CN1380420A - 具有肿瘤细胞特异性感染和转基因表达能力的新型腺病毒 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一套高效低毒的基因转移载体的构建过程及应用:构建了具有位于外源基因两侧的反向重复序列的重组腺病毒和/或含有经修饰的腺病毒纤维蛋白的嵌合载体,使其能够靶向我们选定的目的细胞,尤其是复制活性细胞;本发明的重组腺病毒载体在宿主细胞中经复制重组激活所携外源基因的表达,达到在宿主细胞中特异性表达的目的。本发明的重组腺病毒可作为基因治疗的有效工具,达到基因治疗,特别是各种癌症的基因治疗的目的。

Description

具有肿瘤细胞特异性感染和转基因表达能力的新型腺病毒

发明领域

本发明与基因治疗领域相关。具体地讲，本发明涉及一套高效低毒的基因转移载体：其是具有特定结构的重组和/或经修饰的腺病毒载体。作为靶向目的细胞的基因转移的载体，并利用其在宿主细胞中复制重组激活所携外源基因的表达的能力，达到基因治疗，特别是各种癌症的基因治疗的目的。

发明背景：

目前作为基因治疗的常见载体有逆转录病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒载体，其中作为肿瘤基因治疗较为常用的是腺病毒载体。

腺病毒是一种双链DNA病毒，其基因组长度约为36kb，分为早期转录区和晚期转录区。目前发现，人腺病毒有47个血清型，分属A-F6个亚属，其中C亚属的5型腺病毒是目前人们研究最为详细的一种。

将腺病毒删除E1区及E3区所得到的腺病毒载体常被称为第一代腺病毒载体，这种载体可插入并表达长度为8kb以内的外源基因，这种腺病毒载体本身不能复制产生子代病毒，腺病毒载体DNA也不整合入宿主细胞的基因组中。

对于恶性肿瘤的基因治疗，要求病毒载体可以高效的特异性的进入肿瘤细胞，表达治疗性基因，或特异性的在肿瘤细胞内复制，进而杀死肿瘤细胞。腺病毒载体可感染多种类型细胞，包括静止期细胞。腺病毒载体可以较容易的大规模培养并获得高滴度的病毒纯品。这些特点使得腺病毒作为常用的肿瘤基因治疗载体。腺病毒作为肿瘤基因治疗的载体，提高其对肿瘤细胞的感染效率及特异性是十分重要的。

腺病毒复制和重组机制

腺病毒复制：

通过在无细胞体系和感染细胞中进行的大量研究发现：腺病毒DNA的复制有两步：

第一步，DNA的合成由前体启动直到终端蛋白(PTP)。PTP通过腺病毒聚合酶(pol)作为异源二聚体结合到反向末端重复序列的特定位点，Ad DNA在线性基因组两端开始复制，结果以5’到3’方向合成的子链以相同的极性置换亲代链。

第二步，被置换的亲代链的复制有三个非排他性机制，i)被置换的单链能够通过ITR碱基对形成局部双链，可能启动第二轮DNA合成，ii)当两个相反方向移动的置换叉相遇时，结合在一起的两条亲代链就会分离，产生局部双链和局部单链(ss)分子；完成在被置换的亲代链上的DNA合成，iii)从分子两个不同端开始具有相反极性的被取代链，能够复性形成双链子分子。DNA的复制需要两个构成成分：DBP和聚合酶，DBP被认为能稳定锅柄结构的形成和链间复性过程。聚合酶以每秒20-30个碱基对的速度合成Ad DNA。

腺病毒DNA的复制对于腺病毒重组是首要必备的条件，抑制腺病毒DNA的复制会减少腺病毒重组。

腺病毒重组：

腺病毒DNA的复制产生大量稳定的ssDNA，它们能有效诱导细菌中腺病毒的同源重组。电子显微镜(EM)研究显示：被置换的亲代单链能被转运到其它的双链基因组形成霍利迪连结体结构，此结构与细菌中的同源重组结构非常相似。

针对腺病毒重组方面的早期研究显示：直到感染周期的晚期，腺病毒基因组都能进行重组，而且每个病毒基因组能够进行复合(multiple)重组。腺病毒基因组的群体遗传学(population genetics)给出了类似于T-even噬菌体的模型。更多经得起推敲的研究分析特异限制位点的交叉互换，显示腺病毒基因组之间的重组只有在病毒DNA复制开始之后才能被检测到，并且复制程度和重组频率成比例。抑制腺病毒DNA的复制会明确无误地减少腺病毒的重组。

重组腺病毒载体在体内体外基因转导方面被广泛应用(Hitt，M.M.et al.，1997.Advances in Pharmacology.40：137-205)。用于基因转导的第一代AdE1-载体缺失了E1A/E1B基因，因此被认为在正常细胞中复制是缺陷型的。(Jones，N.，and T.Shenk.1979.Proc Natl Acad Sci U S A.76：3665-9)。

早期编码的蛋白1A(E1A-12S和E1A-13S)和1B(E1B-55k和-19k)通过转激活(transactivating)病毒基因的表达和解除调控(deregulating)细胞周期来介导病毒复制。[(Shenk，T.1996.Adenoviridea，p.2111-2148.In B.N.Fields，Knipe，D.M.，Howley，P.M.(ed)，Fields Virology，vol.2.Lippincott-Raven Publisher，Philadelphia)]。E1A-12S和E1A-13S是进入细胞的病毒基因组首先表达的蛋白，其功能是转激活其它腺病毒转录单元，尤其是E2和E4区，它们编码用于腺病毒DNA复制的蛋白。E1A解除调控细胞周期并通过直接转激活细胞基因诱导细胞DNA合成【(e.g.c-myc(Hiebert，S.W.et al.，1989.Proc Natl Acad Sci U S A.86：3594-8)，cdc2(Kao，C.Y.et al.，1999.J Biol Chem.274：23043-51)，hsp70(Lum，L.S et al.，1992.Mol Cell Biol.12：2599-605)】，并通过和细胞周期调节蛋白如pRb，pRb相关蛋白(P107/P130)，或p300相互作用，(Tiainen，M.et al.，1996.Cell GrowthDiffer.7：1039-50)，E1A和pRb家族成员的结合释放E2F家族转录因子，致使宿主基因转录上调(transcriptional upregulation of host genes)。这些基因是DNA合成的调控子和效应子，最终促使静止期细胞进入S(DNA合成期或复制期)【例如，c-myc，E1f-1，myoD，DNA聚合酶a，细胞周期蛋白A和E，PCNA(Dyson.N.1998.Genes Dev.12：2245-62)】。

在细胞S(DNA合成期或复制期)，这些和其它细胞因子的活性处于高峰【例如，脱氧核糖核酸的合成(Bjorklund，S.et al.，1990.Biochemistry.29：5452-8；Engstrom，Y.et al.，1985.J Biol Chem.260：9114-6)】，产生一个适合于病毒DNA合成的环境。然而，在正常细胞内，E1A诱导细胞周期下调，导致p53蛋白聚集，促使p53介导的G1(复制前期或合成前期)停滞(el-Deiry，W.S.et al.，993.Cell.75：817-25；Xiong，Y.et al.，1993.Nature.366：701-4)或程序性凋亡途径(Miyashita，T.，and J.C.Reed.1995.Cell.80：293-9)。值得注意的，E1A诱导程序性凋亡也可以通过非p53依赖性途径起作用(Teodoro，J.G.et al.，1995.Oncogene.11：467-74)。

在E1B蛋白中，显示19kDa和55kDa蛋白和E1A-13S产物协同作用，通过下调p53驱动细胞周期蛋白D1的表达启动病毒的复制；这对于细胞在细胞周期中度过G1期是必须的(Spitkovsky，D.et al.，1995.Oncogene，10：2421-5)。E1B蛋白的另一重要功能是对抗p53介导的由E1A-12S诱导的凋亡。与E4-orf6和E4-orf3有关的p55蛋白直接阻断p53起作用，而E1B-19k则类似于bc1-2，显示出对p53依赖型凋亡下游事件有抑制作用。(Debbas，M.and E.White.1993.Genes Dev.7：546-54；Rao，L.et al 1992.Proc Natl Acad Sci U S A.89：7742-6)。在细胞溶解感染晚期时间点，E1B络合到E4orf6蛋白上，促进病毒mRNA从细胞核运出，同时抑制了细胞mRNA的转运。(Babiss L.E.and H.S.Ginsberg.1984.J Virol.50：202-12；Ornelles，D.A.，and T.Shenk.1991.J Virol.65：424-9)。E1B-55k抑制p53的活性已被假设是产生(野生型)腺病毒复制导致细胞裂解感染的必要条件。(Bischoff，J.R.etal.，1996.Scince.274：373-6)。因而，E1B-55k突变形型腺病毒应该优先地在p53缺失型肿瘤细胞中复制(Heise，C.e al.，1997.Nat Med.3：639-45；Heise，C.C.etal.，1999.Cancer Res.59：2623-8；Kirn，d.H.，and.F.McCormick.1996.Mol MedToday.2：519-27；Wildner，O.et al.，1999.Canceer Res.59：410-3)。然而，很多研究显示E1B-55k突变形型腺病毒的在细胞中的有效复制能力并不和细胞的p53蛋白的状况相关。(Goodrum，F.D.，and D.A.Ornelles.1998.J Virol.72：9479-90；Hall，A.R.et al.，1998.Nat Med.4：1068-72；Harada，J.N.，and A.J.Berk.1999.J.Virol.73：5333-44；Hay，J.G.et al.，1999..Hum Gene Ther.10：579-90；Rothmann，T.et al.，1998.J Virol.72：9470-8；Turnell，A.S.et al.，1999.J.Virol.73：2074-83；Vollmer，C.M.et al.，1999.Cancer Res.59：4369-74)。

P53功能缺失和多种肿瘤的发生同步，主要是由于突变的积聚和细胞不能进行p53依赖型凋亡(Lowe，S.W.et al.，1994.Science.266：807-10)。在很多不同肿瘤细胞中观测到的另一个共同缺陷是细胞缺失了由G1向S(DNA合成期或复制期)转化的控制，这是由pRb或p16的突变或抑制引起的，其中p16是一种调节磷酸化和pRb活性的激酶抑制子(Kamb，A.et al.，1994.Science.264：436-40；OA.Kamoto et al.，1994 Proc Natl Acad Sci USA.91：11045-9；Vousden，K.H.1995.Semin Cancer Biol.6：109-16)。由于AdE1A/E1B抑制p53和pRb的功能，具有下调的(deregulated)细胞周期和下调的p53和/或pRb途径的肿瘤细胞系支持缺失E1A和E1B基因的腺病毒的复制。

第一代，E1A和/或E1B缺失型腺病毒用于基因治疗基于这样的假设缺失E1A和E1B区序列足以消除病毒基因的表达和复制。(Berk A.J.ET AL.，1979.Cell.17：935-44；Hitt，M.M.et al.，1997.Advances in Pharmacology.40：137-205；Jones，N.，andT.Shenk.1979.Proc Natl Acad Sci USA.76：3665-9)。然而，大量体内体外研究表明，在E1缺失的AdE1载体转导的细胞中有病毒早期晚期蛋白的表达(Engelhardt，J.F.et al.，1994.Hum Gene Ther.5：1217-29；Engelhardt，J.F.et al.，1993.HumGene Ther.4：759-69；Jane，S.M.et al.，1998.Ann Med.30：413-5；Liber，A.etal.，1996.J Virol.70：8944-60；Yang，Y.et al.，1994.Proc Natl Acad SciUSA.91：4407-11；Yang，Y.et al.，1996.J Virol.70：7209-12)。这些发现和二十年前观测到的现象一致，当时发现，缺失了E1A区，早期腺病毒基因转录缓慢，且与剂量有关(Gaynor.R.B.，and A.J.Berk.1983.Cell.33：683-93；Nevins，J.R.1981.Cell.26：213-20)。人们提出了这样的假设：细胞蛋白能够代替E1A的功能，转激活病毒启动子(Gaynor，R.B.，and A.J.Berk.1983.Cell.33：683-93；Lieber，A.etal.，1996.J Virol.70：8944-60)。因此，第一代AdE1A/E1B不足以作为基因治疗的载体。

目前腺病毒载体的靶向性和在宿主中的稳定性：

基因转移载体必须能够有效的对靶细胞进行转导，与宿主基因组稳定的结合，在靶细胞中进行外源DNA的足量表达，并且没有毒性或免疫副反应。目前可使用的病毒载体系统(例如，重组逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)都不适合在众多细胞类型中进行有效的基因转移。逆转录病毒的稳定整合需要细胞分裂。重组的腺病毒不能够感染许多对基因治疗非常重要的细胞类型，包括造血干细胞，单核细胞，T和B淋巴细胞。而且，重组的腺相关病毒只能以非常低的频率整合。

第一代腺病毒的缺陷包括病毒蛋白的表达所引发的免疫反应能够导致毒性和病毒清除。腺病毒DNA在被转导细胞中以游离状态存在是第一代腺病毒载体的另一缺陷。腺病毒DNA稳定的整合到宿主基因组中的现象只在某些特殊亚型的野生株中有报道，在被广泛用于体内外基因传递的E1/E3缺失的Ad5(腺病毒血清型5)中，很难以可检测到的方式出现(Hitt，M.M.et al.1997 Advances in Pharmacology 40：137-205)。

重组腺相关病毒(rAAV)只能以较低的频率(约每20,000基因组一个)随机整合到宿主基因组中(Rutledge，E.A.；Russel，D.W.1997，J.Virology，71，8429-8436)。AAV的两条反向末端重复序列(ITR)和一些未知的宿主细胞内因子的存在看来是对载体整合的唯一必要条件(Xiao，X.et al，1997，J.Virology，71，941-948；Balague，C.，et al.1997，J.Virology，71，3299-3306；Yang，C.C.1997，J.Virology，71，9231-9247)。AAV的REP蛋白的存在，使得AAV选择性的整合到人19号染色体上的特殊位点，称之为AAVSl(Berns，K.I.，1996，Fields Virology，Fields，B.N.et al.(ed)Vol.2，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA，2173-2220)。AAV衣壳是由三种包被蛋白(VP1-3)形成，其与细胞膜上的特殊的硫酸乙酰肝素相互作用以及可能与特殊的受体相互作用。但是，许多类型的细胞包括造血干细胞都缺乏这些结构，因此基于AAV2的重组AAV载体不能够感染这些细胞(Malik P.et al.，1997，J.Virology，71，1776-1783；Quing，K.Y.，et al.1998，J.Virology，72，1593-1599)。rAAV载体的其它缺陷包括插入序列长度的限制(4.5-5kb)，这可以通过缺失所有的病毒基因以及制备低转导滴度的rAAV来进行调整。

腺病毒感染是由Ad5病毒通过其纤维蛋白与细胞表面相连接来起始的(如综述Shenk，1996，Fields Virology，Fields，B.N.et al.(ed)Vol.2，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA，2111-2148)。三聚体纤维蛋白分子远侧的C末端结构域终止于一个球形结构域中，其能够结合于一种特殊细胞受体，该受体近来被证实为柯萨奇(coxaxkie)腺病毒受体(CAR)(Bergelson，J.M.et al.Science，275，1320-1323)。结合后，在一个不依靠病毒吸附的事件中，腺病毒五邻体基质蛋白上的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)结构基元与细胞的α3和β5型整合素蛋白相互作用。这种相互作用引发了细胞水平的内化使得病毒颗粒定位于内含体中(endosome)。内含体的膜在腺病毒五邻体基质蛋白的介导下降解，释放内含体中的内含物到细胞质中。在这个过程中，病毒颗粒逐渐脱去包被，腺病毒DNA被转运到核中并在其中开始复制。共价结合于病毒基因组的末端蛋白以及位于病毒核心颗粒表面的核心蛋白V，两种蛋白都具有核定位信号肽(NLS)(van der Vliet，B.1995，The Molecular Repertoir of Adenoviruses，Vol.2，Doerfler，W.and Boehm，P.(ed.)，Springer Verlag，Berlin，1-31)。这些核定位信号肽在引导腺病毒基因组进入核内中扮演重要角色，而且可能作为结构元件使得腺病毒能够转导非分裂细胞的。当双链线形DNA进入核内后，其通过其末端蛋白与核内基质结构相连接。

因为CAR和特殊整合素的存在与否限制着能够被Ad5或Ad2所感染的细胞类型，人们已经尝试去扩宽腺病毒载体的感染嗜性。为使腺病毒能够靶向新的细胞表面受体，对其包被蛋白进行遗传修饰；已经报道的包括纤维蛋白(Kransnykh，V.et al.1998，J.Virology，72，1844-1852，Kransnykh，V.et al.1996，J.Virology，70，6839-6846，Stevenson，S.D.，et al.1997，J.Virology，71，4782-4790)，五邻体基质蛋白(Wickham，T.J.，et al.1996，J.Virology，70，6831-6838；Wickham，T.J.，et al.1995，Gene Therapy，69，750-756)，六邻体蛋白(Crompton，J.，et al.1994，J.Gen.Virol.75，133-139)。其中最有前途的修饰为对纤维蛋白的功能修饰，更具体的为对纤维蛋白中的球形结构部分的修饰，因为该结构介导了最初的结合。已经有报道两个小组产生了包括Ad5尾/轴和Ad3的球形结构域的纤维蛋白(kransnykh，V.et al.1996 supra，Stevenson，S.D.，et al 1997，supra)。最近构建的重组腺病毒其纤维蛋白的C末端分别包含多聚赖氨酸，促胃泌素释放肽，促生长素抑制素，E-选择蛋白结合多肽，或者寡聚组氨酸，用来改变Ad5的天然嗜性。Kransnykh等发现(Kransnykh，V.et al.1998 supra)异源多肽配基可以被插入到纤维蛋白球形结构域的H1环中而不影响其生物功能。在对其它腺病毒血清型的研究基础上发现纤维蛋白的轴区的长度是关键因素，决定着与细胞表面的整合素蛋白的相互作用以及内化作用的效率。但是还没有报道表明已经能够成功的将Ad5载体对一种特定类型的细胞改变靶向。

然而，第一代腺病毒有许多特性使它们作为有吸引力的基因转移载体(Hitt，M.M.etal.1997 Advances in Pharmacology 40：137-205)。这包括以高滴度水平生产纯化病毒的能力，以及能将长达8kb的外源基因表达盒在体内有效的转移到包括非分裂细胞在内的很多种不同类型的细胞中。

本发明是在第一代腺病毒载体上的提高，增强了细胞靶向性，如靶向肿瘤细胞，并能在其中复制。只有对Ad DNA复制起关键作用的早期病毒蛋白的表达才能启动病毒复制，随后，病毒的复制直接依赖于被感染细胞细胞核中的病毒基因组数目。【(Shenk，T.1996.Adenoviridea，p.2111-2148.In B.N.Fields Knipe，D.M.，Howley，P.M.(ed.)，Field Virology，vol.2.Lippincott-Raven Publisher，Philadelphia；vander Vliet.1995.Adenovirus DNA replication.，p.1-31.In a.P.B.W.Doerfler(ed.)，The molecular repertoire of adenoviruses，vol.2.Springer Verlag，Berlin)】。在以前的研究中显示，缺失E1区的腺病毒载体感染的大多数细胞系和原代细胞(包括鼠的肝细胞)出现DNA重新合成。(Lieber，A.et al.，1996.J Virol.70：8944-60；Nelson，J E.，and M.A.Kay.1997.J Virol.71：8902-7)。然而，检测鼠体内肝脏细胞，没有检测到AdE1-病毒DNA的复制(Nelson，J E.，and M.A.Kay.1997.J Virol.71：8902-7)。原代肝细胞体外和体内检测的这些差异促使我们用缺失E1区的腺病毒载体在各种肿瘤细胞系上进行更深入细致的研究。特别地，我们检测了多种因素在影响载体DNA复制中的作用，如感染性，肿瘤抑制基因状态，细胞周期，免疫血清等。

基于以上讨论，目前需要改进腺病毒使其能够高效的靶向一系列类型的细胞和组织，同时保持能够稳定的整合到基因组中，并为提高基因治疗的安全性，须使腺病毒载体在宿主中有最小的抗原性，特异性的在宿主细胞中表达外源基因。

发明概述：

本发明所述腺病毒载体，不仅能够根据需要靶向并整合进选定的宿主细胞，如肿瘤细胞，基于在宿主细胞中选择性复制的特征，能够通过重组机制进行宿主特异性基因表达。选定的外源基因可以是一条或多条，其在宿主细胞或组织中的表达可用于治疗，报道基因或选择目的。具体的说是(1)能选择性地在活性周期细胞中保持复制能力的含有反向重复序列新型重组腺病毒载体，通过在共感染的载体之间发生同源重组，激活处在活性周期细胞中的外源DNA的表达；(2)腺病毒载体包含经过修饰的纤维蛋白变体使得任何一种血清型的腺病毒能够靶向选定的宿主细胞；以及以上技术的组合。

这里所述宿主细胞尤指肿瘤细胞。本发明也说明了这种载体的产生的方法，应用以及优势。

本发明提供了经改造的重组腺病毒载体，在宿主细胞中进行特定的同源重组以产生预设的基因组重排衍生物，达到改变遗传信息的作用。例如，通过在载体基因组中联入两段反向重复序列(IR)，并且用同种类型(在此也指同一种载体体系)的两个亲代载体共感染来实现基因组重排，或者通过两个不同类型亲代载体上的交叠重复序列进行同源重组(携带IR序列或不带IR序列)，并且当用两个不同亲代载体共感染肿瘤细胞时实现基因组重排(在此也指两种载体体系)。通过重组机制进行宿主特异性基因表达。选定的外源基因可以是一条或多条，其在宿主细胞或组织中的表达可用于治疗，报道基因或选择目的。优选的，在所发明的肿瘤特异性载体中，可以通过诱导细胞凋亡来促使病毒分散，加快病毒从感染细胞中释放，进一步感染周围肿瘤细胞，增强溶瘤效果。

本发明提供新型的携带外源DNA或外源DNA的片段的腺病毒嵌合体，用于向不同类型细胞或组织以不依赖于CAR或α3和β5的存在的方式进行稳定并有效的基因传递，同时还提供了用于生产这种载体的方法和其在基因治疗中靶向特异性的细胞或组织的应用。本发明提供的嵌合纤维蛋白，包括通过用异源性纤维蛋白序列改变野生型纤维蛋白的一段或几段序列来改变其对细胞或组织的结合特异性。被改变的野生型纤维蛋白序列的区域包括来自相同或不同血清型腺病毒或随机选择的蛋白多肽的球形结构区、轴(杆)区、尾部区域。此处所述的异源性纤维蛋白序列可以被插入任何的含有衣壳的基于腺病毒的载体，使得该病毒能选择性感染特定细胞或组织。含有此异源性纤维蛋白序列的腺病毒被用于引导对于特定细胞的基因转染。

本发明还提供一种通过将AAV的rep蛋白加入到重组载体中来改进整合频率和位点特异性重组的方法。

本文所述嵌合型Ad载体包括Ad.AAV基因组以及其衣壳上表达修饰型纤维蛋白。构建这种嵌合性病毒能广泛转染不同种类的细胞，尤其是用逆转录病毒、AAV和普通腺病毒载体很难转染的细胞。这些细胞包括但不限于造血干细胞、肺上皮细胞、树突状细胞、淋巴细胞和内皮细胞。利用此处所述的载体，造血干细胞如CD34+细胞可作为镰刀细胞贫血和地中海贫血基因治疗的靶细胞。嵌合型Ad-AAV载体介导外源基因进入内皮细胞能够用于血管疾病如动脉硬化和手术后冠状动脉再狭窄的基因治疗。

附图简述：

图1A，1B：ΔAd.IR基因组形成的假设机制，复制激活的表达系统。

图2(I)，2(II)，2(III)：腺病毒载体的结构和复制激活的外源DNA表达框架。

图3A，3B：依赖于腺病毒复制的激活外源DNA表达的离体实验。

图4：Ad.IR-BG和Ad.BG的复制和外源DNA表达的动力学比较。

图5A，5B，5C：HPV E6和E7的表达有效支持AdE1-DNA复制的体内、体外实验。

图6：依赖于两个载体间重组的复制激活的肿瘤特异性基因表达的机制，其中每一个载体包含一个同源序列。

图7A，7B：由各包含一半外源DNA序列的两个腺病毒载体共转染的外源DNA的活性。

图8：在源于Hela的转移性肝癌细胞中，载体Ad.IR-BG的肿瘤特异性beta-Gal表达。

图9：转移性肝癌细胞中产生的AdE1-复制的体内实验。

图10：Ad.IR-BG感染后，LOVO细胞中复制依赖型和肿瘤特异性外源DNA表达。

图11：通过两个载体间重组，产生Rep表达型腺病毒载体。

图12：荧光胱天蛋白酶3的活性分析。

图13：TNF-诱导的凋亡。

图14A，14B：表达ikBM的Hela细胞中，TNF-诱导的凋亡有助于腺病毒载体的释放。

图15：在鼠转移性肝癌细胞模型中，诱导凋亡有助于重组腺病毒的分散。

图16A，16B：在肿瘤细胞系中用Southern印迹分析AdE1-DNA的复制。

图17：在细胞周期的不同阶段，被感染的Hela中AdE1-DNA的同步复制。

图18A，18B：在用诺考达唑(nocodazole)处理的滞留于G2/M期的细胞中AdE1-DNA的复制。

图19A，19B，19C，19D：宫颈肿瘤细胞中AdE1-的复制。

图20：M003及M005重组腺病毒基因结构。其中：RSVp：劳氏肉瘤病毒启动子基因；IR：反向重复序列；pA：polyA，多聚腺苷序列；E1a：5型腺病毒E1a基因；IRES：内核糖体进入位点；AP：碱性磷酸酶基因。

图21：E1a基因促进M003重组腺病毒的复制。其中：Ad.WT：野生型腺病毒；Ad.BG：非复制型腺病毒；M003：M003重组腺病毒；M005：M005重组腺病毒。

图22：E1a基因在不同时间促进M003重组腺病毒的复制。

图23：E1a基因促进M003重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤作用。其中：M005：M005病毒；M003：M003病毒；野生型：野生型腺病毒；MOI：感染系数(病毒数/细胞数)。

图24：E1a基因促进腺病毒载体在肿瘤细胞间的扩散。

图25表示利用大肠杆菌将异源纤维蛋白X基因替代Ad5的纤维蛋白的序列的策略。

图26表示在测试细胞中CAR和αv-整合素的表达情况。Hela细胞，CHO细胞，K562细胞和CD34+细胞与抗CAR的单克隆抗体(RmcB，1∶400稀释)或抗αv-整合素抗体(L230，1∶30稀释)共孵育来进行流式细胞术分析。细胞和非相关的单克隆抗体共孵育作为阴性对照(anti-BrdU，1∶100稀释)。第一级抗体的结合通过结合有FITC标记的鼠Ig-G抗体来显影。显示的数据代表在10⁴细胞进行四倍分析的平均结果。

图27显示对病毒的不同血清型在Hela细胞，CHO细胞，K562细胞和CD34+细胞上的附着和内化作用的分析。相同数量的经³H-胸腺核苷酸标记的Ad3，4，5，9，35，和41病毒颗粒(在OD₂₆₀测定，相当于Ad5的感染复数MOI为400pfu/细胞)按照材料方法中所述的在冰上孵育一个小时。细胞经洗涤后，测定附着到每个细胞上的被标记的病毒颗粒的数目。对于内化研究，首先在冰上孵育一小时使病毒吸附到细胞上。然后没有附着的病毒颗粒被吸脱。细胞在37℃孵育30分钟，随后用胰酶-EDTA处理然后洗涤除去没有内化的病毒颗粒。显示的数据从两到四个独立并重复三次的试验中得到。注意对于CD34+细胞来说Y轴的刻度不同。

图28A-28C显示通过对甲基化的病毒DNA进行Southern杂交分析了病毒在K562细胞和CD34+细胞中的复制情况。1×10⁵K562细胞(A)和CD34+细胞(B)分别感染Ad5，Ad9或Ad35。标记着“load”的道代表在将病毒DNA加入到细胞中后，从立即取出的培养液/细胞混合物中提取的DNA。条带的浓度与病毒DNA是否甲基化相应，结果表明85％的插入病毒都被甲基化。为对吸收和内化进行定量，在病毒与细胞共孵育0℃(吸收)和37℃(内化)后进行DNA分析。对于剂量依赖的复制研究，所述剂量的病毒(用基因组数目表示)被加入到细胞中，在转染K562细胞和CD34+细胞16小时或36小时后分别提取细胞的基因组DNA和病毒DNA。通过Southern杂交试验分析等量的样本DNA。为了定量用Ad5/9嵌合探针分别与这两种血清型病毒DNA杂交来分析Ad9相对于Ad5的复制(C)。用相应的Ad5/35嵌合探针来分析Ad5相对于Ad35的复制。因为用Ad5/35和Ad5/9探针分别进行杂交得到相同的信号强度，对于Ad5DNA只有一条道表明Ad5在检测的细胞中复制。为了产生对于病毒基因组的甲基化与非甲基化状态可以特异性区分的条带，Ad5DNA用XhoI酶切，同时对Ad9和Ad35用XhoI和HindIII酶切。对于病毒DNA甲基化(没有复制)特异性的条带：Ad9约12kb，Ad5 35kb，Ad35约12kb。对于DNA非甲基化特异性条带为：Ad9 5.8kb，Ad5 6.1kb，Ad35 9.5kb。杂合的Ad5/9和Ad5/35DNA片段(1.8kb)被用作定量标准和被降解的病毒/细胞DNA共同应用于凝胶中进行电泳(图中的左边部分)  。

图29表明代谢性标记的各病毒血清型对人细胞系的附着附着和内化。

图30A-30B表明Ad5GFP和嵌合Ad5GFP/F35载体的结构。A)具有插入到E3区的GFP表达盒的缺失E1/E3区的基于Ad5的载体(Ad5GFP)以及包含Ad5/35纤维蛋白基因的嵌合载体Ad5GFP/F35的示意图。通过位于所述的纤维蛋白基因的内部或周围的E.coli.KpnI(K)和HindIII位点的PCR克隆和基因重组技术，2.2kb的Ad5纤维蛋白基因被用编码Ad35的短轴盒球形区的0.9kb嵌合纤维蛋白基因置换。下面的图显示了嵌合纤维蛋白区域的详细结构。从在多数病毒血清型中都保守的前两个氨基酸(GV)，Ad5纤维蛋白的尾部(氨基酸(aa)：1-44)被加入到Ad35纤维蛋白的轴区。一段保守的氨基酸TLWT标志着Ad35轴区的末端β-折叠和球状球形的分界线。Ad35纤维蛋白链终止密码子后跟着Ad5纤维蛋白多聚腺苷酸信号。编码嵌合纤维蛋白的Ad5GFP/F35中的区域用Ad5特异性引物进行完全测序(参见材料和方法)。B)病毒基因组的限制性酶切分析。如其它文献所述从纯化的Ad5GFP和Ad5GFP/F35颗粒中分离病毒DNA。用HindIII和KpnI酶切1微克DNA并在溴乙锭染色的琼脂糖凝胶中分离(左图)，随后用Ad5 E4特异性探针对其进行Southern杂交分析(nt 32，7775-33，651)(右图)。表明两种载体正确结构的特定模式被检测。对Ad5GFP和Ad5GFP/F35特异的HindIII片段分别为2.9kb和4.9kb。与7.6kb Ad5GFP片段(1kb的梯度)(Gibco-BRL，GrandIsland，NY)相比，证实正确的Ad5GFP/F35结构的KpnI片段为1.6kb。

图31通过纤维蛋白修饰改变的腺病毒结构。其中Ad5的纤维蛋白被Ad35的纤维蛋白取代。

图32表示了Ad5/35的结构。示意图为缺失了E1/E3的基于Ad5的载体，其具有插入到E3区的GFP表达盒；以及包含Ad5/Ad35纤维蛋白基因的嵌合载体Ad5GFP/F35。通过位于所述的纤维蛋白基因的内部或周围的E.coli.KpnI(K)和HindIII位点的PCR克隆和基因重组技术，2.2kb的Ad5纤维蛋白基因被用编码Ad35的短轴盒球形区的0.9kb嵌合纤维蛋白基因置换。下面的图显示了嵌合纤维蛋白区域的详细结构。从在多数病毒血清型中都保守的前两个氨基酸(GV)，Ad5纤维蛋白的尾部(氨基酸(aa)：1-44)被加入到Ad35纤维蛋白的轴区。一段保守的氨基酸TLWT标志着Ad35轴区的末端β-折叠和球状球形的分界线。Ad35纤维蛋白链终止密码子后跟着Ad5纤维蛋白多聚腺苷酸信号。

图33表示了被标记的Ad5GFP，Ad35，和嵌合的Ad5GFP/F35病毒颗粒与未标记的病毒，以及抗-CAR或抗-αv-整合素单克隆抗体在附着和内化中的交叉竞争。(A)对于附着研究，用超过未标记竞争者病毒100倍的10⁵的K562细胞在4℃预孵育1小时。然后，等量的[³H]标记的病毒，其剂量相当于Ad5GFP的MOI为100pfu/细胞，被加入到细胞中随后在4℃孵育1小时。细胞用预冷的PBS清洗三次，使成球状并测定吸附的病毒的百分比(每分钟细胞相关计数)。对于内化的交叉竞争的分析，在被标记的病毒加入之前，细胞与100倍的竞争者病毒于37℃预孵育30分钟。病毒加入后于37℃预孵育30分钟，细胞用胰蛋白酶-EDTA在37℃处理5分钟，用预冷的PBS清洗，使成球状，被内化的病毒的百分比被测定。对于对照，细胞在没有竞争者的情况下与被标记的病毒孵育。预试验已经表明了用于竞争研究的条件，其使得在K562细胞中的附着/内化对于所有未标记的竞争者为饱和。(B)10⁵K562细胞和抗-CAR单克隆抗体(RmcB，稀释度为1∶100)或和抗-αv-整合素单克隆抗体(L230，稀释度为1∶30)于4℃共孵育1小时，随后根据上述的附着或内化的试验步骤与被标记的病毒共孵育。对于每种特定的血清型，附着/内化病毒的百分比与对照相比较，细胞在加入被标记的病毒之前以1∶100的稀释度与非相关的抗体(抗BrdU单克隆抗体)在同样的条件下共孵育。注意特定的竞争者但不是相应的对照能够显著的抑制Ad5的内化，这与已经公开的数据一致(59)N＞/＝4。

图34.对于[³H]标记的Ad5GFP，Ad35，和嵌合的Ad5GFP/F35病毒颗粒与未标记的Ad3病毒(A)，以及[³H]标记的Ad3病毒颗粒与未标记的病毒颗粒(B)的附着与内化的交叉竞争。10⁵K562根据图6中所述的附着或内化的试验步骤与100倍的未标记的病毒颗粒预先孵育。等量的[3H]标记的Ad5GFP，Ad5GFP/F35，或Ad35(A)或[³H]标记的Ad3(B)被加入到细胞中，其剂量相当于Ad5GFP的MOI为100pfu/细胞。在对照组中，细胞在没有竞争者的情况下与被标记的病毒共同孵育，N＝4。

图35表示了用Ad5GFP和嵌合的Ad5GFP/F35载体在CD34+，K562，和HeLa细胞上进行的转化研究。1×10⁵细胞与不同感染MOI(pfu/细胞)的病毒在100μl培养基中于37℃孵育6小时。病毒包含的培养基被除去，细胞重新悬浮于新鲜的培养基中，随后在37℃孵育18小时。用流式细胞术测定表达GFP的细胞的百分比。N＝3。

图36表明在表达CAR或者αv整合素的人CD34+细胞亚群中GFP阳性细胞的分布。1×10⁵CD34+细胞用Ad5GFP或Ad5GFP/F35以200pfu/细胞的MOI感染细胞。在感染后24小时，细胞和抗-CAR(最终稀释度为1∶100)或抗αv整合素(最终稀释度为1∶30)初级单克隆抗体于37℃孵育1小时。用抗鼠-IgG-PE标记的次级单克隆抗体(最终稀释度为1∶100)于4℃孵育30分钟来结合初级单克隆抗体。对于每个变体，用流式细胞术分析10⁴细胞。只用病毒缓冲液于细胞共孵育来模拟变体的感染。根据从GFP-和PE-匹配的阴性对照中得到的背景信号来设定象限。指明在每个象限中所发现被染色的细胞。所示的数据代表了三个互相独立的试验。

图37A-37B表明了在表达CD34和CD117(c-kit)的人CD34+细胞亚群中GFP阳性细胞的分布。(A)GFP表达与CD34或CD117的共同定位：按照如图8所述，CD34+细胞以200pfu/细胞的MOI感染有Ad5GFP或Ad5GFP/F35。感染后24小时，细胞和抗-CD34-PE连接的单克隆抗体(最终稀释度为1∶2)或抗CD117-PE连接的单克隆抗体(最终稀释度为1∶5)于冰上共同孵育30分钟。每种变体10⁴的细胞用于双色流式细胞分析。对于阴性对照染色，在分析前细胞中不加入抗体。模拟变体感染的细胞仅与病毒缓冲液共孵育。根据从GFP-和PE-匹配的阴性对照中得到的背景信号来设定象限。指明在每个象限中所发现被染色的细胞。每个试验同时进行三组，并重复两次，典型所得的结果被出示。SEM少于统计平均值的10％。(B)用Ad5GFP和嵌合Ad5GFP/F35载体在CD34+/CD117+细胞上进行的转导研究：CD34+细胞，在染色前用没有SCF的培养基培养过夜，然后在冰上与PE-标记的抗-CD117单克隆抗体共同孵育30分钟。用FACS对CD117阳性的细胞分拣。超过97％的被分拣的细胞为CD117阳性。1×10⁵的CD117+/CD34+细胞与病毒稀释缓冲液共同孵育。感染进行三次。SEM少于统计平均值的10％。

图38显示了在感染有Ad5GFP和杂合Ad5GFP/F35载体的CD34+细胞上GFP阳性和GFP阴性部分的病毒基因组的Southern分析。CD34+细胞以MOI100感染有病毒。感染后24小时，用FACS分拣GFP阳性和GFP阴性的细胞。每个部分取10⁵细胞用于分离基因组DNA和病毒DNA。在细胞裂解前，用胰蛋白酶处理，清洗后用DNase酶切除去被细胞外病毒DNA所污染的基因组DNA样品。(A)上面的图表明了在杂交前用溴乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳结果，表明所加载的基因组DNA具有相同的量。这个量相当于从～25,000个GFP+或GFP-的细胞中分离的DNA。标记有load的道代表了从Ad5GFP或Ad5GFP/F35病毒颗粒纯化的病毒DNA，其中混合有作为载体的pBluescript质粒DNA(Stratagene)，并以实际用来感染25,000细胞的量加于胶上。作为浓度标准，Ad5GFP的系列稀释被加于胶上(左侧)。对于Southern分析(下端)，一个相应于Ad5E2区的8kb HindIII片段被用来作为标记探针。杂交滤膜被用于PhosphoImager分析并在70℃曝光于Kodak-X-OMAT胶片上48小时。箭头所指为细胞/病毒基因组DNA。(B)为检测在转导细胞中的Ad5GFP基因组。PCR扩增后用Southern杂交，使用和(A)中同样的样品用于定量Southern杂交分析。从～25,000细胞中纯化的DNA进行PCR(95℃1分钟，53℃1分钟，72℃1分钟，用Ad5-F1和Ad5-R1作为引物进行20个循环)。PCR反应产物的五分之一被用于琼脂糖凝胶电泳(上图)。一个特异于Ad5 E4区的0.9kb长的DNA片段用来检测转化的Ad5GFP/F35基因组。DNA被点样到Nybond-N+膜上并用Ad5 E4特异性DNA探针进行Southern杂交分析。除0.9kb的DNA片段，PCR引物产生了一个较小的0.5kb长的片段，其也能够与E4区探针杂交。

图39表明在Ad感染策略中纤维蛋白轴区长度的角色。在表达CAR的细胞(293，Y79)和没有CAR显著表达的K562细胞上分析CAR结合变体(Ad5和Ad9)和能够与非CAR受体相互作用的Ad35。所有载体包含包装于衣壳被修饰的Ad5中的GFP表达盒。

发明详述：

定义：

除非另有限定，本发明中所有技术术语采用本领域内一般技术人员通常理解的含义，在本发明中，以下术语具有下述含义：

“外源DNA序列”，指被导入本发明所述载体的，编码选定蛋白的一部分或全长的核酸序列。外源DNA序列长度的上限主要取决于病毒的包装容量或稳定性限制。外源DNA序列(也指外源DNA)可以是编码任何所选的蛋白，无论是否来源于载体自身，尤其是具有治疗作用或其它能满足特定要求的特征。外源DNA序列可以按照常规的方法制备，如合成，从自然生物中分离，扩增，克隆，连接，体外突变，引物修改，或类似方法。

外源DNA序列可以包括能相容于原核或真核宿主细胞的序列，这里相容于指能够在宿主细胞内进行载体复制。相应的，外源DNA序列也可以指能够在宿主细胞中指导载体复制的复制子序列，导致形成能够自发复制的载体。可替代地，外源DNA序列可以允许载体依赖于宿主细胞的复制机制来进行复制。

外源DNA序列的另一个例子包括报道基因，其编码的基因产物可以作为选择标记，如药物抗性标记或比色标记。报道基因编码一种很容易被检测到的基因产物，例如可通过肉眼观测，显微镜观测，免疫化学反应或酶化验来检测。优选的报道基因所编码的基因产物可以通过非破坏性的方法检测到同时不会破坏表达报道基因的细胞。

外源DNA序列的另一个例子是治疗基因。编码基因产物(如多肽或RNA)的治疗基因在宿主细胞中表达时能够向宿主细胞或包含宿主细胞的组织或器官或生物体提供治疗或其它需要的功能。治疗可以通过修饰宿主基因组的某个基因的功能或者通过由治疗蛋白，多肽或RNA所提供的附加功能来完成。

“同源的”表示核酸序列的特征，指至少有70％的序列相同。

“同源重组”指具有同源序列的两个核酸分子杂交或在同源区进行重组。

同源的长度如何选择(交叠的同源部分)，要靠研究人员根据序列的构成和外源DNA序列的复杂性，在本领域实验操作技术的指导下来判断(Hasty et al.1991Molec.Cell.Biol.11：5586；Shulman et aal.1990 Molec.CELL.boil.10：4466，其内容被引入本文作为参考)。以实例的方式，Rubnitz和Subramani(Mol.And Cell.Biol.4：2253-2258，1984)，描述了同源重组所需的最低量的同源序列。

交叠同源序列的长度可以是100-11000个碱基对。优选的同源区长度是，但不限于200bp，600bp，900bp，1200bp，4500bp，7200bp。

“肿瘤特异性基因表达”和“肿瘤特异性”在此包含载体基因在肿瘤细胞中表达，但应理解为载体基因的表达在正常细胞中也可能发生，尽管是低水平表达，而这种低水平表达导致载体低水平的、无效的复制和包装，被认为可以忽略或者是背景因素

“第一代腺病毒载体”或“第一代重组腺病毒载体”指在E1和/或E3区有一个或多个基因缺失，该缺失使得腺病毒的复制能力显示缺陷，或称复制缺陷型腺病毒。虽然此载体在正常细胞中也会有表达，但表达水平很低，使得载体复制和包装无法有效进行，以至于可以将这样低的复制包装水平忽略不计。

“G1期”复制前期或合成前期

“S期”DNA合成期或复制期

“G2期”复制后期或合成后期

“M期”有丝分裂期

“非活性周期细胞”指静止的，未经历细胞周期途径的各个阶段，【如G1，S期，G2期和/或M期】的细胞。最常见的非活性周期细胞停留在G1或G2期。

“活性周期细胞”指为了复制经历细胞周期的细胞，包括G1，S，G2和M期细胞。肿瘤细胞属于活性周期细胞。

“载体”包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体。载体序列可以指病毒的出发质粒(base vector)序列，出发质粒载体的序列根据出发载体来源的特定的病毒类型和亚型的不同而变化，可以与非载体或外源DNA序列相连接。

“出发载体序列”可以是可操作地连接到编码基因产物如多肽，rRNA或tRNA的基因序列之上的序列。举例来说，外源DNA序列可以是编码如病毒衣壳蛋白或病毒纤维蛋白的序列。它可以来源于相同或不同的亚型来作为基础载体序列。

出发载体序列可以连接到作为调控元件的外源DNA序列上，如启动子，增强子，转录终止信号，多聚腺苷酸序列。调控元件通过指导转录或翻译来指导编码基因产物的外源DNA的表达。调控元件可以调控外源DNA序列表达的数量和时相。调控元件可以指导外源DNA在特定宿主细胞或组织中的表达(如宿主特异性或组织特异性表达)。

出发载体序列可以连接到外源DNA上从而使载体能够整合到其它核酸序列中。整合序列可以引导整个载体或载体的部分进行整合。整合序列与出发载体序列可以相关也可以不相关。例如整合序列和出发载体序列可以来自相同或不同的病毒血清型。整合序列可以为腺病毒(Ad)，腺相关病毒(AAV)或艾滋病毒(HIV)的反向重复序列(IR)。

出发载体序列可以连接于能够引导载体与宿主细胞基因组发生同源重组的外源DNA序列。这种外源DNA序列可以来自于和出发载体序列来源相同的同种病毒血清型。

载体可以用来将外源序列转运至宿主细胞或宿主细胞基因组中。

载体可以包含多种限制性内切酶位点使得能够很方便的在其中插入外源DNA序列。

“杂合载体”这一术语在本发明中指包含结合了来自两种不同的病毒(如腺病毒和腺相关病毒)的核酸序列的载体。

“嵌合载体”这一术语在此指载体的核酸序列对出发载体而言为非天然的核酸序列(如并非天然存在的序列或不处于其天然背景下的序列-包括同源序列)。本发明中所使用的嵌合载体还可以是一种杂合载体。嵌合载体的一个例子为在其病毒衣壳上表达修饰过的纤维蛋白的Ad.AAV。

“转导”或者“感染”这一术语在此指将病毒颗粒中的病毒DNA引入宿主细胞中的一种方法。病毒DNA在此以重组病毒的形式出现，重组病毒产生的方式为将一段目的DNA片段(可以为能够表达功能蛋白的基因)插入到病毒基因组中。

“转染”在此指将DNA片段引入宿主细胞中的方法。

“异源的”在此指特定位置的核酸序列或多肽序列对于出发的腺病毒载体和被转化的细胞并非内源性的。例如，一段多肽可以从一个蛋白转到另一个蛋白，所形成的蛋白即为此处所述的异源蛋白。一个嵌合的纤维蛋白(例如血清型5的尾部区和血清型35的轴区和球形区)即被认为对于Ad5载体来说为“异源”。该名词还包括来自于一种毒株或血清型的腺病毒的核酸(如编码序列)被引入到另一种不同的毒株或血清型的腺病毒中。

“调控元件”这一术语包括启动子，增强子，转录终止信号，多聚腺苷酸序列和其它表达控制序列。在本发明中调控元件包括但不限于能够在特定的宿主细胞(如组织特异性调控序列)中指导核酸序列表达。

“可操纵的连接”这一术语指多核苷酸序列(如一段编码序列或基因)以特定方式连接于调控元件序列，使得调控元件序列能够控制和调节多核苷酸序列的转录或翻译或两者皆可。调控元件的方向可以变化(如对于右面的反向重复序列ITR来说其方向是反向的)。这一术语还包括在多核苷酸序列的前面有一适当的启动信号(如ATG)来进行表达并维持正确的阅读框，从而使得多核苷酸序列的表达在表达控制序列的控制之下以及产生所需要的多肽或蛋白。调控序列还包括3’序列以确保正确的终止(如多聚腺苷酸终止信号)。

“基因治疗”这一术语在此指一种方法：将一段外源核酸序列引入到细胞中，并通过外源核酸的表达导致受体细胞的功能修饰。外源核酸序列可以为治疗性的，因此其所编码的蛋白，多肽或RNA能够纠正由于遗传错误造成的细胞功能的紊乱或者能够抵消任何不需要的功能，这些功能通常与遗传性或者获得性疾病相关。“外源核酸序列”指在被处理的细胞中没有正常表达的DNA或RNA序列。这一术语还指与未经处理，未被转化的细胞相比，这些DNA序列或RNA序列在被治疗的细胞中是以更高，更低或者其它不同模式进行表达。这种非自然的表达也可以被定义为异源表达。

“基因治疗载体”指用于基因治疗的载体，例如将外源核酸序列引入受体或宿主细胞。外源核酸序列可以瞬时表达或者整合并在受体或宿主细胞中稳定的表达。

“质粒”这一术语在此指任何能够在宿主中独立进行复制并维持高拷贝数的核酸分子，其可以作为克隆工具。

“DNA的平行链”和“DNA的反向平行链”分别代表腺病毒DNA双链的每一条。图示的为DNA的平行链的核酸序列的位置。DNA的反向平行链指DNA双链中的另一条，图中没有显示。纤维蛋白是由DNA的反向平行链所编码。为简化载体图，纤维蛋白被标明在DNA的平行链，实际基因应位于反向平行链。

“报道基因”指任何一种核酸序列，其所编码的多肽或蛋白质能够很容易的被检测，例如通过肉眼观测，显微镜观测，免疫化学反应或酶化验来检测。优选的报道基因所编码的基因产物可以通过非破坏性的方法检测到同时不会破坏到表达报道基因的细胞。

“选择基因”在此指任何一种核酸片段，其所编码的多肽或蛋白质的表达用来标志已被给定载体所转染的细胞。

“治疗基因”这一术语在此指编码功能性多肽，蛋白质或RNA的DNA片段，其在宿主细胞中表达时能够向宿主细胞或包含宿主细胞的组织或器官或生物体提供治疗或其它需要的功能。治疗可以通过修饰宿主基因组的某个基因的功能或者通过由治疗蛋白，多肽或RNA所提供的附加功能来实现。

“宿主组织”或“宿主细胞”这一术语在此指治疗基因在其中表达并修饰其功能的组织或细胞。

可以替换蛋白质序列中的某些氨基酸而并不影响蛋白质的功能在生物领域中是显而易见的。通常，保守的氨基酸替代或者相似的氨基酸替代不会影响蛋白质的功能。相似的氨基酸是指那些在大小和/或电荷性质上相似的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸，以及异亮氨酸和缬氨酸都是相似的氨基酸对。氨基酸对之间的相似性可以通过多种方式来评价。例如，Dayhoff et al.(1978)in Atlas of Protein Sequence and Structure，Volume 5，Supplement 3，Chapter22，pp.345-352，在此被加入作为参考文献，其提供的氨基酸替换的频率表可以作为氨基酸相似性的一种度量。Dayhoff的频率表是基于对一系列进化上不同来源但有相似功能的蛋白质的氨基酸序列进行对照。所以本发明中任何在氨基酸序列上的明显变化(如上所述)都已经被考虑在内。

如上所述，“本质相似”的多肽除由保守的氨基酸变化造成的某些位置的残基不相同之外，有着共同的序列。保守的氨基酸替换是指具有相似侧链的氨基酸残基的可交换性。例如，一族侧链为羟基的脂肪族氨基酸如丝氨酸和苏氨酸；一族包含酰胺侧链的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺；一族具有芳香族侧链的氨基酸如苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；一族具有碱性侧链的氨基酸如赖氨酸，精氨酸和组氨酸；一族侧链包含硫的氨基酸如半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换包括但不限于：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，在本发明中任何在氨基酸序列上“本质相似”序列的多肽替换(如上所述)都已经被考虑在内。

本发明主要包括如下几个方面：

1、本发明提供一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，其含有：

a)外源DNA序列；和

b)一对反向重复序列，分别连接于所述外源DNA序列的两侧。

所述的反向重复序列介导两个相同腺病毒载体的反向重复序列之间的相互同源重组。所述的重组腺病毒载体优选进一步含有细菌复制起始子。

2、本发明提供一种获得解离的重组腺病毒载体的方法，包括：在适合的环境条件下，将至少两个以上第1项所述的亲本重组腺病毒载体导入一个复制活性细胞中，这样两个载体在转导的复制活性细胞中可以发生同源重组，进而生成解离的重组腺病毒载体。本发明还提供通过该方法产生的解离的重组腺病毒载体。其中，所述复制活性细胞是肿瘤细胞。所述的解离的重组腺病毒载体优选是被包装的载体。

3、本发明还提供一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，其含有：编码目标基因的DNA序列的第一片断，这个DNA序列与在另一个重组腺病毒载体中编码同一个目标基因的DNA序列的第二片断有部分的重叠区，可以导致在这个重叠区域两个DNA片断发生同源重组，重组后形成一个完整的基因，它可以表达目的蛋白。

所述的重组腺病毒载体优选进一步含有细菌复制起始子。

4、本发明提供一种获得解离的重组腺病毒载体的方法，包括：在适合的环境条件下，将至少两个以上第3项所述的亲本重组腺病毒载体导入一个复制活性细胞中，这样两个载体在转导的复制活性细胞中可以发生同源重组，进而生成解离的重组腺病毒载体。本发明还提供通过该方法产生的解离的重组腺病毒载体。其中，所述复制活性细胞是肿瘤细胞。所述的解离的重组腺病毒载体优选是被包装的载体。

5、本发明还提供一种重组腺病毒载体，由两条反向平行的DNA链组成，其中第一条链的组成如下：

a)腺病毒左端反向末端重复序列；

b)位于左端反向末端重复序列的3｀端的腺病毒包装序列；

c)位于腺病毒包装序列3｀端的启动子序列；

d)第一反向重复序列，位于启动子序列3｀端；

e)位于第一个反向重复序列3｀端的外源DNA序列，方向是由3｀端到5｀端；

f)第二反向重复序列，位于外源序列(e)的5｀端；

g)负责腺病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，它(它们)位于第二个反向重复序列的3｀端；

h)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端；

第二条链选择性地包含编码腺病毒纤维蛋白的序列，该蛋白使得所述的腺病毒载体靶向特定的宿主细胞。

第5项所述的重组腺病毒载体，进一步包含一个位于第一个反向重复序列3｀端的双向转录终止位点序列。具体地讲，所述终止位点是一个SV40病毒的双向多聚腺苷序列。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，启动子具有肿瘤特异性。在在第5项所述的重组腺病毒载体中，肿瘤特异启动子是劳氏肉瘤(Rous Sarcoma)病毒启动子序列。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，终止位点还可以是一个合成的双向多聚腺苷序列终止位点。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，在外源DNA序列两侧的成对的反向重复序列是相同的序列。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，在外源DNA两侧的反向重复序列是可切割的，其可提供和接收结合位点的拷贝。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，在外源DNA序列两侧的反向重复序列是一个β-球蛋白内含子(intron)序列，不含任何转录及翻译终止位点。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，外源DNA序列表达一个或多个基因产物，包括治疗基因，选择基因，报告基因。所述治疗基因，包括细胞凋亡基因，细胞裂解基因，自杀基因，显性负性I-k-β(negative i-κ-β)，胱天蛋白酶(caspase)，γ球蛋白、人α-1抗胰蛋白酶(hα-1 anti-trypsin)基因。所述选择基因，包括新霉素(neomycin)、氨苄青霉素(ampicillin)、青霉素(penicilin)四环素、(tetracyline)、庆大霉素(gentamycin)基因。所述报告基因，包括人β-葡萄糖苷酸酶、绿色荧光蛋白(fluorescent)、β牛半乳糖苷酶(galactosidase)、碱性磷酸(酯)酶基因。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，所述的外源基因编码一个融合蛋白，该融合蛋白含有一个毒性部分和一个HSV VP22蛋白。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，所述的外源基因是腺病毒E1a基因。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因选自于E1、E2和E4；E2、E3和E4；E2和E4。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，该腺病毒载体还可含有一个绝缘DNA元件，它位于腺病毒包装序列的3｀端。其中，所述绝缘DNA元件是一个鸡γ-球蛋白绝缘元件，或者是一个果蝇黑色素吉普赛(melanogaster gypsy)绝缘元件，它位于腺病毒包装序列的3｀端。

在第5项所述的重组腺病毒载体中，所述的重组腺病毒载体优选进一步含有细菌复制起始子。

6、本发明还提供一种产生解离的重组腺病毒载体的方法，包括：将以上第5项所述的重组腺病毒载体导入宿主细胞，其中，同源重组发生在两个载体的反向重复序列部分，因此可以产生重组腺病毒载体，所得的重组腺病毒载体具有能够在被转导细胞中表达的外源DNA序列。本发明还提供该方法产生的解离的重组腺病毒载体。

具体地讲，用于在以上第6项中导入宿主细胞的解离的重组腺病毒载体优选包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的启动子序列

d)第一反向重复序列，该序列位于启动子序列的3｀端

e)滞留转录的双向转录终止位点序列，位于第一个反向重复序列3｀端

f)以3｀到5｀取向的外源DNA序列，位于双向终止位点序列3｀端

g)第二反向重复序列，该序列位于外源DNA序列(f)的上游

h)以3｀到5｀取向的启动子序列位于外源DNA序列(f)的上游

i)以3｀到5｀取向的腺病毒包装序列，位于的启动子序列(g)的5｀端

j)腺病毒右端反向末端重复序列位于腺病毒包装序列的3｀端。

另外，所述的解离的重组腺病毒载体优选是被包装的载体。

7、本发明还提供一种用于产生被包装的含有外源DNA序列的重组腺病毒载体方法，该载体能够被包装并转导其它细胞，此方法包括：将以上第6项中所述重组腺病毒载体导入宿主细胞，腺病毒在其中复制并包装产生被包装的腺病毒，其能够从被转导的细胞中出来并被转导其它细胞。该方法产生的被包装的重组腺病毒载体也包括在本发明之中。

8.本发明提供一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，该载体由两条反向平行的DNA链组成，其中第一条链的组成如下：a)腺病毒左端反向末端重复序列b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列c)位于包装序列3｀端的启动子序列d)位于启动子序列3｀端的目标基因序列的5’端部分，其含有一段能够与目标基因序列的3’端部分中的一段序列同源交叠的DNA序列e)负责腺病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于目标基因序列的5’端部分序列的3’端f)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端

第二条链选择性地包含编码腺病毒纤维蛋白的序列，该蛋白使得所述的腺病毒载体靶向特定的宿主细胞。

在第8项所述的重组腺病毒载体中，所述的重组腺病毒载体优选进一步含有细菌复制起始子。

9、本发明提供一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，其由两条反向平行的DNA链组成，其中第一条链的组成如下：a)腺病毒左端反向末端重复序列b)负责腺病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于左端反向末端重复序列3｀端c)位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端的目标基因序列的3’端部分，其含有一段能够与目标基因序列的5’端部分中的一段序列同源交叠的DNA序列d)位于目标基因序列3｀端的多聚腺苷序列e)位于多聚腺苷序列终止位点的3｀端的腺病毒包装序列f)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于腺病毒包装序列的3｀端

第二条链选择性地包含编码腺病毒纤维蛋白的序列，该蛋白使得所述的腺病毒载体靶向特定的宿主细胞。

在第9项所述的重组腺病毒载体中，所述的重组腺病毒载体优选进一步含有细菌复制起始子。

在以上第8或第9项所述的重组腺病毒载体中，其中目标基因优选是外源DNA序列。

在以上第8或第9项所述的重组腺病毒载体中，其中同源交叠区优选含有100个碱基对到11,000个碱基对

在以上第8或第9项所述的重组腺病毒载体中，其中负责在被转导细胞中腺病毒复制的基因来源于E1、E2和E4；E2、E3和E4；E2和E4。

在以上第5、8或第9项所述的重组腺病毒载体中，其中位于反向平行链的编码腺病毒纤维蛋白的序列控制腺病毒的靶向，包括球形结构区、轴(杆)区、尾部区。其中，纤维蛋白的尾部区和左、右反向末端重复序列优选来源于相同的血清型。其中，纤维蛋白的轴(杆)区和左、右反向末端重复序列优选来源于不同的血清型。纤维蛋白的轴(杆)区的来源选自3，7，9，11，35型腺病毒。其中，轴(杆)区纤维蛋白优选是短轴(杆)蛋白。纤维蛋白球形区和左、右反向末端重复序列优选来源于不同的血清型的腺病毒，其中，纤维蛋白球形区优选来源于3，7，9，11，35型腺病毒。

另外，在以上第5、8或第9项所述的重组腺病毒载体中，左、右反向末端重复序列和包装序列优选来源于相同的血清型。

10、本发明提供一种产生解离的重组腺病毒载体的方法，此载体含有能够在被被转导细胞中表达的目标基因，该方法包括：a)将以上第9项中所述的第一个重组腺病毒载体，和以上第9项中所述的第二个重组腺病毒载体导入宿主细胞，其中，同源重组发生在第一和第二个载体的同源交叠序列部分，因此可以产生解离的重组腺病毒载体，该载体含有重新构成的目标基因的开放阅读框，能够在被转导细胞中表达，b)分离所产生的解离的重组腺病毒载体。由此方法产生的解离的重组腺病毒载体也包括在本发明的范围之内。具体地讲，以上第10项所述的解离的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的启动子序列

d)位于启动子序列3｀端的具有开放阅读框的目标基因

e)位于目标基因3｀端的转录终止位点序列

f)位于转录终止位点序列3｀端的腺病毒包装序列

g)腺病毒右端反向末端重复序列，位于腺病毒包装序列的3｀端。

所述的解离的重组腺病毒载体优选是被包装的载体。

11、本发明提供一种生产被包装的腺病毒载体的方法，该方法包括：将以上第8或第9项所述的重组腺病毒载体导入宿主细胞，腺病毒载体在其中复制并被包装，产生被包装的以上第8或第9项所述的腺病毒载体，该载体能够从被转导的细胞中释放出来并转导其它细胞，其中所述载体含有目的基因的部分片段。通过该第10项所述的方法产生的被包装的重组腺病毒载体也包括在本发明的范围内。

12、本发明提供一种至少缺少一个E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的绝缘子DNA元件

d)位于绝缘子DNA元件3｀端的Apo E hAAT启动子序列

e)位于Apo E hAAT启动子序列3｀端的Rep78基因序列的5’端部分，其含有一段能够与Rep78基因序列的3’端部分中的一段序列同源交叠的DNA序列

f)用于病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于Rep78基因序列的5’端部分序列的3’端

g)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端。

在第12项所述的重组腺病毒载体中，所述的重组腺病毒载体优选进一步含有细菌复制起始子。

13、本发明提供一种至少缺少一个E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)用于病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于左端反向末端重复序列3｀端

c)位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端的Rep78基因序列的3’端部分，其含有一段能够与Rep78基因序列的5’端部分中的一段序列同源交叠的DNA序列，该序列

d)位于Rep78基因序列的3’端部分3｀端的SV40多聚腺苷序列终止位点

e)位于多聚腺苷序列终止位点的3｀端的腺病毒包装序列

f)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于腺病毒包装序列的3｀端。

在第13项所述的重组腺病毒载体中，所述的重组腺病毒载体优选进一步含有细菌复制起始子。

14、本发明提供至少缺少一个E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的绝缘子DNA元件

d)位于绝缘子DNA元件3｀端的Apo E hAAT启动子序列

e)位于Apo E hAAT启动子序列3｀端的Rep78基因序列开放阅读框

f)位于Rep78基因序列开放阅读框的3｀端的SV40多聚腺苷序列终止位点

g)位于多聚腺苷序列终止位点的3｀端的腺病毒包装序列

h)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于腺病毒包装序列的3｀端。

15、本发明提供一种用以上第5、8或9项所述的重组腺病毒载体转导细胞的方法，包括：在适当条件下使所述腺病毒载体与细胞接触，使得被转导的细胞表达外源DNA，并且所述腺病毒复制并被包装。其中，优选外源DNA序列是自杀基因或编码一个基因。优选所述的基因编码一种蛋白。所述的蛋白可以是免疫刺激因子，选自于由PDGF，EGF，FGF，TGF，IL，TNF，NGF构成的组。所述的蛋白也可以是促细胞裂解蛋白，选自于由腺病毒E3 11.6，腺病毒E1a，E.coli脱氨(基)酶，HSV胸苷激酶，葡(萄)糖苷酸酶，核酶，反义RNA，hMDR构成的组。所述蛋白也可以是诱导凋亡蛋白，选自于由pTEN，p53，p16，p21，pRb，TRAIL，Fas-L，Vhl(van Hippel Lindau)，ikβ突变体，胱天蛋白酶-3，6，9和促胱天蛋白酶-3，6，9构成的组。所述蛋白也可以是放射性同位素集中器蛋白，选自于由钠/碘同向转运子，逆转录病毒受体，或TPO(thyroperoxidase)构成的组。

 16、本发明还提供通过以上第15项所述的方法产生的被转导的细胞。该被转导的细胞可用探测因子标识。

17、本发明提供一种个体的分裂细胞的转导方法，包括：在适当条件下，使以上第5、8或9项所述的腺病毒载体与所述个体的细胞接触，使得细胞被转导。其中所述的个体是人或除人以外的动物。在该方法中，腺病毒载体被施与外周脉管系统，通过气雾剂施用，或直接施给肿瘤。被转导的细胞优选是肿瘤细胞。通过该方法产生的被转导的细胞也包括在本发明的范围内。

18、本发明提供一种产生目标蛋白的方法，包括：在适当条件下培养以上第5、8或9项所述的腺病毒载体，以便于在宿主细胞中产生目标蛋白，并回收产生的蛋白。本发明也包括由该方法产生的蛋白。

19、一种测试样品中是否存在以上第5、8或9项所述腺病毒载体的方法，包括：使所述样品和一种试剂接触，该试剂能够识别并与腺病毒载体结合，测得试剂与样品中的腺病毒载体结合。其中，所述试剂优选是指抗体或一种核酸分子。

为了让人们对本发明能够被更充分的理解，如下进行了进一步的描述。

经改造的腺病毒载体、同源重组的解离的载体及其应用：

经改造的腺病毒载体

本发明提供了新型经改造的腺病毒载体，其含有一段两端连接第一第二段反向重复序列(IR)的外源DNA序列，其中经改造的载体缺少一个腺病毒基因序列E1A，E1B，或E3，或缺少了这些腺病毒基因序列的任何组合。IR介导载体之间的同源重组，获得解离的载体，进而激活外源基因的表达。重组腺病毒也可以在被转导的细胞中包装，并且被包装的载体能够转染其它细胞。

所述腺病毒载体指所有已知的腺病毒血清型载体，即1-51型腺病毒。

本发明一个具体实施方案是，第一和第二段反向重复序列(IR)具有相似的序列，另一实施方案是，第一和第二段IR完全相同。再有的实施方案，外源DNA序列编码全长基因产物，另外的实施方案是，外源DNA序列只编码所选基因产物的一部分，所含的部分可以编码目的蛋白的N端部分也可以编码目的蛋白的C端部分，分别用5’或3’端序列编码。

本发明一个具体实施方案是，经修饰的腺病毒载体包括，按从5’到3’方向含有：第一段腺病毒反向末端重复序列；第一段反向重复序列；一段外源DNA序列；第二段反向重复序列；至少一段腺病毒复制基因序列；第二段腺病毒反向末端重复序列。优选的另一实施方案是载体的构成如下，按从5’到3’方向含有：以5’到3’取向的第一段腺病毒反向末端重复序列；以3’到5’取向的第一段反向重复序列；以3’到5’取向的一段外源DNA序列；以5’到3’取向的第二段反向重复序列；至少一段腺病毒复制基因序列；以3’到5’取向的第二段腺病毒反向末端重复序列。

本发明一个实施方案是，第一和第二段反向重复序列(IR)具有相似的序列，另一实施方案是，第一和第二段IR完全相同。再有的实施方案，外源DNA序列编码全长基因产物，另外的实施方案是，外源DNA序列只编码所选基因产物的一部分，所含的部分可以编码目的蛋白的N端部分也可以编码目的蛋白的C端部分，分别用5’或3’端序列编码。

再具体点说，本发明一个具体实施方案是，经修饰的腺病毒载体含有一对腺病毒反向末端重复序列，一段腺病毒包装序列，一段启动子序列，至少一段腺病毒复制基因序列。该载体的构成，以5’到3’取向含有：第一段腺病毒反向末端重复序列；一段腺病毒包装序列；一段启动子序列；第一段反向重复序列；一段外源DNA序列；第二段反向重复序列；至少一段腺病毒复制基因序列和第二段腺病毒反响末端重复序列。另一优选具体实施方案是载体的构成如下，以5’到3’取向含有：以5’到3’取向的第一段腺病毒反向末端重复序列；一段腺病毒包装序列；以3’到5’取向的第一段反向重复序列；以3’到5’取向的一段外源DNA序列；以5’到3’取向的第二段反向重复序列；至少一段腺病毒复制基因序列，以3’到5’取向的第二段腺病毒反向末端重复序列。

本发明一个更为具体的实施例是哺乳动物腺病毒—人腺病毒5型(见实施例IG)：

有报道一种新型的腺病毒载体(Ad.IR)(Steinwaerder DS。et。al。Naturemedicine。2001 Feb；7(2)：240-243)将腺病毒载体中插入两段反向重复序列，可以使腺病毒在复制过程中发生可定位的同源重组，产生一个截短的基因结构，使插入反向重复序列中反向的外源基因可以正向表达。而这种腺病毒载体的复制只发生在快速生长的肿瘤细胞中。所以，被反向插入于腺病毒载体中的外源基因即可以特异性的表达于肿瘤细胞中，如果外源基因是具有杀伤性的治疗基因，则其在其中表达的肿瘤细胞就会被杀死。

对于肿瘤基因治疗载体，一方面要求其可以在肿瘤细胞内特异性表达外源基因；另一方面，也希望其能在肿瘤细胞内特异性复制、产生子代病毒侵染周围未被感染的肿瘤细胞，提高对肿瘤细胞的杀伤效果。同时，要求其在正常细胞中尽可能不复制，减低对正常细胞的杀伤。为达到这两个目的，将Ad.IR腺病毒载体与5型腺病毒E1a基因结合将会产生一个理想的结果。

5型腺病毒E1a基因位于病毒基因组左端，具有有84％的保守性。E1a编码两个主要的蛋白，一个有243个氨基酸(12S，243R)，一个有289个氨基酸(13S，289R)。E1a-12S和E1a-13S蛋白通过激活病毒基因的表达促使病毒复制。(Shenk，T。1996。Adenoviridea，P。2111-2148。)E1a-12S和E1a-13S蛋白是腺病毒最初表达的两个蛋白，具有激活腺病毒其它基因，特别是E2区和E4区基因的功能，而这两个区的功能是有关腺病毒的复制。

E1a直接活化细胞基因，诱导细胞DNA复制，与细胞周期调控蛋白质pRb，pRb相关蛋白(P107/P130)或P300相互作用。E1a与pRb家族蛋白分子的结合，释放出E2F家族的转录因子，造成宿主细胞中一些有关DNA合成的基因被正向调控，使静止期细胞进入S期。这些和一些其它在S期激活的细胞因子，产生了一个适合病毒DNA合成的环境。在正常细胞中，E1a诱导细胞周期负调控造成P53蛋白的累积，刺激P53介导G1期细胞停滞(e1-Deiry，W.S.et.al.，1993.Cell.75：817-25；Xiong，Y.et.al.1993.Nature，366：701-4)或进入细胞凋亡途径。另外，E1a诱导的调亡也能通过不依据P53途径发生。(Teodoro，J.G.et.al.1995.Oncogene.11：467-74)

  E1a基因过去曾被认为是一个癌基因，可使动物胚胎细胞发生永生化，并可与其他病毒或细胞的癌基因相互作用。在动物实验中，E1a并不能单独诱发癌变，而需与E1b等其它基因共同起作用。5型腺病毒本身没有致癌性，其它型有致癌性的腺病毒与其单独的E1a基因没有必然的联系。近十年来，很多实验证实，5型腺病毒E1a基因不但对人体细胞没有致癌性，而且实际上可以有抑制肿瘤生长的作用。E1a的肿瘤抑制作用可能与E1a对多种基因的调控有关。主要表现在以下几个方面：①neu基因过度表达与人体恶性肿瘤特别是头颈口腔鳞癌密切相关，也与肿瘤的预后及耐药性相关。而有证据显示，E1a基因在转录水平可以特异性的抑制neu基因的表达，可以抑制如粘附、侵袭等与肿瘤转移相关的特性，E1a基因也能抑制癌基因诱导的包括细胞多形性等在内的癌变特性，也可提高高表达neu基因的乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性(Yu DH，et.al.Molecular basis ofoncology.1995：131-162；Ueno NT，et.al.Proc AACR，1998，39：360(Abstract))②E1a通过提高细胞P53水平诱导细胞凋亡，产生抗肿瘤作用。③E1a可以提高细胞对5-氟尿嘧啶、顺铂等化疗药及辐射所诱导的细胞凋亡的敏感性。④E1a可在宿主细胞表面表达，提高机体对细胞表达E1a基因的细胞的杀伤、清除，达到抗肿瘤效果。

作为肿瘤基因治疗，现有问题是提高其特异性地在肿瘤细胞中的表达，Ad.IR重组腺病毒载体具有这一特征，而Ad.IR载体应用于临床的前景在于提高其对肿瘤细胞的感染率或使其可以在肿瘤细胞中特异地有效地复制，并扩散侵染周围未被感染物的肿瘤细胞，提高对肿瘤细胞的杀伤效率。

E1a基因作为抗肿瘤基因近年来已运用于临床试验中。本发明人经过研究试验，将E1a基因插入Ad.IR载体，构建出一种新的肿瘤基因治疗腺病毒载体M003。该腺病毒载体已于2001年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，该中心给出的保藏编号为V200106。构建M003的目的是提供一种可以特异性的肿瘤细胞中复制的腺病毒载体，表达E1a基因，从而特异高效的杀死肿瘤细胞。

本发明所提供的腺病毒载体可以在肿瘤内特异性表达外源基因的原理是基于此载体在肿瘤细胞内特异性的复制并重组。本发明所提供的腺病毒载体可以促进其在肿瘤内的扩散。对于这种肿瘤特异性载体，载体病毒的扩散有利于诱导肿瘤细胞凋亡，增强病毒从受感染肿瘤细胞中释放并感染其它周围未被感染的肿瘤细胞，从而增强对肿瘤细胞的杀伤效果。

本发明中所构建的重组腺病毒载体是经过改造的5型腺病毒。5型腺病毒的基因组含有35935个核苷酸。5型腺病毒是目前研究的最为清楚的一种病毒。流行病学上主要引起人的呼吸道感染，有明显的自愈性。腺病毒作为疫苗应用于人体已有几十年的历史，从未发现有转化人正常细胞及致癌现象发生。

本发明所构建的重组腺病毒载体如图1中所使示的M003和M005。在M003中，腺病毒载体E1a的启动子区被删除，加入RSV病毒启动子(RSVp)控制整个腺病毒载体的复制。RSVp启动子下游是一个表达组件。5’-3’方向依次由碱性磷酸酶基因(AP)，内部核糖体进入位点基因(IRES)，E1a基因和多聚腺苷基因(polyA)组成，并呈3’-5’方向倒置于腺病毒基因组中，该表达组件两侧分别带有反向重复序列(IR).M005是研究用的一个对照病毒，基本结构与M003完全一致，只是其中的E1a基因方向与其在M003中刚好相反，为5’-3’方向。理论上讲，当病毒在肿瘤细胞中复制时，两个病毒基因组之间会在两个反向重复序列之间发生重组，RSV启动子会被复制并反向连接到表达组件的下游，产生一个小的表达单元，在这个单元中，原先在M003病毒中3’-5’方向插入的E1a基因及AP基因可以得到表达。而在M005病毒中5’-3’方向插入的E1a基因不能表达，这样就可以观察到E1a基因在Ad.IR病毒载体生长复制过程中所起的作用。

本发明解决了肿瘤基因治疗领域中的两个问题：

(1)如何在肿瘤细胞内特异性的表达基因，通过使用Ad.IR重组腺病毒载体，可以在肿瘤细胞内特异性表达外源基因，如果特异表达的是一些细胞毒性外源基因或与细胞凋亡有关的外源基因，将对多种肿瘤的治疗提供一种有效的手段。

(2)如何促进肿瘤基因治疗载体的抗肿瘤效果。目前的肿瘤基因治疗载体普通存在感染杀伤效率低的问题。本发明中所使用的重组腺病毒载体，利用5型腺病毒E1a基因，促进病毒载体在肿瘤细胞内的复制及在肿瘤细胞间的扩散。同时，E1a基因也可以发挥抗肿瘤作用。

本发明的经改造的腺病毒载体能够在处于快速细胞周期中的细胞中复制，快速细胞周期中的细胞是指为进行细胞DNA复制进入G1(gap1)，S(DNA合成)，G2(gap2)或M(有丝分裂)期的细胞，包括肿瘤细胞。所述肿瘤细胞可以是任何组织中的，包括颈部，结肠，肺，或乳腺。肿瘤细胞可以是伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤，鼻咽癌(nasalpharyngeal)，霍奇金氏(Hodgkins)淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，肝癌，或非多瘤病毒诱发的(apolyoma-induced)实体瘤细胞。

本发明的经改造的腺病毒载体在细胞中进行分子重组。分子重组可在任何两个本发明的经修饰的腺病毒载体之间产生。例如，可在两个相同的载体间进行，每个载体都含有外源DNA的全长或部分序列。也可在两个不同的载体之间进行，包括在两个分别含有外源DNA序列的5’端部分和3’端部分的载体。

优选实施方案是外源DNA序列的5’端部分和3’端部分包含有一段交叠重复部分，分别含有5’端部分和3’端部分的两个不同的载体之间发生重组。

沿着两个进行分子重组的载体的序列，任何同源序列部分都可能发生重组(如同源重组)。例如，一个载体的反向重复序列和另一载体的反向重复序列之间发生重组。两个载体中的外源DNA的同源交叠部分之间发生重组。

我们把进行分子重组的两个载体称作亲代载体。通过分子重组获得的载体称为“解离的”载体。通过两个本发明所述的经修饰的腺病毒载体之间的分子重组，能够产生一个“解离的”载体。所得的“解离的”载体含有各种亲代载体所有的载体元件，以不同于亲代载体的取向重排。载体元件包括反向末端重复序列，包装序列，绝缘子序列，启动子，反向重复序列，DNA外源DNA序列，腺病毒序列。

“解离的”载体可以含有一个附加启动子序列位于外源DNA上游序列。例如，在“解离的”载体中，第二个启动子位于外源DNA序列上游，位于外源DNA序列上游的启动子能够控制外源DNA的转录(即外源DNA的表达)。

本发明一个优选的实施方案在于，含有全长外源DNA序列的两个相同亲代载体在细胞中进行同源重组，产生一个“解离的”载体，该载体包含以可预见的取向重排的载体元件，其中启动子位于外源DNA序列上游，能够控制外源DNA的转录。

“解离的”载体能够以两种形式发挥功能：一些“解离的”载体能够整合进宿主基因组，另一些能够被包装并进入其它的细胞进一步复制并进行分子重组。

在本发明一个具体的实施方案中，新型腺病毒载体保留了在处于活跃分裂状态的细胞中复制的能力。而且，这种新型腺病毒载体能够在处于活跃分裂状态的细胞中重组(此处指亲代载体)。可选择地，亲代载体包含一段编码所选基因部分序列的外源DNA，该基因编码目的蛋白的N末端或C末端部分。

在体内，来自体内模拟体内的体外环境，体外分别进行实验：将本发明的亲代腺病毒载体导入宿主细胞，载体在细胞内复制，进行同源重组。重组产生可预见的基因组重排衍生物(在此指“解离的”载体)。本发明的“解离的”载体被设计为能够在处于活性周期细胞的细胞中表达“解离的”外源DNA序列，尤其是肿瘤细胞中，无论是在人的肿瘤细胞中还是动物的肿瘤细胞中。

举例来说，遗传信息重组可以通过两个同种载体共转染细胞来实现(单载体系统，也就是某一类型的一个载体被转导入宿主细胞后与另一个拷贝同源重组)(见实施例IA)。用这种单载体系统感染，提供了亲代载体基因组内的IR序列，其能够使同一体系的两个亲代载体在感染后发生基因组重排。亲代载体的构成，按从5’到3’方向含有：一段5’腺病毒反向末端重复序列(AdITR)，或连接到AdITR3’端的腺病毒包装序列，连接到腺病毒包装序列3’端的异源启动子，一段连接到异源启动子3’端的5’IR，可选择的，一段连接到5’IR3’端的双向polyA序列，一段连接到5’IR3’端以3’→5’取向的外源DNA序列(外源DNA)，一段连接到外源DNA序列上游的3’IR，至少一段连接到3’IR3’端的腺病毒复制所要求的腺病毒基因序列，和一段连接到病毒基因3’端的3’ITR。为方便起见，该载体被称为Ad.IR。

举例来说，遗传信息重组也可以通过两个相互之间能够进行同源重组的不同的亲代载体共转染细胞来实现(双载体系统，也就是两种类型的不同亲代载体，每一个携带相同的外源DNA的一部分，当被转导进一个宿主细胞后发生同源重组，产生一个具有全长外源DNA的“解离的”载体)(见实施例1B)，按照本发明，该系统构成如下：(1)第一个亲代腺病毒载体包含一段腺病毒左端ITR序列，一段连接到左端ITR3’端的腺病毒包装序列，一个异源启动子，一段外源DNA序列(任何一段编码蛋白部分序列的重组DNA)，至少一段载体在宿主细胞中复制所要求的腺病毒基因序列(第一个亲代腺病毒载体在此也被称作Ad.1)；和(2)第二个亲代腺病毒载体，包含一段腺病毒左端ITR序列，至少一段连接到左端ITR3’端的，载体在宿主细胞中复制所要求的腺病毒基因序列，一段连接到用于复制的腺病毒基因序列3’端的外源DNA序列(任何一段编码蛋白部分序列的重组DNA)，一段连接到外源DNA序列3’端的polyA终止序列，一段连接到polyA终止序列的腺病毒包装序列，一段连接到腺病毒包装序列3’端的3’ITR(第二个亲代腺病毒载体在此也被称作Ad.2)。

可选择地，上代腺病毒载体可进一步含有一个终止序列(终止位点)，保证外源DNA的正确转录和翻译。终止序列可以来源于天然也可以由人工合成。这类例子包括但不限于SV40的polyA终止位点和人工合成的双向转录终止位点。典型地，双向转录终止位点在外源DNA序列的下游终止外源DNA的转录。

按照本发明所述，启动子可以是组织特异性，肿瘤特异性，非组织特异性，诱导型和持续型的。适合的非特异性的一个例子是病毒启动子，包括RSV，HSV，CMV和HPV启动子。尽管肿瘤特异性启动子不是必须的，但为增强肿瘤特异性，可采用它作为外源启动子。

为屏蔽肿瘤特异性启动子免受腺病毒顺式活化DNA元件的干扰，可以在载体中插入用于绝缘的DNA元件。优选的，插入位点在包装信号的3’端或异源启动子的5’端。可选的绝缘元件包括但不限于球蛋白(globin)DNA元件(如鸡球蛋白DNA元件)和吉普赛(gypsy)DNA元件，如蝇(gypsy DNA元件)。

按照本发明，亲代载体中可以包含不干扰外源DNA转录和翻译的3’IR序列，提高“解离的”载体(infra)的转录。可选的IRs包括被有效翻译的mRNA的最小长度100bp的5’不翻译区(如，看家基因housekeeping gene)，内部核糖体进入位点或最小长度100bp的内含子序列。

根据本发明，不干涉外源基因转录或翻译的3’IR序列被包括到本发明的亲代载体中来改善解离的载体(infra)的转录。合适的IRs包括最小为100bp的能有效翻译的mRNA的5’非翻译区，内部核糖体进入位点或最小为100bp的内含子序列。

优选的，载体中的第一和第二反向重复序列是相同的并且彼此具有相反的方向。这些序列介于100-3,000碱基对。优选的，反向重复序列为可切割的。这提供了外源DNA更有效的转录。反向重复序列的实例包括β-球蛋白内含子，其不含有转录或翻译终止位点，但含有切割供接位点。

根据本发明的单载体的系统(Ad.IR)的应用，外源DNA序列方向为3’-5’(在反方向)并且需要一个重组事件来放置启动子从而使外源DNA进行转录。启动子(如外源启动子)允许在宿主细胞中进行同种或异种外源DNA的转录。可以使用任何所要表达的外源DNA，例如报道基因或功能(或治疗)基因。外源DNA的实例包括但不限于，促进凋亡的基因，细胞毒性基因，自杀基因(如抑癌基因，肿瘤抑制基因，毒素或前体药酶)。

促进凋亡或细胞毒性基因产物的例子包括显性负Iκ-B，胱天蛋白酶-3，胱天蛋白酶-6，和包含毒素以及HSV VP22蛋白的融合蛋白。

自杀基因为基因序列，其表达产生蛋白或因子能抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞死亡。自杀基因包括编码酶(如前体药酶)的基因，抑癌基因，肿瘤抑制基因，编码毒素的基因，编码细胞因子，生长因子的基因，或编码制瘤素的基因。

外源DNA的目的可以为抑制肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞或者产生能够抑制肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞的因子。

适合的前体药酶包括胸腺苷酸激酶(TK)，人β-葡萄糖苷酸酶，来自于大肠杆菌的黄嘌呤-尿嘌呤磷酸核糖转移酶(GPT)基因，或大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)，或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。这些例子中，可以给予被这些基因如TK或CD基因的表达产物所代谢的底物。

癌基因和肿瘤抑制基因的例子包括neu，EGF，ras(包括H，K和Nras)，p53，p16，p21，视网膜神经胶质瘤抑制基因(Rb)，Wilm’s肿瘤基因产物，磷酸酪氨酸磷酸酶(PTPase)以及nm23。

适合的毒素的例子包括假单胞菌外毒素A和S；白喉毒素(DT)；大肠杆菌LT毒素，志贺氏毒素，类志贺氏毒素(SLT-1，-2)，篦麻毒素，相思豆毒素，supporin，和gelonin。

适合的细胞因子包括干扰素，白介素，肿瘤坏死因子(TNF)等，生长因子包括转化生长因子-α(TGFα)和β(TGFβ)，细胞集落刺激因子等。

在本发明的一个实施方案中，腺病毒在被转导细胞中复制的基因包括E1，E2和E4。在本发明的另一个实施方案中，腺病毒在被转导细胞中复制的基因包括E2和E4。在本发明的再一个实施方案中，腺病毒在被转导细胞中复制的基因包括E2和E4。任何或所有的这些载体都能够被以结合的方式(同时使用)用于转导细胞。例如，被转导的细胞感染有三个不同的Ad.IRs，其包括用于复制的基因E1，E2和E4，或E2，E3和E4基因，或E2和E4基因。

在另一个实施方案中，本发明的载体进一步包含选择标记。选择标记可以为现有技术中任何一种标记物，例如基因编码的产物能够给予细胞生物素抗性或者补充宿主的缺陷。在这些条件下存活的细胞包含着带有本发明的DNA构建物的载体。

在另一个实施方案中，选择标记为疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，因为胸苷激酶(tk)基因的存在可以通过用核酸类似物来检测，例如阿昔洛韦(acyclovir)或者甘昔洛韦(gancyclovir)，会对含有HSV-tk基因的细胞会产生细胞毒。缺乏对这些核酸类似物的敏感性说明缺乏胸苷激酶，因此当同源重组发生时，一个交叉事件也会同时发生。

其它合适的标记物还包括但不限于原核β-葡萄糖苷酸酶，放射性同位素串连物，碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白。

同源重组产生的解离的载体

解离的载体能够用本发明中的亲代载体来产生。例如，本发明中的载体能够通过已知的方法如感染被转入到宿主细胞中(优选的为肿瘤细胞)。经过感染后，Ad DNA在细胞中如肿瘤细胞发生特异性复制。在复制后，本发明的解离的Ad载体能够整合到被转化细胞的基因组中。可替换的，复制的Ad载体能够被包装。

例如，在单载体系统中，AdDNA复制使得亲代Ad载体与宿主细胞内的另一个载体拷贝发生同源配对。然后亲代载体发生同源重组来产生解离的载体(如ΔAd.IR)，其能够表达解离的外源DNA序列但不能有效的包装到病毒颗粒中。这种解离的载体(如ΔAd.IR)包含全长的外源DNA序列，在外源DNA序列的5’端和3’端有IR序列，两个反向的亲本载体的5’末端分别位于5’端和3’端，以及启动子以3’-5’方向位于外源DNA的5’端，其能够使外源DNA序列转录。在一个具体实例中，5’末端包括Ad ITRs，Ad ITR3’端的包装序列以及位于包装序列3’端和5’IR5’端的所有序列。优选的，用于复制的腺病毒基因不在解离的载体中。

另一个实施例中，在双载体系统中，Ad DNA复制使得两个亲代载体彼此同源配对并在重叠的同源区发生外源DNA的同源重组从而产生解离的载体。解离的载体具有能够在宿主细胞中被表达的全长外源DNA。

解离的载体(如ΔAd.1-2)包含全长的外源DNA。由全长的外源DNA能够表达目的蛋白。而且，解离的载体包含亲代载体5’和3’末端的部分拷贝。存在于解离的载体5’末端的部分包括5’Ad ITR，位于Ad ITR3’端的包装信号，和位于包装信号3’端的异源启动子。存在于解离的载体中的亲代3’末端部分包含位于外源DNA3’端的多聚腺苷酸终止位点，位于多聚腺苷酸终止位点3’端的腺病毒包装序列，以及位于包装信号3’端的3’ITR。优选的，用于复制的腺病毒基因不在解离的载体中。

解离的载体的特殊功能性元件包括外源启动子，由于其与外源DNA5’末端建立的连接，能够起始外源DNA的表达。优选的，也包括了能够防止亲代载体形成反义RNA的双向polyA。解离的载体的形成仅在亲代载体的DNA复制时发生。这个系统允许复制依赖型的基因表达以及可能的肿瘤特异性基因表达。

外源DNA中进行同源重组的部分其长度通常在100bp到约11000bp的范围。同源区的长度优选，但不限于的为：200碱基对(bp)，600bp，900bp，1200bp，4500bp，7200bp。进行重组的区域可能包括编码区，其中编码区可以仅为一个开放阅读框或外显子和内含子的组合。

为制备本发明中的载体，最好已经知道发生同源重组的序列。同源区的大小可以由已知序列的大小来决定。

一旦本发明的载体被转入到活性周期细胞中，其能够复制并进行或者(1)被包装；或者(2)发生同源重组并表达其外源DNA。在第一种情况下，亲代载体被有效包装，从宿主细胞中出来转导周围的细胞，如活性周期细胞或转移性肿瘤细胞。第二种情况下，亲代载体复制并发生同源重组来产生能够表达其外源DNA的解离的载体。解离的载体只能以非常低的效率被包装。本发明的这两个特性使得载体能够传播并转化其所处的区域如肿瘤的细胞，同时也会分散到并转化散布的位点如肿瘤的转移灶，并在所有被转化的细胞中表达其外源DNA。

经改造的载体的应用

本发明的Ad载体被用于选择性的转化细胞的方法中(如肿瘤细胞)。进行着细胞周期的被转化的细胞能够表达解离的载体中目的外源DNA序列，来直接或间接改善疾病状态。这种方法包括基因治疗的方法。

本发明的载体能够主要在肿瘤细胞中表达解离的外源DNA序列(如外源DNA)，因而使得外源DNA在肿瘤细胞中表达，如子宫颈癌细胞，肺癌细胞，肝癌细胞，乳腺癌细胞，结肠癌细胞，胰腺癌细胞，膀胱癌细胞和前列腺肿瘤细胞。

在一个实施方案中，涉及了用于病毒传播的方法。该方法包含给予研究对象本发明的腺病毒载体(如亲代载体)，并使得病毒感染目的宿主细胞。感染导致了被转化的细胞产生被包装的Ad病毒，其能够从细胞中出来并感染其它细胞，因此产生病毒传播。载体中存在的凋亡基因能够诱导杀灭被转导的细胞，该细胞中一些Ad载体已经被包装，从而载体能够离开细胞，使得病毒发生传播。

本发明的Ad载体可以以对研究对象中被转导细胞而言足够的量和时间(如时间延长和/或多次给予)被给予到研究对象中。

Ad载体的剂量依赖于很多因素，其包括但不限于：被影响的细胞或组织类型，被治疗的疾病类型，疾病的严重程度，研究对象的健康和对治疗的反应。相应的，根据每个研究对象的情况和给药的模式剂量可以发生变化。

腺病毒载体的嗜性改变：

本发明进一步描述一种新的途径：通过改变在腺病毒衣壳表面表达的纤维蛋白使得重组的腺病毒载体能够靶向选定的细胞。已证实改变纤维蛋白的轴区和球形区能够成功的使腺病毒载体靶向于目的细胞类型。

本发明中的腺病毒可以被修饰从而能够靶向目的宿主细胞。现有的超过50种人类腺病毒血清型(附录I)，包括不同组织选择性或嗜性的变异株。现有观点认为腺病毒的不同血清型附着到不同的细胞受体上并且使用不同的机制进入细胞。大多数重组腺病毒都采用5型血清型腺病毒作为出发载体(Hitt，M.M.，et al，1997，Adv.InPharmacology 40，137-205)。Ad5的感染首先通过其纤维蛋白结合于CAR，其次通过其五邻体基质蛋白结合到整合素上。因为大多数细胞和组织中缺乏CAR和/或整合素的表达，Ad5介导的基因转移对于许多在基因治疗中为重要的靶的组织如内皮，平滑肌，皮肤上皮，分化的呼吸道上皮，脑组织，外周血细胞，或者骨髓都效率较低。如下所述的本发明的Ad5载体在改变其纤维蛋白的序列后都具有感染能力和嗜性的变化。

不同血清型腺病毒的感染能力局限于几种人的细胞系内。感染力实验研究表明Ad5和Ad3特别适合于感染并靶向上皮或淋巴细胞，同时Ad9，Ad11和Ad35能够有效的感染人的骨髓细胞。所以Ad9，Ad11和Ad35纤维蛋白的球形区是使Ad5靶向于人骨髓细胞的最佳候选区。其它可能的血清型还包括Ad7。

本发明中纤维蛋白的修饰是将Ad5的纤维蛋白的球形区用其它腺病毒血清型的纤维蛋白球形区替换。本发明的一个实施方案是经修饰的Ad5/Ad35纤维蛋白(重组的Ad5载体表达的修饰过的纤维蛋白，包含Ad5的纤维蛋白尾部区和Ad35纤维蛋白的轴区和球形区)。这种Ad5/Ad35嵌合纤维蛋白表现出更广泛的感染细胞谱包括CD34+的细胞集合，以及具有干细胞活性的细胞。Ad5/11嵌合纤维蛋白(重组的Ad5载体表达的修饰过的纤维蛋白，包含Ad5的纤维蛋白尾部区和Ad11纤维蛋白的轴区和球形区)表现出相似的嗜性。

除球形区的修饰，本发明还描述了对纤维蛋白轴区进行修饰以及修饰球形区以产生缩短的纤维蛋白都有更多的优点。纤维蛋白轴区的长度对于腺病毒载体利用宿主的受体进入宿主细胞起到非常重要的作用。为表明此点分别构建了具有较长轴区(22个β折叠)和较短轴区(7个β折叠)的Ad5，Ad5/9和Ad5/35变体。分析表明对于以CAR作为首要受体的Ad5和Ad5/9进行有效的感染，具有较长轴区的纤维蛋白是必需的，同时Ad5/35(结合于仍属未知的非CAR受体)进入细胞的策略并不依赖于轴区长度(图xx12)。对纤维蛋白轴区长度的修饰(在5-10个β折叠之间)以及对纤维蛋白球形区的修饰(来自于不同的腺病毒血清型)是改变腺病毒载体嗜性的新的模式。

发明优势

本发明公开了具有特定结构的新型腺病毒具有以下优点，(1)其能够在衣壳上表达球形和轴区结构域经修饰的纤维蛋白，使载体具备特殊的靶向能力，能使任何血清型的腺病毒改变靶向，用于细胞特异性感染；(2)利用其在复制活性细胞中选择性复制重组，激活外源基因的表达；(3)有效复制和能向周围肿瘤组织的扩散。这些优点的组合大大提高了腺病毒作为基因治疗载体的转导效率和安全性。

本发明的一个主要优势是提供了一种能够使基因特异性的在快速分裂的细胞如肿瘤细胞中进行基因表达的方法。使用本发明中的载体系统使肿瘤特异性表达毒性或促进凋亡的基因来治疗一系列的癌症，其中下调的细胞周期控制支持了亲代腺病毒的复制。

本发明产生了只有在病毒DNA复制时才产生的功能性的启动子/基因组合，从而代表一种新型选择性转录活化的原理，其可以用于任何类型的条件复制的Ad载体。

与本发明相反，当前基于Ad载体进行肿瘤基因治疗的方法都是用肿瘤特异性启动子来表达治疗基因(Zhang，W.W.1999 Cancer Gene Ther 6，113-38；Parr，M.J.etal.1997 Nat Med 3，1145-9)。但是，在Ad载体中应用外源启动子是存在问题的，因为它们的活性和特异性经常收到病毒增强子和病毒载体基因组中的启动子(Babis，L.E.，et al.1986 Mol Cell Biol 6，3798-806；Ring，C.J.，et al.1996 GeneTher 3，1094-103，Steinwaerder，D.S.and A.Liber，Gene Therapy 7：556-67)或宿主细胞组分的影响。本发明产生了只有在病毒DNA复制时才产生的功能性的启动子/基因组合，从而代表一种新型选择性转录活化的原理，其可以用于任何类型条件复制的Ad载体。

本发明另一个优点是提供了新型腺病毒-腺相关病毒的嵌合体，其能够在衣壳上表达修饰过的纤维蛋白，使载体具备特殊的靶向能力。本发明说明了这种载体的产生的方法，应用以及优势。另外，所述的对球形和轴区结构域的改变提供了一种新的途径，能使任何血清型的腺病毒改变靶向用于细胞特异性感染。

总之，本发明公开了具有特定结构的新型腺病毒具有以下优点：(1)其能够在衣壳上表达球形区和轴区结构域经修饰的纤维蛋白，使载体具备特殊的靶向能力，能使任何血清型的腺病毒改变靶向，用于细胞特异性感染；(2)利用其在复制活性细胞中选择性复制重组，激活外源基因的表达，能够在目标细胞中特异性表达所选基因；(3)有效复制和能向周围肿瘤组织的扩散。这些优点的组合大大提高了腺病毒作为基因治疗载体的转导效率和安全性。

实施例I

A.单载体系统同源重组

这个实施例表明了用本发明的复制活化的Ad载体来进行肿瘤特异性基因表达：一个重组载体包括：腺病毒左端反向末端重复序列；一个腺病毒包装序列位于左端反向末端重复序列的3’端；一个启动子序列位于腺病毒包装序列的3’端；一对第一和第二反向重复序列其中第一反向重复序列位于启动子序列的3’端，第二个反向重复序列位于外源DNA的上游，外源DNA以3’-5’方向位于第一个反向重复序列的3’端；用于亲代Ad载体在被转化的细胞中复制的基因，其位于第二个反向重复序列的3’端；一个腺病毒右端反向末端重复序列位于腺病毒载体在被转化细胞中的复制基因的3’端(Steinwaerder，D，et al.，2001 Nature Medicine 7：2；240-243)。

方法

组织培养：

除非特别说明细胞系从ATCC(Manassas，VA)得到。293(Mivrobix，Toronto，Canada)，HeLa(ATCC#CCL-2)和SK-HepI细胞(HTB-52)在Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)，包含10％胎牛血清(FBS)，补加有2mM的L-谷氨酸(Glu)，100U/ml盘尼西林(P)，和100mg/ml的链霉素(S)。SiHa(ATCC#HTB-5 2)和Caski(ATCC#CCL-1550)生长在包含15％FBS，Glu/PS的DMEM中。LOVO细胞(ATCC#CCL-229)生长在补加有15％FBS，Glu/PS的F12K培养基中。细胞维持于37℃和5％的CO₂中。用于移植的细胞培养在未经处理的petri皿中以减少吸附，用0.6mM EDTA收集单细胞悬液并用DMEM洗两次。如前所述对吸附的细胞进行X-gal染色(Liber，A.，et al.1996 J Virol70，8944-60)。用βGal报道基因检测试剂盒对βGal活性进行光学定量(BoehringerMannheim，Mannheim，Gemany)。用结晶紫进行细胞病理效果检测。培养基被除去，细胞在3.7％的多聚甲醛中于室温下固定3分钟。然后，细胞用PBS洗三次并在1％的结晶紫和70％乙醇溶液中孵育3分钟。染色后，细胞被用水清洗三次然后空气干燥来照相。按照其它文献所述(Liber，A.，et al.1996 J Virol 70，8944-60)来进行噬斑检测。

pAd.IR-βGal载体：

用XhoI/SalI酶切从pREP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)中切下417bp的SV40多聚腺苷酸片段并插入到pBluescript KS(-)的XhoI位点产生pBSSV40pA。3.4kb的βGal基因被插入到pBSSV40pA的平末端BamHI位点上产生pbGalSV40。用ClaI/EcoRI酶切从pSG5(Stratagene，La Jolla，CA)中切下660bp的兔b球蛋白的内含子II并将之插入到pBluescript KS(-)的相应位点产生pBSbII。连接到SV40pA的包含βGal基因的3.9kb片段用SpeI/Asp718酶切出来，用T4聚合酶补平，并插入到pBSbII的SmaI位点产生pbGalSV40bII。用AvrII/BamHI酶切从pSG5中得到bII内含子的第二个拷贝并插入到pbGalSV40bII的XbaI和BamHI位点得到pbGalSV40bII2。用SalI/XhoI酶切从pREP4中得到630bp的RSV启动子并插入到修饰过的pDE1sp1A的XhoI位点得到pHVRSV。为产生病毒穿梭载体pAdIR-BG，用NotI/Sa1I酶切从pbGalSV40bII2上切下5.3kb的bGalSV40bII2表达盒，并用T4聚合酶补平然后插入到pHVRSV的EcoRV位点。用XbaI/XhoI酶切从pbGalSV40bII2上得到4.6kb的bGalSV40bII2表达盒并插入到pHVRSV的SalI和XbaI位点产生了pAdCo。两种穿梭质粒用XmnI酶切来线性化并和pBHG10共转染到293细胞中产生AdE1^-载体Ad.IR-BG和Ad.Co(图2II和2III)。为评价AdE1^-载体制备物中具有复制能力的E1⁺的污染情况，根据文献描述的方法对重组的E1⁺腺病毒进行PCR分析(Zhang，W.W.，et al.1995 Biotechniques 18，444-7)。这种检测在109pfu的重组病毒中只能检测到一例E1⁺腺病毒。下述引物被用于E1A-PCR：5’引物AAGGATCCGCCAGCCATGGAGGAGTTTGTGTTAGATTAT

3’引物AGATCTCTAACTAACGGGACTGTAGACAAACATGCCAC。所用的PCR条件：2.5U Taq聚合酶(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)在50ml的反应液中，5％DMSO，2.5mM MgCl₂，1分钟变性(95℃)，退火(55℃)，延伸(72℃)进行30个循环。

在病毒制备中细菌外毒素的存在被用以前文献所述的检测来排除(Liber，A.et al.1997 J Virol 71，8798-807)。

病毒DNA复制时AdE1-载体中转基因的活化：

插入到AdE1-载体E1区的反向重复(IRs)能够有效的介导依赖于病毒DNA复制的可预知的基因组重排(Steinwaerder，et al.1999 J Virol 73，9303-13)。利用复制依赖表达系统这个发现，构建了包含反向于RSV启动子的βGal基因的载体Ad.IR-BG(图2II)。我们假定在βGal基因侧端的反向同源区能够介导依赖于复制的基因组重排并将转基因带入到与启动子的正确连接。作为对照，构建了仅包含一个同源元件的载体(Ad.Co)(图2III)。图2II表明在用Ad.IR-BG感染子宫颈癌细胞系后形成了可预知的重排基因组(ΔAd.IR-BG)，但在Ad.Co感染后没有发生。在存在羟基脲(HU)的情况下，ΔAd.IR-BG的出现会被抑制，其阻碍了腺病毒DNA的复制但没有阻断蛋白质的合成(Sussenbach，J.S.&van der Vliet，1973 P.C.Virology 54，299-303)。同样的试验程序被用来表明从ΔAd.IR-BG基因组中βGal表达的复制依赖活化(图3A，3B)。在使用Ad.IR-BG的SiHa和Caski细胞中，X-Gal阳性细胞仅在载体DNA复制时产生，其中载体包含的βGal是在RSV启动子的控制下(Ad.BG)(图2I)，其在HU处理或未处理的细胞中都进行持续表达。和预期的一样，在用Ad.Co感染后没有观察到βGal的表达。但是，在Ad.IR-BG和Ad.Co感染HeLa细胞时检测到不依赖于ΔAd.IR-BG形成的背景表达。根据细胞类型不同，在Ad.IR-BG感染的细胞中，用HU处理的细胞其βGal的酶活性为用HU阻断病毒复制的细胞的1到3倍。

复制检验：

为产生甲基化的Ad.BG，Ad.E6，和Ad.E7载体，病毒在表达原核PaeR7甲基转移酶(PMT)的293-PMT细胞中扩增(Nelson，J.E.&Kay，M.A.1997 J Virol 71，8902-7)。如文本中和图例中所述细胞被甲基化的病毒感染。为分离细胞/病毒DNA，细胞用0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA处理然后用离心回收。按照如前所述提取DNA(Liber，A.etal.1996 J Virol 70，8944-60)。用光谱测量DNA的浓度。为检测复制对不复制的病毒DNA的比率，提取的全DNA用HindIII和XhoI酶切并用琼脂糖凝胶电泳随后进行Southern杂交(Liber，A.et al.1996 J Virol 70，8944-60)。用Ad5基因组8kbHindIII片段(bp 18319到bp26328)作为探针检测。用HindIII和XhoI双酶切能够清楚的辨别非甲基化(复制)和甲基化(没有复制)的病毒DNA，因为在293-PMT细胞中病毒基因组的甲基化在Ad5 bp24796处阻断了XhoI位点。因此，只有后代的病毒DNA在HindIII和XhoI酶切后能够被XhoI在bp24796处切割导致产生两条可检测到的1.5kb和6.5kb的片段。

下面的试验表明人乳头瘤病毒基因E6和E7在体内和体外试验中有效的支持了E1缺失的腺病毒的复制。

质粒构建和载体：

pCMVE6/E7：从pLXSNE6/E7中得到HPV16 E6和E7的开发阅读框(Halbert，C.L.，etal.1991 J Virol 65，473-8)。用BamHI酶切从pLXSNE6/E7中释放300bp长的HPVE7基因并将其插入到pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)的BamHI位点得到pCMVE7。通过BstYI酶切从pLXSNE6/E7切下480bp的HPVE6基因。在用T4聚合酶介导的5’突出端的填平，片段被插入到pcDNA3.1的EcoRV位点得到pCMVE6。

pAdE6/E7和Ad.E6/E7：

包含CMV启动子，E6或E7基因和牛生长碱性多聚腺苷酸(bpA)的表达盒被用SalI/DraIII酶切从pCMVE6和pCMVE7中切下。在T4聚合酶介导的DraIII3’突出端补平后，片段被分别插入到用SalI和EcoRV打开的经修饰的pDE1splA所产生的pAdE6和pAdE7。用XmnI酶切使穿梭质粒pAdE6和pAdE7线性化并和pJM17(Bett，A.J.，etal.1994 Proc Natl Acad Sci USA 91，8802-6)共转染到293细胞中产生Ad.E1载体Ad.E6和Ad.E7。Ad.RSVbGal的构建在以前的文献中已有描述(Stratford-Perricaudet，L.D.，et al.1992 J Clin Invest 90，626-30)。

免疫沉淀：

HPV E6和E7蛋白用35S标记并按照Oncogene/Calbiochem(Calbiochem，Cambridge，MA)免疫沉淀手册的方法进行纯化。对于免疫沉淀，使用的单克隆和多克隆的抗HPVE6和HPVE7的抗血清(St.CruzBiotechnology，St Cruz，CA)按照1∶1混合。蛋白样品在12％的聚丙烯酰胺凝胶中分离。凝胶用放射自显影增强仪处理(NEN Research System，Boston，MA)，烘干丙暴露于Kodak X-OMAT AR成像胶卷(Eastman Kodak，Rochester，NY)(图5)。

讨论：

根据用于通常的重组的可以接受的模型，重组过程可能起始于在IR元件和包含反向重复(Ad.IR；图1A，1B)的双链Ad基因组之间的同源区配对。然后，细胞重组酶可以介导单链与双链病毒基因组的交换形成霍利迪(holliday)-连接。这个结构能够如对于典型的霍利迪(holliday)-结构模型所描述的经过一系列旋转运动发生异构化(图1A)。可替代的，在Ad复制中Holiday结构被解离的。子链(5’-D)的合成与一条亲代链(5’-P)相关联并且能够沿着交叉链发生。当两条相反运动的置换叉状结构相遇时，两条交叉的亲代链不结合在一起并分离导致部分双链部分单链的分子。在被置换的亲代链上的合成结束。对Ad2复制描述了相似的分离机制。一个重组产物为ΔAd.IR基因组结构。理论上，第二个长度约67kb的双链产物应该形成。但不可能通过Southern杂交来表明这种产物的存在，很明显这种产物不能有效的产生。其较大的大小需要极长的复制时间(＞40分钟)。基于预测的结构，67kb的产物缺乏包装序列。此外，这种产物的大小也阻止了包装，图中仅出示了一个IR对的配对和交叉互换。相似的，重组在另一个IR对中也能发生并导致相似的产物。为简化通过Ad复制的霍利迪重组模型，只有从一个基因组末端的DNA合成起始被出示。

除子宫颈癌之外一系列广泛的来源于肿瘤的细胞系也能够有效的支持AdE1-DNA。而且，与肿瘤相关的DNA病毒(EBV，HBV，polioma病毒等)，其病毒基因产物也能够功能性的替代腺病毒E1蛋白(Gjorup，O.V.，et al.1994 Proc Natl Acad Sci USA91，12125-9；Schaack，J.，et al.1996 Virology 216，425-30；Tevethia，M.J.&Spector，D.J.1984 Virology 137，428-31；Tevethia，M.J.&Spector，D.J.1989 ProgMed Virol 36，120-90)。因此，本复制活化的表达系统能够允许在一系列肿瘤细胞中进行特异的转基因表达。代表性的，我们证明了来源于结肠癌细胞系的肝转移灶。

选择性Ad复制作为抗肿瘤的一条途径的概念以及被大量研究，使用E1B缺失的AdE1A+载体(Heise，C.et al.1997 Nat Med 3，639-45；Wildner，O.et al.1999 GeneTher 6，57-62；Heise，C.C.，et al.1999 Cancer Res 59，2623-8；Bischoff，J.R.et al.1996 Science 274，373-6)。这种载体的肿瘤特异性是有争议的(Rothmann，T.，et al.1998 J Virol 72，9470-8；Vollner，C.M.et al.1999 Cancer Res 59，4369-74；Turnell，A.S.，et al.1999 J Virol 73，2074-83；Hay，J.G.et al.1999 Hum Gene Ther10，579-90；Harada，J.N.&Berk，A.J.1999 J Virol 73，5333-44；Hall，A.R.，etal.1998 Nat Med 4，1068-72；Goodrum，F.D.&Ornelles，D.A.1998 J Virol72，9479-90)，而且，由于E1表达，不能排除对于正常组织的毒副作用。

总之，E1缺失的腺病毒载体能够特异性的在肿瘤细胞内复制。例如，子宫颈癌细胞表达HPVE6/E7蛋白的内在特性支持了E1缺失的Ad载体的复制而众多正常细胞则不能。基于这些发现Ad.IR载体允许在肿瘤细胞内进行可预测的基因组重排和复制活化的转录。

阐明了复制活化的表达系统。出示了具有肿瘤特异性基因表达的复制活化腺病毒载体需要在一个载体中的IR序列介导的重组。

出示了Ad载体的结构并假设了复制活化转基因表达的原理(图2)。Ad.BG包含原核βGal基因，其在插入到E1区的RSV启动子的持续控制之下(图2I)。亲代载体Ad.IR-BG包含两侧有反向同源元件的βGal基因(图2II)。βGal基因的方向为3’-5’方向朝向位于Ad包装信号(φ)和病毒反向末端重复(Ad.ITR)下游的RSV启动子。同源元件(IR)介导基因组衍生物(ΔAd.IR-BG)的形成，其包括位于转录活化位置的启动子。作为同源元件，两个相同拷贝的兔β-球蛋白内含子被使用，其不包含任何转录终止位点并且在转录时被切除。这保证了翻译会在转基因起始密码子开始，并且在位于ΔAd.IR-BG内的启动子和转基因间不存在任何AUG。一个双向的多聚腺苷酸SV40pA(PA)被用来在亲代载体中结束转录并阻止βGal的反义RNA的形成，其会干扰转基因的表达。对照载体只包含同源元件(Ad.Co)因此不能形成ΔAd.IR-BG(图2III)。

体外试验中在Ad复制时转基因表达被活化(图3A，3B)。在子宫颈癌细胞系中发现基因组重排依赖于AdE1-的复制(图3A)。HeLa，SiHa和Caski细胞以感染复数(MOI)为100(HeLa，SiHa)和300(Caski)被Ad.IR-BG或Ad.Co感染，感染开始后3小时，DNA合成抑制剂羟基脲(HU)被加入到细胞中。感染后72个小时，用对βGal基因特异性的探针通过Southern杂交来分析DNA。箭头表明病毒的全长基因组(34kb)已经重组产物(7.3kb)。体外试验中βGal的表达活化在载体DNA复制时发生。子宫颈癌细胞系用Ad.IR-BG，Ad.Co，或Ad.BG感染并用羟基脲处理，感染后72小时，细胞用X-Gal染色。

比较Ad.IR-BG和Ad.BG的复制和转基因表达的动力学。HeLa细胞以100MOI感染有Ad.IR-BG和Ad.BG90分钟。在感染起始后间隔12小时，用Southern杂交分析DNA并用显色法评价βGal活性(图4)。

HPV E6和E7的表达表明AdE1-DNA在体内和体外都能够复制(图5A，5B，5C)。质粒编码的E6和E7基因在CMV启动子控制下，其感染293细胞后，通过免疫沉淀能够检测到E6和E7的表达。用抗E6血清(图5A，1，2，和6道)或抗E7血清(图5A，3，4和5道)来进行免疫共沉淀。箭头分别表明E6和E7蛋白迁移为18kDa和21kDa处。

HPVE6和HPVE7能够在体外有效的支持AdE1-DNA的复制(图5B)。SKHEP1细胞被用甲基化的Ad.BG，Ad.CMVE6，和Ad.CMVE7以100的感染复数感染。胶表明了感染有甲基化的Ad.BG(没有E6/E7表达)，Ad.CMVE6，Ad.CMVE7，或者Ad.CMVE6加上Ad.CMVE7的细胞限制性图谱。

HPVE6和HPVE7能够有效的在体内支持AdE1-DNA的复制(图5C)。2×10⁹pfu的甲基化的Ad.BG，Ad.E6和Ad.E7通过尾静脉注射给予到C57BL/6鼠中。在给药后五天，通过Southern杂交比较感染有Ad.CMVE6(图5C，1道)，Ad.CMVE7(图5C，2道)，Ad.CMVE6加上Ad.CMVE7(图5C，3道)或者Ad.BG(缺失E1的对照病毒)(图5C，4道)的动物。仅在表达HPV E6和/或HPV E7的载体中观察到载体DNA的复制。

B：双载体系统同源重组

这个例子表明，利用所发明的复制活化的腺病毒载体进行肿瘤特异性基因表达，这个发明包括两个亲代载体，每个载体都含有目的基因的部分片段，并且两个基因片段具有内部的同源重叠区域。在同源重组后，可预测的基因组重排造成一个融合性载体，此载体可以表达目的基因。

方法：

β-gal穿梭质粒。把RSV启动子插入到腺病毒穿梭质粒pHVad2中，RSV启动子在经过Sal I和Xho I酶解pREP-4(Invitrogen，Carlsbad，CA)得到后，把它克隆到用Xho I酶打开的pHVad2质粒中，形成pHVad2RSV。β-gal基因的5｀端部分序列被克隆到这个被改变的穿梭质粒中，然后通过用Eco RV和Xba I对pBgalSV40进行双酶解而释放出来，并把它插入到pHVad2RSV的Eco RV和Xba I酶切位点，形成p5｀βgal。

为了把具有polyA的βgal基因的3｀端部分序列克隆到穿梭质粒pHVad2中，先把pBgalSV40经Asp718和AatII酶解后，补平末端，然后插入具有用Eco RV打开的pHVad2载体中，形成p3｀βgal。

讨论

含有转基因5｀端部分序列的亲代载体Ad.1含有插入到腺病毒载体的下列元件：一个左ITR(末端反向重复序列)、一个位于左ITR的3｀端的腺病毒包装序列、一个位于腺病毒包装序列3｀端的启动子，转基因的5｀端部分序列位于启动子的3｀端，负责腺病毒复制的基因，以及右ITR(末端反向重复序列)。含有转基因3｀端部分序列的亲代载体具有一个左端ITR，负责亲代腺病毒复制的基因位于左ITR的3｀端，转基因的3｀端部分位于负责亲代腺病毒复制的基因的3｀端，以及右ITR。在Ad1中的转基因5｀端部分序列与是与Ad.2中的转基因相同的转基因的5｀端。Ad.2转基因3｀端部分序列是与Ad.1中的转基因相同的转基因的3｀端。下游调控原件的利用是根据目标以及来确定的(比如组织特异性增强子等)，另外可以利用polyA来改善转录水平。转基因的3｀端部分序列必须含有与5｀端部分序列交叠的区域，以便进行重组和重新构建完整的功能基因。(见图6)

在允许腺病毒复制的细胞中进行双亲代载体共染后，导致一个通过同源重组介导的完整功能表达盒。

293细胞的共染允许相应的空心载体的生成以及纯化，这个载体含有功能基因表达盒，两边附着包装信号和5腺病毒ITR。

对于缺失载体来说不需要，但在亲代载体有作用的遗传材料，分别在第一个或者第二个载体的转基因的5｀或者3｀端的后面进行了克隆。

在两个亲代载体间发生的重组是精确的，并可以重新组装一个功能基因。作为支持原理的证据，lacZ阅读框架的两个片段被分别克隆到腺病毒载体中，这样，两个都不能表达功能基因βGal。在进行了两个载体的共染后，阅读框架通过同源重组得以恢复，并可以产生功能性βGal基因表达(见图7)。对重组基因组进行包装后，可以用CsCL梯度离心进行纯化。βGal基因阅读框(通过重组引导活性酶的生产)的恢复是严格依赖于病毒DNA复制进行的。因此，两个病毒的共转染将在肿瘤细胞中激活基因的特异性表达。

一个概括性的框架显示本发明具有肿瘤特异性表达特征的复制活性的腺病毒载体情况，这种特异的基因表达是建立在两个载体重组的基础上的，其中每个载体都含有同源成分。(图6)

转基因的激活与表达是在两个分别携代半个转基因的腺病毒载体共染后发生的(图7)。两个构成完整βGal基因的片段独立地被以相反的方向插入到腺病毒E1位点处。两个βGal基因片段有大约500个碱基序列长度的同源交叠区。完整的LacZ基因在Ad5｀bGal和Ad3｀bGal发生共染后发生重建，并通过同源区发生重组(图7)。在用Ad5｀bGal、Ad3｀bGal或者两个载体的重组体发生感染后，在293个细胞中测定β-半乳糖苷酶活性进行定量。(见图7B；RLU：相对光单位)

C：单载体系统的应用实例

肿瘤基因治疗方法的临床应用体现为肿瘤特异的传递，或者治疗基因的表达。另一个挑战就是在早期肿瘤或者转移肿瘤细胞中靶向每一个细胞。我们针对以上问题或者目标开发了一个系统。我们的方法是基于第一代E1和/或者E3缺失腺病毒载体基础上的，这些载体具有在系统应用后转导所有肿瘤位点的潜力。(Hitt，M.M.，Addison，C.L.，Graham，F.L.1997，Advances in Pharmacology 40，137-205)。很明显，在小鼠的肝脏中发现了大量的腺病毒载体注入小鼠的尾静脉管中。因此，在这项研究中，我们集中瞄准了肝脏转移肿瘤。我们发现，表达HPV E6/E7蛋白的子宫瘤细胞的内在性质有助于缺失了E1基因的载体的复制，但是在体内的肝中使得细胞不能复制。基于这些数据，我们开发了一个复制活化转录的新概念，它允许载体在小鼠肿瘤模型的肝转移癌细胞中限制性的转基因表达。

方法

动物：动物实验的开展是根据由华盛顿大学制定的协会纲要进行的。所有参加实验的动物都要SPF的动物房里。从Taconic购买的8到12周大小的NIH-beige-nude-xid老鼠。这些老鼠缺少B、T以及NK细胞，构成了一个最好的动物模型，适合于进行测定几个免疫缺陷性病症的肝移植实验。门静脉插管和细胞融合在别的地方进行了描述。简单来讲，把硅管插入门静脉中，用粘合剂保护其顶端。套管的远终端被放在一个皮下兜里。第二天，单独悬浮在300ml的DMEM低糖的1.5×3×106个细胞在经过5分钟以后融合进入门静脉中。根据华盛顿大学动物保护委员会的规定，在肿瘤发生过程中，要对所有的动物进行监测，并在21天后进行处死，以避免大肿瘤和腹水。对于皮下肿瘤，每100ml DMEM低糖中含有1×10⁷细胞被注入NIH-beige-nude-xid老鼠的左右腹股沟中。通过尾静脉灌注200ml用DMEM低糖稀释过的腺病毒来进行腺病毒的注射。对于皮下肿瘤，需要用50ml DMEM低糖稀释过的腺病毒进行注射。

组织学：在OCT化合物里冷冻肝脏部分，并以10um为单位进行切片。肝脏部分用x-gal(5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside，5-溴-4-氯-3-吲哆-β-D-半乳糖苷)，和(或者)苏木素、曙红或者中性红进行染色。

这个新的基因表达系统的一个潜在的重要特点是：转基因产物在感染周期中进行后期的积累。为了证明这一点，在用腺病毒载体IR-BG或者参照腺病毒载体BG病毒感染后，在不同的时间点，进行Hela细胞内的βGal基因活性的测定。(图4)。在平行实验中，在收集ΔAd.IR-BG或者Ad.BG基因组的基础上，对载体复制的动力学进行了评估。按照期望，Ad.IR-BG的动力学表现应该严格与ΔAd.IR-BG基因组的积累相关。Ad.BG比Ad.IR-BG具有调节更快的β-半乳糖苷酶活性的聚集，即当Ad.BG在感染48小时后达到75％的最大酶活性时，Ad.IR-BG只达到酶最大活性的47％。

讨论：

细胞外的转基因表达在子宫颈癌细胞株SiHa和Caski里的载体DNA复制呈高度特异性，并与转录基因组原件衍生物ΔAd.IR-BG的形成相关。但是，Hela细胞表明，一些背景表达是独立的ΔAd.IR-BG形成过程。更重要的是，在用重组非适合对照载体，Ad.Co，在转移肿瘤中获得的Hela细胞没有非特异性表达。细胞内实验表明，在这个特别的细胞系中，人工培养或者在细胞外感染条件能诱导ΔAd.IR-BG独立表达。以前，我们已经阐明了在细胞外培养条件能够诱导来自腺病毒基因组中调控元件的非特异转基因表达。

在每个转移肿瘤中，Ad.IR-BG的单个系统载体注射成功地获得了βGal的特异性表达。没有发现额外肿瘤转基因引入。考虑到绝大多注射的载体颗粒感染了肝细胞，仅仅有一小部分转导给了转移肿瘤，这就证明了在细胞内转基因活性的选择性。多个载体融合增加了在每发生一个转移时，转基因表达的肿瘤细胞比例。在高剂量的条件下，可以在正常的肝脏组织中，特别是在门静脉的管壁中，观察到稀有的表达，这说明病毒基因组的数量已经达到了一个低限，在这个低限的条件在组织中先可以诱导低水平的载体DNA的复制。但是，能够导致显著的肿瘤外表达的病毒明显的比在转移肿瘤中达到转基因活化所需病毒的数量大。

除宫颈癌外，其它癌症中获得的多种细胞系也能显著的支持AdE1-DNA。另外，据认为，在那些与DNA病毒相关的肿瘤中，病毒基因产物能在功能上代替腺病毒E1蛋白的功能。所以，所阐述的有复制活性的表达系统应该能在多种肿瘤类型中能够进行特异性表达。具有典型意义的是，我们在从结肠癌细胞株中获得的肝转移中证明了这一点。

我们的研究集中分析肿瘤特异转基因表达，以作为选取溶瘤有效基因的优先考虑。用能够诱导细胞凋亡的基因或者用能够将前药转化为细胞毒药物的基因取代报道基因β-gal将调节高水平对抗肿瘤特异的有效性。由于特异转基因表达动力学，在病毒复制完成时，复制活化表达系统具有表达诱导细胞凋亡或者促使细胞溶解的溶瘤基因产物的潜力，因此能促进重新生产病毒的释放和散布。另外，酶或者前药策略，结合我们的复制Ad.IR载体，能够明确药物治疗的精确时间，促进病毒分散和介导有益的旁观者效应。我们的策略是产生了一个依赖于病毒DNA复制的功能启动子/基因组合，因此代表了一个选择性转录活性的新原则，这个新原则可以被应用到任何类型条件复制腺病毒载体上。

在Hela细胞系获得的肝转移中，证明了由Ad.IR-BG获得的肿瘤特异β-Gal基因表达(图8)。2×10⁶个Hela细胞通过被永久性的放置的门静脉输尿管，被移植到了免疫缺陷性NIH-III小鼠中。A)在14天后，肝脏中没有显著的中心坏死，只发生微转移，并且在肝脏部分比较明显。用x-gal和H&E对肝组织部分进行染色，用中性红进行反染色。B)5×10⁹pfu的Ad.IR-BG在第14天的后期移植进行融合(图8b)。用x-gal、H&E和中性红对肝组织部分进行染色。(C、D)5×10⁹pfu的Ad.IR-BG在第14、15天的后期移植表明肿瘤细胞表达β-Gal基因的高部分。(E、F)在门静脉管臂中，在正常肝组织中的F的箭头符号显示出了单个蓝细胞。肝组织部分用x-gal、H&E和反染色的苏木精进行染色。Ad.Co载体的相同病毒剂量不能导致任何x-gal染色结果。肝脏组织切片用x-gal、H&E和反染色的苏木精进行了染色。

在肝转移中的生产型AdE1复制在细胞内实验中得以证实(图9)。把7×10⁹pfu的Ad.IR-BG注入到没有发生移植的NIH-III老鼠上，或者那些接收1.5×10⁶或者3×10⁶个Hela细胞的老鼠上。病毒融合四天后。部分肝脏进行x-gal染色。在不同肝脏部位取得的100毫克肝脏组织进行均质化，冷冻，一部分被加入到铺满的293细胞中进行空斑试验。4天后对空斑的数目进行记数，计算在每100mg组织中表达的pfu数。

在经过Ad.IR-BG感染后，复制依赖型以及肿瘤特异转基因表达在LOVO细胞中得到证实。在Ad.Co.，Ad.BG，AdIR-BG的MOI(感染复数量)为250的条件下对结肠癌细胞LOVO进行了感染。正常的NIH-III老鼠以及含有在肝转移LOVO细胞的老鼠在移植第14和15天后注射了5×10⁹pfu的AdIR-BG(图10)。注射4天后，组织切片用x-gal和反染色的苏木精进行染色。

D：双载体系统应用实例

方法：

Rep 78穿梭质粒：起初，rep78基因被克隆了，并带有一个可用的polyA。pREP4经过Xho I和Sal I双酶切后释放出SV40polyA，然后插入到经Xho I酶切后的pBSK(+)中。pCMVR78经过Xho I和Cal I双酶切后转移rep78基因并插入到polyA的前面，形成pBS.rep78载体。

为了把rep78基因的5｀端部分克隆到穿梭载体中去，在鸡γ-球蛋白位点的HS-4绝缘元件被首先经Xho I酶切的pSLJCa中移走，补平，然后插入到pHVad2中。pHVad2载体具有Bam HI酶切位点，经其酶切后并补平而形成pHVad2.HS4。下一步，pBS.rep78载体经Eco RV和Xmn I双酶切后释放rep78基因的5｀端部分序列，并被克隆到经Eco RV酶切的pHVad2.HS4中形成pHVHS4.5｀rep。最后，通过对pLXApoEhAAT.hFIX.bPA进行Spe I和Cla I双酶切后转移并把ApoEhAAT启动子克隆进了这个穿梭载体中，并补平，然后插入经Eco RV酶切的pHVHS4.5｀rep载体中，形成p5｀rep78。为了把rep78基因的3｀端部分序列克隆到一个穿梭载体中，rep78基因的3｀端部分在pBS.rep78经Nco I和Asp 718双酶切后被释放出来，补平，并插入经Eco RV酶切的pHVad2中，形成p3｀rep78。

讨论：

此原理被应用于生产被删除Ad基因的载体，这个载体表达毒性或者前细胞凋亡基因。例如，生产的ΔAd.IR载体表达的AAV rep78基因，它被认为可以很大程度地抑制Ad基因的复制，阻止经标准方法产生rep 78表达载体的产生。这个被改变的rep78基因的5｀部分被克隆到一个载体中，而其3｀端被克隆到另一个载体中，每个载体都含有一个658个碱基长度的长共同区域(图11)。在正常滴度条件下，两个载体都成功地进行了表达。经对293个细胞的共转染，功能性重组rep78基因的表达，在通过在具有随后特异位点整合到AAVS1的质粒或者腺病毒框架营救的AAV ITR盒子得以证明。另外也表明了可以表达基因rep78的载体ΔAd.IR的产生。经ΔAd.IR78感染后的Rep78的基因表达经western blot得到了证明。这是第一个关于rep表达腺病毒载体的例子。

Rep78基因表达腺病毒载体是经两个载体的重组而产生的。(图11)在图6展示的相同策略被用于含有转基因rep78的载体上。Ad5｀rep载体也含有被HS-4绝缘子保护的ApoEhAAT启动子。Rep78两个同源序列的长度为658nt。通过对ΔAd.IR78基因组的Southern印迹分析结果表明，有5.8kb的ΔAd.IR78基因组序列仅仅在Ad5｀rep和Ad3｀共感染的293细胞中可以观察到(图11)。通过Southern印迹对质粒DNA重组AAV基因组(从pCMVrep78和ΔAd.IR78表达的rep78获得的)挽救分析表现出3.8kb的期望的挽救产物。对在pCMVrep78和Dad.rep78载体中表达的rep78基因中所获得的Ad.AAV病毒载体基因组获得的重组AAV基因组的Southern印迹分析结果显示，有5.1kb的期望的挽救产物得以表达。

E：双载体系统在提高载体在肿瘤细胞扩散程度方面的用途

方法：

Ad.i-kβM.Ad.ikBM含有1.0kb的cDNA，这段cDNA编码融合于5｀端到红血球凝集素标签间的显性负IkBA蛋白。IkBA基因被插入到Ad.PGK(位于磷酸肝油激酶PGK启动子和bPA信号间)中。通过在293个细胞中与PJM17重组而产生AdikBM。测定了在293个细胞中的菌斑滴度。在按照早期的实验描述中排除了有复制能力的腺病毒和内毒素的感染的情况。

讨论：

在基因治疗方面的一个难题在应用重组腺病毒载体方面也同样存在。为了完全杀死肿瘤细胞，在基因水平上的有效的基因治疗不仅依靠早期的载体转染一部分肿瘤细胞，而且也要依赖于载体在肿瘤组织周围的有效复制和分散。我们假设，但病毒复制完成时开始诱导细胞的凋亡，这将有助于在早期感染细胞重新生成病毒，向周围的肿瘤细胞扩散。我们利用双载体系统来诱导在病毒复制后期的细胞凋亡，促进病毒在整个肿瘤中的扩散。在具有从宫颈癌、结肠癌、肺癌，或者乳腺癌中获得的人肿瘤细胞系的肝转移模型中，我们能够证明，一个腺病毒的新系统可以促使转基因在转移中的特异表达，并以一个复制依赖的方式靶向所有的转移。

在另一个例子中，我们利用了一个缺失E1基因的腺病毒(它可以表达一个显性的负ikB突变体)来阻断在选择肿瘤细胞系中的NF-kB的活性，因此可以使它们对于凋亡刺激物比如TNF敏感(图12)。通过测定细胞的死亡率以及caspase的活性，我们观察到，腺病毒介导的ikBM表达可以诱导在经TNF刺激后的HEK293和Heal细胞中的凋亡(图12)。用一个对照腺病毒，Ad.GFP或者Ad.hAAT感染的HEK293和Hela细胞在经过TNF因子处理后没有发生凋亡。

利用HEK293细胞，我们发现，在完成了病毒复制后的Ad.ikBM感染结合TNF的处理可以比Ad.GFP或者Ad.hAAT感染产生更造和更大的菌斑。这就说明，由腺病毒介导的ikBM基因的表达可以促进病毒的扩散。我们也进一步证明了通过诱导凋亡，是TNF的功能，而不是在腺病毒复制周期的不同时间用TNF处理Ad.ikBM感染的293个细胞来刺激病毒DNA或者蛋白的合成或者病毒的组装(图13)。病毒组装后的TNF处理在复制过程或者复制之前产生了更多更大的菌斑。这个结果支持这个结论：在表达ikBM的细胞中，由TNF介导的凋亡将加速病毒的扩散。

我们也利用了Hela细胞系作为肿瘤模型，来研究在rAd-ikBM转导后，潜在的TNF诱导的细胞凋亡以及病毒扩散情况。我们的实验证明了，但当Hela细胞被RNA合成抑制子放线菌D敏感化时，Hela细胞受制于TNF介导的细胞凋亡。RAd介导的ikBM表达在Hela细胞上有一个与放线菌素D相同的效果(图14a)。当我们测定了在培养上清液中，经rAd-ikBM感染的Hela细胞释放出的病毒，我们发现，TNFa+ikBM的联合培养比对照组产生了更高的滴度。(图14a，b)。这就证明了诱导的凋亡加速了从hela细胞中重新合成腺病毒的释放。

在由hela细胞中获得肝转移的动物模型实验中，我们的初步数据也表明了，经rAd介导的ikBM表达加上TNF诱导的细胞凋亡后，在肿瘤组织中获得了更大面积的转导发生(图15)。我们还从初步的数据中发现，在小鼠肝细胞内实验的ikBM的表达是中性的，或者说具有抵抗凋亡性刺激，比如TNF。

在这个例子中描述的载体可以结合与ΔAd.IR相关的肿瘤特异基因传递，来获得肿瘤特异凋亡。由ΔAd.IR介导的转基因表达发生在DNA复制期或者DNA序列重组之后。所以，当病毒复制完成后，这个复制依赖型系统具有表达凋亡或者溶瘤基因的潜力，因此加速了重新生成病毒的释放和扩散，目的是为了获得多水平的转导和诱导完全的肿瘤凋亡。一个相似思路被用于表达自杀基因，自杀基因(通过加上前体药物并且经常与旁观者效应一道)将会杀死被转导的肿瘤细胞。

胱天蛋白酶3(caspase3)的荧光分析结果显示，由rAd-ikBM转导的Hela细胞在经TNF处理后发生细胞凋亡(图12)。由重组腺病毒rAd-ikBM或者对照病毒rAd-RSVB(它编码β-半乳糖苷酶)感染的Hela细胞，用RNA合成限制因子放线菌D或者放线菌A和hTNFα的不同组合进行处理。没有感染的hela细胞作为对照。利用专门的荧光底物DEVD-AMC测定了细胞溶解产物中与细胞凋亡相关的酶(胱天蛋白酶3)的活性。

TNF介导的细胞凋亡的证明见图13所示。特别地，用rAd-ikBM或者编码GFP的对照腺病毒感染的HEK293细胞分别在0分钟、2小时、21小时或者24小时或者28小时的后期感染的时间点上进行了hTNFα的处理。菌斑代表了经过不同处理后死HEK细胞的数目。记录菌斑的数目，并用图表述出来。

TNF介导的、表达ikBM的hela细胞的凋亡加速了腺病毒载体的释放(图14)。经编码ikBM或者β-球蛋白酶重组腺病毒感染的hela细胞，被用TNF或者放线菌D进行了处理。对不同培养的上清液以菌斑的分析为条件。在第3天、第5天对的在HEK293(经hela细胞上清液感染)培养的菌斑数进行记数，并用图表示。不同处理后的hela细胞培养的上清液决定于菌斑的分析(图14b)。在ikBM介导的加上TNF处理的hela培养的上清液，在HEK293细胞中诱导了最多的菌斑数。

诱导型细胞凋亡促进了分布在肝转移小鼠模型上的腺病毒载体的分布(图15)。具有hela细胞的肝转移模型通过用表达β-球蛋白酶的重组腺病毒，以与rAd表达显性负突变基因I-k-b或者表达绿色荧光蛋白的rAD混合的形式，通过尾静脉进行了感染。感染两周后，有一半小鼠接收皮下注射(lug重组人TNF-α)，其余的接收了盐水注射。注射TNF两天后，把所有的小鼠杀死。用为β-gal的x-gal染色或者针对凋亡细胞的TUNNEL方法进行免疫染色对10um的相邻的肝脏切片进行染色。

F：这个例子提供了支持数据：亲代腺病毒载体在肿瘤细胞中能够特异复制。

讨论：

腺病毒感染的正常靶点包括静止的，或者非分裂的细胞，例如分化的肺上皮细胞。在静止细胞的环境不适合病毒的复制。为了复制，腺病毒生成了一种机制，以强制细胞进入细胞分裂的合成期(S期)。这个过程包括腺病毒E1A和E1B蛋白。结果，那些被删除了E1A和B基因的病毒在病毒DNA复制的时候被损坏。E1缺陷型病毒在细胞内和细胞外的基因转运研究中被广泛应用，被认为是复制缺陷型。但是，在转型肿瘤细胞系里，关于E1腺病毒DNA的复制的详细研究结果表明了复制模板集中，细胞周期以及关于缺少E1的腺病毒DNA合成的细胞循环调控子的影响情况。

腺病毒DNA复制仅仅在早期蛋白关键框架的合成时开始，并直接依赖于在感染细胞核中病毒基因组的数目。细胞核内病毒基因组的数目代表了细胞病毒“内化”以及细胞核“传入”的有效性的一项功能。我们的数据印证了在测定的细胞系中病毒“内化”的明显不同。有意思的是，病毒基因组的核内“传入”的各种变化很少明确表明，腺病毒的核内“传入”利用了普遍的细胞骨架。

在不同的细胞系中感染条件的均等化后，通过基于对复制病毒DNA的选择性酶切的复制分析测定了重新病毒DNA合成。这个方法比在Southern杂交研究病毒DNA的超时聚集，以及在其他复制研究中应用的后期感染的不同时间点上进行乙己酮荧光免疫染色更敏感。这也进一步印证了早期观察到的缺少E1基因的病毒复制情况，证明了在这些细胞系中的一些特定因子能有效代替腺病毒中E1和1B基因。

Southern印迹分析表明了在肿瘤细胞中缺少E1基因的腺病毒复制情况(图16a，b)。以一个长8kb的HindIII酶切片(此片段含有一个甲基化敏感的XhoI位点)断为探针，用Southern印迹分析了病毒的病毒DNA或者总DNA。DNA被甲基化，XhoI限制，产生了两个长度分别为6.5kb和1.5kb的腺病毒片段。肿瘤细胞系间的差异进行了比较分析，细胞系用1倍、1/5、1/10的病毒集中进行感染，感染72小时后，提取细胞DNA，并用HindIII和XhoI酶解，并用Southern印迹进行了分析。在293和hela细胞间进行了比较，并在感染24小时后用Southern印迹对DNA进行了分析。

在不同的细胞周期阶段，同步感染的hela细胞中的AdE1-DNA复制情况见图17。Hela细胞的周期被滞留。完整的细胞循环滞留在FACS分析中得到证明。在移走阿非迪霉素后的0小时和6小时后，25hela细胞用甲基化的病毒感染DNA样本通过Southern印迹进行了分析，6.5kb长度的带代表了非甲基化病毒的DNA，8.0kb的带则代表了母本病毒的DNA。

图18描述了AdE-DNA在通过诺考达唑在滞留于G2/M有丝分裂期中的细胞中的复制情况。感染后24小时，对细胞进行了FACS分析(图18a)。几乎所有的细胞被捕捉在G2/M中。感染后的48小时进行细胞总DNA的提取，并用Southern印迹进行了病毒的复制分析。6.5kb的带代表了去甲基化的病毒DNA，8.0kb的带代表了母本病毒DNA(图18b)。纯化的去甲基化以及甲基化病毒DNA分别用-和+号表示。

在宫颈癌细胞中的AdE-的复制情况见图19。在MOI为100或者300pfu的条件下，用表达AdE1-载体的甲基化的bGal，对在宫颈癌细胞、hela、Siha以及Caski细胞中复制的AdE-DNA进行感染3小时。感染3小时和72小时后，提取总细胞DNA，并用HindIII和XhoI进行酶解。以病毒的8kb长度的HindIII酶解片段为探针(此片段含有一个甲基化敏感Xho-I位点)，进行了Southern印迹分析。复制的病毒DNA(6.5kb)和母本载体DNA(8kb)片段见图19a。甲基化和非甲基化病毒基因组的混合物是标准的(+)。比较分析了在hela细胞中和在293细胞中的AdE1-DNA的复制情况。描述了在不同浓度的甲基化AdBG感染细胞90分钟后的情况。感染24小时后进行了Southern印迹分析(见图19b)。图19c描述了通过AdE1-调节的宫颈癌细胞系的CPE情况。在MOI为0.1、1、10、100(293)和Ad.BG为1、10、100、1000时，293、Hela、SiHa、以及Caski细胞系的共流情况。感染后24分钟或者5天，混合细胞，并用结晶紫进行染色。在细胞内的AdE1-分散情况见图19D。在NIH-III小鼠的肿瘤中得到的皮下的Hela]细胞。腺病毒注射3周后，切除肿瘤细胞切片，染色。

总之，在被分析的肿瘤细胞系中的感染性的变化是明显的。在相等的转导条件下，允许AdE1-DNA复制的所有细胞系，不管他们的pRb，p53，p16的状态。在G2/M(有丝分裂期)间或者在血清刺激以后，载体DNA复制得到加强。

G：重组腺病毒M003和M005的构建

1)M003病毒的构建

以下描述了M003、M005两个重组腺病毒的构建。它们都是带有反向重复序列的5型腺病毒载体，其中M003重组腺病毒含有有功能的E1a基因，而M005含有无功能的E1a基因。

  除非另外说明，本实例所采用的技术，均是本领域常规技术，如分子克隆技术、微生物学技术、细胞生物学技术，这些技术在文献中均有充分解释。如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》第二版(1989)等。

质粒载体的构建：用点突变的方法在pXC1质粒E1a基因前构建出一个AgeI酶切位点，用AgeI和HpaI限制性内切酶将E1a基因切割下来，回收基因片段。用BstXI和BsrGI内切酶切割pIRES2-EGFP质粒，回收含IRES基因的质粒片段，将两个回收片段连接，构成一个新的质粒pIRES.E1a。

用EcoRI和NsiI内切酶切割质粒pLAPSN，回收含有AP基因的DNA片段。用EcoRI和PstI内切酶切割质粒pIRES.E1a，回收大片段，与AP基因片段连接，构成质粒pAP.IRES.E1a。

用FspI切割pAP.IRES.E1a，回收3.6kb长度片段，此为表达组件AP.IRES.E1a。用AvrII和BlpI切割质粒pAd.IR.BG，回收大片段，与表达组件AP.IRES.E1a连接，构成质粒pM003。采用磷酸钙沉淀法将质粒pM003与质粒pBHG10共转染293细胞，将细胞表面铺0.5％琼脂，内含1XMEM，7％胎牛血清，置于37℃，5％CO2培养箱培养，约9天后，培养皿琼脂层下细胞出现噬斑，挑取噬斑，进行扩增，提取重组腺病毒DNA，进行DNA酶切分析，确定正确的重组腺病毒毒株。

2)M005病毒的构建

M005重组腺病毒的构建方法与M003病毒的步骤完全一致，只是在第一步克隆时将E1a基因反向与IRES基因相连，造成E1a基因不能表达。

M003及M005重组腺病毒属于由复制激活产生重组的腺病毒载体(Ad.IR)，两个同种病毒在反向重复序列(IR)之间产生重组，产生一个短的表达单元，左侧的启动子被复制连接到右侧反向重复序列的右侧，使原来反向插入不能表达的外源基因(这里是E1a基因)，得以表达。由于该载体同源重组只发生在肿瘤细胞内，故外源插入基因的特异性表达也只发生在肿瘤细胞内。

3)E1a基因促进M003病毒在细胞内的复制

将M003及M005重组腺病毒和野生对照病毒分别感染293PMT细胞，制备M003及M005甲基化病毒，培养条件为37℃，DMEM培养液，10％胎牛血清，5％CO2。纯化病毒采用氯化铯密度梯度超速离心法，两次离心纯化。

将M003及M005甲基化病毒及对照病毒分别感染SKHepI细胞，在感染后的不同时间点提取细胞中的总DNA，用内切酶HindIII+XbaI酶切过夜，0.8％琼脂糖电泳分离。用腺病毒基因片段放射性探针杂交，做核酸印渍(Southern印迹)分析。结果如图21及图22所示，从图21中可见，表达E1a基因的M003病毒，其复制水平与野生型腺病毒相当，而M005病毒及对照非复制型腺病毒载体没有产生明显的复制现象。从不同时间点的结果来看，野生型腺病毒在SKHep1细胞中的复制情况是，在感染病毒后的24小时内病毒复制逐渐增强，M003重组腺病毒在SKHep1细胞中的复制在感染后的36小时逐渐达到最高，而M005重组腺病毒在SKHep1细胞中没有有效复制。这些结果显示，表达E1a基因的M003病毒基因组在细胞内完成同源重组后，E1a基因被有效表达，加速了病毒基因组在SKHep1细胞内的复制。

4)E1a基因促进M003病毒对肿瘤细胞的杀伤效果

将M003病毒，非复制型腺病毒载体和野生型腺病毒以不同的感染系数(MOI＝3，10，30，100，300，1000)感染SKHep1细胞(不支持非复制型腺病毒载体复制)，LOVO细胞(人大肠癌细胞株)，HeLa细胞(人宫颈癌细胞株)，和293细胞(5型腺病毒转化的人胚胎肾细胞，支持非复制型腺病毒载体复制)，以上细胞分别培养于96孔板中，培养条件是DMEM培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO2。48小时后，将细胞固定，进行结晶紫染色，结果见图23。从图23中可见，对于SKHep1细胞，肿瘤细胞，M003病毒与野生型腺病毒具有相近的杀伤力，而非复制型腺病毒载体对SKHep1细胞，LOVO细胞，HeLa细胞的杀伤力和M003病毒及野生型腺病毒相比有很大差别，显示E1a基因的表达促进了M003重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤效果。

5)在动物体内试验中E1a基因促进

M003重组腺病毒在肿瘤细胞间的扩散

通过B17小鼠门静脉接种人宫颈癌细胞HeLa细胞，三周以后，小鼠肝内形成人肿瘤细胞肝内转移模型。

M003及M005重组腺病毒培养于293细胞内，培养条件为DMEM培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO2。用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，35,000rpm两次离心纯化病毒，最后将病毒稀配于含有1mM MgCl₂，10mM Tris，pH7.5，10％甘油的溶液中。

由肝内肿瘤模型小鼠的尾静脉分别注射M003及M005重组腺病毒，两天后再次注射。三天后杀死小鼠，将肝组织切片，进行碱性磷酸酶染色，结果见图24。

由图24中可见，M003及M005重组腺病毒都特异性的在肿瘤细胞中表达碱性磷酸酶基因，而M003病毒由于E1a基因的表达，随时间的延长，表达碱性磷酸酶基因的肿瘤细胞染色呈簇状，显示病毒在肿瘤细胞间的扩散。这说明E1a基因促进了复制激活同源重组的腺病毒载体(Ad.IR)在肿瘤细胞中特异性的表达及在肿瘤细胞间的扩散。

实施例II

纤维蛋白的修饰A.不同的人或动物的病毒血清型在人骨髓细胞上的感染力测试

因为在-50种已知的病毒血清型中纤维蛋白球形区的氨基酸序列变化相当大，认为不同的腺病毒血清型结合不同的细胞受体蛋白或者利用不同的进入机制(Shenk，T.，1996，In B.N.Fields，et al.(eds.)，Fields Virology，Vol.2，Lippincott-Raven Publisher，Philadelphia；Mathias，P.et al.，1994，Journal ofVirology，68：6811-14；Defer，M.，et al.，1993，J.of Virology，64，3661-3673)。尽管多数腺病毒在五面体蛋白中包含RGD结构，但有一些血清型(如Ad40，41)没有这些保守序列。这些血清型可能利用整合素v-非依赖型途径来完成病毒内化(Davison，A.J.，et al.，1993，J.Mol.Biol.，234，1308-1316；Mathias，P.et al.，1994，Journal of Virology，68：6811-14)。为检测其它腺病毒血清型能否感染存在于人骨髓中的干细胞，研究了一系列不同的人腺病毒血清型和动物病毒(见表II)。作为证实腺病毒血清型有效转导的方法，病毒DNA在感染前被标记并研究病毒基因组在被转导细胞的核中的存在。而且，分析病毒DNA在被转导细胞中是否复制来作为病毒基因早期表达的间接证据。由于不能够得到针对本研究中包含的所有血清型的抗体，因此不可能直接检测到表达的病毒蛋白。与感染检测同步的，可以对被转化的人骨髓细胞进行分析研究HSC或组细胞亚群的形态学和免疫组化特性。选择能够改变靶向，以低MOI感染骨髓细胞CD34+亚群的血清型。下一步，从具有潜在的HSC/CD34+嗜性的血清型中PCR克隆得到纤维蛋白基因并用E.coli重组系统插入到用于产生Ad5的标准穿梭质粒中来取代Ad5的纤维蛋白基因(图25)。

表II

本发明涉及的人和动物腺病毒

腺病毒	人/B组	人/D组	人/F组	鸟	牛	犬	羊	猪	鼠
										血清型	3，7，11，16，21，34，35	8，15，17，19，28.37	40，  41	CELOEDS	3	1，  2	5	4	1

划线的血清型利用CAR非依赖型途径来进入细胞。

方法

细胞和病毒：

HeLa(人子宫癌细胞，ATCC CCL-2.2)，CHO(中国仓鼠卵巢细胞，ATCC CCL-61)，K562(人造血细胞，ATCC45506)，HEp-2(人喉癌细胞，ATCC CCL-23)，293(人胚胎肾细胞，Microbix，Toronto Canada)都培养维持在DMEM，10％FCS，2mM谷氨酸和Pen/Strep中。用于CHO细胞的培养液中补加200μM的天冬氨酸和脯氨酸。在动员后从外周血中根据生产商的说明用MiniMACS VS⁺分离柱(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)纯化人富含CD34+的骨髓细胞。部分被保存于液氮中。在试验前16小时，细胞从冰冻保存中复苏并在IMDM培养基中孵育过夜，补加20％FCS，10^-4Mβ-巯基乙醇，100μg/mlDNaseI，2mM谷氨酸，10U/ml IL-3，和50ng/ml干细胞因子(SCF)或2ng/mlthrombopoietin(Tpo)。制备的CD34+的纯度用流式细胞术鉴定并始终超过90％。

流式细胞术：

生长在非组织培养处理过的10cm皿(Falcon，Franklin Lakes，NJ)中的贴壁细胞(CHO，HeLa)用1mM EDTA处理来分离，然后用包含补加有1％FCS的PBS的清洗缓冲液(WB)洗三次。生长在悬浮液中的细胞(K562，CD34+)用WB洗三次。清洗后，细胞以2×10⁶细胞/毫升悬浮于WB中。2×10⁵细胞与对αv-整合素[L230，ATCC：HB-8448，(Rodriguez，E.，Everitt，E.1999.Arch.virol.144：787-795)(最终滴度1/30)]，CAR[RmcB(Bergelson，J.M.，et al.1997.Science.275：1320-1323；Hsu，K.-H.，L.，et al.，1998，J.Virology.62：1647-1652)(最终滴度1/400)]，或者BrdU[(Amersham，Arlington Heights，IL)(最终滴度1/100)]特异性的单克隆抗体在WB中于37℃孵育1小时。随后，细胞用WB清洗并与标记着荧光isothiocyanate(FITC)的马抗鼠IgG抗体[(Vector Labs.，Burlingame，CA)(最终滴度1/100)]或phycoerythrin(PE)标记的羊抗鼠IgG抗体[(Calbiochem，La Jolla，CA)(1∶100滴度)]在4℃共同孵育30分钟。在用第二抗体孵育后，细胞用WB清洗两次，每个样本中取10⁴细胞用流式细胞重复分析两次。

为分析在被转化的CD34+细胞的CD34和c-kit的表达以及为进行荧光活性细胞筛选(FACS)，根据生产商的说明将纯化的CD34+细胞与phycoerythrin(PE)连接的抗CD34单克隆抗体(Becton-Dickinson Immunocytochemistry Systems，San Jose，CA)或PE标记的抗CD117(c-kit)单克隆抗体(MAb 95C3，Immunotech，Beckman Coulter，Marseille，France)，然后用流式细胞术分析。所有的分析和筛选都在装备有488nm氩和633nm氦氖激光头的FACStar Plus流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上进行。为分析c-kit的表达和CD34+/c-kit+细胞的FACS纯化，在CD34+细胞的培养中不需要将SCF加入到培养液中。

结果

在测试细胞中CAR/αv-整合素的表达：

通常认为CD34+细胞具有使骨髓增加的活性。所以，我们用CD34+细胞作为研究的靶细胞来鉴别具有HSC嗜性的Ad血清型并构建新的病毒载体。在已知能够使CD34+细胞保持在静止期的条件下从献血者体内得到被动员的CD34阳性的外周血细胞进行研究(Leitner，A.，et al.1996，Br.J.Haematol.92：255-262；Roberts，A.W.，Metcalf，D.1995，Blood，86：1600-1605)。通过流式细胞术有超过90％的纯化细胞为CD34阳性。而且，我们将认为是研究对人造血细胞进行基因转移的理想模型K562细胞包括到我们的腺病毒嗜性研究中(McGuckin，et al.1996，Br.J.Haematol.95：457-460)。容易被Ad5感染的HeLa细胞和很难被Ad5感染的CHO细胞被分别用来作为阳性和阴性对照细胞系(Antonious，M.et al.1998，Nucleic Acid Res.，26：721-9)。

对于Ad5，结合初始受体与结合α3β5和αmβ5对于高效的感染靶细胞是同等的重要。用针对CAR(RmcB(Bergelson，J.M.，et al.1997.Science.275：1320-1323；Hsu，K.-H.，L.，et al.，1998，J.Virology.62：1647-1652))和αv-整合素(L230，ATCC：HB-8448，(Rodriguez，E.，Everitt，E.1999.Arch.virol.144：787-795))的单克隆抗体进行流式细胞术分析测试细胞中CAR和αv-整合素的表达情况(图26)。如预期的一样，几乎所有的HeLa细胞高水平的表达CAR和αv-整合素，而CHO细胞缺乏明显的CAR和αv-整合素表达。分别有15％和77％的K562细胞表达CAR和αv-整合素。用于我们的研究中的CD34+细胞只有^-6％的表达CAR，17％的表达αv-整合素。很明显，制备的CD34+细胞代表了不同细胞类型的混合物。与以前的报道一致在非循环的人CD34+细胞中缺少或只有低水平的初始或次级Ad5受体的表达(Huang，S.，et al.1996，J.Virology，70：4502-4508；Neering，S.J.，et al.1996，Blood.88：1147-1155；

Tomko，R.P.，et al.，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94：3352-3356)。

用野生型Ad5和K562细胞的感染试验：

在被感染细胞的细胞核中病毒DNA的存在是一种间接表明病毒附着，内化和核内转移的方法。病毒基因组的核内定位是转基因转录和整合的先决条件。有两种技术被用来标记病毒DNA来进行原位分析。为了优化感染检测，可以使用野生型Ad5和允许Ad5感染的K562细胞。第一种技术(Challberg，S.S.and Ketner，S.1981，Virology114，196-209)是基于³²P标记的病毒DNA。在野生型Ad5和K562细胞扩增期间，³²P磷酸盐(40μCi/ml)被加入到不含磷酸盐的培养基中。在CPE显影后，收集³²P标记的病毒，用CsCl梯度分带并根据标准试验程序在HeLa细胞上滴定。为模拟人骨髓细胞感染的条件，K562细胞与MOI为1，10或100的³²P-Ad5在37℃搅拌条件下孵育2，4，6或8小时。这包括了对于吸收，内化和核内转运必须的时间。清洗后，细胞被固定：用细胞离心涂片器转移到显微载玻片或者用石蜡包埋并切片(根据VECTORlabs，Burlingham，CA的试验程序)。后者具有潜在的优势：对于相同细胞的多重连续切片(5μm)可以用不同的方法来分析(如对³²P标记的病毒DNA，对特定组织学染色，对免疫荧光)，这允许与存在与骨髓中的特定细胞类型相关联。细胞孵育在Kodak NTB-2显影乳液来进行放射自显影。优化曝光的时间来使背景或非核内信号最小化。核内银颗粒剂量和时间依赖性的出现按照优化的条件进行。因为³²P-磷酸盐也能够标记病毒蛋白，所以细胞质背景信号也可能会出现。为了协助检测，可以在切片上用HSC特异性抗体进行免疫荧光。作为替代的方法，可以使用BrdU标记病毒DNA的技术(Liber，A.，et al.，1999，J.of Virology73，9314-9324；Liber，A.，et al.1997.Journal ofVirology 71：8798-8807)。在这种技术中，在wtAd5病毒扩增期间在A549培养液中加入不同量的BrdU。BrdU标记的病毒DNA能够用对BrdU特异的单克隆抗体检测。用结合有生物素/亲合素以及荧光标记的物种-物种特异性的多克隆抗体来增强信号。BrdU标记的病毒DNA能够被检测通过双重和三重免疫荧光在骨髓细胞的细胞离心涂片器以及细胞受体标记物。

讨论

对选定的Ad血清型和CD34+细胞的相互作用进行研究。作为这种筛选的结果我们构建了基于Ad5的载体，其纤维蛋白被来源于Ad35的纤维蛋白所取代。我们证明这种衣壳修饰允许相应的杂合Ad载体对HSCs进行有效的病毒转导。

所有的嗜性和转导研究都是用非循环的CD34+细胞进行的，其被认为是包含HSCs。从被动员的血中纯化的CD34+细胞处于静止期是重要的，因为细胞增殖的诱导是与重新建立造血作用的能力的丧失以及细胞受体谱的改变是相关联的(Becker，P.S.，et al.1999.Exp.Hematol.27：533-541)。已知用细胞因子或生长因子处理造血细胞能够改变包括αv整合素在内的特殊整合素的表达，该整合素可能最终会改变细胞对Ad感染的感受能力或者影响被感染细胞的存活能力(Gonzalez R.，et al.1999.GeneTherapy.6：314-320；Huang，S.，et al.1995，J.Virology，69：2257-2263)。使解释转导研究复杂化的其它事实为CD34+细胞的形态和功能的不寻常的异质化。B.筛选不同腺病毒以建立HSC的嗜性

ATCC提供了超过70种不同的人或动物的腺病毒(见附录I)。基于如下标准选择了15种人的血清型和6种动物腺病毒(见表II)：(i)可以从NIH gene bank中得到其全部的基因组序列或纤维蛋白序列；(ii)没有CAR受体的使用或未知；(iii)不同的亚群以及(iv)中度或轻微的成瘤性(Shenk，T.，1996，In B.N.Fields，etal.(eds.)，Fields Virology，Vol.2，Lippincott-Raven Publisher，Philadelphia)。但是，在附录中出示的任何血清型都可以用于本发明。动物病毒被包括于感染检验是因为这可能提供了克服以前存在的对人Ad5纤维蛋白的体液免疫，这在将Ad载体应用于临床试验中是关键的障碍。

方法

病毒：

下述人腺病毒血清型从ATCC购买：3(VR-3)，4(VR1081)，5(VR-5)，9(VR-1086)，35(VR-716)和41(VR-930)。腺病毒No.VR716从ATCC购买标记为血清型34，但纤维蛋白测序后发现其为血清型35。为扩增，将相应的Ads在防止交叉感染的条件下感染HeLa，293或HEp-2细胞。病毒用CsCl梯度分带，透析并分成小分保存(Liber，A.，et al.1996.Journal of Virology 70：8944-8960)。噬斑滴定按照如下方法进行：汇合的293细胞铺于6孔板并和总体积为1ml病毒共同孵育24小时。感染2周后，对覆盖于1％琼脂/MEM/10％FCS上进行培养的噬斑进行计数。

EM研究：

CsCl分带的Ad保存物被融解并用0.5％戊二醛进行稀释。如前所述制备grids(Mittereder，N.et al.1996.J.Virology.70：7498-7509)。在用2％的甲胺钨酸盐(Nanoprobes，Stony Brook，NY)染色后，碳包被的网用Philips 410电子显微镜在80kV(最终放大倍数为85,000×)进行估计并显微成像。对于每个特殊的Ad血清型，在五个随机视野中每100个中的形态缺陷的病毒颗粒被计数。

结果

电子显微术：

除Ad5之外，关于血清型颗粒的稳定性所知很少。因为病毒颗粒的完整对于进行相互作用的比较研究是关键的，对从上述特异的血清型中得到的病毒颗粒用电子显微术(EM)进行分析。对Ad悬浮液阴性对比染色进行EM研究表明缺陷颗粒(icosahedral形状或luminal染色的丧失)的百分比不超过5％，这表明所制备的血清型具有相当的质量。

血清型筛选：

不同Ad血清型结合不同的细胞受体蛋白并利用不同的进入机制(Defer，M.，et al.，1993，J.of Virology，64，3661-3673；Mathias，P.et al.，1994，Journal ofVirology，68：6811-14)。从ATCC得到的一系列人腺病毒被测定其对于CD34+细胞的嗜性。这包括代表不同亚型的血清型3，4，5，9，35和41(表1)。我们相信由于纤维蛋白轴区的不同(Chroboczek，J.et al.1995.Adenoviru fiber，p.163-200.In a.P.B.W.Doerfler(ed.)，The molecular repertoire of adenoviruses，vol.1.Spinger Verlag，Berlin；Roelvink，P.W.，et al.1998.J.Virology.72：7909-7915)，在五面体中RGD结构花式的存在与否，以及不同组织的嗜性不同，这些血清型利用不同的细胞吸附和内化策略。选择特征相关性较少的Ad35，因为其被发现出现在免疫相容性宿主中，特别是在骨髓受体中(Flomenberg，P.，et al.1994.Journal of Infectious Dieases.169：775-781；Flomenberg，P.，et al.1987.Journal of Infectious Dieases.155：1127-1134；Shields，A.F.，et al.1985 New England Journal of Medicine.312：529-533)。后面的观察使我们相信骨髓细胞为Ad35的天然宿主。

为了扩增，相应的腺病毒保存物感染到HeLa细胞或A549细胞，并使得在给定的时间内只有一种类型的腺病毒在薄层通风罩中操作并且培养于Hepa滤瓶中，最好在分离的CO₂孵箱中培养以避免交叉感染。在扩增期间，病毒DNA用前述的技术之一来进行标记。从纯化的颗粒中分离得到病毒DNA。通过用相应类型病毒的全长基因组作为放射性探针进行Southern印迹来分析XhoI限制性模式研究病毒DNA的甲基化和未甲基化。

讨论

尽管以前有报道通过southern-blot检验来源于2，9，4和41L的纤维蛋白能够结合到CAR上(Roelvink，P.W.，et al.1998.J.Virology.72：7909-7915)，这种结合是否通过生理相关的亲和力来发生以及这是否能够赋予其进入细胞的能力。而且，如所示对于Ad5的五面体与整合素的相互作用，需要次级受体来诱导病毒内化。我们表明不同的血清型能够与K562细胞或CD34+细胞发生不同的相互作用。Ad5，Ad4和Ad41不能够有效的附着并被K562细胞和Cd34+细胞所内化。尽管Ad4属于单独的亚群(E)，认为Ad4代表了病毒亚群B和C的天然杂合载体，其具有和Ad5相关的纤维蛋白(Gruber，W.C.，et al.1993.Virology.196：603-611)。因此，Ad4具有和Ad5相似的附着特性就不令人惊讶了。血清型Ad41F亚群已经表现出具有不同的纤维蛋白，长轴的和短轴的纤维蛋白使其具有不同的细胞进入途径(Tiemessen，C.T.，Kidd，A.H.1995J.Gen.Virol.76：481-497)。Ad41不包含RGD结构花式表明这种病毒可能使用不依赖于αv-整合素途径进入细胞。但是，这些特性不能改善与CD34+细胞的相互作用。Ad9，Ad3，和Ad35能够比Ad5更有效的与CD34+细胞相互作用。在所有的被测试血清型中，Ad35表现出最有效的和K562与CD34+细胞附着并内化的能力。尽管具有短轴的Ad9能够和CAR结合，它更倾向于用αv-整合素途径进入细胞(Roelvink，P.W.，et al.1996.J.Virology.70：7614-7921)。因此，在某些亚型的CD34+细胞中αv-整合素的低水平表达能够解释所观察到的Ad9易感性。C.Ad血清型对于K562细胞和CD34+细胞的附着和内化

方法

用[3H]-甲基胸苷标记Ads：

如其它文献所详述的用[3H]-甲基胸苷标记血清型(Roelvink，P.W.，et al.1996.J.Virology.70：7614-7921)。简要的，5×10⁷HeLa或293细胞生长在含有15mlDMEM/10％FCS175平方厘米的瓶中，并以MOI50或更高的野生型腺病毒感染。感染后12小时，1mCi的[3H]-甲基胸苷被加入到培养液中并在37℃中进一步孵育直到观察到完全的CPE。然后，收集细胞并用冰的PBS清洗，然后重新悬浮于5mlPBS中。经过4次冻融病毒被从细胞中释放出来。离心清除细胞碎片，如前所述病毒颗粒用CsCl梯度超速离心分离并被透析(Liber，A.，et al.1996.Journal of Virology 70：8944-8960)。表达纯化和透析以除去没有被整合的放射性元素。通过分光光度计测定OD₂₆₀来测定野生型Ad颗粒的浓度，利用对于野生型Ad5ε₂₆₀＝9.09×10^-13 ODml cmvirion^-1的消失系数(Maizel，J.V.，et al.1968.Virology.36：115-125)。病毒特异的放射性用液闪仪测量，其范围一般在到1×10^-5到1×10^-4cpm/virion。对于选定的变体，纤维蛋白基因被PCR扩增并测序以保证一致性和没有交叉污染。

病毒DNA被甲基化酶标记并用基因组Shouthern Blot来检测其复制：

为最终证实转化，可以建立检测在被感染细胞中腺病毒的复制的试验程序。病毒DNA合成仅在病毒早期基因从头表达之后发生。位点特异性甲基化策略被用来检测在被感染细胞中病毒的复制(Nelson，J.E.et al，1997，J.Virol.，71：8902-7)。通过将甲基基团取代到XhoI位点CTCGAG中的N6位置的腺嘌呤碱基，并使病毒在表达XhoIisochizomerPaeR7甲基转移酶(PMT)HeLa细胞或A549细胞中进行增殖(Kwoh，T.J.，etal.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，7713-7717)，可以产生甲基化标记的腺病毒。已知甲基化不会影响载体的产量但会阻止被XhoI酶切。通过病毒复制甲基化丧失保留了XhoI酶切，与天然没有甲基化的病毒基因组相比能够通过对被感染的细胞中分离的基因组DNA进行Southern印迹来检测。

附着和内化试验：

这些研究是基于已经发表的试验程序(Wickham，T.J.，et al.1993.Cell.73：309-319)。在预试验中，我们发现用MOI400 pfu/cell的被标记的Ad5感染HeLa细胞时，在4℃40分钟后病毒颗粒与细胞的附着达到平衡。对于附着研究，3.5×10⁵细胞和与MOI为400pfu/cell Ad5等量的[³H]-甲基胸苷标记的腺病毒OD颗粒在100μl冰预冷的吸附缓冲液(Dulbeco’s modified Eagle’s培养液补加有2mM MgCl2，1％BSA，和20mMHEPES)中共同孵育1小时。然后，细胞于1000×g离心4分钟，然后用0.5ml冰预冷的PBS清洗两次。清洗后，细胞于1500×g离心并除去上清液，用液闪仪进行细胞相关的放射性测定。每个细胞所附着的病毒颗粒用病毒特异的放射性和细胞数目来计数。为了测定被内化的被[³H]标记的腺病毒颗粒，细胞和相应的病毒在冰上孵育1小时，如上所述用PBS清洗，重新悬浮于100μl吸附缓冲液中，然后于37℃孵育30分钟。孵育后，细胞用冰的0.05％胰蛋白酶-0.5mMEDTA稀释3倍并于37℃再孵育5-10分钟。这种处理除去99％附着的放射性。最后，细胞于1500×g离心5分钟，除去上清液，并测量每分钟的蛋白酶抗性数目。这个试验程序使内化的数据倍受体的循环所影响的可能性最小化(Rodriguez，E.，Everitt，E.1999.Arch.Virol.144：787-795)。在超过100倍的非标记病毒存在的情况下测量冰上的非特异性附着到细胞上的Ad数目。这个值通常低于附着的病毒的0.1％。

结果

腺病毒颗粒对靶细胞的附着和内化：

选定的血清型通过代谢途径标记有[³H]-胸苷，其在复制期间整合到病毒DNA上。附着和内化能够通过试验手段区分开，利用在低温下(0-4℃)只观察到病毒附着的发生，而内化需要在更高的温度发生。用病毒特异的放射性来对每个细胞上被吸附或被内化的病毒颗粒的数目进行计数，该数目可以用来对Ads3，4，5，9，35和41与CD34+，K562，HeLa和CHO细胞相互作用进行定量(图27)。血清型之间在对不同的细胞系的附着和内化的能力有很大的变化。对于Ad5，与所检测的细胞系的附着程度取决于CAR表达水平。在表现为Ad5很难进行感染的CHO细胞中，附着并被内化的水平约为每个细胞50-70个病毒颗粒。对于给定的Ad5的感染能力这个数目被假定为阴性。其它血清型与CHO细胞的相互作用没有显著的增高表明CHO细胞缺乏相应的受体。所有被测定的血清型都能够与HeLa细胞相互作用；Ad3和Ad35为最有效率的变体。以证明在HeLa细胞上存在Ad3和Ad35的不同受体(Stenvenson，S.C.，etal.1995.J.Virology.69：2850-2857)。Ads 4，5，和41不能附着K562细胞。相反，Ad9和B亚群中的成员，Ad3和Ad35能够有效的和K562细胞相互作用，其中Ad35具有最大数目的被吸附和内化的病毒数目。与Ad5相比，约有25倍或更多的Ad35被附着其中有约四分之三被K562细胞所内化。病毒与CD34+细胞的相互作用更弱。在被测试的血清型中，只有Ad9和Ad35能够显著的被非循环的CD34+细胞所内化。Ad9和Ad35的内化分别比Ad5的效率高4倍和8倍。被CD34+细胞所内化的Ad35病毒颗粒为在HeLa细胞中所见的病毒颗粒的一半，该细胞能够很容易的被基于Ad5的载体所感染。

高水平表达人腺病毒的初级和次级受体的HeLa和293细胞被用来作为病毒附着和内化的阳性对照，CHO细胞被用来作为阴性对照。CHO细胞不能以可检测到的水平表达初级腺病毒受体，因此很难被腺病毒感染。对于附着研究，这些吸附性细胞系用PBS-EDTA从10cm的皿中分离(没有Ca2+和Mg2+)，用冰预冷的PBS清洗三次，重新悬浮于吸附缓冲液中，并按照前面实施例中所述的和病毒颗粒共同孵育。如同预期的一样，所有检测的腺病毒血清型都能够有效的附着并被HeLa细胞所内化(表III)。腺病毒血清型3，5，35，41但没有9，能够有效的附着并被293细胞所内化。相反，大多数血清型都不能被CHO细胞附着并内化。CHO上的附着水平对于腺病毒血清型5和41来说为每个细胞有50-70个病毒颗粒，对于3型腺病毒来说有115个病毒颗粒，对于血清型9和35有180个颗粒。为进一步分析，根据特定细胞系对于腺病毒有效转染的感受力，每个细胞中病毒颗粒的数目超过300的被认为是阳性的，每个细胞中小于70个病毒颗粒时被认为是阴性的。

表III对Ad5和Ad9对表达不同量CAR和αυβ整合素的细胞系的附着和内化的比较分析

细胞系	CAR表达	αυβ整合素表达	Ad9(附着/内化)	Ad5(附着/内化)
					HeLa	++	++	426/370	550/500
CHO	-	++	300/300	70/50
					293	++	++	20/20	1950/1750
Y79	+++	-	190/140	1200/1100
					K562	-	+	320/230	60/50
红细胞	？	？	420/-	68/-

以前的研究表明人血细胞系K562能够被基于Ad5的腺病毒载体以高MOI转化。如图34所示，在MOI为400时在每个细胞上只有60个腺病毒血清型附着，而只有更少的病毒颗粒被内化进入这些细胞。与Ad5相反，大约每细胞320个Ad9的颗粒和约每细胞1500个Ad35的颗粒附着到细胞上并有大约三分之二被K562细胞所内化(图27)人为经刺激的富含CD34+的骨髓细胞从冷冻保存物中取出并在没有细胞因子刺激的生长液中孵育过夜。第二天，对存活的细胞计数。对于附着研究，细胞被预冷的PBS清洗三次，并重新悬浮于吸附缓冲液中并和腺病毒共同孵育。在被测试的腺病毒血清型中，只有Ad9腺病毒颗粒(每细胞约150个病毒颗粒)和Ad35(每个细胞约320病毒颗粒)能够以一定的水平附着到未经刺激的CD34+细胞上，与Ad5相比(每个细胞只有60个病毒颗粒)。四分之三的病毒颗粒能够被细胞所内化。有趣的是在用GM-CSF和EPO/TPO刺激CD34+细胞两周后，Ad9病毒颗粒的附着和内化被显著的增强(每个细胞约300个病毒颗粒)。同时，用GM-CSF瞬时刺激两天不能增加病毒附着到细胞的水平。

基于上述发现：在所有被测试的血清型中，Ad35血清型能够最有效的附着并内化到CD34+细胞中，因此Ad35被选择作为进一步研究。包含短轴Ad35纤维蛋白序列的杂合载体(Ad5 GFP/F35)能够以CAR/整合素非依赖的方式靶向更广谱系的CD34+细胞。

讨论

综上所述，在所有被测试的血清型中，Ad9，Ad3，和Ad35表现出对于K562和CD34+细胞最有效的附着和内化能力。基于吸附/内化数据，作为亚群D和B的代表的Ad9和Ad35被选择来来进行进一步的嗜性研究。D.Ad载体在K562和CD34+细胞中的复制特性：

Ad5和Ad9以及Ad34对于293，K562和CD34+细胞能够感染并在其中复制。如前所述Ad9纤维蛋白的球形结构域具有和Ad5有相同的结合细胞表面初级受体的亲和力。因此，发现Ad9病毒颗粒只能很弱的结合到293细胞上是没有预期到的。为了发现附着和内化数据是如何影响不同血清型腺病毒生物活性的，通过电子显微术，在293细胞的噬斑检验以及在K562细胞和CD34+细胞的定量复制检验研究了Ad5，Ad9和Ad35的特征。

方法

定量复制检验：

1×10⁵ CD34+或K562细胞在100μl生长培养液中被已经在表达XhoI DNA甲基转移isochizomer PaeR7(Nelson，J.E.et al，1997，J.Virol.，71：8902-7)的293细胞中扩增的不同MOI值的Ad5，Ad9或Ad35所感染。在37℃孵育2小时后，细胞在1000×g离心5分钟，除去包含病毒的培养液，细胞重新悬浮于100μl新鲜培养液中，然后在37℃孵育直到收获。在K562细胞被感染后16小时或CD34+细胞被感染36小时，5μg pBS质粒(Stratagene，La Jolla，CA)被加入作为能够用来作为载入对照的载体。如前所述提取基因组DNA(Liber，A.，et al.1996.Journal of Virology 70：8944-8960)。将纯化的细胞(相当于2.5×10⁴细胞)DNA的四分之一用HindIII，XhoI或用HindIII和XhoI共同在37℃过夜，并用1％琼脂糖凝胶分离，随后用杂合的Ad5/9或Ad5和Ad35(Ad5/35)探针来进行Southern印迹。包含Ad5和Ad9(Ad5/9)或Ad5和Ad 35(Ad5/35)序列的杂合探针是用Pfu-TurboDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和用来源于纯化颗粒的病毒DNA作为模板通过两步法PCR扩增来产生。如下的引物可以被用于PCR(Ad5序列和序列号被加上下划线)：

杂合载体 杂合载体Ad5/9R-

杂合载体

CCA-3’，杂合载体

根据从NCBI GENEBANK得到的序列给出核酸数目(对于Ad5 accession No.M73260/M29978，对于Ad9为X74659，对于Ad35为U10272)。在第一次扩增后，对应于纤维蛋白基因的Ad9的968bp，Ad35的859bp片段，相应于Ad5 E4区(位于紧邻Ad5纤维蛋白基因的下游)的Ad5的876bp片段用琼脂糖凝胶电泳纯化。为产生杂合DNA探针，扩增的Ad5DNA探针与经第一轮PCR扩增得到的Ad9或Ad35片段混合，然后用Ad5/9F或Ad5/35F引物和Ad5R1引物进行第二轮扩增。得到的Ad5/9或Ad5/35杂合DNA片段(见图35)被纯化并用分光光度法测量其浓度。相应的杂合载体DNA片段被作为标准物被加入到琼脂糖凝胶中或标记着[³²P]-dCTP作为Southern分析的探针。在定量性Phospho-imager分析后对每个DNA样本中的病毒基因组的数目进行计算。在预试验中，没有检测到杂合DNA探针对任何特殊的病毒血清型有优势杂交。

结果

被选择的血清型在K562细胞和CD34+细胞中的复制：

吸附/内化研究不能最终证明病毒的转导，一个通常被定义为能够允许病毒或外源基因在宿主细胞中表达的基因传递的过程。细胞内物种转运，包括溶酶体裂解，转运到细胞核，以及病毒基因组的核内转移，都依赖于结构性的衣壳蛋白因此其在不同的血清型中也不同(Defer，M.，et al.，1993，J.of Virology，64，3661-3673，Miyazawa，etal.1999.J.Virology.73：6056-6065)。我们相信病毒基因的表达分析可以作为一种证实病毒基因组已经成功的进行了核内转移的方法，而且可以作为选择能够有效的感染我们的靶细胞的血清型的标准。为达到此目的，我们使用了一种试验程序使得能够在被感染的细胞内检测到Ad的复制。病毒DNA合成仅发生于腺病毒早期基因的从头表达之后。我们利用位点特异性甲基化策略来监控在被感染细胞内的病毒DNA的复制(Nelson，J.E.et al，1997，J.Virol.，71：8902-7)。通过将甲基基团取代XhoI位点CTCGAG中的N6位置的腺嘌呤碱基，并使病毒在表达XhoI isochizomerPaeR7甲基转移酶(PMT)293细胞中进行增殖(Kwoh，T.J.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，7713-7717)(293PMT细胞)，可以产生甲基化标记的腺病毒血清型。通过病毒复制甲基化丧失保留了XhoI酶切，与天然没有甲基化的病毒基因组相比能够通过对被感染的细胞中分离的基因组DNA进行Southern印迹来检测。

与Ad5相比，用Ad9和Ad35在K562细胞和CD34+细胞中进行腺病毒复制研究。为进行复制研究，对于甲基化和未甲基化的Ad5，Ad9和Ad35(表2)分别测定其感染滴度(pfu/ml)和基因组滴度(基因组/毫升)。比较甲基化和未甲基化的病毒的pfu对于基因组滴度的比率，结果表明DNA甲基化并没有改变转导特性。用于感染的约85％病毒(Ad5，9和35)被甲基化的，是基于对于存在于载入病毒内的病毒DNA甲基化与非甲基化特异的片段的强度计算得到的(图28)。在吸附(1小时，0℃)或内化(2小时，37℃)后测量的基因组的数目与图12中所示的研究非常相关。Ad9和Ad35与K562和CD34+细胞的相互作用比Ad5更有效。用相同基因组数目的Ad5，9和35在K562和CD34+细胞上进行剂量依赖性复制研究(图28)。基于用不同MOI(2100，420和105基因组每细胞)进行感染后甲基化对于非甲基化病毒DNA的比率来测量复制率。在K562细胞中，测定有效的复制(100％从甲基化转化为非甲基化)对于Ad5 MOI＞/＝2100，Ad9MOI＞/＝420，Ad35 MOI＞/＝105。这表明Ad35以高效率转导K562细胞。在Cd34+细胞中，在用MOI420感染后，对于Ad5复制率为100％，对于Ad9复制率为31％。尽管甲基化的Ad35病毒DNA存在于CD34+细胞中，对于Ad35来说检测不到病毒复制。总之，在K562细胞中进行的病毒复制研究证实了来源于Ad5，9和35吸附和内化的数据，但和前面的结果不同的是Ad9特别是Ad35在CD34+细胞中较弱的复制能力。如后面所述，在异质性细胞群落中如CD34+细胞中，复制分析不能得到某个特定血清型嗜性的明确结论。

综合所有的筛选数据，Ad9和Ad35作为具有对K562细胞和CD34+细胞最强嗜性的亚型。通常认为Ad9能够结合到CAR上，但是，其倾向于用αv-整合素来进入细胞(Roelvink，P.W.，et al.1996.J.Virology.70：7614-7921)。这个进入策略对于CD34+细胞的有效感染可能不是最优化的，因为只有17％的细胞表达αv-整合素(图26)。因此，我们决定集中于将Ad35作为外源纤维蛋白的来源用来构建基于Ad5骨架的杂合载体。

表IV

用293细胞测定光学颗粒对PFU(OPU/PFU)比率的感染检验的结果

病毒	OPU(A260)	PFU	OPU/PFU比率
				Ad5	1.4×1012	1.06×1011	13
Ad9	161×1011	2.6×108	1773

讨论

在K562细胞中进行的病毒复制研究证实了来源于Ad5，9和35吸附和内化的数据。但是，在CD34+细胞中相互作用的数据和复制的数据并不一致，Ad9复制能力较弱而Ad35没有观察到复制。只有早期病毒蛋白开始产生，腺病毒才能够进行复制，而蛋白的产生又直接取决于存在于被感染细胞细胞核中的病毒基因组的数目。因此，复制研究的结果可以被病毒基因组的核内转运，病毒启动子的活性和/或病毒DNA/RNA的细胞内稳定性所影响。这些参数一方面在不同的CD34+亚群中是变化的，和/或在另一方面在不同的腺病毒血清型之间也是变化的。总之，在CD34+细胞中用不同腺病毒血清型进行病毒复制分析不能预测基于Ad5骨架的杂合载体的实际转导特性。这暗示了尝试生产基于Ad5之外的腺病毒基因组的基因转移载体应该谨慎。

近来，腺病毒血清型筛选策略被用来鉴别具有对于初级乳鼠CNS皮层细胞或人脐带静脉上皮细胞嗜性的亚型。基于感染后48小时的六面体产物的免疫组化分析选择了优化的血清型(Ad17)(Chillon，M.，et al.1999.J.Virology.73：2537-2540)。但是，这种方法是存在问题的，至少根据我们所知，针对Ad5六面体的抗体并不与其它血清型交叉反应。而且，六面体只在基因表达开始后表达。如上所述，细胞内转运，病毒基因表达和复制的动力学在不同的血清型之间有显著的变化(Defer，M.，et al.，1993，J.of Virology，64，3661-3673；Miyazawa，et al.1999.J.Virology.73：6056-6065)。

除了是与CD34+细胞相互作用最有效的血清型外，Ad35引起我们的兴趣还因为与其相互作用的受体不同于Ad5和Ad3。Ad35和Ad5GFP/F35的结合不能被Ad5或抗CAR抗体抑制表明Ad35的结合是CAR非依赖性的。首先，Ad5在内化和感染期间不和Ad35以及Ad5GFP/F35相竞争表明α_φβ_3/5□不参与病毒进入。其次，针对αv的功能阻断型抗体不和Ad35以及Ad5GFP/F35竞争内化进入K562细胞，同时这些抗体不阻止Ad5内化。第三，与基于Ad5抗体不同，Ad5GFP/F35感染后的GFP的表达不局限于表达αv整合素的CD34+细胞。从这些事实我们得到结论：Ad35和Ad5GFP/F35杂合载体的感染与αv整合素并不相关。在此情况下，Ad35五面体内的RGD结构模式的存在或缺乏仍要通过对相应的基因组区的测序来决定。交叉竞争检验表明Ad35和Ad5GFP/F35结合到不同于Ad3受体的受体之上。尽管Ad3和Ad35属于相同的亚群，它们已经被分为两个DNA同源组，B1和B2：它们的纤维蛋白的氨基酸组成只有60％的同源性。而且，这些病毒的靶组织不同；Ad3能够导致急性呼吸道感染，而Ad35与肾感染相关(Horwitz，M.S.1996.Adenoviruses，2149-2171.InB.N.Fields，Knipe，D.M.，Howley，P.M.(ed.)，Virology，vol.2.Lippincott-Raven Publisher Inc.，Philadelphia)。因此Ad3和Ad35识别不同的受体并不令人惊讶。

总而言之，Ad35和杂合载体通过CAR-和αv整合素非依赖性途径进入细胞。我们相信Ad35和杂合载体最初结合到其纤维蛋白受体上，这种相互作用足以引发内化反应。另一方面，Ad35的内化可能涉及除αv整合素之外的细胞蛋白。这些膜蛋白可能与用于Ad3内化的蛋白相重叠，其代表为β2整合素，其在细胞表明比αv整合素更为突出(Huang，S.，et al.1996，J.Virology，70：4502-4508)。

根据阴性对照染色的腺病毒悬浮物的EM研究，对于所有被测的腺病毒血清型来说缺陷颗粒的百分比不超过5％。但是，噬斑检验表明不同的待测血清型在293细胞中形成噬斑的能力有很大的不同。所得到的光学颗粒对于PFU(OPU/PFU)的比率对于Ad5为13，其与以前对这种血清型的估计比率相一致。重要的是，这个比率比腺病毒35血清型高3倍，比腺病毒9血清型高150倍。而且，用Ad5/9和Ad5/35DNA探针进行定量Southern印迹用来测定基因组和转化滴度之间的比率。这个研究证实了由噬斑检验所得到的数据。在K562和CD34+细胞中进行的这些腺病毒的定量复制检验也证实了Ad9和Ad3能够更有效的结合到这些细胞的能力。与Ad5相比，Ad9和Ad34以低MOI感染后能观察到病毒基因组的复制。总之，在不同血清型的附着和内化中所得到数据与在靶细胞中所得的感染力的数据相一致。E.不同腺病毒血清型对于原代树突状细胞，JAWSII，MCF-7和REVC细胞的附着和内化

作为原理的证明，血清型筛选策略被用于其它很难被Ad5感染的重要的靶细胞。

结果

RECV细胞作为心瓣狭窄，动脉硬化，炎症等的基因治疗中所靶向的内皮细胞。MCF-7细胞为从肝癌转移灶中分离的乳癌细胞其为肿瘤基因治疗的重要靶细胞。人腺病毒血清型3，5，9，35和41被测试观察它们是否能够结合并被树突状细胞，JAWSII，MCF-7-人乳癌细胞和REVC内皮细胞所内化。所测试的腺病毒血清型没有一个能够有效的附着到原代树突状细胞。腺病毒血清型3能够有效的附着到REVC细胞上(每个细胞约有400个病毒颗粒附着上并约有300个被内化)。与之相比，只有50个Ad5的颗粒能够附着，更少的被REVC所内化。以前的研究就表明人乳癌细胞(MCF-7)难于被Ad5以低MOI所感染。但是，Ad3特别是Ad35能够更有效率的附着并被MCF-7细胞所内化。

讨论

此处所出示的数据(图29)表明不同的人腺病毒血清型识别不同的细胞受体因而能够感染难于被Ad5所感染的细胞类型。这些腺病毒血清型能够比Ad5更有效的附着并内化到人CD34+细胞，REVC，K562和MCF-7细胞。这个发现提供了构建基于Ad5但包含来源于其它血清型受体配基的杂合腺病毒载体的基础。F.在原代人骨髓细胞上的感染研究

因为已经建立的红细胞系不能代表在病人中被靶向以得到长期遗传修饰的重组细胞的最终的造血干细胞的充分模型，正常的原代人骨髓细胞被用来进行感染/重新靶向的研究。

结果

在用不同Ad血清型进行第一轮嗜性研究时，全部的骨髓细胞可以不经过预选的被使用。这是有利的，因为不同腺病毒血清型或遗传重新靶向的载体的嗜性可以在广谱的组细胞亚群中分析，其包括(myeloid，erythoid，megakaryocytic，lymphoid，dentritic，monocytic linegage)。对于短期感染研究(＜5小时)，骨髓细胞悬浮液被培养于补加有10％FCS，β-mercaptoethanol和10μg/ml的IL-3的IMDM中以保证细胞的存活率。

单核细胞检验：

单核骨髓细胞能够和MOI为1，10，100，或1000pfu/cell的不同腺病毒血清型共同孵育一段很短的时间。被感染的骨髓细胞的Paraffin部分或cytospin(细胞离心涂片器)被用来分析核定位的被标记的病毒DNA。BrdU标记可以通过用抗BrdU抗体进行免疫荧光来成像分析；³²P-标记的病毒DNA可以与照相乳液共同孵育来检测。此外，同样的细胞物质能够在特殊的组织学染色(如Wright，Hemo3染色)后进行形态学分析。如果必要，商业可用的抗体可以用于直接与不同荧光染料(FITC(绿色)，TRIT.，RPE，(红色)，RPE-Cy5，AMCA(蓝色))相连的特殊细胞表面标志物来区别不同骨髓细胞亚群的特征。BrdU-标记的病毒DNA(例如作为FITC信号)与表示特殊细胞类型感染的膜标志物的共同定位能够被证明，例如潜在的干细胞/前期祖细胞(CD34⁺，CD38^-)。感染的骨髓细胞亚群的形态学分析给出了特殊的腺病毒血清型能否靶向原始细胞类型的第一手信息。

讨论

因为不同的野生型腺病毒不表达统一的标志物基因而且并不整合，并且标记的病毒DNA不能在活的细胞中进行检测，基于此点，不可能描绘出感染细胞克隆和复制的特征。因此，要基于腺病毒血清型以低MOIs体外感染纯化的CD34+细胞的能力来选择进行重新靶向的研究。骨髓细胞的亚群已知为包含长期重组的细胞。如上所述用不同腺病毒血清型进行感染研究能够在纯化的CD34+细胞上重复(培养在IMDM中，+10％FCS，β-mercaptoethanol和10单位/毫升的IL-3)。CD34+细胞的纯化能够通过在抗CD34+单克隆抗体包被的板上直接用免疫吸附来进行或者如Papyannopoulou所述(Papayannopoulou，T.et al.，1996，Experimental Hematology，24：660-69；Papayannopoulou，T.et al.，1993，Blood，81：229)在MiniMacs柱上进行。分离的CD34+细胞的纯度范围通常在80-95％。在CD34+/CD38-亚群上可以用选定的腺病毒类型重复类似的感染研究。

为证实生产性感染，纯化的CD34+细胞能够被选定的血清型(methylase标记)感染并且分析病毒DNA复制。纯化的人骨髓CD34+细胞能够被作为HSCs的模型用于转化和整合研究。

近来证明HSC活性不存在于CD34阴性人骨髓细胞亚群(Bathia，M.etal.，1998，Nature Medicine，4：1038-45；OsawaM.，et al.，1996，Science，273：242-5；Goodell，M.et al.，1997，Nature Medicine，3：1337-45；Zanjani，E.D.etal.，1998，Exp.Hematology，26：353-60)。在重新靶向和转化研究中，结合在SCID-NOD鼠中的复制检验来测试Lin^-CD34^-38^-。

G纤维蛋白基因的克隆和插入

方法：

相应的纤维蛋白基因的PCR克隆和代替内源Ad5纤维蛋白基因插入Ad5基础穿梭质粒：

选择一个或几个定向于CD34+或其它HSC的腺病毒进行以下进一步的研究。随着病毒类型的不同，纤维蛋白的完全编码区变化范围在1-2kb。该蛋白编码序列可以用pfu聚合酶PCR法从所选择的病毒类型的纯化颗粒的分离的DNA中获得。相应的启动子可根据纤维蛋白序列从EMBL基因库中选择设计。将PacI-BalI片段进入用来重组RecA+E.coli的穿梭载体pCD4(图25所示)。在pCD4中，异源纤维蛋白基因被插入Ad5的直接邻接于纤维蛋白阅读框的同源区域序列的两侧。作为Ad5(穿梭载体)衍生的重组模板，可使用pCD1，pBHG10(Microbix，Toronto，Canada).重组的过程遵循重组腺病毒通常的步骤(Chartier，C.，et al.，1996，J.of Virology，70，4805-4810)。一般的，有90％的最终质粒获得精确重组。可对异源纤维蛋白(X)序列和Ad5序列的连接进行测序来确认重组的正确性。所获得的重组质粒命名为pAd5fiberX(pAd5^fx)。最终产物用于产生基于含有异源纤维蛋白基因的Ad.AAV的pAd5^fx-。

嵌合腺病毒载体的构建：

为进行细胞转导研究，构建两个腺病毒载体：Ad5GFP和含有一个嵌合Ad5/35纤维蛋白的Ad5GFP/F35。他们含有一个2.3kb的，衍生于EGFP基因的CMV启动子[derivedfrom pEGFP-1，(Clontech，Palo Alto，CA)]，该启动子被插入Ad5的E3区。在E3缺失的pBHG10穿梭质粒Ad5序列的25，191-30，818之间插入EGFP表达盒，所得质粒命名为pAdGFP。对于嵌合性载体，pAdGFP中的Ad5型纤维蛋白基因被Ad5/35型嵌合蛋白基因代替，嵌合性温度表基因有两步PCR常规方法产生：第一步，用Pfu-Turbo DNA多聚体扩增三个DNA片段，他们分别是：1)Ad5纤维蛋白的5’不翻译区和尾部区前132个碱基(nt30，818-31，174)，2)Ad35轴(杆)区和球形区(nt 132-991)，和3)包含Ad5纤维蛋白的polyA信号的Ad5的E4区(nt 32，775-33，651)。使用以下引物：对Ad5尾部区，Ad5F-2(nt 30，798-30，825)5’-CGC GAT ATC GAT TGG ATC CAT TAA CTA-3’和Ad5R-2(nt 32，775-33，651)5’-CAG GGG GAC TCT CTT GAA ACC CAT T-3’；对Ad35轴(杆)区和球形区，引物Ad5/35F和Ad5/35R(如上)；对Ad5E4和polyA，引物Ad5F-1和Ad5R-1(如上)。10个PCR循环后，用琼脂糖凝胶电泳纯化，结合，然后进行以Ad5F-2和Ad5R-1为引物的第二轮PCR。所获得PCR产物是长度为2115个碱基的嵌合纤维蛋白基因同时含有Ad5型的尾部区和Ad35型的轴(杆)区和球形区。该产物用于作为包含pAdGFP中片段的SalI/Xbal Ad5型纤维蛋白基因的替代物.产生的质粒被命名为pAdGFP/F35.为产生E1/E3全长的载体基因组，通过在E.coli中的重组(Chartier，C.，etal.1996.Journal of Virology.70：4805-4810)，将pAdGFP和pAdGFP/F35插入pAdHM4(Mizuguchi，H.，Kay，M.A.1998.Huma Gene Theraphy.9：2577-2583)。为达到此目，将被Srfl线性化的pAdHM4和Xbal片段混合共转化RecA+E.coli品系BJ5183，Xbal片段含有GFP基因，Ad5或Ad5/35纤维蛋白基因，和Ad5同族区域。将所得重组产物经限制性分析，正确的重组产物在E.coli HB101中扩增，并由双CsCl梯度联合纯化。质粒被命名为pAd5GFP和pAd5GFP/F35。经核酸内切酶酶切和pAdGFP/F35序列测定可以确认Ad5/35嵌合纤维蛋白基因的正确结构。为产生相应的病毒，用PacI切割pAd5GFP和pAd5GFP/F35来释放病毒基因组并转染293细胞(Lieber，A.，C.-Y.et 1.1996.Journalof Virology.70：8944-8960)。转染后噬菌斑叠层培养7-10天，重组病毒在293细胞中扩增，用标准方法纯化(Lieber，A.，C.-Y.et 1.1996.Journal of Virology.70：8944-8960)

红血球凝聚化验：

用McIlvaine-NaCl缓冲液(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢钠[PH7.2]，用1∶50的0.87％的NaCl稀释)连续稀释分别得到25ml的Ad5，Ad35，或Ad5GFP/F35嵌合性病毒体稀释液，装载到96孔板。每一种病毒稀释液，加入25μl 1％的猴红血球悬浮液(McIlvaine-NaCl缓冲液稀释)。37℃培养1小时后测沉淀模式.所有试验都至少独立进行两次，每次四份。

Southern印迹：

抽提基因组DNA，标记DNA片段并进行杂交试验(Lieber，A.，C.-Y.et 1.1996.Journal of Virology.70：8944-8960).

结果：

嵌合纤维蛋白的结构特征：

先前已有报道，转换纤维蛋白球形区就能够改变嵌合腺病毒载体的定向性(图31)(Chillon，M.，et al.1999.J.Virology.73：2537-2540；Krasnykh，V.，etal.1998.J.Virology.72：1844-1852；Stevenson，S.C.，et al1997.J.Virology.71：4782-4790)。如上所述，纤维蛋白轴(杆)的长度是决定着特定血清型进入策略。因此，我们决定不仅置换Ad5型病毒纤维蛋白球形区，也置换其轴(杆)区.嵌合的Ad5/35纤维蛋白包含了对于和相互作用必须的Ad5的尾部区(1-44氨基酸)，该区连接有来源于Ad35的279个氨基酸，包括具有7个β-折叠和球形区的轴区(图30)。内源性Ad5纤维蛋白polyA信号用于终止嵌合蛋白RNA转录的结束.因为纤维蛋白球形区和RGD基元之间的自然距离被打乱，包括含五面体基质蛋白的结构基元的Ad5衣壳和短轴区纤维蛋白的结合是有风险性的。Ad5纤维蛋白被基于一个E1/E3缺失的腺病毒载体的嵌合纤维蛋白序列替换。该载体携带一个插入E3区的CMV启动子-GFP报道基因表达盒。在滴度＞2×10¹²基因组/毫升的239细胞中产生相应的嵌合病毒(Ad5GFP/F35)。作为比较，构建包含原始Ad5纤维蛋白基因和GFP表达盒的E1/E3缺失的腺病毒载体Ad5GFP.Ad5GFP和Ad5GFP/F35感染颗粒的滴度和比率都非常相似，其表明纤维蛋白的改造没有显著改变嵌合载体的稳定性和/或生长特性。纤维蛋白修饰的正确程度根据对Ad5GFP/F35病毒基因组进行限制性分析来确认。分析过程有Southern探针杂交，纤维蛋白编码区的直接序列，和猴红血球凝聚功能测试。红血球凝聚是由纤维蛋白球形区功能介导的；已知Ad5型纤维蛋白并不介导猴红血球凝聚，而Ad35型有很强的凝聚效应(Pring-Akerblom，P.，et al.1998 J.Virology 72：2297-2304)。在红血球凝聚测试中，当高达1∶512的稀释时Ad5GFP/F35和Ad35的凝血效率相同。与之相对照，同样条件下Ad5未显示红血球凝聚作用。此结果明确显示出合并进Ad5型衣壳的Ad5/Ad35嵌合纤维蛋白的功能性作用。

构建带有异源纤维蛋白分子的嵌合腺病毒载体：

具有Ad5-Ad3纤维蛋白的腺病毒具有活性并可以被高滴度产生(Krasnykh，V.，etal.1996.J.Virology.70，6839-6846；Stevenson，S.C.，et al.，1997.J.Virology.71：4782-4790)。为了测试此处描述的替换纤维蛋白是否影响腺病毒的产生和稳定性，采用标准方法用AAV-β半乳糖表达盒在293细胞中生产两种E1缺失的腺病毒载体。一种载体由pAd.AAV-BG和PCD1(含有内源性Ad5纤维蛋白基因)重组而成，另一种载体(携带异源纤维蛋白)是pAd.AAVβ半乳糖和pAd5纤维蛋白X(pAd5^fx)的重组产物。源自单一噬斑的病毒在239细胞中扩增。每个239细胞中产生的病毒量可以用293细胞溶解物的噬斑滴度测定。我们预见，纤维蛋白的修饰将不会对嵌合载体的稳定性有决定性的影响。最后，骨髓细胞会被重新靶向载体感染。感染两天后，通过使用基础荧光素diβD-Glactopyranoside(FDG)β半乳糖表达进行活细胞计数(Cmantwell，M.J.et al.，1996 Blood 88，4676-4683；Neering S.et al.，1996 Blood，88：1147-55；Fiering，S.N.et al 1991，Cytometry，12：291；Mohler，W.et al.，1996，PNAS，93：57)，被感染的细胞具有菌落形态的特征和表面标识。在感染之前和感染过程中，骨髓细胞可以在添加了血小板生成素(Tpo)的IMDM/FCS中培养，Tpo支持HSC存活(Matsunaga，T.et al.，1998，Blood，92：452-61；Papayannopoulou，T.et al.，1996，Experimental Hematology，24：660-69)。可选择地，重新靶向载体可随AAV-GFPA表达盒产生，进行基于GFP和被转导表面标记基因表达的FACS分析

H Ad5/Ad35嵌合纤维蛋白的竞争性研究

竞争性研究

为研究Ad5，35，和Ad5GFP/F35(图32所示)之间的相互竞争力，更细微地考察嵌合载体感染靶细胞的通道，观察它们附着到宿主细胞上的能力和内化的过程。在竞争地进入(attach)K562细胞的试验中，野生型Ad35载体和Ad5GFP/F35载体都能够识别同样的初级受体(图33A)。因为Ad5病毒颗粒和anti-CAR单克隆抗体(图33B)都不能够竞争性阻止Ad35或Ad5GFP/F35与宿主细胞附着。表明Ad35和Ad5GFP/F35所结合的基础受体与Ad5型的受体不同。在内化过程的竞争力研究中，Ad35和Ad5GFP/F35的竞争力相同。而Ad5和anti-αV-整合素单克隆抗体(L230)(图33c)都不能阻止Ad35或嵌合病毒的内化。为巩固以上试验结果：先采用anti-CAR或anti-αV-整合素单克隆抗体培植的K562细胞，再用Ad5GFP和Ad5GFP/F35感染，随后分析GFP的表达，数据显示其结果和以上侵润及内化过程研究结果一致。综上，实验表明Ad35和Ad5GFP/F35使用了不依赖于CAR和αV-整合素的通道感染K562细胞，该特性是源于其结构因素Ad35型纤维蛋白，而且此蛋白可被置换进Ad5型载体。

Ad3能够有效作用于K562细胞，尽管Ad3和Ad35属于同一亚型(B)，两者之间的纤维蛋白序列的同源性只有约60％。因此，我们决定测试Ad3是否能够与Ad35和Ad5GFP/F35竞争侵润和进入宿主细胞(图34)。这些研究显示：采用不同的受体，Ad3不能阻止Ad35侵润细胞。有意思的是，Ad3对Ad5GFP/F35有轻微的竞争性抑制(图34)。而且在与Ad35和Ad5GFP/F35的共同受体结合后，嵌合病毒衣壳(如Ad5五邻体RGD基元)也可能与第二个细胞受体相互作用，此处与Ad3的结合部位有有部分重合。在细胞内化竞争性试验中，37℃温度下用Ad35和嵌合型病毒预培植能显著降低[³H]标记的Ad3病毒进入细胞的能力。(图34D右)在相对应的实验中，Ad3竞争性阻止Ad35和嵌合病毒的内化，降低病毒进入细胞的水平达30％(图34B右)。Ad5和Ad3之间没有竞争。如上所示(图39B)anti-CAR和anti-αV-整合素单克隆抗体对Ad3进入K562没有影响。综上所述，我们有如下结论：尽管细胞内化中使用了相同的结构因素，其不同于-αV-整合素，Ad35和Ad5GFP/F35所结合的受体不同于Ad3。

嵌合病毒的感染特性研究：

通过不依赖于CAR和αV的通道，用Ad5GFP/F35感染K562细胞。Ad5GFP/F35的感染特性有可能允许几乎不表达CAR和αV-整合素的非环形CD34+的有效转导。为检测该特性，在CD34+细胞、K562细胞和HeLa细胞系上分析Ad5GFP和Ad5GFP/F35，图35显示通过表达GFP所示的转染率与用于感染的感染复数(MOI)有关。当MOI＞＝25，Ad5GFP和Ad5GFP/F35对HeLa细胞的转染率几乎达到100％；当MOI＞＝100时，Ad5GFP/F35对K562细胞的转导率大于95％。与Ad5的转导率相比明显高的多，当MOI＞＝400并维持在相当高水平时，Ad5的转导率能上升到70％。在任何感染复数条件下，Ad5GFP/F35对CD34+的转导率比Ad5GFP高出3倍。有趣的是，当MOI的值升高时，转导率很快达到并维持在某一较高的值，不随着病毒的剂量成比例上升。该结果显示：在两种情况下，只有CD34+细胞的某些特定亚型能够被感染。为进一步明确这些亚型的特性，对其进行进一步转导实验研究：首先，测定经CARs或αV-整合素处理的CD34+细胞群中表达GFP的细胞所占的百分比(图36)。对少量的CAR阳性CD34+细胞共标记复杂性研究，在用Ad5GFP或Ad5GFP/F35感染的CD34+细胞中，CAR的表达和被转导细胞的比例之间没有相关关系。有意思的是，对于Ad5GFP，表达GFP的细胞中有65％是αV-整合素阳性，而低于22％的嵌合病毒感染的GFP阳性细胞显示αV-整合素表达阳性。同时，Ad5GFP感染后，全部CD33+细胞数目中仅仅17％表达GFP，在CD34+/αV-整合素阳性细胞群中表达GFP的比例是50％。这表明Ad5GFP载体介导的GFP有选择性地在αV-整合素阳性的CD34+亚型细胞中表达。相对照，Ad5GFP/F35载体感染的CD34+细胞，GFP都有广泛表达，尽管大部分CD34+细胞是αV-整合素阴性。

其次，同时对被转染的细胞进行GFP、CD34、CD117标记分析。上面提到，只有约90％在感染时显示CD34阳性，因此进行CD34和GFP多参量分析。大多数CD34+细胞形态异源并具有干细胞的性能。一小部分CD34+和CD117+细胞组成原始的造血细胞(Ikuta，K.，Weissman，I.L.1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：1520-1506；Simmons，P.J.，etal.1994.Expl.Hematology.22：157-165)图37总结了与特定干细胞标记相关的GFP表达的分析。其中用嵌合性载体感染的细胞中54％显示CD34+和GFP阳性，以Ad5GFP感染的细胞中仅25％表达转基因和CD34+标记(图37A下)。更重要的，基于GFP表达，嵌合病毒转导80％C-KIT阳性细胞，而Ad5载体仅转导36％(图37A下)。在进一步的实验中，用Ad5GFPH或Ad5GFP/F35感染之前分拣CD34+细胞和CD117细胞，感染24小时后，分析表达GFP的特定细胞群，(图37B)分析结果显示，用嵌合载体比用Ad5GFP转导的CD34+/CD117+细胞数量多40％。由此我们得出结论：实验结果显示，嵌合性Ad5GFP/F35载体在靶向性和转导CD34+细胞的效率上明显优于Ad5GFP载体。实验数据进一步显示：就CD43+细胞系中能够接受腺病毒感染的亚型种类来说，嵌合性病毒所能的感染范围较Ad5型要广泛的多。

分析用Ad5和嵌合病毒感染的CD34+细胞中的病毒基因：

根据GFP的表达测定Ad5GFP和Ad5GFP/F35转染CD34+细胞的转导率，考虑CD34+细胞的在形态和功能参数方面突出的异源性，GFP有可能不能在所有已被有效转导的细胞中表达，其原因包括CMV启动子不是在任何类型的细胞中都有效，或者转基因表达的调控在转录或翻译水平上因不同的细胞子群而不同。为对此进行测试，我们对Ad5GFP和Ad5GFP/F35转染的GFP阳性和GFP阴性CD34+细胞中的病毒基因组计数，在感染24小时后，CD34+细胞按GFP阳性和GFP阴性分群。接着分离病毒DNA，病毒基因组数目由定量Souther Blot测定，如图15所示。每个GFP阳性的CD34+细胞中，约有270个Ad5GFP/F35病毒基因组拷贝。每个GFP阴性的CD34+细胞中约200个Ad5GFP/F35病毒基因组(图38A和39)。这表明，并非所有的被转导的细胞都表达GFP，并暗示了实际的转导率要高于54％(GFP阳性细胞)，我们也可以说CMV启动子并非在所有被转导的CD34+子细胞群中都起作用。用探测极限是每个细胞中14个基因组的Southern印迹探测被感染的CD34+细胞(GFP阳性或阴性)，未发现Ad5GFP载体特异性信号。由此，我们得出结论：经Ad5GFP/F35转导的细胞中载体的DNA浓度比Ad5GFP转导的至少高出20倍。预先用载体特异性引物进行PCR扩增，然后用Southern印迹检测被感染的CD34+细胞，只测到Ad5DFP DNA(图38B和39)。这表明复制缺陷性Ad5载体存在但处于很低的复制水平，可能是受到内化的基因组稳定性的限制。使用PCR-Southern检测，在GFP阴性细胞中也能测到Ad5载体的DNA。这进一步支持CMV不是本发明细胞转导研究的优选启动子。已有他人进行了预先PCR扩增，然后对Ad5载体感染的CD34+细胞中的病毒基因组的研究。(Mitani K.，et al.1994.Humman Gene Theraphy.5：941-948；Neering，S.J.，et al 1996..Blood.88：1147-1155)

讨论：

嵌合型载体Ad5GFP/F35具有何Ad35相近的附着力和内化特性。因此纤维蛋白基因替换足以达到从Ad5到Ad35型细胞取向的改变。Ad5GFP/F35病毒衣壳嵌合体含有整合进Ad5衣壳的Ad35短轴纤维蛋白。在Ad5病毒感染过程中，五邻体基质蛋白和整合素之间的相互作用可以引导病毒内化。对于此相互作用，纤维蛋白轴区长度以及球形区和RGD基元的空间结构对病毒进入细胞起关键作用。当短轴异源纤维蛋白被插入Ad5衣壳，打乱了天然蛋白的空间结构。让人感兴趣的是，Ad5/35嵌合体有很高的感染效率，提示我们：五邻体碱基上的突出的RGD基元不影响Ad35基础受体的相互作用。因此，大多数嵌合性病毒都是替换掉Ad5的球形区，保留Ad5纤维蛋白的长轴区(Chillon，M.，et al.1999.J.virology.73：2537-2540；Krasnykh，V.N.，et al.1996..J.virology.70：6839-6846；Srevevson.S.C.et al.1995.J.Virology.69：2850-2857；Srevevson.S.C.et al.1997.J Virology.71：4782-4790)。例外的，有一种Ad5/7嵌合病毒(Gall，J.，et al.1996.J.Virology.70：2116-2123)，其全部Ad5的纤维蛋白被Ad7的短轴纤维蛋白替换。然而，与Ad5相似，用Ad5/7嵌合体感染细胞仍然需要αV-整合素。

Ad5GFP/F35病毒嵌合体第一次显示：尽管五邻体基质蛋白上存在的RGD基元，嵌合病毒使用的细胞进入通道主要地由异源短轴纤维蛋白的特异性受体决定。这并不排除有可能第二受体具有增强载体亲合力的作用。后者得到以下实验结果的支持：在Ad35和Ad5GFP/F35与Ad5或Ad3的附着力竞争性比较中，我们观测到有轻微的差异。这可能是Ad5/35的附着涉及除高亲和力的纤维蛋白的结合之外，还相关于Ad5衣壳蛋白(如RGD基元)与被Ad3和Ad5使用的重叠的第二级受体的相互作用。

试验显示：Ad5基础载体所能感染的CD34+细胞限于CD34+细胞系某些特定类型。Ad5GFP感染的CD34+细胞中，感染复数MOI大于100时，表达GFP的细胞的比例维持在一个较稳定的值，改现象提示仅有一部分CD34+细胞能够被Ad感染。也有可能，早期病毒基因的表达足以引发病毒复制，导致对CD34+细胞系中部分细胞群选择性感染，显示出野生型Ad5在被感染的CD34+细胞中的强复制能力。对于能够被Ad5载体感染的特定CD34+细胞群，已有相关研究(Byk，T.，et al.1998.Humman GeneTheraphy.9：2493-2502；Neering，S.J.et al.1996..Blood.881147-1155)。我们进一步测定了这部分细胞群的特征发现，Ad5基础载体选择性感染αV-整合素阳性CD34+细胞群。整合素(包括αV)被认为在移植的造血细胞的定植和转运中起重要作用，但αV-整合素的表达和造血细胞的分化之间的关系尚不清楚(Papayannpopoulou，T.，Craddock，C 1997.Aca Haematol.97：97-104；Roy，V.，Verfalllie，C.M.1999 Exp.Hematol.27：302-312)。由于在CAR和GFP的表达之间没有清晰的关系，Ad5GFP可能运用其它的膜蛋白作为基本受体。或者，在感染复数为200-400之间观测到的Ad5GFP载体的转导有可能是由于病毒和αV-整合素之间直接的相互作用启动细胞内化所致，在缺乏CAR时这也许是一条优选的通道(Legrand，V.，et al.1999.J.Virology.73：907-919)。重要的是，Ad5GFP/F35嵌合载体的感染不局限于αV-整合素阳性的CD34+细胞群。

在CD34+细胞中，部分CD34+细胞和CD117+细胞组成原原始的造血细胞(Ikuta，K.，Weissman，I.L.1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：1502-1506；Simmons，P.J.，et al.1994.Expl.Hemarology.22：157-165)。干细胞因素受体CD117(c-kit)属于酪氨酸蛋白激酶家族，已有报道，c-kit+，CD34+索状血细胞含有高比例(16％)的造血祖细胞(Neu，S.，et al.1996.Leukemia Research.20：960-971)。早期的34+/CD117个体长时期内具有复制增生能力(Sanchez，M.J.，et al1996.Immunity.5：513-525)。据报道，平均50-60％的CD34+细胞是CD117阳性。(Ikuta，K.，Weissman，I.L.1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：1502-1506；Neu，S.，et al.1996.Leukemia Research.20：960-971；Simmons，P.J.，etal.1994.Expl.Hematology.22：157-165)。我们的研究发现，在54％的CD34+细胞和80％CD34+/c-kit+细胞中，嵌合载体表达GFP。实际的病毒转导率比这还高，因为在GFP阴性的被感染的细胞中也发现了Ad5GFP/F35载体的DNA。这表明，在我们使用的载体中，用于启动GFP表达的CMV启动子并非在所有被转导的细胞中都有作用。我们只所以选择CMV作为启动子是基于现有技术：PGK和CMV能够在CD34细胞中启动转基因的表达，而HTLV-1和RSV几乎不发挥启动子作用(Byk，T.，et al.1998.Human GeneTheraphy.9：2493-2502；Case，S.S.，et al.1999.Proc.Natl.Acad.，Sci.USA.96：2988-2993)。另一方面，Watanable等的研究表明CMV在一部分特定的CD34+细胞群中不发挥启动作用或者该作用很快就不再表现了(Watanable，T.，et al.1996.Blood.87：5032-5039)。我们的实验数据强化了此观点。考虑到逆转录酶病毒的转导研究，在造血细胞中，逆转录酶病毒的启动子MLB也许是较好的选择(Bregni，M.，et al.GeneTheraphy.5：465-472)。

在显示了Ad5GFP/F35载体有效转导带有干细胞特异标记的细胞之后，下一步做预先进行了GFP阳性和阴性的分类的克隆定量分析。由于腺病毒载体的感染具有细胞毒性并影响MC培养基中祖克隆单位的生长。(Mitanic，K.，et al 1994.Humman GeneTheraphy.5：941-948；Watanable，T.，et al.1996.Blood.87：5032-5039)。腺病毒蛋白在被转导细胞中表达会产生某些副作用(Lieber，A.，C.-Y.et al 1996.Journalof Virology.70：8944-8960；Schieder，G.，et al.1998.NatureGenetics.18：180-183；YangY.，et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：4407-4411)。某些蛋白(例如：E4-orf4，Ptp，或E3-11.6k.)有促进程序性凋亡的作用(Langer.，S.J.，Schaak，J.，1996.virology.221：172-179；Lieber，A.，etal.1998.J.Virology.72：9267-9277；Shtrichman，R.，Kleinberger，T.，1998.J.Virology.72-2975-2983；Tollegson，A.E.，A et al 1996 J.Virology.70-2296-2306)。显然，这会影响Ad5GFP/F35转导研究的结果。Ad5GFP/F35有效转导CD34+细胞意味着病毒蛋白的明显表达。而且，最近公布的数据显示，短期克隆化验大多用于测试成熟祖细胞，而不能严格测试出前体干细胞。

Ad5GFP/F35基础载体能够转导HSC的确定性结论要求进行克隆试验或者可选择的在SCID-NOD小鼠身上进行计数试验。我们可以运用空心(gutless)载体进行此研究。(Steiwaerder，D.s.，et al 1999.J Virol 73：9303-9313)。并且缺失了全部病毒基因的整合的Ad.AAV(LiberA.，et al.1999.J Virol 73：9314-9324)产生基于Ad5GFP/F35的嵌合病毒衣壳。可选择的，空心(gutless)腺病毒，再靶向载体可被用于瞬式表达CD34+细胞上的逆转录酶病毒受体以增加感染逆转录病毒的敏感性，采用的方法我们已经公开过(Liber，A.，et al.1995 Human Gene Theraphy.6：5-11)

我们研究发现：Ad5GFP/F35能够转导具有潜在干细胞能力的造血细胞，显示出转染HSCs的稳定的基因转导和血液紊乱的基因治疗中的重要一步。而且，本发明中的病毒的特点有助于我们更好的理解腺病毒与细胞的相互作用。

                   附录I

  来自于美国典型物种保藏中心可用的人和动物腺病毒1：Adenovirus Type 21 ATCC VR-1099(NIAID V-221-002-014)2：SA18(Simian adenovirus 18) ATCC VR-943 Classification3：SA17(Simian adenovirus 17) ATCC VR-942 Classification4：Adenovirus Type 47 ATCC VR-1309 Classification：Adenov5：Adenovirus Type 44 ATCC VR-1306 Classification：Adenov6：Avian adenovirus Type 4 ATCC VR-829 Classification：Ad7：Avian adenovirus Type 5 ATCC VR-830 Classification：Ad8：Avian adenovirus Type 7 ATCC VR-832 Classification：Ad9：Avian adenovirus Type 8 ATCC VR-833 Classification：Ad10：Avian adenovirus Type 9 ATCC VR-834 Classification：Ad11：Avian adenovirus Type 10 ATCC VR-835 Classification：A12：Avian adenovirus Type 2 ATCC VR-827 Classification：Ad13：Adenovirus Type 45 ATCC VR-1307 Classification：Adenov14：Adenovirus Type 38 ATCC VR-988 Permit：PHS permit requ15：Adenovirus Type 46 ATCC VR-1308 Classification：Adenov16：Simian adenovirus ATCC VR-541 Classification：Adenovir17：SA7(Simian adenovirus 16)ATCC VR-941 Classification：18：Frog adenovirus(FAV-1)ATCC VR-896 Classification：Ad19：Adenovirus type 48(candidate)ATCC VR-1406 Classifica20：Adenovirus Type 42 ATCC VR-1304 Classification：Adenov21：Adenovirus type 49(candidate) ATCC VR-1407 Classifica22：Adenovirus Type 43 ATCC VR-1305 Classification：Adenov23：Avian adenovirus Type 6 ATCC VR-831 Permit：USDA permi24：Avian adenovirus Type 3(Inclusion body hepatitis virus)25：Bovine adenovirus Type 3 ATCC VR-639 Classification：A26：Bovine adenovirus Type 6 ATCC VR-642 Permit：USDA perm27：Canine adenovirus ATCC VR-800 Classification：Adenovir28：Bovine adenovirus Type 5 ATCC VR-641 Permit：USDA perm29：Adenovirus Type 36 ATCC VR-913 Classification：Adenovi30：Ovine adenovirus type 5 ATCC VR-1343 Classification：A31：Adenovirus Type 29 ATCC VR-272 Classification：Adenovi32：Swine adenovirus ATCC VR-359 Classification：Adenoviru33：Bovine adenovirus Type 4 ATCC VR-640 Permit：USDA perm34：Bovine adenovirus Type 8 ATCC VR-769 Permit：USDA perm35：Bovine adenovirus Type 7 ATCC VR-768 Permit：USDA perm36：Adeno-associated virus Type 2(AAV-2H)ATCC VR-680 Cla37：Adenovirus Type 4 ATCC VR-4 Classification：Adenovirus38：Adeno-associated virus Type 3(AAV-3H)ATCC VR-681 Cla39：Peromvscus adenovirus ATCC VR-528 Classification：Aden40：Adenovirus Type 15 ATCC VR-661 Classification：Adenovi41：Adenovirus Type 20 ATCC VR-662 Classification：Adenovi42：Chimpanzee adenovirus ATCC VR-593 Classification：Aden43：Adenovirus Type 31 ATCC VR-357 Classification：Adenovi44：Adenovirus Type 25 ATCC VR-223 Classification：Adenovi45：Chimpanzee adenovirus ATCC VR-592 Classification：Aden46：Chimpanzee adenovirus ATCC VR-591 Classification：Aden47：Adenovirus Type 26 ATCC VR-224 Classification：Adenovi48：Adenovirus Type 19 ATCC VR-254 Classification：Adenovi49：Adenovirus Type 23 ATCC VR-258 Classification：Adenovi50：Adenovirus Type 28 ATCC VR-226 Classification：Adenovi51：Adenovirus Type 6 ATCC VR-6 Classification：Adenovirus52：Adenovirus Type 2 Antiserum：ATCC VR-1079 AS/Rab(NIA53：Adenovirus Type 6 ATCC VR-1083(NIAID V-206-003-014)54：Ovine adenovirus type 6 ATCC VR-1340 Classification：A55：Adenovirus Type 3 ATCC VR-847(Derived from NIAID V-2056：Adenovirus Type 7 ATCC VR-7 Classification：Adenovirus57：Adenovirus Type 39 ATCC VR-932 Classification：Adenovi58：Adenovirus Type 3 ATCC VR-3 Classification：Adenovirus59：Bovine adenovirus Type 1 ATCC VR-313 Classification：A60：Adenovirus Type 14 ATCC VR-15 Classification：Adenovir61：Adenovirus Type 1 ATCC VR-1078(NIAID V-201-001-014)62：Adenovirus Type 21 ATCC VR-256 Classification：Adenovi63：Adenovirus Type 18 ATCC VR-1095(NIAID V-218-003-014)64：Baboon adenovirus ATCC VR-275 Classification：Adenovir65：Adenovirus Type 10 ATCC VR-11 Classification：Adenovir66：Adenovirus Type 33 ATCC VR-626 Classification：Adenovi67：Adenovirus Type 34 ATCC VR-716 Classification：Adenovi68：Adenovirus Type 15 ATCC VR-16 Classification：Adenovir69：Adenovirus Type 22 ATCC VR-257 Classification：Adenovi70：Adenovirus Type 24 ATCC VR-259 Classification：Adenovi71：Adenovirus Type 17 ATCC VR-1094(NIAID V-217-003-014)72：Adenovirus Type 4 ATCC VR-1081(NIAID V-204-003-014)73：Adenovirus Type 16 ATCC VR-17 Classification：Adenovir74：Adenovirus Type 17 ATCC VR-18 Classification：Adenovir75：Adenovirus Type 16 ATCC VR-1093 (NIAID V-216-003-014)76：Bovine adenovirus Type 2 ATCC VR-314 Classification：A77：SV-30 ATCC VR-203 Classification：Adenovirus.Simian(78：Adenovirus Type 32 ATCC VR-625 Classification：Adenovi79：Adenovirus Type 20 ATCC VR-255 Classification：Adenovi80：Adenovirus Type 13 ATCC VR-14 Classification：Adenovir81：Adenovirus Type 14 ATCC VR-1091(NIAID V-214-001-014)82：Adenovirus Type 18 ATCC VR-19 Classifieation：Adenovir83：SV-39 ATCC VR-353 Classification：Adenovirus.Simian(84：Adenovirus Type 11 ATCC VR-849(Derived from NIAID V-285：Duck adenovirus(Egg drop syndrome)ATCC VR-921 Permi86：Adenovirus Type 1 ATCC VR-1 Classification：Adenovirus87：Chimpanzee adenovirus ATCC VR-594 Classification：Aden88：Adenovirus Type 15 ATCC VR-1092(NIAID V-215-003-014)89：Adenovirus Type 13 ATCC VR-1090(NIAID V-213-003-014)90：Adenovirus Type 8 ATCC VR-1368(Derived from NIAID V-2091：SV-31 ATCC VR-204 Classification：Adenovirus.Simian(92：Adenovirus Type 9 ATCC VR-1086(NIAID V-209-003-014)93：Mouse adenovirus ATCC VR-550 Classification：Adenoviru94：Adenovirus Type 9 ATCC VR-10 Classification：Adenoviru95：Adenovirus Type 41 ATCC VR-930 Classification：Adenovi96：Cl ATCC VR-20 Classification：Adenovirus.Simian(Mast97：Adenovirus Type 40 ATCC VR-931 Classification：Adenovi98：Adenovirus Type 37 ATCC VR-929 Classification：Adenovi99：Marble splecn disease virus(Hemorrhagic enteritis virus100：Adenovirus Type 35 ATCC VR-718 Classification：Adenovi101：SV-32(M3)ATCC VR-205 Classification：Adenovirus.Sim102：Adenovirus Type 28 ATCC VR-1106(NIAID V-228-003-014)103：Adenovirus Type 10 ATCC VR-1087(NIAID V-210-003-014)104：Adenovirus Type 20 ATCC VR-1097(NIAID V-220-003-014)105：Adenovirus Type 21 ATCC VR-1098(NIAID V-221-011-014)106：Adenovirus Type 25 ATCC VR-1103(NIAID V-225-003-014)107：Adenovirus Type 26 ATCC VR-1104(NIAID V-226-003-014)108：Adenovirus Type 31 ATCC VR-1109(NIAID V-231-001-014)109：Adenovirus Type 19 ATCC VR-1096(NIAID V-219-002-014)110：SV-36 ATCC VR-208 Classification：Adenovirus，Simian(111：SV-38 ATCC VR-355 Classification：Adenovirus，Simian(112：SV-25(M8)ATCC VR-201 Classification：Adenovirus，Sim113：SV-15(M4)ATCC VR-197 Classification：Adenovirus，Sim114：Adenovirus Type 22 ATCC VR-1100(NIAID V-222-003-014)115：SV-23(M2)ATCC VR-200 Classification：Adenovirus，Sim116：Adenovirus Type 11 ATCC VR-12 Classification：Adenovir117：Adenovirus Type 24 ATCC VR-1102(NIAID V-224-003-014)118：Avian adenovirus Type 1(Chicken Embryo Lethal Orphan：C119：SV-11(M5)ATCC-VR-196 Classification：Adenovirus，Sim120：Adenovirus Type 5 ATCC VR-5 Classification：Adenovirus121：Adenovirus Type 23 ATCC VR-1101 (NIAID V-223-003-014)122：SV-27(M9)ATCC VR-202 Classification：Adenovirus，Sim123：Avian adenovirus Type 2(GAL)ATCC VR-280 Classificati124：SV-1(M1)ATCC VR-195 Classification：Adenovirus，Simi125：SV-17(M6)ATCC VR-198 Classification：Adenovirus，Sim126：Adenovirus Type 29 ATCC VR-1107(NIAID V-229-003-014)127：Adenovirus Type 2 ATCC VR-846 Classification：Adenovir128：SV-34 ATCC VR-207 Classification：Adenovirus，Simian(129：SV-20(M7)ATCC VR-199 Classification：Adenovirus，Sim130：SV-37 ATCC VR-209 Classification：Adenovirus，Simian(131：SV-33(M10)ATCC VR-206 Classification：Adenovirus.Si132：Avian adeno-associated virus ATCC VR-865 Classificatio133：Adeno-associated(satellite)virus Type 4 ATCC VR-646134：Adenovirus Type 30 ATCC VR-273 Classification：Adenovi135：Adeno-associated(satellite)virus Type 1 ATCC VR-645136：Infectious canine hepatitis(Rubarth′s disease.Fox ence137：Adenovirus Type 27 ATCC VR-1105(NIAID V-227-003-014)138：Adenovirus Type 12 ATCC VR-863(Derived from NIAID V-2139：Adeno-associated virus Type 2(molecularly cloned)ATCC140：Adenovirus Type 7a ATCC VR-848(Derived from NIAID V-2

Claims (77)

1、一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，含有：

a)外源DNA序列

b)一对反向重复序列，连接于外源DNA序列序列两侧；

所述的反向重复序列在两个相同腺病毒载体的反向重复序列之间介导相互的同源重组。

2、一种获得解离的重组腺病毒载体的方法，包括：在适合的环境条件下，将至少两个权利要求1所述的亲本重组腺病毒载体导入一个复制活性细胞中，这样两个载体在转导的复制活性细胞中可以发生同源重组，进而生成解离的重组腺病毒载体。

3、通过权利要求2所述的方法产生的解离的重组腺病毒载体。

4、一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，含有：编码一个目标基因的DNA序列的第一段部分，这个DNA序列与在另一个重组腺病毒载体中编码同一个目标基因的DNA序列的第二段部分发生同源重组，重组后形成一个完整的基因，它可以表达目的蛋白。其中，第二个DNA序列与第一个序列有部分的重叠区，在这个重叠区域两个DNA片断发生同源重组。

5、一种获得解离的重组腺病毒载体的方法，包括：在适合的环境条件下，将至少两个权利要求4所述的亲本重组腺病毒载体导入一个复制活性细胞中，这样两个载体在转导的复制活性细胞中可以发生同源重组，进而生成解离的重组腺病毒载体。

6、通过权利要求5所述的方法产生的解离的重组腺病毒载体。

7、权利要求2或5中所述的方法，其中所述的复制活性细胞是肿瘤细胞。

8、一个重组腺病毒载体，由两条反向平行的DNA链组成，其中第一条链的组成如下：

a)腺病毒左端反向末端重复序列；

b)位于左端反向末端重复序列的3｀端的腺病毒包装序列；

c)位于腺病毒包装序列3｀端的启动子序列；

d)第一反向重复序列，位于启动子序列3｀端；

e)位于第一个反向重复序列3｀端的外源DNA序列，方向是由3｀端到5｀端；

f)第二反向重复序列，位于外源序列(e)的5｀端；

g)负责腺病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，它(它们)位于第二个反向重复序列的3｀端；

h)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端；

第二条链选择性地包含编码腺病毒纤维蛋白的序列，该蛋白使得所述的腺病毒载体靶向特定的宿主细胞。

9、权利要求8中的重组腺病毒载体，进一步包含一个位于第一个反向重复序列3｀端的双向转录终止位点序列。

10、权利要求8中的腺病毒载体，其中启动子具有肿瘤特异性。

11、权利要求8中的腺病毒载体，其中肿瘤特异启动子是劳氏肉瘤(Rous Sarcoma)病毒启动子序列。

12、权利要求9中的腺病毒载体，其中终止位点是一个SV40病毒的双向多聚腺苷序列。

13、权利要求8中的腺病毒载体，其中终止位点是一个合成的双向多聚腺苷序列终止位点。

14、权利要求8中的腺病毒载体，其中在外源DNA序列两侧的成对的反向重复序列是相同的序列。

15、权利要求8中的腺病毒载体，其中在外源DNA两侧的反向重复序列是可切割的。

16、权利要求8中的腺病毒载体，其中在外源DNA序列两侧的反向重复序列是一个β-球蛋白内含子序列，不含任何转录及翻译终止位点。

17、权利要求15中的腺病毒载体，其中在外源DNA序列两侧的反向重复序列是提供和接收结合位点的拷贝。

18、权利要求8中的腺病毒载体，其中外源DNA序列表达一个或多个基因产物，包括治疗基因，选择基因和/或报告基因。

19、权利要求18中的腺病毒载体，其中的基因是治疗基因，包括细胞凋亡基因，细胞裂解基因，自杀基因，显性负性I-k-β，胱天蛋白酶，γ球蛋白、人α-1抗胰蛋白酶基因。

20、权利要求18中的腺病毒载体，其中的基因是选择基因，包括新霉素、氨苄青霉素、青霉素、四环素、庆大霉素基因。

21、权利要求18中的腺病毒载体，其中的基因是报告基因，包括人β-葡萄糖苷酸酶、绿色荧光蛋白、β牛半乳糖苷酶、碱性磷酸(酯)酶基因。

22、权利要求18中的腺病毒载体，其中的基因编码一个融合蛋白，含有一个毒性部分和一个HSV VP22蛋白。

23、权利要求18中的腺病毒载体，其中的基因是腺病毒E1a基因。

24、权利要求8中的腺病毒载体，其中在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因选自于E1、E2和E4；E2、E3和E4；E2和E4。

25、权利要求8中的腺病毒载体含有一个绝缘DNA元件，它位于腺病毒包装序列的3｀端。

26、权利要求25中的腺病毒载体，其中绝缘DNA元件是一个鸡γ-球蛋白绝缘元件，或者是一个果蝇黑色素吉普赛绝缘元件，它位于腺病毒包装序列的3｀端。

27、一种产生一个解离的重组腺病毒载体的方法，此载体含有能够在被转导细胞中表达的外源DNA，包括：将权利要求8中所述的重组腺病毒载体导入宿主细胞，其中，同源重组发生在两个载体的反向重复序列部分，因此可以产生重组腺病毒载体，具有能够在被转导细胞中表达的外源DNA序列。

28、通过权利要求27中的方法产生的解离的重组腺病毒载体。

29、权利要求28中的解离的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的启动子序列

d)第一反向重复序列，该序列位于启动子序列的3｀端

e)滞留转录的双向转录终止位点序列，位于第一个反向重复序列3｀端

f)以3｀到5｀取向的外源DNA序列，位于双向终止位点序列3｀端

g)第二反向重复序列，该序列位于外源DNA序列(f)的上游

h)以3｀到5｀取向的启动子序列位于外源DNA序列(f)的上游

i)以3｀到5｀取向的腺病毒包装序列，位于的启动子序列(g)的5｀端

j)腺病毒右端反向末端重复序列位于腺病毒包装序列的3｀端。

30、一种用于产生被包装的含有外源DNA序列的重组腺病毒载体方法，此方法包括：将权利要求8中的重组腺病毒载体导入宿主细胞，腺病毒在其中复制并包装产生权利要求8所述的被包装的腺病毒，其能够从被转导的细胞中释放出来并转导其它细胞。

31.通过权利要求30中的方法产生的被包装的重组腺病毒载体。

32.一个至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，由两条反向平行的DNA链组成，其中第一条链的组成如下：a)腺病毒左端反向末端重复序列b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列c)位于包装序列3｀端的启动子序列d)位于启动子序列3｀端的目标基因序列的5’端部分，其含有一段能够与目标基因序列的3’端部分中的一段序列同源交叠的DNA序列e)负责腺病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于目标基因序列的5’端部分序列的3’端f)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端

第二条链选择性地包含编码腺病毒纤维蛋白的序列，该蛋白使得所述的腺病毒载体靶向特定的宿主细胞。

33、一个至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，由两条反向平行的DNA链组成，其中第一条链的组成如下：a)腺病毒左端反向末端重复序列b)负责腺病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于左端反向末端重复序列3｀端c)位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端的目标基因序列的3’端部分，其含有一段能够与目标基因序列的5’端部分中的一段序列同源交叠的DNA序列d)位于外源基因序列3｀端的多聚腺苷序列e)位于多聚腺苷序列终止位点的3｀端的腺病毒包装序列f)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于腺病毒包装序列的3｀端

第二条链选择性地包含编码腺病毒纤维蛋白的序列，该蛋白使得所述的腺病毒载体靶向特定的宿主细胞。

34、权利要求32或33所述的腺病毒载体，其中目标基因是外源DNA序列。

35、权利要求32或33所述的腺病毒载体，其中同源交叠区含有100个碱基对到11，000个碱基对。

36、权利要求32或33所述的腺病毒载体，其中负责在被转导细胞中腺病毒复制的基因选自于E1、E2和E4；E2、E3和E4；E2和E4。

37、如权利要求8，32或33所述腺病毒载体，其中位于反向平行链的编码腺病毒纤维蛋白的序列控制腺病毒的靶向，包括球形结构区、轴(杆)区、尾部区。

38、如权利要求8，32或33所述腺病毒载体，其中左右反向末端重复序列和包装序列来源于相同的血清型。

39、如权利要37所述腺病毒载体，其中纤维蛋白的尾部区和左右反向末端重复序列来源于相同的血清型。

40、如权利要求37所述腺病毒载体，其中纤维蛋白的轴(杆)区和左右反向末端重复序列来源于不同的血清型。

41、如权利要求40所述腺病毒载体，其中纤维蛋白的轴(杆)区的来源选自3，7，9，11，35型腺病毒。

42、如权利要求37所述腺病毒载体，其中轴(杆)区纤维蛋白是短轴(杆)蛋白。

43、如权利要求37所述腺病毒载体，其中纤维蛋白球形区和左右反向末端重复序列来源于不同的血清型的腺病毒。

44、如权利要求43所述腺病毒载体，其中纤维蛋白球形区的来源选自3，7，9，11，35型腺病毒。

45、一种产生解离的重组腺病毒载体的方法，包括：a)将权利要32中所述的第一个重组腺病毒载体，和权利要求33个中所述的第二个重组腺病毒载体导入宿主细胞，其中，同源重组发生在第一和第二个载体的同源交叠序列部分，因此可以产生解离的重组腺病毒载体，该载体含有重新构成的目标基因的开放阅读框，能够在被转导细胞中表达；b)分离产生的解离的重组腺病毒载体。

46、通过权利要求45中的方法产生的解离的重组腺病毒载体。

47、权利要求46中所述的解离的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的启动子序列

d)位于启动子序列3｀端的具有开放阅读框的目标基因

e)位于目标基因3｀端的转录终止位点序列

f)位于转录终止位点序列3｀端的腺病毒包装序列

g)腺病毒右端反向末端重复序列，位于腺病毒包装序列的3｀端。

48、一种被包装的腺病毒载体的生产方法，其中该载体含有目的基因的部分片段，该方法包括：将权利要求32或33所述的重组腺病毒载体导入宿主细胞，腺病毒载体在其中复制并被包装，产生被包装的权利要求32或33所述的腺病毒载体，该载体能够从被转导的细胞中释放出来转导其它细胞。

49、通过权利要求48所述的方法产生的被包装的重组腺病毒载体。

50、至少缺少一个E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的绝缘子DNA元件

d)位于绝缘子DNA元件3｀端的Apo E hAAT启动子序列

e)位于Apo E hAAT启动子序列3｀端的Rep78基因序列的5’端部分，其含有一段能够与Rep78基因序列的3’端部分中的一段序列同源交叠的DNA序列

f)用于病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于Rep78基因序列的5’端部分序列的3’端

g)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端。

51、至少缺少一个E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)用于病毒在被转导细胞中复制的一个或者几个基因，位于左端反向末端重复序列3｀端

c)位于在被转导细胞中负责腺病毒复制的基因的3｀端的Rep78基因序列的3’端部分，其含有一段能够与Rep78基因序列的5’端部分片断中的一段序列同源交叠的DNA序列

d)位于Rep78基因序列的3’端部分片断3｀端的SV40多聚腺苷序列终止位点

e)位于多聚腺苷序列终止位点的3｀端的腺病毒包装序列

f)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于腺病毒包装序列的3｀端。

52、至少缺少一个E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，包括：

a)腺病毒左端反向末端重复序列

b)位于左端反向末端重复序列3｀端的腺病毒包装序列

c)位于包装序列3｀端的绝缘子DNA元件

d)位于绝缘子DNA元件3｀端的Apo E hAAT启动子序列e)位于Apo E hAAT启动子序列3｀端的Rep78基因序列开放阅读框

f)位于Rep78基因序列开放阅读框的3｀端的SV40多聚腺苷序列终止位点

g)位于多聚腺苷序列终止位点的3｀端的腺病毒包装序列

h)腺病毒右端反向末端重复序列，它位于腺病毒包装序列的3｀端。

53、一种用权利要求8所述的重组腺病毒载体转导细胞的方法，包括：在适当条件下使权利要求8所述腺病毒载体与细胞接触，使得被转导的细胞并表达外源DNA，并且复制包装权利要求8所述的腺病毒载体。

54、一种用权利要求32或33所述的重组腺病毒载体转导细胞的方法，包括：在适当条件下使权利要求32或33所述腺病毒载体与细胞接触，使得被转导的细胞并表达外源DNA，并且复制包装权利要求32或33所述的腺病毒载体。

55、通过权利要求53或54所述的方法产生的被转导的细胞。

56、权利要求53所述的方法，其中外源DNA序列编码一个基因。

57、权利要求56所述的方法，其中所述的基因编码一种蛋白。

58、权利要求54所述的方法，其中外源DNA序列编码一种蛋白。

59、通过权利要求57或58所述的方法，其中所述的蛋白是免疫刺激因子，选自于由PDGF，EGF，FGF，TGF，IL，TNF，NGF构成的组。

60、权利要求57或58所述的方法，其中所述的蛋白是促细胞裂解蛋白，选自于由腺病毒E3 11.6，腺病毒E1a，E.coli脱氨(基)酶，HSV胸苷激酶，葡(萄)糖苷酸酶，核酶，反义RNA，hMDR构成的组。

61、权利要求57或58所述的方法，其中所述蛋白是诱导凋亡蛋白，选自于由pTEN，p53，p16，p21，pRb，TRAIL，Fas-L，Vh1，ikβ突变体，胱天蛋白酶-3，6，9和促胱天蛋白酶-3，6，9构成的组。

62、权利要求57或58所述的方法，其中所述蛋白是放射性同位素集中器蛋白，选自于由由钠/碘同向转运子、逆转录病毒受体和TPO构成的组。

63、权利要求57或58所述的方法，其中所述外源DNA序列是自杀基因。

64、权利要求53或54所述的方法，其中所述的被转导细胞用探测因子标识。

65、转导接受主体的分裂细胞的方法，包括：在适当条件下，使权利要求8，32，33所述的腺病毒载体与个体的细胞接触，使得细胞被转导。

66、权利要求65所述的方法，其中所述的个体是人。

67、权利要求65所述的方法，其中所述的个体是除人以外的动物。

68、权利要求65所述的方法，腺病毒载体被施与外周脉管系统，通过气雾剂施用，或直接施给肿瘤。

69、权利要求65所述的方法，其中被转导的细胞是肿瘤细胞。

70、通过权利要求66或67所述的方法产生的被转导的细胞。

71、一种产生目标蛋白的方法，包括：在适当条件下培养权利要求8，32，33所述腺病毒载体，以便于在宿主细胞中产生目标蛋白，并回收产生的蛋白。

72、由权利要求70所述的方法产生的蛋白。

73、一种测试样品中是否存在权利要求求8，32，33所述腺病毒载体的方法，包括：使该样品和一种试剂接触，该试剂能够识别并与腺病毒载体结合，测得试剂与样品中的腺病毒载体结合。

74、权利要求72所述的方法，其中所述试剂是指抗体。

75、权利要求72所述的方法，其中所述试剂是一种核酸分子。

76、权利要求3，6，29或47所述的解离的腺病毒载体是被包装的载体。

77、权利要求1，4，8，32，33，50，51所述的解离的腺病毒载体，进一步含有细菌复制起始子。

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