CZ2003152A3 - Upravený virus - Google Patents

Description

Oblast techniky

Popisuje nové rekombinantni viry vhodné pro použiti v genové terapii.

Dosavadní stav techniky

Takové rekombinantni viry vykazují změněný tropizmus vzniklý začleněním jednoho nebo více nepřirozených polypeptidů do jednoho nebo více virových komponentů nebo nahrazením takových komponentů nepřirozenými polypeptidy. Tyto obsahovat elementy, virového komponentu, polypeptidů do které j ako funkčních nepřirozené polypeptidy mohou napodobují strukturu původního například umožňují začlenění viríonových částic. Tyto nepřirozené polypeptidy mohou také obsahovat elementy, které udělují nepřirozenému ligandu vazebnou funkci (to je změněný tropizmus) vůči takovým virionovým částicím. Nepřirozené polypeptidy používané v souladu s vynálezem vykazují primární a sekundární aminokyselinové struktury, které umožňují jejich správné sbalení v jádru nebo cytosolu savčích hostitelských buněk a jejich následný transport přes jadernou membránu. Takové struktury umožňují sestavení funkčních rekombinantních viríonových částic s nedotčenou nepřirozenou vazebnou funkcí a tak změněný tropizmus.

Klinická genová terapie se představila v roce 1989. V této době cílem genové terapie bylo opravovat genové defekty v imunitním systému prostřednictvím in vitro zavedení neporušeného genu do porušených buněk pacienta a tranfúze takto upravených buněk zpět do těla pacienta. Od té doby se indikace a možné molekulové'* použití genové terapie dramaticky rozšířilo. Dnes, deset let po jejím představení, je možné • · · · · · » · · · /Λ · ······

Λ · · »··· · · použít genovou terapii při léčbě například vaskulárního onemocnění, zhoubného bujení, zánětlivého a infekčního onemocnění, jako je například HIV.

V současné době se genová terapie nedá použít při léčbě člověka. Jeden hlávní důvod je, že genová terapie vyžaduje sbalení genů, které mají být zavedeny do genových nosičů nebo vektorů, jenž se mohou aplikovat pacientům a které budou cílit geny pouze do určených buněk. Takové vektory nejsou zatím dostupné ve spolehlivé formě.

Pro aplikaci genové terapie se zvažuje vhodnost několika tříd virů. Nejběžnější jsou adenoviry, retroviry, lentiviry a adeno-asociované viry.

Ideální vektory pro genovou terapii jsou ty, které se mohou aplikovat systémově a mohou dále zavádět požadovaný genetický materiál specificky do požadovaných buněk nebo tkání. Avšak viry, které se v současné době zvažují jako vhodné pro genovou terapii, vykazují rozsáhlý tropizmus a jsou schopny infikovat řadu různých typů buněk v lidském těle. Tato skutečnost omezuje potencionální bezpečnost virových vektorů a brání jejich použití při systémové aplikaci. Z tohoto důvodu se popisuje vývoj cílených virových vektorů schopných infikovat pouze vybrané buňky.

Nejvíce zkoumanou skupinou vektorů vhodných pro aplikaci při genové terapii jsou adenoviry. Lidské adenoviry se dělí do šesti hemaglutinačních skupin (A až F) a každá hemaglutinačni skupina se dále dělí na různé sérotypy. Celkem existuje více než 40 různých sérotypů lidských adenovirů. Adenovirus, který se nej častěji používá při genové terapii u člověka je adenovirus typu 5 (Ad5), který patří do hematoglutinační skupiny C. .

• ·

Adenoviry (Ad) jsou DNA viry bez obalu ve tvaru pravidelných ikozaedrů s průměrem 60 až 85 nm.

Adenovirový kapsid obsahuje 252 kapsomérů, 240 hexonů a 12 pentonů (popisuje se v publikaci Ginsberg et al., Virology, 28, 782-83 (1966)). Hexony se získaly ze tří virových proteinů. Hexon obsahuje tři shodné proteiny, kdy každý tvoří 967 aminokyselin, jmenovitě polypeptid II. Peňton obsahuje bázi, která se váže na kapsid a vlákno, které se nekovalentně váže na pentonovou bázi a vyčnívá z ní. Protein IX, VI a lila je také přítomen v adenovirovém obalu a pravděpodobně stabilizuje virový kapsid.

Navázání na buňky probíhá které jsou zakotveny ve virionu Vláknitý protein není nezbytný neporušených virionů. Sestavení infikovaných buněk.

pomocí vláknitých proteinů, na vrcholech ikosahedronu. pro sestavení a uvolnění virionů probíhá v jádru

Vláknitý protein, který je homotrimer vláknitého polypeptidu (jmenovitě adenovirový polypeptid IV) obsahuje tři funkčně odlišné části. Je to N-terminální konec, který nekovalentně kotví vlákno v pentonové bázi ve virionu, který dále obsahuje jaderný lokalizační signál. Dále obsahuje střední část obsahující různý počet repetic tvořených přibližně motivem patnácti aminokyselin (v Ad3 se například opakuje šestkrát, dvacet dvakrát se opakuje v Ad2 a Ad5) a dále obsahuje C-terminální globurální doménu, tzv. „knoflík, která obsahuje ligand vázající se na buněčný receptor adenoviru (popisuje se v publikaci Chrobozek et al., Microbiology and Immunology, (1995), p. 163-200). Knoflík také svou funkcí odpovídá za trimerizaci vlákna (to znamená, že začleňuje trimerizační motiv).

Každá repetice střední oblasti má dvě oblasti obsahující tři aminokyseliny, které tvoří strukturu beta-listů, a dvě • · · · · ·· ·· · • · · · · · · · · .······· · · ·· · · · ··· ···· ···« · ·· ··· · · ·· aminokyselinové oblasti,. které tvoří ohyb přirozené střední části vlákna. Stanovila se krystalická struktura trimerizované domény vázající se na buňky. Nese jedinečnou topologie, která se liší od jiných antiparalelních beta-sendvičů (popisuje se v publikaci Xia et al., Structure 2: 1259-1270, (1993)).

Navázání vlákna na pentonovou bázi virionu může také probíhat v systému, který neobsahuje buňky. To znamená, že vlákno se může také vázat na viriony, které neobsahují vlákno (popisuje se v publikaci Boudin et al., Virology, 116, 589-604, (1982)).

V dosavadním stavu techniky se popisuje úsilí věnované úpravě adenovirových vláken (například produkci rekombinantních proteinů tvořících vlákno) za účelem změnit vlastnosti adenovirových vektorů, například změnou tropizmu nebo schopností vázat se na. buňku.

Protein adenovirového vlákna poskytuje několik biologických funkcí, které musí zůstat zachovány za účelem vzniku aktivních virových částic. Následující rysy vlákna se zdají být klíčové při konstrukci funkčních upravených proteinů vlákna:

i) schopnost tvořit paralelní homotriméry. Tuto funkci zprostředkovává sekvence N-terminální aminokyseliny knoflíku vlákna divokého typu, ii) schopnost vázat se na pentonovou bázi za vzniku pentonových kapsomerů. Tuto funkci zprostředkovává Nterminální konec vlákna divokého typu, iii) schopnost exprimovat ligand vázající se na buňku, který umožňuje zachycení na cílových buňkách. Tuto funkci přirozeně zprostředkovává knoflík vlákna divokého typu (který se váže na buněčný receptor určený pro adenovirus), iv) schopnost transportovat do jádra infikované buňky, což umožňuje tvorbu viru. Tuto funkci hlavně, nikoliv • · • · · ·» • · · · · · · ·· · • · » ·· · * · · r · ····*· · · ··· ·

Cfc · · » · ···· ···· · ·· ·»· ·· ·* exkluzivně, zprostředkovává N-terminální konec vlákna divokého typu.

Předchozí pokusy změnit tropizmus adenoviru zahrnují genetické úpravy vláken a knoflíků. Tento přístup se však neukázal velmi úspěšný. Hlavní problém je začlenění nových ligandů, který jsou schopny změnit tropizmus, aniž porušují trimerizaci vlákna. Například krátký peptidový ligand se přidal na C-konec knoflíku (popisuje se v publikaci Michael et al., Gene Therapy, 2: 660-8, (1995)) a nonapeptid se začlenil do jedné smyčky knoflíku (popisuje se v publikaci Dmitriev et al., J. Virol., 72 (12): 9706-9713 (1998)). Knoflík má však velmi komplexní strukturu, která je způsobena interakcemi mezi třemi podjednotkami vlákna, které jsou nezbytné, aby se zachovala schopnost vázat se na buňku a schopnost trimerizace vlákna. Z toho důvodu knoflík toleruje začlenění pouze několika aminokyselin a proto do dnes neexistuje obecná metoda pro konstrukci funkčních adenovirových vláken, jejichž cílení je geneticky upraveno.

Dalším úkolem bylo zavést nové ligandy do jiných částí virionu adenovirů. Zavedením motivu ALAG, který obsahuje čtyři aminokyseliny, do pentonu adenoviru, je možné cílit adenovirus na buňky normálním způsobem, nikoliv infekcí adenovirem. Opětného cílení se dosáhlo cílením pomocí bispecifické protilátky, kdy jedna specifita se řídila proti peptidu FLAG a druhá proti nové cílové buňce (popisuje se v publikaci Wickham et al., J. Virol., 70: 6831-6838 (1996)).

Dřívější problém při produkci dostatečných rekombinantních virů pro genovou terapii spočívá v zajištění funkčního balení rekombinantních komponentů při expresi v jádru nebo cytosolu hostitelských buněk. To je zvláště relevantní v případě, že upravený virus divokého typu používá dílčí expresi v těchto vnitrobuněčných polohách během replikace, například jako rt ···· ··· ···· · v · ··· · e · · ···· · ·» ··· ·· ·· v adenoviru. Sbalené proteinové struktury zvláště ty, které se spoléhají na disulfidové vazby v cysteinových můstcích, aby udržely funkčně správnou konformaci, například ty, které se získaly z protilátek, mohou být sbaleny špatným způsobem a jsou nefunkční, když se exprimují v redukčním prostředí jádra nebo cytosolu, jako část rekombinantního virového komponentu. Je nutné vytvořit proteinové struktury, které si mohou zachovat funkční konformaci, když se exprimují jako virové komponenty v uvedených buněčných částech tak, že vazebné funkce, které struktury obsahují nebo podporují, zůstávají vazebnou funkcí, zvláště v nepřítomnosti ligandu, jehož navázání je nutné. To jsou hlavní problémy spojené s genetickou manipulací adenovirových vláken použitelných při konstrukci rekombinantních re-cílených adenovirů (Ad-virus) vhodných pro genovou terapii u lidí. Tyto problémy se považují za zvláště důležité, protože daleko nejvíce pacientů se ošetřovalo adenovirovými vektory ve srovnání s libovolným jiným vektorem (popisuje se v publikaci Trapnell et al, Biotechnology, 5: 617-625, (1994)). Vynález popisuje řešení takových problémů konstrukcí virů s geneticky upraveným cílením, které jsou vhodné pro genovou terapii, kde se získal nový tropizmus viru zavedením nového ligandu vázajícího se na buňku do proteinu virové části.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje produkci funkčních rekombinantních adenovirových vláknitých proteinů s novým tropizmem, které vzniknou odstraněním nebo rozrušením (například zablokováním nebo deaktivací) přirozené oblasti vázající se na buňku a jejím nahrazením nepřirozeným polypeptidem nebo přidáním nepřirozeného polypeptidu, který obsahuje externí ligand vázající se na buňku a externí trimerizační motiv. Dokumenty Curiel et al., WO 99/41 359, Wickham et al., WO 98/54 346 a Spooner and Epenetos v US 5 885 808 popisují různé úpravy • · _»····»« · · ·· · * · · · · ···· • ·· · · ·· ··* ·· ·* adenovirových komponent s, cílem vytvořit rekombinantní viry se změněným tropizmem. Žádný z těchto popisů neposkytuje řešení a dokonce ani nerozeznává problémy spojené s expresí funkčních nepřirozených virových komponentů v jádru a cytosolu hostitelských buněk. Problém řeší až uvedený vynález.

Vynález popisuje upravený virus obsahující nepřirozený polypeptid, který obsahuje jednu nebo více částí rámců, kdy každá obsahuje jednu nebo více vazebných částí, které je polypeptid schopen exprimovat v cytoplazmě a jádru savčí hostitelské buňky v prostorovém uspořádání, které je udržováno v nepřítomnosti ligandu vhodném pro uvedené vazebné části. Uvedené prostorové uspořádání umožňuje uvedeným vazebným částem se následně vázat na uvedený ligand. Uvedené vazebné části je polypeptid schopen transportovat přes jadernou membránu. Uvedený upravený virus má změněný tropizmus propůjčený uvedenými vazebnými částmi.

Upravený virus podle vynálezu je virus, který se liší od přirozeného (to je virus divokého typu) viru. Virus je upravený tak, že struktura části viru je změněna ve srovnání s přirozenou částí nebo částí divokého typu (to znamená neupravenou) nebo se k viru přidal strukturální komponent nebo rys, který se nevyskytuje v přirozené formě nebo ve formě divokého typu. Podle vynálezu se s výhodou změnily vlastnosti nebo chování komponentu. Jinými slovy upravený virus se liší funkcí ve srovnání s neupraveným virem (přirozený virus/virus divokého typu) (např. vykazuje změněný tropizmus). Jak se diskutuje shora v textu (a také dále v textu), virus se vhodně upravuje použitím geneticky upravených postupů. Upravený virus podle vynálezu je s výhodou rekombinantní virus.

Upravený virus podle vynálezu se může získat z libovolného viru. Libovolný virus se -'může použít jako základ virového vektoru vhodného pro genovou terapii. Reprezentativní virové • · · rodiny zahrnují adenoviry, retroviry, lentiviry a adenoasociované viry a zvláště zahrnují členy rodiny Adenoviridae nebo jiné virové rodiny, kde se virové strukturální komponenty syntetizují a/nebo prostorově sestavují v jádru nebo cytosolu hostitelské buňky. Jsou to například Reoviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Papovaviridae a Caliciciridae. Ve výhodném provedení vynálezu upravené viry podle vynálezu jsou upravené formy adenovirů, zvláště lidských adenovirů a lidského adenovirů typu 5.

Termín „nepřirozený polypeptid je polypeptidová sekvence tvořená dvěmi nebo více aminokyselinami, jejíž úplná sekvence se nenachází ve funkčně ekvivalentní poloze v aminokyselinové sekvenci viru divokého typu nebo zvláště v proteinu virového komponentu divokého typu, který se geneticky manipuloval.

V jistých výhodných provedeních vynálezu termín „nepřirozený polypeptid může také být nepřirozený v tom smyslu, že se nevyskytuje v přírodě. To znamená, že jde o synteticky a uměle zkonstruovaný nebo připravený polypeptid.

Prostorové uspořádání nepřirozeného polypeptidu po expresi ve vnitrobuněčném prostředí a také jeho prostorové uspořádání v extrabuněčném prostředí by mělo být takové, že je schopné vázat se na požadovaný ligand, například receptor nebo jinou molekulu exprimovanou na vnějším povrchu cílové buňky pro upravený virus.

Jak se uvádí shora v textu nepřirozený polypeptid, když se exprimuje v cytoplazmě savčí buňky má prostorové uspořádání, které je možné udržet v nepřítomnosti ligandu pro vazebnou(é) část (i) polypeptidu. Takové prostorové uspořádání je tak stabilním prostorovým uspořádáním. Jinými slovy po expresi v cytoplazmě polypeptid ^zaujímá prostorové uspořádání, která se udržuje v cytoplazmě a když se polypeptid transportuje do jádra, začleňuje se nebo se uspořádá do virové částice.

9>*

Prostorové uspořádání je .takové, že vazebné části polypeptidu jsou schopny se vázat na jejich ligandy, když spolu přicházejí do kontaktu.

Důležitý rys nepřirozeného polypeptidu podle vynálezu je jeho schopnost správně se sbalit v cytoplazmě nebo cytosolu savčí buňky, to znamená, že se předpokládá terciální nebo třírozměrná struktura, která umožňuje zachování funkčnosti vazebné části (to znamená, že si vazebné části uchovávají svou vazebnou aktivitu vzhledem k jejich ligandům). Jinými slovy vazebná část si uchovává schopnost vázat se na svůj ligand.

Rozpustnost rekombinantních proteinů se považuje za dobrý indikátor jejich správného sbalení. Proto nepřirozené polypeptidy podle vynálezu se mohou s výhodou vybrat nikoliv pouze na základě funkčnosti vazebných částí, stability prostorového uspořádání a schopnosti tvořit část vzniklého virionu, ale také na základě rozpustnosti v buňkách, ve kterých se exprimuje nepřirozený polypeptid nebo protein virové části obsahující nepřirozený polypeptid. U rekombinantních vláknitých proteinů se může testovat jejich exprese v eukaryontních (například v hmyzích) buňkách a stanovila se část získaná v rozpustné frakci buněčných lyzátů.

Zjistilo se, že fenotypická analýza fúzních konstrukcí vlákno-ligand exprimovaných jako rekombinantní proteiny v hmyzích buňkách infikovaných bakuloviry ukazuje, že jejich stupeň rozpustnosti odpovídá izolaci životaschopného rekombinanntího adenoviru. Proto je výhodné, že libovolný nepřirozený polypeptid podle vynálezu nebo protein virové části obsahující nepřirozený polypeptid například fúzní konstrukce vlákno-ligand se charakterizuje s ohledem na jejich rozpustnost a zachycení na cílové buňce jako rekombinantní protein dříve než dojde opětnému začlenění odpovídajícího genu do virového například adenovirového genomu.

• · · « lo ··:· *: :

Vynález dále popisuje upravený virus, kde uvedený nepřirozený polypeptid se vybral za použiti testu rozpustnosti nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující nepřirozený polypeptid. Nepřirozený polypeptid se vybral tak, že více než 25 %, s výhodou více než 30 %, výhodněji více než 50 % nebo dokonce 70 % nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující nepřirozený polypeptid je přítomno v rozpustné frakci buněčného lyzátu buněk exprimujících nepřirozený polypeptid nebo protein virového komponentu obsahujícího nepřirozený polypeptid. Vhodný test se popisuje v příkladech a může se aplikovat s příslušnými změnami i v jiných buněčných expresívních systémech. Nepřirozený polypeptid nebo virová část obsahující uvedený nepřirozený polypeptid je rozpustný v buněčném prostředí znamená, že alespoň 25 až 30 % polypeptidu je přítomno v rozpustné frakci buněčného lyzátu, pak se polypeptid považuje za rozpustný.

Vynález dále popisuje způsob stanovení vhodnosti nepřirozeného polypeptidu (například rekombinantní virový fúzní protein) pro použití při přípravě virového vektoru stanovením jejich rozpustnosti v buněčném systému. Popisuje se způsob testování rozpustnosti nepřirozeného polypeptidu nebo upravené části virového proteinu podle vynálezu, který zahrnuje kroky i) exprese uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo části virového proteinu, která obsahuje uvedený nepřirozený polypeptid v přípustných buňkách, ii) buňky se lyžují za vzniku buněčného lyzátu, iii) oddělení rozpustné a nerozpustné frakce v buněčném lyzátu, iv) analýza rozpustné a nerozpustné frakce buněčného lyzátu, kdy se sleduje obsah uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo části virového proteinu, který obsahuje nepřirozený polypeptid a v) porovnání relativního obsahu uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo části virového proteinu, který obsahuje nepřirozený polypeptid • · · · π· ··:· ·: :

v rozpustné a nerozpustné frakci za účelem stanovení rozpustnosti.

Ligand vhodný pro vazebnou část podle vynálezu je ligand, který odpovídá vazebné části nebo jinými slovy, je to ligand, pro který byla vazebná část navržena nebo vybrána tak, aby došlo k jejímu navázání. Ligand je tak schopný se vázat na vazebnou část. Ligand a jeho vazebná část se považuje za člena páru vázajícího se na základě afinity, přičemž ligand je vazebným partnerem pro vazebnou část.

Vazebná část tak vykazuje vazebnou specifitu nebo je schopna se specificky vázat na požadovaný ligand. Termín „vazebná specifita nebo „specificky se vázat znamená, že vazebná část je schopna se vázat na požadovaný (tedy cílený) ligan způsobem, který se liší od navázání na molekuly nebo ligandy, které nejsou cílem. Vazebná část se buď neváže na molekuly, které nejsou cílem, nebo vykazuje nepodstatné nebo podstatně sníženou (ve srovnání s cílovým ligandem) schopnost vázat se na molekuly, které nejsou cílem, což tvoří tzv. pozadí. Vazebná část tak specificky rozeznává cílový ligand.

Specifita navázání vazebné části tak umožňuje selektivní cílení upraveného viru. Jinými slovy vazebná část se může navrhnout nebo vybrat tak, aby došlo k navázání upraveného viru na požadovanou nebo „cílenou buňku. Může se navrhnout nebo vybrat vazebná část, která se váže na ligand exprimovaný cílenou buňkou nebo na povrchu cílené buňky.

Ligandem tak může být požadovaný ligand a s výhodou se molekula exprimuje na povrchu cílové buňky, ve které se požaduje dosáhnout exprese upraveného viru. Ligandem tak může být receptor na povrchu buňky nebo buněčný povrchový antigen. Ligandem může být molekula proteinu nebo polypeptidu, ale může být libovolné molekulové povahy například lipid nebo uhlovodík.

• · * · • « • ♦ ···

Upravený virus se může upravovat tak, aby se vázal na požadovanou cílovou buňku, na kterou se přirozený virus (virus divokého typu), z kterého se upravený virus odvodil, neváže. Nebo se může upravit tak, aby se dosáhlo více omezené vazebné specifity ve srovnání s virem divokého typu. Jinými slovy váže se pouze na vybranou nebo určitou podsadu nebo typ cílové buňky z široké populace typů cílových buněk, na kterou se váže i virus divokého typu. Takto se mění tropizmus viru. Termín „změněný tropizmus znamená, že upravený virus vykazuje vazebnou specifitu vůči cílové buňce, která je změněna, nebo odlišnou vazabnou specifitu ve srovnání s vazebnou specifitou viru divokého typu, ze kterého se získal.

přítomností polypeptidu,

V obecném případě nepřirozený polypeptid podle vynálezu obsahuje alespoň jednu rámcovou část a jednu nebo více vazebných částí a je schopen interagovat s jinými virovými částmi za vzniku funkční a infekční virové částice. Schopnost tvořit část funkční virové částice může jedné nebo více sekvencí který ovlivňuje navázání na komponenty samotným nepřirozeným polypeptidem nebo virovou částí, která obsahuje nepřirozený polypeptid.

být usnadněna v nepřirozeném další virové

Nepřirozený polypeptid podle vynálezu může nahradit část virového proteinu, který může reagovat s cílovou buňkou, nebo se do něho může začlenit. Upravená část viru (například rekombinanta) vykazuje buněčnou vazebnou funkci buď na základě zachované přirozené struktury samotné virové části nebo nové struktury, která vznikla začleněním nepřirozeného polypeptidu a libovolných obsažených struktur. Nepřirozený polypeptid podle vynálezu je zaveden nebo začleněn do části virového proteinu viru divokého typu nebo s ním tvoří fúzní protein, například adenovirový vláknitý protein. Zvláště je začleněn tak, že se odstraní knoflík vlákna divokého typu (nebo alespoň

13’ ·· ··· · jeho doména vázající se .na buňku) (je například nahrazena). V jiném provedení vynálezu knoflík vlákna viru divokého typu ( nebo jeho doména vázající se na buňku) může být zachována a dále nebo navíc díky vazebné části nebo vazebným částím nepřirozeného polypeptidu Rysem vynálezu je, že buněčné vazebné funkce se liší od vazebných funkcí viru divokého typu tak, že u manipulovaného viru je přítomen změněný virový tropizmus. V případě, že se zachová knoflík vlákna divokého typu (nebo jeho doména vázající se na buňku), uvedeného změněného tropizmu je možné dosáhnout úpravou jeho vazebné domény v oblasti knoflíku, aby došlo kde aktivaci nebo blokaci přirozené vazebné funkce na buňku.

Jak se diskutuje dále v textu, může být za daných okolností nutné zkonstruovat nebo manipulovat upravený virus, kde je nutné řídit (například dočasně řídit) expresi změněného tropizmu. V takovém upraveném viru je možné zachovat přirozený tropizmus nebo tropizmus divokého typu zachováním knoflíku vlákna divokého typu nebo jeho domény vázající se na buňku vedle nepřirozeného polypeptidu, který udílí změněný tropizmus. To je například nutné při propagaci upraveného viru v běžných buněčných liniích, které jsou v oboru známy, kdy v upraveném viru je dále přítomna vazebná funkce divokého typu, například prostřednictvím řízené exprese genu adenovirového vlákna divokého typuz indukovatelného řídícího elementu (například promotor).

Když je třeba, tropizmus se může odstranit řízenou expresí dalších genů části viru divokého typu nebo po expresi odstraněním nebo deaktivací domény knoflíku divokého typu takovým způsobem, že se může exprimovat změněný tropizmus vytvořený nepřirozeným polypeptidem.

Termín „změněný tropizmus podle vynálezu zahrnuje „potencionální změněný tropizmus, to znamená potenciál • · exprimovat změněný tropizmus. To také zahrnuje tropizmus, který je přidaný kmtpopizmu divokého typu.

změněný

Jak se uvádí shora v textu, upravený virus podle vynálezu se přednostně připravuje použitím metod genetických manipulací a v preferovaném provedení vynálezu se nepřirozený polypeptid vyskytuje jako část fúzního proteinu s částí virového proteinu, s výhodou jako fúzní protein s adenovirovým vláknitým proteinem. Takový fúzní protein nebo obecněji taková upravená část virového proteinu reprezentuje oddělenou předmětnou věc vynálezu. V preferovaném provedení uvedeného vynálezu je upravená virová část je upravený adenovirový vláknitý protein obsahující nepřirozený polypeptid, jak se definuje shora v textu.

Způsoby přípravy takových nepřirozených polypeptidů a jejich zavedení do virů nebo částí virů jsou velmi dobře známy v oboru a popisují se v literatuře. Metody molekulární biologie nebo metody genetické manipulace jsou snadno dostupné a používají se při přípravě nebo konstrukci genetických sekvencí schopných exprimovat se jako upravený virus nebo virová část podle vynálezu. Jak se popisuje dále v textu v sekci příkladů provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny nebo nukleotidová sekvence kódující část virového proteinu, jako je adenovirový vláknitý protein, se může upravit tak, že se do něho zavede nukleotidová sekvence kódující nepřirozený polypeptid tak, že kóduje fúzní protein obsahující celý nebo část adenovirového vláknitého proteinu a nepřirozený polypeptid.

V závislosti na části virového proteinu, do kterého je začleněn nepřirozený polypeptid nebo jehož komponent je nahrazen, nepřirozený polypeptid podle vynálezu může obsahovat další element, který napodobuje přirozenou strukturu nebo funkci virové části (to znamená, že je funkční ekvivalent • · · · · · ·· · * * ·

15··:.:. • · ·>·· ·

··· vírové části) tak, že umožňuje sestavení funkčních virionových částic. V případě upravených adenovirových částic podle vynálezu funkční integrita adenovirového vlákna s ohledem na sestavení virionů a zvláště sestavení kapsidu je udržována přítomností externího aminokyselinového trimerizačního motivu, jako je helikální aminokyselinový motiv získaný z holé oblasti lidského plicního povrchového proteinu D (popisuje se v publikaci Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 191-195 (1994)). Tento a jiné trimerizačné motivy, které jsou známy v oboru, se mohou funkčně manipulovat do střední části vlákna a působí jako signál trimerizace vlákna za vzniku vláken, které neobsahují knoflík. Trimerizační motivy vhodné pro inkluzi v upravených virech se popisují v patentovém dokumentu WO 98/54346 a WO 99/41359. V preferovaném provedení podle vynálezu nepřirozený trimerizační motiv přítomný v nepřirozeném polypeptidu je oblast krčku peptidu pocházející z povrchově aktivního činidla D lidských plic.

Jak se popisuje v příkladech dále v textu, může být vhodné nebo nezbytné, aby se takový další nebo externí motiv nebo rys začlenil do viru jako linkerová sekvence. V dosavadním stavu techniky jsou známy uvedené metody vhodné pro začlenění DNA nebo aminokyselinových sekvencí prostřednictvím zachycení linkerové sekvence a jsou pro odborníka rutinní praxí.

Termín „část rámce zde popisuje strukturu polypeptidu (například protein), který si uchovává funkční (například sbalenou) strukturu (nebo konformaci) v jaderném nebo cytosolickém buněčném prostředí. Takové funkční struktury jsou struktury, které umožňují, aby se vazebná část zachytila nebo začlenila do části rámce a přitom se v případě, že ligand není přítomen, zachovalo uspořádání vhodné pro navázání na ligandu. To umožňuje následné navázání na ligand například, když znovu sestavený virion opustí prostředí buňky.

#· * • · · ···· ··· · ·

Základní část pak tvoří typ tzv. „molekulární podpůrné struktury, která poskytuje základ pro podporu nebo „podržení vazebné části ve vhodné prezentaci či uspořádání, aby došlo k navázání na jeho ligand. Základní část také poskytuje vnitromolekulární interakci tvořící možné stabilní uspořádání v cytosolu. Základní částí tak může být molekula proteinu nebo polypeptidu, která zaručuje určité uspořádání v určité oblasti nebo oblastech. Může dojít například k adici, inzerci, deleci nebo substituci aminokyselinové sekvence nebo k začlenění polypeptidové sekvence.

Termín „vazebná část je polypeptidová struktura zachycená na základní části nebo obsahující část základní části podle vynálezu, která si uchovává funkci vázat se na požadovaný (cílový) ligand po expresi nepřirozeného polypeptidu, jehož je součástí, v jádru nebo cytosolu hostitelské buňky.

Vazebná část může být kontinuální nebo nekontinuální sekvence aminokyseliny a může poskytovat vazebné místo pro cílový ligand. Vazebná část tak může být tvořena oblastí molekuly proteinu nebo polypeptidu, například povrchovou oblastí, například určitým počtem „povrchových aminokyselinových zbytků.

V jistém výhodném provedení vynálezu základní a vazebná část mohou být různého původu. Mohou se například získat nebo odvodit z rozdílných zdrojů (například z různých proteinů) a to například vnesením nebo připojením požadované vazebné částí do nebo k požadované základní kostře. V jiných preferovaných provedeních se může vazebná část vytvořit v proteinové základní struktuře úpravou jistých oblastí nebo zbytků základního stavebního proteinu, jak se popisuje dále v textu. V takovém provedení vynálezu může být základní část reprezentována konstantními nebo neupravenými zbytky a vazebnou část mohou tvořit variabilní nebo upravené zbytky.

·· ··· · ·· · • · · *ι 7 * · * / ♦ ····

• · * ♦ · · • · · • · · · • · ··

Nepřirozený polypeptid podle vynálezu může být kombinovaný protein, který se připravil náhodnou mutagenezi určité proteinové struktury za vzniku vazebného proteinu s novými, upravenými nebo zesílenými vazebnými charakteristikami. Takové uměle konstruované „umělé (ve smyslu nepřirozené) proteinové molekuly vázající se na základě afinity (to je proteiny manipulované tak, aby vykazovaly určitou nebo novou vazebnou funkci) jsou obecně známy v oboru.

Takové kombinované proteiny se mohou připravit použitím různých peptidů nebo proteinů jako počáteční struktury (popisuje se v publikaci Nygren and Úhlen, Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469, 1997). Takové proteiny jsou známy v oboru a mohou se v typickém případě připravit náhodnou mutagenezi cílového proteinu , expresí celé knihovny uvedených variant například na povrchu vláknitého bakteriofágu. Pak následuje výběr proteinu vykazujícího požadované vazebné charakteristiky. Tento výběr může v typickém případě zahrnovat vazebnou reakci mezi proteinem a cílovým ligandem (vazebný partner), který může být ímobilizován a tato reakce může proběhnout in vitro nebo in vivo. Mutageneze je náhodná tím, že výsledná aminokyselina kódovaná libovolným kodonem není obecně předem stanovena, ale polohy, do kterých se mutace zavedou jsou předem známy. Mutageneze může substituci, deleci nebo adici aminokyseliny inzerci).

zahrnovat (například

Výhodné kombinované proteiny vhodné pro použití jako nepřirozené polypeptidy podle vynálezu jsou proteiny známé v oboru jako „afilátky Termín „afilátky definuje molekulu vázající se na základě afinity. Tato molekula se odvodila z bakteriálního receptorového proteinu nebo jeho vazebné domény, která se upravila'· (například genetickou manipulací proteinu), přičemž se také upravily (například změnily nebo »» ·♦·· • · · * · ·· · · · «ίο··· ·· · * · ·

Ιο* ·♦·«♦· * · ·· · * • * * · ♦ · · · · ···· · ·· ··· ·* ·* zesílily) vazebné vlastnosti. „Afilátka je nepřirozený protein (ve smyslu, že se nevyskytuje v přírodě) a dále je výhodné, aby obsahoval nové vazebné místo. Příklady a další popis takových proteinových molekul jsou uvedeny v patentovém dokumentu WO 95/19374.

Použití expresivního systému jako je prokázání na povrchu fága poskytuje důležité propojení genotypu a fenotypu. Existuje zde jednotka, která se může vybrat na základě svých specifických vazebných interakcí a který také nese nukleovou kyselinu kódující protein odpovědný za pozorování vazebných charakteristik. To umožňuje dostatečně silnou expresí proteinu, který se vybral na základě svých vazebných charakteristik, přičemž exprese v typickém případě probíhá v transformovaném bakteriálním hostiteli.

Protein vybraný na základě své schopnosti vázat se na cílový ligand (například požadovanou buněčnou povrchovou molekulu) se pak může použít k přípravě upravených virů nebo virové části podle vynálezu nebo se může použít nukleotidová sekvence požadovaného proteinu.

Způsob konstrukce kombinované knihovny molekul proteinu a následný výběr proteinových vazebných molekul, které mají požadované vazebné charakteristiky jsou dobře známy v oboru (popisuje se v publikaci Nygren, P. and Uhlén, M. Current Opinion in Structural Biology (1997) 7: 463-469). V obecném případě se molekula proteinu, která pravděpodobně má podstatné výhodné vlastnosti, jako je necitlivost vůči teplotě nebo pH nebo stabilita uspořádání, používá jako podpora nebo základ a kombinovaná knihovna se pak konstruuje prostřednictvím náhodné, ale cílené substituce aminokyselin (nebo jinými mutacemi)uvedené proteinové molekuly za účelem vytvořit knihovnu molekul, které mají odlišné vazebné charakteristiky.

1£ • · • · · ► ····

Povrchové zbytky jsoz ' v obecném případě cílem náhodné mutageneze.

Vedle technologie vyjevení fága (popisuje se v publikaci Smith et al., Meth. Enzym. 217, 228-57 (1993)) další metody konstrukce knihovny a selekce zahrnují například ribozomální odhalení (popisuje se v publikaci Hanes et al., Proč. Nati., Acad. Sci. USA 94: 4937-4942 (1997)), peptidy na plazmidech (popisuje se v publikaci Schatz et al., Methods Enzymol., (1996) 267: 83-109), fúze RNA-protein (popisuje se v publikací Roberts et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA94: 12297-12302 (1997)) a spojení DNA-protein (STABLE) (popisuje se v publikaci Doi et al., FEBS Lett, 457(2): 227-30, (1999)).

Vhodným proteinovou základní konstrukcí mohou být lineární peptidy, ale základní struktura bude s výhodou obsahovat sbalenou třírozměrnou strukturu, která má potenciál pro vyšší afinity a je méně náchylná vůči proteolytickému štěpení. Ačkoliv základní struktura se může navrhnout jako nová, většinou se pro další manipulaci vybírají přirozeně se vyskytující proteiny nebo domény. Aby nedošlo k omylu, je nutné poznamenat, že termín „protein definuje celé molekuly proteinu, stejně jako jeho části nebo fragmenty, polypeptidy nebo peptidy.

Volba proteinové kostry závisí na několika parametrech, které zahrnují schopnost účinně se exprimovat v požadované hostitelské buňce (například savčí buňka). Protein by měl také obsahovat na svém povrchu dostatečně velké oblasti, které jsou tolerantní k substituci (nebo k inzerci nebo deleci atd.), aniž ztrácejí trojrozměrnou strukturu. Jestliže se knihovna produkuje synteticky, je nutná její malá velikostV případě, že vybraný protein kostry vykazuje vazebnou funkci, aminokyselinové zbytky, ktěré se podílejí na této interakci mohou být cílem náhodné mutace. Náhodná mutace se může ···· • · ♦ * · • · · · · • * · · ·

ΟΛ ♦ ··«· · · · z U· · · · ·«·· · ·· ·« · · 4» « « · · » * · · · ♦ · · · » ··· ·♦ ·· uskutečnit za účelem zvýšení známých vazebných vlastností nebo za účelem vyvinout vazebné molekuly s novými specifikacemi.

Vhodné molekuly kostry se popisují v publikaci Nygren and Úhlen, Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469, 1997 a zahrnují ve vynucené sekvenci cyklické peptidy (počet aminokyselinových zbytků v takové vynucené sekvenci není kritický a může být 5 nebo více, například 5 až 10 nebo více, například 40 nebo více), podpůrné molekuly podobné imunoglobulinům zahrnující Fv nebo jednořetězcové domény (scFv), bakteriální receptory, jako je jedna doména obsahující 58 zbytků, analogy Z stafylokokového proteinu A (SPA)(„oblast Z je derivát domény B SPA) nebo jiné domény nebo analogy SPA, proteiny vázající DNA zvláště zinkové prsty a inhibitory proteáz.

Určitý zájem se věnuje oblasti Z bakteriálního receptoru. V publikaci Nord et al., Protein Engineering 8(6): 601-608 (1995) se dále popisuje způsob konstrukce kombinované knihovny molekul proteinů založených na doméně Z, která se může aplikovat do rozmezí molekul kostry. Popisovaný způsob probíhá na pevné fázi a je založen na postupném sestavení náhodných jednořetězcových oligonukleotidů.

Vedle úprav aminokyselinových sekvencí nebo zbytků v molekule za vzniku vazebné části, se může vazebná část zavést do části kostry, například začleněním nebo přidáním polypeptidu, který obsahuje vazebnou část. Vazebná část se tak zachytí na kosterní části. V takovém případě vazebná část vznikne na základě afinity vazebného partnera pro požadovaný cílový ligand.

Výhodné vazebné části podle vynálezu se mohou získat z ligandů (to jsou vazební partneři) vhodných pro buněčné povrchové receptory, z protilátek proti receptorům (nebo z jejich fragmentů nebo derivátů), z buněčných specifických ··«« «« · ·· • · · · ♦ ·· · · · • ♦ -» «V » ♦ · · *······« · » · t · · · ♦ « · ·· 9 ···· · ·· ·»· ·· ·· peptidů, z jednořetězcových protilátek (ScFv), z protilátek s jednou doménou a z minimálních jednotek rozeznávajících protilátek, jako jsou oblasti určující komplementaritu (CDR) fragmentů Fv. Vazebná část se tak může získat nebo odvodit z místa vázající antigen nebo z oblasti protilátky vázající nebo rozeznávající antigen. Taková protilátka může být přirozená nebo syntetická.

Vynález dále popisuje vazebné části získané z peptidů nebo polypeptidů v libovolné formě, která zahrnuje hormony, protilátky, receptory T buněk, afilátky a ligandy identifikované z různých proteinových knihoven.

Jak se uvádí shora v textu, důležitý rys nepřirozeného polypetidu je ten, že prostorové uspořádání se udržuje v cytoplazmě a v jádru savčí buňky tak, že zůstává zachována vazebná funkce vazebné části. Jak se dále uvádí shora v textu, této skutečnosti lze dosáhnout poskytnutím nepřirozeného polypeptidu, který udržuje správné sbalení v cytoplazmě a jádru savčí buňky. Zjistilo se, že takového správného sbalení je možné dosáhnout použitím nepřirozeného polypeptidu, kde prostorové uspořádání nezávisí na disulfidové vazbě (to znamená, že neobsahuje disulfidové vazby). Jak se popisuje dále v textu, dalším výhodným rysem nepřirozeného polypetidu podle vynálezu je přítomnost α-helikální struktury.

Dokument WO 95/19 374 popisuje několik proteinů kostry, které sdílí výhodný rys, jejichž prostorové uspořádání nesouvisí s vazbami S-S. Takové proteiny kostry jsou použitelné jako části kostry podle vynálezu. Tyto části zahrnují bakteriální receptory, jako je stafylokokový protein A (typ aaa), protein G (vazebné části IgG, typ ββαββ) a protein G (vazebná část HSA, typ ααα) . Části kostry podle vynálezu se mohou také získat z různých bakteriálních receptorů, jako jsou například ty uvedené v tabulce č. 1:

·· ··»· ·· · • · · · » ·

2a· ··:· ·:

«· • ·

1»

99

Tabulka č. 1: Příklady receptorů gram pozitivních bakterií

recept or[l i gand]a	původ
Fc[IgG]recepotr typ I	Staphylococcos aureus
Fc[IgG]recepotr typ II	Staphylococcus pyogenes (skupina A)
Fc[IgG]recepotr typ III	Streptococcus skupina C, G, L
Fc[IgG]recepotr typ IV	bovinní streptokoci skupina G
Fc[IgG]recepotr typ V	Streptococcus zooepidemicus (skupina C)
Fc[IgG]recepotr typ VI	Streptococcus zooepidemicus S212
receptor fibronektinu +	S. aureus, streptokoci
M protein	Streptococcus pyogenes (skupina A)
receptor plasminu	streptokoci skupiny A
kolagenový receptor	S.aureus, streptokoci
receptor fibrinogenu	streptokoci skupina A, C, G
protein L (6 lehkých řetězců)	Peptostreptococcus magnus
protein H (lidský IgG)	Streptococcus pyogenes (skupina A)
protein B(lidský IgA, Al)	streptokoci skupina A
receptor sérového albuminu	streptokoci skupiny A, C, G

^aligand je označen, když jeho název není zřejmý z názvu receptorů

Části kostry podle vynálezu nejsou omezeny na struktury pocházející z bakteriálních receptorů. Vynález také popisuje jiné polypeptidy, které obsahují α-helikální struktury, které se také nazývají α-helikální dvoušroubovice, které jsou známy z různých zdrojů (popisují se v publikaci Cohen et al., Science 263: 488-489, (1994), Harbury et al., Science 262:

·· ···· *· « • · · * · ·

23.· ··:· ···< · «· • · • « • · ·· ·· ··· «

• « ·· • · • · • · • 9 · ··

1401-1407, (1993)). Šroubovice tvořící kostru v těchto peptidech obsahuje repetice aminokyselinových sekvencí obsahujících charakteristicky umístěné hydrofóbní zbytky. Stabilita struktury α-helikální dvoušroubovice nezávisí na intramolekulárních nebo intermolekulárních disulfidových můstcích. Příklady α-helikální dvoušroubovice jsou holé oblasti peptidu, které pocházejí z lidského plicního povrchově aktivního proteinu D, členové superrodiny spektrinu, leucinové zipy a část hemaglutininu ve viru influenzae.

Zvláště preferované jako zdroje nepřirozených polypeptidů podle vynálezu jsou členové rodiny svazků tříšroubovic (například jako Z-oblast stafylokokového proteinu A).

V jednom provedení vynálezu nepřirozený polypeptid podle vynálezu obsahuje část kostry, která je založena na struktuře oblasti získané z bakteriálního receptoru. Výhodné struktury částí kostry podle vynálezu se získaly ze strukturních tříd alfa-alfa-alfa-trojšroubovice nebo beta-beta-alfa-betabeta. Výhodné jsou také struktury založené na rodinyě ahelikální dvoušroubovice nebo z ní získané, zvláště členi libovolné rodiny 2-, 3- nebo 4-helikální dvoušroubovice.

V jednom provedení podle vynálezu se předpokládá, že vazebná část je přítomna ve formě jednoho nebo více helikálních svazků a/nebo ve formě jedné nebo více smyček, které spojují tyto svazky.

V dalším provedení vynálezu je část kostry založena na struktuře oblasti získané ze stafylokokového proteinu A, streptokokového proteinu G nebo proteinu L, který pochází z mikroorganizmu Peptostreptococcus magnus.

V dalším výhodném provedení vynálezu se část konstrukce odvodila z oblasti Z vázající se na imunoglobulin. Uvedená • · · • ···· • · • · · · · oblast Z pochází ze stafylokokového proteinu A (popisuje se v publikaci Z. Nord et al., Protein Engineering 8(6): 601-608 (1995)).

V takovém provedení se vazebná část může vytvořit manipulací kombinovaného proteinu, jak se diskutuje shora v textu. V jiných provedeních vynálezu se vybraná oblast nebo protein (například oblast Z) může použít ve formě divokého typu, jako nepřirozený polypeptid podle vynálezu.

Jak se uvádí shora v textu, prostřednictvím upraveného kombinovaného proteinu, například cílením na zbytky domény Z umístěné na povrchu, se mohou knihovny zkonstruovat z různých nových variant (to jsou nové vazebné molekuly) nazvaných afilátky Z-domény. Mohou se vybrat na základě navázání na požadovaný cílený ligand (popisuje se v publikaci Hansson et al., Immunotechnology 4: 237-52 (1999)).

Výhodné nepřirozené polypeptidy založené na Z-doméně mohou obsahovat následující aminokyselinové sekvence:

VDNKFNKEXXXAXXEIXXLPNLNXXQXXAFIXSLXDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK [SEQ. ID. NO.: 45];

a.

VDNKFNKEXXXAXXEIXXXXXXXXXQXXAFIXSLXDXXXXSANLLAEAKKLNDAQAPK [SEQ. ID. NO.: 46] , kde symbol X je libovolná aminokyselina.

Ve shora uvedených polypeptidech konzervované (to znamená specifikované) aminokyselinové zbytky mohou obsahovat části kostry a variabilní zbytky X, jak poskytuje vazebná část.

Dále stabilita části kostry podle vynálezu není závislá na alfa-šroubovici, což umožňuje, že po expresi nepřirozeného ·· · • · · • · · • ·· · · ♦ · • · · · · • ·

polypeptidu v jádru a cytosolu hostitelské buňky se zachová požadované uspořádání vhodné pro navázání na ligand svou vazebnou částí. Takové kostry například zahrnují kostry získané z jistých protilátek a jejich derivátů, které jsou dobře známy v oboru a nevyžadují přítomnost disulfidových můstků k udržení struktury a mohou se proto exprimovat jako část rekombinantního viru v jádru nebo cytosolu hostitelské buňky, zatímco zůstává zachováno prostorové seskupení a funkčnost jako vazebné části pro požadovaný ligand. Jiné struktury protilátek podle vynálezu zahrnují struktury protilátek, ve kterých strukturně relevantní zbytky cysteinu jsou nahrazeny zbytky alaninu a uchovávají si vazebnou specifitu protilátky.

Vynález popisuje další části kostry například sekvence získané z protilátek (například monoklonální protilátky) a protilátek přeměněných na jednořetězcovou formu, což následuje po konstrukci genetických fúzí s částmi viru nebo po úpravách částí viru. V takovém případě, kde se používá část kostry odvozená od protilátky, pak podobně, jak se popisuje shora v textu, se může vytvořit vazebná část manipulací genu nebo proteinu (například úpravou jistých aminokyselinových zbytků) nebo vazebná část se může začlenit (například připojit nebo vnést) do protilátkové kostry.

Fragmenty protilátek, které zaručují požadovanou vazebnou aktivitu, se mohou použít jako vazebné části pro začlenění smyček nebo oblastí (CDR) protilátek určujících komplementaritu s požadovaným tropizmem do části kostry, která je schopna se správně sbalit. To znamená, že je schopna si v cytoplazmě zachovat vazebnou specifitu připojených nebo začleněných vazebných částí a následně je dopravit do jádra buňky, kde probíhá sestavení viru. Jinými slovy vazebnou částí může být CDR protilátky.

· · • ·· ·

• e · • · · · · · • · φ · · · φ

Jisté kostry tvořené protilátkovou strukturou se mohou použít jako části kostry, například při spojení vazebných částí odvozených od protilátek nebo založených na protilátkách, například smyčky určující specifitu (CDR), což vede k přímé konstrukci protilátek vhodných pro konstrukci cílených virových částic.

Kostra protilátek se může použít jako část kostry (například se jako vazebná část použije smyčka CDR) podle vynálezu, což umožňuje produktivní balení v cytoplazmě a následný transport do jádra buňky. Vytvořily se jednořetězcové fragmenty z monoklonálních protilátek bez disulfidových vazeb (popisuje se v publikaci Proba et al., J. Mol. Biol., 275: 245-53, (1998)). Takové protilátky scFv mohou splňovat funkční kritérium uvedené shora v textu a mohou se použít jako části kostry podle vynálezu. Vazebná část může tvořit vazebné místo samotné protilátky scFv nebo se může dále manipulovat, jak se popisuje shora v textu.

Také se dosáhlo vnit.robuněčné selekce funkčních protilátek, které pocházejí z polyklonálního repertoáru (popisuje se v publikaci Gargano et al., FEBS Letters 414: 537-40, (1997)). Tento postup výběru se použil při určení fragmentů protilátek vhodných pro genetické opětné cílení adenovirů, které jsou zvláště vhodné pro použití jako kostra a/nebo jako vazebné části podle vynálezu.

Jiné použitelné kostry protilátek zahrnují ty kostry, které jsou založené na velbloudích protilátkách, jenž přirozeně postrádají lehké řetězce nebo jisté oblasti VH získané z běžných protilátek.

Příklad protilátkové kostry podle vynálezu, která je schopna produktivního balení v cytoplazmě, je určitý jednořetězcový fragment Fv anti-beta-galaktozidázy. Tento variabilní fragment jediného řetězce (VK, linker, VH) reaguje • · · • · · • · · · · c · • ·« · « •· · ·· ···· • · · · · · · • · · · · · · • ♦ · · · · · ·· «· · ·· ·· s beta-galaktozidázou a je schopen se exprimovat v cytoplazmě, jak se popisuje shora v textu (popisuje se v publikaci Martineau P and Betton J-M: J. Mol. Biol. 292, 921-929 (1999) ) . Vynález dále popisuje upravený virus obsahující část kostry, která obsahuje sekvenci kódující uvedený antibetagalaktosidázový jednořetězcový fragment Fv (SEQ ID NO: 47) a jeho funkčně ekvivalentní varianty.

Vynález se také omezuje na části kostry založené na struktuře protilátky a afilátky (například receptor), která se rozšířila, aby zahrnovala další struktury, přičemž je schopna po expresi v cytosolu/jádru infikovaných buněk si zachovat vazebnou specifitu zachycených nebo začleněných vazebných částí.

V upraveném viru podle vynálezu mohou být přítomny dva nebo více nepřirozených polypeptidů, které například mají odlišné vazebné specifity. Nepřirozené polypeptidy se mohou začlenit do dvou nebo více různých vazebných částí nebo do dvou nebo více různých kosterních nebo vazebných částí konstrukcí.

Vynález popisuje upravený virus, který obsahuje první nepřirozený polypeptid, jenž se váže na cílovou buňku a druhý nepřirozený polypeptid, který se váže na produktivní nebo permisivní buňku.

Nepřirozené polypeptidy podle vynálezu tak mohou být přítomny v rekombinantních částech viru, které obsahují bifunkční nebo multifunkční části konstrukce (nebo konstrukce vazebných částí, které se vyskytují v kostře), jenž vznikají prostřednictvím genetické fúze mezi dvěmi nebo více různými částmi kostry (konstrukce kosterní/vazebné části). Použití takových částí kostry (nebo _tkonstrukcí vazebných částí kostry) mohou například odpovídat za infekčnost řady buněčných cílů pro rekombinantní virus.

• · · · · * · « ·· · · β·

Vynález také popisuje upravený virus, ve kterém nepřirozený polypeptid podle vynálezu obsahuje místo štěpení umístěné v poloze, která umožňuje odštěpení vazebné části nepřirozeného polypeptidu od upraveného viru. Příklady vhodných míst štěpení jsou místa náchylná ke štěpení enzymem Faktor Xa nebo proteázou, jako je proteáza lidského rhinoviru 3C. Jestliže se štěpení provádí na genetické úrovni, například v molekule nukleové kyseliny obsahující část nebo celý rekombinantní adenovirový genom, může se použít místo štěpení citlivé na vhodný restrikční enzym nebo pro ribozym. Tak tomu je například v určité buněčné populaci, kde se virus produkuje nebo na kterou je cílen.

Nepřirozené polypeptidy podle vynálezu jsou schopné procházet jadernou membránou. Jak je známo v oboru, to je podstatný rys virových částí během replikace v hostitelské buňce, kde exprese takových částí probíhá v cytosolu a uspořádání takových částí probíhá v jádru hostitelské buňky například replikací adenovirů.

Nepřirozený polypeptid podle vynálezu má důležitou úlohu nebo funkci. Zaprvé poskytuje novou vazebnou doménu ( to znamená, že zaručuje změněný tropizmus a za druhé funguje jako část viru. Působí jako funkční část virového komponentu (virový protein, například virový kapsidový protein). Nepřirozený polypeptid může být součástí virového proteinu nebo může fungovat jako část virového proteinu. Jinými slovy nepřirozený polypeptid může mít strukturální úlohu nebo funkci při konstrukci nebo sestavení virových částic.

Vynález také popisuje buňky obsahující nebo infikované upraveným virem podle vynálezu. Takové buňky mohou být libovolného původu, ale zaručují, že typ buňky je schopný nést nebo pomnožovat virus. V obecném případě však takové buňky budou savčími buňkami. Takové buňky se mohou transfekovat •· · ·· · ······ • · » ···· ·· ·

Q · * * *·· « · · z, y · ···· ··· ···· · • · · · » · · · » ···· « ·· ··· ·· ·· s částí membrány (například membránový protein), která umožňuje infekci buňky upraveným virem a tak dovoluje pomnožení viru, který vykazuje nepřirozený tropizmus ve specifické buněčné linii, například tam, kde se změněný tropizmus viru brání pomnožení v běžné buněčné linii.

Vynález dále popisuje molekuly nukleové kyseliny kódující nepřirozené polypeptidy nebo upravené proteiny virové části nebo upravené viry. Dále se popisují vektory obsahující takové molekuly nukleových kyselin nebo nukleotidové sekvence kódující nepřirozené polypeptidy nebo upravené proteiny virové části, které slouží buď pro pomnožení upraveného viru nebo pro další jeho manipulaci.

Vynález dále popisuje způsob produkce upraveného viru podle vynálezu v buněčné kultuře. V jednom provedení vynálezu způsob zahrnuje kroky: genetická manipulace viru za vzniku upraveného viru (například rekombinantniho) viru, který obsahuje nepřirozený polypeptid, přičemž polypeptid obsahuje jednu nebo více částí kostry a každá z nich zahrnuje jednu nebo více vazebných částí. Uvedený polypeptid se exprimuje v cytoplazmě a v jádru lidské hostitelské buňky a udržuje prostorové uspořádání vhodné pro uvedenou vazebnou část i v nepřítomnosti ligandu, což umožňuje uvedené vazebné části vázat se na uvedený ligand. Polypeptid je schopný procházet jadernou membránou a rekombinantni virus vykazuje změněný tropizmus, což způsobila uvedená vazebná část. Dále se popisují infekční permisivní buňky, které obsahují uvedený virus, kultivace takových buněk, kdy se produkuje další virus v dostatečně vysokém titru, a shromáždění a čištění upraveného viru. Adenovirové vektory mohou být ve vztahu kpermisivním buňkám replikačně kompetentní nebo nekompetentní. V případě terapie zhoubných nádorů replikačně kompetentní adenoviry mají potencionální výhodu, protože se mohou v nádoru replikovat a rozšířit se tedy do celého nádoru (popisuje se v publikaci • · · · · · · · · »······ · · ·· · · • · ' · · ' · · · * · ···· · . ·· ·'»· «· ·»

Miller et al., Gene Therapy, 3: 557-559). To může teoreticky vést k zesílené vybraného efektorového mechanizmu ve srovnání s mechanizmem replikačně inkompetentních vektorů. Infekční viry mohou přispívat k proti nádorovému účinku v infikovaných buňkách cytopatogenními účinky stejně jako vyvolávají antivirovou imunitní odezvu, která může infikované buňky rozkládat.

Je nutné, aby mohlo dojít během aplikace genové terapie k řízení replikace kompetentního upraveného viru.

Vynález dále popisuje jiné způsoby řízení replikace upraveného adenoviru. Upravený virus podle vynálezu může obsahovat gen kódující virový protein, který je nutný při replikaci viru, jenž probíhá za řízení indukovatelného promotoru nebo genetického elementu.Například adenovirový preterminální protein (pTP) je regulován transkripčním aktivátorem, který odpovídá na tetracyklín (trTA) tak, že pTP se exprimuje pouze v přítomnosti doxycyklinu. V jiném případě upravený virus podle vynálezu může mít upravený genom takovým způsobem, že se virus replikuje pouze v buňkách, které vykazují defekt regulační dráhy syntéza DNA-apoptóza.

Toho je možné v upraveném viru dosáhnout zavedením dalšího štěpícího místa proti směru expresu genu od vazebné části nebo do libovolného takového místa, které umožňuje štěpení vazebné části od upraveného viru, například mezi střední část vlákna a vazebnou část.

Dále vynález popisuje způsob regulace replikace upraveného viru, který zahrnuje kroky: konstrukce upraveného viru tak, že místo štěpení (například místo vhodné pro enzymatické nebo chemické štěpení) je umístěno mezi vazebnou částí, která je nutná pro infekci buňky __a zbytku rekombinantní virové části, jenž obsahuje vazebnou část. Uvedený rekombinantní virus přichází do kontaktu se štěpícím činidlem, přičemž štěpení • · ··· · probíhá chemicky, enzymaticky nebo v případě fotolabilního místa štěpení pomocí světelného záření a dochází k odštěpení vazebné části z uvedené virové části, čímž brání, aby rekombinantní virus vstoupil do dalšího infekčního cyklu.

V případě enzymatického štěpení může být enzym kódován v genomu rekombinanntího viru a může být indukovatelný. V preferovaném provedení vynálezu se štěpící místo štěpí enzymem faktor Xa. Vynález popisuje použití jiných proteáz, které jsou známy v oboru, například lidská proteáza rhinoviru 3C, která je dostupná jako fúzní protein s GST (popisuje se v publikaci Walker et al., Bio/Technology 12: 601 (1994)).

Tato proteáza je aktivní při teplotě 4 °C a rozeznává a štěpí sekvenci LEVLFQ//GP.

Nepřirozené polypeptidy podle vynálezu se mohou vybrat z knihovny, u které se před tím testovalo správné balení peptidu v jádru a cytosolu a požadovaná vazebná funkce způsobem podobným technice projevení fága, která je dobře známa v oboru. Takové knihovny mohou obsahovat kandidátové peptidy fúzované s virovými částmi divokého typu nebo s upravenými (například rekombinantními) virovými částmi podle vynálezu, například adenovirovými vláknitými proteiny. Fúzní knihovna fága se může exprimovat na adenovirionech a používá se k selekci správného cytosolického a jaderného uspořádání pozorováním uvedených fúzí, které umožňují replikaci.

Upravený virus podle vynálezu se může také zkonstruovat tak, aby byly přítomny oba druhy virových částí, jak virové části divokého typu, tak upravené virové části nebo jsou kódovány v genomu a jestliže je to nutné, každý gen komponentu je řízen růnými genetickými řídícími elementy, což jsou například promotory. Tak upravený virus podle vynálezu může obsahovat upravenou virovou část (to znamená, že je upraven tak,' aby zahrnoval nebo obsahoval nepřirozený polypeptid) a • ·· · «· · • · · · · · · · · · • · * ·· · · · · ««······ 4 · · · · • · · · · · · · 4 ···· · · ··· ·· ·· ekvivalentní nebo odpovídající virovou část, která není upravena například vlákno divokého typu a upravené vlákno.

Rekombinantní adenovirus se může například zkonstruovat s vláknem divokého typu nebo s upraveným nebo rekombinantním vláknem (to je upravené vlákno obsahující nebo začleňující nepřirozený polypeptid) například upravené vlákno získané z fúzní knihovny „vlákno-kandidát vazebného peptidu, jehož exprese je řízena odlišným promotorem v adenoviru s deletovanou částí El. Například se ukazuje, že že rekombinantní gen adenovirového vlákna řízený promotorem CMV se může klonovat do vícenásobného klonovacího místa transportního vektoru pAdTrack a že viry se mohou produkovat expresí vlákna divokého typu a rekombinantního vlákna pomocí homologní rekombinace za použití adenovirového vektoru pAdEasy (He T-C, popisuje se v publikaci Zhou S, DaCosta LT, Zy J., Kinzler KW and Vogelstein B: A simplified systém for genereting recombinant adenoviruses, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 95: 25P9-2514, 1998) .

Je také možné, aby se v adenovirovém vektorovém genomu vyskytoval jeden nebo více genů vlákna (například gen divokého typu a upravený gen) řízené jedním nebo více indukovatelnnými promotory, což umožňuje aktivovat nebo deaktivovat každý gen nezávisle. V požadovaných adenovirových konstrukcích se nachází gen vlákna normálního typu ve své normální poloze a je řízen hlavním pozdním promotorem (MLP), může se klonovat tak, aby byl řízen promotorem, který vyvolává produkci hormonu a sym se indukuje dexametasonem. Tento promotor umožňuje expresi v buňkách propagujících vektor expresi vlákna divokého typu. Upravené vlákno se s výhodou klonuje do genomu stejného adenovirového vektoru, například po směru exprese genu od TRE (element odpovídajíc na tetracyklin), který se aktivuje v požadované buněčné linii. V buňkách, které exprimují protein tTA (aktivátor transkripce, který se váže na TRE), se TRE bude • 99 9

••9 99 O « 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9999 »99 9

9 9 9 9 «999 9 9 9 99 aktivovat v nepřítomnosti TC (tetracyklinu) nebo Dox (doxacyklinu). V jiném případě se konstrukce adenovirových vektorů mohou pomnožit v buňkách, které exprimují reverzní tTA(rtTA), kde se TRE a exprese upraveného vlákna aktivuje v přítomnosti Tc (nebo Dox).

Rekombinantní proteiny vlákna v knihovně mohou mít knoflík vlákna divokého typu nahrazený externím trimerizačním motivem a jedním nebo více členy peptidové knihovny (nebo jiným nepřirozeným polypeptidem). Testování rekombinanntích proteinů vlákna za účelem zjištění požadované vazebné aktivity se může provádět způsobem analogickým s metodou vyjádření fága po té, co se rekombinanntí adenovírus pomnožil prostřednictvím exprese vlákna divokého typu v kultuře propagujících buněk.

Upravený virus se změněným tropizmem vyžaduje buňky, které jsou schopny se infikovat, aby se v nich mohl virus pomnožit. Vynález tak popisuje permisivní buňky vhodné pro virus podle vynálezu, které se mohou kultivovat, aby se v nich pomnožil virus. Replikačně nekompetentní virus (který v obecném případě ve svém genomu obsahuje deleci, což ho činí nekompetentním) vyžaduje pro svou produkci a pomnožení speciální buňky, které jsou schopny doplnit deletovanou nebo chybějící genetickou informaci a tak umožnit jeho replikaci. Takové buňky nebo buněčné linie jsou dobře známy v oboru. Vynález dále popisuje úpravy takových propagačních buněk, aby zahrnovaly vazebného partnera (ligand) vhodného pro vazebné části upraveného viru (buňka například exprimuje takový ligand na svém povrchu).

Vynález dále popisuje buňku s výhodou in vítro nebo ex vivo eukaryontní buňku obsahující upravený virus nebo jeho část.

Vynález	dále	ukazuje,	že	upravený	virus	se změněným
tropizmem se	může	pomnožit	ve	stejných	buňkách	jako virus
divokého typu	tak,	že se	nové	vazebné	části,	které mění

*·· ·· « ······ * · · · · « · · « _φ ··· ··♦ · · » ······· · · ·«» · • · · · · · · · · *··· · ·· ··· ·» «« tropizmus, začlení do .virové části, která také obsahuje vazebnou část divokého typu (to je knoflík) s místem štěpení (například enzym, jako je Faktor Xa nebo proteázy lidského rhinoviru 3C) mezi takovými částmi. Po pomnožení v běžných buňkách prostřednictvím působení vazebné části divokého typu se může virová část štěpit, aby se odstranila vazebná část divokého typu (například knoflík divokého typu) a ukazuje novou vazebnou část a tvoří nový tropizmus. Vynález také popisuje, že vazebná část může být také specifická pro ligand, který sám má schopnost vázat buňku. Vazebná část může být specifická pro oblast Fc protilátky, čímž umožňuje použití protilátky, která je buněčně specifická pro požadovaný buněčný typ. Odstranění vazebné části divokého typu štěpením a vystavením viru buněčně specifické protilátce umožňuje vieu adsorbovat protilátku a tak cílit virus do buněk specifikovaných protilátkou.

Nepřirozené polypeptidy podle vynálezu s výhodou udílejí změněný tropizmus rekombinantnímu viru v porovnání s tropizmem viru, do kterého se nepřirozený polypeptid zavedl. Takový změněný tropizmus umožňuje, aby se použily rekombinantní viry při léčbě onemocnění lidí nebo zvířat, buď ošetřením buněk in vivo nebo ex vivo.

Tropizmus upraveného viru podle vynálezu podle vynálezu se může změnit tak, že virus prostřednictvím jedné nebo více vazebných částí cílí určité buňky. Tak vynález popisuje upravený virus, kde nepřirozený polypeptid obsahuje vazebnou část schopnou vázat se na ligand specifický pro buňku, kterým může být membránový antigen specifický pro předstojnou žlázu, recepotr EGF. Her-2/Neu, recepotr VEGF, CD22, gpl20, MHC/peptidové komplexy nebo membránové struktury nebo povrchové molekuly exprimované nebo přítomné v množících se buňkách, nádorové buňky nebo buňky infikované virem.

·· · • ·· · ·· · ·· • · · * · · «« • · · · · · · · • ···· · · * · · · * • · ··· ···· ···· · ·· ··· «» ·*

Existuje řada způsobů, kterými upravený virus vykazuje změněný tropizmus podle vynálezu a které se mohou použít při aplikacích v genové terapii. V takových případech nádorových onemocnění existují následující možnosti:

I. Použití vektorů za účelem zavedení transgenů do nádorů: antisense onkogeny samovražedné geny geny vhodné pro látky upravující imunitu nebo nádorové antigeny geny anti-angiogenních faktorů.

Příklady takových transgenů vhodných pro inkluzi v upraveném viru podle vynálezu jsou antisense anokogeny, samovražedné geny, geny látek modulující imunitu, gyny pro nádorové antigeny, geny anti-angiogenní faktory, cytokiny, geny inhibitorů vaskulární vaskulárního endoteliálního růstu, geny fusogenních membránových glykoproteinů, cytotoxické geny, gen kódující enzym, který přeměňuje cytotoxické látky vhodné pro přípravu farmaceutických prostředků, gen cytosinové deaminázy, gen uracilfosforibosylové transferázy. V preferovaném provedení, vynálezu upravený virus obsahuje transgeny kódující cytosinovou deaminázu a uráčil fosforibosylovou transferázu, buď jako jednotlivé geny nebo s výhodou společně jako bifunkční fúzní gen.

Při léčbě používající viry podle vynálezu s transgeny cytosinové deaminázy a uráčil fosforibosylové transferázy je virus s výhodou přítomen nebo se aplikuje spolěčně s jedním nebo více inhibitory dihydropyrimidinové dehydrogenázy. To zaručuje silnější toxický účinek produktů, které vznikají z uvedených transgenů (5-fluorocytosin).

Vynález také popisuje upravený virus obsahující jednu nebo více virových částí nebo transgenů, které jsou řízeny jedním nebo více indukovatelných promotorů nebo genetických elementů, • · ·· * ♦♦ * · · · » t » · · • ·*♦· · · · • · · · · · ··♦* · ·· <·♦ ·* #♦ které jsou například specifické pro tkáň nebo které odpovídají na přítomnost exogenních látek modulujících expresi.

II. Použití infekčního viru

Použití infekčního viru je výhodnější ve srovnání s vektory, které se nemohou replikovat, protože infekční virus se může v nádoru přecházet z buňky do buňky, čímž se násobí počáteční účinek ve zhoubném nádoru. Poškození nádorových buněk se může objevit ne pouze na základě mechanizmu poškození buněk, který se zavedl do vektoru, ale také mechanizmem spojeným s infekcí virem a s obranou imunitní odezvou vyvolanou buňkami infikovanými virem. Tento princip se už testoval způsobem, kdy se přímo do zhoubného nádoru injekcí zavedl adenovirus, který se připravil genovou manipulací tak, aby se replikoval pouze v mutantních nádorových buňkách p53. Zkušenosti z těchto omezených studií s velkými nádory na mozku a v krku naznačují částečný úspěch, kdy z jedenácti ošetřených nádorů, které jsou jinak rezistentní k libovolné jiné formě léčby, zmizely (Shen Y.: osobní domluva) .

Vynález dále popisuje upravený virus, kde je gen kódující adenovirový smrtící protein (ADP) řízen promotorem, který umožňuje nadměrnou expresi proteinu tak, že se zvýší lytická kapacita uvedeného upraveného viru.

Za účelem použití upraveného viru při genové terapii je možné virus dále upravovat. Principy a cíle jsou popsány v literatuře naznačují, že virus obsahuje nebo začleňuje požadovaný terapeutický gen nebo molekulu terapeutické nukleové kyseliny. Termín „terapeutický zahrnuje jak terapii (léčebnou tak tišící terapii existujících nebo diagnostikovaných stavů) tak profylaxi. Gen může kódovat požadovaný terapeutický produkt (například terapeutický polypeptid nebo antisense molekulu).

• « «	4	*♦	•	♦ • ·	• · •	• · · •
·· ·♦	♦ ·		•	•	• *	•
♦	•		•	•	•	• *
• ·		··		• · ·

Vynález dále popisuje, že upravený virus může zahrnovat místo (například restrikční místo) pro začlenění požadovaného terapeutického genu nebo molekuly nukleové kyseliny.

Jednou nevýhodou použití viru divokého typu při genové terapii dokonce po úpravě podle vynálezu je, že člověk nebo zvíře, které se ošetřuje virem, může vykazovat předem vytvořené protilátky vůči částem viru divokého typu, které jsou stále přítomny nebo částečně upraveny v manipulovaném viru . Předem vytvořené protilátky jsou často cíleny proti hexonovému proteinu lidského adenoviru serotypu 5. Zatímco manipulace jediné virové části, například části obsahující nepřirozený polypeptid podle vynálezu, může být dostatečné pro zeslabení počáteční imunitní odezvy vůči upravenému viru, které dochází prostřednictvím předem vytvořených protilátek. Aby došlo k dalšímu oslabení imunitní odezvy hostitele, je výhodné manipulovat další část viru.

Vynález popisuje upravený virus podle vynálezu, který dále obsahuje virovou část, jenž je nahrazena ekvivalentní částí, nebo je upravena tak, že je omezeno navázání předem vytvořených protilátek vůči viru divokého typu. Adenovirus serotypu Ad5 může obsahovat hexonový protein, který je nahrazen hexonovým proteinem odlišného serotypu. Předem vytvořené protilátky proti naposledy jmenovanému typu proteinu se vyskytují v těle léčeného jedince v omezeném množství ve srovnání se serotypem Ad5. Uvedeným odlišným serotypem může být Ad37. V jiném případě uvedený adenovirus může obsahovat sekvence epitopu hexonového proteinu, na které se předem vytvořené protilátky váží, upravené tak, že vzniká hexon, kterému chybí imunogenní epitopy.

Upravený adenovirus může obsahovat hexonový protein, který dále obsahuje peptid schopný vázat protein. Může to být například protein, který není součástí imunitního systému, ·« ···· • · · • · · • · · · · • · ··· · · jako je lidský sérový albumin, jenž je schopný dostatečně překrýt imunogenní epitopy hexonů, na které se váží předem vytvořené protilátky.

Vynález dále popisuje upravený virus podle vynálezu vhodný pro použití při terapii nebo při přípravě léčebného prostředku vhodného pro léčbu nádorových buněk nebo proliferujících buněk.

Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek obsahující manipulovaný virus podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ekcipient.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 zobrazuje sekvenci konstrukce různých rekombinantních vláken.

A. Sekvence NRP je doplněna pomocí PCR restrikčními místy Xhol a Sphl a liguje se do vlákna WT, které je doplněno restrikčními místy EcoRl a Xhol. Výsledné vlákno se nazývá Al a obsahuje konec vlákna, první repetici střední části vlákna a motiv NRP.

B. EGF se připojil k vláknu Al pomocí SOE. Do sekvence se přidalo mezi NRP a EGF restrikční místo Clal. Výsledné vlákno se nazývá Al EGF. V tomto vláknu se EGF může substituovat pomocí nových ligandů ligací za použití restrikčních míst Clal a Xhol.

C. Část Vlákna Al EGF NRP-linker-EGF se podrobila PCR. Tímto způsobem se do sekvence zavedlo restrikční místo Nhel do rámce se sekvencí vlákna WT. Po klonování AT se sekvence ligovala do vlákna WT za použití restrikčních míst Nhel a Xhol za vzniku vlákna A7* EGF. A7 se liší od Al tím, že A7 obsahuje prvních sedm repetic střední oblasti vlákna Ad5.

φφ φ φφ ♦ · · φ φ φ φ φ φ φ « φ φφ φφ φ · φ φ φ φ φ

V konstrukci Α7 EGF se může EGF nahradit ligaci za použití ligace pomocí restrikčních míst Clal a Xhol novými ligandy.

Obrázek č. 2 znázorňuje zde používaná různá rekombinantní vlákna.

A. Vlákno Ad5 divokého typu.

B. Shora v textu popsané vlákno A 7 EGF.

C. Vlákno A7 scFv C242 se získalo substitucí EGF ve vláknu A7 EGF ligaci fragmentu scFv, jak se popisuje shora v textu.

D. Vlákno A7 scFv G250 se získalo substitucí EGF ve vláknu A7 EGF ligaci fragmentu scFv, jak se popisuje shora v textu.

E. Vlákno A7 Affi IgG, kde EGF ve vláknu A7 EGF se substituovalo vazebnou afilátkou IgG, jak se uvádí shora v textu.

F. Vlákno A7 Affi IgA, kde EGF ve vláknu A7 EGF se nahradilo vazebnou afilátkou IgA, jak se popisuje shora v textu.

G. Vlákno A7 Affi IgG/Affi IgA, kde EGF vevlákně A7 EGF se nahradilo vazebnou afilátkou IgG spojenou s vazebnou afilátkou IgA, jak se uvádí shora v textu.

H. Vlákno A7 ZlgG/ZIgG, kde EGF ve vláknu A7 EGF se nahradil vazebnou afilátkou IgG spojenou s jinou vazebnou afilátkou IgG, jak se uvádí shora v textu.

I. Vlákno A7 ZlgG Xa Knob, kde EGF ve vláknu A7 EGF se nahradilo vazebnou afilátkou IgG ligovanou do štěpitelného knoflíku vlákna divokého typu.

Obrázek č. 3 zobrazuje navázání afilátky Zlg, když se začlení do vláken exprimovaných na virionech.

·· * ·· v ·· «··· • * · · » · · · · Λ λ η · ♦ · · · * ♦ ··· · ·«·« · · · ···· · • · · · · ·«·· ···· 9 ·· «·· ·· ·«

Panel Α.

Po navázání viru nebo proteinu na membránu se vše inkubovalo s Fc3(l) a pak se přidaly anti-lidské IgG konjugované s HRP a došlo k zobrazení.

1= virus A7 ZlgG Xa Knob,

2= stejný virus po štěpení s Xa,

3= virus WT,

4= virus se dvěma vlákny například WT a A7 ZlgG,

5= Fc3(1),

6= protein A,

7= protein AG.

Panel B.

Po navázání viru nebo proteinu na membránu, se vše inkubovalo s Fc3, pak se přidaly anti-lidské IgG konjugované s HRP a došlo k zobrazení.

1= virus A7 ZlgG Xa Knob,

2= stejný virus po štěpení s Xa,

3= virus WT, = virus se dvěma vlákny například WT a A7 ZlgG,

5= Fc3,

6= protein A,

Ί- protein AG.

Panel C.

Kontrola přítomnosti viru na membráně.

1= virus A7 ZlgG Xa Knob,

2= stejný virus po štěpení s Xa,

3= virus WT.

Po navázání viru na membránu se přidal anti-Ad5 hexon konjugovaný s HRP a došlo k zobrazení.

Panel D.

Membrány se ošetřily- · jako v odstavci A a B, ale vypustila se inkubace s Fc.

» w · ·· ·· ·« · *· ·*·· • · ·· « · · • « * · · · ♦ · · « · · » · • · · · · · ·

9· ··· ·· ··

1= virus Α7 ZlgG Xa Knob,,

2= virus WT,

3= protein A,

4= protein AG.

Vysvětlující poznámka: Je známo, že Fc3(l) se váže na ZlgG a protein A. Je známo, že Fc3 se váže pouze na protein G (AG).

Obrázek č. 4 zobrazuje vlákna popsaná v příkladu 11. Linkery NRP se zavedly do restrikčního místa Nhel proti směru transkripce NRP.

Obrázek č. 5 ukazuje fotografie gelů demonstrující expresi a rozpustnost rekombinantích vláken v buňkách Sf9.

(A) lyzát celých buněk, (B) rozpustná frakce.

Buňky infikované virem se shromáždily 48 hodin po infekci, lyžovaly se v isotonickém pufru a buněčné lyzáty se rozdělily do alikvotů. Jeden alikvot se centrifugoval při 10 000 x g po dobu 10 minut a uschoval se supernatant (zobrazeno na panelu B), zatímco ostatní alikvoty se analyzovaly, jako lyzáty celých buněk (panel A) . Oba alikvoty se denaturovaly teplem ve vzorkovém pufru obsahujícím SDS, analyzovaly se běžnou metodou SDS-PAGE a přenesly se na membrány. Bloty reagovaly s monoklonální protilátkou 4d2,5 (tyto monoklonální protilátky jsou specifické pro konec vlákna) a s radioaktivně značenými sekundárními protilátkami. Imunobloty se kvantitativně hodnotily čtením autoradiogramu. Kvantitativní data vyjádřená jako procento obsahu rozpustného vlákna ku celkovému obsahu vlákna, jsou zobrazena v tabulce č. 7.

Příklady provedení vynálezu

Obecné postupy a počáteční materiály ··· ·· · • » ♦ • · · • ·*·* • · ···· ·

• · ·· «··· • · « ♦ » ♦ « · · • · « · ·· ··

Rekombinantní adenovirová vlákna se zkonstruovala za použití metod založených na ligaci a PCR (popisuje se v publikaci Clakson et al., General application of PCR to gene cloning and manipulation, in PCR, A Practical Approach, Eds McPherson MJ, Quirk P and Taylor GR, IRL Press, Oxford, page 187, (1992)), to znamená PCR-ligace-PCR (popisuje se v publikaci Alvaro et al., BioTechniques 18: 746-750 (1995)), a sestřihu přesahující extenze (SOE) (popisuje se v publikaci Horton et al., Recombination and mutagenesis of DNA sequences using PCR, in McPherson MJ (ed.) , Directed Mutagenesis, IRL Press 1991, p. 217)). Genové produkty vytvořené PCR se v obecném případě klonovaly do vektoru pCRII (Invitrogen Corp.) za použití tzv. klonování TA (popisuje se v publikaci Clark J. M., Nuc. Acids Res. 16: 9677-86, (1988)). Subklonování se provedlo použitím standardních metod (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, (1989)) do vektoru pGEX-4T-3 (od firmy Amersham Pharmacia Biotech). Geny kódující rekombinantní vlákna se sekvenovaly za použití sekvenačního přístroje Perkin Elmer ABI Prism a exprimovaly se v savčích buňkách (SV40 transformované do ledvinových buněk afrických zelených opic, COS7, získané ze sbírky American Type Culture Collection, VA, USA) za použití vektorů popsaných dále v textu a v hmyzích buňkách (buňky Sf9 pocházející z S. Frugiperda získaných ze sbírky American Type Collection, VA, USA) za použití exprese bakulovirů (popisuje se v publikaci Kitts et al., Biotechniques 14(5): 810-7, (1993)) (virus a vektor pochází od firmy Clontech, Palo Alto, CA, USA) a barvily se pomocí monoklonálních protilátek specifických pro konec vlákna, trimerické vlákno a ligand, který se váže na nové buňky. Imunobarvením se hodnotily následující parametry:

i) transport do jádra, ii) funkční exprese ligandu vázajícího se na nové buňky, ·» · *» • · · » · ·· · · « ···# · · » • * · · ··*· « ·· ·· · # · • · · · « « * · · » · ♦ · · ·*· ·· ·· iii) schopnost tvořit trimery.

Rekombinantni vlákna se zavedla do genomu adenoviru pomocí metody, která se vyvinula v současné době (jak se popisuje v příkladu 7). Plazmid pTG3602 (popisuje se v publikaci Chartier et al., J. Virol. 70: 4805-4810, (1996)) obsahující celý genom Ad5, jako fragment Pacl-Pacl, se použil jako počáteční materiál. Fragment genomu o přibližné velikosti 9 kb ležící mezi restrikčními místy Spěl a Pacl a obsahující gen vlákna divokého typu se klonoval odděleně do plazmidu pBluescript. Fragment o přibližné velikosti 3 kb ležící mezi restrikčními místy Sací a Kpnl se dále subklonoval. Ve fragmentu o velikosti 3 kb se provedla delece genu přirozeného vlákna s výjimkou N-terminálních nukleotidů ležících proti směru exprese genu od restrikčního místa Ndel vlákna a restrikční místo Xhol zavedené na jeho místo vhodné pro ligaci rekombinantních vláken do deletovaného fragmentu o velikosti 3 kb (transportér vlákna o velikosti 3 kb) mezi restrikčními místy Ndel a Xhol.

Transportní vlákno o velikosti 3 kb obsahující rekombinantni vlákno se znovu zavedl do fragmentu o velikosti 9 kb, který se štěpil restrikčním enzymem Nhel za použití homologní rekombinace v mikroorganizmu E. coli (popisuje se v publikaci Chartier et al., J. Virol. 70: 4805-4810, (1996)). Výsledný rekombinantni fragment o velikosti 9 kb se nakonec oddělil od vektoru restrikčním enzymem Spěl a Pacl a spojil se s izolovaným fragmentem o velikosti 27 kb klonováním do kosmidu.

Přítomnost inzertu očekávaných vlastností se ověřila ve všech kosmidových klonech pomocí PCR. Kosmidové klony se také štěpily restrikčním enzymem HindlII a přítomnost restrikčních fragmentů očekávané velikosti se ověřila na gelech. Rekombinantni adenovirové genomy se izolovaly po štěpení ·· · ·· • · · » · • · · · · • ···· » « · • < · · ···· · ·· ·· ···· « * · • · · • · · · • · · · ·· ·· restrikčním enzymem Pac 1, a použily se pro transfekci vhodných buněk. Výskyt plaků se stanovil mikroskopickým sledováním buněčných kultur.

Seznam jmen používaných oligonukleotidových prímerů (všechny jsou uvedeny jako 5'-3'sekvence):

[SEQ.	ID. NO.:	20]	název	14 9: TTCCTCGAGTTATTCTTGGGCAATGTATGA
[SEQ.	ID. NO.:	21]	název	175 . GGGGAATTCGATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAA
[SEQ.	ID. NO.:	22]	název	196: GCTCGAGTTATCCGTTTGGAAACAACTCTAC
[SEQ.	ID. NO.:	23]	název	228: CTCGAGTCATCTCAATTCCCACCACTT
[SEQ.	ID. NO.:	24]	název	238: TGGCATGCCTGACGTAGCAAGCTTACGA
[SEQ.	ID. NO.:	25]	název	253:
GGGGAATTCATCGATGCAGGTCCAGTTGGTGCAGTCT
[SEQ.	ID. NO.:	2 6]	název	2 65; CAGGTCCAGTTGGTGCAGTCT
[SEQ.	ID. NO.:	27]	název	2 69:
GGGGGCCTGGGCGTCGTTCAGCTTCTTGGCTCCGTTTGGAAACAACTCTAC
[SEQ.	ID. NO.:	28]	název	270:
CTGAACGACGCCCAGGCCCCCAAGAGCGAČCCATCGATCATGAACTCCGACTCCGAATGT
[SEQ.	ID. NO.:	29]	název	273:
CCCCTGGAGTTAAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCT
[SEQ.	ID. NO.:	30]	název	274:
GGGGAATTCATCGATGGACTACAAAGATATTGTGATGACGCAGGCT
[SEQ.	ID. NO.:	31]	název	275: CTACCTCGAGTTAACACTCATTCCTGTTGAAGC
[SEQ.	ID. NO.:	32]	název	326: GGGGCTAGCCCCTGACGTAGCAAGCTTACGA
[SEQ.	ID. NO.:	33]	název	403: GGG CTC GAG TTA CTC GAT GGG GGC TGG
GAG GGC
[SEQ.	ID. NO.:	34]	název	414:

GGCCCCCGAGGCCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGT - ' · [SEQ. ID. NO.: 35] název 416:

GGCCCAGCCCACGAATTCATCGATGGATATTGTGATGACGCAGGCT [SEQ. ID. NO. : 36] název 4~18n aga CTG CAC CAA CTG GAC CTG (SNN) _ieCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGT (S is dA, dG or dC and N is dA, dG, dC or dT)

[SEQ	. ID	. NO. :	37]	název	473:
	CAT	TGT GAT	GAC	CCA GTC	T
[SEQ	. ID	. NO. :	38]	název	474:
	GAA	GCT
[SEQ	. ID	. NO. :	39]	název	476:
	GCT GCA CCA	ACT GTA
[SEQ	. ID	. NO. :	40]	název	478 :
[SEQ	. ID	. NO. :	41]	název	503:
[SEQ	. ID	. NO. :	42]	název	504:
[SEQ	ID	NO. :	4 3]	název	550:

GGC AAT TCC ATC GAT CGC CAC CAT, GGA

CCC CTC GAG TTA ACA CTC ATT CCT GTT

ACC ACG GTC ACC GJC TCC TCA GCT GAT

TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT

GGGCCATCGATCGTAGACAACAAATTCAACAAA

GGGCTCGAGTTATTTCGGCGCCTGAGCATCAŤT

TCGGTTTGGAAACAACTCTACCTTTTTTTTCGGCGCCTGAGCATCATT [SEQ. ID. NO.: 44] název 551:

AAAAAGGTAGAGTTGTTTCCAAACGGAGTAGACAACAAATTCAACAAA

Příklad 1: Genetické začlenění trimerizačního motivu (oblast krčku peptidu z lidského plicního povrchově aktivního činidla D) do adenovirových vláken.

Gen kódující vlákno Ad 5 WT se získalo z viru Ad5 pomocí PCR za použití primeru proti expersi genu (primer 175), který je shodný s prvními šesti kódujícími triplety vlákna plus obsahuje restrikční místo EcoRl, a primeru po směru exprese genu (primer 149), který se váže na šest terminálních kódujících tripletů vlákna plus obsahuje restrikční místo Xhol. Takto získané vlákno se klonovalo do vektoru pBluescript za použití restrikčních míst a mohou se dále subklonovat do jiných vektorů za použití stejných restrikčních enzymů.

Připravily se peptidy vláken, kde se knoflík nahradil externím trimerizačním motivem (popisuje se dále v textu). Existují dva důvody zavedení externího trimerizačního motivu: a) odstranění knoflíku, který obsahuje přirozený trimerizační signál, ale také část vlákna, která se váže na buňku a • · · · ·

46···· · · · • ^v · · · • · · · · · ·

b) současně se doplní nezbytný trimerizační signál.

V tomto případě se použil jeden určitý aminokyselinový motiv, to znamená 36 aa „oblast krčku peptidu = NRP [SEQ: ID. NO. : 2], který pochází z plicního povrchově aktivního proteinu D (popisuje se v publikaci Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 191195 (1994)). Je nutné poznamenat, že používaná sekvence je trochu delší o 8 aminokyselin (KKVELFPN) ve srovnání se skutečnou trimerizační částí NRP, protože ve všech konstrukcích obsahujících NRP zůstal trimerizační signál lidského plicního povrchově aktivního proteinu D. Uvedená sekvence KKVELFPN funguje jako dostatečný linker mezi trimerizačním signálem a doménu C-terminálního cukru lidského plicního povrchově aktivního proteinu D a uvažuje se, že má stejně důležitou funkci ve zde popsaných rekombinantních vláknech. Syntetizovala se sekvence DNA kódující trimerizační motiv, klonovala se a ověřila se sekvenací.

Za účelem zavést motiv NRP do adenovirového vlákna se sekvence NRP podrobila PCR (Clackson et al.,) za použití primeru 238, který obsahuje na N-konci sekvence kódující NRP restrikční místo Sphl, a reverzního primeru 196, který obsahuje na C-konci kódující sekvence restrikční místo Xhol. Po štěpení restrikčním enzymem Sphl a Xhol se sekvence NRP ligovala do genu vlákna WT štěpeného stejným enzymem. Výsledné rekombinantní vlákno Al (SEQ. ID. NO: 3) obsahuje konec vlákna a první repetici střední části a pak následuje trimerizační motiv NRP. Obrázek č. 1 a 2 zobrazuje uvedené konstrukce a způsob konstrukce.

Aby došlo k nahrazení vazebné funkce knoflíku, do vlákna se vedle externího trimerizačního aminokyselinového motivu zavedl ligand nové buňky (popisuje se dále v textu).

Příklad 2: Sestavení genové konstrukce kódující rekombinantní adenovirová vlákna s epidermálním růstovým faktorem • 9 • 9

(EGF) a externím pochází z lidského proteinu D trimerizačním motivem, který plicního povrchově aktivního

Na obrázku č. 1 a 2 jsou zobrazeny uvedené konstrukce a způsob vzniku uvedených konstrukcí.

Sekvence DNA kódující lidský EGF (SEQ. ID. NO.: 4) se syntetizovala, klonovala a sekvenovala. Tato sekvence se pak spojila s vláknem Al, jak se popisuje shora v textu, sestřihem přesahující extenze. V tomto případě se gen EGF podrobil PCR za použití primeru 270 (který je shodný s prvními sedmi kódujícími triplety) a obsahuje přesah tvořený sekvencí aminokyselinového linkeru (SEQ ID NO: 5) získaného ze stafylokokového proteinu A a restrikční místo Clal, a primeru 228 (který je komplementární s prvními sedmi konečnými triplety pozitivního řetězce a obsahuje restrikční místo Xhol). Gen vlákna Al se podrobil PCR za použití primeru shodného s prvními šesti kódujícími triplety genu, přičemž primer obsahuje restrikční místo EcoRl (175). Druhým primerem byl primer 269 komplementární se sedmi terminálními kódujícími triplety pozitivního řetězce a s přesahem, který je komplementární s přesahem zpětného primeru vhodného pro sekvenci EGF. Dva produkty PCR se pak spojily pomocí PCR za standardních podmínek SOE (popisuje se v publikaci Horton et al., Recombination and mutagenesis of DNA sequences using PCR, in McPherson MJ (ed.), Directed Mutagenesis, IRL Press 1991, p. 217)) za vzniku vlákna Al EGF (SEQ ID NO: 6).

Za účelem konstrukce vlákna s prvními sedmi repeticemi střední části, s trimerizačním signálem NRP, stafylokokovým linkerem a EGF, se vlákno Al EGF podrobilo PCR za použití primeru 326 shodného s prvními sedmi triplety 5' konce sekvence NRP a dále obsahuje restrikční místo Nhel a primeru 228, který je komplementární se sedmi terminálními triplety pozitivního řetězce Al. Po klonování se produkt PCR štěpil restrikčními

• · · .ίο·:· • · « · · enzymy Nhel a Xhol a ligoval se do vlákna WT, které se štěpilo stejnými enzymy, přičemž se získalo vlákno A7 EGF (SEQ ID NO: 7), které je podobné vláknu Al EGF, ale liší se tím, že obsahuje prvních sedm repetic střední části vlákna Ad5.

Příklad 3: Sestavení genové konstrukce kódující rekombinantní adenovirová vlákna s jednořetězcovými protilátkami a externím trimerizačním motivem, který pochází z lidského plicního povrchově aktivního proteinu D.

Ke konstrukci rekombinantního adenovírového vlákna se použily dva fragmenty monoklonálních jednořetězcových protilátek. První je jednořetězcový fragment (scFv) monoklonální protilátky G250, který s vysokou selektivitou reaguje s proteinovým antigenem, jenž se vyskytuje na buňkách lidského renálního nádoru (popisuje se v publikaci Oosterwijk et al., Int. J. Cancer 38: 489-94, (1986)). Druhým fragmentem je jednořetězcový fragment monoklonální protilátky C242, který reaguje s kolorektálním a pankreatickým karcinomem (popisuje se v publikací Johansson C., Thesis, University of G'teburg, (1991)) .

Konstrukce G250

Jednořetězcový fragment (variabilní řetězec kappa nebo VK, linker, variabilní těžký řetězec nebo VH, spojovací sekvence a konstantní těžká doména 2 nebo CH2) protilátky G250 se zkonstruoval dříve popsaným způsobem (popisuje se v publikaci

Weijtens et al., J konstrukce G250 je

Immunol., 152(2): 836-43, (1996)). Tato sekvence SEQ ID NO: 8. -Aby došlo ke klonování do dříve uvedených konstrukcí vláken Al a A7, jednořetězcový fragment se doplnil restrikčními místy Clal a Xhol pomocí PCR za použití primerů 416 a 403.

Konstrukce C242 • ·· · /49·:· ·: :

Jednořetězcový fragment protilátek C242 (variabilní řetězec kappa, linker, variabilní řetězec a konstantní řetězec kappa nebo CK) (SEQ ID NO: 9) se zkonstruoval následujícím způsobem, kdy se jako původní templát použije cDNA z hybridomu produkujícího protilátku. VKCK se amplifikoval použitím primerů 274 a 275. VHCH1 se amplifikoval použitím primerů 253 a 273. scFV (jednořetězcový variabilní fragment) (VK LinkLib VH) se zkonstruoval pomocí SOE následujícím způsobem. VK a VH se amplifikovaly odděleně za použití primerů 416/418 a 265/414, kdy se jako templát použila shora v textu uvedená sekvence VKCK a VHCHl a spojila se dohromady za použití primerů 414 a 416 a metody SOE. V konstrukci VK LinkLib VH se VK a VH náhodně rozdělí sekvencí osmnácti jak se popisuje shora v textu (popisuje se v publikaci Tang et al., J. Biol. Chem., 271: 15682-86, (1996)). Nukleotidová sekvence tohoto linkeru je přítomna v primerů 418. Konstrukce VK LinkLib VH se klonovala do vektoru pAKlOO (popisuje se v publikaci Krebber et al., J.

Immunological Methods 201: 35-55, (1977)). Provedlo se zobrazení fága a selekce vazebného činidla antigenu za použití shora v textu popsané metody (popisuje se v publikaci Krebber Methods 201: 35-55, (1977)).

se antigen CanAg reagující s protilátkou C242 adsorboval na biotinem značenou protilátku C241 (která se váže na jiný epitop na antigenu ve srovnání linker mezi aminokyselin, et al., J. Immunological V uvedených experimentech s protilátkou

C242) vázanou na zkumavky potažené streptavidinem (CanAg Diagnostics Ltd., G'teburg, Švédsko). Izolovalo se několik vazebných činidel a ukazuje se, že obsahují různé linkery. Sekvenací se ukázalo, že zvláště konstrukce linkeru VH obsahuje linker PPDFVPPAASFPDHSPRG (k označení aminokyselin se používá jednopísmenný kód). Tato konstrukce se vybrala pro ...další práci na základě schopnosti vázat antigen. CK se spojil s touto konstrukcí pomocí SOE za vzniku formátu C242 VL Link VHCK. Při metodě SOE se konstrukce • · .·5τπ· ·:

VK LinkLib VH amplifikoval za použití primerů 416 a 478 a CK se amplifikoval pomocí primerů 476 a 474. Amplifikované produkty se pak spojily pomocí SOE a použití primerů 416 a

474 .

Pomocí reakce PCR popsané shora v textu se jednořetězcové fragmenty doplnily restrikčním místem Clal (přítomné v primerů 416 a 473) a Xhol (přítomný v primerů 403 a 474) . Pak následovala ligace do konstrukcí vlákna Al a A 7, která se zmiňuje dříve v textu (obrázky č. 1 a 2 zobrazují konstrukce a způsob jejich tvorby) za vzniku vláken Al G250, A7 G250, Al C242 a A7 C 242 (zobrazeno na obrázku č. 1 a (SEQ ID NO: 10 až 13) .

Příklad 4: Sestavení genových konstrukcí kódujících rekombinantní adenovirová vlákna s afilátkami a externí trimerizační motiv pocházející z lidského plicního povrchově aktivního proteinu D

Za účelem zkoumání, zda monovalentní a divalentní struktury vázající se na antigen založené na struktuře domén jediného stafylokokového proteinu A se mohou funkčně exprimovat, když se začlení do rekombinantního adenovirového vlákna, se vytvořily genové konstrukce vhodné pro pro expresi v savčích nebo hmyzích buňkách. Sestavení genových konstrukcí kódujících rekombinantní adenovirová vlákna obsahující doménu Z vázající se na IgG (ZlgG) získanou z stafylokokového proteinu A (popisuje se v publikaci Nilsson B., Prot. Eng. 1:, 107-13, (1987)) (SEQ ID NO: 14) nebo afilátku specifickou pro

IgA získanou z z domény Z (ZlgA) vybranou za použití vyjádření fága (popisuje se v publikaci Gunnerusson E. et al., App. Env. Micro., 65: 4134-40, (1999) (SEQ ID NO: 15).

Geny kódující afiňitrfí části se amplifikovaly PCR za použití primerů 503 a 504 a jako templáty se použily • ·· · * · · • · · .· si:· ···♦ · následující plazmidy: pEZZmpl8 (popisuje se v publikaci Tang et al., J. Biol. Chem., 271: 15682-86, (1996)), který se používá za účelem získání domény Z a pKNl-dZIgA (Clackson et al.,), který se používá za účelem získání konstrukce ZlgA.

Při amplifikaci pomocí PCR se geny vhodné pro dva různé ligandy doplnily restrikčním místem Clal a Xhol. Tato místa se začlenila do čtecího rámce, který je vhodný po následnou ligaci do shora v textu popsaného genu vlákna A7 EGF, výsledkem čehož jsou konstrukce kódující rekombinantní vlákno A7 ZlgG (SEQ ID NO: 16) a A7 ZlgA (SEQ ID NO: 17), které se adaptovalo tak, aby se později dalo začlenit do adenovirového genomu (popisuje se dále v textu) za účelem produkce rekombinantních virů, které nesou nové vazebné specifity. Dále, vlákno Al ZlgG se zkonstruovalo ligaci upraveného ZlgG do shora uvedeného vlákna Al EGF (popisuje se také na obrázku č. 1) .

Vytvořila se třetí genová konstrukce, která kóduje vlákno obsahující shora uvedené afinitní doména. Tato konstrukce kóduje vlákno obsahující konec vlákna, prvních sedm repetic střední oblasti, sekvenci NRP, linker stafylokokového proteinu A, doménu Z vázající IgG, linker z NRP obsahující 8 aminokyselin (KKVELFPN) , po kterém následuje afilátka vázající IgA. Za účelem konstrukce uvedeného vlákna se nejdříve geneticky spojily dvě různé afinitní doména pomocí SOE za použití primerů 550 a 551 s přesahy komplementárními s nukleotidovou sekvencí kódující sekvenci linkeru KKVELFPN. Při PCR se zavedlo do vektoru pGEX-4T-3, který obsahuje genovou konstrukci vlákna A7 EGF pomocí primerů restrikční místo Clal a Xhol za vzniku vlákna A7 ZlgG/ZIgA (SEQ ID NO: 18) .

Sestavila se další genóvá konstrukce, aby kódovala vlákno obsahující dvě spojené domény ZlgG. Tento gen kóduje vlákno ·· * ’ > · · · • · · · .· ?2’.· ·:

• ·

9

9 · ·

Α7 ZlgG /ZlgG (SEQ ID NO: 19) a sestavil se přesně způsobem popsaným v případě vlákna A 7 ZlgG/ZIgA s tou výjimkou, že se při PCR místo genu ZlgA použil gen ZlgG.

Na obrázku č. 1 a 2 je zobrazena schéma konstrukcí a způsob jejich konstrukce.

Příklad 5: Vazebná studie

Geny kódující rekombinantní vlákna se klonovala do cektorů pcDNA (které cílí proteiny vhodné pro expresi do cytosolu) pSecTag (který cílí vylučované produkty) proteiny vhodné pro expresi jako (získáno od firmy Invitrogen BV, Groningen, Holandsko) a vše se transfekovalo do buněk COS7 za použití lipofektaminu (Life Tecnologies,lne. Gaithersburg, MD, USA) , jak popisuje výrobce.

Exprese a poloha v buňce rekombinantních vláken se hodnotily imunologickým barvením za použití následujících primárních činidel:

A. Myší monoklonální protilátky 4D2.5 (určené proti vláknu

Ad5) (které poskytl Dr. Geoffrey Engler, University of Birmingham, Alabama, USA) (popisuje se v publikaci Shin Hong et al., Virology 185: 758-767, (1991)).

B. Myší monoklonální protilátky 2A6.36 (určené proti trimerizovanému vláknu Ad5) (které poskytl Dr. Geoffrey Engler, University of Birmingham, Alabama, USA) (popisuje se v publikaci Shin Hong et al., Virology 185: 758-767, (1991)) .

C. Myší monoklonální protilátky určené proti epidermálnímu růstovému faktoru (EGF) = a-EGF (Cambio, Cambridge, UK, Kat. č. CA 954).

D. Monoklonální myší protilátky značené biotinem určené proti idiotipické protilátce určené proti monoklonální protilátce • ♦

C242= a-Id C242 (popisuje se v publikaci Lindholm et al., nepublikované výsledky).

E. Monoklonální myší protilátky značené biotinem určené proti idiotipické protilátce určené proti monoklonální protilátce C250= a-Id C250 (poskytl Reinder Bolhuis, Daniel Den Hoed Cancer Center, Rotterdam, Holandsko) .

F. Lidské polyklonální protilátky IgA a IgG určené pro hodnocení aktivity afilátky = HigG (Sigma-Aldrich Fine Chemicals, Kat. č. 14506) a HigA ( (Sigma-Aldrich Fine Chemicals, Kat. č. 11010).

Sekundární činidla jsou:

A. Pro identifikaci myších protilátek slouží králičím antimyší ímunoglobulín F(ab)2 (DAKO A/S, Glostrup, Dánsko, Kat. č. F0313) = aMIg značené FITC.

B. Pro identifikaci lidského IgG slouží králičím anti-lidským

IgG (DAKO A/S, Glostrup, Dánsko, Kat. č. F0315) = aHIg značené FITC.

C. Pro identifikaci lidského IgA slouží králičím anti-lidské

IgA (DAKO A/S, Glostrup, Dánsko, Kat. č. F0316) = aHIgA značené FITC.

D. Pro identifikaci biotinylované protilátky slouží streptavidin značený FITC (DAKO A/S, Glostrup, Dánsko, Kat. č. F0422).

Buňky se centrifugovaly na mikroskopických sklíčkách v cytocentrifuze Shandon Cytospin 2 a sušily se vzduchem přes noc při teplotě místnosti, takto připravené vzorky se fixovaly v 3% paraformaldehydu ve fyziologiykém roztoku pufrovaném fosforečnanem. Hodnota pH roztoku je 7,4 (PBS), permeabilita se upravila 0,1 % roztokem Tritonu-X100 v PBS. Po promytí v PBS se takto upravené vzorky inkubovaly s primárními činidly po dobu 30 minut v cele^ s .vysokou vlhkostí, promyly se PBS a inkubovaly se se sekundárními činidly po dobu 30 minut při teplotě 37 °C v cele s vysokou vlhkostí. Po promytí s PBS se • · · ·» * ♦*···· ··· · · · · ·· ·

C λ· · · · · · · · « ···« · » · · « · · · • 9 « · · · · » · ···· <· ·» «*· ·« ·» takto připravené vzorky ponořily do PBS s 50 % glycerolem a prohlížely se pod mikroskopem Zeiss Axophot vybaveným vhodným světelným zdrojem a filtry vhodnými pro FITC.

Výsledky jsou uvedeny dále v textu v tabulce č. 2 a 3. Je zřejmé, že všechny odlišné ligandy vykazují správné navázání v případě, že se odpovídající vlákna exprimuji jako vylučované produkty. Avšak pouze afilátky vykazují očekávané správné navázání v případě, že se vlákna exprimovala v cytosolu a následně se transportovala do jádra. Důvodem je skutečnost, že ne všechny ligandy se mohou v cytosolu a v jádru dobře sbalit. Je zajímavé, že ligandy, které odolávají prostředí v cytosolu a v jádru (afilátky) jsou malé alfa-helikální struktury, jejichž uspořádání nezávisí na můstcích S-S, zatímco ligandy, které se v cytosolu/jádru neexsprimují správným způsobem, mají uspořádání, které závisí na tvorbě můstků S-S, jenž se v cytosolu tvoří velmi málo nebo vůbec.

Tabulka č. 2: Exprese a funkční navázání ligandu v rekombinantním adenovirovém vlákně cíleném za účelem sekrece do buněk COS.

Detekční činidlo
Vlákno	4D2 + aMIg	2A6+ aMIg	a-EGF+ aMIg	a-MIg	a-Id+ aMIg	HlgGt aHIgG	HlgAt aHIgA
WT	+	+	ND	ND	ND	ND	ND
A7 EGF	+	+	+	ND	ND	ND	ND
A7 G250	4-	+	ND	4·	+	ND	ND
A7 C242	+	+	ND	+	+	ND	ND
Al ZlgG	+	ND	ND	ND	ND	+	-
A7 ZlgG	+	ND	ND	ND	ND	+	-
A7 ZlgG/ZIgG	+	ND		ND	ND	t	-
A7 ZlgA	+	ND -	ND	ND	ND	-	+
A7 ZlgG/ZIgA	+	ND	ND	ND	ND	+	t

• · · «55··:· • · · · · • < • · 1 ·· ··

Tabulka č. 3: Exprese a funkčnost ligandu, který se váže v jádru buněk COS na přirozené nebo vybrané rekombinantní vlákno za účelem exprese v cytosolu

Detekční činidlo
Vlákno	4D2 + aMIg	2A6+ aMIg	a-EGF+ aMIg	a-MIg	a-Id+ aMIg	HIgG+ aHIgG	HIgA+ aHIgA
WT	+	+	ND	ND	ND	ND	ND
A7 EGF	+	+	-	ND	ND	ND	ND
A7 G250	+	.+	ND	+	-	ND	ND
A7 C242	+	+	ND	+	-	ND	ND
Al ZlgG	+	ND	ND	ND	ND	+	-
A7 ZlgG	+	ND	ND	ND	ND	+	-
A7 ZlgG/ZIgG	+	ND		ND	ND	+	-
A7 ZlgA	+	ND	ND	ND	ND	-	+
A7 ZlgG/ZIgA	+	ND	ND	ND	ND	+	+
A7 ZlgG Xa Knob	+	ND	ND	ND	ND	+

Výsledky implikují s konstrukcí těchto cílených virů vhodných pro lidskou genovou terapii v případě, že se v cytosolu savčích buněk syntetizují virové strukturální komponenty obsahující nový ligand, který se váže na buňku. Dále v textu jsou dva příklady, kde se popisuje, jak se zkonstruovaly takové uvedené cílené adenoviry.

Příklad 6: Zavedení smyček CDR

Jisté konstrukce monoklonálních protilátek tvořené jediným řetězcem si uchovávají svou vazebnou aktivitu dokonce i v cytosolu savčích buněk (popisuje se v publikaci Cattaneo et al., TIBTECH 17: 115-121> ¢1999)). To je funkce tak zvaných oblastí kostry nebo variabilních oblastí protilátek. Je známo, • · · φ φ .56·*;· ·: :

• · φ · · · · »* · ·· · • · · • · · * « · · · «· ·· že smyčky CDR vázající· antigen se mohou přenášet z jedné protilátky na jinou metodou rekombinace DNA, čímž vznikají protilátky s vlastnostmi kostry jedné protilátky a z vazebnými vlastnostmi druhé protilátky (metodika se popisuje v publikaci Emery et al., Strategies for Humanizing Antibodies, in Antibody Engineering, Carl A.K. Borrebaeck, (ed.), Oxford University Press 1995, page 159).

Takové jednořetězcové protilátky se zavedenou smyčkou založené na variabilní doméně kostry schopné se v cytosolu správně balit a následně se transportovat do jádra buňky se mohou následně doplnit vhodnými klonovacími místy na úrovni genu a pak se mohou ligovat do genů kódující vlákno A7 RGD a ty se mohou zavést do genomu adenoviru, jak se popisuje dále v textu (příklad 7).

Příklad 7: Zavedení rekombinantních vláken do adenovirového genomu

Vlákno divokého typu kódované v genomu adenoviru se nahradilo rekombinantními vlákny metodou podle vynálezu. Při tété metodě se genom adenoviru 5 divokého typu v plazmidu pTG3602 (popisuje se v publikaci Emery et al., Strategies for Humanizing Antibodies, in Antibody Engineering, Carl A.K. Borrebaeck, (ed.), Oxford University Press 1995, page 159) použil jako receptor pro geny kódující rekombianntní vlákna, tento plazmid obsahuje celý genom Ad5 divokého typu spojený s kostrou plazmidu linkery Pacl. Celý genom se pak může získat jako lineární fragment DNA štěpením Pacl, protože restrikční místo Pacl není přítomno v genomu adenoviru. Výsledná lineární DNA adenoviru se pak může transfekovat do vhodných buněk za vzniku viru (popisuje se v publikaci Chartier et al., J. Virol. 70: 4805-4810, (1996)). Z tohoto plazmidu se mohl genom adenoviru štěpit ve formě dvou fragmentů, jeden o velikosti 27 kb a druhý o velikosti 9 kb, za použití restrikčních enzymů • · » · · *

5Π· · · · · 4 · * / « « * · ···· · · ♦ ···

Pacl a Spěl. Fragment - o velikosti 9 kb se klonoval do pBluescriptu. Z fragmentu o velikosti 9 kb obsahující vlákno se dále subklonoval fragment o velikosti 3 kb vzniklý štěpením restrikčními enzymy Sací a Kpnl. Gen vlákna se deletoval v oblasti mezi restrikčním místem Ndel v části konce vlákna a restríkčním místem Munl, které se nachází po směru exprese od genu vlákna a mezí restrikční místa Ndel a Munl se začlenil adapter obsahující restrikční místo Xhol. Tak vznikl trasnportní vektor vhodný pro vlákno. Do transportního vektoru se mezi restrikční místa Ndel a Xhol začlenilo několik rekombinantních vláken a pak vznikl homologní rekombinací v mikroorganismu E. coli fragment o velikosti 9 kb (popisuje se v publikaci Chartier et al., J. Virol. 70: 4805-4810, (1996)). To znamená, že všechny normální elementy regulující expresi vlákna zůstávají neporušeny.

Nakonec se rekombinantní fragmenty o velikosti 9 kb odděleně spojily klonováním do kosmidu za vzniku fragmentu o velikosti 27 kb a tak vznikl úplný genom Ad.

Fragment o velikosti 27 kb se také může odvodit z jiného adenovirového genomu, jako je Ad-YFG popsaný v publikaci He ΤΟ., Zhou S., DaCosta L.T., Yu J. , Kinzler K.W. and Vogelstein B.: A simplified systém for generating recombinant adenoviruses. P/roc. Nati. Acad. Sci., USA 95: 2509-2514, 1998). Jestliže se fragment o velikosti 27 kb získal z pTG3602 výsledný genom bude WT E1+, zatímco fragment o velikosti 27 kb pocházející z Ad-YFG ponese virus s deletovaným El potřebuje například pro replikaci buňky 293 se nízkým počtem pasáží.

Genom rekombinantního adenoviru, který je výsledkem shora popsaných manipulací se může nakonec získat jako lineární fragment štěpením restrikčním enzymem Pacl a použil se pro transfekci permisivní buněčné linie, která vede k vytvoření virových plaků v případě, že je genom funkční. V případě .58* • ·· · φ

• · • » uvedených transfekcí se .použilo transfekční činidlo FuGENE 6 (Roche).

Různá rekombinannti vlákna se vnesla do genomu Ad a následně se transfekovala do permisivnich buněk. Výsledky jsou zobrazeny v tabulce č. 4. Pouze vlákna obsahující knoflík WT a afilátku A7 ZlgG/IgG byly schopny tvořit funkční viriony. Výsledky souhlasí s výsledky uvedenými v tabulce č. 2 a 3.

Tabulka č. 4: Zavedení rekombinantních vláken do virionů

vlákno	transfekovaná buňka	výskyt virových plaků
A7 WT Knob	293	ano
A7 EGF	A549	ne
A7 C242	Colo 205	ne
A7 G250	A75	ne
A7 ZlgG/ZIgG	293/Fc*	ano

(*) Buňky 293/Fc jsou buňky 293 stabilně transfekované Fc3(l) pocházející z lidského IgG exprimovaného jako membránový protein. Aby vznikly buňky 293/Fc, klonovaný Fc3(l) z lidského IgG, který reaguje s doménou Z (popisuje se v publikaci Jendeberg, L., Nilson, P., Larsson, A., Nilsson, B., Uhlén, M. and Nygren, P. A (1997) Engineering of Fcl a Fc3 from human immunoglobulin G to analyse subclass specifity for staphylococcal protein A, J. Imm. Methods 201, 25-34), se liígoval do vektoru pDisplay (od firmy Invitrogen) do rámce se sekvencí transmembránové domény PDGFR, která je přítomná ve vektoru. Kódující sekvence obsahující sekvenci Fc fúzovanou se sekvencí transmembránové domény PDGFR se pak štěpila z vektoru za použití restrikčních enzymů Sfil a Notl a ligovala se do vektoru pSEcTag (který nese gene rezistence na Zeocin) štěpený stejným restrikčním enzymem'. Obnovený vektor se transfekoval do buněk 293 s nízkým počtem pasáží za použití sady FuGENE a • 9

9 99

9 9 9 9 9

9 9 9 · .59··:· *: :

9999 9 ♦· · buňky se pak kultivovaly· za selekčního tlaku Zeocinu, aby se získaly stabilní transformované buňky. Izolovaly se klony a testovala se v nich exprese na membráně Fc3(l), který se váže na membránu za použití stafylokokového proteinu A (Sigma) značeného FITC. Jeden klon buněk 293, který homogeně exprimuje Fc vázaný na membráně se použil při transfekci A7 ZlgG/ZIgG, který obsahuje genom za vzniku virionů.

Příklad 8: Sestavení genových konstrukcí kódujících rekombinantní adenovirová vlákna s afilátkou a štěpitelným knoflíkem divokého typu.

Štěpitelná vlákna obsahují jak nepřirozený polypeptid obsahující externí ligand v tomto případě afilátka a Cterminálně umístěný knoflík divokého typu se zkonstruoval s místem pro aktivovaný faktor X, které se umístilo mezi struktury vázající se na buňku tak, že knoflík je možné odštěpit v okamžiku, kdy se vystaví afilátce. To umožňuje produkci viru v buňkách 293 s následnou infekcí nových cílených buněk, jak se definuje afilátkou po proteolytickém odstraněním knoflíku.

Aby se zkonstruoval gen kódující štěpitelné vlákno vhodný pro ligaci různých ligandů, vlákno WT se podrobilo PCR pomocí primeru 437, který do genomu zavádí restrikční místo Clal, Munl a místo rozeznávané faktorem Xa pak následuje privních sedm tripletů repetice 22a primeru 149, který se váže na konec knoflíku vlákna. Po klonování a restrikci za použití restrikčních enzymů Clal a Xhol se fragment DNA klonoval do dříve zmiňované konstrukce vlákna A7. Výsledný gen vlákna obsahuje v pořadí od N-konce sekvenci konce vlákna, prvních sedm repetic střední části, trimerizační signál NRP, linker ze stafylokokového proteinu^A,.., restrikční místo Clal, restrikční místo Munl, místo štěpitelné faktorem Xa, repetici 22 a knoflík divokého typu. Za účelem ligace do tohoto genu vlákna, ·* ···· gen afilátku ZlgG se doplnil restrikčním místem Clal a Munl pomocí PCR za použití primerů 503 a 505 a ligoval se do shora v textu uvedeného genu „vlákna Xa. Výsledný gen vlákna obsahuje v pořadí od N-konce sekvenci konce vlákna, prvních sedm repetic střední části, trimerizační signál NRP, linker za stafylokokového protřenu A, restrikční místo Clal, nový linker, restrikční místo Munl, místo štěpitelné Xa, repetice 22 a knoflík divokého typu.

Gen vlákna se zavedl do do genomu adenovirů (popisuje se v příkladu 7) . Rekombinantní genom se transfekoval do buněk 293 a viriony se produkovaly a čistily gradientem CsCl. Čištěné viriony se štěpily aktivovaným faktorem X (Xa) (od firmy Sigma) v 50 mM Tris-Cl pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2 po dobu 48 hodin při teplotě místnosti. 1 jednotka Xa se používala pro 5 μΐ virové suspenze.

Test vhodný pro navázání afilátky ZlgG na viriony se provedl v podstatě následujícím způsobem. Virové suspenze se nanesly na membrány PVDF (od firmy BioRad) . Po blokování 3 % želatinou ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris, hodnota pH je 7,4 (TBS), se membrány inkubovaly s FC 10 gg/ml v 1% želatině v TBS po dobu 90 minut při teplotě místnosti, promyly se, inkubovaly se s anti-lidským IgG-HRP (Dakopatts) v roztoku TBS s 1% želatinou po dobu 90 minut při teplotě místnosti, promyly se a vyvíjely se v činidle 4-chloronaftol (od firmy BioRad). Výsledky barvení vlákna WT a rekombinantní viry jsou známy z obrázku č. 3 spolu s různými kontrolami. Je zřejmé, že rekombinantní virus, který se váže na Fc3(l) se také váže na WT Z, zatímco Fc3, který se neváže na WT Z (popisuje se v publikaci Jendeberg, L., Nilsson, P., Larsson, A., Nilsson, B., Uhlén, M. and Nygren, P.-A. (1997), „Engineering of Fcl and Fc3 from human immunoglobulin G to analyse subclass specifity for staphylococcal protein A. J. Imm. Methods 201,

9 ·♦

9 9 · ·

9 9 · · či··:* *: :

···· * ··

25-34) se také naváže na rekombinantní virus. Virus Wt se neváže ani na připravený vzorek Fc.

Příklad 9:.. Testování nepřirozených polypeptidu za účelem stanovení funkčního uspořádání a vazebné speciíity.

Uvedený polypeptid se exprimuje jako část proteinu virové části, kdy se začlenění odpovídající kódující sekvence do vhodné konstrukce. Konstrukce, která obsahuje celý virový genom, kde celý virový genom, ve kterém jedna nebo více částí se nahradí odpovídajícím rekombinantním genem, se exprimovala v buněčné linii vhodné pro pomnožení rekombinantního viru kódovaného rekombinantním virovým genomem. Existují dvě hlavní možnosti v závislosti na skutečnosti, zda funkce WT vázat se na buňku je zachována v rekombinantním genomu nebo nikoliv.

Jestliže funkce WT vázat se na buňku je zachována, virus se může produkovat v normálních buněčných liniích, jako jsou buňky 293 určené pro adenovírus. Schopnost nepřirozeného polypeptidu exprimovat se v uspořádání, které umožňuje vázat se na extracelulární ligand a být částí funkčního virionu, se testuje vazebnou studií provedenou na virionech. Tento přístup se zobrazuje strategií používanou v příkladu 8 shora v textu, kde virové vlákno obsahuje knoflík WT a nepřirozený vazebný kde knoflík se může odstranit proteolytickým Vazebná funkce nepřirozeného polypeptidu se demonstrovala standardní imunologickou technikou na pevné fázi. Jiná strategie pro dosažení stejného výsledku bude produkce virionů s vlákny WT stejně jako s rekombinantními ligand a štěpením.

vlákny, později obsahující nahrazení přirozeného knoflíku.

nepřirozený polypeptid, jako

Jestliže se z virového genomu odstranila funkce WT vázající se na buňku, navázání virionů na buňku bude záležet ·* ·♦·· • · • · · · ···· f · • 9

·« na nepřirozeném polypeptidu. Proto buněčná linie musí být schopná umožnit vstup rekombinantního viru, a je-li to nezbytné, doplnit virový genom genetickou informací, která může rekombinantnímu viru chybět, například sekvence El. Jestliže rekombinantní virus má deletovanou oblast El, jedno řešení je použít buněčnou linii transfekovanou El, jako jsou buňky 293, které se stabilně transfekují receptorem schopným vázat nepřirozený polypeptid, jehož gen je vhodný pro rekombinantní virový genom. Schopnost nepřirozeného polypeptidu exprimovat se v uspořádání, které umožňuje jeho navázání na odpovídající strukturu receptoru a tvořit část funkčního virionu se testuje na základě schopnosti tvořit plaky v buňkách, které jsou transfekované virovým genomem. Tato strategie se používá v příkladu 7 uvedeném shora v textu, kde buňky 293 stabilně exprimující Fc z lidského IgG vázané na membránu se používají k produkci virionů, kde vazebná funkce WT se nahradil afilátkou ZlgG. Přesné vazebné schopnosti nepřirozeného polypeptidu se mohou dále stanovit ve studiích, kde virus soutěží svou schopností vázat se s peptidy, které jsou strukturálně příbuzné s nepřirozeným polypeptidem, který je odpovědný za navázání se na buňku.

Příklad 10: Anti-beta-galaktozidázový jednořetězcový fragment

Fv

Při pokračování experimentů popsaných v příkladu 3 se jednořetězcový fragment s variabilním řetězcem (VK, linker, VH) reagující s beta-galaktosidázou a schopný exprimovat se v cytoplazmě (popisuje se v publikaci Martineau P and Betton J-M: J. Mol. Biol. 292, 921-929 (1999)) se klonoval do shora uvedených konstrukcí vlákna A7. Tento jendořetězcový fragment je sekvence SEQ ID NO: 47. Aby mohlo dojít ke klonování shora v textu uvedených konstrukcí vlákna A7, jednořetězcový fragment se štěpil restikčními enzymy Ncol/EcoRl z plazmidu pPM163R4 (popisuje se v publikaci Martineau P and Betton J-M:

·· ··· ·

♦ * · · * · • 9 · · · £3··:· ·: :

···· « ·· ·

J. Mol. Biol. 292, 921-929 (1999)) a ligoval se do plazmidu, který obsahuje shora v textu uvedené vlákno R7 EGF doplněné adaptérem Clal-Ncol-EcoRl-Xhol, který umožňuje ligaci do rámce jednořetězcového fragmentu.

Při pokračování experimentů popsaných shora v textu v příkladu 5 se hodnotila exprese a poloha v buňce rekombinatních vláken, která obsahují jednořetězcový fragment s variabilním řetězcem (VK, linker, VH) reaktivním s betagalaktosidázou, pomocí imunologického barvení za použití následujících primárních činidel:

beta-galaktosidáza-bíotin (SIGMA, G 5025).

Vedle výsledků zobrazených v tabulce č. 2, jsou výsledky získané v ekvivalentních experimentech v případě konstrukce beta-galaktosidázového jednořetězcového fragmentu Fv vlákna zobrazené v tabulce č. 5.

Tabulka č. 5: Exprese a funkční navázání ligandu na rekombinantní adenovirová vlákna cílená za účelem sekrece do buněk COS.

vlákno	4D2 + aMIg	2A6+ aMIg	β-galaktosidáza + StrAv-FITC
R7 a-β- galaktosidáza	+	+	+

Vedle výsledků zobrazených v tabulce 3, výsledky získané v ekvivalentních experimentech v případě konstrukce anti-betagalaktosidásového jednořetězcového fragmentu Fv vlákna jsou zobrazeny v tabulce č. 6:

Tabulka č. 6: Exprese a funkčnost ligandu vázajícího se v jádru buněk COS v přirozených a vybraných .54' *»·· w · • · rekombinantních vláknech po cílení za účelem exprese v cytosolu

vlákno	4D2+ aMIg	2A6+ aMIg	β-galaktosidáza + StrAv-FITC
R7 a-β- galaktosidáza	+	+	+

Příklad 11: Fenotypická analýza proteinů vláken

Popisuje se další příklad upravených virů podle vynálezu, kde komplex polypeptidových ligandů se začlenil do upraveného proteinu adenovirového vlákna. Příklad ukazuje důležitost vytvoření cíleného, dostupného a funkčního adenovirového vektoru, který vykazuje dva rysy:

(i) :u) by měly stále umožňovat sbalení, které je disulfidových vazeb.

úpravy struktury vlákna dostatečné zachycení viru na buňce a vstup viru do buňky a ligandy začleněné do vlákna by měly být schopny se v cytoplazmě savčí buňky správně sbalit.

Rozpustnost se s výhodou používá k odhadu správného v typickém případě spojeno s absencí Nepřirozené polypeptidy popsané tímto vynálezem nemají s výhodou více než 2 disulfidové vazby. V typickém případě neobsahují více než 1 disulfidovou vazbu a nejvýhodnější je, když neobsahují žádnou disulfidovou vazbu.

Materiály a metody

Buňky

Buňky HEK-293 se získaly od firmy Microbix lne. (Toronto, Ontario, Kanada). Buňky Cosi, A431 a Colo205 se získaly z instituce American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia) a buňky A75 a G43 se získaly od Reindera Bolhuise (z « · • >

#· <r·»· • « ♦ • · · • « « • · · · ·· ·· instituce Daniel Den . Hoed Cancer Center, Rotterdam, Holandsko). Všechny buňky se udržovaly při teplotě 37 °C a v 5% atmosféře C0₂ v Iscovevově kultivačním médiu (Gibco BRL) doplněném 10 % fetálním boviním sérem, (Sigma-Aldrich) a gentamicinem v koncentraci 50 mg/ml (Gibco BRL) . Buňky mikroorganizmu Spodoptera frugida (Sf9) se kultivovaly při teplotě 28 °C v kultivačním médiu TC 100 (Gibco BRL) se stejnými doplňky, jak se popisuje shora v textu.

Protilátky

Monoklonální protilátky (mAb) určené proti epidermálnímu růstovému faktoru (EGF) se získaly od firmy Cambio Ltd. (Cambridge, UK). Protilátky určené proti doménám Va a νβ jednořetězcového receptoru T-buňky (scTCR) a antiidiotypických protilátek určených proti monoklonální protilátce G250 (NUH31 a NUH 84) poskytl Reinder Bolhuis. Monoklonální protilátky určené proti konci vlákna (4D2.5) a monoklonální protilátky určené proti trimeru (2A6.36) se získaly od Jeffa Englera (Univarsity of Alabama at Birmingham, Al). Knoflík vlákna určený proti monokonální protilátkce 1D6.14 se získaly od Bucka Rogerse (UAB, Birmingham, AL) . Monoklonální protilátka RL2, která je specifická pro zbytky spojené přes O GlcNAc se získaly od Larryho Gerace prostřednictvím Jeffa Englera. Anti-idiotypické protilátky značené biotinem určené proti monoklonální protilátce C242 (Idl, Idl3 a Id20) se připravily z původních hybridomů. Streptavidin značený křenovou peroxidázou (HRP), králičí proti-myší imunoglobin G značený isothiokyanátem fluoresceinu (FITC) a streptavidin značený FITC se získal od firmy DAKO (Glostrup, Dánsko).

Tvorba rekombinantních vláken bez knoflíku a názvosloví

Rekombinantní geny vláken se zkonstruovaly použitím metod založených na ligaci, PCR a sestřihem přesahujících extenzí • · ♦· • · * · · • · · · * ··· · · · ·· »··» « · · « « »« · ·» >· ·· (SOE). Sekvence genů . vytvořené pomocí PCR se před subklonováním sekvenovaly. Z plazmidu pAB26 (Microbix, Toronto, Canada) se získaly pomocí PCR za použití přímého primerů (SEQ ID NO: 48) ' -CTC GGA TCC GAT GAA GCG CGC AAG ACC GTC TGA A-3 ’ a reverzního primerů (SEQ ID NO: 49)

5¹-TTC CTC GAG TTA TTC TTG GGC AAT GTA TGA-3' gen kódující vlákno Ad5 WT restrikční místa BamHI a Xhol oblast knoflíku deletovala

Primery zavádějí do genomu V rekombinantních vláknech se nahradila se nevlastním a nanradiia se trimerizačním motivem, který obsahuje 36 aminokyselin (aa) získaným z holé oblasti peptidů (NRP) lidského plicního povrchově aktivního proteinu D. Sekvence NRP (PDVASLRQQVAELQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPNG) (SEQ ID NO:2) , následovaná sekvencí linkeru ze stafylokokového proteinu A (Staph-A linker: AKKLNDAQAPKSD) se ligovala do C-konce střední oblasti vlákna o různé délce obsahující repetice 1, 7 nebo 22.

Výsledné konstrukce se nazvaly Rl, R7 a R22. Do C-konce linkeru Staph-A se přidaly opětně cílené ligandy. Za účelem úspěšného klonování různých ligand se po linkerové sekvenci zavedly restrikční místa Clal a Xhol. Všechny shora v textu zmiňované ligandy se připravily s těmito uvedenými restrikčními místy a název ligandu se uvedl po číslu repetic střední oblasti v názvu vlákně. Například Rl-RGD, R7-EGF atd. (Zobrazeno na obrázku č. 4) . Knoflík R7 je tvořen zkrácenou střední oblastí vlákna (repetice 1 až 7) , nesoucí NRP, linker Staph-A a doménu přirozeného knoflíku, který zahrnuje poslední repetici střední části a spojení knoflíku se střední částí (uvedeno na obrázku č. 4). Za účelem vytvoření dvou konstrukcí vlákna R7-knoflík se do restrikčního místa Nhel, které se nachází na N-konci NRP, začlenil další linker. Tyto linkery se získaly z repetice 17 střední oblasti vlákna Ad5 WT • ·· ···· ·· · · · • · · · • « · · · • · · · · ··· ·· *· ·· · • » · • · · .tr·:· ·«·« · ·· • · • · • · · • · ··

TTTACAGCTTCAAACAATTCCAÁAAAGCTTGAG) a repetice 22 střední oblasti (L22 GGAAACAAAAATAATGATAAGCTAACTTTGTGTGACC) pojmenovaly se jako R7-L17-knob a R7-L22-knob. Schéma vláken je zobrazeno na obrázku č. 4.

Cílené ligandy

Polypeptidové ligandy

Syntetizovaly se fragmenty tvořené dvouřetšzcovou DNA obsahující RGD nebo motiv ACDCRGDCFCG (zkráceně RGD4C) jako oligonukleotidy komplementární s jednořetězcovými terminálními adaptery a hybridizovaly spolu. Z Genu vlákna WT Ad5 se získal pomocí PCR fragment obsahující repetici 22 střední části vlákna, spojení knoflík-střední část a celý knoflík. Syntetizovala se sekvence DNA lidského EGF, klonovala se a ověřila se sekvenováním. Od Reindera Bolhuise se získal klonovaný jednořetězcový receptor T-buňky (který obsahuje disulfidové vazby) vykazující specifitu vůči Magel/HLA Al. Používaný scTCR měl formát Va-linker-νβθβ.

Monoklonální protilátky

Použily se dva jednořetězcové fragmenty monoklonálních protilátek (scFv). První scFv obsahuje variabilní kappa řetězec (nebo VK) , mezerový linker, variabilní těžký řetězec (nebo VH), spojovací sekvenci (JS) a konstantní doménu 2 těžkého řetězce (nebo CH2) monoklonální protilátky G250. Ukázalo se, že monoklonální protilátka G250 vykazuje vysokou specifitu vůči povrchovému antigenu buněk lidského renálního karcinomu.

Afilátky.

Druhý scFv obsahoval stejnou základní strukturu VK-linkerJS-VH a získal se z ňionóklonální protilátky C242, která reaguje s buňkami kolorektálního a pankreatického karcinomu.

β$«

Avšak za účelem získání lepší selektivity pro připravené cílové buňky se získaných z C242

SOE knihovna afilátek cDNA z buněk hybridomu vytvořila pomocí scFv za použití produkujících monoklonální protilátky jako templátu. Peptidový ligand obsahující 18 náhodně rozdělených aminokyselin (SNN)₁₈ se začlenil mezi domény VK a VH, kde S je dA, dG nebo dC a A je dA, dG, dC nebo dT. Afilátky se vybraly pomocí metody vyjádření tága na buňkách kolorektálního karcinomu Colo205 a v případě peptidového ligandu se identifikovala sekvence PPDFVPPAASFPDHSPRG. Pro další schopnosti antigenu se (PPDFVPPAASFPDHSPRG)-VH.

práci založenou na vazebné vybral C242 scFV VKBuněčná exprese a lokalizace vlákna a reaktivita ligandu

Geny kódující rekombinantni vlákna se klonovala do vektorů pcDNA3.1 a pSecTag2 (Invitrogen BV, Groningen, Německo) za účelem dosažení vnitrobuněčné exprese a extrabuněčného uvolnění. Vektory se transfekovaly do buněk Cos7 za použití Lipofectaminu (Life Technologies lne., Gaithersburg, MD USA) podle instrukcí výrobce. Imunologickým barvením se hodnotila exprese, transport do jádra a funkční exprese vláken s novými ligandy schopnými vázat se na buňku. Buňky se centrifugovaly na mikroskopických sklíčkách a sušily se na vzduchu přes noc při teplotě místnosti. Takto připravené vzorky se fixovaly v 3 % paraformaldehydu v PBS a permeabilizovaly se pomocí 0,1 % roztoku Triton-X100 v PBS. Po promytí v PBS se takto upravený vzorek inkuboval s primární protilátkou (monoklonální protilátka určená proti vláknu nebo monoklonální protilátka určená proti ligandu) po dobu 30 minut při teplotě místnosti v cele s vlhkou atmosférou. Směs se znovu promyla PBS a inkubovala se sekundárními protilátkami značenými FITC po dobu 30 minut při teplotě 37 °C v cele s vlhkou atmosférou. Po promytí v PBS se takto upravené vzorky ponořily do PBS s 5% glycerolem a pozorovaly se mikroskopem Zeiss Axioskop

69.*:.:..

• · • · · · · vybaveným vhodným světelným zdrojem a filtry, které jsou vhodné pro FITC.

Fenotypická analýza proteinů vlákna

Rekombinantní proteiny vlákna se exprimovaly v hmyzích buňkách infikovaných rekombinantními bakuloviry a hodnotily se z hlediska následujících čtyř kritérií:

(i) rozpustnost, (ii) trimerizace, (iii) glykosylace a (ív) prostorové uspořádání rekombinantní pentonové báze in vivo za vzniku pentonových kapsomérů.

(i) Za účelem imunologické kvantifikace rozsputných frakcí ve srovnání s nerozpustnými frakcemi rekombinantních vláken se buňky Sf9 lyžovaly v hypotonickém roztoku (10 mM Tris-HCl, hodnota pH je 7,5) při teplotě 0 °C.

Upravily se izotonické podmínky roztoku (150 mM NaCl v 10 mM Tris-HCl, hodnota pH je 7,5 a lyzátu se centrifugovaly při 15 000 x g po dobu 10 minut. Supernatatnty a pelety se pak . analyzovaly běžnou metodou SDS-PAGE a imunologickým přenosem na membránu za použití monoklonálních protilátek 4D2.5 proti konci vlákna, které fungují jako primátní protilátky, a jako sekundární protilátky se použily anti-myší IgG značené [³⁵S]SRL (Amersham Pharmacia Biotech, 100 pCi/ml, použilo se 5 gCi na jeden blot) .

(ii) Status oligomerizace vlákna se testoval způsobem SDSPAGE v podmínkách, které nezpůsobují denaturaci (oznažuje se jako NDS-PAGE) a běžným způsobem denaturační SDS-PAGE. NDS-PAGE se liší od SDS-PAGE tím, že se vzorky před elektroforézou nedenaturovaly povařením ve vzorkovém pufru s SDS.

• · · ·

Λ · · · · · · ·· * / (J ·♦·♦··· · ···· · • · · · · · · · · ···· * ·· ··· ·· ·· (iii) Glykosylace rekombinantních vláken se hodnotila imunoreakcí blotů za použití monoklonálních protilátek RL2 a chemickou detekcí za použití DIG Glycan Detection Kit (Roche) (iv) Sestavení vlákna s pentovou baží se testovala koinfekcí stejných buněk Sf9 se dvěmi rekombinantními AcNPV, jeden exprimuje pentonovou bázi, druhý exprimuje protein vlákna.

Přítomnost pentonového kapsomeru se detekovala v buněčném lyzátu 40 hodin po infekci a analyzovala se metodou PAGE za přirozených podmínek při průchodu nízkého napětí přes noc za stálého chlazení. Imunologická kvantifikace přirozeného pentonu, pentové báze a proteinů vlákna se provedla jak se popisuje dále v textu za použití odpovídajících primárních protilátek (určených proti pentonové bázi nebo proti vláknu), dále se použije jako sekundární protilátka anti-myší nebo anti-králičí celé IgG značené [³⁵S]SRL. Bloty se exponovaly na radiografický film (Hyperfilm beta-max, Amersham Pharmacia Biotech) a autoradiogramy se prohlížely při vlnové délce 610 nm za použití automatického densitometru (REP-EDC, Helena Laboratories, Beaumont, TX) . V jiném případě proteinové pruhy se vyřízly z blotů a na scintilačním počítači se určila jejich radioaktivita (Beckman LS-6500).

Zavedení rekombinantních upravených vláken do virionů

Rekombinantní vlákna se zavedla do genomu Ad5, jak se popisuje shora v textu. Fragment o velikosti 9 kb pocházející z genomu Ad5 (poloha v mapě 75,4 až 100) a obsahující gen vlákna WT se vytvořil štěpením plazmidu pTG3602 restrikčními enzymy Spěl a PacI. Plazmid pTG3602 obsahuje celý genom WT Ad5 vázaný na plazmid pBluescript II SK(-) (od firmy Stratagene) a po přidání restrikčnímho místa Pac I do MCS se vytvořil plazmid pGAG9. Fragment o velikosti 3 kb vytvořený štěpením • · · ·

71* • · · · plazmidu pGAC9 restrikčními enzymy Sací a KpnI se pak subklonoval do plazmidu pBluescript II SK(-). Ve fragmentu o velikosti 3 kb se deletovalo restrikční místo Ndel (které se nachází na konci domény vlákna Ad5) a deletovaná sekvence se nahradila linkerem, který obsahuje restrikční místo Xhol. Tak vznikl plazmid pGAC3, který se stal recipientním plazmidem pro všechny genové konstrukce vláken, které se začlenily mezi restrikční místa Ndel a Xhol. Rekombinantní vlákna začleněná do plazmidu pGAG3 se znovu začlenila do plazmidu pGAG9 a štěpila se restrikčním enzymem Nhel za použití homologní rekombinace v mikroorganizmu E. coli BJ5183. Výsledný rekombinantní plazmid pGAG9 se pak vystřihl z vektoru použitím restrikčních enzymů Spěl a Pacl a spojil se s izolovaným fragmentem o velikosti 27 kb (v mapě se nachází .v poloze 0 až 75,5 mu), který reprezentuje levostraný segment genomu Ad5, pomocí klonování do kosmidu (SuperCosl Cosmid Vector Kit a Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene). Přítomnost správného rekombinantího vlákna v kosmidových klonech se ověřila pomocí PCR a restrikční analýzou za použití restrikčních enzymů Spěl a HindlII.

V případě produkce viru se rekombinantní kosmidové genomy izolovaly po použití restrikčního enzymu Pacl a transfekovaly se do buněk, které exprimují receptory odpovídající ligandu začleněnému do vlákna. Při standardní transfekční reakci se použily 2 μg DNA a 3 μΐ FuGENE (Roche) v prohlubni o velikosti 35 mm. Genomy Ad5, které zahrnují gen vlákna obsahující jako ligand buď motivy RGD nebo knoflík vlákna WT se transfekovaly do buněk 293. V případě jiných vláken, které jsou ligandem, se genomy Ad5 s ligandem EGF transfekovaly do buněk A549, scFvC242 se transfekovaly do buněk Colo 205, scFv-G250 se tranfekovaly do buněk A75 a scTCR specifické pro Magel/HLA Al se transfekovaly do buně-k G43. Provedly se nejméně tři různé transfekce. Při každé se použily destičky se šesti prohlubněmi. Výskyt plaků se determinoval mikroskopickým pozorováním transfekovaných buněčných kultur. Ověření rekombinantní sekvence vlákna se provedlo pomocí PCR s primery specifickými pro každou konstrukci vlákna.

Charakterizace rekombinantního vlákna a virionů Ad5

Buněčná exprese

Za účelem hodnocení síly exprese vlákna se buňky 293 infikovaly virem WT, R7-knob a R7-RGD v množství 10 jednotek tvořících plaky na jednu buňku. Buňky se shromáždily a čtyřikrát prošly cyklem zmrazení a rozmražení a pak se analyzovaly metodou SDS-PAGE a westernovým blotem. Bloty se nechaly reagovat s protilátkou 4D2.5 a detekovaly se antimyším IgG značeným HRP (DAKO).

Obsah vlákna ve virionech Ad5

Počet kopií vlákna ve virionech se stanovil po izolaci virionů Ad5 pomocí gradientu CsCl, analýzou SDS-PAGE a westernovým blotem, jak se popisuje shora vtextu. Množství viru naneseného do akrylového gelu se normalizoval s ohledem na stejné množství infekčních částic, což se stanovilo titrací viru na buňkách 293 (vyjádřeno jako jednotky tvořící plaky na mililitr), a s ohledem na stejné množství fyzikálních částic (PP) stanovených testem množství proteinu (BioRad). Počet PP se stanovil pomocí analýzy SDS-PAGE a barvením rekombinantů Ad5 Comassieovou modří, které se podrobily elektroforéze spolu s širokým rozmezím vzorků standardního bovinního sérového albuminu (BSA) (2x krystalizovaný, BioRad). Obsah proteinu v pruzích tvořených hexonem se hodnotil porovnáním se standardními pruhy BSA automatickým densitometrem (REP-EDC, Helena Laboratories, Beaumont, TX) . Počet částic PP Ad5 ve vzorcích se vypočítal z hmotnosti jediného virionů 2,91 x lOe16 g, to znamená 2,91 mg* v případě 10e+13 virionů. Index ·· ···· • ······ · • · · ·· * ·· infekčnosti reprezentuje- poměr infekčních a přirozených částic.

Rychlost růstu rekombinantního viru Ad5.

Rychlost růstu se měřila produkcí plaků v buňkách 293. Při standarních testech se virus v PBS absorboval do buněčných monovrstev (vzorek obsahuje 4xl0⁴ buněk) při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Buňky se jednou promyly a dále se inkubovaly v Iscoovevově kultivačním médiu doplněném 10 % FCS a gentamicinem v koncentraci 50 mg/ml při teplotě 37 °C. Buňky se shromáždily 24, 48 a 72 hodin po infekci (pi), centrifugovaly se, rozpustily se v 0,2 ml PBS a čtyřikrát prošly cyklem zmrazení a rozmražením. Supernatanty se titrovaly za použití buněk 293 a titr viru se vyjádřil, jako množství jednotek tvořécí plaky v jednom mililitru. Celkový obsah proteinu Ad se stanovil pomocí IDEIA™ Adenovirus kit (od firmy DAKO).

Účinnost transdukce genu.

Monovrstvy buněk 293 na destičkách obsahujících 24 prohlubní se infikovaly způsobem popsaným shora v textu rekombinantními viry v množství 10 jednotek tvořících plaky na jednu buňku. Buňky se shromáždily 24 hodin po infekci, promyly se PBS chlazeným ledem a pak došlo k fixaci pomocí 0,5 % glutaraldehydu po dobu 15 minut. Buňky se třikrát promyly v PBS a anylazovala se exprese transgenního GFP za použití emisního kanálu FL1 v cytometru FACScan (Becton-Dickinson, San Joe, CA).

Test vyskytu knoflíku vlákna ve virovém kapsídu

Přítomnost nebo absence přijatelného knoflíku ve virionech se stanovila testem ELISA. Izolované viriony se ředily v 50 mM uhličitanovém-hydrogenubl-ičitanovém pufru s hodnotou pH 9,6 až do dosažení konečné koncentrace 5xl0⁵ jednotek tvořícíh plaky

7/ na jeden mililitr. Alikvoty o objemu 100 ml se adsorbovaly na destičky vhodné pro test ELISA přes noc při teplotě 4 °C. Materiál adsorbovaný do prohlubní se fixoval 0,5 % glutaraldehydem. Prohlubně se pak promyly PBS, který obsahuje 0,1 % Tween-20 (promývací pufr) a blokoval se po dobu 2 hodin 200 ml PBS, které obsahují 1 % BSA. Prohlubně se pak třikrát promyly promývacím pufrem a inkubovaly se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti se 100 ml roztoku monoklonálních protilátek 1D6.4 určených proti knoflíku vlákna značených biotinem v koncentraci 1 mg/ml. Vázané protilátky se detekovaly za použití streptavidinu značeného HRP (DAKO) v ředění 1:2 000 po dobu jedné hodina při teplotě místnosti. Barevné vyjádření se získalo pomocí substrátu TMB (CanAg Diagnostics, Goteborg, Švédsko) a zastavilo se přidáváním 0,12 M HC1 po dobu 10 minut. Destičky . se pak hodnotily použitím odečítacího zařízení vhodného pro mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm.

Princip konstrukce rekombinantních vláken

Vlákna bez knoflíku s nevlastním trimerizačním motivem (NRP), který pochází z lidského plicního povrchově aktivního proteinu D, se zkonstruovala s různým počtem repetic střední části vlákna a z různými strukturami ligandu. Tyto tři podstatné elementy těchto konstrukcí vláken se zvažují jak z hlediska struktury, tak funkce:

(i) kostra vlákna (ii) flexibilní linker (iii) buněčné ligandy.

Kostra vlákna

Vlákna se nazývají podle počtu repetic střední části a počtu přítomných ligandů. Jako příklad se uvádí R7-EGF obsahující konec vlákna?, N-terminálních 7 repetic střední oblasti, motiv NRP a C-terminální peptid EGF, který je « · · • · · »· ·· buněčným ligandem. Vlákno· Rl-RGD vykazuje pouze jednu repetici střední části (první repetice) a RGD slouží jako ligand. Ze tří možných délek střední části, krátká (1 repetice), střední (7 repetic) a dlouhá (22 repetic) se vybralo pro další konstrukce a studie s různými ligandy vlákno střední délky se sedmi repeticemi (R7). Pro účely popsané dále v textu důvody vybrání vlákna R7 jsou založeny na vysoké rozpustnosti rekombinantního proteinu, uchování většiny z biologických funkcí vlákna a na výtěžku progenů viru Ad5/FibR7. Studie zjišťující porovnatelné výhody středních oblastí vlákna různých délek se provedla s vlákny Rl-RGD, R7-RGD a R22-RGD, přičemž všechny tři konstrukce nesou stejný buněčný ligand RGD.

Linker

Za účelem hodnocení možné výhody dalšího linkeru ve střední oblasti vlákna se zkonstruovaly dvě vlákna R7-NRP-knob s dalším peptidovým linkerem začleněným mezi střední oblast a motiv NRP. Testovaly se dva linkery získané z virů Ad5 repetice 17 střední části (L17) a Ad5 repetice 22 střední části (L22). Výsledná rekombinantní vlákna se nazvala R7-L17knob a R7-L22-knob.

Buněčné ligandy

Testovalo se několik ligandů a porovnávala se jejich funkčnost. Tyto ligandy se navrhly, aby se opětně cílily vektory Ad5 na molekuly na povrchu buněk, které jsou velmi rozšířeny, jako jsou například integríny nebo molekuly HLA nebo méně rozšířené molekuly, jako jsou determinanty specifické pro buňky maligních nádorů. Tyto ligandy se liší ve velikosti a komplexnosti, co se týká struktur, jako je scTR nebo scFv, které obsahují několik polypeptidových oblastí s požadavkem správného sbalení.

·· · • ·

Exprese vláken a ligandů v savčích buňkách

Rekombinantní vlákna se nejdříve dočasně exprimují v savčích buňkách za použití buněk Cos7 transfekovaných plazmidem. Rekombinantní vlákna se exprimovala ze dvou různých vektorů, jeden se navrhl za účelem vnitrobuněčné exprese rekombinantních proteinů, druhý za účelem jejich extrabuněčného uvolnění prostřednictvím dráhy sekrece. U buněk se testovala síla exprese vlákna, umístění a funkčnost ligandů v buňce. Všechna různá testovaná vlákna vykazují zjevné vhodné vazebné schopnosti ligandů, když se získají jako vylučované proteiny. V případě vláken syntetizovaných z vnitrobuněčného expresívního vektoru se ve všech případech pozorovalo umístění v jádru, s výjimkou vlákna R7-L22-knob. To předpokládá, že průchod cytoplazmou a průchod póry jádra je stejně dostatečný pro upravená vlákna jako pro vlákno WT Ad5.

Žádný z vnějších ligandů nefúzoval s vlákny, které vykazují vazebnou aktivitu. Dokonce uvažované vnitrobuněčné exprimované vlákno R7-scTCR by se mohlo detekovat v jádru a barvilo se monoklonálními protilátkami určenými proti Va, které rozeznávají epitop nezávislý na uspořádání oblasti Va, žádné zbarvení se nedetekovalo za použití jiné monoklonální protilátky, která není závislá na prostorovém uspořádání určenou proti oblasti Vb. Za účelem testování možného nežádoucího účinku oblasti vlákna na reaktivitu vnitrobuněčných ligandů, se ligandy exprimovaly jako oddělené konstrukce z vektoru pcDNA. Dochází k nedetekovatelnému návázání nefúzovaných vnitrobuněčných ligandů na jejich specifickou monoklonální protilátku, což indikuje, že ligandy se chovají podobně ať'jsou volné nebo fúzované s vláknem.

Zjistil se rozdíl ve vazebné schopnosti mezi fúzemi vlákna a ligandu navržených za účelem vylučování a exprese v cytoplazmě. To naznačuje, že proteiny fúzí vlákno-ligand se navrhly tak, aby prošly navrženou sekreční drahou a došlo ·♦ ···· ·»4· « k jejich správnému sbalení a vyskytovaly se ve správném prostorovém uspořádání. Z toho nevyplývá, že se všechny vnitrobuněčné proteiny fúzí vlákno-ligand budou balit správně, protože se zdá, že buněčné prostředí hraje důležitou úlohu v tomto postupu. Podstatný rozdíl by se mohl detekovat mezi cytosolem buněk Cos7 a Sf9, z hlediska balícího paternu a reaktivity proteinů fúzí vlákno-ligand. To byl případ oblasti knoflíku vlákna R7-L22-knob, ligandu EGF vlákna R7-EGF a ligandu scFV vlákna R7-G250, které vykazují reaktivitu v buňkách Sf9 a nikoliv vbuňkách Cos7.

Fenotyp rekombinantních vláken exprimovaných v hmyzích buňkách Za účelem další analýzy vlastností vláken s ligandy, se různé konstrukce exprimovaly jako rekombinantní proteiny v systémech bakulovirus-hmyzí buňka a testovala se rozpustnost proteinu, trimerizace, glykosylace a tvorba pentonu v buňkách Sf9 sestavením pentonových bází.

Rozpustnost proteinu a prostorové uspořádání

Rozpustnost rekombinantních proteinů se obvykle považuje za dobrý indikátor jejich správného sbalení. Testovala se celková exprese všech rekombinantních proteinů vláken v hmyzích buňkách a stanovila se jejich část získaná v rozpustných frakcích buněčných lyzátů. Všechny rekombinanty vláken se vysoce exprimovaly v buňkách Sf9 v množství podobném k vláknu WT Ad5, ačkoliv jejich stupeň rozpustnosti podstatně kolísá. Odhadlo se, že když rozpustná frakce obsahovala více než 50 % celkového exprimovaného vlákna, vlákna měla rozpustnost podobnou vláknu WT. Vlákno se může považovat za špatně sbalené, jestliže jeho rozsputná frakce reprezentuje méně než 20 % celkově exprimovaného vlákna. Podle uvedeného kritéria se vlákna WT, R7-knob, R7-L17-knob, R7-L22-knob, RlRGD, R7-RGD a R7-RGD4C' získala hlavně v rozpustné frakci (rozpustnost je 60 až 95 %) . Naopak pouze 22 % R22-RGD a méně než 15 % vláken R7-EGF, .R7-C242 a R7-scTCR bylo rozpustných, což potvrzuje, že nesprávné sbalení je způsobeno tím, že vlákno reaguje s určitou monoklonální protilátkou. Nejméně rozpustná konstrukce vlákna byla R7-G250, která se vyskytovala jako 95 % podíl nerozpustné frakce (uvedeno na obrázku č. 5 a v tabulce č. 7 dále v textu).

7: Fenotypická charakterizace rekombinantních vláken v buňkách Sf9 infikovaných bakulovirem

Tabulka č.

trimerizace (b)
vlákno	glykosylace	NDS-PAGE	IF	sestavení (c) s penton. bází	rozpustno st (d) %
WT	+	+	+	+	60
R7-knob	+	+	+	+	72
R7-L17-knob	+	+	+	+	70
R7-L22-knob	+	+	+	+	75
Rl-RGD	-	-	+	+	89
R7-RGD	-	+		+	94
R22-RGD	-	+	l·	+	22
R7-RGD4C	+	+	+	+	78
R7-EGF	-	ND (e)	+	ND	13
R7-C242	-	ND	-	ND	11
R7-G250	-	ND	-	ND	5
R7-SCTCR	-	ND	+	ND	12

(a) Buňky Sf9 infikované bakulovirem se shromáždily 48 hodin po infekci a analyzovaly se odlišné biologické funkce, jako je rozpustnost, O-GlcNAc glykosylace, trimerizace a tvorba pentonových kapsidů rekombinantních vláken.

(b) Status trimerizace vláken se stanovil in vitro elektroforézou buněčného lyzátu buněk Sf9 na SDS-gelu aniž došlo k tepelné denaturaci (NDS-PAGE) a in šitu .19.

> · · ⁴ ·· ·· imunologickým fluorescenčním barvením fixovaných buněk za použití monoklonálních protilátek určených proti trimeru (2A6.36).

(c) Kapacita vláken sloučit se s pentonovou baží za vzniku pentonového kapsomeru se testovala způsobem společné infekce stejných buněk Sf9 dvěma různými rekombinantními bakuloviry, kdy jeden exprimuje adenovirové vlákno a druhý adenovirovou pentonovou bázi. Lyzát buněk Sf9 se analyzoval 48 hodin po společné infekci za účelem výskytu pentonu (báze a vlákno) elektroforézou přirozených proteinů na 6 % akrylamidových gelech za podmínek, které nesjou denaturační (Karayan et al. , 1994).

(d) Rozpustnost se testovala v buňkách Sf9 infikovaných jediným bakulovirem. Buňky shromážděné 48 hodin po infekci se lyžovaly izotonickým pufrem a buněčný lyzát se rozdělil do alikvotů. Jeden alikvot se centrifugoval při 10 000 x g po dobu 10 minut a supernatant se uschoval, zatímco další alikvoty se analyzovaly jako celobuněčné lyzáty. Čištěný i celobuněčné lyzáty se denaturovaly při teplotě 100 °C ve vzorkovém pufru, který obsahuje SDS, a provedla se lektroforéza na denaturačním gelu obsahujícím SDS a obsah gelu se přenesl na membránu. Bloty se nechaly reagovat s monoklonální protilátkou 4D2.5 určenou proti konci vlákna a se sekundární protilátkou značenou radioaktivně, jak je zobrazeno na obrázku č. 5. Imunobloty se kvantitativně hodnotily prohlížením autoradiogramu a výsledky dané průměrem tří stanovení se vyjádřily jako procento rozpustného versus celkový obsah vlákna. Hodnota SD tvořila 15 % hodnoty průměru.

(e) Symbol ND znamená nedetekovatelnou hodnotu.

Trimerizace

Schopnost různých “vlá'*ken tvořit trimery še stanovila elektroforeticky in vitro použitím analýzy NDS-PAGE buněčných .30, • · • · · ···· · > · · « ♦ · ·* lyzátů a imunologicky . in šitu použitím imunologického fluorescenčního barvení fixovaných buněk. Hodnocením jejich elektroforetických paternů se stanovilo, že R7-EGF, R7-C242, R7-G250 a R7-scTCR nejsou schopny tvořit homotriméry, zatímco R7-knob, R7-L17-knob, R7-L22-knob, R7-RGD, R22-RGD a R7-RGD4C se trimerizují na úroveň vlákna WT (uvedeno v tabulce č. 7) .

fluorescenční barvení buněk za použití protilátek 2A6.36 určených proti trimeru

Imunologické monoklonálních vykazují, že všechny vlákna mimo R7-C242 a R7-G250 tvoří trimery (uvedeno v tybulce č. 7) . Zjevná neshoda je dána použitou -metodou detekce nebo možností, že trimery vlákna R7EGF, R7-C242, R7-G250 a R7-scTCR nejsou stabilní in vitro. Ať už je důvod jakýkoliv, jestliže trimery vláken se v buňkách tvoří s malou účinností, imunologické fluorescenční barvení je v tomto případě více citlivé a více vhodné při detekci trimerů.

Glykosylace

Glykosylace vláken se analyzovala westernovým přenosem za použití RL2, což jsou monoklonální protilátky specifické pro zbytky peptidu spojené s O-GlcNAc. Vláknité konstrukce, které reagují s RL2, byly vedle vlákna WT, R7-L17-knob, R7-L22-knob, R7-knob a R7-RGD4C (tabulka č. 7).

Uspořádání s pentonovou bází

Když se buňky Sf9 infikovaly dvěma různými bakuloviry, přičemž jeden exprimuje adenovirové vlákno a druhý exprimuje pentonovou bází, dva proteiny jsou schopny interagovat vnitrobuněčně za vzniku pentonových kapsomerů. Když se testují uvedené vlastnosti, ukazuje se, že proteiny vláken R7-EGF, R7C242, R7-G250 a R7-scTCR ztratily svou kapacitu tvořit pentonovou bázi, zatímco dalších osm rekombinantních vláken vykazuje konzervovanou funkci prostorového upořádání (tabulka č. 7) .

« · «· ·♦··

Qi· • · • · · • ·♦ ·· ·· 9 • · • · ♦ · · • · ♦ · · ♦ · 99

Zavedení rekombinantních genů vláken do virového genomu a vitalita virů

Rekombinantní geny vláken se znovu začlenily do virového genomu, čímž nahradily gen vlákna WT. Každý rekombinantní genom viru se pak zavedl transfekcí do odpovídající buněčné linie, která exprimuje receptor vhodný pro rekombinantní vlákno. Životaschopné rekombinantní viry se určily schopností tvořit plaky. Plaky se pozorovaly v případě genomů Ad5, které nesou vlákno WT a rekombinantních vláken R7-knob, 57-L17-knob, Rl-RGD, R7-RGD a R7-RGD4C.

Obsah vlákna, infekčnost a růstová rychlost rekombinantních virů

Rekombinantní adenovirus R7-RGD nesoucí sedm repetic se vybral jako nejlěpší možnost na základě vlastností vlákna, jako je trimerizace, stabilita, uspořádání s pentonovou bází a schopnost vázat ligand. Avšak tento adenovirus, který neobsahuje vlákno, je méně účinný při sestavování a produkci viru ve srovnání s virem WT. V tomto případě charakteristiky vlákna Ad-R7-knob, které nesou oblast knoflíku, se porovnávaly s charakteristikami adenoviru WT a Ad-R7-RGD, který nenese knoflík. Nejdříve se testovala produkce vláken v buňkách 293 infikovaných s každým ze tří adenovirů v různém čase po infekci. Produkce vláknitých proteinů, které pocházejí z adenoviru R7-knob, se porovnávala s produkcí adenoviru WT, zatímco množství proteinu vlákna pocházející z adenoviru RlRGD byl podstatně nižší.

Pak se porovnával obsah vlákna v jednom virionu adenoviru R7-knob s adenovirem divokého typu. Dva různé viry vykazovaly podobné množství obsahu vlákna, když se normalizuje počet částic (PP). Zjistilo se, že u adenoviru R7-knob je obsaženo více proteinu vlákna, když se dva virové vzorky normalizovaly v počtu infekčních částic (jednotky tvořící plaky). To «« · ·· · &2· ukazuje, že adenovirus R.7-knob je méně infekční ve srovnání s adenovirem divokého typu. Tuto skutečnost potvrdilo zjištění infekčního indexu (poměr jednotek tvořících plaky ku PP), který se vypočítal z infekčního titru (exprimovaného jako počet jednotek tvořící plaky v jednom mililitru, jak se stanovilo titrací buněk 293) a z koncentrace PP (stanovené biochemickou metodou). Infekční index viru Ad-R7-knob (1:100 až 1:200) byl dvou až osmi násobně nižší než index adenoviru divokého typu (1:35 až 1:500). Infekční index AD-R7-RGD (1:200 až 1:500) se pohyboval ve stejném rozmezí jako index Ad-R7knob.

Růstová rychlost Ad-R7-knob se porovnávala s rychlotí růstu adenoviru divokého typu. Alikvoty buněčných vzorků se infikovaly se stejnou hodnotou MOI a progeny infekčního viru se stanovily testem tvorby plaků na buňkách 293. Růstová křivka v případě tří virů byla podobná, ale produkce infekčního adenoviru byla nižší ve srovnání s adenovirem divokého typu v případě Ad-R7-knob i Ad-R7-RGD. Také se testovalo pohlcení viru buňkou v případě Ad-R7-knob a odhadla se schopnost transdukce genu reportéru GFP do buněk 293, což se srovnávalo s Ad5-GFP, který nese vlákna divokého typu (AdWTFib). Zjistilo se, že transdukční kapacita PP je 6 krát nižší v případě adenoviru R7-knob ve srovnání s adenovirem AdWTFib.

Kapacita navázání receptoru rekombinantích virionů

U adenoviru Ad-FibR7-knob se testovala jeho vazebná kapacita receptoru a srovnávala se s virem WT. Zjistilo se, že viriony WT Ad5 a Ad-FibR7-knob reagují s monoklonálními protilátkami určenými proti knoflíku v testu ELISA, což naznačuje, že epitopy knoflíku jsou přijatelné pro monoklonální protilátky na pbouch typech virionů. Imunologická reaktivita knoflíku byla vyšší v případě adenoviru divokého typu ve srovnání s reaktivitou Ad-FibR7-knob. To naznačuje, že ·« «·«· • · · » * · • ···♦ .33. :

determinanty virionů vázající se na buňky jsou účinnější nebo/a vykazují vyšší afinitu v případě, že knoflík je obsažen ve vláknu s 22 repeticemi střední oblasti, jako je WT Ad5, ve srovnání s kratším vláknem se sedmi repeticemi.

Výsledky ukazují, že ligandy, které nejsou v cytosolu a v jádru správně sbaleny, vykazují prostorové uspořádání, které je vysoce závislé na tvorbě disulfidových můstků. Tak se mohou použít protilátky a jejich fragmenty, které neobsahují disulfidové můstky, zatímco si uchovávají přirozený nebo upravený, vazebný epitop.

Počet repetic ve střední části by mělo být s výhodou alespoň 7, nepříklad 6 až 12. Přítomnost knoflíku divokého typu (například jako jeden ze dvou typů proteinů vlákna, kdy druhý typ je upraven za účelem nového cílení) může být výhodná při tvorbě rekombinantních, životaschopných virionů adenoviru.

•4 ····

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1746 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA .
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Pozice: 1 ..1746
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=sekvence kódující protein vlákna adenoviru 5 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

10	20	30	40	50
atgaagcgcg	caagaccgtc	tgaagatacc	ttcaaccccg	tgtatccata
tacttcgcgc	gttctggcag	acttctatgg	aagttggggc	acataggtat
60	70	80	90	100
tgacacggaa	accggtcctc	caactgtgcc	ttttcttact	cctccctttg
actgtgcctt	tggccaggag	gttgacacgg	aaaagaatga	ggagggaaac
110	120	130	140	150
tatcccccaa	tgggtttcaa	gagagtcccc	ctggggtact	ctctttgcgc
atagggggtt	acccaaagtt	ctctcagggg	gaccccatga	gagaaacgcg
160	170	180	190	200
ctatccgaac	ctctagttac	ctccaatggc	atgcttgcgc	tcaaaatggg
gataggcttg	gagatcaatg	gaggttaccg	tacgaacgcg	agttttaccc
210	220	230	240	250
caacggcctc	tctctggacg	aggccggcaa	ccttacctcc	caaaatgtaa
gttgccggag	agagacctgc	tccggccgtt	ggaatggagg	gttttacatt
260	270	280	290	300
ccactgtgag	cccacctctc	aaaaaaacca	agtcaaacat	aaacctggaa
ggtgacactc	gggtggágag	tttttttggt	tcagtttgta	tttggacctt
310	320	330	340	350
atatctgcac	ccctcacagt	tacctcagaa	gccctaactg tggctgccgc
tatagacgtg	gggagtgtca	atggagtctt	cgggattgac accgacggcg

• ·

	• · · • · · • · · .· ·?5· • · · · ·	• · · • · ·· • · · • · · · · • · · • « · · ·	• · ··· · • · » • · · • · · • · · · • · · ·
360	370	380	390	400
cgcacctcta	atggtcgcgg	gcaacacact caccatgcaa	tcacaggccc
gcgtggagat	taccagcgcc	cgttgtgtga	gtggtacgtt	agtgtccggg
410	420	430	440	450
cgctaaccgt	gcacgactcc	aaacttagca	ttgccaccca	aggacccctc
gcgattggca	cgtgctgagg	tttgaatcgt	aacggtgggt	tcctggggag
460	470	480	490	500
acagtgtcag	aaggaaagct	agccctgcaa	acatcaggcc	ccctcaccac
tgtcacagtc	ttcctttcga	tcgggacgtt	tgtagtccgg	gggagtggtg
• 510	520	530	540	550
caccgatagc	agtaccctta	ctatcactgc	ctcaccccct	ctaactactg
gtggctatcg	tcatgggaat	gatagtgacg	gagtggggga	gattgatgac
560	570	580	590	600
ccactggtag	cttgggcatt	gacttgaaag	agcccattta	tacacaaaat
ggtgaccatc	gaacccgtaa	ctgaactttc	tcgggtaaat	atgtgtttta
610	620	630	640	650
ggaaaactag	gactaaagta	cggggctcct	ttgcatgtaa	cagacgacct
ccttttgatc	ctgatttcat	gccccgagga	aacgtacatt	gtctgctgga
660	670	680	690	700
aaacactttg	accgtagcaa	ctggtccagg	tgtgactatt	aataatactt
tttgtgaaac	tggcatcgtt	gaccaggtcc	acactgataa	ttattatgaa
710	720	730	740	750
ccttgcaaac	taaagttact	ggagccttgg	gttttgattc	acaaggcaat
ggaacgtttg	atttcaatga	cctcggaacc	caaaactaag	tgttccgtta
760	770	780	790	800
atgcaactta	atgtagcagg	aggactaagg	attgattctc	aaaacagacg
tacgttgaat	tacatcgtcc	tcctgattcc	taactaagag ttttgtctgc
810	820	830	840	850
ccttatactt	gatgttagtt	atccgtttga	tgctcaaaac	caactaaatc
ggaatatgaa	ctacaatcaa	taggcaaact acgagttttg gttgatttag

• 4

860	870	880	890	900
taagactagg	acagggccct	ctttttataa	actcagccca	caacttggat
attctgatcc	tgtcccggga	gaaaaatatt	tgagtcgggt	gttgaaccta
910	920	930	940	950
attaactaca	acaaaggcct	ttacttgttt	acagcttcaa	acaattccaa
taattgatgt	tgtttccgga	aatgaacaaa	tgtcgaagtt	tgttaaggtt
960	970	980	990	1000
aaagcttgag	gttaacctaa	gcactgccaa	ggggttgatg	tttgacgcta
tttcgaactc	caattggatt	cgtgacggtt	ccccaactac	aaactgcgat
1010	1020	1030	1040	1050
cagccatagc	cattaatgca	ggagatgggc	ttgaatttgg	ttcacctaat
gtcggtatcg	gtaattacgt	cctctacccg	aacttaaacc	aagtggatta
1060	1070	1080	1090	1100
gcaccaaaca	caaatcccct	caaaacaaaa	attggccatg	gcctagaatt
cgtggtttgt	gtttagggga	gttttgtttt	taaccggtac	cggatcttaa
1110	1120	1130	1140	1150
tgattcaaac	aaggctatgg	ttcctaaact	aggaactggc	cttagttttg
actaagtttg	ttccgatacc	aaggatttga	tccttgaccg	gaatcaaaac
1160	1170	1180	1190	1200
acagcacagg	tgccattaca	gtaggaaaca	aaaataatga	taagctaact
tgtcgtgtcc	acggtaatgt	catcctttgt	ttttattact	attcgattga
1210	1220	1230	1240	1250
ttgtggacca	caccagctcc	atctcctaac	tgtagactaa	atgcagagaa
aacacctggt	gtggtcgagg	tagaggattg	acatctgatt	tacgtctctt
1260	1270	1280	1290	1300
agatgctaaa	ctcactttgg tcttaacaaa	atgtggcagt	caaatacttg
tctacgattt	gagtgaaacc agaattgttt	tacaccgtca	gtttatgaac
1310	1320	1330	1340	1350
ctacagtttc	agttttggct gttaaaggca	gtttggctcc	aatatctgga

• · ·<·^7· · · · · · · • &«♦· · * · · · · · · • · · · · · · · · ···· · ·· ··· ·· ··

gatgtcaaag tcaaaaccga	caatttccgt	caaaccgagg	ttatagacct
1360	1370	1380	1390	1400
acagttcaaa	gtgctcatct	tattataaga	tttgacgaaa	atggagtgct
tgtcaagttt	cacgagtaga	ataatattct	aaactgcttt	tacctcacga
1410	1420	1430	1440	1450
actaaacaat	tccttcctgg	acccagaata	ttggaacttt	agaaatggag
tgatttgtta	aggaaggacc	tgggtcttat	aaccttgaaa	tctttacctc
1460	1470	1480	1490	1500
atcttactga	aggcacagcc	tatacaaacg	gtgttggatt	tatgcctaac
tagaatgact	tccgtgtcgg	atatgtttgc	cacaacctaa	atacggattg
' 1510	1520	1530	1540	1550
ctatcagctt	atccaaaatc	tcacggtaaa	actgccaaaa	gtaacattgt
gatagtcgaa	taggttttag	agtgccattt	tgacggtttt	cattgtaaca
1560	1570	1580	1590	1600
cagtcaagtt	tacttaaacg	gagacaaaac	taaacctgta	acactaacca
gtcagttcaa	atgaatttgc	ctctgttttg	atttggacat	tgtgattggt
1610	1620	1630	1640	1650
ttacactaaa	cggtacacag	gaaacaggag	acacaactcc	aagtgcatac
aatgtgattt	gccatgtgtc	ctttgtcctc	tgtgttgagg	ttcacgtatg
1660	1670	1680	1690	1700
tctatgtcat	tttcatggga	ctggtctggc	cacaactaca	ttaatgaaat
agatacagta	aaagtaccct	gaccagaccg	gtgttgatgt	aattacttta
1710	1720	1730	1740
atttgccaca	tcctcttaca	ctttttcata	cattgcccaa	gaataa
taaacggtgt	aggagaatgt	gaaaaagtat	gtaacgggtt	cttatt

• · (2) (Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace:

/poznámka=oblast peptidu z lidského plicního povrchově aktivního proteinu D (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

PDVASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPNG (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 353 nukleotidů
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=rekombinanntí vlákno Al (xii) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

gaattcg

atg

aag

cgc

gca

aga

ccg

tet

gaa

gat

acc

ttc

aac

ccc

gtg

tat

cca tat

gac

acg

gaa

acc

ggt

cct

cca

act

gtg

cct

ttt

ctt

act

cct

ccc

ttt gta

tcc

ccc

aat

ggg

ttt

caa

gag

agt

ccc

cct

ggg

gta

ctc

tet

ttg

cgc cta

tcc

gaa

cct

cta

gtt

acc

tcc

aat

ggc

atg

cct

gac

gta

gca

agc

tta ega

caa

cag

gta

gaa

gcc

ttg

ca‘a

ggg

cag

gta

caa

cac

tta

cag

gcg

gca ttt

agc

caa

tac

aaa

aag

gta

gag

ttg

ttt

cca

aac

gga

gcc

aag

aag

ctg aac gac gcc cag gcc ccc aag agc gac cca tcg atc taa ctc gag • · .· &3..:

(2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 183 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetě
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: -
	(B)	Pozice: 1 ..183
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=lidský epidermální růstový faktor (EGF) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

20 30 40 50 gggaattcat gaactccgac tccgaatgtc cattgtccca cgacggttac cccttaagta cttgaggctg aggcttacag gtaacagggt gctgccaatg M NSD SEC PLSH DGY>

70 80 90 100 tgtttgcacg acggtgtttg tatgtacatc gaagctttgg acaagtacgc acaaacgtgc tgccacaaac atacatgtag cttcgaaacc tgttcatgcg

CLH DGVC Μ Y I EAL DKYA>

110 120 130 140 150 ttgtaactgt gttgttggtt acatcggtga aagatgtcaa tacagagact aacattgaca caacaaccaa tgtagcca<jt ttctacagtt atgtctctga

CNC V V G YIGE RCQ YRD>

9o:·

160 170 180 tgaagtggtg ggaattgaga tgataagaat tcc acttcaccac ccttaactct actattctta agg LKWW ELR *>

(2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 39 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:	dvouřetě
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: -
	(E)	Pozice: 1 ..39

(D) Jiné informace:

/poznámka=sekvence kódující linker stafylokokvého proteinu A (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

20 30 gccaagaagc tgaacgacgc ccaggccccc aagagcgac cggttcttcg acttgctgcg ggtccggggg ttctcgctg AKK LNDA QAP K S D>

_a_SPA 48-60_a_ ze (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 513 párů baží (B) TYP: nuklepvá kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE:

• · • · · .· src:· ·· · · · (iii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: (C) Pozice :1..513 (D) Jiné informace:

/poznámka=konstrukce vlákna Al EGF (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

20 30 40 50 atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tacttcgcgc gttctggcag acttctatgg aagttggggc acataggtat

MKR ARPS EDT F N P V Y P Y>

b b konec b b >

vlákna

70 80 90 100 tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg actgtgcctt tggccaggag gttgacacgg aaaagaatga ggagggaaac

DTE TGP PTVP FLT PPF>

_b_b_ konec b_ b__>

vlákna . 110 120 13*0 · 140 150 tatcccccaa tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc atagggggtt acccaaagtt ctctcagggg gaccccatga gagaaacgcg L ’ S L R>

a_>

V S P N GFQ ESP PGV>

b konec b >

vlákna

160 170 180 190 200 ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc atgcctgacg tagcaagctt gataggcttg gagatcaatg gaggttaccg tacggactgc atcgttcgaa

LSE P L V T SNG M>

_a_R1_a_a_>

P DVA S L>

_ plicní povrch. _>

aktivní

210 220 230 240 250 acgacaacag gtagaagcct tgcaagggca ggtacaacac ttacaggcgg tgctgttgtc catcttcgga acgttcccgt ccatgttgtg aatgtccgcc

R Q Q	V E A	L Q G Q V	Q H L	Q A>
		trim. plic. povrch.	! c	>
		aktiv, proteinu D
260	270	280	290	300

catttagcca atacaaaaag gtagagttgt ttccaaacgg agccaagaag gtaaatcggt tatgtttttc catctcaaca aaggtttgcc tcggttcttc

AFSQ YKK VEL F P N G>

__ trim. plic. povrch. _C__>

aktiv, proteinu D

A K K>

>

>Clal

I

310 320 330 | 340 350 ctgaacgacg cccaggcccc caagagcgac ccatcgatca tgaactccga gacttgctgc gggtccgggg gttctcgctg ggtagctagt acttgaggct

Μ N S D> d>

I» N D A Q A P KS D>

SPA 48-60_e_>

_v . .. ^{p s} *>

93:

360 370 380 390 400 ctccgaatgt ccattgtccc acgacggtta ctgtttgcac gacggtgttt gaggcttaca ggtaacaggg tgctgccaat gacaaacgtg ctgccacaaa

SEC PLS HDGY CLH DGV>

_ epidermální růst. faktor (urogastron), kodon_ST _>

410	420	430	440	450
gtatgtacat	cgaagctttg	gacaagtacg	cttgtaactg	tgttgttggt
catacatgta	gcttcgaaac	ctgttcatgc	gaacattgac	acaacaacca
C Μ Y I	E A L	D K Y	A C N C	V V G>
_epidermální růst. faktor (urogastron), kodon ST	>
460	470	480	490	500
tacatcggtg	aaagatgtca	atacagagac	ttgaagtggt	gggaattgag
atgtagccac	tttctacagt	tatgtctctg	aacttcacca	cccttaactc
Y I G	E R C Q	Y R D	L K W	W E L R>

I >

epidermální růst. faktor (urogastron), kodon_ST >xhol

I 510 atgactcgag ggg tactgagctc ccc

X>

_>

2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 811 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(C)	Pozice: 1 ..811
	(D)	Jiné informace:
		/poznámka-5'konstrukce vlákna A7
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

EGF ·· ···· >EcoRl

I 10 20 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca M>

>

M KRA R P _j_j_

S E konec

D T F N P V> _j_>

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga YPYD TET GPP TVPF LTP>

— konec

110 ccctttgtat gggaaacata

P F V

120 cccccaatgg gggggttacc

S P N G

130 gtttcaagag caaagttctc

F Q E konec -140 agtccccctg tcagggggac

S P P

150 gggtactctc cccatgagag

L S>

G V>

>

160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt

L A L>

L R L SEP L V T S NGM>

-k-repetice 1 ->

210 220 230 240 250 aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa tttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt „ L T S Q>

_f_>

K M G N G L S L D E A G N>

----repetice 2 ->

»· ····

260 270 . 280 290 300 aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaa ttacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt

I N>

_>

NVT T V S P PLK KTK S N>

-^f-repetice 3 - -f-^f->

310 320 330 340 350 cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtgg ggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc

L T V>

LEI SAP LTVT SEA>

e e >

'repetice

360 370 380 390 400 ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatca gacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt

L T M Q S>

-repetice 6

AAAA PLM VAG N T>

-repetice 5

410 420 430 440 450 caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg gtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc

LSI A T Q G>

-repetice

QAP LTVH DSK> _ repetice 6 _^c— _>

460 470 480 490 500 acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttac tggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg ·· « ·*

I t 9 · · .·’ Μ· ·: :

··» · ·♦ »· ·«·· • · « <

• · · <

·· ·«

L Α>

a >

G K>

repetice 7

P D V A S L> ;plicní povrch. >

aktivní

540

510

550

520 530 gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggca ctgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgt RQQV EAL QGQ VQHL Q A A>

-:-trim. plic. povrch. _^k-^> aktiv, proteinu D

560 570 580 590 600 tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagct aaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc ggttcttcga

FSQ YKKV ELF PNG>

>

_trim. plic. povrch, aktiv, proteinu D

A K K L>

m >

>Clal

610

620

630

640

650 gaacgacgcc caggccccca agagcgaccc atcgatcatg aactccgact cttgctgcgg gtccgggggt tctcgctggg tagctagtac ttgaggctga

Μ N S D>

NDA QAP K S D> SPA 48-60 m >

S I>

660 670 680 690 700 ccgaatgtcc attgtcccac gacggttact gfcttgcacga cggtgtttgt ggcttacagg taacagggtg ctgccaatga caaacgtgct gccacaaaca ·· · » · · • · ···· · »· • * • « • · • « ·· ·«·· • ·· ·· r « ♦ • · · · • « · · · • · · · · ··· ·· ··

SECP LSH DGY

G V C>

-epidermální růst. faktor (urogastron), kodon_ST

710 720 730 740 750 atgtacatcg aagctttgga caagtacgct tgtaactgtg ttgttggtta tacatgtagc ttcgaaacct gttcatgcga acattgacac aacaaccaat

Μ Y I E	A L D	K Y A C N	C V	V G Y>
_epidermální	růst. faktor	(urogastron) , kodon_	_ST	>
760	770	780	790	800

catcggtgaa agatgtcaat acagagactt gaagtggtgg gaattgagat gtagccactt tctacagtta tgtctctgaa cttcaccacc cttaactcta

IGE R C Q YRDL KWW E L R>

-epidermální růst. faktor (urogastron), kodon_ST >xhol | 810 gactcgaggg g ctgagctccc c X>

>

Informace o SEQ ID NO: 8:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 1056 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klič: -
	(C)	Pozice: 1 . .1056
	(D)	Jiné informace: /poznámka=konstrukce G250
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

20 30 40 50 gacattgtga tgacccagtc tcaaagattc atgtccacaa cagtaggaga ctgtaacact actgggtcag agtttctaag tacaggtgtt gtcatcctct

DIV MTQS QRF MST T V G D> _^c__c VK_c c >

⁶⁰ 70 30 90 100 cagggtcagc atcacctgca aggccagtca gaatgtggtt tctgctgttg gtcccagtcg tagtggacgt tccggtcagt cttacaccaa agacgacaac

RVS ITC. KASQ NVV c c VK c c

S A V>

y 9 · · · · · · · ···· 9 99 999 99 99

110 120 130 140 150 cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaactact gatttactca ggaccatagt tgtctttggt cctgttagag gatttgatga ctaaatgagt A W Y Q Q K P G Q S PKLL I Y S> _c__c VK_c_c_>

160 170 180 190 200 gcatccaatc ggtacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc cgtaggttag ccatgtgacc tcagggacta gcgaagtgtc cgtcacctag

A S N RYTG V P D RFT GS GS> _c_c VK c_c_>

210 220 230 240 250 tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tatgcagtct gaagacctgg accctgtcta aagtgagagt ggtaatcgtt atacgtcaga cttctggacc

GTD F T L T I S N MQS EDL> _c_c VK_c_c_>

260 270 280 290 300 ctgatttttt ctgtcaacaa tatagcaact atccgtggac gttcggtgga gactaaaaaa gacagttgtt atatcgttga taggcacctg caagccacct ADFF CQQ Y S N YPWT FGG> _c_c VK_c_c_ >

310 320 330 340 350 ggcaccaagc tggaaatcaa aggatctggc tctacttccg gtagcggcaa ccgtggttcg acctttagtt tcctagaccg agatgaaggc catcgccgtt

G T K L E I K>

_VK c >

GS*G STS GSGK>

linker linker «· ·

_ 360 370 380 390 400 atcctctgaa ggcaaaggta ctagagacgt gaagctcgtg gagtctgggg taggagactt ccgtttccat gatctctgca cttcgagcac ctcagacccc

DV KLV ESO _a_VH a_>

SSE GKG TR>

_linker _d_>

410 420 430 440 450 gaggcttagt gaagcttgga gggtccctga aactctcctg tgcagcctct ctccgaatca cttcgaacct cccagggact ttgagaggac acgtcggaga GGLV KLG GSL KLSC A A S> _a_a VH_a_a_>

460 470 480 490 500 ggattcactt tcagtaacta ttacatgtct tgggttcgcc agactccaga cctaagtgaa agtcattgat aatgtacaga ačccaagcgg tctgaggtct

GFT FSNY YMS WVR Q T P E> _a_a VH_a_a_>

510 520 530 540 550 gaagaggctg gagttggtcg cagccattaa tagtgatggt ggtatcacct cttctccgac ctcaaccagc gtcggtaatt atcactacca ccatagtgga

KRL ELV A A I N SDG GIT> _a_a_VH_a_a_>

560 570 580 590 600 actatctaga cactgtgaag ggccgattca ccatttcaag agacaatgcc tgatagatct gtgacacttc ccggctaagt ggtaaagttc tctgttacgg YYLD TVK GRF TISR D N A> _a_a VH_a_a_>

610 aagaacaccc ttcttgtggg

620 tgtacctgca acatggacgt

630 aatgagcagt ttactcgtca

640 ctgaagtctg gacttcagac

650 aggacacagc tcctgtgtcg • · ·

···· ·

KNT LYLQ MSS LKS E D T A> _a_a_VH_a_a__>

660 670 680 690 700 cttgttttac tgtgcaagac accgctcggg ctacttttct atggactact gaacaaaatg acacgttctg tggcgagccc gatgaaaaga tacctgatga

LFY C AR H R S G Y F S MDY> _a_a VH_a__a_>

710 720 730 740 750 ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct catgcccacc gtgcccagca ccccagttcc ttggagtcag tggcagagga gtacgggtgg cacgggtcgt WGQGTSV TVS S>

_a_VH a_a >

A>

_>

C P P C P>

-kloubový ->

spoj

760 770 780 790 800 cctgaactcc tagggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacttgagg atccccctgg cagtcagaag gagaaggggg gttttgggtt

PEL LGGP SVF LFP PKPK> _b_b CH2 b_b_>

810 820 830 840 850 ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg cctgtgggag tactagaggg cctggggact ccagtgtacg caccaccacc

DTL MIS RTPE VTC VVV> _b_b CH2 b_b_>

860 870 880 890 900 acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc tgcactcggt gcttctggga ctccagttca agttgaccat gcacctgccg D V. S H EDP.EVK F N W Y V D G>

ip2 ···» · j ♦ * · « « · · · ·· · · · • · · β • · · « » • · · · · * · · · · · · _b_b CH2 b_b_>

910 920 930 940 950 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacctccacg tattacggtt ctgtttcggc gccctcctcg tcatgttgtc

VEV HNAK TKP REE Q Y N S> _b_b CH2 b_b_>

960 970 980 990 1000 cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga gtgcatggcc caccagtcgc aggagtggca ggacgtggtc ctgaccgact

TYR VVS VLTV L H Q DWL> _b_b CH2 b_b _>

. 1010 1020 1030 1040 1050 atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca ačaaagccct cccagccccc taccgttcct catgttcacg ttccagaggt tgtttcggga gggtcggggg NGKE YKC KVS NKAL P A P> _b_b CH2 b_b_>

atcgag tagctc

I E>

	• · · ·« · * · · · · · · los·:.:..: : : • · · · · ···· · ·· ···
Informace o	SEQ ID NO: 9:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 793 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: -
	(C)	Pozice: 1 . .793
	(D)	Jiné informace:
		/poznámka=konstrukce C242
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
>Sfi	>EcoRl >Clal Λ' I I
1	10	1 1 (20 1 30 40

gcggcccagc cggccacgaa ttcatcgatg gatattgtga tgactcaggc cgccgggtcg gccggtgctt aagtagctac ctataacact actgagtccg

A Q PATN SSM>

_B_ revers. primer__>

DIV Μ T Q A> _VK PHARMACIA_>

A>

>

1Q4 • · · » ·

60	70	80	90	100
tgcaccctct	gtacctgtca	ctcctggaga	gtcagtatcc	atctcctgca
acgtgggaga	catggacagt	gaggacctct	cagtcatagg	tagaggacgt
APS	V P V	T P G E	S V S	ISO
c	i VK PHARMACIA	d >
110	120	130	140	150
ggtctagtaa	gagtctcctg	catagtaatg	gcaacactta	cttgtattgg
ccagatcatt	ctcagaggac	gtatcattac	cgttgtgaat	gaacataacc
R S S K	S L L	H S N	G N T Y	L Y W>
d VK PHARMACIA	d >
	S L L	H S N	G N T Y	L Y>
	f	: CDR1	f >
160	170	180	190	200
ttcctgcaga	ggccaggcca	gtctcctcag	ctcctgatat	atcggatgtc
aaggacgtct	ccggtccggt	cagaggagtc	gaggactata tagcctacag
F L Q	R P G Q	S P Q	L L I	Y R M S>

_d_VK PHARMACIA_d_>

R M S>

>

210 220 230 240 250 caaccttgtc tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa gttggaacag agtcctcagg gtctgtccaa gtcaccgtca cccagtcctt

NLV SGV PDRF SGS GSG> _d VK PHARMACIA_d_- >

• · · · · • · · ·

105

L V S>

e >

260 270 280 290 300 ctgctttcac actgagaatc agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt gacgaaagtg tgactcttag tcatctcacc tccgactcct acacccacaa TAFT L R I SRV EAED V G V>

d VK PHARMACIA d >

310 320 330 340 350 tattactgtc tgcaacatct agagtatccg ttcacgttcg gtcctgggac ataatgacag acgttgtaga tctcataggc aagtgcaagc caggaccctg

LQHL EYP FT>

_a_CDR3_a_>

YYC LQHL EYP FTF GPGT>

_d_VK PHARMACIA_d_>

360 370 380 390 400 caagctggag ctgaaacggc ccccggactt tgttcccccg gccgctagtt gttcgacctc'gactttgccg ggggcctgaa acaagggggc cggcgatcaa

KLE L K R>

_VK PHARMACIA_>

PPDF VPP A A S>

_1_1_825_1_>

410 420 430 440 450 tccctgatca ctcccctcgt ggccaggtcc agttggtgca gtctggacct agggactagt gaggggagca ccggtccagg tcaaccacgt cagacctgga QV QLVQ SGP>

_VH PHARMACIA [SPLIT]_>

F P D H S P R G>

825 1 >

«

460 470 480 490 500 gagctgaaga agcctggaga' gacágtcaag atctcctgca aggcttctga · · ·

10£ • · · •··· * φ ···· ctcgacttct tcggacctct ctgtcagttc tagaggacgt tccgaagact

E L K K P G E h VH PHÍ

C K A S D>

h >

510 ttataccttc aatatggaag Y T F ]	520 acatactatg tgtatgatac T Y Y íi VH PHZ	530 gaatgaactg cttacttgac G Μ N W ^RMACIA [meze	540 ggtgaagcag ccacttcgtc	550 gctccgggaa cgaggccctt A P G> i >
V :ra]	K Q t
	Y Y	G M N>
	CDR1 >
560	570	580		590	600
agggtttaaa	gtggatgggc	tggatagaca	ccaccactgg agagccaaca
tcccaaattt	cacctacccg	acctatctgt	ggtggtgacc tctcggttgt
K G L K	W M G	W I D	T T	T G	E P T>
1	i VH PHARMACIA [SPLIT]	h >
		W I D	T T	T G	E P T>
		_ CDR2 r_p7pr3l	>
610	620	630		640	650
tatgctgaag	attttaaggg	acggattgcc	ttctctttgg	agacctctgc
atacgacttc	taaaattccc	tgcctaacgg	aagagaaacc	tctggagacg
Y A E	D F K G	R I A	F £	: L	E T S A>
h VH PHARMACIA fmezeral	l·	i >
Y A E	D F K G>
CDR2 |	[mezera] i	. >
660	670	680		690	700
cagcactgcc	tatttgcaga	tcaaaaacct	caaaaatgag	gacacggcta
gtcgtgacgg	ataaacgtct	agtttttgga	gtttttactc	ctgtgccgat
STA	Y L Q	I K N L	K	N E	D ' T A>
1	1 VH PHARMACIA [mezera]	h >
710	720	730		740	750

·· ··· · ιονί.:..:

catatttctg tgcaagacgg gggccttaca actggtactt tgatgtctgg gtataaagac acgttctgcc cccggaatgt tgaccatgaa actacagacc

R GPY NWYF D V> g_CDR3_g_>

TYFC ARR GPY NWYF D V W> _h VH PHARMACIA [mezera] h_>

>Xho (-) StopXho_adapt_ [Split] ₍

I

760 770 780 | 790 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ctcgattaac tcg ccggttccct ggtgccagtg gcagaggagt gagctaattg agc

L X>

_>

GQG TTVT V S S>

_VH PHARMACIA _[mezera] _>

(2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 1411 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: -
	(C)	Pozice: 1 ..1411
	(D)	Jiné informace:
		/poznámka=konstrukce vlákna Al G250
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

• · · · ίο# *·:

>EcoRl

I

I 10 20 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

_>

M KRA RPSE D T F N P V> _^f_^f_ konec _^f->

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga YPYD TET GPP T V P F LTP>

— konec

110 120 130 140 150 ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc gggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag

L S>

_>

P F V SPNG FQE SPP GV> f f f >

- -konec - - 160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cctgacgtag aaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac ggactgcatc LRL SEP LVTS NGM>

d ____, d_>

P D V>

repetice 1 • · · ·

103 ♦ · * · 9 ¹ ·· ··

210 caagcttacg gttcgaatgc A S L R

220 acaacaggta tgttgtccat

Q Q V

230 gaagccttgc cttcggaacg

E A L trim. plic. povrch, aktiv, proteinu D

240 250 aagggcaggt acaacactta ttcccgtcca tgttgtgaat Q G Q V Q H L>

_g_>

260 caggcggcat gtccgccgta

270 ttagccaata aatcggttat

280 caaaaaggta gtttttccat

Q A A F S Q Y K K V __ trim. plic. povrch.

aktiv, proteinu D

290 300 gagttgtttc caaacggagc ctcaacaaag gtttgcctcg

A>

_>

ELF P N G>

_g_?

>Clal

310 320 330 caagaagctg aacgacgccc aggcccccaa gttcttcgac ttgctgcggg tccgggggtt KKL N D A QAPK _b_SPA 48-60_B

340 gagcgaccca ctcgctgggt S D>

_>

P

350 tcgatcgaca agctagctgt

S I>

:_>

D>

360 ttgtgatgac aacactactg I V Μ T

370 ccagtctcaa ggtcagagtt

Q S Q

380 agattcatgt tctaagtaca R F M VK * j

390 400 ccacaacagt aggagacagg ggtgttgtca tcctctgtcc S T T V G D R> _3_>

410

420

430

440

450 lid gtcagcatca cctgcaaggc cagtcagaat gtggtttctg ctgttgcctg cagtcgtagt ggacgttccg gtcagtctta caccaaagac gacaacggac

VSI TCKA SQN VVS A V A W> _3_3 VK j_j_>

460 470 480 490 500 gtatcaacag aaaccaggac aatctcctaa actactgatt tactcagcat catagttgtc tttggtcctg ttagaggatt tgatgactaa atgagtcgta

Y Q Q KPG Q S P K LLI Y S A> _3_3 VK j_3_>

510 520 530 540 550 ccaatcggta cactggagtc cctgatcgct tcacaggcag tggatctggg ggttagccat gtgacctcag ggactagcga agtgtccgtc acctagaccc SNRY T G V PDR FTGS G S G> _3_3 VK 3_j___>

560 570 580 590 600 acagatttca ctctcaccat tagcaatatg cagtctgaag acctggctga tgtctaaagt gagagtggta atcgttatac gtcagacttc tggaccgact

TDF T I> T I SNM QSE D L A D> _3_3 VK j_j_>

610 620 630 640 650 ttttttctgt caacaatata gcaactatcc gtggacgttc ggtggaggca aaaaaagaca gttgttatat cgttgatagg cacctgcaag ccacctccgt

FFC QQY SNYP WTF G G G> _3_3 VK j_3_>

660 670 680 690 700 ccaagctgga aatcaaagga tctggctcta cttccggtag cggcaaatcc ggttcgacct ttagtttcct agaccgagat gaaggccatc gccgtttagg T K L E I K>

«* _VK_j_>

G SGS TSGS GKS>

linker

4» ·· · 4 ♦ 4 • 4 4 • 444

m* *44»

710 720 730 740 750 tctgaaggca aaggtactag agacgtgaag ctcgtggagt ctgggggagg agacttccgt ttccatgatc tctgcacttc gagcacctca gaccccctcc

DVK LVE S G G G> _h VH h_>

S E G K G T R>

-linke r -k—?

760 770 780 790 800 cttagtgaag cttggagggt ccctgaaact ctcctgtgca gcctctggat gaatcacttc gaacctccca gggactttga gaggacacgt cggagaccta

LVK LGG SLKL SCA A S G>

_h_ h VH h_h_>

810 820 830 840 850 tcactttcag taactattac atgtcttggg ttcgccagac tccagagaag agtgaaagtc attgataatg tacagaaccc aagcggtctg aggtctcttc FTFS NYY MSW VRQT P Ξ K> _h_h VH h_h_>860 870 880 890 900 aggctggagt tggtcgcagc cattaatagt gatggtggta tcacctacta tccgacctca accagcgtcg gtaattatca ctaccaccat agtggatgat

RLE LVAA INS DGG I T Y Y> _h_h VH h_h_>

910 920 930 940 950 tctagacact gtgaagggcc gattcaccat ttcaagagac aatgccaaga agatctgtga cacttcccgg ctaagtggta aagttctctg ttacggttct

LDT VKG R F T I SRD N A K> _h_h VH h_h_>

960 acaccctgta ,tgtgggacat .970 cctgcaaatg ggacgtttac

980 agcagtctga tcgtcagact

990 agtctgagga tcagactcct

1000 cacagccttg gtgtcggaac ·♦ ♦ 9 ·

11/’ ···» »· ♦ ♦ » «» ♦ · » ♦· *♦·<

·· ·«

NTLY L Q M SSL KS _h h VH h

E D T A L> h_ >

1010 1020 1030 1040 1050 ttttactgtg caagacaccg ctcgggctac ttttctatgg actactgggg aaaatgacac gttctgtggc gagcccgatg aaaagatacc tgatgacccc

FYC ARHR SGY F S M D Y W G> _h_h VH h_h_>

1060 1070 1080 1090 1100 tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcatg cccaccgtgc ccagcacctg agttccttgg agtcagtggc agaggagtac gggtggcacg ggtcgtggac

QGT SVT V S S>

_ h VH_h_>

A P>

_>

C P P C P>

_1_kloubový_1_>

. spoj

1110 1120 1130 1140 1150 aactcctagg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac ttgaggatcc ccctggcagt cagaaggaga aggggggttt tgggttcctg ELLG GPS VEL FPPK PKD> _i_i_CH2_i_i_>

1160 1170 1180 1190 1200 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt tgggagtact agagggcctg gggactccag tgtacgcacc accacctgca

TLM ISRT PEV TCV V V D V> _i _i_CH2_i_i_>

1210 1220 1230 1240 1250 gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg ctcggtgctt ctgggactcc agttcaagtt gaccatgcac ctgccgcacc

SHE DPE VKFN W Y V DGV>

• · · « · lis* ·*:* ·: :

··»· » ..

i CH2 i i • ·· *

1260 1270 1280 1290 1300 aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcat gttgtcgtgc EVHN AKT KPR EEQY NST>

'_i_i_CH2_i_i_>

; 1310 1320 1330 1340 1350 taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg atggcccacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttacc

YRV VSVL TVL H Q D W L N G> _i_i_CH2_i_i_>

1360 1370 1380 1390 1400 caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg gttcctcatg ttcacgttcc agaggttgtt tčgggagggt cgggggtagc

KEY KCK VSNK ALP API> _i_i CH2_i_i_>

>Xhol

I

11410 agtaactcga g tcattgagct c * L E>

a>

E>

_>

2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1702 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(C) Pozice: 1 ..1702

Ht.

• φ φ » φ φ φ φ * φφφφ φ φ · · φ φ * φ · » φ φ φ φ φ • φ φ φ φ φ « · (D) Jiné informace: /poznámka=konstrukce A7 G250/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

>EcoRl

I | 10 20 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

_>

, M KRA RPSE D T F NPV>

vlákna

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga YPYD TET GPP TVPF LTP>

m ir m m >

konec

110 120 130 140 150 ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc gggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag

L S>

_>

P F V SPNG FQE SPP GV>

IR_konec _IR IR_>

160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt

L A L>

LRL SEP L V T S NGM> _ k _ k >

repetice 1 - --—

210 220

230 240 250 aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa tttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt

11*3, • · * · • * * · · ·····« 9 · · • · ·«

L T S Q>

i >

K M G N GLS LDE A G N>

repetice 2

260 270 280 290 300 aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaa ttacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt

I N>

_>

NVT TVSP PLK KTK SN>

_1_repetice 3 _1_1_>

310 320 330 340 350 cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtgg ggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc

L T V>

LEI

SAP

L T V T S E A>

_h_repetice 4 _h_>

360 370 380 390 400 ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatca gacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt L T M Q S>

-repetice 6 AAAA PLM VAG NT>

_O_repetice 5 _3_>

410 420 430 440 450 caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg gtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc

LSI A T Q G>

« >

--repetice 7 ~

L T V H

D S K>

repetice 6 ·* «

Itfi.

• · <·♦· ·

460 470 480 490 500 acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttac tggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg

L A>

d >

PLT V S E G K>

_ repetice 7 _^e_>

P D V A S L>

_plicni povrch. _>

aktivní

510 520 530 540 550 gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggca ctgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgt

RQQV EAL QGQ VQHL Q A A>

_trim. plic. povrch. _n_>

aktiv, proteinu D

560 570 580 ’ 590 600 tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagct aaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc ggttcttcga

A K K L> _b_>

F S ’Q YKKV ELF P N G>

-trim. plic. povrch, aktiv, proteinu D >Clal

610 620 630 | 640 650 gaacgacgcc caggccccca agagcgaccc atcgatcgac attgtgatga cttgctgcgg gtccgggggt tctcgctggg tagctagctg taacactact

NDA QAP KSD>

_SPA 48-60_b_>

P S I> c_>

D I V M>

q >

·· · • » »

660 670 680 690 700 cccagtctca aagattcatg tccacaacag taggagacag ggtcagcatc gggtcagagt ttctaagtac aggtgttgtc atcctctgtc ccagtcgtag TQSQRFM STT VGDR V S I> _q_q VK_q_q_>

710 720 730 740 750 acctgcaagg ccagtcagaa tgtggtttct gctgttgcct ggtatcaaca

I tggacgttcc ggtcagtctt acaccaaaga cgacaacgga ccatagttgt TCK A S Q N VVS A V A W Y Q Q>

_q_q VK_q_q _>

760 770 780 790 800 gaaaccagga caatctccta aactactgat ttactcagca tccaatcggt ctttggtcct gttagaggat ttgatgacta aatgagtcgt aggttagcca

KPG QSP KLLI YSA SNR> _q_q vk q_q_>

810 · 820 830 840 850 acactggagt ccctgatcgc ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc tgtgacctca gggactagcg aagtgtccgt cacctagacc ctgtctaaag

YTGV PDR FTG SGSG T D F>

_q_q VK_q_q_____>

860 870 880 890 900 actctcacca ttagcaatat gcagtctgaa gacctggctg attttttctg tgagagtggt aatcgttata cgtcagactt ctggaccgac taaaaaagac

TLT I S N M QSE D L A DFFC> _q_q VK_q_ q _>

910 920 930 940 950 tcaacaatat agcaactatc cgtggacgtt cggtggaggc accaagctgg y agttgttata tcgttgatag gcacctgcaa gccacctccg tggttcgacc QQY SNY PWTF GGG T K L>

__q__q VK_q__q__ >

113* ·♦ * •: . · · * • · · * *·*··« _t * * * ·· ►··· ·· * ♦ · * · » * · · , • * ♦ I ·· ··

960 970 · 980 990 1000 aaatcaaagg atctggctct acttccggta gcggcaaatc ctctgaaggc tttagtttcc tagaccgaga tgaaggccat cgccgtttag gagacttccg E I K>

_>

G SGS TSG SGKS SEG>

.linker

1010 1020 1030 1040 1050 aaaggtacta gagacgtgaa gctcgtggag tctgggggag gcttagtgaa tttccatgat ctctgcactt cgagcacctc agaccccctc cgaatcactt

DVK LVE SGG G L V K> _o_VH_o_>

K G T R> _r >

1060	1070	1080	1090	1100
gcttggaggg	tccctgaaac tctcctgtgc	agcctctgga	ttcactttca
cgaacctccc	agggactttg	agaggacacg tcggagacct	aagtgaaagt
L G G	S L K	L S C A	A S G	F T F>
c	> o VH o o >
1110	1120	1130	1140	1150
gtaactatta	catgtcttgg	gttcgccaga	ctccagagaa	gaggctggag
cattgataat	gtacagaacc	caagcggtct	gaggtctctt ctccgacctc
S N Y Y	M S W	V R Q	T P E K	R L E>
c	) o VH o o >
1160	1170	1180	1190	1200
ttggtcgcag	ccattaatag	tgatggtggt	atcacctact	atctagacac
aaccagcgtc	ggtaattatc	actaccacca	tagtggatga	tagatctgtg
LVA	A I N S	D G G	I T Y	Y L D T>

_o_o VH o_o_>

1210 1220 1230 1240 1250 tgtgaagggc cgattcacca tttcaagaga caatgccaag aacaccctgt

V, ·* ♦·· ·

11.3 • · · ·· ··

acacttcccg gctaagtggt aaagttctct gttacggttc ttgtgggaca V K G RFT ISRD N A K N T L>

__o__o_VH_o_o_>

1260 1270 1280 1290 1300 acctgcaaat gagcagtctg aagtctgagg acacagcctt gttttactgt tggacgttta ctcgtcagac ttcagactcc tgtgtcggaa caaaatgaca

Y L Q M SSL KSE DTAL FY C>

I

_._o_o_VH_o_o_>

1310 1320 1330 1340 1350 gcaagacacc gctcgggcta cttttctatg gactactggg gtcaaggaac cgttctgtgg cgagcccgat gaaaagatac ctgatgaccc cagttccttg

ARH RSGY FSM DYW G Q G T> _ o_o VH_O_o_>

1360 1370 1380 1390 1400 ctcagtcacc gtctcctcat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctag gagtcagtgg cagaggagta cgggtggcac gggtcgtgga cttgaggatc

S V T V S S>

_VH_>

A P EL L> _CH2_>

C P P C P>

—^S-kloubní spoj’->

1410 1420 1430 1440 1450 ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg cccctggcag tcagaaggag aaggggggtt ttgggttcct gtgggagtac GGPS VFL FPP KPKD TLM> _ p_P CH2_p__p__>

1460 1470 1480 1490 1500 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga tagagggcct ggggactcca gtgtacgcac caccacctgc actcggtgct

120’ ·♦ · • 9 • ♦ ♦ 9 9

I» ···· « · · ·* ··«( ·*·· «

I S R TPEV TCV VVD V S H E>

CH2

1510 1520 1530 1540 1550 agaccctgag gtcaágttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata tctgggactc cagttcaagt tgaccatgca cctgccgcac ctccacgtat

DPE VKF NWYV DGV EVH> _p_p_CH2_p_p_>

1560 1570 1580 1590 1600 atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgggtg tacggttctg tttcggcgcc ctcctcgtca tgttgtcgtg catggcccac NAKT KPR EEQ YNST YRV> _p__p CH2_p_p_>

1610 1620 1630 1640 1650 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta cagtcgcagg agtggcagga cgtggtcctg accgacttac cgttcctcat

V S V LTVL HQD W L N G K E Y> _p_p CH2 p_p_>

>Xhol

I

1660 1670 1680 1690 1700 caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagtaactcg gttcacgttc cagaggttgt ttcgggaggg tcgggggtag ctcattgagc

K C K V S N K A L P API E> _p_CH2 p_p >

ag tc

E>

121.

·· « «· • · w · • « · · · • ···· · « · • · · »«·« « «· ·· ···· • · I ·· ·· (2) Informace o SEQ ID NO: 12 (i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1111 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(C)	Pozice: 1 ..1111
	(D)	Jiné informace:
		/poznámka=konstrukce vlákna
(Xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

>EcoRl i 10 20 30 40 50

I gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

M KRA RPSE DTF NPV>

O O konec O

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga YPYD TET GPP TVPF LTP>

110 ccctttgtat gggaaacata

P F V

120 cccccaatgg gggggttacc

S P N G — konec 130 gtttcaagag caaagttctc

F Q E konec 140 agtccccctg tcagggggac s p p

150 gggtactctc cccatgagag

L S>

G V>

)_>

160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cctgacgtag a· aaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac ggactgcatc L. R. L s E P L V T S N G M>

m repetice 1 m >

·· · • · · « • · · ···· · ·

12?

···· ·· · ·· ···· • « • * · · · • · · · · · • · · · · · ·» ··· ·· ··

D V>

210 220 230 240 250 caagcttacg acaacaggta gaagccttgc aagggcaggt acaacactta gttcgaatgc tgttgtccat cttcggaacg ttcccgtcca tgttgtgaat

ASLR Q Q V EAL QGQV QHL>

_trim. plic. povrch. p_>

aktiv, proteinu D ~

260 270 280 290 300 caggcggcat ttagccaata caaaaaggta gagttgtttc caaacggagc gtccgccgta aatcggttat gtttttccat ctcaacaaag gtttgcctcg

A>

_>

Q A A FSQY KKV ELF PNG>

.trim. plic. povrch, aktiv, proteinu D >Clal

350

340

310 320 330 caagaagctg aacgacgccc aggcccccaa gagcgaccca tcgatcgata gttcttcgac ttgctgcggg tccgggggtt ctcgctgggt agctagctat KKL NDA QAPK SD>

_b SPA 48-60_b_>

P S I>

_c_>

D>

360 370 380 390 400 ttgtgatgac tcaggctgca ccctctgtac ctgtcactcc tggagagtca aacactactg agtccgacgt gggagacatg gacagtgagg acctctcagt I V Μ T Q A A P S V P V T P G E S>

e VK PHARMACIA _>

123

410 420 430 440 450 gtatccatct cctgcaggtc tagtaagagt ctcctgcata gtaatggcaa cataggtaga ggacgtccag atcattctca gaggacgtat cattaccgtt

VSI SCRS SKS L L H S N G N>

_e_VK PHARMACIA_e_>

S LLH S N G N>

_g_CDR1_>

' 460 470 480 490 500 cacttacttg tattggttcc tgcagaggcc aggccagtct cctcagctcc gtgaatgaac ataaccaagg acgtctccgg tccggtcaga ggagtcgagg

TYL YWF L QRP GQS PQL> _e_VK PHARMACIA_e_>

TYL Y>

_g >

510	520	530	540	550
tgatatatcg gatgtccaac	cttgtctcag	gagtcccaga	caggttcagt
actatatagc ctacaggttg	gaacagagtc	ctcagggtct	gtccaagtca
L I Y R	MSN	L V S	G V P D	R F S>
e	VK PHARMACIA	e	i >
R	MSN	L V S>
f	CDR2	>
560	570	580	590	600
ggcagtgggt	caggaactgc	tttcacactg	agaatcagta	gagtggaggc
ccgtcaccca gtccttgacg	aaagtgtgac	tcttagtcat	ctcacctccg
G S G	S G T A	F T L	R I S	R V E A>
e	VK PHARMACIA	e >
610	620	630	640	650
tgaggatgtg ggtgtttatt actgtctgca acatctagag	tatccgttca
actcctacac	ccacaaataa	tgacagacgt	tgtagatctc	ataggcaagt
		L Q	HLE	Y P F>

d CDR3 d___>

124 • ·· ·

EDV GVY YCLQHLE Y P F> _e_VK PHARMACIA_e_>

660 670 680 690 700 cgttcggtcc tgggaccaag ctggagctga aacggccccc ggactttgtt gcaagccagg accctggttc gacctcgact ttgccggggg cctgaaacaa

T>

_>

TFGP GTK LEL KR>

_e_VK PHARMACIA_e_>

P P D F V>

_8 2 5_>

710 720 730 740 750 cccccggccg ctagtttccc tgatcactcc cctcgtggcc aggtccagtt gggggccggc gatcaaaggg actagtgagg ggagcaccgg tccaggtcaa

Q V Q L> _i_>

PPA ASFPDHS PRG>

_1_8 2 5_1_>

760 770 780 790 800 ggtgcagtct ggacctgagc tgaagaagcc tggagagaca gtcaagatct ccacgtcaga cctggactcg acttcttcgg acctctctgt cagttctaga

VQS GPE.LKKP GET V K I> _i_VH PHARMACIA [mezera] _i__>

810 820 830 840 850 cctgcaaggc ttctgattat accttcacat actatggaat gaactgggtg ggacgttccg aagactaata tggaagtgta tgatacctta cttgacccac SCKA SDY TFT YYGM NWV> _i_VH PHARMACIA [SPLIT]_i___>

YYGM M>

' _CDR1 k >

860 870 880 890 900 • · · 4 • · · · · · • · · · ·

125.· ··:· ·: :

··· · · ·? · aagcaggctc cgggaaaggg tttaaagtgg atgggctgga tagacaccac ttcgtccgag gccctttccc aaatttcacc tacccgacct atctgtggtg

KQA PGKG LKW MGW I D T T>

_i_VH PHARMACIA [mezera] i_>

W I D T T>

_CDR2 [SP_>

910 920 930 940 950 cactg'gagag ccaacatatg ctgaagattt taagggacgg attgccttct gtgacctctc ggttgtatac gacttctaaa attccctgcc taacggaaga

TGE PTY AEDF KGR IAF> __i_VH PHARMACIA [mezera] i_>

TGE PTY AEDF KG>

_j ' CDR2 [mezera] _j_>

960 970 980 990 1000 ctttggagac ctctgccagc actgcctatt tgcagatcaa aaacctcaaa gaaacctctg gagacggtcg tgacggataa acgtctagtt tttggagttt SLET SAS TAY L Q I K NLK> _i_VH PHARMACIA [mezera] _i_>

1010	1020	1030	1040	1050
aatgaggaca cggctacata	tttctgtgca agacgggggc cttacaactg
ttactcctgt	gccgatgtat	aaagacacgt tctgcccccg gaatgttgac
			R G P Y	N w:
			CDR3
N E D	TÁTY	F C A R	R G P Y	N w:
i VH PHARMACIA rmP7Pral	i
1060	1070	1080	1090	1100
gtactttgat	gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcactcg
catgaaacta	cagaccccgg	ttccctggtg ccagtggcag aggagtgagc
		4		L>
Y F D	V>

h >

126 »· · · · • · · · · * ♦ · · · • ······ · > · · · ···· · ·· ·

YFD V W G Q G T T V T V S S> -i-VH PHARMACIA _[mezera] __i_ >

>Xhol i

11110 attaactcga g taattgagct c D * L E> _a_>

127 (2:

• · · · · • · · · · • · · · « • ······ a • · * « ·♦·· · 99

Informace o SEQ ID NO: 13:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1402 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: -
	(C)	Pozice: 1 . .1402
	(D)	Jiné informace:

(Xi) /poznámka=konstrukce vlákna A7 C242/ Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

>EcoRl | 10 20 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

_>

M KRA RPSE DTF NPV>

V_V_ konec _V___>

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga

YPYD TET GPP TVPF LTP>

_v_konec _^v_^V--^>

110 120 130 140 150 ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc

128 • ·

gggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag L S>

_>

P F V SPNG F Q E SPP GV> _V_' konec V_V_>

160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaacgtggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt

L A L>

LRL SEP L V T S N G M>

-*--repetice 1 - 210 220 230 240 250 aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa tttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt

L T S Q>

_r_>

KMGN GLS LDE A G N>

_S_repetice 2 _S_>

260 aatgtaacca ttacattggt

NVT

270 ctgtgagccc gacactcggg

T V S P

280 acctctcaaa tggagagttt

PLK ce 3 _

290 aaaaccaagt ttttggttca

KTK

300 caaacataaa gtttgtattt

I N>

_>

S N>

>

310 cctggaaata ggacctttat

320 tctgcacccc agacgtgggg

330 tcacagttac agtgtcaatg

340 ctcagaagcc gagtcttcgg

350 ctaactgtgg gattgacacc L T V>

• · • · · ·

129

400

LEI SAP LTVT SEA>

_repetice 4

360

370

380

390 ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatca gacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt

L T M Q S>

_repetice 6_>

AAAA PLM VAG N T>

_P_repetice 5 -,-P_

410 420 430 440 450 caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg gtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc

LSI A T Q G>

_repetice -7 _ >

QAP L Τ V H DSK>

-repetice 6 —

460 470 480 490 500 acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttac tggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg

L A>

_m_>

G K>

_n_>

P D V A S L>

_plicni povrch. _>

aktivní

510 520 530 540 · 550 gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggca ctgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgt

RQQV EAL QGQ*' VQHL Q A A>

M__W_>

580 590

PLT repetice trim. plic. povrch, -aktiv, proteinu D

570

560

600 • · · ·

130 ’ .: :

* · 9 9

9999 9 99 tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagct aaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc ggttcttcga

A K K L> _b_>

FSQ YKKV ELF P N G>

trim. plic. povrch. >

aktiv, proteinu D >Clal i

610 gaacgacgcc cttgctgcgg

N D A

620 caggccccca gtccgggggt

Q A P PA 48-60 ]

630 agagcgaccc tctcgctggg K S D>

I >

| 640 atcgatcgat tagctagcta

650 attgtgatga taacactact

P S I>

_c_>

D I V M> _e__>

660 670 680 690 700 ctcaggctgc accctctgta cctgtcactc ctggagagtc agtatccatc gagtccgacg tgggagacat ggacagtgag gacctctcag tcataggtag

T Q A A PSV PVT PGES VSI>

_e_VK PHARMACIA_e_>

710 720 730 740 750 tcctgcaggt ctagtaagag tctcctgcat agtaatggca acacttactt aggacgtcca gatcattctc agaggacgta tcattacčgt tgtgaatgaa

SCR SSKS LLH SNG N T Y L>

_e_VK PHARMACIA_e__>

S LL H SNG N T Y L>

_g._ g_CDRl g__>

Λ

760 770 ' 780 790 800 gtattggttc ctgcagaggc caggccagtc tcctcagctc ctgatatatc'

131 • · • · · > ···· ·«· · · • · * ·· · · · · • · · · · · « • · » · « · « • · · · · · · 99 99 9 99 9 9 cataaccaag gacgtctccg gtccggtcag aggagtcgag gactatatag YWF LQR PGQS P Q L L I Y>

_e_VK PHARMACIA_e_>

_>

Y>

>

810 820 830 840 850 ggatgtccaa ccttgtctca ggagtcccag acaggttcag tggcagtggg cctacaggtt ggaacagagt cctcagggtc tgtccaagtc accgtcaccc

RMSN LVS GVP DRFS GSG>

_e_VK PHARMACIA_e_>

RMSN L V S>

_CDR2_>

860 870 880 · 890 900 tcaggaactg ctttcacact gagaatcagt agagtggagg ctgaggatgt agtccttgac gaaagtgtga ctcttagtca tctcacctcc gactcctaca

SGT AFTL RIS RVE A E D V> _e_VK PHARMACIA_e_>

910 920 930 940 950 gggtgtttat tactgtctgc aacatctaga gtatccgttc acgttcggtc cccacaaata atgacagacg ttgtagatct cataggcaag tgcaagccag

L QHLE YPF T> d_CDR3_d >

GVY YCL QHLE YPF T F G> _e_VK PHARMACIA_e_>

960 970 980 990 1000 ctgggaccaa gctggagctg aaacggcccc cggactttgt tcccccggcc gaccctggtt cgacctcgac tttgccgggg gcctgaaaca agggggccgg PGTK LEL K R>

_ VK PHARMACIA_e_>

..... . p,....p_; D F V P P A>

4 4 4

		4 4 4 4 4 • ♦ 4 4 4 • 4 4 4 4 1 OO · ····«· 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 44	4 44 4444 4 4 4 4 4 • 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 44 4 44 44
		1	825 1	>
1010	1020	1030	1040	1050

gctagtttcc ctgatcactc ccctcgtggc caggtccagt tggtgcagtc cgatcaaagg gactagtgag gggagcaccg gtccaggtca accacgtcag

S F P 1	D H S 825 1	Q V Q L· V _VH PHARMACIA PRO >	Q S> [ >
1060	1070	1080	1090	1100

tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg acctggactc gacttcttcg gacctctctg tcagttctag aggacgttcc

GPE LKK PGET V K I SCK>

_i_VH PHARMACIA [mezera] _i_>

1110	1120	1130	1140	1150
cttctgatta	taccttcaca	tactatggaa	tgaactgggt	gaagcaggct
gaagactaat	atggaagtgt	atgatacctt	acttgaccca	cttcgtccga
A S D Y	TFT	Y Y G	Μ N W V	K Q A>

_i_VH PHARMACIA [mezera] _i_>

Y Y G M N>

_CDRl_k_>

1160 1170 1180 1190 1200 ccgggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg atagacacca ccactggaga ggccctttcc caaatttcac ctacccgacc tatctgtggt ggtgacctct

P G K GLKW MGW I _i_VH PHARMACIA [_mezera]

D T T T G E>

i >

E>

j CDR2 [mezera]

1210 gccaacatat cggttgtata

1220 gctgaagatt cgacttctaa

1230 ttaagggacg aattccctgc

1240 gattgccttc ctaacggaag

1250 tctttggaga agaaacctct

133 •« ·· ♦ <

·· ···· • · ·

PTY AED FKGR I A F SLE>

_i_VH PHARMACIA [mezera] _i_>

PTY AED FKG>

_CDR2 [mezera] j_>

1260 1270 1280 1290 1300 cctctgccag cactgcctat ttgcagatca aaaacctcaa aaatgaggac ggagacggtc gtgacggata aacgtctagt ttttggagtt tttactcctg

TSAS TAY LQI KNLK NED>

_i_VH PHARMACIA _[mezera] _i_>

1310 1320 1330 1340 1350 acggctacat atttctgtgc aagacggggg ccttacaact ggtactttga tgccgatgta taaagacacg ttctgccccc ggaatgttga ccatgaaact

RG PYN WYFD>

_h CDR3 h_>

TAT YFCA RRG PY N WYFD>

i_VH PHARMACIA [mezera] _i_>

>Xhol

I

1360 1370 1380 1390 1400 tgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcactc gattaactcg acagaccccg gttccctggt gccagtggca gaggagtgag ctaattgagc

L D * L> _a_ >

V>

_>

VWG Q G T TVTV SS>

_VH PHARMACIA _[mezera] _i_>

ag tc

E>

134 ·· ··· · • · • · • ♦ (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 174 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(C)	Pozice: 1 ..174
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=afilátka ZlgG/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

20 30 40 50 gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt catctgttgt ttaagttgtt tcttgttgtt ttgcgcaaga tactctagaa VDN K F N K EQQ NAF Y E I L> _ a_a_ z-doména a_a_>

70 80 90 100 acatttacct aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt tgtaaatgga ttgaatttgc ttcttgttgc tttgcggaag taggtttcaa

HLP NLN EEQR'NAF I QS> _^a_,^a_ Z-doména _^a_^a_>

110 120 130 140 150 taaaagatga cccaagccaa agcgctaact tgctagcaga agctaaaaag attttctact gggttcggtt tcgcgattga acgatcgtct tcgatttttc LKDD„PSQ SAN LLAE A K K> _a._a_ z-doména _a_a_>

160 170 ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaa gatttactac gagtccgcgg cttt

L N D A Q A P - K>.

- —-- Z-doména ——^a->

135 φ φ φ φ φ > φφφφ (2) Informace ο SEQ ID ΝΟ: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 174 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(C)	Pozice: 1 ..174
	(D)	Jiné informace:
		/poznámka=afilátka ZlgA
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

20 30 40 50 gtagacaaca aattcaacaa agaaacaata caagcgagtc aagagatcag catctgttgt ttaagttgtt tctttgttat gttcgctcag ttctctagtc

V D N KFNK E T I QAS Q E I R> _a_AFFI IGA _a_a_>

70 80 90 100 actattacct aacttaaacg gtagacaaaa gcttgccttc atccacagtt tgataatgga ttgaatttgc catctgtttt cgaacggaag taggtgtcaa

LLP NLN GRQK LAF I H S> _a_AFFI IGA _a_a_>

110 120 130 140 150 tacttgatga cccaagccaa agcgctaact tgctagcaga agctaaaaag atgaactact gggttcggtt tcgcgattga acgatcgtct tcgatttttc LLDD PSQ S A N LLAE A K K>

__a_AFFI IGA _a_a_>

160 170 ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaa gatttactac gagtccgcgg cttt

LND AQAP K> AFFI IGA a >

136 »··· * · (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 820 párů baží

	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: -
	(C)	Pozice: 1 ..820
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=rekombinantní vlákno A7 ZlgG/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

>EcoRl

I | 10 20 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

_>

M KRA RPSE DTF NPV>

_j_3_ konec _3 >

• ·· ·

137

9999 9 9

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga Y PY D TET GPP TVPF LTP>

-J-----7_ konec -3-3_110 ccctttgtat gggaaacata

P F V

120 cccccaatgg gggggttacc

S P N G

130 gtttcaagag caaagttctc

F Q E

140 agtccccctg tcagggggac

S P P .

150 gggtactctc cccatgagag

L S>

_>

G V>

>

160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaacgcggat aggcttggág atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt

L A L>

L R L SEP LVTS NGM>

_^h_ repetice i _^h_^>

210 220 230 240 250 aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa tttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt

L T S Q>

£ >

K M G N G L S L D E A G N>

-- repetice 2 -— --Q--• « · · „ _ _ *·· «· · *· ·

138 · ···· ··· ···· · '•s 9 · · · · « « · » ···· · ·· *·· ·· ··

260 270 280 290 300 aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaa ttacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt

I N>

_>

NVT TVSP PLK KTK SN> _f_; repetice 3 _f_f_>

310 320 330 340 350 cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtgg ggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc

L T V>

_>

LEI SAP L T V T SEA>

β β >

-- repetice 4 -360 370 380 390 400 ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatca gacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt

L T M Q S> r s — repetice AAAA PLM VAG N T>

_d repetice 5 _d_>

410 420 430 440 450 caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg gtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc

L S I A T Q G>

_ repetice 7 _>

QAP LTVH DSK>

_ repetice 6 _C_>

*'

460 470 480 490 500 acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttac tggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg ·· · Μ • · · · · · • · · · * 139 * ···· « · ·

-¹- -⁷ · · · 9 »··* β ·» » ·· ····

L Α>

_a_>

PLT VSE G Κ>

_ repetice 7 _b_>

Ρ D V A S L>

plicni povrch. . >

aktivní

510	520	530	540 550
gacaacaggt	agaagccttg	caagggcagg	tacaacactt acaggcggca
ctgttgtcca	tcttcggaac	gttcccgtcc	atgttgtgaa tgtccgccgt
R Q Q V	E A L	Q G Q	V Q H L Q A A>
	trim. plic. povrch, aktiv, proteinu D	k >
560	570	580	590 600
tttagccaat	acaaaaaggt	agagttgttt	ccaaacggag ccaagaagct
aaatcggtta	tgtttttcca	tctcaacaaa	ggtttgcctc ggttcttcga
F S Q	Y K K V	ELF	P N G>
trim. aktiv.	plic. povrch, proteinu D		> A K K L> 1 >

>Clal

610	620	630	| 640	650
gaacgacgcc	caggccccca	agagcgaccc	atcgatcgta	gacaacaaat
cttgctgcgg	gtccgggggt	tctcgctggg	tagctagcat	ctgttgttta
N D A	Q A P	K S D>
SPA 48-60 .	1 >
		P	S I>

m_>

	4	V D N K>
o	>
660	670	680	690	700

tcaacaaaga acaacaaaac gcgttctatg agatcttaca tttacctaac ♦ ♦ * ·· ♦ · · ···· · · · • · · · · « < a φ

140 .♦ ··:· ·· »·· · agttgtttct tgttgttttg cgcaagatac tctagaatgt aaatggattg FNKE QQN A F Y E I L H L P N> _O_O_ 2-doména __O____'

710	720	730	740	750
ttaaacgaag	aacaacgaaa	cgccttcatc	caaagtttaa	aagatgaccc
aatttgcttc	ttgttgcttt	gcggaagtag	gtttcaaatt	ttctactggg
LNE	E Q R N	A F I	Q S L	K D D P>
O O 7,-rloména °	o	>
760	770	780	790	800
aagccaaagc	gctaacttgc tagcagaagc taaaaagcta	aatgatgctc
ttcggtttcg	cgattgaacg	atcgtcttcg atttttcgat	ttactacgag
S Q S	A N L	L A E A	K K L	N D A>

_Q _2 - doména O_O__ >Xhol

I

810 | 820 aggcgccgaa ataactcgag tccgcggctt tattgagctc *>

_>

Q A P K>

_o_>

2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 820 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ÍX)	ZNAKY:
	(C)	Pozice: 1 ..820
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=rekombinantní vlákno A7 ZlgA/ (xi) Popis sekvence: ‘SEQ ID NO: 17:

** ··v ·

141 >EcoRl

I '

I 10 ^: 20 ’ 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

_>

M KRA RPSE DTF NPV> _j_3_

J.

konec

70 80 90 100 atccg/tatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga YPYD TET GPP TVPF LTP> -——.3-3- konec —3—,-3->

110 120 130 140 150 ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc gggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag

L S>

PFV SPNG FQE SPP G V>

i i i >

-^J-konec -^JJ160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt

L A L>

LRL SEP L V T S N G M>

-k- repetice 1 -k->

210 220 230 240 250 aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa tttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt L T S Q>

f >

K M G N G L S L D E A G N> U

9« ····

142 ···· · _ g_Repetice 2 _9_>

260 270 280 290 300 aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaa ttacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt

I N>

N V T TVSP P LK KTK SN> _X-repetice 3 -f-^>

310 320 330 340 350 cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtgg ggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc

L T V>

LEI SAPLTVT SEA>

_^e-repetice 4 -®->

360 370 380 390 400 ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatca gacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt L T M Q S>

>

— repetice o AAAA PLM VAG NT>

_A_ _repetice 5 _d_>

410 420 430 440 450 caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg gtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc

LSI A T Q G>

_repetice 7 _>

QAP LTVH DSK>

_ repetice 6 C_>

460

470

480

490

500 *· ···· ·♦ « • · 4

143 .·’ ···· · *·*· 4 ·· • · • · t · • · *· ·· · 4 • 4 · • · · ♦ • · · *·· 4« ·· acccctcaca gtgtcagaag gáaagctagc ccctgacgta gcaagcttac tggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg

L A>

_a_>

PLT VSE GK> _ repetice 7_b_>

			P D V	A S L>
/			_plicní povrch. _> aktivní
510	520	530	540	550
gacaacaggt	agaagccttg	caagggcagg	tacaacactt	acaggcggca
ctgttgtcca	tcttcggaac	gttcccgtcc	atgttgtgaa	tgtccgccgt
R Q Q V	EAL	Q G Q	V Q H L	Q A A>
	trim. plic.	povrch.	]	< >

aktiv, proteinu D

560 570' 580 590 600 tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagct aaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc ggttcttcga

F S Q	Y K K V	E
;trim.	plic. povrch.
aktiv,	. proteinu D

L F P N G>

_>

A K K L> _1__>

>Clal

610 gaacgacgcc cttgctgcgg

NDA

620 caggccccca gtccgggggt

Q A P IPA 48-60 .

630 agagcgaccc tctcgctggg

K S D>

>

640 atcgatcgta tagctagcat

650 gacaacaaat ctgttgttta

P S I>

m_>

D N - K>

·· ··· ·· · • · ·

144 .**···*· *·«· « • · · • · · • · « · • · · · ·· ··

660 670 680

690 700 tcaacaaaga aacaatacaa gcgagtcaag agatcagact attacctaac agttgtttct ttgttatgtt cgctcagttc tctagtctga taatggattg F N K E T I Q ASQ EIRL L P N> _o_AFFI IGA _o_o_>

710 720 730 740 750 ttaaacggta gacaaaagct tgccttcatc cacagtttac ttgatgaccc aatttgccat ctgttttcga acggaagtag gtgtcaaatg aactactggg

LNG P. Q K L A F I H S L LDDP> _o_AFFI IGA _o_o_ >

760 770 780 790 800 aagccaaagc gctaacttgc tagcagaagc taaaaagcta aatgatgctc ttcggtttcg cgattgaacg atcgtcttcg atttttcgat ttactacgag

SQS ANL L A E A KKL NDA> _o_AFFI IGA _o_'_o__>

>Xhol

I

810 I 820 aggcgccgaa ataactcgag tccgcggctt tattgagctc *>

_>

Q A P K>

_o_>

2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1003 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(C)	Pozice: 1 ..1003
	(D)	Jiné informace: /poznámka=rekombinantní

vlákno A7 ZlgG/ZIgA/ • 9

14V ··;· ·: :

• · · 9 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

>EcoRl

I 10 20 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

_>

M KRA RPSE DTF N P V> _Í_Ó_konec ' _Ó-^:

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga YPYD TET GPP TVPF LTP> _Ϊ_3_konec __j_j___·

110 ccctttgtat gggaaacata

P F V

120 cccccaatgg gggggttacc

S P N G

130 gtttcaagag caaagttctc

F Q E konec 140 agtccccctg tcagggggac

S P P

150 gggtactctc cccatgagag

L S>

_>

G V>

>

160 170 180 190 200 tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt

L A L>

__>

LRLSEPLVTSNGM>

-k-repetice 1 ->

*

210 220 230 240 250 aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa tttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt ··· · · · · ·· · • · · · · · · · · ······· · · ·· · ·

L T S Q> _f_>

D E A G N>

_g_>

280 290 300

KMGN GLS L _9_repetice 2

260 270 aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaa ttacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt I N>

_>

NVT TVSP PLK KTK SN> _f_repetice 3 _f_f_>

310 320 330 340 350 cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtgg ggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc

L T V>

_>

LEI SAP LTVT SEA>

_®_repetice 4 _θ_

360	r 370	380	390	400
ctgccgccgc	acctctaatg	gtcgcgggca	acacactcac	catgcaatca
gacggcggcg tggagattac	cagcgcccgt	tgtgtgagtg	gtacgttagt'
			L T	M Q S>
			_repetice 6 >
A A A A	P L M	V A G	N T>
	5 · d >
410	420	430	440	450
caggccccgc	taaccgtgca	cgactccaaa	cttagcattg	ccacccaagg
gtccggggcg	attggcacgt	gctgaggttt	gaatcgtaac	ggtgggttcc
			LSI	A T Q G> >
Q A P	L T V H	D S K>

• ·

142..

-reetice 6

460 470 480 490 500 acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttac tggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg

L A>

_a_>

PLT VSE GK>

f _'_repetice 7 b_>

P D V A S L>

_plicni povrch. ' _>

aktivní

540

550

510 520 530 gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggca ctgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgt

RQQV EAL QGQ VQHL Q A A>

_ trim. plic. povrch. _k_>

aktiv, proteinu D

560 570 580 590 600 tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagct aaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc .ggttcttcga

FSQ YKKV ELF P N G>

_>

A K K L>

>

trim. plic· povrch, aktiv, proteinu D >Clal

610

620

630

640

650 gaacgacgcc caggccccca agagcgaccc atcgatcgta gacaacaaat cttgctgcgg gtccgggggt tctcgctggg tagctagcat ctgttgttta

NDA QAP KS D>* _SPA 48-60_1_>

P S I>

nt >

148*

V D N K> _o_ >

660 670 680 690 700 tcaacaaaga acaacaaaac gcgttctatg agatcttaca tttacctaac agttgtttct tgttgttttg cgcaagatac tctagaatgt aaatggattg FNKE Q Q N A F Y EILH L P N> _O_O_ z-doména o_o_>

710 720 730 740 750 ttaaacgaag aacaacgaaa cgccttcatc caaagtttaa aagatgaccc aatttgcttc ttgttgcttt gcggaagtag gtttcaaatt ttctactggg

LNE EQRN AFI QSL K D D P> -°-Z-doména _°_°-^>

760 770 780 790 800 aagccaaagc gctaacttgc tagcagaagc taaaaagcta aatgatgctc ttcggtttcg cgattgaacg atcgtcttcg atttttcgat ttactacgag

SQS ANL LAEA KKL NDA>

_°_Z-doména_°_°->

i

810 820 830 840 850 aggcgccgaa aagctcgacc gtagacaaca aattcaacaa agaaacaata tccgcggctt ttcgagctgg catctgttgt ttaagttgtt tctttgttat

Q A P K>

_o_>

S S T>

_>

VDN K F N K .E T I> _AFFI IGA _q_>

860 870 890 890 900 caagcgagtc aagagatcag actattacct aacttaaacg gtagacaaaa gttcgctcag ttctctagtc tgataatgga ttgaatttgc catctgtttt

QAS QEIR LLP NLN G R Q K>

·· 4 ·· 9 ·· ···· • · · · · ·· · · · • · · ♦·· · · · ······· · · · · · · _ , > ♦ ·· · ···· ................

_q_AFFI IGA _q_ q_>

910 920 930 940 950 gcttgccttc atccacagtt tacttgatga cccaagccaa agcgctaact cgaacggaag taggtgtcaa atgaactact gggttcggtt tcgcgattga

L A F IHS LLDD PSQ SAN> _q_AFFI IGA _q_q_>

/ ' >Xhol

I

960 970 980 990 1000 tgctagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaataactc acgatcgtct tcgatttttc gatttactac gagtccgcgg ctttattgag *>

_>

L L A E AKKLND A Q A P K> _q_AFFI IGA _q_q_>

gag ctc ·· « • * · ΐ5α·*⁵·:· · ···* · ·· ···

(2) Informace ο SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	CA)	DÉLKA: 1003 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetě
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: -
	(D)	Pozice: 1 ..1003
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=rekombinantní vlákno

ZlgG/ZIgG/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

A7 >EcoRl

I | 10 20 30 40 50 gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctefa agataccttc aaccccgtgt cttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcaca

M>

>

M KRA RPSE _j_j_konec

D T F N P V>

„_3_>

70 80 90 100 atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct taggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgagga

YPYD TET GPP TVPF LTP>

. 3 konec _3__3._ ·· « ·· · 0 9· · · ·· • · · · 9 9 • ···· ♦ · · ·

15J5.. : ·..· ·« ····

A · · • · · • · » • · · · ·· a¹»

110 ccctttgtat gggaaacata

P F V

120

130

140

150 cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagag

L S>

_>

SPNG FQE SPP G V>

I_. konec _j_j_>

160 tttgcgccta aaacgcggat

L R L

210 aaatgggcaa tttacccgtt

K M G N

260

170 180 190 200 tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagt

L Ά L>

SEP LVTS NGM>

^L_repetice 1 _>

220 230 240 250 cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt L T S Q>

_f_>

GLS LDE A G N>

’ repetice 2 «' $->

270 280 290 300 aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaa

152 ttacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtattt I N>

_>

NVT TVSP PLK KTK SN> f , f f >

-—— -repetice 3 - - 310 320 330 340 350 cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtgg ggactítttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacacc

L T V>

LEI SAP LTVT SEA>

.repetice 4

360

370

380

390

400 ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatca gacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagt

L T M Q S>

-repetice 6

AAAA PLM VAG NT>

— repetice 5

410 420 430 440 450 caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg gtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttcc

LSI A T Q G>

_repetice 7 >

Q A P LTVH DSK>

c >

-repetice 6 — 460 470 480 490 500 acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttac tggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg

L A>

a >

153 .· ····

P L T VSE G K>

__repetice 7

P D V A S L>

_plicní povrch'. _>

aktivní

510 520 530

540 550 gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggca ctgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgt

RQQ.V EAL QGQ V Q H L Q A A>

] trim. plic. povrch. _R >

aktiv, proteinu D

560	570	580	590	600
tttagccaat	acaaaaaggt	agagttgttt	ccaaacggag	ccaagaagct
aaatcggtta	tgtttttcca	tctcaacaaa	ggtttgcctc	ggttcttcga
F S Q	Y K K V	ELF	P N G>
; trim.	plic. povrch.		>

aktiv, proteinu D

A K K L> _1_ >

>Clal

610	620	630	| 640	650
gaacgacgcc	caggccccca	agagcgaccc	atcgatcgta	gacaacaaat
cttgctgcgg	gtccgggggt	tctcgctggg	tagctagcat	ctgttgttta
N D A	Q A P	K S D>

_SPA 48-60_1_>

P S I> m_>

V D N K> _o__>

660 670 680 690 700 «' tcaacaaaga acaacaaaac gcgttctatg agatcttaca tttacctaac agttgtttct tgttgttttg cgcaagatac tctagaatgt aaatggattg F N K E Q Q NAFY EILH LPN>

• · • · ·

154’

710 ttaaacgaag aatttgcttc LNE c	720 aacaacgaaa ttgttgcttt E Q R N ) o
/ 7 60	770
aagccaaagc	gctaacttgc
ttcggtttcg	cgattgaacg
S Q S	A N L
c	> c
810 .	820
aggcgccgaa	aagctcgacc
tccgcggctt	ttcgagctgg
Q A P K>
c	> >
	S S T>
	>
860	870
aacgcgttct	atgagatctt
ttgcgcaaga	tactctagaa
N A F	Y E I L
E	> F
910	920
aaacgccttc	atccaaagtt
tttgcggaag	taggtttcaa
N A F	I Q S
_E	’ P

z-doména O.

880 acatttacct tgtaaatgga H L P.

Z-doména J

930 taaaagatga attttctact

I» K D D

Z-doména

730

A F I

780

L A E A

830

V D N

i 740 : caaagtttaa r gtttcaaatt Q S L 0 o	750 aagatgaccc ttctactggg K D D P> >
790	800
; taaaaagcta	aatgatgctc
atttttcgat	ttactacgag
K K L	N D A>
O o	>
840	850
aattcaacaa	agaacaacaa
ťtaagttgtt	tcttgttgtt
K F N K	E Q Q>
F Z-doména .P.	>
890	900
aacttaaacg	aagaacaacg
ttgaatttgc	ttcttgttgc
N L N	E E Q R>
P P	>
940	950
. cccaagccaa	agcgctaact
: gggttcggtt	tcgcgattga
l P S Q	S A N>
? P	>

• · • · · ·

155.· • · · I >Xhol

I

960 970 980 990 1000 tgctagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaataactc acgatcgtct tcgatttttc gatttactac gagtccgcgg ctttattgag *>

_>

LLAE AKKLND AQAP K> -P--Z-doména -P-P->

gag ctc • · (2)

Informace o SEQ ID NO: 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 822 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: (C) Pozice: 1 ..822 (D) Jiné informace:

/poznámka=jednořetězcový fragment Fv anti beta-galaktosidázy (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 47:

ATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAAGCCTGGTCAAGCCTGGGGGG

TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATAGCATGAAC

TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCTCATCCATTAGTGGTAG

TAGTAGATACATATACTACGCAGACTTCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC

AACGCCACGAACTCACTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTG

TTTATTACTGTGTGAGATCCAGTATTACGATTTTTGGTGGCGGTATGGACGTCTGG

GGCAGAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGG

CAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGT

CTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCGCTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGT

TATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGAT

TTATGAGGACAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGT

CTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGAT

TATTACTGCAGCTCATATACAACCAGGAGCACTCGAGTTTTCGGCGGAGGGACCAA

GCTGGCCGTCCTAGGTGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGA

ATGGGGCCGCACATCACCATCATCACCAT

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Upravený virus zahrnující jeden nebo více nepřirozených polypeptidů, které obsahují jednu nebo více částí kostry vykazující sbalenou tříprostorovou strukturu a jednu nebo více vazebných částí, přičemž polypeptid je schopný se exprimovat v cytoplazmě a v jádru savčí hostitelské buňky v uspořádání, které se udržuje v nepřítomnosti ligandu vhodného pro uvedené vazebné části a umožňuje uvedeným vazebným částem se následně vázat na uvedený ligand, a uvedený polypeptid je schopný procházet jadernou membránou, dále uvedený upravený virus vykazuje změněný tropizmus propůjčený uvedenými vazebnými částmi.

   Upravený virus vybraného ze lentiviry, Picornaviridae, Caliciviridae.

   podle nároku 1, skupiny zahrnující adeno-asociované

   Parvoviridae, který se získal z viru adenoviry, retroviry, viry, Reoviridae, •Papovaviridae a
2. 3. Upravený lidského virus podle adenovirů.

   nároku nebo 2, který se získal z
3. 4. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 3, který se získal z lidského adenovirů serotypu 5.
4. 5. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 4, kde uvedený nepřirozený polypeptid nahrazuje protein virového části nebo se do něj začleňuje nebo s ním tvoří fúzní protein.
5. 6. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 5, kde uvedený nepřirozený polypeptid a/nebo protein virové části obsahující nepřirozený polypeptid je rozpustný v buněčném prostředí.
6. 7. Upravený virus podle nároku 6, kde více než 30 % nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující nepřirozený polypeptid je přítomen v rozpustné frakci buněčného lyzátu buněk, které exprimují nepřirozený polypeptid nebo protein virové části obsahující nepřirozený polypeptid.
7. 8. Upravený virus podle libovolného z nároků 5 až 7, kde uvedený protein virové části je protein vlákna adenovirů.
8. 9. Upravený virus podle nároku 8, kde uvedený nepřirozený polypeptid se začlenil do proteinu vlákna adenovirů tak, že knoflík vlákna divokého typu nebo jeho část vázající se na buňky je odstraněna.
9. 10. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 9, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje jeden nebo více dalších elementů, které napodobují přirozenou strukturu nebo funkci proteinu virové části, do kterého se uvedený nepřirozený polypeptid začleňuje nebo který uvedený nepřirozený polypeptid nahrazuje.
10. 11. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 10, kde uvedený nepřirozený polypeptid neobsahuje žádné disulfidové vazby.
11. 12. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 11, kde nepřirozený polypeptid obsahuje jednu nebo více alfahelikálních struktur.

    • · · • · 4 • · · « · · 9 9 159:.. : • · · • · · · • · · 9 · · · « • · * ·· ··· • · · · · · • · · • · · • · · • · · · • · · « 13. Upravený virus podle' libovolného z nároků 1 až 12, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje část kostry získanou z protilátky, která je schopna umožnit sbalení

    v cytoplazmě a následný transport do jádra buňky.
12. 14. Upravený virus podle nároku 13, kde uvedená část kostry obsahuje jednu nebo více vazebných částí získaných z CDR nebo další protilátky.
13. 15. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 12, kde uvedený nepřirozený polypeptid je kombinačním proteinem nebo afilátkou nebo je obsahuje.
14. 16. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 15, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje jednu nebo více částí kostry získanou z bakteriálního receptorů.
15. 17. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 12 nebo 16, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje jednu nebo více vazebných částí, které jsou přítomny v jedné nebo více smyček helikálního svazku a/nebo v jedné nebo více smyček obsahující tyto svazky.
16. 18. Upravený virus podle nároku 16, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje jednu nebo více částí kostry získaných z oblasti Z vázající imunoglobulin, která pochází ze stafylokokového proteinu A, nebo z oblasti vázající imunoglobulin, která pochází ze streptokokového proteinu G.
17. 19. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 18, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje jednu nebo více částí kostry, jenž obsahují nepřirozený trimerizační motiv.

    ·· · » ·

    160* ·· ··
18. 20. Upravený virus podle’ nároku 19, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje jednu nebo více částí kostry, které obsahují oblast krčku peptidu pocházejícího z lidského plicního povrchově aktivního proteinu D.
19. 21. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 20, který obsahuje dva nebo více různých nepřirozených polypeptidů.
20. 22. Upravený virus podle nároku 21, který obsahuje první nepřirozený polypeptid, jenž se váže na cílovou buňku, a druhý nepřirozený polypeptid, jenž se váže na produkční nebo permisivní buňku.
21. 23. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 22, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje místo štěpení umístěné v poloze, která umožňuje odštěpení vazebné části nepřirozeného polypeptidů z upraveného viru.
22. 24. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 23, který obsahuje upravenou virovou část obsahující uvedený nepřirozený polypeptid a odpovídající neupravenou virovou část, jako je například vlákno divokého typu a upravené vlákno.
23. 25. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 24, kde uvedený nepřirozený polypeptid obsahuje vazebnou část schopnou vázat se na ligand specifický pro buňku, kterým může být membránový antigen specifický pro předstojnou žlázu, receptor EGF, Her-2/Neu, receptor VEGF, CD22, gpl20, komplexy MHC/peptid nebo membránové struktury nebo povrchové molekuly exprimované nebo přítomné na proliferačních buňkách, nádorových buňkách nebo buňkách infikovaných virem.

    • · • » · ·

    161··
24. 26. Upravený virus podle 'libovolného z nároků 1 až 25, který dále obsahuje místo vhodné pro začlenění jednoho nebo více požadovaných terapeutických genů nebo molekul nukleové kyseliny.
25. 27. Upravený virus podle nároku 26, který obsahuje transgeny kódující cytosinovou deaminázu a/nebo uráčil fosforibosylovou transferázu buď jako jednotlivé geny nebo společně jako bifunkční fúzní gen.
26. 28. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 27, který dále obsahuje virovou část, jenž je nahrazena ekvivalentní částí z odlišného serotypu nebo je upravena tak, že se redukuje navázání uvedeného viru na předem vytvořené protilátky proti části divokého typu.
27. 29. Upravený virus podle nároku 28, kde uvedená virová část je hexonový protein.
28. 30. Upravený virový protein obsahující nepřirozený polypeptid podle libovolného z nároků 1 až 25.
29. 31. Buňka obsahující upravený virus nebo virový protein podle libovolného z nároků 1 až 30.
30. 32. Permisivní buňka vhodná pro upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 29, která je schopna být kultivována pro účely propagace uvedeného upraveného viru.
31. 33. Způsob produkce upraveného viru podle libovolného z nároků

    1 až 29 se tím, genetickou obsahující v buněčné kultuře, ž e zahrnuje kroky:

    manipulací jeden nebo vyznačuj viru vzniká upravený virus více nepřirozených polypeptidů,

    i) • · · · * • · · · * • ·♦···· «

    162.:.. :

    které obsahují jednu nebo více částí kostry obsahující jednu nebo více vazebných částí, přičemž polypeptid je schopen se exprimovat v cytoplazmě a jádru savčí hostitelské buňky v uspořádání, které se udržuje i při absenci ligandu vhodného pro uvedené vazebné části a umožňuje uvedeným vazebným částem se následně vázat na uvedený ligand, a uvedený polypeptid je schopen být transportován jadernou membránou, přičemž uvedený upravený virus má změněný tropizmus udělený uvedenými vazebnými částmi, ii) infekci permisivních buněk uvedeným upraveným virem, iii) kultivaci uvedených buněk za vzniku viru a iv) shromáždění a případně čištění produkovaného upraveného viru.
32. 34. Způsob regulující replikaci upraveného viru podle

    i) ii) libovolného se tím, z nároků 1 až ž e zahrnuje:

    29, vyznačuj i c i konstrukci upraveného viru tak, že místo štěpení je umístěno mezi vazebnou částí nutnou pro buněčnou infekci a zbytkem rekombinantní virové části, jejíž část tvoří vazebná část a uvedený rekombinantní virus přijde do kontaktu se štěpícím činidlem nebo štěpícími prostředky, což umožňuje odštěpení uvedené vazebné části od uvedené virové části a což brání, aby rekombinantní virus procházel dalšími infekčními cykly.
33. 35. Způsob, vyznačující se tím, že určuje vhodnost nepřirozeného polypeptidů pro použití při přípravě virového vektoru stanovením jeho rozpustnosti v buněčném systému.

    se tím, ·· · ·4 · « ♦ ♦ · · · · · » • · · · · · · • ·····* · · _β .

    163.:.. : ·..· .:. ·.
34. 36. Způsob podle nároku 35, vyznačuj ící ž e zahrnuje:

    i) expresi uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující uvedený nepřirozený polypeptid v permisivních buňkách, ii) buňky se podrobí lýzi za vzniku buněčného lyzátu, iii) oddělení rozpustné a nerozpustné frakce buněčného lyzátu, iv) analýzu obsahu uvedeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující uvedený nepřirozený polypeptid v rozpustné a nerozpustné frakci buněčného lyzátu a

    v) porovnání relativního obsahu uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující uvedený nepřirozený polypeptid v rozpustné nebo nerozpustné frakci.
35. 37. Způsob testování rozpustnosti nepřirozeného polypeptidu podle libovolného z nároků 1 až 25 nebo upraveného virového proteinu podle nároku 30, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:

    i) expresi uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu vírové části obsahující uvedený nepřirozený polypeptid v permisivních buňkách, ii) vystavení buněk lýzi za vzniku buněčného lyzátu, iii) oddělení rozpustné a nerozpustné frakce buněčného lyzátu, iv) analýza obsahu uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující uvedený nepřirozený polypeptid v rozpustné a nerozpustné frakci buněčného lyzátu a

    v) porovnání relativního obsahu uvedeného nepřirozeného polypeptidu nebo proteinu virové části obsahující uvedený nepřirozený polypeptid v rozpustné nebo nerozpustné frakci.

    • · ··
36. 38. Upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 29, který je vhodný pro použití při terapii.
37. 39. Použití upraveného viru podle libovolného z nároků 1 až 29 při přípravě léčebného prostředku vhodného pro léčbu nádorových nebo proliferujících buněk.
38. 40. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje upravený virus podle libovolného z nároků 1 až 29 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ekcipient.