JP2016518121A - キメラアデノ随伴ウイルス/ボカウイルスパルボウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年4月8日に出願された米国特許出願第61/809,702号明細書(その開示は本明細書に組み込まれる)の出願日の利益を主張する。
本発明は、米国立保健研究所により授与されたHL108902の下での政府の援助を伴いなされた。政府は本発明においてある種の権利を有する。
阻害剤の使用を必要とする(非特許文献21;非特許文献23)。
BoV1ゲノムから生成した。HBoV1のより大きいゲノムおよび高い気道向性は、遺伝性および後天性肺疾患のような遺伝病および後天性疾患、癌の遺伝子治療、ならびに例えば呼吸疾患に対するワクチンを包含する遺伝子導入例えば気道遺伝子導入のためのウイルスベクターを創成するために理想的である。本明細書にさらに記述されるとおり、HBoV1キャプシドが過大なrAAV2ゲノムをパッケージングしたrAAV2/HBoV1キメラウイルス(例えば約5.5kbゲノム)を創成した。臨床試験は、肺嚢胞性線維症(CF)疾患のための遺伝子治療の状況でrAAV2ゲノムを適用することの安全性を裏付けている。該キメラベクターは、HBoV1キャプシドの気道頂端向性もまた提供しつつ、rAAV2ゲノムの高い安全性プロファイルを保持する。rAAV2/HBoV1は、rAAV1若しくはrAAV2(4.7kbゲノム)よりそれぞれ5.6および70倍より大きい効率でHAEを頂端で形質導入することが可能であることが示された。分子研究は、気道上皮細胞の分極がHBoV1キャプシドに媒介される遺伝子導入に必要とされたことを示した。さらに、完全長のCFTRコーディング配列および強いCBAプロモーターを含有するrAAV2/HBoV1−CFTRウイルスは、嚢胞性線維症のHAE中のCFTR依存性塩素イオン輸送を効率的に修正した。従って、キメラAAV/HBoVウイルスベクターは、嚢胞性線維症および他の肺疾患の遺伝子治療、ならびにHBoV1感染症およびインフルエンザウイルスのような他の呼吸器ウイルスに対するワクチンの開発に有用である。感染期中のプロテアソーム阻害剤の同時投与もまた、AAV/HBoV1キメラベクター形質導入を1000倍だけ大きく高める。
産物をコードする発現カセットを包含しうる。一態様において、遺伝子産物は治療的遺伝子産物である。一態様において、遺伝子産物は予防的遺伝子産物である。一態様において、遺伝子産物は触媒RNAである。一態様において、遺伝子産物はポリペプチド若しくはペプチドである。一態様において、キャプシドタンパク質はHBoV1、HBoV2、HBoV3若しくはHBoV4キャプシドタンパク質である。一態様において、ボカウイルスキャプシドタンパク質は、肺若しくは他の器官の感染症についての独特の向性を付与するヒト以外の種から単離されたボカウイルス、例えばブタボカウイルスからである。一態様において、ワクチン接種のため使用されるrAAV/HBoV若しくはrAAV/BoVベクターは家畜若しくは愛玩動物を保護するため動物で使用される。一態様において、AAVゲノムはAAV−1、AAV−2若しくはAAV−5ゲノムである。一態様において、AAVゲノムはAAV−1、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6、AAV−7、AAV−8若しくはAAV−9ゲノムである。
んでなるrAAVゲノムを含んでなるキメラウイルスと接触させることを包含し、ここで該量はrAAVの形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める。
様において、剤はプロテアソーム調節物質例えばプロテアソーム阻害剤である。一態様において、剤は化学療法剤、脂質低下薬、抗生物質、粘液溶解薬若しくは食品添加物である。
定義
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含んでなるか若しくはそれと会合しかつin vitro若しくはin vivoいずれかで細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するのに使用し得る巨大分子若しくは巨大分子の会合を指す。具体的に説明するベクターは、例えばプラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ベヒクルを包含する。ときに「標的ポリヌクレオチド」若しくは「トランスジーン」と称される送達されるべきポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコーディング配列(治療的若しくは目的のタンパク質をコードする遺伝子のような)、ワクチン開発における目的のコーディング配列(哺乳動物において免疫応答を導き出すのに適するタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような)および/または選択可能若しくは検出可能なマーカーを含みうる。
情報が存在しない。rAAVゲノムはいずれの血清型のAAVからでもありうる。
ム調節物質は、例えばトリペプチジルアルデヒド(MG132すなわちZ−LLL若しくはMG101すなわちLLnL)、ボルテゾミブ(Velcade)、プロテアソームのカルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼおよび/若しくはキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害する剤のようなプロテアソーム阻害剤を包含する(Wagnerら、2002;Youngら、2000;Seisenbergerら、2001)。
リメラーゼ分子が転写されているDNAから遊離されたようになる若干の傾向が常に存在し、かつ、コーディング領域に達する前に横断されるべき配列の長さを増大させることが、コーディング領域の転写が完了する若しくはおそらく開始される前でさえ遊離が起こるであろう見込みを一般に増大させるであろうために生じる。ターミネーターは、従って、一方向のみ(「一方向」ターミネーター)若しくは双方の方向(「双方向」ターミネーター)からの転写を予防することができ、そして配列特異的終止配列若しくは配列非特異的ターミネーターまたは双方から構成されうる。多様なこうしたターミネーター配列が当該技術分野で既知であり;そして本発明の状況内のこうした配列の具体的に説明する使用を下に提供する。
スプライシング、翻訳若しくは分解を包含するポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は過程の頻度、速度若しくは特異性に影響することがあり、また、性質が高める若しくは阻害性でありうる。当該技術分野で既知の調節エレメントは、例えばプロモーターおよびエンハンサーのような転写制御配列を包含する。プロモーターは、ある種の条件下で、RNAポリメラーゼを結合しかつ通常は該プロモーターから下流(3’の方向に)に配置されるコーディング領域の転写を開始することが可能なDNA領域である。プロモーターはAAVプロモーター例えばP5、P19、P40およびAAV ITRプロモーターならびに異種プロモーターを包含する。
合物からそれを濃縮するための精製技術を使用することにより製造しうる。濃縮は、溶液の容量あたり重量のような絶対基準で測定し得るか、若しくはそれは供給源混合物中に存在する第二の潜在的に妨害する物質に関して測定し得る。
ヒト気道上皮細胞は、臨床試験で最も広範に使用されている遺伝子治療ベクター、アデノ随伴ウイルス(rAAV)を包含される大部分のウイルスベクターによる感染に高度に耐性である。乳幼児および若年小児における喘鳴を伴う急性気道感染症(ARTI)の病原体でありそうである(Allanderら、2007;Christensenら、2010;Dengら、2012;Donら、2010)自律性ヒトパルボウイルス、ヒト
ボカウイルス1(HBoV1)は、頂端膜からHEAを効率的に感染させ、子孫ウイルスの複製および細胞病理をもたらす(Huangら、2012a)。印象的には、細胞あたり10-3DNアーゼ耐性粒子(DRP)というきわめて低い感染多重度(MOI)でのHAEのHBoV1感染が増殖性感染をもたらす(実施例2を参照されたい)。最近、完全長の5543ntのHBoV1の完全なゲノム(双方の端の末端パリンドローム配列を包含する)がクローン化され、そしてHBoV1産生のための細胞培養物系が確立された(実施例1)。HAEの頂端膜側からのHBoV1感染の高い効率を考え、HBoV1はヒト気道遺伝子治療のための組換えベクターを操作するのに適することが仮定された。
作動可能に連結されている異種プロモーター例えば強いプロモーターを収容し得る長さ約5.2kb若しくはそれ以上の)外来遺伝子、ならびに複製およびパッケージのための全部のシスエレメントを内部に持ち、該ヘルパープラスミドはHBoVウイルスタンパク質のための発現カセットのみをコードする。HBoV1ウイルスの1つの重要な特徴は、依存性パルボウイルスでありかつ複製のためにヘルパーウイルス共感染を必要とするrAAVと対照的に、そのゲノムが許容細胞中で自律的に複製することである。
予防的若しくは治療的遺伝子産物は別にして、組換えAAVベクターおよび/若しくは
ウイルスは、例えば、それと二重鎖を形成することにより正常なmRNAの翻訳を阻害するのに使用し得るアンチセンスmRNA(mRNAの相補物)をコードするポリヌクレオチドおよびリボザイム(RNA触媒)をコードするポリヌクレオチドを包含する、タンパク質をコードしないポリヌクレオチドもまた含み得る。加えて、適切に配置されたスプライスアクセプター部位および/若しくはスプライスドナー部位により隣接されている、または異種エンハンサー、異種プロモーター若しくは異種エンハンサーおよびプロモーターのような転写制御配列を有するオープンリーディングフレームの部分を有するrAAVベクターの選択された対を使用しうる。例えば米国特許第6,436,392号明細書(その開示は本明細書に引用することにより組み込まれる)を参照されたい。例えば、第一のAAVベクターは、AAVの5’末端逆位配列を含んでなる第一のDNAセグメント;遺伝子の1エクソンおよびスプライスドナー部位を含んでなるDNAフラグメントに作動可能に連結されているプロモーターを含んでなる第二のDNAセグメントであって、該第二のDNAセグメントは完全長ポリペプチドをコードせず;およびAAVの3’末端逆位配列を含んでなる第三のDNAセグメントを包含することができ;ならびに、第二のAAVベクターは、連結された:AAVの5’末端逆位配列を含んでなる第一のDNAセグメント;スプライスアクセプター部位、および第一のAAVベクターのDNAセグメントと一緒になって完全長ポリペプチドをコードする最低1個の他のエクソンを含むDNAフラグメントを含んでなる第二のDNAセグメント;ならびにAAVの3’末端逆位配列を含んでなる第三のDNAセグメントを含んでなる。一例において、第一のAAVベクターは、以下、すなわちAAVの5’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント;転写制御領域を包含する遺伝子の一部分を含んでなる第二の核酸セグメント;スプライスドナー部位を含んでなる第三の核酸セグメント;およびAAVの3’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを包含し;ならびに、第二のAAVベクターは、連結された:AAVの5’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント;スプライスアクセプター部位を含んでなる第二の核酸セグメント;第一のAAVベクターの核酸セグメントと一緒になって機能的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる遺伝子を含んでなる遺伝子の一部分を含んでなる第三の核酸セグメント;およびAAVの3’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを含んでなる。さらなる一例において、第一のAAVベクターは、以下、すなわちAAVの5’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント;スプライスアクセプター部位を含んでなる第二の核酸セグメント;遺伝子の一部分を含んでなる第三の核酸セグメント;およびAAVの3’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを包含し;ならびに、第二の組成物は:AAVの5’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント;該部分を有する上の核酸セグメントと一緒になって機能的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる遺伝子を含んでなる遺伝子の一部分を含んでなる第二の核酸セグメントであって、該遺伝子の該部分は転写制御領域を包含し;スプライスドナー部位を含んでなる第三の核酸セグメント;AAVの3’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを含んでなる第二のAAVベクターを含んでなり;このベクターは宿主細胞中で、第二のAAVベクターからの配列に連結されている第一のAAVベクターからの配列を含んでなるRNA転写物を生じ、この配列はスプライスドナー部位がスプライスアクセプター部位に対し5’であるように配置され、ならびにこの転写物は機能的タンパク質をコードするmRNAにスプライスされる。
存在によりさらに示唆される。類似の感染性パターンもまた、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることを示唆する。多様なAAV血清型のなかでAAV2が最も普遍的に使用される。
させるために、例えば(必ずしもでないとは言え)AAV起源のいかなる介在配列も伴わずにいずれかの直接近位でコーディング配列から上流および下流双方に現れることを意味している。しかしながら、単一のITRが2個のITRを含んでなる配置と通常関連する機能を実行するのに十分であることができ(例えば第WO 94/13788号明細書を参照されたい)、そして1個のみのITRをもつベクター構築物を、従って本発明のパッケージングおよび製造方法とともに使用し得る。
rep遺伝子を含んでなるAAVパッケージングプラスミドを、複製機能を供給するのに使用し得る(米国特許第5,658,776号明細書に記述されるとおり)。あるいは、プロモーターに作動可能に連結されているAAV rep遺伝子を含む安定な哺乳動物細胞株を、複製機能を供給するのに使用し得る(例えば、Trempeら、第WO 9513392号明細書);Bursteinら(第WO 98/23018号明細書);およびJohnsonら(米国特許第5,656,785号明細書)を参照されたい。上述されたところのキャプシド形成タンパク質を提供するAAV cap遺伝子は、AAV rep遺伝子と一緒に若しくは別個に提供し得る(例えば上で引用される明細書および特許、ならびにAllenら(第WO 98/27204号明細書)を参照されたい。他の組合せが可能でありかつ本発明の範囲内に包含される。
キメラウイルス若しくはrBoVは遺伝子治療若しくはワクチン接種の目的上個体への投与のため使用し得る。治療のための適する疾患は、限定されるものでないが、ウイルス、細菌若しくは寄生生物感染により誘発されるもの、多様な悪性病変および過剰増殖状態、自己免疫状態、ならびに先天性欠損症を挙げることができる。
る場合に固体若しくは液体いずれかのエアロゾルを提供する組成物を使用するエアロゾル剤による。気道中への別の投与様式は、ベクターを滴下するための軟性光ファイバー気管支鏡を使用することである。典型的に、ウイルスベクターはリンゲル平衡塩類溶液(pH7.4)のような製薬学的に適するパイロジェンフリー緩衝液中にある。必要とされないとは言え、製薬学的組成物は、場合によっては、正確な量の投与に適する単位剤形で供給されうる。
、若しくは免疫蛍光細胞計数により分析しうる。ベクターを気管支鏡検査法により投与する場合、肺機能検査を実施することができ、また、気管支肺胞洗浄液を炎症性サイトカインの存在について評価しうる。処置された被験者もまた、臨床特徴について、および該細胞が該治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドにより運搬されることを意図している機能を発現しているかどうかを決定するために監視しうる。
本発明で有用な剤の分類は、限定されるものでないが抗生物質、化学療法剤例えばアントラサイクリン類、プロテアソーム調節物質、脂質低下薬、粘液溶解薬および食品添加物を挙げることができる。例示的剤は、プロテアソーム阻害剤(Wagnerら、2002;Youngら、2000;Seisenbergerら、2001)、ならびにプロテアソームおよびユビキチン経路を調節する、例えばプロテアソームに結合しかつ/若しくはプロテアソーム、ユビキチン、ユビキチン担体タンパク質若しくはユビキチンリガーゼの活性を調節する剤を包含する。これらの剤の例は、抗生物質例えばエポキソミシン、脂質低下薬例えばシンバスタチン、食品添加物例えばタンニン酸、および化学療法剤例えばシスプラチン、ドキソルビシンのようなアントラサイクリン、ならびにカンプトテシンを制限なしに包含する。一態様において、該剤は、
LLnL(MG101)、Z−LLL(MG132)、ボルテゾミブ(Velcade)、エポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、シンバスタチン、タンニン酸、カンプトテシン若しくはシスプラチン
である。
(式中
R2はN末端アミノ酸封鎖基であり;
R3、R4およびR5はそれぞれ独立に水素、(C1−C10)アルキル、アリール若しくはアリール(C1C10)アルキルであり;ならびに
R6、R7およびR8はそれぞれ独立に水素、(C1−C10)アルキル、アリール若しくはアリール(C1C10)アルキルであり);またはその製薬学的に許容できる塩
である。
(式中、Rは水素、アミノ酸若しくはペプチドであり、N末端アミノ酸は場合によってはアミノ基でアセチル、アシル、トリフルオロアセチル若しくはベンジルオキシカルボニルで保護されていることができ;Aはアミノ酸若しくは直接結合であり;A1は1アミノ酸であり;ならびに
R1はヒドロキシ若しくはアミノ酸であり、ここでC末端アミノ酸は場合によってはカルボキシ基で(C1−C6)アルキル、フェニル、ベンジルエステル若しくはアミド(例えば各Rが独立に水素若しくは(C1−C6)アルキルであるC(=O)NR2)で保護されていることができ);
またはその製薬学的に許容できる塩
である。
本発明により同定される剤の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか若しくは予防的であるか、および当業者に既知の他の要因に依存して連続的若しくは間歇的でありうる。本発明の剤の投与は、予め選択された時間の期間にわたり本質的に連続的でありうるか、若しくは一連の間隔を空けられた用量でありうる。局所および全身双方の投与を企図している。本発明の剤が予防目的上使用される場合、本発明の剤は例えば全身投与による慢性の使用に従う。
。肺への投与のためには気道投与が好ましいことができる。該製剤は、適切な場合、別個の単位剤形で便宜的に提示されることができ、そして薬局に公知の方法のいずれかにより調製しうる。こうした方法は、剤を液体担体、固体マトリックス、半固形担体、微細に粉砕された固体担体若しくはそれらの組合せとの会合にもたらす段階、およびその後必要な場合は生成物を所望の送達系に導入若しくは成形する段階を包含しうる。
用量容器中の単位投与形態で提示しうる。有効成分は、油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液若しくは乳剤のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定化剤および/若しくは分散助剤のような調合剤(formulatory agent)を含有しうる。あるいは、有効成分は、使用前に適するベヒクル例えば無菌のパイロジェンフリー水での構成のため、無菌固形物の無菌的単離若しくは溶液からの凍結乾燥により得られる粉末の形態にあることができる。
しくは複数)を覆いかつその後裏打ち層の伸張の表面が接着手段のための基部となり得る様式で外側に伸張し得るように、より大きな寸法のものであり得る。あるいは、ポリマーマトリックスはポリアクリレート若しくはアクリレート/ビニルアセテートコポリマーのような接着性ポリマーを含有し得るか若しくはそれから構築され得る。長期適用のため、微孔性かつ/若しくは呼吸可能な裏打ち積層を使用することが望ましいことができ、その結果皮膚の水和若しくは解離が最低限にされ得る。
。液体スプレー剤は便宜的に加圧パックから送達される。滴剤は、単純な点眼用スポイトで蓋をされた瓶(eye dropper−capped bottle)を介して、若しくは液体内容物を一滴ずつ送達するように適合されたプラスチック瓶を介して、特別に造形された閉鎖を介して送達し得る。
一態様において、本発明は、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびrAAVゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを提供する。一態様において、ボカウイルスキャプシドはHBoVキャプシドである。一態様において、HBoVキャプシドはHBoV1、HBoV2、HBoV3若しくはHBoV4キャプシドである。一態様において、ゲノムは異種遺伝子産物例えば治療的タンパク質をコードする発現カセットを含んでなる。一態様において、rAAVゲノムはrAAV−2ゲノムである。一態様において、rAAVゲノムはrAAV−1、rAAV−3、rAAV−4、rAAV−5、rAAV−6、rAAV−7、rAAV−8若しくはrAAV−9ゲノムである。一態様において、rAAvゲノムはヒト以外の種のAAV由来である。一態様において、発現カセットは繊毛気道上皮細胞で発現されるプロモーター例えばFOXJ1プロモーターを包含する。一態様において、ゲノムはトランススプライシングドメインを包含する。ウイルスゲノムによりコードされる遺伝子産物は、ウイルス、細菌、腫瘍若しくは真菌抗原でありうる。一態様において、トランスジーンは中和抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする。一態様において、遺伝子産物は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼA、第VIII因子、ジストロフィン、α1−アンチトリプシン、サーファクタントタンパク質SP−D、SP−A若しくはSP−C、エリスロポエチン、RSVタンパク質、HBoVタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARSタンパク質、サイトカイン例えばIFN−α、IFN−γ、TNF、IL−1、IL−17若しくはIL−6である。異種遺伝子産物例えば治療的遺伝子産物、触媒RNA、予防的遺伝子産物、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するのに有効な量で細胞を感染させるのに単離されたキメラウイルスを使用する、哺乳動物細胞中での異種遺伝子産物の発現方法もまた提供される。一態様において、ウイルスは昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞から単離される。哺乳動物細胞のキメラウイルス形質導入を高める方法がさらに提供される。該方法は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および異種遺伝子産物をコードするトランスジーンを
含んでなるrAAVゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルス、ならびにrAAV形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低1種の剤と哺乳動物細胞を接触させることを包含する。一態様において、哺乳動物細胞は哺乳動物肺細胞である。一態様において、剤はプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物である。
しくは寄生生物の抗原である。一態様において、遺伝子産物はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物に対する中和抗体である。
なるrHBoVと接触させることを包含し、ここで該量は形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める。剤は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびrHBoVゲノムを含んでなる単離されたrHBoVを用いるウイルス遺伝子治療にかけられる哺乳動物に投与することができ、ここで該ゲノムは哺乳動物におけるその発現が治療的であるトランスジーンを含んでなる。該剤はプロテアソーム阻害剤であることができ、そして該剤と接触されない哺乳動物中の細胞に関して哺乳動物の細胞中のトランスジーンの発現を高めるのに有効な量で投与される。一態様において、rHBoVは治療的ペプチド若しくは治療的ポリペプチドをコードする。一態様において、細胞若しくは哺乳動物は細胞がウイルスと接触される前に該剤と接触される。一態様において、細胞若しくは哺乳動物は細胞が剤と接触される前にウイルスと接触される。一態様において、細胞若しくは哺乳動物はウイルスおよび剤と同時に接触される。一態様において、剤およびウイルスは肺に投与される。一態様において、ウイルスは経口投与される。一態様において、ウイルスは鼻に投与される。一態様において、ウイルスは血管に投与される。
細胞培養
細胞株および初代細胞。ヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞(CRL−1573)、HeLa(CCL−2)、MDCK(CCL−34)、MRC−5(CCL−171)、LLC−MK2(CCL−7)およびVero−E6(CRL−1586)はAmerican Type Culture Collection(ATCC、ヴァージニア州マナサス)から得、そして10%ウシ胎児血清(FCS)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。ヒト気道上皮細胞から発する細胞株は、A549(ATCC CCL−185)、BEAS−2B(ATCC CRL−9609)、16HBE14o−(Dieter Gruenert博士から得た)ならびにNuLi−1およびCuFi−8(Tissue and Cell Culture Core、Center for Gene Therapy、University of Iowa)である。NuLi−1およびCuFi−8は、hTERTおよびHPV E6/E7遺伝子を発現することによりそれぞれ正常および嚢胞性線維症ヒト初代気道細胞から不死化した(Zabnerら、2003)。初代Clonetics正常ヒト気管支/気管
上皮細胞(NHBE)はLonza(メリーランド州ウォーカーズビル)から購入した。細胞は供給元により提供される説明書に従って培地中で培養した。
鼻咽頭吸引液を、急性HBoV1感染(抗体陽転、ウイルス血症、および吸引液1mlあたり104gcを上回るHBoV1)を有したブラジル・サルヴァドールの市中肺炎を伴う小児から得た(Nascimento−Carvalhoら、2012)。ウイルスDNAをKantolaら(2010)に記述される方法に従って抽出した。
HBoV1エピソームのヘッドトゥーテイル結合の配列は、HBoVのLEHおよびREHがそれぞれBPVのLEHおよびMVCのREHのもの(Sunら、2009;Lusebrinkら、2011)と構造および配列双方の類似性を共有していることを示唆する。PhusionハイフィディリティーPCRキット(NEB、マサチューセッツ州イプスウィッチ)を製造元の説明書に従って使用して、HBoV1の左端ヘアピン(LEH)および右端ヘアピン(REH)を増幅した。簡潔には、98℃で30秒間のDNA変性に、35サイクルの:98℃で10秒間の変性;55℃で15秒間のアニーリング;および72℃で30秒間の伸張が続いた。最終サイクルの後に伸張を72℃で10分間継続した。PCR産物を2%アガロースゲル中の電気泳動により分析した。DNAバンドをQIAquickゲル抽出キット(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を使用して抽出し、そして抽出されたDNAを、フォワードおよびリバース増幅プライマー上の伸張された配列に相補的なプライマーを使用して、MCLAB(カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)で直接配列決定した。PCRで生成されたDNAをpGEM−Tベクター(Promega、ウィスコンシン州マディソン)にクローン化し、そして個々のクローンの培養物から単離されたDNAをその後配列決定した。
pBBベクターの構築。pBBSmaIベクターを、B19V感染性クローンpM20(Zhiら、2004)からB19V配列の全部を除去することにより(SalI消化)生成されたベクターバックボーン(pProEX HTbベクター;Invitrogen)中に59−SalI−SacII−KpnI−SmaIApaI−SphI−KpnI−HindIII−XhoI−39のリンカーを挿入することにより構築した。全部のクローン化作業はSure 2(Agilent、カリフォルニア州ラホヤ)の大腸菌(
Escherichia coli)株で実施した。HBoV1の全部のヌクレオチド番号はHBoV1完全長ゲノム(GenBank受託番号:JQ923422)を指す。
60mm皿中で増殖された細胞を2mgのプラスミドでトランスフェクトし;Lipofectamine and Plus試薬(Invitrogen/Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド)をQiuら(2002)に記述されるとおり使用した。トランスフェクション実験のいくつかについて、HEK293細胞を、アデノウイルス5(Ad5)E2a、E4orf6およびVA遺伝子を含有する2mgのpHelperプラスミド(Agilent)とコトランスフェクトしたか、若し
くはQiuら(2002)に記述されるとおり5のMOIのアデノウイルス5型に感染させた。
低分子量(Hirt)DNAをトランスフェクトされた細胞から抽出し、DpnIで消化し(若しくは消化されないままにし)そしてQiuら(2006)に記述されるとおりサザンブロッティングにより分析した。
細胞を溶解し、SDS−8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離し、そしてLiuら(2004)に記述されるとおり示されるところの抗体を用いてブロッティングした。
HEK293細胞をDMEM−10%FCS中15枚の150mmプレート上で培養し、そしてLipoD293(SignaGen、メリーランド州ゲーサーズバーグ)を使用して皿あたり15mgのpIHBoV1でトランスフェクトした。5%CO2および37℃で48時間維持された後に細胞を収集し、10mLのリン酸緩衝生理的食塩水、pH7.4(PBS)に再懸濁し、そしてそれらを4凍結(−196℃)および解凍(37℃)サイクルにかけることにより溶解した。細胞ライセートをその後10,000rpmで30分間回転した。上清を収集しかつ連続的CsCl勾配で評価した。簡潔には、密度をCsClを添加することにより1.40g/mLに調整し、そしてサンプルを11ml遠心管中に負荷しかつSorvall TH641ローターで36,000rpmで20℃で36時間回転した。
最終の精製されたウイルス調製物を約5倍だけ濃縮し、そして炭素膜で被覆された300メッシュの銅EMグリッドに1分間吸着させ、次いで脱イオン水で5秒間洗浄しかつ1%酢酸ウラニルで1分間染色した。グリッドを風乾し、そして電界放出銃を装備された200kVのTecnai F20 G2透過型電子顕微鏡で検査した。
完全に分化した初代B−(3種の異なるサブタイプのそれぞれ)、CuFi−およびNuLi−HAEをMillicellインサート(0.6cm2;Millipore)中で培養し、そして150μLの精製されたHBoV1(リン酸緩衝生理的食塩水、pH7.4;PBS中1×107gc/mL)を頂端膜側から(約750gc/細胞の感染多重度すなわちMOIで;インサートあたり2×106細胞の平均)接種した。HAEのそれぞれについて、2時間インキュベーション、次いで頂端チャンバー(apical chamber)からウイルスを吸引し、そして200mLのPBSで細胞を3回洗浄して結合されないウイルスを除去した。HAEをその後ALIでさらに培養した。
で感染させた。
HBoV1感染後、ALIメンブレンをPBS中3.7%パラホルムアルデヒドで室温にて15min固定した。固定されたメンブレンを数個の小片に切断し、PBSで5分間3回洗浄し、そして0.2%Triton X−100で室温で15分間透過処理した。メンブレンをその後、2%FCSを含むPBS中100倍希釈の一次抗体と37℃で1時間インキュベートした。これに次いでフルオレセインイソチオシアネート若しくはローダミン結合二次抗体とインキュベートした。共焦点画像を、Nikon EZ−C1ソフトウェアにより制御されるEclipse C1 Plus共焦点顕微鏡(Nikon、ニューヨーク州メルビル)を用いて撮影した。使用された一次抗体はChenら(2010)に報告されたところの抗(HBoV1)NS1、NP1およびVP1/2であった。
ウイルスサンプルを頂端および側底双方の膜側から複数の時点で収集した。頂端の洗浄および収集は、200mLのPBSを頂端チャンバーに添加すること、サンプルを37℃および5%CO2で10分間インキュベートすること、ならびに200mLのPBSを頂端チャンバーから取り出しかつ保存することにより実施した。その後50mLの培地を各側底チャンバーから収集した。
GTA GGA−3’(配列番号2;nt2466ないし2443);およびPrimeTimeプローブ、5’ 6FAM−TGA GCT CAG GGA ATA TGA AAG ACA AGC ATC G−3’ Iowa Black FQ(配列番号3;nt2411ないし2441)。Premix Ex Taq(Takara Bio USA、ウィスコンシン州マディソン)を標準的プロトコルに従いqPCRのため使用した。2.5mLの抽出されたDNAを25mLの反応容量で使用した。
感染の最後の日に、Millicellインサート上のHAEをPBSで洗浄しかつ4%パラホルムアルデヒド中で約30分間固定した。固定されたメンブレンを数個の小片に
切断しそしてPBSで3回洗浄した。各メンブレン断片を15mL円錐管中の20%ショ糖に移しかつ底部に滴下させ;それをその後、刃に直角なメンブレンの切り出しを可能にした方向で凍結保護物質OCT中に垂直に埋め込んだ。クライオスタット切片を10mmの厚さで切断し、スライド上に置きそしてヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。画像を60倍の倍率でNikon 80i蛍光顕微鏡で撮影した。
HBoV1ゲノムの末端ヘアピンはボカウイルス属のものに典型的である HBoV1に感染させたHAE中で同定されたHBoV1エピソームのヘッドトゥーテイル結合(Schildgrenら、2012;Lasebrinkら、2011)は、BPV1の左端ヘアピン(LEH)の部分に同一の2配列(3’−CGCGCGTA−5’および3’−GATTAG−5’)を所有することが見出された(Sunら、2009;Chenら、1986)。この知見はヘッド配列がHBoV1 LEHの一部であることを示唆した。ヘッド配列をリバースプライマー(RHBoV1_LEH)の39端として使用した。BPV1 LEHから予測されるHBoV1ゲノムの39端を固定するフォワードプライマー(FHBoV1_nt1)と一緒になって、LEHのヘアピンを、HBoV1に感染した患者から採取された鼻咽頭吸引物(HBoV1 Salvador1単離物)(Nascimento−Carvalhoら、2012)から調製されたウイルスDNA抽出液(1.26108gc/mL)から増幅した。ただ1本の特異的DNAバンドがおよそ150bpに検出された。
TAG TTA TAT ATA ACA T−3’;配列番号4)を含有することが見出された。従って、HBoV1 REH全体がそのMVC対蹠物に構造が類似であることが推測された。この配列を標的とされたリバースプライマー(RHBoV1_nt5464)およびREHの上流に位置するフォワードプライマー(FHBoV1_nt5201)を使用して、特異的な約300bp長のDNAフラグメントを増幅した。配列決定は、予測されたREHのパリンドロームヘアピンの存在を確認し、そしてヘアピンの端の2個の新規ヌクレオチドを示した。
HBoV1 Salvador1単離物の非構造(NS)およびキャプシド(VP)タンパク質コーディング(NSVP)遺伝子を、患者で抽出されたウイルスDNAからクローン化および配列決定した。その後、LEH、NSVP遺伝子およびREHをpBBSmaI中に連結した。該単離物の完全長ゲノムのこの配列をGenBankに寄託し(JQ923422)、これは本明細書に引用することにより組み込まれる。
かどうかを検討した。具体的には、pIHBoV1をHEK293細胞(処理されない若しくはアデノウイルスに感染させた)に単独で若しくはpHelperとともにトランスフェクトした。興味深いことに、pIHBoV1がヘルパーウイルスの非存在下で良好に複製したことが見出された。事実、全3種の代表的形態の複製されたボカウイルスDNA(Sunら、2009;Luoら、2011)(DpnI消化耐性dRF DNA、mRF DNAおよびssDNA)が、各テストケースでかつ同様のレベルで検出された。DpnI消化は、ダム部位(dam site)でメチル化されている原核生物細胞から調製されたプラスミドDNAのみを切断する(Wohbeら、1985)ため、DpnI消化耐性DNAのバンドは細胞中で新たに複製されたDNAである。対照的に、これらDNAの形態のウイルスゲノムはpIHBoV1でトランスフェクトされた初代気道上皮細胞(NHBE)中で非存在であり、かつ、pIHBoV1でトランスフェクトされたヒト気道上皮細胞株BEAS−2B、A549および16HBE14o−中で、アデノウイルスの存在下であっても非常に低レベル(pIHBoV1でトランスフェクトされたHEK293細胞中より20倍超より低い)で存在した。従って、これらの細胞中での複製はこれらの状況で非存在であるか若しくは乏しいようである。
pIHBoV1でトランスフェクトされたHEK293細胞から精製されたHBoV1ビリオンの感染性を、HBoV1感染に対し許容性であることが既知のin vitro培養物モデルである(Dijkmanら、2009)分極された初代HEAで検査した。3組(異なるドナー、培養物ロット#B29−11、B31−11およびB33−11)のB−HAEを生成し、そしてこれらをHBoV1に頂端側から感染させた。最初に、B−HAE培養物を多様な量のウイルスに感染させ、そして約750gc/細胞の感染多重度(MOI)を使用した場合、細胞の大部分(約80%)が感染後(p.i.)5日に抗NS1染色(ウイルスゲノムが複製したことおよびそれによりコードされる遺伝子が発現
されたことを示す)について陽性であった。このMOIをその後頂端感染に使用した。特に、B29−11、B31−11およびB33−11 HAEがそれぞれ生産的HBoV1感染を支援した。p.i.12日の感染させたB31−11 HAEの免疫蛍光(IF)分析は、事実上全部の細胞がNS1およびNP1を発現したこと、ならびに感染させた細胞のかなりの部分がキャプシドタンパク質(VP1/2)を発現したことを示した。
JQ923422)のものと同一の配列を示した。加えて、偽似感染させたB−HAE中でウイルスは検出されなかった。
肉眼的細胞変性効果は(gross cytopathic effect)HBoV1に感染させたB−HAEで観察されなかったとは言え、偽似対HBoV1感染上皮(B33−11)の組織学分析は形態学的差違を示した。すなわち、感染させたBHAEはp.i.7日に明白な繊毛を特徴とせず、また、平均してp.i.22日に、偽似感染させたものよりかなりより薄かった。経上皮電気抵抗(TEER)をB−HAEの感染中に監視し、そして、p.i.6日にそれが約1,200の値から約400(.cm2まで低下した一方、偽似感染させたB−HAEは初期TEERを維持したことを見出した。特に、感染させたB−HAE中のTEERの低下はHBoV1分泌の増大により伴われた。
したことを確認した。特に、感染させたB−HAEはp.i.22日に明らかになった核増大の変化を示し、気道上皮細胞肥大を示している。
初代HAE培養物はHBoV1感染を支援するとは言え、それらの有用性は、ドナー間の変動性、組織の入手可能性および高い費用により制限される。HBoV1感染を支援するそれらの能力についての代替の細胞培養物モデルを探求した。精製されたHBoV1を使用し、HEK293細胞、HeLa、MDCK、MRC−5、LLC−MK2およびVero−E6を包含する普遍的呼吸器ウイルスに対し許容性の他の普遍的上皮細胞株(Reinaら、2001)、ならびに数種の形質転換若しくは不死化されたヒト気道上皮細胞株(A549、BEAS−2B、16HBE14o−(Cozensら、1994)、NuLi−1およびCuFi−8(Zabnerら、2013)、ならびに初代NHBE細胞を包含する他の細胞を、感染を支援する能力について慣習的単層培養物中で検査した。全部が、IF分析により決定されるところのHBoV1感染について陰性であった。数種の呼吸器ウイルスは分極されたHAEを感染させるがしかし未分化細胞はしない(Pyrcら、2010)ため、分極された上皮のいくつかの特徴がHBoV1感染に決定的に重要でありうることが推測された。従って、不死化された細胞(NuLi−1およびCuFi−8)を空気−液体界面(ALI)で1か月間分極させた。分極が500Ω.cm2より大きいTEERの検出により一旦確認されれば、培養物を、初代B−HAE培養物について使用されたと同一の条件下でHBoV1に感染させた。特に、IF分析は、p.i.10日に、HBoV1に感染させたCuFi−HAE(CuFi−8細胞から分化した)がNS1について均一に陽性であった一方、HBoV1に感染させたNuLi−HAE(NuLi−1細胞から分化した)はそうでなかったことを示した。さらに、CuFi−HAEはHBoV1のNS1、NP1およびVP1/VP2タンパク質を発現した。頂端膜側からのウイルス放出のキネティクスは、同様の力価(最高で26107gc/mL)でウイルスに感染させた初代B−HAEのものと同様であったとは言え、側底膜側からのウイルス放出は検出不可能であった。HBoV1感染は、上皮の厚さの減少、およびタイトジャンクション構成タンパク質ZO−1の上皮細胞周縁からの解離もまたもたらした。
完全長HBoV1ゲノムをクローン化しそしてその末端ヘアピンを同定した。このクローンのHEK293細胞へのトランスフェクションから産生されるビリオンは、分極されたHAE培養物を感染させることが可能である。かように、HAEのin vitro培養物モデル系を使用して、HBoV1の分子生物学および病態形成を研究することに対するきわめて重要な障壁を克服するリバースジェネティックス系が確立された。
V1 DNAの複製は基本的に、REHおよびLEHでそれぞれ末端および連結の解離を伴う自律性パルボウイルスのローリングヘアピン依存性DNA複製のモデル(Cotmoreら、1987)に従うことが考えられる。パルボウイルスDNAの複製は細胞周期のS期への進入若しくはヘルパーウイルスの存在に依存する(Cotmoreら、1987;Bernsら、1990)。この点に関して、成熟した傷害されていない気道上皮は、(細胞周期のG0期の)分極されたHAE中の細胞の大多数がそうであるように、有糸分裂が静止状態である(細胞分裂の1%未満)(Wangら、1999;Leighら、1995;Axersら、1988)ことは困惑させる。しかしながら、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV;パルボウイルス科のデペンドウイルス属の)はHAEを頂端で感染させかつレポーター遺伝子を発現する。組換えAAVによる遺伝子発現は、転写されることが可能である二本鎖DNAの形態へのssDNAウイルスゲノムの転換を必要とする。この転換はDNA合成を必要とする。これゆえ、HBoV1はその複製可能な形態のDNAを合成するために類似のアプローチを使用することが仮定された。特に、野生型AAVは初代HAEを頂端で感染させ、そしてアデノウイルスを共感染させた場合に複製した。HBoV1が正常HAE中でどのように複製するかの正確な機構はさらなる検討のための興味深いトピックとなるであろう。
は長年ヒト組織中に持続するようではない(Norjaら、2010)。
接種されたHAE培養物の最終TEERは、感染の終了までに400Ω・cm2未満の値に減少し、偽似感染させたHAEのものと比較して約2〜3倍の減少であった。気道上皮の破壊は組織学的にもまた観察された。偽似感染させたHAEと比較して、上皮の厚さおよび繊毛の存在として示される感染の終了時の気道上皮損傷の程度は、入力ウイルスのMOIと相関した。特に、100vgc/細胞のMOIを接種されたHAEは漸進的な組織学的変化を示した。p.i.12日に、100vgc/細胞のMOIで接種されたHAEの平坦化は、0.1ないし0.001vgc/細胞のMOIを接種されたHAEについてp.i.26〜28日に観察されたものに似ていた。さらに、HBoV1感染により引き起こされる上皮損傷は、以下のアッセイ、すなわち1)MOI 100〜0.1vgc/細胞で感染させたHAE中で非存在でありかつ0.01および0.001vgc/細胞のMOIできわめて低かった、有意に低下されたβ−チューブリンIV(繊毛のマーカー(Matrosovichら、2004;Villenaveら、2010))とのHBoV1 NS1の共検出;2)タイトジャンクション構成タンパク質ZO−1(Zona occludens−1)(11)の解離;ならびに3)後期感染での核増大により実証された。感染後早期に、NS1を発現する細胞は優勢にβ−チューブリンIVをほとんど若しくは全く含有せず、かつ、解離されたZO−1染色を有し(MOI=100vgc/細胞、p.i.5日)、ウイルスが非繊毛細胞を最初に感染させること若しくは繊毛がウイルス複製の経過中早期に脱落されることのいずれも示唆している。
ンクションの明瞭な解離を示した。
プラスミド。pIHBoV1は5543bpの完全長HBoV1ゲノムを含有する感染性クローンプラスミドである(Huangら、2012)。prHBoV1−CBAlucは、pIHBoV1由来の組換えHBoV1(rHBoV1)導入プラスミドであり、そして、HBoV1ゲノムの2.64kbのHindIII/BglIIフラグメントを、CMVエンハンサー/ニワトリβ−アクチンプロモーターに駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含有する2.74kbのフラグメントにより置換することにより構築した。HBoV1 DNA複製において不可欠の役割を演じるNP1遺伝子を、生じるprHBoV1−CBAlucプラスミド中で完全に除去した。組換えによるレスキューされた野生型ウイルスの可能性を低下させるため、5’存続された(5’ remained)NS遺伝子コーディング領域を、平滑末端ライゲーションを使用するBspE1部位の排除によりさらに破壊し、そして3’VP部分的コーディング領域を、145bpのPstIないしEcoRIフラグメントの除去によりさらに欠失した。ヘルパープラスミドpHBoV1KUm630は末端反復を伴わない5299bpのHBoV1ゲノム(99ないし5395nt)(Chenら、2010)を内部に持ち、P5プロモーターおよび3’ポリAシグナルがウイルス遺伝子の発現のため保持されている。pAV−Rep2およびpAD4.1は、以前に記述されたところの293細胞中のプロウイルスプラスミドからのrAAV2ゲノムのレスキューおよび複製を支援するヘルパープラスミドである。pAV2−F5tg83lucは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動する180bpの合成プロモーターを伴う4.85kbのrAAVプロウイルスゲノムを含有するrAAV2シス導入プラスミドである。pAV2−CF5tg83lucはpAV2−F5tg83lucのより長い形態であり、そして180bpの合成プロモーターの上流に600bpのスタッファ配列を挿入してrAAV2プロウイルスゲノム長さ5.4kbを生成することにより派生された。pAV2−CBAhCFTRは、580bpのCMV IEエンハンサーおよびβ−アクチンプロモーター(CBAプロモーター)、50bpの合成ポリAシグナル、ならびに56bpの5’UTRおよび45bpの3’UTRを含有する4443bpのヒトCFTR cDNAを含むヒトCFTR発現カセットを含有する、過大な5.5kbのrAAV2プロウイルスゲノムを内部に持つ。
for Gene Therapyから得た。上皮を12mmのMillicellメンブレンインサート(Millipore)上で増殖させ、そして使用前に空気−液体界面で2%USG培地で分化させた。CuFi8細胞のALIでの分極は初代HAEに類似の条件を使用して実施した。分極された気道上皮を頂端で感染させるため、1×1010DRPのウイルスをUSG培地で50μlの最終容量に希釈し、そしてMillicellインサートの上部チャンバーに適用した。側底感染のため、1×1010DRPのウイルスを底部チャンバー中の培地に直接添加した。ウイルスは典型的に上皮に16hr曝露しそしてその後除去した。この時点でMillicellインサートを少量のUSG培地で手
早く洗浄し、そして底部チャンバー中にのみ新鮮USG培地を供給した。およそ1〜2×106細胞が各Millicellインサート中にあり、そして従って感染多重度(MOI)は約5,000ないし10,000DRP/細胞と推定される。形質導入は、細胞ライセート若しくはIVIS生物光工学画像法を使用する感染後多様な時点のルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。
使用して分析した。
組換えHBoV1(rHBoV1)ベクターの製造およびHAEモデル系におけるその形質導入特性。完全長HBoV1ゲノムのプラスミドクローン(pIHBoV1)を使用して、ヘルパーウイルス機能に対する必要性を伴わずにHEK293細胞中でトランスフェクション後に感染性HBoV1ビリオンを産生し得る(Huangら、2012)。最初に、HBoV1ウイルスタンパク質がHEK293細胞中でトランス補完しかつrHBoV1ゲノムの複製およびパッケージングをレスキューし得るかどうかを試験することにより、rHBoV1を生成することを試みた。感染性プラスミド(pIHBoV1)、rHBoV1プロウイルスプラスミド(prHBoV1−CBAluc)およびトランスヘルパープラスミド(pHBoV1KUm630)中で見出される野性型HBoV1ゲノムの構造を図1Aに図解で示す。prHBoV1−CBAlucは、CBAプロモーターに駆動されるルシフェラーゼ遺伝子をコードする5.5kbのrHBoV1プロウイルスゲノムを含有した。prHBoV1−CBAlucからのrHBoV1ゲノムのレスキューおよび複製を支援するpHBoV1KUm630の能力を、これらのプラスミドをHEK293細胞中にコトランスフェクトすることにより確認した。トランスフェクトされた細胞から抽出されたHirt DNAを、メチル化されたプラスミドのバックグラウンドシグナルを排除するためのDpnI消化後のサザンブロットにより評価した。図1Bに示されるとおり、rHBoV1複製中間体は、prHBoV1−CBALucおよびpHBo
V1KUm630でコトランスフェクトされた細胞でのみ観察されたが、しかしprHBoV1−CBALuc単独ではされなかった。コトランスフェクションからの検出された複製中間体は野生型HBoV1プロウイルスプラスミドpIHBoV1からのレベルより低かったとは言え、われわれは、pHBoV1KUm630プラスミドが、rHBoV1ゲノム複製を支援するための必要なヘルパー機能をトランスで提供すると結論づける(図1C)。組換えウイルスを生成するため、prHBoV1−CBAlucおよびpHBoV1KUm630をHEK293にコトランスフェクトし、次いでCsCl平衡超遠心分離法を用いて細胞ライセートから精製した。この勾配からの画分をTaqMan PCRによりウイルスゲノムについて評価し、そして1.45ないし1.40g/mLの密度でピークを示し(図1C)、ウイルスDNAの成功裏のキャプシド形成を示唆した。30枚の150mmプレートからのウイルス収量は合計1.25×1011rHBoV1ゲノムコピー(vc)若しくはDNアーゼI耐性粒子(DRP)を生じた。これはHEK293細胞中のpIHBoV1のトランスフェクションから得られる野生型HBoV1の収量(10枚の150mm皿あたり約2×1011DRP)(Huangら、2012)のおよそ20%である。
的なDNアーゼI耐性ウイルス粒子が粗ライセートからCsClバンド形成により回収された(図2A)。トランスフェクションカクテルからpAV−Rep2を省くことはDNアーゼ1耐性ウイルス粒子を産生することに失敗した。注目すべきは、キメラrAAV2/HBoV1ビリオンの密度が約1.435g/mLで、rHBoV1ビリオンのものに類似であった(図1A)。この密度はrAAV2/2ビリオンの1.414g/mlの密度よりわずかにより重かった(図1A)。キメラrAAV/HBoV1ベクターの典型的な収量はrAAV2ベクターより10ないし20倍より小さかったが、しかし類似のスケールで生成される場合にrHBoV1ベクターより2ないし4倍より大きかった。対照的に、ヒトパルボウイルスB19キャプシド中へのrAAVゲノムのシュードパッケージングは、rAAV2/HBoV1についてわれわれが観察したものよりはるかにより少なく効率的である(Ponnazhaganら、1998)。
示した。これらの差違は、部分的に、rHBoV1のものを上回るrAAV2/HBoV1の生成における2〜3倍より高い収率を説明しうる。
された知識が、rAAVの生成において複製能力のあるウイルスを排除する同様の戦略を適用し得る前に必要とされるであろう。
膜からのそれぞれ約14倍および約32倍より多いウイルス取り込みを示した(図4C)ことを示した。AV2/HBc.F5tg83lucのウイルス取り込みはまたAV2/1.CMVlucより2.3倍より効率的でもあった(P=0.026)。さらに、核へのrAAV2/HBoV1の侵入後プロセシングはrAAV2/2についてより迅速であるようであり、rAAV2/2についての約7%と比較して、約15%の内部移行されたAV2/HBc.F5tg83lucゲノムが、感染後18時間までに核画分中で検出された(図4CおよびD)。興味深いことに、ウイルスゲノムの細胞質/核分布はrAAV2/1(86.4/13.6%)およびrAAV2/HBoV1(85.0/15.0%)について同様であった(図4CおよびD)。試験された双方のrAAV血清型と対照的に、rAAV2/HBoV1は側底膜からHAEを乏しく形質導入した(図4B)。全体として、これらの知見は、rAAV2/HBoV1ウイルス取り込みおよび核移行が初代分化HAEの頂端感染後に高度に効率的であることを示唆する。
の知見である(図1D)。対照的に、分極される場合、CuFi細胞は、野生型HBoV1での頂端(しかし側底でない)感染後に子孫ウイルスを効率的に産生する(Huangら、2012)。これらの知見は、分極が、ウイルス受容体/共受容体の発現若しくはHBoV1ビリオンの細胞内プロセシングに関与する因子の発現のような増殖性感染に必要とされる細胞性因子(1種若しくは複数)に影響することを示唆する。ウイルス複製はキメラrAAV2/HBoV1ベクター内で発生しないため、これは分極により影響されるHBoV1感染後の段階(1若しくは複数)を定義するための機会であった。この目的のため、実験をrAAV2/HBoV1を用いて実施して、気道上皮細胞の分極が、ビリオンの受容体結合/取り込み若しくは侵入後細胞内プロセシングを伴う段階によりHBoV1キャプシドに媒介される形質導入に影響するかどうかに取り組んだ。ユビキチン−プロテアソーム経路はHAE ALI培養物中のrAAV2/HBoV1形質導入に影響を及ぼすため、われわれは、感染のこれら2段階に対するプロテアソーム阻害剤の影響もまた検査した。
し得る。CF遺伝子治療のためのrAAVベクターの適用は、該ウイルスの比較的小さいパッケージング容量および完全長CFTR cDNAの大きなサイズ(4443bpのコーディング配列)により妨げられていた。これは、非常に小さい合成のより弱いプロモーターの使用および/若しくはクロライドチャネル機能に決定的に重要ではないCFTRドメインの欠失を必要としていた(Zhangら、1998)。これらアプローチの双方はCFTRに媒介される遺伝子治療について最適に及ばない。rAAV2/HBoV1ベクターは、ヒトCFTR遺伝子発現のための強い転写調節エレメントを収容する十分な空間を有するとみられる。このアプローチについての概念実証を提供するため、強いCBAプロモーターにより駆動される5.2kbのヒトCFTR発現カセットを含有する5.5kbのゲノムを内部に持ったrAAV2プロウイルスプラスミドを構築した。このプロウイルスプラスミドがHBoV1ビリオン中にパッケージングされた場合、結果として生じるウイルス収量(AV2/HBc.CBAhCFTR)は、10枚の150mm皿のトランスフェクトされたHEK293細胞から平均1.5×1011DRPであり、ルシフェラーゼレポーターをもつrAAV2/HBoV1ベクターについて類似レベルの産生であった。AV2/HBc.CBAhCFTR内の5.5kbのrAAVゲノムの完全性をアルカリ性アガロースゲル分析により確認した(データは示されない)。
新たに発見されかつ部分的に特徴づけられたHBoV1は、CF気道遺伝子治療ベクターの設計のためのいくつかの潜在的な魅力的利点を提供する。第一に、野生型HBoV1はきわめて低いMOIで頂端膜側からHAEを効率的に感染させ、そのキャプシドタンパク質が気道感染に高度に適合されていることを示唆している。第二に、野生型HBoV1は5500ntのゲノムを有し、より大きいCFTR発現カセットが組換えHBoV1ウイルス中に効率的にパッケージングされ得ることを示唆する。これらの理由上、われわれは、複製欠損rHBoV1およびシュードタイプされたrAAV2/HBoV1双方のベクターを成功裏に生成し、そしてHAE中のそれらの形質導入プロファイルを研究した。われわれの知見は、rAAV2/HBoV1ベクターが実際にCFの遺伝子治療のための
rAAVベクターに対する魅力的な一代替となりうることを示す。加えて、これらの新たな組換えのHBoV1に基づくベクターを評価するわれわれの研究は、分極/分化がHAEの頂端および側底膜からのHBoV1キャプシドに媒介される感染および形質導入にどのように影響するかに関する興味深い生物学を明らかにした。
イルスに対する中和抗体に関して何も知られていない。HBoV1感染は主に生涯の最初の1年以内に発生することを考えれば、こうした免疫は二次感染に対し保護的であることが推定される。しかしながら、健康な小児および成人双方からの糞便中のHBoVの頻繁な検出ならびに血清疫学研究は、ウイルス排出が長期間起こり得かつ/若しくは患者が頻繁な再発性感染症を有し得ることを示唆する(Kapoorら、2010)。二次感染若しくは既往性免疫応答もまた普遍的に起こるようであり、そして、HBoV1一次感染は呼吸器疾病と強く関連する一方、HBoV1による二次的免疫活性化はしない(Meriluotoら、2012)。こうした体液性免疫が気道表面からの感染を予防し得るか、若しくはHBoV1の複製および拡散を制限するよう作用するかどうかは、不明なままである(Kornerら、2011)。野生型HBoV1が一次感染後に気道中の長期かつ低レベルの持続性を示す(Martinら、2010;Allanderら、2005)という事実は、このウイルスが免疫検出を逃れる方法を有しうることを示唆する。rHBoV1およびrAAV2/HBoV1ベクターの開発は、こうした疑問が、組換えレポーターウイルスをHBoV1に感染した患者からの血清若しくは気管支肺胞洗浄液サンプルと組み合わせるHAE再構成実験を使用して取り扱われることを可能にするはずである。これらの未知のものにもかかわらず、HBoV1に基づく組換えベクターの開発は、CF遺伝子治療および/若しくは野生型HBoV1感染から保護するための乳幼児のワクチン接種に対する独特の利用性を有しうる。
グおよび脱コートの機構の差違がこれらの観察結果の原因であることができ、そしてさらなる検討を正当化する。
ター中でのrAAV2/HBoV1産生は、Sf9細胞培養物1リットルあたり1014DRPより上の収量までさらなる10倍増大させ得ることが仮定された。
AV2/HBc.CBAhCFTRで修正することにおけるそれらの有効性を比較するため、不死化ヒトCF気道細胞株CuFi8(遺伝子型:ΔF508/ΔF508)由来のCuFi−ALI中の新たなベクターの機能性を試験する。cAMPに調節されるCl-チャネル活性の補完についての短絡電流(Isc)の変化を測定し、そしてp.i.10日の頂端膜側の完全にプロセシングされたCFTRタンパク質のレベルを検査する。より生理学的なレベルのCFTRの発現がCFTR活性を復帰させることができるという仮説を試験するため、50倍範囲にわたる4種のベクター用量でこれらのベクターを使用して感染させたCF異種移植片中のCFTR発現レベルおよび機能の並べた比較評価を実施する。経上皮電位差(TEPD)を測定してCFTR補完のレベルを評価する。その後、気道液を、in vitro細菌死滅アッセイならびに(実験の終了での)細菌クリアランスを評価するin vivo細菌攻撃実験のため収集する。表面上皮でのCFTRの発現は、Metamorphソフトウェアおよび/若しくは完全にプロセシングされたBおよびCについての免疫沈降キナーゼアッセイを使用して、頂端膜でのIF染色により定量することができる。移植片サンプル中のベクター由来CFTR mRNAおよび細胞内ベクターゲノムコピー(vgc)の数は、以前にわれわれの実験室により記述されたとおりqPCRにより定量することができる。
を実施して移植片中の細菌クリアランスを評価することができる。
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具体的説明の目的上示された一方、本発明は付加的な態様の影響を受けやすいこと、および本明細書の詳細のあるものは本発明の基本原則から離れることなくかなり変えられてよいことが、当業者に明らかであろう。
Claims (58)
- ボカウイルスキャプシドタンパク質および組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルス。
- ゲノムが異種遺伝子産物をコードする発現カセットを含んでなる、請求項1に記載のウイルス。
- 遺伝子産物が治療的タンパク質をコードする、請求項2に記載のウイルス。
- rAAVゲノムがrAAV−1、rAAV−2、rAAV−3、rAAV−4、rAAV−5、rAAV−6、rAAV−7、rAAV−8若しくはrAAV−9ゲノムである、請求項1ないし3のいずれか1つに記載のウイルス。
- 遺伝子産物がウイルス、細菌、腫瘍、寄生生物若しくは真菌抗原である、請求項2ないし4のいずれか1つに記載のウイルス。
- 遺伝子産物が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼA、第VIII因子、ジストロフィン、α1−アンチトリプシン、サーファクタントタンパク質SP−D、SP−A若しくはSP−C、エリスロポエチン、HBoVタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、RSVタンパク質、中和抗体若しくはその抗原結合フラグメント、SARSウイルスタンパク質、またはサイトカイン例えばIFN−α、IFN−γ、TNF、IL−1、IL−17若しくはIL−6である、請求項2ないし4のいずれか1つに記載のウイルス。
- 請求項2ないし6のいずれか1つに記載のウイルスを提供すること;および細胞を異種遺伝子産物を発現するのに有効な量のウイルスに感染させることを含んでなる、哺乳動物細胞中での異種遺伝子産物の発現方法。
- 遺伝子産物が、治療的遺伝子産物、触媒RNA、マイクロRNA、RNAプレトランスプライシング分子(PTM−RNA)、中和抗体若しくはその抗原結合フラグメント、予防的遺伝子産物、ポリペプチド若しくはペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 哺乳動物細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質および異種遺伝子産物をコードするトランスジーンを含んでなるrAAVゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルス、ならびにrAAV形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低1種の剤と接触させることを含んでなる、哺乳動物細胞のキメラウイルス形質導入を高める方法。
- 哺乳動物細胞が哺乳動物鼻上皮細胞、気管気管支細胞若しくは肺細胞である、請求項9に記載の方法。
- 剤が、プロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物である、請求項9に記載の方法。
- 内因性遺伝子産物の異常な発現を伴う状態の危険がある若しくはそれを有する哺乳動物を、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびrAAVゲノムを含んでなる有効量の単離されたキメラウイルスと接触させることを含んでなり、rAAVゲノムは機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするトランスジーンを含んでなり、哺乳動物中でのその発現が該状態の最低1種の症状を阻害若しくは処置する、該状態の阻害若しくは処置方法。
- トランスジーンが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、α−アンチトリプシン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼA、第VIII因子、ジストロフィン若しくはエリスロポエチンをコードする、請求項9ないし12のいずれか1つに記載の方法。
- 哺乳動物が、形質導入を高める量の最低1種のプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物とさらに接触される、請求項12若しくは13に記載の方法。
- 最低1種の剤が、LLnL、Z−LLL、ボルテゾミブ(Velcade)、エポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、シンバスタチン、タンニン酸、カンプトテシン若しくはシスプラチンである、請求項9ないし14のいずれか1つに記載の方法。
- 哺乳動物細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびrAAVゲノムを含んでなるキメラウイルス、ならびに剤と接触されない哺乳動物細胞に関してウイルスの形質導入を高めるのに有効な量の剤と接触させることを含んでなり、該剤がプロテアソーム阻害剤である、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める方法。
- 哺乳動物細胞を、プロテアソーム阻害剤であるある量の剤、ならびにボカウイルスキャプシドタンパク質およびトランスジーンを含んでなるrAAVゲノムを含んでなるキメラウイルスと接触させることを含んでなり、該量はrAAVの形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める、哺乳動物細胞中のトランスジーンの発現を高める方法。
- ウイルス遺伝子治療にかけられる哺乳動物に、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびrAAVゲノム(該ゲノムは哺乳動物中のその発現が治療的であるトランスジーンを含んでなる)を含んでなる単離されたキメラウイルスとともに、剤と接触されない哺乳動物中の細胞に関して該哺乳動物の細胞中のトランスジーンの発現を高めるのに有効な量の、プロテアソーム阻害剤である最低1種の剤を投与することを含んでなる方法。
- rAAVが治療的ペプチド若しくは治療的ポリペプチドをコードする、請求項16ないし18のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞若しくは哺乳動物が、該細胞若しくは哺乳動物がウイルスと接触される前に剤と接触される、請求項16ないし19のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞若しくは哺乳動物が、該細胞若しくは哺乳動物が剤と接触される前にウイルスと接触される、請求項16ないし19のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞若しくは哺乳動物がウイルスおよび剤と同時に接触される、請求項16ないし19のいずれか1つに記載の方法。
- 剤およびウイルスが肺、鼻上皮、消化管若しくは血液に投与される、請求項16ないし22のいずれか1つに記載の方法。
- ウイルスが経口若しくは非経口投与される、請求項16ないし22のいずれか1つに記載の方法。
- 哺乳動物に、微生物の感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量の、ボカウイルスキャプシドタンパク質および予防的遺伝子産物をコードするrAAVゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫化方法。
- 遺伝子産物がウイルス若しくは細菌の抗原である、請求項25に記載の方法。
- ヒト以外のボカウイルスキャプシドタンパク質およびrBoVゲノムを含んでなる単離されたrBoV。
- ゲノムが、異種遺伝子産物例えば治療的遺伝子産物、触媒RNA、マイクロRNA、PTM−RNA、中和抗体若しくはその抗原結合フラグメント、予防的遺伝子産物、ポリペプチド若しくはペプチドをコードする発現カセットを含んでなる、請求項27に記載のウイルス。
- 請求項27に記載のウイルスを提供すること;および異種遺伝子産物を発現するのに有効な量のウイルスで細胞を感染させることを含んでなる、哺乳動物細胞中の異種遺伝子産物の発現方法。
- 遺伝子産物が治療的遺伝子産物、触媒RNA、予防的遺伝子産物、ポリペプチド若しくはペプチドである、請求項29に記載の方法。
- 哺乳動物細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質および異種遺伝子産物をコードするトランスジーンを含んでなるrBoVゲノムを含んでなる単離されたrBoV、ならびに形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低1種の剤と接触させることを含んでなる、哺乳動物細胞のキメラウイルス形質導入を高める方法。
- 哺乳動物細胞が哺乳動物の肺、胃腸、鼻上皮若しくは気管細胞である、請求項31に記載の方法。
- 剤が、プロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物である、請求項31若しくは32に記載の方法。
- 内因性遺伝子産物の異常な発現を伴う状態の危険がある若しくはそれを有する哺乳動物を、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびrBoVゲノムを含んでなる有効量の単離されたrBoVと接触させることを含んでなり、該rHBoVゲノムは機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするトランスジーンを含んでなり、哺乳動物中のその発現が該状態の最低1種の症状を阻害若しくは処置する、該状態の阻害若しくは処置方法。
- トランスジーンが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、α−アンチトリプシン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼA、第VIII因子、ジストロフィン若しくはエリスロポエチンをコードする、請求項31ないし34のいずれか1つに記載の方法。
- 哺乳動物を、形質導入を高める量の最低1種のプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物と接触させることをさらに含んでなる、請求項34に記載の方法。
- at剤が、LLnL、Z−LLL、ボルテゾミブ(Velcade)、エポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラル
ビシン、シンバスタチン、タンニン酸、カンプトテシン若しくはシスプラチンである、請求項31ないし33若しくは36のいずれか1つに記載の方法。 - 哺乳動物細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびrBoVゲノムを含んでなるrBoV、ならびに剤と接触されない哺乳動物細胞に関してウイルスの形質導入を高めるのに有効な量の剤と接触させることを含んでなり、該剤がプロテアソーム阻害剤である、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める方法。
- 哺乳動物細胞を、プロテアソーム阻害剤であるある量の剤、ならびにヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびトランスジーンを含んでなるrBoVゲノムを含んでなるrHBoVと接触させることを含んでなり、該量は形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める、哺乳動物細胞中のトランスジーンの発現を高める方法。
- ウイルス遺伝子治療にかけられる哺乳動物に、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびrBoVゲノムを含んでなる単離されたrBoV(該ゲノムは哺乳動物中のその発現が治療的であるトランスジーンを含んでなる)とともに、剤と接触されない哺乳動物中の細胞に関して哺乳動物の細胞中のトランスジーンの発現を高めるのに有効な量の、プロテアソーム阻害剤である剤を投与することを含んでなる方法。
- rHBoVが治療的ペプチド若しくは治療的ポリペプチドをコードする、請求項38ないし40のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞若しくは哺乳動物が、該細胞がウイルスと接触される前に剤と接触される、請求項38ないし40のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞若しくは哺乳動物が、該細胞が剤と接触される前にウイルスと接触される、請求項38ないし40のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞若しくは哺乳動物がウイルスおよび剤と同時に接触される、請求項38ないし40のいずれか1つに記載の方法。
- 剤およびウイルスが肺、鼻上皮、消化管若しくは血液に投与される、請求項38ないし44のいずれか1つに記載の方法。
- ウイルスが経口または例えば肺、鼻上皮若しくは血液に非経口投与される、請求項38ないし44のいずれか1つに記載の方法。
- ウイルスが肺、鼻上皮若しくは血液に投与される、請求項46に記載の方法。
- 哺乳動物に、微生物の感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量の、ヒト以外のボカウイルスキャプシドタンパク質および予防的遺伝子産物をコードするrBoVゲノムを含んでなる単離されたrBoVを投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫化方法。
- 哺乳動物に、BoVの感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量の、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびrAAVゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫化方法。
- キメラウイルスが肺、消化管、鼻上皮若しくは血液に投与される、請求項49に記載の
方法。 - 請求項1ないし6のいずれか1つに記載のキメラウイルスまたは請求項27若しくは28に記載のウイルスを含んでなるワクチン。
- 哺乳動物に、HBoVの感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量の、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびrHBoVゲノムを含んでなる単離されたrHBoVを投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫化方法。
- キメラウイルスが肺、鼻上皮若しくは血液に投与される、請求項52に記載の方法。
- rBoVがヒトrBoVである、請求項9、12、16、17、18、25、31、34、38、39若しくは40に記載の方法。
- rBoVがヒト以外のrBoVである、請求項9、12、16、17、18、25、31、34、38、39若しくは40に記載の方法。
- rBoVがブタ、ネコ若しくはイヌBoVである、請求項55に記載の方法。
- rBoVがヒトrBoVである、請求項1に記載のウイルス。
- rBoVがヒト以外の哺乳動物rBoVである、請求項1に記載のウイルス。
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