CN1304316A - 在纤维结的hi环中含有异源肽表位的腺病毒载体 - Google Patents

在纤维结的hi环中含有异源肽表位的腺病毒载体 Download PDF

Info

Publication number
CN1304316A
CN1304316A CN99804659A CN99804659A CN1304316A CN 1304316 A CN1304316 A CN 1304316A CN 99804659 A CN99804659 A CN 99804659A CN 99804659 A CN99804659 A CN 99804659A CN 1304316 A CN1304316 A CN 1304316A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
fiber
adenovirus
gene
flag
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99804659A
Other languages
English (en)
Inventor
D·T·屈里埃尔
V·N·克拉斯尼坎
I·德米特里耶夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UAB Research Foundation
Original Assignee
UAB Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UAB Research Foundation filed Critical UAB Research Foundation
Publication of CN1304316A publication Critical patent/CN1304316A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/14011Baculoviridae
    • C12N2710/14111Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种用基因方法改变腺病毒纤维细胞-结合蛋白,来修饰重组腺病毒载体嗜性的方法。本发明产生了具有修饰的纤维基因的腺病毒,且实现了这种新的嗜性。该重组腺病毒具有HI环区域被修饰的纤维基因。

Description

在纤维结的HI环中含有异源肽表位的腺病毒载体
发明背景
与相关申请的相互参照
本申请申明,享有于1998年2月6日申请的U.S.临时申请No.60/073,947(现已放弃)的权益和于1998年9月10日的申请的临时申请No.60/099,801(现已放弃)的权益。
联邦资助说明
本发明的完成部分使用了国立卫生研究院RO1-HL50255,RO1-CA68245,RO1-CA74242,R21-CA69343,T32-CA75930和DAMD 17-94-J4398拨款下的资金。因此联邦政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及病毒和基因治疗。具体来说,本发明涉及的是以特定细胞寻靶同时伴发消去内源向性的目的,制造变形纤维与腺病毒性载体的重组体。
相关工艺的描述
许多基因治疗应用中采用了重组腺病毒性载体(21,35,38)。主要是因为用此载体能获得体内和体外高水平基因转移。重组腺病毒载体与其它得到的系统区别在于其完成原位基因递送到各种器官中分化靶细胞的独特能力(5,6,9,10,12,20,25,27,29,31)。
用重组腺病毒作基因治疗的一个缺点是,此病毒须依赖柯萨基病毒和腺病毒受体(CAR)的存在方能达到高水平的基因转移。在某些环境中,这可能导致重组病毒粒子被高CAR-表达的非把靶细胞所结合,而真正的靶细胞,如果转导差而CAR低的话,则不能结合重组病毒。为了补偿这种结合,需要显著提高所给予的载体的量,这就增加了产生直接毒性和对该载体免疫反应的危险,进一步损害了治疗的总体效果。所以,将目前一代的腺病毒性载体用于基因治疗,可以通过使病毒靶向转导特定的细胞类型,而得到显著的改进。
除了这一特性,腺病毒生物学特性妨碍了对这种载体潜能的全面认识。从这一角度来说,亲代病毒对多种组织细胞的广泛嗜性可能使基因传递无法限制于真正的靶细胞。所以,对于需要靶向的、细胞特异性基因递送的许多基因治疗应用而言,腺病毒载体的滥嗜性就成为一种混乱因素。以这种构思为基础,已发展了改变腺病毒天然嗜性的方法,使得衍生的载体能定向输送基因。
完成这目的的策略涉及到改变腺病毒感染途径的若干特定步骤。血清型2和5的腺病毒通常通过其纤维蛋白质的羧基末端球形结构域和一级受体相互作用完成初期识别和结合于靶细胞(4,17,36)。结合后,其五邻体碱性蛋白中的RGD基序与αvβ3和αvβ5细胞之间整联蛋白发生相互反应(1-3,37,39,40)。这种反应触发了细胞的内化作用,病毒粒子借此定位于核内体中。核内体的酸化引发了衣壳蛋白的构形变化,与核内体膜相互作用,使得它们形式是小泡破裂和颗粒释出。
随着核内体的裂解(endosomolysis),病毒粒子移位入核,在那里演绎着病毒生命周期的后续步骤。明白了在病毒感染途径中衣壳蛋白所起的重要作用后,提出的策略是通过对衣壳蛋白的修饰来改变这种过程。
在这点上,通过修饰编码衣壳蛋白的病毒基因来腺病毒载体基因重靶向,如果成功的话,则提供了对目前一代基因递送运载体进行显著性改进的简单方法。为了这一目的,一些实验小组报道了对腺病毒纤维蛋白该球形结结构域的基因修饰和将这种嵌合纤维掺入到病毒粒子中。例如,Stevenson等报道成功地生成了包含由Ad5纤维的尾及茎结构域和Ad3的该球形结结构域组成的Ad5纤维病毒粒子。另外,Michael等描述了将胃泌素释放肽掺入到重组Ad5纤维的羧基末端。这一发现还被Legrand等进一步扩大,他再生(rescue)了含有这种纤维的重组腺病毒载体。Wickham等描述了含有羧基-末端赖氨酸序列纤维的重组病毒的生成。这些研究确立了这种基因方法的基本可行性,但显示了许多限制因素。
所有这些对腺病毒纤维的修饰都是针对该蛋白的羧基端。另外,起初做出这些努力时尚不知道纤维球形结的三维结构(3D)。所以,采用纤维羧基末端是一种未全面加入所有相关考虑的选择。显然,对靶向目的来说,3D结构信息对在纤维结中安定异源蛋白序列关系重大。这种靶向配体的定位如果能够理想地完成,则可以达到表面呈递和对该纤维四级结构的最小干扰。
为了克服腺病毒感染受到CRA-依赖性的限制,有人提议将具有受体结合特异性的小肽基序加入到腺病毒纤维蛋白的羧基末端,从而使病毒能通过新的细胞表面受体附着和感染。Wickham等人将这一理论进一步发展,他们制备了几种含有定位于该纤维分子羧基末端靶向配体的纤维的重组腺病毒证明了此方法的可行性。
虽然在一些实验中,以载体再靶向为目的的腺病毒纤维羧基端的基因修饰证明了它的用途,但在另一些实验中失败了,提示所定位的纤维分子部位不是加入靶向蛋白分子的最佳位置。已发表的发现强烈指出,在纤维分子的羧基端加上25-30个以上异源蛋白序列的氨基酸残基时,对该纤维三聚体的稳定性有显著的消极作用并且因此与纤维的功能的不相容。另外,该纤维(球形)结的三维结构表明纤维的羧基端朝向病毒粒子而远离细胞表面,故此为靶向配体的加入提供了亚最佳环境。
以前本领域不足处在于缺乏重新靶向目的所需的将异源蛋白序列加入到腺病毒纤维结蛋白中的有效方法。本发明完成了本领域这一长期的需要和愿望。
发明概要
基因治疗应用中所采用的目前一代重组腺病毒载体可以通过设计能将基因体内递送给所被选定细胞的靶载体而得到改进。为了实现这种靶向,可以将配体加入到腺病毒纤维蛋白中,该纤维蛋白介导了腺病毒与其细胞表面受体的一级结合。根据所提出的该纤维的细胞结合域的结构,该纤维结的HI环可用作异源配体加入的部位。已采用在杆状病毒感染昆虫细胞中表达的纤维蛋白来证明FLAG八肽加入HI环中不会破坏纤维三聚体,也不干扰位于该结中的细胞-结合位点的形成。之后已产生了含有这种修饰纤维的重组腺病毒,而且这种经基因工程掺入此结中的结短肽序列与该纤维的生物学功能相容。此外,通过采用配体特异性抗体,已证明掺入到此结中的肽保留了与本文含有修饰纤维的成熟病毒粒子结合的有效性。这些发现提示异源性配体可以掺入到纤维结的HI环中,而且该(掺入)地点具有的性能与其用于腺病毒重新靶向的策略相一致。
由于腺病毒-介导的基因转移给细胞(这种细胞表达了腺病毒纤维受体CAR的临界水平)效率低使得重组腺病毒载体(Ad)的用途受到限制。为了完成在临床上有重要意义的腺病毒载体的CAR-非依赖性基因转移,本文建议通过对病毒纤维蛋白的基因改变来修饰病毒嗜性。本文显示了在纤维结结构域HI环中加入Arg-Gly-Asp(RGD)肽导致病毒在进入细胞过程中利用替代受体的能力。同样也证明了,由于其扩大的组织嗜性,这种新的载体能够有效地转导原代肿瘤细胞。该载体显示向卵巢癌细胞的基因转移增加了2-3个数量级,提示含有掺入了RGD肽的纤维的重组腺病毒可以大量用于治疗缺少一级Ad5受体的肿瘤。
本发明的一实施例中提供了一种重组腺病毒,其中该腺病毒包含在纤维结的HI环区域被修饰的纤维基因。另一实施例提供了,在需要这种治疗的生物个体杀死肿瘤细胞的方法,该方法包括如下步骤:给予该个体有效量的含有纤维结HI环区域被修饰的纤维基因的重组腺病毒;以及编码单纯性疱症病毒-胸苷激酶的基因;和用9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤治疗生物个体。
在本发明的又一实施例中,提供了基因治疗需要这种治疗的个体的方法,它包括如下步骤:给予该个体有效量的含有纤维结HI环区域被修饰的纤维基因的重组腺病毒和一种治疗基因。
本发明一实施例中,提供了一种增加腺病毒传导细胞能力的方法,它包括如下步骤:在腺病毒纤维结的HI环区域中修饰该纤维基因。
从以下为了公开目的而叙述的发明优选实施例中,显然可见本发明的其它和更多的方面,特点和优点。
附图的简要说明
为了让上面所述的本发明的特征,优点以及发明目的等更清楚,在细节上更明白和易理解,可参考附图中所描述的某些实施例对本发明的简要总结性说明。这些图是本说明书的一个组成部分。需要指出的是,附图是用来说明本发明的实施例的,不能认为是对本发明范围的限制。
图1显示了Ad5纤维结的3D模型。当从上面沿三折对称轴看时,该三聚体形成了类似螺旋浆的结构。HI环暴露在结外,连接参与形成细胞结合位点的β-链H和I。(经允需复制于参考文献47)
图2显示了纤维结HI环的修饰。用RCR-为基础的诱变去除了编码HI环高变区的一部分纤维基因。将一独特的限制性内切位点掺入到该去除部位,使得编码异源蛋白序列的DNA节断得以克隆。被去除的HI环氨基酸在纤维-FLAG蛋白中得以恢复,FLAG八肽被加入到苏氨酸-546和脯氨酸-547之间。用一实心三角表示去除点。
图3显示了用聚丙烯酰胺凝胶电泳对重组纤维蛋白的分析。用凝胶电泳分析昆虫细胞所表达的纤维蛋白,证实了它们的三聚体构形。为了将三聚物解离成单体,将其先在样品缓冲液中煮沸使其变性,然后将它们置于7.5%的聚丙烯酰胺凝胶上。用考马斯蓝染色观察条带。图3A显示了用Ni-NTA-琼脂糖凝胶柱纯化的带6-组氨酸-尾的纤维蛋白。泳道1。野生型纤维,煮沸的;泳道2,野生型纤维,没煮沸的;泳道3,纤维-FLAG,煮沸的;泳道4,纤维-FLAG,没煮沸的;泳道M,广范围蛋白标准。图3B显示了用抗-FLAGM2亲和凝胶作免测沉淀法纯化的纤维-FLAG蛋白。泳道1,没煮沸的蛋白;泳道2,煮沸的蛋白;泳道M,广范围蛋白标准。左边的数字是用千道尔顿表示的标记蛋白的分子量。
图4显示了重组纤维蛋白对腺病毒感染力的抑制。海拉细胞与野生型纤维(wt)(图4A)或纤维-FLAG(图4B)以标明浓度在室温下预温育10分钟。加入感染复数为10的AdCMVLuc,室温再培育了30分钟。吸去未结合病毒,加入完全培养液,将细胞转移到37℃。30小时后,裂解细胞,测定荧光素酶的活力。荧光素酶的活力以缺少阻断性纤维蛋白时活力的百分数给出。每个点代表一个实验四次测定的均值。
图5显示了Ad5FHIFLAG的生成。为了在纤维基因中加入独特的Swal限制性内切位点对主质粒(pTG3602)作了修饰,由此创造出的质粒pVK50适用于纤维修饰。Ad5FHHIFLAG的基因组由同源性DNA重组产生,此重组在E.coli内含有纤维-FLAG基因的DNA片断和用Swal消化线性化的质粒pVK50方向进行。为了使病毒存活,将所得的含有完整腺病毒基因组和修饰纤维基因的质粒pVK300用PacⅠ切开,用于转染293细胞。
图6描述了腺病毒结合测试。4℃用系列稀释的野生型(wt)Ad5纤维或纤维-FLAG来培养每份样品含105个细胞的A549细胞一小时。在样品中加入用125I标记的病毒Ad5CMVLacZ(图6A)和Ad5FHIFLAG(图6B),继续培养1小时。细胞用4ml含0.1%BSA的PBS洗涤,低速离心沉淀。γ-计数仪测定样品的放射性。每点代表一次实验的两次测定的均值。
图7描述了FLAG肽进入完整的Ad5FHIFLAG病毒粒子。对用CsCl梯度纯化的Ad5FHIFLAG病毒粒子作透析,用下述抗-FLAG M2-亲和凝胶作免测沉淀,用游离FLAG肽洗脱。含有未修饰纤维的重组腺病毒载体Ad5CMVLuc用作结合的阴性对照。用DNase Ⅰ处理整个纯化过程中收集的组份,以消化痕量细胞DNA,然后用SDS、EDTA处理,用蛋白酶K从病毒粒子中释放腺病毒DNA。所得的样品用0.8%的琼脂凝胶分析,用溴化乙锭着色测定DNA。泳道1-泳道3,分别为含有非结合物质的上清液中,缓冲液冲洗中,FLAG-洗脱液中的AdCMVLuc;泳道4-泳道6,分别为上清液中,缓冲洗液,FLAG-洗脱液中的AdCMVLuc。泳道M,DNA分子量标准(凝胶上可见,与3-12标记对应的条带)。图8显示了在纤维结HI环上含有靶RGD表位的基因修饰的腺病毒感染两种人卵巢细胞系(SKOV3.ipl和OV-4)和两种原代人卵巢癌细胞系的能力,以及重组纤维结蛋白的存在抑制转导的结果。每点代表一次实验四次测定的均值。误差棒表示标准偏差。
图9显示了重组纤维蛋白和αvβ3整联蛋白间相互作用的分析。将杆状病毒表达纤维蛋白吸附于ELISA平板上,与各种浓度纯化的整联蛋白αvβ3一起培育。用抗-α亚基单克隆抗体VNR139测定与纤维蛋白结合的整联蛋白。每点代表一次实验三次读数的均值。一些SDs小于符号。
图10显示了与固定的Ad5CMVluc和Ad5lucRGD病毒粒子结合的αvβ3整联蛋白的ELISA实验。将CsCl纯化的Ad5CMVluc和Ad5lucRGD病毒粒子固定在ELISA平板孔中,与亲和纯化的αvβ3整联蛋白一起培育,然后与单克隆抗体VNR139一起培育。显示的数据为一次实验一式三份实验数据的均值±SD。
图11显示用流式细胞测定分析了在293、HUVEC和RD细胞内的CAR和整联蛋白的表达。细胞与抗-CAR(RmcB),抗-αvβ3(LM609)或抗-αvβ5(P1F6)整联蛋白单克隆抗体一起培育,以SM洗涤去除未结合的单克隆体,再与第二FITS-标记的山羊抗-小鼠IgG血清培育。去除FITS-标记的抗体后,用流式细胞计数仪分析含104细胞的等份。293(11A),HUVEC(11C),和RD(11E)细胞中有CRA的表达。在293(11B),HUVEC(11D),和RD(11F)细胞中有αvβ3(细线)和αvβ5(粗线)整联蛋白的表达。双点线表示阴性对照。
图12显示了腺病毒-介导的基因转移到各种人细胞系。将293(12A),HUVEC(12B),或RD(12C)细胞在室温下与DMEM/F12或与含有重组Ad5纤维结(100μg/ml)的DMEM/F12预培育10分钟,然后在室温下与1,10或100pfu/细胞(以DMEM/F12配的)AdCMVLuc或Ad5lucRGD接触30分钟。吸去没有结合的病毒,加入完全培养基。37℃下培育30小时后,裂解细胞,用相关光度单位(RLU)测定荧光素酶的活力。对于293、HUVEC和RD细胞,在模拟感染细胞中测得的背景荧光素酶活力分别为261、223和163rlu。从相应细胞系得到的所有读数中扣除这些活力。每点代表三次测定的均值±SD。
图13显示了293、HUVEC或RD细胞与125I标记的腺病毒结合的比较。以DMEM-Ad培养基(DMEM,200mM HEPES,0.5%BSA)配的100μl等份细胞,106个细胞每份,在4℃下与50μl125I标记的腺病毒(105cpm每个样品)培育1小时。然后用4ml含0.1%BSA的PBS稀释样品,离心沉淀细胞。用γ-计数仪测定细胞沉淀的放射活性。显示为一次实验一式三份数据的均值±SD。
图14显示了对标记的AdCMVLuc和Ad5lucRGD结合到293和HUVEC细胞的抑制。293(14A)或HUVEC(14B)细胞与DMEM-Ad或与含有Ad5纤维结(100μg/ml)、Ad2五邻体碱基(100μg/ml)或它们组合物的DMEM-Ad4℃预培育1小时。然后在样品中加入50μl等份的125标记的病毒。剩下的步骤与图13中描述的一样。
图15显示了人卵巢癌细胞的流式细胞计数仪分析。如图11中描述的步骤用流式细胞计数仪分析了SKOV3.ipl或OV-4细胞中的CAR、αvβ3和αvβ5整联蛋白的表达。SKOV3.ipl中CAR的表达,图15A,OV-4细胞的,图15C。图15B和图15D分别显示了SKOV3.ipl和OV-4细胞中的αvβ3(细线)和αvβ5(粗线)整联蛋白的表达。双点线显示了阴性对照。
图16显示了AdCMVLuc和Ad5lucRGD介导的向培养的卵巢癌细胞作基因转移的效率比较。人卵巢癌细胞SKOV3.ipl(16A)和OV-4(16B)用AdCMVLuc或Ad5lucRGD转导(感染复数为1或10pfu/细胞),基本上与293、HUVEC和RD细胞所描述的相同。在用病毒感染细胞前先加入重组Ad5纤维结蛋白。每一数据为一实验三次独立测定的平均值。
图17显示了从患卵巢癌病人腹水分离的原代细胞的转导。在有或缺少阻断性Ad5纤维结蛋白时,用AdCMVLuc或Ad5lucRGD转导(感染复数为1或10)从两位卵巢癌患者腹水分离的细胞(图17A和图17B)。每一数据为三次独立测定的平均值。
图18显示了腺病毒载体-介导的基因转移到人卵巢肿瘤细胞系。在用标准培养基(灰色柱)和(阴影柱)或含有重组Ad5纤维结(黑色柱)和(双阴影柱)的培养基中预培育后,SKOv3.ipl(图18A)、CaOV-3(图18B)和UCI-101(图18C)细胞用AdCMVLuc或Ad5lucRGD感染(感染复数为1或10pfu/细胞)。37℃培养30小时后,裂解细胞,测定荧光素酶活力。对蛋白浓度的数据进行了规一化。模拟感染细胞的背景荧光素酶的活力也作了显示(空白柱)。每点为三次独立测定的均值±标准差。
图19显示了腺病毒载体-介导的基因转移到卵巢癌患者分离的人腹水细胞中。在用标准培养基(灰色柱)和(阴影柱)或含有重组Ad5纤维结(黑色柱)和(双阴影柱)的培养基中预培育后,将腹水分离所得的原代细胞用AdCMVLuc或Ad5lucRGD感染(感染复数为1或10pfu/细胞)。37℃培养30小时后,裂解细胞,测定荧光素酶活力。显示的蛋白浓度数据作了规一化。还展示了模拟感染细胞的背景荧光素酶的活力(空白柱)。每点为三次独立测定的均值±标准差。数据来自二个代表性样品(图19A)和(图19B)。
图20显示了腺病毒载体一介导的基因转移到原代外植卵巢肿瘤。从卵巢癌患者直接获得的肿瘤性移植物以3×105或3×106pfu的剂量,分别用AdCMVLuc(灰色柱)和(黑色柱)或Ad5lucRGD(阴影柱)和(双阴影柱)感染。37℃培养30小时后,裂解组织,测定荧光素酶的活力。显示的蛋白浓度为标准化的数据。还显示了模拟感染肿瘤移植物的背景荧光素酶活力(空白柱)。每点为同一患者三次移植物测定的均值±标准差。显示的数据来自三个代表性患者的数据。
图21显示了在卵巢肿瘤和腹膜间皮中基因转移水平增加的差异。间皮条带取自因良性肿瘤动手术的患者,与纤维结一起培养,以3×105或3×106pfu剂量的Ad5lucRGD感染。37℃培养30小时后,裂解组织,测定荧光素酶的活力。同时也呈现了肿瘤移植物中相似感染的结果。显示的蛋白浓度为标准化的数据。每点为同一患者三个间皮移植物测定的均值±标准差。显示了四个代表性患者的数据。
图22显示了通过荧光素酶表达复制一缺损腺病毒载体AdCMVKuc将基因转移到人细胞系。人SCCHN细胞系FaDu,SCC-4和SCC-25及宫颈癌阳性对照细胞系HeLa以每个细胞10个载体粒子的感染复数感染,48小时后测定荧光素酶基因产物。同样用重组纤维结(K)作阻断实验。结果显示为均值±SEM,也显示了每毫克总细胞蛋白的荧光素酶的相对光度单位(RLU)。
图23显示了用AdCMVLuc和Ad5lucRGD的基因转移到人SCCHN肿瘤细胞系的相对效率的比较。Ad5lucRGD在纤维HI环中含有一个RGD基序来靶向特性整联蛋白。如图22对此作了分析。以均值±SEM显示结果。
图24显示了对SCCHN细胞系AdCMVLuc和Ad5lucRGD的相对基因转移频率的分析。以250颗粒/细胞的感染复数感染靶细胞。感染48小时后,与荧光素酶mRNA的探针杂交分析了细胞的报道基因产物。
图25显示了AdCMVLuc和Ad5lucRGD对原代SCCHN肿瘤和正常颊粘膜的不同基因转移效率的分析。从患者制得新鲜组织(10-20mg)用腺病毒载体(106载体粒子/mg组织)感染。24小时后,测定细胞的荧光素酶基因产物的表达。
图26显示了全身性给予载体后各种器官中的基因表达。将在200μlhepes缓冲盐水中的109pfu的AdCMVLuc或Ad5lucRGD注射入8-10周龄的雌性C57black6小鼠的尾部侧静脉。三天后,处死小鼠获得器官,以浸在乙醇和干冰的聚丙烯试管快速冷冻。冷冻的器官(每个实验中都为完整器官)用在乙醇/干冰浴中冷却的研钵和研杵研磨成细粉。器官粉在室温下用裂解缓冲液(Promega Madison,WI)裂解20分钟。将裂解物冷冻一融化循环三次,然后在微量离心机上14,000rpm离心15分钟。上清液中荧光素酶的活力用荧光素酶试验系统试剂盒(Promega)参照产品说明书进行测定。用Berthold光度计测定相对光度单位(RLU)。用BioRad DC蛋白测定试剂盒参照产品说明书测定裂解物的蛋白含量。结果以RLU/毫克蛋白表示,每点代表一只小鼠,5只小鼠的平均值用一柱图表示。用对数转换的数据作方差分析进行统计学分析,p<0.05有意义。显示的数据为三次分开实验的代表。
图27显示了与肝脏表达相比的各种器官中的荧光素酶表达率。如图26测定各种器官中荧光素酶的表达,然后测定每个小鼠表明的器官/肝脏的表达率。数据为表达率的平均值(±SD)。
本发明的详细说明
图1显示了纤维结蛋白的3D模型图解。HI环不参与纤维结分子内的反应,这样掺入附加蛋白序列不影响纤维的三聚(化)。另外,此环主要是由亲水氨基酸残基构成的,而且暴露在纤维结外。它显示了一种高度的柔性,创造了配体掺入的最佳环境。而且不同血清型腺病毒纤维结的HI环的长度也有显著不同。这一事实提示此环原始结构的改变,如嵌入或缺失,必须与该结整个结结构域的正确折叠相容。最后,HI环不参与该结中推定的细胞结合位点的形成。
已开发一种通过操纵此结中的HI环来修饰腺病毒纤维蛋白的方法。此法可将异源氨基酸序列加入到HI环中,而不影响纤维多肽的正确折叠和它的生物功能。另外,这些结果提示纤维结HI环部位为实现以遗传性改变衣壳蛋白为基础的嗜性修饰策略提供了优点。
本发明证实可利用HI环掺入靶向配体,来修饰腺病毒的嗜性。具体说,将RGD基序肽加入到纤维结中,使得病毒可利用RGD/整联蛋白相互反应作为感染旁路,显著改善了腺病毒转导几种类型细胞的能力,而这些细胞通常是难以被Ad感染的。为了显示该修饰病毒的用途,将此病毒载体用作向原代卵巢癌细胞有效基因转移的工具。具体说,在HI环含有RGD-基序的纤维的重组腺病毒载体能够显著增加基因递送给靶细胞的能力,这种递送是通过CAR-非依赖性细胞进入机制。
本发明提供了包含一种含有纤维基因变体的修饰的腺病毒载体的组合物。
本发明涉及一种重组腺病毒,其中的腺病毒包括一种纤维结HI环区域经修饰的纤维基因。较佳的是,这种重组腺病毒可以执行CAR-非依赖性基因转移。另外,这种腺病毒可以进一步包括含对纤维结的其它修饰,从而消除腺病毒的天然嗜性。最佳的是,该修饰过的纤维结保留了其三聚(化)能力和原有的生物合成能力。例如,该纤维基因可以通过在纤维结的HI环区域引入一个配体来修饰,这种配体的代表例子是生理性配体,抗受体的抗体和细胞特异性肽。较好的配体为序列Arg-Gly-Asp(RGD),更好的为序列CDCRGDCFC。另外,编码腺病毒的腺病毒载体还可包含一种治疗基因,如单纯性疱疹病毒一胸腺嘧啶激酶的基因。
本发明还涉及一种在需要这种治疗的个体中杀死肿瘤细胞的方法,该方法包括如下步骤:给予个体有效剂量的含有在纤维结HI环区域修饰的纤维基因和单纯性疱疹病毒-胸苷激酶基因的重组腺病毒;用9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤治疗个体。较佳的是,这种给药是全身性的。
本发明还涉及一种向需要基因治疗的个体提供基因治疗的方法,该方法包括如下步骤:给予个体有效量的含有在纤维结HI环区域修饰的纤维基因和治疗基因的重组腺病毒。较佳的是,这种给药是全身性的。影响个体的典型疾病为癌、囊性纤维变性和Duchene型肌营养不良。
本发明还涉及一种增强腺病毒转导细胞能力的方法,该方法包括如下步骤:在腺病毒纤维结HI环区域修饰纤维基因。较佳的是,该纤维基因通过引入一个配基到纤维结的HI环区域进行修饰,典型的配体是生理性配体,抗受体的抗体和细胞特异性肽。较好的配基为序列Arg-Gly-Asp(RGD),更好的为序列CDCRGDCFC。一般,细胞为肿瘤细胞,可以是体内、体外和活体内的。最佳的是,编码腺病毒的腺病毒载体还包括治疗基因。
从本发明来说,采用了本领域技能中的常规分子生物学,微生物学,和DNA重组技术。这些技术可参见于文献,如,Sambrook,Fritsch &Maniatis,″Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);″DNA Cloning:APractical Approach,″卷Ⅰ和Ⅱ(D.N.Glover ed.1985);″OligonucleotideSynthesis″(M.J.Gait ed.1984);″Nucleic Acid Hybridization″[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)];″Transcription and Translation″[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)];″Animal Cell Culture″[R.I.Freshney,ed.(1986)];″Immobilized Cells And Enzymes″[IRL Press,(1986)];B.Perbal,″A Practical Guide To Molecular Cloning″(1984)。由此,解释下列术语的定义。
“DNA分子”指的是脱氧核糖核苷酸的聚合形式(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶),以其单链形式或双链螺旋形式。这一术语只指分子的一级和二级结构,不限制它的任何三级形式。所以,本术语包括特别是线型DNA分子(如,限制片断),病毒,质粒和染色体中发现的双链DNA。这里讨论的结构,按常例给出的只是DNA非转录链的5‘到3’的序列(即,具有与mRNA同源序列的链)。
“载体”指的是一种复制子,如质粒,嗜菌体或粘粒,它们可以吸附另一DNA片断,从而产生所吸附片断的复制。“复制子”是一种基因元件(如,质粒,染色体,病毒),其功能为体内DNA复制的自主单元,如能在其自身控制下复制。“复制起点”指的是参与DNA合成的DNA序列。“表达控制序列”指的是控制和调节转录和翻译另一DNA序列的DNA序列。编码序列是当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时,与转录和翻译控制序列操作性连接并在它们的控制下,然后mRNA被翻译成编码序列所编码的蛋白。
通常,含有启动子序列的表达载体是用来与宿主连接的,其中启动子序列能促进插入的DNA片断的有效转录和翻译。表达载体典型的包括复制起点,启动子,终止子,以及哪些有能力在转化细胞中提供表型选择的特殊基因。被转化的宿主可以按本领域已知的方法发酵和培养,以达到最佳细胞生长。
DNA“编码序列”是指当置于适当的调节序列控制下,能转录和翻译为体内多肽的DNA双链序列。编码序列的边界为5‘(氨基)端的起始密码子到3’(羧基)端的翻译终止子。一个编码序列可以包括,但不限制于,原核序列,真核mRNA的cDNA,真核(如,哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止子序列通常位于编码序列的3‘端。“cDNA”指的是复制-DNA或互补-DNA,它是mRNA转录物的反转录反应产物。“外显子”是转录自基因位点的被表达的序列,“内显子”指的是基因位点的非表达的序列。
转录和翻译的控制序列是DNA的调节序列,如启动子,增强子,聚腺苷酸化信号,终止子等,它们提供编码序列在宿主细胞中的表达。“顺式元件”是一种核苷酸序列,也被称为“共有序列”或“基序”,它可与那些能上调和下调特定基因位点表达的蛋白相互作用。“信号序列”也可以包括在编码序列中。这个序列编码是位于多肽N-端的一种信号肽,其与宿主细胞联系并且将该多肽引向合适的细胞内位置。已发现信号序列可与许多原核和真核生物的天然蛋白相结合。
“启动子序列”指的是一种DNA调节区域,能在细胞内结合RNA聚合酶和引发下游(3向)编码序列的转录。本发明定义,启动子序列其3’端连接转录的起始位点并向上游(5‘)方向延伸包括最小数量的引发可检测水平(高于背景)的转录所必需的碱基和元件。在启动子序列中,可找到转录起始位点和负责与RNA聚合酶结合的蛋白结合区域(共有序列)。真核的启动子经常,但并非总是,含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10和-35共有序列外,还含有SD(Shine-Dalgarno)序列。
术语“寡核苷酸”指的是一种包括两种或更多(最好在三个以上)脱氧核糖核苷酸的分子。它的确切大小由很多因素决定,取决于基本功能和该寡核苷酸的用处。本文用的“引物”指一种寡核苷酸,不论是以限制性酶消化的纯化天然寡核苷酸,还是合成产生的寡核苷酸,当其在引物延伸产物的合成条件下,如存在核苷酸和诱导剂如DNA多聚酶和适当的温度及pH时,可以作为引发合成的点,而所诱导的引物延伸产物与核苷酸链是互补的。引物可以是单链的也可以是双链的,但必须足够长使能在诱导剂存在时引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素,包括温度、引物来源和使用方法。例如,诊断应用,取决于靶序列的复杂性,寡聚核苷酸引物通常包含15-25或更多的核苷酸,虽然它也可以包含更少的核苷酸。
所选引物须与特定的靶DNA序列的不同链基本互补。这就是说,引物必须与它们各自的链充分的互补性杂交。因此,引物序列无需反映模板的确切序列。例如,一段非-互补核苷酸片断可附着于引物的5’端,而引物序列的其余部分与此链互补。另外,只要引物序列和与之杂交的系列足够互补时,非-互补碱基或更长的序列可散布在引物中,这样形成衍生产物合成的模板。
本文所用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指能在一特定核苷酸序列上或附近切割双链DNA的酶。
“DNA重组技术”指合并两个异源DNA分子的技术,通常这是体外连接不同生物体DNA的结果。DNA重组分子通常用基因工程实验生成。同义的术语包括“基因拼接”,“分子克隆”和“基因工程”。这些操作的产物是“重组体”或“重组分子”。
当这种DNA被引入到细胞内时,细胞就被外来或异源DNA“转化”或“转染”了。转化DNA可能或没有被整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如在原核生物,酵母和哺乳动物细胞中,转化DNA可能被维持在附加元件如载体或质粒上。对于真核细胞来说,稳定被转化细胞是转化的DNA已螯合到染色体中的细胞,这样通过染色体的复制将遗传给子代细胞。这种稳定性的证据是该真核细胞能够建立由含转化DNA的子代细胞群组成的细胞系和克隆。“克隆”是由一个细胞或有丝分裂前体衍生的一个细胞群体。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的一个原代细胞的克隆。一种生物,如植物或动物,用外源DNA转化后称为“转基因的”的生物。
本文用的术语“宿主”不仅包括原核生物,也包括真核生物如酵母、植物和动物细胞。重组DNA分子或基因可用于以本领域普通技术人员公知的任何一种技术来转化宿主。原核宿主可以包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)、灵杆菌(Serratia marcesens)、和枯草杆菌(Bacillussubtilis)。真核宿主包括酵母如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞和昆虫细胞,更好的则是植物细胞如拟南芥(Arabidopsisthaliana)和烟草(Tobaccum nicotiana)。
当确定长度的DNA序列中的核苷酸有至少75%(较好的是80%,最好的是90%或95%)是配对的,则这两个DNA序列是基本同源的。序列的基本同源可通过用序列数据库的标准软件或Southern杂交实验,如在为特殊系统定义的严谨条件下,进行序列比较来鉴定。明确适合的杂交条件在本领域技术人员的能力之内见如Maniatis er al.,同上;DNA Cloning,Vols.Ⅰ&Ⅱ,同上;Nucleic Acid Hybridization,同上。
DNA结构中的“异源”区域是在较大的DNA分子中天然不能与该较大DNA分子缔合的一段区域。因此,当该异源区域编码一哺乳动物基因时,该基因往往侧接了在来源生物基因组中不会侧接的哺乳动物基因组的DNA。另一例子为,该编码序列其自身在自然中是没有的(如,cDNA中的基因组编码序列包括内含子,或合成序列中包含了与自然基因不同的密码子)。等位(基因)变异或天然发生的突变并不指这里所说DNA的异源区域。
本文的“片断”指多肽,长度上通常至少10个残基,较好的是至少20个残基,最好的是至少30个残基(如50个),但必须少于全部完整的序列。片断可用本领域技术人员所知的方法制得,如用酶分解自然的或重组的蛋白,采用编码目标片断的表达载体的DNA重组技术,或通过化学合成。可用本文所述方法评价候选片断展示酶特性的能力(如,与特异性抗体结合,或展示部分酶促或催化活性)。采用本领域技术人员所公知的标准方案,纯化的片断或抗原性片断可用于从不同酶的多种功能片断生成新的调节酶,也可用于生成抗体。
按照本领域普通技术人员所公知的常规Northern杂交技术,可采用标准Nothern印迹试验来确定细胞或植物组织或其它转基因组织中或细胞中的mRNA的相对量。另外,按照本领域普通技术人员所公知的常规Southern杂交技术,可采用标准Southern印迹试验来确定转基因系统中该基因的存在和拷贝量。Northern印迹和Southern印迹都用到了杂交探针,即放射性标记的cDNA,含有全长单链的DNA或其至少20(较好的是至少30,更好的是至少50,最好的是至少100)个连续核苷酸长度的片断。DNA杂交的探针可以用按照本领域普通技术人员所公知的许多不同方法中的一种来标记。
这些研究中最常用的标记物是放射性元素、酶、暴露在紫外光下发荧光的化学剂,和其它。已知有许多的荧光剂可用于标记。它们包括,如,荧光素、罗丹明、金胺、得克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝和荧光黄。一种特殊的探测物质为山羊中制得的通过异硫氰酸盐与荧光素交联的抗-兔抗体。蛋白质可用放射性元素或酶标记。放射性标记可用目前能得到的计数方法检测。较佳同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
酶标记也同样采用,可用比色、分光光度计、荧光分光光度计、电流计或气体定量技术来测定。通过与桥连分子(如碳二亚胺、二异氰酸盐、戊二醛等)反应使酶与所选择的粒子交联。许多可用于这种方法的酶已经知道并采用了。较佳的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、葡糖氧化酶和过氧化酶及碱性磷酸酶。美国专利NO.3,654,090、3,850,752和4,016,043里还叙述了其它的标记物质和方法。
如这里所说的,自然的生物合成指修饰后纤维结保留了理想的特性(即,将修饰的纤维结掺入到病毒中,校正被修饰的纤维结和腺病毒衣壳蛋白的结构性结合,等等)。
以下的实施例为说明本发明的各种具体实施方案,对本发明没有任何形式的限制。
实施例1
细胞
从Microbix(Toronto,Ontario,Canada)购得的用Ad5 DNA转化的293人肾细胞系。由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassis,VA)得到海拉(Hela)人腺癌细胞,A549人肺癌细胞,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD)。分别由Janet Price(M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX)和Timothy J.Eberlein(Beigham andWomen’s Hospital,Boston,MA)得到人卵巢癌细胞系SKOV3.ipl和OV-4,在37℃,5%CO2下用Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)-Ham’s F12(从Mediatech Herndon,VA获得)维持,并加入10%的胎牛血清(FCS)(HycloneLaboratories,Logan,UT),100单位/ml的青霉素,100μg/ml的链霉素。原代卵巢癌细胞如下分离:在亚拉巴马大学伯明翰分校医院的妇科肿瘤学部的外科手术中收集上皮性卵巢癌的恶性腹水,并由病理学家分级。加工手术后所得物质以除去红细胞,再除去死细胞。简要地说,在小等份的原代物质中加入裂解缓冲液,室温培育2分钟后,加入完全培养基,离心,将细胞沉淀垂悬于完全培养基中,与Ficoll 400溶液(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)混合,离心后收集细胞带。为了除去死细胞,将收集的细胞垂悬于含5%FBS的培养基中、以Ficoll溶液衬垫于下方,离心后,收获活的细胞,转移到另-试管,-150℃用添加有2%二甲基亚砜(Fisher Scientific)的FBS保存。由美国典型培养物保藏中心(Manassis,VA)获的三种人头颈肿瘤细胞系和海拉细胞。研究的细胞系是FaDu(咽鳞状细胞癌)、SCC-4和SCC-25(舌鳞状细胞癌)及海拉。FaDu细胞在最低基本培养基中生长,添加有10%胎牛血清(FBS)(GibcoBRL,Grand Island,NY),0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸钠。SCC-4和SCC-25细胞在Ham’s F12/Dulbecco改进的Eagle培养基中培养,重量比(DMEM/F12)为1∶1,并含有10%FBS,2mM的谷氨酰胺和400ng/ml的氢化可的松(Sigma,St.Louis,MO)。所有细胞在37℃5%的CO2中培养。原代人SCCHN肿瘤样品从手术(The University of Alabama atBirmingham,Birmingham,AL)中获得,运到实验室接受实验。简单地说,肿瘤和正常组织被仔细的切碎,并分成大约相等的等分,称重,然后用100μlOptiMEM(GibcoBRL)覆盖。所有的实验,采用了10-20mg/组织样品。
实施例2
酶,蛋白试验和抗体
由New England Biolabs(Beverly,Mass.)或Boehringer Mannheim(Indianapolis,Ind)获得限制性内切酶,T4 DNA连接酶,T4聚核苷酸激酶和蛋白酶K。
用Bradford蛋白测定法(Bio-Rad,Hercules,Calif.)以牛丙种球蛋白为标准测定纯化蛋白的浓度。
在亚拉巴马大学伯明翰分校的杂交瘤中心研究所制得了抗-纤维的单克隆抗体4D2(19)和1D6.14(14)。从Scientific Imaging Systems(EastmanKodak,New Haven,Conn.)购得抗-FLAG单克隆抗体M2和M2亲和凝胶。由Chemicon(Chemicon,Temecula,Cal.)和Gibco-BRL(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)分别购得抗-αvβ3整联蛋白单克隆抗体LM609和抗-αvβ5整联蛋白单克隆抗体P1F6。由R.W.Finberg(Dana-Farber Cancer Institute,HarvardMedical School,Boston,Mass.)得到抗-CAR单克隆抗体RmcB。由Dr.R.L.Crowell(Hehnemann University,Philadelphia,PA)(Lee etal.,J.Virol.62:1647,1988)获得用腹水制备的小鼠抗-CAR单克隆抗体(RmcB)。由Chemicon International INC(Temecula,CA)购得抗-αVβ3mAb,LM609,抗-αVβ3复合的mAb,P1F6,抗-α2β1 mAb,BHA2.1和抗-α3β1,MAB1992。由Sigma(St.Louis,MO)购得对照小鼠IgG和抗-小鼠IgG的FITC-交联的F(ab’)2片断。
实施例3
流式细胞术和间接流式细胞荧光术
在T75瓶生长的细胞用乙二胺四乙酸(EDTA)释放,以SM缓冲液(Hepes缓冲盐水,0.1%叠氮钠,1%BSA)再悬浮(2×106细胞/ml)。4℃下,将200,000个细胞与200μl SM中的5μg/mlLM609,P1F6,RmcB或无第-mAb(阴性对照)培养2小时。然后用SM洗涤细胞,与5μg/ml的第二FITC-标记的山羊抗-小鼠IgG血清(Jackson Labs,West Grove,PA)4℃培养1小时。SM洗涤后,在UAB FACS中心研究所进行流式细胞计数分析每份样品104个细胞。
培养的细胞用PBS洗涤,用乙二胺四乙酸收获15分钟。离心洗脱下的细胞,用含1%牛血清白蛋白(BSA)和0.1%的叠氮钠的PBS垂悬,浓度为105个细胞/ml。然后将细胞在冰上与第一抗体培养1小时。接下来,洗涤细胞,与FITC-交联的抗-小鼠IgG再培养1小时。用1%BSA/PBS洗涤后,细胞进行流式细胞计数分析。
实施例4
6-组氨酸(His)-尾重组蛋白的表达和纯化重组Ad5纤维结蛋白在E.coli中表达,并在Ni-亚硝基三乙酸(NTA)-琼脂糖(Qiagen,Valencia,CA)上通过固定金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化。使人腺病毒血清型2五邻体碱基蛋白在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞中表达。借助于由P.Boulanger(Institute ofBiology,Monpellier,France)提供的重组杆状病毒AcNPV-PbWT(18)。从杆状病毒感染的细胞纯化五邻体碱基蛋白,是通过两步离子-交换层析,用DEAE-琼脂糖FF柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)然后在POROS HQ柱(PerseptiveBiosystems,MA)上纯化。在杆状病毒感染的Sf9细胞中表达的重组纤维蛋白用Ni-NTA-琼脂糖层析分离纯化。用Bradford蛋白测定法(Bio-Rad,Hercules,CA),以牛丙种球蛋白为标准测定蛋白浓度。
实施例5
ELISA
基本上如Qiagen手册上描述的那样,将6-组氨酸尾纤维固体在Ni-NTA组氨酸吸附条(HisSorb Strips)(Qiagen)上。简单的说,将200μl浓度为1μg/ml的纤维蛋白溶液加入到每条Ni-NTA组氨酸吸附条的每个孔中,室温培养1小时。培养后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)-吐温(Tween)缓冲液洗涤诸孔四次,加入200μl抗-纤维抗体(1∶2000稀释)或抗-FLAG抗体(1∶140稀释)。室温培养2小时后,再次洗涤诸孔,与1∶10,000稀释的交联与辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗-小鼠免疫球蛋白G培养45分钟。然后诸孔用PBS-Tween缓冲液洗涤四次,用2’,2’-连氮-二(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(二胺盐)显色。ABTS-HRP反应在405nm微量滴定板读数仪上读取。
用以下的方法进行固相结合试验(Sharma et al.,1997,Virology.239:150-7)。简单的说,以50mM的碳酸盐-碳酸氢盐液稀释纯化的纤维蛋白或腺病毒粒子,以pH9.6的缓冲液配成浓度为10μg蛋白/ml,取每份100μl加入到96-孔Nunc-Maxisorp ELISA平板的孔中。平板4℃培养过夜,然后在室温下用200μl的封闭缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,0.5%酪蛋白)封闭2小时。用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,150 nM NaCl)洗涤诸孔三次。纯化的整联蛋白αvβ3(Chemicon International Inc.,Temecula,CA)以结合缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,2mM CaCl2,1mM MgCl2,1mM MnCl2,0.5%酪蛋白)稀释到浓度0.04-0.5μg/ml,然后取每份100μl加入到孔中。4℃培养过夜后,用含2mM CaCl2,1mMMgCl2,1mMMnCl2的洗涤缓冲液洗涤三次。结合的整联蛋白用小鼠单克隆抗-人整联蛋白αv-亚基抗体VNR139(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)检测。VNR139抗体以结合缓冲液作1∶3000稀释,以每份100μl加入到孔中,室温继续培养1小时,然后再次洗涤诸孔。ELISA平板用VECTASTAIN试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA)参照说明显色。用加入1N的H2SO4停止颜色的发展,平板在490nm下用微量滴定板读数仪读数。
实施例6
重组质粒的构建
从得克萨斯大学西南药物中心(Dallas,Texas)R.D.Gerard得到分别表达萤火虫荧光素酶和细菌β-半乳糖苷酶(18)的E1-缺失的Ad5载体,AdCMVLuc和AdCMVLacZ。
采用PCR技术来制备编码缺失HI环的Ad5纤维结区域的基因。用到如下两对引物:
F1:(5’TAAGGATCCGGTGCCATTACAGTAGGAAACAAAAATAA 3’)(SEQ ID No.1);
R1:(5’CATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTG 3’)(SEQ IDNo.2);
F2(5’GTAACACTAACGATATCTGCATACTCTATGTCATTTTCATGG 3’)(SEQ ID No.3);和
R2:(5’CCCAAGCTTACAATTGAAAAATAAACACGTTGAAACATAAC 3’)(SEQ IC No.4)分别用来扩增与位点1159到1451和1642到1747对应的纤维基因部分。另外,第二个片断还包含了病毒基因组中毗邻纤维基因3’端的Ad5 DNA的43bp。所得的片断用凝胶纯化,混合,加入用F1和F2引物的第三PCR。得到的产物在编码HI环序列缺失部分的位置上有一独特的EcoRV限制(酶切)位点,同样在分子的末端也插入了BamHⅠ和HindⅢ位点以便利接下来进行克隆。该DNA片断可用BamHⅠ和HindⅢ来切断,克隆到BamHⅠ-HindⅢ-消化的细菌表达载体pQE30(Qiagen,Santa Clara,Calif.),得到质粒pQE.KNOB△HI。
为了构建含有掺入到纤维HI环的FLAG序列的表达质粒,退火寡核苷酸TACACTAAACGGTACCCAGGAAACAGGAGACACAACTGACTACAAGGACGACGATGACAAGCC(SEQID                   No.5                    )                   和GGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGGGTACCGTTTAGTGTA(SEQID No.6)以形成双螺旋并克隆到EcoRV-消化的pQE.KNOB△HI中。含正确取向该双螺旋的质粒命名为pQE.KNOBHIFLAG。
如下制备用于产生表达嵌合纤维的重组杆状病毒的转移质粒:用pQE.KNOBHIFLAG的BglⅡ-Mfel片断来替代前面所述载体pBS.F5.UTR(25)的BglⅡ-Mfel片断,由此产生pBS.F5HIFLAG。将pBS.F5HIFLAG的BssHⅡ-Xhol片断克隆到BssHⅡ-XhoⅠ-消化的杆状病毒转移载体pFastBacl(LifeTechnologies,Gaithersburg,Md.)中,得到pFB.F5HIFLAG。为了将6-组氨酸纯化尾引入到该嵌合纤维的氨基端,pFB.F5HIFLAG的BamHI-BssHⅡ片断用编码MetHis6Lys的由寡聚核苷酸GATCCATGCATCACCATCACCATCACAAG(SEQ IDNo.7)和CGCGCTTGTGATGGTGATGGTGATGCATG(SEQ ID No.8)制备的合成双螺旋替代。所得的质粒pFB6H.F5HIFLAG含有氨基端带6-His尾的纤维的编码基因和插入HI环的FLAG肽的编码基因。为了衍生出类似的质粒(含有没修饰的HI环编码序列的纤维基因),pFB6H.F5HIFLAG中的BssHⅡ-Mfel片断用pNEB.PK3.6(25)的同源片断来替代,生成pFB6H.F5。为了将在HI环中有FLAG序列的纤维的编码基因克隆到纤维穿梭载体pNEB.PK3.6中,用pQE.KNOBHIFLAG的BstXI-Mfel片断来替代该质粒中所含野生型纤维基因的BstXⅠ-Mfel片断,从而产生pNEB.F5HIFLAG。
为了便于在大肠杆菌中通过同源重组生成重组体腺病毒的基因组,将从Transgene(Strasbourg,France)得到的质粒pTG3602(7)进行(基因)工程改造创造一种适合纤维基因修饰的特殊载体。为了达到这一目的,采用了位于纤维基因上的Ndel位点。质粒pTG3602用Ndel部分消化,并用Ndel-Swal接头连接,接头为TACCCATTTAAATGGG(SEQ ID No.9)。这种纤维基因中含有Swal位点的质粒命名为PVK50。
如Chartier等描述(7),在E.coli BJ5183中进行同源DNA重组生成了含编码纤维-GLAG蛋白基因的重组腺病毒基因组,该重组是在用SwaⅠ线性化的pVK50和含感兴趣基因的pNEB.F5HIFLAG的3-kb EcoRⅠ片断之间进行。将新生成的基因组从生成的质粒pVK300中切下,用于拯救该病毒。
为了产生成重组Ad5纤维基因,该基因编码的纤维在结区的HI环中含有RGD-4C肽,将寡聚核苷酸CAC ACT AAA CGG TAC ACA GGA AAC AGG AGA CAC AACTTG TGA CTG CCG CGG AGA CTG TTT CTG CCC(SEQ ID No.10)和GGG CAG AAACAG TCT CCG CGG CAG TCA CAA GTT GTG TCT CCT GTT TCC TGT GTA CCG TTT AGTGTG(SEQ ID No.11)生成的双螺旋克隆到前述质粒pQE.KNOB△HI(21)的EcoRV位点,由此得到pQE.KNOB.RGDHI
为了制备出适合于产生感兴趣病毒的基因组的穿梭载体,将pQE.KNOB.RGDHI的含RGD-4C编码序列的修饰过的纤维基因的BstXⅠ-MunⅠ-片断亚克隆到用BstXⅠ和MunⅠ切的纤维穿梭载体pNEB.PK3.6中(Krasnykh.et a1.,1996,J.Virol.70:6829-46)。为了得到含有纤维-RGD基因的Ad5基因组,用所得的质粒pNEB.PK.FHIRGD,与前述大肠杆菌BJ5183中DNASwal-消化的pVK50进行同源DNA重组。这样重组所得的质粒命名为pVK503。
从质粒pGEMR-luc(Promega,Madison,Wisc)中切除的火萤荧光素酶作为1.7kb BamHⅠ-XhoⅠ-片断,并克隆到BamHⅠ-XhoⅠ-消化的pcDNA3(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,得到pcDNA.Luc。为了破坏荧光素酶ORF的PacⅠ和ClaⅠ位点,用寡核苷酸CAA ATA CAA AGG ATA TCA GGT GGC CCC CGC TGA ATT GGA GT(SEQID No.12)和CGA CTC CAA TTC AGC GGG GGC CAC CTG ATA TCC TTT GTA TTT GAT(SEQID No.13)合成的双螺旋来替代pcDNA.Luc中的41bp PacⅠ-ClaⅠ-片断,这样得到pcLucPC1。
为了制备含有在表达盒中含有这种修饰的荧光素酶基因的穿梭载体,如下在pACCMVpLpA(Becker,et al.1994,Meth.Cell Biol.43:161-89)中克隆该基因。质粒pcLucPC1用BamHⅠ酶切,用克列诺酶(Klenow)处理填平末端,然后用XhoⅠ酶切。克隆的载体pACCMVpLpA用EcoRⅠ酶切,用克列诺酶处理,然后用SalⅠ断裂。这两种DNA分子的联接生成pACCMV.Luc△PC。这种质粒可用于与ClaⅠ-线性化的pVK503进行同源DNA重组,来生成含有基因组Ad5lucRGD的pVK703。
为了衍生表达纤维-RGD的重组杆状病毒,如下修饰转移载体pFB.F5HIFLAG。先将EcoRⅠ接头,CGG CGA ATT CGC,掺入到pFB.F5HIFLAG的ClaⅠ位点,得到pFB.F5.RI。然后,用含有纤维-RGD基因3’部分的pNEB.PK.FHIRGD的NcoⅠ-MunⅠ-片断替代pFB.F5.RI的NcoⅠ-MunⅠ-片断,得到pFB.F5HIRGD。按照制造商的推荐采用Bac-to-Bac试剂盒(Gibco BRLGaithersburg,MD),通过位点特异性转座将该质粒用于产生重组杆状病毒基因组。
腺病毒在293细胞中增殖,按照标准流程(15)用CsCl梯度离心纯化。用Maizel等人(28)描述的方法用分光光度法260nm下转换系数1.1×1012病毒粒子/吸光度单位来测定病毒粒子的滴度。用Mittereder等人(32)描述的噬斑试验法来测定293细胞上感染性病毒粒子的滴度。用Gibco-BRL(Life Technologies)的Bac-to-Bac表达试剂盒中按照制造商的方案生成表达嵌合纤维的重组腺病毒。
实施例7
腺病毒感染试验
为了评价腺病毒感染,在12-孔板各孔中加入1ml培养液中,将各细胞系的105个细胞加入到一个加样孔中,一式三份。然后培养细胞过夜,使黏附。起初,细胞培养在含2%FBS的300μl/孔的培养液中,含或不含最终浓度20μg/ml的纤维结蛋白,培养15分钟。在每个孔中加入最终体积为300μl的混合的感染复合物,含a)10-250pfu/细胞的AdCMVLuc或Ad5lucRGD,或b)20μg/ml AdCMVLuc/结蛋白或Ad5lucRGD/结蛋白。在37℃5%CO2下,培养细胞1小时,然后用pH7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤,再补充1ml的完全培养基。感染48小时后,用PBS清洗细胞,用酶试验或荧光素酶mRNA原位杂交来分析荧光素酶的表达。所有的荧光素酶试验,细胞都用200μl的Promega(Madison,WI)裂解缓冲液来裂解。按照制造商说明,将每个样品10μl与50μl的Promega荧光素酶试验试剂混合,在Berthold荧光上重复测定三份重复样品。对于原代组织,在1ml含或不含20μg/ml结蛋白的OptiMEM中培养切碎的等份组织30分钟,用AdCMVLuc或Ad5lucRGD(5×107pfu/10mg组织)转导1小时。在更换培养基(含抗生素的OptiMEM)后,再培养该组织24小时。然后将组织匀浆和离心。收集的上清液用于荧光素酶的试验和蛋白浓度的测定。
实施例8
荧光素酶mRNA的原位杂交
原位杂交技术的流程可参见(Bucy et al.,J.Exp.Med.180:1251,1994;Panoskaltsis-Martari & Bucy,BioTechiq.18:300,1995)。简单的说就是,在含有1ml培养基的12-孔板各孔中接种细胞。在细胞达到亚铺满状态时,用250pfu/细胞的AdCMVLuc或Ad5lucRGD转导1小时。再培养48小时后,用PBS清洗细胞,用Versene(GibcoBRL)重悬浮细胞。离心后,细胞以浓度为106细胞/ml重悬于DEPC-处理的PBS中。100μl每种样品中的细胞用cytospin吸附于载玻片上。然后用PBS淋洗细胞,室温下用3%多聚甲醛固定1小时。固定的细胞用0.2MHCl处理以抑制内源性碱性磷酸酶的活力,用0.1M三乙醇胺和乙酸酐来乙酰化,减少背景染色,并50℃与400pg/ml/kb相关核糖探针的杂交溶液杂交过夜。该杂交溶液由以下成分组成,50%甲酰胺,4X SSC,1XDenhardt溶液(Sigma),500mg/ml热变性鲱精子DNA,250mg/ml酵母转化RNA,和10%硫酸葡萄糖。杂交后,用2X的SSC冲洗细胞,再用氯化钠-Tris-EDTA缓冲液冲洗,用核糖核酸酶(RNase)A(20mg/ml的氯化钠-Tris-EDTA溶液)37℃处理30分钟,除去过量的没有杂交的探针。接下来,用以下试剂进行一系列严谨度渐增的冲洗:2X SSC,1X SSC,0.5X SSC和Tris-NaCl(0.15M),pH 7.5,含正常马血清。然后以浓度为1∶5000的与抗-洋地黄毒苷抗体交联碱性磷酸酶染色细胞。接下来用Tris-NaCl洗涤细胞,转移到含MgCl2的碱性Tris缓冲液中(pH 9.5)。最后,载玻片与酶底物溶液(氮蓝四唑/BCIP,Boehringer-Mannheim)4℃潮湿暗室中培养过夜。以Tris-EDTA(pH 8.0)冲洗载玻片终止显色反应。
实施例9
FLAG的进入试验
用免测沉淀试验证明掺入到完整Ad5FHIFLAG病毒的FLAG-尾的纤维蛋白与抗-FLAG M2单克隆抗体的结合。经CsCl梯度纯化的Ad5FHIFLAG或AdCMVLuc用HEPES缓冲液(10mM HEPES,1mM MgCl2,10%甘油,[pH 7.4])透析,并如下吸附在M2-亲和凝胶〔Eastman Kodak〕上。将50微升含l011个病毒粒子的透析后病毒与100μl用HEPES缓冲液平衡的M2-亲和胶混合,该HEPES缓冲液含有50mM NaCl和0.5%牛血清白蛋白(BSA),然后4℃在回转轮中培养过夜。培养后,凝胶通过微量离心机的瞬时离心沉降。收集上清液用于进一步的分析,凝胶用0.5ml Tris-缓冲盐水(TBS)洗涤。4℃用50μl含400μgFLAG肽/ml的TBS洗脱病毒。含没有结合物质的上清液、洗液和洗脱液用于检测病毒的存在。由此,取这些组份的等份在37℃用终浓度分别为1%,10mM,和100μg/ml的月桂基磺酸钠,EDTA和蛋白酶K处理1小时。样品用琼脂糖凝胶电泳分析检测病毒DNA。
实施例10
用免测沉淀法纯化纤维-FLAG蛋白
如下将重组纤维-FLAG蛋白在杆状病毒感染的Sf9细胞中表达。为了大量表达纤维-FLAG蛋白,以感染复数5-10用重组杆状病毒感染T75瓶中的Sf9细胞单层,然后在28℃培养,直到观察到完整的(致)细胞病变(效应)。感染后的2-3天,刮下细胞,低速离心沉淀,垂悬于裂解缓冲液(50mM Tris-HClpH 8.0,150mM NaCl,1%诺乃洗涤剂(Nonidet)P40,0.1%SDS,0.02%叠氮钠,100μg/ml苯甲基磺酰氯,1μg抑蛋白酶肽/ml)中。然后将细胞在冰上培养30分钟。在微量离心机上以12,000×g离心5分钟澄清裂解物。使澄清的裂解物与M2亲和凝胶浆混合,剩下的步骤与Ad5FHIFLAG的免测沉淀法所述相同。
实施例11
重组蛋白的三聚试验
为了确定表达于杆状病毒感染的昆虫细胞中的纤维蛋白是否能形成三聚体,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了这些蛋白(如参考文献30)。蛋白或者在跑电泳前煮沸以解离三聚体,或者不经变性加样在凝胶上。这些分子的三聚体或单体结构根据它们在凝胶上的迁移率确定。
实施例12
重组纤维蛋白对病毒介导基因转移的抑制
在类似于前所述的(17,24,34,36)感染抑制实验中评价了纤维-FLAG嵌合体阻断腺病毒介导的基因转移的能力。简单的说就是,将生长在24-孔中的海拉细胞单层先在室温下与10系列倍稀释的野生型纤维或纤维-FLAG蛋白预培养,然后用表达火萤荧光素酶的缺陷性腺病毒重组复制子,AdCMVLuc感染。洗去没有结合的病毒,37℃培养细胞使发生AdCMVLuc内化作用并表达荧光素酶基因。感染30小时后,用Promega(Madison,Wis)的荧光素酶试验系统分析感染细胞的裂解物。
实施例13
病毒结合试验
如Wickham等人描述,使人肺癌A549细胞生长于T75瓶然后用EDTA收获,PBS洗涤一次,沉淀,用DMEM-Ad培养基(DMEM,20mM Hepes,0.5%BSA)垂悬,终浓度107个细胞/ml。将每等份为100微升的细胞移到5ml的实验管中,4℃与100μl以DMEM-Ad培养基稀释的重组纤维培养1小时。
重组腺病毒AdCMVlacZ和Ad5FHIFLAG用CsCl梯度纯化,用含10nMHEPES,1mM MgCl2,10%甘油[pH7.4]的缓冲液透析。(如参考文献20描述的)用125I的IODO-BEADS碘化试剂(Pierce,Rockford,Ⅲ)标记每等份含50mg病毒蛋白的二份病毒。用PD-10柱(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行凝胶过滤将标记的病毒从没有掺入125I的病毒中纯化出来。每等份50微升总放射活性为l05cpm标记过的病毒加入到与纤维稀释液或PBS预培养过的A549细胞中,4℃培养一小时。样品用4ml含有0.1%BSA的PBS稀释,离心沉淀细胞。吸去含有未结合病毒的上清液,用γ-计数仪测定细胞沉淀的放射性。
实施例14
杆状病毒感染的昆虫细胞中重组纤维的表达
为了证明用纤维结的HI环来掺入异源蛋白序列的适用性,首先使用了在杆状病毒表达系统表达的重组纤维蛋白。该系统已证明其可用于表达功能性Ad2,Ad3,和Ad5纤维蛋白以及Ad3-Ad5和Ad5-Ad3纤维嵌合体(13,26,33,37)。
为了达到这一目的,用PCR法衍生出了在HI环有部分缺失的Ad5纤维结的编码基因。该缺失是用基因工程的方法从纤维结结构域的HI环除去氨基酸TLNGTQETGDTTP(SEQ ID No.14),然后在缺失的序列位置上引入一个独特的EcoRV位点,这样就便于在这一区域中克隆替代序列(图2)。缺失切掉的HI环部分,在人腺病毒不同血清型的纤维结中区别是很大的。由PCR生成的序列含有与两个纤维结蛋白片断对应的开放读框,包括氨基酸甘氨酸-387到异亮氨酸-534和丝氨酸-548到谷氨酰胺-581(按照野生型Ad5纤维蛋白序列这部分确定坐标)。将该序列克隆到质粒载体pQE30中。
新生成的质粒pQE.KNOB△HI用作掺入编码FLAG八肽(DYKDDDDK(SEQ IDNo.15))的DNA片断的克隆载体,该片断被广泛用作测定和纯化的尾。由此,该FLAG肽在纤维构造中可作为一种探针被探测到,以确定掺入到纤维结HI环的异源肽序列在三聚纤维分子中是否可接近。通过将该序列掺入到纤维结的开放读框中,先前缺失的密码子得以恢复。所以,在新生成的质粒pQE.KNOBHIFLAG中的FLAG编码序列作为插入物被引入到苏氨酸-546和脯氨酸-547之间。该质粒然后可用于在杆状病毒转移载体中构建一个完整的重组纤维基因。出于对照目的设计了含野生型纤维基因的类似转移质粒。为了便于接下来对表达产物的纯化,将编码氨基酸-末端6-组氨酸尾的序列引入到这两种基因的设计中。这些质粒然后被用于产生二种重组杆状病毒,该杆状病毒含有编码野生型Ad5纤维的纤维基因和在结区域的HI环中含有FLAG肽的纤维蛋白。
采用设计用于纯化6-组氨酸尾蛋白的Ni-NTA-琼脂糖,从杆状病毒感染的昆虫细胞裂解物中回收了重组纤维。纯化纤维的产量范围为10μg蛋白/106个感染细胞。两种重组蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,它们形成了稳定的三聚体,该三聚体在凝胶加样缓冲液中煮沸后,分解成分子量为63KDa的单体(图3A)。这一结证明,在纤维结的HI环中掺入短肽序列不会消除纤维的三聚作用。所以,通过杆状病毒表达系统可得到制备量的重组纤维,这种纤维适于序列的分析。
实施例15
纤维三聚体中FLAG肽的可接近性
为了明确引入到纤维HI环的FLAG肽是否可参与结合,采用可以FLAG尾蛋白与含抗-FLAG单克隆抗体的亲和基质起特异性反应为基础的试验。这些实验中,将HI环中有FLAG序列(纤维-FLAG)的重组纤维蛋白在Ni-NTA-琼脂糖柱上纯化,然后与M2-亲和凝胶免测沉淀。用FLAG肽将结合到基质的蛋白特异性洗脱下,用含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶分析(图3B)。根据该分析,纤维-FLAG蛋白有效的结合于M2-亲和凝胶上,证明了在三聚纤维分子中的FLAG表位能与抗-FLAG单克隆抗体反应。重要的是,该反应不影响三聚体的稳定性,这提示含有掺入到纤维结HI环新配体的重组病毒是将在感染的结合步骤中保持其结构的完整性。
实施例16
重组纤维-FLAG蛋白对腺病毒感染的抑制
由于不知道FLAG肽是否具有使腺病毒靶向新的细胞受体的能力,必须确定该肽掺入HI环后是否影响纤维结中细胞结合位点的正确折叠。如果HI环不参与该位点的形成以及如果纤维-FLAG不结合到细胞表面的纤维受体上,则进一步试图拯救含有这种重组纤维的病毒将难免要失败。为了确定此事,用纤维-FLAG重组蛋白来阻断腺病毒在体外研究中的感染。已建立的试验是以以下事实为基础的,该事实就是重组腺病毒纤维蛋白通过产生它们的腺病毒能够阻断感染。另外,这种对病毒感染的抑制以剂量依赖形式发生。
使接种于12-孔组织培养平板的海拉细胞与不同浓度的野生型Ad5纤维或纤维-FLAG蛋白预培养,再用表达火萤荧光素酶作为受体的重组Ad5载体AdCMVLuc感染。先前,这一试验是以用病毒载体的基因转移为基础的,用放射标记的病毒(24)进行经典结合试验可产生相关加样孔的数据。感染30小时后,裂解细胞,裂解物用于荧光素酶活力试验(图4)。根据该试验,两种纤维蛋白以剂量依赖方式阻断了AdCMVLuc感染,证明了感染抑制的相同性。异源肽序列掺入到纤维结的HI环不影响由纤维蛋白羧基端部分形成的细胞结合位点的正确折叠。
实施例17
用ELISA鉴定纤维-FLAG蛋白
为了得到另外的证据来支持纤维-FLAG蛋白的功能性效用,用ELISA分析了这种重组蛋白,其中用到了一些FLAG表位特异性的单克隆抗体和不同构象的Ad5纤维。为了完成这一目的,将昆虫细胞表达的野生型纤维和纤维-FLAG蛋白吸附于包盖了Ni-NTA(Qiagen)的HisSorb ELISA条带,并用抗-纤维抗体4D2或抗-FLAG抗体M2探测。抗体4D2与Ad5纤维单体和三聚体反应,在该试验中作为阳性对照,而抗体1D6.14与纤维结中构象未确定的一个表位结合,且对三聚体是特异性的。然后用山羊抗-小鼠抗体-HRP交偶物显色ELISA条带。
两种纤维蛋白与抗-纤维抗体4D2和1D6.14有效地起了反应,这就意味着纤维-FLAG分子中纤维结的3D结构与野生型纤维相同。另外,纤维-FLAG嵌合体与抗-FLAG抗体M2特异性反应,证明了该表位结合于三聚纤维分子的可行性。所以,结果验证了凝胶电泳分析Ni-NTA-或M2-亲和凝胶纯化的纤维-FLAG蛋白的数据,为进-步鉴定提供了将纤维-FLAG嵌合体掺入到腺病毒病毒粒子中的合理性。
实施例18
Ad5FHIFLAG的产生
尽管从重组纤维-FLAG蛋白得到的数据支持其在腺病毒病毒粒子中的功能应用已是事实,成功的产生该重组病毒将支持对具有病毒功能的纤维结HI环修饰可以相容的假说。所以将纤维-FLAG嵌合体掺入到腺病毒病毒粒子中。为了产生这种病毒,采用了一种在E.coli细胞中同源DNA重组为基础的新的基因技术。简单的说,这种技术包括将两种线状DNA分子之间的重组共转化到细菌细胞中产生一种重组腺病毒基因组。其中的一种分子是质粒pTG3602或它的衍生物,含有克隆入细菌载体中的全部腺病毒基因组并侧接了两个PacⅠ位点。该重建结果产生了该重组模式中的第二个伙伴是与腺病毒基因组DNA的两个片断侧接的感兴趣的基因构建物,该第二个伙伴规定了重组产生的腺病毒基因组中该结构的位置。此DNA序列可以是在小的重组质粒用基因工程方法修饰过的转基因或原始Ad5基因。
为了降低pTG3602产生的非重组体背景,在转化前,在最终构建物将要插入的基因组区域或其附近用限制性内切酶切开该质粒。虽然这一技术与传统的在哺乳动物细胞中经同源重组产生重组腺病毒基因组技术相比有许多优点,但它要求在将被修饰的腺病毒基因组区域中存在独特的限制性位点。然而,pTG3602中的Ad5基因组DNA在纤维基因中不含有任何独特的限制性位点,这就限制了其不能用在纤维的修饰上。由此,为了克服这一限制,该质粒通过在纤维基因中插入一个限制性内切酶SwaⅠ的独特切割位点加以修饰。为了这一目的,将存在于Ad5 DNA中位于纤维基因5’端下游47bp的两个NdeⅠ位点中的一个,通过插入一个SwaⅠ-接头转变为SwaⅠ位点(图5)。生成的质粒pV50接下来被用来与含有编码纤维-FLAG基因的DNA片断同源重组,该纤维-FLAG侧翼接了毗邻于Ad5基因组中纤维基因的病毒DNA。作为这种重组体的结果产生了质粒pVK300,它在完整腺病毒基因组中含有修饰过的纤维基因。用PacⅠ消化从pVK300释放出腺病毒DNA,用于转染293细胞来拯救该病毒(如参考文献7所述)。从新生成的病毒的病毒粒子的CsCl梯度纯化分离得到DNA,对Ad5FHIFLAG作PCR分析和循环测序来证明掺入到基因组纤维基因中FLAG编码基因的存在。根据这两种分析得知,AdFHIFLAG确实包含了感兴趣的纤维基因。
实施例19
用细胞-结合试验鉴定Ad5FHIFLAG
与通常从生长的野生型Ad5收获的产率相比,生长于293细胞的这种病毒的产率,接近1011PFU每次制备(从20个75cm2组织培养瓶获得)。而且,无论是在获得病毒还是在扩充病毒时,在噬斑形成的动力学上都没有滞后。这些发现提示在纤维结的HI环中引入的FLAG肽对纤维分子的正确折叠和它的生物学功能都没有明显的影响。
为了证明这点,用放射标记的Ad5FHIFLAG来研究其结合到细胞表明纤维受体的能力。在该试验中,使125I标记的Ad5FHIFLAG与A549人肺癌细胞结合,该人肺癌细胞已知可以表达高水平的Ad5纤维受体。杆状病毒表达的野生型Ad5和纤维-FLAG用作竞争剂来选择性阻断细胞受体并抑制病毒结合。用含有野生型纤维的重组腺病毒载体Ad5CMVLacZ作为对照。图6A和6B清楚显示了,就象预计的那样,当与二型纤维之一竞争时,两种病毒都显示了相同的剂量反应。由此,将异源肽掺入到纤维-FLAG蛋白的HI环对位于结上的细胞结合位点的形成没有任何负影响,所以不影响病毒的感染性。
实施例20
Ad5FHIFLAG病毒粒子中FLAG的可接近性
如要将导向配体插入到纤维结中,必需确定在掺入腺病毒病毒粒子后这样的配体是否能参加与其靶细胞表面的受体的相互反应。为了这一目的,将FLAG序列掺入到Ad5FHIFLAG的纤维中来测定完整腺病毒粒子结的HI环的可接近性。这种试验类似于用于评价表达于昆虫细胞的重组纤维-FLAG蛋白中的FLAG可接近性的试验。
将CsCl梯度纯化的病毒粒子用HEPES缓冲液透析,与M2亲和凝胶培育,让FLAG肽和交联在凝胶基质上的抗-FLAG单克隆抗体之间发生反应。类似方法制备的含有野生型纤维的AdCMVLuc病毒粒子,用于该实验的阴性对照。培育后,收集含未结合物质的缓冲液,用缓冲液洗涤凝胶除去痕量的游离病毒。最后,用可溶性的FLAG肽洗脱凝胶上的病毒。用蛋白酶K处理收集的样品等份释放出病毒粒子中的病毒DNA,然后用琼脂糖凝胶电泳观察(图7)。如所预计的一样,AdCMVLuc病毒粒子不与M2抗体反应,而且只有在含未结合病毒的组份中和洗液中才检测到。显然相反,Ad5FHIFLAG颗粒有效地结合在M2-亲和凝胶上,而病毒DNA则主要出现在FLAG肽洗脱液中。由此,这些发现明确了经基因工程掺入到完整Ad5病毒的纤维结域HI环中的异源配体序列,仍保持了与相关受体结构相互反应的可及性,从而证明了在这基础上产生基因工程化的靶向腺病毒载体的合理性。
实施例21
重组纤维蛋白腺病毒的转导效率
将所用的细胞系接种于12-孔组织培养平板上,密度为2×105细胞/每孔用完全培养基培养并设适当对照。让接种细胞37℃附着过夜。第二天,用1X PBS洗涤细胞,室温下与250μlPBS(对照)或250μl溶于1X PBS的重组Ad5纤维结(100μg/ml)预培育10分钟。然后,分别用Ad5CMBLuc或Ad5LucRGD以2感染复数:1PFU/细胞或10PFU/细胞(250μl/每孔在DMEM/F12中含4%FBS)感染细胞。37℃培育30分钟后,除去各孔的纤维结溶液和感染性培养基。各孔用1X PBS洗涤一次,然后加入1ml新鲜完全培养基到各孔中。将细胞培养48小时,进行荧光素酶试验。
融解这两种主要的细胞,并等份分入到15ml的离心管中。PBS洗涤,纤维结处理,和病毒感染程序均在悬浮液中进行。在感染细胞后,离心悬浮液,吸弃培养基,细胞垂悬于完全培养基中,接种于12-孔板孔中37℃培养48小时。对于荧光素酶活力分析,制备Ad-转导细胞的裂解物,按照Promega的“Luciferase Assay System”说明进行荧光素酶试验。
尽管做过许多尝试来改进腺病毒使其在基因治疗应用中用作载体,但仍然存在很多缺点,其中之一就是这种病毒的混乱嗜性。基因修饰腺病毒的包膜蛋白使靶向新的细胞表面受体是最根本的,如果成功的话,是可能是克服这种限制最有效的方法。从这一角度来说,纤维五邻体碱蛋白六邻体蛋白是这种基因修饰的候选目标。据报道在修饰五邻体碱基(42,46)和六邻体时,这种变化都限定于将短肽序列引入到腺病毒病毒粒子该组件的外部结构域中。相反,大量的研究尝试了对纤维蛋白的功能性修饰。对纤维蛋白修饰的这些尝试有一个很明显的解释:与六邻体和五邻体碱性蛋白相反,纤维蛋白介导了病毒与其相关细胞受体的主要相互反应,从而规定了病毒的嗜性。另外,由于其杆状结构,纤维可能最佳地暴露出经基因工程加入到它结构中的新结合配体,从而提供了与另一细胞受体的有效结合。所以,改变含有细胞结合位点的正常纤维的羧基端结区域是修饰病毒嗜性的符合逻辑的方法。
自从这种想法产生以来,许多研究组织来证明了它的用途。为了该目的,衍生了含有嵌合Ad5-Ad3(25,37)纤维的重组腺病毒,证明了创造功能性纤维嵌合体的可能性。另外,也显示了通过替换纤维的结域,可以改变这种病毒的特异性受体。进一步的是,Wickham等人(45)显示了在纤维多肽中加上羧基-末端的聚赖氨酸序列,导致扩大腺病毒载体的嗜性。最近,已产生了若干腺病毒,其纤维含有羧基端胃泌素释放肽(30a),抑生长素,E-选择蛋白结合肽,和6-组氨酸序列(24a)。然而,这些尝试都没涉及到消除腺病毒载体的天然嗜性;这些方法中,基因工程产生的载体具有不同于先前存在的天然嗜性的新嗜性。
直到最近,完成重靶向的腺病毒载体的具体设计能力受到两个主要问题的限制:缺少对纤维结区域结构的认识和在腺病毒基因组中操纵纤维基因的困难。在这一方面,Xia等人(47,48)公布了Ad5纤维结的3D模型,Chartier等人(7)发展的基因技术,该技术可以修饰腺病毒基因组的任何区域,从而推进了通过改变纤维的结区域使腺病毒重靶向的努力。本研究是唯一的试图产生重组腺病毒基因组和衍生具有修饰过的含新肽配体纤维的腺病毒载体的研究。
本发明中的方法描述了用纤维结的HI环作为掺入异源肽序列的位点。按照Ad5纤维结的3D模型,HI环既不参与该结内稳定其三聚构形的相互反应,也不参与受体结合位点的形成。重要的是,由于亲水性氨基酸残基在其主序列中占优势,HI环就暴露在结外,这样便利了潜在配体与细胞受体的相互反应。
为了证明该构思,将FLAG编码序列掺入到与HI环相应的纤维基因区域中,这种修饰的基因在杆状病毒感染的昆虫细胞中得到表达。将氨基末端6-组氨酸尾加入到此设计中,目的是对重组纤维蛋白进行简便的柱层析纯化。用杆状病毒表达重组完整纤维是高效的,根据凝胶分析和用三聚体-特异性抗-纤维单克隆抗体作的ELISA结果,表达产物是三聚的。
为了进一步鉴定昆虫细胞产生的纤维-FLAG蛋白,证明了了该纤维三聚体中FLAG的可接近性。所用的试验根据为FLAG-标记的蛋白与含有抗-FLAG单克隆抗体的M2-亲和凝胶的特异性相互反应。该分析证明FLAG肽位于三聚纤维结的表面,可参与结合,所以支持了关于HI环定位于表面的假说。采用纤维-FLAG嵌合体阻断了腺病毒的感染,也证明了将FLAG肽插入到纤维结的HI环不影响位于该结的细胞结合区域的正确折叠。这一重要发现考虑了HI环连接β-链H和I的HI环,而该环被假设参与了与细胞受体的结合(47,48)。
为了将纤维-FLAG嵌合体掺入到腺病毒病毒粒子中,用近期(7)描述的方法来产生了重组腺病毒基因组。为了达到该目的,修饰从Transgene得到的主质粒pTG3602,(基因)工程生成了一种载体,该载体大大有利于腺病毒基因组中纤维基因的修饰。通过用这种质粒,产生了重组基因组和拯救了感兴趣的病毒,Ad5FHIFLAG。重要的是,这种新病毒的高产率,并显示出与野生型Ad5相同的感染动力学。成功获得Ad5FHIFLAG及随后病毒的鉴定,证明了以在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的纤维-FLAG蛋白的获得为基础的结论,由此在进一步的纤维-模型实验中选用杆状病毒作为表达系统。该理论的进一步证据为,将RGD肽(CDCRGDCFC(SEQ ID No.16))编码序列掺入到纤维基因区域的HI环内,替换氨基酸TLNGTQETGDTTP(SEQ IDNo.17)。RGD肽对整联蛋白有亲和性。为了将纤维-RGD嵌合体掺入到腺病毒病毒粒子中,用最近(7)描述的方法产生了重组腺病毒基因组。RGD肽是多种类型整联蛋白的已知配体,包括αvβ5和αvβ3(Ruoslahti,E.1996 RGD和其它整联蛋白的识别序列,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.12:697-715)。测试了在HI环内含有RGD肽的腺病毒感染卵巢癌细胞系和原代卵巢癌细胞的能力。发现这种含有RGD肽的腺病毒可感染卵巢细胞系和原代卵巢癌细胞,而有时野生型腺病毒不能作到这一点。另外,测试了在HI环内含有RGD肽的腺病毒感染293细胞的能力。修饰过的腺病毒不能感染野生型腺病毒感染的细胞。由此,HI环的插入和替换二者引入了新的嗜性并除去了野生型的嗜性。本发明证明,纤维结的HI环是掺入异源肽配体的方便位点,该配体也许可成功的用于在基因治疗中使腺病毒载体靶向。纤维结的该部位可用作替代位点,或除纤维蛋白的羧基端修饰外,提供了一种独特的环状环境,该环境可能为某些配体序列发挥适当生物学功能所需要。例如,这种结构可能有利于从嗜菌体展示文库中得到的肽配体,该文库含有侧接两个半胱氨酸残基形成二硫键的随机肽序列(23,24)。另外,具有这种环状构形的配体比位于纤维羧基端的配体对细胞羧肽酶降解的敏感性差。为了认识配体掺入的HI环的全部潜能,可以制作在该位点含有各种靶向组份的重组腺病毒。产生所含纤维中具有HI环中掺入了的靶向配体的重组腺病毒,将推进制备基因治疗用的改进的腺病毒载体的努力。虽然开发纯化腺病毒的新方法并非为重点,但成功的将FLAG肽表位用于结合实验中,提示可将这种或类似的纯化尾掺入到腺病毒病毒粒子中,以方便其纯化。这种简单的纯化技术无需昂贵的实验设备,如超速离心机或高压液相层析系统,而且若需要易于放大。
实施例22
腺病毒-介导的基因转移试验
如上所述用细胞系进行腺病毒-介导转导实验。从卵巢癌患者的腹水中获得的原代细胞,如下制备作此分析:先加入含有150mM NH4Cl,1mM KHCO3和0.1mMNa2EDTA的缓冲液来裂解样品中的红细胞。然后,在一步梯度的Ficoll-Hypaque(Media Preparaton Shared Facility,UAB Comprehensive Cancer Center,Birmingham,Al.)上低速离心从活细胞中除去细胞碎片和死细胞。用含有10%胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories,Logan,UT),100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM/F12)(Cellgro,Herndon.VA)洗涤两次。分析125I标记的腺病毒与293,HUVEC或RD细胞的结合。
实施例23
纤维-RGD蛋白通过RGD三肽与整联蛋白的有效相互作用
如上所示,FLAG八肽掺入到Ad5纤维的HI环并不干扰位于结中的细胞结合位点的正确折叠,且在免测沉淀分析中可结合FLAG特异性抗体。以腺病毒靶向为目的为了利用这些发现,将RGD-4C肽,CDCRGDCFC(SEQ ID No.16),(已知对哺乳动物细胞表面的几种整联蛋白有高亲和力)引入到纤维结的HI环中。进行该努力以期产生一种腺病毒载体,它可以通过纤维-RGD/整联蛋白相互作用结合到细胞上。因此,这种病毒的感染不依赖细胞膜上的CAR受体。
为此,使含有纤维蛋白,纤维-RGD的RGD-4C在杆状病毒表达系统中表达,目的是鉴定该蛋白执行靶向功能的能力。将编码氨基端6-组氨酸尾的序列掺入到纤维-RGD基因中,以便于产物的下游纯化。
IMAC-纯化的纤维-RGD蛋白电泳显示,该纤维保持了其自然三聚结构(没有显示数据),已知这对病毒组装时该纤维与五邻体碱基的结合是很关键。为了评价纤维-RGD结合整联蛋白的能力,用纯化的αvβ3整联蛋白对纤维蛋白作ELISA分析。该试验显示,与作阴性对照的野生型纤维蛋白相反,纤维-RGD与αvβ3整联蛋白的结合十分有效(图9)。所以,这些实验证实该修饰纤维的功能性用途并证明了产生含有这种纤维的重组腺病毒的合理性。
以Chartier等人描述的方法产生了这种病毒。为了简化下游基因转移的试验,在腺病毒基因组的E1区域引入了一表达盒,该盒含有由巨细胞病毒启动子驱动的火萤荧光素酶基因。命名为Ad5lucRGD的新病毒的基因组在E.coli中通过两步流程产生,采用质粒pVK50和分离自两个穿梭载体pNEB.PK.FHIRGD和pACCMV.Luc/△PC之间的同源DNA重组,这两个载体分别含有纤维基因和侧接腺病毒DNA序列的荧光素酶表达盒。
这一方法的使用要求将含有新产生的腺病毒基因组的这种重组质粒用限制性内切酶PacI消化,以从该质粒主链中释放出Ad5 DNA的转化末端重复序列(ITR)。为了在此法中能采用含有内部PacⅠ位点的火萤荧光素酶,通过将-沉默突变导入该基因来消去该位点。作为前面提到的DNA重组结果,得到质粒pVK703,然后用于转染293细胞来得到Ad5lucRGD。用PCR以及从CsCl-纯化Ad5lucRGD病毒粒子分离得到的病毒DNA循环测序证实了该病毒的身份。
为了显示掺入Ad5lucRGD纤维的RGD三肽的可及性,用该病毒作ELISA试验,此试验类似于前面纯化纤维蛋白的试验。该分析清楚的显示,对所用的所有浓度整联蛋白而言,αvβ3有效地结合于固定的Ad5lucRGD粒子,而αvβ3与对照病毒的结合仅在背景水平(图10)。根据这些结果,发现Ad5lucRGD在体内和体外都有能力与各种类型的RGD-结合整联蛋白相互作用,所以可在感染初期利用这种作用来附着靶细胞。
实施例24
Ad5lucRGD有能力介导CAR-非依赖性基因传送
接下来,检测了在Ad5lucRGD纤维中引入RGD-基序是否会导致这种病毒感染细胞能力的变化。为了研究Ad5lucRGD的感染途径,用这种病毒来基因转移到几种细胞系,这些细胞系表达有不同水平的CAR以及整联蛋白αvβ3和αvβ3。为此,对下述细胞系作了一系列流式细胞分析,包括293人肾细胞,人脐带内皮细胞,HUVEC和人胚胎横纹肌肉瘤细胞RD。293细胞能支持腺病毒的感染,HUVECs与腺病毒的结合很弱,而CAR在RD细胞中的表达是传代依赖性的。
流式细胞分析显示293细胞高水平表达CAR(图11A)和αvβ3整联蛋白,而αvβ3表达中等水平(图11B)。HUVECs显示CAR表达中等水平(图11C),而细胞表面的两种整联蛋白的量都相当高(图11D)。横纹肌肉瘤细胞RD是CAR-阴性(图11E),αvβ3高表达和αvβ3中等表达。(图11F)。由此,在后面的基因转移实验中,建立了一系列细胞系覆盖了CAR表达的整个范围,而在它们的胞质膜上整联蛋白αvβ3和αvβ3的表达水平是中等至高的。然后,用Ad5lucRGD进行了一个试验,此试验的基础是重组Ad5纤维结蛋白竞争性抑制腺病毒介导基因传递,已知该重组蛋白能有效阻断病毒与CAR受体的结合。
如图12A所示,在293细胞中由对照病毒AdCMVLuc介导的荧光素酶表达,被重组纤维结蛋白有效的阻断了。根据所用的感染复数(MOI),纤维结蛋白阻断了AdCMVLuc-转导细胞中85%-93%的荧光素酶活力。
显著相反,同样浓度的纤维结只能阻断293细胞中40%-60%Ad5lucRGD介导基因表达,这就表明除了用野生型Ad5能很好鉴定纤维-CAR相互作用外,Ad5lucRGD能够利用另一条替代的、CAR-非依赖性的细胞进入途径。需注意的是这种细胞结合的替代机理的贡献是很显著的,提供了向293细胞全部基因转移的40%-60%。
为了进一步研究Ad5lucRGD定向的基因递送现象,用相同的方法来观察HUVECs的转导。这些细胞对采用含有野生型纤维的腺病毒载体作转导相对比较困难。这些发现结合流式细胞术的数据,显示了在HUVECs中CAR的中等表达。重要的是,在这些细胞中测到的αvβ3和αvβ3整联蛋白的高水平意味着HUVECs容易用Ad5lucRGD转导。虽然,与293细胞相比,在HUVEC细胞中这两种病毒介导的荧光素酶活力都较低,但实验揭示了这两种病毒显示的转导分布图有明显区别(图12B)。首先,Ad5lucRGD转导的细胞中荧光素酶的表达是AdCMVLuc转导的细胞中的30倍左右。其次,Ad5纤维结对AdCMVLuc介导转导的影响比用293细胞作的实验明显小,与在HUVECs中相对缺少CAR相一致。最重要的是,重组纤维结蛋白对Ad5lucRGD指导的荧光素酶表达水平没有抑制作用。
在RD细胞上也产生了十分类似的结果,RD细胞不表达CAR受体。在AdCMVLuc-转导的RD细胞裂解液中测到的荧光素酶的活力非常低:MOI为1pfu/细胞时,几乎与模拟感染的细胞得到的读数相等(图12C)。再者,Ad5lucRGD指导的转基因表达水平比AdCMVLuc介导的高16-47倍。这一表达对纤维结的抑制作用无反应。这些实验清楚地显示,RGD-4C肽掺入到Ad5lucRGD纤维中将导致病毒与细胞相互作用初期几步发生巨大变化,推测创造了另一种细胞附着途径。
实施例25
Ad5lucRGD显示由于4RGD/整联蛋白的相互作用增加了细胞结合的效率
已经明确Ad5CMVluc和Ad5lucRGD显示了不同效率的基因递送和纤维结介导的转导抑制,比较了这两种病毒的细胞结合情况。为了说明这件事,两种病毒都用125I标记,在293、HUVEC和RD细胞上用它们作病毒结合试验。该试验在(4℃),使病毒结合于细胞上,但预防病毒内化的条件下进行。如图13所示,Ad5CMVluc和Ad5lucRGD的结合效率在CAR-阳性293细胞上相似,而在HUVEC和RD细胞上结合的标记Ad5lucRGD病毒比例明显高于Ad5CMVluc病毒。由于将含RGD的肽掺入到纤维分子中的目的是使得病毒可以利用细胞整联蛋白作为替代受体,进行了一种试验,在该试验中在重组Ad2五邻体碱基蛋白存在时完成了放射标记的病毒与细胞的结合。由于在纤维分子中鉴定到在高度活动的环凸出部中有RGD基序存在,该五邻体碱基能结合αvβ3和αvβ3整联蛋白,由此可以和含有一个RGD-基序的其它分子或高分子复合物竞争与这些细胞受体的结合。
在测试病毒结合于293细胞时(图14A),该五邻体碱性蛋白不能抑制细胞与这两种病毒的结合。当纤维结蛋白单独或与五邻体碱基一起都可以阻断94%Ad5CMVluc和75%Ad5lucRGD的结合。用HUVEC细胞作同样的实验,再次显示纤维结蛋白对Ad5CMVluc粒子结合的抑制比对Ad5lucRGD病毒粒子结合的抑制程度要大(图14B)。另外,五邻体碱基能够减少25%结合于这些细胞的Ad5lucRGD相关放射活性而其对Ad5CMVluc结合的作用很小。当一起使用时,这两种阻断试剂减少了40%Ad5lucRGD结合。当这些病毒用于在RD细胞上作的结合试验时,得到了相似的结果。虽然,五邻体碱基不能象结蛋白阻断对照病毒的结合那样阻断Ad5lucRGD与HUVEC细胞的结合,但其作为整联蛋白特异性抑制剂显示了在感染过程中Ad5lucRGD可以利用细胞整联蛋白作为替代受体。
实施例26
Ad5lucRGD介导增强了基因转移到卵巢癌细胞中
通过用腺病毒载体直接体内基因递送来治疗癌患者的许多临床试验还在起步中,检测了Ad5lucRGD扩大的嗜性能使它对这种类型临床应用是否有用。首先,检测了这种重组载体将基因递送到培养的人卵巢癌细胞中的能力。用流式细胞术鉴定两种细胞系,SKOV3.ipl和OV-4,显示它们中等-高水平的表达整联蛋白αvβ3和αvβ3(图15B和15D),SKOV3.ipl表达高水平的CAR(图15A),而OV-4中等表达CAR(图15C)。
用SKOV3.ipl和OV-4进行的基因传递实验显示,将含有RGD的重组纤维蛋白掺入到Ad5lucRGD病毒中可以显著改善该病毒有效转导这些细胞的能力(图16A)。在不同的MOI测试中,Ad5lucRGD转导的培养的SKOV3.ipl细胞,与用对照病毒转导的细胞相比,显示荧光素酶的活力增加了30-60倍。有趣的是,当纤维结阻断了90%以上Ad5CMVluc介导基因传递,它却只阻断了15-20%Ad5lucRGD处理的细胞中荧光素酶的活力。
在用OV-4细胞作实验中,这两种病毒载体显示的转导效率差异有300-600倍(图16B)。以前,纤维结作为CAR介导细胞进入的抑制剂,对Ad5lucRGD介导基因的递送没有显著的作用,有力地提示了该病毒主要利用RGD-整联蛋白相互反应来结合OV-4细胞。
接下来,评价了在人卵巢癌原代细胞中Ad5lucRGD载体的用途。从这一角度看,最近的人体临床试验着重于腺病毒载体在不同模型系统中效力之间的不均等,而且在临床中发现转导效力相当低。这些发现意味着,需要改进载体设计作为加强癌基因治疗的治疗指数的通用方法。由于已证明整联蛋白经常由各种上皮细胞肿瘤超量表达,靶向这些细胞表面受体的载体可以提供一种完成CAR-非依赖性基因转移的工具。
实验中,在存在或缺少阻断纤维结蛋白的情况下,用Ad5lucRGD和AdCMVLuc处理从两位患者得到的卵巢癌细胞。所得的结果肯定了先前由培养细胞得到的发现。要注意的是,用AdCMVLuc处理的细胞裂解物的荧光素酶读数非常低(图17A和17B),这就表明含有非修饰纤维的腺病毒载体不能有效感染卵巢癌细胞的能力。纤维结对AdCMVLuc-介导的荧光素酶表达的强烈抑制,意味着纤维-CAR相互作用是用这种病毒来感染该类型细胞的唯一途径。显著相反,Ad5lucRGD指导的转基因表达比AdCMVLuc-转导细胞中测到的高2-3个数量级。MOI 1pfu/细胞时,纤维结阻断了20%的基因转移,MOI 10pfu/细胞时,无作用可见。所以,通过CAR-非依赖性途径来实现显著增强基因递送的能力,意味着腺病毒载体的基因重靶向对高效肿瘤转导通用性。
实施例27
通过基因修饰的腺病毒向人卵巢癌细胞系进行载体-介导的基因转移
用Ad5lucRGD或AdCMVLuc病毒感染人卵巢癌细胞系SKOV3.ipl,CaOV-3和UCI-101。在这些基因转移实验中,由修饰的RGD Ad载体观察到荧光素酶活力的显著增强(图18)。剂量为3×105和3×106pFU时,与用对照病毒感染的细胞相比,Ad5lucRGD-感染的SKOV3.ipl细胞培养物显示荧光素酶活力增加了4.7-7.6倍。同样观察到用CaOV-3细胞增加了244.2-471.6倍,用UCI-101细胞增加了2.5-4.2倍。
为了确定这些基因转移水平增强的机理基础,与重组纤维蛋白一起培养实现了对天然进入途径的腺病毒内化作用的阻断。在SKOV3.ipl细胞中,过量的纤维结蛋白与载体竞争与细胞的结合阻断了82%和91%AdCMVLuc-介导的荧光素酶活力。相反,这种操作只阻断了27%和39%的Ad5lucRGD荧光素酶活力。这些结果一起表明,Ad5lucRGD载体用了另一种替代的细胞进入途径来感染。CaOV-3细胞在剂量为3×105PFU时,由于感染水平太低没有测到显著的阻断,而在纤维结阻断当剂量为3×106PFU时观察到AdCMVLuc荧光素酶活力减少了55%。与此相对比的是,在分别用剂量3×105和3×106PFUAd5lucRGD感染后,观察到荧光素酶活力受到0.1%和42%的阻断。同样,UCI-101培养物显示因纤维结阻断减少了94%和97%的AdCMVLuc荧光素酶活力,而Ad5lucRGD-编码的荧光素酶活力减少要小得多为28%和39%。所以,CAR-非依赖性基因转移将导致显著增加转移到人卵巢癌细胞的基因。
实施例28
通过基因修饰的腺病毒向人卵巢腹水样品进行载体-介导的基因转移
对本文载体在更加临床相关的人卵巢肿瘤腹水样品中进行试验(Sterman etal.,Human Gene Ther.,9:1083,1998)。在这里需要注意的是,已发现一些上皮细胞肿瘤超量表达整联蛋白(Keely et al.,Trends Cell Biol.8:101,1998;Sanders et al.,Cancer Invest.,16:329,1998;Liapis er al.,Hum.Pathol.28:433,l997;Natali et al.,Cancer Res.,57:1554,1997;Pignatelli et al.,Hum.Pathol.23:1159,1992),将通过RGD基序的这些受体开发成可行的替代途径来促进高效的CAR-非依赖性基因转移。
以剂量为3×105和3×106PFU用AdCMVLuc和Ad5lucRGD载体感染卵巢癌腹水样品,在一个亚组的样品中加入阻断性纤维结。这些感染的结果与培养细胞系实验中所见相似(图19)。与Ad5lucRGD感染的细胞相比AdCMVLuc感染细胞中荧光素酶活力非常低。荧光素酶活力的增高水平分别在腹水样品#1中是64-50倍,腹水样品#2中为44%和26.1%。在过量纤维结存在时,由AdCMVLuc诱导的荧光素酶活力被阻断了90%,这又意味着通过CAR-非依赖性细胞进入途径获得了Ad5lucRGD递送基因的显著增强。在以前的研究中(Dmitriev et al.,J.Virol.72:9706,1998),已证明用Ad5lucRGD向卵巢癌细胞转移基因获类似的增强。本研究中注意到增强数量级的差异也许反映了不同患者原代组织之间的差异。另外,先前研究用的是预先冰冻的细胞,而本实验用的是新鲜的细胞。这两个研究的结果与在临床相关组织样品中通过替代的细胞进入途径而显著增强了腺病毒-介导的基因转移是相容的。
实施例29
腺病毒载体介导了向原代卵巢肿瘤外植块的基因转移
由于外植块对基因转移-向更难以驾驭,新鲜的外植块是验证临床应用中载体效力评分的最严谨的实验底物。由此,三种新鲜原代卵巢肿瘤样品以剂量3×105和3×106PFU用具有阻断性纤维结的AdCMVLuc和Ad5lucRGD感染。再一次显示,与AdCMVLuc载体相比,Ad5lucRGD载体产生了荧光素酶活力的增加(图20)。肿瘤#1样品,在所示Ad剂量时荧光素酶活力提高11.1和5.7倍,肿瘤#2荧光素酶活力提高1.6和2.4倍,肿瘤#3则增加了3.6和5.3倍。纤维结阻断了绝大部分AdCMVLuc感染,但只轻微阻断了Ad5lucRGD的感染,再一次证明CAR-非依赖性基因转移提供了观察到的基因转移效力增加的基础。所以,在这种高水平严谨性的短时培养系统中观察到了基因转移的显著增加。
实施例30
腺病毒载体介导的基因转移到间皮组织样品中
与普通组织相比,载体转导肿瘤组织的效力分析将提供关于不同感染的信息,这些信息对也许关系到人体临床使用。从这一角度说,根据载体对肿瘤和非肿瘤组织的不同感染力可以断定其在人体中的毒性和效率。由此,从在良性妇科条件下作手术的患者获得了四份间皮组织样品,以剂量3×105和3×106PFU的AdCMVLuc和Ad5lucRGD感染,并用纤维结阻断感染。有趣的是,有Ad5lucRGD载体(图21)和AdCMVLuc载体的间皮组织样品都表达了低荧光素酶活力。这些数据提示一种可取的肿瘤与普通组织基因转移的比例将改进这种新的腺病毒基因治疗载体的治疗指数。
实施例31
腺病毒载体介导的基因转移到人SCCHN细胞系
由于在体内的高效性,腺病毒载体已被用于各种癌基因治疗方法中(Huber& Lazo,Gene Therapy for Neoplastic Diseases,Ann.New York Acad.Sci.Vol 716)。虽然如此,与剂量相关的毒性和人体试验中原位转导效率低提示腺病毒载体以现在的形式对于这种应用可能是亚最佳的(Roth & Cristiano,J.Natl.Canc.Inst.89:21,1997)。为了明确这点,我们评价了腺病毒载体对人SCCHN细胞系的效力作为它们用于疾病的标准。在这些研究中,采用了编码荧光素酶报道基因的复制-缺陷型腺病毒载体。将该病毒载体递送给培养的细胞,固定的感染复数(moi)为10质粒/细胞,48小时后,评价细胞的荧光素酶基因表达。另外,在重组纤维结蛋白的存在下作平行实验。该试验实现了对腺病毒载体与它靶受体CAR相互作用的阻断,提供了一种观察通过CAR途径介导的基因转移的程度指标。用高度可感染的人细胞系HeLa作为对照。
在这些研究中,对照HeLa细胞系对腺病毒载体介导的基因递送高度敏感,如预计的一样。然而要注意的是,人SCCHN细胞系与对照HeLa相比对腺病毒载体介导的感染的敏感性显著很低(图22)。从这一角度说,观察到的荧光素酶活力对FaDu是4.8×105,对SCC-25是6.9×105RLU/mg蛋白。这些报道基因的数量分别为HeLa所观察水平的4.0%和5.7%。SCCHN细胞系SCC-4显示出略微较高的敏感性,得到的荧光素酶的水平为HeLa观察到的38%,与纤维结竞争研究在HeLa细胞和SCCHN细胞系中90%以上受到阻断。由此,观察到的转导水平是通过CAR-依赖途径完成的。根据这些研究表明,与HeLa相比,SCCHN细胞对腺病毒载体介导的基因转移的敏感性显著较低。另外,这些研究还提示着参与腺病毒载体感染人SCCHN细胞系的主要细胞因素是主要的腺病毒受体CAR。
采用基因修饰的编码荧光素酶基因的腺病毒Ad5lucRGD来转导人SCCHN细胞系。这些研究中直接比较了没修饰的对照病毒AdCMVLuc。与对照病毒AdCMVLuc相比,Ad5lucRGD用于HeLa细胞导致基因转移4倍增加(图23A)。加入重组纤维结对通过Ad5lucRGD的基因转移无显著抑制作用,证明转基因表达水平的增加代表了非-CAR途径发生的转导。Ad5lucRGD还应用于人SCCHN细胞系。在这些研究中,观察到在其它的腺病毒耐性细胞中基因转移的显著增加。具体是,对FaDu,SCC-4和SCC-25细胞基因转移分别增加了35,18和77倍。明显的是,纤维结竞争对通过Ad5lucRGD载体完成的这些细胞的基因转移没有作用。由此,实现了CAR非依赖性基因转移到SCCHN细胞提供了一种克服在SCCHN中缺少CAR的手段,并可能高度增加基因转移的水平。
实施例32
在腺病毒感染SCCHN细胞系中的原位杂交
用原位杂交来检测荧光素酶基因的mRNA转录。为了达到这一目的,使荧光素酶mRNA与毛地黄毒苷配基标记的核糖探针杂交,用酶细胞化学技术来检测。以没有感染的SCCHN细胞系SCC-25细胞作为对照,来显示阳性信号(图24A)。以moi为250pfu/细胞的AdCMVLuc感染这些细胞,产生了有限的阳性染色。相反,用同样moi的Ad5lucRGD感染的细胞则显示了增强信号,表明感染率>80%。这些载体产生的相对荧光素酶活力分别为4.1×107和3.3×109,与原位杂交的结果一致。根据这些研究,显然Ad5lucRGD感染更多的靶肿瘤细胞组份。所以,CAR非依赖性基因转移的高效性使得在人SCCHN细胞中基因的转移水平和转导率都有显著的增加。这后一参数是预测任何癌基因治疗方法最终用途的关键因素。
实施例33
基因转移到人SCCHN的原代外植块
由于细胞系提供了与基因转移相关的组织特定参数的指标,人肿瘤的类似物是不精确的。从这一角度说,载体在原代物质中的效力通常不同于从细胞系中得到的效力。另外,在人细胞系/小鼠异种移植模型中基因的转移频率通常过高的评估了最终在人临床基因治疗实验中得到的感染率(Hesdorffer etal.,J.Clin.Oncol.16:165:1998;Bellon et al.,Hum.Gene Ther.8:15,1997)。在这一基础上,人的原代材料是研究所开发载体方法有效性的关键底物。另外,肿瘤和相应正常组织中的靶载体平行分析提供了对感染的差异的理解,这种差异可能在人临床应用中发生。该差异可能是说明给定基因治疗方法的治疗指数的关键因素。由此,对嗜性-修饰的腺病毒载体在正常颊粘膜,与SCCHN相关的正常组织中进行了研究。
在这些研究中,与人SCCHN细胞系相比,原代肿瘤细胞表现出对腺病毒载体AdCMVLuc的相对抗性(图25)。这些发现证实了在原代细胞和细胞系中所见的不一致性,并增加了实现有价值的人肿瘤原位转导率的困难。接下来将这些发现与Ad5lucRGD0病毒作比较。值得注意的是,Ad5lucRGD实现了对其它难处理的肿瘤靶细胞基因转移的增加。具体说,在原代肿瘤的两种分离物中得到2.4和5.8倍的增加。用纤维结作的竞争研究证实所观察到的增加是通过CAR-非依赖性基因的转移发生的。因此,新鲜的原代肿瘤材料,代表了载体分析的临床相关研究底物,对它来说CAR-非依赖性基因转移显著增加了基因转移到人SCCHN肿瘤中。进一步注意到,在正常颊粘膜中没有观察到AdCMVLuc和Ad5lucRGD之间的差异(图25)。这项重要的发现表明这种CAR-非依赖性方法可以使改进的肿瘤对正常基因进行差向转移,由此可能改进治疗的研究。
实施例34
Ad5lucRGD的系统寻靶潜力
作为逻辑步骤的下一步,评价了Ad5lucRGD的系统寻靶潜力,所得的数据表明HI环中的RGD基序可以促进全身血管递送的感染,这是靶向腺病毒载体以前没有显示过的重要特性。
为了评价Ad5lucRGD的系统转导的性能,将该病毒与第一代腺病毒载体(AdCMVLuc)比较,后者与Ad5lucRGD相同在E1中也有CMV-驱动的荧光素酶盒,但没有RGD修饰的纤维蛋白。由同一操作者在独立的二次分开场合,对这些病毒同时进行噬斑滴定,以确保两种载体的剂量相等(以噬斑形成单位(pfu)为基础),进行比较。将二载体(109pfu)从尾侧部静脉注射C57black6小鼠中,五只小鼠/组。三天后,处死小鼠,取出器官(心脏,肺,肝,脾,肾),并作荧光素酶活力分析。每项分析中,整个器官快速冷冻,用研钵和杵碾磨,在裂解缓冲液中裂解细胞,悬浮液中的荧光素酶活力用商品试剂盒(Promega)和Berthold荧光光度计测定。数据以裂解物的蛋白含量标准化。
器官荧光素酶表达的分析揭示了与AdCMVLuc相比,Ad5lucRGD在肝,肺,脾和肾中有统计学意义的提高,最显著的发现是Ad5lucRGD的此酶表达增加了50倍(图26)。显然,这种体内高水平的增加比得上体外用这种载体所见。相反,在心脏内没见提高。两种载体转基因表达的最高水平都是在肝中发现的。肝中病毒的摄取可能与非特性和CAR特性性机理联合的循环因素有关(Zinn et al.,Gene Ther.5:798,1998)。从这一角度说,有证据表明在小鼠肝脏中的mCAR(人CAR的鼠同源物)水平(Tomko et al.,PNAS,94:3352,1997)。由于除了与整联蛋白结合的特性外,Ad5lucRGD还保持其天然的嗜性,这就不令人觉得奇怪这种载体主要由肝脏摄取。事实上,在该部位(肝)出现了Ad5lucRGD引起的荧光素酶表达中等增强。然而,重要的是肝脏表达外,每只小鼠其它器官中荧光素酶的表达率揭示了Ad5lucRGD的差异性转导作用(图27)。这种差异性表明这些发现是由两种载体不同的生物学性能引起的,而不能归因于载体制备物滴度的微小差异。因此,这些数据提供了第一手证据,证明基因修饰的腺病毒纤维可以在高度严格条件下全身性血管给药中选择性提高转基因的表达。
一些研究者发现,由于肝脏中腺病毒载体占优势的结合,故在全身给予腺病毒后,在肝脏以外的其它器官中报道基因表达的细胞定位很困难(Worgall etal.,Hum.Gene Ther.8:37,1997)。由于这个原因,在这里报道的实验中,选择了随后用光度单位测定的荧光素酶报道基因。这种技术的高灵敏度使得在器官水平可重复评价该修饰载体的转基因表达情况。为了在细胞分辨水平说明转基因的表达,在各种器官中对荧光素酶mRNA进行了原位杂交。对于这两种载体,荧光素酶mRNA可在肝细胞(大于15%的细胞用病毒剂量为109pfu)中测得,并且这两种载体之间没有明显的性质不同。用其它的细胞测定系统(如,用β-半乳糖苷酶报道物),该杂交方法的灵敏度有限意味除肝脏外其它器官中都没有测到荧光素酶mRNA的信号。所以我们相信需要进一步修饰该载体来减少肝脏中的螯合,使得用现有技术对非-肝脏的转基因表达有足够的细胞分辨率。重要的是,令人鼓舞地证明了基因改变腺病毒的纤维可以大大改进全身给药后某些非肝脏部位的转基因表达,这将提供一种刺激来(基因)工程改造附加的精品而除去天然嗜性。
这里的数据是开发靶向腺病毒载体的关键。先前没有报道过全身给药的靶向载体的性能。在本研究中,显示了在HI环中加入RGD基序改变了全身给予载体后的转基因表达分布,表明此载体这一区域是靶向基序插入的潜在理想位置,并且该载体的作用也不会受到血清因素或基序可及性受限制的损害。所以,该方法如果与进一步修饰除去天然嗜性成功结合,也许可以产生一种真正的全身途径给药的细胞-特异性受体。
本发明描述了重组腺病毒载体的产生和鉴定,该载体含有带有RGD-4C序列的纤维,此RGD-4C序列通过基因工程方法掺入到纤维结区域羧基端的HI环中。产生这种病毒是为了证明纤维结的HI环可用作掺入短肽配体的最佳部位,该短肽配体使病毒结合于配体-特异性细胞受体上,从而改变或扩大了此载体的嗜性。
细胞整联蛋白和各种含有RGD三肽的蛋白之间的相互作用是大分子间最具特征的相互作用。该作用在各种基础性生物过程中扮演重要角色,包括细胞吸附和病毒感染。从这一角度说,已显示包含RGD基序的粘附蛋白如纤连蛋白,玻连蛋白,胶原,骨桥蛋白,血小板反应蛋白,血纤蛋白原,层粘连蛋白和yon Willebrand因子因RGD基序使这些蛋白和整联蛋白分子之间发生有效和特异性的相互作用。还知道RGD基序存在于某些病毒蛋白中包括柯萨奇病毒和口蹄疫病毒的VP1蛋白,大多数已知腺病毒的五邻体碱基蛋白,非洲马病病毒和兰舌病毒的VP7蛋白,人免疫缺损病毒的Tat蛋白,和单纯疱疹病毒的糖蛋白H。在某些实例中,该三肽已证明在病毒感染过程中起着重要作用,是通过介导病毒与细胞表面的整联蛋白之间的初级和二级相互反应。另外,将含有RGD序列遗传掺入到嵌合的乙肝B病毒核心,脊髓灰质炎病毒颗粒,嗜菌体fd和人腺病毒病毒粒子中,使得这些病毒颗粒与细胞整联蛋白发生特异性相互作用,从而导致前述结构与细胞表面结合。
本发明描述了一种遗传策略来扩大重组腺病毒载体对正常细胞和难以被腺病毒感染细胞类型的嗜性。根据本文公开的发现,即位于HI环的FLAG肽的可及性定位于Ad5纤维蛋白结区域中最接近于假定的细胞结合区域的RGD-4C肽,可以使这种配体有效参与和细胞膜上整联蛋白的相互作用。用ELISA为基础的结合实验显示了纯化的整联蛋白αvβ3与纤维-RGD蛋白的RGD基序之间的直接相互作用。这一关键性发现提供了产生含有这种纤维-RGD蛋白的重组腺病毒载体Ad5lucRGD的合理性。在一些细胞系上用Ad5lucRGD产生的数据表明该病毒与含未修饰纤维的病毒相比,在基因转移分布上有显著的区别。当用CAR-阴性细胞作基因递送实验时,该区别特别显著。以放射标记的病毒体外结合细胞作为基因转移的平行实验,结果支持转基因表达效力的增加是病毒和靶细胞之间更有效的初级相互作用的结果这一概念。
为了显示新产生的病毒载体在临床基因治疗中的用途,用Ad5lucRGD将基因递送给从卵巢癌患者腹水中分离的细胞。在这模型中,Ad5lucRGD比含有非修饰纤维的对照病毒,在指导转基因表达上要高2-3个数量级。这些结果有力的表明含有插入RGD肽纤维的重组腺病毒载体也许可以大量用于以体内基因递送为基础的癌基因治疗方法上。另外,几种类型的整联蛋白在肿瘤血管系统的超量表达的凭证证明表达Ad5lucRGD治疗性基因的衍生物也许可用于通过废除它们的血供给来根除肿瘤。
为了载体重靶向成功地将RGD三肽掺入到腺病毒纤维蛋白的HI环中,意味着其它的肽配体也可以在纤维分子中起作用。从这一角度说,迅速出现的嗜菌体展示文库技术证明它可用作鉴定肽的一种手段,这些肽显示能在体内特异性结合于细胞表面的某些分子。这种高度通用的技术基础是短肽配体能使嗜菌体颗粒靶向细胞膜上先前鉴定过的或结构未知的结构。最近在体内嗜菌体生物淘选的成功有力的表明了该技术可以提供大量的用于修饰重组腺病毒载体内源嗜性的靶向肽。
虽然显示了如何将短肽掺入到纤维结的HI环中,但没有充分明确该部位的大小限制。从这一角度说,HI环结构与较大尺寸蛋白配体(如,单链抗体scFv)的相容性将显著扩大潜在靶向方法的范围。另外,将大的多肽配体掺入到HI环,该HI环与参与形成细胞结合位点的β-链H和I相连,可能造成空间位阻,这样就防碍了纤维结与CAR的直接相互作用,从而导致消除该病毒的内源嗜性。然后这将形成新一代的真正重靶向的腺病毒载体,能够通过CAR-非依赖性机制来进行细胞特殊性基因递送。
以下为本文引用的参考文献:1.Bai,et al.,1994.J.Virol.68:5925-5932.2.Bai,et al.,1993.J.Virol.67:5198-5205.3.Belin,et al.,J.Gen.Virol.74:1485-14974.Bergelson,et al.,1997.Science 275:1320-1323.5.Bout,et al.,1994.Gene Ther.1:385-394.6.Bout,et al.,1994,Hum.Gene Ther.5:3-10.7.Chartier,et al.,1996.J.Virol.70:4805-4810.8.Crompton,et al.,1994.J.Gen.Virol.75:133-139.9.Crystal,et al.,1994.Nat.Genet.8:42-51.10.Csete,et al.,1995.Transplantation 59:263-268.11.Curiel,et al.,1992.Hum.Gene Ther.3:147-154.12.DeMatteo,et al.,1995.Ann.Surg.222:229-239.13.Di Guilmi,et al.,1995.Virus Res.38:71-81.14.Douglas,et al.,1996.Nat.Biotcehnol.14:1574-1578.15.Graham,et al.,1977.J.Gen.Virol.36:59-74.16.Henry,et al.,J.Virol.68:5239-5246.17.Herz,J., & R.D.Gerard.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2812-2816.18.Hong,J.S. & J.A.Engler.1991.Virology 185:758-767.19.Hong,et al.,1997.EMBO J.16:2294-2306.20.Huang,et al.,1996.J.Virol.70:4502-4508.21.Jaffe,et al.,1992.Nat.Genet.1:372-378.22.Jolly,D.1994.Cancer Gene Ther.1:51-64.23.Koivunen,et al.,1994.Peptides in cell adhesion research,inMethods in Enzymology 245:346-369.24.Koivunen,et al.,1994.J.Cell Biol.124:373-380.25.Krasnykh,et al.,1996.J.Virol.70:6839-6846.26.Le Gal La Salle,et al.,1993.Science 259:988-990.27.Louis,et al.,1994.J.Virol.68:4104-4106.28.Maeda,et al.,1994.Gastroenterology 106:1638-1644.29.Maizel,et al.,1968.Virlolgy 36:115-125.30.Mastrangeli,et al.,1994.Am.J.Physiol.266:G1146-G1155.31.Michael,et al.,1995.Gene Ther.2:660-668.32.Mitani,1994.Hum.Gene Ther.5:941-948.33.Mittereder,et al.,1996.J.Virol.70:7498-7509.34.Novelli,A., & P.A.Boulanger.1991.Virology 185:365-376.35.Roelvink,et al.,1996.J.Virol.70:7614-762l.36.Siegfried,W.1993.Exp.Clin.Endocrinol.101:7-11.37.Stevenson,et al.,1997.J.Virol.71:4782-4790.38.Stevenson,et al.,1995.J.Virol.69:2850-2857.39.Tomko,R.P et al.,1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3352-3356.40.Trapnell,B., & M.Gorziglia.1994.Curr.Opin.Biotechnol.5:617-625.41.Varga,et al.,1991.J.Virol.65:6061-6070.42.Wickham,et al.,1995.Gene Ther.2:750-756.43.Wickham,et al.,1994.J.Cell Biol.127:257-264.44.Wickham,et al.,1993.Cell 73:309-319.45.Wickham,et al.,1996.Nat.biotechnol.14:1570-1573.46.Wickham,et al.,1996.J.Virol.70:6831-6838.47.Xia,et al.,1995.Top.Microbiol.Immunol.199:39-46.48.Xia,et al.,1994.Structure 2:1259-1270.
本说明书中提到的任何专利或出版物都表明了本领域技术人员的适合于本发明的水平。这些专利和出版物与每个独立的出版物相同程度的全内入本文作为参考。
本领域技术人员将易于领会本发明适合执行目的、获得所述结果和利益。本发明实施例和所附带的方法、流程、处理和分子仅是优选实施例的代表,是示范性的,对本发明的范围不起任何的限制作用。本领域技术人员从本发明的构思所作的任何改变和其它用途都在权利要求书中。

Claims (23)

1.一种重组腺病毒,其特征在于,该腺病毒包含了在纤维结的HI环区域被修饰的纤维基因。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒,其特征在于,该腺病毒可实现不依赖于CAR的基因转移。
3.如权利要求1所述的重组腺病毒,其特征在于,该腺病毒还含有对所述纤维结的额外修饰,从而除去所述的腺病毒的天然嗜性。
4.如权利要求1所述的重组腺病毒,其特征在于,所述修饰过的纤维结保持了其三聚化能力并保留了其天然生物合成的特性。
5.如权利要求1所述的重组腺病毒,其特征在于,所述的纤维基因的修饰是在所述的纤维结的HI环区域中引入配体。
6.如权利要求5所述的重组腺病毒,其特征在于,所述的配体选自生理配体,抗-受体抗体和细胞特异性肽。
7.如权利要求5所述的重组腺病毒,其特征在于,所述的配体包含了具有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的三肽。
8.如权利要求7所述的重组腺病毒,其特征在于,所述的配体包含了具有CDCRGDCFC序列的肽。
9.如权利要求1所述的重组腺病毒,其特征在于,编码所述腺病毒的腺病毒载体还包含治疗基因。
10.如权利要求9所述的重组腺病毒,其特征在于,所述治疗基因是单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因。
11.一种在需要这种处理的个体中杀死肿瘤细胞的方法,其特征在于,包括:给予所述个体有效量的权利要求10所述的重组腺病毒;和
用9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤处理所述的个体。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述的给药是全身的。
13.一种在需要这种处理的个体进行基因治疗的方法,其特征在于,包括以下步骤:给予所述个体有效量的权利要求9所述的重组腺病毒。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述的给药是全身的。
15.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述的个体所患的疾病选自:癌,囊性纤维化和Duchene型肌营养不良。
16.一种增加腺病毒转导细胞能力的方法,该方法包括:修饰所述腺病毒纤维结的HI环区的纤维基因。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述的纤维基因的修饰是在所述的纤维结的HI环区域中引入配体。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述的配体选自生理配体,抗-受体抗体和细胞特异性肽。
19.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述的配体包含了具有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的三肽。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述的配体包括具有CDCRGDCFC序列的肽。
21.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述的细胞是肿瘤细胞。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述的肿瘤细胞选自体外,体内和活体内。
23.如权利要求16所述的方法,其特征在于,编码所述腺病毒的腺病毒载体还包含治疗基因。
CN99804659A 1998-02-06 1999-02-05 在纤维结的hi环中含有异源肽表位的腺病毒载体 Pending CN1304316A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7394798P 1998-02-06 1998-02-06
US60/073,947 1998-02-06
US9980198P 1998-09-10 1998-09-10
US60/099,801 1998-09-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1304316A true CN1304316A (zh) 2001-07-18

Family

ID=26755086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99804659A Pending CN1304316A (zh) 1998-02-06 1999-02-05 在纤维结的hi环中含有异源肽表位的腺病毒载体

Country Status (11)

Country Link
US (1) US7297542B2 (zh)
EP (1) EP1053013A4 (zh)
JP (1) JP2002507391A (zh)
KR (1) KR20010034487A (zh)
CN (1) CN1304316A (zh)
AU (1) AU744252B2 (zh)
BR (1) BR9908613A (zh)
CA (1) CA2327545A1 (zh)
IL (1) IL137681A0 (zh)
NO (1) NO20003956L (zh)
WO (1) WO1999039734A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106714845A (zh) * 2014-08-11 2017-05-24 得克萨斯州大学系统董事会 通过crispr/cas9介导的基因编辑预防肌营养不良

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6395875B1 (en) * 1999-01-25 2002-05-28 Brookhaven Science Associates Llc Recombinant soluble adenovirus receptor
US7157266B2 (en) * 1999-01-25 2007-01-02 Brookhaven Science Associates Llc Structure of adenovirus bound to cellular receptor car
JP2003514577A (ja) * 1999-11-25 2003-04-22 トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム 改変アデノウイルス繊維および使用
DE60111733T2 (de) 2000-04-12 2006-05-18 Amersham Health As Integrinbindende peptidderivate
JP3635462B2 (ja) 2000-05-31 2005-04-06 国立医薬品食品衛生研究所長 アデノウイルスベクター
JP2003534805A (ja) 2000-05-31 2003-11-25 ユニバーシティ オブ サスカチュワン 変化した親和性を有する改変ウシアデノウイルス
NO20004795D0 (no) 2000-09-26 2000-09-26 Nycomed Imaging As Peptidbaserte forbindelser
HU230901B1 (hu) 2001-07-10 2019-01-28 Ge Healthcare Limited Peptidalapú vegyületek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
KR100491299B1 (ko) 2001-09-29 2005-05-24 학교법인연세대학교 개선된 질환 치료 효과를 갖는 재조합 아데노바이러스 및그를 포함하는 약제학적 조성물
JP2006514538A (ja) * 2002-07-10 2006-05-11 トランスジーン ソシエテ アノニム 細胞受容体への結合が除去された改変アデノウイルス繊維
WO2005027711A2 (en) * 2003-05-01 2005-03-31 University Of Washington Capsid-modified adenovirus vectors and methods of using the same
JP2007503843A (ja) 2003-05-14 2007-03-01 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー アデノウイルス親和性の拡大
US20070104732A1 (en) * 2003-10-24 2007-05-10 Bernard Massie Ligand-pseudoreceptor system for generation of adenoviral vectors with altered tropism
CA2552262C (en) 2004-02-02 2016-04-19 The University Of British Columbia Scodaphoresis and methods and apparatus for moving and concentrating particles
US8529744B2 (en) 2004-02-02 2013-09-10 Boreal Genomics Corp. Enrichment of nucleic acid targets
US10337054B2 (en) 2004-02-02 2019-07-02 Quantum-Si Incorporated Enrichment of nucleic acid targets
US7473418B2 (en) 2004-03-25 2009-01-06 Cell Genesys, Inc. Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof
DE102004021584A1 (de) * 2004-05-03 2005-12-01 Stefan Kochanek Modifizierte virale Vektorpartikel
US7776322B2 (en) 2004-08-16 2010-08-17 Stefan Kochanek Modified viral vector particles
CA2496294A1 (en) * 2005-02-07 2006-08-07 The University Of British Columbia Apparatus and methods for concentrating and separating particles such as molecules
US9868961B2 (en) 2006-03-30 2018-01-16 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for localized secretion of anti-CTLA-4 antibodies
US7919079B2 (en) 2006-03-31 2011-04-05 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Cancer immunotherapy compositions and methods of use
WO2008140474A1 (en) * 2006-10-26 2008-11-20 Johns Hopkins University Recombinant adenovirus vaccines
EP2238434A4 (en) * 2008-02-01 2011-06-22 Univ British Columbia METHODS AND APPARATUS FOR INTRODUCING AND RECOVERING PARTICLES
US8791239B2 (en) * 2008-05-04 2014-07-29 University Of Maryland, College Park Fibrous assemblies for antibody presentation, and multiplexed antigenic analysis using same
US20110256055A1 (en) 2008-12-23 2011-10-20 Ge Healthcare Limited Application of 99mtc peptide-based compound as a bone marrow imaging agent
WO2010121381A1 (en) 2009-04-21 2010-10-28 The University Of British Columbia System and methods for detection of particles
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
WO2012006145A2 (en) * 2010-06-29 2012-01-12 The Johns Hopkins University Com positions and methods for retargeting virus constructs
CA2742327A1 (en) 2011-05-20 2012-11-20 The University Of British Columiba Systems and methods for enhanced scoda
EP2798069B1 (en) * 2011-12-15 2017-03-29 Washington University Porcine knob xenotype chimeric adenoviral vector for dendritic cell infection
WO2013104994A2 (en) 2012-01-13 2013-07-18 The University Of British Columbia Multiple arm apparatus and methods for separation of particles
WO2013138505A1 (en) * 2012-03-13 2013-09-19 Salk Institute For Biological Studies Selective cell targeting using adenovirus and chemical dimers
US9512477B2 (en) 2012-05-04 2016-12-06 Boreal Genomics Inc. Biomarker anaylsis using scodaphoresis
AU2014236207B2 (en) 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
US9340835B2 (en) 2013-03-15 2016-05-17 Boreal Genomics Corp. Method for separating homoduplexed and heteroduplexed nucleic acids
CN104634978A (zh) * 2013-11-13 2015-05-20 长春百克生物科技股份公司 一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒
US11130986B2 (en) 2015-05-20 2021-09-28 Quantum-Si Incorporated Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3013639A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
CN110650745A (zh) 2016-12-21 2020-01-03 曼珍有限责任公司 武装复制型溶瘤腺病毒
PL3645551T3 (pl) 2017-06-27 2024-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zrekombinowane wektory wirusowe o zmodyfikowanym tropizmie i ich zastosowania do celowanego wprowadzania materiału genetycznego do komórek ludzkich
JP2022521268A (ja) 2019-02-21 2022-04-06 アンリーシュ イミュノ オンカリティクス,インコーポレイテッド 腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び使用法
KR20220101108A (ko) 2019-10-29 2022-07-19 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 유체의 연동 펌핑 및 연관 방법, 시스템, 및 디바이스

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9223084D0 (en) * 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
US5846782A (en) * 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
JP2001520511A (ja) * 1995-12-08 2001-10-30 ザ ユーナヴァーサティ オブ アラバマ アト バーミングハム リサーチ ファンデーション 向標的性アデノウイルス・ベクター
US6824771B1 (en) * 1999-05-12 2004-11-30 The Uab Research Foundation Infectivity-enhanced conditionally-replicative adenovirus and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106714845A (zh) * 2014-08-11 2017-05-24 得克萨斯州大学系统董事会 通过crispr/cas9介导的基因编辑预防肌营养不良

Also Published As

Publication number Publication date
IL137681A0 (en) 2001-10-31
WO1999039734A1 (en) 1999-08-12
CA2327545A1 (en) 1999-08-12
US20020081280A1 (en) 2002-06-27
JP2002507391A (ja) 2002-03-12
EP1053013A1 (en) 2000-11-22
NO20003956L (no) 2000-10-05
KR20010034487A (ko) 2001-04-25
AU744252B2 (en) 2002-02-21
EP1053013A4 (en) 2004-12-22
NO20003956D0 (no) 2000-08-04
BR9908613A (pt) 2000-10-31
AU2659599A (en) 1999-08-23
US7297542B2 (en) 2007-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1304316A (zh) 在纤维结的hi环中含有异源肽表位的腺病毒载体
CN1077919C (zh) 转染动物细胞的重组dna病毒载体
CN1115414C (zh) 用于基因治疗的病毒载体
CN1059705C (zh) 高等真核细胞中引入核酸复合物的组合物
CA2303477C (en) Chimaeric adenoviruses
JP2002507391A5 (zh)
CN1071457A (zh) 将核酸导入高等真核细胞内的结合体
CN1314948A (zh) 用于递送异源基因的定向腺病毒载体
CN1650021A (zh) 稳定的腺病毒载体及其增殖方法
CN1236390A (zh) 血管形成因子及其在治疗心血管疾病中的用途
CN1360638A (zh) 用编码腺病毒e1蛋白的序列在人体细胞中生产重组蛋白
FR2664905A1 (fr) Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus.
CN1561394A (zh) 人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林及有关蛋白的突变蛋白
CN1359391A (zh) 重组腺病毒
CN1443243A (zh) 修饰的病毒
Karayan et al. Structural and functional determinants in adenovirus type 2 penton base recombinant protein
JP2007531507A (ja) 効率的な受容体結合のための修飾型線維タンパク質
US6815200B1 (en) Modified adenovirus containing a fiber replacement protein
JP2004512015A (ja) 変異ファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子
CN1323723C (zh) Tie2受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统
CN1676166A (zh) 与人表皮生长因子受体egfr特异性结合的配体寡肽
Farinha-Arcieri et al. Expression and purification of a recombinant adenovirus fiber knob in a baculovirus system
US20020137213A1 (en) Adenovirus particles with mutagenized fiber proteins
CN1796566A (zh) 新型重组腺病毒载体骨架质粒及其用途
CN1918288A (zh) 表达sars免疫原的载体、含所述载体或其表达产物的组合物、制备和使用方法和实验

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication