ES2275699T3

ES2275699T3 - Produccion de un papilomavirus humano(hpv) quimerico.

Info

Publication number: ES2275699T3
Application number: ES01952419T
Authority: ES
Inventors: Robert S. Lowe; Craig M. Dept.Microbiol. and Immunology MEYERS; Jiaping Zhang; Michelle Kaupas; Kathrin U. Jansen
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-03
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2021-07-03
Also published as: US6841157B2; DE60124725D1; EP1309342B1; US20040043471A1; ATE345814T1; EP1309342A4; WO2002004595A2; JP2004502452A; WO2002004595A3; DE60124725T2; CA2415763A1; EP1309342A2

Abstract

Un papilomavirus quimérico infeccioso en el que los genes tempranos son del HPV-18 y los genes tardíos son de una segunda fuente.

Description

Producción de un papilomavirus humano (HPV) quimérico.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a un papilomavirus humanos quiméricos infecciosos (HPV), y a procedimientos para su producción. También incluye diversos ensayos que utilizan estos virus.

Antecedentes de la invención

La capacidad para producir papilomavirus humanos infecciosos se ha visto obstaculizada por la dificultad para propagar el virus in vivo o in vitro. Se han utilizado varios procedimientos para propagar unos pocos tipos de virus, pero no son útiles para todos los virus debido a los requisitos de replicación específicos de cada tipo.

Se han usado cultivos suspendidos para producir HPV 18 infecciosos (patente de EE.UU. 5.994.115 (Meyers); y Meyers y col., 1997 J. Virol. 71 (10): 7381-6); y HPV 31b (Meyers, y col. 1992 Science 257: 971-973 1992). La producción de HPV 11 infecciosos también se ha conseguido usando el modelo de xenotrasplante murino Kreider, y col. 1987 J. Virol. 61: 590).

Los tipos de HPV infecciosos producidos hasta la fecha representan sólo un pequeño número de los más de 80 tipos de HPV que se han identificado. Sería más deseable desarrollar un sistema mediante el cual pudieran cultivarse convenientemente otros serotipos de HPV, incluyendo HPV quiméricos. Además, sería deseable desarrollar un ensayo sensible que pudiera ser usado para detectar la presencia de infectividad y anticuerpos neutralizantes. El documento WO 00/39151 describe un ensayo para anticuerpos neutralizantes que emplea partículas viroides (VLP).

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a papilomavirus quiméricos infecciosos. En una forma de realización preferida, los papilomavirus son quimeras en las que los genes tempranos (por ejemplo, E1, E2, E3, E4, E5, E6 y E7) son del HPV 18 y los genes tardíos (L1 y L2) son de un segundo tipo de papilomavirus. Los genes tardíos, en las formas de realización preferidas, pueden incluir otros serotipos de papilomavirus humano, o incluso de papilomavirus no humanos (es decir, papilomavirus bovino BPV, papilomavirus de conejo de cola blanca CRPV y papilomavirus oral canino COPV.

En las formas de realización en las que los genes tardíos proceden de un papilomavirus humano, éstos se eligen preferiblemente del grupo formado por serotipos que están relacionados con enfermedades humanas, tales como cánceres y verrugas genitales, es decir, HPV 6a, HPV 6b, HPV 11 y HPV 16. Otros serotipos que son preferidos incluyen: HPV 1, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 41, HPV 47, HPV 51, HPV 57 y HPV 58.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para obtener un papilomavirus quimérico infeccioso que comprende:

a): preparar un papilomavirus quimérico infeccioso en el que los genes tempranos son del HPV 18 y los genes tardíos son de un segundo papilomavirus

b): preparar un cultivo celular suspendido de células epiteliales en diferenciación;

c): infectar el cultivo celular con el papilomavirus quimérico, e

d): incubar el cultivo celular en unas condiciones que faciliten la replicación vírica.

Otro aspecto más de esta invención es un ensayo para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes de papilomavirus humano en un suero que comprende:

a): poner en contacto un cultivo celular que comprende papilomavirus quimérico infeccioso con el suero; y

b): determinar si se produce la replicación del papilomavirus quimérico en el cultivo celular en presencia del suero.

En las formas de realización preferidas, esta detección se realiza poniendo en contacto el ARN de las células infectadas por el virus quimérico con la transcriptasa inversa, con objeto de obtener un ADNc. Entonces el ADNc se amplifica en un ensayo de PCR. Opcionalmente, la cantidad de ADN amplificado se compara con un grupo de control, tal como, por otro lado, una línea celular infectada de forma idéntica no expuesta al suero.

Otro aspecto más de esta invención son vectores usados para construir los virus quiméricos, y células hospedadoras que contienen los papilomavirus quiméricos infecciosos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: esquema de un procedimiento para crear un HPV quimérico.

Las Figuras 2A y 2B muestran la producción de plásmidos con secuencias quiméricas. La Figura 2A muestra un plásmido que contiene la secuencia genómica del HPV 18, con la secuencia codificante para las proteínas estructurales L1 y L2 sustituida por un sitio de clonación Bgl II.

La Figura 2B muestra la producción de un plásmido que contiene la secuencia genómica del HPV 18, con la secuencia codificante para las proteínas estructurales L1 y L2 sustituida por las proteínas homólogas del HPV 16.

Las Figuras 3A y 3B son análisis por inmunotransferencia Southern de líneas celulares clonales que contienen HPV. Se evaluaron varias líneas celulares que habían sido transfectadas con ADN quimérico de HPV 18/16 para comprobar la presencia de ADN vírico episomal. El ADN se aisló de cada línea celular, se digirió con endonucleasa de restricción Eco RI, con endonucleasa de restricción Bgl II o no se digirió, y se evaluó mediante inmunotransferencia Southern. El ADN sondeado con una sonda específica de HPV 18 (Figura 3A) mostró que los clones 2a, 3a, 3b, 3c, 4c y 5c contenían una banda de aproximadamente 8 Kb cuando se digerían con Eco RI, lo que indicaba que todas las secuencias víricas eran episomales. Se detectó una banda de 5,6 Kb tras la digestión con Bgl II, demostrando, además, que el ADN episomal contiene la secuencia codificante de las L2/L1 de HPV 16. El ADN sin digerir muestra un ADN genómico vírico en superhélice y mellado. El análisis por inmunotransferencia Southern usando una sonda específica para L2/L1 de HPV 16 (Figura 3B) confirmó la naturaleza episomal del ADN vírico y verificó la presencia de una secuencia de L2/L1 de HPV 16 de 2,4 Kb en el ADN quimérico vírico.

La Figura 4 es un Ensayo de Protección del ARN de líneas celulares clonales que contienen HPV. Se realizó un ensayo de protección de ARN sobre el ARN extraído de las líneas celulares 2a y 5c crecidas como cultivos suspendidos. Usando una ribosonda específica para L1 de HPV 16, se muestra que el clon 2c produce una gran cantidad de ARN específico de L1 de HPV 16, mientras que el clon 5a está produciendo una cantidad menor. Y1 es un ARN de control procedente de levadura digerido con ARNasas. Y2 es un ARN de control de levadura no
digerido.

La Figura 5 es una demostración de la presencia del virus quimérico infeccioso. Se infectaron células HaCat con diluciones del virus del clon quimérico 2A de HPV 18/16. Las células se recogieron después de 7 días, y la infección por el virus se detectó por la presencia de un producto de 486 pb de E1^E4 de HPV 18 en una RT-PCT anidada (flecha). Las diluciones del virus están indicadas por encima de la figura. "Falsamente" indica células que fueron infectadas falsamente.

Las Figuras 6A y 6B son una demostración de la neutralización específica del HPV 16. Se incubaron células HaCat en presencia de diluciones de sueros inmunizados con VLP de L1 de presueros de Rhesus o post HPV 16, y después se añadió el clon 2A del virus quimérico. Las células se recogieron después de 7 días, y la infección por el virus se detectó por la presencia de un producto de 486 pb de E1^E4 de HPV 18 en una RT-PCT anidada (flecha). Las diluciones del virus están indicadas por encima de la figura. Las Figuras A y B representan los resultados de dos monos Rhesus diferentes.

Según se usa a lo largo de esta memoria descriptiva y reivindicaciones, se aplican los siguientes términos:

Infeccioso: un virus es infeccioso si puede replicarse en una célula hospedadora adecuada. Esto permite distinguir el virus de una partícula viroide (VLP), que está formada por proteína(s) de cápside vacía(s) que no contiene(n) ácidos nucleicos, y por lo tanto no puede replicarse en ninguna célula.

El HPV ha sido un virus especialmente difícil de hacer crecer en un cultivo celular, dado que sus genes tempranos parecen ser activos únicamente en células no diferenciadas, mientras que sus genes tardíos (que codifican para las proteínas estructurales que forman la cápside) son activos en células diferenciadas. Sin embargo, se sabe que el HPV 18 infeccioso puede hacerse crecer en cultivos suspendidos, según se describe en el documento de EE.UU. 5.994.115.

Según esta invención, se ha averiguado que el sistema de cultivo suspendido usado para el HPV 18 estimulará el crecimiento de papilomavirus quiméricos infecciosos.

Los virus quiméricos de esta invención tienen generalmente dos fuentes para su genoma. La primera fuente contribuye a los genes víricos tempranos. Los genes tempranos codifican para, y expresan, las proteínas no estructurales del papilomavirus que son necesarias para la producción de un virus infeccioso. Estos genes incluyen E1, E1^E4 (un transcrito empalmado, parte del ARN procede de E1 y la otra de E4), E2, E3, E4, E5, E6 y E7.

Una segunda fuente de ADN aporta los genes que codifican para los genes tempranos, L1 y L2. Estas secuencias permiten la producción de las proteínas estructurales L1 y L2 que se ensamblan en partículas infecciosas del virus que contienen el ADN genómico vírico quimérico.

En esta invención, la fuente de los genes tempranos es un papilomavirus humano, el HPV 18.

La fuente de los genes tardíos puede ser cualquier papilomavirus, humano o no humano. Algunas fuentes particularmente preferidas incluyen HPV 6a, 6b, 11, 16 y otros HPV relacionados con enfermedades. Otros serotipos incluyen HPV 1, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 41, HPV 47, HPV 51, HPV 57 y HPV 58. Algunos serotipos también preferidos incluyen papilomavirus animales, especialmente aquellos papilomavirus usados en modelos de enfermedades animales, tales como el papilomavirus de conejo de cola blanca (CRPV), el papilomavirus bovino (BPV) y el papilomavirus oral canino (COPV). Todo esto es necesario para que el investigador tenga acceso a la secuencia de genes de L1 y/o L2, de forma que pueda ser clonada usando las técnicas descritas en este documento. Se conocen las secuencias de genes L de numerosos papilomavirus humanos y animales.

Por lo tanto, un aspecto de esta invención es un papilomavirus quimérico infeccioso. En las formas de realización preferidas, el papilomavirus quimérico de esta invención se elige de entre uno de los siguientes virus (la primera porción del nombre se refiere a la fuente de los genes Tempranos; la segunda porción del nombre se refiere a la fuente de los genes Tardíos): HPV18-16, HPV 18-11, HPV 18-6a, HPV18-6b, HPV 18-31, HPV 18-33, HPV 18-35, HPV 18-39, HPV 18-41, HPV 18-42, HPV 18-47, HPV 18-51, HPV 18-57, HPV 18-58, HPV 18-COPV, HPV18-BPV, HPV18-CRPV.

El genoma del virus quimérico puede ensamblarse usando plásmidos y técnicas de biología molecular estándares. En resumen, esto se consigue produciendo un fragmento de ADN que contenga la secuencia codificante de los genes estructurales del papilomavirus L1 y L2, y clonando este ADN en la ubicación apropiada de un plásmido que contenga los genes tempranos del HPV 18, necesarios para la replicación del virus.

Los virus quiméricos de esta invención se hacen crecer en un sistema de cultivo suspendido (también denominado sistema de cultivo organotípico). En resumen, se obtiene un equivalente dérmico a partir una mezcla de colágeno de tipo I y fibroblastos. Se colocan células procedentes de una línea celular derivada de células epiteliales en diferenciación en la parte superior del equivalente dérmico, y mientras están sumergidas se dejan crecer hasta confluencia. El equivalente dérmico, con las células epiteliales en su parte superior, se levanta entonces en una rejilla de alambre, en la que permanece en una interfase aire-líquido. A partir de este punto, las células epiteliales nunca entran en contacto con los medios de cultivo. La alimentación de las células epiteliales se realiza mediante difusión a través del equivalente dérmico. Las células epiteliales se estratificarán y se diferenciarán durante un periodo de aproximadamente dos semanas. Preferiblemente, se añade al medio un inductor de la cinasa de proteínas C, y las células que han conservado copias episomales del ADN vírico quimérico biosintetizarán viriones.

Uno de los usos significativos de los virus quiméricos de esta invención es en ensayos, en particular en ensayos de neutralización. Mientras que en la técnica existen ensayos que evalúan si un suero contiene anticuerpos neutralizantes, estos ensayos emplean, todos, un virus no infeccioso, o son in vivo. El ensayo de esta invención, por el contrario, puede ser realizado in vitro, lo que es mucho más conveniente para el investigador, y puede usar partículas infecciosas. Por lo tanto, es más probable que los resultados simulen lo que ocurre realmente durante una infección que lo que se produce in vitro. Adicionalmente, dado que puede usarse esencialmente el mismo procedimiento con cualquier papilomavirus quimérico, puede evaluarse fácilmente un gran número de serotipos usando un procedimiento de cultivo idéntico.

Por lo tanto, otro aspecto de esta invención es un ensayo para determinar si un anticuerpo neutralizante específico para un epítopo encontrado en la cápside de un papilomavirus está presente en una muestra, que comprende:

(a): poner en contacto lo muestra con un papilomavirus quimérico infeccioso según la invención; y

(b): determinar si la infectividad del virus quimérico está modulada.

En las formas de realización preferidas de esta invención, los genes tardíos son de HPV 6, 11 ó 16. En otras formas de realización, la muestra es una muestra de suero de un individuo del que se cree que ha estado expuesto al mismo serotipo de HPV que la fuente de los genes tardíos. Por lo tanto, por ejemplo, si uno quería determinar si un individuo tenía anticuerpos neutralizantes para el HPV 16, el virus quimérico debía tener los genes tardíos de HPV 16; un ejemplo sería una quimera de HPV 18-16. Este ensayo también es útil para discernir entre serotipos que están genéticamente muy relacionados, tales como el HPV 6 y el 11, cuyas proteínas tardías difieren sólo en unos pocos aminoácidos.

Se puede determinar si la infectividad del virus quimérico está modulada de varias formas. Un cambio en la infectividad del virus es una medida relativa, es decir, puede producirse una preparación de virus estándar en la que se comparan todos los demás tipos. En las formas de realización preferidas del ensayo de neutralización, por ejemplo, el control positivo "sin suero" es el estándar mediante el que se mide cualquier reducción en la infectividad.

Otro ensayo que es parte de esta invención detecta si un virus quimérico ha infectado realmente (es decir, ha entrado) en las células, o si simplemente se ha unido a la superficie pero todavía no ha invadido la célula. En este ensayo puede usarse un análisis mediante RT-PCR (PCR con transcriptasa inversa) del ARN de los transcritos derivados de los genes tempranos. Cuando el virus quimérico se replica en una célula humana, se crea una variante empalmada del gen E1^E4 que tiene 486 pb de largo, en lugar de varias Kb (que es la longitud del genoma vírico no empalmado). Por lo tanto, la detección de la variante empalmada puede usarse como una indicación de que se ha producido la infección. La variante empalmada E1^E4 puede ser cualquiera (las secuencias de E1 y de E4 son conocidas en la técnica). Las secuencias preferidas son:

(Los oligonucleótidos usados como cebadores en la amplificación mediante PCR están subrayados).

1

ARN E1^E4 empalmado entre los nucleótidos 929 y 3434:

2

Además, pueden introducirse genes indicadores en el ADN genómico para mejorar la capacidad de detectar la infección. Estos virus quiméricos serían útiles en la elaboración de vacunas diseñadas para desencadenar respuestas inmunes ante proteínas de papilomavirus. Además, proporcionaría una herramienta para estudiar los aspectos moleculares de la replicación vírica, y podría jugar un importante papel en el desarrollo de tratamientos terapéuticos asociados con infecciones por papilomavirus.

Los siguientes ejemplos no limitantes se presentan para ilustrar mejor la invención.

Ejemplo 1 Producción de un plásmido de transferencia HPV 18 \Delta L2/L1

Se digirieron 20 \mug del plásmido PBS-HPV 18 (del Dr. Craig Meyers, Hershey Medical Center, Hershey, Pa.) con Aatll (Boehringer Mannheim Cat# 775207). El ADN digerido se purificó en una columna Centrisep (Princeton Separations Cat# CS-901) y después se digirió con Afl II (New England Biolabs Cat# 520S). La banda de 6647 pb resultante se purificó en gel usando un kit de extracción en gel QIAEX (QIAGEN Cat#20021).

Usando los siguientes oligonucleótidos (Midland Co.) y polimerasa de ADN pfu Turbo (Strategene), se produjeron dos fragmentos de PCR:

1.: Un producto de la PCR de 720 pb que contiene el ADN genómico del HPV 18 desde el nucleótido 3542 en el sitio AatII hasta el inicio de la secuencia de L2 del HPV 18 en el nucleótido 4246. El lado 5' del fragmento de la PCR contiene un sitio de restricción AatlI, mientras que el lado 3' contiene un sitio de restricción BglII. Los oligonucleótidos usados para producir el producto de la PCR eran:

: 18 Aat II: 5' CGG CCA GAC GTC GGC TGC TAC ACG 3' (ID. SEC. Nº 1)

: 18 Bgl II B: 5' GCT AGC AGA TCT ACT TTT ATT ACA AAA ATA CAA AAA GC 3' (ID. SEC. Nº 2).

2.: Un producto de la PCR de 593 pb que contiene el ADN genómico del HPV 18 desde el nucleótido 7137 en el sitio de detención de L1 del HPV 18 hasta el sitio de restricción AflII en el nucleótido 7730. El lado 5' del fragmento de la PCR contiene un sitio de restricción BglII, mientras que el lado 3' contiene un sitio de restricción Afl II. Los oligonucleótidos usados para producir el producto de la PCR eran:

: 18 Afl II: 5' GTA TGC AAT TAG CTT AAG TAA AAA CAA AC 3' (ID. SEC. Nº 3).

: 18 Bgl II F: 5' GCT AGC AGA TCT TAT GTG TGT GTG TAT ATA TAT ATA CAT C 3' (ID. SEC. Nº 4).

Los productos de la PCR Aat II/Bgl II y Afl II/Bgl II se purificaron usando un kit de purificación QlAquick PCR (Qiagen Cat# 28104). El producto de la PCR Aat II/Bgl II se digirió con Aat II. El producto de la PCR Afl II/Bgl II se digirió con Afl II. Los productos de la PCR digeridos se purificaron usando un kit de purificación QlAquick PCR (Qiagen Cat# 28104).

El plásmido digerido con Afl II/Aat II se ligó con los dos productos de la PCR digeridos con Aat II/Bgl II y Afl II/Bgl II. La ligación resultante se digirió con Bgl II, se purificó con Genieprep y se ligó.

Se transformó DH5 \alpha (BRL Cat# 18258), y las colonias se cribaron para buscar el plásmido correcto, que tenía la secuencia de L2/L1 del HPV 18 reemplazada por un sitio de clonación Bgl II. Este nuevo plásmido de 7932 pb se denomina pBS-HPV 18 A L2/L1.

Ejemplo 2 Producción del plásmido pBS-HPV 18/16 que contiene las secuencias codificantes de L2/L1 del HPV 16

Se usaron los oligonucleótidos indicados a continuación (Midland Co.) y polimerasa de ADN pfu Turbo (Strategene) para producir un producto de la PCR de 2,9 Kb que contiene el marco abierto de lectura de L2 y L1 del HPV 16. El ADN usado para la plantilla de la PCR derivaba del ADN genómico de L1/L2 del HPV 16 de células CasKi que habían sido clonadas en pUC18. Tanto el lado 5' como el lado 3' del fragmento de la PCR contienen un sitio de restricción Bgl II. Los oligonucleótidos usados para producir el producto de la PCR fueron:

16 L2 Bgl II F: 5' GCT AGC AGA TCT ATG CGA CAC AAA CGT TCT GCA AAA CG 3' (ID. SEC. Nº 5)

16 L1 Bgl II B: 5'GCT AGC AGA TCT TTA CAG CTT ACG TIT TTT GCG TIT AGC AG 3' (ID. SEC. Nº 6).

El producto de la PCR de 2,9 Kb de L2/L1 de HPV 16 se purificó en gel usando el kit de purificación QIAEX II (QIAGEN). El producto purificado se digirió con Bgl II, se inactivó por calor y se purificó usando Genieprep (Ambion Cat# 1950).

El pBS-HPV 18 \Delta L2/L1 se digirió con Bgl II, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de gamba (Boehringer Mannheim Cat# 1758250), y se inactivó por calor con fosfatasa a 65ºC durante 15 minutos.

El producto de la PCR de 2,9 Kb digerido con Bgl II, que representa los marcos abiertos de lectura de L2 y L1 del HPV 16, se ligó con pBS-HPV 18 \Delta L2/L1 digerido con Bgl II, dando como resultado un plásmido de 10857 pb que contiene toda la secuencia genómica del HPV 18 excepto la secuencia codificante de L2/L1, que fue reemplazada por la secuencia de codificante de L2/L1 del HPV 16. Este plásmido se denominó pBS-HPV 18/16.

Ejemplo 3 Producción del plásmido pBS-HPV 18/16 que contiene las secuencias codificantes de L2/L1 del HPV 16 y un sitio Eco RI mutado.

El protocolo para producir un virus infeccioso en cultivos suspendidos requiere la liberación del ADN genómico del HPV antes de la transfección en células J2. La secuencia genómica del HPV 18 no contiene un sitio Eco RI, y se usa esta endonucleasa de restricción para liberar el ADN genómico del plásmido. El ADN quimérico del plásmido pBS-HPV 18/16 contiene un sitio Eco RI en la secuencia codificante de L2/L1 del HPV 16. Se realizó una mutagénesis dirigida usando el kit de mutagénesis Quick Change Site Directed (Strategene Cat# 200518) según las instrucciones del fabricante. Se usaron los siguientes oligos para alterar el sitio Eco RI sin modificar la secuencia de aminoácidos:

5'-CAT ACA TAC ATT CTA TGA ACT CCA CTA TTT TGG AG 3' (ID. SEC. Nº 7)

\hskip0.1cm

y

\hskip0.1cm

5' CTC CAA AAT AGT GGA GTT CAT AGA ATG TAT GTA TG 3' (ID. SEC. Nº 8)

El plásmido resultante se denominó pBS-HPV 18/16M.

Ejemplo 4 Producción del virus quimérico Protocolo de electroporación de queratinocitos con ADN vírico quimérico

Se usó esencialmente el método de cultivo suspendido descrito en la patente de EE.UU. 5.994.115 (que se incorpora al presente documento como referencia) para cultivar las células. En resumen, el procedimiento usado fue como sigue:

Se establecieron placas de células 3T3 J2 tratadas con mitomicina C (platos de 10 cm) el día antes de la electroporación. Estas células se dividieron a 1:3 y se alimentaron con medio E + FCS al 5%, y se incubaron hasta el día siguiente. Se digirió el ADN del plásmido pBS-HPV 18/16M con Eco RI para linealizar y liberar el ADN vírico quimérico genómico. El ADN vírico se extrajo con un extracto de fenol/cloroformo y un extracto de cloroformo, se precipitó con EtOH y se resuspendió a 10 \mug/10 \lambda en tampón TE [pH 8] (basado en el peso de partida). Se preparó ADN de esperma de salmón (desnaturalizado y tratado con ultrasonidos) a 10 mg/ml. Se preparó una disolución madre de BES 500 mM [pH 7,2] en agua destilada estéril.

Transfección

Se hirvió ADN de esperma de salmón durante 5 minutos e inmediatamente se colocó en hielo y 10 \lambda de ADN de plásmido digerido, y se alicuotaron 4,25 \lambda de ADN de esperma de salmón en tubos Eppendorf de 1,5 ml.

Tripsinizar y contar los queratinocitos. Resuspender usando la siguiente ecuación y formulación del medio.

células = ml de E + FCS al 10% + BES 5 mM [pH 7,2].

20 x 10^{6} células/ml.

Se elaboró una disolución celular de 250 \lambda (aproximadamente 5 X 10^{6} células) con las mezclas de ADN de más arriba. Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las disoluciones se transfirieron a una cubeta de electroporación (BIO-RAD Gene Pulser Cuvette; cat# 165-2088). La electroporación tuvo lugar a 210 v/960 \muFd usando un BIO-RAD Gene Pulser. Entonces las células se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Después, cada muestra de electroporación se estratificó en 10 ml de E + FCS al 10%; después se resuspendió aproximadamente a 300 rpm durante 10 minutos. Cada muestra se resuspendió en 6 ml de E + FCS al 10%.

Las células J2 tratadas con mitomicina se realimentaron con E + FCS al 10% (aproximadamente 8 ml), después se colocaron en placas de células J2 tratadas con mitomicina.

Al día siguiente las placas se realimentaron con 10 ml de E + FCS al 10% + EGF, y se realimentaron cada 2 días durante aproximadamente 7 días usando E + FCS al 10% + EGF. Después de este tiempo, las placas se alimentaron cada 2 días con E + FCS al 5%+ EGF. Los alimentadores tratados con mitomicina C estaban en los cultivos.

Ejemplo 5 Producción de cultivos suspendidos

Se produjeron cultivos suspendidos para mantener el ADN vírico en un estado episomal y para producir cultivos madre de virus infecciosos. Se tripsinizaron células alimentadoras J2, y la concentración de células viables se determinó mediante una tinción con trypan blue. Para cada suspendido se usó un total de 6,25 x 10^{5} células/ml.

Las células J2 se centrifugaron durante 6 min y se resuspendieron a 6,25 x 10^{5} células/ml en tampón de reconstitución. Se añadió colágeno de rabo de rata (de tipo I) a cada tubo, junto con 3 \mul de NaOH 10 N por ml de mezcla de colágeno por tubo. Los tubos se mezclaron invirtiéndolos durante 5 min. Se alicuotaron 2,5 ml a cada pocillo de una placa en grupos de 6 pocillos, y las placas se incubaron a 37ºC durante 12-16 h.

Se añadieron 2 ml de medio E al pocillo y se incubó. Se sembraron células epiteliales en el suspendido a una concentración de aproximadamente 0,5-1,0 x 10^{6} células epiteliales por suspendido. Se incubaron a 37ºC durante 4 h hasta el día siguiente y el medio se reemplazó cuando fue necesario.

Las células se dejaron crecer hasta confluencia, después se colocó una rejilla de alambre en una placa de Petri de 100 mm. El gel de colágeno se levantó sobre la rejilla de alambre, y se añadió medio E hasta que la zona inferior de la rejilla estuviera llena de medio, pero no se permitió que el medio atravesara los orificios de la rejilla. Las células epiteliales se dejaron estratificar y diferenciar en la interfase aire/líquido.

Para su análisis, se recogieron los suspendidos fijándolos en paraformaldehído al 4%, y el suspendido se incluyó en parafina. Se cortaron secciones de 4 \muM para una inmunohistoquímica.

El ADN celular total se aisló de las células infectadas mediante un análisis por inmunotransferencia Southern. El ARN se aisló de las células infectadas mediante ensayos de protección de ARN.

Los viriones se purificaron de los cultivos suspendidos mediante gradientes isopícnicos en CsCl y se usaron para un análisis por EM, así como en ensayos de infectividad y de neutralización.

Ejemplo 6 Ensayos de infectividad y de neutralización

Se sembraron células HaCat en placas de 12 pocillos a una densidad de 10^{5} células/pocillo, con medio de crecimiento (suero bovino fetal al 10% (Gibco), DMEM con abundante glucosa (Gibco), 1 X penicilina y estreptomicina). Al día siguiente se aspiró el medio de las células, y se colocaron en las células 100 \mul de diluciones madre de virus diluidas seriadamente en Optimem (Gibco) y se incubaron durante 1 hora en una estufa de incubación a 37ºC y un 5% de CO_{2}. Para el ensayo de neutralización se añadieron sueros de prueba a las células antes de la adición del virus. Después de la adsorción del virus se añadió medio nuevo a los pocillos, y las células se incubaron durante 7 días adicionales. Entonces se aisló el ARN total de las células con Trizol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Se usaron 2 \mug de ARN total en una reacción de RT-PCR de una sola etapa (Titan One Tube RT-PCR System, Boehringer Mannheim). Los oligonucleótidos usados en la RT-PCR fueron:

: Cebador directo; nt 530-552: 5' CAA CCG AGC ACG ACA GGA ACG AC 3' (ID. SEC. Nº 9) y

: Cebador inverso; nt 3603-3582: 5' CAG GTC CAC AAT GCT GCT TCT C 3' (ID. SEC. Nº 10)

La etapa de RT se realizó a 50ºC durante 30 minutos. Ésta fue seguida por una reacción de PCR con las siguientes condiciones: 95ºC, 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 95ºC, 15 segundos; 55ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 30 segundos, y una extensión final de 72ºC, 7 minutos. Se retiraron 2 \mul de la primera reacción de RT-PCR y se usaron en una subsiguiente reacción de PCR con cebadores oligonucleotídicos anidados (oligonucleótidos 5' TCC AAC GAC GCA GAG AAA CAC 3' (cebador directo; nt 553-573) (ID. SEC. Nº 11) y 5' GAG TCC ACA GTG TCC AGG TC 3' (cebador inverso; nt 3578-3558) (ID. SEC. Nº 12).

Las condiciones de la segunda reacción de PCR fueron como sigue: 96ºC, 60 segundos, seguido de 30 ciclos de 94ºC, 15 segundos; 65ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 30 segundos, y una extensión final de 72ºC, 7 minutos. Los productos de la PCR anidados se visualizaron en un gel de agarosa al 1% que contenía EtBr. La presencia de un producto de la PCR de 486 pb demuestra que las células HaCat fueron infectadas por el virus, que producía un transcrito empalmado E1^E4 específico del HPV 18.

Ejemplo 7 Producción de líneas celulares que contienen ADN quimérico del HPV 18/16.

Se evaluaron varias líneas celulares que habían sido transfectadas con ADN quimérico del HPV 18/16 para comprobar la presencia del ADN vírico episomal. Se aisló el ADN de cada línea celular, se digirió con endonucleasa de restricción Eco RI, con endonucleasa de restricción Bgl II o no se digirió, y se evaluó mediante una inmunotransferencia Southern. Eco RI linealizará el ADN vírico genómico, dando como resultado una banda de 7,9 Kb si el ADN es episomal, mientras que Bgl II liberará la secuencia codificante de 2,4 Kb de L2/L1 del HPV 16 del ADN vírico genómico quimérico. El análisis por inmunotransferencia Southern del ADN sondeado con una sonda específica del HPV 18 demostró que los clones 2a, 3a, 3b, 3c, 4c y 5c contenían una banda de aproximadamente 8 Kb cuando se digerían con Eco RI, lo que indicaba que todas las secuencias víricas eran episomales. Se detectó una banda de 5,6 Kb tras la digestión con Bgl II, demostrando adicionalmente que el ADN episomal contiene la secuencia codificante de L2/L1 del HPV 16. El ADN sin digerir muestra un ADN vírico genómico en superhélice y mellado. El análisis por inmunotransferencia Southern usando una sonda específica para L2/L1 de HPV 16 confirmó la naturaleza episomal del ADN vírico y verificó la presencia de la secuencia de 2,4 Kb de L2/L1 del HPV 16 en el ADN vírico
quimérico.

Ejemplo 8 Demostración de la transcripción de L1 de HPV 16.

Con objeto de determinar si la secuencia codificante de L1 de HPV 16 estaba siendo transcrita, se realizó un ensayo de protección del ARN realizado sobre el ARN extraído de las líneas celulares 2a y 5c crecidas como cultivos suspendidos. Usando una ribosonda específica de L1 de HPV 16 se muestra que el clon 2c está produciendo una gran cantidad de ARN específico de L1 de HPV 16, mientras que el clon 5a está produciendo una cantidad menor.

Y1 es un ARN de control derivado de levadura digerido con ARNasas. Y2 es un ARN de control de levadura no digerido. Como se esperaba, no se detectó ARN cuando se usó una sonda específica para L1 de HPV 18.

Ejemplo 9 Análisis inmunohistoquímico de los clones

Se analizaron los cultivos suspendidos de cuatro clones mediante inmunohistoquímica para comprobar la presencia de la proteína L1 del HPV 16. Los cultivos suspendidos de los clones 2a y 3a muestran muchas más células positivas en L1 de HPV 16 que los clones 5c y 5e. Interesantemente, los clones 2a y 3a también muestran un mayor número de coilocitos, y presentan un fenotipo más anormal que los clones 5c y 5e. Estos resultados son coherentes con el hecho de que 2a contenía más ADN genómico vírico y ARN de L1 de HPV 16 que el clon 5c.

Ejemplo 10 Infectividad del virus quimérico HPV 18/16

Con objeto de determinar si se había producido un virus quimérico infeccioso mediante cultivos suspendidos que contienen copias episomales del ADN genómico del HPV 16/18 quimérico, se infectó una línea celular de queratinocitos humanos (HaCat) con diluciones seriadas del virus purificado a partir de los clones 2a y 5c. Se usó la detección de un transcrito empalmado de 486 pb E1^E4 del HPV 18 mediante una amplificación por RT-PCR anidada para demostrar la infección de las células HaCat in vitro. El virus quimérico HPV 18/16 aislado del clon 2a todavía se detectaba a una dilución de 1:800, mientras que el virus derivado del clon 5c sólo se detectaba a una dilución de 1:50. Esto es coherente con los resultados previos, que demuestran que el clon 5c contenía menos ADN genómico vírico, ARN de L1 de HPV 16 y proteína L1 de HPV 16 que el clon 2a. No se detectó ningún virus en el ARN aislado de células HaCat infectado falsamente, lo que demuestra la especificidad de éste ensayo. Estos resultados demuestran por primera vez la capacidad de producir virus HPV quiméricos infecciosos.

Ejemplo 11 Neutralización específica del virus HPV 16

Estábamos interesados en observar si este virus quimérico HPV 18/16, infeccioso que contiene las proteínas estructurales L2 y L1 del HPV 16, podía ser neutralizado mediante sueros policlonales específicos para el HPV 16. Se incubaron células HaCat en presencia de diluciones de presueros de Rhesus o de sueros inmunizados con VLP de L1 post HPV 16, y después se añadió una dilución 150 ó 1:100 de la disolución madre de virus quimérico. Después de 1 hora de incubación se añadió medio a las células, y las células se cultivaron durante 7 días adicionales. Se aisló el ARN total y se analizó mediante RT-PCR para comprobar la presencia de un transcrito empalmado E1^E4 de 486 pb del HPV 18, que indicaba que se había producido la infección por el virus. Los sueros post-inmunización de los dos Rhesus fueron capaces de inhibir la infección vírica a unas diluciones de 1:10 y 1:100. Uno de los dos sueros neutralizó el virus a 1:1000. Diluciones similares de los presueros no tuvieron efecto sobre la infectividad, lo que demuestra que la neutralización del virus no es debida a efectos no específicos del suero. La neutralización con sueros inmunes producidos contra las VLP del HPV 18 tampoco tuvo efecto, demostrando adicionalmente la especificidad de los resultados.

<110> Merck & Co., Inc.

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<120> PRODUCCIÓN DE PAPILOMAVIRUS HUMANO QUIMÉRICO

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<130> 20708 PCT

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<150> 60/216.556

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<151> 2000-07-07

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

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<170> FastSEQ para Windows, Versión 4.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggccagacg tcggctgcta cacg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctagcagat ctacttttat tacaaaaata caaaaagc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtatgcaatt agcttaagta aaaacaaac

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctagcagat cttatgtgtg tgtgtatata tatatacatc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctagcagat ctatgcgaca caaacgttct gcaaaacg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctagcagat ctttacagct tacgttttt gcgtttagca g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catacataca ttctatgaac tccactattt tggag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccaaaata gtggagttca tagaatgtat gtatg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Sonda para PCR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaccgagca cgacaggaac gac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggtccaca atgctgcttc tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccaacgacg cagagaaaca c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtccacag tgtccaggtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Papilomavirus humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Papilomavirus humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

4

Claims

1. Un papilomavirus quimérico infeccioso en el que los genes tempranos son del HPV-18 y los genes tardíos son de una segunda fuente.

2. Un papilomavirus según la Reivindicación 1 en el que los genes tardíos son una fuente elegida del grupo constituido por HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, HPV 31, HPV 33, HPV 35 HPV 39, HPV 41, HPV 42, HPV 47, HPV 51, HPV 57, HPV 58, papilomavirus bovino, papilomavirus de conejo de cola blanca y papilomavirus canino.

3. Un vector que codifica para un papilomavirus quimérico infeccioso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Una célula hospedadora que comprende un papilomavirus quimérico infeccioso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

5. Un procedimiento para obtener un papilomavirus quimérico infeccioso que comprende:

(a): preparar un papilomavirus quimérico en el que los genes tempranos son del HPV-18 y los genes tardíos son de una segunda fuente de papilomavirus;

(b): preparar un cultivo de células suspendido de células epiteliales en diferenciación;

(c): infectar el cultivo celular con el papilomavirus quimérico,

(d): incubar el cultivo celular en unas condiciones que faciliten la replicación vírica, y

(e): recoger el papilomavirus quimérico resultante.

6. Un procedimiento según la Reivindicación 5 en el que los genes tardíos son de una fuente elegida del grupo constituido por: HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, papilomavirus bovino, papilomavirus de conejo de cola blanca y papilomavirus canino.

7. Un ensayo para detectar la presencia de un anticuerpo neutralizante de un papilomavirus humano en un suero que comprende:

(a): poner en contacto un cultivo celular que comprende papilomavirus quimérico infeccioso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 con el suero; y

(b): determinar si se produce la replicación del papilomavirus quimérico en el cultivo celular en presencia del suero.

8. Un procedimiento según la Reivindicación 7 en el que la etapa (b) comprende poner en contacto ácidos nucleicos del virus quimérico con una transcriptasa inversa, y amplificar el ADNc resultante.

9. Un procedimiento según la Reivindicación 8 que comprende además comparar la cantidad de ADNc obtenida con la de una célula de control.