JP2004502452A - キメラヒトパピローマウイルスの製造 - Google Patents
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Abstract
本発明は感染性キメラパピローマウイルス、特に初期遺伝子がヒトパピローマウイルス(HPV)18に由来し、後期遺伝子が別のHPVに由来するものに関する。本発明はラフト細胞培養でウイルスを培養する方法と、これらのキメラウイルスを利用するアッセイにも関する。
Description
【0001】
発明の技術分野
本発明は感染性キメラヒトパピローマウイルス(HPV)とその製造方法に関する。本発明はこれらのウイルスを利用する種々のアッセイにも関する。
【0002】
発明の背景
感染性ヒトパピローマウイルスはin vivo又はin vitroウイルス増殖が困難であるため、作製能が阻まれている。少数のウイルス型を増殖させるために数種の方法が利用されているが、複製要件が型毎に固有であるため、これらの方法は全ウイルスに有用ではない。感染性HPV18(米国特許第5,994,115号(Meyers)及びMeyersら,1997 J.Virol.71(10):7381−6)及びHPV31b(Meyersら,1992 Science 257:971−973,1992)を作製するためにラフト培養が使用されている。異種移植マウスモデルを使用して感染性HPV11の作製も行われている(Kreiderら,1987 J.Virol.61:590)。
【0003】
現在までに作製されている感染性HPVの型は同定されている80種を越えるHPV型のうちのほんの少数に過ぎない。キメラHPVを含む他のHPV血清型を簡便に培養できるシステムを開発することが最も望ましい。更に、感染性および中和抗体の存在を検出するために使用可能な感度の高いアッセイを開発することも望ましい。
【0004】
発明の詳細な説明
本発明は、感染性キメラパピローマウイルスに関する。1つの好ましい実施態様において、パピローマウイルスは、初期遺伝子(例えばE1、E2、E3、E4、E5、E6及びE7)が第1のパピローマウイルスに由来し、後期遺伝子(L1及びL2)が第2のパピローマウイルス型に由来するキメラである。1つの好ましい実施態様において、初期遺伝子はヒトパピローマウイルス(HPV)に由来し、より好ましい態様ではHPV18に由来する。好ましい実施態様において、後期遺伝子は他のヒトパピローマウイルス血清型又は非ヒトパピローマウイルス(即ちウシパピローマウイルスBPV、ワタオウサギパピローマウイルスCRPV、及びイヌ口腔パピローマウイルスCOPV)を含んでいてもよい。
【0005】
後期遺伝子がヒトパピローマウイルスに由来する態様において、後期遺伝子は生殖器癌及び疣贅等のヒト疾患に関連する血清型、即ちHPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16及びHPV18からなる群から選択することが好ましい。他の好ましい血清型としては、HPV1、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV41、HPV47、HPV51、HPV57及びHPV58が挙げられる。
【0006】
本発明の別の態様は感染性キメラパピローマウイルスの取得方法であり、
(a)初期遺伝子が第1の型のパピローマウイルスに由来し、後期遺伝子が第2のパピローマウイルスに由来するキメラパピローマウイルスを作製する段階と、
(b)分化しつつある上皮細胞のラフト細胞培養物を作製する段階と、
(c)細胞培養物にキメラパピローマウイルスを感染させる段階と、
(d)ウイルス複製を維持する条件下で細胞培養物をインキュベートする段階を含む。
【0007】
本発明の更に別の態様は血清中のヒトパピローマウイルス中和抗体の存在を検出するためのアッセイであり、
(a)感染性キメラパピローマウイルスを含む細胞培養物を血清と接触させる段階と、
(b)血清の存在下に細胞培養物内でキメラパピローマウイルス複製が起こるか否かを決定する段階を含む。
【0008】
好ましい実施態様において、この検出はキメラウイルスを感染させた細胞からのRNAを逆転写酵素と接触させてcDNAを得ることにより実施される。その後、cDNAをPCRアッセイで増幅する。場合により、増幅したDNAの量を対照群(例えば同様に感染させるが、血清に暴露していない細胞系)と比較する。
【0009】
本発明の更に別の態様は、キメラウイルスを構築するために使用するベクターと、感染性キメラパピローマウイルスを含む宿主細胞である。
【0010】
図面の簡単な説明
図1は、キメラHPVの作製方法の概要図である。
【0011】
図2A及び2Bはキメラ配列をもつプラスミドの作製を示す。図2Aは、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をBglIIクローニング部位で置換したプラスミドを示す。図2Bは、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をHPV16の相同タンパク質で置換したプラスミドを示す。
【0012】
図3A及び3Bは、HPVを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。HPV18/16キメラDNAをトランスフェクトした数種の細胞系についてエピソームウイルスDNAの有無を調べた。DNAを各細胞系から抽出し、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ又はBglII制限エンドヌクレアーゼで消化するか又は消化せずにサザンブロットにより評価した。HPV18特異的プローブ(図3A)でDNAを探査した処、クローン2a、3a、3b、3c、4c及び5cは、EcoRIで消化した場合には約8kbのバンドを含んでいることが判明し、全ウイルス配列はエピソームであることが明らかになった。BglIIで消化した場合には5.6Kbのバンドが検出され、エピソームDNAがHPV16L2/L1コーディング配列を含むことが更に立証された。未消化DNAはスーパーコイル及びニックゲノムウイルスDNAを示す。HPV16L2/L1特異的プローブ(図3B)を使用したサザンブロット分析により、ウイルスDNAはエピソーム種であることが確認され、キメラウイルスDNA内に2.4Kb HPV16L2/L1配列が存在することが実証された。
【0013】
図4は、HPVを含むクローン細胞系のRNAプロテクションアッセイである。ラフト培養物として増殖させた細胞系2a及び5cから抽出したRNAでRNAプロテクションアッセイを実施した。HPV16L1特異的リボプローブを使用すると、クローン2aは多量のHPV16L1特異的RNAを産生するが、クローン5cは産生量が少ないことが判明した。Y1はRNアーゼで消化した酵母由来RNA対照である。Y2は未消化酵母RNA対照である。
【0014】
図5は、感染性キメラウイルスの存在を示すものである。HPV18/16キメラクローン2Aからのウイルスの希釈液をHaCat細胞に感染させた。7日後に細胞を回収し、486bpHPV18E1∧E4入れ子RT−PCR産物(矢印)の存在によりウイルス感染を検出した。ウイルス希釈比を図面の上部に示す。「モック(mock)」は偽感染細胞を示す。
【0015】
図6A及び6Bは、HPV16特異的中和を示す。アカゲザル免疫前血清又はHPV16L1VLP免疫後血清の希釈液の存在下にHaCat細胞をインキュベートした後、キメラウイルスクローン2Aを加えた。7日後に細胞を回収し、486bpHPV18E1∧E4入れ子RT−PCR産物(矢印)の存在によりウイルス感染を検出した。ウイルス希釈比を図面の上部に示す。図A及びBは2頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
【0016】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して以下の用語を適用する。
【0017】
感染性−適当な宿主細胞で複製できる場合にウイルスは感染性である。これは核酸を含まない空のキャプシドタンパク質から構成され、従っていかなる細胞でも複製できないウイルス様粒子(VLP)からウイルスを区別するために用いる。
【0018】
HPVは初期遺伝子が未分化細胞でしか活性でないと思われるが、(キャプシド形成のために構造タンパク質をコードする)後期遺伝子は分化細胞で活性であるため、細胞培養で特に増殖しにくいウイルスであった。しかし、参考資料として本明細書に組込む米国特許第5,994,115号に記載されているように、感染性HPV18はラフト培養で増殖できることが公知である。
【0019】
本発明によると、HPV18に使用されるラフト培養系は感染性キメラパピローマウイルスの増殖を維持することが判明した。
【0020】
本発明のキメラウイルスは一般に2つのゲノムソースをもつ。第1のソースはウイルス初期遺伝子のソースである。初期遺伝子は感染性ウイルスの産生に必要なパピローマウイルスの非構造タンパク質をコードし、これを発現する。これらの遺伝子としてはE1、E1∧E4(RNAの一部がE1から、その他の部分がE4に由来する、スプライス転写産物)、E2、E3、E4、E5、E6及びE7が挙げられる。
【0021】
第2のDNAソースは後期遺伝子L1及びL2をコードする遺伝子のソースである。これらの配列は、キメラウイルスゲノムDNAを含む感染性ウイルス粒子に組込まれるL1及びL2構造タンパク質の産生を可能にする。
【0022】
本発明の好ましい実施態様では、初期遺伝子のソースはヒトパピローマウイルスであり、特にHPV18である。しかし、他の血清型のウイルスも本発明で利用可能であり、初期遺伝子のソースとしてHPV18を挙げたのは例示の目的であり、これに限定されない。
【0023】
後期遺伝子のソースは、ヒト又は非ヒトのいかなるパピローマウイルスとすることができる。特に好ましいソースとしてはHPV6a、6b、11、16、18、他の疾患関連HPVが挙げられる。他の血清型としてはHPV1、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV41、HPV47、HPV51、HPV57及びHPV58が挙げられる。その他、動物パピローマウイルス、特にワタオウサギパピローマウイルス(CRPV)、ウシパピローマウイルス(BPV)及びイヌ口腔パピローマウイルス(COPV)等の動物疾患モデルで使用されるパピローマウイルスに由来するものも好ましい血清型である。「研究者がする必要があることのすべては、L1及び/又はL2遺伝子配列を得て、それによって、本明細書に記載の技術を使用してクローニングすることである。」多数のヒト及び動物パピローマウイルスL遺伝子の配列が公知である。
【0024】
従って、本発明の1態様は感染性キメラパピローマウイルスである。好ましい実施態様において、本発明のキメラパピローマウイルスは以下のウイルス(命名の前の部分は初期遺伝子のソースを表し、後の部分は後期遺伝子のソースを表す)即ちHPV18−16、HPV18−11、HPV18−6a、HPV18−6b、HPV18−31、HPV18−33、HPV18−35、HPV18−39、HPV18−41、HPV18−42、HPV18−47、HPV18−51、HPV18−57、HPV18−58、HPV18−COPV、HPV18−BPV、HPV18−CRPVの1種から選択される。
【0025】
キメラウイルスゲノムはプラスミドと標準分子生物学技術を使用して作製することができる。要約すると、これはパピローマウイルス構造L1及びL2遺伝子のコーディング配列を含むDNAフラグメントを作製し、ウイルス複製に必要なHPV18の初期遺伝子を含むプラスミドの適当な位置にこのDNAをクローニングすることにより行われる。
【0026】
本発明のキメラウイルスはラフト培養系(器官型培養系とも言う)で増殖させる。要約すると、I型コラーゲンとフィブロブラストの混合物から皮膚に相当するもの(以下皮膚等価物とする。)を作製する。分化しつつある上皮細胞に由来する細胞系からの細胞を皮膚等価物の表面に載せ、培地中で、飽和するまで培養する。次に、上皮細胞を表面に載せた皮膚等価物を金網上に引上げ、空気−液体界面に維持する。この時点から上皮細胞は培地に接触しなくなる。上皮細胞の補充は皮膚等価物に拡散させることにより行う。上皮細胞は約2週間で層を形成し分化する。タンパク質キナーゼCのインデューサーを培地に加え、キメラウイルスDNAのエピソームコピーを維持している細胞がビリオンを生合成するようにすることが好ましい。
【0027】
本発明のキメラウイルスの特筆すべき用途の1つはアッセイ、特に中和アッセイである。血清が中和抗体を含むか否かを評価するアッセイは当分野で利用されているが、これらのアッセイはいずれも非感染性ウイルスを利用するか又はin vivoである。これに対して、本発明のアッセイは、in vitroで実施することができ、研究者にとってはるかに簡便でしかも感染性粒子を使用することができる。従って、in vitroで生じる現象よりも感染中に実際に生じる現象に似た結果が得られ易い。更に、いかなるキメラパピローマウイルスにも本質的に同一手順を使用することができるので、同一培養方法を使用しながら多数の血清型を容易に調べることができる。
【0028】
従って、本発明の別の態様はパピローマウイルスキャプシド上に存在するエピトープに特異的な中和抗体が試料中に存在するか否かを決定するためのアッセイであり、
(a)試料を感染性キメラパピローマウイルスと接触させる段階と、
(b)キメラウイルスの感染性が変化するか否かを調べる段階を含む。
【0029】
本発明の好ましい実施態様において、感染性キメラパピローマウイルスは初期遺伝子をコードする第1の遺伝子ソースと、後期遺伝子をコードする第2の遺伝子ソースをもつ。これらの後期遺伝子はHPV6、11、16又は18に由来することが好ましい。他の態様では、試料は後期遺伝子のソースと同一血清型HPVに暴露されたとされる個体からの血清試料である。従って、例えば個体がHPV16に対する中和抗体をもつか否かを調べたいならば、キメラウイルスはHPV16後期遺伝子をもつべきであり、1例はHPV18−16キメラである。このアッセイは後期タンパク質が数個のアミノ酸しか相違しない遺伝的に密接に関連する血清型(例えばHPV6及び11)を鑑別するのにも有用である。
【0030】
キメラウイルスの感染性が変化するか否かは多数の方法で調べることができる。ウイルス感染性の変化は相対測定であり、即ち他の全型と比較する標準ウイルス調製物を作製することができる。中和アッセイの好ましい実施態様において、例えば「無血清」陽性対照は感染性の完全低下を測定する標準である。
【0031】
本発明に含まれる別のアッセイでは、キメラウイルスが実際に細胞に感染(即ち侵入)しているのか、又は単に表面に結合しているだけでまだ細胞に侵入していないかを検出する。このアッセイでは、初期遺伝子に由来するRNA転写産物のRT−PCR(逆転写酵素−PCR)を使用することができる。キメラウイルスがヒト細胞内で複製すると、(スプライスしていないウイルスゲノムの長さである)数Kbではなく、486bp長のE1∧E4遺伝子のスプライス変異体が形成される。従って、感染が生じたことの指標としてスプライス変異体の検出を使用することができる。E1∧E4スプライス変異体は任意変異体とすることができる(E1及びE4の配列は当分野で公知である)。好適配列を以下に示す(PCR増幅でプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドを下線で示す)。
【0032】
【化1】
【0033】
E1∧E4RNAはヌクレオチド929〜3434間でスプライスした。
【0034】
【化2】
【0035】
更に、感染検出能を改善すためにゲノムDNAにリポーター遺伝子を導入してもよい。これらのキメラウイルスはパピローマウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘発するように設計されたワクチンの評価に有用である。更に、ウイルス複製の分子的側面を研究するためのツールにもなり、パピローマウイルス感染に関連する治療処置の開発に重要な役割を果たすと思われる。
【0036】
以下、非限定的な実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【0037】
実施例1:HPV18ΔL2/L1トランスファープラスミドの作製
PBS−HPV18プラスミド(Hershey Medical Center,Hershey,Pa.のCraig Meyers博士から入手)20μgをAatII(Boehringer Mannheim Cat#775207)で消化した。消化したDNAをCentrisepカラム(Princeton Separations Cat#CS−901)で精製した後、AflII(New England Biolabs Cat#520S)で消化した。得られた6647bpバンドをQIAEXゲル抽出キット(QIAGEN Cat#20021)で精製した。
【0038】
下記オリゴヌクレオチド(Midland Co.)及びpfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して2つのPCRフラグメントを作製した。
【0039】
1.AatII部位のヌクレオチド3542からヌクレオチド4246のHPV18L2配列の始点までのHPV18ゲノムDNAを含む720bpPCR産物。このPCRフラグメントの5’側はAatII制限部位を含み、3’側はBglII制限部位を含む。このPCR産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
18AatII:5’CGG CCA GAC GTC GGC TGC TAC ACG3’(配列番号1)
18BglIIB:5’GCT AGC AGA TCT ACT TTT ATT ACA AAA ATA CAA AAA GC3’(配列番号2)
であった。
【0040】
2.HPV18L1の停止部位のヌクレオチド7137からヌクレオチド7730のAflII制限部位までのHPV18ゲノムDNAを含む593bpPCR産物。このPCRフラグメントの5’側はBglII制限部位を含み、3’側はAflII制限部位を含む。このPCR産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
18AflII:5’GTA TGC AAT TAG CTT AAG TAA AAA CAA AC3’(配列番号3)
18BglIIF:5’GCT AGC AGA TCT TAT GTG TGT GTG TAT ATA TAT ATA CAT C3’(配列番号4)
であった。
【0041】
AatII/BglII及びAflII/BglIIPCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen Cat#28104)で精製した。AatII/BglIIPCR産物をAatIIで消化した。AflII/BglIIPCR産物をAflIIで消化した。消化したPCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen Cat#28104)で精製した。
【0042】
AflII/AatIIで消化したプラスミドをAatII/BglII及びAflII/BglIIで消化した2種のPCR産物に連結した。得られた連結物をBglIIで消化し、Genieprepで精製し、連結した。
【0043】
DH5α(BRL Cat#18258)を形質転換し、HPV18L2/L1配列がBglIIクローニング部位で置換された適正プラスミドのコロニーをスクリーニングした。この新規7932bpプラスミドをpBS−HPV18ΔL2/L1と呼ぶ。
【0044】
実施例2:HPV16L2/L1コーディング配列を含むプラスミドpBS−HPV18/16の作製
下記オリゴヌクレオチド(Midland Co.)及びpfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用してHPV16L2及びL1オープンリーディングフレームを含む2.9KbPCR産物を作製した。PCR鋳型に使用したDNAはpUC18にクローニングしたCasKi細胞からのHPV16L1/L2ゲノムDNAに由来した。このPCRフラグメントの5’及び3’側はいずれもBglII制限部位を含む。このPCR産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
16L2BglIIF:5’GCT AGC AGA TCT ATG CGA CAC AAA CGT TCT GCA AAA CG3’(配列番号5)
16L1BglIIB:5’GCT AGC AGA TCT TTA CAG CTT ACG TTT TTT GCG TTT AGC AG3’(配列番号6)
であった。
【0045】
2.9Kb HPV16L2/L1PCR産物をQIAEX II精製キット(QIAGEN)でゲル精製した。精製産物をBglIIで消化し、熱不活化した後、Genieprep(Ambion Cat#1950)を使用して精製した。
【0046】
pBS−HPV18ΔL2/L1をBglIIで消化し、エビアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim Cat#1758250)で脱リン酸し、ホスファターゼと共に65℃で15分間熱不活化した。
【0047】
HPV16L2及びL1オープンリーディングフレームに相当するBglIIで消化した2.9KbPCR産物をBglIIで消化したpBS−HPV18ΔL2/L1に連結し、L2/L1コーディング配列をHPV16L2/L1コーディング配列で置換した以外は全HPV18ゲノム配列を含む10857bpプラスミドを得た。このプラスミドをpBS−HPV18/16と命名した。
【0048】
実施例3:HPV16L2/L1コーディング配列と突然変異EcoRI部位を含むプラスミドpBS−HPV18/16の作製
ラフト培養で感染性ウイルスを作製するプロトコールはJ2細胞へのトランスフェクション前にHPVゲノムDNAの放出を必要とする。HPV18ゲノム配列はEcoRI部位を含まないので、この制限エンドヌクレアーゼを使用してゲノムDNAをプラスミドから放出させる。キメラDNAプラスミドpBS−HPV18/16はHPV16L2/L1コーディング配列内にEcoRI部位を含む。Quick Change Site Directed mutagenesis Kit(Stratagene Cat#200518)を製造業者の指示に従って使用して部位特異的突然変異誘発を実施した。以下のオリゴヌクレオチド:5’CAT ACA TAC ATT CTA TGA ACT CCA CTA TTT TGG AG3’(配列番号7)及び5’CTC CAA AAT AGT GGA GTT CAT AGA ATG TAT GTA TG3’(配列番号8)を使用し、アミノ酸配列を変えずにEcoRI部位を改変した。得られたプラスミドをpBS−HPV18/16Mと命名した。
【0049】
実施例4:キメラウイルスの作製
キメラウイルスDNAのケラチノサイトエレクトロポレーションプロトコール (参考資料として本明細書に組込む)米国特許第5,994,115号に記載されているラフト培養法を原則的に使用して細胞を培養した。要約すると、以下の手順を使用した。
【0050】
エレクトロポレーションの前日にマイトマイシンCで処理した3T3J2細胞のプレート(10cmプレート)を準備した。これらの細胞を1:3に分割し、E培地+5%FCSで、一晩インキュベートした。pBS−HPV18/16MプラスミドDNAをEcoRIで消化して直鎖化し、ゲノムキメラウイルスDNAを放出させた。ウイルスDNAをフェノール/クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出で抽出し、EtOH沈澱させ、TE[pH8]緩衝液に10μg/10λ(初期重量に基づく)となるように再懸濁した。サケ精子DNA10mg/mlを調製(変性及び音波処理)した。滅菌蒸留水で500mM BES[pH7.2]ストックを調製した。
【0051】
トランスフェクション
サケ精子DNAを5分間煮沸し、直ぐに氷上に取り、消化プラスミドDNA10λとサケ精子DNA4.25λを1.5mlエッペンドルフチューブに分注した。
【0052】
ケラチノサイトをトリプシン処理し、計数した。以下の式と培地組成を使用して再懸濁した。
【0053】
細胞=ml(E+10%FCS+5mM BES[pH7.2])
20×106細胞/ml。
【0054】
上記からのDNA混合物を使用して250λ細胞溶液(約5×106細胞)を調製した。溶液を室温で10分間インキュベートした。溶液をエレクトロポレーションキュベット(BIO−RAD Gene Pulser Cuvette;cat#165−2088)に移した。BIO−RAD Gene Pulserを使用して210v/960μFdでエレクトロポレーションを行った。次に細胞を室温で10分間インキュベートした。
【0055】
次に各エレクトロポレーションサンプルをE+10%FCS10mlに重層した後、約300rpmで10分間遠心した。各サンプルをE+10%FCS6mlに再懸濁した。
【0056】
マイトマイシンで処理したJ2細胞にE+10%FCS(約8ml)を再補充した後、マイトマイシンCで処理したJ2細胞のプレートに播種した。
【0057】
翌日、プレートにE+10%FCS+EGF10mlを再補充し、E+10%FCS+EGFを2日おきに約7日間再補充した。その後、プレートに2日ごとにE+5%FCS+EGFを補充した。マイトマイシンCで処理したフィーダーが培養物上に得られた。
【0058】
実施例5:ラフト培養物の作製
ウイルスDNAをエピソーム状態に維持して感染性ウイルスストックを調製するためにラフト培養物を作製した。J2フィーダー細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー染色により生存細胞濃度を測定した。各ラフトに合計6.25×105細胞/mLを使用した。
【0059】
J2細胞を6分間遠心し、再構成緩衝液に6.25×105細胞/mLとなるように再懸濁した。ラット尾コラーゲン(I型)を各チューブに加えると共に、各チューブにコラーゲンミックス1ml当たり10N NaOH3μLを加えた。5分間チューブを転倒して混合した。6ウェルクラスタープレートの各ウェルに2.5mLを分注し、プレートを37℃で12〜16時間インキュベートした。
【0060】
E培地2mLをウェルに加えてインキュベートした。上皮細胞を約0.5〜1.0×106上皮細胞/ラフトの密度でラフト上に播種した。細胞を37℃で4時間〜一晩インキュベートし、必要に応じて培地を交換した。
【0061】
細胞が飽和した後、100mmペトリ皿に金網を置いた。コラーゲンゲルを金網上に引上げ、金網の下側が培地で満たされるまでE培地を加えたが、培地が金網の網目を通過しないようにした。上皮細胞を空気/液界面で層を形成させ、分化させた。
【0062】
分析のために4%パラホルムアルデヒドに固定することによりラフトを回収し、ラフトをパラフィン包埋した。免疫組織化学分析のために4μm切片を切り取った。
【0063】
サザンブロット分析のために感染細胞から全細胞DNAを抽出した。RNAプロテクションアッセイのために感染細胞からRNAを抽出した。
【0064】
ビリオンをラフト培養物からCsCl等密度勾配により精製し、EM分析と感染性及び中和アッセイに使用した。
【0065】
実施例6:感染性及び中和アッセイ
増殖培地(10%ウシ胎児血清(Gibco)、高グルコースDMEM(Gibco)、1×ペニシリン及びストレプトマイシン)を加えた12ウェルプレートにHaCat細胞を105細胞/ウェルの密度で播種した。翌日、培地を細胞から吸引し、Optimen(Gibco)で連続希釈したウイルスストック100μLを細胞上に加え、37℃5%CO2インキュベーターで1時間インキュベートした。中和アッセイのために、ウイルス添加前に試験血清を細胞に加えた。ウイルス吸着後、新鮮培地をウェルに加え、細胞を更に7日間インキュベートした。その後、Trizol(Life Technilogies)を製造業者の指示に従って使用して細胞から全RNAを抽出した。全RNA2μgを1段階RT−PCR反応(Titan One Tube RT−PCR System,Boehringer Mannheim)に使用した。RT−PCRで使用したオリゴヌクレオチドは、
順方向プライマー;nt530〜552:5’CAA CCG AGC ACG ACA GGA ACG AC3’(配列番号9)及び
逆方向プライマー;nt3603〜3582:5’CAG GTC CAC AAT GCT GCT TCT C3’(配列番号10)
であった。
【0066】
RT段階は50℃で30分間実施した。その後、95℃で5分後、95℃15秒、55℃30秒、72℃30秒を40サイクル、72℃7分間の最終伸長の条件でPCR反応を実施した。1回目のRT−PCR反応から2μLを取出し、入れ子オリゴヌクレオチドプライマー(オリゴヌクレオチド5’TCC AAC GAC GCA GAG AAA CAC3’(順方向プライマー;nt553〜573)(配列番号11)及び5’GAG TCC ACA GTG TCC AGG TC3’(逆方向プライマー;nt3578〜3558)(配列番号12))を使用した次のPCR反応に使用した。
【0067】
2回目のPCR反応の条件は96℃で60秒後、94℃15秒、65℃30秒、72℃30秒を30サイクルと、72℃7分間の最終伸長とした。EtBrを加えた1%アガロースゲルで入れ子PCR産物を可視化した。486bpPCR産物の存在はHaCat細胞がHPV18特異的E1∧E4スプライス転写産物を産生したウイルスに感染したことを示す。
【0068】
実施例7:HPV18/16キメラDNAを含む細胞系の作製
HPV18/16キメラDNAを感染させた数種の細胞系についてエピソームウイルスDNAの有無を調べた。各細胞系からDNAを抽出し、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ又はBglII制限エンドヌクレアーゼで消化するか又は消化せず、サザンブロットにより評価した。DNAがエピソームであるならばEcoRIはゲノムウイルスDNAを直鎖化して7.9Kbバンドとなるが、BglIIはキメラゲノムウイルスDNAから2.4Kb HPV16L2/L1コーディング配列を放出する。DNAをHPV18特異的プローブで探査したサザンブロットの結果、EcoRIで消化した場合にはクローン2a、3a、3b、3c、4c及び5cは約8kbバンドを含むことが判明し、全ウイルス配列はエピソームであると思われた。BglIIで消化した場合には5.6Kbバンドが検出され、エピソームDNAはHPV16L2/L1コーディング配列を含むことが更に立証された。未消化DNAはスーパーコイル及びニックゲノムウイルスDNAを示す。HPV16L2/L1特異的プローブを使用したサザンブロット分析により、ウイルスDNAはエピソーム種であることが確認され、キメラウイルスDNA内に2.4Kb HPV16L2/L1配列が存在することが実証された。
【0069】
実施例8:HPV16L1転写の立証
HPV16L1コーディング配列が転写されているか否かを調べるために、ラフト培養物として増殖させた細胞系2a及び5cから抽出したRNAでRNA保護アッセイを実施した。HPV16L1特異的リボプローブを使用すると、クローン2aは多量のHPV16L1特異的RNAを産生するが、クローン5cは産生量が少ないことが判明した。Y1はRNアーゼで消化した酵母由来RNA対照である。Y2は未消化酵母RNA対照である。予想通り、HPV18L1特異的プローブを使用した場合にはRNAは検出されなかった。
【0070】
実施例9:クローンの免疫組織化学的分析
4種のクローンのラフト培養物についてHPV16L1タンパク質の有無を免疫組織化学分析した。クローン2a及び3aのラフト培養物はクローン5c及び5eよりも多数のHPV16L1陽性細胞を示す。興味深いことに、クローン2a及び3aはクローン5c及び5eよりもコイロサイトの数も多く、表現型も異常である。これらの結果は、2aがクローン5cよりも多数のウイルスゲノムDNA及びHPV16L1RNAを含むという事実に一致している。
【0071】
実施例10:キメラHPV18/16ウイルスの感染性
キメラHPV16/18ゲノムDNAのエピソームコピーを含むラフト培養物により感染性キメラウイルスが産生されたか否かを調べるために、クローン2a及び5cからの精製ウイルスの連続希釈液をヒトケラチノサイト細胞系(HaCat)に感染させた。入れ子RT−PCR増幅による486bpHPV18E1∧E4スプライス転写産物の検出を使用してHaCat細胞のin vitroでの感染を調べた。クローン2aから抽出したHPV18/16キメラウイルスは希釈比1:800でも検出されたが、クローン5cに由来するウイルスは希釈比1:50でしか検出されなかった。これはクローン5cがクローン2aよりも少量のウイルスゲノムDNA、HPV16L1RNA及びHPV16L1タンパク質を含むという先の結果に一致している。モック感染HaCat細胞から抽出したRNAではウイルスは検出されず、このアッセイの特異性が明らかにされた。これらの結果は感染性キメラHPVウイルスを作製できることを立証した最初のものである。
【0072】
実施例11:HPV16特異的ウイルス中和
本発明者らはHPV16L2及びL1構造タンパク質を含む感染性HPV18/16キメラウイルスがHPV16特異的ポリクローナル血清により中和できたか否かを調べることに注目した。アカゲザル免疫前血清又はHPV16L1VLP免疫後血清の希釈液の存在下にHaCat細胞をインキュベートした後、キメラウイルスストックの150又は1:100希釈液を加えた。1時間インキュベーション後に培地を細胞に加え、細胞を更に7日間培養した。全RNAを抽出し、486bpHPV18E1∧E4スプライス転写産物の有無をRT−PCRにより分析した処、ウイルス感染が生じたことが判明した。2頭のアカゲザルからの免疫後血清は希釈比1:10及び1:100でウイルス感染を阻害することができた。2種の血清の一方は1:1000でウイルスを中和した。同様の希釈比で免疫前血清は感染性に無効であり、このウイルス中和は非特異的血清効果によるものではないことが判明した。HPV18VLPに対して作製した免疫血清で中和しても効果はなく、結果の特異性が更に明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【図1】
キメラHPVの作製方法の概要図である。
【図2A】
キメラ配列をもつプラスミドの作製を示し、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をBglIIクローニング部位で置換したプラスミドを示す。
【図2B】
キメラ配列をもつプラスミドの作製を示し、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をHPV16の相同タンパク質で置換したプラスミドを示す。
【図3A】
HPVを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。
【図3B】
HPVを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。
【図4】
HPVを含むクローン細胞系のRNAプロテクションアッセイである。
【図5】
感染性キメラウイルスの存在を示すものである。
【図6A】
HPV16特異的中和を示すものであり、2頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
【図6B】
HPV16特異的中和を示すものであり、2頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
発明の技術分野
本発明は感染性キメラヒトパピローマウイルス(HPV)とその製造方法に関する。本発明はこれらのウイルスを利用する種々のアッセイにも関する。
【0002】
発明の背景
感染性ヒトパピローマウイルスはin vivo又はin vitroウイルス増殖が困難であるため、作製能が阻まれている。少数のウイルス型を増殖させるために数種の方法が利用されているが、複製要件が型毎に固有であるため、これらの方法は全ウイルスに有用ではない。感染性HPV18(米国特許第5,994,115号(Meyers)及びMeyersら,1997 J.Virol.71(10):7381−6)及びHPV31b(Meyersら,1992 Science 257:971−973,1992)を作製するためにラフト培養が使用されている。異種移植マウスモデルを使用して感染性HPV11の作製も行われている(Kreiderら,1987 J.Virol.61:590)。
【0003】
現在までに作製されている感染性HPVの型は同定されている80種を越えるHPV型のうちのほんの少数に過ぎない。キメラHPVを含む他のHPV血清型を簡便に培養できるシステムを開発することが最も望ましい。更に、感染性および中和抗体の存在を検出するために使用可能な感度の高いアッセイを開発することも望ましい。
【0004】
発明の詳細な説明
本発明は、感染性キメラパピローマウイルスに関する。1つの好ましい実施態様において、パピローマウイルスは、初期遺伝子(例えばE1、E2、E3、E4、E5、E6及びE7)が第1のパピローマウイルスに由来し、後期遺伝子(L1及びL2)が第2のパピローマウイルス型に由来するキメラである。1つの好ましい実施態様において、初期遺伝子はヒトパピローマウイルス(HPV)に由来し、より好ましい態様ではHPV18に由来する。好ましい実施態様において、後期遺伝子は他のヒトパピローマウイルス血清型又は非ヒトパピローマウイルス(即ちウシパピローマウイルスBPV、ワタオウサギパピローマウイルスCRPV、及びイヌ口腔パピローマウイルスCOPV)を含んでいてもよい。
【0005】
後期遺伝子がヒトパピローマウイルスに由来する態様において、後期遺伝子は生殖器癌及び疣贅等のヒト疾患に関連する血清型、即ちHPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16及びHPV18からなる群から選択することが好ましい。他の好ましい血清型としては、HPV1、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV41、HPV47、HPV51、HPV57及びHPV58が挙げられる。
【0006】
本発明の別の態様は感染性キメラパピローマウイルスの取得方法であり、
(a)初期遺伝子が第1の型のパピローマウイルスに由来し、後期遺伝子が第2のパピローマウイルスに由来するキメラパピローマウイルスを作製する段階と、
(b)分化しつつある上皮細胞のラフト細胞培養物を作製する段階と、
(c)細胞培養物にキメラパピローマウイルスを感染させる段階と、
(d)ウイルス複製を維持する条件下で細胞培養物をインキュベートする段階を含む。
【0007】
本発明の更に別の態様は血清中のヒトパピローマウイルス中和抗体の存在を検出するためのアッセイであり、
(a)感染性キメラパピローマウイルスを含む細胞培養物を血清と接触させる段階と、
(b)血清の存在下に細胞培養物内でキメラパピローマウイルス複製が起こるか否かを決定する段階を含む。
【0008】
好ましい実施態様において、この検出はキメラウイルスを感染させた細胞からのRNAを逆転写酵素と接触させてcDNAを得ることにより実施される。その後、cDNAをPCRアッセイで増幅する。場合により、増幅したDNAの量を対照群(例えば同様に感染させるが、血清に暴露していない細胞系)と比較する。
【0009】
本発明の更に別の態様は、キメラウイルスを構築するために使用するベクターと、感染性キメラパピローマウイルスを含む宿主細胞である。
【0010】
図面の簡単な説明
図1は、キメラHPVの作製方法の概要図である。
【0011】
図2A及び2Bはキメラ配列をもつプラスミドの作製を示す。図2Aは、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をBglIIクローニング部位で置換したプラスミドを示す。図2Bは、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をHPV16の相同タンパク質で置換したプラスミドを示す。
【0012】
図3A及び3Bは、HPVを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。HPV18/16キメラDNAをトランスフェクトした数種の細胞系についてエピソームウイルスDNAの有無を調べた。DNAを各細胞系から抽出し、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ又はBglII制限エンドヌクレアーゼで消化するか又は消化せずにサザンブロットにより評価した。HPV18特異的プローブ(図3A)でDNAを探査した処、クローン2a、3a、3b、3c、4c及び5cは、EcoRIで消化した場合には約8kbのバンドを含んでいることが判明し、全ウイルス配列はエピソームであることが明らかになった。BglIIで消化した場合には5.6Kbのバンドが検出され、エピソームDNAがHPV16L2/L1コーディング配列を含むことが更に立証された。未消化DNAはスーパーコイル及びニックゲノムウイルスDNAを示す。HPV16L2/L1特異的プローブ(図3B)を使用したサザンブロット分析により、ウイルスDNAはエピソーム種であることが確認され、キメラウイルスDNA内に2.4Kb HPV16L2/L1配列が存在することが実証された。
【0013】
図4は、HPVを含むクローン細胞系のRNAプロテクションアッセイである。ラフト培養物として増殖させた細胞系2a及び5cから抽出したRNAでRNAプロテクションアッセイを実施した。HPV16L1特異的リボプローブを使用すると、クローン2aは多量のHPV16L1特異的RNAを産生するが、クローン5cは産生量が少ないことが判明した。Y1はRNアーゼで消化した酵母由来RNA対照である。Y2は未消化酵母RNA対照である。
【0014】
図5は、感染性キメラウイルスの存在を示すものである。HPV18/16キメラクローン2Aからのウイルスの希釈液をHaCat細胞に感染させた。7日後に細胞を回収し、486bpHPV18E1∧E4入れ子RT−PCR産物(矢印)の存在によりウイルス感染を検出した。ウイルス希釈比を図面の上部に示す。「モック(mock)」は偽感染細胞を示す。
【0015】
図6A及び6Bは、HPV16特異的中和を示す。アカゲザル免疫前血清又はHPV16L1VLP免疫後血清の希釈液の存在下にHaCat細胞をインキュベートした後、キメラウイルスクローン2Aを加えた。7日後に細胞を回収し、486bpHPV18E1∧E4入れ子RT−PCR産物(矢印)の存在によりウイルス感染を検出した。ウイルス希釈比を図面の上部に示す。図A及びBは2頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
【0016】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して以下の用語を適用する。
【0017】
感染性−適当な宿主細胞で複製できる場合にウイルスは感染性である。これは核酸を含まない空のキャプシドタンパク質から構成され、従っていかなる細胞でも複製できないウイルス様粒子(VLP)からウイルスを区別するために用いる。
【0018】
HPVは初期遺伝子が未分化細胞でしか活性でないと思われるが、(キャプシド形成のために構造タンパク質をコードする)後期遺伝子は分化細胞で活性であるため、細胞培養で特に増殖しにくいウイルスであった。しかし、参考資料として本明細書に組込む米国特許第5,994,115号に記載されているように、感染性HPV18はラフト培養で増殖できることが公知である。
【0019】
本発明によると、HPV18に使用されるラフト培養系は感染性キメラパピローマウイルスの増殖を維持することが判明した。
【0020】
本発明のキメラウイルスは一般に2つのゲノムソースをもつ。第1のソースはウイルス初期遺伝子のソースである。初期遺伝子は感染性ウイルスの産生に必要なパピローマウイルスの非構造タンパク質をコードし、これを発現する。これらの遺伝子としてはE1、E1∧E4(RNAの一部がE1から、その他の部分がE4に由来する、スプライス転写産物)、E2、E3、E4、E5、E6及びE7が挙げられる。
【0021】
第2のDNAソースは後期遺伝子L1及びL2をコードする遺伝子のソースである。これらの配列は、キメラウイルスゲノムDNAを含む感染性ウイルス粒子に組込まれるL1及びL2構造タンパク質の産生を可能にする。
【0022】
本発明の好ましい実施態様では、初期遺伝子のソースはヒトパピローマウイルスであり、特にHPV18である。しかし、他の血清型のウイルスも本発明で利用可能であり、初期遺伝子のソースとしてHPV18を挙げたのは例示の目的であり、これに限定されない。
【0023】
後期遺伝子のソースは、ヒト又は非ヒトのいかなるパピローマウイルスとすることができる。特に好ましいソースとしてはHPV6a、6b、11、16、18、他の疾患関連HPVが挙げられる。他の血清型としてはHPV1、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV41、HPV47、HPV51、HPV57及びHPV58が挙げられる。その他、動物パピローマウイルス、特にワタオウサギパピローマウイルス(CRPV)、ウシパピローマウイルス(BPV)及びイヌ口腔パピローマウイルス(COPV)等の動物疾患モデルで使用されるパピローマウイルスに由来するものも好ましい血清型である。「研究者がする必要があることのすべては、L1及び/又はL2遺伝子配列を得て、それによって、本明細書に記載の技術を使用してクローニングすることである。」多数のヒト及び動物パピローマウイルスL遺伝子の配列が公知である。
【0024】
従って、本発明の1態様は感染性キメラパピローマウイルスである。好ましい実施態様において、本発明のキメラパピローマウイルスは以下のウイルス(命名の前の部分は初期遺伝子のソースを表し、後の部分は後期遺伝子のソースを表す)即ちHPV18−16、HPV18−11、HPV18−6a、HPV18−6b、HPV18−31、HPV18−33、HPV18−35、HPV18−39、HPV18−41、HPV18−42、HPV18−47、HPV18−51、HPV18−57、HPV18−58、HPV18−COPV、HPV18−BPV、HPV18−CRPVの1種から選択される。
【0025】
キメラウイルスゲノムはプラスミドと標準分子生物学技術を使用して作製することができる。要約すると、これはパピローマウイルス構造L1及びL2遺伝子のコーディング配列を含むDNAフラグメントを作製し、ウイルス複製に必要なHPV18の初期遺伝子を含むプラスミドの適当な位置にこのDNAをクローニングすることにより行われる。
【0026】
本発明のキメラウイルスはラフト培養系(器官型培養系とも言う)で増殖させる。要約すると、I型コラーゲンとフィブロブラストの混合物から皮膚に相当するもの(以下皮膚等価物とする。)を作製する。分化しつつある上皮細胞に由来する細胞系からの細胞を皮膚等価物の表面に載せ、培地中で、飽和するまで培養する。次に、上皮細胞を表面に載せた皮膚等価物を金網上に引上げ、空気−液体界面に維持する。この時点から上皮細胞は培地に接触しなくなる。上皮細胞の補充は皮膚等価物に拡散させることにより行う。上皮細胞は約2週間で層を形成し分化する。タンパク質キナーゼCのインデューサーを培地に加え、キメラウイルスDNAのエピソームコピーを維持している細胞がビリオンを生合成するようにすることが好ましい。
【0027】
本発明のキメラウイルスの特筆すべき用途の1つはアッセイ、特に中和アッセイである。血清が中和抗体を含むか否かを評価するアッセイは当分野で利用されているが、これらのアッセイはいずれも非感染性ウイルスを利用するか又はin vivoである。これに対して、本発明のアッセイは、in vitroで実施することができ、研究者にとってはるかに簡便でしかも感染性粒子を使用することができる。従って、in vitroで生じる現象よりも感染中に実際に生じる現象に似た結果が得られ易い。更に、いかなるキメラパピローマウイルスにも本質的に同一手順を使用することができるので、同一培養方法を使用しながら多数の血清型を容易に調べることができる。
【0028】
従って、本発明の別の態様はパピローマウイルスキャプシド上に存在するエピトープに特異的な中和抗体が試料中に存在するか否かを決定するためのアッセイであり、
(a)試料を感染性キメラパピローマウイルスと接触させる段階と、
(b)キメラウイルスの感染性が変化するか否かを調べる段階を含む。
【0029】
本発明の好ましい実施態様において、感染性キメラパピローマウイルスは初期遺伝子をコードする第1の遺伝子ソースと、後期遺伝子をコードする第2の遺伝子ソースをもつ。これらの後期遺伝子はHPV6、11、16又は18に由来することが好ましい。他の態様では、試料は後期遺伝子のソースと同一血清型HPVに暴露されたとされる個体からの血清試料である。従って、例えば個体がHPV16に対する中和抗体をもつか否かを調べたいならば、キメラウイルスはHPV16後期遺伝子をもつべきであり、1例はHPV18−16キメラである。このアッセイは後期タンパク質が数個のアミノ酸しか相違しない遺伝的に密接に関連する血清型(例えばHPV6及び11)を鑑別するのにも有用である。
【0030】
キメラウイルスの感染性が変化するか否かは多数の方法で調べることができる。ウイルス感染性の変化は相対測定であり、即ち他の全型と比較する標準ウイルス調製物を作製することができる。中和アッセイの好ましい実施態様において、例えば「無血清」陽性対照は感染性の完全低下を測定する標準である。
【0031】
本発明に含まれる別のアッセイでは、キメラウイルスが実際に細胞に感染(即ち侵入)しているのか、又は単に表面に結合しているだけでまだ細胞に侵入していないかを検出する。このアッセイでは、初期遺伝子に由来するRNA転写産物のRT−PCR(逆転写酵素−PCR)を使用することができる。キメラウイルスがヒト細胞内で複製すると、(スプライスしていないウイルスゲノムの長さである)数Kbではなく、486bp長のE1∧E4遺伝子のスプライス変異体が形成される。従って、感染が生じたことの指標としてスプライス変異体の検出を使用することができる。E1∧E4スプライス変異体は任意変異体とすることができる(E1及びE4の配列は当分野で公知である)。好適配列を以下に示す(PCR増幅でプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドを下線で示す)。
【0032】
【化1】
【0033】
E1∧E4RNAはヌクレオチド929〜3434間でスプライスした。
【0034】
【化2】
【0035】
更に、感染検出能を改善すためにゲノムDNAにリポーター遺伝子を導入してもよい。これらのキメラウイルスはパピローマウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘発するように設計されたワクチンの評価に有用である。更に、ウイルス複製の分子的側面を研究するためのツールにもなり、パピローマウイルス感染に関連する治療処置の開発に重要な役割を果たすと思われる。
【0036】
以下、非限定的な実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【0037】
実施例1:HPV18ΔL2/L1トランスファープラスミドの作製
PBS−HPV18プラスミド(Hershey Medical Center,Hershey,Pa.のCraig Meyers博士から入手)20μgをAatII(Boehringer Mannheim Cat#775207)で消化した。消化したDNAをCentrisepカラム(Princeton Separations Cat#CS−901)で精製した後、AflII(New England Biolabs Cat#520S)で消化した。得られた6647bpバンドをQIAEXゲル抽出キット(QIAGEN Cat#20021)で精製した。
【0038】
下記オリゴヌクレオチド(Midland Co.)及びpfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して2つのPCRフラグメントを作製した。
【0039】
1.AatII部位のヌクレオチド3542からヌクレオチド4246のHPV18L2配列の始点までのHPV18ゲノムDNAを含む720bpPCR産物。このPCRフラグメントの5’側はAatII制限部位を含み、3’側はBglII制限部位を含む。このPCR産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
18AatII:5’CGG CCA GAC GTC GGC TGC TAC ACG3’(配列番号1)
18BglIIB:5’GCT AGC AGA TCT ACT TTT ATT ACA AAA ATA CAA AAA GC3’(配列番号2)
であった。
【0040】
2.HPV18L1の停止部位のヌクレオチド7137からヌクレオチド7730のAflII制限部位までのHPV18ゲノムDNAを含む593bpPCR産物。このPCRフラグメントの5’側はBglII制限部位を含み、3’側はAflII制限部位を含む。このPCR産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
18AflII:5’GTA TGC AAT TAG CTT AAG TAA AAA CAA AC3’(配列番号3)
18BglIIF:5’GCT AGC AGA TCT TAT GTG TGT GTG TAT ATA TAT ATA CAT C3’(配列番号4)
であった。
【0041】
AatII/BglII及びAflII/BglIIPCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen Cat#28104)で精製した。AatII/BglIIPCR産物をAatIIで消化した。AflII/BglIIPCR産物をAflIIで消化した。消化したPCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen Cat#28104)で精製した。
【0042】
AflII/AatIIで消化したプラスミドをAatII/BglII及びAflII/BglIIで消化した2種のPCR産物に連結した。得られた連結物をBglIIで消化し、Genieprepで精製し、連結した。
【0043】
DH5α(BRL Cat#18258)を形質転換し、HPV18L2/L1配列がBglIIクローニング部位で置換された適正プラスミドのコロニーをスクリーニングした。この新規7932bpプラスミドをpBS−HPV18ΔL2/L1と呼ぶ。
【0044】
実施例2:HPV16L2/L1コーディング配列を含むプラスミドpBS−HPV18/16の作製
下記オリゴヌクレオチド(Midland Co.)及びpfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用してHPV16L2及びL1オープンリーディングフレームを含む2.9KbPCR産物を作製した。PCR鋳型に使用したDNAはpUC18にクローニングしたCasKi細胞からのHPV16L1/L2ゲノムDNAに由来した。このPCRフラグメントの5’及び3’側はいずれもBglII制限部位を含む。このPCR産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
16L2BglIIF:5’GCT AGC AGA TCT ATG CGA CAC AAA CGT TCT GCA AAA CG3’(配列番号5)
16L1BglIIB:5’GCT AGC AGA TCT TTA CAG CTT ACG TTT TTT GCG TTT AGC AG3’(配列番号6)
であった。
【0045】
2.9Kb HPV16L2/L1PCR産物をQIAEX II精製キット(QIAGEN)でゲル精製した。精製産物をBglIIで消化し、熱不活化した後、Genieprep(Ambion Cat#1950)を使用して精製した。
【0046】
pBS−HPV18ΔL2/L1をBglIIで消化し、エビアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim Cat#1758250)で脱リン酸し、ホスファターゼと共に65℃で15分間熱不活化した。
【0047】
HPV16L2及びL1オープンリーディングフレームに相当するBglIIで消化した2.9KbPCR産物をBglIIで消化したpBS−HPV18ΔL2/L1に連結し、L2/L1コーディング配列をHPV16L2/L1コーディング配列で置換した以外は全HPV18ゲノム配列を含む10857bpプラスミドを得た。このプラスミドをpBS−HPV18/16と命名した。
【0048】
実施例3:HPV16L2/L1コーディング配列と突然変異EcoRI部位を含むプラスミドpBS−HPV18/16の作製
ラフト培養で感染性ウイルスを作製するプロトコールはJ2細胞へのトランスフェクション前にHPVゲノムDNAの放出を必要とする。HPV18ゲノム配列はEcoRI部位を含まないので、この制限エンドヌクレアーゼを使用してゲノムDNAをプラスミドから放出させる。キメラDNAプラスミドpBS−HPV18/16はHPV16L2/L1コーディング配列内にEcoRI部位を含む。Quick Change Site Directed mutagenesis Kit(Stratagene Cat#200518)を製造業者の指示に従って使用して部位特異的突然変異誘発を実施した。以下のオリゴヌクレオチド:5’CAT ACA TAC ATT CTA TGA ACT CCA CTA TTT TGG AG3’(配列番号7)及び5’CTC CAA AAT AGT GGA GTT CAT AGA ATG TAT GTA TG3’(配列番号8)を使用し、アミノ酸配列を変えずにEcoRI部位を改変した。得られたプラスミドをpBS−HPV18/16Mと命名した。
【0049】
実施例4:キメラウイルスの作製
キメラウイルスDNAのケラチノサイトエレクトロポレーションプロトコール (参考資料として本明細書に組込む)米国特許第5,994,115号に記載されているラフト培養法を原則的に使用して細胞を培養した。要約すると、以下の手順を使用した。
【0050】
エレクトロポレーションの前日にマイトマイシンCで処理した3T3J2細胞のプレート(10cmプレート)を準備した。これらの細胞を1:3に分割し、E培地+5%FCSで、一晩インキュベートした。pBS−HPV18/16MプラスミドDNAをEcoRIで消化して直鎖化し、ゲノムキメラウイルスDNAを放出させた。ウイルスDNAをフェノール/クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出で抽出し、EtOH沈澱させ、TE[pH8]緩衝液に10μg/10λ(初期重量に基づく)となるように再懸濁した。サケ精子DNA10mg/mlを調製(変性及び音波処理)した。滅菌蒸留水で500mM BES[pH7.2]ストックを調製した。
【0051】
トランスフェクション
サケ精子DNAを5分間煮沸し、直ぐに氷上に取り、消化プラスミドDNA10λとサケ精子DNA4.25λを1.5mlエッペンドルフチューブに分注した。
【0052】
ケラチノサイトをトリプシン処理し、計数した。以下の式と培地組成を使用して再懸濁した。
【0053】
細胞=ml(E+10%FCS+5mM BES[pH7.2])
20×106細胞/ml。
【0054】
上記からのDNA混合物を使用して250λ細胞溶液(約5×106細胞)を調製した。溶液を室温で10分間インキュベートした。溶液をエレクトロポレーションキュベット(BIO−RAD Gene Pulser Cuvette;cat#165−2088)に移した。BIO−RAD Gene Pulserを使用して210v/960μFdでエレクトロポレーションを行った。次に細胞を室温で10分間インキュベートした。
【0055】
次に各エレクトロポレーションサンプルをE+10%FCS10mlに重層した後、約300rpmで10分間遠心した。各サンプルをE+10%FCS6mlに再懸濁した。
【0056】
マイトマイシンで処理したJ2細胞にE+10%FCS(約8ml)を再補充した後、マイトマイシンCで処理したJ2細胞のプレートに播種した。
【0057】
翌日、プレートにE+10%FCS+EGF10mlを再補充し、E+10%FCS+EGFを2日おきに約7日間再補充した。その後、プレートに2日ごとにE+5%FCS+EGFを補充した。マイトマイシンCで処理したフィーダーが培養物上に得られた。
【0058】
実施例5:ラフト培養物の作製
ウイルスDNAをエピソーム状態に維持して感染性ウイルスストックを調製するためにラフト培養物を作製した。J2フィーダー細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー染色により生存細胞濃度を測定した。各ラフトに合計6.25×105細胞/mLを使用した。
【0059】
J2細胞を6分間遠心し、再構成緩衝液に6.25×105細胞/mLとなるように再懸濁した。ラット尾コラーゲン(I型)を各チューブに加えると共に、各チューブにコラーゲンミックス1ml当たり10N NaOH3μLを加えた。5分間チューブを転倒して混合した。6ウェルクラスタープレートの各ウェルに2.5mLを分注し、プレートを37℃で12〜16時間インキュベートした。
【0060】
E培地2mLをウェルに加えてインキュベートした。上皮細胞を約0.5〜1.0×106上皮細胞/ラフトの密度でラフト上に播種した。細胞を37℃で4時間〜一晩インキュベートし、必要に応じて培地を交換した。
【0061】
細胞が飽和した後、100mmペトリ皿に金網を置いた。コラーゲンゲルを金網上に引上げ、金網の下側が培地で満たされるまでE培地を加えたが、培地が金網の網目を通過しないようにした。上皮細胞を空気/液界面で層を形成させ、分化させた。
【0062】
分析のために4%パラホルムアルデヒドに固定することによりラフトを回収し、ラフトをパラフィン包埋した。免疫組織化学分析のために4μm切片を切り取った。
【0063】
サザンブロット分析のために感染細胞から全細胞DNAを抽出した。RNAプロテクションアッセイのために感染細胞からRNAを抽出した。
【0064】
ビリオンをラフト培養物からCsCl等密度勾配により精製し、EM分析と感染性及び中和アッセイに使用した。
【0065】
実施例6:感染性及び中和アッセイ
増殖培地(10%ウシ胎児血清(Gibco)、高グルコースDMEM(Gibco)、1×ペニシリン及びストレプトマイシン)を加えた12ウェルプレートにHaCat細胞を105細胞/ウェルの密度で播種した。翌日、培地を細胞から吸引し、Optimen(Gibco)で連続希釈したウイルスストック100μLを細胞上に加え、37℃5%CO2インキュベーターで1時間インキュベートした。中和アッセイのために、ウイルス添加前に試験血清を細胞に加えた。ウイルス吸着後、新鮮培地をウェルに加え、細胞を更に7日間インキュベートした。その後、Trizol(Life Technilogies)を製造業者の指示に従って使用して細胞から全RNAを抽出した。全RNA2μgを1段階RT−PCR反応(Titan One Tube RT−PCR System,Boehringer Mannheim)に使用した。RT−PCRで使用したオリゴヌクレオチドは、
順方向プライマー;nt530〜552:5’CAA CCG AGC ACG ACA GGA ACG AC3’(配列番号9)及び
逆方向プライマー;nt3603〜3582:5’CAG GTC CAC AAT GCT GCT TCT C3’(配列番号10)
であった。
【0066】
RT段階は50℃で30分間実施した。その後、95℃で5分後、95℃15秒、55℃30秒、72℃30秒を40サイクル、72℃7分間の最終伸長の条件でPCR反応を実施した。1回目のRT−PCR反応から2μLを取出し、入れ子オリゴヌクレオチドプライマー(オリゴヌクレオチド5’TCC AAC GAC GCA GAG AAA CAC3’(順方向プライマー;nt553〜573)(配列番号11)及び5’GAG TCC ACA GTG TCC AGG TC3’(逆方向プライマー;nt3578〜3558)(配列番号12))を使用した次のPCR反応に使用した。
【0067】
2回目のPCR反応の条件は96℃で60秒後、94℃15秒、65℃30秒、72℃30秒を30サイクルと、72℃7分間の最終伸長とした。EtBrを加えた1%アガロースゲルで入れ子PCR産物を可視化した。486bpPCR産物の存在はHaCat細胞がHPV18特異的E1∧E4スプライス転写産物を産生したウイルスに感染したことを示す。
【0068】
実施例7:HPV18/16キメラDNAを含む細胞系の作製
HPV18/16キメラDNAを感染させた数種の細胞系についてエピソームウイルスDNAの有無を調べた。各細胞系からDNAを抽出し、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ又はBglII制限エンドヌクレアーゼで消化するか又は消化せず、サザンブロットにより評価した。DNAがエピソームであるならばEcoRIはゲノムウイルスDNAを直鎖化して7.9Kbバンドとなるが、BglIIはキメラゲノムウイルスDNAから2.4Kb HPV16L2/L1コーディング配列を放出する。DNAをHPV18特異的プローブで探査したサザンブロットの結果、EcoRIで消化した場合にはクローン2a、3a、3b、3c、4c及び5cは約8kbバンドを含むことが判明し、全ウイルス配列はエピソームであると思われた。BglIIで消化した場合には5.6Kbバンドが検出され、エピソームDNAはHPV16L2/L1コーディング配列を含むことが更に立証された。未消化DNAはスーパーコイル及びニックゲノムウイルスDNAを示す。HPV16L2/L1特異的プローブを使用したサザンブロット分析により、ウイルスDNAはエピソーム種であることが確認され、キメラウイルスDNA内に2.4Kb HPV16L2/L1配列が存在することが実証された。
【0069】
実施例8:HPV16L1転写の立証
HPV16L1コーディング配列が転写されているか否かを調べるために、ラフト培養物として増殖させた細胞系2a及び5cから抽出したRNAでRNA保護アッセイを実施した。HPV16L1特異的リボプローブを使用すると、クローン2aは多量のHPV16L1特異的RNAを産生するが、クローン5cは産生量が少ないことが判明した。Y1はRNアーゼで消化した酵母由来RNA対照である。Y2は未消化酵母RNA対照である。予想通り、HPV18L1特異的プローブを使用した場合にはRNAは検出されなかった。
【0070】
実施例9:クローンの免疫組織化学的分析
4種のクローンのラフト培養物についてHPV16L1タンパク質の有無を免疫組織化学分析した。クローン2a及び3aのラフト培養物はクローン5c及び5eよりも多数のHPV16L1陽性細胞を示す。興味深いことに、クローン2a及び3aはクローン5c及び5eよりもコイロサイトの数も多く、表現型も異常である。これらの結果は、2aがクローン5cよりも多数のウイルスゲノムDNA及びHPV16L1RNAを含むという事実に一致している。
【0071】
実施例10:キメラHPV18/16ウイルスの感染性
キメラHPV16/18ゲノムDNAのエピソームコピーを含むラフト培養物により感染性キメラウイルスが産生されたか否かを調べるために、クローン2a及び5cからの精製ウイルスの連続希釈液をヒトケラチノサイト細胞系(HaCat)に感染させた。入れ子RT−PCR増幅による486bpHPV18E1∧E4スプライス転写産物の検出を使用してHaCat細胞のin vitroでの感染を調べた。クローン2aから抽出したHPV18/16キメラウイルスは希釈比1:800でも検出されたが、クローン5cに由来するウイルスは希釈比1:50でしか検出されなかった。これはクローン5cがクローン2aよりも少量のウイルスゲノムDNA、HPV16L1RNA及びHPV16L1タンパク質を含むという先の結果に一致している。モック感染HaCat細胞から抽出したRNAではウイルスは検出されず、このアッセイの特異性が明らかにされた。これらの結果は感染性キメラHPVウイルスを作製できることを立証した最初のものである。
【0072】
実施例11:HPV16特異的ウイルス中和
本発明者らはHPV16L2及びL1構造タンパク質を含む感染性HPV18/16キメラウイルスがHPV16特異的ポリクローナル血清により中和できたか否かを調べることに注目した。アカゲザル免疫前血清又はHPV16L1VLP免疫後血清の希釈液の存在下にHaCat細胞をインキュベートした後、キメラウイルスストックの150又は1:100希釈液を加えた。1時間インキュベーション後に培地を細胞に加え、細胞を更に7日間培養した。全RNAを抽出し、486bpHPV18E1∧E4スプライス転写産物の有無をRT−PCRにより分析した処、ウイルス感染が生じたことが判明した。2頭のアカゲザルからの免疫後血清は希釈比1:10及び1:100でウイルス感染を阻害することができた。2種の血清の一方は1:1000でウイルスを中和した。同様の希釈比で免疫前血清は感染性に無効であり、このウイルス中和は非特異的血清効果によるものではないことが判明した。HPV18VLPに対して作製した免疫血清で中和しても効果はなく、結果の特異性が更に明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【図1】
キメラHPVの作製方法の概要図である。
【図2A】
キメラ配列をもつプラスミドの作製を示し、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をBglIIクローニング部位で置換したプラスミドを示す。
【図2B】
キメラ配列をもつプラスミドの作製を示し、HPV18のゲノム配列を含み、構造タンパク質L1及びL2のコーディング配列をHPV16の相同タンパク質で置換したプラスミドを示す。
【図3A】
HPVを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。
【図3B】
HPVを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。
【図4】
HPVを含むクローン細胞系のRNAプロテクションアッセイである。
【図5】
感染性キメラウイルスの存在を示すものである。
【図6A】
HPV16特異的中和を示すものであり、2頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
【図6B】
HPV16特異的中和を示すものであり、2頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
Claims (14)
- 感染性キメラパピローマウイルス。
- 初期遺伝子が第1のソースに由来し、後期遺伝子が第2のソースに由来する、請求項1に記載のパピローマウイルス。
- 初期遺伝子がヒトパピローマウイルス(HPV)に由来する、請求項2に記載のパピローマウイルス。
- 初期遺伝子がHPV18に由来する、請求項3に記載のパピローマウイルス。
- 後期遺伝子がHPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV41、HPV42、HPV47、HPV51、HPV57、HPV58、ウシパピローマウイルス、ワタオウサギパピローマウイルス及びイヌパピローマウイルスからなる群から選択されるソースに由来する、請求項3に記載のパピローマウイルス。
- 感染性キメラパピローマウイルスをコードするベクター。
- 感染性キメラパピローマウイルスを含む宿主細胞。
- 感染性キメラパピローマウイルスの取得方法であって、
(a)初期遺伝子が第1のパピローマウイルスソースに由来し、後期遺伝子が第2のパピローマウイルスソースに由来するキメラパピローマウイルスを作製する段階と、
(b)分化しつつある上皮細胞のラフト細胞培養物を作製する段階と、
(c)細胞培養物にキメラパピローマウイルスを感染させる段階と、
(d)ウイルス複製を維持する条件下で細胞培養物をインキュベートする段階と、
(e)得られたキメラパピローマウイルスを回収する段階を含む、前記方法。 - 初期遺伝子がヒトパピローマウイルス(HPV)に由来する、請求項8に記載の方法。
- 初期遺伝子がHPV18に由来する、請求項9に記載の方法。
- 後期遺伝子がHPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、ウシパピローマウイルス、ワタオウサギパピローマウイルス及びイヌパピローマウイルスからなる群から選択されるソースに由来する、請求項9に記載のパピローマウイルス。
- 血清中のヒトパピローマウイルス中和抗体の存在を検出するためのアッセイであって、
(a)感染性キメラパピローマウイルスを含む細胞培養物を血清と接触させる段階と、
(b)血清の存在下に細胞培養物内でキメラパピローマウイルス複製が生じるか否かを調べる段階を含む、前記アッセイ。 - 段階(b)がキメラウイルスからの核酸を逆転写酵素と接触させ、得られたcDNAを増幅する段階を含む、請求項12に記載の方法。
- 得られたcDNAの量を対照細胞からの量と比較する段階を更に含む請求項13に記載の方法。
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