CN1443243A - 修饰的病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种修饰的病毒，它包含一或多种非天然多肽，所述多肽包含一或多个框架半分子，每个框架半分子包含一或多个结合半分子，所述多肽能在哺乳动物宿主细胞的细胞质和核中表达为缺乏所述结合半分子的配体时能维持的一种构象，该构象允许所述结合半分子随后与所述配体结合，所述多肽能跨核膜转运，这种修饰的病毒由所述结合半分子赋予它改变的向性，本发明还涉及所述病毒在治疗中的应用，尤其在肿瘤或其它癌性细胞的治疗中的应用。

Description

修饰的病毒
本发明涉及适于在基因治疗中应用的新的重组病毒。这种重组病毒展示了改变的向性，其向性是由于在一或多种病毒成分中掺入一或多种非天然多肽，或者用非天然多肽替代这些成分而造成的。这些非天然多肽可包含能模拟起始病毒成分的结构的元件，从而能在功能性病毒体颗粒中包含所述多肽。这些非天然多肽还可以包含能使所述病毒体颗粒具有非天然配体结合功能(即改变的向性)的元件。本质上，本发明中应用的非天然多肽具有能使它们在哺乳动物宿主细胞的细胞核以及胞质溶胶中正确折叠并随后能跨核膜转运的一级和二级氨基酸结构。所述结构使得能装配出功能性重组病毒体颗粒，且所述病毒体具有完整无损的非天然结合功能并因此具有改变的向性。
临床基因治疗首次出现在1989。当时的目的是通过在体外将健康基因导入患者的缺陷细胞并将处理过的细胞回输给患者而纠正免疫系统中的基因缺陷。自那时起，对基因治疗的说明和可能的分子应用大大增多。在十余年后的现在，人们已经正视基因治疗在治疗诸如血管疾病，癌症，炎性疾病和传染病如HIV中的用途。
但是直至目前，基因治疗在人类医学中仍然不算一种有效的方法。一个主要的原因是，基因治疗要求包装基因，以便将它们运送至基因载体，而这些载体必须能给药于人类并将上述基因仅靶向目标细胞。迄今尚无可靠的这类载体。
已有数类病毒被考虑作为基因治疗中的载体，最常用的是腺病毒，逆转录病毒，慢病毒和腺伴随病毒。
理想的基因治疗载体是那些能全身给药且能将遗传物质特异性运送至目标细胞或组织的载体。但是，目前考虑用于人类基因治疗的病毒具有较广泛的向性，能感染人体中多种不同类型的细胞。这使病毒载体的安全性受限，不能全身给药。因此，开发能仅仅感染所选细胞的靶向型病毒载体成为基因治疗的神圣目标。
一种已得到最广泛研究的基因治疗载体是腺病毒。人类腺病毒可分为六个血凝素组(A-F)，每个血凝素组又可以再分为不同血清型。共有40种以上不同的人类腺病毒血清型。最常用于人类基因治疗的腺病毒是腺病毒5型(Ad5)，它属于血凝素C组。
腺病毒(Ad)是无包膜的DNA病毒，为规则的二十面体形状，直径60-85nm。
腺病毒衣壳包含252个壳粒，240个六邻体和12个五邻体(Ginsberg等，Virology，28，782-83(1966))。其六邻体和五邻体都来自三种病毒蛋白。六邻体含有三个相同的蛋白，每个有967个氨基酸，称为多肽II。五邻体有一个基座与衣壳结合，还有一个尾丝(fiber)，它与五邻体的基座非共价结合并且从该基座凸出。腺病毒外壳还有蛋白IX，VI和IIIa，一般认为它们使病毒衣壳稳定。
细胞结合通过尾丝蛋白完成，这些蛋白锚着在病毒体的二十面体顶部。尾丝蛋白并非完整病毒体装配和释放所必需。病毒体的装配发生在被感染细胞的核内。
尾丝蛋白是尾丝多肽(称为腺病毒多肽IV)的同型三聚体，它包含三个功能不同的部分：N-末端尾部，使尾丝非共价锚着在病毒体的五邻体基座上，并且还包含核定位信号；茎区(shaft domain)，含有不同数量的重复单元，每个单元有大约15个氨基酸的尾丝茎区基元，(例如，在Ad3中重复六次，在Ad2和Ad5中重复22次)；和C-末端球形区，称为“顶球(knob)”，它含有与细胞上Ad-受体结合的配体(Chrobozek等，Microbiology和Immunology，(1995)，p.163-200)。此顶球还负责使尾丝形成三聚体(即，它掺入一个三聚体化基元)。
每一茎区重复单元有两个形成β折叠的3-氨基酸区和两个组成天然延伸的尾丝茎区的转角的氨基酸区。三聚体化的细胞结合区的晶体结构已经明确，它显示出特有的不同于其它反-平行β-夹心的拓扑结构(Xia等，Structure 2：1259-1270，(1993))。尾丝与病毒体的五邻体基座的结合也可以发生在无细胞的系统中，即尾丝可以与无尾丝的病毒体结合(Boudin等，Virology，116：589604，(1982))。
对腺病毒尾丝进行修饰(如产生重组尾丝蛋白)，从而改变腺病毒载体的特性，如改变其向性或与细胞结合的特性，现有技术中已经有这方面的报道。
腺病毒尾丝蛋白行使数种生物学功能，这些功能是产生活性病毒颗粒所必需维持的功能。以下的尾丝特性被视为在构建功能性修饰型尾丝蛋白时十分重要：
i)形成平行的同型三聚体的能力。该功能由野生型尾丝顶球的N-末端氨基酸序列介导。
ii)与五邻体基座结合，从而形成五邻体壳粒的能力。该功能由野生型尾丝的尾部介导。
iii)表达与细胞结合的配体，从而能附着于靶细胞的能力。在天然状态下，该功能由野生型尾丝顶球(其与细胞上的Ad-受体结合)介导。
iv)转运至被感染细胞的核内的能力，这是形成病毒的关键。该功能主要由野生型尾丝的尾部介导，但也可能还有其它部位来介导。
此前关于改变腺病毒向性的尝试涉及对尾丝和顶球的基因修饰。但是，这种方法经证实并不是十分成功。主要问题在于，如何将新配体掺入功能性病毒(context)中，使其能改变向性而又不影响尾丝的三聚体化。例如，在顶球的C-末端添加一个较短的肽配体(Michael等，Gene Therapy，2：660-8，(1995))和在其中一个顶球“环”中引入九肽(Dmitriev等，J.Virol.，72(12)：9706-9713(1998))。但是，这种顶球由于三个尾丝亚单位之间的相互作用而具有非常复杂的结构，而上述相互作用是确保与细胞结合以及三聚体化所必需的。因此，这种顶球仅能耐受少量氨基酸的插入，目前尚无构建功能性、遗传再靶向(re-targete)的腺病毒尾丝的通用方法。
还有人尝试将新配体导入腺病毒颗粒的其它部位。将FLAG四氨基酸基元引入Ad五邻体，有可能将Ad引向通常情况下不被Ad感染的细胞。这种再靶向可通过用双特异性抗体进行靶向而实现，这种双特异性抗体的其中一种特异性是针对FLAG肽，另一种针对新的靶细胞(Wickham等，J.Virol.，70：6831-6838，(1996))。
在制备用于基因治疗的有效重组病毒时，遇到了一个此前未曾遇到的问题，即如何确保表达在宿主细胞的核以及胞质溶胶中的重组成分发生功能性折叠。尤其是，当进行改造的野生型病毒的复制需要利用表达在这些细胞内部位的成分时，例如，在腺病毒的情况中。折叠的蛋白结构，尤其是那些依靠半胱氨酸之间的二硫键来维持功能性正确构象的结构，如衍生自抗体的结构，当作为重组病毒成分表达在核和胞质溶胶的还原环境中时，可能发生错误折叠，变成无功能结构。因此，本领域目前仍然需要能在作为病毒成分表达于上述细胞内空间时维持功能性构象的蛋白结构，以便使这些结构所包含或支持的结合功能维持有效，尤其是在缺乏结合所需的配体时。
因此在对腺病毒尾丝进行遗传工程改造，以便其可用于构建人类基因治疗所需的重组再靶向腺病毒(Ad-病毒)时仍然存在很大的问题。这些问题被认为很重要，因为更多的患者是用腺病毒载体而不是用任何其它类型的载体进行治疗(Trapnell等，Biotechnology，5：617-625，(1994))。本发明在构建用于基因治疗的遗传再靶向病毒时绕开了这些问题，通过将与细胞结合的新配体引入病毒成分蛋白而获得了新的病毒向性。
本文所述本发明有一部分涉及制备具有新向性的功能性重组腺病毒尾丝蛋白，方法是去除(例如封闭或灭活)天然的细胞结合区，将它替换为，或者添加含有外来的细胞结合性配体和外来的三聚体化基元的非天然多肽。Curiel等在WO 99/41359中，Wickham等在WO 98/54346中以及Spooner和Epenetos在US 5,885,808中，都公开了为了制备具有改变的向性的重组病毒而对腺病毒成分进行的各种修饰。这些文献无一提供了解决在宿主细胞的核和胞质溶胶中表达功能性非天然病毒成分时遇到的问题的方法，或者根本没有提到、甚至没有认识到这些问题，而本发明解决了这样的问题。
因此，本发明一个方面提供了一种包含非天然多肽的修饰的病毒，所述多肽包含一或多个框架半分子，每个框架半分子包含一或多个结合半分子，所述多肽能在哺乳动物宿主细胞的细胞质和核中表达为缺乏所述结合半分子的配体时能维持的一种构象，该构象允许所述结合半分子随后与所述配体结合，所述多肽能跨核膜转运，这种修饰的病毒由所述结合半分子赋予它改变的向性。
本发明中“修饰的”病毒因此是指不同于天然(即野生型)病毒的病毒。通常，病毒经过修饰后，该病毒的成分相对于天然或野生型(即未修饰的)成分发生了结构变化，或者使该病毒增加了在天然或野生型中未出现的结构成分或特性。优选，根据本发明，改变所述成分的特性或行为。换而言之，修饰的病毒与未修饰(天然/野生型)病毒相比，功能不同(例如，表现出已改变的向性)。如上所述(也如下所述)，优选用遗传工程技术对病毒进行常规修饰。相应地，本发明修饰的病毒优选为重组病毒。
本发明修饰的病毒可以衍生自任何病毒，尤其是任何可作为基因治疗之病毒载体的基础来用的病毒。病毒的代表类型包括，腺病毒，逆转录病毒，慢病毒和腺伴随病毒，特别包括腺病毒科的成员，或者病毒结构成分在宿主细胞的核或胞质溶胶中合成和/或装配的其它病毒科，如呼肠孤病毒科(Reoviridae)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，细小病毒科(Parvoviridae)，乳多空病毒科(Papovaviridae)和杯状病毒科(Caliciviridae)。在一个优选方面，本发明修饰的病毒是腺病毒的修饰形式，尤其是人类腺病毒，更尤其是人类腺病毒5型。
本文中“非天然多肽”是指具有两个或多个氨基酸的多肽序列，其完整序列并未发现于野生型病毒氨基酸序列中的功能等效位置，或更尤其未发现于将被改造的野生型病毒成分蛋白中的功能等效位置
在本发明的某些优选实施方案中，“非天然多肽”还可以是指自然界未曾出现过，即为人工合成或人工构建或制备的多肽。
根据本发明，非天然多肽在细胞内环境中表达以后的构象，以及更重要的是，它在细胞外环境中的构象，应使它能结合所需配体，例如表达在所述修饰病毒所靶向细胞外表面上的受体或其它分子。
如上所述，优选本发明的非天然多肽表达在哺乳动物细胞的细胞质中时，具有在缺乏该多肽上结合半分子的配体时能维持的构象。这种构象因此是稳定的构象。换而言之，通过在细胞质中表达，所述多肽呈现一种在细胞质中、以及当该多肽转运至核内并掺入或装配至病毒颗粒中时能维持的构象。而且，该构象使得所述多肽的一或多个结合半分子在暴露于它们的配体时能与之结合。
因此，本发明非天然多肽的一个重要特征是，它能在哺乳动物细胞的细胞质或胞质溶胶中正确折叠，即呈现一种能允许结合半分子维持功能(即，结合半分子维持它们与相应配体结合的活性)的三维结构。换而言之，结合半分子维持与其配体进行功能性结合的能力。
一般认为重组蛋白的可溶性是它们正确折叠的良好指示。因此本发明的非天然多肽不仅可以根据结合半分子的功能、构象的稳定性以及成为装配病毒体的一部分的能力来进行选择，还可以根据表达非天然多肽、或含有非天然多肽之病毒成分蛋白的细胞内部的可溶性来进行选择。例如，可以测定重组尾丝蛋白自真核细胞(如昆虫细胞)中的总表达，以及它们回收在细胞裂解物的可溶性级分中的比例。
本发明发现，对以重组蛋白形式表达在杆状病毒感染的昆虫细胞中的尾丝-配体融合构建体进行表型分析，其结果显示它们的可溶性程度与有活力的重组腺病毒的回收相关。因此，优选本发明的任何非天然多肽，或含有非天然多肽的病毒成分蛋白(例如尾丝-配体融合构建体)，它们的特征在于可溶性以及作为重组蛋白与靶细胞的结合特性，而不是相应基因向病毒(例如腺病毒)基因组中的再插入。
本发明因此提供了一种修饰的病毒，其中所述非天然多肽用该非天然多肽或含有该非天然多肽的病毒成分蛋白的可溶性试验来选择。对非天然多肽的选择应使得，在表达非天然多肽或含有非天然多肽的病毒成分蛋白的细胞裂解后的可溶性级分中，有超过25％，优选超过30％，更优选超过50％或甚至70％的非天然多肽或含有非天然多肽的病毒成分蛋白。一个合适的试验在本文实施例中描述，其经过必要的修改(mutatis mutandis)后可以应用于其它细胞表达系统中。本文中，在细胞环境中可溶的非天然多肽或含有非天然多肽的病毒成分蛋白应该解释为：当细胞裂解物的可溶性级分中有至少25-30％的所述多肽时，可以认为该多肽是“可溶的”。
因此，本发明另一方面提供了一种确定用于制备病毒载体的非天然多肽(如重组病毒融合蛋白)的可溶性的方法，即测定该多肽在细胞系统中的可溶性。更具体地，本发明提供了一种分析本发明的非天然多肽或修饰的病毒蛋白成分的可溶性的方法，包括以下步骤：i)在容许细胞中表达非天然多肽或含有该非天然多肽的病毒成分蛋白；ii)裂解这些细胞，产生细胞裂解物；iii)分离细胞裂解物的可溶性级分和不溶性级分；iv)分析所述细胞裂解物的可溶性级分和不溶性级分中，所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白的含量；和v)比较所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白在可溶性级分和不溶性级分中的相对含量，从而确定可溶性。
本发明结合半分子的配体可以是对应于该结合半分子的配体，或者说，是设计或选择的结合半分子能结合的配体。因此，所述配体能与所述结合半分子结合。因此配体与其结合半分子可以看作是亲和结合对的成员，其中的配体是结合半分子的结合配对物。
因此，结合半分子具有针对目标配体的结合特异性，或者能与目标配体特异性结合。“结合特异性”或“特异性结合”是指，结合半分子能与目标配体(或“靶”)以一种不同于与非靶分子或配体结合的方式进行结合。因此，结合半分子或者不与非靶分子结合，或者与非靶分子的结合很弱或大大减弱(与结合靶配体的能力相比)，例如，仅为本底水平。结合半分子因此能特异性识别靶配体。
结合半分子的这种结合特异性因此允许所述修饰病毒的选择性靶向。换而言之，可以对结合半分子进行设计或选择，使修饰的病毒与所需细胞或“靶”细胞结合。可以对结合半分子进行设计或选择，使其与靶细胞表达、或者表达在靶细胞上(例如细胞表面)的配体结合。
配体因此可以是任何所需的配体，优选表达在靶细胞表面的分子，所述靶细胞是希望所述修饰的病毒能在其中表达的细胞。配体因此可以是细胞表面受体，或细胞表面抗原。配体通常是蛋白或多肽分子，但也可以是任何类型的分子，例如脂质或碳水化合物。
这样一来，修饰的病毒经过修饰后，可以结合所需的靶细胞，而相应的天然(野生型)病毒不能与该细胞结合，或者修饰的病毒经过修饰后，可以比野生型病毒具有更严格的结合特异性，换而言之，仅与野生型病毒所能结合的众多类型的靶细胞群体中特定的或具体的亚组或亚型靶细胞结合。病毒的向性因此被改变。故，“改变的向性”是指修饰的病毒展现与其相应野生型病毒相比已经改变的，或不同的靶细胞结合特异性。
通常，本发明的非天然多肽包含至少一个框架半分子和一或多个结合半分子，并能与其它病毒成分相互作用而形成功能性、感染性病毒体。作为组成部分而组建功能性病毒体的能力，可以通过在病毒体装配过程中，在该非天然多肽内包含一或多个影响该多肽(或包含该多肽的病毒成分)与其它病毒成分相结合的序列而得到促进。
本发明非天然多肽可以替代或掺入能与靶细胞相互作用的任何病毒成分蛋白。修饰的(例如重组的)病毒成分或者由于保留了该病毒成分本身的天然结构特性而具有结合细胞的功能，或者由于掺入了非天然多肽以及任何其中所含的结构而赋予它新的结构，从而具有结合细胞的功能。在本发明优选的方面，将非天然多肽引入或掺入野生型病毒的病毒蛋白成分(例如，腺病毒尾丝蛋白)，或者与该成分形成融合蛋白，尤其优选将非天然多肽掺入后，野生型尾丝顶球(或至少其细胞结合区)被除去(即被替代)。
但是，在另一个实施方案中，保留了野生型尾丝顶球(或其细胞结合区)，并借助所述非天然多肽的结合半分子而添加了另一个细胞结合区。细胞结合功能相对于将要改造的野生型病毒发生改变，使得改变的病毒向性出现在修饰的病毒中，这是本发明的特征。当保留野生型尾丝顶球(或其细胞结合区)时，这种改变的向性可以通过修饰野生型顶球/其细胞结合区，来灭活或封闭天然或野生型细胞结合功能而获得(或促进)。
正如下文将述，有时可能希望构建或改造一种修饰的病毒，使其中可以对改变的向性的表达进行控制(例如，暂时控制)。因此，在这种修饰的病毒中，可以通过保留野生型尾丝顶球(或其细胞结合区)而保留天然或野生型向性，另外还提供能赋予改变的向性的非天然多肽。例如，这可以用于在本领域已知的常规细胞系中繁殖修饰的病毒，方式是在修饰的病毒中另外包含野生型结合功能，例如，由诱导型控制元件(如启动子)控制野生型腺病毒尾丝基因的表达。
需要时，可通过控制(例如阻止)另外的野生型病毒成分基因的表达，或者在表达后，通过去除或灭活野生型顶球/区，使得由非天然多肽赋予的改变的向性表达，从而改变野生型向性。本发明中“改变的向性”因此包括“潜在的”改变的向性，即表达改变的向性的潜能。它还包括除了野生型向性以外的另外一种改变的向性。
如上所述，本发明修饰的病毒优选用遗传工程技术制备，在本发明优选的实施方案中，非天然多肽以与病毒蛋白成分形成的融合蛋白的形式来提供，优选与腺病毒尾丝蛋白形成的融合蛋白。这种融合蛋白，或者更一般地，这种修饰的病毒成分蛋白，代表了本发明的一个方面。在本发明该方面的一个优选实施方案中，修饰的病毒成分是含有上述非天然多肽的修饰的腺病毒尾丝蛋白。
用于制备这种非天然多肽并将它们引入病毒或病毒成分的技术是本领域已知的，有很多相关文献。因此，例如，可采用分子生物学或遗传工程技术来制备本发明的、能表达为修饰的病毒或病毒成分的基因序列构建体。正如以下实施例将进一步描述的，可以对编码病毒成分蛋白(如腺病毒尾丝蛋白)的核酸分子或核苷酸序列进行修饰，以便引入编码非天然多肽的核苷酸序列，从而，例如编码一种融合蛋白，它包含部分或完整的腺病毒尾丝蛋白以及所述非天然多肽。
根据插入了本发明非天然多肽的病毒成分蛋白，或者该多肽所替代的成分，本发明的非天然多肽可以选择包含另一种元件，该元件模拟该病毒成分的天然结构或功能(即，是该病毒成分的功能性等效物)，从而促进功能性病毒粒子的装配。在本发明修饰的腺病毒尾丝的例子中，腺病毒尾丝在病毒体装配、尤其衣壳装配方面的功能完整性，通过外部氨基酸三聚体化基元(如来自人肺表面活性物质蛋白D的颈区的螺旋状氨基酸基元(Hoppe等，FEBS Letters，344：191-195(1994))能维持。可以将这种以及本领域已知的其它三聚体化基元功能性改造至尾丝茎部，作为尾丝三聚体化信号，产生无顶球的尾丝。例如，适于包含在修饰的病毒中的三聚体化基元参见WO98/54346和WO 99/41359。在本发明一个优选实施方案中，出现在非天然多肽中的非天然三聚体化基元是来自人肺表面活性物质D的颈区肽。
如下文实施例将述，将任何这样的额外或外部基元或特征借助“接头”序列引入病毒可能是便利的或必需的。这种通过连接至接头序列而引入DNA或氨基酸序列的构建技术是本领域已知的，也是蛋白质/遗传工程的常规技术。
本文中“框架半分子”是在细胞核以及胞质溶胶环境中保留了功能性(如折叠的)结构(或构象)的多肽(如蛋白)结构。这种功能性结构是能允许结合半分子连接或插入该框架半分子、以便在缺乏配体时保留配体结合构象的结构。这促进了随后与该配体的结合，例如，重新装配的病毒体离开细胞环境之时。
因此可将框架半分子看成一种“分子支架”结构，它提供框架以便支持或“支撑”结合半分子，使之处于合适的状态或构象，从而允许与其配体结合。框架半分子还提供了分子内相互作用，使得有可能在胞质溶胶中形成稳定的构象。框架半分子因此可以是蛋白或多肽分子，它呈现一种特定的构象或结构，并能耐受一或多个特定区域中的修饰，例如通过添加、插入、缺失或取代氨基酸序列进行的修饰，或事实上插入多肽序列。
因此，本文中“结合半分子”是附着于或包含本发明所述框架半分子的一部分的多肽结构，当宿主细胞的核和胞质溶胶中表达了所述非天然多肽后，作为其中一个部分的上述多肽结构仍保留与所需(靶)配体结合的功能。
结合半分子可以是邻接的或非邻接的氨基酸序列，而且可以看成它提供了结合靶配体的位点。因此，结合半分子应该是蛋白或多肽分子的区域，例如，表面区域，如一组“表面”氨基酸残基。
在本发明的某些优选实施方案中，框架半分子和结合半分子可以有不同的来源(例如来自不同蛋白)，它们可通过将所需半分子“移植”或连接至所需框架而获得，或衍生。在其它优选实施方案中，结合半分子可以在蛋白的“框架”结构内部，通过修饰框架蛋白的特定区域或残基而产生，见下文详述。在这种实施方案中，框架半分子可以是“恒定的”或未经修饰的残基，而结合半分子可以是“可变的”或修饰的残基。
因此，本发明的非天然多肽可以是一种组合蛋白，它通过使具体的蛋白结构随机化(随机诱变)，产生具有修饰的或增强的新结合特性的结合蛋白。这种合成的、“人工”的(即非天然)、蛋白性质的亲和结合分子(即，通过改造而具有特定的或新的结合功能的蛋白)是本领域公知的。
这种组合蛋白可以使用各种肽和蛋白作为起始结构来制备(Nygren和Uhlen，Current Opinion in Structural Biology，7：463-469，1997)。这种蛋白是本领域已知的，一般如下制备：对靶蛋白进行随机诱变，在诸如丝状噬菌体表面表达这些变体的整个文库，然后选出展示所需结合特性的蛋白。这种选择通常涉及，变体蛋白与一般情况下被固定的靶配体(结合配对物)之间的结合反应，且这种选择可在体内或体外进行。诱变是随机的，最终所得由任何特定密码子编码的氨基酸通常不是预先确定的，但引入突变的位置通常是事先定好的。诱变可能涉及氨基酸的取代、缺失、或添加(例如，插入)。
优选作为本发明非天然多肽使用的组合蛋白是本领域通常称为亲和体(affibody)的蛋白。术语“亲和体”在本文中是指衍生自细菌受体蛋白，或其结合结构域的一种亲和结合分子，其中的结合结构域已被修饰(例如，经蛋白/基因工程改造)，因此修饰(例如，改变或增强)了它的结合特性。优选地，所述亲和体是非天然蛋白(指并非天然存在的)，还优选具有新的结合位点。这种蛋白分子的实例和进一步详述见WO 95/19374。
噬菌体表面展示等表达系统的应用在基因型和表型之间提供了一种重要联系；有一种自身包含的单元，它可根据其特异性结合来选择并且还带有编码负责所述结合特性的蛋白的核酸。这使得能表达有效量的根据其结合特性而被选出的蛋白，这种表达通常发生在转化的细菌宿主中。
根据其结合靶配体(例如所需细胞表面分子)的能力而选出的蛋白，随后可用于制备本发明的修饰的病毒或病毒成分，或更具体地，可以如此使用编码所需组合蛋白的核苷酸序列。
构建蛋白分子的组合文库并随后进行筛选，以便获得具有所需结合特性的蛋白性质的结合分子，该过程所用的技术是本领域已知的(Nygren，P.和Uhlen，M.Current Opinion in Structural Biology(1997)7：463-469)。通常，使用可能具有内在有利特性，如温度或pH不敏感性(insensitivity)、或组合稳定性的蛋白分子作为“支架”或“框架”，然后通过对蛋白进行随机但靶向的氨基酸取代(或其它突变)来构建组合文库，以便产生具有不同结合特性的分子文库。表面残基通常是随机诱变的目标。
除了噬菌体展示技术(Smith等，Meth.Enzym.217，228-57，(1993))，其它用于文库构建和筛选的方法包括，例如，核糖体展示(Hanes等，Proc.Natl.，Acad.Sci.USA 94：4937-4942(1997))、质粒上的肽(Schatz等，MethodsEnzymol.，(1996)267：83-109)、RNA蛋白融合体(Roberts等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302(1997))和DNA-蛋白连接(STABLE)(Doi等，FEBSLett，457(2)：227-30，(1999))。
适当的蛋白框架可以仅仅是线性肽，但优选所述框架具有折叠的三维结构，它具有潜在的较高亲和力并且不易被蛋白裂解性降解。可以重新(denovo)设计框架，但通常选用天然存在的蛋白或结构域进行进一步的改造。为避免疑问，应注意本说明书全文中，“蛋白”用于指完整蛋白分子及其结构域或片段，多肽或肽。
对蛋白框架的选择取决于数种参数，包括在所需宿主细胞(如哺乳动物细胞)中有效表达的能力。所述蛋白还应该在其表面包含足够大的区域，这样的区域应该是对取代(或插入或缺失等)耐受，而且不破坏总体的三维结构。如果文库要通过合成来产生，必需先有一个较小的总量。当所选框架蛋白具有结合功能时，参与该相互作用的氨基酸残基可以作为随机化的标靶。随机化可以用于增强已知的结合特性或使结合分子具有新的特异性。
适当的框架分子如Nygren等(同上)所述，包括：一段有限序列中的环形肽(这种有限序列中的氨基酸残基的数量并非关键，可以是5或更多，例如，5-10或更多，例如40或更多)、含有Fv或单链(scFv)结构域的免疫球蛋白-样支架、细菌受体如58-残基的单一结构域葡萄球菌蛋白A(SPA)类似物Z(“Z结构域”是SPA的B结构域的衍生物)、或SPA的其它结构域或类似物、DNA-结合蛋白尤其锌指结构以及蛋白酶抑制剂。
特别有兴趣的是细菌受体结构域Z。Nord等在Protein Engineering 8(6)：601-608(1995)中描述了一种构建基于Z结构域的蛋白分子的组合文库的方法，其适用于很多框架分子。所述方法有固相的辅助，并且基于随机化单链寡核苷酸的逐步装配。
在分子中修饰氨基酸序列或残基，从而产生结合半分子，的另一种方法是，将结合半分子引入框架半分子，例如插入或添加由结合半分子组成或包含结合半分子的多肽，结合半分子因此可以与框架半分子结合。在这种情况下，结合半分子可以由所需靶配体的亲和结合配对物来提供。
本发明优选的结合半分子可以衍生自，但不限于，细胞表面受体的配体(即结合配对物)、抗受体的抗体(或抗体片段或衍生物)、细胞特异性肽、单链抗体(ScFv)、单一结构域抗体、抗体的最小识别单位如Fv片段的互补-决定区(CDR)。结合半分子因此可以从抗体的抗原结合位点或者抗原结合或识别/区获得或者衍生出，而这种抗体可以是天然的或合成的。
本发明还涉及从任何形式的肽或多肽衍生的结合半分子，所述肽或多肽包括从各种蛋白文库鉴定的激素、抗体、T细胞受体、亲和体及配体。
如上所述，非天然多肽的一个重要特征是在哺乳动物的细胞质和核中维持构象，从而保留该结合半分子的结合功能。如下将述，这可以通过提供能在哺乳动物细胞的胞质和核中维持正确折叠的非天然多肽而获得。业已发现这种正确折叠可以用不依赖二硫键维持构象(即不含有二硫键)的非天然多肽而获得。如下文将详述，本发明非天然多肽的另一优选特征是存在α-螺旋结构。
WO 95/19374描述了数种框架蛋白，它们具有共同的不依赖S-S键维持构象的有利特征。这种框架蛋白可作为本发明的框架半分子来使用。这些包括细菌受体的结构域，如葡萄球菌蛋白A(ααα型)、蛋白G(IgG结合部分，ββαββ型)、蛋白L(ββαββ型)、以及蛋白G(HSA结合部分，ααα型)。本发明的框架半分子也可以衍生自各种细菌受体，例如，但不限于表1所列的那些：
 表1：G+细菌受体的实例受体[配体]a                              来源Fc[IgG]受体I型        金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
      II型        化脓性葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes)[A族]
      III型       链球菌(Streptococcus)C族、G族、L族
      IV型        牛的G族链球菌
      V型         兽瘟链球菌(Streptococcus zooepidemicus)[C族]
      VI型        兽瘟链球菌S212纤连蛋白受体+         金黄色葡萄球菌，链球菌M蛋白                 化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)[A族]纤溶酶受体            A族链球菌胶原受体              金黄色葡萄球菌，链球菌纤维蛋白原受体        链球菌A族、C族、G族蛋白L[6轻链]          大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白H[人IgG]          化脓性链球菌[A族]蛋白B[人IgA，A1]      无乳链球菌(Streptococcus agalactie)[B族]蛋白Arp[人IgA]        A族链球菌血清白蛋白受体        链球菌A族、C族、G族
a当不能用受体的名称清楚表示时用配体表示
本发明的框架半分子并不限于来自细菌受体的结构。本发明中还可以使用其它含有α螺旋结构的多肽，所述α螺旋结构通常称为α-螺旋型卷曲螺旋，已知它们有多种来源(Cohen等，Science 263：488-489，(1994)；Harbury等，Science 262：1401-1407，(1993))。构成这些肽中的框架的螺旋由重复的氨基酸序列组成，这些序列含有特征性分布的疏水残基。α-螺旋型卷曲螺旋的结构不依赖于分子内部或分子间的二硫桥来维持稳定。α-螺旋型卷曲螺旋的实例有人肺部表面活性物质蛋白D的颈部区肽，血影蛋白超家族，亮氨酸拉链，以及流感病毒血凝素的多个部分。
特别优选将三-螺旋束家族的成员作为本发明非天然多肽的来源(例如，葡萄球菌蛋白A的Z-结构域)。
因此，在一个实施方案中，本发明的非天然多肽包含基于细菌受体衍生的结构域的结构的框架半分子。优选本发明框架半分子的结构衍生自或基于α-α-α-(ααα)-三-螺旋束或者β-β-α-β-β结构类型。还优选所述结构基于或衍生自α-螺旋型卷曲螺旋家族，尤其2-，3-或4-螺旋型卷曲螺旋家族任一个中的成员。
本发明一个实施方案中，结合半分子出现在一或多个螺旋束和/或一或多个与这些束相连的环的内部。
本发明更优选的实施方案中，框架半分子基于源自葡萄球菌蛋白A，链球菌蛋白G或大消化链球菌蛋白L的结构域的结构。
本发明更尤其优选的实施方案中，框架半分子是葡萄球菌蛋白A中结合免疫球蛋白的Z结构域的衍生物(Nord等，同上)。
在这样的实施方案中，结合半分子可以通过上述组合蛋白质工程产生。在其它实施方案中，所选的结构域或蛋白质(例如，Z结构域)可以以野生型形式作为本发明的非天然多肽来使用。
如上所述，通过对，例如，位于Z结构域表面的残基进行组合蛋白质工程改造，可以构建文库，利用与所需靶配体的结合从这样的文库中选出新的变体(即新的结合分子)作为Z结构域的亲和体(Hansson等，Immunotechnology 4：237-52(1999))。
优选的基于Z结构域的非天然多肽可能包含以下氨基酸序列：VDNKFNKEXXXAXXEIXXLPNLNXXQXXAFIXSLXDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK[SEQ ID NO：45]；和VDNKFNKEXXXAXXEIXXXXXXXXXQXXAFIXSLXDXXXXSANLLAEAKKLNDAQAPK[SEQ ID NO：46]，其中X是任何氨基酸。
在上述多肽中，可以认为保守的(即，具体指明的)氨基酸残基构成了框架半分子，它与可变残基X一起组成结合半分子。
此外，本发明的框架半分子无需依赖α-螺旋来维持它们的稳定，只要在所述非天然多肽于宿主细胞的核以及胞质溶胶中表达后，所述结合半分子与配体结合所需的构象仍能维持既可。这种框架可以包括本领域已知的、衍生自特定抗体和它们的衍生物的框架，它们无需二硫桥的存在来维持结构，因此可以作为重组病毒成分的一个部分表达在宿主细胞的核或胞质溶胶中，并仍然维持功能性构象以及行使所需配体的结合半分子的功能。本发明的其它抗体结构包括下述抗体结构，其中与结构相关的半胱氨酸残基已经被丙氨酸残基取代，但仍保留了该抗体的结合特异性。
本发明还涉及另外的框架半分子，如衍生自下述抗体的序列，所述抗体例如是单克隆抗体，以及转变为单链形式从而得以与病毒成分构建遗传融合体或对病毒成分进行修饰的抗体。当使用衍生自抗体的框架半分子时，类似于上文所述，可以通过蛋白质/遗传工程技术产生结合半分子(例如通过修饰特定的氨基酸残基)或者可以将结合半分子引入(例如，连接至或移植至)所述抗体框架。
赋予所需结合活性的抗体片段可以通过如下处理而作为结合半分子使用：将具有所需向性的抗体的互补决定环或区(CDR)移植至，能在细胞质中产生有效(productive)折叠(即能保留所结合或插入的结合半分子的结合特异性)、随后转运至发生病毒装配的细胞核中的框架半分子。换而言之，结合半分子可以是抗体的CDR。
此外，根据本发明，特定抗体的结构框架可以用作框架半分子，例如与基于抗体或衍生于抗体的结合半分子(如特异性决定环(CDR))联合，直接构建出适于构建再靶向的病毒成分的抗体。
抗体框架可用作本发明的框架半分子(例如接受CDR环作为结合半分子)，只要它能在细胞质中有效折叠并随后转运至细胞核中。可以制备来自单克隆抗体的不含二硫键的单链Fv片段(Proba等，J.Mol.Biol.，275：245-53，(1998))。这种ScFv抗体只要符合上述功能标准，就可用在本发明的框架半分子上。结合半分子可以是ScFv抗体本身的结合部位，或可以如上所述进一步改造。
来自多克隆群体的功能性抗体的细胞内选择也可以实现(Gargano等，FEBS Letters 414：537-40，(1997))。这种选择技术可用于鉴定适于腺病毒遗传再靶向的抗体片段，即适于用作本发明的框架，和/或结合半分子。
其它可用的抗体框架包括基于camel抗体的那些(它们天然缺乏轻链)，或衍生自常规抗体的特定VH区。
本发明能在细胞质中产生有意义的折叠的抗体框架的一个实例是，一种具体的抗β-半乳糖苷酶单链Fv片段。该单链可变区(VK，接头，VH)与β-半乳糖苷酶反应，并能在细胞质中表达，见前述(Martineau P和Betton J-M：J.Mol.Biol.292，921-929(1999)。因此，本发明还提供了一种修饰的病毒，它含有框架半分子，该半分子包含编码该抗β-半乳糖苷酶单链Fv片段[SEQID.47.]及其功能等效变体的序列。
本发明不限于基于抗体和亲和体(如受体)结构的框架半分子，还包括其它结构，只要它们在感染细胞的胞质溶胶/核中表达时能保留所附着或掺入的结合半分子的结合特异性。
本发明的修饰的病毒中可以有两种或多种非天然多肽，例如具有不同结合特异性的多肽，或者可以将非天然多肽掺入两种或多种不同的结合半分子中，或掺入事实上两种或多种不同的框架/结合半分子构建体中。
相应地，本发明提供了一种修饰的病毒，它们包含结合靶细胞的第一非天然多肽以及结合生产细胞或容许细胞的第二非天然多肽。
本发明的非天然多肽因此可以以含有双-或多重功能性框架半分子(或框架/结合半分子构建体)的形式出现在重组病毒成分中，所述半分子通过使两或多种不同框架半分子(框架/结合半分子构建体)发生遗传融合而构建。使用这种框架半分子(或框架/结合半分子构建体)可以，例如，赋予重组病毒对多重细胞标靶的感染性。
本发明还提供了一种修饰的病毒，该病毒中的本发明非天然多肽含有切割位点，该位点的位置使非天然多肽的结合半分子能从该修饰的病毒上切割下来，例如，所述位置是该结合半分子位于尾丝上相对于装配成的病毒体而言的远端。合适的切割位点的实例是易于被因子Xa酶或蛋白酶如人类鼻病毒3C蛋白酶切割的位点。如果是在基因水平上进行切割，例如，在含有部分或全部重组腺病毒基因组的核酸分子内发生切割，可以在，例如能产生所述病毒或作为所述病毒标靶的特定细胞群体中，使用易于被合适的限制酶或核酶切割的位点。
本发明的非天然多肽能跨核膜转运。正如本领域已知，这是病毒在宿主细胞内复制期间病毒成分所必备的特征，在所述宿主细胞中这些病毒成分在胞质溶胶中表达，而这些成分的装配发生在该宿主细胞的核中，例如腺病毒的复制。
可以认为本发明的非天然多肽行使双重功能，第一是提供新的结合结构域(即赋予改变的向性)，第二是发挥病毒成分的功能，即作为病毒成分(病毒蛋白，例如病毒衣壳蛋白)的功能性部分。非天然多肽因此可以作为病毒蛋白的一部分而发挥功能。换而言之，非天然多肽在构建或装配病毒粒子时，扮演结构角色或有功能。
含有本发明的修饰的病毒，或者被该病毒感染的细胞，也包括在本发明的范围内。所述细胞可以是任何来源，只要该细胞类型能携带或繁殖所述病毒。但一般情况下，所述细胞是哺乳动物细胞。所述细胞可以被膜成分(例如膜蛋白)转染，所述膜成分允许该修饰的病毒感染该细胞，并因此允许在特定细胞系中繁殖具有非天然向性的病毒，例如，在所述细胞系中，本领域已知的常规细胞系中的繁殖由于病毒向性的改变而被阻止。
本发明还涉及编码本发明非天然多肽、或修饰的病毒成分蛋白、或修饰的病毒的核酸分子。含有所述核酸分子，或编码所述非天然多肽、或修饰的病毒成分蛋白、或修饰的病毒的核苷酸序列的载体，无论是用于繁殖所述修饰的病毒或者是进一步对修饰的病毒进行改造，都包括在本发明的范围内。
本发明还有一方面提供了一种在细胞培养中产生本发明修饰的病毒的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：对病毒进行遗传修饰，以便产生修饰的(例如，重组的)含有非天然多肽的病毒，其中所述多肽含有一或多个框架半分子，每个框架半分子含有一或多个结合半分子，所述多肽能在宿主细胞的细胞质和核中表达，并在缺乏所述结合半分子的配体的情况下，在那里呈现和维持一种构象，该构象使得所述结合半分子随后与所述配体结合，所述多肽还能跨核膜转运，其中所述重组病毒具有由所述结合半分子赋予的改变的向性；用所述病毒感染容许细胞；培养所述细胞，以便产生病毒(例如，以足够高的滴度)，收获，并可选择纯化所产生的修饰性病毒。
可以使Ad载体相对于容许细胞具有或不具有复制竞争力。在肿瘤治疗中，具有复制竞争力的Ad有较强的优势，即它可以在肿瘤中复制并扩散(Miller等，Gene Therapy，3：557-559)。理论上，这可以使选定的效应物机制相比于用不具有复制竞争力的载体所得到的增强。而且，感染性病毒可以通过在感染细胞中发挥致细胞病变效应以及激发一种可能损害感染细胞的抗病毒免疫应答而发挥抗-肿瘤效应。
在基因治疗中，希望存在一种手段(means)可以控制具有竞争力的修饰性病毒的复制。
其它控制修饰性腺病毒复制的手段也包括在本发明的范围内。例如，本发明的修饰病毒可包含编码病毒复制所必需的病毒蛋白的基因，所述蛋白受控于诱导型启动子或遗传元件。例如，可以将腺病毒前-终止蛋白(pTP)置于四环素应答性转录激活因子(trTA)的调控之下，使得pTP仅在有强力霉素时表达。或者，本发明的修饰病毒可以包含对基因组的修饰，导致该病毒仅在DNA合成-凋亡调节途径有缺陷的细胞中复制。
通常，这可以在本发明的修饰性病毒中实现，方法是，在结合半分子上游、或者在能使结合半分子从所述修饰病毒上切割下来的任何这类位置，例如，在尾丝茎和结合半分子之间，引入另一切割位点。
因此，本发明另一方面还提供了一种调节修饰性病毒的复制的方法，包括以下步骤：构建一种修饰性病毒，使切割位点(例如易于被酶裂解或化学裂解的位点)位于细胞感染所必需的结合半分子与含有该结合半分子的重组病毒成分的剩余部分之间，使所述重组病毒与能将所述结合半分子从所述病毒成分上切割下来的切割试剂或切割手段(例如，酶，化学物质，或者在光敏性切割位点的情况下，光照)接触，从而阻止重组病毒进行进一步的感染周期。
如果上述方法中的切割手段是酶解，则所述切割酶可以编码在重组病毒的基因组中，并且可以是诱导型的。在一个优选实施方案中，切割位点由因子Xa酶来切割。本发明还包括使用其它本领域已知的蛋白酶，例如，人类鼻病毒3C蛋白酶，它可以作为GST融合蛋白的形式来提供(Walker等，Bio/Technology 12：601(1994))。该蛋白酶在4℃具有活性，能识别并切割序列LEVLFQ//GP。
利用与本领域已知的噬菌体展示技术类似的方式，从文库中筛选在核和胞质溶胶中正确折叠的肽以及所需的结合功能后，可以从文库中选出本发明的非天然多肽。这种文库可以由与本发明野生型或修饰(如重组)的病毒成分(如腺病毒尾丝蛋白)融合的候选肽组成。尾丝融合体文库可以表达在腺病毒粒子上，并用于通过观察那些促进复制的候选融合体来选出正确的胞质溶胶和核构象。
本发明修饰的病毒也可以用出现在或编码在基因组中的野生型病毒成分以及修饰的病毒成分来构建，必要时，还可使每种成分基因受控于不同的遗传控制元件，例如，启动子。因此，本发明修饰的病毒可以包含修饰的病毒成分(即经过修饰而包含非天然多肽)和等效的或相应的未经修饰的病毒成分，例如，野生型尾丝，和修饰的尾丝。
例如，重组腺病毒可以用野生型尾丝和修饰的或重组的尾丝(即含有或插入了非天然多肽的修饰的尾丝)来构建，例如，所述修饰的尾丝衍生自“尾丝-候选结合肽”融合体文库，该文库在E1缺失型腺病毒中于不同启动子控制下表达。例如，本发明人显示，可以将受控于CMV启动子的重组腺病毒尾丝基因克隆至穿梭载体pAdTrack的多克隆位点，用Ad载体pAdEasy通过同源重组产生既能表达WT尾丝又能表达重组尾丝的病毒(He T-C，Zhou S，DaCosta LT，Yu J，Kinzler KW和Vogelstein B：A simplified system forgenerating recombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci，USA，95：2509-2514，1998)。
还可以在腺病毒载体基因组中包含受控于一或多个诱导型启动子的一或多种尾丝基因(例如野生型基因和修饰的基因)，从而允许每种基因分别开启或关闭。例如，在所需的Ad构建体中，可以将野生型尾丝基因克隆成不在它通常的位置，也不受主要晚期启动子(MLP)的控制，而受激素诱导型MMTV启动子的控制，从而可以被地塞米松(dexamethasone)诱导。该启动子允许野生型尾丝在繁殖该载体的细胞中表达。优选地，将修饰的尾丝克隆至相同的Ad载体基因组中，例如，位于能在所需细胞系中开启的TRE(四环素应答元件)序列元件的下游。在表达tTA蛋白(与TRE结合的转录激活因子)的细胞中，TRE可以在缺乏Tc(四环素)或Dox(强力霉素(doxacyclin))的情况下被激活。或者并且更优选，Ad载体构建体可以在表达反式tTA(rtTA)的细胞中繁殖，在这些细胞中，TRE，以及对修饰的尾丝的表达，在有Tc(或Dox)的情况下被激活。
所述文库中重组尾丝蛋白的野生型尾丝顶球可以被外源三聚体化基元和肽文库的一或多个成员(或其它非天然多肽)替代。一旦在能繁殖病毒的细胞培养中，重组腺病毒通过表达野生型尾丝而得以繁殖，就可以以类似于噬菌体展示的方式筛选具有所需结合活性的重组尾丝蛋白。
相应地，具有改变的向性的修饰病毒需要能被其感染并因此允许其繁殖的细胞。故本发明还提供了本发明病毒的容许细胞，它能通过培养而繁殖所述病毒。不具有复制竞争力的病毒(通常在其基因组中包含缺失，因而失去竞争力)需要特殊的生产型细胞或繁殖型细胞，它们能提供该病毒所缺失或丢失的遗传信息以便复制。这种细胞或细胞系是本领域已知的。具有改变的向性的修饰病毒可能不能感染这类细胞，正如本领域已知的那样。相应地，本发明包括对这类繁殖型细胞进行修饰，以使其包括所述修饰病毒的结合半分子的结合配对物(配体)(例如，使所述细胞在它们的表面表达这类配体)。
相应地，本发明提供了一种细胞，优选体外或回体(ex-vivo)的真核细胞，它含有本发明的修饰的病毒或病毒成分。
本发明还涉及，通过在包含野生型结合半分子(即，顶球)的病毒成分中安置新的向性-改变结合半分子，并在这些半分子之间安排一个切割位点(如因子Xa或人类鼻病毒3C蛋白酶的切割位点)，使具有改变的向性的修饰性病毒与野生型病毒在相同细胞中繁殖。经由野生型结合半分子的作用而在常规细胞中繁殖后，所述病毒成分被裂解，从而除去野生型结合半分子(例如，野生型顶球)，暴露出新的结合半分子，并赋予新的向性。本发明还涉及，所暴露的结合半分子可以特异于一种配体，该配体自身具有结合细胞的能力。例如，所述结合分子可以特异于抗体的Fc区，从而允许使用对所需细胞类型具有细胞特异性的抗体。通过切割去除野生型结合半分子并使病毒暴露于细胞特异性抗体，就能使所述抗体吸附至所述病毒，并因此将所述病毒靶向所述抗体特异性针对的细胞。
本发明的非天然多肽优选赋予重组病毒以相对于引入该非天然多肽的病毒的向性而言改变了的向性。这种改变的向性使本发明的重组病毒可以用于治疗人类或动物受试者的疾病，无论是对需要治疗的受试者进行体内治疗，或者是对其进行细胞回体治疗。
本发明修饰的病毒的向性经过改变后，该病毒可以通过一或多个结合半分子靶向特定的细胞。因此，本发明还提供了一种修饰的病毒，其中一种非天然多肽含有能结合细胞特异性配体的结合半分子，所述配体可以是前列腺特异性膜抗原，EGF受体，Her-2/Neu，VEGF受体，CD22，gp120，MHC/肽复合体或表达在或出现在增生细胞、肿瘤细胞或病毒感染细胞表面的膜结构或表面分子。
有多种方式可以将本发明展示改变的向性的修饰性病毒应用在基因治疗中。在肿瘤疾病的情况中，有以下选择：
I.使用载体将转基因引入肿瘤，所述转基因如：
-反义癌基因
-自杀基因
-免疫调节物质或肿瘤抗原的基因
-抗-造血因子的基因
适于包含在本发明的修饰性病毒中的转基因实例有：反义癌基因，自杀基因，免疫调节物质的基因，肿瘤抗原的基因，抗-造血因子的基因，细胞因子基因，血管内皮生长抑制物的基因，致膜融合的糖蛋白的基因，细胞毒基因，编码将前体药物转化为细胞毒物质的酶的基因，胞嘧啶脱氨酶的基因，尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因。本发明优选实施方案中，修饰的病毒含有编码胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因，它们可以是各自单独的基因，或者，更优选是合并在一起作为双功能融合基因。
在应用本发明的具有胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶的转基因的病毒进行治疗的方法中，优选所述病毒与一或多种二氢嘧啶脱氢酶的抑制剂一起存在或一起给药。这能使这些转基因形成的产物的毒性效应相对于前体药物，5-氟胞嘧啶增加。
本发明还提供了一种修饰的病毒，它含有受控于一或多种诱导型启动子或遗传元件的一或多种病毒成分或转基因，它们可以是组织特异性的，或者能应答外源的表达调节物质的存在。
II.感染性病毒的用途。这比应用非复制型载体有额外的价值，它使病毒可以在肿瘤内从细胞扩散至细胞，从而增强最初对肿瘤的打击，或效应。肿瘤细胞不仅可以通过工程化安装至所述载体中的细胞-破坏机制来破坏，还可以通过病毒感染本身所伴随的细胞破坏作用以及机体免疫应答对病毒感染细胞的攻击来破坏。该原理已通过直接向肿瘤内注射腺病毒而在人体中验证，其中的腺病毒已经通过基因改造而只能在p53突变的肿瘤细胞中复制。从有限的对“头颈部”大肿瘤的试验获得的经验也有令人鼓舞之处：11例接受治疗的肿瘤中有2例完全消退，这些病例都是对任何形式的已知治疗耐受者(Shen Y：Personal communication)。
本发明还提供了一种修饰的病毒，其中编码腺病毒死亡蛋白(ADP)的基因受控于允许该蛋白过度表达的启动子之下，所述修饰性病毒的裂解能力因此而增强。
因此，对于基因治疗而言，修饰的病毒可以进一步用本领域广知的标准技术、原则和方案进行修饰，以便掺入或包含所需治疗基因或治疗性核酸分子。“治疗性”在本文中广泛用于包括治疗(指对于已经存在或被确诊的病症进行的治愈性或缓解性治疗)和预防。所述基因可以编码所需治疗性产物(例如，治疗性多肽或反义分子)。
在本发明另一方面，所述修饰的病毒可以包括用于插入所需治疗性基因/核酸分子的位点(如，限制性位点)。
在基因治疗中使用野生型病毒(即使是根据本发明进行了修饰以后)的一个好处是，用该病毒治疗的人类或动物受试者，可以拥有事先形成的、针对仍存在于所述修饰性病毒中或者仅被部分修饰的野生型病毒成分的抗体。例如人的腺病毒血清型5的六邻体蛋白通常是预先形成的抗体的靶。尽管对单一病毒成分，如含有本发明多肽的成分进行修饰，就足以减弱由事先形成的抗体对所述修饰性病毒的初始免疫应答，但优选修饰该病毒的其它成分，以便进一步减弱宿主的免疫应答。
因此，本发明还提供了一种根据本发明修饰的病毒，其中的另一种病毒成分被等效的成分替代或者被修饰，从而事先形成的、针对野生型病毒的抗体与该病毒的结合减少。例如，腺病毒血清型Ad5可包含一种六邻体蛋白，它被替换为另一种不同血清型的六邻体蛋白，针对后者的抗体比血清型Ad5的抗体水平低，例如，所述不同血清型可以是Ad37。或者，修饰的腺病毒可以包含一种六邻体蛋白的表位序列，该蛋白可被事先形成的抗体结合，所述病毒已经被修饰，从而能产生缺乏免疫原性表位的重组六邻体。
而且，修饰的腺病毒可以包含一种六邻体蛋白，该蛋白进一步含有能结合蛋白(如人血清白蛋白等非免疫系统蛋白)的肽，该肽足以覆盖该六邻体上可被事先形成的抗体结合的免疫原性表位。
本发明还提供了，根据本发明修饰的病毒在治疗或者在制备用于治疗肿瘤细胞或增生细胞的药物中的用途。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有本发明的修饰的病毒以及一种可药用的载体或赋形剂。
本发明参照以下非限制性实施例详细说明，其中：
图1图示不同重组尾丝的构建顺序。
A.利用PCR使NRP序列侧翼带有Sph1和Xho1位点，并将该序列连接至已在侧翼带有EcoR1和Xho1位点的WT尾丝中。所得尾丝称为A1，它含有尾丝尾部，最初的茎部重复单元以及NRP基元。
B.通过SOE将EGF与尾丝A1相连。在此过程中，在NRP和EGF序列之间添加一个氨基酸接头和一个Cla1限制性位点。所得尾丝命名为A1EGF。在此尾丝中，通过在Cla1和Xho1位点进行连接就可以将EGF替换为新的配体。
C.对尾丝A1 EGF的NRP-接头-EGF部分进行PCR。在此过程中，在序列中引入一个上游Nhe1位点，使之与WT尾丝序列在一个读框中。AT克隆之后，将该序列用Nhe1和Xho1连接至WT尾丝，得到尾丝A7 EGF。A7区别于A1之处在于，A7包含Ad5尾丝的最初7个茎部重复单元。在A7 EGF构建体中，可以通过在Cla1和Xho1位点进行连接而将EGF替换为新的配体。
图2图示本申请使用的不同重组尾丝。
A.Ad5野生型尾丝。
B.上述A7 EGF尾丝。
C.A7 scFv C242尾丝，其通过如上所述的连接将A7 EGF尾丝中的EGF替换为scFv片段而产生。
D.A7 scFv G250尾丝，其通过如上所述的连接将A7 EGF尾丝中的EGF替换为scFv片段而产生。
E.A7 Affi IgG尾丝，其中A7 EGF尾丝中的EGF已如上所述替换为结合IgG的亲和体。
F.A7 Affi IgA尾丝，其中A7 EGF尾丝中的EGF已如上所述替换为结合IgA的亲和体。
G.A7 Affi IgG/Affi IgA尾丝，其中A7 EGF尾丝中的EGF已如上所述替换为结合IgG的亲和体，所述结合IgG的亲和体与结合IgA的亲和体如上所述相连。
H.A7 ZIgG/ZIgG尾丝，其中A7 EGF尾丝中的EGF已如上所述替换为结合IgG的亲和体，所述结合IgG的亲和体与另一结合IgG的亲和体如上所述相连。
I.A7 ZIgG Xa尾丝顶球，其中A7 EGF尾丝中的EGF已替换为结合IgG的亲和体，所述结合IgG的亲和体与一种可切割的野生型尾丝顶球相连。
图3显示ZIgG亲和体插入表达在病毒体上的尾丝中之后的结合。
A组 当病毒或蛋白与膜结合后，将其与Fc3(1)一起保温，再与HRP偶联的抗人IgG一起保温，然后显色。1＝病毒A7 ZIgG Xa顶球；2＝相同病毒经Xa切割；3＝WT病毒；4＝具有两个尾丝(如WT和A7 ZIgG)的病毒；5＝Fc3(1)；6＝蛋白A；7＝蛋白AG。
B组 当病毒或蛋白与膜结合后，将其与Fc3一起保温，再与HRP偶联的抗人IgG一起保温，然后显色。1＝病毒A7 ZIgG Xa顶球；2＝相同病毒经Xa切割；3＝WT病毒；4＝具有两个尾丝(如WT和A7 ZIgG)的病毒；5＝Fc3；6＝蛋白A；7＝蛋白AG。
C组 对照，显示膜上存在病毒。1＝病毒A7 ZIgG Xa顶球；2＝相同病毒经Xa切割；3＝WT病毒。与病毒结合后，将膜与HRP偶联的抗Ad5六邻体一起保温，然后显色。
D组 处理的方法同A组和B组中膜的处理，但不与Fc保温。1＝病毒A7 ZIgG Xa顶球；2＝WT病毒；3＝蛋白A；4＝蛋白AG。说明：已知Fc3(1)与ZIgG和蛋白A结合。已知Fc3仅与蛋白G(AG)结合。
图4图示实施例11中所述尾丝。NRP-接头插入在NRP上游的NheI位点中。
图5显示凝胶照片，证实重组尾丝在Sf9细胞中的表达和可溶性。(A)全细胞裂解物；(B)可溶性级分。用杆状病毒感染细胞，48小时后收获细胞，用等渗缓冲液裂解，将细胞裂解物分成两个等份。其中一份在10,000xg离心10min并取上清(B组)，另一份以全细胞裂解物的形式进行分析(A组)。两个等份均在SDS-样品缓冲液中加热变性，用常规SDS-PAGE进行分析，并进行印迹。使印迹与4D2.5mAb(特异于尾丝尾部)和放射性标记的第二抗体反应。免疫印迹通过放射自显影扫描来定量。定量的数据表示为可溶性尾丝含量相对于尾丝总含量的百分比，见表7。
实施例
主要方法和起始物质
重组腺病毒尾丝用基于连接和PCR的方法(Clackson等，Generalapplication of PCR to gene cloning and manipulation，in PCR，A PracticalApproach，Eds McPherson MJ，Quirke P and Taylor GR，IRL Press，Oxford，page 187，(1992))，即PCR-连接-PCR法(Alvaro等，BioTechniques 18：746-750(1995))来构建，并通过重叠延伸来剪接(SOE)(Horton等，Recombination andmutagenesis of DNA sequences using PCR，in McPherson MJ(ed)，DirectedMutagenesis，IRL Press 1991，p 217.)。通常将PCR所得基因产物用所谓的TA克隆法(Clark J.M.，Nuc.Acids Res.16：9677-86，(1988))克隆至载体pCRII(Invitrogen Corp.)中。按照标准方法再克隆(Sambrook等，Molecular cloning.Alaboratory manual.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989))至载体pGEX-4T-3(Amersham Pharmacia Biotech)中。编码重组尾丝的基因用Perkin Elmer ABI Prism测序仪测序，用下述载体在哺乳动物细胞(SV40转化的非洲绿猴肾细胞，COS7，来自美国典型培养物保藏中心，VA，USA)中表达，用杆状病毒表达法(Kitts等，Biotechniques 14(5)：810-7，(1993))在昆虫细胞(Sf9细胞，来自草地夜蛾(S.frugiperda)，美国典型培养物保藏中心，VA，USA)(病毒和载体来自Clontech，Palo Alto，CA，USA)，用特异于尾丝尾部、三聚体尾丝以及结合细胞的新配体的单克隆抗体染色。通过免疫染色评价以下参数：
i)核转运
ii)结合细胞的新配体的功能性表达
iii)形成三聚体的能力
可通过近期开发的方法(如本文实施例7所述)将重组尾丝拯救至Ad基因组中。可以用含有完整Ad5基因组(为Pac1-Pac1片段)的质粒pTG3602(Chartier等，J.Virol.，70：4805-4810，(1996))作为起始物质。将Spe1和Pac1之间的含有野生型尾丝基因的近9kb基因组片段单独克隆至pBluescript中。由该片段进一步克隆Sacl和Kpnl之间的近3kb片段。在此3kb片段中产生天然尾丝基因的缺失，但不缺失尾丝的Nde1位点上游的N-末端核苷酸，取而代之的是引入一个Xho1位点以便将重组尾丝连接至缺失了尾丝的3kb片段(3kb尾丝穿梭体)中的Nde1和Xho1之间。
利用在大肠杆菌中的同源重组将带有重组尾丝的3kb尾丝穿梭体重新引入已被Nhe1切割的9kb片段中(Chartier等，同上)。所得9kb重组片段最后用Spe1和Pac1从载体上切下来，经粘粒克隆而与分离的27kb片段连接。
具有预期特性的插入子的存在通过在所有粘粒克隆中进行PCR来检验。粘粒克隆也用Hind III进行限制性处理，具有预期大小的限制性片段的存在在凝胶上检验。
用Pac 1进行限制性处理后，分离出重组的Ad基因组，用于转染合适的细胞。通过对转染细胞培养物进行显微镜检来确定空斑的出现。
所用引物的寡核苷酸引物名称列表(都按照5′-3′顺序)：
[SEQ.ID.NO.：20]名称149：
TTCCTCGAGTTATTCTTGGGCAATGTATGA
[SEQ.ID.NO.：21]名称175：
GGGGAATTCGATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAA
[SEQ.ID.NO.：22]名称：196：
GCTCGAGTTATCCGTTTGGAAACAACTCTAC
[SEQ.ID.NO.：23]名称：228：
CTCGAGTCATCTCAATTCCCACCACTT
[SEQ.ID.NO.：24]名称：238：
TGGCATGCCTGACGTAGCAAGCTTACGA
[SEQ.ID.NO.：25]名称：253：
GGGGAATTCATCGATGCAGGTCCAGTTGGTGCAGTCT
[SEQ.ID.NO.：26]名称：265：CAGGTCCAGTTGGTGCAGTCT
[SEQ.ID.NO.：27]名称：269：
GGGGGCCTGGGCGTCGTTCAGCTTCTTGGCTCCGTTTGGAAACAACTCTAC
[SEQ.ID.NO.：28]名称：270：
CTGAACGACGCCCAGGCCCCCAAGAGCGACCCATCGATCATGAACTCCGACTCCGAATGT
[SEQ.ID.NO.：29]名称：273：
CCCCTGGAGTTAAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCT
[SEQ.ID.NO.：30]名称：274：
GGGGAATTCATCGATGGACTACAAAGATATTGTGATGACGCAGGCT
[SEQ.ID.NO.：31]名称：275：
CIACCTCGAGTTAACACTCATTCCTGTTGAAGC
[SEQ.ID.NO.：32]名称：326：
GGGGCTAGCCCCTGACGTAGCAAGCTTACGA
[SEQ.ID.NO.：33]名称：403：
GGG CTC GAG TTA CTC GAT GGG GGC TGG GAG GGC
[SEQ.ID.NO.：34]名称：414：
GGCCCCCGAGGCCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGT
[SEQ.ID.NO.：35]名称：416：
GGCCCAGCCCACGAATTCATCGATGGATATTGTGATGACGCAGGCT
[SEQ.ID.NO.：36]名称：418：AGA CTG CAC CAA CTG GAC CTG(SNN)18CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGT(S是dA、dG或dC，N是dA、dG、dC或dT)
[SEQ.ID.NO.：37]名称：473：
GGC AAT TCC ATC GAT CGC CAC CAT GGA CAT TGT GAT GACCCA GTC T
[SEQ.ID.NO.：38]名称：474：
CCC CTC GAG TTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT
[SEQ.ID.NO.：39]名称：476：ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCTGAT GCT GCA CCA ACT GTA
[SEQ.ID.NO.：40]名称：478：TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT
[SEQ.ID.NO.：41]名称：503：
GGGCCATCGATCGTAGACAACAAATTCAACAAA
[SEQ.ID.NO.：42]名称：504：
GGGCTCGAGTTATTTCGGCGCCTGAGCATCATT
[SEQ.ID.NO.：43]名称：550：
TCGGTTTGGAAACAACTCTACCTTTTTTTTCGGCGCCTGAGCATCATT
[SEQ.ID.NO.：44]名称：551：
AAAAAGGTAGAGTTGTTTCCAAACGGAGTAGACAACAAATTCAACAAA
实施例1：
将三聚体化基元(人肺表面活性物质D的颈区肽)通过遗传技术插入腺 病毒尾丝
用上游引物(引物175)和下游引物(引物149)经PCR从Adt病毒制剂获得编码Ad 5 WT尾丝的基因，所述上游引物为尾丝的前6个密码子外加一个EcoR1位点，所述下游引物是能与尾丝的6个末端密码子退火的序列外加一个Xho1位点。利用这些限制性位点将所得尾丝[SEQ.ID.NO.：1]克隆至载体pBluescript中，并可用相同的限制酶进一步克隆至其它载体中。
制成尾丝肽，其中的顶球被一种外部三聚体化基元替代(见下述)。引入外部三聚体化基元有两个目的：a)除去含有天然三聚体化信号的顶球以及尾丝的细胞结合部分，b)同时提供必要的三聚体化信号。这种情况下，用到一种特定的氨基酸基元，即来自人的“肺表面活性物质蛋白D”的36aa“颈区肽”＝NRP[SEQ.ID.NO.：2](Hoppe等，同上)。应注意，所用序列略长于NRP的实际三聚体化部分，其中位于人肺表面活性物质蛋白D的三聚体化信号之后的8个氨基酸(KKVELFPN)，在所有含有NRP序列的构建体中都得以保留。KKVELFPN可作为人肺表面活性物质D的三聚体化信号和C-末端碳水化合物结构域之间的有效接头，并被认为在本文所述重组尾丝中具有相同的重要功能。合成、克隆并通过测序验证三聚体化基元的DNA序列。
为了将NRP基元引入腺病毒尾丝，用上游引物238和下游反向引物196对NRP序列进行PCR(Clackson等，同上)，所述上游引物在NRP编码的N末端含有Sph1，所述下游引物在该编码序列的C末端含有Xho1。用Sph1和Xho1切割后，将NRP序列连接至也用相同酶切割的WT尾丝基因。所得重组尾丝A1[SEQ.ID.NO.：3]含有尾丝尾部和第一个颈区重复单元，后接所述NRP三聚体化基元。构建体和构建途径的图示参见图1和2。
为了替代所述顶球的细胞结合功能，除了外部的三聚体化氨基酸基元，还将一个新的细胞结合配体随后引入该尾丝(见下文)。
实施例2：
用表皮生长因子(EGF)以及来自人肺表面活性物质D的外部三聚体化 基元装配编码重组腺病毒的基因构建体
构建体和构建途径的图示参见图1和2。
在本项目中合成、克隆并测序人EGF[SEQ.ID.NO.：4]的DNA序列。然后将该序列通过利用重叠延伸进行的剪接而与上述A1尾丝连接。在这种情况下，用上游引物(270)和下游引物(228)对EGF进行PCR，上游引物(等同于前7个密码子)含有葡萄球菌蛋白A的氨基酸接头突出端的序列[SEQ.ID.NO.：5]和一个Cla1限制性位点，下游引物互补于+链末端的7个密码子并含有一个Xho1位点。用上游引物(175)和下游引物(269)对A1尾丝基因进行PCR，所述上游引物为该基因的前6个密码子外加一个EcoR1位点，所述下游引物互补于+链末端7个密码子，还有一个突出端互补于EGF序列的反向(Back)引物的突出端。在标准SOE条件(Horton等，同上)下，对上述两种PCR产物进行PCR，产生尾丝A1 EGF[SEQ.ID.NO.：6]。
为了构建带有前7个茎区重复单元的尾丝，用上游引物(326)和下游引物(228)对NRP三聚体化信号、葡萄球菌接头和EGF、尾丝A1EGF进行PCR，所述上游引物为NRP序列的前7个5′三联体外加一个上游Nhe1位点，所述下游引物与A1正链的最后7个三联体互补。克隆之后，将PCR产物用Nhe1和Xho1进行限制性消化，并连接至已用相同酶消化的WT尾丝中，获得尾丝A7 EGF[SEQ.ID.NO.：7]，它与A1EGF类似，区别是它含有Ad5尾丝的前7个茎区重复单元。
实施例3：
用单链抗体以及来自人肺表面活性物质D的外部三聚体化基元装配编 码重组腺病毒尾丝的基因构建体
使用了两种单克隆抗体单链片段来构建重组腺病毒尾丝。第一种是单克隆抗体G250的单链片段(scFv)，其以高度选择性与人的肾癌细胞表面的蛋白抗原反应(Oosterwijk等，Int.J.Cancer 38：489-94，(1986))。第二种是单克隆抗体C242的单链片段，其与i.a.结直肠癌和胰腺癌反应(Johansson C.，Thesis，University of Gteburg，(1991))。
G250构建体
抗体G250的单链片段(κ链可变区或VK，重链可变区或VH，连接序列和重链恒定区2或CH2)如前文所述来构建(Weijtens等，J.Immunol.，152(2)：836-43，(1996))。该G250构建体是[SEQ.ID.NO.：8]。为了能克隆至上述A1和A7尾丝构建体中，用引物416和403通过PCR在所述单链片段上游添加一个Cla1位点，在下游添加一个Xho1位点。
C242构建体
抗体C242的单链片段κ链可变区，接头，重链可变区和κ链恒定区或CK)[SEQ.ID.NO.：9]如下所述，用来自产生该抗体的杂交瘤的cDNA作为起始模板经SOE而制备。VKCK用引物274和275进行扩增，VHCH1用引物253和273进行扩增。scFv(单链可变片段)(VK LinkLib VH)如下述通过SOE构建。用上述VKCK和VHCH1作为模板，用引物416/418和265/414分别扩增VK和VH，并利用引物414和416通过SOE连接。在构建体VKLinkLib VH中，VK和VH之间的接头是随机化的18个氨基酸的序列，如前述(Tang等，J.Biol.Chem.，271：15682-86，(1996))。该接头的核苷酸序列出现在引物418中。将构建体VK LinkLib VH克隆至载体pAK100(Krebber等，J.Immunological Methods 201：35-55，(1997))。使用前述方法(Krebber等，同上)进行噬菌体展示并通过淘选(panning)对抗原结合物进行选择。在这些实验中，将与抗体C242反应的CanAg抗原吸附至生物素化的抗体C241(它与C242结合所述抗原上的不同表位)，而抗体C241结合至链亲和素包被的试管上(CanAg Diagnostics Ltd，G′teburg，Sweden)。分离出数种结合物，它们显示含有不同的接头。一种特殊的VK Linker VH构建体经测序显示含有接头PPDFVPPAASFPDHSPRG(单字母氨基酸密码)，选择它进行进一步的基于抗原结合能力的工作。通过SOE将CK与该构建体连接，获得C242 VKLink VHCK形式。在此SOE中，用引物416和478扩增VK LinkLib VH，用引物476和474扩增CK。然后将扩增产物用引物416和474通过SOE连接。
在上述PCR反应中，给单链片段的基因序列提供了一个上游Cla1位点(出现在引物416和473中)和一个下游Xho1(出现在引物403和474中)，以便连接至前述的A1和A7尾丝构建体中(构建体和构建途径的图示参见图1和2)，从而构建尾丝A1 G250，A7 G250，A1 C242和A7 C242(图1和[SEQ I.D.NOS.10-13])。
实施例4：
用多种抗体以及来自人肺表面活性物质D的外部三聚体化基元装配编 码重组腺病毒尾丝的基因构建体
为了研究基于单一葡萄球菌蛋白A结构域结构的一价和二价抗原结合结构插入重组腺病毒尾丝后能否功能性表达，制备了用于哺乳动物和昆虫细胞表达的基因构建体。如下装配编码重组腺病毒尾丝的基因构建体，所述尾丝含有衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合型Z结构域(ZIgG)(NilssonB.，Prot.Eng.1：，107-13，(1987))[SEQ.ID.NO.：14]或利用噬菌体展示技术选出的Z结构域衍生型IgA-特异性亲和体(ZIgA)(Gunneriusson E.等，App.Env.Micro.，65：4134-40，(1999))[SEQ.ID.NO.：15]。
使用以下质粒作为模板，用引物503和504经PCR扩增编码每种亲和半分子的基因：用于Z结构域构建体的pEZZmpl8(Tang等，同上)和用于ZIgA构建体的pKN1-dZIgA(Clackson等，同上)。
在PCR扩增中，在两种不同亲和配体的基因中的适当读框内提供了上游ClaI位点和下游XhoI位点，以便随后连接至上述尾丝基因A7 EGF，导致分别获得编码重组尾丝A7 ZIgG[SEQ.ID.NO.：16]和A7 ZIgA[SEQ.ID.NO.：17]的构建体，它们可用于随后在Ad基因组中拯救(见下文)，从而产生携带新结合特异性的重组病毒。另外，通过将修饰的ZigG连接至上述尾丝A1 EGF中，构建了尾丝A1 ZIgG(也参见图1)。
还装配了第三种基因构建体，它编码含有上述两种亲和结构域的尾丝。该构建体编码的尾丝含有尾丝尾部，前7个茎区重复单元，NRP序列，葡萄球菌蛋白A接头，结合IgG的Z结构域，来自NRP的8氨基酸接头(KKVELFPN)，后面是结合IgA的亲和体。为了构建这种尾丝，首先将两种不同亲和结构域用引物550和551经SOE连接在一起，使其具有与编码接头序列KKVELFPN的核苷酸序列互补的突出端。在该PCR中，利用所述引物引入上游ClaI位点和下游XhoI位点，以便与含有尾丝A7 EGF基因构建体的载体pGEX-4T-3连接，得到尾丝A7 ZIgG/ZIgA[SEQ.ID.NO.：18]。
还装配了另一种基因构建体，它编码含有两个相连的ZigG结构域的尾丝。该基因编码尾丝A7 ZIgG/ZIgG[SEQ.ID.NO.：19]，用装配A7 ZIgG/ZIgA的方式进行装配，不同的是在PCR反应中使用ZIgG基因而非ZIgA。
构建体和构建途径的图示参见图1和2。
实施例5：
结合研究
将编码重组尾丝的基因克隆至载体pcDNA(其靶向表达在胞质溶胶中的蛋白)和pSecTag(其靶向表达为分泌产物的蛋白)，并用Lipofectamin(LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD，USA)按照厂家建议转染至COS7细胞中，所述两种载体都来自Invitrogen BV，Groningen，荷兰。
重组尾丝的表达和细胞定位用以下第一试剂通过免疫染色来评估：
第一试剂：
小鼠单克隆抗体4D2.5(抗-Ad5尾丝)(Dr Geoffrey Engler惠赠，University of Birmingham，Alabama，USA)(Shin Hong等，Virology 185：758-767，(1991))。
小鼠单克隆抗体2A6.36(抗-三聚体Ad5尾丝)(Dr Geoffrey Engler惠赠，University of Birmingham，Alabama，USA)(Shin Hong等，同上)。
抗表皮生长因子(EGF)的小鼠单克隆抗体＝a-EGF(Cambio，Cambridge，UK，Cat no CA 954)。
生物素化的抗单克隆抗体C242的小鼠单克隆抗独特型抗体＝a-Id C242(Lindholm等，未发表的结果)。
生物素化的抗单克隆抗体G250的小鼠单克隆抗独特型抗体＝a-Id C250(Reinder Bolhuis惠赠，Daniel Den Hoed Cancer Center，Rotterdam，荷兰)。
用于评估亲和体活性的人的多克隆IgG和IgA＝HIgG(Sigma-AldrichFine Chemicals，Cat no 14506)和HIgA(Sigma-Aldrich Fine Chemicals，Cat noI1010)。
第二试剂：
用于鉴定小鼠抗体：FITC标记的F(ab)2兔抗小鼠免疫球蛋白(DAKOA/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0313)＝aMIg。
用于鉴定人的IgG：FITC标记的F(ab)2兔抗人IgG(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0315)＝aHIgG。
用于鉴定人的IgA：FITC标记的F(ab)2兔抗人IgA(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0316)＝aHIgA。
用于鉴定生物素化抗体：FITC标记的链亲和素(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0422)。
简言之，在Shandon Cytosin2细胞离心机(cytocentrifuge)中将细胞离心至显微镜载玻片上，室温风干过夜，用3％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液pH7.4(PBS)固定，所述缓冲液已用0.1％Triton-X100的PBS透化处理。在PBS中洗涤后，将制品与第一试剂于37℃潮湿小室中温育30分钟，在PBS中再进行洗涤，然后与第二试剂于37℃潮湿小室中温育30分钟。在PBS中洗涤后，将制品浸没在(mount)含有50％甘油的PBS中，用配备了适于FITC的光源和滤片的Zeiss Axophot显微镜进行观察。
结果示于下表2和3。显而易见的是，所有不同配体当其相应尾丝以分泌产物的形式表达时都显示相应的结合。但是，当尾丝表达在胞质溶胶中并随后转运至核时，仅有亲和体显示预期的正确结合。因此，不是所有配体能在胞质溶胶和核内正确折叠。有趣的是，能经受胞质溶胶和核内环境的配体(亲和体)都是不依赖S-S桥维持其构象的小α-螺旋结构，而显示在胞质溶胶/核内不能正确表达的配体都具有依靠S-S桥维持的构象，而这种S-S桥在胞质溶胶中很弱或根本无法形成。
表2：靶向COS细胞中的分泌的重组腺病毒尾丝的表达和功能性配体结合
检测试剂尾丝            4D2+    2A6+    a-EGF+    a-MIg    a-Id+    HigG+    HigA+
            aMIg    aMIg    aMIg               aMIg     aHIgG    aHIgAWT              +       +       ND        ND       ND       ND       NDA7 EGF          +       +       +         ND       ND       ND       NDA7 G250         +       +       ND        +        +        ND       NDA7 C242         +       +       ND        +        +        ND       NDA1 ZIgG         +       ND      ND        ND       ND       +        -A7 ZIgG         +       ND      ND        ND       ND       +        -A7 ZIgG/ZIgG    +       ND      ND        ND       ND       +        -A7 ZIgA         +       ND      ND        ND       ND       -        +A7 ZIgG/ZIgA    +       ND      ND        ND       ND       +        +
表3：天然型和选定的重组型尾丝靶向胞质溶胶中的表达后，在COS细胞的核内的表达和配体结合功能。
检测试剂尾丝             4D2+    2A6+    a-EGF+    a-MIg    a-Id+    HigG+    HigA+
             aMIg    aMIg    aMIg               aMIga    aHIgG    aHIgAWT               +       +       ND        ND       ND       ND       NDA7 EGF           +       +       -         ND       ND       ND       NDA7 G250          +       +       ND        +        -        ND       NDA7 C242          +       +       ND        +        -        ND       NDA1 ZIgG          +       ND      ND        ND       ND       +        -A7 ZIgG          +       +       ND        ND       ND       +        -A7 ZIgG/ZIgG     +       ND      ND        ND       ND       +        -A7 ZIgA          +       +       ND        ND       ND       -        +A7 ZIgG/ZIgA     +       ND      ND        ND       ND       +        +A7 ZIgGxa顶球    +       ND      ND        ND       ND       +        -
上述结果明显暗示了用于人类基因治疗的再靶向(re-targeted)病毒(即腺病毒)的构建，其中含有新的细胞结合配体的病毒结构成分在哺乳动物细胞胞质溶胶中合成。以下两个实施例明示如何构建这种再靶向病毒。
实施例6：
移植CDR环
单克隆抗体的某些单链构建体即使在哺乳动物细胞的胞质溶胶中也能保留它们的结合特异性(Cattaneo等，TIBTECH 17：115-121，(1999))。这就是所谓的抗体可变区之框架区的功能。已知结合抗原的CDR环可以通过重组DNA技术从一种抗体转移至另一抗体，所得抗体具有来自一种抗体的框架特性和来自另一抗体的结合特性(方法参见Emery等，Strategies forHumanizing Antibodies，in Antibody Engineering，Carl A.K.Borrebaeck，(ed.)，Oxford University Press 1995，page 159)。
这种环-移植型单链抗体，基于能在胞质溶胶中折叠、并随后转运至细胞核的可变区框架，所得抗体随后可提供基因水平的适当克隆位点，与编码尾丝A7 RGD的基因连接，在腺病毒基因组中拯救，见下述(实施例7)。
实施例7：
在腺病毒基因组中拯救重组尾丝
将Ad基因组中编码的野生型尾丝通过本项目中开发的以下方法取代为重组尾丝。在所述方法中，用质粒pTG3602中的野生型Ad5基因组(Emery等，同上)作为编码重组尾丝的基因的受体。该质粒含有完整的野生型Ad5基因组，它与质粒骨架通过Pac1接头相连。由于该Ad基因组中缺乏Pac1位点，因此用Pac1切割后，回收的基因组是线性DNA片段。然后可用所得线性Ad DNA转染易感细胞，产生病毒(Chartier等，同上)。也可以用Pac1和Spe1酶将该质粒上的所述Ad基因组切割为两种片段：27kb和9kb。将9kb片段克隆至pBluescript中。该9kb片段含有所述尾丝，可从中再克隆出一段含有所述尾丝基因的3kb Sac1-Kpn1片段。该尾丝基因缺失尾丝尾部的Nde1位点和紧接该尾丝基因下游的Mun1位点之间的片段，并在Nde1和Mun1位点之间引入了含有Xho1位点的衔接子及下游序列，从而获得一种尾丝穿梭载体。已将数种重组尾丝连接在该穿梭载体的Nde1和Xho1之间，然后通过在大肠杆菌中的同源重组而拯救至上述9kb片段中(Chartier等，同上)。这意味着，完整保留了调节尾丝表达所需的所有正常元件。
最后，通过粘粒克隆法将多种重组9kb片段分别与27kb片段连接，以便重新产生完整的Ad基因组。
所述27kb片段也可以衍生自另一种腺病毒基因组，如He等人所述的Ad-YFG(He T-C，Zhou S，DaCosta LT，Yu J，Kinzler KW and Vogelstein B：Asimplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci，USA，95：2509-2514，1998)。如果该27kb片段衍生自pTG3602，所得基因组将为WT E1+；如果该27kb片段衍生自Ad-YFG，将产生E1缺陷型病毒，它们需要，例如，低传代数的293来进行复制。
用上述方法获得的重组Ad基因组可用Pac1切割成线性片段，用于转染容许细胞系，当该基因组具有功能时，可产生病毒空斑。可以用FuGENE6转染试剂(Roche)进行这些转染。
可以将各种重组尾丝拯救至Ad基因组，并随后转染至容许细胞中。结果见表4。这些尾丝中，仅有那些含有WT顶球的尾丝和亲和体A7 ZIgG/IgG能产生功能性病毒体。这些结果与表2和3所示完全一致。
表4：将重组尾丝拯救至病毒体中
尾丝              转染的细胞      出现病毒空斑
A7 WT顶球         293             有
A7 EGF            A549            无
A7 C242           Colo 205        无
A7 G250           A75             无
A7 ZIgG/ZIgG      293/Fc*        有
(*)293/Fc是用来自人类IgG、表达为膜蛋白的Fc3(1)稳定转染的293细胞。为了产生293/Fc，从与Z区反应的人类IgG克隆Fc3(1)(Jendeberg，L.，Nilsson，P.，Larsson，A.，Nilsson，B.，Uhlen，M.和Nygren，P.-A(1997)“Engineering of Fcl and Fc3 from human immunoglobulin G to analysesubclass specificity for staphylococcal protein A”J.Imm.Methods 201，25-34.)，将其连接至载体pDisplay(Invitrogen)中，与该载体中的PDGFR跨膜区序列同在一个读框。利用限制酶SfiI和NotI将与PDGFR跨膜区序列融合的含有该Fc序列的编码序列从该载体中切割下来，连接至也用相同酶切割的载体pSecTag(其携有Zeocin抗性基因)。将重新构建的载体用FuGENE转染低传代数的293细胞，用Zeocin选出稳定转染的细胞。分离克隆，用FITC标记的葡萄球菌蛋白A(Sigma)检验膜结合型Fc3(1)的膜表达。用一个均匀表达膜结合型Fc的293克隆转染含有基因组的A7 ZIgG/ZIgG，以便产生病毒体。
实施例8：
装配编码重组腺病毒尾丝的基因构建体，所述尾丝带有亲和体和可切 割的野生型顶球
可切割的尾丝包含带有外部配体(这里是亲和体)的非天然多肽，并且在其C-末端有野生型顶球，用位于细胞结合结构之间的活化因子X位点来构建，使得可以将所述顶球切割下来，从而暴露亲和体。这允许病毒在293细胞中产生，随后，将顶球通过蛋白裂解作用去除后，通过亲和体识别并感染新的靶细胞。
为了构建用于连接不同配体的可切割型尾丝的基因，用上游引物(437)和下游引物149对WT尾丝进行PCR，所述上游引物在重复单元22的前7个三联体之前引入Cla1，Mun1和因子Xa识别位点，下游引物对应于尾丝顶球的末端。克隆并用Cla1和Xho1消化后，将DNA片段克隆至上述A7尾丝构建体中。所得尾丝基因从N-末端开始，依次包含：尾部序列，前7个茎区重复单元，NRP三聚体化信号，来自葡萄球菌蛋白A的接头，Cla1位点，Mun1位点，Xa切割位点，重复单元22和野生型顶球。为了连接成该尾丝基因，用引物503和505经PCR产生亲和体ZIgG，其带有上游Cla1位点和下游Mun1位点，将其连接至上述“Xa尾丝”基因。所得尾丝基因从N-末端开始，依次包含：尾部序列，前7个茎区重复单元，NRP三聚体化信号，来自葡萄球菌蛋白A的接头，Cla1位点，新接头，Mun1位点，Xa切割位点，重复单元22和野生型顶球。
将尾丝基因拯救至腺病毒基因组(见实施例7)。用重组基因组转染293细胞，产生病毒体，在CsC1梯度上纯化。纯化的病毒体用活化的因子X(Xa)(Sigma)在50mM Tris-Cl pH8.0；100mM NaCl；5mM CaCl2中室温切割48小时。5uL病毒悬液使用1UXa。
ZIgG亲和体与病毒体结合的试验基本如下所述。将病毒悬液印迹至PVDF膜(BioRad)。膜用3％明胶的Tris缓冲盐水，pH7.4(TBS)封闭后，与FC 10ug/mL在1％明胶的TBS溶液中室温温育90分钟，洗涤，与抗-人IgG-HRP(Dakopatts)在TBS/1％明胶中室温温育90分钟，洗涤，用4-氯萘酚试剂(BioRad)显色。对WT病毒和重组病毒以及不同对照的染色结果见图3。显然，重组病毒与结合WT Z的Fc3(1)结合，而不结合WT Z的Fc3(Jendeberg，L.，Nilsson，P.，Larsson，A.，Nilsson，B.，Uhlen，M.和Nygren，P.-A.(1997)“Engineering of Fcl and Fc3 from human immunoglobulin G to analysesubclass specificity for staphylococcal protein A”J.Imm.Methods 201，25-34)不能结合重组病毒。WT病毒不与任何一种Fc制剂结合。
实施例9：
分析非天然多肽的功能性构象和结合特异性
通过将相应编码序列插入适当的构建体，可以将候选多肽表达为病毒成分蛋白的组成部分。所述构建体包含完整病毒基因组，其中一或多个成分已被相应的重组成分基因取代，该构建体可以在适于所述重组病毒基因组所编码的重组病毒繁殖的细胞系中表达。根据重组基因组中是否保留结合WT细胞的功能，有两种主要的可能性。
如果保留了结合WT细胞的功能，病毒可以在正常能产生该病毒的细胞系(producer line)中产生，如对于腺病毒而言的293细胞。非天然多肽表达为允许其结合胞外配体并作为功能性病毒体的一部分的能力，可以通过对病毒体的结合研究来分析。该方法实例如以上实施例8中所用策略，其中病毒尾丝既含有WT顶球也含有非天然的结合配体，并且所述顶球可以通过蛋白裂解作用去除。非天然多肽的结合功能通过标准固相免疫技术来证实。另一种策略是产生带有WT尾丝以及重组尾丝的病毒体，后者含有非天然多肽以代替天然顶球。
如果结合WT细胞的功能已从病毒基因组中删除，病毒体将依赖于非天然多肽来与细胞结合。因此，所述细胞系必需能允许重组病毒进入，必要时，还能提供重组病毒所缺的遗传信息，例如E1的序列。如果所述重组基因组为E1缺陷型，一种解决方法是，使用E1转染的细胞系如293，并用能结合该重组病毒基因组所编码的非天然多肽的受体稳定转染这些细胞。所述非天然多肽表达为允许其与相应受体结构结合并成为功能性病毒体的一部分的能力，可以通过筛选该病毒基因组所转染过的细胞的空斑形成来分析。该策略实例如上述实施例7，其中使用稳定表达来自人类IgG膜结合型Fc的293来产生病毒，所述病毒中WT结合功能已被亲和体ZIgG替代。非天然多肽的确切结合特性可以进一步在以下研究中测定：使病毒与结构上相关于负责细胞结合的非天然多肽的多肽，对结合进行竞争。
实施例10：
抗β-半乳糖苷酶单链Fv片段
在续接实施例3的实验中，将一种单链可变区片段(VK，接头，VH)克隆至上述A7尾丝构建体中，该片段能与β-半乳糖苷酶反应，并能表达在细胞质中(Martineau P和Betton J-M：J.Mol.Biol.292，921-929(1999))。该单链片段是[SEQ.ID.NO.：47)。为了能克隆至上述A7尾丝构建体中，可以用Nco1/EcoR1从质粒pPM163R4(Martineau P and Betton J-M同上)中切出该片段，连接至含有上述尾丝R7 EGF的质粒中，后一质粒提供了Cla1-Nco1-EcoR1-Xho1衔接子，可用于将单链片段连接在同一读框中。
在续接实施例5的实验中，含有可与β-半乳糖苷酶反应的单链可变区片段(VK，接头，VH)的重组尾丝，用以下额外的第一试剂：β-半乳糖苷酶-生物素(SIGMA，G 5025)，通过免疫染色来评估其表达和细胞定位。
除了表2所示结果，抗β-半乳糖苷酶单链Fv片段尾丝构建体的同等实验的结果见表5：
表5：靶向COS细胞中分泌的重组腺病毒尾丝的表达和功能性配体结合
尾丝               4D2+aMIg      2A6+aMIg   β-半乳糖苷酶+StrAv-FITC
R7a-β-半乳糖苷酶  +             +          +
除了表3所示结果，抗β-半乳糖苷酶单链Fv片段尾丝构建体的同等实验的结果见表6：
表6：天然的以及选定的重组尾丝靶向胞质溶胶中的表达后，在COS细胞核中的表达和功能性配体结合
尾丝               4D2+aMIg     2A6+aMIg    β-半乳糖苷酶+StrAv-FITC
R7a-β-半乳糖苷酶  +            +           +
实施例11：
尾丝蛋白的表型分析
以下是本发明的修饰病毒的另一实例，其中在修饰的腺病毒尾丝蛋白中引入了复合多肽配体。该实例证实了产生再-靶向的可变和功能性Ad载体的重要性，所述载体具有两个特点：(i)尾丝结构的修饰应该仍然允许该病毒有效附着并进入细胞，和(ii)插入该尾丝的配体应该能在哺乳动物细胞质中正确折叠。可以方便地使用可溶性来评估正确折叠，它通常与缺乏二硫键有关。优选本文所述非天然多肽具有的二硫键不超过2个，通常不超过1个，最优选不含二硫键。
材料和方法
细胞。HEK-293细胞得自Microbix Inc.(Toronto，Ontario，Canada)。Cos7，A431和Colo205细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，Virginia)，A75和G43得自Reinder Bolhuis(Daniel Den Hoed Cancer Center，Rotterdam，The Netherlands)。所有细胞在37℃和5％CO2的条件下，在添加了10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)和50mg/ml庆大霉素(Gibco BRL)的Iscove′s培养基(Gibco BRL)中维持。草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞(ATCC)培养在28℃的有上述相同添加剂的TC 100培养基(Gibco BRL)中。
抗体。抗表皮生长因子(EGF)的单克隆抗体(mAb)购自Cambio Ltd.(Cambridge，UK)。抗单链T-细胞受体(scTCR)的Vα和Vβ结构域的抗体，以及抗mAb G250的抗-独特型抗体(NUH31和NUH84)由Reinder Bolhuis惠赠。抗尾丝尾部的MAb(4D2.5)，及抗尾丝三聚体的mAb(2A6.36)得自JeffEngler(University of Alabama at Birmingham，AL)。抗尾丝顶球的CAR-封闭型mAb 1D6.14由Buck Rogers(UAB，Birmingham，AL)提供。特异于O-连接的GlcNAc残基的单克隆抗体RL2通过Jeff Engler得自Larry Gerace。抗mAb C242的生物素化抗-独特型抗体(Id1，Id13和Id20)从原始杂交瘤产生。辣根过氧化物酶(HRP)-标记的链亲和素，异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的兔抗-小鼠免疫球蛋白G和链亲和素-FITC购自DAKO(Glostrup，DK)。
重组无顶球的尾丝的制备和命名。重组尾丝基因用基于连接、PCR、以及经由重叠延伸而进行的剪接(SOE)的方法来构建。PCR所得序列在亚克隆之前进行测序。编码Ad5 WT尾丝的基因用正向引物(SEQ ID NO：48)5′-CTC GGA TCC GAT GAA GCG CGC AAG ACC GTC TGA A-3′和反向引物(SEQ ID NO：49)5′-TTC CTC GAG TTA TTC TTG GGC AAT GTA TGA-3′经PCR得自pAB26(Microbix，Toronto，Canada)，所用引物在上游引入Bam HI位点，在下游引入XhoI位点。重组尾丝中的顶球区已被衍生自人肺表面活性蛋白D颈区肽(NRP)的36个氨基酸(aa)的外来三聚体化基元替代。将后接葡萄球菌蛋白A之接头序列(Staph-A接头：AKKLNDAQAPKSD)的NRP序列(PDVASLRQQVAELQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPNG)(SEQ ID NO：2)，连接至具有不同长度(1，7或22重复单元)的尾丝茎区的C-末端。
将所得构建体分别命名为R1，R7和R22。在Staph-A接头的C-末端添加再-靶向配体。为了便于克隆各种配体，在接头序列之后引入ClaI和XhoI位点。下述所有配体都带有这些限制性位点，配体的名称表示在尾丝名称中茎区重复单元数目之后。例如，R1-RGD，R7-EGF等(图4)。R7-顶球表示截短型尾丝茎区(重复单元1-7)，它含有NRP，Staph-A接头和天然顶球区，包括最后一个茎区重复单元以及茎区-顶球连接部位(图4)。在两种R7-顶球尾丝构建体中，在NRP的N-末端侧NheI位点插入额外的接头。这些接头来自Ad5 WT尾丝茎区重复单元17(L17：TTTACAGCTTCAAACAATTCCAAAAAGCTTGAG)和尾丝茎区重复单元22(L22 GGAAACAAAAATAATGATAAGCTAACTTTGTGTGACC)，将它们分别命名为R7-L17-顶球和R7-L22-顶球。尾丝图示见图4。
靶向配体。多肽配体。含有RGD或ACDCRGDCFCG(缩写为RGD4C)基元的双链DNA片段合成为带有单链末端衔接子的互补寡核苷酸，使它们退火在一起。含有茎区重复单元22的片段，茎区-顶球连接部位以及完整顶球通过PCR从WT Ad5尾丝基因获得。合成、克隆并经测序检验人EGF的DNA序列。特异于Magel/HLA A1的克隆化单链T-细胞受体(含二硫键)得自Reinder Bolhuis。所用scTCR具有Vα-接头-VβCβ形式。
单克隆抗体。使用了两种mAb单链片段(scFv)。第一种scFv由mAbG250的κ链可变区(或VK)，间隔接头，重链可变区(或VH)，连接序列(JS)和重链恒定区2(或CH2)组成。MAb G250显示对人肾癌细胞的表面抗原具有高度特异性。
亲和体。第二种scFv含有相同的基本结构VK-接头-JS-VH，并衍生自mAb C242，该抗体与结直肠癌和胰腺癌反应。但是，为了获得对所设计的靶细胞更好的选择性，用产生mAb的杂交瘤细胞的cDNA作为原始模板，通过SOE制备了C242 scFv-衍生的亲和体库。在VK和VH区之间插入了一段18个氨基酸的肽配体(SNN)18，其中S是dA，dG或dC，N是dA，dG，dC或dT。通过在结直肠癌细胞Colo205上进行的噬菌体展示而筛选亲和体，将序列PPDFVPPAASFPDHSPRG鉴定为肽配体。然后，根据C242 scFv VK-(PPDFVPPAASFPDHSPRG)-VH的抗原结合能力，选择它进行下一步工作。
尾丝的细胞表达和定位以及配体反应性。将编码重组尾丝的基因克隆至载体pcDNA3.1和pSecTag2(Invitrogen BV，Groningen，Germany)中，以便分别进行细胞内表达和细胞外释放。用Lipofectamin(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD，USA)按照厂家建议将所述载体转染至Cos7中。如下通过免疫染色评估具有新的细胞结合配体的尾丝的表达、核转运和功能性表达。将细胞在Shandon Cytospin2细胞离心机中离心至显微镜载玻片上，并室温风干过夜。将制剂在3％多聚甲醛的PBS中固定，用0.1％Triton-X100的PBS进行透化处理。在PBS中洗涤后，将制剂与第一抗体(抗-尾丝mAb，或抗-配体mAb)于37℃潮湿小室中温育30分钟，再在PBS中洗涤，与FITC标记的第二抗体于37℃潮湿小室中温育30分钟。在PBS中洗涤后，将制剂浸没在含有50％甘油的PBS中，在配备了相应光源和针对的FITC滤片的Zeiss Axioskop显微镜下观察。
尾丝蛋白的表型分析。将重组尾丝蛋白表达在用重组杆状病毒感染的昆虫细胞中，根据4个标准进行分析：(i)可溶性，(ii)三聚体化作用，(iii)糖基化作用，和(iv)与重组五邻体基座体内装配，形成五邻体壳粒。
(i)为了对可溶性和不溶性重组尾丝级分进行免疫定量，将Sf9在0℃的低渗缓冲液(10mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.5)中裂解，将细胞裂解物调整为等渗条件(150mM NaCl在10mM Tris-HCl中，pH7.5)，15,000xg离心10min。然后用抗-尾部的4D2.5mAb作为第一抗体、用[35S]SRL-标记的抗-小鼠IgG作为第二抗体(Amersham Pharmacia Biotech；100μCi/ml；5μCi/印迹)通过常规SDS-PAGE和免疫印迹分析上清和沉淀。(ii)尾丝的寡聚化状态借助非变性SDS-PAGE(称为NDS-PAGE)和常规的变性SDS-PAGE分析。NDS-PAGE区别于SDS-PAGE之处在于，电泳前，未将样品置于SDS样品缓冲液中煮沸变性。(iii)重组尾丝的糖基化可通过在印迹上与单克隆抗体RL2的免疫反应来评估，也可以用DIG Glycan检测试剂盒(Roche)进行化学检测。(iv)带有五邻体基座的尾丝的装配通过用两种重组AcNPV共转染相同的Sf9细胞来评估，所述AcNPV之一表达五邻体基座，另一表达尾丝蛋白。
于感染后40小时的细胞裂解物中检测五邻体壳粒的存在，并通过天然条件下、低电压、冷却过夜的PAGE分析。天然五邻体、五邻体基座和尾丝蛋白的免疫定量如上所述进行，使用相应的第一抗体(抗-五邻体基座或抗-尾丝)，随后用[35S]SRL-标记的抗-小鼠或抗-兔完整IgG的第二抗体。将印迹暴露于放射性胶片(Hyperfilm beta-max，Amersham Pharmacia Biotech)在610nm，用自动显象密度计(REP-EDC，Helena Laboratories，Beaumont，TX)对放射自显影图进行扫描。或者，将蛋白带从印迹上切下来，于闪烁计数器(Beckman LS-6500)中测量放射活性。
在病毒体中拯救重组修饰性尾丝。如上所述在Ad5基因组中拯救重组尾丝。简言之，用Spe I和Pac I消化pTG3602产生来自于Ad5基因组的9kb-片段，该片段跨作图单位(mu)75.4-100并包含WT尾丝基因。质粒pTG3602包含以两个Pac I位点为界的完整WT Ad5基因组。然后将此75.4-100mu-片段克隆至pBluescript II SK(-)(Stratagene)，在其MCS中添加PacI位点后，得到质粒pGAG9。将pGAG9的Sac I-Kpn I 3kb-片段亚克隆至pBluescript IISK(-)。在该3kb-片段中于Nde I位点(位于Ad5尾丝的尾部区域中)下游创建一个大的缺失，所缺失的序列被含有Xho I位点的接头取代。将所得质粒pGAG3(它能接收我们的所有尾丝基因构建体)插入Nde I和Xho I位点之间。利用在大肠杆菌BJ5183中的同源重组，将插入pGAG3的重组尾丝再引入已用Nhe I消化的pGAG9中。然后，将所得pGAG9用Spe I和Pac I从该载体上切下来，通过粘粒克隆法连接至分离的代表Ad5基因组的左侧节段的27kb-片段(0-75.5mu)(SuperCos lCosmid Vector Kit和Gigapack III GoldPackagingExtract，Stratagene)。粘粒克隆中正确的重组尾丝的存在，通过PCR以及用Spe I和Hind III进行的限制性分析来验证。
为了产生病毒，将重组粘粒基因组用Pac I进行限制性处理，然后分离，转染至表达受体的细胞，所述受体对应于插入了尾丝的配体。在标准转染反应中，根据厂家建议，每个35-mm的孔中添加2μg DNA和3μl FUGEN(Roche)。用携带尾丝基因的Ad5基因组转染293细胞，所述尾丝基因含有RGD基元或WT尾丝顶球作为配体。在带有其它配体的尾丝的情况中，用带有EGF配体的Ad5基因组转染A549细胞，用scFv-C242转染Colo 205细胞，用scFv-G250转染A75细胞，用特异于Magel/HLA A1的scTCR转染G43细胞。同时进行了至少3种不同的转染，每种使用一个6孔板。用显微镜观察转染细胞培养物，从而确定空斑率。使用特异于每种尾丝构建体的引物经PCR验证重组尾丝序列。
对重组尾丝和Ad5病毒体的鉴定
细胞表达。为了评估尾丝的表达用10pfu/细胞的WT，R7-顶球和R7-RGD病毒感染293细胞。收获细胞，冻融4次，用SDS-PAGE和western印迹分析。使印迹与4D2.5反应并用HRP-标记的抗-小鼠IgG(DAKO)显示。
Ad5病毒体的尾丝含量。Ad5病毒体经CsCl纯化后，如上述用SDS-PAGE和western印迹分析它的尾丝拷贝数。将丙烯酰胺凝胶中的病毒上样量，按照对293细胞进行病毒滴定所得的感染颗粒(表示为空斑形成单位/ml；PFU/fml)进行等量标准化，按照通过蛋白分析(BioRad)测定的物理颗粒(PP)进行等量标准化。PP的数量通过对Ad5重组体进行SDS-PAGE分析和考马斯兰染色来确定，一同电泳的还有一系列牛血清白蛋白(BSA)标准品(2x crystallized，BioRad)。六邻体带的蛋白含量通过在自动密度计(REP-EDC，Helena Laboratories，Beaumont，TX)中扫描，并与BSA标准品泳带进行比较而评估。样品中Ad5 PP的数量按照每个病毒体2.91×10e-16g的质量(也就是每10e+13个病毒体2.91mg)来计算。感染指数代表了感染性颗粒相对于物理(physical)颗粒的比率。
重组Ad5的生长速率。通过在293细胞中产生空斑来测量生长速率。在标准试验中，于37℃1小时将病毒的PBS液吸附至细胞单层(4×104细胞/样品)。洗涤细胞，进一步与添加了10％FCS和50mg/ml庆大霉素的Iscove培养基于37℃温育。于感染后(pi)24，48和72h之时收获细胞，离心，溶于0.2ml PBS中，冻融4次。将上清在293细胞上滴定，将滴度表示为空斑形成单位/ml。Ad蛋白总含量用IDEATM腺病毒试剂盒(DAK0)测量。
基因转导效力。如上所述用10pfu/细胞的重组病毒感染24孔板上的293细胞。24hpi收获细胞，用冰冷却的PBS洗涤，随后在0.5％戊二醛中固定15min。在PBS中洗三次后，用FACScan cytometer中的FL1发射通道(emission channel)(Becton-Dickinson，San Jose，CA)，分析细胞的转基因GFP的表达。
对病毒衣壳中尾丝顶球的分析。病毒体中可接近的顶球的存在与否通过ELISA分析。将纯化的病毒体用50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH9.6稀释至终浓度为5×105PFU/ml。取100ml等份试样吸附至ELISA平板上，4℃过夜。将吸附在孔中的材料用0.5％戊二醛固定，然后用含有0.1％Tween-20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤，用200ml含有1％BSA的PBS封闭2h。然后在洗涤缓冲液中将孔洗3次，并于室温下与100ml浓度为1mg/ml的生物素化抗-顶球mAb 1D6.14温育1h。结合的抗体用1∶2,000稀释的HRP-链亲和素(DAKO)室温作用1h来检测。用TMB底物(CanAg Diagnostics，Goteborg，Sweden)显色，用0.12M HCl作用10min以便终止反应。在设定为450nm的微滴板读板仪上读数。
构建重组尾丝的原理
构建带有外源三聚体化基元(NRP，来自人肺表面活性蛋白D)的无顶球尾丝，它们具有不同数量的茎区重复单元和不同的配体结构。从结构和功能的角度看，这些尾丝构建体的三种组成型元件应该是：(i)尾丝支架，(ii)弹性接头，和(iii)细胞配体。
尾丝支架。尾丝根据其茎区重复单元的数目以及配体来命名。例如，R7-EGF含有尾丝尾部，7个N-末端茎区重复单元，NRP基元，以C-末端EGF肽作为细胞配体。R1-RGD尾丝仅含有1个(第1个)茎区重复单元，以RGD为配体。在三种可能的茎区长度，即短单元(1个重复)、中长单元(7个重复)和长单元(22个重复)中，选择带有7个重复单元的中等大小尾丝作为进一步构建并研究不同配体的支架。基于以下原因，对R7的选择是基于：它作为重组蛋白具有高溶解度，能保留尾丝的绝大部分生物学功能，并能产生Ad5/FibR7病毒后代。用R1-RGD，R7-RGD和R22-RGD尾丝研究了不同长度的尾丝茎区的相对优势，这三种构建体都携带相同的细胞配体RGD。
接头。为了评估尾丝茎区中额外的接头的可能优势，构建了两种R7-NRP-顶球尾丝，它们在茎区和NRP基元之间插入了一个额外的肽接头。据此检验了两种衍生自病毒的接头，Ad5茎区重复单元17(L17)和Ad5茎区重复单元22(L22)。所得重组尾丝分别命名为R7-L17-顶球和R7-L22-顶球。
细胞配体。检验了数种配体并比较了它们的功能。这些配体被设计成能将Ad5载体再靶向分布广泛的细胞表面分子，如整联蛋白或HLA分子，或再靶向分布不那么广泛的分子，如恶性细胞特异性决定簇。它们在大小和复杂性方面各不相同，从单个三肽基元(如RGD)到较复杂的结构(如scTR或scFv，它们由多个需要正确折叠的多肽结构域组成)。
尾丝和配体在哺乳动物细胞中的表达。首先，用质粒转染的Cos7细胞作为哺乳动物细胞，使重组尾丝在其中瞬时表达。重组尾丝由两种不同载体表达，一种被设计为在细胞内表达重组蛋白，另一种被设计为经由分泌途径使重组蛋白释放至细胞外。分析细胞中的尾丝表达水平、细胞定位及其配体的功能。所检验的所有不同尾丝，当以分泌蛋白的形式收获时，均表现出与相应配体的明显结合。至于由细胞内表达载体合成的尾丝，在除了R7-L22-顶球以外的所有情况中都观察到核定位。这暗示，修饰的尾丝象WT Ad5尾丝一样有效地发生了胞质转运和跨核孔过程。
但是，没有一种与尾丝融合的外源配体显示出预期的结合活性。可以在核内检测到细胞内表达的R7-scTCR尾丝，并可以用识别不依赖Va区构象的表位的抗-Va mAb对其染色，但用另一种依赖于构象的抗Vb区mAb检测不到染色。为了检测尾丝结构域对细胞内配体反应性的可能的不利影响，还从载体pcDNA表达了我们的配体，为另外的构建体。非融合的细胞内配体与它们的特异性mAb之间未检测到结合，表明游离的或与尾丝融合的配体有相似的行为。
被设计为分泌的以及被设计为胞质表达的尾丝-配体融合体之间存在结合能力的较大差异。这提示，被设计为经历分泌途径的尾丝-配体融合蛋白发生了正确折叠，表现出正确构象。这并不暗示，所有的细胞内尾丝-配体融合蛋白都不能正确折叠，因为细胞环境似乎也在该过程中起作用。在Cos7和Sf9细胞中，可以检测到尾丝-配体融合蛋白的折叠模式和反应性有显著性差异。对于R7-L22-顶球的尾丝顶球结构域，R7-EGF的EGF配体，以及R7-G250(显示出在Sf9细胞中具有一定的反应性，但在Cos7细胞中没有反应性)的scFV配体而言，情况便是如此。
昆虫细胞中表达的重组尾丝的表型。为了进一步分析带有配体的尾丝的特性，将我们的不同构建体在杆状病毒-昆虫细胞系统中表达为重组蛋白，并分析了在Sf9细胞中，蛋白质的可溶性、三聚体化、糖基化以及通过与五邻体基座发生体内装配形成五邻体的情况。
蛋白的可溶性和构象。重组蛋白的可溶性提出被认为可以很好地指示它们的正确折叠。我们因此检测了我们的所有重组尾丝蛋白在昆虫细胞中的总表达，并确定了回收在细胞裂解物的可溶性级分中的比例。所有所述尾丝重组体都在Sf9细胞中高水平表达，其水平与WT Ad5尾丝类似，但它们相互间的可溶性程度有显著差异。我们估计，当可溶性级分含有所表达的尾丝总量的50％上时，尾丝具有类似于WT的可溶性并因此能正确折叠。当尾丝的可溶性级分占总量的不足20％时，可以认为它错误折叠。根据这些标准，WT、R7-顶球、R7-L17-顶球、R7-L22-顶球、R1-RGD，R7-RGD和R7-RGD4C尾丝主要回收在可溶性级分中(60-95％可溶性)。相比之下，仅22％的R22-RGD和不到15％的R7-EGF，R7-C242及R7-scTCR尾丝被发现可溶，证实它们的、通过不能与其相应mAb反应而提示的非正确折叠。可溶性最差的尾丝构建体是R7-G250，其有95％回收在不溶性级分中(参见图5和以下表7)。
表7.对杆状病毒感染的Sf9细胞中表达重组尾丝的表型鉴定(a)
                     三聚体化(b)尾丝         糖基化  NDS-PAGE    IF    与五邻体基   可溶性
                                    座装配(c)  (d)(％)WT             +         +       +         +         60R7-顶球        +         +       +         +         72R7-L17-顶球    +         +       +         +         70R7-L22-顶球    +         +       +         +         75R1-RGD         -         -       +         +         89R7-RGD         -         +       +         +         94R22-RGD        -         +       +         +         22R7-RGD4C       +         +       +         +         78R7-EGF         -         ND(e)   +         ND        13R7-C242        -         ND      -         ND        11R7-G250        -         ND      -         ND        5R7-scTCR       -         ND      +         ND        12
(a)杆状病毒感染48小时后收获Sf9细胞，分析重组尾丝的不同生物学功能，可溶性，O-GlcNAc糖基化，三聚体化，以及五邻体壳粒的形成。
(b)测定尾丝的三聚体化状态，方法是体外不经热变性而使得Sf9细胞的裂解物在SDS-凝胶中电泳(NDS-PAGE)，以及用抗-三聚体mAb(2A6.36)对已被固定的细胞进行原位免疫荧光染色。
(c)尾丝与五邻体基座装配而形成五邻体壳粒的能力，通过用两种不同的重组杆状病毒共转染相同的Sf9细胞来分析，所述重组病毒，一种表达Ad尾丝，另一种表达Ad五邻体基座。共感染48h后，分析Sf9细胞裂解物中五邻体(基座+尾丝)的出现，方法是使天然蛋白在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(Karayan等，1994)。
(d)分析单个被杆状病毒感染的Sf9细胞中的可溶性。将感染48h后收获的细胞在等渗缓冲液中裂解，将细胞裂解物分成两个等份。其一于10,000xg离心10min并保留上清，另一作为全细胞裂解物来分析。两等份均在100℃的SDS-样品缓冲液中变性，在变性的SDS-凝胶中电泳，并印迹。使印迹与抗-尾丝-尾部的mAb 4D2.5、放射性标记的第二抗体反应，如图5所示。免疫印迹通过放射性自显影扫描来定量，结果表示为可溶性尾丝相对于总尾丝含量的百分比。取三次测定的平均值，SD取报道值均值(mean)的15％以内。
(e)ND，无法检测。
三聚体化。不同尾丝自我装配成三聚体的能力，通过在体外对细胞裂解物进行NDS-PAGE电泳分析，以及对已被固定的细胞进行原位免疫荧光染色而确定。根据它们的电泳模式，R7-EGF、R7-C242、R7-G250和R7-scTCR不能形成同型三聚体，而R7-顶球、R7-L17-顶球、R7-L22-顶球、R7-RGD，R22-RGD和R7-RGD4C以WT的水平三聚体化(表7)。但是，用抗-三聚体mAb 2A6.36对细胞进行的免疫荧光染色显示，除了R7-C242和R7-G250以外的所有尾丝都形成三聚体(表7)。这种明显差异可能是由于检测方法的不同，和/或是由于R7-EGF，R7-C242，R7-G250和R7-scTCR尾丝三聚体在体外有可能变得不稳定。不管是什么原因，如果细胞内形成的尾丝三聚体效力极低，这种情况下，免疫荧光染色将更敏感，也更适于检测三聚体。
糖基化。同样的，尾丝的糖基化用RL2(特异于肽-连接的O-GlcNAc残基的mAb)经western印迹来分析。能够与之反应的尾丝构建体除了WT，还有R7-L17-顶球、R7-L22-顶球、R7-顶球、和R7-RGD4C(表7)。
与五邻体基座的装配。当用表达Ad尾丝和表达五邻体基座的两种不同杆状病毒感染Sf9细胞时，这两种蛋白能在细胞内相互作用，形成五邻体壳粒。当分析这一特性时，蛋白R7-EGF，R7-C242，R7-G250和R7-scTCR失去了它们与五邻体基座装配的能力，而其它8种重组尾丝保留了它们的装配功能(表7)。
重组尾丝基因在病毒基因组中的拯救以及病毒的生存力。将我们的重组尾丝基因再插入Ad5病毒基因组中以替代WT尾丝基因。然后通过转染将每种重组病毒基因组引入表达该重组尾丝的特有受体的相应细胞系。有活力的重组病毒的拯救通过空斑形成来评估。携带WT尾丝、以及重组尾丝R7-顶球、R7-L17-顶球、R1-RGD，R7-RGD和R7-RGD4C的Ad5基因组都观察到了空斑。
重组病毒的尾丝含量、感染力和生长速率。在尾丝三聚体化、稳定性、与五邻体基座的装配以及配体结合方面最合适的是携带7个茎区重复单元的重组R7-RGD Ad，将其选出。但这种无顶球的Ad的病毒装配和生成不如WT病毒。在本实施例中，将携带顶球结构域的Ad-R7-顶球与WT Ad和无顶球的Ad-R7-RGD进行特性比较。我们首先分析了用这三种Ad中的每一种感染293细胞，于感染后(pi)不同时间点尾丝蛋白的生成。R7-顶球Ad的尾丝蛋白的生成水平与WT Ad的相当，R7-RGD Ad的水平则低很多。
我们然后比较了R7-顶球Ad与WT Ad的每个病毒体的尾丝含量。当根据物理颗粒(PP)数进行标准化处理后，两种病毒显示出相似的尾丝含量，但是当将两种病毒样品按照感染性颗粒数(PFU)进行标准化处理后，R7-顶球Ad的尾丝蛋白相对较多。这表明，R7-顶球Ad比WT感染力小。这一点通过感染力指数(PFU∶PP)得到证实，该指数可从感染滴度(表达为PFU/ml，通过在293细胞上进行的滴定来确定)和PP浓度(通过生物化学方法确定)来计算。Ad-R7-顶球的感染力指数(1∶100-1∶200)比WT Ad5(1∶25-1∶50)低2-8倍。Ad-R7-RGD的感染力指数(1∶200-1∶500)在类似于Ad-R7-顶球的范围内。
比较Ad-R7-顶球与WT病毒的生长速率。以相同的MOI感染等份的细胞样品，通过在293细胞上进行的空斑试验测定感染性病毒后代。三种病毒的生长曲线相似，但感染性Ad R7-顶球和Ad-R7-RGD的产生次于WT。还检测了Ad-R7-顶球的病毒摄取，并评估了它将GFP报告基因转导至293细胞的能力，与携带Ad5-GFP的WT尾丝(Ad-WTFib)进行比较。结果发现，R7-顶球Ad的转导能力/PP比Ad-WTFib的低6倍。
重组病毒体的受体-结合能力。分析Ad-FibR7-顶球相对于WT病毒的受体结合能力。发现WT Ad5和Ad-FibR7-顶球病毒体在ELISA中都与抗-顶球mAb反应，表明这两种病毒体表面的顶球表位都易于被mAb接近。但WTAd的顶球免疫反应性高于Ad-FibR7-knob的。这提示，顶球由22-茎区-重复单元型尾丝携带(如在WT Ad5中)相比于由较短者(7-重复单元型尾丝)携带的情况，病毒体的细胞结合决定簇更有效和/或具有更高亲和力。
这些结果表明，所有在胞质溶胶和核中不正确折叠的配体具有高度依赖于二硫桥的形成的构象。因此，应该使用它们的缺乏二硫桥但保留了天然或修饰型表位结合的抗体或片段。
茎区部分的重复单元的数目优选至少约为7，例如6-12。野生型顶球(例如，为两种尾丝蛋白之一，其中第二种已经被修饰，以便再靶向)的存在可能有利于产生重组、有活力的Ad病毒体。
                           序列表序列表[SEQ.ID.NO.：1]-腺病毒5的尾丝蛋白的编码序列序列范围：1至1746
                 10         20         30         40         50
         atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata
         tacttcgcgc gttctggcag acttctatgg aagttggggc acataggtat
                 60         70         80         90        100
         tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg
         actgtgcctt tggccaggag gttgacacgg aaaagaatga ggagggaaac
                110        120        130        140        150
         tatcccccaa tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc
         atagggggtt acccaaagtt ctctcagggg gaccccatga gagaaacgcg
                160        170        180        190        200
         ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc atgcttgcgc tcaaaatggg
         gataggcttg gagatcaatg gaggttaccg tacgaacgcg agttttaccc
                210        220        230        240        250
         caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc caaaatgtaa
         gttgccggag agagacctgc tccggccgtt ggaatggagg gttttacatt
                260        270        280        290        300
         ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa
         ggtgacactc gggtggagag tttttttggt tcagtttgta tttggacctt
                310        320        330        340        350
         atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc
         tatagacgtg gggagtgtca atggagtctt cgggattgac accgacggcg
                360        370        380        390        400
         cgcacctcta atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggcccgcgtggagat taccagcgcc cgttgtgtga gtggtacgtt agtgtccggg
   410        420        430        440        450cgctaaccgt gcacgactcc aaacttagca ttgccaccca aggacccctcgcgattggca cgtgctgagg tttgaatcgt aacggtgggt tcctggggag
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   760        770        780        790        800atgcaactta atgtagcagg aggactaagg attgattctc aaaacagacgtacgttgaat tacatcgtcc tcctgattcc taactaagag ttttgtctgc
   810        820        830        840        850ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac caactaaatcggaatatgaa ctacaatcaa taggcaaact acgagttttg gttgatttag
   860        870        880        890        900taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggatattctgatcc tgtcccggga gaaaaatatt tgagtcgggt gttgaaccta
   910        920        930        940        950attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaataattgatgt tgtttccgga aatgaacaaa tgtcgaagtt tgttaaggtt
   960        970        980        990       1000aaagcttgag gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgctatttcgaactc caattggatt cgtgacggtt ccccaactac aaactgcgat
  1010       1020       1030       1040       1050cagccatagc cattaatgca ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaatgtcggtatcg gtaattacgt cctctacccg aacttaaacc aagtggatta
  1060       1070       1080       1090       1100gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa attggccatg gcctagaattcgtggtttgt gtttagggga gttttgtttt taaccggtac cggatcttaa
  1110       1120       1130       1140       1150tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc cttagttttgactaagtttg ttccgatacc aaggatttga tccttgaccg gaatcaaaac
  1160       1170       1180       1190       1200acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaacttgtcgtgtcc acggtaatgt catcctttgt ttttattact attcgattga
  1210       1220       1230       1240       1250ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaaaacacctggt gtggtcgagg tagaggattg acatctgatt tacgtctctt
  1260       1270       1280       1290       1300agatgctaaa ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttgtctacgattt gagtgaaacc agaattgttt tacaccgtca gtttatgaac
  1310       1320       1330      1340        1350ctacagtttc agttttggct gttaaaggca gtttggctcc aatatctggagatgtcaaag tcaaaaccga caatttccgt caaaccgagg ttatagacct
  1360       1370       1380       1390       1400acagttcaaa gtgctcatct tattataaga tttgacgaaa atggagtgcttgtcaagttt cacgagtaga ataatattct aaactgcttt tacctcacga
  1410       1420       1430       1440       1450actaaacaat tccttcctgg acccagaata ttggaacttt agaaatggagtgatttgtta aggaaggacc tgggtcttat aaccttgaaa tctttacctc
  1460       1470       1480       1490       1500atcttactga aggcacagcc tatacaaacg gtgttggatt tatgcctaactagaatgact tccgtgtcgg atatgtttgc cacaacctaa atacggattg
  1510       1520       1530       1540       1550ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgtgatagtcgaa taggttttag agtgccattt tgacggtttt cattgtaaca
  1560       1570       1580       1590       1600cagtcaagtt tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaaccagtcagttcaa atgaatttgc ctctgttttg atttggacat tgtgattggt
  1610       1620       1630       1640       1650ttacactaaa cggtacacag gaaacaggag acacaactcc aagtgcatacaatgtgattt gccatgtgtc ctttgtcctc tgtgttgagg ttcacgtatg
  1660       1670       1680       1690       1700tctatgtcat tttcatggga ctggtctggc cacaactaca ttaatgaaatagatacagta aaagtaccct gaccagaccg gtgttgatgt aattacttta
  1710       1720       1730       1740atttgccaca tcctcttaca ctttttcata cattgcccaa gaataataaacggtgt aggagaatgt gaaaaagtat gtaacgggtt cttatt[SEQ.ID.NO.：2]-人肺表面活性物质蛋白D的颈区PDVASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPNG[SEQ.ID.NO.：3]-重组尾丝A1gaattcg atg aag cgc gca aga ccg tct gaa gat acc ttc aac ccc gtg tatcca tat gac acg gaa acc ggt cct cca act gtg cct ttt ctt act cct cccttt gta tcc ccc aat ggg ttt caa gag agt ccc cct ggg gta ctc tct ttgcgc cta tcc gaa cct cta gtt acc tcc aat ggc atg cct gac gta gca agctta cga caa cag gta gaa gcc ttg caa ggg cag gta caa cac tta cag gcggca ttt agc caa tac aaa aag gta gag ttg ttt cca aac gga gcc aag aagctg aac gac gcc cag gcc ccc aag agc gac cca tcg atc taa ctc gag[SEQ.ID.NO.：4]-人的表皮生长因子(EGF)序列范围：1至183
                 10         20         30         40         50
         gggaattcat gaactccgac tccgaatgtc cattgtccca cgacggttac
         cccttaagta cttgaggctg aggcttacag gtaacagggt gctgccaatg
                  M   N  S  D   S  E  C   P  L  S  H   D  G  Y>
                 60         70         80         90        100
         tgtttgcacg acggtgtttg tatgtacatc gaagctttgg acaagtacgc
         acaaacgtgc tgccacaaac atacatgtag cttcgaaacc tgttcatgcg
          C  L  H   D  G  V  C   M  Y  I   E  A  L   D  K  Y  A>
                110        120        130        140        150
         ttgtaactgt gttgttggtt acatcggtga aagatgtcaa tacagagact
         aacattgaca caacaaccaa tgtagccact ttctacagtt atgtctctga
           C  N  C   V  V  G   Y  I  G  E   R  C  Q   Y  R  D>
           160        170        180
    tgaagtggtg ggaattgaga tgataagaat tcc
    acttcaccac ccttaactct actattctta agg
    L  K  W  W   E  L  R   *>[SEQ.ID.NO.：5]-葡萄球菌蛋白A的氨基酸接头序列范围：1至39
                 10         20         30
         gccaagaagc tgaacgacgc ccaggccccc aagagcgac
         cggttcttcg acttgctgcg ggtccggggg ttctcgctg
          A  K  K   L  N  D  A   Q  A  P   K  S  D>
         ＿＿＿＿__a＿＿_SPA 48-60＿＿＿a＿＿＿＿_[SEQ.ID.NO.：6]-尾丝构建体A1 EGF序列范围：1至513
                 10         20         30         40         50
         atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata
         tacttcgcgc gttctggcag acttctatgg aagttggggc acataggtat
          M  K  R   A  R  P  S   E  D  T   F  N  P   V  Y  P  Y>
         ＿＿＿＿__b＿＿＿＿＿b＿ 尾＿＿_b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿__>
                 60         70         80         90        100
         tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg
         actgtgcctt tggccaggag gttgacacgg aaaagaatga ggagggaaac
           D  T  E   T  G  P   P  T  V  P   F  L  T   P  P  F>
         ＿＿＿＿__b＿＿＿＿＿b＿＿ 尾 ＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
                110        120        130        140        150
         tatcccccaa tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc
         atagggggtt acccaaagtt ctctcagggg gaccccatga gagaaacgcg
                                                   L   S  L  R>
                                     ＿a＿＿＿＿＿>V  S  P  N   G  F  Q   E  S  P   P  G  V>＿＿＿＿＿b＿＿＿  尾 ＿＿＿＿＿b＿＿＿＿>
   160        170        180        190        200ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc atgcctgacg tagcaagcttgataggcttg gagatcaatg gaggttaccg tacggactgc atcgttcgaaL  S  E   P  L  V  T   S  N  G   M>＿＿＿＿＿a＿＿R1-_＿a＿＿＿＿＿a＿_>
                                 P  D   V  A  S  L>
                         ＿＿＿_肺表面活性物质＿＿＿_>
   210        220        230        240        250acgacaacag gtagaagcct tgcaagggca ggtacaacac ttacaggcggtgctgttgtc catcttcgga acgttcccgt ccatgttgtg aatgtccgccR  Q  Q   V  E  A   L  Q  G  Q   V  Q  H   L  Q  A>＿＿＿＿＿＿＿＿_肺表面活性物质蛋白D TRIM＿c＿＿＿＿＿＿>
    260        270        280        290        300catttagcca atacaaaaag gtagagttgt ttccaaacgg agccaagaaggtaaatcggt tatgtttttc catctcaaca aaggtttgcc tcggttcttcA  F  S  Q   Y  K  K   V  E  L   F  P  N  G>＿＿＿＿＿＿__肺表面活性物质蛋白D TRIM＿＿_c_>
                                          A  K  K>
                                         ＿＿＿＿_>
                              >Cla1
                                |
   310        320        330   |    340        350ctgaacgacg cccaggcccc caagagcgac ccatcgatca tgaactccgagacttgctgc gggtccgggg gttctcgctg ggtagctagt acttgaggct
                                        M  N  S  D>
                                      _d＿＿＿＿＿>L  N  D   A  Q  A  P   K  S  D>＿＿＿＿＿＿SPA 48-60_e＿＿＿＿＿>
                                     P  S  I>
                                    ＿＿＿＿＿>
           360        370        380        390        400
    ctccgaatgt ccattgtccc acgacggtta ctgtttgcac gacggtgttt
    gaggcttaca ggtaacaggg tgctgccaat gacaaacgtg ctgccacaaa
      S  E  C   P  L  S   H  D  G  Y   C  L  H   D  G  V>
    ＿＿＿＿＿＿＿＿表皮生长因子(尿抑胃素)；密码子_ST＿＿_>
           410        420        430        440        450
    gtatgtacat cgaagctttg gacaagtacg cttgtaactg tgttgttggt
    catacatgta gcttcgaaac ctgttcatgc gaacattgac acaacaacca
    C  M  Y  I   E  A  L   D  K  Y   A  C  N  C   V  V  G>
    ＿＿＿＿＿＿＿__表皮生长因子(尿抑胃素)；密码子_ST＿＿_>
           460        470        480        490        500
    tacatcggtg aaagatgtca atacagagac ttgaagtggt gggaattgag
    atgtagccac tttctacagt tatgtctctg aacttcacca cccttaactc
     Y  I  G   E  R  C  Q   Y  R  D   L  K  W   W  E  L  R>
    ＿＿＿＿＿＿＿__表皮生长因子(尿抑胃素)；密码子_ ST ＿＿>
      >xho1
        |
        |  510
    atgactcgag ggg
    tactgagctc ccc
       X>
    ＿＿>[SEQ.ID.NO.：7]-尾丝构建体A7 EGF序列范围：1至811
      >EcoR1
        |
        |    10    20    30    40    50
        gaattcgatg  aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgtcttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca
    M>
   ＿＿>
    M   K  R  A   R  P  S  E   D  T  F   N  P  V>
   ＿＿j＿＿＿＿＿j＿＿＿ 尾 ＿＿＿＿＿_j＿＿＿＿__>
      60         70         80         90        100atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactccttaggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgaggaY  P  Y  D   T  E  T   G  P  P   T  V  P  F   L  T  P>＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿j＿_ 尾 ＿_j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
   110        120        130        140        150ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctcgggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag
                                              L  S>
                                             ＿＿_>P  F  V   S  P  N  G   F  Q  E   S  P  P   G  V>＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿ 尾 ＿＿_＿j＿＿＿＿＿j＿＿_>
    160        170        180        190        200tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctcaaaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt
                                        L  A  L>
                                        ＿＿＿＿＿>L  R  L   S  E  P   L  V  T  S   N  G  M>＿＿＿＿＿h＿＿_重复单元1_＿＿＿h＿＿＿＿＿>
   210        220        230        240        250aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaatttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt
                                      L   T  S  Q>
                                     ＿f＿＿＿＿＿>K  M  G  N   G  L  S   L  D  E   A  G  N>＿＿＿＿＿g＿＿_重复单元2_＿＿＿g_＿＿＿_>
   260        270        280        290        300aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaattacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt
                                              I  N>
                                              ＿＿_>N  V  T   T  V  S  P   P  L  K   K  T  K   S  N>＿＿＿＿＿f＿＿＿__重复单元3＿__f＿＿＿＿__f_＿＿>
   310        320        330        340        350cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtggggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc
                                         L  T  V>
                                        ＿＿＿＿＿>L  E  I  S  A  P   L  T  V  T   S  E  A>＿＿＿＿__e＿＿＿_重复单元4_＿__e___＿＿＿_>
   360        370        380        390        400ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatcagacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt
                                    L  T   M  Q  S>
                                    ＿重复单元6＿＿_>A  A  A  A   P  L  M   V  A  G   N  T>＿＿＿＿__d＿_重复单元5＿＿＿＿_d＿＿_>
    410        420        430        440        450caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagggtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc
                               L  S  I   A  T  Q  G>
                             ＿___重复单元7＿＿＿_>Q  A  P   L  T  V  H   D  S  K>＿＿＿＿＿重复单元6＿c＿＿______>
   460        470        480        490        500acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttactggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg
                        L  A>
                       ＿__a_>P  L  T   V  S  E   G  K>＿＿＿_＿重复单元7＿__b＿＿>
                                P  D  V   A  S  L>
                               ＿_肺表面活性物质＿_>
   510        520        530        540        550gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggcactgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgtR  Q  Q  V   E  A  L   Q  G  Q   V  Q  H  L   Q  A  A>＿＿________＿＿＿肺表面活性物质蛋白D TRIM_k＿＿＿＿__>
   560        570        580        590        600tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagctaaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc ggttcttcgaF  S  Q   Y  K  K  V   E  L  F   P  N  G>＿＿＿＿＿__肺表面活性物质蛋白D TRIM＿＿＿>
                                         A  K  K  L>
                                        _m＿＿＿____>
                            >Cla1
                              |
    610        620        630 |      640        650gaacgacgcc caggccccca agagcgaccc atcgatcatg aactccgactcttgctgcgg gtccgggggt tctcgctggg tagctagtac ttgaggctga
                                     M   N  S  D>
                                     _1＿＿＿＿__>N  D  A   Q  A  P   K  S  D>＿＿＿＿＿SPA 48-60＿m＿＿＿＿>
                            P   S   I>
                           __n＿＿＿＿>
   660        670        680        690        700ccgaatgtcc attgtcccac gacggttact gtttgcacga cggtgtttgtggcttacagg taacagggtg ctgccaatga caaacgtgct gccacaaaca
    S  E  C  P   L  S  H   D  G  Y   C  L  H  D   G  V  C>
    ＿＿＿＿＿＿＿＿_表皮生长因子(尿抑胃素)；密码子_ST＿__>
           710        720        730        740        750
    atgtacatcg aagctttgga caagtacgct tgtaactgtg ttgttggtta
    tacatgtagc ttcgaaacct gttcatgcga acattgacac aacaaccaat
     M  Y  I   E  A  L  D   K  Y  A   C  N  C   V  V  G  Y>
    ＿＿＿＿＿＿＿_表皮生长因子(尿抑胃素)；密码子_ST ＿＿_>
           760        770        780        790        800
    catcggtgaa agatgtcaat acagagactt gaagtggtgg gaattgagat
    gtagccactt tctacagtta tgtctctgaa cttcaccacc cttaactcta
      I  G  E   R  C  Q   Y  R  D  L   K  W  W   E  L  E>
    ＿＿＿＿＿＿＿__表皮生长因子(尿抑胃素)；密码子_ST＿＿_>
    >xh01
      |
      |    810
    gactcgaggg g
    ctgagctccc c
    X>
    _>[SEQ.ID.NO.：8]-G250构建体序列范围：1至1056
                 10         20         30         40         50
         gacattgtga tgacccagtc tcaaagattc atgtccacaa cagtaggaga
         ctgtaacact actgggtcag agtttctaag tacaggtgtt gtcatcctct
          D  I  V   M  T  Q  S   Q  R  F   M  S  T   T  V  G  D>
         ＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_VK＿＿_c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
                 60         70         80         90        100
         cagggtcagc atcacctgca aggccagtca gaatgtggtt tctgctgttg
         gtcccagtcg tagtggacgt tccggtcagt cttacaccaa agacgacaac R  V  S   I  T  C   K  A  S  Q   N  V  V   S  A  V>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_VK＿＿_c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
   110        120       130         140        150cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaactact gatttactcaggaccatagt tgtctttggt cctgttagag gatttgatga ctaaatgagtA  W  Y  Q   Q  K  P   G  Q  S   P  K  L  L   I  Y  S>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_VK＿＿_c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
   160        170        180        190        200gcatccaatc ggtacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatccgtaggttag ccatgtgacc tcagggacta gcgaagtgtc cgtcacctagA  S  N   R  Y  T  G   V  P  D   R  F  T   G  S  G  S>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_VK＿＿_c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
   210        220        230        240        250tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tatgcagtct gaagacctggaccctgtcta aagtgagagt ggtaatcgtt atacgtcaga cttctggaccG  T  D   F  T  L   T  I  S  N   M  Q  S   E  D  L>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_VK＿＿_c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
   260        270        280        290        300ctgatttttt ctgtcaacaa tatagcaact atccgtggac gttcggtggagactaaaaaa gacagttgtt atatcgttga taggcacctg caagccacctA  D  F  F   C  Q  Q   Y  S  N   Y  P  W  T   F  G  G>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_VK＿＿_c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
   310        320        330        340        350ggcaccaagc tggaaatcaa aggatctggc tctacttccg gtagcggcaaccgtggttcg acctttagtt tcctagaccg agatgaaggc catcgccgttG  T  K   L  E  I  K>＿＿＿＿＿VK＿＿＿＿_c_>
                    G  S  G   S  T  S   G  S  G  K>
                    ＿＿＿＿d＿_连接＿_d＿＿＿＿＿>
   360        370        380        390        400atcctctgaa ggcaaaggta ctagagacgt gaagctcgtg gagtctggggtaggagactt ccgtttccat gatctctgca cttcgagcac ctcagacccc
                        D  V   K  L  V   E  S  G>
                       ＿＿_a＿＿＿VH＿a＿＿＿＿＿>S  S  E   G  K  G   T  R>＿＿＿＿＿_连接＿＿＿d＿＿＿>
   410        420        430        440        450gaggcttagt gaagcttgga gggtccctga aactctcctg tgcagcctctctccgaatca cttcgaacct cccagggact ttgagaggac acgtcggagaG  G  L  V   K  L  G   G  S  L   K  L  S  C   A  A  S>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_VH＿＿_a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
   460        470        480        490        500ggattcactt tcagtaacta ttacatgtct tgggttcgcc agactccagacctaagtgaa agtcattgat aatgtacaga acccaagcgg tctgaggtctG  F  T   F  S  N  Y   Y  M  S   W  V  R   Q  T  P  E>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_VH＿＿_a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
   510        520        530        540        550gaagaggctg gagttggtcg cagccattaa tagtgatggt ggtatcacctcttctccgac ctcaaccagc gtcggtaatt atcactacca ccatagtggaK  R  L   E  L  V   A  A  I  N   S  D  G   G  I  T>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_VH＿＿_a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
   560        570        580        590        600actatctaga cactgtgaag ggccgattca ccatttcaag agacaatgcctgatagatct gtgacacttc ccggctaagt ggtaaagttc tctgttacggY  Y  L  D   T  V  K   G  R  F   T  I  S  R   D  N  A>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_VH＿＿_a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
   610        620        630        640        650aagaacaccc tgtacctgca aatgagcagt ctgaagtctg aggacacagcttcttgtggg acatggacgt ttactcgtca gacttcagac tcctgtgtcgK  N  T   L  Y  L  Q   M  S  S   L  K  S   E  D  T  A>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_VH＿＿_a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
    660        670        680        690        700cttgttttac tgtgcaagac accgctcggg ctacttttct atggactactgaacaaaatg acacgttctg tggcgagccc gatgaaaaga tacctgatgaL  F  Y   C  A  R   H  R  S  G   Y  F  S   M  D  Y>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_VH＿＿_a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
   710        720        730        740        750ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct catgcccacc gtgcccagcaccccagttcc ttggagtcag tggcagagga gtacgggtgg cacgggtcgtW  G  Q  G   T  S  V   T  V  S   S>＿＿＿＿＿a＿＿_VH＿_a＿＿＿＿＿a＿>
                                                A>
                                                ＿_>
                                C  P  P  C  P>
                                ＿＿__铰链＿＿__>
   760        770        780        790        800cctgaactcc tagggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaaggacttgagg atccccctgg cagtcagaag gagaaggggg gttttgggttP  E  L   L  G  G  P   S  V  F   L  F  P   P  K  P  K>＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_CH2＿＿_b_＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
   810        820        830        840        850ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtggcctgtgggag tactagaggg cctggggact ccagtgtacg caccaccaccD  T  L   M  I  S   R  T  P  E   V  T  C   V  V  V>＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_CH2＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
   860        870        880        890        900acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggctgcactcggt gcttctggga ctccagttca agttgaccat gcacctgccgD  V  S  H   E  D  P   E  V  K   F  N  W  Y   V  D  G>
    ＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_CH2＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
           910        920        930        940        950
    gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag
    cacctccacg tattacggtt ctgtttcggc gccctcctcg tcatgttgtc
     V  E  V   H  N  A  K   T  K  P   R  E  E   Q  Y  N  S>
    ＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_CH2＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
           960        970        980        990       1000
    cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga
    gtgcatggcc caccagtcgc aggagtggca ggacgtggtc ctgaccgact
      T  Y  R   V  V  S   V  L  T  V   L  H  Q   D  W  L>
    ＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_CH2＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
          1010       1020       1030       1040       1050
    atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc
    taccgttcct catgttcacg ttccagaggt tgtttcggga gggtcggggg
    N  G  K  E   Y  K  C   K  V  S   N  K  A  L   P  A  P>
    ＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_CH2＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
    atcgag
    tagctc
     I  E>
    ＿＿＿>[SEQ.ID.NO.：9]-C242构建体序列范围：1至793
         >Sfi         >EcoR1   >Cla1
          |               |      |
          |     10        |20    |    30         40         50
        gcggcccagc cggccacgaa ttcatcgatg gatattgtga tgactcaggccgccgggtcg gccggtgctt aagtagctac ctataacact actgagtccg
A  Q   P  A  T  N   S  S  M>
＿＿＿b_反向引物＿＿＿＿＿＿>
                              D  I  V   M  T  Q  A>
                              ＿＿VK药物＿＿＿＿＿_>A>＿>
    60         70         80         90        100tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc atctcctgcaacgtgggaga catggacagt gaggacctct cagtcatagg tagaggacgtA  P  S   V  P  V   T  P  G  E   S  V  S   I  S  C>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿VK药物＿＿＿＿＿＿＿＿d＿＿＿＿__>
   110        120        130        140        150ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattggccagatcatt ctcagaggac gtatcattac cgttgtgaat gaacataaccR  S  S  K   S  L  L   H  S  N   G  N  T  Y   L  Y  W>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿_VK药物＿＿＿＿＿＿＿＿_d＿＿＿＿＿>
         S  L  L   H  S  N   G  N  T  Y   L  Y>
       ＿＿＿＿__f＿＿_＿CDR1＿＿＿＿__f＿＿＿_>
   160        170        180        190        200ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtcaaggacgtct ccggtccggt cagaggagtc gaggactata tagcctacagF  L  Q   R  P  G  Q   S  P  Q   L  L  I   Y  R  M  S>＿＿＿＿__d＿＿＿___VK药物＿＿＿＿＿＿＿＿_d＿＿＿＿__>
                                           R  M  S>
                                          ________>
   210        220        230        240        250caaccttgtc tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaagttggaacag agtcctcagg gtctgtccaa gtcaccgtca cccagtccttN  L  V   S  G  V   P  D  R  F   S  G  S   G  S  G>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿VK药物＿＿＿＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿> N  L  V   S>＿＿＿＿＿e＿＿>
   260        270        280        290        300ctgctttcac actgagaatc agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgttgacgaaagtg tgactcttag tcatctcacc tccgactcct acacccacaaT  A  F  T   L  R  I   S  R  V   E  A  E  D   V  G  V>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿VK药物＿＿＿＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿>
   310        320        330        340        350tattactgtc tgcaacatct agagtatccg ttcacgttcg gtcctgggacataatgacag acgttgtaga tctcataggc aagtgcaagc caggaccctg
       L  Q  H  L   E  Y  P   F  T>
      _a＿＿＿＿＿CDR3＿＿＿_a＿＿＿>Y  Y  C   L  Q  H  L   E  Y  P   F  T  F   G  P  G  T>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿_VK药物＿＿＿＿＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿>
   360        370        380        390        400caagctggag ctgaaacggc ccccggactt tgttcccccg gccgctagttgttcgacctc gactttgccg ggggcctgaa acaagggggc cggcgatcaaK  L  E   L  K  R>＿_VK药物＿＿＿＿＿>
                  P  P  D  F    V  P  P    A  A  S>
                _1＿＿＿＿＿1＿825＿＿_1＿＿＿＿＿>
   410        420        430        440        450tccctgatca ctcccctcgt ggccaggtcc agttggtgca gtctggacctagggactagt gaggggagca ccggtccagg tcaaccacgt cagacctgga
                      Q  V   Q  L  V  Q   S  G  P>
                      ＿＿VH药物[断裂]＿＿＿＿＿＿_>F  P  D  H   S  P  R   G>＿＿＿＿＿825＿＿＿＿1＿_>
   460        470        480        490        500gagctgaaga agcctggaga gacagtcaag atctcctgca aggcttctgactcgacttct tcggacctct ctgtcagttc tagaggacgt tccgaagactE  L  K   K  P  G  E   T  V  K   I  S  C   K  A  S  D>＿＿＿＿＿h＿＿＿VH药物[断裂]＿＿＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>
   510        520        530        540        550ttataccttc acatactatg gaatgaactg ggtgaagcag gctccgggaaaatatggaag tgtatgatac cttacttgac ccacttcgtc cgaggcccttY  T  F   T  Y  Y   G  M  N  W   V  K  Q   A  P  G>＿＿＿＿＿h＿＿＿VH药物[断裂]＿＿＿＿＿＿＿_h＿＿＿＿＿>
           Y  Y   G  M  N>
           ＿＿＿cDR1＿＿＿>
   560        570        580       590         600agggtttaaa gtggatgggc tggatagaca ccaccactgg agagccaacatcccaaattt cacctacccg acctatctgt ggtggtgacc tctcggttgtK  G  L  K   W  M  G   W  I  D   T  T  T  G   E  P  T>＿＿＿＿＿h＿＿＿VH药物[断裂]_＿＿＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>
                   W  I  D   T  T  T  G   E  P  T>
                   ＿＿＿＿CDR2[断裂] _＿＿＿＿＿>
   610        620        630        640        650tatgctgaag attttaaggg acggattgcc ttctctttgg agacctctgcatacgacttc taaaattccc tgcctaacgg aagagaaacc tctggagacgY  A  E   D  F  K  G   R  I  A   F  S  L   E  T  S  A>＿＿＿＿＿h＿＿_VH药物[断裂]_＿＿＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>Y  A  E   D  F  K  G>＿＿_CDR2[断裂]  _＿_i_>
   660        670        680        690        700cagcactgcc tatttgcaga tcaaaaacct caaaaatgag gacacggctagtcgtgacgg ataaacgtct agtttttgga gtttttactc ctgtgccgatS  T  A   Y  L  Q   I  K  N  L   K  N  E   D  T  A>＿＿＿＿＿h＿＿_VH药物[断裂]＿＿＿＿＿＿___h＿＿＿＿＿>
   710        720        730        740        750catatttctg tgcaagacgg gggccttaca actggtactt tgatgtctgggtataaagac acgttctgcc cccggaatgt tgaccatgaa actacagacc
               R   G  P  Y   N  W  Y  F   D  V>
               ＿_g＿＿＿＿_CDR3＿＿＿_g_＿＿＿>T  Y  F  C   A  R  R   G  P  Y   N  W  Y  F   D  V  W>＿＿＿＿＿h＿＿＿＿VH药物[断裂]＿＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>
                  >Xho(-)StopXho_adapt_[断裂]
                               |
    760        770        780  |      790ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ctcgattaac tcgccggttccct ggtgccagtg gcagaggagt gagctaattg agc
                             L  X>
                             ＿＿＿>G  Q  G   T  T  V  T   V  S  S>＿＿_VH药物[断裂]＿＿＿＿＿＿＿_>[SEQ.ID.NO.：10]-尾丝构建体A1 G250序列范围：1至1411
       >EcoR1
         |
         |       10         20         30         40         50
         gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt
         cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca
                 M>
                _＿>
                 M   K  R  A   R  P  S  E   D  T  F   N  P  V>
                ＿_f＿＿＿＿＿f＿＿＿ 尾 ＿＿＿＿_＿f＿＿＿＿＿>
                 60         70         80         90        100
         atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct
         taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga
         Y  P  Y  D   T  E  T   G  P  P   T  V  P  F   L  T  P>
         ＿＿＿＿＿f＿＿＿＿＿f＿ 尾 ＿＿f＿＿＿＿＿f＿＿＿＿＿>
                110        120        130        140        150
         ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc
         gggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag
                                                           L  S>
                                                          ＿＿＿>
          P  F  V   S  P  N  G   F  Q  E   S  P  P   G  V>
         ＿＿＿＿＿f＿＿＿＿＿ 尾 ＿＿＿_f＿＿＿＿＿f＿＿_>
                160        170        180        190        200
         tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cctgacgtag
         aaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac ggactgcatc
           L  R  L   S  E  P   L  V  T  S   N  G  M>
         ＿＿＿＿＿d＿＿_重复单元1_＿＿＿d＿＿＿＿＿>
                                                      P  D  V>
                                       ＿＿＿＿＿>
   210        220        230        240        250caagcttacg acaacaggta gaagccttgc aagggcaggt acaacacttagttcgaatgc tgttgtccat cttcggaacg ttcccgtcca tgttgtgaatA  S  L  R   Q  Q  V   E  A  L   Q  G  Q  V   Q  H  L>＿＿＿＿＿＿＿＿_肺表面活性物质蛋白D TRIM＿g＿＿＿＿＿>
   260        270        280        290        300caggcggcat ttagccaata caaaaaggta gagttgtttc caaacggagcgtccgccgta aatcggttat gtttttccat ctcaacaaag gtttgcctcg
                                                 A>
                                               _＿>Q  A  A   F  S  Q  Y   K  K  V   E  L  F   P  N  G>_＿＿＿＿＿＿＿_肺表面活性物质蛋白D TRIM＿_g_＿＿＿_>
                                   >Cla1
                                     |
   310        320        330        340        350caagaagctg aacgacgccc aggcccccaa gagcgaccca tcgatcgacagttcttcgac ttgctgcggg tccgggggtt ctcgctgggt agctagctgtK  K  L   N  D  A   Q  A  P  K   S  D>＿＿＿＿＿b＿＿SPA 48-60＿＿＿＿b＿＿＿_>
                                     P   S  I>
                                    ＿_c＿＿＿>
                                               D>
                                              _＿_>
   360        370        380        390        400ttgtgatgac ccagtctcaa agattcatgt ccacaacagt aggagacaggaacactactg ggtcagagtt tctaagtaca ggtgttgtca tcctctgtccI  V  M  T   Q  S  Q   R  F  M   S  T  T  V   G  D  R>＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿j＿_VK＿＿_j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
   410        420        430        440        450gtcagcatca cctgcaaggc cagtcagaat gtggtttctg ctgttgcctgcagtcgtagt ggacgttccg gtcagtctta caccaaagac gacaacggacV  S  I   T  C  K  A   S  Q  N   V  V  S   A  V  A  W>＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿j＿_VK＿＿_j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
   460        470        480       490         500gtatcaacag aaaccaggac aatctcctaa actactgatt tactcagcatcatagttgtc tttggtcctg ttagaggatt tgatgactaa atgagtcgtaY  Q  Q   K  P  G   Q  S  P  K   L  L  I   Y  S  A>_＿＿＿＿_j＿＿＿＿＿j＿_VK_＿＿j＿＿＿＿＿j_＿＿＿＿_>
   510        520        530        540        550ccaatcggta cactggagtc cctgatcgct tcacaggcag tggatctgggggttagccat gtgacctcag ggactagcga agtgtccgtc acctagacccS  N  R  Y   T  G  V   P  D  R   F  T  G  S   G  S  G>_＿＿＿＿_j＿＿＿＿＿j＿＿VK_＿＿j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
   560        570        580        590        600acagatttca ctctcaccat tagcaatatg cagtctgaag acctggctgatgtctaaagt gagagtggta atcgttatac gtcagacttc tggaccgactT  D  F   T  L  T  I   S  N  M   Q  S  E   D  L  A  D>_＿＿＿＿_j＿＿＿＿＿j＿_VK_＿＿j＿＿＿＿＿j_＿＿＿＿_>
   610        620        630        640        650ttttttctgt caacaatata gcaactatcc gtggacgttc ggtggaggcaaaaaaagaca gttgttatat cgttgatagg cacctgcaag ccacctccgtF  F  C   Q  Q  Y   S  N  Y  P   W  T  F   G  G  G>_＿＿＿＿_j＿＿＿＿＿j＿_VK＿＿_j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
   660        670        680        690        700ccaagctgga aatcaaagga tctggctcta cttccggtag cggcaaatccggttcgacct ttagtttcct agaccgagat gaaggccatc gccgtttaggT  K  L  E   I  K>＿＿＿_VK_j＿＿＿_>
               G   S  G  S   T  S  G  S   G  K  S>
               ＿_k＿＿＿＿＿_连接＿＿＿k＿＿＿＿＿>
   710        720        730        740        750tctgaaggca aaggtactag agacgtgaag ctcgtggagt ctgggggaggagacttccgt ttccatgatc tctgcacttc gagcacctca gaccccctcc
                    D  V  K   L  V  E   S  G  G  G>
                  ＿＿＿＿_h＿＿VH＿＿h_＿＿＿＿＿>S  E  G   K  G  T  R>_＿＿＿＿连接＿＿＿＿k_>
   760        770        780        790        800cttagtgaag cttggagggt ccctgaaact ctcctgtgca gcctctggatgaatcacttc gaacctccca gggactttga gaggacacgt cggagacctaL  V  K   L  G  G   S  I  K  L   S  C  A   A  S  G>＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿h＿_VH＿_＿h＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>
   810        820        830        840        850tcactttcag taactattac atgtcttggg ttcgccagac tccagagaagagtgaaagtc attgataatg tacagaaccc aagcggtctg aggtctcttcF  T  F  S   N  Y  Y   M  S  W   V  R  Q  T   P  E K>＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿h＿_VH＿＿_h＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>
   860        870        880        890        900aggctggagt tggtcgcagc cattaatagt gatggtggta tcacctactatccgacctca accagcgtcg gtaattatca ctaccaccat agtggatgatR  L  E   L  V  A  A   I  N  S   D  G  G   I  T  Y  Y>＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿h＿_VH＿＿_h＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿＿>
   910        920        930        940        950tctagacact gtgaagggcc gattcaccat ttcaagagac aatgccaagaagatctgtga cacttcccgg ctaagtggta aagttctctg ttacggttctL  D  T   V  K  G   R  F  T  I   S  R  D   N  A  K>＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿h＿_VH＿＿_h＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>
   960        970        980        990       1000acaccctgta cctgcaaatg agcagtctga agtctgagga cacagccttgtgtgggacat ggacgtttac tcgtcagact tcagactcct gtgtcggaacN  T  L  Y   L  Q  M   S  S  L   K  S  E  D   T  A  L>＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿h＿_VH＿＿_h＿＿＿＿＿h＿＿＿＿＿>
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         |
         |1110
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    taattgagct c
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      >EcoR1
        |
        |       10         20         30         40         50
        gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt
        cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca
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                                       _b＿＿＿＿__>F  S  Q   Y  K  K  V   E  L  F   P  N  G>＿＿＿＿＿__肺表面活性物质蛋白D TRIM＿＿＿>
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                              |
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                       R  G   P  Y  N   W  Y  F  D>
                     ＿＿＿_h_＿_CDR3＿h＿＿＿＿＿>T  A  T   Y  F  C  A   R  R  G   P  Y  N   W  Y  F  D>＿＿＿＿＿i＿＿_VH药物[断裂]_＿＿＿＿＿＿＿i＿＿＿＿__>
                                           >Xho1
                                             |
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                                     L   D  *  L>
                                   ＿_a＿＿＿＿__>V>＿__>V  W  G   Q  G  T   T  V  T  V   S  S>__＿＿＿_VH药物[断裂]＿＿＿＿_＿i＿＿＿_>agtcE>＿>[SEQ.ID.NO.：14]－
序列范围：1至174-亲和体ZIgG
              10         20         30         40         50
      gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt
      catctgttgt ttaagttgtt tcttgttgtt ttgcgcaaga tactctagaa
       V  D  N   K  F  N  K   E  Q  Q   N  A  F   Y  E  I  L>
      ＿＿＿＿＿a_＿＿＿＿_a_ Z-区 ＿_a_＿＿＿＿_a＿＿＿＿__>
              60         70         80         90        100
      acatttacct aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt
      tgtaaatgga ttgaatttgc ttcttgttgc tttgcggaag taggtttcaa
        H  L  P   N  L  N   E  E  Q  R   N  A  F   I  Q  S>
      ＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a_ Z-区 ＿_a＿＿＿＿＿a_＿＿＿＿_>
             110        120        130        140        150
      taaaagatga cccaagccaa agcgctaact tgctagcaga agctaaaaag
      attttctact gggttcggtt tcgcgattga acgatcgtct tcgatttttc
      L  K  D  D . P  S  Q   S  A  N   L  L  A  E   A  K  K>
      _＿＿＿＿_a_＿＿＿＿_a_ Z-区 ＿_a_＿＿＿＿_a＿＿＿＿＿>
             160        170
      ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaa
      gatttactac gagtccgcgg cttt
       L  N  D   A  Q  A  P   K>
      ＿＿＿＿＿ Z-区 ＿＿a＿＿>[SEQ.ID.NO.：15]-亲和体ZIgA序列范围：1至174
            10         20         30         40         50
    gtagacaaca aattcaacaa agaaacaata caagcgagtc aagagatcag
    catctgttgt ttaagttgtt tctttgttat gttcgctcag ttctctagtc
     V  D  N   K  F  N  K   E  T  I   Q  A  S   Q  E  I  R>
    ＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿AFFI IGA ＿a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
            60         70         80         90        100
    actattacct aacttaaacg gtagacaaaa gcttgccttc atccacagtt
    tgataatgga ttgaatttgc catctgtttt cgaacggaag taggtgtcaa
     L  L  P   N  L  N   G  R  Q  K   L  A  F   I  H  S>
    ＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿AFFI IGA ＿a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
           110        120        130        140        150
    tacttgatga cccaagccaa agcgctaact tgctagcaga agctaaaaag
    atgaactact gggttcggtt tcgcgattga acgatcgtct tcgatttttc
    L  L  D  D   P  S  Q   S  A  N   L  L  A  E   A  K  K>
    ＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿AFFI IGA ＿a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
           160        170
    ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaa
    gatttactac gagtccgcgg cttt
     L  N  D   A  Q  A  P   K>
    ＿＿＿＿AFFI IGA ＿＿a＿＿>[SEQ.ID.NO.：16]-重组尾丝A7 ZIgG序列范围：1至820
      >EcoR1
        |
        |       10         20         30         40         50
        gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt
        cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca
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    60         70         80         90        100atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactccttaggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgaggaY  P  Y  D   T  E  T   G  P  P   T  V  P  F   L  T  P>_＿＿＿＿_j_＿＿＿＿_j＿_ 尾 ＿_j_＿＿＿＿_j＿＿＿＿__>
   110        120        130        140        150ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctcgggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag
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   160        170        180        190        200tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctcaaaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt
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   210        220        230        240        250aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaatttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt
                                      L   T  S  Q>
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   260        270        280        290        300aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaattacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt
                                              I  N>
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   310        320        330        340        350cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtggggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc
                                         L  T  V>
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   360        370        380        390        400ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatcagacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt
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   410        420        430        440        450caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagggtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc
                              L  S  I   A  T  Q  G>
                             _＿＿重复单元7＿＿＿＿>Q  A  P   L  T  V  H   D  S  K>_＿＿＿＿重复单元6＿_c_＿＿＿＿_>
   460        470        480        490        500acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttactggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg
                       L  A>
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                           ＿_肺表面活性物质_＿＿>
   510        520        530        540        550gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggcactgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgtR  Q  Q  V   E  A  L   Q  G  Q   V  Q  H  L   Q  A  A>_＿＿＿＿＿＿＿＿ 肺表面活性物质蛋白D TRIM＿k_＿＿＿＿>
   560        570        580        590        600tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagctaaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc ggttcttcgaF  S  Q   Y  K  K  V   E  L  F   P  N  G>_＿＿＿＿＿_肺表面活性物质蛋白D TRIM＿＿＿>
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                             |
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    aatttgcttc ttgttgcttt gcggaagtag gtttcaaatt ttctactggg
     L  N  E   E  Q  R  N   A  F  I   Q  S  L   K  D  D  P>
    _＿＿＿＿_o_＿＿＿＿_o_ Z-区 _＿o_＿＿＿＿_o＿＿＿＿＿>
           760        770        780        790        800
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    ttcggtttcg cgattgaacg atcgtcttcg atttttcgat ttactacgag
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                   |
           810     |  820
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    Q  A  P K>
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      >EcoR1
        |
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                              L  S  I   A  T  Q  G>
                             ＿＿＿重复单元7＿＿＿>Q  A  P   L  T  V  H   D  S  K>＿＿＿_＿重复单元6_＿c＿＿＿＿＿>
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                              ＿肺表面活性物质＿＿>
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                              L  S  I   A  T  Q  G>
                             ＿＿＿重复单元7＿＿＿>Q  A  P   L  T  V  H   D  S  K>＿＿＿＿＿重复单元6＿c＿＿＿＿＿>
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                               P  D  V   A  S  L>
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Claims (40)

1.一种修饰的病毒，它包含一或多种非天然多肽，所述多肽包含一或多个框架半分子，每个框架半分子包含一或多个结合半分子，所述多肽能在哺乳动物宿主细胞的细胞质和核中表达为缺乏所述结合半分子的配体时能维持的一种构象，该构象允许所述结合半分子随后与所述配体结合，所述多肽能跨核膜转运，这种修饰的病毒由所述结合半分子赋予它改变的向性。
2.权利要求1的修饰的病毒，它衍生自选自下组的病毒：腺病毒，逆转录病毒，慢病毒，腺伴随病毒，呼肠孤病毒科，小RNA病毒科，细小病毒科，乳多空病毒科和杯状病毒科。
3.权利要求1或2的修饰的病毒，它衍生自人类腺病毒。
4.权利要求1-3任一项的修饰的病毒，它衍生自人类腺病毒血清型5。
5.权利要求1-4任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽，替代了野生型病毒的病毒蛋白成分，或掺入到这样的成分中，或与这样的成分形成融合蛋白。
6.权利要求1-5任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽和/或包含该非天然多肽的病毒成分蛋白可溶于细胞环境。
7.权利要求6的修饰的病毒，其中所述非天然多肽或包含该非天然多肽的病毒成分蛋白有30％以上出现在细胞裂解物的可溶性级分中，所述细胞是指表达所述非天然多肽或包含该非天然多肽的病毒成分蛋白的细胞。
8.权利要求5-7任一项的修饰的病毒，其中所述病毒蛋白成分是腺病毒尾丝蛋白。
9.权利要求8的修饰的病毒，其中所述非天然多肽掺入至腺病毒尾丝蛋白中，使得野生型尾丝顶球或其细胞结合区被去除。
10.权利要求1-9任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多个另外的元件，所述元件模拟病毒成分蛋白的天然结构或功能，所述病毒成分蛋白是掺入了所述非天然多肽者，或者是被所述非天然多肽替代者。
11.权利要求1-10任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽不含任何二硫键。
12.权利要求1-11任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多个α-螺旋结构。
13.权利要求1-12任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含来源于抗体的框架半分子，其能在细胞质中有效折叠并随后转运至细胞核中。
14.权利要求13的修饰的病毒，其中所述框架半分子包含一或多个源自另一抗体的CDR的结合半分子。
15.权利要求1-12任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽是组合蛋白或亲和体，或者它包含组合蛋白或亲和体。
16.权利要求1-15任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多个源自细菌受体的框架半分子。
17.权利要求1-12或16任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多个结合半分子，所述半分子出现在螺旋束的一或多个环内和/或出现在与这些螺旋束相连的一或多个环内。
18.权利要求16的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多个框架半分子，所述半分子源自葡萄球菌蛋白A与免疫球蛋白结合的Z区或者链球菌蛋白G的免疫球蛋白结合区。
19.权利要求1-18任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多个框架半分子，所述半分子包含非天然三聚体基元。
20.权利要求19的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多个框架半分子，所述半分子包含来自人肺表面活性物质蛋白D的颈区肽。
21.权利要求1-20任一项的修饰的病毒，其包含两种或更多种不同的非天然多肽。
22.权利要求21的修饰的病毒，其包含与靶细胞结合的第一非天然多肽以及与生产细胞或容许细胞结合的第二非天然多肽。
23.权利要求1-22任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽在能使该非天然多肽的结合半分子从所述修饰的病毒上切割下来的部位中包含切割位点。
24.权利要求1-23任一项的修饰的病毒，其中所述病毒包括含所述非天然多肽的修饰的病毒成分以及相应的未修饰的病毒成分，例如野生型尾丝和修饰的尾丝。
25.权利要求1-24任一项的修饰的病毒，其中所述非天然多肽包含能结合细胞特异性配体的结合半分子，所述配体可以是前列腺特异性膜抗原，EGF受体，Her-2/Neu，VEGF受体，CD22，gp120，MHC/肽复合物或膜结构或由增生细胞、肿瘤细胞或病毒感染的细胞所表达的或出现在其表面的分子。
26.权利要求1-25任一项的修饰的病毒，其还包含能插入一或多个所需治疗性基因或核酸分子的位点。
27.权利要求26的修饰的病毒，其包含编码胞嘧啶脱氨酶和/或尿嘧啶磷酸核糖转移酶的转基因，所述转基因为单独的基因或者为双功能融合基因。
28.权利要求1-27任一项的修饰的病毒，其还包含一种病毒成分，该成分被另一血清型的等效成分替代，或者被修饰，使得该病毒与预先形成的、针对野生型成分的抗体的结合减少。
29.权利要求28的修饰的病毒，其中所述病毒成分是六邻体蛋白。
30.一种修饰的病毒蛋白，其包含权利要求1-25任一项限定的非天然多肽。
31.一种细胞，其包含权利要求1-30任一项限定的修饰的病毒或病毒蛋白。
32.一种容许细胞，其容许权利要求1-29任一项所限定的修饰的病毒，并且其通过培养能繁殖所述修饰的病毒。
33.一种在细胞培养中产生权利要求1-29任一项限定的修饰型病毒的方法，包括以下步骤：
i)对病毒进行遗传修饰，以便产生含一或多种非天然多肽的修饰的病毒，所述多肽包含一或多个框架半分子，每个框架半分子包含一或多个结合半分子，所述多肽能在哺乳动物宿主细胞的细胞质和核中表达为缺乏所述结合半分子的配体时能维持的一种构象，该构象允许所述结合半分子随后与所述配体结合，所述多肽能跨核膜转运，这种修饰的病毒由所述结合半分子赋予它改变的向性；
ii)用所述修饰的病毒感染容许细胞；
iii)培养所述细胞，以便产生所述病毒；和
iv)对所产生的修饰型病毒进行收获，并任选纯化。
34.一种调节权利要求1-29任一项所限定的修饰型病毒的复制的方法，包括以下步骤：
i)构建修饰型病毒，使得感染细胞所需的结合半分子与该重组病毒成分上的其余部分之间有切割位点；和
ii)使所述重组病毒与能将所述结合半分子从所述病毒成分上切割下来的切割试剂或切割工具接触，从而阻止该重组病毒继续其感染周期。
35.一种确定非天然多肽是否适用于制备病毒载体的方法，所述方法是确定该多肽在细胞系统中的可溶性。
36.权利要求35的方法，包括以下步骤：
i)在容许细胞中表达所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白；
ii)裂解所述细胞，以便产生细胞裂解物；
iii)分离所述细胞裂解物的可溶性和不溶性级分；
iv)分析所述细胞裂解物的可溶性级分和不溶性级分中，所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白的含量；和
v)比较所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白在可溶性级分和不溶性级分中的相对含量。
37.一种评估权利要求1-25任一项限定的非天然多肽或权利要求30限定的修饰型病毒蛋白的可溶性的方法，包括以下步骤：
i)在容许细胞中表达所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白；
ii)裂解所述细胞，以便产生细胞裂解物；
iii)分离所述细胞裂解物的可溶性和不溶性级分；
iv)分析所述细胞裂解物的可溶性级分和不溶性级分中，所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白的含量；和
v)比较所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白在可溶性级分和不溶性级分中的相对含量。
38.权利要求1-29任一项限定的修饰型病毒在治疗中的用途。
39.权利要求1-29任一项限定的修饰型病毒在制备用于治疗肿瘤细胞或增生细胞的药物中的用途。
40.一种药物组合物，它含有权利要求1-29任一项限定的修饰型病毒以及可药用的载体或赋形剂。
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