a un sujeto junto con el vector viral.
Las citocinas se pueden administrar mediante cualquier método conocido en la técnica. Las citocinas exógenas se pueden administrar al sujeto, o alternativamente, un ácido nucleico que codifica una citocina se puede administrar al sujeto usando un vector adecuado, y la citocina se puede producirin vivo.
Sujetos, formulaciones farmacéuticas y modos de administración
Los vectores virales, las partículas de AAV y las cápsides encuentran uso tanto en aplicaciones veterinarias como médicas. Los sujetos adecuados incluyen tanto aves como mamíferos. El término "aviar" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, pollos, patos, gansos, codornices, pavos, faisanes, loros, periquitos y similares. El término "mamífero", tal como se usa en la presente, incluye, de modo no taxativo, humanos, primates no humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc.
Los sujetos humanos incluyen neonatos, bebés, jóvenes, adultos y sujetos geriátricos.
En realizaciones representativas, el sujeto "necesita" los métodos de la invención.
En realizaciones particulares, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de virus y/o cápside y/o partícula de AAV de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, agentes estabilizantes, amortiguadores, portadores, adyuvantes, diluyentes, etc. Para la inyección, el portador será típicamente un líquido. Para otros métodos de administración, el portador puede ser sólido o líquido. Para la administración por inhalación, el portador será respirable y, opcionalmente, puede estar en forma de partículas sólidas o líquidas. Para la administración a un sujeto o para otros usos farmacéuticos, el portador será estéril y/o fisiológicamente compatible.
Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es tóxico o indeseable de otro modo,es decir,el material se puede administrar a un sujeto sin causar ningún efecto biológico indeseable.
Ejemplos
Ejemplo 1(Ejemplo de referencia)
El vector del virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés) se ha utilizado en más de 100 ensayos clínicos con resultados prometedores, en particular, para el tratamiento de la ceguera y la hemofilia B. El AAV no es patógeno, tiene un amplio tropismo tisular y puede infectar células en división o no en división. Más importante aún, la transducción del vector AAV ha inducido la expresión transgénica terapéutica a largo plazo en ensayos preclínicos y clínicos. A día de hoy, hay 12 serotipos de AAV aislados para la administración de genes. Entre ellos, se ha demostrado que el AAV8 es el mejor para dirigirse al hígado de ratón. Debido a los extensos estudios en animales preclínicos con deficiencia de FIX, se han llevado a cabo ensayos clínicos de Fase I/II utilizando AAV2 y AAV8 en pacientes con hemofilia B. Los resultados de estos ensayos son muy prometedores; sin embargo, la expresión de FIX de pacientes que recibieron AAV/FIX no fue proporcional a lo que se ha logrado en modelos animales a pesar de que se utilizó la misma dosis de vector/kg. Cuando se utilizaron 1*1011 partículas de FIX que codifican para AAV8 en ratones knockout de FIX para administración sistémica, se detectó un 160% de FIX de nivel normal en sangre. Sin embargo, cuando se administraron 2*1011 partículas de AAV8/FIX, solo el 40% de FIX se logró en primates y menos del 1% de FIX se encontró en humanos. La expresión inconsistente de FIX después de la transducción del vector AAV entre estas especies puede deberse a la alteración del tropismo de hepatocitos en diferentes especies. Otro hallazgo interesante de los ensayos clínicos AAV FIX es la respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de la cápside que erradica los hepatocitos transducidos con AAV y, por lo tanto, da como resultado un fracaso terapéutico. Este fenómeno no se ha demostrado en modelos animales después de la administración de AAV, lo que señala otra variación entre los estudios preclínicos y clínicos. Cuando se utilizó una dosis mucho más alta de vector AAV/FIX, se detectó la expresión de FIX en ambos ensayos clínicos utilizando AAV2 o AAV8; sin embargo, el nivel de FIX en sangre disminuyó en la semana 4 o 9 después de la inyección, respectivamente. Otros estudios sugirieron que la infección por el vector AAV provocó una respuesta de CTL específica de la cápside, que parecía eliminar los hepatocitos transducidos con AAV. Por lo tanto, los resultados de estos ensayos clínicos resaltan la necesidad de explorar enfoques efectivos para mejorar la transducción de AAV sin aumentar la carga de la cápside del vector. Cualquier mejora del vector que reduzca el antígeno de la cápside de AAV también afectará las desalentadoras preocupaciones de producción de vectores y será una adición bienvenida al desarrollo de fármacos de terapia génica viables.
Se han explorado muchas estrategias para aumentar la transducción del vector AAV. Una estrategia es optimizar el casete de vector de AAV mediante la utilización de un promotor y/o potenciador fuerte, optimización de codones del ADNc transgénico, secuencia de poliadenilación eficaz y el uso de un genoma de vector autocomplementario si es posible. A nivel de la cápside de AAV, se ha prestado mucha atención al empleo de serotipos naturales que muestran tropismos diferenciales, cápsides diseñadas racionalmente o cápsides seleccionadas o examinadas a partir de una biblioteca de cápsides mutantes. Sin embargo, un inconveniente de este enfoque es que los experimentos relevantes no se pueden realizar en humanos y se sigue observando una variación entre especies en el tropismo de la cápside de AAV dada la recopilación continua de datos en humanos. Un tercer método para mejorar la transducción del vector AAV se basa en la fisiología celular alterada a través de agentes farmacológicos. Se han utilizado muchos agentes farmacológicos para mejorar la transducción de AAV en varios niveles de infección; sin embargo, la mayoría de estos fármacos se utilizan como terapias contra el cáncer y tienen efectos secundarios graves.
En nuestros estudios previos de anticuerpos neutralizantes, se descubrió que el suero humano tenía un efecto mejorado sobre la transducción de AAV. En este estudio, hemos identificado varias proteínas del suero humano que interactúan directamente con los viriones de AAV y tienen el potencial de afectar la transducción de AAV. Entre estas proteínas, la más interesante es la albúmina sérica humana (HSA), un agente terapéutico que es la proteína más abundante en la sangre y que ha sido ampliamente utilizada en la práctica clínica. Si la interacción de HSA con viriones de AAV mejora la transducción de AAV, este enfoque se puede aplicar inmediatamente en ensayos clínicos de AAV. En la presente, demostramos que la interacción de HSA con el vector AAV mejora la transducción de AAV, y que esta mejora no se limita a células específicasin vitroo tejidosin vivo.Se logró una mejora comparable independientemente de la incubación de HSA con vectores AAV antes de la congelación del vector o después de la descongelación. La adición de HSA en las preparaciones de vectores antes de la diálisis no afectó el efecto de mejora de HSA en la transducción de AAV. Los estudios de mecanismos sugieren que la HSA aumentó la unión de AAV a la superficie de la célula dianain vitroy dio como resultado la rápida eliminación en la sangre después de la administración sistémica. El análisis de anticuerpos neutralizantes (Nab) demostró que la interacción de la albúmina con AAV aún mejoraba la transducción de AAV en presencia de Nab y no afectaba la actividad de Nab. Aplicamos este enfoque para tratar la hemofilia en ratones deficientes en FIX. Después de la administración sistémica de AAV/FIX incubado con albúmina humana, se logró una mayor expresión de FIX transgénico y una mejor corrección fenotípica.
El suero humano mejora la transducción de AAV.Nuestros resultados anteriores demostraron una mayor transducción de AAV únicamente por la presencia de suero humano. Ampliamos este hallazgo para examinar la mejora de la transducción de AAV utilizando 10 muestras de suero humano y encontramos que la interacción del suero humano con AAV indujo un aumento de aproximadamente 4 veces en la actividad transgénica de una manera independiente de la cápside de AAVin vitro(Figura 1a).Dado que el AAV8 se ha utilizado en varios ensayos clínicos en pacientes con hemofilia, se eligió la cápside del AAV8 para los siguientes experimentos. Aunque se observó una mayor actividad transgénica en duraciones más cortas, el mayor efecto se logró después de la incubación del suero con viriones de AAV durante >2 h(Figura 1b). Para determinar si el efecto de mejora del suero humano sobre la transducción de AAV en células Huh7 se mantuvoin vivo,los vectores AAV8/luc se incubaron con suero diluido en serie y luego se administraron mediante inyecciones retroorbitales o musculares (el músculo contralateral recibió el vector sin suero). Como se muestra en lasFigurass 1cy1d, incluso una dilución de suero > 3000 veces aún mejoró la transducción de AAV en el hígado y los músculos en 2-5 veces o 4-16 veces, respectivamente. La mejora de la transducción de AAV también se demostró después de la incubación de vectores de AAV con suero de otras especies, incluidos ratones, perros, primates y bovinos fetales(Figuras 9y10).
La albúmina sérica humana ejerce un efecto de mejora sobre la transducción de AAV.Los datos de los experimentos anteriores sugieren fuertemente que algunos componentes del suero mejoran la transducción de AAVin vitroein vivo.Para examinar si la mejora en la transducción requiere la interacción directa del virión de AAV con una (s) proteína(s) sérica (s), diseñamos 5 cohortes: 1. Células Huh7 en medio completo y AAV incubadas con PBS, 2. Células Huh7 en medio completo y AAV incubadas con suero humano, 3. Células Huh7 en medio libre de suero y AAV incubadas con PBS, 4. Células Huh7 en medio libre de suero y AAV incubadas con PBS, y luego se adicionó la misma cantidad de suero al medio de cultivo justo antes de la aplicación del virus en las células, 5. Células Huh7 en medio libre de suero y AAV incubadas con suero humano. De manera similar a la metodología descrita anteriormente, se logró una transducción mejorada en la cohorte 2 en comparación con la cohorte 1. Curiosamente, no se observó un aumento de la transducción de AAV en la cohorte 4 con una alta dilución de suero en comparación con el grupo 3, mientras que se obtuvo un aumento de la transducción en la cohorte 5(Figura 2a).Estos resultados sugieren que la mejora mediada por suero humano de la transducción de AAV requiere la interacción directa de la (s) proteína(s) sérica (s) humana (s) con viriones de AAV. Es interesante observar que el aumento de veces fue aparentemente mucho mayor en el grupo "libre de suero" que en el grupo "medio completo" a diluciones de 4 a 16 veces de suero humano. Esto se debe a que el medio completo contiene suero bovino fetal (FBS) que mejora la transducción de AAV. Cuando los vectores de AAV incubados con PBS se adicionan a las células mantenidas en medio completo, los vectores de AAV interactuarán con las proteínas FBS que inducen una transducción más alta que la que los vectores de AAV se aplican a las células en el medio libre de suero (datos no mostrados). Para identificar qué proteínas séricas aumentan la transducción de AAV, se incubó suero humano con vectores de AAV8 y luego se utilizó un anticuerpo que reconoce viriones de AAV8 intactos para reducir las proteínas de unión de AAV8 para el análisis de espectrometría de masas. Entre las proteínas identificadas, la más interesante es la albúmina sérica humana(Tabla 5).La albúmina sérica es la proteína más abundante en la circulación y se ha utilizado ampliamente en muchos entornos clínicos y, por lo tanto, el objetivo principal de este estudio es investigar el efecto de la HSA en la transducción de AAV.
Para confirmar aún más los datos de espectrometría de masas de la unión de HSA a AAV8, incubamos las partículas de AAV8 con HSA y luego utilizamos el anticuerpo de albúmina humana para reducir las partículas de AAV unidas a la albúmina. Luego se cuantificó el número de copias del genoma de AAV mediante Q-PCR. Como se muestra en laFigura 2b,la inmunoprecipitación con el anticuerpo específico de albúmina (A80-129A, Bethyl Lab, INC) dio como resultado el doble de genomas derribados en comparación con los controles (isotipo IgG o PBS). Para examinar si la interacción de la albúmina humana con el virión de AAV afectó la transducción de AAV, incubamos las partículas de AAV8 con suero reducción en HSA (> 99% de reducción,Figura 11)o HSA recombinante. Se demostró que la transducción a partir de suero reducido en albúmina humana fue menor que el vector tratado con suero completo(Figura 2c).Los vectores de AAV incubados con HSA recombinante (rHSA) también dieron como resultado una mayor transducción, pero en menor medida en comparación con el suero completo humano(Figura 2d).Para explorar si la HSA mejora la transducción de AAVin vivo,los vectores AAV8/luc se incubaron con diferentes concentraciones de rHSA y luego se administraron a ratones mediante inyección retroorbital o muscular. Después de la administración sistémica, los vectores pretratados con HSA demostraron una mayor transducción hepática (1,5 a 8 veces(Figura 12a)).De acuerdo con la estimulación de la transducción de AAV por suero humano en el músculo, se observó una mayor transducción en el músculo (2,1 a 11,5 veces) después de la incubación de los vectores AAV8 con rHSA(Figura 12b).Estos resultados implican que la albúmina sérica humana aumenta la transducción de AAVin vitroein vivo.
Efecto de mejora de la HSA de grado clínico en la transducción de AAV.Dado que la HSA se ha aplicado ampliamente en la clínica, luego probamos si la HSA de grado clínico también tiene la capacidad de mejorar la transducción de AAV. Cuando se incubó HSA de grado clínico al 5%, que es idéntica a la concentración de albúmina sérica en la sangre de sujetos normales, con vectores de AAV a diferentes diluciones, se observó una mayor transducción de AAVin vitroincluso a una dilución de 20.000 veces(Figura 3a).A continuación, se incubó AAV8/luc con HSA al 25% a diferentes diluciones antes de la inyección retroorbital o muscular. Una dilución de una vez se define como 1 *1012 partículas de AAV incubadas con 10 ul de HSA al 25% en 1 ml de solución. Como se muestra en lasFigurass 3by3c,la HSA de grado clínico aumentó significativamente la transducción de AAV8 en aproximadamente 3 o 5 veces en el hígado y el músculo, respectivamente. A continuación, se documentó el efecto a largo plazo de la HSA en la transducción de a Av en las semanas 1, 2, 4 y 7 después de la inyección muscular(Figura 13).Estos resultados indican que la HSA de grado clínico mejora la transducción de AAV en el músculo para la expresión sostenida del transgén. Además, observamos que la incubación de HSA con AAV2 o AAV9 indujo una transducción mucho mayorin vitroein vivo(Figura 14).
La mejora de la transducción de AAV por HSA no se ve alterada por la congelaciónldescongelación.En los experimentos anteriores, las preparaciones de AAV se descongelaron e incubaron con HSA antes de administrarse a células o ratones. En el entorno clínico, puede no ser práctico para el personal médico realizar esta incubación inmediatamente antes de la inyección. Por lo tanto, la incubación de HSA con vectores de AAV antes del almacenamiento a -80 °C simplificaría la traducción de la transducción de vectores de AAV mejorada con HSA. Para investigar esto, primero incubamos vectores de AAV con HSA de grado clínico durante 2 horas a 4 °C. La mitad de la solución se almacenó a -80 °C durante tres días, mientras que la otra alícuota de virus AAV se utilizó inmediatamente para infectar células Huh7 a una dosis de 1*103 partículas/célula. Después de descongelar la preparación de HSA-a Av congelada, se analizó la transducción del vector en Huh7 de la misma manera. Como se muestra enla Figura 4a,se observó un aumento similar en la actividad de luciferasa independientemente de la criopreservación del vector HSA. La mejora de la HSA de la transducción de AAV después de la incubación y la crioconservación también se observó después de la inyección muscular(Figuras 4by4c).
Transducción de AAV después de la adición de HSA a las preparaciones de AAV antes de la diálisis.Durante la producción del vector, es necesario realizar diálisis vectorial para extraer altas concentraciones de sal independientemente de los métodos utilizados para la purificación (CsCl o cromatografía en columna). Para determinar si la incubación de vectores de AAV en HSA durante la diálisis afecta la transducción de AAV, los vectores AAV8/luc purificados por ultracentrifugación en gradiente de CsCI o por columna de intercambio aniónico se mezclaron con 10 ul de HSA o PBS al 25% en 1 ml de 1012 partículas justo antes de la diálisis. Luego, estas formulaciones se dializaron contra PBS y se analizó la transducción de AAV en ratones mediante inyección retroorbital o muscular directa. Como se muestra enla Figura 5,la incubación con HSA durante la diálisis aún aumentó la transducción del vector en el hígado y el músculo en más de 2 veces o 4 veces, respectivamente, en comparación con el control de incubación con PBS. El efecto de mejora fue similar para diferentes enfoques de purificación. Esta observación implica que la albúmina humana podría adicionarse a las preparaciones de AAV antes de la diálisis de vectores purificados de diferentes maneras para mejorar la administración de genes.
La albúmina aumenta la capacidad de unión de AA Va las células diana.El primer paso para la transducción eficaz de AAV es la unión del virión de AAV a las células diana a través de receptores primarios y secundarios. Para examinar si la incubación de albúmina con vectores de AAV aumenta la unión celular, los vectores AAV8/luc se incubaron con HSA o PBS. Luego, se adicionaron células Huh7 a 4 ° C para evitar la internalización del vector, como se muestra en nuestro estudio anterior. Después de lavados extensos, se recuperó el ADN total y se determinó el número de copias del genoma de AAV mediante Q-PCR. Como se muestra enla Figura 6a,la incubación con HSA aumentó significativamente la unión del vector AAV a las células Huh7 en 3 veces. Para determinar si la HSA aumenta la unión al vector y la absorción por el hígado, se administraron 1*1011 partículas de AAV8/luc, preincubadas en HSA o PBS, mediante inyección retroorbital y se determinó la actividad de luciferasa 24 horas después. De acuerdo con el resultado observado en las células Huh7, se logró una mayor transducción en el hígado(Figs. 6by6c).Cuarenta y ocho horas después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se recolectó el hígado para cuantificar la actividad de luciferasa y el número de copias del genoma de AAV. De manera similar al análisis de imagenología en vivo, se encontró una mayor actividad de luciferasa y un mayor número de copias del genoma de AAV en los hígados de ratones a los que se administraron vectores de AAV pretratados con HSA en comparación con los vectores de AAV administrados incubados en PBS solo(Figuras 6dy6e).El resultado de una mayor absorción del vector AAV por el hígado con la preincubación de HSA se correlacionó con la eliminación del vector de la sangre. Después de la administración del vector de AAV, hubo una disminución marginal en el número de copias del genoma de AAV por microlitro de plasma en ratones que recibieron vector de AAV tratado con HSA, en comparación con los ratones de control a los 15 minutos y 24 horas después de la inyección (p>0,05). Sin embargo, se observó una reducción significativa del número de copias del genoma de AAV en la cohorte de HSA a las 2 horas después de la administración de AAV (p<0,05). Estos resultados sugieren que la transducción mejorada del vector AAV por HSA resulta de una mayor unión de partículas a las células diana.
La interacción de la albúmina con el AAV no interfiere con la actividad neutralizante del anticuerpo.Para investigar si la interacción de la albúmina humana con los viriones de AAV bloquea la actividad del anticuerpo neutralizante (Nab) de AAV, se realizó el ensayo de Nabin vitro.IVIG es el suero combinado de más de 1000 sujetos y contiene AAV Nab contra diferentes serotipos. Primero incubamos los viriones AAV8/Luc con una dilución de 100 veces de HSA o PBS, y luego se adiciona IVIG a diferentes concentraciones. Después de la transducción en células Huh7, se calculó el título de Nab. Como se muestra en laFigura 7a,se obtuvo el mismo título de Nab (1:200 de IVIG) independientemente del vector AAV preincubado con HSA. También estudiamos si la HSA todavía es capaz de mejorar la transducción de AAV en presencia de Nab de AAV, y encontramos que la incubación de HSA con AAV aumentó la transducción de AAV con una eficiencia similar en presencia de diferentes cantidades de IVIG(Figura 7b).Estos resultados sugieren que la interacción de HSA con AAV no afecta el mecanismo de infección del virus AAV.
Mejora de la corrección fenotípica de la hemofilia B utilizando albúmina humana para mejorar la transducción del vector AAV.Para estudiar la corrección fenotípica utilizando vectores AAV incubados con HSA, utilizamos ratones con hemofilia B como modelo de enfermedad y AAV8/FIX-OPT, que se ha utilizado en ensayos clínicos de fase I en pacientes con hemofilia B. Después de la inyección, se determinaron la concentración y la función de FIX en diferentes puntos temporales y se evaluó la corrección fenotípica en la semana 6. Como se muestra enla Figura 8a,se detectaron niveles de FIX más de 5 veces más altos en ratones que recibieron AAV8/FIX-OPT incubado que aquellos con los mismos vectores tratados con PBS. De manera similar, la actividad de FIX en plasma fue mucho mayor en los ratones que recibieron el vector tratado con HSA(Figura 8b).A las 6 semanas después de la inyección de AAV, todos los ratones se sometieron a una exposición hemorrágica de transección de la vena de la cola para evaluar la funciónin vivodel factor IX humano expresado en vector. Los ratones con hemofilia B no tratados tuvieron hemorragia profunda (30 mg de sangre/g de peso corporal de los ratones) después de la exposición en comparación con los controles WT. Los ratones con hemofilia B que recibieron vectores de AAV incubados en HSA demostraron una disminución significativa en la pérdida de sangre en comparación con los vectores de AAV incubados en PBS(p<0,05,Figura 8c).De hecho, los ratones hemofílicos tratados con vectores incubados en HSA demostraron una pérdida de sangre similar a la de los controles WT. Estos resultados demuestran una mejor corrección de la hemofilia B utilizando vectores AAV preincubados con HSA, y también sugieren la posible utilización de esta formulación para aumentar la eficacia a dosis de vector más bajas para el tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades.
Las observaciones de menor expresión de FIX y respuestas de CTL específicas de la cápside a la cápside de AAV a dosis altas en ensayos de FIX de AAV humano han enfatizado la necesidad de estrategias más eficientes que mantengan una administración génica eficiente a dosis más bajas. Nuestro informe anterior señaló que la transducción de AAV fue potenciada por el suero humano; sin embargo, no se identificaron los componentes precisos. Por lo tanto, para la búsqueda de vectores de AAV más eficientes, el objetivo de este estudio fue identificar proteínas específicas del suero humano que interactúan con los viriones de AAV para inducir una mayor transducción. De las proteínas que interactúan con la cápside de AAV8 identificadas a partir del análisis de espectroscopia de masas(Tabla 5),se realizó una experimentación adicional con HSA. Estas investigaciones demostraron que la incubación de AAV8 con HSA recombinante o de grado clínico aumentó la transducción de AAV, mientras que suero humano reducido en albúmina disminuyó la transducción. La HSA de grado clínico mejoró significativamente la transducción de AAV en el hígado y los músculos esqueléticos de ratones. Para facilitar la aplicación de HSA en la producción de vectores de AAV y en ensayos clínicos, nuestros estudios demostraron que la congelación de vectores de AAV después de la incubación con albúmina humana o la adición de HSA en preparaciones de AAV antes de la diálisis aún daba como resultado una transducción mejorada. Los estudios de mecanismos sugirieron que la albúmina humana aumentó la unión del vector AAV a la superficie de la célula diana y dio como resultado una eliminación de sangre más rápida después de la administración sistémica, pero no afectó la vía de infección por AAV. Finalmente, en un modelo preclínico de ratón de hemofilia B, los vectores AAV incubados con albúmina aumentaron la expresión de FIX humano y mejoraron el fenotipo hemorrágico a niveles WT.
Las proteínas séricas son capaces de interactuar con los virus y afectar la infección por virus. Por ejemplo, el adenovirus ha sido ampliamente estudiado por su interacción con las proteínas séricas, incluidos los factores de coagulación y los complementos para el direccionamiento hepático. Nuestro estudio previo de Nab demostró que el suero en la dilución sin actividad de Nab en realidad mejoró la transducción de AAV independientemente del serotipo. Otros estudios han encontrado que varias proteínas séricas tienen un efecto sobre la transducción de AAV a través de la interacción con viriones de AAV. Denard et al. han identificado la proteína de unión a galectina 3 (G3BP) y la proteína C reactiva (CRP) que interactúan con AAV. Mostraron que la interacción de G3BP con viriones de AAV condujo a la formación de agregados de AAV que bloquean la transducción de AAV, y que la interacción de CRP con AAV resultó en una mayor transducción. La mejora de la PCR de la transducción de<a>A<v>es específica de la especie y específica del serotipo de AAV. En otro estudio, Sais et al. demostraron que la cápside de AAV2 se une a las proteínas del complemento C3 para mejorar la absorción de AAV por los macrófagos e inducir la activación de los macrófagos. En este estudio, la incubación de AAV y HSA de grado clínico mejora la transducciónin vitro e in vivo.En general, la mejora de la albúmina humana en la transducción de AAV es menor que en el suero completo. Este hallazgo implica que otras proteínas en el suero también pueden desempeñar un papel para mejorar la transducción de AAV. Valdrá la pena estudiar cómo la interacción de estas proteínas afecta la transducción de AAV.
Se observa que la mejora de la transducción de AAV con el virus tratado con albúmina humana en el músculo es generalmente mayor que en el hígado. Una explicación de este fenómeno podría ser que la sangre contiene una concentración muy alta de albúmina, lo que mejora la transducción en cierta medida después de las inyecciones sistémicas. Por el contrario, menos albúmina reside en el tejido muscular, por lo que después de la inyección muscular, la magnitud del aumento de la transducción por albúmina es mayor que la observada después de las inyecciones IV. Después de la administración sistémica del vector de AAV, los viriones de AAV interactuarán inmediatamente con la albúmina. Sin embargo, nuestros estudios demostraron que la incubación más prolongada de HSA con viriones de AAV indujo una mayor potenciación de la transducción. Este resultado indica que se debe lograr una mayor mejora de la transducción mediante la preincubación de HSA con viriones de AAV después de la administración sistémica. En este estudio, la mejora de la transducción de los viriones de AAV incubados con albúmina sérica humana se logró en el hígado y los músculos después de la administración sistémica y la inyección directa, respectivamente. Dado que el hígado absorbe más viriones de AAV de la circulación después de la administración sistémica, es posible que se escape menos vector de AAV de la sangre para transducir otros tejidos como el corazón y el músculo esquelético. Por otro lado, el vector AAV tratado con albúmina aumenta la transducción muscular. Se desconoce si la transducción mejorada en el corazón o el músculo esquelético se puede lograr después de la administración sistémica de vectores de AAV incubados con albúmina. Para aumentar la transducción de AAV en el corazón y el músculo esquelético después de la administración sistémica, se han desarrollado varios mutantes de AAV desdirigidos al hígado (AAV2i8 y AAV9.45), se está probando si se logrará la mejora de la transducción en el músculo después de la administración sistémica de estos vectores de AAV desdirigidos al hígado incubados con albúmina.
La albúmina está emergiendo como un portador de proteínas versátil para el direccionamiento de fármacos y para la mejora del perfil farmacocinético de fármacos basados en péptidos o proteínas. Se han descrito varios receptores de albúmina que inducen endocitosis. La vía para la endocitosis de la albúmina depende del tipo de célula e incluye endocitosis mediada por clatrina o caveolina. Aunque se desconoce cómo interactúa el vector de AAV con la albúmina, este estudio demostró que la interacción de AAV con albúmina aumenta la capacidad de unión de AAV de las células diana. Esto puede explicarse por el hecho de que la albúmina, después de la interacción con AAV, proporciona otra capa para la unión de AAV en la superficie celular a través de los receptores de albúmina.
La albúmina tiene una vida media prolongada en la sangre. Ahora se ha hecho evidente que la regulación homeostática de la albúmina está controlada por el receptor Fc neonatal (FcRn). FcRn rescata la albúmina de la degradación en las células mediante la unión de la albúmina dentro de los compartimentos endosómicos intracelulares, lo que luego resulta en el transporte del complejo ternario a la membrana celular para la liberación de ligandos de vuelta a la circulación. Debido a estas propiedades de la albúmina, hay algunas preguntas sobre el efecto de la interacción de la albúmina con el vector AAV en la transducción. Dado que la absorción de albúmina es a través de endocitosis mediada por clatrina o caveolina, y la entrada celular de AAV es por endocitosis mediada por clatrina, se desconoce si la albúmina y el AAV compiten en la vía de endocitosis. Otra pregunta es si la albúmina se disocia del AAV en el endosoma o entra en el núcleo. La tercera pregunta es si la exocitosis o transcitosis de albúmina afecta la transducción de AAV. El cuarto es el efecto de la transducción mejorada de la interacción con albúmina y AAV sobre la respuesta de CTL específica de la cápside de AAV. Aunque la interacción de la albúmina con los viriones de AAV aumenta la unión de AAV a la superficie de la célula diana, es posible que la interacción pueda influir en el tráfico intracelular de AAV. Una mayor elucidación de estos problemas ayudará a diseñar enfoques más efectivos para el uso de albúmina en la terapia génica de AAV.
Nuestro estudio demostró que las cápsides de AAV interactúan conjuntamente con la albúmina sérica humana, lo que aumenta la transducciónin vitroein vivo.La mejora de la eficiencia de transducción de la albúmina humana de grado clínico también permitió la corrección fenotípica en un modelo de ratón con hemofilia B después de la administración sistémica de un vector de AAV de dosis por lo demás subóptima. Para fines clínicos, la adición de albúmina humana en las preparaciones de virus AAV antes de la diálisis o la congelación del virus AAV después de la incubación con albúmina todavía da como resultado una mejora de la transducción. Aunque se desconoce el mecanismo exacto de la interacción del virión de AAV con la albúmina humana, nuestros hallazgos son importantes para la inclusión inmediata de HSA en diversas aplicaciones clínicas que sufren de una transducción deficiente a dosis de vector toleradas. Por lo tanto, nuestros resultados de estos estudios indican claramente que la incubación de albúmina humana de grado clínico con vectores de AAV durante la diálisis debe realizarse para mejorar la eficiencia de la transducción de AAV en futuros ensayos clínicos.
Líneas celulares.Las células HEK293 y Huh7 (de ATCC) se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5% en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina.
Producción de virus AAV.El vector AAV se produjo usando un enfoque estándar con transfección de tres plásmidos en células HEK293. En resumen, el plásmido transgénico de AAV pTR/CBA-luc o pTTR/FIX-opt se cotransfectó con el plásmido auxiliar de AAV y el plásmido auxiliar de adenovirus pXX6-80 en células HEK293. Sesenta horas después, las células se cosecharon y se lisaron, y el lisado celular se aplicó para la ultracentrifugación contra el gradiente de CsCl o la purificación con columna. Los viriones de AAV se recolectaron y se titularon mediante dot-blot.
El suero humano individual se adquirió de Valley Biomedical (Minchester, VA), se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C para su uso futuro.
Ensayo de transducción de AAV in vitro.Se sembraron 1*105 células Huh7 en una placa de 48 pocillos en 300 uL de DMEM que contiene FBS al 10% o medio sin suero. AAV/luc se incubó con suero o rHSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o HSA de grado clínico (Albuminar, CSL Behring LLC, Kankakee, IL). Luego se adicionó la mezcla a las celdas indicadas. Cuarenta y ocho horas después, las células se lisaron con amortiguador de lisis pasiva (Promega) y se midió la actividad luciferasa con un lector de placas automatizado Wallac1420 Victor 2. El aumento en veces de la expresión transgénica se calculó como la expresión transgénica de los grupos tratados con suero o albúmina en comparación con la de PBS.
Experimentos con animales.Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones específicas libres de patógenos de acuerdo con las pautas establecidas por los comités de animales de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte. Los experimentos con animales se realizaron en ratones con hemofilia B (FIX-/-) o ratones C57BL/6 normales (adquiridos en Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Para la administración sistémica, se incubaron 1*1010 partículas del vector AAV/luc con suero o albúmina humana durante 2 h a 4 °C, seguido de la administración retroorbital en ratones C57BL hembra adultos. En los puntos de tiempo indicados, la imagenología se realizó utilizando un sistema de imágenes Xenogen IVIS Lumina (Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA) después de la inyección intraperitoneal de sustrato de D-luciferina a 120 mg/kg (Nanolight, Pinetop, AZ). Las imágenes bioluminiscentes se analizaron utilizando el software Living Image. Para la inyección muscular, se incubaron 1*109 partículas de vector AAV/luc con suero o albúmina humana durante 2 h a 4 °C. Luego, la mezcla se inyectó directamente en los músculos de las patas traseras de ratones C57BL de 6-8 semanas de edad. En los puntos de tiempo indicados, se realizó imagenología y se analizaron imágenes bioluminiscentes.
Para los estudios de hemofilia B, se inyectaron ratones machos adultos con hemofilia B con 2*109 partículas de vectores AAV8/FIX a través de la vena de la cola. En los puntos de tiempo indicados, se recolectó sangre del plexo venoso retroorbital bajo anestesia con isoflurano. En la semana 6 después de la inyección de AAV8/FIX, se realizó un análisis de sangradoin vivo.
Reducción de albúmina humana.Se utilizó un kit de reducción de albúmina Pierce™ (Cat # 85160, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) siguiendo las instrucciones de la compañía con una ligera modificación. En resumen, después de transferir la resina a la columna y centrifugar a 12.000 rpm durante 1 min, la columna se lavó y se cargó con 50 uL de suero negativo para Nab de AAV previamente probado. Después de la centrifugación, el flujo se aplicó a la nueva columna tratada con resina y se repitieron los pasos anteriores. Para lograr el máximo reducción de la albúmina, se aplicó el flujo continuo dos veces más y se utilizaron un total de 4 columnas para una muestra. Se adicionó 50 uL de amortiguador de unión/lavado a la columna para liberar las proteínas no unidas y se centrifugaron. El flujo final se aplicó para la detección de albúmina utilizando el kit ELISA.
Coinmunoprecipitación.La coinmunoprecipitación de proteínas séricas se realizó con el kit de coinmunoprecipitación Pierce (Co-IP) (Cat# 26149, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). En primer lugar, se realizó la inmovilización del anticuerpo. Después de la adición de la suspensión de resina en una columna de centrifugación y centrifugación, la columna se lavó y se insertó con el tapón inferior. Luego, los anticuerpos diluidos y la solución de cianoborohidruro de sodio se adicionaron directamente a la resina en la columna de centrifugación secuencialmente y se incubaron durante 2 horas a TA. Después de la centrifugación y el lavado, se adicionó amortiguador de extinción a la columna y se centrifugó. Se aplicó amortiguador de extinción a la resina, seguido de la adición de solución de cianoborohidruro de sodio durante 15 minutos. Después de la centrifugación y el lavado, la mezcla de virus AAV con suero humano o PBS se transfirió a la resina y se incubó durante 2 horas a 4 °C. Después de la centrifugación y el lavado, se adicionó amortiguador de elución y se incubó durante 5 minutos y se centrifugó; el flujo a través de la solución se recolectó para el análisis de espectrometría de masas o la cuantificación del número de genoma de AAV mediante Q-PCR.
Espectrometría de masas.Las proteínas se redujeron, alquilaron y digirieron con tripsina utilizando el protocolo FASP. Los péptidos se resuspendieron en acetonitrilo al 2%/ácido fórmico al 98% (0,1%) antes del análisis por LC-MS/MS. En resumen, los péptidos se cargaron en una o.d. de 2 cm de largo X 360 |jm * 100 |jm de diámetro interno de precolumna de sílice fundida microcapilar rellena con resina Magic 5 jm C18AQ (Michrom Biosciences, Inc.). Después de la carga de la muestra, la precolumna se lavó con Solvente A al 95% (ácido fórmico al 0,1% en agua)/Solvente B al 5% (ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo) durante 20 min a una velocidad de flujo de 2 uL/min. La precolumna se conectó luego a una o.d. de 360 jm . * columna analítica de 75 jm de diámetro interno rellena con 22 cm de resina C18 de 5 jm . Los péptidos se eluyeron a una velocidad de flujo de 250 nL/min aumentando el porcentaje de solvente B al 40% con un sistema de suministro de solvente Nano-Acquity HPLC (Waters Corp.). El sistema LC se conectó directamente a través de una fuente de ionización por electropulverización conectada a un espectrómetro de masas de trampa de iones LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). El espectrómetro de masas fue controlado por el software Xcalibur y operado en el modo dependiente de datos, en el que el escaneo MS inicial registró las relaciones de masa a carga (m/z) de iones en el intervalo de 400-2000. Los 10 iones más abundantes se seleccionaron automáticamente para la posterior disociación activada por colisión. Todos los archivos se buscaron utilizando MASCOT (Matrix Science, Ver.2.3.02) a través de Proteome Discoverer (Thermo., Ver. 1.3.0.339) contra la base de datos que contiene proteínas humanas descargadas de Uniprot. Los parámetros de búsqueda incluyeron una tolerancia de masa del péptido de 10 ppm y una tolerancia iónica del fragmento de 0,6 unidades de masa. La búsqueda permitió modificaciones variables de la oxidación de Met y carbamidometilo de Cys. Cada muestra se procesó 2 veces (R1 y R2). La diferencia de dos veces entre la muestra de AAV y PBS se consideró positiva.
Cuantificación de la expresión de luciferasa en los tejidos.Los animales utilizados para los estudios de imagenología se sacrificaron dos semanas después de la inyección de AAV y se recolectaron los siguientes órganos: hígado, bazo, riñón, corazón, pulmón, músculo esquelético (gastrocnemio) y cerebro. El tejido se picó y se homogeneizó en amortiguador de lisis pasiva (Promega, Madison, WI). Los lisados de tejido se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 minutos para extraer/remover los residuos celulares. El sobrenadante se transfirió a placas de 96 pocillos para el análisis de la actividad de la luciferasa como se describió anteriormente. La concentración de proteína total en los lisados tisulares se midió utilizando el ensayo Bradford (BioRad, Hercules, CA).
Análisis del número de copias del genoma de AAV.Para determinar las tasas de depuración sanguínea de varios vectores de rAAV, se obtuvo plasma de ratones a las 2, 6, 24 y 48 horas después de la administración intravenosa de vectores de rAAV. El aislamiento del ADN viral del plasma se realizó utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los genomas virales se cuantificaron mediante PCR en tiempo real con cebador directo: 5'-AAAAGCACTCTGATTGACAAATAC-3' (SEQ ID NO: 127) y cebador inverso: 5'-CCTTCGCTTCAAAAAATGGAAC-3' (SEQ ID NO: 128). La PCR en tiempo real se realizó en un instrumento LightCycler 480 (Roche Diagnostics Cooperation, Indianápolis, IN). Se realizó un volumen final de 10 uL de reacción de cuantificación absoluta utilizando la mezcla SYBR Green (Roche Diagnostics Cooperation, Indianápolis, IN) complementada con cebadores 0,2 uM. No se incluyó ningún control de plantilla en cada ejecución para descartar la posibilidad de contaminación para cada conjunto de cebador-sonda. La reacción se amplificó a 95 °C durante 10 min seguido de 45 ciclos de 10 s a 95 °C, 10 s a 60 °C y 10 s a 72 °C, seguido de un ciclo de fusión. Se accedió a cada gen por duplicado. La cuantificación absoluta se realizó con base en comparaciones máximas de segunda derivada con curvas estándar de ADN plasmídico (luciferasa).
Para detectar el número de copias del genoma de AAV en diferentes tejidos, los animales se sacrificaron y los órganos seleccionados se recolectaron en la semana 2 después de la inyección iv de rAAV. Después del aislamiento del ADN utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, CA), se realizó una PCR en tiempo real en cada muestra tanto para el gen de la luciferasa como para el gen de la lámina B2 deMus musculusde ratón. Los cebadores utilizados para el gen de la lámina B2 deMus musculusde ratón fueron: 5'-GGACCCAAGGACTACCTCAAGGG-3' (SEQ ID NO: 129) (directo) y 5'-AGGGCACCTCCATCTCGGAAAC -3' (SEQ ID NO: 130) (reverso). La copia del genoma se analizó mediante el software Lightcycler v.4.5 (Roche Diagnostics Cooperation, Indianápolis, IN) basado en los del plásmido pTR-CBA-Luciferasa utilizado en la transducción inicial y el gen endógeno.
Ensayo de unión a AAV.Se incubaron 5*1010 partículas del vector AAV/luc con albúmina sérica humana de grado clínico a 4 °C durante diferentes duraciones. Luego se adicionaron 5*105 células Huh preenfriadas al vector AAV durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron cuatro veces con PBS frío y se transfirieron a un nuevo tubo. El ADN de las células se extrajo y se aplicó para Q-PCR para determinar el número de copias del genoma de AAV por célula utilizando cebadores específicos de luc.
Análisis de anticuerpos neutralizantes.El ensayo Nab se llevó a cabo como se describe en nuestro estudio anterior con ligeras modificaciones. En resumen, se incubaron 1*108 partículas del vector AAV8/Luc con una dilución de 100 veces de HSA al 25% a 4 °C durante 2 horas, luego se adicionó IVIG a diferente dilución durante otras 2 horas. La mezcla se aplicó para infectar células Huh7. 48 horas después, se analizó la actividad luciferasa del lisado celular y se calculó el título de anticuerpos neutralizantes.
Ensayos de antígeno y actividad del factor IXhumano.El ensayo de actividad del factor IX humano de una etapa del antígeno del factor IX humano se realizó como se describió anteriormente. La actividad específica del factor IX, expresada como unidades de actividad del factor IX por miligramo de proteína (U/mg), se calculó dividiendo la actividad del factor IX (U/ml) por la concentración de la proteína del factor IX (antígeno del factor IX) (mg/ml).
Modelo de sangrado in vivo.El sangradoin vivose analizó como se describió previamente por Meeks, et al con una ligera modificación. Después de la anestesia, se seccionaron 3 mm de la cola distal y se colocó la cola proximal en el tubo precalentado y prepesado. Cuarenta minutos después del clip de cola o antes de la muerte debido al sangrado, se calculó la pérdida de sangre por gramo de peso corporal.
Análisis estadístico.Los datos cuantitativos se presentaron como medias ± DE. Se utilizó la prueba t de Student para realizar todos los análisis estadísticos. Los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron una diferencia estadísticamente significativa.
Ejemplo 2(Ejemplo de referencia)
La expresión transgénica terapéutica se ha logrado con éxito en pacientes con hemofilia después de la administración sistémica del vector del virus adenoasociado (AAV). Numerosos estudios preclínicos han demostrado que la expresión transgénica a largo plazo es inducida por el transgén de suministro mediado por AAV. Específicamente para el tratamiento de la hemofilia con el vector AAV, aunque se han generado datos alentadores en modelos animales hemofílicos con inyección intramuscular del vector AAV y se encontró expresión transgénica a largo plazo en músculos en pacientes con hemofilia B después de IM, no se detectó la FIJACIÓN transgénica terapéutica en la sangre. El hígado es el órgano natural para sintetizar los factores hemofílicos (FIX y FVIII). En los ensayos clínicos, tanto el AAV2 como el AAV8 se han utilizado para administrar FIX para dirigirse al hígado en pacientes con hemofilia B. Después de la administración de vectores de AAV en la sangre, el virus primero se encontrará con las proteínas séricas. La interacción del virus con las proteínas séricas puede afectar la transducción de AAV en el hígado. Nuestro estudio previo ha identificado varias proteínas mediante análisis de espectrometría de masas y ha demostrado que la albúmina sérica humana mejora la transducción de AAV mediante la interacción directa con viriones de AAV. Sin embargo, hay varias preguntas que deben abordarse. ¿Todas las demás proteínas séricas de unión a AAV también afectan la transducción de AAV? ¿La combinación de las proteínas séricas mejora aún más la transducción de AAV? Entre las proteínas de unión a AAV8 identificadas por espectrometría de masas, aparte de la albúmina, la transferrina y la apolipoproteína B (ApoB) son las más interesantes, ya que tienen receptores en el hígado. Las transferrinas son glucoproteínas del plasma sanguíneo fijadoras de hierro que controlan el nivel de hierro libre en la sangre y otros fluidos tisulares. La proteína transferrina cargada con hierro se une a un receptor de transferrina y se transporta a la célula por endocitosis mediada por el receptor. La ApoB es la apolipoproteína primaria de los quilomicrones, VLDL, IDL y partículas de LDL, y la ApoB es esencial para la formación de partículas de LDL. La ApoB en la partícula de LDL actúa como un ligando para que los receptores de LDL liberen grasas en las células. En el siguiente estudio, estudiamos el efecto de las LDL y la transferencia sobre la transducción de AAV en el hígado, y el efecto de la combinación de proteínas séricas sobre la transducción hepática de AAV. Nuestros resultados han demostrado que la acción inerte de LDL o transferrina con viriones AAV8 mejoró la transducción hepática de AAV. Sin embargo, no hubo efecto de la combinación de tres proteínas (HSA, LDL, transferrina) sobre la mejora adicional de la transducción de AAV.
La incubación de AAV8 con LDL o transferrina aumenta la transducción en células Huh.Dado que la transferrina y la apoB pueden unirse específicamente al receptor de transferrina y al receptor de LDL en los hepatocitos, supusimos que la interacción de la transferrina o la apoB con los viriones de AAV era capaz de mejorar la transducción. Los vectores AAV8/luc que codifican para el gen de la luciferasa de luciérnaga se incubaron con diferentes diluciones de concentración sanguínea normal de<l>D<l>o transferrina durante 1 hora a 4 °C, luego se transdujeron en células Huh7 o 293. Cuarenta y ocho horas después, se recolectó el lisado celular para el análisis de luciferasa. Como informamos anteriormente, la interacción de AAV8 con albúmina humana aumentó la transducción de AAV8 en células Huh7 incluso a la dilución de 1:10000(Figura 15).También encontramos que la transferrina y la LDL ejercían la potenciación de la transducción de AAV8 en células Huh7 a la dilución de 1:1000 y 1:100, respectivamente. No se mostró un aumento marcado de la expresión del transgén en las células 293 independientemente de las diferentes proteínas séricas o las diluciones(Figura 15).Este resultado implica que la interacción de LDL o la transferencia con AAV8 aumenta la transducción en los hepatocitos.
AAV8 no utiliza receptores de LDL o de transferencia para la transducción hepática.Se ha demostrado que los receptores de LDL o de transferencia se utilizan para la infección hepática eficaz de algunos virus. El bloqueo de estos receptores con la inyección de dosis altas de LDL o lactoferrina disminuye la infectividad de estos virus en el hígado de ratones. Se han identificado los receptores primarios para otros serotipos, pero se desconoce qué receptores primarios utiliza el AAV8 para una transducción eficaz. Se ha demostrado que el AAV8 es el mejor serotipo para transducir el hígado de ratón. Para estudiar si AAV8 se une a los receptores de LDL o transferrina para la transducción de células diana, se administraron 0,5 mg de LDL humana (que satura los receptores de LDL) o 1 mg de lactoferrina (que satura la LRP, así como HSPG) en ratones, y 5 min más tarde, se inyectaron 1x1010 partículas de AAV8/luc. Después de tres días después de la inyección de AAV, se tomó la imagen. Fue sorprendente observar que la preinyección de LDL o lactoferrina en realidad aumentó la transducción de AAV8 en el hígado(Figura 16).Este resultado sugiere que AAV8 puede no emplear los receptores de LDL y transferrina para la transducción eficaz del hígado de ratón.
La interacción de AA V8 con LDL o transferrina mejora la transducción del hígado de ratón.La incubación de AAV8 con LDL o transferrina aumentó la transducción en la línea celular de hepatocitos humanos Huh7 pero no en la línea celular de no hepatocitos 293T. Como se describió anteriormente, para estudiar el efecto de LDL y transferrina en la transducción hepática de AAV en ratones, se incubaron 1x1010 partículas de AAV8/luc con diferentes diluciones de LDL o transferrina, luego se inyectaron en ratones a través de la vena retroorbital. En el día 3, 10 y 14 después de la inyección de AAV, se llevó a cabo la imagenología del ratón. Como se muestra enla Figura 17,incluso a la dilución de 10000 veces para LDL y 1000 veces para transferrina, se observó la mejora de la transducción hepática a lo largo de los experimentos.
La incubación de AAV8 con LDL o transferrina aumenta la unión de los viriones del virus a las células diana.Se ha demostrado que la transducción mejorada de HSA se debe a un aumento de la unión de los viriones de AAV a las células diana. Para examinar si el mismo mecanismo se aplica al efecto de LDL y transferrina en la transducción de AAV8 en hepatocitos, primero realizamos el análisis de unión virus-células en células Huh7. El virus AAV8 se incubó con LDL o TRF a diferentes diluciones de concentración sanguínea normal durante 1 hora a 4 °C, luego se adicionaron células Huh7 y se incubaron durante otras 2 horas a 4 °C. Después de un lavado exhaustivo con PBS, se extrajo el ADN de las células Huh7 y se aplicó para medir el número de copias del genoma de AAV utilizando PCR cuantitativa. De acuerdo con el resultado de la expresión transgénica, la incubación de LDL o ApoB o transferrina con viriones AAV8 aumentó la unión de AAV8 a células Huh7(Figura 18).La dilución de 10 a 1000 veces de HSA tuvo una unión de virus similar a las células Huh7. Por el contrario, la capacidad de unión de AAV8 a las células Huh7 para LDL y transferrina fue dependiente de la dosis. Por lo tanto, más proteínas incubadas con el vector AAV indujeron una mayor unión del virus a las células Huh7.
Para estudiar el efecto de LDL y transferrina sobre la capacidad de unión de AAV en el hígado de ratón, primero investigamos la cinética de la eliminación del virus en la sangre después de la administración de AAV. Se inyectaron 1x1011 partículas de vectores AAV8/luc preincubados con LDL o transferrina a una dilución de 100 veces en ratones a través de la vena retroorbital. La imagenología de ratón se realizó a las 48 horas después de la inyección de AAV8 (Figuras 19A y 19B). De acuerdo con los resultados descritos anteriormente, AAV8 pretratado con LDL o transferrina aumentó la transducción del hígado de ratón. Además, a los 5 min, 2 h, 24 h y 48 h después de la inyección de AAV, se extrajo sangre y se recolectó plasma después de una breve centrifugación de las muestras de sangre. El número de copias del genoma de AAV en plasma se midió mediante PCR cuantitativa (Figura 19C). En contraste con la cinética de eliminación del virus para AAV8 incubado con HSA, se encontró un mayor título de virus en sangre en ratones que recibieron AAV8 pretratado con LDL y transferrina a los 5 minutos después de la inyección de AAV. No hubo diferencias después de 2 horas después de la administración de AAV.
Para estudiar el efecto de las proteínas séricas LDL y transferrina sobre la biodistribución de AAV8, el día 7 después de la administración de AAV, los ratones se sacrificaron y se recolectaron diferentes tejidos para el análisis de expresión transgénica y la detección del número de copias del genoma de AAV. Como se muestra enla Figura 20,en comparación con los ratones de control que recibieron el vector AAV8 incubado con PBS, el aumento de la expresión transgénica solo se mostró en el hígado de los ratones tratados con vectores AAV8 preincubados con LDL o transferrina. En alineación con la expresión transgénica, se observó un mayor número de copias del genoma de AAV en el hígado de ratones que recibieron AAV8 con LDL o transferrina. Estos resultados sugieren que la incubación de AAV8 con LDL o transferrina no cambia el tropismo tisular de AAV8, sino que aumenta la absorción de AAV en el hígado.
Ningún aumento adicional de la expresión transgénica de AAV8 incubado con la combinación de proteínas séricas.Nuestro estudio previus y los resultados anteriores demostraron que la proteína sérica individual (HSA, LDL y transferrina) mejoró la transducción de AAV8 en las células hepáticas. A continuación, nos preguntamos si la combinación de estas proteínas tiene más potencial para aumentar la transducción de AAV8. El vector AAV8 se incubó con la combinación de dos o tres proteínas y se transdujo en células Huh7. En comparación con AAV8 tratado con albúmina, no se logró un aumento adicional de la expresión transgénica independientemente de cualquier combinación o dilución de proteína individual(Figura 21).
También se incubaron 1x1010 partículas de AAV8/luc con tres proteínas, individuales o en combinación, a la dilución de 100 veces y se inyectaron en ratones a través de la vena retroorbital. En el día 3 y 7 después de la inyección de AAV, se tomó imagenología de los ratones. De manera similar a los resultados en células Huh7, en comparación con la proteína individual, la combinación de HSA, LDL y transferrina no aumentó la expresión transgénica hepática de AAV8(Figura 22).
Las proteínas séricas se unen competitivamente a la misma ubicación de los viriones AAV8.Los resultados descritos anteriormente de los experimentosin vitroein vivodemostraron que la combinación de proteínas séricas no tiene una transducción hepática superior en comparación con las proteínas individuales. Se observó una mejora similar de la transducción hepática a partir de AAV8 incubado con HSA, o LDL o transferrina. Se supone que estas proteínas pueden unirse a la misma ubicación de la superficie del virión de AAV. Para apoyar esta hipótesis, realizamos el ensayo de competencia. Primero, se incubó el virus AAV8 con la mezcla de albumina a diferentes diluciones y LDL o transferrina a una dilución de 1:100. Luego, los viriones de AAV fueron derribados por anticuerpos específicos para ApoB o transferencia y titulados por PCR cuantitativa (Figura 23A). La incubación de AAV8 con combinaciones que contienen una alta concentración de HSA bloqueó completamente la unión del virus a LDL o transferrina. La disminución de la concentración de HSA aumentó la unión de los viriones AAV8 a otras proteínas. Cuando se usó 10000 veces de HSA, no se mostró inhibición de la unión de AAV8 a LDL o transferrina. A continuación, realizamos el análisis del bloque de unión a la proteína AAV8. AAV8/luc se incubó con HSA a diferentes diluciones durante 30 min, luego se adicionó LDL o transferrina a una dilución de 100 veces durante una hora. Después de la extracción con anticuerpos específicos de LDL 0 transferrina, similar al análisis de competencia, la alta concentración de HSA bloqueó la unión posterior del virión de AAV a LDL o transferencia (Figura 23B).
En resumen, las proteínas séricas (LDL-ApoB, transferrina, albúmina) pueden mejorar la transducción hepática de AAV8 a través del mecanismo de aumento de la unión del virión de AAV a las células diana. Estas proteínas interactúan con la misma ubicación en la superficie del virión AAV8.
Ejemplo 3(Ejemplo de referencia)
Entre los 12 serotipos de AAV, se sabe que la administración sistémica de AAV9 induce la transducción global en modelos animales. Por lo tanto, se ha propuesto en ensayos clínicos dirigirse al cerebro y los músculos mediante infusión periférica de vectores AAV9 para administrar transgenes terapéuticos. Los resultados de estudiosin vitroein vivohan sugerido que los vectores AAV9 son capaces de cruzar las barreras endoteliales de los vasos sanguíneos a través de una transcitosis eficiente, lo que contribuye a su transducción superior en el músculo, el corazón y otros tejidos u órganos después de la administración sistémica de genes. Los vectores AAV9 interactuarán primero con las proteínas séricas antes de unirse a las células diana después de la administración sistémica. Para dilucidar si algunas proteínas séricas son capaces de interactuar con AAV9 y mejorar su transducción, realizamos el análisis de espectrometría de masas para las proteínas séricas de unión a AAV9 y estudiamos el efecto potencial de estas proteínas séricas de unión en la transducción global de AAV9.
Las proteínas séricas con modulación de la permeabilidad vascular se unen a AAV9.Para identificar qué proteínas séricas son capaces de unirse a la superficie del virión de AAV9, realizamos una inmunoprecipitación para el ensayo de espectrometría de masas. Los viriones de AAV9 se incubaron con suero humano durante 2 h a 4 °C. Se adicionó el anticuerpo monoclonal ADK9, que solo reconoce la cápside de AAV9 intacta. Luego, se extrajeron las proteínas séricas de unión a AAV9 y se analizaron mediante espectrometría de masas. Entre las proteínas identificadas(Tabla 6),varias proteínas pueden influir en la permeabilidad vascular, que incluyen: Fibrinógeno (Fib), fibronectina (FN), plasminógeno (PMG), factor de von Willebrand (vWF), glicoproteína alfa-1-ácido (AGP) y factor plaquetario 4 (PF4)(Tabla 7).
La interacción directa del fibrinógeno con AAV9 mejora la transducción de todo el cuerpo.La Fib es una glicoproteína que ayuda a la formación de coágulos sanguíneos. Fib es un hexámero que contiene dos conjuntos de tres cadenas diferentes (a, p y<y>), que están unidas entre sí por enlaces disulfuro. El fibrinógeno es sintetizado por los hepatocitos y la concentración en el plasma sanguíneo es de 2 a 4 mg/ml. El fibrinógeno es un soluble con un peso molecular de 340 kDa. El análisis de espectrometría de masas ha demostrado que se identificó que las tres cadenas de Fib se unían a AAV9(Tabla 7).Para estudiar el efecto de Fib sobre la transducción de AAV9 en ratones, incubamos 1 x1010 partículas de<a>AV9 con 3 mg de Fib a 4 °C durante 2 h y luego se inyectaron en ratones (cohorte Fib-PBS). Tres días después, se realizó la imagenología. En comparación con los ratones que recibieron solo AAV9 (cohorte PBS), o los ratones tratados con Fib justo antes de la inyección de AAV9 (cohorte PBS-Fib), se logró una transducción hepática aproximadamente 3 veces mayor en ratones dentro de la cohorteFib-PBS (Figura 24).Además, con base en el perfil de imagenología, también se observó una fuerte transducción en la cabeza, el corazón y otras ubicaciones al lado del hígado en ratones que recibieron AAV9 preincubado con Fib. No hubo diferencias en la expresión transgénica, en el hígado o en todo el cuerpo, entre la cohorte de PBS y la cohorte de PBS-Fib. Este resultado sugiere que la incubación de Fib con el vector AAV9 es capaz de aumentar la permeabilidad vascular de AAV9 y mejorar la transducción de todo el cuerpo de AAV9, y la mejora de la transducción requiere la interacción directa de Fib con los viriones de AAV. Para examinar la alta transducción en otros tejidos además del hígado, realizamos la administración sistémica de vectores AAV9 preincubados con Fib, y en la semana uno después de la inyección de AAV, los ratones se sacrificaron y los tejidos se recolectaron para el análisis de luciferasa y la detección del número de copias del genoma(Figura 25).De acuerdo con la imagenología, los ratones en la cohorte de Fib-PBS tuvieron una mayor expresión transgénica en el hígado, corazón, pulmón, músculo y cerebro que los ratones en las cohortes de PBS y PBS-Fib(Figura 25A).Además, se encontró un mayor número de copias del genoma de AAV en los tejidos de ratones de la cohorte Fib-PBS que los de las otras dos cohortes(Figura 25B).Cuando el AAV9 se incubó con dosis reducidas de Fib, la transducción mejorada solo se observó a la concentración de 1 mg y 100 ug de Fib. La Fib con dosis más bajas no tuvo ningún efecto sobre la transducción de AAV9(Figura 26).
Los viriones de AAV superiores persisten después de la administración sistémica de AAV9 incubado con fibrinógeno.Se ha demostrado que el aclaramiento sanguíneo del vector AAV9 es más lento que el de otros serotipos, lo que puede contribuir a una mayor permeabilidad vascular para una alta transducción de todo el cuerpo. Para estudiar si la incubación de Fib afectó la cinética de la eliminación de AAV9 en la sangre, inyectamos 2X1011 partículas de AAV9 en ratones, y en el día 2, se tomó imagenología de ratones(Figura 27A).De manera similar a la observación anterior, se mostró una mayor expresión transgénica en el hígado en ratones tratados con AAV9 preincubado con Fib que en ratones de cohorte PBS o cohorte PBS-Fib(Figura 27B).En diferentes momentos, se extrajo sangre y se detectó el número de copias del genoma de AAV en plasma mediante PCR cuantitativa. Se encontró un número de copias del genoma significativamente mayor en circulación en los ratones que recibieron AAV9 incubado con Fib que el de los ratones dentro de las otras dos cohortes a los 20 min, 2 h y 24 h después de la inyección de AAV. No hubo diferencias a las 48 horas después de la administración de AAV entre las tres cohortes(Figura 27C).El resultado puede explicar que la transducción mejorada de todo el cuerpo puede resultar de viriones de AAV más altos en circulación después de la administración sistémica del vector AAV9 preincubado con fibrinógeno.
La interacción de otras proteínas séricas con AAV9 mejora la transducción.El objetivo principal de este estudio fue examinar qué proteínas séricas mejoraron la transducción de todo el cuerpo de AAV9. Para este propósito, en combinación con los resultados del análisis de espectrometría de masas, varias otras proteínas que también se unen a AAV9 pueden modular la permeabilidad vascular para afectar la transducción de todo el cuerpo de AAV9, que incluyen: Alfa-1-glucoproteína ácida 2 (AGP), fibronectina (FN), factor de von Willebrand (vWF), factor plaquetario 4 (PF4) y plasminógeno (PMG). Se incubó el vector AAV9 con estas proteínas a la concentración sanguínea fisiológica e inyectamos en ratones. En el día 3 después de la administración de AAV, se llevó a cabo imagenología de ratón. Todas estas proteínas indujeron una mayor transducción hepática en ratones tratados con AAV9(Figura 28).En algunos grupos, en la semana 1 después de la inyección de AAV, también se encontró una alta expresión transgénica en el cerebro en ratones que recibieron AAV9 preincubado con AGP o FN o PF4 o VWF(Figuras 29Ay29B).Los ratones se sacrificaron en la semana 1 después de la administración de AAV, y se detectó el número de copias del genoma de AAV en el hígado y el cerebro. De acuerdo con el perfil de imagen, se obtuvo un número de copias del genoma de 3 a 4 veces mayor en el hígado de ratones que recibieron AAV9 preincubado con Fib, o PF4 o VWF. A diferencia del hígado, solo se observó un número de copias del genoma ligeramente mayor en el cerebro de los ratones que recibieron AAV9 preincubado con proteínas séricas, a excepción de PF4(Figura 29C).
A continuación, examinamos el efecto de la proteína sérica, a diferentes dosis, sobre la transducción mejorada de AAV9. El AAV9 se incubó con diferentes diluciones de proteínas séricas y luego se administró a ratones a través de la vena retroorbital. Como se muestra enla Figura 30,todavía se observó una transducción mejorada para AGP a una dilución de 1000 veces y fibronectina a una dilución de 100 veces, pero no hubo un aumento de la transducción para PF4 y vWF, a pesar de que se utilizó una dilución de 10 veces de estas proteínas(Figura 30).
La incubación del crioprecipitado con AAV9 mejora la transducción de AAV9.Con base en los resultados de los estudios anteriores, varias proteínas séricas mejoraron la transducción de todo el cuerpo de AAV9. La siguiente pregunta es si podemos usar estas proteínas en ensayos clínicos de inmediato. No hay una proteína individual disponible en la práctica clínica; sin embargo, el crioprecipitado se ha utilizado en clínicas durante mucho tiempo. El crioprecipitado es un producto sanguíneo congelado preparado a partir de plasma mediante centrifugación de plasma fresco congelado y precipitación. El crioprecipitado contiene principalmente fibrinógeno, factor VIII, vWF, factor XIII y fibronectina. El crioprecipitado se ha utilizado para tratar pacientes con hemofilia, enfermedad por vWF, hipofibrinogenemia, afibrinogenemia, et al. Dado que se ha demostrado que el fibrinógeno, el vWF y la fibronectina mejoran la transducción de AAV9 como se describió anteriormente, a continuación probamos si el crioprecipitado tenía efecto sobre la transducción de AAV9. El AAV9 se incubó con crioprecipitado a diferentes dosis y se inyectó sistémicamente en ratones. La mejora de la transducción de AAV9 en el hígado fue dependiente de la dosis con una dilución de 100 a 10000 veces del crioprecipitado. No hubo mejora con la dosis de una dilución de 100000 veces del crioprecipitado(Figura 31).Este resultado indica que el crioprecipitado podría usarse inmediatamente en futuros ensayos clínicos cuando se requieran vectores AAV9 para la administración sistémica.
El crioprecipitado, que está compuesto por fibrinógeno, vWF y fibronectina, podría aplicarse inmediatamente en los ensayos clínicos para aumentar la permeabilidad de los vasos sanguíneos y dirigirse al cerebro y los músculos después de la administración sistémica de a AV9.
Ejemplo 4(Ejemplo de referencia)
Se ha realizado un experimento más sobre el efecto de la interacción de la albúmina con los viriones de AAV sobre la actividad de inhibición del anticuerpo neutralizante A20. Como se muestra enla Tabla 8y laFigura 32,independientemente de la dilución de albúmina (sin dilución, 5 veces, 50 veces, 500 veces), la incubación de albúmina humana con AAV2 no bloqueó la función de inhibición de A20. El título de anticuerpo neutralizante A20 (la dilución al primer momento inhibe la transducción de AAV en más del 50%) fue consistentemente el mismo (dilución 1:640). Este resultado indica que la interacción de la albúmina con el virión de AAV no es capaz de interferir con la unión del anticuerpo neutralizante A20 a la cápside de AAV y el bloqueo de la transducción de AAV.
Con base en estos estudios, 5% de HSA a una dilución de 20000 veces en 12,5 ul tiene el efecto de mejorar la transducción de AAV (1x10e8 partículas de AAV)in vitro.En un ejemplo, se pueden incubar alrededor de 3000 moléculas (2830) de albúmina humana con un virión de AAV para mejorar la transducción. Ver el cálculo a continuación:
Peso molecular de la albúmina sérica humana (kDa): 66,5 kDa
1 ng = 15,04 fmol = 905570676 moléculas
12,5 ul de HSA al 5% (50ug/ul) = 625 ug = 625000 ng
5% de HSA a una dilución de 20000 en 12,5 ul todavía tiene un efecto para mejorar la transducción de AAV (1*108 partículas de AAV).
Luego, el total de moléculas de HSA es 625000/20000 x 905570676 = 282990836466 moléculas de HSA/virión de AAV = 282990836466/100000000 =2830 moléculas/virión de AAV
Ejemplo 5:(Ejemplo de referencia) Estabilidad del complejo de proteínas de fusión de albúmina/AAV
Método.Se cargaron 1*1010 partículas del vector AAV8/luc en la membrana de nitrocelulosa en un aparato múltiple, luego la membrana se bloqueó con gelatina al 1% seguido de incubación con albúmina de suero humano (HSA) al 25% a una dilución de 1: 1000 durante 30 min para permitir la interacción directa de AAV con albúmina. Después de lavar con PBS, se adicionó el amortiguador con diferente concentración de sal o pH al pocillo individual del aparato colector. Después de la remoción de los diferentes amortiguadores, la membrana se lavó y se hibridó con antialbúmina humana de cabra conjugada con HRP seguido de desarrollo de color usando kits de quimioluminiscencia Immun-Star™ (Bio-Rad).
Resultado.Como se muestra enla Figura 33,la albúmina humana se disoció del complejo AAV/HSA cuando se adicionó una concentración diferente de NaCl, la disociación del complejo AAV/HAS dependió de la concentración de NaCl(Figura 33A).Una mayor concentración de NaCl interrumpió completamente la interacción de los viriones AAV8 con HSA. También encontramos que el complejo HSA/AAV era estable a pH>6 pero se disociaba a pH<5(Figura 33B).
Ejemplo 6(Ejemplo de referencia)
El vector del virus adenoasociado (AAV) se ha aplicado con éxito en ensayos clínicos en pacientes con enfermedades de la sangre y trastornos de la visión. Dos preocupaciones restringen la aplicación más amplia del vector AAV: Eliminación mediada por respuesta de células T citotóxicas (CTL) específicas de la cápside de AAV de células diana transducidas con AAV y bloqueo mediado por anticuerpos neutralizantes (Nab) de la transducción de AAV. Se ha demostrado que la presentación del antígeno de la cápside depende de la dosis, lo que indica que la mejora de la transducción de AAV con dosis bajas de vector de AAV disminuirá potencialmente la carga de antígeno de la cápside y, con suerte, extirpará el aclaramiento mediado por CTL de la cápside de las células diana transducidas con AAV sin comprometer la expresión transgénica. Se han explorado varios enfoques para este propósito, que incluyen: optimización del casete transgénico, modificación de la cápside de AAV e interferencia del tráfico de AAV con agentes farmacológicos. La modificación de la cápside de AAV puede cambiar el tropismo de AAV, especialmente porque la eficiencia de transducción de AAV es desconocida en los tejidos humanos.
Los reactivos farmacológicos para mejorar la transducción de AAV generalmente tienen efectos secundarios no deseados. Es imperativo desarrollar estrategias ideales para mejorar la transducción de AAV, pero sin un cambio en el tropismo por la modificación de las cápsides o los efectos secundarios negativos del tratamiento farmacológico. Se ha realizado un estudio pionero y encontramos que la albúmina sérica humana (HSA) tiene un efecto mejorado sobre la transducción de AAV por interacción directa del virión de AAV con la albúmina. Estas observaciones tienen una importancia crítica para los ensayos clínicos, ya que la albúmina existe naturalmente y es la proteína más recuperada en la circulación.
La transducción efectiva de AAV implica los siguientes pasos: unión a la superficie de la célula diana a través de receptores y correceptores, endocitosis en endosomas, escape de endosomas, entrada nuclear y desrecubrimiento del virión de AAV seguido de expresión transgénica. Se pueden modificar varios pasos para mejorar la transducción de AAV, incluida la unión celular, el escape endosómico y la entrada nuclear. Nuestros estudios preliminares han demostrado que la HSA puede interactuar directamente con el virión de AAV y mejorar su transducción debido al aumento de la unión del virus AAV en la superficie celular, tal vez a través de los receptores de HSA.
Para una administración eficaz de fármacos o bio-carga, varios estudios han demostrado que se han identificado numerosos péptidos (incluidos los péptidos de penetración celular-CPP) para dirigirse específicamente a los hepatocitos, ayudar al escape del endosoma (endosomolisis) y aumentar la entrada nuclear. Los estudios descritos examinan si la fusión de estos péptidos con HSA mejorará aún más la transducción hepática de AAV. La interferencia con el tráfico de viriones de AAV para mejorar la transducción también puede influir en la presentación del antígeno de la cápside; estudios previos han demostrado que la presentación del antígeno de la cápside se basa en la degradación mediada por el proteasoma de la cápside de AAV. Muchos virus (por ejemplo, CMV, herpes) utilizan péptidos VIPR (proteínas virales que interfieren con la presentación del antígeno, por ejemplo, US6, ICP47) para bloquear la presentación del antígeno. En estos experimentos, estudiaremos el efecto de la transducción mejorada de AAV con HSA en la presentación del antígeno de la cápside y exploraremos si la fusión de VIPR con HSA interferirá con la presentación del antígeno de la cápside de AAV. La transducción mejorada de AAV por HSA se debe a más unión de viriones en la superficie diana después de la interacción con la albúmina. Este resultado sugiere que el péptido de fusión de albúmina se puede utilizar como un ligando de receptor alternativo para la transducción de AAV para evitar la actividad del anticuerpo neutralizante (Nab) de AAV. Se ha sugerido que los epítopos para el reconocimiento de anticuerpos neutralizantes se encuentran en 9 regiones variables (VR) de la superficie del virión. Estudios previos han demostrado que los péptidos de AAV VR bloquean la función de Nab. La combinación de diferentes péptidos derivados de AAV VR puede tener una mayor capacidad para bloquear la actividad de Nab. Se explorará si la proteína de fusión de albúmina con péptidos derivados de las regiones variables de superficie del virión de<a>A<v>interfiere con la actividad del anticuerpo neutralizante.
Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se han utilizado con éxito para transducir hepatocitos en ensayos clínicos de Fase I en pacientes con hemofilia B. Sin embargo, los resultados clínicos han sugerido que los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de la cápside eliminan los hepatocitos transducidos con AAV, lo que resulta en un fracaso terapéutico. La presentación del antígeno de la cápside en las células diana transducidas con AAV depende de la dosis. Para evitar el aclaramiento mediado por CTL específico de la cápside de las células hepáticas transducidas con AAV, se ha propuesto una dosis más baja de vectores de AAV para reducir la carga de antígeno de la cápside en las células transducidas con AAV. Para obtener eficiencias de transducción similares con dosis bajas de vector, se han explorado varios enfoques, incluida la optimización transgénica, las alteraciones de la cápside y los tratamientos farmacológicos para mejorar la transducción. Se han utilizado varios agentes farmacológicos para este propósito, incluidos inhibidores del proteasoma, inhibidores de la síntesis de ADN e inhibidores de la topoisomerasa. Sin embargo, estos medicamentos tienen efectos secundarios graves. También se ha demostrado que la modificación de la cápside de AAV puede mejorar la transducción hepática. Nuestro estudio reciente demostró que el injerto de los residuos de unión al receptor de galactosa AAV9 en el virión AAV2 (receptores duales) indujo una expresión transgénica hepática más fuerte. Sin embargo, otros mutantes tal como AAV2i8 (AAV2 con intercambio de sitio de unión a heparina de AAV8) cambian el tropismo hepático de sus padres a trópico muscular. La albúmina es la proteína plasmática más abundante y se sintetiza en el hígado. La albúmina es una proteína altamente soluble y estable. Las estructuras cristalográficas de rayos X de la albúmina humana han revelado que es una molécula en forma de corazón que consiste en un 67% de hélices a y sin láminas p, y se pliega en tres dominios homólogos donde cada uno se divide en subdominios A y B. Los dominios están conectados a través de largos bucles flexibles. Cada uno de los tres dominios tiene bolsillos de unión hidrófobos que permiten transportar sustancias. Por lo tanto, la albúmina actúa como un taxi molecular que transporta sustancias esenciales y productos de desecho en el torrente sanguíneo para una distribución óptima a sus sitios diana. Se han descrito varios receptores de albúmina: la glicoproteína de la superficie celular (gp)18, gp30, gp60 (albondina), el complejo magalina/cubilina, la proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC; también llamada osteonectina) y FcRn. Después de que la albúmina se une a los receptores, se absorbe a través de la endocitosis. La vía para la endocitosis de la albúmina depende del tipo de célula e incluye endocitosis mediada por clatrina o caveolina. La albúmina sérica humana (HSA) atrae un gran interés en la industria farmacéutica, ya que puede unirse a una notable variedad de fármacos, afectando su administración y eficacia y, en última instancia, alterando las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del fármaco.
La infección por AAV es un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión del virus a la superficie celular, seguido de la captación viral, el tráfico intracelular, la localización nuclear, la eliminación del recubrimiento y la síntesis de ADN de segunda cadena. El AAV2 inicia la infección al unirse a su receptor primario (proteoglicanos de sulfato de heparán-HSPG) y correceptores (integrina y receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos). Para que el AAV continúe su ciclo de vida, debe liberarse del endosoma después de la endocitosis. Después del escape del endosoma, el AAV viaja rápidamente al núcleo celular y se acumula en el espacio perinuclear, comenzando dentro de los 30 minutos posteriores al inicio de la endocitosis. En dos horas, se pueden detectar partículas virales en el núcleo celular, lo que sugiere que la partícula de AAV ingresa al núcleo antes de desprenderse. Curiosamente, la mayoría del virus intracelular permanece en un compartimento perinuclear estable. Después de la unión al receptor, la internalización y la entrada nuclear, el virión de AAV desenvuelve y libera un molde de ADN de hebra individual, que debe convertirse en un intermedio dúplex antes de que pueda producirse la transcripción. Algunos pasos son factores limitantes de la velocidad para la transducción efectiva de AAV, incluida la capacidad de unión del virus a las células diana, la eficiencia del escape endosómico y la entrada nuclear.
Los péptidos de penetración celular (CPP), también conocidos como dominios de transducción de proteínas (PTD), son pequeños péptidos capaces de transportar péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y nanopartículas a través de las membranas celulares hacia las células, lo que resulta en la internalización de la carga intacta. Los CPP pueden cumplir diferentes funciones, tal como mejorar la capacidad de unión de la carga y aumentar el escape de la carga del endosoma y la entrada nuclear. Se han identificado varios péptidos que se unen específicamente a los hepatocitos. Un péptido se deriva de la proteína de circumsporozoito que contiene los aminoácidos de la región I conservada (KLKQP,<s>E<q>ID NO: 131) más el dominio de aminoácidos básico cadena arriba de la región I (DNEKLRKPKHKKLKQPADG, SEQ ID NO: 132). Otro dominio del péptido preS 1 es del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (PLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP, SEQ ID NO: 133). Una tercera es de la proteína de fibra de cola de fago T7 (KNESSTNATNTKQWRDETKGFRDEAKRFKNTAG, SEQ ID NO: 134). Algunos péptidos tienen la propiedad de promover la alteración de la membrana endosómica a través de diferentes mecanismos: formación de poros en la membrana endosómica, efecto amortiguador del pH (el efecto de esponja de protones), fusión en la membrana endosómica y alteración fotoquímica de la membrana endosómica. Estos péptidos se derivan de virus, bacterias y proteínas humanas/animales, así como sintéticas. En sistemas biológicos de orden superior, una señal de localización nuclear (NLS) es esencial para dirigir las cargas macromoleculares al núcleo. Para mejorar la eficiencia de la importación nuclear, la unión directa o indirecta de CPP con secuencias de localización nuclear (NLS) a ADN o portadores de genes ha atraído mucho interés en la investigación. Las NLS son péptidos cortos basados en motivos ricos en lisina, arginina o prolina que pueden ser reconocidos por miembros de la superfamilia de proteínas de transporte nuclear Importin. La importina-a se une directamente a la señal NLS, y el complejo se transloca al núcleo a través del complejo de poros nucleares (NPC) mediante el acoplamiento sucesivo de importina p y nucleoporinas (Nups). Por lo tanto, el NLS supera la barrera de la membrana nuclear y promueve la translocación nuclear. La NLS más conocida y ampliamente estudiada en el campo de la terapia génica proviene del antígeno tumoral grande del virus de simio 40 (SV40).
Para la administración de fármacos mediada por albúmina, las cargas endocitadas a menudo quedan atrapadas en los endosomas, donde pueden ser degradadas por enzimas hidrolíticas. Para la infección por AAV, después de la absorción, (Gal) o el ácido siálico (Sia) como receptores primarios para la unión a la superficie celular. Diferentes cepas de AAV también requieren una interacción posterior con correceptores para la absorción celular. Se han identificado residuos de aminoácidos clave involucrados en el reconocimiento de Gal por las cápsides de AAV9. La modificación de los sitios de unión al receptor en la cápside de AAV puede cambiar el perfil transgénico o la eficiencia de transducción. Hemos sido pioneros en estudios de diseño racional de cápsides de AAV; por ejemplo, hemos mutado los residuos críticos para el sitio de unión al receptor primario entre diferentes serotipos y hemos demostrado que la quimera AAV2/AAV8 AAV2i8 mostró un perfil de transducción alterado. AAV2i8 transduce selectivamente los músculos esqueléticos cardíacos y de todo el cuerpo con alta eficiencia y pierde el tropismo hepático. Otros estudios que integran residuos de unión a Gal del receptor primario de AAV9 en la cápside de AAV2 (AAV2G9) mostraron que AAV2G9 tiene una función de receptor dual y explota los receptores de Gal y sulfato de heparán para la infección. De particular interés, AAV2G9 conserva un tropismo similar a AAV2, pero confiere un inicio más rápido y una mayor expresión transgénica hepática en ratones. De manera similar, el injerto de la huella de Gal en el AAV2i8 (AAV2i8G9) también indujo una mayor transducción en el músculo y el hígado, comparable con AAV9.
Además, hemos demostrado que las modificaciones en el residuo 265 de la cápside de AAV2 cambian el tropismo tisular de AAV2 y el perfil inmune. La inserción de un ácido aspártico en el residuo 265 de la cápside de AAV2 (AAV2D) indujo una transducción muscular mucho mayor que AAV2. De manera similar, la administración sistémica de AAV2D también indujo una mayor transducción hepática que AAV2. El residuo 585 Arg contribuye a la capacidad de unión a heparina de AAV2 y la mutación del sitio de unión a heparina de AAV2 (AAV2/585E) extirpa el tropismo hepático de AAV2. Sin embargo, la inserción de Asp en el residuo 265 de la cápside de AAV2/585E restauró el tropismo hepático a una eficiencia de transducción similar a la observada usando AAV8. Aunque estos estudios demostraron que se logró una mayor transducción hepática con mutaciones, también se cambió el tropismo tisular.
Mejora de la transducción hepática con agentes quimioterapéuticos.Se han utilizado varios agentes químicos para mejorar la transducción de AAV, incluidos inhibidores del proteasoma tal como MG-132 y bortezomib, inhibidores de la síntesis de ADN tal como hidroxiurea (HU) y afidicolina, e inhibidores de la topoisomerasa tal como etopósido y camptotecina. Hasta ahora, el principal candidato para mejorar la transducción de rAAVin vivoes el inhibidor del proteasoma bortezomib, que se ha demostrado que aumenta la expresión transgénica de 3 a 6 veces en un estudio en animales grandes. Además, se ha identificado un agente novedoso, el trióxido de arsénico, así como un inhibidor alternativo del proteasoma, carfilzomib, que también aumenta la transducción hepática de AAV(Figura 34).
Transducción hepática mejorada con albúmina sérica humana.Cuando se realizó análisis de anticuerpos neutralizantes de AAV en sueros humanos, se observó una mayor transducción de AAV a pesar de que se utilizó una dilución muy alta de sueros. Para aislar qué proteínas pueden unirse a AAV y mejorar la transducción, incubamos AAV2 con suero humano y eliminamos las proteínas de unión a AAV2 utilizando el anticuerpo A20 para la inmunoprecipitación. Después del análisis con espectrometría de masas, se identificó la albúmina sérica humana (HSA)(Figura 35A).Además, confirmamos la interacción directa de la albúmina sérica con los viriones de AAV mediante el estudio de la colocalización con AAV2 marcado con Cy5 y albúmina marcada con Cy3(Figura 35B).Para dilucidar el efecto de HSA en la transducción de AAV, realizamos un ensayo de transducción con suero reducción en HSA y albúmina humana recombinante en células Huh7. Se encontró una mejora menor de la transducción de AAV2 con suero reducción en HSA que con suero completo(Figura 35C).La transducción de AAV mejorada de rHSA fue similar a la del suero completo(Figura 35D).También se demostró que la rHSA mejoró la transducción de AAV8(Figura 35E).Para examinar si el efecto de la HSA en la transducción mejorada de AAV se limita a tejidos específicos, inyectamos el vector AAV8 preincubado con rHSA en diferentes tejidos y encontramos una transducción mejorada en el hígado y el músculo(Figuras 35Fy 3G).
Tráfico de AAV.Usando viriones de AAV marcados con fluorescencia para rastrear el virus después de la infección, observamos la internalización de AAV a través de fosas recubiertas con clatrina y el escape de los endosomas tempranos (t1/2<10 min) permitiendo la penetración en el citosol. Luego, el AAV se trasladó rápidamente al núcleo celular y se acumuló en el espacio perinuclear dentro de los 30 minutos posteriores al inicio de la endocitosis. En 2 horas, se pudieron detectar partículas virales dentro del núcleo celular. Para respaldar los resultados de la fluorescencia, se realiza un inmunoanálisis utilizando el anticuerpo monoclonal A20 para detectar viriones intactos después de la entrada del receptor. Se observó un resultado similar. Para determinar aún más la ubicación celular de los viriones intactos durante la infección, se utilizó un anticuerpo monoclonal de Y-tubulina para localizar el centro organizador de microtúbulos (MTOC) y descubrimos que el virus AAV viaja al núcleo a través del MTOC. Usando el seguimiento de una partícula individual para monitorear el movimiento viral en tiempo real, descubrimos que el AAV2 mostraba solo un movimiento unidireccional en los microtúbulos (MT) hacia los núcleos. Además, el análisis de microscopía electrónica demostró que las partículas de AAV2 se transportaron en MT dentro de los compartimentos membranosos y que la acidificación de los endosomas que contienen AAV2 se retrasó por la interrupción de los MT.
La presentación del antígeno de la cápside de AAV es dependiente de la dosis y ocurre temprano.Para investigar la respuesta a la dosis de la presentación del antígeno de la cápsidein vivo,se inyectaron cantidades variables de partículas del vector AAV2-OVA en ratones para examinar la estimulación de las células T OT-1. Cuando se comparó con el control no tratado, una dosis de 5*1010 partículas de AAV2-OVA indujo la proliferación de células T OT-1(Figuras 36A-C). Es importante destacar que no hubo proliferación de células de bazo en grupos con dosis de AAV2-OVA menores o iguales a 1*1010 partículas.
Se ha demostrado que la expresión transgénica aumenta gradualmente después de la administración de AAV2 en ratones, alcanza su punto máximo en la semana 6 y luego permanece estable a largo plazo. Para abordar si la cinética de presentación antigénica de los epítopos de la cápsidein vivose corresponde con la dinámica de la expresión transgénica, inyectamos 1*1011 partículas de AAV2-OVA/AAT por vía intravenosa. En varios puntos de tiempo después de la inyección, se administraron células T OT-1 esplénicas marcadas con colorante CFSE a los ratones tratados. Diez días después de la transferencia, se midió la división de linfocitos T OT-1 mediante citometría de flujo. Como se muestra enla Figura 37,durante los días 3-12 y los días 21-30, la división de células T OT-1 aumentó significativamente en los animales tratados con el vector AAV2-OVA/AAT frente a los receptores de control. Sin embargo, no se observaron diferencias para la proliferación de células OT-1 entre AAV2-OVA y los grupos de control durante los días 41-50 y los días 61-70 (p>0,05). Este resultado indica que la presentación cruzada de antígeno de la cápside de AAV2 ocurre temprano después de la administración sistémica de AAV2. También se observaron cinéticas y eficiencia similares de presentación de antígenos a partir de un vector AAV8-OVA después de la aplicación sistémica. En este estudio, utilizaremos vectores AAV2/OVA y AAV8/OVA para investigar el efecto de las proteínas de fusión de albúmina humana sobre la cinética y la respuesta a la dosis de la presentación cruzada del antígeno de la cápside de AAV (2 y 8) después de la aplicación sistémica en un modelo de ratón.
La doble función del inhibidor del proteasoma en la presentación del antígeno de la cápside de AAV.Como bortezomib mejora la transducción de AAV, también estudiamos el efecto de este inhibidor del proteasoma en la presentación del antígeno de la cápside de AAV y descubrimos que una alta concentración de bortezomib inhibe la presentación del antígeno de la cápside con una mayor expresión transgénica. Por el contrario, una menor concentración de bortezomib (10 nM) aumentó la presentación de antígenos de células HepG2/kb transducidas con AAV2-OVA sin aumentar la expresión transgénica, y una dosis intermedia (100 nM) mejoró tanto la transducción como la presentación de antígenos.
Los VIPR inhiben la presentación de antígenos.Para determinar si los VIPR de los péptidos virales pueden ejercer la capacidad de inhibir la presentación del antígeno, se cotransfectó CMV VIPR US6 o HSV VIPR ICP47 en células 293 con construcciones de expresión de OVA y H-2kb, luego las células 293 se coincubaron con células de bazo OT-1 para el ensayo de presentación del antígeno. Al analizar el porcentaje de células positivas dobles CD8/CD69 (para la activación temprana de células T) o CD8/IFN-Y en todo el subconjunto de CD8, después de restar el fondo, las células positivas dobles de la expresión de CD8/CD69 o CD8/IFN-Y en el grupo tratado con ICP47 o US6 fue mucho menor que el grupo sin tratamiento con VIPRs, se demostró una inhibición de más del 95% de la presentación del epítopo OVA con US6 e ICP47(Figura 38).Para explorar la inhibición de VIPR en la presentación de antígenosin vivo,se transfectaron células 293 con constructos OVA, H-2kb e ICP47 o GFP, luego se inyectaron 1x10' células 293 en 0,2 ml de matrigel en ratones del flanco izquierdo por vía subcutánea. Simultáneamente, se transfundieron células de bazo OT-1 activadasin vitroa través de la vena de la cola y se midió el tamaño del tumor cada 2-3 días. Después de 20 días, no se encontró tumor en ratones trasplantados con células 293 transfectadas con GFP más infusión de células de bazo OT-1. Todos los demás ratones desarrollaron tumores de tamaño similar después del xenoinjerto de células 293 transfectadas con GFP sin infusión de células de bazo OT-1 o ICP-47 independientemente de la aplicación de células de bazo OT-1(Tabla 9).
Evasión de la actividad de A20 con inserciones en el residuo 265 de la cápside de AAV2.Nuestros estudios han demostrado que el anticuerpo A20 (que solo reconoce el virión de AAV2 intacto) no puede bloquear la transducción de AAV2.5 (mutante de AAV2 con sustitución de 5 aa de AAV1). Para evaluar si las inserciones en el residuo 265 también extirpan el sitio de unión de A20 y mejoran la transducción muscular, primero evaluamos la unión del anticuerpo. El análisis de la afinidad de unión a A20 mediante transferencia de puntos Western mostró que A20 no reconoció mutantes, similar al resultado para AAV2.5, lo que destaca la importancia del sitio 265 en una huella de reconocimiento de anticuerpocápside. Para estudiar los perfiles de anticuerpos neutralizantes de mutantes de AAV2 con 20 inserciones de aminoácidos individuales diferentes en el residuo 265, analizamos la actividad de NAb de sueros inmunizados con diferentes mutantes en ratones. No se encontró una relación obvia entre la transducción muscular de mutantes y las propiedades de aminoácidos insertados o el título de NAb y la reactividad cruzada.
Desarrollo de mutantes de escape IVIG Nab de hígado de ratón usando evolución dirigida.Hemos aislado con éxito varios mutantes con la capacidad de escape de Nab y tropismo muscular en presencia de suero humano mediante inyección directa de una biblioteca de barajado de AAV en el músculo de ratón. Para ampliar este estudio para aislar mutantes de AAV diana hepáticos con escape de Nab, primero inyectamos IVIG en los ratones y tres horas después, se administró la biblioteca de AAV a través de la vena retroorbital. En el día 3 después de la inyección de AAV, los ratones recibieron Ad dl309 durante 2 días. Se cosechó el hígado de ratón y se extrajo el ADN de Hirt. El producto de PCR del ADN de Hirt se clonó en pSSV9 para hacer la segunda biblioteca. Después de repetir los pasos anteriores durante dos ciclos más, el producto de PCR se clonó en pXR y se secuenció. Se han recuperado cuatro mutantes de AAV del hígado de ratón(Figura 39).Estos mutantes se utilizaron para envasar la luciferasa y después de la administración de estos mutantes y AAV8 en ratones mediante inyección retroorbital, se se tomó la imagenología. En comparación con AAV8 (con transducción hepática de ratón superior), todos los mutantes indujeron una transducción hepática inferior(Figura 39).Este hallazgo es similar a los mutantes aislados del músculo que tienen menor transducción muscular que el AAV6.
Inhibición de péptidos de AAV en la actividad de Nab.Se realizó un escaneo de epítopos en sueros de ratones C57BL/6 y Balb/C inmunizados con AAV2, así como en el anticuerpo monoclonal A20. Después de la incubación de sueros o A20 Ab con una biblioteca de péptidos, se adicionó el vector AAV2 a la mezcla de sueros y péptidos, y luego se comparó la transducción de AAV2 con el péptido de control. Usando este enfoque, se han identificado varios péptidos que aumentan la transducción de AAV2 con vectores AAV2/GFP(Figura 40).El análisis estructural ha demostrado que péptidos enteros o porciones de ellos están expuestos en la superficie del virión AAV2. El péptido p28 está parcialmente enterrado bajo una lámina beta que contiene la región aa 265 y está situado fuera, pero entre las proyecciones que forman el eje de tres pliegues. Las porciones expuestas de p29, p32 y p68 están situadas alrededor del poro de 5 pliegues. El péptido p67 se localiza en la depresión fuera del poro de 5 veces. P28 también se encuentra justo fuera de la depresión de simetría doble(Figura 10).El anticuerpo A20 se generó originalmente a partir de ratones C57BL/6. Se identificaron dos péptidos (p28 y p67) seleccionados para la interferencia de A20 en el grupo de péptidos (p28, p32 y p67) de ratones C57BL/6, lo que respalda la validez de este enfoque. Estos resultados preliminares demuestran la capacidad de los péptidos de AAV V<r>para inhibir la actividad de Nab como señuelos.
Exploración de proteínas de fusión de albúmina para mejorar aún más la transducción hepática de AAV.Los datos preliminares y resultados clínicos indican que la presentación del antígeno de la cápside de a Av depende de la dosis y que una dosis más baja de vectores de AAV reduce la presentación general del antígeno. Por lo tanto, es razonable explorar estrategias efectivas para lograr los niveles terapéuticos necesarios mientras se usan dosis de vector más bajas. Para lograr este objetivo, se han explotado varios enfoques para mejorar la transducción hepática de AAV, incluida la utilización de diferentes serotipos, la modificación genética de las cápsides de AAV y la optimización de los casetes de vectores de AAV, así como la aplicación de agentes químicos. Sin embargo, estos enfoques cambian el tropismo de AAV (modificación de la cápside de AAV) o tienen efectos secundarios no deseados (agentes farmacológicos). Nuestro estudio preliminar ha demostrado que la albúmina sérica humana (HSA) es capaz de mejorar la transducción de AAV a través de la interacción directa con los viriones de AAV.
La albúmina ha surgido como un importante portador de proteínas para el direccionamiento de fármacos. La albúmina es la proteína plasmática más abundante (35-50 g/L de suero humano) en la circulación. La tecnología de fusión con HSA está bien establecida para mejorar la eficacia, biodisponibilidad y seguridad de los polipéptidos terapéuticamente relevantes. La tecnología ha generado proteínas de fusión de albúmina en diferentes especies, y se ha aplicado a citocinas y péptidos bioactivos. Para el direccionamiento específico de hepatocitos, se han identificado varios péptidos. Además, los péptidos que penetran en las células (CPP) se han estudiado activamente para la administración eficiente de fármacos. Los CPP son una clase de péptidos diversos, habitualmente con 5-30 aminoácidos, y a diferencia de la mayoría de los péptidos, pueden cruzar la membrana celular. Los CPP pueden transportar con éxito cargas tal como ARNip, ácidos nucleicos, agentes terapéuticos de moléculas pequeñas, proteínas, puntos cuánticos y agentes de contraste de IRM, tantoin vitrocomoin vivo.Este sistema tiene menor citotoxicidad en comparación con otros métodos de administración. Los CPP son atractivos para aplicaciones médicas, no solo por su alta capacidad de internalización, sino también por su potencial para el diseño de modificación variable. En general, los CPP se pueden clasificar ampliamente en tres tipos: (1) péptidos catiónicos de 6-12 aminoácidos de longitud que comprenden predominantemente residuos de arginina, lisina y/u ornitina; (2) péptidos hidrófobos tal como secuencias líder de factores de crecimiento secretados o citocinas; y (3) péptidos anfipáticos obtenidos mediante la unión de péptidos hidrófobos a NLS.
El secuestro endosómico y la entrada nuclear insuficiente son dos pasos limitantes para la transducción efectiva de AAV, basados en la evidencia de que se requiere la interacción directa entre la albúmina y los viriones de AAV para mejorar la transducción, suponemos que las proteínas de fusión de albúmina con péptido específico de hepatocitos y CPP mejorarán la transducción de hepatocitos de AAV al aumentar la unión específica al hígado, la endosomólisis y la entrada nuclear.
El efecto de las proteínas de fusión de albúmina en la transducción hepática de AAV.Se han identificado varios péptidos que se unen específicamente a los hepatocitos, incluida una secuencia de 33 aminoácidos (KNESSTNATNTKQWRDETKGFRDEAKRFKNTAG, SEQ ID NO: 134) dentro del dominio de varilla en espiral de la proteína de fibra de cola de fago T7 (p17), el péptido CSPI-plus (DNEKLRKPKHKKLKQPADG, SEQ ID NO: 132) de la proteína de circumsporozoito (CSP) y el péptido pre S (PLGFFPDHQLDPAFGANSNN PDWDFNP, SEQ ID NO: 133) del virus de la hepatitis B. La vía endocítica es el principal mecanismo de captación de AAV y albúmina. La albúmina queda atrapada en los endosomas después de la absorción y es degradada por enzimas específicas en el lisosoma. El pH ácido en los endosomas ayuda a la exposición a AAV de la fosfolipidasa para escapar. Por lo tanto, una de los pasos limitantes de la velocidad para lograr una transducción eficaz de AAV es facilitar el escape endosómico y garantizar la administración citosólica del vector de AAV. Se han identificado numerosos péptidos derivados de virus/bacterias/plantas o agentes tensioactivos sintéticos para este propósito. El péptido (GLFGAIa Gf IENGWEGMIDGWYG, SEQ ID n O: 135) de HA2 de la proteína HA se ha estudiado ampliamente para el escape endosómico (endosomólisis). En los sistemas biológicos, se requiere una señal de localización nuclear (NLS) para suministrar cargas macromoleculares al núcleo. El NLS popular (CGCGPKKKRKVG, SEQ ID NO: 136) de s V40 se utilizará en este estudio. El tráfico de carga bioactiva de la unión en la superficie celular al núcleo implica muchos pasos, incluida la endocitosis mediada por receptores, el escape del endosoma y la entrada nuclear.
Los péptidos (que tienen funciones en la unión de hepatocitos, la endosomólisis y la entrada nuclear, en singular o en combinación) se conjugan con HSA y se determina el efecto de las proteínas de fusión de HSA sobre la transducción de AAV en hepatocitos. Los casetes de proteína de fusión HSA son impulsados por el promotor CMV y expresan la proteína de fusión en células 293. La proteína de fusión purificada se utiliza paraelanálisis de transduccióninvitro ein vivo.Los análisisin vitroincluyen la transducción después de la incubación con la proteína de fusión en líneas celulares de hepatocitos humanos (Huh7 y HepG2) y líneas celulares no hepatocíticas (293, Hela, Cho, C2C12, MG87, etc.). Los experimentosin vivo secomponen de análisis de transducción en el hígado y otros tejidos a través de la administración sistémica, así como la transducción muscular por inyección muscular directa. Se probarán los serotipos 2 y 8 de AAV, ya que se han utilizado en ensayos clínicos para dirigirse a los hepatocitos.
Clonación de proteína de fusión de albúmina.Se utilizará un enfoque de PCR para hacer una construcción de fusión de HSA (con una etiqueta His 6) con el enlazador GGGGSGGGGSGGGAS (SEQ ID NO: 137). La secuenciación de clones se realizará para garantizar los casetes correctos.
Purificación de la proteína de fusión HSA-preS.Las construcciones de expresión pCMV-HSA o las proteínas de fusión pCMV-HSA se transfectan en células HEK293. Después de la transfección, las células se cultivan en medio de reemplazo Opti-MEM® I (Invitrogen) cada 3 días durante 3-4 veces en total. Los sobrenadantes se agrupan y las proteínas se concentran mediante precipitación con sulfato de amonio (60% de saturación) y se cargan en una columna de níquelácido nitrilotriacético (Qiagen, Hilden, Alemania) equilibrada con amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM. Después de un paso de lavado (amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 35 mM), las proteínas HSA etiquetadas con His se eluyen con amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 100 mM. Las fracciones de proteína se agrupan y se dializan contra PBS. La concentración de proteína se determina espectrofotométricamente.
Producción de vectores AAV.Todos los virus AAV recombinantes (rAAV) se generan usando el método de transfección triple estándar usando el plásmido auxiliar adenoviral XX6-80 con un plásmido de envasado (serotipos y mutantes de AAV) y un plásmido ITR (luciferasa). El vector rAAV se purifica usando un gradiente de cesio y los títulos físicos de los vectores se evalúan usando hibridación de transferencia puntual y PCR cuantitativa.
Transducción de AAV en diferentes líneas celulares.Se incubarán 1*108 partículas del vector AAV/luc con HSA o proteínas de fusión de HSA durante 2 h a 4 °C. Luego, la mezcla se adiciona a 1*105 células en medio de cultivo libre de suero durante dos días, y se detectará la expresión de luciferasa en el lisado celular.
Transducción de AAV después de la administración sistémica en ratones.Los vectores de AAV que codifican para el transgén de luciferasa se incubarán con HSA o proteínas de fusión de HSA (individuales o en combinación) o PBS durante 2 horas a 4 °C, luego la mezcla se administrará a ratones C57BL/6 mediante inyección retroorbital a la dosis de 1 x i010 partículas (5*1012/kg). En los puntos de tiempo indicados después de la inyección de AAV, se realizó imagenología de ratón y se analiza la imagenología de bioluminiscencia en el área del hígado. En la semana 2 después de la inyección, los ratones se sacrificarán para la expresión del transgén y la detección de copias del genoma de AAV en diferentes tejidos.
Transducción de AAV después de la inyección muscular en ratones.Se inyectarán 1*109 partículas de AAV/luc incubadas con HSA en los músculos de las patas traseras de los ratones. En diferentes momentos después de la inyección, se lleva a cabo la imagenología. Para cada serotipo se diseñan seis grupos: PBS, HSA y proteínas de fusión HSA (HSA-perS, HSA-HA, HSA-NLS y HSA-comb).
Cuantificación de la expresión de luciferasa en tejidos in vitro.Se recolectan varios órganos para la expresión de luciferasa que incluyen: hígado, bazo, riñón, corazón, pulmón, músculo esquelético (gastrocnemio) y cerebro. El tejido se pica y se homogeneiza en amortiguador de lisis pasiva. Los lisados de tejido se centrifugan brevemente a 10.000 rpm durante 5 minutos para extraer los residuos celulares. El sobrenadante se transfiere a placas de 96 pocillos para el análisis de la actividad de la luciferasa con un lector de placas automatizado Wallac1420 Victor 2. La concentración de proteína total en los lisados tisulares se mide utilizando el ensayo Bradford.
Distribución tisular del vector AAV.Para detectar el número de copias del genoma de AAV en diferentes tejidos, se aísla el ADN de los tejidos utilizando el kit Qiagen DNeasy Blood & Tissue. Se realiza PCR en tiempo real en cada muestra tanto para el gen de la luciferasa como para el gen de la lámina B2 de Mus musculus de ratón. Los cebadores utilizados para el gen de la Lamina B2 son: 5'-GGACCCAAGGACTACCTCAAGGG-3' (SEQ ID NO: 129) (directo) y 5'-AGGGCACCTCCATCTCGGAAAC -3' (SEQ ID NO: 130) (inverso); para la luciferasa: cebador directo: 5'-AAAAGCACTCTGATTGACAAATAC-3' (SEQ ID NO: 127) y cebador inverso: 5'-CCTTCGCTTCAAAAAATGGAAC-3' (SEQ ID NO: 128). Los genomas virales se cuantifican mediante PCR en tiempo real en un instrumento LightCycler 480. La copia del genoma se analiza mediante el software Lightcycler v.4.5 basado en los del plásmido pTR-CBA-Luciferasa utilizado en la transducción inicial y el gen endógeno.
Análisis estadísticos.Todos los datos se presentan como medias ± SEM. Compararemos los valores medios de diferentes grupos experimentales mediante una prueba t de Student de dos colas o ANOVA unidireccional. Un valor P de <0,05 se considera significativo.
El mecanismo de transducción hepática de AAV utilizando proteínas de fusión HSA.Para estudiar el mecanismo del efecto de la HSA sobre la transducción de AAV, realizaremos los siguientes experimentos: Análisis de unión de AAV, análisis de tráfico intracelular utilizando virus marcados con fluorescentes y microscopía confocal, y depuración de AAV en sangre después de la administración sistémica.
Análisis de unión a AAV.1*106 células se incubarán con el vector AAV preincubado con HSA o proteínas de fusión de HSA a 103-105 partículas/célula a 4 °C durante 1 hora y se lavarán con medio frío para remover el virus no unido. Después del lavado, se aísla el ADN genómico de AAV y se cuantifican copias del genoma/célula del vector de AAV mediante qPCR con cebadores específicos para luciferasa de luciérnaga.
Marcado con colorante fluorescente de partículas virales y proteínas de fusión de albúmina.Como se describió anteriormente, los viriones de AAV purificados o las proteínas de fusión de HSA se incubarán durante 1 hora a 4 °C en PBS con un exceso molar de diez veces de ésteres de mono N-hidroxisuccinimida (NHS) Cy5 o Cy3 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) sobre la proteína de la cápside o unidades de albúmina. Los virus o proteínas marcados se dializan para extraer los colorantes libres contra PBS que contiene 5% de sorbitol.
Inmunocitoquímica.Las células Huh7 se incuban con vectores AAV2 marcados con fluorescencia preincubados con proteínas de fusión HSA a una dosis de 10000 partículas/ célula durante un tiempo diferente (30 min, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h y 24 h). Estas células se fijan con paraformaldehído al 2% durante 15 min a TA. Después del lavado, las células se colocarán en placas en portaobjetos LabTek de 4 cámaras recubiertos previamente con L-lisina. Dos horas después, las células se permeabilizan con Triton X-100 al 0,1% en PBS a temperatura ambiente durante 5 min. Las células se lavan y se incuban con anticuerpos primarios contra LAMP (para endosoma) o Y-tubulina (para MTOC) durante 1 hora a 37°C. Después del lavado, las células se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con Cy3. Después de un lavado final, las células se montan en Vectashield (Vector Laboratories; Burlingame, CA) y se analizan con un microscopio de barrido láser confocal (Leica SP2).
Depuración sanguínea de AAV.Después de la inyección en la vena de la cola de 1X1011 partículas de AAV/luc en ratones C57BL/6, el plasma se obtiene de ratones a las 2, 6, 24 y 48 horas. El aislamiento del ADN viral del plasma se realiza utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue. Los genomas virales se cuantifican mediante PCR en tiempo real.
Se ha demostrado que la CPP mejora la transducción de AAV cuando se mezcla directamente con el vector AAV en un estudio. La transducción mejorada de AAV en hepatocitos se puede lograr utilizando proteínas de fusión de HSA de un péptido individual o combinación de tres péptidos para la incubación con AAVin vitroein vivo.La proteína de fusión de HSA conjugada con la combinación de tres péptidos tiene un efecto de mejora mucho mayor sobre la transducción de AAV que cualquier péptido individual. Las proteínas de fusión de HSA conjugadas con péptido endosomolítico o NLS o péptidos combinados también ejercen un efecto de mejora sobre la transducción de AAV en líneas celulares o tejidos no hepatocíticos. Las proteínas de fusión de HSA conjugadas con péptido endosomolítico (individualmente o en combinación) son capaces de aumentar el escape del vector AAV del endosoma y disminuir la acumulación perinuclear de AAV, que se visualiza utilizando virus marcados con colorante fluorescente y microscopía confocal. Se visualizará más virus en el núcleo cuando el vector AAV se incube con proteínas de fusión HSA conjugadas con NLS. Se detectarán más copias del genoma de AAV en el hígado cuando las proteínas de fusión de HSA se conjugan con el péptido preS de HBV; también esta proteína de fusión inducirá una eliminación sanguínea más rápida del vector de AAV después de la administración sistémica.
Investigar el efecto de las proteínas de fusión de albúmina en la presentación del antígeno de la cápside de AAV.Los datos indican que la presentación del antígeno de la cápside de AAV depende de la dosis y que una dosis más baja de vectores de AAV puede reducir la presentación general del antígeno. Otros estudios exploran diferentes estrategias para lograr los niveles terapéuticos necesarios mientras se usan dosis de vector más bajas. Estos incluyen enfoques para explotar la mejora de la transducción hepática de AAV, incluida la utilización de diferentes serotipos, la modificación genética de las cápsides de AAV y la optimización de los casetes de vectores de AAV, así como la aplicación de reactivos químicos.
Muchos virus evaden la respuesta inmunitaria humana produciendo péptidos específicos (VIPR) para interferir con la presentación del antígeno-MHC I utilizando diversos mecanismos. Dos VIPR (US6 e ICP47) han sido bien caracterizados y se pueden utilizar para este propósito específico. El producto génico US6 del citomegalovirus humano (CMVH), una proteína de membrana integral de tipo I residente en el retículo endoplasmático (RE) de 23 kDa que se une a TAP, inhibe la translocación de péptidos y evita el ensamblaje de MHC de clase I. Se demuestra que los 20 residuos C-terminales del dominio luminal son esenciales para la inhibición de TAP. La proteína ICP47 del virus del herpes simple (VHS)-1 se une específicamente a TAP, bloqueando así la unión a péptidos, la translocación por TAP y la posterior carga de péptidos en moléculas MHC de clase I en el RE. Se descubrió que un fragmento corto de 32 residuos de aminoácidos, ICP47 (aa3-34), era la región mínima que albergaba la capacidad de inhibir la unión del péptido a TAP Los resultados demuestran que la presentación de antígenos se inhibióin vitrocon la suplementación de ICP47 y US6.
El efecto del tratamiento con albúmina en la presentación del antígeno de la cápside de AAV in vivo.Para estudiar la presentación del antígeno de la cápside, utilizaremos nuestros virus modificados de forma genética con la integración del péptido OVA SIINFEKL en HIloop (AAV2/OVA y AAV8/OVA) para realizar estos estudios en líneas celulares de hepatocitos HepG2/K2b y después de la administración sistémica en ratones, incluida la respuesta a la dosis y la cinética.
Análisis de presentación de antígenos en células HepG2/H2kb.Se incuban 1*109 partículas del vector AAV/OVA con HSA durante 2 horas a 4 °C y luego se usan para infectar 1*105 células HepG2/H2kb. 24 h después, se adicionarán 1*106 células de bazo de ratones OT-1 a células HepG2 durante la noche. Las células se cosecharán y se teñirán con CD8 y CD69 para la detección de la activación temprana de las células T
Experimentos en animales para la cinética de la presentación de antígenos a partir de cápsides vacías de AAV.Se diseñarán siete grupos de experimentos: HSA, HSA/preS, HSA/HA2, HSA/NSL, HSA/comb, tratamiento con vehículo -PBS y sin AAV como control negativo. Los vectores de AAV (1*1011 partículas) se incuban con HSA o proteínas de fusión, luego se administran a ratones C57BL mediante inyección en la vena de la cola. En diferentes puntos de tiempo (días 3, 21, 41 y 61 después de la administración de AAV), se transfundirán 5*106 células de bazo OT-1 marcadas con CFSE en estos ratones tratados mediante administración IV. Diez días después de la infusión de células OT-1, se sacrificarán los ratones y se analizará la proliferación de células CD8 OT-1.
Experimentos en animales para la dosis-respuesta de la presentación del antígeno de la cápside de AAV a partir de cápsides vacías de AAV.Las dosis crecientes de partículas de AAV (108, 109, 1010, 1011 y 1012) incubadas con HSA o proteínas de fusión se inyectarán en ratones C57BL a través de la vena de la cola. Tres días después, las células OT-1 marcadas con CFSE se infundirán para un ensayo de proliferación de CD8 de OT-1. Se asignarán seis grupos de ratones (0, 108, 109, 1010, 1011 y 1012 de partículas de AAV).
Albúmina fusionada con VIPR en la presentación del antígeno de la cápside.SE usará US6 para hacer proteínas de fusión con HSA (HSA-US6) y HSA-comb (HSA-comb-US6). El efecto de las proteínas de fusión US6 sobre la expresión transgénica y la presentación del antígeno de la cápside se estudiaráin vitroein vivocomo se describe en la presente.
Experimentos con ratones.Para la expresión transgénica, se diseñarán cuatro grupos (HSA, HSA-US6, HSA-comb, HSA-comb-US6). Para la cinética de presentación del antígeno, se asignarán 6 grupos (control, PBS, HSA, HSA-US6, HSA-comb, HSA-comb-US6). Para la dosis-respuesta de la presentación del antígeno, se estudiarán 6 dosis (0, 108, 109, 1010, 1011, 1012 partículas/ratón).
El inhibidor del proteasoma bortezomib a una dosis alta tiene una doble función: aumento de la transducción de AAV y disminución de la presentación de antígenos. Sin embargo, cuando se usa una dosis relativamente baja, la transducción de AAV aumenta o no cambia, pero la presentación del antígeno aumenta. Nuestro estudio previo ha demostrado que la presentación efectiva del antígeno de la cápside de AAV requiere el escape del virus de los endosomas al citosol para la ubiquitinación y la degradación por el proteasoma. Esto permite que más virus escapen de los endosomas y viajen al núcleo rápidamente cuando se incuban con HSA o proteínas de fusión, con el resultado de que la HSA o sus proteínas de fusión aumentarán la presentación del antígeno de la cápsidein vitroy en un período de tiempo temprano después de la administración sistémica de AAV en ratones. Los virus unidos a proteínas de fusión de HSA con péptidos endosomolíticos y NLS pueden moverse hacia el núcleo más rápido, por lo que la eficiencia de la presentación del antígeno de la cápside debe ser menor o indetectable a partir de la transducción del virus unido a h Saen puntos de tiempo posteriores in vivo.
Estudio del efecto de las proteínas de fusión de albúmina en el escape de AAVNab.En la población humana general, más del 95% de los sujetos están infectados naturalmente por virus AAV y la mitad de ellos generan anticuerpos neutralizantes, lo que puede excluir a estos sujetos de la terapia génica beneficiosa de AAV. Esto afecta particularmente a los pacientes con trastornos hepáticos, que necesitan la administración sistémica de vectores AAV para dirigirse al hígado. Lo que se busca principalmente son vectores AAV con la capacidad de evadir Nab humanos y conferir tropismo hepático humano. Se han explotado varios enfoques para superar los Nab de AAV, incluido el enmascaramiento de la superficie de AAV con polímeros recubiertos, el desarrollo de mutantes de AAV con una biblioteca de barajado de AAV en presencia de Nab, así como el uso de serotipos alternativos de AAV, mutantes de AAV generados a partir de la mutación racional del dominio de unión a Nab en la superficie de la cápside de AAV, la aféresis plasmática, el anticuerpo anti-CD20 (Rituximab) para reducir las células B y el exceso de cápsides de AAV vacías como señuelos para los Nab. Estos enfoques cambian el tropismo de AAV, tardan mucho tiempo o tienen una baja eficiencia u otros efectos secundarios negativos (deficiencia de Ig, aumento de la carga de antígeno de la cápside). El enfoque ideal sería tener la capacidad de escapar de Nab sin cambios en el tropismo hepático y efectos secundarios graves. Aunque la interacción directa de HSA con AAV mejora la transducción de AAV, las ubicaciones de los sitios de unión de HSA en los viriones de AAV siguen siendo desconocidas. Es posible que los sitios de unión de HSA en la superficie del virión de AAV sean los que AAV utiliza para la unión efectiva y la transducción efectiva. En otras palabras, los sitios de unión a HSA también son diana de los Nab. Para explorar el papel de la albúmina y sus proteínas de fusión en el bloqueo de la función de Nab, estudiaremos si HSA rescata la transducción de AAV en presencia de Nab. La superficie de AAV tiene 9 regiones variables (VR) que desempeñan un papel para la transducción de AAV y la unión de Nab. Se supone que un vector AAV es capaz de escapar de la unión a Nab si se utilizan péptidos de 9 VR como señuelos. Esto es similar a una aplicación virion vacía. Se realizaron experimentos para determinar si HAS o sus proteínas de fusión afectan la transducción de AAV en hepatocitos en presencia de Nab. El efecto de la HSA y las proteínas de fusión se prueba sobre la actividad neutralizante del anticuerpo monoclonal A20. A continuación, se examina el efecto de HSA y sus proteínas de fusión sobre la transducción de AAV en presencia de sueros de ratón inmunizado con AAV y humano con Nab positivo que incluye IVIG.
El efecto de la albúmina y sus proteínas de fusión sobre el escape de Nab.Para estudiar si la albúmina o las proteínas de fusión de albúmina interfieren con la actividad de Nab, los virus AAV2/luc se incuban con HSA o proteínas de fusión de HSA, y luego se adiciona Nab (A20, suero de ratón inmunizado con AAV y suero humano o IVIG) para el ensayo de actividad neutralizante.
Ensayo de anticuerpos neutralizantes en células Huh7.Se incuban 1*108 partículas de vector AAV2/luc en 10 ul con 10 ul de HSA o HSA-preS o PBS durante 2 horas a 4 °C, luego se adiciona 20 ul de A20 o sueros de ratón o humano en diluciones en serie durante otras 2 horas a 4 °C. La mezcla de AAV, HSA y Nab se cocultiva con 1*105 células Huh en medio libre de suero durante 48 h. El lisado celular se utilizará para medir la actividad de la luciferasa. Los títulos de Nab se definen como la dilución más alta para la cual la actividad de luciferasa es 50% menor que los controles.
Inmunización en ratones.1*1010 partículas de AAV2/luciferasa (AAV/luc) se inyectan por vía intraperitoneal en ratones C57BL/C, y los ratones se refuerzan con el mismo virus el día 14. Los sueros sanguíneos se recolectan a través del plexo retroorbital en los puntos de tiempo indicados para los ensayos de NAb.
IgIV humana y plasma.10% de IglV humana (Gamunex-c) se compra de Grifols Therapeutics Inc. (Research Triangle Park, NC). El suero humano individual se adquiere de Valley Biomedical (Minchester, VA). La IgIV humana y el suero se dividen en alícuotas y se almacenan a -80 °C para su uso futuro.
El efecto de la albúmina fusionada con AAV VR en el escape de Nab.Hay 9 VR en la superficie del virión de AAV. Las proteínas de fusión de HSA se construyen con cada péptido de VR individual y la combinación de péptidos de los 9 VR. Después de la purificación de las proteínas de fusión de HSA, se prueba el efecto sobre la transducción de AAV en células Huh7 y en hígado de ratón para verificar si la incubación de las proteínas de fusión de HSA con el péptido VR de AAV afecta la transducción de AAV. A continuación, se estudia el efecto de estas proteínas de fusión HSA para determinar su efecto sobre la transducción de AAV en presencia de Nab de ratón y humano en células Huh 7.
Experimentos con ratones.Para estudiar el efecto de la proteína de fusión HSA con AAV2 VR sobre la transducción de AAV, se incuban 1*1010 partículas de AAV2/luc con proteínas de fusión HSA o HSA-VR durante 2 h a 4 °C y luego se administran a ratones mediante inyección retroorbital. En diferentes momentos, se tomarán y analizarán la imagenología. Se diseñarán 12 grupos: PBS, HSA, 9 HSA-VR (de individual) y HSA-VR (de la combinación de 9 VR).
El efecto de la proteína de fusión de albúmina con CPPy VR en el escape de Nab.Con base en los estudios descritos en la presente, se muestra que la proteína de fusión de albúmina HSA-comb con ligando específico de hepatocitos y CPP anfipático induce una mayor transducción de hepatocitos de AAV que cualquier proteína de fusión con CPP individual, y las HSA-VR (que contienen 9 VR) poseen una inhibición más fuerte en la actividad de Nab que cualquier HSA-VR individual. El efecto de la proteína de fusión de albúmina HSA-Comb-VR (que se compone de HAS y péptidos de CPP y 9 AAV2 VR) se prueba luego en la transducción de hepatocitos como se describe en la presente y la capacidad de evasión de Nab.
Experimentos con ratones.Para la expresión transgénica, se asignarán 4 grupos (PBS, HSA-comb, HSA-VR y HSA-comb-VR). Los vectores AAV2/luc se incuban con HSA-comb-VR durante 2 horas a 4 °C y luego se administran a ratones. Se toma y analiza la imagen del ratón.
Se ha demostrado que los Nab de AAV se unen a las regiones comunes en la superficie del virión de AAV y diferentes Nab reconocen diferentes epítopos. Con base en esta prueba, se realiza en el entendimiento de que la HSA puede compartir algunos sitios de unión con Nab de algunas muestras de suero, lo que sugiere que la incubación de HSA con AAV2 bloqueará la actividad de Nab. Dado que las RV desempeñan un papel importante para la transducción efectiva de AAV que implica la unión a AAV, el tráfico intracelular, etc., y un estudio de escaneo de péptidos ha demostrado que los péptidos derivados de las RV de AAV son capaces de bloquear la actividad de Nab, anticipamos que las proteínas de fusión B SA con péptidos de las RV de AAV como señuelo inhibirán la actividad de Nab en la transducción de AAV.
El objetivo general de estos estudios es explorar la aplicación de la albúmina humana en la administración de genes de AAV, incluida la transducción mejorada de AAV, la deleción de la presentación del antígeno de la cápside de AAV y el bloqueo del reconocimiento de anticuerpos neutralizantes de AAV, que es fundamental para aplicaciones más amplias en defectos de la síntesis de proteínas hepáticas. Estos estudios preliminares y las contribuciones continuas al desarrollo de vectores AAV respaldan el diseño experimental general.
Ejemplo 7:(Ejemplo de referencia) El efecto de IVIG en la transducción de AAV
Es bien sabido que la inmunoglobulina de sueros inmunizados con AAV tiene actividad neutralizante en la transducción de AAV. En nuestros estudios, cuando se utilizó IVIG humana como fuente para el análisis de anticuerpos neutralizantes de AAV, en realidad demostramos que se detectó un efecto neutralizante cuando se utilizó una alta concentración de IVIG, sin embargo, cuando se aplicó la dosis más baja de IVIG, la expresión transgénica mejorada se observó en el hígado después de la administración sistémica (Figura 41). El resultado indica que la inmunoglobulina no neutralizante aumenta la transducción de AAV.
Ejemplo 8:(Ejemplo de referencia) Aplicación del vector de virus adenoasociado poliploide para la mejora de la transducción y la evasión de anticuerpos neutralizantes
Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se han utilizado con éxito en ensayos clínicos en pacientes con hemofilia y ceguera. La exploración de estrategias efectivas para mejorar la transducción de AAV y escapar de la actividad de anticuerpos neutralizantes sigue siendo imperativa. Estudios previos han demostrado la compatibilidad de las cápsides de los serotipos de AAV y los sitios de reconocimiento de AAV Nab ubicados en diferentes subunidades de la cápside de un virión. En este estudio, cotransfectamos plásmidos auxiliares AAV2 y AAV8 en diferentes proporciones (3:1, 1: 1 y 1:3) para ensamblar cápsides haploides y estudiar su transducción y actividad de escape de Nab. El rendimiento del virus haploide fue similar al de los parentales y la capacidad de unión al sulfato de heparina se correlacionó positivamente con la entrada de la cápside de AAV2. Después de la inyección muscular, todos los virus haploides indujeron una mayor transducción que los vectores AAV parentales (de 2 a 9 veces más que AAV2), siendo el más alto de estos el vector haploide AAV2/8 1:3. Después de la administración sistémica, se observó una transducción 4 veces mayor en el hígado con AAV2/8 haploide 1:3 que con AAV8 solo. Es importante destacar que se envasa el casete del factor IX terapéutico en cápsides haploides AAV2/8 1:3 y las inyectamos en ratones knockout FIX a través de la vena de la cola. Se logró una mayor expresión de FIX y una mejor corrección fenotípica con el vector de virus haploide AAV2/8 1:3 en comparación con el de AAV8. Además, el virus haploide AAV2/8 1:3 pudo escapar de la neutralización de AAV2 y tuvo una reactividad cruzada de Nab muy baja con AAV2.
Para mejorar la capacidad de evasión de Nab del virus poliploide, produjimos el vector triploide AAV2/8/9 mediante la cotransfección de los plásmidos auxiliares AAV2, AAV8 y AAV9 en una proporción de 1:1:1. Después de la administración sistémica, se observó una transducción 2 veces mayor en el hígado con el vector triploide AAV2/8/9 que con AAV8. El análisis de anticuerpos neutralizantes demostró que el vector AAV2/8/9 fue capaz de escapar de la actividad de anticuerpos neutralizantes de sueros de ratón inmunizados con serotipos parentales. Estos resultados indican que el virus poliploide podría potencialmente adquirir ventaja de los serotipos parentales para la mejora de la transducción y la evasión del reconocimiento de Nab. Esta estrategia debe explorarse en futuros ensayos clínicos en pacientes con anticuerpos neutralizantes positivos.
El número de plásmidos auxiliares con diferentes genes cap no está limitado y puede mezclarse y envasarse en función de los requisitos específicos de un régimen de tratamiento particular.
Líneas celulares.Las células HEK293, las células Huh7 y las células C2C12 se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5% en medio de Eagle modificado de Dulbecco con suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina al 10%.
Producción de virus AAV recombinante.El AAV recombinante se produjo mediante un sistema de transfección de triple plásmido. Se transfectó una placa de 15 cm de células HEK293 con 9 |jg del plásmido transgénico de AAV pTR/CBA-Luc, 12 jg del plásmido auxiliar de AAV y 15 jg del plásmido auxiliar de Ad XX680. Para generar viriones AAV2/8 triploides, la cantidad de cada plásmido auxiliar para AAV2 o AAV8 transfectado se cotransfectó en tres proporciones diferentes de 1:1, 1:3 y 3:1. Para hacer vectores haploides AAV2/8/9, la proporción de plásmido auxiliar para cada serotipo fue 1:1:1. Sesenta horas después de la transfección, se recolectaron y lisaron las células HEK293. El sobrenadante se sometió a ultracentrifugación en gradiente de CsCl. El título de virus se determinó mediante PCR cuantitativa.
Transferencia Western e inmunotransferencia.De acuerdo con el título de virus, se cargó la misma cantidad de viriones en cada carril, seguido de electroforesis en un gel de poliacrilamida Bis-Tris NuPage al 4-10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y luego se transfirió a una membrana de PVDF atravésdel sistema de transferencia en seco iBlot® 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La membrana se incubó con el anticuerpo B1 específico para las proteínas de la cápside de AAV.
Se llevó a cabo un ensayo de inmunotransferencia nativa como se describió anteriormente. En resumen, las cápsides purificadas se transfirieron a una membrana Hybond-ECL (Amersham, Piscataway, NJ) mediante el uso de un punto secante al vacío. Las membranas se bloquearon durante 1 h en PBS de leche al 10% y luego se incubaron con el anticuerpo monoclonal A20 o ADK8. Las membranas se incubaron con un anticuerpo anti-ratón de cabra acoplado a peroxidasa durante 1 hora. Las proteínas se visualizaron mediante Amersham Imager 600 (GE Healthcare Biosciences, Pittsburg, PA).
Ensayo de transducción in vitro.Las células Huh7 y C2C12 se transdujeron mediante virus recombinantes con 1 * 104 vg/célula en una placa de 24 pocillos de fondo plano. Cuarenta y ocho horas después, las células se recolectaron y evaluaron mediante un sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI).
Ensayos de inhibición de heparina.Se evaluó la capacidad de la heparina soluble para inhibir la unión de virus recombinantes a células Huh7 o C2C12. En resumen, AAV2, AAV8, virus haploides AAV2/8 1: 1, AAV2/8 1:3 y AAV2/83:1 se incubaron en DMEM en presencia o ausencia de HS soluble durante 1 Hat 37°C. Después de la preincubación, la mezcla de virus recombinantes y HS soluble se adicionó a las células Huh7 o C2C12. A las 48 h posteriores a la transducción, las células se cosecharon y se evaluaron mediante ensayo de luciferasa.
Estudio en animales.Los experimentos con animales realizados en este estudio se realizaron con ratones C57BL/6 y ratones FIX-/-. Los ratones se mantuvieron de acuerdo con las pautas de los NIH, según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UNC (IACUC). Se inyectaron ratones hembra C57BL/6 de seis semanas de edad con 3 * 1010 vg de virus recombinantesmedianteinyección retroorbital. Se obtuvieron imágenes de la expresión de luciferasa una semana después de la inyección utilizando un Xenogen IVIS Lumina (Caliper Lifesciences, Waltham, MA) después de la inyección i.p. de sustrato de D-luciferina (Nanolight Pinetop, AZ). Las imágenes bioluminiscentes se analizaron utilizando Living Image (PerkinElmer, Waltham, MA). Para la transducción muscular, se inyectaron 1 * 1010 partículas de AAV/Luc en el gastrocnemio de hembras C57BL/6 de 6 semanas de edad. Se tomaron imágenes de los ratones en los puntos de tiempo indicados.
Los ratones macho knockout FIX (ratones FIX KO) recibieron 1 * 1010 vgmedianteinyección en la vena de la cola. En varios momentos después de la inyección, se recolectó sangre del plexo retroorbital. En la semana 6, se realizó el análisis de sangrado del ratón.
Cuantificación de la expresión de luciferasa en el hígado Los animales utilizados para los estudios de imagenología se sacrificaron en la semana 4 después de la inyección del virus recombinante, y se recolectaron los hígados. Los hígados se picaron y homogeneizaron en amortiguador de lisis pasiva. Después de centrifugar los lisados hepáticos, se detectó la actividad luciferasa en el sobrenadante. La concentración de proteína total en los lisados tisulares se midió utilizando el ensayo Bradford (BioRad, Hercules, CA).
Detección del número de copias del genoma de AAV en el hígado.Los hígados picados se trataron con proteasa K. El ADN del genoma total se aisló con el mini kit de ADN genómico PureLink (Invitrogen, Carlsbad, CA). El gen de la luciferasa se detectó mediante ensayo de qPCR. El gen laminar de ratón sirvió como control interno.
Ensayos de expresión, función y tiempo de sangrado de cola de FIX humano.La expresión de FIX humano, el ensayo de actividad de hFIX de una etapa y el ensayo de tiempo de sangrado de la cola se realizaron como se describió anteriormente. Ensayo de neutralización Se sembraron células Huh7 en una placa de 48 pocillos a una densidad de 105 células para cada pocillo. Se incubaron diluciones dobles del anticuerpo de ratón con AAV-Luc (1*108 vg) durante 1 h a 37 °C. La mezcla se adicionó a las células y se incubó durante 48 horas a 37 °C. Las células se lisaron con amortiguador de lisis pasiva (Promega, Madison, WI) y se midió la actividad luciferasa. Los títulos de Nab se definieron como la dilución más alta para la cual la actividad de luciferasa fue 50% menor que los controles sin suero.
Análisis estadístico.Los datos se presentaron como media ± SD. Se utilizó la pruebatde Student para realizar todos los análisis estadísticos. Los valores de P < 0,05 se consideraron una diferencia estadísticamente significativa.
Caracterización de virus haploides in vitro.Nuestro estudio previo ha demostrado la compatibilidad de la cápside entre las cápsides de AAV1, 2, 3 y 5. Los virus haploides se produjeron mediante transfección de plásmidos auxiliares de AAV de dos serotipos a diferentes proporciones con el transgén de AAV y adenovirus auxiliar pXX6-80. La transducción mejorada del virus haploide se observó en algunas líneas celulares en comparación con los vectores parentales. El AAV2 está bien caracterizado por su biología y como vehículo de suministro de genes y el AAV8 ha atraído mucha atención debido a la alta transducción en el hígado de ratón. Ambos serotipos se han utilizado en varios ensayos clínicos en pacientes con hemofilia. Para investigar la posibilidad de que la cápside del serotipo 2 y 8 de AAV forme virus haploide y su perfil de transducción, se transfectaron los plásmidos auxiliares de AAV2 y AAV8 en las proporciones de 3:1, 1:1 y 1:3 para formar vectores haploides. Todos los virus haploides se purificaron usando gradiente de cesio y se titularon mediante Q-PCR. No hubo diferencias significativas en el rendimiento del virus entre los virus haploides y los AAV2 o AAV8 parentales. Para determinar si se expresaban las proteínas de la cápside de los virus haploides, se realizó un análisis de transferencia Western en genomas de virus equivalentes de virus haploides purificados utilizando el anticuerpo monoclonal B1 que reconoce las proteínas de la cápside de AAV2 y AAV8. En todos los virus haploides, se observó la mezcla de cápsides VP2 de AAV2 y AAV8, la intensidad de la cápside VP2 de AAV2 o AAV8 en virus haploides se relacionó con la proporción de dos plásmidos auxiliares. Estos resultados sugirieron que las cápsides de AAV 2 y AAV8 eran compatibles y capaces de ensamblarse en viriones de AAV.
Para determinar si el tropismo del virus haploide se cambió mediante la mezcla de las proteínas de la cápside, se analizó la eficacia de transducción de los virus haploides mediante la transducción de las líneas celulares Huh7 humana y C2Cl2 de ratón. La eficiencia de transducción de AAV8 fue mucho menor que la de AAV2 en ambas líneas celulares. La transducción de todos los vectores haploides fue mayor que la de AAV8, y la eficiencia se correlacionó positivamente con la adición de la cápside de AAV2 en ambas líneas celulares. Aunque la transducción del vector haploide fue menor que AAV2 en células Huh7, el vector haploide AAV2/83:1 indujo una transducción 3 veces mayor que AAV2 en células C2C12.
Estos datos de transducciónin vitrorespaldan que la preparación de virus está compuesta por vectores haploides pero no por la mezcla de vectores de serotipo individuales e indican que el vector haploide puede mejorar la transducción de AAV. El proteoglicano de sulfato de heparina se ha identificado como el receptor primario de AAV2. A continuación, investigamos si la inhibición de la capacidad de unión a la heparina cambiaba la transducción de los virus haploides. La preincubación de vectores de AAV con heparina soluble bloqueó la transducción de AAV2 en casi un 100% en células Huh7 y C2C12, y bloqueó la transducción de AAV8 en un 37% y 56% en células Huh7 y C2C12, respectivamente. La inhibición de la transducción del vector haploide por la heparina soluble dependió de la entrada de la cápside de AAV2 en ambas líneas celulares. Se observó una mayor inhibición de la transducción con más entrada de la cápside de AAV2. Este resultado sugiere que los virus haploides pueden usar ambos receptores primarios de vectores parentales para una transducción eficaz.
Aumento de la transducción muscular de virus haploides.Como se describió anteriormente, la eficiencia de transducción del virus haploide AAV2/8 3:1 es mayor que la de AAV2 y AAV8 en la línea celular muscular C2C12. A continuación, estudiamos si la alta transducciónin vitrose traducía en tejidos musculares de ratón. Los vectores haploides y parentales AAV2/8 se inyectaron directamente en el músculo de las patas traseras en ratones C57BL/6. Como controles, también se investigaron las mezclas de virus AAV2 y AAV8 en las proporciones de 3:1, 1: 1 y 1:3. Para una comparación conveniente, una pata se inyectó con AAV2 y la otra con el vector probado. Se administró un vector total de * 1010 vg para cada virus. En comparación con AAV2, se logró una transducción muscular similar para AAV8. Contrariamente al resultado en las células C2C12, se observó una mayor transducción muscular de todos los virus haploides.
Los vectores haploides AAV2/81:1 y AAV2/81:3 lograron una transducción 4 y 2 veces mayor que AAV2, respectivamente. En particular, la transducción muscular del vector haploide AAV2/8 3:1 fue más de 6 veces mayor que la de AAV2. Sin embargo, todos los virus de la mezcla tuvieron eficiencias de transducción similares a AAV2. Estos resultados sugieren que el virus haploide es capaz de aumentar la transducción muscular y respalda además que los virus producidos a partir de la cotransfección de dos plásmidos de la cápside son haploides.
Transducción hepática mejorada de virus haploides.El AAV2 y el AAV8 se han utilizado para dirigirse al hígado en varios ensayos clínicos en pacientes con hemofilia B. También evaluamos la eficiencia de transducción de los virus haploides en el hígado de ratón. Los virus mezclados con AAV2 y AAV8 también se inyectaron como controles. Se administró una dosis de 3 * 1010 vg de vector AAV/luc en ratones C57BL a través de la vena retroorbital; la imagenología se llevó a cabo el día 3 después de la inyección de AAV. El virus haploide AAV2/8 1:3 indujo la mayor eficiencia de transducción que otros virus haploides, mixtos e incluso AAV8 parental en hígados de ratón. La eficiencia de transducción del vector haploide AAV2/8 1:3 fue aproximadamente 4 veces mayor que la de AAV8. La transducción hepática de otros virus haploides fue menor que la del vector parental AAV8 pero mayor que AAV2. El día 7 después de la inyección, los ratones se sacrificaron, se recolectaron los hígados y se aisló el ADN genómico. El número de copias del gen de la luciferasa en el hígado se determinó mediante qPCR. A diferencia del resultado para la eficiencia de transducción hepática, se encontró un número de copias del genoma del vector AAV similar en el hígado independientemente de los virus haploides o los serotipos 2 y 8 de AAV. Cuando la expresión transgénica se normalizó al número de copias génicas, consistente con la expresión transgénica en el hígado, el vector haploide AAV2/8 1:3 indujo la expresión transgénica relativa más alta que cualquier otro vector y serotipo haploide. El perfil de transducción de los virus haploides en el hígado fue diferente al de la transducción muscular, en la que todos los virus haploides indujeron una mayor expresión transgénica que la de los serotipos parentales, con lo mejor de AAV2/83:1.
Aumento de la expresión terapéutica de FIX y mejora de la corrección fenotípica hemorrágica con vector haploide en un modelo de ratón con hemofilia B.Con base en los resultados anteriores, el vector haploide AAV2/8 1:3 indujo una transducción hepática mucho mayor que AAV8. A continuación, probamos adicionalmente si el vector haploide AAV2/8 1:3 podría aumentar la expresión transgénica terapéutica en un modelo de enfermedad animal. Se utilizó FIX humano (hFIX) como gen terapéutico e inyectamos el vector haploide AAV2/8 1:3/hFIX, que codifica para el transgén FIX optimizado para humanos, e impulsado por el promotor específico del hígado, TTR, en ratones knockout (KO) de FIX a través de la vena de la cola a una dosis de 1 * 1010 vg/ratón. En las semanas 1, 2 y 4 posteriores a la inyección, la expresión de hFIX y la actividad en circulación se analizaron mediante ELISA y la actividad del factor de una etapa, respectivamente. En la semana 6, la pérdida de sangre para la función hFIXin vivose evaluó utilizando un ensayo de recorte de cola. De acuerdo con la observación de una alta transducción hepática con el vector AAV haploide en ratones C57BL/6 de tipo ancho, el vector haploide AAV2/8 1:3 dirigido al hígado produjo mucho más hFIX que el vector AAV8 después de 2 semanas después de la inyección. La mayor expresión de la proteína hFIX de AAV2/8 1:3 estuvo estrechamente relacionada con una alta actividad de FIX. La pérdida de sangre para los ratones con inyección de AAV2/8 1:3/hFIX fue similar a la de los ratones C57BL/6 de tipo silvestre y menor que la de los ratones KO. Sin embargo, los ratones tratados con AAV8 tuvieron más pérdida de sangre que los ratones de tipo silvestre. Estos datos muestran que el vector haploide AAV2/8 1:3 aumenta la expresión transgénica terapéutica del hígado y mejora la corrección fenotípica de la enfermedad.
La capacidad de los virus haploides AAV2I8 para escapar del anticuerpo neutralizante.Cada virión de virus haploide individual se compone de 60 subunidades de diferentes cápsides de serotipo de AAV. La inserción de algunas subunidades de la cápside de un serotipo en otras subunidades de la cápside de un serotipo diferente puede cambiar la estructura de la superficie del virión. Es bien sabido que la mayoría de los anticuerpos monoclonales de AAV reconocen residuos en las diferentes subunidades de un virión individual. Para estudiar si el virus haploide es capaz de escapar de los Nab generados a partir del vector parental, primero realizamos un ensayo de unión a Nab utilizando anticuerpos monoclonales mediante un ensayo de inmunotransferencia. Se adsorbieron tres diluciones de partículas que contienen genoma de virus en una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con Nab A20 o ADK8, que reconoce<a>AV2 o AAV8 intactos, respectivamente. Todos los virus haploides y virus con mezcla de AAV2 y AAV8 fueron reconocidos por el anticuerpo monoclonal ADK8 o A20. La reactividad de los virus haploides con A20 aumentó mediante la incorporación de más cápsides de AAV2 en el virión del virus haploide. Sin embargo, no hubo un cambio obvio para el reconocimiento de Nab anti-AAV8 ADK8 entre los virus haploides, independientemente de las proporciones de la cápside. En particular, la unión de AAV2/8 haploide 1:3 a A20 fue mucho más débil que las de AAV2 parental y el virus con mezcla de AAV2 y 8 en la proporción 1:3, lo que indicó que los sitios de unión a A20 se reducen en la superficie del virión haploide AAV2/8 1:3.
A continuación, analizamos el perfil inmunológico de los virus haploides contra los sueros de ratones inmunizados con AAV. Los títulos de Nab se utilizaron para evaluar la capacidad del suero para inhibir la transducción del vector. Se recolectaron sueros de ratones tratados con virus parentales en la semana 4 después de la inyección. Como se muestra en laTabla 10,los perfiles de neutralización de los virus haploides contra A20 o ADK8 fueron similares a los datos de la inmunotransferencia nativa. No hubo reactividad cruzada de Nab entre AAV8 y AAV2. Es interesante observar que los sueros de ratón inmunizados con AAV8 tenían una actividad neutralizante similar contra el virus AAV8 y todos los virus haploides, independientemente de la cantidad de incorporación de la cápside de AAV8, pero no los virus mezclados con AAV2 y AAV8. Ninguna inhibición del suero de AAV8 en la mezcla de virus puede explicarse por la transducción superior de AAV2 a AAV8 en la línea celular analizada. Sin embargo, los virus haploides escaparon parcialmente de la neutralización del suero de AAV2. La transducción de AAV2/8 haploide 1:1 obtuvo una disminución de 16 veces con respecto a AAV2 parental después de la incubación de virus y suero anti-AAV2. La capacidad de escapar del Nab sérico de AAV2 para los virus haploides fue mucho mayor que para los virus mezclados con AAV2 y AAV8. Sorprendentemente, el AAV2/8 haploide 1:3 escapó casi por completo del suero de AAV2 y la neutralización de A20, lo que sugiere que el virus haploide tiene el potencial de usarse para los individuos que tienen el Nab anti-AAV2 (Tabla 10).
Mejora de la capacidad de evasión de anticuerpos neutralizantes con un vector triploide hecho de tres serotipos.Nuestros datos descritos anteriormente demostraron que los virus AAV2/8 haploides no podían escapar de la actividad del anticuerpo neutralizante de AAV8, pero tenían la capacidad de evadir el anticuerpo neutralizante de AAV2, que dependía de la cantidad de integración de la cápside de<a>AV8. Para estudiar si el virus poliploide hecho de más cápsides de serotipos mejoró la capacidad de escape de Nab, se fabricó el virus triploide AAV2/8/9 con la proporción de 1:1:1. Después de la inyección del vector triploide AAV2/8/9 en ratones, en comparación con AAV2, el virus triploide AAV2/8/9 indujo una transducción 2 veces mayor en el hígado que AAV8. No se observaron diferencias en la transducción hepática entre AAV8 y los vectores haploides AAV2/9 y AAV8/9 en los que el vector triploide se preparó a partir de dos plásmidos auxiliares de AAV en una proporción de 1:1. Se observó que la administración sistémica de AAV9 indujo una mayor transducción hepática que AAV8. Cuando se realizó el ensayo de anticuerpos neutralizantes, el vector haploide AAV2/8/9 mejoró su capacidad de escape de Nab en aproximadamente 20 veces, 32 veces y 8 veces, respectivamente, en comparación con AAV2, 8 y 9 (Tabla 11).
En este estudio, los viriones de AAV poliploides se ensamblaron a partir de cápsides de 2 serotipos o 3 serotipos. La capacidad de unión de los virus haploides a la heparina del receptor primario de AAV2 dependió de la cantidad de entrada de la cápside de AAV2. Todos los virus haploides lograron una mayor eficacia de transducción que el vector AAV2 parental en músculo e hígado de ratón, mientras que el virus haploide AAV2/8 1:3 tuvo una mejora significativa de la transducción hepática que el vector AAV8 parental. En comparación con AAV8, la administración sistémica del virus haploide AAV2/8 1:3 para administrar FIX humano indujo una expresión de FIX mucho mayor y mejoró la corrección fenotípica de la hemofilia en ratones FIX-/-. Es importante destacar que el virus haploide AAV2/8 1:3 pudo escapar de la neutralización del suero anti-AAV2. La integración de la cápside de AAV9 en viriones haploides de AAV2/8 mejoró aún más la capacidad de escape de anticuerpos neutralizantes.
El receptor primario de AAV2 es HSPG, mientras que el receptor primario de AAV8 aún no está claro. Para estudiar si los virus haploides podrían usar receptores tanto de AAV2 como de AAV8, realizamos un ensayo de inhibición de heparina para probar la capacidad de los virus haploides para unirse al motivo del receptor de heparina. La inhibición de la heparina da como resultado, en líneas celulares Huh7 y C2C12, el apoyo de que los virus haploides utilizan el motivo del receptor de heparina de las cápsides de AAV2 para una transducción eficaz. Hasta cierto punto, AAV8 también mostró una disminución de la eficiencia de transducción en presencia de heparina, pero la eficiencia de transducción sigue siendo mayor que la de AAV2.
Uno de los aspectos más desafiantes de la transducción eficiente en los ensayos clínicos es la amplia prevalencia de anticuerpos neutralizantes contra el vector AAV. El aclaramiento mediado por Nab de los vectores de<a>A<v>se ha convertido en un factor limitado para la administración repetida de la transferencia génica de AAV. Varios estudios han explorado la modificación genética de las cápsides de AAV para la evasión de Nab mediante la mutación racional de sitios de reconocimiento de anticuerpos neutralizantes o enfoques de evolución dirigida. La mutación de la cápside puede cambiar el tropismo de AAV y la eficiencia de transducción. Además, la identificación de sitios de unión a Nab en viriones de AAV está muy por detrás de la aplicación del vector en ensayos clínicos, y es imposible determinar todos los sitios de unión a Nab a partir de sueros poli. Estudios previos han demostrado que los sitios de reconocimiento de varios anticuerpos monoclonales de AAV se hilan en las diferentes subunidades de un virión. Cuando la cápside de AAV8 se introduce en el virión de AAV2, la capacidad de unión a A20 y la actividad neutralizante de los sueros inmunizados con AAV2 disminuyeron drásticamente para los virus haploides. La integración de las cápsides de AAV2 en los viriones de AAV8 no redujo la capacidad de unirse al anticuerpo monoclonal ADK8 de AAV8 intacto y no escapó a la actividad neutralizante de los sueros anti-AAV8 (Tabla 10). Esto sugiere que todos los sitios de reconocimiento de Nab de los polisueros pueden estar ubicados en la misma subunidad del virión AAV8. Además, el resultado sugiere que las cápsides de AAV8 integradas en los viriones de AAV2 pueden desempeñar un papel importante en el tráfico intracelular del virus.
Cuando el virus triploide se elaboró a partir de cápsides de tres serotipos AAV2, 8 y 9, diferentes de los vectores triploides AAV2/8, el virus haploide AAV2/8/9 tiene la capacidad de escapar de los sueros de actividad de anticuerpos neutralizantes de los ratones inmunizados con AAV2, 8 o 9, lo que sugiere que AAV8 y AAV9 comparten la vía de transducción similar.
Varias líneas de evidencia de este estudio respaldan el ensamblaje del virión poliploide a partir de la transfección de dos o tres plásmidos auxiliares de AAV. (1) Se mostraron dos bandas de VP2 de diferentes tamaños a partir de virus haploides usando análisis de transferencia Western. Estas VP2 coinciden con el tamaño de diferentes serotipos. (2) Los perfiles de transducción fueron diferentes en las células C2C12 frente a Huh7. El vector 3:1 de AAV2/8 haploide, en particular, demostró una transducción menor que la de AAV2 en células Huh7, pero mayor en células C2C12. (3) Se demostró una mayor transducción muscular con todos los virus AAV2/8 haploides en comparación con los vectores parentales AAV2 y AAV8, así como los virus con una mezcla de AAV2 y AAV8. (4) El virus triploide AAV2/8 1:3 tenía un tropismo hepático mejorado en comparación con AAV8. (5) El patrón de unión de los virus haploides a A20 y ADK8 es diferente de los virus con una mezcla de AAV2 y AAV8. (6) El perfil de la actividad neutralizante del suero de AAV2 es diferente entre los virus haploides y los virus de mezcla. (7) El virus AAV2/8/9 triploide evade la actividad de anticuerpos neutralizantes de sueros de ratones inmunizados con cualquier serotipo parental.
Estos virus poliploides mejoran la eficiencia de la transducciónin vitro e in vivo,e incluso escapan a la neutralización de los sueros inmunizados con vectores parentales. La aplicación del virus poliploide para administrar un FIX transgénico terapéutico fue capaz de aumentar la expresión de FIX y mejorar la corrección fenotípica de la hemofilia en ratones con deficiencia de FIX. Estos resultados indican que los vectores AaV haploides tienen la capacidad de mejorar la transducción y evadir los Nab.
Ejemplo 9:Transducción de AAV mejorada a partir de vectores de AAV haploides mediante el ensamblaje de viriones de<a>A<v>con VP1/VP2deun vector de<a>A<v>y VP3 de uno alternativo
En los estudios anteriores, se ha demostrado que se ha logrado una mayor transducción de AAV utilizando vectores poliploides que se producen mediante la transfección de dos plásmidos auxiliares de AAV (AAV2 y AAV8 o AAV9) o tres plásmidos (AAV2, AAV8 y AAV9). Estos viriones vectoriales poliploides individuales pueden estar compuestos por diferentes subunidades de la cápside de diferentes serotipos. Por ejemplo, el AAV2/8 haploide, que se genera por transfección de plásmidos auxiliares de AAV2 y auxiliares de AAV8, puede tener subunidades de la cápside con diferentes combinaciones en un virión para una transducción eficaz: VP1 de A<a>V8 y VP2/VP3 de AAV2, o VP1/VP2 de AAV8 y VP3 de AAV2, o VP1 de AAV2 y VP2/VP3 de AAV8, o VP1/VP2 de AAV2 y VP3 de AAV8, o VP1 de AAV8 y VP3 de AAV2, o VP1 de AAV2 y VP3 de AAV8, o VP1/VP2/VP3 de AAV2, o VP1/VP2/VP3 de AAV8. En los siguientes estudios, encontramos que se podía lograr una transducción mejorada a partir de vectores haploides con VP1/VP2 de una cápside del vector AAV y VP3 de una alternativa.
La generación de VP1, VP2 y VP3 por diferentes serotipos de AAV ofrece dos estrategias diferentes para producir estas proteínas diferentes. Curiosamente, las proteínas VP se traducen a partir de una secuencia de nucleótidos CAP individual con secuencias superpuestas para VP1, VP2 y VP3.
El gen Cap codifica para 3 proteínas: VP1, VP2 y VP3. Como se muestra en la figura anterior, VP1 contiene las proteínas VP2 y VP3, y VP2 contiene la proteína VP3. Por lo tanto, el gen Cap tiene 3 segmentos, inicio de VP1 - inicio de VP2 -inicio de VP3 - final de las 3 proteínas VP
El solapamiento de las secuencias de nucleótidos para las proteínas VP presenta una oportunidad para generar las diferentes proteínas VP a partir de diferentes serotipos de AAV. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos contiene los nucleótidos de "A" en el primer segmento, en donde A es un primer serotipo, "B" en el segundo segmento, en donde B es un segundo serotipo que es distinto y diferente de A y "B" en el tercer segmento; la proteína VP1 resultante contendría segmentos ABB, la proteína VP2 contendría segmentos BB y VP3 contendría un segmento B. Por lo tanto, dependiendo de qué segmentos contienen qué secuencias de nucleótidos, la cápside resultante tendrá diferentes cantidades de cada proteína Cap.
En el caso de obtener los genes Cap de dos serotipos de AAV diferentes (designados como A y B), hay 6 combinaciones posibles de las tres proteínas Cap.
En el caso de obtener los genes Cap de tres serotipos de AAV diferentes (designados como A, B y C), hay 6 combinaciones posibles de las tres proteínas Cap.
Además, el gen Cap en el plásmido auxiliar se puede generar con una copia completa de la secuencia de nucleótidos para la proteína VP particular de los dos serotipos de AAV. Los genes Cap individuales generarán las proteínas VP asociadas con ese serotipo de AAV particular (designadas como A y B).
En el caso de 3 genes Cap diferentes, el plásmido auxiliar se puede generar con una copia completa de la secuencia de nucleótidos para la proteína VP particular de los tres serotipos de AAV. Los genes Cap individuales generarán las proteínas VP asociadas con ese serotipo de AAV particular (designadas como A, B y C).
<E l>vector haploide con C-terminal de VP1I VP2 de AA V8 y VP3 de AAV2 potencia la transducción de AAV.Se ha demostrado que los vectores haploides AAV2/8 en cualquier proporción de cápside de AAV2 a cápside de AAV8 indujeron una mayor transducción hepática que AAV2 o los virus con mezcla de vectores AAV2 y vectores AAV8 en la misma proporción. Para dilucidar qué subunidades de AAV en el vector haploide individual AAV2/8 contribuyen a una transducción más alta que AAV2, hicimos diferentes construcciones que expresaban VP1/VP2 de AAV8 solamente, VP3 de AAV2 solamente, VP1/VP2 quimérico (28m-2VP3) con N-terminal de AAV2 y C-terminal de AAV8, o AAV8/2 quimérico con N-terminal de AAV8 y C-terminal de AAV2 sin mutación del codón de partida de VP3. Estos plásmidos se utilizaron para producir el vectorAAVhaploide con diferentes combinaciones. Después de la inyección de 1*1010 partículas de estos vectores haploides en ratones a través de la vena retroorbital, se evaluó la eficiencia de la transducción hepática. El vector quimérico a AV82 (AAV82) indujo una transducción hepática un poco más alta que AAV2. Sin embargo, el AAV82 haploide (H-AAV82) tuvo una transducción hepática mucho mayor que el AAV2. Se observó un aumento adicional en la transducción hepática con el vector haploide 28m-2vp3. También administramos estos vectores haploides en los músculos de ratones. Para facilitar la comparación, la pata derecha se inyectó con el vector AAV2 y la pata izquierda se inyectó con el vector haploide cuando el ratón estaba boca arriba. En la semana 3 después de la inyección de AAV, se se tomó la imagenología. De acuerdo con la observación en el hígado, todos los vectores haploides y los vectores quiméricos tuvieron una mayor transducción muscular con lo mejor del vector haploide 28m-2vp3. Este resultado indica que la VP1/VP2 quimérica con N-terminal de AAV2 y C-terminal de AAV8 atribuye a una alta transducción hepática de vectores haploides de AAV82.
Aumento de la transducción hepática de AAV a partir del vector haploide con VP1IVP2 de otros serotipos y VP3 de AA V2.Se ha demostrado que el vector haploide AAV82 con VP1/VP2 de AAV8 y VP3 de AAV2 aumenta la transducción hepática como se describió anteriormente. A continuación, nos gustaría examinar si otros viriones haploides, en los que VP1/VP2 se deriva de diferentes serotipos, también aumentan la transducción. En estudios preclínicos, se ha demostrado que el AAV9 transduce eficientemente diferentes tejidos. Se ha creado un vector haploide AAV92 (H-AAV92) en el que VP1/VP2 era de AAV9 y VP3 de AAV2. Después de la administración sistémica, la imagen se realizó en la semana 1. Se logró una transducción hepática aproximadamente 4 veces mayor con H-AAV92 que con AAV2. Estos datos indican que VP1/VP2 de otros serotipos también es capaz de aumentar la transducción de AAV2.
Transducción hepática de AAV mejorada del vector haploide con VP3 del mutante de AAV2 u otros serotipos.AAV9 utiliza glicano como receptor primario para la transducción efectiva. En nuestros estudios previos, hemos injertado el sitio de unión del receptor de glicano AAV9 en AAV2 para producir AAV2G9 y encontramos que AAV2G9 tiene un tropismo hepático más alto que AAV2. Aquí hicimos el vector haploide (H-AAV82G9) en el que VP1/VP2 de AAV8 y VP3 de AAV2G9. Después de la inyección sistémica en ratones, en comparación con AAV2G9, se observó una transducción hepática más de 10 veces mayor tanto en la semana 1 como en la semana 2 después de la aplicación de H-AAV82G9. Para estudiar vectores haploides en los que VP3 de otros serotipos y VP1/VP2 de diferentes serotipos o variantes, clonamos otros constructos: AAV3 VP3 solamente, AAV rh10 VP1/VP2 solamente, y crearon diferentes vectores haploides con varias combinaciones (H-AAV83, H-AAV93 y H-AAVrh10-3). Después de la inyección sistémica en ratones, la imagenología se llevó a cabo en la semana 1. De acuerdo con los resultados obtenidos de otros vectores haploides, se logró una mayor transducción hepática con vectores haploides (H-AAV83, H-AAV93 y H-AAVrh10-3) que con AAV3. Es interesante observar que estos vectores haploides también indujeron una transducción de todo el cuerpo basada en el perfil de imagenología, que es diferente de los resultados de los vectores haploides 5 con VP3 de AAV2, que solo transdujeron el hígado de manera eficiente. Colectivamente, los vectores haploides con VP1/VP2 de un serotipo y VP3 de uno alternativo son capaces de mejorar la transducción y tal vez cambiar el tropismo.
Ejemplo 10:(Ejemplo de referencia) Los vectores de virus adenoasociados poliploides mejoran la transducción y escapan del anticuerpo neutralizante
Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se han utilizado con éxito en ensayos clínicos en pacientes con hemofilia y ceguera. Aunque la aplicación de vectores AAV ha demostrado ser segura y tener un efecto terapéutico en estos ensayos clínicos, uno de los principales desafíos es su baja infectividad que requiere una cantidad relativamente grande de genomas de virus. Además, una gran parte de la población tiene anticuerpos neutralizantes (Nab) contra los AAV en la sangre y otros fluidos corporales. La presencia de Nab plantea otro desafío importante para aplicaciones más amplias de AAV en futuros ensayos clínicos. Las estrategias efectivas para mejorar la transducción de AAV y escapar de la actividad de anticuerpos neutralizantes son muy demandadas. Estudios previos han demostrado la compatibilidad de las cápsides de los serotipos de AAV y los sitios de reconocimiento de AAV Nab ubicados en diferentes subunidades de la cápside de un virión. En este estudio, proponemos estudiar si los virus AAV poliploides producidos a partir de la cotransfección de diferentes plásmidos auxiliares de AAV tienen la capacidad de mejorar la transducción de AAV y el escape de Nab. Se cotransfectaron plásmidos auxiliares AAV2 y AAV8 en diferentes proporciones (3:1, 1:1 y 1:3) para ensamblar cápsides haploides. El rendimiento del virus haploide fue similar al de los parentales, lo que sugiere que estas dos cápsides de AAV eran compatibles. En las líneas celulares Huh7 y C2Cl2, la eficiencia de transducción de AAV8 fue mucho menor que la de AAV2; sin embargo, la transducción de todos los vectores haploides fue mayor que la de AAV8. La eficiencia de transducción y la capacidad de unión al sulfato de heparina para los vectores haploides se correlacionaron positivamente con la cantidad de cápside de AAV2 integrada. Estos resultados indican que los vectores de virus haploides conservan sus propiedades de virus parentales y aprovechan los vectores parentales para mejorar la transducción. Después de la inyección muscular, todos los virus haploides indujeron una mayor transducción que los vectores AAV parentales (de 2 a 9 veces más que AAV2), siendo el más alto de estos el vector haploide AAV2/83:1.
Después de la administración sistémica, se observó una transducción 4 veces mayor en el hígado con el vector haploide AAV2/8 1:3 que con LOS AAV solos. Es importante destacar que se envasa el casete del factor IX terapéutico en las cápsides 1:3 del vector haploide AAV2/8 y las inyectamos en ratones knockout FIX a través de la vena de la cola. Se logró una mayor expresión de FIX y una mejor corrección fenotípica con el vector haploide AAV2/8 vector de virus 1:3 en comparación con el de LOS AAV. Sorprendentemente, el virus haploide AAV2/8 1:3 pudo escapar de la neutralización de AAV2 y tuvo una reactividad cruzada de Nab muy baja con AAV2. Pero el anticuerpo neutralizante de AAV puede inhibir la transducción del vector haploide AAV2/8 con la misma eficiencia que AAV8. A continuación, produjimos el vector triploide AAV2/8/9 mediante la cotransfección de los plásmidos auxiliares AAV2, AAV8 y AAV9 en una proporción de 1:1:1. Después de la administración sistémica, se observó una transducción 2 veces mayor en el hígado con el vector triploide AAV2/8/9 que con AAV8. El análisis de anticuerpos neutralizantes demostró que el vector AAV2/8/9 fue capaz de escapar de la actividad de anticuerpos neutralizantes de sueros de ratón inmunizados con el serotipo parental, diferente del vector triploide AAV2/8. Los resultados indican que el virus poliploide podría potencialmente adquirir ventaja de los serotipos parentales para la mejora de la transducción y tiene la capacidad de evadir el reconocimiento de Nab. Esta estrategia debe explorarse en futuros ensayos clínicos en pacientes con anticuerpos neutralizantes positivos.
Ejemplo 11:(Ejemplo de referencia) La sustitución de subunidades de la cápside de AAV mejora la transducción y escapa del anticuerpo neutralizante
El efecto terapéutico se ha logrado en ensayos clínicos en pacientes con enfermedades de la sangre y trastornos ciegos utilizando el vector del virus adenoasociado (AAV). Sin embargo, dos preocupaciones restringen la ampliación de la aplicación del vector AAV: Células T citotóxicas (CTL) específicas de la cápside de AAV y anticuerpos neutralizantes (Nab). La mejora de la transducción de AAV con dosis bajas de vector de AAV disminuirá potencialmente la carga de antígeno de la cápside y, con suerte, extirpará el aclaramiento mediado por CTL de la cápside de las células diana transducidas con AAV sin comprometer la expresión transgénica. Actualmente, se han explorado 12 serotipos y más de 100 variantes o mutantes para la administración de genes debido a su diferente tropismo tisular y eficiencia de transducción. Se ha demostrado que existe compatibilidad de la cápside entre los serotipos de AAV, y la integración de aminoácidos específicos de un serotipo en otra cápside de AAV mejora la transducción de AAV. Al aprovechar los diferentes mecanismos para la transducción efectiva de AAV de diferentes serotipos, se logró una mayor transducción de AAV utilizando virus mosaico en el que las subunidades de la cápside de a Av se derivan de diferentes serotiposin vitroein vivo.Los estudios estructurales recientes sobre la interacción de vectores de AAV con anticuerpos neutralizantes monoclonales demostraron que Nab se une a residuos en varias subunidades diferentes de una superficie de virión, lo que sugiere que el cambio del ensamblaje de subunidades del virión de AAV puede extirpar el sitio de unión de Nab de AAV y luego escapar de la actividad de Nab. Hemos demostrado que el vector mosaico AAV es capaz de evadir la actividad de Nab. Estos resultados indican que la sustitución de subunidades de la cápside de AAV tiene el potencial de mejorar la transducción de AAV y la capacidad de neutralizar la evasión de anticuerpos.
El vector del virus adenoasociado (AAV) se ha aplicado con éxito en ensayos clínicos en pacientes con enfermedades de la sangre y trastornos ciegos. Dos preocupaciones restringen la amplia aplicación del vector AAV: La respuesta de las células T citotóxicas (CTL) específicas de la cápside de AAV mediaba la eliminación de las células diana transducidas con AAV y el bloqueo de la transducción de AAV mediado por anticuerpos neutralizantes (Nab). Se ha demostrado que la presentación del antígeno de la cápside depende de la dosis, lo que indica que la mejora de la transducción de AAV con dosis bajas de vector de AAV disminuirá potencialmente la carga de antígeno de la cápside y, con suerte, extirpará el aclaramiento mediado por CTL de la cápside de las células diana transducidas con AAV sin comprometer la expresión transgénica. Se han explorado varios enfoques para este propósito, que incluyen: optimización del casete transgénico, modificación de la cápside de AAV e interferencia del tráfico de AAV con agentes farmacológicos. La modificación de la cápside de AAV puede cambiar el tropismo de AAV; especialmente la eficiencia de transducción de AAV es desconocida en los tejidos humanos. Aunque se han realizado varios ensayos clínicos, el vector AAV se eligió empíricamente en función de la observación de modelos animales. Los reactivos farmacológicos para mejorar la transducción de AAV generalmente tienen efectos secundarios no deseados. Es imperativo desarrollar estrategias ideales para mejorar la transducción de AAV, pero sin cambiar su tropismo por la modificación de las cápsides y sin efectos secundarios del tratamiento farmacológico. Actualmente, hay 12 serotipos y más de 100 variantes o mutantes que se han explorado para la administración de genes. La transducción efectiva de AAV implica los siguientes pasos que incluyen: unión a la superficie de la célula diana a través de receptores y correceptores, endocitosis en endosomas, escape de endosomas, entrada nuclear, desrecubrimiento del virión de<a>A<v>seguido de expresión transgénica. Para diseñar racionalmente nuevos vectores AAV para mejorar la transducción, hemos desarrollado virus quiméricos: AAV2.5 (en el que el mutante de AAV2 con sustitución de 5 aa de AAV1) y AAV2G9 (en el que el receptor de galactosa de AAV9 se injerta en la cápside de AAV2). Ambos mutantes quiméricos inducen una transducción mucho mayor que AAV2 en músculo e hígado de ratón, respectivamente. Estas observaciones indican que estos virus quiméricos pueden usar propiedades de ambos serotipos de AAV para mejorar la transducción (por ejemplo, AAV2G9 usa dos receptores primarios: heparina y galactosa para una unión eficaz a la superficie celular). Con base en la compatibilidad entre las subunidades de la cápside de diferentes serotipos de AAV para el ensamblaje del virus y nuestros resultados preliminares, que demostraron que la integración de aminoácidos específicos de otros serotipos (1 o 9) en el serotipo 2 de AAV mejoró la transducción de AAV2 en el músculo y el hígado, razonamos que la sustitución de algunas subunidades de la cápside de otros serotipos es capaz de mejorar la transducción de AAV al aprovechar diferentes mecanismos para la transducción efectiva de AAV de diferentes serotipos. Además, los anticuerpos preexistentes contra el AAV natural han afectado el éxito de la hemofilia B y otros estudios de transferencia génica de AAV. En la población humana general, alrededor del 50% porta anticuerpos neutralizantes. Se han considerado varios enfoques para diseñar vectores de AAV que evaden NAb, incluida la modificación química, el serotipo diferente del vector de AAV, el diseño racional y la mutagénesis combinatoria de la cápsidein situ,así como el reducción biológico del título de NAb (utilización de la cápside vacía, reducción de células B y plasma-aféresis). Estos enfoques tienen baja eficiencia o efectos secundarios o cambios en el tropismo de AAV. Los estudios estructurales recientes sobre la interacción de vectores de AAV con anticuerpos neutralizantes monoclonales demostraron que Nab se une a residuos en varias subunidades diferentes de una superficie de virión, lo que sugiere que el cambio del ensamblaje de subunidades del virión de AAV puede extirpar el sitio de unión de Nab de AAV y luego escapar de la actividad de Nab. Tenemos resultados que respaldan firmemente la noción de que los nuevos vectores de AAV en mosaico tienen el potencial de mejorar la transducción en varios tejidos y son capaces de escapar de la actividad neutralizante de los anticuerpos.
Ejemplo 12:(Ejemplo de referencia) Tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central con VP1/VP2/VP3 de dos o más serotipos de AAV diferentes
En un primer experimento, se utilizan dos plásmidos auxiliares. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV4. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para la descarboxilasa de ácido glutámico 65 (GAD65) y/o la descarboxilasa de ácido glutámico 67 (GAD67), cuya secuencia de nucleótidos se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para la proteína GAD65 y/o GAD67 para tratar la enfermedad de Parkinson, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos del sistema nervioso central asociados con la enfermedad de Parkinson mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción . De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la enfermedad de Parkinson tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2 o AAV4.
En un experimento adicional, se utilizan nuevamente dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV5. Un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para CLN2 para tratar la enfermedad de Batten está contenido en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad de Batten, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos del sistema nervioso central asociados con la enfermedad de Parkinson mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la enfermedad de Batten tiene una mayor especificidad para el tejido relevante del sistema nervioso central que un vector de virus compuesto solo por AAV3 o AAV5.
En otro experimento, se utilizan tres plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV4. Un tercer plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV5. Un cuarto plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para el factor de crecimiento nervioso (NGF) para tratar la enfermedad de Alzheimer está contenido en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los cuatro plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad de Alzheimer, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos del sistema nervioso central asociados con la enfermedad de Alzheimer mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3, AAV4 y AAV5) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar la enfermedad de Alzheimer tiene una mayor especificidad para el tejido relevante del sistema nervioso central que un vector de virus compuesto solo por AAV3, AAV4 o AAV5.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV4 y VP3 de AAV5. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para<a>A<c>insertada entre dos ITR para tratar la enfermedad de Canavan. El AAV triploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad de Canavan, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos del sistema nervioso central asociados con la enfermedad de Canavan mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV2, AAV4 y AAV5) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción . De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar la enfermedad de Canavan tiene una mayor especificidad para el tejido relevante del sistema nervioso central que un vector de virus compuesto solo por AAV2, AAV4 o AAV5.
Tratamiento de enfermedades del corazón con VP1I VP2I VP3 de dos o más serotipos de AAV diferentes.En un experimento, se utilizan dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV6. Un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para la proteína para tratar la enfermedad cardíaca está contenido en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad cardíaca, en parte al aumentar la especificidad del tejido cardíaco asociado con la enfermedad cardíaca mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la enfermedad cardíaca tiene una mayor especificidad para el tejido cardíaco relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV2 o AAV6.
En un experimento adicional, se utilizan dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9. Un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para la proteína para tratar la enfermedad cardíaca está contenido en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína para tratar la enfermedad cardíaca, en parte al aumentar la especificidad del tejido cardíaco asociado con la enfermedad cardíaca mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la enfermedad cardíaca tiene una mayor especificidad para el tejido cardíaco relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV3 o AAV9.
En un experimento, se utilizan tres plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV6. Un tercer plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9. Un cuarto plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína para tratar enfermedades cardíacas está contenido en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los cuatro plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad cardíaca, en parte al aumentar la especificidad para el tejido cardíaco asociado con la enfermedad cardíaca mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3, AAV6 y AAV9) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar la enfermedad cardíaca tiene una mayor especificidad para el tejido cardíaco relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV3, AAV6 o AAV9.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV3 y VP3 de AAV9. Un segundo plásmido contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína para tratar la enfermedad cardíaca insertada entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los dos plásmidos codifica para la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad cardíaca, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos cardíacos asociados con la enfermedad cardíaca mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV2, AAV3 y AAV9) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar la enfermedad cardíaca tiene una mayor especificidad para el tejido cardíaco relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV2, AAV3 o AAV9.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV6. Un segundo plásmido contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína para tratar la enfermedad cardíaca insertada entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos codifica para la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad cardíaca, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos cardíacos asociados con la enfermedad cardíaca mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3 y AAV6) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la enfermedad cardíaca tiene una mayor especificidad para el tejido cardíaco relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV2 o AAV6.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV9. Un segundo plásmido contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína para tratar la enfermedad cardíaca insertada entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los dos plásmidos codifica para la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad cardíaca, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos cardíacos asociados con la enfermedad cardíaca mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3, AAV6 y AAV9) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar la enfermedad cardíaca tiene una mayor especificidad para el tejido cardíaco relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV3, AAV6 o AAV9.
Tratamiento de enfermedades del pulmón con VP1I VP2I VP3 de dos o más serotipos de AAV diferentes.En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Cap de AAV9. Un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR para tratar la fibrosis quística se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para CFTR para tratar la fibrosis quística, en parte al aumentar la especificidad para el tejido pulmonar asociado con la fibrosis quística mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la fibrosis quística tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2 o AAV9.
En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV10. Un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR para tratar la fibrosis quística se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para CFTR para tratar la fibrosis quística, en parte al aumentar la especificidad para el tejido pulmonar asociado con la fibrosis quística mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la fibrosis quística tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3 o AAV10.
En un experimento, se utilizan tres plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9. Un tercer plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV10. Un cuarto plásmido codifica para una secuencia de nucleótidos para CFTR para tratar la fibrosis quística está contenido en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los cuatro plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para CFTR para tratar la fibrosis quística, en parte al aumentar la especificidad para el tejido pulmonar asociado con la fibrosis quística mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3, AAV9 y AAV10) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar la fibrosis quística tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3, AAV9 o AAV10.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV9 y VP3 de AAV9. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR insertada entre dos ITR para tratar la fibrosis quística. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la fibrosis quística, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos del sistema nervioso central asociados con la fibrosis quística mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV2 y AAV9) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la fibrosis quística tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2 o AAV9.
En un experimento adicional, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV10 y VP3 de AAV10. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR insertada entre dos ITR para tratar la fibrosis quística. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la fibrosis quística, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos del sistema nervioso central asociados con la fibrosis quística mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3 y AAV10) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar la fibrosis quística tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3 o AAV10.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV9 y VP3 de AAV10. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR insertada entre dos ITR para tratar la fibrosis quística. El AAV triploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la fibrosis quística, en parte al aumentar la especificidad para los tejidos del sistema nervioso central asociados con la enfermedad de Canavan mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV2, AAV9 y AAV10) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar la fibrosis quística tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2, AAV9 o AAV10.
Tratamiento de enfermedades del músculo esquelético con VP1I VP2I VP3 de dos o más serotipos de AAV diferentes.Para los siguientes experimentos, la enfermedad del músculo esquelético puede ser, pero no se limita a, Distrofia Muscular Duchene, Distrofia Muscular de Cintura y extremidades, Parálisis Cerebral, Miastenia Gravis y Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS).
En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV8. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos de una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético, en parte aumentando la especificidad para el músculo esquelético asociada con una enfermedad del músculo esquelético mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar una enfermedad del músculo esquelético tiene una mayor especificidad para el tejido del músculo esquelético relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV2 o AAV8.
En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos de una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético, en parte aumentando la especificidad para el músculo esquelético asociada con una enfermedad del músculo esquelético mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar una enfermedad del músculo esquelético tiene una mayor especificidad para el tejido del músculo esquelético relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV3 o AAV9.
En un experimento, se utilizan tres plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV8. Un tercer plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9. Un cuarto plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos de una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético que se inserta entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los cuatro plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético, en parte al aumentar la especificidad para el músculo esquelético asociada con una enfermedad del músculo esquelético mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV3, AAV8 y AAV9) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar una enfermedad del músculo esquelético tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3, AAV8 o AAV9.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV9 y VP3 de AAV9. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos de una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar una enfermedad del músculo esquelético que, en parte, aumenta la especificidad para los tejidos del músculo esquelético asociados con una enfermedad del músculo esquelético mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3 y AAV9) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar una enfermedad del músculo esquelético tiene una mayor especificidad para el tejido del músculo esquelético relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV3 o AAV9.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV8. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos de una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar una enfermedad del músculo esquelético que, en parte, aumenta la especificidad para los tejidos del músculo esquelético asociados con una enfermedad del músculo esquelético mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3 y AAV8) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar una enfermedad del músculo esquelético tiene una mayor especificidad para el tejido del músculo esquelético relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV3 o AAV8.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV9. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos de una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético que se inserta entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar una enfermedad del músculo esquelético que, en parte, aumenta la especificidad para los tejidos del músculo esquelético asociados con una enfermedad del músculo esquelético mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3, AAV8 y AAV9) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar una enfermedad del músculo esquelético tiene una mayor especificidad para el tejido muscular esquelético relevante que un vector de virus compuesto solo por AAV3, AAV8 o AAV9.
Tratamiento de enfermedades del hígado con VP1I VP2I VP3 de dos o más serotipos de AAV diferentes.En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV6. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para un Factor IX (FIX) para tratar la hemofilia B que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético, en parte al aumentar la especificidad para FIX asociada con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia B tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2 o AAV6.
En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV7. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para un Factor IX (FIX) para tratar la hemofilia B que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético, en parte al aumentar la especificidad para FIX asociada con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia B tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3 o AAV7.
En un experimento, se utilizan tres plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV6. Un tercer plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV7. Un cuarto plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para un Factor IX (FIX) para tratar la hemofilia B que se inserta entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los cuatro plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar la hemofilia B, en parte al aumentar la especificidad para el tejido hepático asociado con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo, AAV3, AAV6 y AAV7) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia B tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3, AAV6 o AAV7.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV6. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para FIX para tratar la hemofilia B que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la hemofilia B que, en parte, al aumentar la especificidad para los tejidos hepáticos asociados con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV2 y AAV6) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia B tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2 o AAV6.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV7 y VP3 de AAV7. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para FIX para tratar la hemofilia B que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la hemofilia B que, en parte, al aumentar la especificidad para los tejidos hepáticos asociados con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV3 y AAV7) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia B tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3 o AAV7.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV7. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para FIX para tratar la hemofilia B que se inserta entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la hemofilia B que, en parte, al aumentar la especificidad para los tejidos hepáticos asociados con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV3, AAV6 y AAV7) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia B tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3, AAV6 o AAV7.
En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el Rep de AÁV2 y el gen Cap de AAV6. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para un Factor VIII (FVIII) para tratar la hemofilia A que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético, en parte aumentando la especificidad para FVIII asociado con la hemofilia A mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia A tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2 o AAV6.
En un experimento, se utilizan de nuevo dos plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y el segundo plásmido auxiliar tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV7. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para un FVIII para tratar la hemofilia A que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína para tratar una enfermedad del músculo esquelético, en parte aumentando la especificidad para FVIII asociado con la hemofilia A mediante el uso de múltiples serotipos de AAV para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia A tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3 o AAV7.
En un experimento, se utilizan tres plásmidos auxiliares con diferentes serotipos de AAV como fuente de los genes Rep y Cap. El primer plásmido auxiliar tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y el segundo plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV6. Un tercer plásmido auxiliar tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV7. Un cuarto plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para un FVIII para tratar la hemofilia A que se inserta entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los cuatro plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para una proteína FVIII para tratar la hemofilia A, en parte al aumentar la especificidad para el tejido hepático asociado con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV3, AAV6 y AAV7) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia A tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3, AAV6 o AAV7.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV6. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para FVIII para tratar la hemofilia B que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para FVIII para tratar la hemofilia A que, en parte, aumenta la especificidad para los tejidos hepáticos asociados con la hemofilia A mediante el uso de múltiples serotipos de AAV (por ejemplo,<a>AV2 y AAV6) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia A tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV2 o AAV6.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV7 y VP3 de AAV7. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para FVIII para tratar la hemofilia A que se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para FVIII para tratar la hemofilia A que, en parte, al aumentar la especificidad para los tejidos hepáticos asociados con la hemofilia B mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV3 y AAV7) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus haploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia A tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3 o AAV7.
En otro experimento, se utiliza un plásmido auxiliar con diferentes serotipos de AAV como fuente para los genes Rep y Cap. El plásmido auxiliar tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV7. Un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para FVIII para tratar la hemofilia A que se inserta entre dos ITR. El AAV triploide generado a partir de los dos plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para FVIII para tratar la hemofilia B que, en parte, al aumentar la especificidad para los tejidos hepáticos asociados con la hemofilia A mediante el uso de múltiples serotipos de AAV(por ejemplo,,AAV3, AAV6 y AAV7) para obtener las proteínas que codifican para VP1, VP2 y VP3 de acuerdo con los métodos de esta descripción. De hecho, el virus triploide creado por este método para tratar el tejido hepático en un paciente que padece hemofilia A tiene una mayor especificidad por el tejido relevante que un vector viral compuesto solo por AAV3, AAV6 o AAV7.
Ejemplo 13:(Ejemplo de referencia) Uso de AAV para tratar una enfermedad Tratamiento de la enfermedad de Parkinson
Un paciente masculino de 45 años de edad que padece la enfermedad de Parkinson se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PTA 13274 (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n .° 9,441,206), que contiene un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV2 y un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV4 y un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para la descarboxilasa de ácido glutámico 65 (GAD65) y/o la descarboxilasa de ácido glutámico 67 (GAD67), cuya secuencia de nucleótidos se inserta entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para la proteína GAD65 y/o GAD67 para tratar la enfermedad de Parkinson. El AAV se administra al paciente, que poco después de la administración muestra una reducción en la frecuencia de los temblores y una mejora en el equilibrio del paciente. Con el tiempo, el paciente también ve una reducción en el número y la gravedad de las alucinaciones y delirios que el paciente padeció antes de la administración del AAV.
Tratamiento de la enfermedad de Batten.Un paciente masculino de 8 años de edad que padece la enfermedad de Batten se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PTA 13274 (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n .° 9.441.206), que contiene un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3 y un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV5. Un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para CLN2 para tratar la enfermedad de Batten, en donde el gen CLN2 se ha insertado entre dos ITR. El AAV haploide generado a partir de los tres plásmidos contiene la secuencia de nucleótidos para tratar la enfermedad de Batten. El AAV se administra al paciente, que poco después de la administración muestra un aumento de la agudeza mental. Además, el paciente ve una reducción en las convulsiones y una mejora en las habilidades motoras y de signos que el paciente padecía antes de la administración del AAV.
Tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.Una paciente de 73 años que padece la enfermedad de Alzheimer se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PTA 13274 (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n .° 9,441,206), que contiene un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV4; y, un tercer plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV5. Un cuarto plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para el factor de crecimiento nervioso (NGF) para tratar la enfermedad de Alzheimer, en donde el NGF se ha insertado entre dos ITR. El AAV triploide se administra al paciente, que poco después de la administración muestra un aumento en la agudeza mental y la memoria a corto plazo. El paciente también puede comunicarse mejor con los demás y comienza a funcionar de manera más independiente que antes de la administración del AAV.
Tratamiento de las enfermedades cardíacas.Un paciente masculino de 63 años que padece una enfermedad cardíaca se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PTA 13274(ver, por ejemplo,la patente de los Estados Unidos n .° 9.441.206), que contiene:
(1) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV2; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV6; y, un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para la proteína para tratar la enfermedad cardíaca que está contenida en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR;
(2) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un tercer plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para la proteína para tratar la enfermedad cardíaca que está contenida en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR;
(3) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de a AV6; un tercer plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un cuarto plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína para tratar enfermedades cardíacas está contenido en un tercer plásmido y se ha insertado entre dos ITR;
(4) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV3 y VP3 de AAV9; y, un segundo plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína para tratar la enfermedad cardíaca insertada entre dos ITR;
(5) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV6; y, un segundo plásmido contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína para tratar la enfermedad cardíaca insertada entre dos ITR; o,
(6) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV9; y, un segundo plásmido contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína para tratar la enfermedad cardíaca insertada entre dos ITR, en donde el AAV poliploide se administra al paciente, quien poco después de la administración muestra una reducción en los síntomas asociados con la enfermedad cardíaca y muestra una mejora proporcional en la salud cardíaca del paciente.
Tratamiento de la fibrosis quística.Una mujer de 19 años que padece de Fibrosis Quística se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PTA 13274 (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n .° 9.441.206), que contiene:
(1) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV10; y, un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR que se inserta entre dos iTR;
(2) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; un tercer plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV10; y un cuarto plásmido que codifica una secuencia de nucleótidos para CFTR que se ha insertado entre dos ITR;
(3) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV9 y VP3 de AAV9; y un segundo plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR insertada entre dos ITR;
(4) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV10 y VP3 de AAV10; y, un segundo plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR insertada entre dos ITR; o,
(7) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV2 y VP1 de AAV2, VP2 de AAV9 y VP3 de AAV10; y, un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para CFTR insertada entre dos ITR, en donde
el AAV se administra al paciente, que poco después de la administración muestra una desaceleración en el aumento del daño al pulmón del paciente; una reducción en el aumento de la pérdida de la función pulmonar y una reducción en la velocidad con la que se daña el hígado y una desaceleración en el aumento de la gravedad de la cirrosis hepática. El mismo paciente también ve una reducción en la gravedad de la diabetes relacionada con la Fibrosis Quística que el paciente había comenzado a padecer.
Tratamiento de la enfermedad del músculo esquelético - Esclerosis lateral amiotrófica (ALS).Un varón de 33 años de edad que padece Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS) se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PTA 13274 (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n .° 9.441.206), que contiene:
(1) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV2; un segundo plásmido auxiliar que tiene el Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV8; y, un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para la superóxido dismutasa 1 (SOD1) que se inserta entre dos ITR;
(2) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para SOD1 que se inserta entre dos ITR;
(3) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de a AV8; un tercer plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un cuarto plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para SOD1 que se inserta entre dos ITR;
(4) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV9 y VP3 de AAV9; y, un segundo plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para SOD1 que se inserta entre dos ITR;
(5) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV8; y, un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para SOD1 que se inserta entre dos ITR; o,
(6) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y v P1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV; y, un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para SOD1 que se inserta entre dos ITR, en donde el AAV se administra al paciente, quien poco después de la administración muestra una reducción en los síntomas asociados con la ALS, incluyendo una ralentización o detención en la progresión del daño a las neuronas motoras en el cerebro y la médula espinal y el mantenimiento de la comunicación entre el cerebro y los músculos del paciente.
Distrofia Muscular de Duchenne.Un varón de 5 años de edad que padece de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PTA 13274, que contiene:
(1) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV2; un segundo plásmido auxiliar que tiene el Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV8; y, un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para distrofina que se inserta entre dos ITR;
(2) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para distrofina que se inserta entre dos ITR;
(3) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV8; un tercer plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un cuarto plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para la distrofina que se inserta entre dos ITR;
(4) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV9 y VP3 de AAV9; y, un segundo plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para distrofina que se inserta entre dos ITR;
(5) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV8; y, un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para distrofina que se inserta entre dos ITR; o,
(6) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV; y, un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para la distrofina que se inserta entre dos ITR, en donde el AAV se administra al paciente, quien poco después de la administración muestra una desaceleración en el aumento del daño y desgaste de los músculos esqueléticos del paciente, así como una desaceleración o detención del daño padecido por el corazón y los pulmones como resultado de la Distrofia Muscular Duchene.
Miastenia Gravis.Una mujer de 33 años de edad que padece de Miastenia Gravis (MG) se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular He K293 aislada con ATCC No. PTA 13274, que contiene:
(1) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV2; un segundo plásmido auxiliar que tiene el Rep de AAV2 y el gen Cap de AAV8; y, un tercer plásmido que codifica para la secuencia de nucleótidos para el gen de modo que el paciente ya no padecerá de MG que se inserta entre dos ITR;
(2) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un tercer plásmido que codifica para el gen de modo que el paciente ya no padecerá de MG que se inserta entre dos iTR;
(3) un primer plásmido auxiliar que tiene los genes Rep y Cap de AAV3; un segundo plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV8; un tercer plásmido auxiliar que tiene el gen Rep de AAV3 y el gen Cap de AAV9; y, un cuarto plásmido que codifica para el gen de modo que el paciente ya no padecerá de MG que se inserta entre dos ITR; (4) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y v P1 de AAV3, v P2 de AAV9 y VP3 de AAV9; y, un segundo plásmido que codifica el gen de modo que el paciente ya no padecerá de MG que se inserta entre dos ITR;
(5) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV8; y, un segundo plásmido codifica para el gen de modo que el paciente ya no padecerá de MG que se inserta entre dos ITR; o,
(6) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de AAV3 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV8 y VP3 de AAV; y, un segundo plásmido codifica para el gen de tal manera que el paciente ya no padecerá de MG que se inserta entre dos ITR, en donde el AAV se administra al paciente, quien poco después de la administración muestra una desaceleración en el aumento de la ruptura en la comunicación entre los músculos y los nervios del cuerpo del paciente, lo que resulta en una desaceleración o detención en la gravedad de la pérdida de control muscular. La movilidad del paciente se estabiliza y ya no empeora después de la administración del AAV y la respiración del paciente tampoco empeora después de la administración del AAV.
Distrofia Muscular de Cintura y extremidades.Un varón de 13 años de edad que padece de Distrofia Muscular de Cintura y extremidades (LGMD) se trata con un AAV generado a partir de una línea celular, tal como la línea celular HEK293 aislada con ATCC No. PtA 13274, que contiene:
(1 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 2 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e e l R e p d e A A V 2 y e l g e n C a p d e A A V 8 ; y, un te rc e r p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra u n o d e lo s q u in c e g e n e s c o n u n a m u ta c ió n a s o c ia d a c o n L G M D , q u e in c lu y e , p e ro n o s e lim ita a, m io tilin a , te le to n in a , c a lp a ín a -3 , a lfa -s a rc o g lic a n o y b e ta -s a rc o g lic a n o q u e s e in s e r ta e n tre d o s ITR ;
(2 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 3 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e e l R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 9 ; y, un te rc e r p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra u n o d e lo s q u in c e g e n e s c o n u n a m u ta c ió n a s o c ia d a c o n L G M D , q u e in c lu y e , p e ro n o s e lim ita a, m io tilin a , te le to n in a , c a lp a ín a -3 , a lfa -s a rc o g lic a n o y b e ta -s a rc o g lic a n o q u e s e in s e r ta e n tre d o s ITR ;
(3 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 3 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e el g e n R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e a A V 8; un te rc e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e e l g e n R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 9 ; y, un c u a r to p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra u n o d e lo s q u in c e g e n e s c o n u n a m u ta c ió n a s o c ia d a c o n L G M D , q u e in c lu y e , p e ro n o s e lim ita a, m io tilin a , te le to n in a , c a lp a ín a -3 , a lfa -s a rc o g lic a n o y b e ta -s a rc o g lic a n o q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R ;
(4 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 3 y V P 1 d e A A V 3 , V P 2 d e A A V 9 y V P 3 d e A A V 9 ; y, un s e g u n d o p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra u n o d e lo s q u in c e g e n e s c o n u n a m u ta c ió n a s o c ia d a c o n L G M D , q u e in c lu y e , p e ro no s e lim ita a, m io tilin a , te le to n in a , c a lp a ín a -3 , a lfa -s a rc o g lic a n o y b e ta -s a rc o g lic a n o q u e s e in s e r ta e n tre d o s ITR ;
(5 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 3 y V P 1 d e A A V 3 , V P 2 d e A A V 8 y V P 3 d e A A V 8 ; y, un s e g u n d o p lá s m id o c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra u n o d e lo s q u in c e g e n e s co n u n a m u ta c ió n a s o c ia d a co n L G M D , q u e in c lu y e , p e ro no s e lim ita a, m io tilin a , te le to n in a , c a lp a ín a -3 , a lfa -s a rc o g lic a n o y b e ta -s a rc o g lic a n o q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R ; o,
(6 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 3 y V P 1 d e A A V 3 , V P 2 d e A A V 8 y V P 3 d e A A V ; y, un s e g u n d o p lá s m id o c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra u n o d e lo s q u in c e g e n e s co n u n a m u ta c ió n a s o c ia d a co n L G M D , q u e in c lu y e , p e ro no s e lim ita a, m io tilin a , te le to n in a , c a lp a ín a -3 , a lfa -s a rc o g lic a n o y b e ta -s a rc o g lic a n o q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R , e n d o n d e u n o o m á s d e lo s A A V , c a d a u n o d e lo s c u a le s c o d if ic a u n o d e lo s 15 g e n e s d ife re n te s a s o c ia d o s co n L G M D s e a d m in is tra a l p a c ie n te , q u ie n p o c o d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n m u e s tra u n a d e s a c e le ra c ió n o d e te n c ió n en la a tro f ia y a tro f ia m u s c u la r a d ic io n a l.
Tratamiento de Enfermedades del Hígado -Hemofilia B.<U n v a ró n d e 9 a ñ o s d e e d a d q u e p a d e c e u n a H e m o fil ia B>re s u lta n te d e u n a d e f ic ie n c ia d e F a c to r IX (F IX ) s e t ra ta co n un A A V g e n e ra d o a p a r t ir d e u n a lín e a c e lu la r, ta l c o m o la lín e a c e lu la r H E K 293 a is la d a co n A T C C N o . P t A 13274 , q u e c o n tie n e :
(1 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 2 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e e l R e p d e A A V 2 y e l g e n C a p d e A A V 6 ; y, un te rc e r p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F IX p a ra t r a ta r la h e m o fil ia B q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R ;
(2 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 2 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e e l R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 7 ; y un te rc e r p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F IX p a ra t r a ta r la h e m o fil ia B q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R ;
(3 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 3 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e el g e n R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 6 ; un te rc e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e e l g e n R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 7 ; y un c u a rto p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F IX q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R ;
(4 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 2 y V P 1 d e A A V 2 , V P 2 d e A A V 6 y V P 3 d e A A V 6 ; y un s e g u n d o p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F IX q u e s e in s e r ta e n tre d o s iT R ;
(5 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 2 y V P 1 d e A A V 3 , V P 2 d e A A V 7 y V P 3 d e A A V 7 ; y un s e g u n d o p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F IX q u e s e in s e r ta e n tre d o s iT R ; o,
(6 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 2 y V P 1 d e A A V 3 , V P 2 d e A A V 6 y V P 3 d e A A V 7 ' y un s e g u n d o p lá s m id o c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F IX q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R , e n d o n d e el A A V s e a d m in is t ra al p a c ie n te , q u ie n p o c o d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n m u e s tra u n a re d u c c ió n e n la g ra v e d a d d e la h e m o fil ia B, in c lu id a u n a re d u c c ió n e n lo s e p is o d io s h e m o rrá g ic o s .
Hemofilia A.<U n v a ró n d e 8 a ñ o s d e e d a d q u e p a d e c e u n a H e m o fil ia A re s u lta n te d e u n a d e f ic ie n c ia d e F a c to r V III (F V III)>s e t ra ta c o n un A A V g e n e ra d o a p a rt ir d e u n a lín e a c e lu la r, ta l c o m o la lín e a c e lu la r H E K 293 a is la d a c o n A T C C N o . P T A 13274 , q u e c o n tie n e :
(1 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 2 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e el R e p d e A A V 2 y el g e n C a p d e A A V 6 ; y, un te rc e r p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F V III q u e s e in s e r ta e n tre d o s ITR ;
(2 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 2 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e el R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 7 ; y un te rc e r p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F V III q u e s e in s e r ta e n tre d o s ITR ;
(3 ) un p r im e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e lo s g e n e s R e p y C a p d e A A V 3 ; un s e g u n d o p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e el g e n R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 6 ; un te rc e r p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e e l g e n R e p d e A A V 3 y e l g e n C a p d e A A V 7 ; y un c u a rto p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F V III q u e s e in s e r ta e n tre d o s ITR ;
(4 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 2 y V P 1 d e A A V 2 , V P 2 d e A A V 6 y V P 3 d e A A V 6 ; y un s e g u n d o p lá s m id o q u e c o d if ic a p a ra la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s p a ra F V III q u e s e in s e r ta e n tre d o s IT R ;
(5 ) un p lá s m id o a u x il ia r q u e t ie n e la R e p d e A A V 2 y V P 1 d e A A V 3 , V P 2 d e A A V 7 y V P 3 d e A A V 7 ; y un s e g u n d o p lá s m id o que codifica para la secuencia de nucleótidos para FVI11 que se inserta entre dos ITR; o,
(6) un plásmido auxiliar que tiene la Rep de<a>A<v>2 y VP1 de AAV3, VP2 de AAV6 y VP3 de AAV7' y un segundo plásmido codifica para la secuencia de nucleótidos para FVIII que se inserta entre dos ITR, en donde el AAV se administra al paciente, quien poco después de la administración muestra una reducción en la gravedad de la hemofilia A, incluida una reducción en los episodios hemorrágicos.
T l 1 :
T a b la 2 : R e s id u o s d e a m in o á c id o s a b r e v ia tu r a s
T a b la 3 :
T a b la 4 :
Tabla 5: Resultado de MS para proteínas séricas de unión a AAV8
Tabla 5 (continuación):
Acceso Descripción Cambio de veces P01766 ig cadena pesada región V-lil 8RO OS-Homo sapiens PE-1 SV-i 2.46875 P01598 Ig cadena kappa región V-l £U OS=Homo sapiens PE=1 SV-1 3.82978T234 P0278? Serotransferrina OS=Homo sapiens GN-Tf PE-i SV=3 NO P04003 Cadena alfa de proteína de unión a C4b OS=Homo sapiens GN=C4BPA P f=1 SV=2 1.527777778 P01591 inmunogiobuiina cadena j OS=Homo sapiens GN4GJ PE= 1 SV-4 2.716049383 P01G19 ig cadena kappa región V-lll 36 OS-Homo sapiens PE-1 SV-1 2.611111111 P02747 Complemento C1q subcomponente subumdad C OS-Homo sapiens GN-C1QC PE-1 SV"3 2.529113765 PÜ2790 Hemopexina OS=Honrvo sapiens GN=HPX PE=S SV=2 30.71428571 POS452 Tetranectma OS=Horoo sapiens GN-CLEC3B PE= 1 SV~3 ND P80748 'g cadena lambda región V-lll LOi OS-Homo sapiens P£=l SV=1 NO P01717 Ig cadena lambda región V-IV Hií OS=Horm> sapiens PE=l SV=1 2.142857143 P49908 Selenoproteina P OS=Homo sapiens GN=SEPP1 PE=1 $V=3 ND P01714 Ig cadena lambda región V-lll SH OS-Homo sapiens PE-1 SV-1 ND P01625 'g cadena kappa región V-IV Len OS' Homo sapiens PE 1 SV 2 5 Q98SK4 Proteína fem-1 homologo A OS-Homo sapiens GN-FEM1A PE=1 SV-1 0.264285714 K7ER74 Proteina AP0C4 APOC2 OS=Homo sapiens GN=APOC4-APOC2 P€=2 SV=3 ND P02743 Suero amliolde P-componente OS-Homo sapiens GN-APCS PE-1 SV=2 ND POS 603 Factor de complemento OS-Homo sapiens GN-CFH PE=1 SV=4 ND P02746 Subunidad de subcomponente del complemento Clq 8 OS-Homo sapiens GN-C1QB PE =4 SV=3 ND B4E124 Pacto; de complemento 8 OS-Homo sapiens GN -CF8 PE -2 SV-1 ND P01S97 Ig cadena kappa región V-l Q£E OS-Homo sapiens PE-1 $V=1 2.989690/22 V96YM3 Apolipoproteina A-il OS-Horno sapiens GN-APOA? PF=4 SV=1 ND P01774 lg cadena pesada región V-lll POM OS-Homo sapiens PE=3 SV=1 2.636363636 P01019 Angiotensma OS-Homo sapiens 6N-AGT PE-1 SV-1 ND 54R460 Proteina sin caracterizar OS-Horno saprens Pf=4 SV-1 ND P19652 Giicoproteína alfa-i-ácido 2 OS-Homo sapiens GN-ORM2 PE-1 SV-2 ND P22352 Glutationa peroxidasa 3 OS-Homo sapiens<3N-a3PX3 PE-1 SV»2 2.741935484 ¡3KPZ3 homologa de la proteina de cabeza granulada 10S-Homo sapiens GN'-GRHLl PE-2 SV-1 ND P02749 Beta-2-giicoprotetna 1 OS-Homo sap eas GN-APOH PE-1 SV-3 3.428571429 P01008 Anbtrombina-ili OS-Homo sapiens GN-SERPINC t PE~1 SV~ 1 ND
* ND indica que no se ha detectado proteína en el grupo de control
T abla 6: Resultado de MS para proteínas séricas de unión a AAV8
EP3 610023 B1
* ND indica que no se ha detectado proteína en el grupo de control
Tabla 7:<Proteínas séricas potenciales que se unen a AAV9 para aumentar la permeabilidad vascular>
ND indica que no se ha detectado proteína en el grupo de control
S e c u e n c ia s
AAV1 (SEO ID NO: 1381
1 ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag
61 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 121 cgcgacaggg gggagagtgc cacactctca agcaaggagg ttttgtaagt ggtgatgtca 181 tatagttgtc acgcgatagt taatgattaa cagtcaggtg atgtgtgtta tccaatagga
241 tgaaagcgcg cgcatgagtt ctcgcgagac ttccggggta taaaggggtg agtgaacgag 301 cccgccgcca ttctctgctc tgaactgcta gaggaccctc gctgccatgg ctaccttcta
361 cgaagtcatt gttcgcgtcc catttgacgt ggaggaacat ctgcctggaa tttctgacag
421 ctttgtggac tgggtaactg gtcaaatttg ggagctgcct cccgagtcag atttgaattt
481 gactctgatt gagcagcctc agctgacggt tgctgacaga attcgccgcg tgttcctgta
541 cgagtggaac aaattttcca agcaggaatc caaattcttt gtgcagtttg aaaagggatc
601 tgaatatttt catctgcaca cgcttgtgga gacctccggc atctcttcca tggtcctagg
661 ccgctacgtg agtcagattc gcgcccagct ggtgaaagtg gtcttccagg gaatcgagcc 721 acagatcaac gactgggtcg ccatcaccaa ggtaaagaag ggcggagcca ataaggtggt 781 ggattctggg tatattcccg cctacctgct gccgaaggtc caaccggagc ttcagtgggc
841 gtggacaaac ctggacgagt ataaattggc cgccctgaac ctggaggagc gcaaacggct 901 cgtcgcgcag tttctggcag aatcctcgca gcgctcgcag gaggcggctt cgcagcgtga 961 gttctcggct gacccggtca tcaaaagcaa gacttcccag aaatacatgg cgctcgtcaa 1021 ctggctcgtg gagcacggca tcacttccga gaagcagtgg atccaggaga atcaggagag 1081 ctacctctcc ttcaactcca cgggcaactc tcggagccaa atcaaggccg cgctcgacaa 1141 cgcgaccaaa atcatgagtc tgacaaaaag cgcggtggac tacctcgtgg ggagctccgt 1201 tcccgaggac atttcaaaaa acagaatctg gcaaattttt gagatgaacg gctacgaccc 1261 ggcctacgcg ggatccatcc tctacggctg gtgtcagcgc tccttcaaca agaggaacac 1321 cgtctggctc tacggacccg ccacgaccgg caagaccaac atcgcggagg ccatcgccca 1381 cactgtgccc ttttacggct gcgtgaactg gaccaatgaa aactttccct ttaatgactg
1441 tgtggacaaa atgctcattt ggtgggagga gggaaagatg accaacaagg tggttgaatc 1501 cgccaaggcc atcctggggg gctccaaggt gcgggtcgat cagaaatgta aatcctctgt 1561 tcaaattgat tctacccccg tcattgtaac ttccaataca aacatgtgtg tggtggtgga
1621 tgggaattcc acgacctttg aacaccagca gccgctggag gaccgcatgt tcaaatttga 1681 actgactaag cggctcccgc cagattttgg caagattact aagcaggaag tcaaagactt 1741 ttttgcttgg gcaaaggtca atcaggtgcc ggtgactcac gagtttaaag ttcccaggga 1801 attggcggga actaaagggg cggagaaatc tctaaaacgc ccactgggtg acgtcaccaa 1861 tactagctat aaaagtccag agaagcgggc ccggctctca tttgttcccg agacgcctcg 1921 cagttcagac gtgactgtcg atcccgctcc tctgcgaccg ctcaattgga attcaaggta
1981 tgattgcaaa tgtgaccatc atgctcaatt tgacaacatt tctgacaaat gtgatgaatg
2041 tgaatatttg aatcggggca aaaatggatg tatctgtcac aatgtaactc actgtcaaat
2101 ttgtcacggg attcccccct gggagaagga aaacttgtca gattttgggg attttgacga
2161 tgccaataaa gaacagtaaa taaagcgagt agtcatgtct tttgttgatc accctccaga
2221 ttggttggaa gaagttggtg aaggtcttcg cgagtttttg ggccttgaag cgggcccacc 2281 gaaaccgaaa cccaatcagc agcatcaaga tcaagcccgt ggtcttgtgc tgcctggtta 2341 taactatctc ggacccggaa acggtctcga tcgaggagag cctgtcaaca gggcagacga 2401 ggtcgcgcga gagcacgaca tctcgtacaa cgagcagctt gaggcgggag acaaccccta 2461 cctcaagtac aaccacgcgg acgccgagtt tcaggagaag ctcgccgacg acacatcctt 2521 cgggggaaac ctcggaaagg cagtctttca ggccaagaaa agggttctcg aaccttttgg 2581 cctggttgaa gagggtgcta agacggcccc taccggaaag cggatagacg accactttcc 2641 aaaaagaaag aaggctcgga ccgaagagga ctccaagcct tccacctcgt cagacgccga 2701 agctggaccc agcggatccc agcagctgca aatcccagca caaccagcct caagtttggg 2761 agctgataca atgtctgcgg gaggtggcgg cccattgggc gacaataacc aaggtgccga 2821 tggagtgggc aatgcctcgg gagattggca ttgcgattcc acgtggatgg gggacagagt 2881 cgtcaccaag tccacccgca cctgggtgct gcccagctac aacaaccacc agtaccgaga 2941 gatcaaaagc ggctccgtcg acggaagcaa cgccaacgcc tactttggat acagcacccc 3001 ctgggggtac tttgacttta accgcttcca cagccactgg agcccccgag actggcaaag 3061 actcatcaac aactattggg gcttcagacc ccggtctctc agagtcaaaa tcttcaacat
3121 ccaagtcaaa gaggtcacgg tgcaggactc caccaccacc atcgccaaca acctcacctc 3181 caccgtccaa gtgtttacgg acgacgacta ccaactcccg tacgtcgtcg gcaacgggac 3241 cgagggatgc ctgccggcct tccccccgca ggtctttacg ctgccgcagt acggctacgc 3301 gacgctgaac cgagacaacg gagacaaccc gacagagcgg agcagcttct tttgcctaga 3361 gtactttccc agcaagatgc tgaggacggg caacaacttt gagtttacct acagctttga
3421 agaggtgccc ttccactgca gcttcgcccc gagccagaac ctctttaagc tggccaaccc 3481 gctggtggac cagtacctgt accgcttcgt gagcacctcg gccacgggcg ccatccagtt 3541 ccaaaagaac ctggcgggca gatacgccaa cacctacaaa aactggttcc cggggcccat 3601 gggccgaacc cagggctgga acacgagctc tggcagcagc accaacagag tcagcgtcaa 3661 caacttttcc gtctcaaacc ggatgaacct ggagggggcc agctaccaag tgaaccccca 3721 gcccaacggg atgacaaaca cgctccaagg cagcaaccgc tacgcgctgg aaaacaccat 3781 gatcttcaac gctcaaaacg ccacgccggg aactacctcg gtgtacccag aggacaatct 3841 actgctgacc agcgagagcg agactcagcc cgtcaaccgg gtggcttaca acacgggcgg 3901 tcagatggcc accaacgccc agaacgccac cacggctccc acggtcggga cctacaacct 3961 ccaggaagtg cttcctggca gcgtatggat ggagagggac gtgtacctcc aaggacccat 4021 ctgggccaag atcccagaga cgggggcgca ctttcacccc tctccggcca tgggcggatt 4081 cggactcaaa cacccgccgc ccatgatgct catcaaaaac acgccggtgc ccggcaacat 4141 caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc cagtacagca ccgggcaggt 4201 caccgtggag atggaatggg agctcaaaaa ggaaaactcc aagaggtgga acccagagat 4261 ccagtacacc aacaactaca acgaccccca gtttgtggac tttgctccag acggctccgg 4321 cgaatacaga accaccagag ccatcggaac ccgatacctc acccgacccc tttaacccat 4381 tcatgtcgca taccctcaat aaaccgtgta ttcgtgtcag tgaaatactg cctcttgtgg
4441 tcattcaatg aacatcagct tacaacatct acaaaacccc cttgcttgag agtgtggcac
4501 tctcccccct gtcgcgttcg ctcgctcgct ggctcgtttg ggggggtggc agctcaaaga 4561 gctgccagac gacggccctc tggccgtcgc ccccccaaac gagccagcga gcgagcgaac 4621 gcgacagggg ggagag
AAV2 (SEO ID NO: 139)
1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc
61 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 121 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag
181 ggttagggag gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat
241 gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga
301 ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg
361 accttgacga gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg
421 aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga
481 ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc 541 cggaggccct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc
601 tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg
661 aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg
721 tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc 781 ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac
841 agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga
901 cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc 961 cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca 1021 aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca 1081 atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta 1141 tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt 1201 ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt
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AAV5 (SEO ID NO: 142)
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AAV9 (SEO ID NO: 146)
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AAV10 (SEQ ID NO: 147)
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61 ggcatttctg actcgtttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagct gcccccggat
121 tctgacatgg atcggaatct gatcgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 181 cgcgacttcc tggtccactg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttctttgtt
241 cagttcgaga agggcgagtc ctacttccac ctccacgttc tcgtcgagac cacgggggtc 301 aagtccatgg tcctgggccg cttcctgagt cagatcagag acaggctggt gcagaccatc 361 taccgcgggg tcgagcccac gctgcccaac tggttcgcgg tgaccaagac gcgaaatggc 421 gccggcgggg ggaacaaggt ggtggacgag tgctacatcc ccaactacct cctgcccaag 481 acccagcccg agctgcagtg ggcgtggact aacatggagg agtatataag cgcgtgtcta 541 aacctcgcgg agcgtaaacg gctcgtggcg cagcacctga cccacgtcag ccagacgcag 601 gagcagaaca aggagaatct gaacccgaat tctgacgcgc ccgtgatcag gtcaaaaacc 661 tccgcgcgct acatggagct ggtcgggtgg ctggtggacc ggggcatcac ctccgagaag 721 cagtggatcc aggaggacca ggcctcgtac atctccttca acgccgcctc caactcgcgg 781 tcccagatca aggccgcgct ggacaatgcc ggaaagatca tggcgctgac caaatccgcg 841 cccgactacc tggtaggccc gtccttaccc gcggacatta aggccaaccg catctaccgc 901 atcctggagc tcaacggcta cgaccccgcc tacgccggct ccgtcttcct gggctgggcg 961 cagaaaaagt tcggtaaacg caacaccatc tggctgtttg ggcccgccac caccggcaag 1021 accaacatcg cggaagccat agcccacgcc gtgcccttct acggctgcgt gaactggacc 1081 aatgagaact ttcccttcaa cgattgcgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggc 1141 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtccgcc aaggccattc tgggcggaag caaggtgcgc 1201 gtggaccaaa agtgcaagtc ctcggcccag atcgacccca cgcccgtgat cgtcacctcc 1261 aacaccaaca tgtgcgccgt gatcgacggg aacagcacca ccttcgagca ccagcagccg 1321 ctgcaggacc gcatgttcaa gttcgagctc acccgccgtc tggagcacga ctttggcaag 1381 gtgaccaagc aggaagtcaa agagttcttc cgctgggctc aggatcacgt gactgaggtg 1441 gcgcatgagt tctacgtcag aaagggcgga gccaccaaaa gacccgcccc cagtgacgcg 1501 gatataagcg agcccaagcg ggcctgcccc tcagttccgg agccatcgac gtcagacgcg 1561 gaagcaccgg tggactttgc ggacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgcgggcatg 1621 cttcagatgc tgtttccctg caagacatgc gagagaatga atcagaattt caacgtctgc
1681 ttcacgcacg gggtcagaga ctgctcagag tgcttccccg gcgcgtcaga atctcaaccc 1741 gtcgtcagaa aaaagacgta tcagaaactg tgcgcgattc atcatctgct ggggcgggca 1801 cccgagattg cgtgttcggc ctgcgatctc gtcaacgtgg acttggatga ctgtgtttct
1861 gagcaataaa tgacttaaac caggtatggc tgctgacggt tatcttccag attggctcga
1921 ggacaacctc tctgagggca ttcgcgagtg gtgggacctg aaacctggag ccccgaagcc 1981 caaggccaac cagcagaagc aggacgacgg ccggggtctg gtgcttcctg gctacaagta 2041 cctcggaccc ttcaacggac tcgacaaggg ggagcccgtc aacgcggcgg acgcagcggc 2101 cctcgagcac gacaaggcct acgaccagca gctcaaagcg ggtgacaatc cgtacctgcg 2161 gtataaccac gccgacgccg agtttcagga gcgtctgcaa gaagatacgt cttttggggg 2221 caacctcggg cgagcagtct tccaggccaa gaagagggta ctcgaacctc tgggcctggt 2281 tgaagaaggt gctaaaacgg ctcctggaaa gaagagaccg ttagagtcac cacaagagcc 2341 cgactcctcc tcgggcatcg gcaaaaaagg caaacaacca gccagaaaga ggctcaactt 2401 tgaagaggac actggagccg gagacggacc ccctgaagga tcagatacca gcgccatgtc 2461 ttcagacatt gaaatgcgtg cagcaccggg cggaaatgct gtcgatgcgg gacaaggttc 2521 cgatggagtg ggtaatgcct cgggtgattg gcattgcgat tccacctggt ctgagggcaa 2581 ggtcacaaca acctcgacca gaacctgggt cttgcccacc tacaacaacc acttgtacct 2641 gcgtctcgga acaacatcaa gcagcaacac ctacaacgga ttctccaccc cctggggata 2701 ttttgacttc aacagattcc actgtcactt ctcaccacgt gactggcaaa gactcatcaa
2761 caacaactgg ggactacgac caaaagccat gcgcgttaaa atcttcaata tccaagttaa 2821 ggaggtcaca acgtcgaacg gcgagactac ggtcgctaat aaccttacca gcacggttca 2881 gatatttgcg gactcgtcgt atgagctccc gtacgtgatg gacgctggac aagaggggag 2941 cctgcctcct ttccccaatg acgtgttcat ggtgcctcaa tatggctact gtggcatcgt
3001 gactggcgag aatcagaacc aaacggacag aaacgctttc tactgcctgg agtattttcc 3061 ttcgcaaatg ttgagaactg gcaacaactt tgaaatggct tacaactttg agaaggtgcc
3121 gttccactca atgtatgctc acagccagag cctggacaga ctgatgaatc ccctcctgga 3181 ccagtacctg tggcacttac agtcgactac ctctggagag actctgaatc aaggcaatgc 3241 agcaaccaca tttggaaaaa tcaggagtgg agactttgcc ttttacagaa agaactggct 3301 gcctgggcct tgtgttaaac agcagagatt ctcaaaaact gccagtcaaa attacaagat 3361 tcctgccagc gggggcaacg ctctgttaaa gtatgacacc cactatacct taaacaaccg 3421 ctggagcaac atcgcgcccg gacctccaat ggccacagcc ggaccttcgg atggggactt 3481 cagtaacgcc cagcttatat tccctggacc atctgttacc ggaaatacaa caacttcagc 3541 caacaatctg ttgtttacat cagaagaaga aattgctgcc accaacccaa gagacacgga 3601 catgtttggc cagattgctg acaataatca gaatgctaca actgctccca taaccggcaa 3661 cgtgactgct atgggagtgc tgcctggcat ggtgtggcaa aacagagaca tttactacca 3721 agggccaatt tgggccaaga tcccacacgc ggacggacat tttcatcctt caccgctgat 3781 tggtgggttt ggactgaaac acccgcctcc ccagatattc atcaagaaca ctcccgtacc 3841 tgccaatcct gcgacaacct tcactgcagc cagagtggac tctttcatca cacaatacag 3901 caccggccag gtcgctgttc agattgaatg ggaaattgaa aaggaacgct ccaaacgctg 3961 gaatcctgaa gtgcagttta cttcaaacta tgggaaccag tcttctatgt tgtgggctcc
4021 tgatacaact gggaagtata cagagccgcg ggttattggc tctcgttatt tgactaatca
4081 tttgtaa
AAV12 (SEQ ID NO: 149)
1 ttgcgacagt ttgcgacacc atgtggtcac aagaggtata taaccgcgag tgagccagcg
61 aggagctcca ttttgcccgc gaagtttgaa cgagcagcag ccatgccggg gttctacgag
121 gtggtgatca aggtgcccag cgacctggac gagcacctgc ccggcatttc tgactccttt
181 gtgaactggg tggccgagaa ggaatgggag ttgcccccgg attctgacat ggatcagaat 241 ctgattgagc aggcacccct gaccgtggcc gagaagctgc agcgcgagtt cctggtggaa 301 tggcgccgag tgagtaaatt tctggaggcc aagttttttg tgcagtttga aaagggggac
361 tcgtactttc atttgcatat tctgattgaa attaccggcg tgaaatccat ggtggtgggc
421 cgctacgtga gtcagattag ggataaactg atccagcgca tctaccgcgg ggtcgagccc 481 cagctgccca actggttcgc ggtcacaaag acccgaaatg gcgccggagg cgggaacaag 541 gtggtggacg agtgctacat ccccaactac ctgctcccca aggtccagcc cgagcttcag
601 tgggcgtgga ctaacatgga ggagtatata agcgcctgtt tgaacctcgc ggagcgtaaa
661 cggctcgtgg cgcagcacct gacgcacgtc tcccagaccc aggagggcga caaggagaat 721 ctgaacccga attctgacgc gccggtgatc cggtcaaaaa cctccgccag gtacatggag 781 ctggtcgggt ggctggtgga caagggcatc acgtccgaga agcagtggat ccaggaggac 841 caggcctcgt acatctcctt caacgcggcc tccaactccc ggtcgcagat caaggcggcc 901 ctggacaatg cctccaaaat catgagcctc accaaaacgg ctccggacta tctcatcggg
961 cagcagcccg tgggggacat taccaccaac cggatctaca aaatcctgga actgaacggg 1021 tacgaccccc agtacgccgc ctccgtcttt ctcggctggg cccagaaaaa gtttggaaag 1081 cgcaacacca tctggctgtt tgggcccgcc accaccggca agaccaacat cgcggaagcc 1141 atcgcccacg cggtcccctt ctacggctgc gtcaactgga ccaatgagaa ctttcccttc 1201 aacgactgcg tcgacaaaat ggtgatttgg tgggaggagg gcaagatgac cgccaaggtc 1261 gtagagtccg ccaaggccat tctgggcggc agcaaggtgc gcgtggacca aaaatgcaag 1321 gcctctgcgc agatcgaccc cacccccgtg atcgtcacct ccaacaccaa catgtgcgcc 1381 gtgattgacg ggaacagcac caccttcgag caccagcagc ccctgcagga ccggatgttc 1441 aagtttgaac tcacccgccg cctcgaccac gactttggca aggtcaccaa gcaggaagtc 1501 aaggactttt tccggtgggc ggctgatcac gtgactgacg tggctcatga gttttacgtc
1561 acaaagggtg gagctaagaa aaggcccgcc ccctctgacg aggatataag cgagcccaag 1621 cggccgcgcg tgtcatttgc gcagccggag acgtcagacg cggaagctcc cggagacttc 1681 gccgacaggt accaaaacaa atgttctcgt cacgcgggta tgctgcagat gctctttccc 1741 tgcaagacgt gcgagagaat gaatcagaat tccaacgtct gcttcacgca cggtcagaaa 1801 gattgcgggg agtgctttcc cgggtcagaa tctcaaccgg tttctgtcgt cagaaaaacg 1861 tatcagaaac tgtgcatcct tcatcagctc cggggggcac ccgagatcgc ctgctctgct 1921 tgcgaccaac tcaaccccga tttggacgat tgccaatttg agcaataaat gactgaaatc
1981 aggtatggct gctgacggtt atcttccaga ttggctcgag gacaacctct ctgaaggcat 2041 tcgcgagtgg tgggcgctga aacctggagc tccacaaccc aaggccaacc aacagcatca 2101 ggacaacggc aggggtcttg tgcttcctgg gtacaagtac ctcggaccct tcaacggact 2161 cgacaaggga gagccggtca acgaggcaga cgccgcggcc ctcgagcacg acaaggccta 2221 cgacaagcag ctcgagcagg gggacaaccc gtatctcaag tacaaccacg ccgacgccga 2281 gttccagcag cgcttggcga ccgacacctc ttttgggggc aacctcgggc gagcagtctt 2341 ccaggccaaa aagaggattc tcgagcctct gggtctggtt gaagagggcg ttaaaacggc 2401 tcctggaaag aaacgcccat tagaaaagac tccaaatcgg ccgaccaacc cggactctgg 2461 gaaggccccg gccaagaaaa agcaaaaaga cggcgaacca gccgactctg ctagaaggac 2521 actcgacttt gaagactctg gagcaggaga cggaccccct gagggatcat cttccggaga 2581 aatgtctcat gatgctgaga tgcgtgcggc gccaggcgga aatgctgtcg aggcgggaca 2641 aggtgccgat ggagtgggta atgcctccgg tgattggcat tgcgattcca cctggtcaga 2701 gggccgagtc accaccacca gcacccgaac ctgggtccta cccacgtaca acaaccacct 2761 gtacctgcga atcggaacaa cggccaacag caacacctac aacggattct ccaccccctg 2821 gggatacttt gactttaacc gcttccactg ccacttttcc ccacgcgact ggcagcgact 2881 catcaacaac aactggggac tcaggccgaa atcgatgcgt gttaaaatct tcaacataca 2941 ggtcaaggag gtcacgacgt caaacggcga gactacggtc gctaataacc ttaccagcac 3001 ggttcagatc tttgcggatt cgacgtatga actcccatac gtgatggacg ccggtcagga 3061 ggggagcttt cctccgtttc ccaacgacgt ctttatggtt ccccaatacg gatactgcgg
3121 agttgtcact ggaaaaaacc agaaccagac agacagaaat gccttttact gcctggaata 3181 ctttccatcc caaatgctaa gaactggcaa caattttgaa gtcagttacc aatttgaaaa
3241 agttcctttc cattcaatgt acgcgcacag ccagagcctg gacagaatga tgaatccttt 3301 actggatcag tacctgtggc atctgcaatc gaccactacc ggaaattccc ttaatcaagg 3361 aacagctacc accacgtacg ggaaaattac cactggagac tttgcctact acaggaaaaa 3421 ctggttgcct ggagcctgca ttaaacaaca aaaattttca aagaatgcca atcaaaacta 3481 caagattccc gccagcgggg gagacgccct tttaaagtat gacacgcata ccactctaaa 3541 tgggcgatgg agtaacatgg ctcctggacc tccaatggca accgcaggtg ccggggactc 3601 ggattttagc aacagccagc tgatctttgc cggacccaat ccgagcggta acacgaccac 3661 atcttcaaac aatttgttgt ttacctcaga agaggagatt gccacaacaa acccacgaga 3721 cacggacatg tttggacaga ttgcagataa taatcaaaat gccaccaccg cccctcacat 3781 cgctaacctg gacgctatgg gaattgttcc cggaatggtc tggcaaaaca gagacatcta 3841 ctaccagggc cctatttggg ccaaggtccc tcacacggac ggacactttc acccttcgcc 3901 gctgatggga ggatttggac tgaaacaccc gcctccacag attttcatca aaaacacccc 3961 cgtacccgcc aatcccaata ctacctttag cgctgcaagg attaattctt ttctgacgca
4021 gtacagcacc ggacaagttg ccgttcagat cgactgggaa attcagaagg agcattccaa 4081 acgctggaat cccgaagttc aatttacttc aaactacggc actcaaaatt ctatgctgtg
4141 ggctcccgac aatgctggca actaccacga actccgggct attgggtccc gtttcctcac

Claims (8)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. U n m é to d o p a ra c re a r un v ir ió n d e v iru s a d e n o a s o c ia d o (A A V ) q u e c o m p re n d e p o n e r e n c o n ta c to c é lu la s , en c o n d ic io n e s p a ra la fo rm a c ió n d e v ir io n e s d e A A V , co n u n a p r im e ra s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o y u n a s e g u n d a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o , e n d o n d e el v ir ió n d e A A V s e fo rm a a p a rt ir d e a l m e n o s la p ro te ín a v ira l 1 (V P 1 ) d e A A V 8 y la s p ro te ín a s e s tru c tu ra le s v ira le s d e la p ro te ín a v ira l 3 (V P 3 ) d e A A V 2 , e n d o n d e el p r im e r á c id o n u c le ic o c o d if ic a V P 1 s o lo d e l s e ro t ip o A A V 8 p e ro n o e s c a p a z d e e x p re s a r V P 3 , y la s e g u n d a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o c o d if ic a V P 3 s o lo d e un s e ro t ip o A A V 2 y a d e m á s n o e s c a p a z d e e x p re s a r V P 1 , y e n d o n d e , e l v ir ió n d e A A V c o m p re n d e V P 1 s o lo d e l s e ro t ip o A A V 8 y V P 3 s o lo d e l s e ro t ip o A A V 2 , y e n d o n d e s i s e e x p re s a la p ro te ín a v ira l 2 (V P 2 ), e s s o lo d e l s e ro t ip o A A V 8.
2. U n a p lu ra lid a d d e p a rt íc u la s d e v e c to r d e A A V g e n e ra d a s m e d ia n te e l m é to d o d e la re iv in d ic a c ió n 1.
3. U n a c á p s id e d e v iru s a d e n o a s o c ia d o (A A V ) q u e c o m p re n d e u n a p ro te ín a v ira l 1 d e A A V 8 (V P 1 ), p ro te ín a v ira l 2 d e A A V 8 (V P 2 ) y p ro te ín a v ira l 3 d e A A V 2 ( V p 3), e n d o n d e la V P 1 y V P 2 e n la c á p s id e s o n s o lo d e A a V 8, y la V P 3 e n la c á p s id e e s s o lo d e A A V 2.
4. U n a p a rt íc u la d e v e c to r d e v iru s a d e n o a s o c ia d o (A A V ) q u e c o m p re n d e :
(a ) la c á p s id e d e A A V d e la re iv in d ic a c ió n 3; y
(b ) u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o q u e c o m p re n d e al m e n o s u n a s e c u e n c ia d e re p e t ic ió n te rm in a l, y q u e c o m p re n d e o p c io n a lm e n te u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o h e te ró lo g a , e n d o n d e la m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o e s tá e n c a p s id a d a p o r la c á p s id e d e A A V .
5. L a p a rt íc u la d e v e c to r d e A A V d e la re iv in d ic a c ió n 4 p a ra u s a rs e e n un m é to d o d e tra ta m ie n to .
6. U n a c o m p o s ic ió n q u e c o m p re n d e la c á p s id e d e A A V d e la re iv in d ic a c ió n 3 y /o la p a r t íc u la d e v e c to r d e A A V d e c o n fo rm id a d c o n la re iv in d ic a c ió n 4 e n un p o r ta d o r fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le .
7. U n m é to d o p a ra fa b r ic a r un v e c to r d e v iru s a d e n o a s o c ia d o (A A V ), q u e c o m p re n d e :
a ) t r a n s fe c ta r u n a c é lu la h o s p e d a d o ra c o n u n o o m á s p lá s m id o s q u e p ro p o rc io n a n , e n c o m b in a c ió n , to d a s la s fu n c io n e s y g e n e s n e c e s a r io s p a ra e n s a m b la r p a r t íc u la s d e A A V , e n d o n d e la s p ro te ín a s d e la c á p s id e e s tá n c o d if ic a d a s e x c lu s iv a m e n te p a ra u n o o m á s p lá s m id o s q u e e x p re s a n s o lo la p ro te ín a v ira l 1 d e A A V 8 y la p ro te ín a v ira l 2 (V P 1 /V P 2 ) y la p ro te ín a v ira l 3 d e A A V 2 (V P 3 );
b) in t ro d u c ir u n a o m á s c o n s tru c c io n e s d e á c id o n u c le ic o e n u n a lín e a c e lu la r d e e n v a s a d o o lín e a c e lu la r p ro d u c to ra p a ra p ro p o rc io n a r , e n c o m b in a c ió n , to d a s la s fu n c io n e s y g e n e s n e c e s a r io s , in c lu id a s la s s e c u e n c ia s d e v iru s a u x il ia r p a ra e n s a m b la r p a r tíc u la s d e A A V , e n d o n d e la s p ro te ín a s d e la c á p s id e e s tá n c o d if ic a d a s e x c lu s iv a m e n te p a ra u n a o m á s c o n s tru c c io n e s d e á c id o n u c le ic o q u e e x p re s a n s o lo V P 1 /V P 2 d e A A V 8 y s o lo V P 3 d e A A V 2 ;
c ) in t ro d u c ir e n u n a c é lu la h o s p e d a d o ra u n o o m á s v e c to re s d e b a c u lo v iru s re c o m b in a n te s q u e p ro p o rc io n a n en c o m b in a c ió n to d a s la s fu n c io n e s y g e n e s n e c e s a r io s p a ra e n s a m b la r p a r t íc u la s d e A A V , e n d o n d e la s p ro te ín a s d e la c á p s id e e s tá n c o d if ic a d a s e x c lu s iv a m e n te p a ra u n o o m á s p lá s m id o s q u e e x p re s a n s o lo V P 1 /V P 2 d e A A V 8 y s o lo V P 3 de A A V 2 ; y /o
d ) in t ro d u c ir e n u n a c é lu la h o s p e d a d o ra u n o o m á s v e c to re s d e h e rp e s v iru s re c o m b in a n te s q u e p ro p o rc io n a n en c o m b in a c ió n to d a s la s fu n c io n e s y g e n e s n e c e s a r io s p a ra e n s a m b la r p a r t íc u la s d e A A V , e n d o n d e la s p ro te ín a s d e la c á p s id e e s tá n c o d if ic a d a s e x c lu s iv a m e n te p a ra u n o o m á s p lá s m id o s q u e e x p re s a n s o lo V P 1 /V P 2 d e A A V 8 y s o lo V P 3 de A A V 2.
8. El m é to d o d e la re iv in d ic a c ió n 7 , e m d o n d e la s s e c u e n c ia s d e v iru s a u x il ia r s o n s e c u e n c ia s a u x il ia re s d e a d e n o v iru s o s e c u e n c ia s a u x il ia re s d e h e rp e s v iru s
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