TW202328174A - 以反向末端重覆序列製造封閉dna - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了核酸分子，其包含第一反向末端重複序列（ITR）、第二ITR和編碼靶序列的基因匣。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR是人博卡病毒的ITR。還公開了在基因療法應用中使用所述核酸分子的方法。

Description

以反向末端重覆序列製造封閉DNA
本揭露提供了核酸分子，其包含第一反向末端重複序列（ITR）、第二ITR和編碼靶序列的基因匣。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR是人博卡病毒的ITR。還公開了在基因療法應用中使用所述核酸分子的方法。
基因療法提供了治療多種疾病的持久手段的可能性。過去，許多基因療法通常依賴於使用病毒載體。有多種可以選擇用於這個目的的病毒劑，每種病毒劑具有不同特性，這使得它們更適合於或更不適合於基因療法。然而，一些病毒載體的不期望的特性已經導致了臨床安全性問題並且限制了它們的治療用途。
腺相關病毒（AAV）是一種常見的基因療法載體，但是它並非沒有缺點。AAV基因體的編碼序列側接反向末端重複序列（ITR），所述反向末端重複序列是病毒複製和包裝以及轉基因表現所需。AAV ITR的T形髮夾結構易於由宿主細胞蛋白質結合，抑制AAV載體中的轉基因表現。需要提供靶序列的有效且持久的表現，同時避免現有AAV載體技術的局限性。
本文公開了核酸分子及其用途，所述核酸分子包含位於包含異源多核苷酸序列的基因匣兩側的第一反向末端重複序列（ITR）和/或第二ITR。
在一態樣，本文提供了包含位於包含異源多核苷酸序列的基因匣兩側的第一ITR和第二ITR的核酸分子，其中所述第一ITR和第二ITR是博卡病毒ITR或其片段/衍生物（例如人博卡病毒1 ITR）。在另一態樣，本文提供了包含第一ITR和第二ITR的核酸分子，其中第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約75%相同的多核苷酸序列，並且第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約75%相同的多核苷酸序列。
在一些實施例中，第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施例中，第一ITR包含SEQ ID NO: 1中所示的多核苷酸序列。在一些實施例中，第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約50%相同的多核苷酸序列。
在一些實施例中，第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施例中，第二ITR包含SEQ ID NO: 2中所示的多核苷酸序列。在一些實施例中，第一ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約50%相同的多核苷酸序列。
在一些實施例中，第一ITR包含SEQ ID NO: 1中所示的多核苷酸序列，並且第二ITR包含SEQ ID NO: 2中所示的多核苷酸序列。
在一些實施例中，核酸分子還包含基因匣，所述基因匣包含異源多核苷酸序列和至少一個表現控制序列，如啟動子、增強子、內含子、轉錄終止信號或轉錄後調節元件。
在一些實施例中，基因匣還包含啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是組織特異性啟動子。在一些實施例中，所述啟動子驅動所述異源多核苷酸序列在器官中的表現，其中所述器官包括肌肉、中樞神經系統（CNS）、眼睛、肝臟、心臟、腎臟、胰腺、肺、皮膚、膀胱、泌尿道、脾臟、髓系細胞譜系和淋巴樣細胞譜系或其任何組合。在一些實施例中，所述啟動子驅動所述異源多核苷酸序列在以下細胞中的表現：肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、竇狀細胞、傳入神經元、傳出神經元、中間神經元、神經膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞、肺上皮細胞、許旺細胞、衛星細胞、感光細胞、視網膜神經節細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞或其任何組合。在一些實施例中，所述啟動子定位於所述異源多核苷酸序列的5'。在一些實施例中，所述啟動子是小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子（mTTR）、天然人因子VIII啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、人白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、三重四脯胺酸（TTP）啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒（CMV）啟動子、α1-抗胰蛋白酶（AAT）、肌肉肌酸激酶（MCK）、肌球蛋白重鏈α（αMHC）、肌紅蛋白（MB）、結蛋白（DES）、SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、tMCK或磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子。
在一些實施例中，所述基因匣還包含內含子序列。在一些實施例中，所述內含子序列定位於所述異源多核苷酸序列的5'。在一些實施例中，所述內含子序列定位於所述啟動子的3'。在一些實施例中，所述內含子序列包含合成內含子序列。
在一些實施例中，所述基因匣還包含轉錄後調節元件。在一些實施例中，所述調節元件定位於異源多核苷酸序列的3'。在一些實施例中，所述調節元件包含突變的土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（WPRE）、微小RNA結合位點、DNA核靶向序列或其任何組合。
在一些實施例中，所述基因匣還包含3'UTR多聚(A)尾序列。在一些實施例中，所述3'UTR多聚(A)尾序列選自bGH多聚(A)、肌動蛋白多聚(A)、血紅蛋白多聚(A)及其任何組合。
在一些實施例中，所述基因匣還包含增強子序列。在一些實施例中，所述增強子序列定位於第一ITR與第二ITR之間。
在一些實施例中，所述核酸分子從5'至3'包含：所述第一ITR、所述基因匣和所述第二ITR；其中所述基因匣包含組織特異性啟動子序列、內含子序列、所述異源多核苷酸序列、轉錄後調節元件和3'UTR多聚(A)尾序列。
在一些實施例中，所述基因匣從5'至3'包含：組織特異性啟動子序列、內含子序列、所述異源多核苷酸序列、轉錄後調節元件和3'UTR多聚(A)尾序列。
在一些實施例中，所述基因匣是單股核酸。在一些實施例中，所述基因匣是雙股核酸。
在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼治療性蛋白質。
在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼凝血因子、生長因子、激素、細胞因子、抗體、其片段或其任何組合。在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼凝血因子。在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼生長因子。在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼激素。在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼細胞因子。
在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼FVIII蛋白。
在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼X連鎖抗肌萎縮蛋白、MTM1（肌微管素）、酪胺酸羥化酶、AADC、環水解酶、SMN1、FXN（共濟蛋白（frataxin））、GUCY2D、RS1、CFH、HTRA、ARMS、CFB/CC2、CNGA/CNGB、Prf65、ARSA、PSAP、IDUA（MPS I）、IDS（MPS II）、PAH、GAA（酸性α-葡糖苷酶）、GALT、OTC、CMD1A、LAMA2或其任何組合。
在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼微小RNA（miRNA）。在一些實施例中，所述miRNA下調包括以下的靶基因的表現：SOD1、HTT、RHO、CD38或其任何組合。
在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列編碼凝血因子，其中所述凝血因子包含因子I（FI）、因子II（FII）、因子III（FIII）、因子IV（FIV）、因子V（FV）、因子VI（FVI）、因子VII（FVII）、因子VIII（FVIII）、因子IX（FIX）、因子X（FX）、因子XI（FXI）、因子XII（FXII）、因子XIII（FXIII）、血管性血友病因子（VWF）、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖連蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑（ZPI）、纖溶酶原、α2-抗纖溶酶、組織纖溶酶原啟動物（tPA）、尿激酶、纖溶酶原啟動物抑制劑-1（PAI-1）、纖溶酶原啟動物抑制劑-2（PAI2）或其任何組合。
在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列經密碼子優化。在一些實施例中，所述異源多核苷酸序列經密碼子優化以用於在人體內表現。
在一些實施例中，將所述核酸分子與遞送劑一起配製。在一些實施例中，所述遞送劑包括脂質奈米顆粒。在一些實施例中，所述脂質奈米顆粒是可離子化的。在一些實施例中，所述遞送劑包括脂質體、非脂質聚合物分子、胞內體或其任何組合。
在一些實施例中，所述核酸分子被配製用於靜脈內、經皮、皮內、皮下、肺部、神經內、眼內、鞘內、口服投予或其任何組合。在一些實施例中，所述核酸分子被配製用於靜脈內投予。在一些實施例中，所述核酸分子被配製用於通過原位注射投予。在一些實施例中，所述核酸分子被配製用於通過吸入投予。
在另一態樣，本文提供了一種載體，包含本文所述的核酸分子。
在另一態樣，本文提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含本文所述的核酸分子或本文所述的載體。在一些實施例中，宿主細胞是昆蟲細胞。
在另一態樣，本文提供了一種醫藥組合物，包含本文所述的核酸分子。
在另一態樣，本文提供了一種醫藥組合物，包含本文所述的載體和醫藥上可接受的賦形劑。
在另一態樣，本文提供了一種醫藥組合物，包含本文所述的宿主細胞和醫藥上可接受的賦形劑。
在另一態樣，本文提供了一種套組，包含本文所述的核酸分子和用於向有需要的個體投予所述核酸分子的說明書。
在另一態樣，本文提供了一種桿狀病毒系統，用於產生本文所述的核酸分子。
在一些實施例中，所述核酸分子是在昆蟲細胞中產生的。
在另一態樣，本文提供了一種奈米顆粒遞送系統，包含本文所述的核酸分子。
在另一態樣，本文提供了一種在有需要的個體體內表現異源多核苷酸序列的方法，包括向所述個體投予本文所述的核酸分子、本文所述的載體或本文所述的醫藥組合物。
在另一態樣，本文提供了一種治療有需要的個體的疾病或障礙的方法，包括向所述個體投予本文所述的核酸分子、本文所述的載體或本文所述的醫藥組合物。
在一些實施例中，將所述核酸分子通過靜脈內、經皮、皮內、皮下、口服、肺部、神經內、眼內、鞘內或其任何組合投予。在一些實施例中，所述核酸分子是靜脈內投予的。在一些實施例中，所述核酸分子是通過原位注射投予。在一些實施例中，所述核酸分子是通過吸入投予。
在一些實施例中，所述個體是哺乳動物。在一些實施例中，所述個體是人。
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本文公開了核酸分子及其用途，所述核酸分子包含經修飾的第一反向末端重複序列（ITR）和/或經修飾的第二ITR，所述經修飾的第一反向末端重複序列（ITR）和/或經修飾的第二ITR側接包含異源多核苷酸序列的基因匣。在一些實施例中，第一和/或第二ITR衍生自人博卡病毒1（HBoV1）。
在附圖和序列表中展示了本揭露的例示性構築體。為了提供對說明書和申請專利範圍的清晰理解，下文提供了以下定義。 定義
應注意，術語“一個/一種（a）”或“一個/一種（an）”實體是指一個/一種或多個/多種所述實體：例如，“一個核苷酸序列”應理解為代表一個或多個核苷酸序列。類似地，“一種治療性蛋白質”和“一種miRNA”應理解為分別代表一種或多種治療性蛋白質和一種或多種miRNA。因此，術語“一個/一種（a）”（或“一個/一種（an）”）、“一個/一種或多個/多種”和“至少一個/一種”在本文中可互換使用。
術語“約”在本文中用於意指大約、大致、大概或在……左右。在術語“約”結合數字範圍使用時，其通過擴展所述數值上下的邊界來修飾所述範圍。通常，術語“約”在本文中用於向上或向下（較高或較低）以10%的差異修飾高於和低於所述值的數值。
同樣如本文所用，“和/或”是指並且涵蓋一個或多個相關列示專案的任何和所有可能組合，以及在替代方案（“或”）中解釋時組合的缺少。
“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸”、“一個或多個核苷酸的序列”和“多核苷酸”可互換使用並且是指呈單股形式或雙股螺旋的核糖核苷（腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”）或去氧核糖核苷（去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷或去氧胞苷；“DNA分子”）的磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯和硫代酸酯。單股核酸序列是指單股DNA（ssDNA）或單股RNA（ssRNA）。雙股DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術語核酸分子、特別是DNA或RNA分子僅僅是指分子的一級和二級結構，並且不將其限制為任何特定三級形式。因此，這個術語包括尤其在線性或環狀DNA分子（例如，限制性片段）、質體、超螺旋化DNA和染色體中發現的雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子的結構時，在本文中可以根據常規習慣描述序列，僅沿DNA的非轉錄股（即，具有與mRNA同源的序列的股）以5’至3’方向給出序列。“重組DNA分子”是已經經歷分子生物學操作的DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、合成DNA和半合成DNA。本揭露的“核酸組合物”包含如本文所述的一種或多種核酸。
如本文所用，“反向末端重複序列”（或“ITR”）是指位於單股核酸序列的5'端或3'端的核酸子序列，其包含一組核苷酸（初始序列），之後下游是其反向互補體，即回文序列。初始序列與反向互補體之間的插入核苷酸序列可以具有任何長度，包括零。在一個實施例中，可用於本揭露的ITR包含一個或多個“回文序列”。ITR可以具有任何數目的功能。在一些實施例中，本文所述的ITR形成髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成T形髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成非T形髮夾結構，例如U形髮夾結構。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的長期存活。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的永久存活（例如，持續細胞的整個壽命）。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的穩定性。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的保留。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的持久性。在一些實施例中，ITR抑制或防止核酸分子在細胞的細胞核中的降解。
在一個實施例中，ITR的初始序列和/或反向互補體包含約2-600個核苷酸、約2-550個核苷酸、約2-500個核苷酸、約2-450個核苷酸、約2-400個核苷酸、約2-350個核苷酸、約2-300個核苷酸或約2-250個核苷酸。在一些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約5-600個核苷酸、約10-600個核苷酸、約15-600個核苷酸、約20-600個核苷酸、約25-600個核苷酸、約30-600個核苷酸、約35-600個核苷酸、約40-600個核苷酸、約45-600個核苷酸、約50-600個核苷酸、約60-600個核苷酸、約70-600個核苷酸、約80-600個核苷酸、約90-600個核苷酸、約100-600個核苷酸、約150-600個核苷酸、約200-600個核苷酸、約300-600個核苷酸、約350-600個核苷酸、約400-600個核苷酸、約450-600個核苷酸、約500-600個核苷酸或約550-600個核苷酸。在一些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約5-550個核苷酸、約5至500個核苷酸、約5-450個核苷酸、約5至400個核苷酸、約5-350個核苷酸、約5至300個核苷酸或約5-250個核苷酸。在一些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約10-550個核苷酸、約15-500個核苷酸、約20-450個核苷酸、約25-400個核苷酸、約30-350個核苷酸、約35-300個核苷酸或約40-250個核苷酸。在某些實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約225個核苷酸、約250個核苷酸、約275個核苷酸、約300個核苷酸、約325個核苷酸、約350個核苷酸、約375個核苷酸、約400個核苷酸、約425個核苷酸、約450個核苷酸、約475個核苷酸、約500個核苷酸、約525個核苷酸、約550個核苷酸、約575個核苷酸或約600個核苷酸。在特定實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約400個核苷酸。
在其他實施例中，ITR的初始序列和/或反向互補體包含約2-200個核苷酸、約5-200個核苷酸、約10-200個核苷酸、約20-200個核苷酸、約30-200個核苷酸、約40-200個核苷酸、約50-200個核苷酸、約60-200個核苷酸、約70-200個核苷酸、約80-200個核苷酸、約90-200個核苷酸、約100-200個核苷酸、約125-200個核苷酸、約150-200個核苷酸或約175-200個核苷酸。在其他實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-150個核苷酸、約5-150個核苷酸、約10-150個核苷酸、約20-150個核苷酸、約30-150個核苷酸、約40-150個核苷酸、約50-150個核苷酸、約75-150個核苷酸、約100-150個核苷酸或約125-150個核苷酸。在其他實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-100個核苷酸、約5-100個核苷酸、約10-100個核苷酸、約20-100個核苷酸、約30-100個核苷酸、約40-100個核苷酸、約50-100個核苷酸或約75-100個核苷酸。在其他實施例中，初始序列和/或反向互補體包含約2-50個核苷酸、約10-50個核苷酸、約20-50個核苷酸、約30-50個核苷酸、約40-50個核苷酸、約3-30個核苷酸、約4-20個核苷酸或約5-10個核苷酸。在另一個實施例中，初始序列和/或反向互補體由兩個核苷酸、三個核苷酸、四個核苷酸、五個核苷酸、六個核苷酸、七個核苷酸、八個核苷酸、九個核苷酸、十個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸或20個核苷酸組成。在其他實施例中，初始序列與反向互補體之間的插入核苷酸是（例如，由以下組成）0個核苷酸、1個核苷酸、兩個核苷酸、三個核苷酸、四個核苷酸、五個核苷酸、六個核苷酸、七個核苷酸、八個核苷酸、九個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸或20個核苷酸。
因此，如本文所用的“ITR”可以折疊回於自身並形成雙股區段。例如，在折疊形成雙螺旋時，序列GATCXXXXGATC包含GATC的初始序列及其互補體（3'CTAG5'）。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的連續回文序列（例如，GATCGATC）。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的中斷的回文序列（例如，GATCXXXXGATC）。在一些實施例中，連續或中斷的回文序列的互補部分彼此相互作用以形成“髮夾環”結構。如本文所用，在單股核苷酸分子上的至少兩個互補序列鹼基配對形成雙股部分時，產生“髮夾環”結構。在一些實施例中，僅ITR的一部分形成髮夾環。在其他實施例中，整個ITR形成髮夾環。在一些實施例中，ITR保留衍生出它的野生型ITR的Rep結合元件（RBE）。RBE的保留對於ITR的穩定性和製造目的可能是重要的。
如本文所用的術語“細小病毒”涵蓋細小病毒科，包括但不限於自主複製的細小病毒和依賴病毒。自主細小病毒包括例如以下屬的成員：博卡病毒屬（ Bocavirus）、依賴病毒屬、紅病毒屬、阿留申病毒屬（ Amdovirus）、細小病毒屬（ Parvovirus）、濃核病毒屬（ Densovirus）、重複病毒屬（ Iteravirus）、康特拉病毒屬（ Contravirus）、禽細小病毒屬（ Aveparvovirus）、反芻類細小病毒屬（ Copiparvovirus）、原細小病毒屬（ Protoparvovirus）、四型細小病毒屬（ Tetraparvovirus）、雙義濃核病毒屬（ Ambidensovirus）、短濃核病毒屬（ Brevidensovirus）、肝胰濃核病毒屬（ Hepandensovirus）和對蝦濃核病毒屬（ Penstyldensovirus）。例示性自主細小病毒包括但不限於人博卡病毒1（HBoV1）、豬細小病毒、小鼠微小病毒、犬細小病毒、水貂腸炎病毒、牛細小病毒、雞細小病毒、貓瘟病毒、貓細小病毒、鵝細小病毒（GPV）、H1細小病毒、番鴨細小病毒、蛇細小病毒和B19病毒。其他自主細小病毒是熟習此項技術者已知的。參見例如Fields等人 Virology, 第2卷, 第69章 (第4版, Lippincott-Raven Publishers)。
如本文所用的術語“非AAV”涵蓋來自細小病毒科的核酸、蛋白質和病毒，不包括細小病毒科的任何腺相關病毒（AAV）。“非AAV”包括但不限於以下屬的自主複製成員：博卡病毒屬、依賴病毒屬、紅病毒屬、阿留申病毒屬、細小病毒屬、濃核病毒屬、重複病毒屬、康特拉病毒屬、禽細小病毒屬、反芻類細小病毒屬、原細小病毒屬、四型細小病毒屬、雙義濃核病毒屬、短濃核病毒屬、肝胰濃核病毒屬和對蝦濃核病毒屬。
如本文所用，術語“腺相關病毒”（AAV）包括但不限於AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型（包括3A型和3B型）、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、山羊AAV、蝦AAV、Gao等人（J. Virol. 78:6381 (2004)）和Moris等人（Virol. 33:375 (2004)）所披露的那些AAV血清型和進化枝以及目前已知或將來發現的任何其他AAV。參見例如，FIELDS等人 VIROLOGY, 第2卷, 第69章（第4版, Lippincott-Raven Publishers）。
如本文所用，術語“衍生自”是指組分從指定分子或生物體分離或使用指定分子或生物體製備，或者資訊（例如，胺基酸或核酸序列）來自指定分子或生物體。例如，衍生自第二核酸序列（例如，ITR）的核酸序列（例如，ITR）可以包括與第二核酸序列的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列。在核苷酸或多肽的情況下，衍生的物質可以通過例如天然存在的誘變、人工定向誘變或人工隨機誘變來獲得。用於衍生核苷酸或多肽的誘變可以是有意定向的或有意隨機的，或者是各自的混合。誘變核苷酸或多肽以產生衍生自第一核苷酸或多肽的不同核苷酸或多肽可以是隨機事件（例如，由於聚合酶失真而引起），並且所衍生的核苷酸或多肽的鑒定可以通過適當的篩選方法（例如，如本文所討論）來進行。多肽的誘變通常需要操縱編碼多肽的多核苷酸。
“無衣殼（capsid-free）”或“無衣殼（capsid-less）”載體或核酸分子是指不具有衣殼的載體構築體。
如本文所用，“編碼區”或“編碼序列”是多核苷酸中由可轉譯成胺基酸的密碼子組成的部分。雖然“終止密碼子”（TAG、TGA或TAA）通常不轉譯成胺基酸，但是可以認為其是編碼區的一部分，但是任何側接序列（例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子等）不是編碼區的一部分。編碼區的邊界通常由5’末端的起始密碼子（編碼所得多肽的胺基末端）和3’末端的轉譯終止密碼子（編碼所得多肽的羧基末端）來決定。兩個或更多個編碼區可以存在於單一多核苷酸構築體中（例如，在單一載體上），或者存在於單獨的多核苷酸構築體中（例如，在單獨的（不同的）載體上）。然後，結果就是單一載體可以僅含有單個編碼區，或包含兩個或更多個編碼區。
哺乳動物細胞分泌的某些蛋白質與分泌信號肽相關，一旦生長中的蛋白質鏈跨越糙面內質網的輸出已經起始，所述分泌信號肽便從成熟蛋白質被切割下來。一般熟習此項技術者知道，信號肽通常融合至多肽的N末端，並且從完整或“全長”多肽被切割下來以產生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些實施例中，天然信號肽或該序列的保留了指導多肽分泌的能力的功能衍生物與所述多肽可操作地締合。可替代地，可以使用異源哺乳動物信號肽（例如，人組織纖溶酶原啟動物（TPA）或小鼠ß-葡糖醛酸糖苷酶信號肽）或其功能衍生物。
術語“下游”是指核苷酸序列位於參考核苷酸序列的3’。在某些實施例中，下游核苷酸序列是指轉錄起點之後的序列。例如，基因的轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點的下游。
術語“上游”是指核苷酸序列位於參考核苷酸序列的5’。在某些實施例中，上游核苷酸序列是指位於編碼區或轉錄起點的5’側的序列。例如，大多數啟動子位於轉錄起始位點的上游。
如本文所用，術語“基因匣”是指能夠指導特定多核苷酸序列在適當宿主細胞中表現的DNA序列，其包含與目的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子。基因匣可以涵蓋位於編碼區上游（5’非編碼序列）、內部或下游（3’非編碼序列），且影響相關編碼區的轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯的核苷酸序列。如果意圖在真核細胞中表現編碼區，則多腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常將位於編碼序列的3'。在一些實施例中，基因匣包含編碼基因產物的多核苷酸。在一些實施例中，基因匣包含編碼miRNA的多核苷酸。在一些實施例中，基因匣包含異源多核苷酸序列。
編碼產物（例如，miRNA或基因產物（例如，多肽，如治療性蛋白質））的多核苷酸可以包括與一個或多個編碼區可操作地締合的啟動子和/或其他表現（例如，轉錄或轉譯）控制序列。在可操作締合中，以將基因產物的表現置於一個或多個調節區的影響或控制下的方式將基因產物（例如，多肽）的編碼區與所述一個或多個調節區締合。例如，如果啟動子功能的誘導引起編碼由編碼區所編碼的基因產物的mRNA的轉錄，並且如果啟動子與編碼區之間的連接的性質不干擾啟動子指導基因產物表現的能力或者不干擾DNA模板被轉錄的能力，則編碼區和啟動子“可操作地締合”。除了啟動子以外的其他表現控制序列（例如，增強子、操縱子、抑制物和轉錄終止信號）也可以與編碼區可操作地締合以指導基因產物表現。
“表現控制序列”是指提供編碼序列在宿主細胞中的表現的調節核苷酸序列，如啟動子、增強子、終止子等。表現控制序列通常涵蓋有助於與其可操作地連接的編碼核酸的有效轉錄和轉譯的任何調節核苷酸序列。表現控制序列的非限制性例子包括啟動子、增強子、轉譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點或莖環結構。多種表現控制序列是熟習此項技術者已知的。這些包括而不限於在脊椎動物細胞中起作用的表現控制序列，如但不限於來自巨細胞病毒的啟動子和增強子片段（即時早期啟動子，與內含子A結合）、猿猴病毒40（早期啟動子）和反轉錄病毒（如勞斯肉瘤病毒）。其他表現控制序列包括衍生自脊椎動物基因的那些，如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔β珠蛋白，以及能夠控制真核細胞中基因表現的其他序列。另外的合適的表現控制序列包括組織特異性啟動子和增強子以及淋巴因子誘導型啟動子（例如可由干擾素或白細胞介素誘導的啟動子）。其他表現控制序列包括內含子序列、轉錄後調節元件和多腺苷酸化信號。在本揭露的其他地方討論了另外的例示性表現控制序列。
類似地，多種轉譯控制元件是一般熟習此項技術者已知的。這些轉譯控制元件包括但不限於核糖體結合位點、轉譯起始和終止密碼子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件（特別是內部核糖體進入位點，或IRES）。
如本文所用的術語“表現”是指多核苷酸產生基因產物（例如RNA或多肽）的過程。它包括而不限於將多核苷酸轉錄成信使RNA（mRNA）、轉移RNA（tRNA）、小髮夾RNA（shRNA）、小干擾RNA（siRNA）或任何其他RNA產物以及將mRNA轉譯為多肽。表現產生“基因產物”。如本文所用，基因產物可以是核酸，例如通過基因轉錄產生的信使RNA，或者是從轉錄物轉譯的多肽。本文描述的基因產物還包括經過轉錄後修飾（例如多腺苷酸化或剪接）的核酸，或經過轉譯後修飾（例如甲基化、糖基化、脂質的添加、與其他蛋白質亞基締合或蛋白水解切割）的多肽。如本文所用，術語“產量”是指通過基因表現產生的多肽的量。
“載體”是指用於將核酸選殖和/或轉移至宿主細胞中的任何媒劑。載體可以是複製子，另一核酸區段可以與其連接以實現所連接區段的複製。“複製子”是指在體內起自主複製單元的作用（即，能夠在其自身控制下複製）的任何基因元件（例如，質體、噬菌體、粘粒、染色體、病毒）。術語“載體”包括在體外、離體或在體內將核酸引入細胞中的媒劑。很多載體是本領域已知和使用的，包括例如質體、經修飾的真核病毒或經修飾的細菌病毒。通過將適當的多核苷酸片段連接到具有互補粘性末端的選擇載體中，可以實現將多核苷酸插入合適的載體中。
可以對載體進行工程化以編碼選擇性標記或報導子，其提供對已經摻入了載體的細胞的選擇或鑒定。選擇性標記或報導子的表現允許鑒定和/或選擇摻入了並表現含於載體上的其他編碼區的宿主細胞。本領域中已知並使用的選擇性標記基因的例子包括：提供針對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺磷除草劑、磺醯胺等的抗性的基因；和用作表型標記的基因，即花色苷調節基因、異戊烷基轉移酶基因等。本領域中已知並使用的報導子的例子包括：螢光素酶（Luc）、綠色螢光蛋白（GFP）、氯黴素乙醯轉移酶（CAT）、β-半乳糖苷酶（LacZ）、β-葡糖醛酸糖苷酶（Gus）等。還可以將選擇性標記視為報導子。
如本文所用的術語“宿主細胞”是指例如可以或已經用作ssDNA或載體的接受者的微生物、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。所述術語包括已經轉導的初始細胞的後代。因此，如本文所用的“宿主細胞”通常是指已經用外源DNA序列轉導的細胞。應理解，由於天然、偶然或刻意突變，單個親代細胞的後代的形態或基因體或總DNA互補體可能不一定與初始親代完全相同。在一些實施例中，宿主細胞可以是體外宿主細胞。
術語“選擇性標記”是指能夠基於標記基因的效應（即，對抗生素的抗性、對除草劑的抗性、比色標記、酶、螢光標記等）加以選擇的鑒定因子（通常是抗生素或化學抗性基因），其中所述效應用於跟蹤目的核酸的遺傳和/或鑒定已經遺傳目的核酸的細胞或生物體。本領域中已知並使用的選擇性標記基因的例子包括：提供針對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺磷除草劑、磺醯胺等的抗性的基因；和用作表型標記的基因，即花色苷調節基因、異戊烷基轉移酶基因等。
術語“報導基因”是指編碼能夠基於報導基因的效應加以鑒定的鑒定因子的核酸，其中所述效應用於跟蹤目的核酸的遺傳性、鑒定已經遺傳目的核酸的細胞或生物體和/或測量基因表現誘導或轉錄。本領域中已知並使用的報導基因的例子包括：螢光素酶（Luc）、綠色螢光蛋白（GFP）、氯黴素乙醯轉移酶（CAT）、β-半乳糖苷酶（LacZ）、β-葡糖醛酸糖苷酶（Gus）等。也可以將選擇性標記基因視為報導基因。
“啟動子”與“啟動子序列”可互換使用並且是指能夠控制編碼序列或功能RNA的表現的DNA序列。通常，編碼序列位於啟動子序列的3'。啟動子可以整體衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界中發現的不同啟動子的不同元件構成，或者甚至包含合成DNA區段。熟習此項技術者應理解，不同的啟動子可以指導基因在不同組織或細胞類型中、或在不同發育階段、或回應不同環境或生理條件而表現。使基因在大多數細胞類型中在大多數時間表現的啟動子一般被稱為“構成型啟動子”。使基因在特定細胞類型中表現的啟動子一般被稱為“細胞特異性啟動子”或“組織特異性啟動子”。使基因在發育或細胞分化的特定階段表現的啟動子一般被稱為“發育特異性啟動子”或“細胞分化特異性啟動子”。在用誘導啟動子的試劑、生物分子、化學品、配體、光等暴露或處理細胞後被誘導並且使基因表現的啟動子一般被稱為“誘導型啟動子”或“可調型啟動子”。還認識到，由於在大多數情況下，尚未完全界定調節序列的確切邊界，所以不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。在本揭露的其他地方討論了另外的例示性啟動子。
啟動子序列通常在其3’末端以轉錄起始位點為界，並向上游（5’方向）延伸以包括以高於背景的可檢測水平起始轉錄所必需的最小數目的鹼基或元件。在啟動子序列內將發現轉錄起始位點（例如通過用核酸酶S1標示（mapping）方便地界定）以及負責RNA聚合酶的結合的蛋白質結合結構域（共有序列）。
在一些實施例中，核酸分子包含組織特異性啟動子。在某些實施例中，組織特異性啟動子驅動治療性蛋白質在肝臟中、在肝細胞和/或內皮細胞中的表現。在一個特定實施例中，啟動子包含TTP啟動子。在一個特定實施例中，啟動子包含mTTR啟動子。在一個特定實施例中，啟動子包含A1AT啟動子。
術語“質體”是指染色體外元件，其通常攜帶不是細胞中心代謝的一部分的基因，並且通常是環狀雙股DNA分子的形式。此類元件可以是衍生自任何來源的單股或雙股DNA或RNA的線性、環狀或超螺旋化的自主複製序列、基因體整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中多個核苷酸序列已經接合或重組至獨特構築體中，所述構築體能夠將用於所選基因產物的啟動子片段和DNA序列以及適當的3'非轉譯序列引入細胞中。
可以使用的真核病毒載體包括但不限於腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒（例如，痘苗病毒載體）、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電脂質（細胞轉染劑）、DNA-蛋白質複合物和生物聚合物。
“選殖載體”是指“複製子”，其是單位長度的連續複製的核酸並且其包含複製起點，如質體、噬菌體或粘粒，另一核酸區段可以與所述複製子連接以實現所連接區段的複製。某些選殖載體能夠在一種細胞類型（例如，細菌）中複製，並在另一細胞類型（例如，真核細胞）中表現。選殖載體通常包含一個或多個可以用於選擇包含載體的細胞的序列和/或一個或多個用於插入目的核酸序列的多選殖位點。
術語“表現載體”是指設計為使得所插入核酸序列在插入宿主細胞中之後能夠表現的媒劑。將所插入核酸序列以如上所述的與調節區可操作地締合地放置。
通過本領域中熟知的方法將載體引入宿主細胞中，所述方法是例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂轉染（溶酶體融合）、使用基因槍或DNA載體轉運蛋白。如本文所用，“培養”（“culture”，“to culture”和“culturing”）意指在體外條件下培育細胞，所述條件允許細胞生長或分裂或使細胞維持存活狀態。如本文所用，“培養的細胞”是指體外繁殖的細胞。
如本文所用，術語“多肽”旨在涵蓋單數“多肽”以及複數“多肽”，並且是指由通過醯胺鍵（也稱為肽鍵）線性連接的單體（胺基酸）構成的分子。術語“多肽”是指兩個或更多個胺基酸的任何一條或多條鏈，並且不涉及產物的具體長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質”、“胺基酸鏈”或用於指兩個或更多個胺基酸的一條或多條鏈的任何其他術語包括於“多肽”的定義內，並且術語“多肽”可以代替這些術語中的任一個術語或與其互換使用。術語“多肽”還意圖指多肽的表現後修飾的產物，所述修飾包括但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/阻斷基團衍生、蛋白質水解切割或通過非天然存在的胺基酸修飾。多肽可以從天然生物來源衍生或通過重組技術產生，但不一定是從指定的核酸序列轉譯。其能以任何方式產生，包括通過化學合成產生。
術語“胺基酸”包括丙胺酸（Ala或A）；精胺酸（Arg或R）；天門冬醯胺酸（Asn或N）；天門冬胺酸（Asp或D）；半胱胺酸（Cys或C）；麩醯胺酸（Gln或Q）；麩胺酸（Glu或E）；甘胺酸（Gly或G）；組胺酸（His或H）；異白胺酸（Ile或I）；白胺酸（Leu或L）；離胺酸（Lys或K）；甲硫胺酸（Met或M）；苯丙胺酸（Phe或F）；脯胺酸（Pro或P）；絲胺酸（Ser或S）；蘇胺酸（Thr或T）；色胺酸（Trp或W）；酪胺酸（Tyr或Y）；和擷胺酸（Val或V）。非傳統胺基酸也在本揭露的範圍內，並且包括正白胺酸、鳥胺酸、正擷胺酸、高絲胺酸和其他胺基酸殘基類似物，如Ellman等人 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)中所述的那些。為了產生這種非天然存在的胺基酸殘基，可使用Noren等人 Science 244:182 (1989)和Ellman等人, 同上的程式。簡單來說，這些程式涉及用非天然存在的胺基酸殘基化學啟動抑制劑tRNA，之後進行RNA的體外轉錄和轉譯。引入非傳統胺基酸也可以使用本領域中已知的肽化學來實現。如本文所用，術語“極性胺基酸”包括具有零個淨電荷，但是在其側鏈的不同部分具有非零部分電荷的胺基酸（例如，M、F、W、S、Y、N、Q、C）。這些胺基酸可以參與疏水相互作用和靜電相互作用。如本文所用，術語“帶電胺基酸”包括在其側鏈上具有非零淨電荷的胺基酸（例如，R、K、H、E、D）。這些胺基酸可以參與疏水相互作用和靜電相互作用。
本揭露還包括多肽的片段或變體及其任何組合。術語“片段”或“變體”在涉及本揭露的多肽結合結構域或結合分子時包括保留參考多肽的至少一些特性（例如，對FcRn結合結構域或Fc變體的FcRn結合親和力、對FVIII變體的凝結活性或對VWF片段的FVIII結合活性）的任何多肽。除了本文中其他地方討論的特定抗體片段以外，多肽片段包括蛋白質水解片段以及缺失片段，但是不包括天然存在的全長多肽（或成熟多肽）。本揭露的多肽結合結構域或結合分子的變體包括如上所述的片段，以及由於胺基酸取代、缺失或插入而具有改變的胺基酸序列的多肽。變體可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的變體可以使用本領域中已知的誘變技術來產生。變體多肽可以包含保守或非保守胺基酸取代、缺失或添加。
“保守胺基酸取代”是用具有類似側鏈的胺基酸殘基替代胺基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如天門冬胺酸、麩胺酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、非極性的側鏈（例如丙胺酸、擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、β-分支側鏈（例如蘇胺酸、擷胺酸、異白胺酸）、以及芳香族側鏈（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。因此，如果多肽中的胺基酸被來自相同側鏈家族的另一種胺基酸替代，則將取代視為保守的。在另一個實施例中，胺基酸串可以用結構上類似但側鏈家族成員的順序和/或組成不同的串來保守地替代。
如本領域中已知的術語“同一性百分比”是兩個或更多個多肽序列或者兩個或更多個多核苷酸序列之間的關係，如通過比較序列所確定。在本領域中，根據具體情況，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之間的序列關聯性程度，如通過此類序列的串之間的匹配所確定。“同一性”可以通過已知方法容易地計算，所述已知方法包括但不限於： Computational Molecular Biology(Lesk, A. M.編) Oxford University Press, 紐約 (1988)； Biocomputing: Informatics and Genome Projects(Smith, D. W.編) Academic Press, 紐約 (1993)； Computer Analysis of Sequence Data, Part I(Griffin, A. M.和Griffin, H. G.編) Humana Press, New Jersey (1994)； Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje, G.編) Academic Press (1987)；以及 Sequence Analysis Primer(Gribskov, M.和Devereux, J.編) Stockton Press, 紐約 (1991)。確定同一性的優選方法設計為給出所測試序列之間的最佳匹配。確定同一性的方法被編纂於可公開獲得的電腦程式中。序列比對和同一性百分比計算可以使用序列分析軟體來進行，所述序列分析軟體是例如LASERGENE生物資訊學計算套件的Megalign程式（DNASTAR Inc.，威斯康辛州麥迪森市）、GCG程式套件（Wisconsin Package 9.0版，Genetics Computer Group（GCG），威斯康辛州麥迪森市）、BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403 (1990)）和DNASTAR（DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. 威斯康辛州麥迪森市 53715 美國）。在本申請的上下文中將理解，如果使用序列分析軟體進行分析，除非另外指定，否則分析結果將基於所參考程式的“缺省值”。如本文所用的“缺省值”將意指在首次初始化時最初用軟體載入的任一組值或參數。出於確定查詢序列（例如核酸序列）與參考序列之間的百分比同一性的目的，僅使用與參考序列中的核苷酸匹配的查詢序列中的核苷酸來計算同一性百分比。因此，在確定查詢序列或其指定部分（例如，核苷酸1-522）與參考序列之間的同一性百分比，通過將匹配的核苷酸的數量除以完全查詢序列中的核苷酸的總數來計算同一性百分比。
如本文所用，對應於本揭露的特定序列中的核苷酸的核苷酸是通過比對本揭露的序列以最大化與參考序列的同一性來鑒定。用於鑒定參考序列中的等效胺基酸的編號是基於用於鑒定本揭露的序列中的相應胺基酸的編號。
如本文所用，“治療”（“Treat”、“treatment”、“treating”）是指，例如，疾病或病症嚴重程度的降低；病程持續時間的縮短；與疾病或病症有關的一種或多種症狀的改善；為患有疾病或病症的個體提供有益的效果而不一定治癒所述疾病或病症或與疾病或病症相關的一種或多種症狀的預防。
如本文所用，“投予”意指經由醫藥上可接受的途徑將本揭露的醫藥上可接受的核酸分子、從所述核酸分子表現的多肽或包含所述核酸分子的載體給予至個體。投予途徑可以是靜脈內的，例如靜脈內注射和靜脈內輸注。另外的投予途徑包括例如皮下、肌內、口服、經鼻和經肺投予。核酸分子、多肽和載體可以作為包含至少一種賦形劑的醫藥組合物的一部分來投予。
如本文所用，“脂質奈米顆粒”是指具有至少一個奈米級維度（例如，1 nm至1,000 nm）的顆粒，其包含一種或多種陽離子脂質。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包含在可用於將活性劑或治療劑如核酸（例如mRNA）遞送至相關靶位點（例如細胞、組織、器官、腫瘤等）的配製品中。在一些實施例中，本文公開的脂質奈米顆粒包含核酸。此類脂質奈米顆粒通常包含一種或多種選自中性脂質、帶電脂質、類固醇和聚合物接合脂質的賦形劑。在一些實施例中，可以將活性劑或治療劑如核酸包封在脂質奈米顆粒的脂質部分中，或包封在由脂質奈米顆粒的一些或全部脂質部分包封的水性空間中，從而保護其免受酶降解或由宿主生物體或細胞的機制觸發的其他不期望的效應，如不利的免疫反應。
如本文所用的術語“醫藥上可接受的”是指分子實體和組合物在投予至人時在生理上可耐受並且通常不會產生毒性或過敏反應或類似的不良反應（如胃部不適、頭暈等）。任選地，如本文所用，術語“醫藥上可接受的”意指由聯邦政府或州政府的管理機構批准或者在美國藥典或其他公認藥典中列示用於動物，更特別是用於人。
如本文所用，片語“有需要的個體”包括將受益於本揭露的核酸分子、多肽或載體的投予的個體（如哺乳動物個體）。在一些實施例中，個體是人個體。在一些實施例中，個體是患有血友病的個體。個體可以是成年人或未成年人（例如，小於12歲）。
如本文所用，術語“治療性蛋白質”是指本領域中已知可以向個體投予的任何多肽。在一些實施例中，治療性蛋白質包含選自以下的蛋白質：凝血因子、生長因子、抗體、其功能片段、或它們的組合。如本文所用，術語“凝血因子”是指天然存在的或重組產生的分子或其類似物，其預防個體的出血發作或縮短出血發作的持續時間。換句話說，其意指具有促凝血活性（即，負責將纖維蛋白原轉形為不溶性纖維蛋白的網狀物，從而引起血液凝結或凝血）的分子。如本文所用的“凝血因子”包括啟動的凝血因子、其酶原或可啟動的凝血因子。“可啟動的凝血因子”是呈無活性形式（例如，呈其酶原形式）的凝血因子，其能夠被轉形為活性形式。術語“凝血因子”包括但不限於因子I（FI）、因子II（FII）、因子III（FIII）、因子IV（FIV）、因子V（FV）、因子VI（FVI）、因子VII（FVII）、因子VIII（FVIII）、因子IX（FIX）、因子X（FX）、因子XI（FXI）、因子XII（FXII）、因子XIII（FXIII）、血管性血友病因子（VWF）、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖連蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑（ZPI）、纖溶酶原、α2-抗纖溶酶、組織纖溶酶原啟動物（tPA）、尿激酶、纖溶酶原啟動物抑制劑-1（PAI-1）、纖溶酶原啟動物抑制劑-2（PAI2）、其酶原、其活化形式或其任何組合。
如本文所用的“凝血活性”意指參與生化反應級聯的能力，所述級聯以形成纖維蛋白凝塊告終和/或降低出血症或出血發作的嚴重程度、持續時間或頻率。
如本文所用，“生長因子”包括本領域中已知的包括細胞因子和激素在內的任何生長因子。
如本文所用，術語“異源的”或“外源的”是指此類分子通常在給定背景下（例如，在細胞中或在多肽中）未發現。例如，可以將外源或異源分子引入細胞中並且僅在例如通過轉染或其他形式的基因工程化操縱細胞之後存在，或者異源胺基酸序列可以存在於其天然不存在的蛋白質中。
“參考核苷酸序列”在本文中用作與本揭露的核苷酸序列的比較時，是與本揭露的核苷酸序列基本上相同的多核苷酸序列，但是對應於FVIII序列的部分未經優化。在一些實施例中，本文公開的核酸分子的參考核苷酸序列是SEQ ID NO: 32。
如本文所用，關於核苷酸序列的術語“優化”是指編碼多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列已經突變以增強所述多核苷酸序列的特性。在一些實施例中，進行優化以增加轉錄水平、增加轉譯水平、增加穩態mRNA水平、增加或減少調節蛋白（如通用轉錄因子）的結合、增加或減少剪接或增加多核苷酸序列產生的多肽的產量。可以對多核苷酸序列進行以使其優化的變化的例子包括密碼子優化、G/C含量優化、去除重複序列、去除富含AT的元件、去除隱蔽剪接位點、去除抑制轉錄或轉譯的順式作用元件、添加或去除多聚T或多聚A序列、在轉錄起始位點周圍添加增強轉錄的序列（如Kozak共有序列）、去除可以形成莖環結構的序列、去除去穩定序列、去除CpG基序及其兩個或更多個組合。 核酸分子
本揭露的某些方面旨在克服AAV載體用於基因療法的缺陷。特別地，本揭露的某些方面涉及包含第一ITR、第二ITR和基因匣的核酸分子。在一些實施例中，基因匣編碼治療性蛋白質和/或miRNA。在一些實施例中，第一ITR和第二ITR側接包含異源多核苷酸序列的基因匣。在一些實施例中，核酸分子不包含編碼衣殼蛋白、複製蛋白和/或組裝蛋白的基因。在一些實施例中，基因匣編碼治療性蛋白質。在一些實施例中，治療性蛋白質包含凝血因子。在一些實施例中，基因匣編碼miRNA。在某些實施例中，基因匣定位於第一ITR與第二ITR之間。在一些實施例中，核酸分子還包含一個或多個非編碼區。在某些實施例中，所述一個或多個非編碼區包含啟動子序列、內含子、轉錄後調節元件、3'UTR多聚(A)序列或其任何組合。
在一個實施例中，基因匣是單股核酸。在另一個實施例中，基因匣是雙股核酸。在另一個實施例中，基因匣是封閉末端雙股核酸（ceDNA）。
在一些實施例中，核酸分子包含：(a) 第一ITR，其是衍生自細小病毒科的非AAV家族成員的ITR（例如，HBoV1 ITR）；(b) 組織特異性啟動子序列，例如TTP或TTR啟動子；(c) 內含子，例如合成內含子；(d) 編碼miRNA或治療性蛋白質（例如凝血因子）的核苷酸；(e) 轉錄後調節元件，例如WPRE；(f) 3'UTR多聚(A)尾序列，例如bGHpA；(g) 第二ITR，其是衍生自細小病毒科的非AAV家族成員的ITR（例如，HBoV1 ITR）。在一些實施例中，核酸分子包含：(a) 第一ITR，其是衍生自細小病毒科的非AAV家族成員的ITR（例如，HBoV1 ITR）；(b) 組織特異性啟動子序列，例如mTTR啟動子；(c) 內含子，例如合成內含子；(d) 編碼miRNA或治療性蛋白質（例如凝血因子）的核苷酸；(e) 轉錄後調節元件，例如WPRE；(f) 3'UTR多聚(A)尾序列，例如bGHpA；(g) 第二ITR，其是衍生自細小病毒科的非AAV家族成員的ITR（例如，HBoV1 ITR）。在一些實施例中，組織特異性啟動子是人α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子包含SEQ ID NO: 36的核苷酸序列。
在一些實施例中，本文公開了包含基因匣的分離的核酸分子，所述基因匣包含與SEQ ID NO: 9至少約75%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，本文公開了包含與SEQ ID NO: 9具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。
在一些實施例中，本文公開了包含基因匣的分離的核酸分子，所述基因匣包含與SEQ ID NO: 33至少約75%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，本文公開了包含與SEQ ID NO: 33具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。
在一些實施例中，本文公開了包含基因匣的分離的核酸分子，所述基因匣包含與SEQ ID NO: 14至少約75%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，本文公開了包含與SEQ ID NO: 14具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。
在另一態樣，本文公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少85%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少90%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 35至少50%相同。
本文還公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
在某些實施例中，本文公開的核酸分子包含來自人博卡病毒1（HBoV1）的ITR序列。在某些實施例中，本文公開的核酸分子包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2至少約75%相同的第一ITR。 A. 反向末端重複序列（ITR）
本揭露的某些方面涉及一種核酸分子，其包含第一ITR（例如，5' ITR）和第二ITR（例如，3' ITR）。通常，ITR參與細小病毒（例如，AAV）從原核質體進行DNA複製和拯救或切除（Samulski等人, 1983, 1987；Senapathy等人, 1984；Gottlieb和Muzyczka, 1988）。另外，ITR似乎是AAV原病毒整合和將AAV DNA包裝至病毒粒子中所需的最小序列（McLaughlin等人, 1988；Samulski等人, 1989）。這些元件是細小病毒基因體的有效操縱必需的。假設對於ITR功能不可或缺的最小定義元件是Rep結合位點和末端解離位點加允許髮夾形成的可變回文序列。回文核苷酸區域通常作為DNA複製的起點以及作為病毒的包裝信號以順式一起作用。ITR中的互補序列在DNA複製期間折疊成髮夾結構。在一些實施例中，ITR折疊成髮夾T形結構。在其他實施例中，ITR折疊成非T形髮夾結構，例如折疊成U形髮夾結構。資料表明，AAV ITR的T形髮夾結構可以抑制兩側為ITR的轉基因的表現。參見例如，Zhou等人 (2017) Scientific Reports7:5432。通過利用不形成T形髮夾結構的ITR，可以避免這種形式的抑制。因此，在某些方面中，與包含形成T形髮夾的AAV ITR的多核苷酸相比，包含非AAV ITR的多核苷酸具有改善的轉基因表現。
如本文所用，“反向末端重複序列”（或“ITR”）是指位於單股核酸序列的5'端或3'端的核酸子序列，其包含一組核苷酸（初始序列），之後下游是其反向互補體，即回文序列。初始序列與反向互補體之間的插入核苷酸序列可以具有任何長度，包括零。在一個實施例中，可用於本揭露的ITR包含一個或多個“回文序列”。ITR可以具有任何數目的功能。在一些實施例中，本文所述的ITR形成髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成T形髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成非T形髮夾結構，例如U形髮夾結構。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的長期存活。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的永久存活（例如，持續細胞的整個壽命）。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的穩定性。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的保留。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的持久性。在一些實施例中，ITR抑制或防止核酸分子在細胞的細胞核中的降解。
因此，如本文所用的“ITR”可以折疊回於自身並形成雙股區段。例如，在折疊形成雙螺旋時，序列GATCXXXXGATC包含GATC的初始序列及其互補體（3'CTAG5'）。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的連續回文序列（例如，GATCGATC）。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的中斷的回文序列（例如，GATCXXXXGATC）。在一些實施例中，連續或中斷的回文序列的互補部分彼此相互作用以形成“髮夾環”結構。如本文所用，在單股核苷酸分子上的至少兩個互補序列鹼基配對形成雙股部分時，產生“髮夾環”結構。在一些實施例中，僅ITR的一部分形成髮夾環。在其他實施例中，整個ITR形成髮夾環。
在一些實施例中，ITR包含天然存在的ITR，例如ITR包含衍生自細小病毒科的成員的ITR的全部或一部分。在一些實施例中，ITR包含合成序列。在一個實施例中，第一ITR或第二ITR包含合成序列。在另一個實施例中，第一ITR和第二ITR各自包含合成序列。在一些實施例中，第一ITR或第二ITR包含天然存在的序列。在另一個實施例中，第一ITR和第二ITR各自包含天然存在的序列。
在一些實施例中，ITR包含天然存在的ITR的一部分（例如，截短型ITR）或由所述部分組成。在一些實施例中，ITR包含天然存在的ITR的片段或由所述片段組成，其中所述片段包含至少約5個核苷酸、至少約10個核苷酸、至少約15個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少約25個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約35個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約45個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約55個核苷酸、至少約60個核苷酸、至少約65個核苷酸、至少約70個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約80個核苷酸、至少約85個核苷酸、至少約90個核苷酸、至少約95個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約125個核苷酸、至少約150個核苷酸、至少約175個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約225個核苷酸、至少約250個核苷酸、至少約275個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約325個核苷酸、至少約350個核苷酸、至少約375個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約425個核苷酸、至少約450個核苷酸、至少約475個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約525個核苷酸、至少約550個核苷酸、至少約575個核苷酸或至少約600個核苷酸；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在某些實施例中，ITR包含天然存在的ITR的片段或由所述片段組成，其中所述片段包含至少約129個核苷酸；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在某些實施例中，ITR包含天然存在的ITR的片段或由所述片段組成，其中所述片段包含至少約102個核苷酸；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在一些實施例中，ITR保留衍生出它的野生型ITR的Rep結合元件（RBE）。在一些實施例中，ITR保留衍生出它的野生型ITR的RBE中的至少一個。在一些實施例中，ITR保留衍生出它的野生型ITR的RBE或其功能部分中的至少一個。RBE的保留對於ITR的穩定性和製造目的可能是重要的。
在一些實施例中，ITR包含天然存在的ITR的一部分或由所述部分組成，其中所述片段包含天然存在的ITR的長度的至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%；其中所述片段保留天然存在的ITR的功能特性。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自野生型HBoV1 ITR。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自野生型B19 ITR。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自野生型GPV ITR。
在某些實施例中，ITR包含如下序列或由如下序列組成，所述序列在正確比對時與天然存在的ITR的同源部分具有至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在其他實施例中，ITR包含如下序列或由如下序列組成，所述序列在正確比對時與天然存在的ITR的同源部分具有至少90%的序列同一性；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在一些實施例中，ITR包含如下序列或由如下序列組成，所述序列在正確比對時與天然存在的ITR的同源部分具有至少80%的序列同一性；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在一些實施例中，ITR包含如下序列或由如下序列組成，所述序列在正確比對時與天然存在的ITR的同源部分具有至少70%的序列同一性；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在一些實施例中，ITR包含如下序列或由如下序列組成，所述序列在正確比對時與天然存在的ITR的同源部分具有至少60%的序列同一性；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。在一些實施例中，ITR包含如下序列或由如下序列組成，所述序列在正確比對時與天然存在的ITR的同源部分具有至少50%的序列同一性；其中ITR保留天然存在的ITR的功能特性。
在一些實施例中，ITR包含來自AAV基因體的ITR。在一些實施例中，ITR是選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11及其任何組合的AAV基因體的ITR。在一些實施例中，ITR是熟習此項技術者已知的任何AAV基因體的ITR，包括天然分離物，例如天然人分離物。在一個特定實施例中，ITR是AAV2基因體的ITR。在另一個實施例中，ITR是經基因工程化以在其5′和3′端包括衍生自一個或多個AAV基因體的ITR的合成序列。
在一些實施例中，ITR不是衍生自AAV基因體（即ITR衍生自不是AAV的病毒）。在一些實施例中，ITR是非AAV的ITR。在一些實施例中，ITR是來自選自但不限於以下的病毒科細小病毒科的非AAV基因體的ITR：博卡病毒屬、依賴病毒屬、紅病毒屬、阿留申病毒屬、細小病毒屬、濃核病毒屬、重複病毒屬、康特拉病毒屬、禽細小病毒屬、反芻類細小病毒屬、原細小病毒屬、四型細小病毒屬、雙義濃核病毒屬、短濃核病毒屬、肝胰濃核病毒屬、對蝦濃核病毒屬及其任何組合。在某些實施例中，ITR衍生自人博卡病毒1（HBoV1）。在另一個實施例中，ITR衍生自紅病毒屬細小病毒B19（人病毒）。在另一個實施例中，ITR衍生自番鴨細小病毒（MDPV）株。在某些實施例中，MDPV株被減弱，例如MDPV株FZ91-30。在其他實施例中，MDPV株是病原性的，例如MDPV株YY。在一些實施例中，ITR衍生自豬細小病毒，例如豬細小病毒U44978。在一些實施例中，ITR衍生自小鼠微小病毒，例如小鼠微小病毒U34256。在一些實施例中，ITR衍生自犬細小病毒，例如犬細小病毒M19296。在一些實施例中，ITR衍生自水貂腸炎病毒，例如水貂腸炎病毒D00765。在一些實施例中，ITR衍生自依賴細小病毒（ Dependoparvovirus）。在一個實施例中，依賴細小病毒是依賴病毒屬鵝細小病毒（GPV）株。在一個具體實施例中，GPV株被減弱，例如GPV株82-0321V。在另一個具體實施例中，GPV株是病原性的，例如GPV株B。
核酸分子的第一ITR和第二ITR可以衍生自相同基因體（例如，衍生自相同病毒的基因體），或衍生自不同基因體（例如，衍生自兩種或更多種不同病毒基因體的基因體）。在某些實施例中，第一ITR和第二ITR衍生自相同的AAV基因體。在一個具體實施例中，存在於本發明的核酸分子中的這兩個ITR是相同的，並且特別地可以是AAV2 ITR。在其他實施例中，第一ITR衍生自AAV基因體並且第二ITR並非衍生自AAV基因體（例如，非AAV基因體）。在其他實施例中，第一ITR並非衍生自AAV基因體（例如，非AAV基因體）並且第二ITR衍生自AAV基因體。在再其他實施例中，第一ITR和第二ITR二者都並非衍生自AAV基因體（例如，非AAV基因體）。在一個特定實施例中，第一ITR和第二ITR是相同的。
在一些實施例中，第一ITR衍生自非AAV基因體，並且第二ITR衍生自非AAV基因體，其中第一ITR和第二ITR衍生自相同的基因體。非AAV病毒基因體的非限制性例子來自：博卡病毒屬、依賴病毒屬、紅病毒屬、阿留申病毒屬、細小病毒屬、濃核病毒屬、重複病毒屬、康特拉病毒屬、禽細小病毒屬、反芻類細小病毒屬、原細小病毒屬、四型細小病毒屬、雙義濃核病毒屬、短濃核病毒屬、肝胰濃核病毒屬和對蝦濃核病毒屬。在一些實施例中，第一ITR衍生自非AAV基因體，並且第二ITR衍生自非AAV基因體，其中第一ITR和第二ITR衍生自不同的病毒基因體。
在一些實施例中，第一ITR衍生自AAV基因體，並且第二ITR衍生自人博卡病毒1（HBoV1）。在其他實施例中，第二ITR衍生自AAV基因體，並且第一ITR衍生自人博卡病毒1（HBoV1）。
在一些實施例中，第一ITR包含衍生自AAV或非AAV基因體的ITR的全部或一部分或由所述ITR的全部或一部分組成，並且第二ITR包含衍生自AAV或非AAV基因體的ITR的全部或一部分或由所述ITR的全部或一部分組成。在一些實施例中，衍生自AAV或非AAV基因體的ITR的一部分是衍生自AAV或非AAV基因體的天然存在的ITR的截短形式。在一些實施例中，衍生自AAV或非AAV基因體的ITR的一部分包含衍生自AAV或非AAV基因體的天然存在的ITR的部分。例如，衍生自AAV或非AAV基因體的ITR的一部分包含衍生自AAV或非AAV基因體的天然存在的ITR的部分，其中至少一個RBE或其功能部分被保留。
在某些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含衍生自HBoV1的ITR的全部或一部分，或由所述ITR的全部或一部分組成。在某些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含衍生自HBoV1的ITR的全部或一部分，或由所述ITR的全部或一部分組成。在一些實施例中，第二ITR是第一ITR的反向互補體。在一些實施例中，第一ITR是第二ITR的反向互補體。在一些實施例中，衍生自HBoV1的第一ITR和/或第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或2中所示的核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%相同，其中第一ITR和/或第二ITR保留衍生出它的HBoV1 ITR的功能特性。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與選自SEQ ID NO: 1或2的核苷酸序列至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%相同，其中第一ITR和/或第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，第一ITR包含SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，第二ITR包含SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中，第一ITR包含SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列或由其組成，並且第二ITR包含SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列或由其組成。
對於熟習此項技術者將理解，本文所述的任何第一ITR序列可以與本文所述的任何第二ITR序列匹配。在一些實施例中，本文所述的第一ITR序列是5'ITR序列。在一些實施例中，本文所述的第二ITR序列是3'ITR序列。在一些實施例中，本文所述的第二ITR序列是5'ITR序列。在一些實施例中，本文所述的第一ITR序列是3'ITR序列。熟習此項技術者將能夠確定關於基因匣的架構的第一和第二ITR的合適的取向。
在另一個特定實施例中，ITR是經基因工程化以在其5'和3'端包括並非衍生自AAV基因體的ITR的合成序列。在另一個特定實施例中，ITR是經基因工程化以在其5'和3'端包括衍生自一個或多個非AAV基因體的ITR的合成序列。存在於本發明的核酸分子中的兩個ITR可以是相同或不同的非AAV基因體。具體地，ITR可以衍生自相同的非AAV基因體。在一個具體實施例中，存在於本發明的核酸分子中的這兩個ITR是相同的，並且特別地可以是AAV2 ITR。
在一些實施例中，ITR序列包含一個或多個回文序列。本文所公開的ITR的回文序列包括但不限於天然回文序列（即，在自然界中發現的序列）、合成序列（即，未在自然界中發現的序列）（如偽回文序列）及其組合或經修飾形式。“偽回文序列”是包括不完美的回文序列在內的回文DNA序列，其與形成二級結構的天然AAV或非AAV回文序列中的序列共用小於80%（包括小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%或無）核酸序列同一性。天然回文序列可以從本文所公開的任何基因體獲得或衍生。合成回文序列可以基於本文所公開的任何基因體。
回文序列可以是連續或中斷的。在一些實施例中，回文序列是中斷的，其中回文序列包含第二序列的插入。在一些實施例中，第二序列包含啟動子、增強子、整合酶的整合位點（例如，Cre或Flp重組酶的位點）、基因產物的開放閱讀框或其組合。
在一些實施例中，ITR形成髮夾環結構。在一個實施例中，第一ITR形成髮夾結構。在另一個實施例中，第二ITR形成髮夾結構。仍然在另一個實施例中，第一ITR和第二ITR二者都形成髮夾結構。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR不形成T形髮夾結構。在某些實施例中，第一ITR和/或第二ITR形成非T形髮夾結構。在一些實施例中，非T形髮夾結構包含U形髮夾結構。
在一些實施例中，本文所述的核酸分子中的ITR可以是轉錄啟動的ITR。轉錄啟動的ITR可以包含已經通過包括至少一個轉錄活性元件而被轉錄啟動的野生型ITR的全部或一部分。多種類型的轉錄活性元件適用於這個背景。在一些實施例中，轉錄活性元件是構成型轉錄活性元件。構成型轉錄活性元件提供持續水平的基因轉錄，並且在需要持續表現轉基因時是優選的。在其他實施例中，轉錄活性元件是誘導型轉錄活性元件。誘導型轉錄活性元件通常在誘導物（或誘導條件）不存在下展現低活性，並且在誘導物存在下（或切換至誘導條件）上調。當僅在某些時間或在某些位置需要表現時或當需要使用誘導劑逐步增加表現水平時，誘導型轉錄活性元件可能是優選的。轉錄活性元件也可以具有組織特異性；也就是說，其僅在某些組織或細胞類型中展現活性。
可以以多種方式將轉錄活性元件摻入ITR中。在一些實施例中，將轉錄活性元件摻入ITR的任何部分的5任或ITR的任何部分的3任。在其他實施例中，轉錄啟動的ITR的轉錄活性元件位於兩個ITR序列之間。如果轉錄活性元件包含兩個或更多個必須被間隔開的元件，則那些元件可以與ITR的部分交替。在一些實施例中，ITR的髮夾結構缺失並用轉錄元件的反向重複來替代。這後一種排列將產生類比結構中的缺失部分的髮夾。多個串聯轉錄活性元件也可以存在於轉錄啟動的ITR中，並且這些元件可以相鄰或間隔開。另外，可以將蛋白質結合位點（例如，Rep結合位點）引入轉錄啟動的ITR的轉錄活性元件中。轉錄活性元件可以包含使得能夠通過RNA聚合酶受控轉錄DNA以形成RNA的任何序列，並且可以包含例如如下文所定義的轉錄活性元件。
轉錄啟動的ITR向具有相對受限的核苷酸序列長度的核酸分子提供轉錄啟動和ITR功能二者，這有效地使可以攜帶並從核酸分子表現的轉基因的長度最大化。將轉錄活性元件摻入ITR中可以以多種方式來完成。對ITR序列和轉錄活性元件的序列需求的比較可以提供對編碼ITR內的元件的方式的瞭解。例如，可以通過在複製轉錄活性元件的功能元件的ITR序列中引入特定變化將轉錄活性添加至ITR。本領域中存在多種技術可有效添加、缺失和/或改變特定位點的具體核苷酸序列（參見例如，Deng和Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88）。產生轉錄啟動的ITR的另一方式涉及在ITR中的所需位置引入限制位點。另外，可以使用本領域中已知的方法將多個轉錄活性元件摻入轉錄啟動的ITR中。
通過說明的方式，可以通過包括一個或多個諸如以下的轉錄活性元件來產生轉錄啟動的ITR：TATA盒、GC盒、CCAAT盒、Sp1位點、Inr區、CRE（cAMP調節元件）位點、ATF-1/CRE位點、APBβ盒、APBα盒、CArG盒、CCAC盒或如本領域中已知參與轉錄的任何其他元件。 B. 治療性蛋白質
本揭露的某些方面涉及一種包含第一ITR、第二ITR和編碼靶序列的基因匣的核酸分子，其中靶序列編碼治療性蛋白質。在一些實施例中，基因匣編碼一種治療性蛋白質。在一些實施例中，基因匣編碼多於一種治療性蛋白質。在一些實施例中，基因匣編碼相同治療性蛋白質的兩個或更多個複製。在一些實施例中，基因匣編碼相同治療性蛋白質的兩種或更多種變體。在一些實施例中，基因匣編碼兩種或更多種不同的治療性蛋白質。
本揭露的某些實施例涉及一種包含第一ITR、第二ITR和編碼治療性蛋白質的基因匣的核酸分子，其中治療性蛋白質包含凝血因子。在一些實施例中，凝血因子選自FI、FII、FIII、FIV、FV、FVI、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII、VWF、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖連蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑（ZPI）、纖溶酶原、α2-抗纖維蛋白溶酶、組織纖溶酶原啟動物（tPA）、尿激酶、纖溶酶原啟動物抑制劑-1（PAI-1）、纖溶酶原啟動物抑制劑-2（PAI2）、其任何酶原、其任何活性形式及其任何組合。在一個實施例中，凝血因子包含FVIII或其變體或片段。在另一個實施例中，凝血因子包含FIX或其變體或片段。在另一個實施例中，凝血因子包含FVII或其變體或片段。在另一個實施例中，凝血因子包含VWF或其變體或片段。
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR和編碼靶序列的基因匣，其中靶序列編碼治療性蛋白質，其中治療性蛋白質包含因子VIII多肽。除非另外指定，否則如本文所用，“因子VIII”在整個本申請中縮寫為“FVIII”，意指具有其在凝結中的正常作用的功能性FVIII多肽。因此，術語FVIII包括功能性變體多肽。“FVIII蛋白”可與FVIII多肽（或蛋白質）或FVIII互換使用。FVIII功能的例子包括但不限於啟動凝結的能力、作為因子IX的輔因子作用的能力或在Ca 2+和磷脂存在下與因子IX形成因子Ⅹ酶（tenase）複合物的能力，所述複合物然後將因子X轉形為啟動形式Xa。
本文所用的治療性蛋白質中的FVIII部分具有FVIII活性。FVIII活性可以通過本領域中任何已知方法來測量。許多測試可用於評估凝血系統的功能：啟動部分促凝血酶原激酶時間（aPTT）測試、生色測定、ROTEM測定、凝血酶原時間（PT）測試（也用於確定INR）、纖維蛋白原測試（通常通過克勞斯法進行）、血小板計數、血小板功能測試（通常通過PFA-100進行）、TCT、出血時間、混合測試（如果將患者的血漿與正常血漿混合，是否矯正異常）、凝結因子測定、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試（例如，因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A）、稀釋魯塞爾蝰蛇毒時間（dRVVT）、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記法（TEG或Sonoclot）、凝血彈性測量法（TEM ®，例如ROTEM ®）或優球蛋白溶解時間（ELT）。
aPTT測試是測量“固有”（也稱為接觸啟動途徑）和常見凝結途徑二者的功效的性能指示物。這個測試一般用於測量市售重組凝血因子（例如，FVIII）的凝血活性。其與測量外在途徑的凝血酶原時間（PT）結合使用。
ROTEM分析提供關於止血的整體動力學的資訊：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性和溶解。凝血彈性測量法中的不同參數依賴於血漿凝結系統的活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響這些相互作用的許多因素。這個分析可以提供次級止血的全面見解。
生色測定機制是基於血液凝結級聯的原理，其中在啟動的因子IX、磷脂和鈣離子的存在下，啟動的FVIII加速因子X轉形為因子Xa。因子Xa活性是通過水解對因子Xa具有特異性的對硝基苯胺（pNA）底物來評估。在405 nM下測量的對硝基苯胺的初始釋放速率與因子Xa活性成正比，並且因此與樣品中的FVIII活性成正比。生色測定得到了國際血栓形成與止血學會（ISTH）的科學標準化委員會（SSC）的FVIII和因子IX小組委員會的推薦。從1994年以來，生色測定也已經是歐洲藥典中用於指定FVIII濃縮物效力的參考方法。
在一些實施例中，基因匣包含編碼FVIII多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列經密碼子優化。在一些實施例中，基因匣包含由mTTR啟動子驅動、編碼密碼子優化的FVIII的核苷酸序列和合成內含子。在一些實施例中，基因匣包含國際申請號PCT/US2017/015879中披露的核苷酸序列，將所述申請通過引用以其整體併入。在一些實施例中，基因匣是如PCT/US2017/015879中所述的“hFVIIIco6XTEN”基因匣。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 32。
在一些實施例中，基因匣包含經密碼子優化的cDNA，其編碼與XTEN 144肽融合的B結構域缺失（BDD）的經密碼子優化的人因子VIII（BDDcoFVIII）。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣具有SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
在一些實施例中，基因匣包含由mTTR啟動子驅動、編碼密碼子優化的FVIII的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣還包含A1MB2增強子元件。在一些實施例中，基因匣還包含嵌合或合成內含子。在一些實施例中，基因匣還包含土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）。在一些實施例中，基因匣還包含牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號。
在一些實施例中，本揭露涉及編碼具有FVIII活性的多肽的經密碼子優化的核酸分子。在一些實施例中，多核苷酸編碼全長FVIII多肽。在其他實施例中，核酸分子編碼B結構域缺失的（BDD）FVIII多肽，其中FVIII的B結構域的全部或一部分缺失。
在其他實施例中，通過去除一個或多個CpG基序和/或甲基化至少一個CpG基序來進一步優化本文公開的核酸分子。如本文所用，“CpG基序”是指含有通過磷酸鍵與鳥苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列。術語“CpG基序”包括甲基化和非甲基化CpG二核苷酸。非甲基化CpG基序在細菌和病毒來源的核酸（例如，質體DNA）中是常見的，但在脊椎動物DNA中被抑制並大部分甲基化。因此，非甲基化CpG基序刺激哺乳動物宿主產生快速發炎反應。Klinman,等人 (1996). PNAS 93:2879-2883。在Yew, N. S.,等人 (2002). Mol Ther. 5(6):731-738和國際申請號PCT/US2001/010309中描述了CpG去除的例示性方法。在一些實施例中，本文公開的核酸分子已被修飾為含有更少的CpG基序（即CpG減少或CpG缺失）。在一個實施例中，位於所選胺基酸的密碼子三聯體內的CpG基序被改變為缺少CpG基序的相同胺基酸的密碼子三聯體。在一些實施例中，本文公開的核酸分子已被優化以降低先天免疫反應。
在一個特定實施例中，核酸分子編碼包含與SEQ ID NO: 10具有至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列同一性的胺基酸序列的多肽或其片段。在一些實施例中，本揭露的核酸分子編碼包含信號肽的FVIII多肽或其片段。在其他實施例中，核酸分子編碼缺少信號肽的FVIII多肽。在一些實施例中，所述信號肽包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列。在一些實施例中，所述信號肽包含SEQ ID NO: 10的胺基酸1-19。
在一些實施例中，核酸分子包含第一ITR、第二ITR和編碼靶序列的基因匣，其中所述靶序列編碼治療性蛋白質，並且其中所述治療性蛋白質包含生長因子。生長因子可以選自本領域中已知的任何生長因子。在一些實施例中，生長因子是激素。在其他實施例中，生長因子是細胞因子。在一些實施例中，生長因子是趨化因子。
在一些實施例中，生長因子是腎上腺髓質素（AM）。在一些實施例中，生長因子是血管生成素（Ang）。在一些實施例中，生長因子是自分泌運動因子。在一些實施例中，生長因子是骨形態發生蛋白（BMP）。在一些實施例中，BMP選自BMP2、BMP4、BMP5和BMP7。在一些實施例中，生長因子是睫狀神經營養因子家族成員。在一些實施例中，睫狀神經營養因子家族成員選自睫狀神經營養因子（CNTF）、白血病抑制因子（LIF）、白介素-6（IL-6）。在一些實施例中，生長因子是集落刺激因子。在一些實施例中，集落刺激因子選自巨噬細胞集落刺激因子（m-CSF）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）。在一些實施例中，生長因子是表皮生長因子（EGF）。在一些實施例中，生長因子是肝配蛋白。在一些實施例中，肝配蛋白選自肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2和肝配蛋白B3。在一些實施例中，生長因子是促紅細胞生成素（EPO）。在一些實施例中，生長因子是成纖維細胞生長因子（FGF）。在一些實施例中，FGF選自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。在一些實施例中，生長因子是胎牛促體素（FBS）。在一些實施例中，生長因子是GDNF家族成員。在一些實施例中，GDNF家族成員選自神經膠質細胞株衍生的神經營養因子（GDNF）、神經秩蛋白、普塞芬蛋白和阿特敏蛋白。在一些實施例中，生長因子是生長分化因子-9（GDF9）。在一些實施例中，生長因子是肝細胞生長因子（HGF）。在一些實施例中，生長因子是肝細胞瘤衍生的生長因子（HDGF）。在一些實施例中，生長因子是胰島素。在一些實施例中，生長因子是胰島素樣生長因子。在一些實施例中，胰島素樣生長因子是胰島素樣生長因子-1（IGF-1）或IGF-2。在一些實施例中，生長因子是白介素（IL）。在一些實施例中，IL選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。在一些實施例中，生長因子是角質形成細胞生長因子（KGF）。在一些實施例中，生長因子是遷移刺激因子（MSF）。在一些實施例中，生長因子是巨噬細胞刺激蛋白（MSP或肝細胞生長因子樣蛋白（HGFLP）。在一些實施例中，生長因子是肌生成抑制蛋白（GDF-8）。在一些實施例中，生長因子是神經調節蛋白。在一些實施例中，神經調節蛋白選自神經調節蛋白1（NRG1）、NRG2、NRG3和NRG4。在一些實施例中，生長因子是神經營養蛋白。在一些實施例中，生長因子是腦衍生的神經營養因子（BDNF）。在一些實施例中，生長因子是神經生長因子（NGF）。在一些實施例中，NGF是神經營養蛋白-3（NT-3）或NT-4。在一些實施例中，生長因子是胎盤生長因子（PGF）。在一些實施例中，生長因子是血小板衍生的生長因子（PDGF）。在一些實施例中，生長因子是腎胺酶（RNLS）。在一些實施例中，生長因子是T細胞生長因子（TCGF）。在一些實施例中，生長因子是血小板生成素（TPO）。在一些實施例中，生長因子是轉形生長因子。在一些實施例中，轉形生長因子是轉形生長因子α（TGF-α）或TGF-β。在一些實施例中，生長因子是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。在一些實施例中，生長因子是血管內皮生長因子（VEGF）。 C. 表現控制序列
在一些實施例中，本揭露的核酸分子或載體還包含至少一個表現控制序列。例如，本揭露的分離的核酸分子可以與至少一個表現控制序列可操作地連接。例如，表現控制序列可以是啟動子序列或啟動子-增強子組合。
構成型哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HPRT）、腺苷脫胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子和其他構成型啟動子。在真核細胞中組成性地發揮作用的例示性病毒啟動子包括例如來自以下病毒的啟動子：巨細胞病毒（CMV）、猿猴病毒（例如，SV40）、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）、勞斯肉瘤病毒、巨細胞病毒、莫洛尼白血病病毒的長末端重複（LTR）和其他反轉錄病毒、以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。其他構成型啟動子是一般熟習此項技術者已知的。可用作本揭露的基因表現序列的啟動子還包括誘導型啟動子。誘導型啟動子是在誘導劑的存在下表現。例如，在某些金屬離子的存在下誘導金屬硫蛋白啟動子以促進轉錄和轉譯。其他誘導型啟動子是一般熟習此項技術者已知的。
在一個實施例中，本揭露包括轉基因在組織特異性啟動子和/或增強子控制下的表現。在另一個實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在肝細胞中的表現。在某些實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在肝細胞、竇狀細胞和/或內皮細胞中的表現。在一個特定實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在內皮細胞中的表現。在某些實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在以下中的表現：肌肉細胞、中樞神經系統、眼睛、肝臟、心臟或其任何組合。肝特異性啟動子的例子包括但不限於小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子（mTTR）、天然人因子VIII啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、人白蛋白最小啟動子和小鼠白蛋白啟動子。在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含mTTR啟動子。mTTR啟動子描述於Costa等人 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:4697中。FVIII啟動子描述於Figueiredo和Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838中。在一些實施例中，啟動子選自肝特異性啟動子（例如，α1-抗胰蛋白酶（AAT））、肌肉特異性啟動子（例如，肌肉肌酸激酶（MCK）、肌球蛋白重鏈α（αMHC）、肌紅蛋白（MB）和結蛋白（DES））、合成啟動子（例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK和tMCK）或其任何組合。
在一些實施例中，轉基因表現靶向肝臟。在某些實施例中，轉基因表現靶向肝細胞。在其他實施例中，轉基因表現靶向內皮細胞。在一個特定實施例中，轉基因表現靶向天然表現內源FVIII的任何組織。在一些實施例中，轉基因表現靶向中樞神經系統。在某些實施例中，轉基因表現靶向神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向傳入神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向傳出神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向中間神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向神經膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向星形膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向少突膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向小神經膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向室管膜細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向許旺細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向衛星細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向肌肉組織。在一些實施例中，轉基因表現靶向平滑肌。在一些實施例中，轉基因表現靶向心肌。在一些實施例中，轉基因表現靶向骨骼肌。在一些實施例中，轉基因表現靶向眼睛。在一些實施例中，轉基因表現靶向感光細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向視網膜神經節細胞。
可用於本文公開的核酸分子的其他啟動子包括小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子（mTTR）、天然人FVIII啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、人白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、三重四脯胺酸（TTP）啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒（CMV）啟動子、α1-抗胰蛋白酶（AAT）啟動子、肌肉肌酸激酶（MCK）啟動子、肌球蛋白重鏈α（αMHC）啟動子、肌紅蛋白（MB）啟動子、結蛋白（DES）啟動子、SPc5-12啟動子、2R5Sc5-12啟動子、dMCK啟動子、tMCK啟動子、磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子或人α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子或其任何組合。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含甲狀腺素轉運蛋白（TTR）啟動子。在一些實施例中，啟動子是小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。mTTR啟動子的非限制性例子包括mTTR202啟動子、mTTR202opt啟動子和mTTR482啟動子，如美國公開號US2019/0048362中披露，其通過引用以其整體併入。在一些實施例中，啟動子是肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。在一些實施例中，啟動子是肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子mTTR482。mTTR482啟動子的例子描述於Kyostio-Moore等人 (2016) Mol Ther Methods Clin Dev. 3:16006，和Nambiar B.等人 (2017) Hum Gene Ther Methods, 28(1):23-28中。在一些實施例中，啟動子是包含SEQ ID NO: 16的核酸序列的肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子是人α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子包含SEQ ID NO: 36的核苷酸序列。
可以使用一種或多種增強子元件進一步增強表現水平以實現治療功效。一種或多種增強子可以單獨提供，或與一種或多種啟動子元件一起提供。通常，表現控制序列包含多個增強子元件和組織特異性啟動子。在一個實施例中，增強子包含一個或多個複製的α-1-微球蛋白/雙庫尼茨抑制劑（bikunin）增強子（Rouet等人 (1992) J. Biol. Chem. 267:20765-20773；Rouet等人 (1995), Nucleic Acids Res. 23:395-404；Rouet等人 (1998) Biochem. J. 334:577-584；Ill等人 (1997) Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30）。在一些實施例中，增強子衍生自肝特異性轉錄因子結合位點，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和Enh1，包括HNF1、（有義）-HNF3、（有義）-HNF4、（反義）-HNF1、（反義）-HNF6、（有義）-EBP、（反義）-HNF4（反義）。
在一些實施例中，增強子元件包含一個或兩個修飾的凝血酶原增強子（pPrT2）、一個或兩個α1-微雙庫尼茨抑制劑（microbikunin）增強子（A1MB2）、修飾的小鼠白蛋白增強子（mEalb）、乙型肝炎病毒增強子II（HE11）或CRM8增強子。在一些實施例中，A1MB2增強子是國際申請號PCT/US2019/055917中披露的增強子。在一些實施例中，增強子元件是A1MB2。在一些實施例中，增強子元件包括A1MB2增強子序列的多個複製。在一些實施例中，A1MB2增強子定位於編碼FVIII多肽的核酸序列的5'。在一些實施例中，A1MB2增強子定位於啟動子序列如mTTR啟動子的5'。在一些實施例中，增強子元件是包含SEQ ID NO: 15的核酸序列的A1MB2增強子。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含內含子或內含子序列。在一些實施例中，內含子序列是天然存在的內含子序列。在一些實施例中，內含子序列是合成序列。在一些實施例中，內含子序列衍生自天然存在的內含子序列。在一些實施例中，內含子序列是雜合合成內含子或嵌合內含子。在一些實施例中，內含子序列是嵌合內含子，所述嵌合內含子由雞β-肌動蛋白/兔β-珠蛋白內含子組成並且已經修飾以消除現有五個ATG序列，從而減少假轉譯起始。在一些實施例中，嵌合內含子包含SEQ ID NO: 17的核酸序列。在一些實施例中，內含子序列定位於編碼FVIII多肽的核酸序列的5'。在一些實施例中，嵌合內含子定位於啟動子序列如mTTR啟動子的5'。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含轉錄後調節元件。在某些實施例中，轉錄後調節元件包含突變的土撥鼠肝炎病毒調節元件（WPRE）。WPRE被認為增強病毒載體遞送的轉基因的表現。WPRE的例子描述於Zufferey等人 (1999) J Virol., 73(4):2886-2892；Loeb等人 (1999) Hum Gene Ther. 10(14):2295-2305中。在一些實施例中，WPRE定位於編碼FVIII多肽的核酸序列的3'。在一些實施例中，WPRE包含SEQ ID NO: 18的核酸序列。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含轉錄終止子。在一些實施例中，轉錄終止子是多腺苷酸化（poly(A)）序列。轉錄終止子的非限制性例子包括衍生自牛生長激素多腺苷酸化信號（BGHpA）、猿猴病毒40多腺苷酸化信號（SV40pA）或合成多腺苷酸化信號的那些。在一個實施例中，3'UTR多聚(A)尾包含肌動蛋白多聚(A)位點。在一個實施例中，3'UTR多聚(A)尾包含血紅蛋白多聚(A)位點。在一些實施例中，轉錄終止子是BGHpA。Woychik等人(1984) PNAS 81:3944-3948描述了BGHpA轉錄終止子的例子。在一些實施例中，轉錄終止子定位於對編碼FVIII多肽的核酸序列進行編碼的基因匣的3'端。在一些實施例中，轉錄終止子是包含SEQ ID NO: 19的核酸序列的BGHpA。
在一些實施例中，文中公開的核酸分子包含一個或多個DNA核靶向序列（DTS）。DTS促進含有此類序列的DNA分子易位至核中。在某些實施例中，DTS包含SV40增強子序列。在某些實施例中，DTS包含c-Myc增強子序列。在一些實施例中，核酸分子包含位於第一ITR與第二ITR之間的DTS。在一些實施例中，核酸分子包含位於第一ITR的3'和轉基因（例如FVIII蛋白）的5'的DTS。在一些實施例中，核酸分子包含位於核酸分子上轉基因3'和第二ITR 5'的DTS。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含toll樣受體9（TLR9）抑制序列。例示性TLR9抑制序列描述於例如Trieu等人 (2006) Crit Rev Immunol. 26(6):527-44；Ashman等人 Int’l Immunology 23(3): 203-14中。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含編碼HBoV1的非結構蛋白的核酸序列。“非結構蛋白”是指由HBoV1表現的六種蛋白即NS1、NS1-70、NS2、NS3、NS4和NP1中的任一種。非結構蛋白由mRNA轉錄物表現，所述mRNA轉錄物通過單個病毒前體mRNA的選擇性剪接和多腺苷酸化產生。NS1至NS4蛋白被編碼於相同開放閱讀框（ORF）的不同區域中。NS1結合HBoV1複製起點，並且推測在旋轉髮夾複製（rolling-hairpin replication）過程中對起點的單股DNA（ssDNA）產生切口。NS1在真核細胞中HBoV1 ITR介導的載體生產的表現中起重要作用。在一個實施例中，產生表現HBoV1 NS1的表現構築體。在一些實施例中，本文公開的核酸分子編碼Shen等人 (2015) J Virology 89(19): 10097-10109中描述的非結構蛋白。
在一些實施例中，核酸分子包含微小RNA（miRNA）結合位點。在一個實施例中，miRNA結合位點是miR-142-3p的miRNA結合位點。在其他實施例中，miRNA結合位點是Rennie等人 (2016) RNA Biol. 13(6):554-560描述的miRNA結合位點。 桿狀病毒中 ceDNA 的產生
桿狀病毒是最突出的感染昆蟲的病毒。已鑒定出超過500種桿狀病毒分離株，其中大部分源自鱗翅目（ Lepidoptera）的昆蟲。兩種最常見的分離株是苜蓿銀紋夜蛾（ Autographa californica）多核多角體病毒（AcMNPV）和家蠶（ Bombyx mori）核多角體病毒（BmNPV）。在表現載體中，桿狀病毒因其超大的基因載荷容量（高達幾十kb，有一些報導為高達100 kb）而脫穎而出。這種轉基因容量已經用於產生重組AAV載體（高達38 kb表現匣）。然而，在生產用於基因療法的病毒或非病毒載體時，通常需要將幾種桿狀病毒表現載體感染到昆蟲宿主細胞中。每種桿狀病毒表現載體的產生是耗時的，並且增加了生產成本，這代表了大多數桿狀病毒表現載體系統的顯著缺點。然而，產生了一種新的多功能桿狀病毒穿梭載體（桿粒），其被專門設計用於容納多個轉基因（其可使用現有桿粒工具實現）。這種多功能桿粒（稱為“BIVVBac”）還可用於體內基因療法的rAAV載體產生，以及任何所需蛋白質（例如重組蛋白質）的產生。該桿粒表現系統進一步描述於美國專利申請號63/069,073中，將其通過引用以其整體特此併入。
在某些實施例中，使用包含“BIVVBac”重組桿粒的桿狀病毒表現載體系統產生所公開的核酸分子。在某些實施例中，BIVVBac是經基因修飾的AcMNPV，其包含至少兩個外來序列插入位點。包含含有至少兩個外來序列插入位點的桿粒的桿狀病毒表現載體系統允許減少需要產生的桿狀病毒表現載體的總數。
在某些實施例中，BIVVBac包含第一外來序列插入位點和第二外來序列插入位點。第一外來序列插入位點和第二外來序列插入位點可以是不同的，從而利用不同的機制來驅動外來序列（例如，異源序列、異源基因）的插入。外來序列的插入可以由本領域已知的任何方法驅動。例如，可以通過轉位或位點特異性重組來插入外來序列。可以將外來序列插入位點設計為包含在報導基因內，使得在插入外來序列後，報導基因被破壞。報吿基因的破壞可有助於鑒定其中插入了外來序列的桿粒選殖。在此類實施例中，將外來序列插入位點與報導基因框內融合，或者將報導基因與外來序列插入位點框內融合。
在某些實施例中，第一外來序列插入位點允許經由轉位插入外來序列。在某些實施例中，第一外來序列插入位點包含用於插入轉位子的優先靶位點。在某些實施例中，第一外來序列插入位點是用於插入轉位子的優先靶位點。在某些實施例中，第一外來序列插入位點是作為細菌轉位子的附著位點的優先靶位點。合適的細菌轉位子及其相應的附著位點是熟習此項技術者已知的。例如，轉位子Tn7以其高頻率轉位到細菌染色體的特定位點（attTn7）的能力而聞名。因此，在某些實施例中，第一外來序列插入位點是作為Tn7轉位子的附著位點的優先靶位點（例如，attTn7）。在一些實施例中，第一外來序列插入位點是作為mini-Tn7轉位子的附著位點的優先靶位點（例如，mini-attTn7，即Tn7轉位因子識別和插入Tn7轉位子所需的最小DNA序列）。
在某些實施例中，第二外來序列插入位點允許經由位點特異性重組插入外來序列。在某些實施例中，第二外來序列插入位點包含能夠介導位點特異性重組事件的優先靶位點。各種位點特異性重組酶技術是熟習此項技術者已知的。例如，Cre-loxP系統經由Cre重組酶介導位點特異性重組，所述Cre重組酶能夠識別稱為loxP位點的34個鹼基對的DNA序列。因此，第二外來序列插入位點是用於Cre介導的重組的優先靶位點。在某些實施例中，第二外來序列插入位點是包含能夠被Cre重組酶識別的loxP位點或其變體的優先靶位點。
在一些實施例中，重組桿粒包含變體VP80基因，使得桿粒展現出其編碼的蛋白質的降低的表現。例如，本文公開了包含由於VP80基因座中的插入和/或缺失而失活的VP80基因的桿狀病毒DNA骨架。在一些實施例中，重組桿粒包含美國專利申請號US 63/069,115中披露的桿粒。
在某些實施例中，使用單個桿狀病毒表現載體產生ceDNA。在這種“單BAC”方法中，單一桿狀病毒表現載體（例如，BIVVBac）編碼在桿狀病毒系統中產生ceDNA所需的所有必需元件，並且有可能在任何桿狀病毒容許性細胞株中用於產生ceDNA。這種方法描繪於 圖 1A中。
在某些實施例中，使用多種桿狀病毒表現載體產生ceDNA。在這種“雙BAC”方法中，將ceDNA產生所需的必需元件插入到兩種不同的桿狀病毒（例如，兩種BIVVBac桿粒）中，並且有可能用於在容許桿狀病毒感染的任何細胞株中進行共感染。這種方法描繪於 圖 1B中。
在某些實施例中，通過穩定細胞株產生ceDNA。在這種方法中，將產生ceDNA所需的必需元件插入在桿狀病毒系統的兩個組分中。該方法描繪於 圖 1C中。穩定細胞株可以通過以下方式來產生：在桿狀病毒基因啟動子（例如，桿狀病毒構成型基因啟動子）的控制下穩定地整合蛋白質編碼序列。在某些實施例中，穩定細胞株是穩定的昆蟲細胞株。
用於將核酸穩定地整合到多種宿主細胞株中的方法在本領域中是已知的。例如，重複選擇（例如，通過使用選擇性標記）可以用於選擇已整合含有選擇性標記（和AAV cap和rep基因和/或rAAV基因體）的核酸的細胞。在其他實施例中，核酸能以位點特異性方式整合到細胞株中以產生生產細胞株。若干種位點特異性重組系統是本領域已知的，如FLP/FRT（參見例如O'Gorman, S.等人 (1991) Science251:1351-1355）、Cre/loxP（參見例如Sauer, B.和Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.85:5166-5170）以及phi C31-att（參見例如Groth, A. C.等人 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci.97:5995-6000）。
本揭露還提供了由本揭露的核酸分子編碼的多肽。在一些實施例中，本揭露的多肽由包含本文公開的分離的核酸分子的載體編碼。在又其他實施例中，本揭露的多肽由包含本文公開的分離的核酸分子的宿主細胞產生。 宿主細胞
本揭露還提供了一種包含本揭露的核酸分子或載體的宿主細胞。如本文所用，術語“轉形”應在廣義上使用，是指將DNA引入受體宿主細胞中，這改變了基因型並因此導致受體細胞的變化。
“宿主細胞”是指已經用使用重組DNA技術構築並且編碼至少一種異源基因的載體轉形的細胞。本揭露的宿主細胞優選地具有哺乳動物來源；最優選地具有人或小鼠來源。相信熟習此項技術者有能力優先地確定最適合於其目的的特定宿主細胞株。例示性宿主細胞株包括但不限於CHO、DG44和DUXB11（中國倉鼠卵巢系，DHFR-）、HELA（人宮頸癌）、CVI（猴腎系）、COS（具有SV40 T抗原的CVI的衍生物）、R1610（中國倉鼠成纖維細胞）、BALBC/3T3（小鼠成纖維細胞）、HAK（倉鼠腎系）、SP2/O（小鼠骨髓瘤）、P3x63-Ag8.653（小鼠骨髓瘤）、BFA-1c1BPT（牛內皮細胞）、RAJI（人淋巴細胞）、PER.C6 ®、NS0、CAP、BHK21和HEK 293（人腎）。在一個特定實施例中，宿主細胞選自：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6 ®細胞、NS0細胞、CAP細胞及其任何組合。在一些實施例中，本揭露的宿主細胞具有昆蟲來源。在一個特定實施例中，宿主細胞是SF9細胞。宿主細胞株典型地可從商業服務、美國組織培養物保藏中心（American Tissue Culture Collection）或公開的文獻中獲得。
將本揭露的核酸分子或載體引入宿主細胞中可以通過熟習此項技術者熟知的多種技術來完成。這些技術包括但不限於轉染（包括電泳和電穿孔）、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、與包膜DNA的細胞融合、顯微注射和完整病毒感染。參見Ridgway, A. A. G. " Mammalian Expression Vectors" 第24.2章, 第470-472頁 Vectors, Rodriguez和Denhardt編(Butterworths, Boston, Mass. 1988)。最優選地，通過電穿孔將質體引入宿主中。使轉形的細胞在適合於產生輕鏈和重鏈的條件下生長，並且測定重鏈和/或輕鏈蛋白質合成。例示性測定技術包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）或螢光啟動細胞分選儀分析（FACS）、免疫組織化學等。
使包含本揭露的分離的核酸分子或載體的宿主細胞在適當生長培養基中生長。如本文所用，術語“適當生長培養基”是指含有細胞生長所需的營養物的培養基。細胞生長所需的營養素可以包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素、礦物質和生長因子。任選地，培養基可以含有一種或多種選擇因子。任選地，培養基可以含有小牛血清或胎牛血清（FCS）。在一個實施例中，培養基基本上不含IgG。生長培養基通常將例如通過藥物選擇或必需營養素的缺乏來選擇含有DNA構築體的細胞，所述營養素通過DNA構築體上或與DNA構築體共轉染的選擇性標記來補充。所培養的哺乳動物細胞通常在市售的含血清或無血清培養基（例如，MEM、DMEM、DMEM/F12）中生長。在一個實施例中，培養基是CDoptiCHO（Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德）。在另一個實施例中，培養基是CD17（Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德）。適合於所用特定細胞株的培養基的選擇在一般熟習此項技術者的水平內。
本揭露的多個方面提供了一種選殖本文所述的核酸分子的方法，所述方法包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，並且將所得載體引入合適的細菌宿主菌株中。如本領域中已知，核酸的複雜二級結構（例如，長回文區）可能不穩定並且難以在細菌宿主菌株中選殖。例如，本揭露的包含第一ITR和第二ITR（例如，非AAV細小病毒ITR，例如HBoV1 ITR）的核酸分子可能難以使用常規方法來選殖。長DNA回文序列抑制DNA複製並且在大腸桿菌（ E. coli）、芽孢桿菌屬（ Bacillus）、鏈球菌屬（ Streptococcus）、鏈黴菌屬（ Streptomyces）、釀酒酵母（ S. cerevisiae） 、小鼠和人的基因體中不穩定。這些效應是由於通過股內鹼基配對形成髮夾或十字形結構所致。在大腸桿菌中，在SbcC或SbcD突變體中可以顯著克服對DNA複製的抑制。SbcD是核酸酶亞基，並且SbcC是SbcCD複合物的ATP酶亞基。大腸桿菌SbcCD複合物是負責防止長回文序列複製的外切核酸酶複合物。SbcCD複合物是具有ATP依賴性雙股DNA外切核酸酶活性和ATP非依賴性單股DNA內切核酸酶活性的核複合物。SbcCD可以識別DNA回文序列並通過攻擊所產生的髮夾結構來瓦解複製叉。
在某些實施例中，合適的細菌宿主菌株不能拆分十字形DNA結構。在某些實施例中，合適的細菌宿主菌株包含SbcCD複合物中的破壞。在一些實施例中，SbcCD複合物中的破壞包含SbcC基因和/或SbcD基因中的基因破壞。在某些實施例中，SbcCD複合物中的破壞包含SbcC基因中的基因破壞。包含SbcC基因中的基因破壞的各種細菌宿主菌株是本領域中已知的。例如而不限於，細菌宿主菌株PMC103包含基因型 sbcC 、 recD 、 mcrA 、 ΔmcrBCF；細菌宿主菌株PMC107包含基因型 recBC 、 recJ 、 sbcBC 、 mcrA 、 ΔmcrBCF；並且細菌宿主菌株SURE包含基因型 recB 、 recJ 、 sbcC 、 mcrA 、 ΔmcrBCF 、 umuC 、 uvrC。因此，在一些實施例中，選殖本文所述的核酸分子的方法包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，並且將所得載體引入宿主菌株PMC103、PMC107或SURE中。在某些實施例中，選殖本文所述的核酸分子的方法包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，並且將所得載體引入宿主菌株PMC103中。
合適的載體是本領域已知的。在某些實施例中，用於本揭露的選殖方法中的合適的載體是低複製載體。在某些實施例中，用於本揭露的選殖方法中的合適的載體是pBR322。
因此，本揭露提供了選殖核酸分子的方法，其包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，和將所得載體引入包含SbcCD複合物中的破壞的細菌宿主菌株中，其中核酸分子包含第一反向末端重複序列（ITR）和第二ITR，其中第一ITR和/或第二ITR包含與SEQ ID NO. 1或2中所示的核苷酸序列至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%相同的核苷酸序列或其功能衍生物。 FVIII 多肽的產生
本揭露還提供了由本揭露的核酸分子編碼的多肽。在一些實施例中，本揭露的多肽由包含本文公開的分離的核酸分子的載體編碼。在又其他實施例中，本揭露的多肽由包含本揭露的分離的核酸分子的宿主細胞產生。
多種方法可用於從本揭露的優化的核酸分子重組產生FVIII蛋白。所需序列的多核苷酸可通過從頭固相DNA合成或通過PCR誘變早期製備的多核苷酸來產生。寡核苷酸介導的誘變是製備核苷酸序列中的取代、插入、缺失或改變（例如，改變密碼子）的一種方法。例如，通過將編碼所需突變的寡核苷酸與單股DNA模板雜交來改變起始DNA。雜交後，DNA聚合酶用於合成整合了寡核苷酸引子的模板的完整第二互補股。在一個實施例中，基因工程例如基於引子的PCR誘變足以摻入本文所定義的改變以產生本揭露的多核苷酸。
對於重組蛋白生產，將本揭露的編碼FVIII蛋白的優化的多核苷酸序列插入適當的表現媒劑中，即含有所插入編碼序列的轉錄和轉譯所必需的元件的載體，或在RNA病毒載體的情況下為含有複製和轉譯所必需的元件的載體。
將本揭露的多核苷酸序列插入載體的適當閱讀框中。然後將表現載體轉染到將表現多肽的合適靶細胞中。本領域已知的轉染技術包括但不限於磷酸鈣沈澱（Wigler等人 1978, Cell14 : 725）和電穿孔（Neumann等人 1982, EMBO, J.1 : 841）。多種宿主表現載體系統可用於在真核細胞中表現本文所述的FVIII蛋白。在一個實施例中，真核細胞是動物細胞，包括哺乳動物細胞（例如，HEK293細胞、PER.C6 ®、CHO、BHK、Cos、HeLa細胞）。本揭露的多核苷酸序列還可編碼允許FVIII蛋白分泌的信號序列。熟習此項技術者將理解，當FVIII蛋白被轉譯時，信號序列被細胞裂解以形成成熟蛋白。本領域已知各種信號序列，例如天然因子VII信號序列、天然因子IX信號序列和小鼠IgK輕鏈信號序列。可替代地，當不包括信號序列時，可通過裂解細胞回收FVIII蛋白。
本揭露的FVIII蛋白可以在轉基因動物（如齧齒類動物、山羊、綿羊、豬或牛）體內合成。術語“轉基因動物”是指已經將外來基因摻入基因體中的非人動物。因為這個基因是在種系組織中存在，其從親代傳遞給後代。將外源基因引入單細胞胚胎中（Brinster等人 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4438）。產生轉基因動物的方法是本領域已知的，包括產生免疫球蛋白分子的轉基因（Wagner等人 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376；McKnight等人 1983, Cell 34 : 335；Brinster等人 1983, Nature 306: 332；Ritchie等人 1984, Nature 312: 517；Baldassarre等人 2003, Theriogenology 59 : 831；Robl等人 2003, Theriogenology 59: 107；Malassagne等人 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267）。
表現載體可以編碼允許容易純化或鑒定重組產生的蛋白質的標籤。例子包括但不限於載體pUR278（Ruther等人 1983, EMBO J. 2: 1791），其中本文所述的FVIII蛋白編碼序列可以與lac Z編碼區同框連接到載體中，從而產生雜合蛋白；pGEX載體可用於表現具有谷胱甘肽S-轉移酶（GST）標籤的蛋白質。這些蛋白質通常是可溶的，並且可以通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，隨後在游離谷胱甘肽的存在下洗脫而容易地從細胞中純化。載體包括切割位點（例如，PreCission Protease（Pharmacia，新澤西州皮派克）），以便在純化後容易除去標籤。
出於本揭露的目的，可以使用許多表現載體系統。這些表現載體典型地可作為附加體或作為宿主染色體DNA的組成部分在宿主生物中複製。表現載體可包括表現控制序列，包括但不限於啟動子（例如天然關聯的或異源啟動子）、增強子、信號序列、剪接信號、增強子元件和轉錄終止序列。優選地，表現控制序列是能夠轉形或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統。表現載體還可以利用衍生自動物病毒的DNA元件，所述動物病毒如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒（RSV、MMTV或MOMLV）、巨細胞病毒（CMV）或SV40病毒。其他涉及具有內部核糖體結合位點的多順反子系統的使用。
一般來說，表現載體含有選擇標記（例如胺苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性或新黴素抗性）以允許檢測用所需DNA序列轉形的那些細胞（參見例如，Itakura等人, 美國專利4,704,362）。可以通過引入一種或多種標記來選擇已將DNA整合至其染色體中的細胞，所述一種或多種標記允許選擇經轉染的宿主細胞。所述標記可以提供對營養缺陷型宿主的原營養、殺生物劑抗性（例如抗生素）或對重金屬如銅的抗性。選擇性標記基因可以直接與待表現的DNA序列連接，或通過共轉形引入同一細胞中。
可用於表現優化的FVIII序列的載體的例子是NEOSPLA（美國專利號6,159,730）。此載體含有巨細胞病毒啟動子/增強子、小鼠β珠蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素多腺苷酸化序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1和外顯子2、二氫葉酸還原酶基因和前導序列。已發現此載體在摻入可變區和恒定區基因、細胞中轉染、隨後在含有G418的培養基中選擇和甲胺蝶呤擴增後，會導致非常高水平的抗體表現。在美國專利號5,736,137和5,658,570中也教示載體系統，這些文獻各自通過引用以其整體併入本文。此系統提供高表現水平，例如＞ 30 pg/細胞/天。其他例示性載體系統披露於例如美國專利號6,413,777中。
在其他實施例中，可使用多順反子構築體表現本揭露的多肽。在這些表現系統中，可以從單個多順反子構築體產生多個目的基因產物，如多聚體結合蛋白的多個多肽。這些系統有利地使用內部核糖體進入位點（IRES）以在真核宿主細胞中提供相對較高水平的多肽。在美國專利號6,193,980中披露了相容的IRES序列，該專利也併入本文。
更一般地，一旦製備了編碼多肽的載體或DNA序列，就可以將表現載體引入適當的宿主細胞中。也就是說，所述宿主細胞可被轉形。如上所述，可以通過熟習此項技術者熟知的各種技術來實現將質體引入宿主細胞中。轉形的細胞在適於產生FVIII多肽的條件下生長，並進行FVIII多肽合成測定。例示性測定技術包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）或螢光啟動細胞分選儀分析（FACS）、免疫組織化學等。
在描述用於從重組宿主分離多肽的過程時，術語“細胞”和“細胞培養物”可互換使用以表示多肽來源，除非另有明確說明。換言之，從“細胞”中回收多肽可以意指從離心沈澱的全細胞，或從含有培養基和懸浮細胞二者的細胞培養物中回收。
用於蛋白質表現的宿主細胞株優選是哺乳動物來源的；最優選是人或小鼠來源的，因為本揭露的分離的核酸已被優化用於在人細胞中表現。上文已經描述了例示性宿主細胞株。在產生具有FVIII活性的多肽的方法的一個實施例中，所述宿主細胞是HEK293細胞。在產生具有FVIII活性的多肽的方法的另一個實施例中，所述宿主細胞是CHO細胞。
編碼本揭露的多肽的基因也可以在非哺乳動物細胞（如細菌或酵母或植物細胞）中表現。在這一方面，應當理解，也可以轉形多種單細胞非哺乳動物微生物如細菌；即那些能夠在培養或發酵中生長的那些微生物。易於轉形的細菌包括以下的成員：腸桿菌科，如大腸桿菌（Escherichia coli）或沙門氏菌屬（Salmonella）的菌株；芽孢桿菌科，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；肺炎球菌屬（Pneumococcus）；鏈球菌屬（Streptococcus）和流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）。還應理解，當在細菌中表現時，多肽典型地會成為內含體的一部分。必須分離、純化多肽，然後將其組裝成功能性分子。
可替代地，可將本揭露的優化的核苷酸序列摻入轉基因中以引入轉基因動物的基因體中並隨後在轉基因動物的乳汁中表現（參見，例如Deboer等人, US 5,741,957，Rosen, US 5,304,489，和Meade等人, US 5,849,992）。合適的轉基因包括與來自乳腺特異性基因的啟動子和增強子可操作連接的多肽的編碼序列（如酪蛋白或β乳球蛋白）。
體外生產允許按比例放大以得到大量的所希望的多肽。在組織培養條件下用於哺乳動物細胞培養的技術是本領域已知的並且包括同質懸浮培養（例如在氣升式反應器或連續攪拌反應器中），或在瓊脂糖上微珠或陶瓷盒上的固定化或包埋的細胞培養（例如在中空纖維、微膠囊中）。如果必要和/或需要，可以通過常規層析方法純化多肽溶液，例如凝膠過濾，離子交換層析，DEAE-纖維素層析或（免疫）親和層析，例如，在合成鉸鏈區多肽的優選生物合成後或在本文所述的HIC層析步驟之前或之後。親和標籤序列（例如His(6)標籤）可任選地附接或包含在多肽序列內以促進下游純化。
一旦表現後，所述FVIII蛋白可以根據本領域的標準程式純化，包括硫酸銨沈澱、親和柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等（一般參見Scopes，Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982))）。對於藥物用途，至少約90%至95%均一性的基本上純的蛋白質是優選的，98%至99%或更高均一性是最優選的。 醫藥組合物
含有本揭露的分離的核酸分子、核酸分子編碼的具有FVIII活性的多肽、載體或宿主細胞的組合物可以含有合適的醫藥上可接受的載劑。例如，所述組合物可以含有有助於將活性化合物加工成設計用於遞送至作用位點的製劑的賦形劑和/或助劑。
醫藥組合物可以被配製用於通過推注注射的腸胃外投予（即靜脈內、皮下或肌內）。注射用配製品能以單位劑型存在，例如在添加有防腐劑的安瓿中或多劑量容器中。組合物可以採取諸如於油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液等形式，並且含有諸如助懸劑、穩定劑和/或分散劑等配製劑。可替代地，活性成分可以呈粉末形式，用於用合適的媒劑（例如，無熱原水）來構造。
適合於腸胃外投予的配製品還包括呈水溶性形式（例如，水溶性鹽）的活性化合物的水溶液。另外，可以投予作為適當油性注射懸浮液的活性化合物的懸浮液。合適的親脂溶劑或媒劑包括脂肪油（例如，芝麻油）或合成脂肪酸酯（例如，油酸乙酯或甘油三酯）。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。任選地，懸浮液還可以含有穩定劑。脂質體還可以用於包封本揭露的分子，用於遞送至細胞或間質空間中。例示性醫藥上可接受的載劑是生理上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些實施例中，組合物包含等滲劑，例如糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇）或氯化鈉。在其他實施例中，組合物包含增強活性成分的貯存期限或有效性的醫藥上可接受的物質（如潤濕劑）或少量輔助物質（如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液）。
本揭露的組合物可以呈多種形式，包括例如液體（例如，可注射和可輸注的溶液）、分散液、懸浮液、半固體和固體劑型。優選形式取決於投予方式和治療應用。
組合物可以配製為溶液、微乳液、分散液、脂質體或其他適合於高藥物濃度的有序結構。無菌可注射溶液可以通過以下方式製備：將活性成分以所需量摻入視需要具有上文所列舉成分中的一種或組合的適當溶劑中，之後過濾滅菌。通常，分散液是通過以下方式來製備：將活性成分摻入無菌媒劑中，所述無菌媒劑含有基礎分散介質和來自上文所列舉的那些成分的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，這些方法從先前無菌過濾的溶液產生活性成分和任何其他所需成分的粉末。可以例如通過以下方式維持溶液的適當流動性：通過使用諸如卵磷脂等包衣，在分散液的情況下通過維持所需顆粒尺寸，以及通過使用表面活性劑。可注射組合物的延長吸收可以通過以下方式來實現：在組合物中包括延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽和明膠。
活性成分可以用受控釋放配製品或裝置來配製。此類配製品和裝置的例子包括植入物、經皮貼劑和微囊化遞送系統。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。製備此類配製品和裝置的方法是本領域已知的。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., 紐約, 1978。
可注射長效配製品可以通過以下方式來製備：形成藥物於生物可降解聚合物（如聚丙交酯-聚乙交酯）中的微囊化基質。根據藥物與聚合物的比率以及所採用聚合物的性質，可以控制藥物釋放速率。其他例示性生物可降解聚合物是聚原酸酯和聚酐。可注射長效配製品還可以通過將藥物捕集於脂質體或微乳液中來製備。
可以將補充性活性化合物摻入組合物中。在一個實施例中，用另一凝血因子或其變體、片段、類似物或衍生物配製本揭露的嵌合蛋白。例如，凝血因子包括但不限於因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纖維蛋白原、血管性血友病因子或重組可溶性組織因子（rsTF）或前述任一種的啟動形式。凝血因子或止血劑還可以包括抗纖維蛋白溶解藥，例如ε-胺基己酸、胺甲環酸。
可以調節劑量方案以提供最佳所需反應。例如，可以投予單次推注，可以隨時間投予若干次分開劑量，或者可以如治療情況的緊迫性所示的成比例地減少或增加劑量。有利的是以劑量單位形式配製腸胃外組合物，以便於投予和劑量均勻。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 賓夕法尼亞州伊斯頓 1980)。
除了活性化合物以外，液體劑型還可以含有惰性成分，如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯。
合適的醫藥載劑的非限制性例子也描述於E. W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑的一些例子包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。組合物還可以含有pH緩衝試劑以及潤濕劑或乳化劑。
對於口服投予，醫藥組合物可以採取通過常規手段製備的片劑或膠囊的形式。還可以將組合物製備為液體，例如糖漿或懸浮液。液體可以包括助懸劑（例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪）、乳化劑（卵磷脂或阿拉伯膠）、非水性媒劑（例如，扁桃仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油）和防腐劑（例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸）。製劑還可以包括調味劑、著色劑和甜味劑。可替代地，組合物可以作為乾產品存在，用於用水或另一種合適的媒劑來構造。
對於經頰投予，組合物可以採取根據常規方案的片劑或錠劑的形式。
對於通過吸入投予，根據本揭露使用的化合物便捷地以含有或不含賦形劑的霧化氣溶膠的形式或以氣溶膠噴霧劑的形式從任選地具有推進劑的加壓包或霧化器遞送，所述推進劑是例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供遞送計量的閥來確定。例如用於吸入器或吹入器中的明膠的膠囊和藥筒可以配製含有化合物與諸如乳糖或澱粉等合適的粉末基質的粉末混合物。
醫藥組合物還可以被配製用於作為例如含有常規栓劑基質（如可哥脂或其他甘油酯）的栓劑或保留灌腸劑經直腸投予。
在一個實施例中，醫藥組合物包含具有因子VIII活性的多肽、編碼所述具有因子VIII活性的多肽的經優化的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或包含所述載體的宿主細胞和醫藥上可接受的載劑。在一些實施例中，組合物是通過選自以下的途徑來投予：局部投予、眼內投予、腸胃外投予、鞘內投予、硬膜下投予和口服投予。腸胃外投予可以是靜脈內或皮下投予。 治療方法
在一些方面中，本揭露涉及治療有需要的個體的疾病或病症的方法，其包括投予本文所公開的核酸分子、載體、多肽或醫藥組合物。
在一些實施例中，本揭露涉及治療出血障礙的方法。在一些實施例中，本揭露涉及治療血友病A的方法。
分離的核酸分子、載體或多肽可以用以下方式投予：靜脈內、皮下、肌內或通過任何粘膜表面，例如口服、舌下、經頰、舌下、經鼻、經直腸、經陰道或通過經肺途徑。可以將凝血因子蛋白植入或連接生物聚合物固相支持物內，從而允許將嵌合蛋白緩慢釋放至所需部位。
在一個實施例中，分離的核酸分子、載體或多肽的投予途徑是腸胃外的。如本文所用的術語腸胃外包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或陰道投予。在一些實施例中，將分離的核酸分子、載體或多肽靜脈內投予。雖然所有這些投予形式都明確地考慮在本揭露的範圍內，但是投予形式可以是注射用溶液，特別是用於靜脈內或動脈內注射或滴注。
用於治療病症的本揭露的組合物的有效劑量根據許多不同因素而變化，所述因素包括投予方式、靶位點、患者的生理狀態、患者是人還是動物、投予的其他藥物以及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者是人，但是也可以治療非人哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。治療劑量可以使用熟習此項技術者已知的常規方法逐步調整，以優化安全性和功效。
本揭露的核酸分子、載體或多肽可以任選地與在需要治療（例如，預防性或治療性）的障礙或病症的治療中有效的其他藥劑組合投予。
如本文所用，與輔助療法結合或組合的本揭露的分離的核酸分子、載體或多肽的投予意指依序、同時、同延、並行、伴隨或同期投予或施用所述療法和所公開的多肽。熟習此項技術者將理解，可以定時投予或施加組合的治療性方案的各種組分以增強治療的總體有效性。基於所選輔助療法和本說明書的教示內容，技術人員（例如，醫師）在不進行過度實驗的情況下便能夠容易地辨別有效的組合治療方案。
應進一步瞭解，本揭露的分離的核酸分子、載體或多肽可以與一種或多種藥劑結合或組合使用（例如，以提供組合治療方案）。可以與本揭露的多肽或多核苷酸組合的例示性藥劑包括代表用於所治療的特定障礙的當前護理標準的藥劑。此類藥劑在本質上可以是化學的或生物的。術語“生物劑（biologic）”或“生物劑（biologic agent）”是指預期用作治療劑的從活的生物體和/或其產物製備的任何醫藥活性劑。
要與本揭露的多核苷酸或多肽組合使用的藥劑的量可以隨個體變化，或者可以根據本領域的知識來投予。參見例如，Bruce A Chabner等人, Antineoplastic Agents,Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287（Joel G. Hardman等人編, 第9版 1996）。在另一個實施例中，投予符合護理標準的量的這種藥劑。
在一個實施例中，本文還公開了一種套組，所述套組包含本文公開的核酸分子以及向有需要的個體投予所述核酸分子的說明書。在另一個實施例中，本文公開了一種用於產生本文所提供的核酸分子的桿狀病毒系統。所述核酸分子是在昆蟲細胞中產生。在另一個實施例中，提供了一種針對表現構築體的奈米顆粒遞送系統。表現構築體包含本文公開的核酸分子。 基因療法
在一些實施例中，本文公開的核酸分子用於基因療法。本文公開的優化的FVIII核酸分子可用於需要表現FVIII的任何情境。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
例如，已經探索出體基因療法作為血友病A的可能治療。基因療法是血友病的特別有吸引力的治療，因為其可能在載體的單次投予後通過連續內源性產生FVIII來治癒疾病。血友病A非常適合於基因替代方法，因為其臨床表現可完全歸因於缺少以微小量（200 ng/ml）在血漿中迴圈的單一基因產物（FVIII）。
在一態樣，本文所述的核酸分子可用於AAV基因療法。AAV能夠感染許多哺乳動物細胞。參見例如，Tratschin等人 (1985) Mol. Cell Biol. 5:3251-3260和Grimm等人 (1999) Hum. Gene Ther. 10:2445-2450。rAAV載體攜帶編碼目的基因或其片段的核酸序列，其處於指導基因產物在細胞中表現的調節序列的控制下。在一些實施例中，將rAAV與載劑和適於投予的其他組分一起配製。
在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於慢病毒基因療法。慢病毒是RNA病毒，其中病毒基因體是RNA。當宿主細胞被慢病毒感染時，基因體RNA被反轉錄成DNA中間體，所述中間體被非常有效地整合到所感染細胞的染色體DNA中。在一些實施例中，將慢病毒與載劑和適於投予的其他組分一起配製。在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於腺病毒療法。腺病毒用於基因療法的綜述可參見例如Wold等人 (2013) Curr Gene Ther. 13(6):421-33)。在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於非病毒基因療法。本揭露的優化的FVIII蛋白可以在哺乳動物（例如，人患者）體內產生，使用基因治療方法對於選自以下的出血疾病或障礙的治療將是治療上有益的：出血凝結障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸腔內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血和髂腰肌鞘出血。在一個實施例中，出血疾病或障礙是血友病。在另一個實施例中，所述出血性疾病或障礙是血友病A。這涉及投予與合適的表現控制序列可操作地連接的經優化的FVIII編碼核酸。在某些實施例中，這些序列被摻入病毒載體中。用於此類基因療法的合適病毒載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、EB病毒載體、乳多空病毒載體、痘苗病毒載體、單純皰疹病毒載體和腺相關病毒（AAV）載體。所述病毒載體可以是複製缺陷型病毒載體。在其他實施例中，腺病毒載體在其E1基因或E3基因中有缺失。在其他實施例中，所述序列被摻入熟習此項技術者已知的非病毒載體中。
在另一態樣，本文公開的核酸分子用於特異性改變活生物體的遺傳信息（例如基因體）。如本文所用，術語“改變”或“遺傳信息的改變”是指細胞基因體的任何改變。在治療遺傳障礙的上下文中，改變可包括但不限於插入、缺失和/或校正。
在一些方面，改變還可以包括基因嵌入、剔除或減弱。如本文所用，術語“嵌入”是指將DNA序列或其片段添加到基因體中。這種待嵌入的DNA序列可以包括一個或多個完整的基因，可以包括與前述的基因或任何部分或片段關聯的調節序列。例如，可以將編碼野生型蛋白質的cDNA插入攜帶突變基因的細胞的基因體中。嵌入策略不需要替換全部或部分缺陷基因。在一些情況下，嵌入策略可進一步涉及用所提供的序列取代現有序列，例如用野生型複製取代突變等位基因。術語“剔除”是指消除基因或基因的表現。例如，可以通過缺失或添加核苷酸序列從而導致閱讀框破壞來剔除基因。作為另一個例子，可以通過用不相關序列替代基因的一部分來剔除基因。如本文所用的術語“減弱”是指減少基因或其一種或多種基因產物的表現。作為基因減弱的結果，可以減弱蛋白質活性或功能，或者可以降低或消除蛋白質水平。
在一些實施例中，本文公開的核酸序列用於基因體編輯。基因體編輯通常是指優選以精確或預先確定的方式修飾基因體的核苷酸序列的過程。本文所述的基因體編輯方法的例子包括使用定點核酸酶在基因體中的精確靶位置切割去氧核糖核酸（DNA），從而在基因體中的特定位置產生單股或雙股DNA斷裂的方法。如Cox等人 (2015). Nature Medicine 21(2): 121-31中最近所綜述的，這樣的斷裂可以並定期地通過天然的內源性細胞過程如同源定向修復（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）來修復。這兩個主要的DNA修復過程由一系列替代途徑組成。NHEJ直接連接由雙股斷裂導致的DNA末端，有時會丟失或添加核苷酸序列，這可能會破壞或增強基因表現。HDR利用同源序列或供體序列作為模板，用於在斷裂點插入限定的DNA序列。同源序列可以在內源性基因體中，如姐妹染色單體。可替代地，供體可以是外源核酸，如質體、單股寡核苷酸、雙股寡核苷酸、雙股體寡核苷酸或病毒，其具有與核酸酶切割的基因座高度同源的區域，但還可以含有額外的序列或序列變化，包括可以摻入切割的靶基因座中的缺失。第三種修復機制可以是微同源介導的末端連接（MMEJ），也稱為“替代NHEJ”，其中遺傳結局與NHEJ類似，因為在切割位點可發生小的缺失和插入。MMEJ可以利用DNA斷裂位點兩側的幾個鹼基對的同源序列來驅動更有利的DNA末端連接修復結局，並且最近的報導進一步闡明了該過程的分子機制，參見例如Cho和Greenberg (2015). Nature 518, 174-76。在一些情況下，可以基於對DNA斷裂位點處的潛在微同源性的分析來預測可能的修復結局。
這些基因體編輯機制中的每一種都可用於產生所需的基因體改變。基因體編輯過程中的一個步驟可以是在預期突變位點附近的靶基因座中產生一個或兩個DNA斷裂，後者作為雙股斷裂或作為兩個單股斷裂。這可以通過使用定點多肽，如CRISPR內切核酸酶系統等來實現。
在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於脂質奈米顆粒（LNP）介導的FVIII ceDNA遞送。由陽離子脂質與其他脂質組分如中性脂質、膽固醇、PEG、PEG化脂質和寡核苷酸形成的脂質奈米顆粒已用於阻斷血漿中核酸的降解並促進細胞對寡核苷酸的攝取。此類脂質奈米顆粒可用於將本文所述的核酸分子遞送給個體。
本揭露提供了增加個體中具有FVIII活性的多肽的表現的方法，其包括向有需要的個體投予本揭露的分離的核酸分子，其中所述多肽的表現相對於包含SEQ ID NO: 6的參考核酸分子而言增加。本揭露還提供了增加個體中具有FVIII活性的多肽的表現的方法，其包括向有需要的個體投予本揭露的載體，其中所述多肽的表現相對於包含參考核酸分子的載體增加。
本文所述的所有各個方面、實施例和選擇都能以任何和所有變化組合。
本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都通過引用併入本文，併入程度就像每個單獨的出版物、專利或專利申請被具體地且單獨地指出以通過引用併入一樣。 實例
在提供了上述公開文本之後，可以通過參考本文提供的實例獲得進一步的理解。這些實例僅用於說明的目的，而不旨在是限制性的。 實例 1 ：產生 ceDNA 的方法
在桿狀病毒-昆蟲細胞系統中，重組BEV遞送在強啟動子下的感興趣基因，並且提供病毒在昆蟲細胞中複製所必需的轉錄複合物。該系統提供了將感興趣轉基因以穩定細胞株的形式插入在桿狀病毒基因體和/或昆蟲細胞基因體中的靈活性。利用桿狀病毒-昆蟲細胞系統的這些優點，設計了三種不同的ceDNA生產方法，以根據可擴展性的難易度提供廣泛的選擇。 1.  單BAC
為了研究單Bac方法用於轉基因表現的用途，通過Tn7轉位將優化的FVIIIXTEN表現匣與細小病毒ITR插入在BIVVBac中多角體蛋白基因座中的 mini-attTn7位點處，並且在相同骨架中，通過Cre-LoxP重組將ITR特異性複製（Rep）基因表現匣插入在 EGT基因座中的LoxP位點處。然後產生重組BEV並將其用於在Sf9細胞中感染以產生FVIIIXTEN ceDNA，如 圖 1A中所描繪。使用用於控制Rep表現水平的不同啟動子來證明單Bac方法用於ceDNA產生的概念，如下所述。 2.  雙BAC：
為了研究雙Bac方法用於轉基因表現的用途，通過Tn7轉位將優化的FVIIIXTEN表現匣與細小病毒ITR、以及將ITR特異性複製（Rep）基因表現匣插入在兩種不同BIVVBac桿粒中的多角體蛋白基因座中的 mini-attTn7位點處。然後產生重組BEV並將其用於在Sf9細胞中共感染以產生FVIIIXTEN ceDNA，如 圖 1B中所描繪。使用兩種桿狀病毒的不同感染複數（MOI）比率和對Rep表現水平的微調以獲得可重複的ceDNA生產力來研究與雙BAC方法相關的挑戰，如以下實驗中所述。 3.  穩定細胞株：
為了研究穩定細胞株方法用於轉基因表現的用途，用優化的具有細小病毒ITR的FVIIIXTEN表現匣產生穩定細胞株。重組桿粒還通過以下方式產生：通過Tn7轉位將ITR特異性複製（Rep）基因表現匣插入在BIVVBac桿粒中多角體蛋白基因座中的 mini-attTn7位點處。然後產生重組Rep.BEV並將其用於在FVIIIXTEN穩定細胞株中感染以產生FVIIIXTEN ceDNA，如 圖 1C中所描繪。通過使用GFP作為代表的FACS細胞分選富集FVIIIXTEN轉形體以加快產生穩定細胞株的過程來研究與穩定細胞株方法相關的挑戰，如以下實驗中所述。 實例 2 ： FVIIIXTEN HBoV1 ITR 表現構築體
人博卡病毒1（HBoV1）（一種自主細小病毒）是支援野生型腺相關病毒2（AAV2）複製的輔助病毒。AAV以及非AAV細小病毒ITR用於產生FVIIIXTEN ceDNA的用途已經在桿狀病毒系統中得到證實（參見例如，美國專利申請號63/069,073）。與其他細小病毒ITR相比，HBoV1 ITR具有獨特的大小和形式。HBoV1的5’(REH) ITR為140 bp長（SEQ ID NO: 1）並形成具有完全鹼基配對的“U”形髮夾，而3’ (LEH) ITR為200 bp長（SEQ ID NO: 2）並形成具有三向連接的環，這使得其本質上是不對稱的，不同於其他細小病毒ITR的末端區域（ 圖 2A）。
研究HboV1 ITR用於產生FVIIIXTEN ceDNA。假設不對稱ITR可以通過穩定轉基因而增強長期持續表現。為了驗證該假設，通過GenScript®（Piscataway, NJ）®合成DNA構築體以產生SEQ ID NO: 3所示的核酸序列（ 圖 2A），所述DNA構築體包含在肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子（mTTR482）和增強子元件（A1MB2）、雜合合成內含子（嵌合內含子）、土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）、牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號的調節下的包含XTEN 144肽（FVIIIXTEN）的B結構域缺失（BDD）的經密碼子優化的人因子VIII（BDDcoFVIII），其兩側為人HBoV1 5’和3’ ITR。將該合成DNA選殖到pFastBac1（Invitrogen）載體中以產生pFastBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs轉移載體 （圖 2B ）。然後將該載體轉形到BIVVBac DH10B大腸桿菌中以產生重組BEV，AcBIVVBac.Polh.GPV.Rep Tn7，如下所述。 實例 3 ： HBoV1 NS1 （非結構的）表現構築體HBoV1 NS1 Tn7轉移載體
已知HBoV1通過mRNA轉錄物表現五種非結構蛋白，即NS1、NS2、NS3、NS4和NP1，所述mRNA轉錄物通過單個病毒前體mRNA的選擇性剪接和多腺苷酸化產生。NS1至NS4蛋白被編碼於相同開放閱讀框（ORF）的不同區域中。NS1由分別在N末端、中間和C末端的起始結合/核酸內切酶結構域（OBD）、解旋酶結構域和推定的反式啟動結構域（TAD）組成。NS1結合HBoV1複製起點，並且推測在旋轉髮夾複製（rolling-hairpin replication）過程中對起點的單股DNA（ssDNA）產生切口。
為了研究NS1在真核細胞中的ITR介導的載體產生中並從Sf9細胞“拯救”兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN ceDNA載體基因體的作用，產生HBoV1 NS1表現構築體並將其插入BIVVBac中以在Sf9細胞中產生表現HBoV1 NS1的重組BEV。
為了產生表現載體，從HBoV1基因體（GenBank登錄號：JQ923422）獲得HBoV1 NS1的編碼序列並針對Sf細胞基因體進行密碼子優化，然後通過GenScript®合成以產生如SEQ ID NO: 4所示的核酸序列。然後在AcMNPV多角體蛋白啟動子的控制下，將合成的HBoV1 NS1 DNA選殖到pFastBac1（Invitrogen）載體中（ 圖 3A），以產生pFastBac.Polh.HBoV1.NS1（ 圖 3B）轉移載體。還將合成的HBoV1 NS1 DNA選殖到在即時早期1（IE1）啟動子控制下的pFastBac1（Invitrogen）載體中，所述啟動子之前是AcMNPV轉錄因子 hr5元件（ 圖 4A），以產生pFastBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1（ 圖 4B）轉移載體。還將合成的HBoV1 NS1 DNA選殖到在OpMNPV即時早期2（IE2）啟動子下的pFastBac1（Invitrogen）載體中（ 圖 5A），以產生pFastBac.OpIE2.HBoV1.NS1（ 圖 5C）轉移載體。然後將這些載體轉形到BIVVBac DH10B大腸桿菌中以產生重組BEV：分別為AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7、AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1 Tn7或AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1 Tn7。
然後將這些重組BEV與FVIIIXTEN BEV一起用於Sf9細胞的共感染（雙BAC），以產生FVIIIXTEN ceDNA載體。 HBoV1 NS1 Cre-LoxP供體載體
為了研究單Bac方法用於產生ceDNA的用途，將HBoV1 NS1基因在LoxP位點插入多角體蛋白基因座中的Tn7位點處編碼FVIIIXTEN表現匣的重組BIVVBac中。在這些位點插入這兩種基因的基本原理是避免在FVIIIXTEN兩側的反向末端重複序列（ITR）與也是回文重複序列的LoxP序列的干擾。
此外，為了解決與上述單BAC系統相關的挑戰，測試了在感染週期期間在不同時間和水平表現的桿狀病毒基因的不同啟動子，以控制編碼FVIIIXTEN HBoV1 ITR和NS1的單BAC中HBoV1 NS1表現的水平。
在AcMNPV多角體蛋白啟動子（ 圖 3A）或前面有（ 圖 4A）和沒有（ 圖 5B）AcMNPV轉錄增強子 hr5元件的即時早期1啟動子的控制下，將合成的Sf密碼子優化的HBoV1 NS1 DNA選殖到Cre-LoxP供體載體（如美國專利申請號63/069,073所述）中，分別產生pCL.Polh.HBoV1.NS1（ 圖 3C）、pCL.HR5.IE1.HBoV1.NS1（ 圖 4C）和pCL.IE1.HBoV1.NS1（ 圖 5D）Cre-LoxP供體載體。這些構築體用首碼“pCL”表示“質體Cre-LoxP”。（見 圖 3C 、圖 4C 、圖 5D ）。然後將所得Cre-LoxP供體載體在LoxP位點插入Tn7位點處編碼FVIIIXTEN HBoV1 ITR的BIVVBac桿粒中（ 圖 6B），如下所述。 實例 4 ： FVIIIXTEN HBoV1 ITR 桿狀病毒表現載體（ BEV ）
為了產生編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣（ 圖 2A）的重組BEV，首先，用Tn7轉移載體pFastBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs（ 圖 2B）超轉形BIVVBac DH10B大腸桿菌（美國專利申請號63/069,073中所述）。在康黴素、健他黴素、X-Gal和IPTG上選擇轉形體。BIVVBac中在 mini-attTn7插入位點處的FVIIIXTEN表現匣和健他黴素抗性基因的位點特異性轉位破壞了LacZα（與 mini-attTn7框內融合）並且在X-Gal介導的雙重抗生素選擇上產生白色大腸桿菌菌落。通過鹼裂解小量製備從白色大腸桿菌菌落中分離重組桿粒DNA，並且用限制酶消化以確定正確的遺傳結構。限制酶作圖的結果顯示每種重組桿粒的預期片段，表明具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣在BIVVBac的多角體蛋白基因座中的位點特異性轉位（ 圖 6A）。通過使用轉移質體內部和外部的引子對跨越預期插入位點的區域進行PCR擴增並對所得擴增子進行測序，獲得了進一步的確認（資料未顯示）。
根據製造商的說明書，將編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣的正確重組桿粒大量製備純化並使用Cellfectin®（Invitrogen）轉染試劑轉染到Sf9細胞中。在轉染後4-5天，收穫子代桿狀病毒並在Sf9細胞中進行噬斑純化，如前所述。Jarvis等人 (2014), Methods Enzymol., 536: 149-163。重組BEV，AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN. HBoV1.ITRs Tn7 （圖 6B ）的六個經噬斑純化的RFP+選殖在Sf9細胞中擴增至P1（傳代1），所述Sf9細胞以0.5 × 10 6/mL接種在T25燒瓶中的補充有10%熱滅活胎牛血清（FBS）的ESF-921培養基中。在感染後4-5天，對於每個選殖BEV，所有選殖顯示通過RFP+細胞數確定的感染進展，表明病毒能夠正常複製，並且在桿狀病毒基因體中插入具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN轉基因對子代病毒產生沒有不利影響。選擇最高的RFP+選殖用於在Sf9細胞中進一步擴增以產生工作BEV原液（P2），然後用於在雙BAC系統中與HBoV1 NS1 BEV共感染以產生ceDNA載體。 實例 5 ： FVIIIXTEN HBoV1 ITRs + HBoV1 NS1 桿狀病毒表現載體（ BEV ）
為了測試BIVVBac是否可用於容納多個轉基因，產生了在不同啟動子控制下編碼兩個轉基因表現匣的衍生載體家族：1) FVIIIXTEN HBoV1 ITRs和2) HBoV1 NS1。這些BEV分兩步產生。首先，如上所述，將具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣經由Tn7轉位插入在BIVVBac中多角體蛋白基因座中的 mini-attTn7位點。然後，使用Cre重組酶（New England Biolabs）經由體外Cre-LoxP重組將所得桿粒BIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs（ 圖 6B）用於在 EGT基因座的LoxP位點處插入HBoV1 NS1表現匣。
在該方法中，將編碼在AcMNPV多角體蛋白啟動子（ 圖 3C）或前面有（ 圖 4C）和沒有（ 圖 5D）AcMNPV轉錄增強子 hr5元件的即時早期1（IE1）啟動子下的HBoV1 NS1的Cre-LoxP供體載體插入BIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs（ 圖 6B）桿粒中。將重組反應物在DH10B大腸桿菌中轉形，並且在康黴素、健他黴素和胺苄青黴素上選擇轉形體。通過以下方式來篩選三重抗生素抗性菌落：通過限制酶作圖和/或使用轉移質體內部和外部的引子對跨越預期插入位點的區域進行PCR擴增（ 圖 7A 、圖 7B 和圖 7C），並對所得擴增子進行測序。
大量製備法純化編碼兩個轉基因匣的正確重組桿粒，並且使用Cellfectin®（Invitrogen）轉染試劑在Sf9細胞中轉染。在轉染後4-5天，收穫子代桿狀病毒並在Sf9細胞中進行噬斑純化。將每種重組BEV（AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1. NS1 LoxP： 圖 7D；AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)IE1.HBoV1. NS1 LoxP： 圖 7E；和AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)HR5.IE1.HBoV1.NS1 LoxP： 圖 7F）的六個經噬斑純化的RFP+和GFP+選殖在Sf9細胞中擴增至P1（傳代1），所述Sf9細胞以0.5×10 6/mL接種在T25燒瓶中的補充有10%熱滅活胎牛血清（FBS）的ESF921培養基中。在感染後4-5天，所有選殖對於每種重組BEV均顯示出感染進展（通過GFP+和RFP+細胞的數量確定），這表明病毒能夠正常複製並且在同一桿狀病毒基因體中插入多個轉基因對子代病毒產生沒有不利影響。通過低速離心收穫P1病毒，並處理感染的細胞沈澱，以通過免疫印跡檢測HBoV1 NS1。最後，進一步擴增每種BEV的最高HBoV1 NS1表現選殖以產生工作BEV原液（P2），隨後在Sf9細胞中滴定。如下所述，將滴定的BEV用於Sf9細胞中的感染以產生FVIIIXTEN ceDNA載體。 實例 6 ：從單 BAC 產生 FVIIIXTEN HBoV1 ITRs ceDNA 載體
在Sf9細胞中測試編碼FVIIIXTEN HBoV1 ITR和HBoV1 NS1基因（ 圖 7D- 圖 7F）的單BAC BEV的FVIIIXTEN ceDNA產生。用每種BEV的滴定工作原液（P2）以0.1、0.5、1.0、2.0或3.0噬斑形成單位（pfu）/細胞的感染複數（MOI）感染約2.5 × 10 6/mL細胞（ 圖 8A）。將細胞懸浮於50 mL無血清ESF-921培養基中，然後在28ºC振盪培養箱中培育72-96 h或直至細胞活力達到60%-70%。在感染後約96 h，收穫感染細胞，並且處理沈澱，以用於根據製造商的說明書通過PureLink Maxi Prep DNA分離套組（Invitrogen）進行FVIIIXTEN ceDNA載體分離。在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳上分析最終洗脫級分，以確定FVIIIXTEN ceDNA載體的生產力。
編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和多角體蛋白驅動的HBoV1-NS1的AcBIVVBac (mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1 LoxPBEV（ 圖 8B）的瓊脂糖凝膠分析示於 圖 8C中。結果顯示在所有測試劑量中，DNA條帶對應於FVIIIXTEN HBoV1 ITRs（約8.5 kb）ceDNA的大小，隨著MOI增加生產力增加。
該結果與用AAV2 ITRs單BAC獲得的ceDNA生產力（其中先前觀察到生產力隨著病毒載量的增加而降低）相反。不受理論的約束，HBoV1-NS1蛋白可以由於REH和LEH ITR的獨特結構而在HBoV1 ITR的末端解離位點具有獨特的結合機制和核酸內切酶活性以用於DNA複製（ 圖 2A）。
總之，這些實驗顯示，單BAC方法確實證明了從編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和NS1轉基因的單一重組BEV產生ceDNA的概念。它還顯示了在桿狀病毒穿梭載體（BIVVBac）中不同基因座處插入多個轉基因的可行性和功能性，以及其用於在桿狀病毒昆蟲細胞系統中產生重組AAV載體的潛在用途。 實例 7 ： HBoV1 NS1 （非結構的）桿狀病毒表現載體（ BEV ）
唯一的在結構上表徵的細小病毒NS1 N末端核酸酶結構域來自AAV2 Rep，其結合複製起點（Ori）中的連續四核苷酸重複序列。然而，這種四核苷酸重複序列對AAV是特異性的並且不存在於HBoV1中。實際上，HBoV1基因體的LEH（3’ ITR）形成具有三向連接的環，而REH（5’ ITR）是具有完全鹼基配對的髮夾（ 圖 2A），它們在博卡病毒中是保守的，但與AAV和細小病毒B19（B19V）基因體的末端區域不同。這些發現表明，HBoV1中Ori的NS1識別模式可能與AAV中的不同。此外，已知AAV不引起人疾病並且是依賴病毒，因為病毒複製需要輔助病毒如皰疹病毒或腺病毒。HBoV1 NS1與AAV Rep共用少至14%的序列同一性。已經證明，HBoV1-NS1含有帶正電荷的表面，所述表面是Ori的推定結合位點並直接支持HBoV DNA複製，如以針對細小病毒提出的常見旋轉髮夾機制。
HBoV1-NS1顯現是真核細胞中ITR介導的載體生產所必需的。為了研究兩側為ITR的FVIIIXTEN載體基因體從Sf9細胞或FVIIIXTEN BEV中的潛在“拯救”，在不同桿狀病毒啟動子下產生編碼HBoV1-NS1的重組BEV以優化Sf9細胞中NS1表現的水平。
為了產生這些BEV，用Tn7轉移載體pFastBac.Polh.HBoV1-NS1 （圖 3B ）、pFastBac.HR5.IE1.HBoV1-NS1 （圖 4B ）或pFastBac.OpIE2.HBoV1.NS1 （圖 5C ）超轉形BIVVBac DH10B大腸桿菌（參見美國專利申請號63/069,073）。在康黴素、健他黴素、X-Gal和IPTG上選擇轉形體。在BIVVBac中在 mini-attTn7插入位點處HBoV1-NS1表現匣和健他黴素抗性基因的位點特異性轉位破壞LacZα（與 mini-attTn7框內融合），並切在X-Gal介導的雙重抗生素選擇上產生白色大腸桿菌菌落。因此，通過鹼裂解小量製備從白色大腸桿菌菌落中分離重組桿粒DNA，並且用限制酶消化以確定正確的遺傳結構。限制酶作圖的結果顯示了每種重組桿粒的預期片段，這表明HBoV1-NS1在BIVVBac的多角體蛋白基因座中的位點特異性轉位（ 圖 9A）。通過使用轉移質體內部和外部的引子對跨越預期插入位點的區域進行PCR擴增並對所得擴增子進行測序，獲得了進一步的確認（資料未顯示）。
根據製造商的說明書，使用Cellfectin®（Invitrogen）轉染試劑將編碼Polh.HBoV1-NS1、HR5.IE1.HBoV1-NS1或OpIE2-HBoV1-NS1的確認的正確重組桿粒轉染到Sf9細胞中。在轉染後4-5天，收穫子代桿狀病毒並在Sf9細胞中進行噬斑純化，如前所述。Jarvis等人 (2014), Methods Enzymol., 536: 149-163。將每種重組BEV，AcBIVVBac.Polh.HBoV1-NS1 Tn7 （圖 9B ）、AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1 Tn7 （圖 9C ）和AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1 Tn7 （圖 9D ）的六個經噬斑純化的RFP+選殖在Sf9細胞中擴增至P1（傳代1），所述Sf9細胞以0.5 × 10 6/mL接種在T25燒瓶中的補充有10%熱滅活胎牛血清（FBS）的ESF-921培養基中。在感染後4-5天，對於每個選殖BEV，所有選殖顯示通過RFP+細胞數確定的感染進展，表明病毒能夠正常複製，並且在桿狀病毒基因體中插入HBoV1-NS1對子代病毒產生沒有不利影響。
選擇最高的RFP+選殖用於在Sf9細胞中進一步擴增以產生工作BEV原液（P2）。然後將滴定的病毒原液用於與FVIIIXTEN BEV在雙BAC系統或FVIIIXTEN HBoV1 ITRs穩定細胞株中共感染以產生ceDNA載體。 實例 8 ：從雙 BAC 產生 FVIIIXTEN HBoV1 ITRs ceDNA 載體
為了研究用於轉基因表現的雙BAC方法，測試編碼FVIIIXTEN HBoV1 ITRs的選殖重組BEV與多角體蛋白驅動的HBoV1-NS1 BEV，以用於以1 : 10和1 : 5比率的不同MOI或以0.3、1.0、3.0和5.0 pfu/細胞的MOI的不同比率共感染以在Sf9細胞中產生FVIIIXTEN ceDNA載體（ 圖 10A）。具體地，將約2.0 × 10 6/mL細胞接種在50 mL無血清ESF-921培養基中，並且分別用MOI為0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 pfu/細胞的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7BEV與MOI為0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5 pfu/細胞來保持恒定1:10比率或MOI為0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1.0 pfu/細胞來保持恒定1 : 5比率的AcBIVVBac.Polh.HBoV1-NS1 Tn7BEV的滴定工作原液（P2）共感染。類似地，對細胞還以1 : 1、1 : 2、1 : 5或1 : 10比率以0.3、1.0、3.0或5.0 pfu/細胞的恒定MOI共感染（ 圖 10B）。在每種情況下，不去除病毒接種物，並且將細胞在28ºC搖床培養箱中培育直到活力達到60%-70%。在感染後約96 h，收穫感染細胞，並且處理沈澱，以用於根據製造商的說明書通過PureLink Maxi Prep DNA分離套組（Invitrogen）進行FVIIIXTEN ceDNA載體分離。在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳上分析最終洗脫級分，以確定ceDNA生產力。
如所預期的，瓊脂糖凝膠分析顯示出不同條件下FVIIIXTEN ceDNA生產力的不同程度。然而，以3.0 pfu/細胞的MOI共感染的雙BAC顯示FVIIIXTEN ceDNA生產力水平隨病毒載量比率增加而增加，與測試的其他條件相比，1 : 10比率下的生產力水平是最高的（ 圖 10C）。較高的病毒載量顯現提高了FVIIIXTEN HBoV1 ITRs ceDNA的生產力，這與在單BAC BEV中的觀察結果一致（參見實例6）。這進一步表明在Sf9細胞中HBoV1-ITR依賴性FVIIIXTEN ceDNA複製需要更高水平的HBoV1-NS1。
單BAC或雙BAC的結果表明，HBoV1-NS1複製水平對桿狀病毒系統中FVIIIXTEN ceDNA生產力具有顯著影響。
作為測試上文討論的幾種不同共感染條件的替代方案，通過利用桿狀病毒基因體的不同啟動子探索了提高FVIIIXTEN ceDNA生產力的其他方法。桿狀病毒基因啟動子根據其在感染週期中的轉錄開始分為即時早期、早期、晚期和極晚期啟動子。其中，如名稱所指示，即時早期（ ie）基因啟動子在病毒感染後立即啟動，並在整個感染週期中保持活性。然而，晚期或極晚期基因啟動子如多角體蛋白保持沈默直到病毒達到感染的晚期。
為了利用從桿狀病毒基因體中啟動子的這種寬範圍選擇，測試了HBoV1-NS1的即時早期1（IE1）啟動子。顯示增加Sf9細胞中表現水平的轉錄增強子 hr5元件被包括在IE1啟動子之前。這產生了編碼在之前是AcMNPV轉錄增強子 hr5元件的AcMNPV即時早期1（IE1）啟動子控制下的HBoV1-NS1的重組BEV，如 圖 9C所描繪。
基於 圖 10C中獲得的結果，通過保持恒定比率1 : 10，以不同MOI用編碼FVIIIXTEN HBoV1 ITRs和 hr5.IE1驅動的HBoV1-NS1的BEV共感染Sf9細胞。作為陽性對照，包括多角體蛋白驅動的HBoV1-NS1 BEV，並在同一組實驗中再次測試。更具體地，將約2.0 × 10 6/mL Sf9細胞用MOI為0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 pfu/細胞的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7BEV（ 圖 10B）與MOI為0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5 pfu/細胞來保持恒定1:10比率的AcBIVVBac.Polh.HBoV1-NS1 Tn7或AcBIVVBac.hr5.IE1.HBoV1-NS1 Tn7BEV（ 圖 11B）的滴定工作原液（P2）共感染。其餘程式如上所述（參見實例6）。
在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳上分析最終洗脫級分，以確定ceDNA生產力。多角體蛋白驅動的HBoV1-NS1共感染顯示FVIIIXTEN ceDNA生產力水平隨著MOI增加而增加，這進一步證實了用於ceDNA生產的雙BAC方法的再現性。然而，出人意料的是，如 圖 10C中觀察到的， hr5.IE1驅動的HBoV1-NS1共感染顯示出幾乎不可檢測水平的FVIIIXTEN ceDNA，生產力沒有隨著MOI增加而明顯增加。
該資料表明HBoV1-NS1的早期發作對於拯救具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN ceDNA可能不是關鍵的。相反，感染後期較高水平的表現可能是具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN ceDNA的有效拯救和生產力所需要的。這些結果進一步證實了在Sf9細胞中HBoV1-ITR依賴性FVIIIXTEN ceDNA複製需要較高水平的HBoV1-NS1。
總之，這些實驗已經表明，雙BAC方法確實證明了從編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和/或NS1轉基因的兩種重組BEV產生ceDNA的概念。這些實驗也證明了最佳MOI比率和/或啟動子對於在Sf9細胞中實現FVIIIXTEN ceDNA的較高生產力的重要性。 實例 9 ： FVIIIXTEN HBoV1 ITR 穩定細胞株
假設昆蟲細胞基因體可能被修飾以產生ceDNA，以用於桿狀病毒感染後的治療應用。為了檢驗該假設，通過GenScript®（Piscataway, NJ）合成質體，所述質體編碼在AcMNPV即時早期（ie1）啟動子控制下的新黴素抗性標記（pUC57.HR5.IE1.NeoR.P10PAS: SEQ ID NO: 7）（ 圖 12A）或增強的綠色螢光蛋白（eGFP）（pUC57.HR5.IE1.eGFP.P10PAS: SEQ ID NO: 8）（ 圖 12B），所述啟動子之前是轉錄增強子 hr5元件，所述新黴素抗性標記或所述增強的綠色螢光蛋白之後是AcMNPV p10多腺苷酸化信號。
使用修改的磷酸鈣轉染方法，將這些質體與編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN的質體（Sf.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs）（ 圖 12C）共轉染到Sf9細胞中。在轉染後24 h，在螢光顯微鏡下視覺化細胞以確定轉染效率，並且結果顯示＞ 80% GFP+細胞，這表明更高的轉染效率。在轉染後72 h，用G418抗生素（Sigma Aldrich）以1.0 mg/mL終濃度選擇細胞，所述G418抗生素懸浮於完全TNMFH培養基（補充有10% FBS + 0.1% Pluronic F68的Grace昆蟲培養基）中。在約一周的選擇之後，回收了約50%的轉形細胞，這表明新黴素抗性標記穩定地整合到該細胞群中。將存活細胞從選擇培養基中取出並且用新鮮的完全TNMFH培養基培養直到匯合生長。隨著匯合細胞繼續分裂，將它們作為貼壁培養物逐漸擴增到更大的培養器皿中。隨後，通過以下方式使多選殖細胞群適應懸浮培養：在搖瓶中在完全TNMFH中培養1代並且在補充有10% FBS的ESF-921培養基中生長1代。最後，使細胞作為懸浮培養物適應搖瓶中的無血清ESF-921。通常將這些搖瓶培養物維持在無血清ESF-921培養基中，每四天傳代一次，並且監測細胞生長。 實例 10 ： FVIIIXTEN ceDNA 純化
在桿狀病毒-昆蟲細胞系統中，重組BEV遞送在強啟動子下的感興趣基因，並且提供病毒在昆蟲細胞中複製所必需的轉錄複合物。通常，桿狀病毒DNA基因體在細胞核中複製並產生數以千萬個子代病毒顆粒，每個子代病毒顆粒含有全長DNA基因體。已經證明桿狀病毒基因體DNA與ceDNA共純化，同時使用基於質體DNA的純化方法（如矽膠柱）從昆蟲細胞中分離DNA。商業質體DNA套組柱通常不被設計用於基於分子量分離DNA，因而通常樣品中存在的所有形式的DNA均可以與這些柱結合。此外，大分子量DNA的結合能力可能與低分子量DNA不同，並且基於陰離子交換的套組柱未基於不同大小的DNA的結合效率進行優化。
假設在ceDNA製備物中觀察到的高分子量DNA（＞ 20 kb）最可能是與低分子量FVIIIXTEN ceDNA（約8.5 kb）共純化的桿狀病毒和/或Sf9細胞基因體DNA（參見例如 圖 8C 、圖 10C 和圖 11C）。
先前，採用間接方法以通過剔除桿狀病毒衣殼基因（如VP80）來減少桿狀病毒DNA，所述桿狀病毒衣殼基因是產生感染性子代病毒產生所需的。這種方法顯示出從剔除BEV獲得的ceDNA製備物中桿狀病毒DNA的顯著減少（參見美國專利申請號63/069,115）。雖然這種方法在減少桿狀病毒DNA污染方面是有效的，但它無法減少細胞基因體DNA，其在從感染細胞沈澱中獲得的總DNA中以顯著量（約60%）存在。
因此，採用了將FVIIIXTEN ceDNA與其餘不需要的DNA分離的直接方法，並且證明所述直接方法從來自感染細胞沈澱的總DNA製備物中高效獲得純化的FVIIIXTEN（＞ 95%純度）。這種新穎的方法利用了製備型電泳，其廣泛用於根據大小和電荷分離不同的蛋白質分子。參見例如Michov, B. (2020) Electrophoresis. Berlin, Boston: De Gruyter, 第405-424頁。例如，Bio-Rad Model 491 prep cell或其他此類單元可用於基於大小分離複雜分子。
ceDNA純化的整個工作流程如 圖 13中所示，其中過程開始於將無血清昆蟲細胞培養基中的Sf9細胞培養物從0.5 L放大至1.5 L或更高體積（ 圖 13A）。在達到約2.5 x 10 6/mL的所需細胞密度後，通常在接種密度為約1.3 x 10 6/mL的情況下培育2天后，將細胞用單BAC或雙BAC BEV（取決於用於產生ceDNA的方法）以優化的MOI感染，並且將細胞在28ºC搖床培養箱中培育，直到活力達到約60%-70%，這通常需要約4天（ 圖 13B）。一旦活力達到約70%，就收穫細胞並且對其進行處理，以根據製造商的說明書通過陰離子交換層析套組柱（如PureLink HiPure Expi質體Gigaprep純化套組（Invitrogen））進行總DNA純化。在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢查純化DNA材料的等分試樣以確定DNA生產力和完整性（ 圖 13C）。
然後將純化的材料載入到製備型瓊脂糖凝膠電泳單元上，所述單元含有0.5%製備型瓊脂糖凝膠和0.25%堆積瓊脂糖凝膠，根據製造商的說明書進行組裝。在緩衝液再迴圈流速為約50 mL/min且洗脫緩衝液速率為50 µL/min的情況下，將樣品在4ºC下以低電壓（約40恒定伏特）運行6-7天，以在70-80 min將每個級分收集在級分收集室中。在連續洗脫電泳之後，在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢查20 µL的每個級分以確定FVIIIXTEN ceDNA的純度（ 圖 13D）。將所需級分合併以在-20C下用3 M NaOAc（pH 5.5）和100% EtOH沈澱1-2 h。最後，將沈澱的FVIIIXTEN ceDNA以高速沈澱並且用70% EtOH洗滌一次，然後再懸浮於TE（pH 8.0）緩衝液中。將純化的FVIIIXTEN ceDNA再次在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢查以確認純度和完整性，然後注射到動物中以進行體內功效研究（ 圖 13E）。 實例 11 ： FVIIIXTEN HBoV1 ITR 體內功效ssFVIIIXTEN HBoV1 ITR（單股DNA）
假設在ITR區域內形成的髮夾能夠實現較高水平的長期持續轉基因表現。為了在體內研究HBoV1 ITR的功能性，在hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠中測試包含具有預先形成的HBoV1 ITR的經密碼子優化的人FVIIIXTEN的單股DNA（ssDNA）。這些小鼠含有人 FVIII-R593C轉基因，所述轉基因被設計為具有鼠白蛋白（ Alb）啟動子，所述啟動子驅動含有在輕度血友病A患者中經常觀察到的突變的改變的人凝結因子VIII（FVIII）cDNA的表現。這些小鼠還攜帶 FVIII基因的剔除並且缺乏內源性FVIII蛋白。這些雙突變小鼠耐受人FVIII注射並且沒有FVIII活性。它們在用人FVIII處理後產生非常少的抑制性抗體並且缺乏FVIII反應性T細胞或B細胞。hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠進一步描述於Bril, 等人 (2006) Thromb. Haemost. 95(2): 341-7中。
通過在95ºC使PmlI消化的雙股DNA片段產物（FVIII表現匣和質體骨架）變性，然後在4ºC冷卻以允許回文ITR序列折疊來產生具有預先形成的HBoV1 ITR的單股FVIIIXTEN（ssFVIIIXTEN）。然後，將ssFVIIIXTEN以10 μg或40 μg/小鼠（分別相當於400 μg或1600 μg/kg）經由流體動力學尾靜脈注射全身注射。以7天的間隔從注射小鼠中收集血漿樣品5.5個月。根據製造商的說明書，通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定來測量血漿FVIII活性。
對於ssFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 14A中。結果顯示在5.5個月的歷程內在HemA小鼠中具有劑量依賴性反應，在兩個測試劑量下均具有FVIII表現的超生理水平（＞ 1000%正常值）。然而，直到第56天觀察到FVIII表現的初始下降，但隨後在第168天之前水平穩定，表明來自注射動物肝臟的兩側為HBoV1 ITR的ssFVIIIXTEN的持續表現。因此，這些結果驗證了HBoV1 ITR用於FVIIIXTEN在體內的長期持續表現的功能性。 ceFVIIIXTEN HBoV1 ITR（封閉末端DNA）
為了驗證HBoV1 ITR在ceDNA中的功能性，將如上所述從感染的Sf9細胞沈澱純化的ceFVIIIXTEN以0.3 μg、1.0 μg 或2.0 μg/小鼠（分別相當於12 μg、40 μg和80 μg/kg）經由流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠中。以7天間隔收集來自注射小鼠的血漿樣品，並且通過生色測定測量FVIII活性，如上所述。
對於ceFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 14B中。該研究結果顯示在HemA小鼠中的劑量依賴性反應，在注射後直至第56天，在最高測試劑量下觀察到FVIII表現的超生理水平（＞ 500%正常值）。有趣的是，當對小鼠注射1600 μg/kg的ssFVIIIXTEN時實現類似的表現水平，其比ceFVIIIXTEN劑量（80 μg/kg）高至少20倍（ 圖 14A- 圖 14B）。該資料表明與ssDNA形式相比，ceDNA提供更高水平的FVIII表現。
總之，這些體內研究驗證了HBoV1 ITR在ssDNA或ceDNA形式中的功能性，並證明HBoV1 ITR可用於在桿狀病毒昆蟲細胞系統中產生編碼目的轉基因的功能性ceDNA。 實例 12 ：使用 CRISPR Cas 剔除 HBoV1 NS1 BEV 中的 VP80 提高 ceDNA 載體純度
在AcMNPV多角體蛋白啟動子下表現的HBoV1 NS1確實能夠拯救兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN，並證明在桿狀病毒系統中用HBoV1 ITR產生ceDNA的概念。然而，在ceDNA製備物中觀察到顯著水平的桿狀病毒DNA（vDNA）污染，可能是由於與AAV2 Rep-BEV相比需要更高的病毒載量來實現更高的ceDNA生產力。在這些ceDNA製備物中觀察到的高分子量DNA（＞ 20 kb）（ 圖 8C ，圖 10C）最可能是與低分子量ceDNA（約8 kb）共純化的桿狀病毒基因體DNA。
為了減少ceDNA製備物中的桿狀病毒DNA污染，實施了剔除VP80的間接方法，VP80是在昆蟲細胞（Sf9）中產生感染性病毒顆粒所需的桿狀病毒基因體的必需基因。使用Alt-R CRISPR-Cas9系統（參見美國專利申請號63/069,115）在所有三種NS1 BEV中剔除VP80（ 圖 9B 、圖 9C 和圖 9D）。這種方法可能減少子代病毒顆粒的數量，並最終減少ceDNA製備物中的桿狀病毒DNA污染。 CRISPR-Cas9剔除AcMNPV VP80基因：
如前所述（參見例如，國際申請號PCT/US2021/047202），選擇編碼在AcMNPV多角體蛋白（ 圖 9B）或OpMNPV OpIE2（ 圖 9C）啟動子下的HBoV1 NS1的重組BEV，以通過CRISPR-Cas9系統剔除vp80基因。
簡言之，根據製造商的說明書，設計兩個靶向編碼序列的crRNA並用於使用Alt-R CRISPR-Cas9系統（Integrated DNA Technology TM）產生功能性sgRNA。然後使用Cellfectin®（Invitrogen TM）轉染試劑，將每個sgRNA與SpCas9核酸酶和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7或AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1 Tn7桿粒DNA共轉染Sf9細胞，所述細胞以0.5 × 106/mL接種在T25燒瓶中的無血清ESF-921培養基中。轉染後4-5天，在螢光顯微鏡下觀察細胞，結果顯示對於兩種sgRNA靶標，約10% RFP+細胞。感染細胞的例示性螢光顯微鏡圖像示於 圖 15中。在單獨Cas9情況下用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7BEV感染的細胞顯示出預期的感染進展（ 圖 15A），然而，相比之下，sgRNA.VP80.T1（ 圖 15B）或sgRNA.VP80.T2（ 圖 15C）處理的細胞顯示出對單獨細胞的限制性感染，這可能是由於VP80的剔除。
為了確定每種sgRNA誘導的插入缺失，收穫子代桿狀病毒並在互補Sf.39K.VP80細胞株中純化噬斑，如前所述。Jarvis等人 (2014), Methods Enzymol., 536: 149-163。在感染後5-6天，將十二個經噬斑純化的RFP+選殖在Sf.39K.VP80細胞中擴增到P1，所述細胞以0.5 × 10 6/mL接種在T25燒瓶中的補充有10% FBS的ESF-921培養基中。擴增選殖的螢光顯微鏡觀察顯示約80%的RFP+細胞，這表明Sf.39K.VP80細胞株能夠以反式互補VP80功能用於產生子代病毒。通過低速離心收穫每個選殖BEV，然後根據製造商的說明書，通過Qiagen的DNeasy血液和組織基因體DNA分離套組（目錄號69506）將細胞沈澱用於總DNA分離。將得到的DNA用作模板，以用AcMNPV vp80編碼序列特異的引子對每個靶序列進行PCR擴增。然後凝膠純化PCR擴增物並通過Genewiz測序設施直接測序。通過TIDE（通過DEcomposition追蹤插入缺失）程式（tide.deskgen.com）使用默認設置分析所得序列以確定每種sgRNA誘導的插入缺失。TIDE分析顯示，在vp80編碼序列中，在sgRNA.T1處理的AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7BEV選殖#4中具有最高（97.1%）-15 bp缺失的移碼突變（ 圖 16A）和AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1 Tn7BEV選殖#4中具有最高（37.4%）-4 bp和（26.9%）-3 bp缺失的移碼突變（ 圖 16B），沒有可檢測的插入。將每個選殖擴增到P2以產生工作BEV原液，隨後在Sf.39K.VP80細胞中滴定，如前所述。Jarvis等人 (2014), Methods Enzymol., 536: 149-163。然後將滴定的vp80KO BEV的工作原液用於共感染雙BAC系統以產生FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA載體。 使用vp80KO BEV產生人FVIIIXTEN ceDNA：
將約2.0 × 10 6個細胞接種於100 mL無血清ESF-921培養基中，並以1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 pfu/細胞的MOI用AcBIVVBac.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1ΔVP80 Tn7或AcMNPV.OpIE2.HBoV1.NS1Δ VP80 Tn7BEV的滴定工作PP1P2原液共感染。在每種情況下，不去除病毒接種物，並且將細胞在28ºC搖床培養箱中培育直到活力達到60%-70%。在感染後約96 h，收穫感染細胞，並且處理沈澱，以用於根據製造商的說明書通過PureLink Maxi Prep DNA分離套組（Invitrogen）進行FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA分離。
通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析最終洗脫級分，以確定ceDNA生產力和純度。瓊脂糖凝膠分析顯示在表現在AcMNPV多角體蛋白或OpMNPV OpIE2啟動子下的HBoV1 NS1的vp80KO BEV中非常低至無可檢測的高分子量（＞ 20 kb）桿狀病毒DNA（vDNA）污染（ 圖 16C）。這表明當以2.0、3.0或4.0 pfu/細胞的MOI共感染細胞時，vp80KO方法能夠減少污染性桿狀病毒DNA並同時提高FVIIIXTEN HboV1 ceDNA產量（圖11C，圖16C）。 實例 13 ：從雙 BAC 系統產生 FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA 載體
遺傳不穩定性是桿狀病毒學領域中並且尤其是在Sf9細胞中重組桿狀病毒的若干傳代後的主要關注點之一。此外，桿狀病毒基因體含有幾個同源區（hr），它們易於在Sf9細胞中傳代時重組，並可能在重組BEV中丟失轉基因。反向末端重複序列（ITR）也是回文重複序列，並且考慮到桿狀病毒DNA的大尺寸，可能在桿狀病毒基因體中的不同基因座處重組。因此，為了確定編碼具有HBoV1 WT ITR的在肝特異性mTTR啟動子下的FVIIIXTEN基因的重組BEV的遺傳穩定性，通過以0.1 pfu/細胞的MOI感染Sf9細胞來依序擴增BEV，如前所述。Jarvis等人 (2014), Methods Enzymol., 536: 149-163。測試所得重組BEV的使用雙BAC系統的FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA產生（參見 圖 17A，和 圖 17B中描繪的構築體）。
將約2.0 × 10 6個細胞接種於100 mL無血清ESF-921培養基中，並以1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 pfu/細胞的MOI用AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN. HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7BEV的滴定工作原液（P3或P4）共感染。在每種情況下，不去除病毒接種物，並且將細胞在28ºC搖床培養箱中培育直到活力達到60%-70%。在感染後約96 h，收穫感染細胞，並且處理沈澱，以用於根據製造商的說明書通過PureLink Maxi Prep DNA分離套組（Invitrogen）進行FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA分離。
通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析最終洗脫級分，以確定ceDNA生產力。如 圖 17C中所示的瓊脂糖凝膠分析顯示與P3或P4（和P5，資料未顯示）BEV幾乎相等水平的FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA生產力，表明編碼FVIIIXTEN HBoV1 ITR的重組BEV在Sf9細胞中的隨後傳代中是遺傳穩定的。 實例 14 ：從單 BAC 系統產生 FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA 載體
HBoV1單BAC系統已顯示在Sf9細胞中產生FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA載體（參見例如 圖 8C）。然而，使用多選殖重組BEV實現了概念驗證。為了支援更大規模的生產，需要產生選殖BEV。因此，在該研究中，將HBoV1單BAC多選殖BEV進行噬斑純化並在Sf9細胞中擴增（參見 圖 18A）。然後篩選這些選殖單BAC BEV，以用於在Sf9細胞中產生FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA載體。
如前所述進行重組HBoV1單BAC BEV的噬斑純化和擴增。Jarvis等人 (2014), Methods Enzymol., 536: 149-163。通過在補充有10%胎牛血清的100 mL ESF-921培養基中感染約1.0 × 106/mL Sf9細胞，將六個經噬斑純化的選殖擴增到P2，並在28ºC振盪培養箱中培育4-5天或直到細胞活力達到60%-70%。在感染後4-5天，收穫無細胞上清液並作為P2工作原液儲存，並根據製造商的說明書，通過PureLink Maxi Prep DNA分離套組（Invitrogen）處理細胞沉澱用於FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA分離。
通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析最終洗脫級分，以確定FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA載體生產力。 圖 18C示出了編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和多角體蛋白驅動的HBoV1-NS1的HBoV1單BAC（ 圖 18B所描繪的構築體）的瓊脂糖凝膠分析。結果顯示出不同選殖的HBoV1 ceDNA生產力的不同程度，與其他測試的選殖相比，選殖#2和選殖#4是HBoV1 ceDNA的更高生產者（ 圖 18C）。該結果顯示出從相同原液獲得的不同桿狀病毒選殖的變異性，並突出了使用選殖重組BEV用於大規模ceDNA製造的重要性。
為了確定選殖HBoV1單BAC BEV的最佳生產力，以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0或5.0 pfu/細胞的MOI用HBoV1單BAC BEV選殖#5的滴定工作原液（P2）感染約2.0 × 10 6個細胞。在每種情況下，不去除病毒接種物，並且將細胞在28ºC搖床培養箱中培育直到細胞活力達到60%-70%。在感染後約96 h，收穫感染細胞，並且處理沈澱，以用於根據製造商的說明書通過PureLink Maxi Prep DNA分離套組（Invitrogen）進行FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA分離。通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析最終洗脫級分，以確定FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA生產力。
瓊脂糖凝膠分析顯示在所有測試劑量中，DNA條帶對應於FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA（約8.5 kb）的大小，隨著MOI增加生產力增加。該結果與用AAV2 ITR單BAC獲得的ceDNA生產力（其中觀察到生產力隨病毒載量增加而降低）相反。該HBoV1單BAC方法證明了從編碼具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和NS1轉基因的單個重組BEV產生ceDNA的概念。還顯示在桿狀病毒穿梭載體（BIVVBac）的不同基因座處插入多個轉基因的可行性和功能性。 實例 15 ： FVIIIXTEN HBoV1 ssDNA 與 ceDNA 體內功效ssFVIIIXTEN HBoV1 ITR（單股DNA）
假設在HBoV1 ITR區域內形成的髮夾以更高水平驅動轉基因的長期持續表現。為了在體內驗證HBoV1 ITR的功能性，在hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中測試包含經密碼子優化的人FVIIIXTEN（ssFVIIIXTEN）和預先形成的HBoV1 ITR的單股DNA（ssDNA）。
通過在95ºC使PmlI消化的雙股DNA（dsDNA）片段產物（FVIII表現匣和質體骨架）變性，然後在4ºC冷卻以允許回文ITR序列折疊來產生具有預先形成的HBoV1 ITR的ssFVIIIXTEN。所得ssFVIIIXTEN通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳證實。凝膠分析顯示ssFVIIIXTEN的dsDNA大小的一半，表明有效的髮夾形成（ 圖 19A）。將ssFVIIIXTEN以10 μg或40 μg/小鼠（分別相當於400 μg或1600 μg/kg）經由流體動力學尾靜脈注射全身注射。以7天的間隔從注射小鼠中收集血漿樣品5.5個月。根據製造商的說明書，通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定來測量血漿FVIII活性。
對於ssFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 19C中。結果顯示在5.5個月的歷程內在HemA小鼠中具有劑量依賴性反應，在較高劑量佇列中具有FVIII表現的超生理水平（＞ 1000%正常值）。然而，直到第56天觀察到FVIII表現的初始下降，並在第140天之前水平穩定，表明來自肝臟的兩側為HBoV1 ITR的ssFVIIIXTEN的持續表現。這些結果驗證了HBoV1 ITR用於FVIIIXTEN在體內的長期持續表現的功能性。 ceFVIIIXTEN HBoV1 ITR（封閉末端DNA）
在封閉末端DNA（ceDNA）和單股DNA（ssDNA）之間存在主要的結構差異，其中分別地，前者是雙股，而後者是單股。這種差異可能影響表現水平以及核酸分子的穩定性。該研究顯示出HBoV1 ITR在ceDNA形式中的體內功能性。為了對此進行測試，使用如實例8中所述的雙Bac方法獲得ceFVIIIXTEN，將其從感染的Sf9細胞沈澱純化，並通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定品質。瓊脂糖凝膠分析顯示ceFVIIIXTEN純度＞ 90%，沒有可檢測的污染DNA（ 圖 19B）。
將所得的ceFVIIIXTEN以0.3 µg、1.0 µg或2.0 µg/小鼠（分別相當於12 µg、40 µg和80 µg/kg）經由流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中。以7天間隔收集來自注射小鼠的血漿樣品，並通過生色分析測量FVIII活性，如上所述。對於ceFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 19C中。
結果顯示出在HemA小鼠中具有劑量依賴性反應，在對於ceFVIIIXTEN測試的最高劑量（80 μg/kg）下FVIII表現具有超生理水平（＞ 500%正常值）。ceDNA的FVIII表現的最高水平比1600 µg/kg下ssFVIIIXTEN實現的最高水平低2倍。然而，以高得多的量給予ssDNA以實現FVIII表現的這些高水平。ceDNA顯現每劑量提供更高水平的FVIII表現。例如，400 μg/kg的ssDNA和40 μg/kg的ceDNA的FVIII表現水平是可比的（ 圖 19C）。這些體內研究驗證了HBoV1 ITR在ssDNA或ceDNA形式中的功能性，並顯示HBoV1 ITR可用於在桿狀病毒昆蟲細胞系統中產生編碼目的轉基因的功能性ceDNA。 實例 16 ： FVIIIXTEN HBoV1 單體與多聚體 ceDNA 體內功效
已顯示重組AAV基因體在附加體中持續存在，並且認為它們的附加體存在與長期轉基因表現相關。這些基因體顯現通過單體環化過程產生，產生頭對尾AAV環狀基因體。然而，隨著時間的推移，單體環狀中間體下降，有利於高分子量環狀多聯體。其他細節披露於Duan等人 (1998), J Virol. 72(11);8568-8577中。目前關於封閉末端DNA（ceDNA）的附加體存在和在體內ceDNA的單體形式優於多聯體形式的益處知之甚少。
進行該研究以通過在hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中經由流體動力學尾靜脈注射測試兩種形式的FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA（ceFVIIIXTEN）來確定單體形式和多聚體形式的ceDNA的體內影響。
通過PAGE純化產生ceFVIIIXTEN的單體和多聚體形式，如前所述（參見國際申請號PCT/US2021/047218）。通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定ceFVIIIXTEN的多聯體形式的品質，結果顯示大多數物種是ceFVIIIXTEN的單體或多聚體形式（ 圖 20A）。將純化的單體或多聚體ceFVIIIXTEN經由流體動力學尾靜脈注射以40 μg/kg全身注射到hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中。以7天的間隔從注射小鼠中收集血漿樣品約3個月。根據製造商的說明書，通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定來測量血漿FVIII活性。
對於ceFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 20B中。結果顯示在3個月的歷程中，單體或多聚體形式的ceFVIIIXTEN之間在FVIII表現水平上沒有顯著差異。該資料表明，單體和多聚體形式的ceFVIIIXTEN具有可比的體內效力和穩定性。 實例 17 ： FVIIIXTEN HBoV1 mTTR 與 A1AT ssDNA 體內功效
用於上文公開的實驗的FVIIIXTEN表現匣含有mTTR啟動子和增強子元件（V2.0， 圖 1）。該啟動子是小鼠肝特異性的，但其肝特異性表現尚未在大型動物模型或人個體中研究。因此，在該研究中，通過用V2.0表現匣中的人肝特異性α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子（SEQ ID NO: 36）替代mTTR啟動子和增強子元件來產生V3.0 FVIIIXTEN表現匣（SEQ ID NO: 35）（ 圖 1）。
為了在體內驗證mTTR相對於A1AT啟動子的功能性，在hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中測試包含經密碼子優化的人FVIIIXTEN（ssFVIIIXTEN）與預先形成的HBoV1 ITR的單股DNA（ssDNA）（ 圖 21A）。通過在95ºC使PmlI消化的雙股DNA（dsDNA）片段產物（mTTR或A1AT FVIII表現匣和質體骨架）變性，然後在4ºC冷卻以允許回文ITR序列折疊來產生具有預先形成的HBoV1 ITR的ssFVIIIXTEN。將所得ssFVIIIXTEN通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠分析顯示ssFVIIIXTEN的dsDNA大小的一半，表明有效的髮夾形成（ 圖 21B）。將ssFVIIIXTEN以10 μg/小鼠經由流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中。以7天的間隔從注射小鼠中收集血漿樣品5.5個月。根據製造商的說明書，通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定來測量血漿FVIII活性。
對於ssFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 21C中。這些結果顯示，直至注射後第21天，FVIII表現水平相當，表明hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠動物模型中mTTR或A1AT啟動子表現的FVIIIXTEN水平沒有顯著差異。 序列 表 2 ：其他核苷酸和胺基酸序列
SEQ ID NO / 描述 核苷酸或胺基酸序列
SEQ ID NO.1: HBoV1 5’ ITR GTGGTTGTACAGACGCCATCTTGGAATCCAATATGTCTGCCGGCTCAGTCATGCCTGCGCTGCGCGCAGCGCGCTGCGCGCGCGCATGATCTAATCGCCGGCAGACATATTGGATTCCAAGATGGCGTCTGTACAACCAC
SEQ ID NO.2: HBoV1 3’ ITR TTGCTTATGCAATCGCGAAACTCTATATCTTTTAATGTGTTGTTGTTGTACATGCGCCATCTTAGTTTTATATCAGCTGGCGCCTTAGTTATATAACATGCATGTTATATAACTAAGGCGCCAGCTGATATAAAACTAAGATGGCGCATGTACAACAACAACACATTAAAAGATATAGAGTTTCGCGATTGCATAAGCAA
SEQ ID NO.3: HBoV1-5’ITR- mTTR482-內含子- coBDDFVIIIXTEN (V2.0)-WPRE-bGHPolyA- HBoV1-3’ITR GTATACCTGCAGGCTAGCCACGTGTTGTTGTTGTACATGCGCCATCTTAGTTTTATATCAGCTGGCGCCTTAGTTATATAACATGCATGTTATATAACTAAGGCGCCAGCTGATATAAAACTAAGATGGCGCATGTACAACAACAACACATTAAAAGATATAGAGTTTCGCGATTGCAAGCTTGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGGAATTCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTACTCGAGGCCACCATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGAGCGCCACTCCGGAATCGGGCCCAGGAAGCCCTGCCGGATCCCCGACCAGCACCGAGGAGGGAAGCCCCGCCGGGTCACCGACTTCCACTGAGGAGGGAGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAAGCGGCCGCTCATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTGCCTAGGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAAGACCATGGGCGCGCCAGGCCTGTCGACGCCCGGGCGGTACCGCGATCGCTCGCGACGCATAAAGTATATGTGACGTGGTTGTACAGACGCCATCTTGGAATCCAATATGTCTGCCGGCGATTAGATCATGCGCGCGCGCAGCGCGCTGCGCGCAGCGCAGGCATGACTGAGCCGGCAGACATATTGGATTCCAAGATGGCGTCTGTACAACCACGTGCTTAAGCTGCAGACTAGTGAGCTCGTTAAC
SEQ ID NO.4: Sf密碼子優化HBoV1 NS1 GCGGCCGCGGATCCGCCACCATGGCATTCAATCCGCCCGTAATACGCGCATTTTCACAACCCGCCTTTACGTATGTCTTTAAGTTTCCGTACCCTCAATGGAAAGAGAAAGAGTGGCTACTGCACGCGTTGCTTGCCCACGGCACCGAGCAGTCCATGATTCAATTACGTAACTGTGCCCCACACCCGGACGAGGATATTATCCGGGACGATCTTCTAATAAGTTTGGAAGATAGGCATTTCGGGGCGGTCCTGTGTAAAGCGGTATACATGGCTACTACCACGTTGATGTCTCACAAGCAACGCAATATGTTCCCAAGGTGCGACATAATCGTTCAGTCAGAGTTAGGTGAAAAAAATTTACATTGTCATATTATCGTTGGAGGCGAAGGCCTATCAAAGAGAAACGCTAAGAGCTCTTGCGCTCAGTTTTACGGACTTATATTAGCAGAAATTATCCAGCGCTGTAAGAGTTTACTAGCCACCCGTCCGTTTGAGCCGGAAGAAGCGGATATATTTCATACGTTGAAGAAAGCGGAGCGCGAGGCCTGGGGTGGAGTTACTGGCGGTAACATGCAAATCTTACAATACAGGGACCGTCGGGGTGACCTGCATGCACAGACTGTTGATCCCCTCAGATTCTTCAAAAATTATTTGTTACCGAAGAACCGATGCATAAGTAGTTACAGCAAACCTGATGTCTGTACTAGCCCTGATAACTGGTTCATTCTGGCCGAAAAAACGTACTCGCATACACTTATCAATGGATTGCCGCTTCCCGAGCACTATCGAAAAAACTATCATGCCACCCTGGATAATGAAGTTATACCTGGACCACAGACTATGGCGTATGGAGGGAGAGGCCCTTGGGAACATTTACCCGAGGTGGGTGACCAGAGGCTTGCCGCAAGTTCCGTGAGCACTACGTATAAGCCAAACAAGAAGGAGAAGCTAATGCTCAACCTCCTCGACAAGTGTAAGGAGTTGAATCTTCTAGTTTATGAGGATCTTGTAGCGAACTGCCCAGAGCTGCTGCTCATGCTAGAAGGCCAACCTGGAGGTGCTCGACTCATCGAGCAAGTACTAGGAATGCATCACATCAATGTATGCTCGAATTTCACCGCGCTAACGTACCTCTTCCATCTGCATCCGGTGACATCGCTGGATAGTGACAACAAAGCGTTACAGCTTTTACTAATTCAAGGGTACAACCCCCTGGCAGTGGGGCATGCTCTCTGTTGTGTGTTAAACAAACAATTTGGTAAACAGAACACAGTCTGTTTTTACGGGCCAGCATCTACTGGGAAAACAAATATGGCAAAAGCGATTGTGCAGGGAATCCGGCTATATGGCTGCGTCAACCATCTTAACAAGGGTTTTGTTTTCAATGATTGTCGACAACGCCTCGTAGTCTGGTGGGAGGAATGCCTAATGCACCAGGACTGGGTGGAGCCAGCAAAGTGTATTCTTGGCGGGACCGAATGTCGTATCGACGTCAAGCACAGAGATTCTGTCCTATTGACACAAACGCCTGTAATAATTTCGACTAATCACGACATTTACGCCGTCGTGGGAGGGAATTCGGTGTCTCACGTTCACGCTGCGCCTCTCAAAGAACGGGTTATTCAGCTGAATTTTATGAAACAACTCCCCCAAACTTTTGGTGAGATAACCGCCACAGAAATCGCTGCTCTGCTACAGTGGTGCTTTAATGAATATGACTGCACCCTGACAGGTTTCAAACAGAAGTGGAATTTGGACAAGATACCTAACTCATTCCCGTTGGGGGTATTGTGCCCAACACATTCCCAAGATTTCACACTTCACGAAAATGGGTATTGCACGGACTGCGGGGGCTACCTTCCCCACTCCGCTGATAATTCAATGTATACCGATCGGGCTAGCGAAACATCCACCGGCGACATAACGCCCTCCAAATGATTCGAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGAGGCATGCGGTACC
SEQ ID NO.5: 外側引子 GTGGACGTGAAAGAAACC
SEQ ID NO.6: 內側引子 GGTCATAGCTGTTTCCTGTG
SEQ ID NO.7: hr5.ie1.neo.p10PAS ATTAAGCTTCCGCGTAAAACACAATCAAGTATGAGTCATAAGCTGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAACCGAACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAACGCACGATCAGTGGATGATGTCATTTGTTTTTCAAATCGAGATGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGTGTAACGCACGATCGATTGATGAGTCATTTGTTTTGCAATATGATATCATACAATATGACTCATTTGTTTTTCAAAACCGAACTTGATTTACGGGTAGAATTCTACTTGTAAAGCACAATCAAAAAGATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTGAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAAAACACAATCAAGAAATGATGTCATTTGTTATAAAAATAAAAGCTGATGTCATGTTTTGCACATGGCTCATAACTAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGCGCGTCGATGTCTTTGTGATGCGCGCGACATTTTTGTAGGTTATTGATAAAATGAACGGATACGTTGCCCGACATTATCATTAAATCCTTGGCGTAGAATTTGTCGGGTCCATTGTCCGTGTGCGCTAGCATGCCCGTAACGGACCTCGTACTTTTGGCTTCAAAGGTTTTGCGCACAGACAAAATGTGCCACACTTGCAGCTCTGCATGTGTGCGCGTTACCACAAATCCCAACGGCGCAGTGTACTTGTTGTATGCAAATAAATCTCGATAAAGGCGCGGCGCGCGAATGCAGCTGATCACGTACGCTCCTCGTGTTCCGTTCAAGGACGGTGTTATCGACCTCAGATTAATGTTTATCGGCCGACTGTTTTCGTATCCGCTCACCAAACGCGTTTTTGCATTAACATTGTATGTCGGCGGATGTTCTATATCTAATTTGAATAAATAAACGATAACCGCGTTGGTTTTAGAGGGCATAATAAAAGAAATATTGTTATCGTGTTCGCCATTAGGGCAGTATAAATTGACGTTCATGTTGGATATTGTTTCAGTTGCAAGTTGACACTGGCGGCGACAAGATCGTGAACAACCAAGTGACGCGGCCGCATTTGTAAAAAAAAAATAAATAAAAATGATCGAGCAGGACGGCCTGCACGCTGGTTCTCCAGCTGCTTGGGTCGAGCGTCTGTTCGGTTACGACTGGGCTCAGCAGACCATCGGTTGCTCCGACGCTGCTGTGTTCCGTCTGTCCGCTCAGGGTCGTCCCGTGCTGTTCGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCTCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCTGCTCGTCTGTCCTGGCTGGCTACCACTGGTGTCCCTTGCGCTGCTGTCCTGGACGTGGTCACTGAGGCTGGTCGTGACTGGCTGCTGCTGGGAGAAGTGCCTGGACAGGACCTGCTGTCCAGCCACCTGGCTCCAGCTGAGAAGGTGTCCATCATGGCTGACGCTATGCGTCGTCTGCACACCCTGGACCCTGCTACCTGCCCCTTCGACCACCAAGCTAAGCACCGTATCGAGCGTGCTCGTACCCGTATGGAAGCTGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAAGAACACCAGGGACTGGCCCCTGCTGAGCTGTTCGCTCGTCTGAAGGCTCGTATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTTACTCACGGCGACGCTTGCCTGCCCAACATCATGGTCGAGAACGGTCGTTTCTCCGGTTTCATCGACTGCGGTCGTCTGGGTGTCGCTGACCGTTACCAGGATATCGCTCTGGCTACCCGTGATATCGCTGAGGAACTGGGTGGCGAGTGGGCTGACAGATTCCTGGTGCTGTACGGTATCGCTGCTCCCGACTCCCAGCGTATCGCTTTCTACCGTCTGCTGGACGAGTTCTTCTAAGCCCCTTGTAAACGCCACAATTGTGTTTGTTGCAAATAAACCCATGATTATTTGATTAAAATTGTTGTTTTCTTTGTTCATAGACAATAGTGTGTTTTGCCTAAACGGGTACC
SEQ ID NO.8: hr5.ie1.eGFP.p10PAS ATTAAGCTTCCGCGTAAAACACAATCAAGTATGAGTCATAAGCTGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAACCGAACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAACGCACGATCAGTGGATGATGTCATTTGTTTTTCAAATCGAGATGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGTGTAACGCACGATCGATTGATGAGTCATTTGTTTTGCAATATGATATCATACAATATGACTCATTTGTTTTTCAAAACCGAACTTGATTTACGGGTAGAATTCTACTTGTAAAGCACAATCAAAAAGATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTGAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAAAACACAATCAAGAAATGATGTCATTTGTTATAAAAATAAAAGCTGATGTCATGTTTTGCACATGGCTCATAACTAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGCGCGTCGATGTCTTTGTGATGCGCGCGACATTTTTGTAGGTTATTGATAAAATGAACGGATACGTTGCCCGACATTATCATTAAATCCTTGGCGTAGAATTTGTCGGGTCCATTGTCCGTGTGCGCTAGCATGCCCGTAACGGACCTCGTACTTTTGGCTTCAAAGGTTTTGCGCACAGACAAAATGTGCCACACTTGCAGCTCTGCATGTGTGCGCGTTACCACAAATCCCAACGGCGCAGTGTACTTGTTGTATGCAAATAAATCTCGATAAAGGCGCGGCGCGCGAATGCAGCTGATCACGTACGCTCCTCGTGTTCCGTTCAAGGACGGTGTTATCGACCTCAGATTAATGTTTATCGGCCGACTGTTTTCGTATCCGCTCACCAAACGCGTTTTTGCATTAACATTGTATGTCGGCGGATGTTCTATATCTAATTTGAATAAATAAACGATAACCGCGTTGGTTTTAGAGGGCATAATAAAAGAAATATTGTTATCGTGTTCGCCATTAGGGCAGTATAAATTGACGTTCATGTTGGATATTGTTTCAGTTGCAAGTTGACACTGGCGGCGACAAGATCGTGAACAACCAAGTGACGCGGCCGCATTTGTAAAAAAAAAATAAATAAAAATGGTGTCCAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGTGTCGTGCCCATCCTGGTCGAACTGGACGGCGACGTGAACGGTCACAAGTTCTCCGTGTCTGGCGAAGGCGAGGGCGACGCTACCTACGGAAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCTTGGCCTACCCTGGTCACCACTCTGACCTACGGTGTCCAGTGCTTCTCCCGTTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGATTTCTTCAAGTCCGCTATGCCCGAGGGTTACGTGCAAGAGCGTACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGTGCTGAAGTGAAGTTCGAAGGCGACACCCTCGTGAACCGTATCGAGCTGAAGGGTATCGACTTCAAGGAAGATGGAAACATCCTGGGCCACAAGCTCGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTGTACATCATGGCCGACAAGCAAAAGAACGGCATCAAAGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGTTCCGTGCAGCTGGCTGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGTCCTGTGCTGCTGCCTGACAACCACTACCTGTCCACCCAGTCCGCTCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGTGACCACATGGTGCTGCTCGAGTTCGTGACCGCTGCTGGTATCACCCTGGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGCCCCTTGTAAACGCCACAATTGTGTTTGTTGCAAATAAACCCATGATTATTTGATTAAAATTGTTGTTTTCTTTGTTCATAGACAATAGTGTGTTTTGCCTAAACGGGTACC
SEQ ID NO: 9 編碼 coBDDFVIIIXTEN (V2.0)的核苷酸序列 ATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGAGCGCCACTCCGGAATCGGGCCCAGGAAGCCCTGCCGGATCCCCGACCAGCACCGAGGAGGGAAGCCCCGCCGGGTCACCGACTTCCACTGAGGAGGGAGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAA
SEQ ID NO: 10 coBDDFVIIIXTEN (V2.0)的胺基酸序列 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNGAPTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGASSPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO: 11 coBDDFVIIIXTEN (V2.0)的信號肽 MQIELSTCFFLCLLRFCFS
SEQ ID NO: 12 BDD成熟人FVIII的胺基酸序列 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO: 13 編碼BDD成熟人FVIII的核苷酸序列 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTAC
SEQ ID NO: 14 V2.0 表現匣 mTTR482-內含子- coBDDFVIIIXTEN (V2.0)-WPRE-bGHPolyA GGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGGAATTCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTACTCGAGGCCACCATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGAGCGCCACTCCGGAATCGGGCCCAGGAAGCCCTGCCGGATCCCCGACCAGCACCGAGGAGGGAAGCCCCGCCGGGTCACCGACTTCCACTGAGGAGGGAGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAAGCGGCCGCTCATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTGCCTAGGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAAGACCATGGGCGCGCCAGGCCTGTCGACGCCCGGGCGGTACCGCGATCGCTCGCGACGCATAAAG
SEQ ID NO: 15 A1MB2增強子 GGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACC
SEQ ID NO: 16 mTTR啟動子 GATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAG
SEQ ID NO: 17 嵌合內含子 TCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTA
SEQ ID NO: 18 WPRE TCATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTG
SEQ ID NO: 19 bGHpA CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA
SEQ ID NO: 20 野生型人成熟FVIII蛋白的胺基酸序列 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO: 21 B19 WT 5’ CCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAAGATGGCGGACAATTACGTCATTTCCTGTGACGTCATTTCCTGTGACGTCACTTCCGGTGGGCGGGACTTCCGGAATTAGGGTTGGCTCTGGGCCAGCTTGCTTGGGGTTGCCTTGACACTAAGACAAGCGGCGCGCCGCTTGATCTTAGTGGCACGTCAACCCCAAGCGCTGGCCCAGAGCCAACCCTAATTCCGGAAGTCCCGCCCACCGGAAGTGACGTCACAGGAAATGACGTCACAGGAAATGACGTAATTGTCCGCCATCTTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGGTGTCTTCTTTTAAATTTT
SEQ ID NO: 22 B19 WT 3’ AAAATTTAAAAGAAGACACCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAAGATGGCGGACAATTACGTCATTTCCTGTGACGTCATTTCCTGTGACGTCACTTCCGGTGGGCGGGACTTCCGGAATTAGGGTTGGCTCTGGGCCAGCGCTTGGGGTTGACGTGCCACTAAGATCAAGCGGCGCGCCGCTTGTCTTAGTGTCAAGGCAACCCCAAGCAAGCTGGCCCAGAGCCAACCCTAATTCCGGAAGTCCCGCCCACCGGAAGTGACGTCACAGGAAATGACGTCACAGGAAATGACGTAATTGTCCGCCATCTTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGG
SEQ ID NO: 23 5’_B19_最小 CCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAGCGCGCCGCTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGGTGTCTTCTTTTAAATTTT
SEQ ID NO: 24 3’_B19_最小 AAAATTTAAAAGAAGACACCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAGCGGCGCGCTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGG
SEQ ID NO: 25 5’_GPV_最小 CTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACGTTCGTTCGCATGCGAACGAACGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAGACTCAAGGACAAGAGGATATTTTGCGCGCCAGGAAGTG
SEQ ID NO: 26 3’_GPV_最小 CACTTCCTGGCGCGCAAAATATCCTCTTGTCCTTGAGTCTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACGTTCGTTCGCATGCGAACGAACGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAG
SEQ ID NO: 27 5’_GPV_Δ186 CTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGCATGCGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAGACTCAAGGACAAGAGGATATTTTGCGCGCCAGGAAGTG
SEQ ID NO: 28 3’_GPV_Δ186 CACTTCCTGGCGCGCAAAATATCCTCTTGTCCTTGAGTCTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGCATGCGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAG
SEQ ID NO: 29 5’_GPV_Δ120 CTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCCGGTCACGTGCTTCCTGTCACGTGTTTCCGGTCGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGCATGCTCACGTGACCGGAAACACGTGACAGGAAGCACGTGACCGGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAGACTCAAGGACAAGAGGATATTTTGCGCGCCAGGAAGTG
SEQ ID NO: 30 3’_GPV_Δ120 CACTTCCTGGCGCGCAAAATATCCTCTTGTCCTTGAGTCTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCCGGTCACGTGCTTCCTGTCACGTGTTTCCGGTCACGTGAGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGGCATGCGACCGGAAACACGTGACAGGAAGCACGTGACCGGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAG
SEQ ID NO: 31 野生型人FVIII的核酸序列 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCCCAGAATTCAAGACACCCTAGCACTAGGCAAAAGCAATTTAATGCCACCACAATTCCAGAAAATGACATAGAGAAGACTGACCCTTGGTTTGCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAAATGTCTCCTCTAGTGATTTGTTGATGCTCTTGCGACAGAGTCCTACTCCACATGGGCTATCCTTATCTGATCTCCAAGAAGCCAAATATGAGACTTTTTCTGATGATCCATCACCTGGAGCAATAGACAGTAATAACAGCCTGTCTGAAATGACACACTTCAGGCCACAGCTCCATCACAGTGGGGACATGGTATTTACCCCTGAGTCAGGCCTCCAATTAAGATTAAATGAGAAACTGGGGACAACTGCAGCAACAGAGTTGAAGAAACTTGATTTCAAAGTTTCTAGTACATCAAATAATCTGATTTCAACAATTCCATCAGACAATTTGGCAGCAGGTACTGATAATACAAGTTCCTTAGGACCCCCAAGTATGCCAGTTCATTATGATAGTCAATTAGATACCACTCTATTTGGCAAAAAGTCATCTCCCCTTACTGAGTCTGGTGGACCTCTGAGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTTAGAATCAGGTTTAATGAATAGCCAAGAAAGTTCATGGGGAAAAAATGTATCGTCAACAGAGAGTGGTAGGTTATTTAAAGGGAAAAGAGCTCATGGACCTGCTTTGTTGACTAAAGATAATGCCTTATTCAAAGTTAGCATCTCTTTGTTAAAGACAAACAAAACTTCCAATAATTCAGCAACTAATAGAAAGACTCACATTGATGGCCCATCATTATTAATTGAGAATAGTCCATCAGTCTGGCAAAATATATTAGAAAGTGACACTGAGTTTAAAAAAGTGACACCTTTGATTCATGACAGAATGCTTATGGACAAAAATGCTACAGCTTTGAGGCTAAATCATATGTCAAATAAAACTACTTCATCAAAAAACATGGAAATGGTCCAACAGAAAAAAGAGGGCCCCATTCCACCAGATGCACAAAATCCAGATATGTCGTTCTTTAAGATGCTATTCTTGCCAGAATCAGCAAGGTGGATACAAAGGACTCATGGAAAGAACTCTCTGAACTCTGGGCAAGGCCCCAGTCCAAAGCAATTAGTATCCTTAGGACCAGAAAAATCTGTGGAAGGTCAGAATTTCTTGTCTGAGAAAAACAAAGTGGTAGTAGGAAAGGGTGAATTTACAAAGGACGTAGGACTCAAAGAGATGGTTTTTCCAAGCAGCAGAAACCTATTTCTTACTAACTTGGATAATTTACATGAAAATAATACACACAATCAAGAAAAAAAAATTCAGGAAGAAATAGAAAAGAAGGAAACATTAATCCAAGAGAATGTAGTTTTGCCTCAGATACATACAGTGACTGGCACTAAGAATTTCATGAAGAACCTTTTCTTACTGAGCACTAGGCAAAATGTAGAAGGTTCATATGACGGGGCATATGCTCCAGTACTTCAAGATTTTAGGTCATTAAATGATTCAACAAATAGAACAAAGAAACACACAGCTCATTTCTCAAAAAAAGGGGAGGAAGAAAACTTGGAAGGCTTGGGAAATCAAACCAAGCAAATTGTAGAGAAATATGCATGCACCACAAGGATATCTCCTAATACAAGCCAGCAGAATTTTGTCACGCAACGTAGTAAGAGAGCTTTGAAACAATTCAGACTCCCACTAGAAGAAACAGAACTTGAAAAAAGGATAATTGTGGATGACACCTCAACCCAGTGGTCCAAAAACATGAAACATTTGACCCCGAGCACCCTCACACAGATAGACTACAATGAGAAGGAGAAAGGGGCCATTACTCAGTCTCCCTTATCAGATTGCCTTACGAGGAGTCATAGCATCCCTCAAGCAAATAGATCTCCATTACCCATTGCAAAGGTATCATCATTTCCATCTATTAGACCTATATATCTGACCAGGGTCCTATTCCAAGACAACTCTTCTCATCTTCCAGCAGCATCTTATAGAAAGAAAGATTCTGGGGTCCAAGAAAGCAGTCATTTCTTACAAGGAGCCAAAAAAAATAACCTTTCTTTAGCCATTCTAACCTTGGAGATGACTGGTGATCAAAGAGAGGTTGGCTCCCTGGGGACAAGTGCCACAAATTCAGTCACATACAAGAAAGTTGAGAACACTGTTCTCCCGAAACCAGACTTGCCCAAAACATCTGGCAAAGTTGAATTGCTTCCAAAAGTTCACATTTATCAGAAGGACCTATTCCCTACGGAAACTAGCAATGGGTCTCCTGGCCATCTGGATCTCGTGGAAGGGAGCCTTCTTCAGGGAACAGAGGGAGCGATTAAGTGGAATGAAGCAAACAGACCTGGAAAAGTTCCCTTTCTGAGAGTAGCAACAGAAAGCTCTGCAAAGACTCCCTCCAAGCTATTGGATCCTCTTGCTTGGGATAACCACTATGGTACTCAGATACCAAAAGAAGAGTGGAAATCCCAAGAGAAGTCACCAGAAAAAACAGCTTTTAAGAAAAAGGATACCATTTTGTCCCTGAACGCTTGTGAAAGCAATCATGCAATAGCAGCAATAAATGAGGGACAAAATAAGCCCGAAATAGAAGTCACCTGGGCAAAGCAAGGTAGGACTGAAAGGCTGTGCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTAC
SEQ ID NO: 32 編碼 BDD-co6FVIII (V1.0)的核苷酸序列 (無XTEN) GCCACTCGCCGGTACTACCTTGGAGCCGTGGAGCTTTCATGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAACTCCCCGTGGATGCCAGATTCCCCCCCCGCGTGCCAAAGTCCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTCTTTGTCGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATCGCCAAGCCGCGCCCACCTTGGATGGGCCTCCTGGGACCGACCATTCAAGCTGAAGTGTACGACACCGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCGTCCCACCCCGTGTCCCTGCATGCGGTCGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCCGAAGGAGCTGAGTACGACGACCAGACTAGCCAGCGGGAAAAGGAGGACGATAAAGTGTTCCCGGGCGGCTCGCATACTTACGTGTGGCAAGTCCTGAAGGAAAACGGACCTATGGCATCCGATCCTCTGTGCCTGACTTACTCCTACCTTTCCCATGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGGCTGATTGGTGCACTTCTCGTGTGCCGCGAAGGTTCGCTCGCTAAGGAAAAGACCCAGACCCTCCATAAGTTCATCCTTTTGTTCGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCATGGCATTCCGAAACTAAGAACTCGCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCCTCAGCCCGCGCCTGGCCTAAAATGCATACAGTCAACGGATACGTGAATCGGTCACTGCCCGGGCTCATCGGTTGTCACAGAAAGTCCGTGTACTGGCACGTCATCGGCATGGGCACTACGCCTGAAGTGCACTCCATCTTCCTGGAAGGGCACACCTTCCTCGTGCGCAACCACCGCCAGGCCTCTCTGGAAATCTCCCCGATTACCTTTCTGACCGCCCAGACTCTGCTCATGGACCTGGGGCAGTTCCTTCTCTTCTGCCACATCTCCAGCCATCAGCACGACGGAATGGAGGCCTACGTGAAGGTGGACTCATGCCCGGAAGAACCTCAGTTGCGGATGAAGAACAACGAGGAGGCCGAGGACTATGACGACGATTTGACTGACTCCGAGATGGACGTCGTGCGGTTCGATGACGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATTCGCAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAAACCTGGGTGCACTACATCGCGGCCGAGGAAGAAGATTGGGACTACGCCCCGTTGGTGCTGGCACCCGATGACCGGTCGTACAAGTCCCAGTATCTGAACAATGGTCCGCAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGCGGTTCATGGCGTACACTGACGAAACGTTTAAGACCCGGGAGGCCATTCAACATGAGAGCGGCATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAGGTCGGCGATACCCTGCTCATCATCTTCAAAAACCAGGCCTCCCGGCCTTACAACATCTACCCTCACGGAATCACCGACGTGCGGCCACTCTACTCGCGGCGCCTGCCGAAGGGCGTCAAGCACCTGAAAGACTTCCCTATCCTGCCGGGCGAAATCTTCAAGTATAAGTGGACCGTCACCGTGGAGGACGGGCCCACCAAGAGCGATCCTAGGTGTCTGACTCGGTACTACTCCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCATCGGGACTCATTGGACCGCTGCTGATCTGCTACAAAGAGTCGGTGGATCAACGCGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCCGTGTTTGATGAAAACAGATCCTGGTACCTCACTGAAAACATCCAGAGGTTCCTCCCAAACCCCGCAGGAGTGCAACTGGAGGACCCTGAGTTTCAGGCCTCGAATATCATGCACTCGATTAACGGTTACGTGTTCGACTCGCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTCCATGAAGTCGCTTACTGGTACATTCTGTCCATCGGCGCCCAGACTGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGTTACACCTTTAAGCACAAGATGGTGTACGAAGATACCCTGACCCTGTTCCCTTTCTCCGGCGAAACGGTGTTCATGTCGATGGAGAACCCGGGTCTGTGGATTCTGGGATGCCACAACAGCGACTTTCGGAACCGCGGAATGACTGCCCTGCTGAAGGTGTCCTCATGCGACAAGAACACCGGAGACTACTACGAGGACTCCTACGAGGATATCTCAGCCTACCTCCTGTCCAAGAACAACGCGATCGAGCCGCGCAGCTTCAGCCAGAACCCGCCTGTGCTGAAGAGGCACCAGCGAGAAATTACCCGGACCACCCTCCAATCGGATCAGGAGGAAATCGACTACGACGACACCATCTCGGTGGAAATGAAGAAGGAAGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAAAATCAGTCCCCTCGCTCATTCCAAAAGAAAACTAGACACTACTTTATCGCCGCGGTGGAAAGACTGTGGGACTATGGAATGTCATCCAGCCCTCACGTCCTTCGGAACCGGGCCCAGAGCGGATCGGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAGTTCACCGACGGCAGCTTCACCCAGCCGCTGTACCGGGGAGAACTGAACGAACACCTGGGCCTGCTCGGTCCCTACATCCGCGCGGAAGTGGAGGATAACATCATGGTGACCTTCCGTAACCAAGCATCCAGACCTTACTCCTTCTATTCCTCCCTGATCTCATACGAGGAGGACCAGCGCCAAGGCGCCGAGCCCCGCAAGAACTTCGTCAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTCCAACACCATATGGCCCCGACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGACGTGGACCTTGAGAAGGATGTCCATTCCGGCCTGATCGGGCCGCTGCTCGTGTGTCACACCAACACCCTGAACCCAGCGCATGGACGCCAGGTCACCGTCCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTCACCATTTTTGACGAAACTAAGTCCTGGTACTTCACCGAGAATATGGAGCGAAACTGTAGAGCGCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCGACTTTCAAGGAGAACTATAGATTCCACGCCATCAACGGGTACATCATGGATACTCTGCCGGGGCTGGTCATGGCCCAGGATCAGAGGATTCGGTGGTACTTGCTGTCAATGGGATCGAACGAAAACATTCACTCCATTCACTTCTCCGGTCACGTGTTCACTGTGCGCAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCGCTGTACAATCTGTACCCCGGGGTGTTCGAAACTGTGGAGATGCTGCCGTCCAAGGCCGGCATCTGGAGAGTGGAGTGCCTGATCGGAGAGCACCTCCACGCGGGGATGTCCACCCTCTTCCTGGTGTACTCGAATAAGTGCCAGACCCCGCTGGGCATGGCCTCGGGCCACATCAGAGACTTCCAGATCACAGCAAGCGGACAATACGGCCAATGGGCGCCGAAGCTGGCCCGCTTGCACTACTCCGGATCGATCAACGCATGGTCCACCAAGGAACCGTTCTCGTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCTATGATTATCCACGGAATTAAGACCCAGGGCGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCCCTGTACATCTCGCAATTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGGAAGAAGTGGCAGACTTACAGGGGAAACTCCACCGGCACCCTGATGGTCTTTTTCGGCAACGTGGATTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCACCGATCATAGCCAGATATATTAGGCTCCACCCCACTCACTACTCAATCCGCTCAACTCTTCGGATGGAACTCATGGGGTGCGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCGTTGGGGATGGAATCAAAGGCTATTAGCGACGCCCAGATCACCGCGAGCTCCTACTTCACTAACATGTTCGCCACCTGGAGCCCCTCCAAGGCCAGGCTGCACTTGCAGGGACGGTCAAATGCCTGGCGGCCGCAAGTGAACAATCCGAAGGAATGGCTTCAAGTGGATTTCCAAAAGACCATGAAAGTGACCGGAGTCACCACCCAGGGAGTGAAGTCCCTTCTGACCTCGATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATTAGCAGCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAGGTCAAGGTGTTCCAGGGGAACCAGGACTCGTTCACACCCGTGGTGAACTCCCTGGACCCCCCACTGCTGACGCGGTACTTGAGGATTCATCCTCAGTCCTGGGTCCATCAGATTGCATTGCGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
SEQ ID NO: 33 編碼 coBDDFVIII的核苷酸序列 (V2.0) (無XTEN) GCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAA
SEQ ID NO: 34 V1.0 表現匣 TTP-內含子- BDDFVIIIco6XTEN (V1.0)-WPRE-bGHPolyA ATGCAGATTGAGCTGTCCACTTGTTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGCTTCTGTTTCTCCGCCACTCGCCGGTACTACCTTGGAGCCGTGGAGCTTTCATGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAACTCCCCGTGGATGCCAGATTCCCCCCCCGCGTGCCAAAGTCCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTCTTTGTCGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATCGCCAAGCCGCGCCCACCTTGGATGGGCCTCCTGGGACCGACCATTCAAGCTGAAGTGTACGACACCGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCGTCCCACCCCGTGTCCCTGCATGCGGTCGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCCGAAGGAGCTGAGTACGACGACCAGACTAGCCAGCGGGAAAAGGAGGACGATAAAGTGTTCCCGGGCGGCTCGCATACTTACGTGTGGCAAGTCCTGAAGGAAAACGGACCTATGGCATCCGATCCTCTGTGCCTGACTTACTCCTACCTTTCCCATGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGGCTGATTGGTGCACTTCTCGTGTGCCGCGAAGGTTCGCTCGCTAAGGAAAAGACCCAGACCCTCCATAAGTTCATCCTTTTGTTCGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCATGGCATTCCGAAACTAAGAACTCGCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCCTCAGCCCGCGCCTGGCCTAAAATGCATACAGTCAACGGATACGTGAATCGGTCACTGCCCGGGCTCATCGGTTGTCACAGAAAGTCCGTGTACTGGCACGTCATCGGCATGGGCACTACGCCTGAAGTGCACTCCATCTTCCTGGAAGGGCACACCTTCCTCGTGCGCAACCACCGCCAGGCCTCTCTGGAAATCTCCCCGATTACCTTTCTGACCGCCCAGACTCTGCTCATGGACCTGGGGCAGTTCCTTCTCTTCTGCCACATCTCCAGCCATCAGCACGACGGAATGGAGGCCTACGTGAAGGTGGACTCATGCCCGGAAGAACCTCAGTTGCGGATGAAGAACAACGAGGAGGCCGAGGACTATGACGACGATTTGACTGACTCCGAGATGGACGTCGTGCGGTTCGATGACGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATTCGCAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAAACCTGGGTGCACTACATCGCGGCCGAGGAAGAAGATTGGGACTACGCCCCGTTGGTGCTGGCACCCGATGACCGGTCGTACAAGTCCCAGTATCTGAACAATGGTCCGCAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGCGGTTCATGGCGTACACTGACGAAACGTTTAAGACCCGGGAGGCCATTCAACATGAGAGCGGCATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAGGTCGGCGATACCCTGCTCATCATCTTCAAAAACCAGGCCTCCCGGCCTTACAACATCTACCCTCACGGAATCACCGACGTGCGGCCACTCTACTCGCGGCGCCTGCCGAAGGGCGTCAAGCACCTGAAAGACTTCCCTATCCTGCCGGGCGAAATCTTCAAGTATAAGTGGACCGTCACCGTGGAGGACGGGCCCACCAAGAGCGATCCTAGGTGTCTGACTCGGTACTACTCCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCATCGGGACTCATTGGACCGCTGCTGATCTGCTACAAAGAGTCGGTGGATCAACGCGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCCGTGTTTGATGAAAACAGATCCTGGTACCTCACTGAAAACATCCAGAGGTTCCTCCCAAACCCCGCAGGAGTGCAACTGGAGGACCCTGAGTTTCAGGCCTCGAATATCATGCACTCGATTAACGGTTACGTGTTCGACTCGCTGCAACTGAGCGTGTGCCTCCATGAAGTCGCTTACTGGTACATTCTGTCCATCGGCGCCCAGACTGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGTTACACCTTTAAGCACAAGATGGTGTACGAAGATACCCTGACCCTGTTCCCTTTCTCCGGCGAAACGGTGTTCATGTCGATGGAGAACCCGGGTCTGTGGATTCTGGGATGCCACAACAGCGACTTTCGGAACCGCGGAATGACTGCCCTGCTGAAGGTGTCCTCATGCGACAAGAACACCGGAGACTACTACGAGGACTCCTACGAGGATATCTCAGCCTACCTCCTGTCCAAGAACAACGCGATCGAGCCGCGCAGCTTCAGCCAGAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGCACAAGTGAGTCTGCAACTCCCGAGTCCGGACCTGGCTCCGAGCCTGCCACTAGCGGCTCCGAGACTCCGGGAACTTCCGAGAGCGCTACACCAGAAAGCGGACCCGGAACCAGTACCGAACCTAGCGAGGGCTCTGCTCCGGGCAGCCCAGCCGGCTCTCCTACATCCACGGAGGAGGGCACTTCCGAATCCGCCACCCCGGAGTCAGGGCCAGGATCTGAACCCGCTACCTCAGGCAGTGAGACGCCAGGAACGAGCGAGTCCGCTACACCGGAGAGTGGGCCAGGGAGCCCTGCTGGATCTCCTACGTCCACTGAGGAAGGGTCACCAGCGGGCTCGCCCACCAGCACTGAAGAAGGTGCCTCGAGCCCGCCTGTGCTGAAGAGGCACCAGCGAGAAATTACCCGGACCACCCTCCAATCGGATCAGGAGGAAATCGACTACGACGACACCATCTCGGTGGAAATGAAGAAGGAAGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAAAATCAGTCCCCTCGCTCATTCCAAAAGAAAACTAGACACTACTTTATCGCCGCGGTGGAAAGACTGTGGGACTATGGAATGTCATCCAGCCCTCACGTCCTTCGGAACCGGGCCCAGAGCGGATCGGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAGTTCACCGACGGCAGCTTCACCCAGCCGCTGTACCGGGGAGAACTGAACGAACACCTGGGCCTGCTCGGTCCCTACATCCGCGCGGAAGTGGAGGATAACATCATGGTGACCTTCCGTAACCAAGCATCCAGACCTTACTCCTTCTATTCCTCCCTGATCTCATACGAGGAGGACCAGCGCCAAGGCGCCGAGCCCCGCAAGAACTTCGTCAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTCCAACACCATATGGCCCCGACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGACGTGGACCTTGAGAAGGATGTCCATTCCGGCCTGATCGGGCCGCTGCTCGTGTGTCACACCAACACCCTGAACCCAGCGCATGGACGCCAGGTCACCGTCCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTCACCATTTTTGACGAAACTAAGTCCTGGTACTTCACCGAGAATATGGAGCGAAACTGTAGAGCGCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCGACTTTCAAGGAGAACTATAGATTCCACGCCATCAACGGGTACATCATGGATACTCTGCCGGGGCTGGTCATGGCCCAGGATCAGAGGATTCGGTGGTACTTGCTGTCAATGGGATCGAACGAAAACATTCACTCCATTCACTTCTCCGGTCACGTGTTCACTGTGCGCAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCGCTGTACAATCTGTACCCCGGGGTGTTCGAAACTGTGGAGATGCTGCCGTCCAAGGCCGGCATCTGGAGAGTGGAGTGCCTGATCGGAGAGCACCTCCACGCGGGGATGTCCACCCTCTTCCTGGTGTACTCGAATAAGTGCCAGACCCCGCTGGGCATGGCCTCGGGCCACATCAGAGACTTCCAGATCACAGCAAGCGGACAATACGGCCAATGGGCGCCGAAGCTGGCCCGCTTGCACTACTCCGGATCGATCAACGCATGGTCCACCAAGGAACCGTTCTCGTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCTATGATTATCCACGGAATTAAGACCCAGGGCGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCCCTGTACATCTCGCAATTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGGAAGAAGTGGCAGACTTACAGGGGAAACTCCACCGGCACCCTGATGGTCTTTTTCGGCAACGTGGATTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCACCGATCATAGCCAGATATATTAGGCTCCACCCCACTCACTACTCAATCCGCTCAACTCTTCGGATGGAACTCATGGGGTGCGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCGTTGGGGATGGAATCAAAGGCTATTAGCGACGCCCAGATCACCGCGAGCTCCTACTTCACTAACATGTTCGCCACCTGGAGCCCCTCCAAGGCCAGGCTGCACTTGCAGGGACGGTCAAATGCCTGGCGGCCGCAAGTGAACAATCCGAAGGAATGGCTTCAAGTGGATTTCCAAAAGACCATGAAAGTGACCGGAGTCACCACCCAGGGAGTGAAGTCCCTTCTGACCTCGATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATTAGCAGCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAGGTCAAGGTGTTCCAGGGGAACCAGGACTCGTTCACACCCGTGGTGAACTCCCTGGACCCCCCACTGCTGACGCGGTACTTGAGGATTCATCCTCAGTCCTGGGTCCATCAGATTGCATTGCGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
SEQ ID NO: 35 V3.0 表現匣 人密碼子優化A1AT-內含子- BDDFVIIIXTEN-WPRE-bGHPolyA ATCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGAACTAGCCACTAGCCTGAGGCTGGTCAAAATTGAACCTCCTCCTGCTCTGAGCAGCCTGGGGGGCAGACTAAGCAGAGGGCTGTGCAGACCCACATAAAGAGCCTACTGTGTGCCAGGCACTTCACCCGAGGCACTTCACAAGCATGCTTGGGAATGAAACTTCCAACTCTTTGGGATGCAGGTGAAACAGTTCCTGGTTCAGAGAGGTGAAGCGGCCTGCCTGAGGCAGCACAGCTCTTCTTTACAGATGTGCTTCCCCACCTCTACCCTGTCTCACGGCCCCCCATGCCAGCCTGACGGTTGTGTCTGCCTCAGTCATGCTCCATTTTTCCATCGGGACCATCAAGAGGGTGTTTGTGTCTAAGGCTGACTGGGTAACTTTGGATGAGCGGTCTCTCCGCTCTGAGCCTGTTTCCTCATCTGTCAAATGGGCTCTAACCCACTCTGATCTCCCAGGGCGGCAGTAAGTCTTCAGCATCAGGCATTTTGGGGTGACTCAGTAAATGGTAGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGGAATTCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTACTCGAGGCCACCATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGAGCGCCACTCCGGAATCGGGCCCAGGAAGCCCTGCCGGATCCCCGACCAGCACCGAGGAGGGAAGCCCCGCCGGGTCACCGACTTCCACTGAGGAGGGAGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAAGCGGCCGCTCATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTGCCTAGGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAAGACCATGGGCGCGCCAGGCCTGTCGACGCCCGGGCGGTACCGCGATCGCTCGCGACGCATAAAG
SEQ ID NO: 36 人α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子 ATCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGAACTAGCCACTAGCCTGAGGCTGGTCAAAATTGAACCTCCTCCTGCTCTGAGCAGCCTGGGGGGCAGACTAAGCAGAGGGCTGTGCAGACCCACATAAAGAGCCTACTGTGTGCCAGGCACTTCACCCGAGGCACTTCACAAGCATGCTTGGGAATGAAACTTCCAACTCTTTGGGATGCAGGTGAAACAGTTCCTGGTTCAGAGAGGTGAAGCGGCCTGCCTGAGGCAGCACAGCTCTTCTTTACAGATGTGCTTCCCCACCTCTACCCTGTCTCACGGCCCCCCATGCCAGCCTGACGGTTGTGTCTGCCTCAGTCATGCTCCATTTTTCCATCGGGACCATCAAGAGGGTGTTTGTGTCTAAGGCTGACTGGGTAACTTTGGATGAGCGGTCTCTCCGCTCTGAGCCTGTTTCCTCATCTGTCAAATGGGCTCTAACCCACTCTGATCTCCCAGGGCGGCAGTAAGTCTTCAGCATCAGGCATTTTGGGGTGACTCAGTAAATGGTAGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAG
圖 1A- 圖 1C是根據本發明的一個實施例的用於在桿狀病毒系統中產生ceDNA的方法的示意圖。 圖 1A示出了單BAC方法的示意圖，其中將在不同基因座處編碼FVIIIXTEN和Rep基因的單一重組BEV用於在Sf9細胞中進行感染以產生ceDNA。 圖 1B示出了雙BAC方法的示意圖，其中將Sf9細胞用編碼FVIIIXTEN和/或Rep基因的重組BEV共感染以產生ceDNA。 圖 1C示出了穩定細胞株方法的示意圖，其中FVIIIXTEN表現匣穩定地整合到Sf9細胞基因體中並且通過感染編碼Rep基因的重組BEV以產生ceDNA而被挽救。
圖 2A- 圖 2B是人FVIIIXTEN表現構築體的示意圖。 圖 2A示出了根據本發明的一個實施例的表現構築體的示意性線性圖譜，所述表現構築體包含與XTEN 144肽融合的B結構域缺失（BDD）的經密碼子優化的人因子VIII（coFVIII）（FVIIIXTEN），其在肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子（mTTR482）和增強子元件（A1MB2）、雜合合成內含子（嵌合內含子）、土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）和牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號的調節下。FVIIIXTEN表現匣兩側為人博卡病毒1型（HBoV1）野生型（WT）ITR。（SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2）。 圖 2B示出了通過將FVIIIXTEN表現匣（SEQ ID NO: 3）插入pFastBac1載體（Invitrogen）中而製備的根據本發明的一個實施例的Tn7轉移載體的示意性圖譜。
圖 3A- 圖 3C是根據本發明的實施例的複製（Rep）基因表現構築體的示意圖。 圖 3A示出了合成DNA的線性示意性圖譜，所述合成DNA編碼在AcMNPV多角體蛋白啟動子下的Sf密碼子優化的HBoV1 NS1基因，隨後是SV40多腺苷酸化信號（SV40 PAS）。 圖 3B示出了通過將HBoV1 NS1合成DNA（SEQ ID NO: 4）插入pFastBac1載體（Invitrogen）中而製備的根據本發明實施例的Tn7轉移載體的示意性圖譜。 圖 3C示出了通過將HBoV1 NS1合成DNA（SEQ ID NO: 4）插入Cre-LoxP供體載體中而製備的根據本發明實施例的Cre-LoxP供體載體的示意性圖譜，所述Cre-LoxP供體載體如在桿狀病毒表現系統（美國專利申請號63/069,073）中所描述而產生，將所述專利申請出於引用以其整體併入本文。
圖 4A- 圖 4C是根據本發明的實施例的複製（Rep）基因表現構築體的示意圖。 圖 4A示出了合成DNA的線性示意性圖譜，所述合成DNA編碼在AcMNPV即時早期1（pIE1）啟動子下的Sf密碼子優化的HBoV1 NS1基因，所述啟動子之前是AcMNPV轉錄增強子 hr5元件，所述基因之後是SV40多腺苷酸化信號（SV40 PAS）。 圖 4B示出了通過將HBoV1 NS1合成DNA（SEQ ID NO: 4）插入pFastBac1載體（Invitrogen）中而製備的根據本發明實施例的Tn7轉移載體的示意性圖譜。 圖 4C示出了通過將HBoV1 NS1合成DNA（SEQ ID NO: 4）插入Cre-LoxP供體載體中而製備的根據本發明實施例的Cre-LoxP供體載體的示意性圖譜。
圖 5A- 圖 5D是根據本發明的實施例的複製（Rep）基因表現構築體的示意圖。 圖 5A示出了合成DNA的線性示意性圖譜，所述合成DNA編碼在OpMNPV即時早期2（OpIE2）啟動子下的Sf密碼子優化的HBoV1 NS1基因，隨後是SV40多腺苷酸化信號（SV40 PAS）。 圖 5B示出了合成DNA的線性示意性圖譜，所述合成DNA編碼在AcMNPV即時早期1（pIE1）啟動子下的Sf密碼子優化的HBoV1 NS1基因，隨後是SV40多腺苷酸化信號（SV40 PAS）。 圖 5C示出了通過將HBoV1 NS1合成DNA（SEQ ID NO: 4）插入pFastBac1載體（Invitrogen）中而製備的根據本發明實施例的Tn7轉移載體的示意性圖譜。 圖 5D示出了通過將在AcMNPV即時早期1（pIE1）啟動子下的HBoV1 NS1合成DNA（SEQ ID NO: 4）插入如美國專利申請號63/069,073所述產生的Cre-LoxP供體載體中而製備的根據本發明實施例的Cre-LoxP供體載體的示意性圖譜。
圖 6A- 圖 6B示出了編碼具有HBoV1 ITR的人FVIIIXTEN的重組桿狀病毒表現載體（BEV）的產生。 圖 6A是編碼具有HBoV1 ITR的人FVIIIXTEN的重組BIVVBac桿粒選殖（BIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7）的限制酶作圖的瓊脂糖凝膠電泳圖像。 圖 6B是編碼如所指示的兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣（SEQ ID NO: 3）的重組BEV（AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7）的示意圖。
圖 7A- 圖 7F是包含人FVIIIXTEN和Rep基因表現匣的單BAC的示意圖及其確認研究。 圖 7A- 圖 7C是通過外側/內側PCR引子（SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6）篩選的BIVVBac（mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs）Polh.HBoV1.NS1 LoxP（ 圖 7A）、BIVVBac（mTTR. FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs）IE1.HBoV1.NS1 LoxP（ 圖 7B）、和BIVVBac（mTTR.FVIIIXTEN. HBoV1.ITRs）HR5.IE1.HBoV1.NS1 LoxP（ 圖 7C）的重組桿粒選殖的瓊脂糖凝膠電泳圖像。如 圖 7D- 圖 7F中的紅色箭頭所指示。 圖 7D示出了編碼如所指示的在AcMNPV多角體蛋白（pPolh）啟動子下的HBoV1 NS1和兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣的重組桿狀病毒表現載體（BEV）的示意性圖譜（AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1. NS1 LoxP）。 圖 7E示出了編碼如所指示的在AcMNPV即時早期1（pIE1）啟動子下的HBoV1 NS1、和兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣的重組BEV的示意性圖譜（AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)IE1.HBoV1. NS1 LoxP）。 圖 7F示出了編碼如所指示的在AcMNPV即時早期1啟動子（之前是AcMNPV轉錄增強子 hr5元件，pHR5.IE1）下的HBoV1 NS1、和兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣的重組BEV的示意性圖譜（AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)HR5.IE1.HBoV1.NS1 LoxP）。
圖 8A- 圖 8C示出了根據本發明的一個實施例使用單BAC方法產生人FVIIIXTEN ceDNA載體。 圖 8A是使用重組BEV在Sf9細胞中產生FVIIIXTEN ceDNA載體的單BAC方法的示意圖，所述重組BEV編碼在AcMNPV多角體蛋白啟動子下的HBoV1 NS1基因和兩側為HBoV1 ITR的人FVIIIXTEN表現匣（AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1 LoxP）。 圖 8B示出了AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1 LoxPBEV的示意性圖譜。 圖 8C是從用(AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1 LoxP)BEV的滴定病毒原液（P2）感染的Sf9細胞分離的ceDNA載體的瓊脂糖凝膠電泳圖像。對應於FVIIIXTEN ceDNA（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶由箭頭指示。
圖 9A- 圖 9D示出了包含編碼HBoV1 NS1的序列的重組桿狀病毒表現載體（BEV）的示意圖及其確認研究。 圖 9A是在AcMNPV多角體蛋白即時早期1（之前是AcMNPV轉錄增強子 hr5元件）下或OpMNPV即時早期2啟動子下的HBoV1.NS1的重組桿粒選殖的限制酶作圖的瓊脂糖凝膠電泳圖像（分別為BIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7、BIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1 Tn7和BIVVBac.OpIE2. HBoV1.NS1 Tn7）。 圖 9B示出了AcBIVVBac.Polh.HBoV1. NS1 Tn7的示意性圖譜。 圖 9C示出了AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1 Tn7的示意性圖譜。 圖 9D示出了AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1 Tn7的示意性圖譜。
圖 10A- 圖 10C示出了根據本發明的一個實施例使用雙BAC方法產生人FVIIIXTEN ceDNA載體。 圖 10A是產生FVIIIXTEN ceDNA載體的雙BAC方法的示意圖，其中用重組BEV共感染Sf9細胞，所述重組BEV編碼兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣（AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7）和/或編碼在AcMNPV多角體蛋白啟動子下的HBoV1 NS1基因（AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7）。 圖 10B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7BEV的示意性圖譜。 圖 10C是從Sf9細胞分離的ceDNA載體的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述Sf9細胞用所指示的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7BEV以恒定比率的不同MOI或恒定MOI的不同比率共感染。對應於FVIIIXTEN ceDNA載體（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶由箭頭指示。
圖 11A- 圖 11C示出了根據本發明的一個實施例使用雙BAC方法產生人FVIIIXTEN ceDNA載體。 圖 11A是產生FVIIIXTEN ceDNA載體的雙BAC方法的示意圖，其中用重組BEV共感染Sf9細胞，所述重組BEV編碼兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣（AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7）和/或編碼在AcMNPV多角體蛋白啟動子下的HBoV1 NS1基因（AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7）或在即時早期1啟動子（之前是AcMNPV轉錄增強子 hr5元件）下的HBoV1 NS1基因（AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1 Tn7）。 圖 11B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1. NS1 Tn7BEV的示意性圖譜。 圖 11C是從Sf9細胞分離的ceDNA載體的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述Sf9細胞用AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7（左圖）或AcBIVVBac.HR5.IE1.HBoV1.NS1 Tn7（右圖）BEV的不同MOI共感染。對應於FVIIIXTEN ceDNA載體（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶由箭頭指示。
圖 12A- 圖 12C示出了用於產生編碼兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣的穩定細胞株的材料。 圖 12A示出了質體的示意性圖譜，所述質體編碼在AcMNPV即時早期1（IE1）啟動子下的新黴素抗性標記，所述啟動子之前是AcMNPV轉錄增強子 hr5元件，所述新黴素抗性標記之後是AcMNPV p10多腺苷酸化信號（P10 PAS）。 圖 12B示出了質體的示意性圖譜，所述質體編碼在AcMNPV即時早期1（IE1）啟動子下的增強的綠色螢光蛋白（eGFP）標記，所述啟動子之前是AcMNPV轉錄增強子 hr5元件，所述eGFP標記之後是AcMNPV p10多腺苷酸化信號（P10 PAS）。 圖 12C示出了兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣的示意性圖譜（SEQ ID NO: 3），其被穩定地整合到Sf9細胞基因體中以產生穩定的細胞株。
圖 13A- 圖 13E示出了根據本發明的一個實施例使用雙BAC方法生產和純化FVIIIXTEN ceDNA載體的工作流程。 圖 13A示出了Sf9細胞擴增和持續時間（第0-2天）的示意圖，其中將細胞從小規模（0.5 L）到大規模培養（1.5 L）燒瓶依次放大以在無血清ESF921培養基中實現2.5至3.0 x 10 6/mL的細胞密度。 圖 13B示出了Sf9大型培養（1.5 L）燒瓶感染和培育持續時間（第2-6天）的示意圖，其中在MOI分別為0.1和0.01噬斑形成單位（pfu）/細胞的情況下，用重組BEV共感染細胞，所述重組BEV編碼兩側為HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表現匣（AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7）和/或編碼在AcMNPV多角體蛋白啟動子下的HBoV1 NS1基因（AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7）。 圖 13C示出了質體Giga Prep純化套組和瓊脂糖凝膠電泳以及處理持續時間（第6-7天）的圖像，其中每日測量感染細胞的細胞密度和活力，並且一旦細胞活力達到70%-80%，就通過低速離心沈澱細胞。通過PureLink TMHiPure Expi質體Gigaprep套組（Invitrogen）將FVIIIXTEN ceDNA載體從感染細胞沈澱中純化，並且在瓊脂糖凝膠電泳上運行等分試樣以確定FVIIIXTEN ceDNA（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和/或Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的生產力。 圖 13D示出了Bio-Rad Model 491 Prep Cell和瓊脂糖凝膠電泳以及處理持續時間（第7-12天）的圖像，其中將Giga-prep純化的DNA載入到Prep Cell中的製備型瓊脂糖凝膠上以將FVIIIXTEN ceDNA（約8.5kb 片段）從高分子量DNA中分離。在0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠上分析以70-80 min間隔從製備型瓊脂糖凝膠電泳中收集的洗脫級分，以確定FVIIIXTEN ceDNA的純度。 圖 13E示出了瓊脂糖凝膠電泳的圖像，其中將從Prep Cell收集的級分合併，並且用1/10體積的3M NaOAc（pH 5.5）和3體積的100%乙醇沈澱以獲得純化的FVIIIXTEN ceDNA。凝膠圖像示出了與起始材料相比FVIIIXTEN ceDNA的純度，其中箭頭指示對應於FVIIIXTEN ceDNA載體（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶。
圖 14A- 圖 14B示出了通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定測量的血漿FVIII活性水平的圖示。 圖 14A示出了在以不同間隔從hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠收集的血液樣品中測量的血漿FVIII活性水平的圖形曲線，所述小鼠經由流體動力學尾靜脈注射被全身注射了1600或400 μg/kg單股FVIIIXTEN HBoV1 ITRs DNA（ssDNA）。 圖 14B示出了在以不同間隔從hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠收集的血液樣品中測量的血漿FVIII活性水平的圖形曲線，所述小鼠經由流體動力學尾靜脈注射被全身注射了80、40或12 µg/kg FVIIIXTEN HBoV1 ITRs ceDNA（ceDNA）。誤差條表示標準差。
圖 15A- 圖 15C示出了根據本發明的一個實施例用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7桿粒DNA和VP80 sgRNA共轉染的Sf9細胞的紅色螢光（上部小圖）或亮視野（下部小圖）顯微圖像。 圖 15A示出了用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7桿粒DNA和單獨Cas9共轉染的細胞的顯微圖像。 圖 15B示出了用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7桿粒DNA和sgRNA.VP80.T1共轉染的細胞的顯微圖像。 圖 15C示出了用AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7桿粒DNA和sgRNA.VP80.T2共轉染的細胞的顯微圖像。
圖 16A- 圖 16C示出了VP80KO BEV的產生。 圖 16A和 圖 16B示出了AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1ΔVP80 Tn7和AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1ΔVP80 Tn7選殖BEV的TIDE分析，以確定由CRISPR/Cas9誘導的插入缺失（indel）。 圖 16C是從Sf9細胞分離的FVIIIXTEN ceDNA載體的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述Sf9細胞用如所指示的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1ΔVP80 Tn7或AcBIVVBac.OpIE2.HBoV1.NS1ΔVP80 Tn7BEV以不同MOI共感染。對應於FVIIIXTEN ceDNA載體（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶由箭頭指示。
圖 17A- 圖 17C示出了使用雙BAC方法產生人FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA。 圖 17A是產生FVIIIXTEN ceDNA載體的雙BAC方法的示意圖。 圖 17B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7BEV的示意性圖譜。 圖 17C是從Sf9細胞分離的FVIIIXTEN ceDNA載體的瓊脂糖凝膠電泳圖像，對所述Sf9細胞在1.0、2.0、3.0、4.0或5.0 MOI下用AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs Tn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1 Tn7BEV共感染。對應於FVIIIXTEN ceDNA載體（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶由箭頭指示。
圖 18A- 圖 18D示出了使用單BAC方法產生人FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA載體。 圖 18A是在Sf9細胞中產生FVIIIXTEN ceDNA載體的單BAC方法的示意圖。 圖 18B示出了AcBIVVBac（mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs）Polh.HBoV1.NS1 LoxPBEV的示意性圖譜。 圖 18C是從在Sf9細胞中擴增到P2的選殖HBoV1單BAC BEV分離的ceDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖像。 圖 18D是從在0.1、0.2、0.3、0.4或0.5 MOI下用HBoV1單BAC BEV感染的Sf9細胞分離的ceDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖像。對應於FVIIIXTEN ceDNA（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶由箭頭指示。
圖 19A- 圖 19C示出了體內HBoV1 ssDNA和ceDNA的產生和測試。 圖 19A是單股DNA（ssDNA）FVIIIXTEN HBoV1的瓊脂糖凝膠電泳圖像。 圖 19B是FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖像。 圖 19C示出了ssFVIIIXTEN和ceFVIIIXTEN的歸一化為占正常值百分比的FVIII表現水平。誤差條表示標準差。
圖 20A- 圖 20B示出了FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA的單體和多聚體形式的測試。 圖 20A是FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA的單體和多聚體形式的瓊脂糖凝膠電泳圖像。 圖 20B示出了在用FVIIIXTEN HBoV1 ceDNA的單體和多聚體形式注射的小鼠中歸一化為占正常值百分比的FVIII表現水平。誤差條表示標準差。
圖 21A- 圖 21C示出了肝特異性mTTR和人A1AT啟動子驅動FVIIIXTEN在HBoV1 ITR構築體中表現的測試。 圖 21A是兩側為HBoV1 WT ITR的具有肝特異性mTTR或A1AT啟動子的FVIIIXTEN表現匣的示意圖。 圖 21B是如所述通過限制酶消化產生的單股DNA（ssDNA）FVIIIXTEN HBoV1的瓊脂糖凝膠電泳圖像。 圖 21C示出了在用圖21A中所示的mTTR或A1AT啟動子構築體注射的小鼠中歸一化為占正常值百分比的FVIII表現水平。誤差條表示標準差。
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Claims (74)

  1. 一種核酸分子，其包含位於包含異源多核苷酸序列的基因匣兩側的第一反向末端重複序列（ITR）和第二ITR，其中： 所述第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約75%相同的多核苷酸序列，並且所述第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約75%相同的多核苷酸序列。
  2. 如請求項1所述的核酸分子，其中所述第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同的多核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2所述的核酸分子，其中所述第一ITR包含SEQ ID NO: 1中所示的多核苷酸序列。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的核酸分子，其中所述第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同的多核苷酸序列。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的核酸分子，其中所述第二ITR包含SEQ ID NO: 2中所示的多核苷酸序列。
  6. 如請求項5所述的核酸分子，其中所述第一ITR包含SEQ ID NO: 1中所示的多核苷酸序列，並且所述第二ITR包含SEQ ID NO: 2中所示的多核苷酸序列。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的核酸分子，其還包含啟動子。
  8. 如請求項7所述的核酸分子，其中所述啟動子是組織特異性啟動子。
  9. 如請求項7或8所述的核酸分子，其中所述啟動子驅動所述異源多核苷酸序列在器官或組織中的表現，其中所述器官或組織包括肌肉、中樞神經系統（CNS）、眼睛、肝臟、心臟、腎臟、胰腺、肺、皮膚、膀胱、泌尿道、脾臟、髓系細胞譜系和淋巴樣細胞譜系或其任何組合。
  10. 如請求項7-9中任一項所述的核酸分子，其中所述啟動子驅動所述異源多核苷酸序列在以下細胞中的表現：肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、竇狀細胞、傳入神經元、傳出神經元、中間神經元、神經膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞、肺上皮細胞、許旺細胞、衛星細胞、感光細胞、視網膜神經節細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞或其任何組合。
  11. 如請求項7-10中任一項所述的核酸分子，其中所述啟動子定位於所述異源多核苷酸序列的5'。
  12. 如請求項7-11中任一項所述的核酸分子，其中所述啟動子是小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子（mTTR）、天然人因子VIII啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、人白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、三重四脯胺酸（TTP）啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒（CMV）啟動子、α1-抗胰蛋白酶（AAT）啟動子、肌肉肌酸激酶（MCK）啟動子、肌球蛋白重鏈α（αMHC）啟動子、肌紅蛋白（MB）啟動子、結蛋白（DES）啟動子、SPc5-12啟動子、2R5Sc5-12啟動子、dMCK啟動子、tMCK啟動子、磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子或A1AT啟動子。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列還包含內含子序列。
  14. 如請求項13所述的核酸分子，其中所述內含子序列定位於所述異源多核苷酸序列的5'。
  15. 如請求項13或14所述的核酸分子，其中所述內含子序列定位於所述啟動子的3'。
  16. 如請求項13-15中任一項所述的核酸分子，其中所述內含子序列包含合成內含子序列。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的核酸分子，其中所述基因匣還包含轉錄後調節元件。
  18. 如請求項17所述的核酸分子，其中所述轉錄後調節元件定位於所述異源多核苷酸序列的3'。
  19. 如請求項17或18所述的核酸分子，其中所述轉錄後調節元件包含土撥鼠肝炎病毒調節元件（WPRE）、微小RNA結合位點、DNA核靶向序列、TLR9抑制序列或其任何突變。
  20. 如請求項1至19中任一項所述的核酸分子，其中所述基因匣還包含3'UTR多聚(A)尾序列。
  21. 如請求項20所述的核酸分子，其中所述3'UTR多聚(A)尾序列選自bGH多聚(A)、肌動蛋白多聚(A)、血紅蛋白多聚(A)及其任何組合。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的核酸分子，其中所述基因匣還包含增強子序列。
  23. 如請求項22所述的核酸分子，其中所述增強子序列定位於所述第一ITR與所述第二ITR之間。
  24. 如請求項1至23中任一項所述的核酸分子，其中所述核酸分子從5'至3'包含：所述第一ITR、所述基因匣和所述第二ITR，其中所述基因匣包含組織特異性啟動子序列、內含子序列、異源多核苷酸序列、轉錄後調節元件和3'UTR多聚(A)尾序列。
  25. 如請求項24所述的核酸分子，其中所述基因匣從5'至3'包含：組織特異性啟動子序列、內含子序列、所述異源多核苷酸序列、轉錄後調節元件和3'UTR多聚(A)尾序列。
  26. 如請求項25所述的核酸分子，其中所述基因匣包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列。
  27. 如請求項1至26中任一項所述的核酸分子，其中所述基因匣是單股核酸。
  28. 如請求項1至26中任一項所述的核酸分子，其中所述基因匣是雙股核酸。
  29. 如請求項1至28中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼治療性蛋白質。
  30. 如請求項1至29中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼凝血因子、生長因子、激素、細胞因子、抗體、其片段或其任何組合。
  31. 如請求項1至30中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼凝血因子。
  32. 如請求項1至30中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼生長因子。
  33. 如請求項1至30中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼激素。
  34. 如請求項1至30中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼細胞因子。
  35. 如請求項1至30中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼抗體或其片段。
  36. 如請求項1至30中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼X連鎖抗肌萎縮蛋白、MTM1（肌微管素）、酪胺酸羥化酶、AADC、環水解酶、SMN1、FXN（共濟蛋白）、GUCY2D、RS1、CFH、HTRA、ARMS、CFB/CC2、CNGA/CNGB、Prf65、ARSA、PSAP、IDUA（MPS I）、IDS（MPS II）、PAH、GAA（酸性α-葡糖苷酶）、GALT、OTC、CMD1A、LAMA2或其任何組合。
  37. 如請求項1至28中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列編碼微小RNA（miRNA）。
  38. 如請求項37所述的核酸分子，其中所述miRNA下調包含以下的靶基因的表現：SOD1、HTT、RHO、CD38或其任何組合。
  39. 如請求項31所述的核酸分子，其中所述凝血因子包括因子I（FI）、因子II（FII）、因子III（FIII）、因子IV（FIV）、因子V（FV）、因子VI（FVI）、因子VII（FVII）、因子VIII（FVIII）、因子IX（FIX）、因子X（FX）、因子XI（FXI）、因子XII（FXII）、因子XIII（FXIII）、血管性血友病因子（VWF）、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、纖連蛋白、抗凝血酶III、肝素輔因子II、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑（ZPI）、纖溶酶原、α2-抗纖溶酶、組織纖溶酶原啟動物（tPA）、尿激酶、纖溶酶原啟動物抑制劑-1（PAI-1）、纖溶酶原啟動物抑制劑-2（PAI-2）或其任何組合。
  40. 如請求項1至39中任一項所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列經密碼子優化。
  41. 如請求項40所述的核酸分子，其中所述異源多核苷酸序列經密碼子優化以用於在人體內表現。
  42. 如請求項1至41中任一項所述的核酸分子，其中將所述核酸分子與遞送劑一起配製。
  43. 如請求項42所述的核酸分子，其中所述遞送劑包括脂質奈米顆粒（LNP）。
  44. 如請求項42所述的核酸分子，其中所述遞送劑包括脂質體、非脂質聚合物分子、胞內體或其任何組合。
  45. 如請求項1至44中任一項所述的核酸分子，其中所述核酸分子被配製用於靜脈內、經皮、皮內、神經內、眼內、鞘內、皮下、肺部或口服投予或其任何組合。
  46. 如請求項45所述的核酸分子，其中所述核酸分子被配製用於靜脈內投予。
  47. 如請求項1至44中任一項所述的核酸分子，其中所述核酸分子被配製用於通過原位注射投予。
  48. 如請求項1至44中任一項所述的核酸分子，其中所述核酸分子被配製用於通過吸入投予。
  49. 一種載體，其包含如請求項1至41中任一項所述的核酸分子。
  50. 一種宿主細胞，其包含如請求項1至41中任一項所述的核酸分子或如請求項49所述的載體。
  51. 如請求項50所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是昆蟲細胞。
  52. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至41中任一項所述的核酸。
  53. 一種醫藥組合物，其包含如請求項49所述的載體和醫藥上可接受的賦形劑。
  54. 一種醫藥組合物，其包含如請求項50所述的宿主細胞和醫藥上可接受的賦形劑。
  55. 一種套組，其包含如請求項1至48中任一項所述的核酸分子和用於向有需要的個體投予所述核酸分子的說明書。
  56. 一種桿狀病毒系統，其用於產生如請求項1至41中任一項所述的核酸分子。
  57. 如請求項56所述的桿狀病毒系統，其中如請求項1-41中任一項所述的核酸分子是在昆蟲細胞中產生的。
  58. 如請求項56或57所述的桿狀病毒系統，其還包含重組桿粒，其中所述重組桿粒包含變體VP80基因，使得所述桿粒展現出其編碼的蛋白質的降低的表現。
  59. 一種奈米顆粒遞送系統，其包含如請求項1至48中任一項所述的核酸分子。
  60. 一種在有需要的個體中表現異源多核苷酸序列的方法，其包括向所述個體投予如請求項1至48中任一項所述的核酸分子、如請求項49所述的載體或如請求項52-54中任一項所述的醫藥組合物。
  61. 一種治療有需要的個體的疾病或障礙的方法，其包括向所述個體投予如請求項1至48中任一項所述的核酸分子、如請求項49所述的載體或如請求項52-54中任一項所述的醫藥組合物。
  62. 一種治療出血障礙的方法，其包括： 向有需要的個體投予核酸分子， 其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列。
  63. 如請求項61或62所述的方法，其中所述障礙是血友病A。
  64. 如請求項60-63中任一項所述的方法，其中將所述核酸分子通過靜脈內、經皮、皮內、神經內、眼內、鞘內、皮下、口服、肺部或其任何組合投予。
  65. 如請求項64所述的方法，其中將所述核酸分子通過靜脈內投予。 [請求項64]如請求項60-63中任一項所述的方法，其中將所述核酸分子通過原位注射投予。
  66. 如請求項60-63中任一項所述的方法，其中將所述核酸分子通過吸入投予。
  67. 如請求項60-66中任一項所述的方法，其中所述個體是哺乳動物。
  68. 如請求項67所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
  69. 一種重組桿粒，其包含： 編碼HBoV1 Rep的序列，其中插入的HBoV1 Rep序列破壞報導基因或其功能部分的閱讀框；以及 包含核酸分子的異源序列，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 3、9、14、33或35的核苷酸序列。
  70. 重組桿粒組，其包含第一桿粒和第二桿粒， 其中所述第一桿粒包含編碼Rep的序列，其中插入的Rep破壞報導基因或其功能部分的閱讀框；以及 其中所述第二桿粒包含異源序列，所述異源序列包含含有SEQ ID NO: 3、9、14、33或35的核苷酸序列的核酸分子。
  71. 一種包含SEQ ID NO: 3、9、14、33或35的核酸序列的穩定細胞株，其中所述核酸序列穩定地整合到所述穩定細胞株的基因體中。
  72. 一種產生封閉末端DNA（ceDNA）分子的方法，其包括用包含如請求項69所述的桿粒的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞。
  73. 一種產生封閉末端DNA（ceDNA）分子的方法，其包括用包含如請求項70所述的重組桿粒組的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞。
  74. 一種產生封閉末端DNA（ceDNA）分子的方法，其包括將編碼Rep蛋白的桿狀病毒引入如請求項71所述的穩定細胞株中。
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