JP2003514577A - 改変アデノウイルス繊維および使用 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は配列番号１の残基４９１〜５０５の間に含まれる領域の一つまたは数個の残基の変異によって改変されたアデノウイルス繊維、かかる繊維を含んでなるウイルス粒子または偽粒子、およびそれらの使用に関する。
Description
【０００１】
本発明は特にアデノウイルスの天然細胞受容体の認識およびそれとの結合に関
与する領域において変異したアデノウイルス繊維に関する。本発明はまた、かか
る繊維をその表面に持ち、所望により、改変された、あるいはターゲッティング
さえもなされたそれらの粒子および偽粒子に宿主特異性を付与するリガンドと組
み合わせたウイルス粒子、より詳しくはアデノウイルス粒子、および偽粒子に関
する。本発明は遺伝子治療プロトコールの実施の関係において使用できるベクタ
ーまたは組成物の開発に関して特に最も価値がある。
与する領域において変異したアデノウイルス繊維に関する。本発明はまた、かか
る繊維をその表面に持ち、所望により、改変された、あるいはターゲッティング
さえもなされたそれらの粒子および偽粒子に宿主特異性を付与するリガンドと組
み合わせたウイルス粒子、より詳しくはアデノウイルス粒子、および偽粒子に関
する。本発明は遺伝子治療プロトコールの実施の関係において使用できるベクタ
ーまたは組成物の開発に関して特に最も価値がある。
【０００２】
アデノウイルスは標的細胞に生体材料を導入するのに極めて効果的な天然系で
あることが以前から記載されてきた。これが今日アデノウイルスベクターが多く
の遺伝子治療の適用で広く用いられている理由である。
あることが以前から記載されてきた。これが今日アデノウイルスベクターが多く
の遺伝子治療の適用で広く用いられている理由である。
【０００３】
それらは多くの動物種で実証され、比較的病原性がなく、非組込み型であり、
しかも、分裂細胞でも休止細胞でも複製する。さらに、それらは広範な宿主域を
持ち、例えば上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞、および滑膜細胞
などの極めて多数の細胞種に感染することができる（Bramson et al., 1995, Cu
rr. Op. Biotech. 6, 590-595）。
しかも、分裂細胞でも休止細胞でも複製する。さらに、それらは広範な宿主域を
持ち、例えば上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞、および滑膜細胞
などの極めて多数の細胞種に感染することができる（Bramson et al., 1995, Cu
rr. Op. Biotech. 6, 590-595）。
【０００４】
アデノウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子のフレーム
となる２つの逆方向反復領域（逆方向末端反復配列(Inverted Terminal Repeat)
としてＩＴＲで示される）を含むおよそ３６ｋＤの二本鎖直鎖ＤＮＡ分子からな
る。初期遺伝子はアデノウイルスゲノムに散在する４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４：Ｅ
はearly）に分かれ、それら固有のプロモーターとともに提供される６つの転写
単位を含む。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５：Ｌはlate）は一部、初期転写単位にわた
り、主として主要後期プロモーターＭＬＰから転写される。
となる２つの逆方向反復領域（逆方向末端反復配列(Inverted Terminal Repeat)
としてＩＴＲで示される）を含むおよそ３６ｋＤの二本鎖直鎖ＤＮＡ分子からな
る。初期遺伝子はアデノウイルスゲノムに散在する４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４：Ｅ
はearly）に分かれ、それら固有のプロモーターとともに提供される６つの転写
単位を含む。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５：Ｌはlate）は一部、初期転写単位にわた
り、主として主要後期プロモーターＭＬＰから転写される。
【０００５】
アデノウイルス細胞内感染周期は十分文献に記載され、下記の二段階の必須工
程に基づく： （ｉ）初期：複製の開始が進み、ウイルスＤＮＡの複製および転写を調節する
初期タンパク質が産生する。 （ii）後期：ゲノムの複製が続き、この間、アデノウイルス粒子（またはキャ
プシド）を基本とする構造タンパク質が合成される。
程に基づく： （ｉ）初期：複製の開始が進み、ウイルスＤＮＡの複製および転写を調節する
初期タンパク質が産生する。 （ii）後期：ゲノムの複製が続き、この間、アデノウイルス粒子（またはキャ
プシド）を基本とする構造タンパク質が合成される。
【０００６】
次ぎに核内で新しいウイルスの構築が起こるが、まず、二十面体構造のエンプ
ティーキャプシドを形成するようにウイルス粒子が構築され、新たに形成された
ゲノムが内包される。その後放出されるアデノウイルスは他の許容細胞に感染力
を持つ。
ティーキャプシドを形成するようにウイルス粒子が構築され、新たに形成された
ゲノムが内包される。その後放出されるアデノウイルスは他の許容細胞に感染力
を持つ。
【０００７】
さらに詳しくは、感染の際、アデノウイルスはエンドサイトーシスのプロセス
を経て細胞へと透過するが、これは許容細胞の表面に存在する特異的な受容体に
アデノウイルス粒子が付着した後に起こる。この過程でアデノウイルス粒子の表
面に存在する繊維およびペントンベースがウイルスの細胞付着およびそれらのイ
ンターナリゼーションに不可欠な役割を果たす(Wickham et al., 1993, Cell, 7
3, 309-319)。特にアデノウイルスは三量体型の繊維を介して許容細胞の表面に
存在する細胞受容体（特にＣＡＲ）に結合し(Philipson et al., 1968, J. Viol
. 2, 1064-1075; Defer et al., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673)、その後、ペ
ントンベースの、αＶβ３およびαＶβ５細胞インテグリンへの結合を介したエ
ンドサイトーシスによりウイルス粒子がインターナライズされる(Mathias et al
., 1994, J. Viol. 68, 6811-6814)。
を経て細胞へと透過するが、これは許容細胞の表面に存在する特異的な受容体に
アデノウイルス粒子が付着した後に起こる。この過程でアデノウイルス粒子の表
面に存在する繊維およびペントンベースがウイルスの細胞付着およびそれらのイ
ンターナリゼーションに不可欠な役割を果たす(Wickham et al., 1993, Cell, 7
3, 309-319)。特にアデノウイルスは三量体型の繊維を介して許容細胞の表面に
存在する細胞受容体（特にＣＡＲ）に結合し(Philipson et al., 1968, J. Viol
. 2, 1064-1075; Defer et al., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673)、その後、ペ
ントンベースの、αＶβ３およびαＶβ５細胞インテグリンへの結合を介したエ
ンドサイトーシスによりウイルス粒子がインターナライズされる(Mathias et al
., 1994, J. Viol. 68, 6811-6814)。
【０００８】
アデノウイルスが細胞へ透過しなければならないこの自然の能力は、細胞への
高分子の輸送を可能にするために広く利用されている(Otero et al., 1987, Vio
logy, 160, 75-80; Fitzgerald et al., 1983, Cell, 32, 607-617: Seth et al
., 1984, Mol. Cell Biol., 4, 1528-1533; Defer et al., 1990, J. Viol., 64
, 3661-3673; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252, 431-434; Curiel et al
., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 8850-8854; Rosenfeld et al., 1992,
Cell, 68, 143-155; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 258
1-2584; Curiel et al., 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154)。
高分子の輸送を可能にするために広く利用されている(Otero et al., 1987, Vio
logy, 160, 75-80; Fitzgerald et al., 1983, Cell, 32, 607-617: Seth et al
., 1984, Mol. Cell Biol., 4, 1528-1533; Defer et al., 1990, J. Viol., 64
, 3661-3673; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252, 431-434; Curiel et al
., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 8850-8854; Rosenfeld et al., 1992,
Cell, 68, 143-155; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 258
1-2584; Curiel et al., 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154)。
【０００９】
例えば、アデノウイルスゲノム自体好ましくは目的の異種核酸配列をまた含ん
でなるもの（組換えアデノウイルス）の導入の他、in vitroおよびin vivoで、
所望により、アデノウイルス感染を中和する抗体(Michael et al., 1993, J. Bi
ol. Chem., 268, 6866-6869)、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）の存在下、
あるいは所望により陽イオン脂質などの陽イオン化合物（米国特許第５，９２８
，９４４号；特許出願ＷＯ９５／２１２５９）の存在下で、例えばデキストラン
(Otero et al., 1987, Virology, 160, 75-80)、タンパク質(Carrasco et al.,
1981, Virology, 113, 623-629; Fitzgerald et al., 1983, Cell, 32, 607-617
; Defer et al., 1990, J. Viol., 64, 3661-3673)、リガンドと会合したプラス
ミドＤＮＡ(Curiel et al., 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154; Cotton et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6094-6098)などの非ウイルス起源の
高分子の導入を促進することができる。このように、in vitroプラスミドトラン
スフェクションプロトコールに関してアデノウイルス粒子を用いると、トランス
フェクション効率が１００〜１０００倍高高めることができることが示されてい
る。上記の公報および特許出願の内容は引用することによりそのまま本願の一部
とされる。
でなるもの（組換えアデノウイルス）の導入の他、in vitroおよびin vivoで、
所望により、アデノウイルス感染を中和する抗体(Michael et al., 1993, J. Bi
ol. Chem., 268, 6866-6869)、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）の存在下、
あるいは所望により陽イオン脂質などの陽イオン化合物（米国特許第５，９２８
，９４４号；特許出願ＷＯ９５／２１２５９）の存在下で、例えばデキストラン
(Otero et al., 1987, Virology, 160, 75-80)、タンパク質(Carrasco et al.,
1981, Virology, 113, 623-629; Fitzgerald et al., 1983, Cell, 32, 607-617
; Defer et al., 1990, J. Viol., 64, 3661-3673)、リガンドと会合したプラス
ミドＤＮＡ(Curiel et al., 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154; Cotton et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6094-6098)などの非ウイルス起源の
高分子の導入を促進することができる。このように、in vitroプラスミドトラン
スフェクションプロトコールに関してアデノウイルス粒子を用いると、トランス
フェクション効率が１００〜１０００倍高高めることができることが示されてい
る。上記の公報および特許出願の内容は引用することによりそのまま本願の一部
とされる。
【００１０】
アデノウイルスは多くの研究の課題であり、いくつかの科学者チームも複製欠
陥型の、すなわち、これらのアデノウイルスベクターがそれらが感染した細胞で
分裂または増殖することができないようにゲノムが操作されているアデノウイル
スベクターを開発している。欠陥アデノウイルスベクターは特にＥ１領域の少な
くとも一部を欠失させることにより得られる（欠陥アデノウイルスベクターの例
としては、特に特許出願ＷＯ９４／２８１５２およびＷＯ９４／１２６４９を参
照）。
陥型の、すなわち、これらのアデノウイルスベクターがそれらが感染した細胞で
分裂または増殖することができないようにゲノムが操作されているアデノウイル
スベクターを開発している。欠陥アデノウイルスベクターは特にＥ１領域の少な
くとも一部を欠失させることにより得られる（欠陥アデノウイルスベクターの例
としては、特に特許出願ＷＯ９４／２８１５２およびＷＯ９４／１２６４９を参
照）。
【００１１】
アデノウイルス繊維は３つの異なるドメインからなる(Chroboczek et al., 19
95, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200)： （ａ）テールであるＮ末端においては、その配列があるアデノウイルス血清型
から他の血清型まで極めて保存されている。ペントンベースと相互作用し、キャ
プシドの分子の固定を確保する。 （ｂ）シャフトである中央部においては、特定の数のシート反復配列からなる
ロッド様構造であり、その数は検討中の血清型によって異なる。 （ｃ）ヘッドであるＣ末端においては、三量体化シグナルを含む球形構造を有
し(Hong and Engler, 1996, J. Virol, 70, 7071-7078; Novelli and Boulanger
, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303; Novelli and Boulanger, 1991, Viro
logy 185, 365-376)、許容細胞との結合の一端を担う(Henry et al., 1994, J.
Virol. 68, 5239-5246; Louis et al., J. Virol. 68, 4104-4106)。
95, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200)： （ａ）テールであるＮ末端においては、その配列があるアデノウイルス血清型
から他の血清型まで極めて保存されている。ペントンベースと相互作用し、キャ
プシドの分子の固定を確保する。 （ｂ）シャフトである中央部においては、特定の数のシート反復配列からなる
ロッド様構造であり、その数は検討中の血清型によって異なる。 （ｃ）ヘッドであるＣ末端においては、三量体化シグナルを含む球形構造を有
し(Hong and Engler, 1996, J. Virol, 70, 7071-7078; Novelli and Boulanger
, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303; Novelli and Boulanger, 1991, Viro
logy 185, 365-376)、許容細胞との結合の一端を担う(Henry et al., 1994, J.
Virol. 68, 5239-5246; Louis et al., J. Virol. 68, 4104-4106)。
【００１２】
また、Xia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270)は、アデノウイルスノブ
ウイルスの三次元結晶学的構造を決定した。各単量体はＡ〜ＤおよびＧ〜Ｊで表
される８個の非平衡シートと、８〜５５残基の６つの主要なループを含んでなる
。例えば、ループＣでゃシートＣとシートＤを連結したものである。補助的なシ
ートＥとＦはシートＤとＧの間にあるループＤＧの一部を形成すると考えられる
ことが表示されている。つまり、表１は配列番号１で示されるＡｄ５繊維のアミ
ノ酸配列におけるこれらの構造の位置を示しており、＋１は最初のＭｅｔ残基を
表す。一般に、シートは組織化したコンパクトな構造を形成し、ループはもっと
柔軟である。これらの用語はタンパク質生化学の分野では一般的であり、基本的
な研究の中で定義されている（例えば、Stryer, Biochemistry, 2nd edition, C
hap. 2, pp. 11-39, Ed Freeman and Company, San Francisco参照）。
ウイルスの三次元結晶学的構造を決定した。各単量体はＡ〜ＤおよびＧ〜Ｊで表
される８個の非平衡シートと、８〜５５残基の６つの主要なループを含んでなる
。例えば、ループＣでゃシートＣとシートＤを連結したものである。補助的なシ
ートＥとＦはシートＤとＧの間にあるループＤＧの一部を形成すると考えられる
ことが表示されている。つまり、表１は配列番号１で示されるＡｄ５繊維のアミ
ノ酸配列におけるこれらの構造の位置を示しており、＋１は最初のＭｅｔ残基を
表す。一般に、シートは組織化したコンパクトな構造を形成し、ループはもっと
柔軟である。これらの用語はタンパク質生化学の分野では一般的であり、基本的
な研究の中で定義されている（例えば、Stryer, Biochemistry, 2nd edition, C
hap. 2, pp. 11-39, Ed Freeman and Company, San Francisco参照）。
【００１３】
【表１】
【００１４】
４つのシートＡ、Ｂ、ＣおよびＪはウイルス粒子に向かったＶシートをなす。
他の４つの（Ｄ、Ｇ、ＨおよびＩ）はＲシートを形成するが、これは細胞受容体
に面していると推測される。Ｖシートはこの構造の三量体化に重要な役割を果た
すと考えられるが、Ｒシートはその受容体との相互作用に関与すると考えられる
。
他の４つの（Ｄ、Ｇ、ＨおよびＩ）はＲシートを形成するが、これは細胞受容体
に面していると推測される。Ｖシートはこの構造の三量体化に重要な役割を果た
すと考えられるが、Ｒシートはその受容体との相互作用に関与すると考えられる
。
【００１５】
いくつかのチームがすでに、天然繊維がそれらの天然の向性を改変するよう変
異され、異なる細胞受容体を認識するようにこの繊維の結合の特異性を変化させ
たアデノウイルス粒子を記載している。
異され、異なる細胞受容体を認識するようにこの繊維の結合の特異性を変化させ
たアデノウイルス粒子を記載している。
【００１６】
このように、ＷＯ９４／１０３２３では、その繊維が、シャフトの２２の反復
単位の一つの末端に挿入されたある抗原（ｓｃＦｖ型のもの）に特異的な抗体の
フラグメントの配列を含んでなるように変異させた５型アデノウイルス（Ａｄ５
）粒子が記載されている。このように変異させたアデノウイルス粒子の感染の特
異性は、産生したアデノウイルスが標的抗原を示す細胞に付着できるように改変
されている。
単位の一つの末端に挿入されたある抗原（ｓｃＦｖ型のもの）に特異的な抗体の
フラグメントの配列を含んでなるように変異させた５型アデノウイルス（Ａｄ５
）粒子が記載されている。このように変異させたアデノウイルス粒子の感染の特
異性は、産生したアデノウイルスが標的抗原を示す細胞に付着できるように改変
されている。
【００１７】
米国特許第５，５４３，３２８号では、ノブドメインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ
）の配列、またはＡｐｏＥペプチドのもので置き換えられ、それぞれＴＮＦの細
胞受容体またはＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体を発現する細胞へ改変さ
れたアデノウイルス粒子を付着するように再び命令するようになったキメラアデ
ノウイルス繊維が記載されている。
）の配列、またはＡｐｏＥペプチドのもので置き換えられ、それぞれＴＮＦの細
胞受容体またはＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体を発現する細胞へ改変さ
れたアデノウイルス粒子を付着するように再び命令するようになったキメラアデ
ノウイルス繊維が記載されている。
【００１８】
ＷＯ９５／２６４１２では、Ｃ末端にリガンドを組み込むことにより改変され
た繊維が記載されている。
た繊維が記載されている。
【００１９】
ＷＯ９６／２６２８１では、天然繊維の一部、特にノブを、別の血清型由来の
アデノウイルス繊維の同等の部分で置き換え、さらに所望によりそのＣ末端にビ
トロネクチン特異的ＲＧＤペプチドを挿入することで得られるキメラ繊維が記載
されている。
アデノウイルス繊維の同等の部分で置き換え、さらに所望によりそのＣ末端にビ
トロネクチン特異的ＲＧＤペプチドを挿入することで得られるキメラ繊維が記載
されている。
【００２０】
さらに、フランス特許出願ＦＲ２，７５８，８２１（９７ ０１００５）はそ
れぞれアデノウイルスの主要受容体および補因子としてのクラスＩ主要組織適合
性複合体抗体の役割、およびフィブロネクチンモジュールIIIの役割を実証して
いる。
れぞれアデノウイルスの主要受容体および補因子としてのクラスＩ主要組織適合
性複合体抗体の役割、およびフィブロネクチンモジュールIIIの役割を実証して
いる。
【００２１】
Tomko et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 3352-3356)、Bergelson e
t al. (1997, Science 275, 1320-1323)およびRoelvink et al. (1998, J. Viro
l. 72, 7909-7915)は種々のアデノウイルス血清型の別の受容体を記載している
。これは４６ｋＤａの表面分子ＣＡＲ（コクサッキーおよびアデノウイルス受容
体）である。
t al. (1997, Science 275, 1320-1323)およびRoelvink et al. (1998, J. Viro
l. 72, 7909-7915)は種々のアデノウイルス血清型の別の受容体を記載している
。これは４６ｋＤａの表面分子ＣＡＲ（コクサッキーおよびアデノウイルス受容
体）である。
【００２２】
その内容が引用することにより本願の一部とされる出願ＷＯ９８／４４１２１
において、本願の発明者らはすでに、価値があり、より詳しくはループＣＤから
シートＩにわたるドメインに作用する、さらに特には５型アデノウイルス（Ａｄ
５）繊維（配列番号１）の残基４４１〜５５７および２型アデノウイルス（Ａｄ
２）繊維の残基４４１〜５５８にわたるアデノウイルス繊維の改変を記載してい
る。発明者らはさらに、好ましくは領域内において、ループＣＤ、シートＤおよ
びループＤＧの隣接部分（Ａｄ２およびＡｄ５の繊維の４４１〜４７８番）、さ
らに詳しくはＡｄ５に関しては残基４４３〜４６２に、またはＡｄ２の場合には
４５１〜４６６にわたる領域を含んでなる部分を改変するのが有利であることを
示した。
において、本願の発明者らはすでに、価値があり、より詳しくはループＣＤから
シートＩにわたるドメインに作用する、さらに特には５型アデノウイルス（Ａｄ
５）繊維（配列番号１）の残基４４１〜５５７および２型アデノウイルス（Ａｄ
２）繊維の残基４４１〜５５８にわたるアデノウイルス繊維の改変を記載してい
る。発明者らはさらに、好ましくは領域内において、ループＣＤ、シートＤおよ
びループＤＧの隣接部分（Ａｄ２およびＡｄ５の繊維の４４１〜４７８番）、さ
らに詳しくはＡｄ５に関しては残基４４３〜４６２に、またはＡｄ２の場合には
４５１〜４６６にわたる領域を含んでなる部分を改変するのが有利であることを
示した。
【００２３】
さらに詳しくは、発明者らは以下により得られたＡｄ５繊維変異体の利点も記
載している。
載している。
【００２４】
（ｉ）これらの領域における一以上のアミノ酸の置換による。この置換は特に
以下の群： ４４３番のグリシン残基のアスパラギン酸での置換、 ４４４番のセリン残基のリジンでの置換、 ４４５番のロイシン残基のフェニルアラニンでの置換、 ４４６番のアラニン残基のトレオニンでの置換、 ４４９番のセリン残基のアスパラギン酸での置換、 ４５０番のグリシン残基のアスパラギンまたはリジンでの置換、 ４５１番のトレオニン残基のリジンまたはロイシンでの置換、 ４５２番のバリン残基のアスパラギンまたはトレオニンでの置換、 ４５５番のアラニン残基のフェニルアラニンでの置換、 ４５７番のロイシン残基のアラニンでの置換、 ４５９番のイソロイシン残基のアラニンでの置換 から選択され得る。 および／または （ii）その繊維ドメインの総てまたは一部の欠失、特にループＣＤの欠失、シ
ートＤの欠失、かつ／またはループＤＧの欠失、好ましくは ４５４番のセリンから４６１番のフェニルアラニンまでにわたる領域の欠失、 ４４１番のバリンから４５３番のグルタミンまでにわたる領域の欠失、または ４４１番のバリンから４６１番のフェニルアラニンまでにわたる領域の欠失 から選択される欠失による。
以下の群： ４４３番のグリシン残基のアスパラギン酸での置換、 ４４４番のセリン残基のリジンでの置換、 ４４５番のロイシン残基のフェニルアラニンでの置換、 ４４６番のアラニン残基のトレオニンでの置換、 ４４９番のセリン残基のアスパラギン酸での置換、 ４５０番のグリシン残基のアスパラギンまたはリジンでの置換、 ４５１番のトレオニン残基のリジンまたはロイシンでの置換、 ４５２番のバリン残基のアスパラギンまたはトレオニンでの置換、 ４５５番のアラニン残基のフェニルアラニンでの置換、 ４５７番のロイシン残基のアラニンでの置換、 ４５９番のイソロイシン残基のアラニンでの置換 から選択され得る。 および／または （ii）その繊維ドメインの総てまたは一部の欠失、特にループＣＤの欠失、シ
ートＤの欠失、かつ／またはループＤＧの欠失、好ましくは ４５４番のセリンから４６１番のフェニルアラニンまでにわたる領域の欠失、 ４４１番のバリンから４５３番のグルタミンまでにわたる領域の欠失、または ４４１番のバリンから４６１番のフェニルアラニンまでにわたる領域の欠失 から選択される欠失による。
【００２５】
同様に、本願の発明者らはこれまでに、ループＡＢを含んでシートＡからシー
トＢにわたる繊維領域に含まれる一以上の残基の少なくとも一つの変異を含んで
なる改変アデノウイルス繊維によって提供される利点を実証している（フランス
優先権９９／１０８５９から利益を受ける特許出願を参照）。さらに詳しくは、
ループＡＢに含まれる、特に残基４００〜４２８の間、さらに詳しくはＡｄ５繊
維（またはＡｄ２繊維の配列において定義される同等物）を表す配列番号１の残
基４０４〜４１８の間、好ましくは残基４０４〜４０８の間に含まれる一以上の
残基にある変異が提案される。好ましい例では、変異残基は４０４番のトレオニ
ン残基、４０６番のアラニン残基および４０８番のセリン残基から選択される。
特定の場合では、作出された変異は以下の置換： ４０８番のセリン残基の、少なくとも二つのカルボキシル基を有する残基、特
にアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される残基での置換、 ４０４番のトレオニン残基のグリシン残基での置換、 ４０６番のアラニン残基のリジン残基での置換 から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換からなる。
トＢにわたる繊維領域に含まれる一以上の残基の少なくとも一つの変異を含んで
なる改変アデノウイルス繊維によって提供される利点を実証している（フランス
優先権９９／１０８５９から利益を受ける特許出願を参照）。さらに詳しくは、
ループＡＢに含まれる、特に残基４００〜４２８の間、さらに詳しくはＡｄ５繊
維（またはＡｄ２繊維の配列において定義される同等物）を表す配列番号１の残
基４０４〜４１８の間、好ましくは残基４０４〜４０８の間に含まれる一以上の
残基にある変異が提案される。好ましい例では、変異残基は４０４番のトレオニ
ン残基、４０６番のアラニン残基および４０８番のセリン残基から選択される。
特定の場合では、作出された変異は以下の置換： ４０８番のセリン残基の、少なくとも二つのカルボキシル基を有する残基、特
にアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される残基での置換、 ４０４番のトレオニン残基のグリシン残基での置換、 ４０６番のアラニン残基のリジン残基での置換 から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換からなる。
【００２６】
本発明の発明者らによってこれまでになされ、その内容が引用することにより
本発明の一部とされるこれら２つの発明では、アデノウイルス繊維領域を、また
アデノウイルスの天然型細胞受容体との結合を阻害または回避する利点を有する
、これらの領域において同定された変異体が記載されている。
本発明の一部とされるこれら２つの発明では、アデノウイルス繊維領域を、また
アデノウイルスの天然型細胞受容体との結合を阻害または回避する利点を有する
、これらの領域において同定された変異体が記載されている。
【００２７】
本発明者らはこれまでのところ、改変、特に残基４９１〜５０５の間のアデノ
ウイルス繊維領域の一以上の残基の置換または欠失からなる新規な変異体を同定
し、かかる改変型繊維を有するアデノウイルス粒子の通常の許容細胞に対する感
染力を阻害または回避することを目的としたそれらの価値を示した。本発明の目
的は特に、用いるアデノウイルス粒子の治療的量を少なくし、治療する細胞に対
する感染をテーゲッティングすることを可能にする新規な代替法を提供すること
にある。この特異性は、細胞傷害性遺伝子を発現するアデノウイルス粒子を用い
る場合に健常な細胞への細胞傷害作用の伝播を避ける上で特に有利なものとなる
。本発明により提供される利点は、主としてアデノウイルス技術と結びついた蔓
延や副作用のリスクの軽減に関するものである。また、本発明の開示により、ウ
イルスベクター、特に組換えウイルスベクター、または非ウイルスベクターの投
与による治療法の開発を意図したその他のターゲッティング系を設定することも
可能となる。
ウイルス繊維領域の一以上の残基の置換または欠失からなる新規な変異体を同定
し、かかる改変型繊維を有するアデノウイルス粒子の通常の許容細胞に対する感
染力を阻害または回避することを目的としたそれらの価値を示した。本発明の目
的は特に、用いるアデノウイルス粒子の治療的量を少なくし、治療する細胞に対
する感染をテーゲッティングすることを可能にする新規な代替法を提供すること
にある。この特異性は、細胞傷害性遺伝子を発現するアデノウイルス粒子を用い
る場合に健常な細胞への細胞傷害作用の伝播を避ける上で特に有利なものとなる
。本発明により提供される利点は、主としてアデノウイルス技術と結びついた蔓
延や副作用のリスクの軽減に関するものである。また、本発明の開示により、ウ
イルスベクター、特に組換えウイルスベクター、または非ウイルスベクターの投
与による治療法の開発を意図したその他のターゲッティング系を設定することも
可能となる。
【００２８】
これらアデノウイルス繊維の新規な変異体によって、以下の特性を有するウイ
ルス粒子を生産することが可能となる。
ルス粒子を生産することが可能となる。
【００２９】
（ｉ）このような変異型繊維を含んでなるウイルス粒子は天然アデノウイルス
細胞受容体に実質的に付着せず、すなわち、変異型繊維を有するこれらのウイル
ス粒子の宿主特異性は、野生型繊維、すなわち非変異型繊維を有するウイルス粒
子の宿主特異性に比べて低いか、あるいは阻害的でさえある。
細胞受容体に実質的に付着せず、すなわち、変異型繊維を有するこれらのウイル
ス粒子の宿主特異性は、野生型繊維、すなわち非変異型繊維を有するウイルス粒
子の宿主特異性に比べて低いか、あるいは阻害的でさえある。
【００３０】
（ii）このような変異型繊維を含んでなるウイルス粒子がアンチリガンド特異
的なリガンドもまた含んでなる場合には、非変異型ウイルス粒子に比べて、改変
型粒子に、それらの表面にアンチリガンドを有する一以上の特異的細胞種に対す
る新たな向性を付与することができる。
的なリガンドもまた含んでなる場合には、非変異型ウイルス粒子に比べて、改変
型粒子に、それらの表面にアンチリガンドを有する一以上の特異的細胞種に対す
る新たな向性を付与することができる。
【００３１】
これらアデノウイルス繊維の新規な変異体はまた、偽粒子、特に下記のような
ウイルスまたは合成偽粒子を生産することも可能とする。
ウイルスまたは合成偽粒子を生産することも可能とする。
【００３２】
「変異型繊維は天然型細胞受容体とは実質的に付着しない」とは、繊維が天然
型細胞受容体と結合する能力を低下または破壊するように改変されていることを
示すものとする。かかる特性は、当業者に公知の技術を適用することで、特に野
生型アデノウイルス繊維の総てまたは一部からなる競合物の存在下で行われる、
改変型繊維を有するウイルスに関する感染競合実験を通じて相当するウイルス粒
子の感染力または細胞結合性を調べることにより確認することができる（この測
定に関するより詳細なことは本願の実験の節を参照）。天然型の特性の欠如はま
た、標識ウイルス（例えば、Roelvink et al., 1996, J. Viol. 70, 7614-7621
の技術に従って３Ｈ−チミジンで標識）の存在下で行う細胞付着試験によって、
あるいは許容細胞、すなわちリガンドによりテーゲッティングされる表面分子を
発現する細胞の感染力試験（下記実施例参照）によって評価することもできる。
有利には、「変異型繊維は天然型細胞受容体とは実質的に付着しない」とは、下
記の実施例で開示されるような競合試験を用いて測定した残存感染率がおよそ０
〜６０％の間、好ましくは０〜４０％の間、もっぱら好ましくは０〜２０％の間
である。また、有利な具体例によれば、変異型アデノウイルス繊維の三量体化の
特性やペントンベースとの結合の特性は影響を及ぼさない。これらの特性は以下
の実施例で用いられる技術によって容易に確認される。
型細胞受容体と結合する能力を低下または破壊するように改変されていることを
示すものとする。かかる特性は、当業者に公知の技術を適用することで、特に野
生型アデノウイルス繊維の総てまたは一部からなる競合物の存在下で行われる、
改変型繊維を有するウイルスに関する感染競合実験を通じて相当するウイルス粒
子の感染力または細胞結合性を調べることにより確認することができる（この測
定に関するより詳細なことは本願の実験の節を参照）。天然型の特性の欠如はま
た、標識ウイルス（例えば、Roelvink et al., 1996, J. Viol. 70, 7614-7621
の技術に従って３Ｈ−チミジンで標識）の存在下で行う細胞付着試験によって、
あるいは許容細胞、すなわちリガンドによりテーゲッティングされる表面分子を
発現する細胞の感染力試験（下記実施例参照）によって評価することもできる。
有利には、「変異型繊維は天然型細胞受容体とは実質的に付着しない」とは、下
記の実施例で開示されるような競合試験を用いて測定した残存感染率がおよそ０
〜６０％の間、好ましくは０〜４０％の間、もっぱら好ましくは０〜２０％の間
である。また、有利な具体例によれば、変異型アデノウイルス繊維の三量体化の
特性やペントンベースとの結合の特性は影響を及ぼさない。これらの特性は以下
の実施例で用いられる技術によって容易に確認される。
【００３３】
本発明において「残基」および「アミノ酸」は同義語である。「シート」およ
び「ループ」はXia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270)によって定義され
ている。「ウイルス」および「アデノウイルス」はそれぞれ「ウイルス粒子」お
よび「アデノウイルス粒子」と同義語である。「粒子」とは、高分子（特に、ウ
イルスゲノム、デキストラン、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡなど））を含み得るキャプシドからなるように構成された、ペプ
チドおよび／または脂質を含んでなる構造を表すものとする。「ウイルス偽粒子
」または「アデノウイルス偽粒子」とは、それぞれいずれのウイルスまたはアデ
ノウイルスゲノムも含まないウイルスまたはアデノウイルス粒子（非ウイルスま
たは非アデノウイルスゲノムの存在は排除するものではない）を表すものとし、
特定の場合に、ゲノムが存在しない「エンプティー」粒子も挙げられる。あるい
は、「非ウイルス偽粒子」とは、例えばペプチドまたは糖タンパク質のアミノ末
端またはカルボキシ末端タンパク質配列の脂質との会合によって作製された人工
粒子を表す。かかる改変脂質は次ぎにリポソーム型構造に組み込まれる。このよ
うな技術は当業者に十分公知であり、例えばインフルエンザウイルスの表面糖タ
ンパク質を有するリポソームを作製するためにすでに応用されている(Tikchonen
ko et al., 1988, Gene, 63, 321-330)。これらのリポソーム偽粒子は標的細胞
の輸送する高分子、特に核酸ももちろん含んでもよい。「変異」とは、一以上の
残基の欠失、置換または付加、あるいはこれらの可能性の組合せを表すものとす
る。その他の特定の場合では、かかる「変異」はまた少なくとも一つの残基の修
飾、特に化学的修飾からなってもよい。かかる修飾は特にエステル化、アルキル
化、ＰＥＧ化、ヒドロキシアルキル化などからなる。
び「ループ」はXia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270)によって定義され
ている。「ウイルス」および「アデノウイルス」はそれぞれ「ウイルス粒子」お
よび「アデノウイルス粒子」と同義語である。「粒子」とは、高分子（特に、ウ
イルスゲノム、デキストラン、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡなど））を含み得るキャプシドからなるように構成された、ペプ
チドおよび／または脂質を含んでなる構造を表すものとする。「ウイルス偽粒子
」または「アデノウイルス偽粒子」とは、それぞれいずれのウイルスまたはアデ
ノウイルスゲノムも含まないウイルスまたはアデノウイルス粒子（非ウイルスま
たは非アデノウイルスゲノムの存在は排除するものではない）を表すものとし、
特定の場合に、ゲノムが存在しない「エンプティー」粒子も挙げられる。あるい
は、「非ウイルス偽粒子」とは、例えばペプチドまたは糖タンパク質のアミノ末
端またはカルボキシ末端タンパク質配列の脂質との会合によって作製された人工
粒子を表す。かかる改変脂質は次ぎにリポソーム型構造に組み込まれる。このよ
うな技術は当業者に十分公知であり、例えばインフルエンザウイルスの表面糖タ
ンパク質を有するリポソームを作製するためにすでに応用されている(Tikchonen
ko et al., 1988, Gene, 63, 321-330)。これらのリポソーム偽粒子は標的細胞
の輸送する高分子、特に核酸ももちろん含んでもよい。「変異」とは、一以上の
残基の欠失、置換または付加、あるいはこれらの可能性の組合せを表すものとす
る。その他の特定の場合では、かかる「変異」はまた少なくとも一つの残基の修
飾、特に化学的修飾からなってもよい。かかる修飾は特にエステル化、アルキル
化、ＰＥＧ化、ヒドロキシアルキル化などからなる。
【００３４】
「核酸配列」とは、正確な一連のヌクレオチドを表すＤＮＡおよび／またはＲ
ＮＡおよび／またはＰＮＡの合成または単離された天然の直鎖または環状、二本
鎖または一本鎖断片を表すものとし、改変されていても改変されていなくともよ
く、大きさの制限なく核酸の断片または領域を定義することが可能なものである
。好ましい具体例によれば、それはｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡおよびウイルスゲノムからなる群から選択される核酸
である。
ＮＡおよび／またはＰＮＡの合成または単離された天然の直鎖または環状、二本
鎖または一本鎖断片を表すものとし、改変されていても改変されていなくともよ
く、大きさの制限なく核酸の断片または領域を定義することが可能なものである
。好ましい具体例によれば、それはｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡおよびウイルスゲノムからなる群から選択される核酸
である。
【００３５】
アミノ酸配列の「一部」とは、最低６個、好ましくは１０個、より好ましくは
１５個、いっそう好ましくは２０個、最も好ましくは３０個の連続するアミノ酸
を含んでなり、かつ／またはその部分が由来する配列と同じ生物活性、特にウイ
ルスの標的細胞を認識し、それと結合する能力を有するアミノ酸配列を意味する
ものとする。
１５個、いっそう好ましくは２０個、最も好ましくは３０個の連続するアミノ酸
を含んでなり、かつ／またはその部分が由来する配列と同じ生物活性、特にウイ
ルスの標的細胞を認識し、それと結合する能力を有するアミノ酸配列を意味する
ものとする。
【００３６】
核酸配列の「一部」とは、最低１８個、好ましくは３０個、より好ましくは４
５個、いっそう好ましくは６０個、最も好ましくは９０個の連続するヌクレオチ
ドを含んでなり、かつ／またはその部分が由来する核酸配列によりコードされて
いるアミノ酸配列と同じ生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を
意味するものとする。
５個、いっそう好ましくは６０個、最も好ましくは９０個の連続するヌクレオチ
ドを含んでなり、かつ／またはその部分が由来する核酸配列によりコードされて
いるアミノ酸配列と同じ生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を
意味するものとする。
【００３７】
「in vivoでその遺伝子を確実に発現させるエレメント」とは、標的細胞に導
入された後、その遺伝子を確実に発現させるのに必要なエレメントを表すものと
する。これらには特にその細胞で有効なプロモーター配列および／または調節配
列、および所望により標的細胞の表面でそのポリペプチドを発現させるのに必要
な配列がある。用いるプロモーターはウイルスプロモーター、偏在性プロモータ
ーまたは組織特異的プロモーター、あるいは合成プロモーターであってよい。例
としては、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０（シミアンウイ
ルス）もしくはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、またはワクシニアウイルスの
プロモーター、あるいは筋クレアチンキナーゼ、アクチンまたは肺サーファクタ
ントをコードする遺伝子のプロモーターなどのプロモーターが挙げられる。ある
細胞種に特異的なプロモーター配列、または規定の条件下で活性化され得るプロ
モーター配列を選択することもできる（例えば米国特許第５，８７４，５３４号
）。この文献にはかかるプロモーター配列に関する詳細な情報が示されている。
好ましい例では、この「核酸配列」は「異種」遺伝子、すなわちそれを含む核酸
配列とは起源の異なる遺伝子もまた含んでもよい。かかる遺伝子の例は下記に示
されている。また、このような核酸配列は、転写プロモーター機能または上記遺
伝子の転写が影響を受けない限り、転写プロモーター活性を有する同一であって
も異なっていてもよい少なくとも二つの配列、および／または互いに連続して、
互いに離れて、互いに同じ方向に、あるいは互いに反対の方向に置かれた、同一
であっても異なっていてもよい少なくとも二つの遺伝子を含んでもよい。同様に
、この種の核酸構築物には転写を妨げず、翻訳工程の前にスプライシングされる
「中立な」核酸配列、またはイントロンを導入することもできる。かかる配列お
よびその使用は文献（ＷＯ９４／２９４７１）に記載されている。このような核
酸はまた細胞内輸送に、複製および／または組込みに、転写または翻訳に必要な
配列を含んでもよい。かかる配列は当業者に十分公知である。また、本発明に従
って使用できる核酸は、それらが標的細胞のゲノムに組み込まれないように改変
された化合物、または例えばスペルミンのようにそれ自体細胞への核酸の導入効
率に作用しない薬剤を用いて安定化させた核酸であってもよい。
入された後、その遺伝子を確実に発現させるのに必要なエレメントを表すものと
する。これらには特にその細胞で有効なプロモーター配列および／または調節配
列、および所望により標的細胞の表面でそのポリペプチドを発現させるのに必要
な配列がある。用いるプロモーターはウイルスプロモーター、偏在性プロモータ
ーまたは組織特異的プロモーター、あるいは合成プロモーターであってよい。例
としては、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０（シミアンウイ
ルス）もしくはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、またはワクシニアウイルスの
プロモーター、あるいは筋クレアチンキナーゼ、アクチンまたは肺サーファクタ
ントをコードする遺伝子のプロモーターなどのプロモーターが挙げられる。ある
細胞種に特異的なプロモーター配列、または規定の条件下で活性化され得るプロ
モーター配列を選択することもできる（例えば米国特許第５，８７４，５３４号
）。この文献にはかかるプロモーター配列に関する詳細な情報が示されている。
好ましい例では、この「核酸配列」は「異種」遺伝子、すなわちそれを含む核酸
配列とは起源の異なる遺伝子もまた含んでもよい。かかる遺伝子の例は下記に示
されている。また、このような核酸配列は、転写プロモーター機能または上記遺
伝子の転写が影響を受けない限り、転写プロモーター活性を有する同一であって
も異なっていてもよい少なくとも二つの配列、および／または互いに連続して、
互いに離れて、互いに同じ方向に、あるいは互いに反対の方向に置かれた、同一
であっても異なっていてもよい少なくとも二つの遺伝子を含んでもよい。同様に
、この種の核酸構築物には転写を妨げず、翻訳工程の前にスプライシングされる
「中立な」核酸配列、またはイントロンを導入することもできる。かかる配列お
よびその使用は文献（ＷＯ９４／２９４７１）に記載されている。このような核
酸はまた細胞内輸送に、複製および／または組込みに、転写または翻訳に必要な
配列を含んでもよい。かかる配列は当業者に十分公知である。また、本発明に従
って使用できる核酸は、それらが標的細胞のゲノムに組み込まれないように改変
された化合物、または例えばスペルミンのようにそれ自体細胞への核酸の導入効
率に作用しない薬剤を用いて安定化させた核酸であってもよい。
【００３８】
本発明の繊維はヒト、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタまたはサル起
源のアデノウイルスに由来するものであってもよいし、あるいは異種起源の断片
、すなわちアデノウイルス繊維由来のものではない断片すなわち非アデノウイル
ス繊維由来の断片）をはじめとする多様な起源の断片を含んでなってもよい（以
下、これは特に「ハイブリッド繊維」と記載する）。ヒトアデノウイルス繊維に
ついては、血清型Ｃ由来のもの、特に２型または５型アデノウイルス（Ａｄ２ま
たはＡｄ５）が好ましい。Ａｄ２繊維は５８０個のアミノ酸（ａａ）を含んでな
るが、その配列は引用することによりその内容が本願の一部とされるHerisse et
al. (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042)に開示されている。Ａｄ５のも
のはChroboczek and Jacrot (1987, Virology 161, 549-554)により同定され、
５８２個のアミノ酸（配列番号１）を有している。本願の説明を簡単にするため
、Ａｄ５に関する位置のみを示している。しかし、他起源のアデノウイルス繊維
の配列を基にして種々のシートおよびループの相当の位置を同定することは当業
者の範囲内にある（これは本願に詳述されているものと同じ具体例となる）。例
えば、当業者ならばＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースで入手できるアデノウイ
ルス繊維配列を確認し、種々のシートおよびループの相当の位置およびこれまで
に記載されているような残基の位置を調べることができる。例えば、ＧｅｎＢａ
ｎｋ参照例としては、特にヒト血清型２（＃ＡＡＡ９２２２３）、３（＃ＣＡＡ
２６０２９）、５（＃Ｍ１８３６９）、３１（＃ＣＡＡ５４０５０）または４１
（＃Ｘ１７０１６）のアデノウイルス繊維配列が挙げられる。本発明の繊維が動
物起源である場合、ウシアデノウイルス、特にＢＡＶ−３株の使用が好ましい。
これは多くの研究の課題となっており、その繊維の配列は出願ＷＯ９５／１６０
４８に開示されている。もちろん、本発明の繊維は本発明に記載の改変の他、そ
の適用で提供される繊維の特徴に影響を及ぼさない限り、天然の配列に対して他
の改変を有していてもよい。上記の刊行物またはＧｅｎＢａｎｋ参照の内容は引
用することによりそのまま本願の一部とされる。本発明はまた、本願に記載され
るような改変型繊維に関し、それはまた例えば特許出願ＷＯ９８／４４１２１ま
たはフランス優先権９９／１０８５９から利益を受ける特許出願（本願の上記を
参照）に記載されるもののような他の変異も含む。
源のアデノウイルスに由来するものであってもよいし、あるいは異種起源の断片
、すなわちアデノウイルス繊維由来のものではない断片すなわち非アデノウイル
ス繊維由来の断片）をはじめとする多様な起源の断片を含んでなってもよい（以
下、これは特に「ハイブリッド繊維」と記載する）。ヒトアデノウイルス繊維に
ついては、血清型Ｃ由来のもの、特に２型または５型アデノウイルス（Ａｄ２ま
たはＡｄ５）が好ましい。Ａｄ２繊維は５８０個のアミノ酸（ａａ）を含んでな
るが、その配列は引用することによりその内容が本願の一部とされるHerisse et
al. (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042)に開示されている。Ａｄ５のも
のはChroboczek and Jacrot (1987, Virology 161, 549-554)により同定され、
５８２個のアミノ酸（配列番号１）を有している。本願の説明を簡単にするため
、Ａｄ５に関する位置のみを示している。しかし、他起源のアデノウイルス繊維
の配列を基にして種々のシートおよびループの相当の位置を同定することは当業
者の範囲内にある（これは本願に詳述されているものと同じ具体例となる）。例
えば、当業者ならばＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースで入手できるアデノウイ
ルス繊維配列を確認し、種々のシートおよびループの相当の位置およびこれまで
に記載されているような残基の位置を調べることができる。例えば、ＧｅｎＢａ
ｎｋ参照例としては、特にヒト血清型２（＃ＡＡＡ９２２２３）、３（＃ＣＡＡ
２６０２９）、５（＃Ｍ１８３６９）、３１（＃ＣＡＡ５４０５０）または４１
（＃Ｘ１７０１６）のアデノウイルス繊維配列が挙げられる。本発明の繊維が動
物起源である場合、ウシアデノウイルス、特にＢＡＶ−３株の使用が好ましい。
これは多くの研究の課題となっており、その繊維の配列は出願ＷＯ９５／１６０
４８に開示されている。もちろん、本発明の繊維は本発明に記載の改変の他、そ
の適用で提供される繊維の特徴に影響を及ぼさない限り、天然の配列に対して他
の改変を有していてもよい。上記の刊行物またはＧｅｎＢａｎｋ参照の内容は引
用することによりそのまま本願の一部とされる。本発明はまた、本願に記載され
るような改変型繊維に関し、それはまた例えば特許出願ＷＯ９８／４４１２１ま
たはフランス優先権９９／１０８５９から利益を受ける特許出願（本願の上記を
参照）に記載されるもののような他の変異も含む。
【００３９】
本発明によれば、残基４９１〜５０５の間のＡｄ５アデノウイルス繊維領域お
よび本願に記載されるような改変物がもちろん、異種アデノウイルス繊維、すな
わちＡｄ５アデノウイルス繊維とは異なる繊維に、上記異種繊維の相当領域の付
加、または置換として導入できることを明示しておくべきであろう。
よび本願に記載されるような改変物がもちろん、異種アデノウイルス繊維、すな
わちＡｄ５アデノウイルス繊維とは異なる繊維に、上記異種繊維の相当領域の付
加、または置換として導入できることを明示しておくべきであろう。
【００４０】
第一の具体例によれば、本発明は、配列番号１の残基４９１〜５０５の間の領
域の一以上の残基の変異により改変されているアデノウイルス繊維に関する。好
ましくはそれは、配列番号１で示される５型アデノウイルス（Ａｄ５）繊維の配
列の総てまたは一部を含んでなり、上記配列の残基４９１〜５０５の間の領域の
一以上の残基の変異により改変されたアデノウイルス繊維である。
域の一以上の残基の変異により改変されているアデノウイルス繊維に関する。好
ましくはそれは、配列番号１で示される５型アデノウイルス（Ａｄ５）繊維の配
列の総てまたは一部を含んでなり、上記配列の残基４９１〜５０５の間の領域の
一以上の残基の変異により改変されたアデノウイルス繊維である。
【００４１】
上記に示したように、変法によれば、この変異は記載の領域における一以上の
アミノ酸の置換によって作出されるものであってもよい。この能力においては、
下記の例が挙げられ、これによりＡｄ５繊維は以下の変異から選択される少なく
とも一つの変異を有する： ４９１番のチロシン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９４番のアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９５番のバリン残基のアルギニンでの置換、 ４９６番のグリシン残基のセリンでの置換、 ４９７番のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９８番のメチオニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９９番のプロリン残基のグリシンでの置換、 ５００番のアスパラギン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０３番のアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０４番のチロシン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０５番のプロリン残基のグリシン残基での置換。
アミノ酸の置換によって作出されるものであってもよい。この能力においては、
下記の例が挙げられ、これによりＡｄ５繊維は以下の変異から選択される少なく
とも一つの変異を有する： ４９１番のチロシン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９４番のアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９５番のバリン残基のアルギニンでの置換、 ４９６番のグリシン残基のセリンでの置換、 ４９７番のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９８番のメチオニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９９番のプロリン残基のグリシンでの置換、 ５００番のアスパラギン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０３番のアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０４番のチロシン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０５番のプロリン残基のグリシン残基での置換。
【００４２】
本発明は好ましくは、変異残基が４９４番のアラニン残基および５０３番のア
ラニン残基から選択されることを特徴とする、５型アデノウイルス繊維に関する
。
ラニン残基から選択されることを特徴とする、５型アデノウイルス繊維に関する
。
【００４３】
天然型繊維中のそれらの空間的位置により、これらの残基は検討中のアデノウ
イルスの天然型細胞受容体を認識、および／または直接または間接的に相互作用
することができる。
イルスの天然型細胞受容体を認識、および／または直接または間接的に相互作用
することができる。
【００４４】
特定の具体例によれば、本発明の繊維は上記の改変の他、
ループＡＢ、ＣＤ、ＤＧ、ＧＨ、ＨＩおよび／またはＩＪ、および／または
シートＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび／またはＪ
における一以上の変異、特には出願ＷＯ９８／４４１２１およびフランス優先権
９９／１０８５９から利益を受ける特許出願（上記参照）の出願人によってこれ
までに記載されている一以上の変異を含んでなることを特徴とする。
９９／１０８５９から利益を受ける特許出願（上記参照）の出願人によってこれ
までに記載されている一以上の変異を含んでなることを特徴とする。
【００４５】
本発明によれば、アデノウイルス繊維の三次元構造を大幅に改変しないことが
好ましいので、ベンドをなすアミノ酸は、Xia et al. 1994に記載されたものの
ような同じ構造をなす残基と置換される。
好ましいので、ベンドをなすアミノ酸は、Xia et al. 1994に記載されたものの
ような同じ構造をなす残基と置換される。
【００４６】
本発明の繊維はまた欠失によって改変してもよい。
【００４７】
有利な具体例によれば、少なくとも一つの改変がループおよび／またはシート
の少なくとも３個の連続する残基の欠失である場合、その欠失領域は第一のアデ
ノウイルスにより認識されるものとは異なる細胞受容体と相互作用し得る第二の
アデノウイルスの繊維に由来する同等のループおよび／またはシートからの残基
で置換すればよい。これにより本発明の繊維の構造を維持することができると同
時に、第二のアデノウイルスのものに相当する宿主特異性をそれに付与すること
ができる。Xia et al. (1994)で示されるように、感染および細胞受容体との相
互作用の際に関与する繊維の領域は３型および７型アデノウイルスでは異なる。
従って、Ａｄ５の受容体に結合する能力を低下させるために、上記で示されたも
のから少なくとも３個の連続する残基を欠失させ、おそらくＡｄ３またはＡｄ７
繊維の相当領域に由来する残基で置換したＡｄ５またはＡｄ２繊維は、Ａｄ３ま
たはＡｄ７の細胞受容体に対する新たな特異性をそれに付与することとなる。
の少なくとも３個の連続する残基の欠失である場合、その欠失領域は第一のアデ
ノウイルスにより認識されるものとは異なる細胞受容体と相互作用し得る第二の
アデノウイルスの繊維に由来する同等のループおよび／またはシートからの残基
で置換すればよい。これにより本発明の繊維の構造を維持することができると同
時に、第二のアデノウイルスのものに相当する宿主特異性をそれに付与すること
ができる。Xia et al. (1994)で示されるように、感染および細胞受容体との相
互作用の際に関与する繊維の領域は３型および７型アデノウイルスでは異なる。
従って、Ａｄ５の受容体に結合する能力を低下させるために、上記で示されたも
のから少なくとも３個の連続する残基を欠失させ、おそらくＡｄ３またはＡｄ７
繊維の相当領域に由来する残基で置換したＡｄ５またはＡｄ２繊維は、Ａｄ３ま
たはＡｄ７の細胞受容体に対する新たな特異性をそれに付与することとなる。
【００４８】
本発明はまた、上記のように天然型細胞受容体へ結合する能力が実質的に低下
されているが、なお三量体化し得るアデノウイルス繊維に関する。かかる特性は
特に本願の実験の節に記載の技術を用いて求められる。
されているが、なお三量体化し得るアデノウイルス繊維に関する。かかる特性は
特に本願の実験の節に記載の技術を用いて求められる。
【００４９】
同じく有利な具体例によれば、本発明の繊維はまたリガンドまたはターゲッテ
ィングエレメントも含んでなる。本発明において「リガンド」は、非変異型アデ
ノウイルス繊維の天然型細胞受容体とは異なる細胞「アンチリガンド」（すなわ
ち、クラスＩ組織適合系の抗原、フィブロネクチンまたはコクサッキーウイルス
の細胞受容体（ＣＡＲ））を認識し、好ましくは高い親和性で結合または相互作
用すし得るものととして定義する。このアンチリガンドは、自然に、またはかか
るアンチリガンドをその表面で発現させるまたはその表面に曝させる目的で標的
細胞を改変した後に、ターゲッティングが望まれる細胞の表面で発現され得る、
または表面に曝されれ得る（細胞表面マーカー、受容体、組織適合性抗原によっ
て提供される抗原性ペプチドなど）。本発明により遂行される目的によれば、か
かるリガンドは例えば抗体もしくは抗体フラグメント、脂質、糖脂質、ホルモン
、ポリペプチド、短鎖ペプチド、ポリマー（ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩなど）
、糖、オリゴヌクレオチド、抗原、ビタミン、レクチンもしくはペプチドＪＴＳ
−１（ＷＯ９４／４０９５８）の総てまたは一部、あるいはかかる化合物の組合
せであってよい。「抗体」とは特に、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（
例えば、Ｆａｂフラグメントなど）および一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を表す。これ
らの名称および略語は免疫学の分野で一般的なものである。また、かかるターゲ
ッティングエレメントはこの粒子または偽粒子をある細胞種またはある特定の組
織（腫瘍細胞、肺上皮細胞、造血系細胞、筋細胞、神経細胞など）へ向けること
ができる。それらはまた、細胞への浸透または所望によりエンドソーム溶解を促
進するエレメントであってもよい。特に、それらは増殖因子受容体、サイトカイ
ン受容体、レクチン受容体、または付着タンパク質受容体などの受容体と相互作
用し得るリガンドである、肝細胞の表面のアシアロ糖タンパク質受容体をターゲ
ッティングすることができるガラクトシル残基であってもよく、それらはまたＦ
ａｂフラグメントなどの抗体フラグメント、インフルエンザウイルス・ヘマグル
チニンＨＡ−２サブユニット由来の融合誘導ペプチドＩＮＦ−７(Plank et al.,
1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924)、ＳＶ４０ウイルスＴ抗原またはエ
プスタイン・バーウイルスＥＢＮＡ−１タンパク質由来の核局在化シグナル、Ｇ
ＲＰ（ガストリン放出ペプチド）リガンド、ＥＰＰＴペプチド（米国特許第５，
５９１，５９３号）またはＬＤＶペプチド（米国特許第５，６２８，９７９号）
であってもよい。
ィングエレメントも含んでなる。本発明において「リガンド」は、非変異型アデ
ノウイルス繊維の天然型細胞受容体とは異なる細胞「アンチリガンド」（すなわ
ち、クラスＩ組織適合系の抗原、フィブロネクチンまたはコクサッキーウイルス
の細胞受容体（ＣＡＲ））を認識し、好ましくは高い親和性で結合または相互作
用すし得るものととして定義する。このアンチリガンドは、自然に、またはかか
るアンチリガンドをその表面で発現させるまたはその表面に曝させる目的で標的
細胞を改変した後に、ターゲッティングが望まれる細胞の表面で発現され得る、
または表面に曝されれ得る（細胞表面マーカー、受容体、組織適合性抗原によっ
て提供される抗原性ペプチドなど）。本発明により遂行される目的によれば、か
かるリガンドは例えば抗体もしくは抗体フラグメント、脂質、糖脂質、ホルモン
、ポリペプチド、短鎖ペプチド、ポリマー（ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩなど）
、糖、オリゴヌクレオチド、抗原、ビタミン、レクチンもしくはペプチドＪＴＳ
−１（ＷＯ９４／４０９５８）の総てまたは一部、あるいはかかる化合物の組合
せであってよい。「抗体」とは特に、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（
例えば、Ｆａｂフラグメントなど）および一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を表す。これ
らの名称および略語は免疫学の分野で一般的なものである。また、かかるターゲ
ッティングエレメントはこの粒子または偽粒子をある細胞種またはある特定の組
織（腫瘍細胞、肺上皮細胞、造血系細胞、筋細胞、神経細胞など）へ向けること
ができる。それらはまた、細胞への浸透または所望によりエンドソーム溶解を促
進するエレメントであってもよい。特に、それらは増殖因子受容体、サイトカイ
ン受容体、レクチン受容体、または付着タンパク質受容体などの受容体と相互作
用し得るリガンドである、肝細胞の表面のアシアロ糖タンパク質受容体をターゲ
ッティングすることができるガラクトシル残基であってもよく、それらはまたＦ
ａｂフラグメントなどの抗体フラグメント、インフルエンザウイルス・ヘマグル
チニンＨＡ−２サブユニット由来の融合誘導ペプチドＩＮＦ−７(Plank et al.,
1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924)、ＳＶ４０ウイルスＴ抗原またはエ
プスタイン・バーウイルスＥＢＮＡ−１タンパク質由来の核局在化シグナル、Ｇ
ＲＰ（ガストリン放出ペプチド）リガンド、ＥＰＰＴペプチド（米国特許第５，
５９１，５９３号）またはＬＤＶペプチド（米国特許第５，６２８，９７９号）
であってもよい。
【００５０】
本発明において、さらに詳しくは腫瘍細胞、感染細胞、特定の細胞種、または
特異的な表面マーカーを有するあるカテゴリーの細胞をターゲッティングするこ
とが有利であろう。例えば、ターゲッティングされる宿主細胞がＨＩＶウイルス
（ヒト免疫不全ウイルス）に感染した細胞であれば、リガンドはフシン(fusin)
、ＣＤ４受容体、またはウイルスタンパク質（外被糖タンパク質）もしくは残基
３７から７２にわたるＨＩＶウイルスＴＡＴタンパク質(Fawell et al., 1994,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668)に向けられる抗体のフラグメントで
あってもよい。腫瘍細胞に関しては、腫瘍特異的な抗原（例えば、乳癌の場合の
ＭＵＣ−１タンパク質、ＨＰＶパピローマウイルスＥ６またはＥ７タンパク質の
特定のエピトープ）、あるいは過剰発現する抗原（特定のリンパ系腫瘍で過剰発
現するＩＬ−２受容体）を認識するリガンドに関して選択する。Ｔリンパ球のタ
ーゲッティングを意図する場合には、Ｔ細胞受容体のリガンドを用いればよい。
また、肝細胞のテーゲッティングにはトランスフェリンがよい候補となる。一般
に、本発明において用い得るリガンドは文献に広く記載され、かかるリガンドを
コードする遺伝子は標準的な技術を用いて（例えば、ｃＤＮＡ増幅などにより）
クローニングできる。それらを化学合成することも可能であるし、またそれらを
本発明の改変型繊維と組み合わせることもできる。これに関しては、ガラクトシ
ル残基を組み合わせると、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用するため、肝
特異性を付与することができる。最後に、好ましい具体例によれば、上記リガン
ドは本発明の繊維のＣ末端か、あるいは少なくとも一つの改変が少なくとも３個
の連続する残基の欠失である場合には欠失させた残基の代わりとして挿入する。
特異的な表面マーカーを有するあるカテゴリーの細胞をターゲッティングするこ
とが有利であろう。例えば、ターゲッティングされる宿主細胞がＨＩＶウイルス
（ヒト免疫不全ウイルス）に感染した細胞であれば、リガンドはフシン(fusin)
、ＣＤ４受容体、またはウイルスタンパク質（外被糖タンパク質）もしくは残基
３７から７２にわたるＨＩＶウイルスＴＡＴタンパク質(Fawell et al., 1994,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668)に向けられる抗体のフラグメントで
あってもよい。腫瘍細胞に関しては、腫瘍特異的な抗原（例えば、乳癌の場合の
ＭＵＣ−１タンパク質、ＨＰＶパピローマウイルスＥ６またはＥ７タンパク質の
特定のエピトープ）、あるいは過剰発現する抗原（特定のリンパ系腫瘍で過剰発
現するＩＬ−２受容体）を認識するリガンドに関して選択する。Ｔリンパ球のタ
ーゲッティングを意図する場合には、Ｔ細胞受容体のリガンドを用いればよい。
また、肝細胞のテーゲッティングにはトランスフェリンがよい候補となる。一般
に、本発明において用い得るリガンドは文献に広く記載され、かかるリガンドを
コードする遺伝子は標準的な技術を用いて（例えば、ｃＤＮＡ増幅などにより）
クローニングできる。それらを化学合成することも可能であるし、またそれらを
本発明の改変型繊維と組み合わせることもできる。これに関しては、ガラクトシ
ル残基を組み合わせると、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用するため、肝
特異性を付与することができる。最後に、好ましい具体例によれば、上記リガン
ドは本発明の繊維のＣ末端か、あるいは少なくとも一つの改変が少なくとも３個
の連続する残基の欠失である場合には欠失させた残基の代わりとして挿入する。
【００５１】
特にリガンドの化学的な性質により、本発明の改変型繊維にそれを種々の方法
、さらに詳しくは下記の方法で組み込めばよい： ・そのリガンドをコードする核酸配列を目的の改変型繊維をコードする核酸配
列へクローニングすることによる。これに関しては、リガンドコードする上記核
酸配列を上記繊維の変異領域をコードする繊維の核酸配列領域に導入する、また
はその近くに置く特定の場合が挙げられる。 ・例えば化学的グラフトにより、あらかじめ改変および作製した繊維に直接組
み込むことによる。
、さらに詳しくは下記の方法で組み込めばよい： ・そのリガンドをコードする核酸配列を目的の改変型繊維をコードする核酸配
列へクローニングすることによる。これに関しては、リガンドコードする上記核
酸配列を上記繊維の変異領域をコードする繊維の核酸配列領域に導入する、また
はその近くに置く特定の場合が挙げられる。 ・例えば化学的グラフトにより、あらかじめ改変および作製した繊維に直接組
み込むことによる。
【００５２】
本発明のもう一つの課題は、配列番号１の残基４９１から残基５０５にわたる
領域を含んでなり、上記領域が上記のように改変されていることを特徴とするペ
プチド断片に関する。
領域を含んでなり、上記領域が上記のように改変されていることを特徴とするペ
プチド断片に関する。
【００５３】
かかるペプチド断片は特に以下の特性を有する。
（ｉ）このペプチド断片を所定のアデノウイルス繊維の配列番号１の残基４９
１から残基５０５にわたる領域の代わりに（すなわち相当位置に）組み込んだ場
合、上記変異型繊維を含んでなるアデノウイルス粒子は非改変型アデノウイルス
繊維の天然型細胞受容体には実質的に付着しない。
１から残基５０５にわたる領域の代わりに（すなわち相当位置に）組み込んだ場
合、上記変異型繊維を含んでなるアデノウイルス粒子は非改変型アデノウイルス
繊維の天然型細胞受容体には実質的に付着しない。
【００５４】
（ii）（ｉ）の変異型繊維を含んでなるアデノウイルス粒子がアンチリガンド
特異的なリガンドもまた含んでなる場合には、非変異型アデノウイルス繊維を含
んでなるアデノウイルス粒子に比べて、改変型アデノウイルス粒子に、それらの
表面にアンチリガンドを有する一以上の特異的細胞種に対する新たな向性を付与
することができる。
特異的なリガンドもまた含んでなる場合には、非変異型アデノウイルス繊維を含
んでなるアデノウイルス粒子に比べて、改変型アデノウイルス粒子に、それらの
表面にアンチリガンドを有する一以上の特異的細胞種に対する新たな向性を付与
することができる。
【００５５】
本発明はまた、その表面に本発明の改変型繊維またはペプチド、および所望に
より上記のようなリガンドを含んでなるウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子
に関する。好ましい例では、このウイルス粒子は機能的に天然型の繊維、または
そのウイルス粒子のその標的細胞への付着に天然に関与するその他のいずれかの
ペプチドを欠いている。
より上記のようなリガンドを含んでなるウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子
に関する。好ましい例では、このウイルス粒子は機能的に天然型の繊維、または
そのウイルス粒子のその標的細胞への付着に天然に関与するその他のいずれかの
ペプチドを欠いている。
【００５６】
かかる粒子がウイルスゲノムを含む場合には「ウイルス性ウイルス(viral vir
us)」が好ましく、そのゲノムがまた改変されている場合には特に「組換えウイ
ルス性ウイルス」（例えば組換えアデノウイルス、好ましくは複製欠陥組換えア
デノウイルス）が挙げられる。かかる例は以下のさらに詳細に記載されている。
よって本発明はまた、かかるウイルスおよび組換えウイルスに関する。
us)」が好ましく、そのゲノムがまた改変されている場合には特に「組換えウイ
ルス性ウイルス」（例えば組換えアデノウイルス、好ましくは複製欠陥組換えア
デノウイルス）が挙げられる。かかる例は以下のさらに詳細に記載されている。
よって本発明はまた、かかるウイルスおよび組換えウイルスに関する。
【００５７】
本発明に従ってウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子を得るためには、改変
型繊維または上記ペプチドおよび任意の上記リガンドは、
型繊維または上記ペプチドおよび任意の上記リガンドは、
【００５８】
（ｉ）特にそのウイルス粒子がその末端にかかるゲノムを含む場合にはウイル
スゲノム自体によって発現され得る。この場合、このゲノムは上記改変型繊維の
発現のため、あるいは本発明の上記ペプチドのため、また所望により上記リガン
ドのために必要な核酸配列を含む。
スゲノム自体によって発現され得る。この場合、このゲノムは上記改変型繊維の
発現のため、あるいは本発明の上記ペプチドのため、また所望により上記リガン
ドのために必要な核酸配列を含む。
【００５９】
（ii）下記のように補足細胞系によりトランスで提供してもよく、これは上記
改変型繊維の発現のため、あるいは本発明の上記ペプチドのため、また所望によ
り上記リガンドのために必要な核酸配列を含む。
改変型繊維の発現のため、あるいは本発明の上記ペプチドのため、また所望によ
り上記リガンドのために必要な核酸配列を含む。
【００６０】
（iii）ウイルス粒子の表面に化学修飾により、より詳しくはウイルス生産の
専門家である当業者により広く用いられている技術に従ってウイルス粒子を生産
した後、組み込むことができる。（iii）に従う特定の例では上記ウイルス粒子
はアデノウイルス粒子ではなく、外被のないウイルス粒子が好ましい。かかるウ
イルスはウイルス学の一般的な研究で広く記載されており、例えばFields et al
. (1990, Virology, Raven Press, NY)などがある。
専門家である当業者により広く用いられている技術に従ってウイルス粒子を生産
した後、組み込むことができる。（iii）に従う特定の例では上記ウイルス粒子
はアデノウイルス粒子ではなく、外被のないウイルス粒子が好ましい。かかるウ
イルスはウイルス学の一般的な研究で広く記載されており、例えばFields et al
. (1990, Virology, Raven Press, NY)などがある。
【００６１】
特定の具体例によれば、本発明のウイルス粒子としては上記で示されたものが
あり、アデノウイルス粒子の厳密な例では、リガンドが繊維以外のウイルスキャ
プシドタンパク質、特にヘキソンまたはペントンに挿入されることを特徴とする
。有利な具体例によれば、ウイルスゲノムおよび粒子はアデノウイルスゲノムお
よびアデノウイルス粒子である。
あり、アデノウイルス粒子の厳密な例では、リガンドが繊維以外のウイルスキャ
プシドタンパク質、特にヘキソンまたはペントンに挿入されることを特徴とする
。有利な具体例によれば、ウイルスゲノムおよび粒子はアデノウイルスゲノムお
よびアデノウイルス粒子である。
【００６２】
本発明はまた、その表面に変異型繊維または本発明のペプチド、および所望に
より上記のようなリガンドを含んでなるウイルス偽粒子、特にアデノウイルス偽
粒子に関する。本発明の特定の例によれば、本発明のこのウイルス偽粒子は「エ
ンプティー」とされ、すなわちいずれの核酸も含まない。しかしながら本発明は
また、かかるウイルス偽粒子が高分子、より詳しくはウイルスまたはアデノウイ
ルスゲノムではない核酸を含む場合に関する。かかるウイルス偽粒子の使用は特
に上記文献ＷＯ９５／２１２５９または米国特許第５，９２８，９４４号に示さ
れている。
より上記のようなリガンドを含んでなるウイルス偽粒子、特にアデノウイルス偽
粒子に関する。本発明の特定の例によれば、本発明のこのウイルス偽粒子は「エ
ンプティー」とされ、すなわちいずれの核酸も含まない。しかしながら本発明は
また、かかるウイルス偽粒子が高分子、より詳しくはウイルスまたはアデノウイ
ルスゲノムではない核酸を含む場合に関する。かかるウイルス偽粒子の使用は特
に上記文献ＷＯ９５／２１２５９または米国特許第５，９２８，９４４号に示さ
れている。
【００６３】
もう一つの具体例によれば、本発明はまた、「人工粒子」とも呼ばれる偽粒子
に関する。かかる粒子は特に （ｉ）本発明のペプチド配列または改変型アデノウイルス繊維を含有する、ま
たはそれらからなるペプチドまたは糖タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキ
シ末端タンパク質配列と会合した脂質または糖脂質などの極性化合物の形成、お
よび （ii）上記改変極性化合物のリポソーム型構造への組込み の後に製造できる。
に関する。かかる粒子は特に （ｉ）本発明のペプチド配列または改変型アデノウイルス繊維を含有する、ま
たはそれらからなるペプチドまたは糖タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキ
シ末端タンパク質配列と会合した脂質または糖脂質などの極性化合物の形成、お
よび （ii）上記改変極性化合物のリポソーム型構造への組込み の後に製造できる。
【００６４】
かかる技術は当業者に周知であり、例えばインフルエンザウイルスの表面糖タ
ンパク質を有するリポソームを作製するためにすでに応用されている(Tikchonen
ko et al., 1988, Gene, 63, 321-330)。
ンパク質を有するリポソームを作製するためにすでに応用されている(Tikchonen
ko et al., 1988, Gene, 63, 321-330)。
【００６５】
本発明のもう一つの特定の例によれば、上記偽粒子は
（ｉ）出願ＷＯ９８／４４１２１またはフランス優先権９９／１０８５９から
利益を受ける特許出願（上記参照）に記載されているようなペプチド配列または
改変型アデノウイルス繊維を含有する、またはそれらからなるペプチドまたは糖
タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端タンパク質配列と会合した脂質
または糖脂質などの極性化合物の形成、および （ii）上記改変極性化合物のリポソーム型構造への組込み の後に製造される。
利益を受ける特許出願（上記参照）に記載されているようなペプチド配列または
改変型アデノウイルス繊維を含有する、またはそれらからなるペプチドまたは糖
タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端タンパク質配列と会合した脂質
または糖脂質などの極性化合物の形成、および （ii）上記改変極性化合物のリポソーム型構造への組込み の後に製造される。
【００６６】
また、それらの構造内にかかる配列または上記改変型アデノウイルス繊維を含
むように改変された陽イオン脂質または高分子を得ることも可能である。文献に
は本発明に従って使用できる多数の脂質の例が示されている。トランスフェクシ
ョンにより細胞へ核酸を導入するための合成ベクターとして一般に使用される陽
イオン脂質または高分子の例も挙げられる。限定されるものではないが、Felgne
r et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Sol
aiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Biocon
jugate Chemistry 5, pp. 647-654または特許出願ＷＯ９８／０８４８９、ＷＯ
９８／１７６９３、ＷＯ９８／３４９１０、ＷＯ９８／３７９１６、ＷＯ９８／
５３８５３、ＥＰ８９０３６２またはＷＯ９９／０５１８３に記載されているも
のなどの化合物であってもよい。これらの陽イオン化合物は細胞へのそれらの導
入（トランスフェクション）を可能とするために核酸との複合体（リポプレック
スまたはポリプレックス、またはより一般的にはポジプレックスとも呼ばれる）
を形成し得る。本発明のかかるペプチドまたは改変型アデノウイルス繊維を上記
複合体へ組み込むことにより、例えば目的の細胞種をターゲッティングすること
ができるポジプレックスを得ることが可能となる。
むように改変された陽イオン脂質または高分子を得ることも可能である。文献に
は本発明に従って使用できる多数の脂質の例が示されている。トランスフェクシ
ョンにより細胞へ核酸を導入するための合成ベクターとして一般に使用される陽
イオン脂質または高分子の例も挙げられる。限定されるものではないが、Felgne
r et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Sol
aiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Biocon
jugate Chemistry 5, pp. 647-654または特許出願ＷＯ９８／０８４８９、ＷＯ
９８／１７６９３、ＷＯ９８／３４９１０、ＷＯ９８／３７９１６、ＷＯ９８／
５３８５３、ＥＰ８９０３６２またはＷＯ９９／０５１８３に記載されているも
のなどの化合物であってもよい。これらの陽イオン化合物は細胞へのそれらの導
入（トランスフェクション）を可能とするために核酸との複合体（リポプレック
スまたはポリプレックス、またはより一般的にはポジプレックスとも呼ばれる）
を形成し得る。本発明のかかるペプチドまたは改変型アデノウイルス繊維を上記
複合体へ組み込むことにより、例えば目的の細胞種をターゲッティングすること
ができるポジプレックスを得ることが可能となる。
【００６７】
粒子または偽粒子（ウイルス系または人工）にリガンドもまた含める場合、そ
れはそれらに化学的に結合させてもよい。しかし、そのリガンドをコードする配
列がウイルスゲノム、好ましくはアデノウイルスゲノムに挿入される変法が好ま
しい。これらの場合には、上記配列は好ましくは本発明の改変型繊維をコードす
る配列へ挿入され、さらの特には読み取り枠を保存するような位相に挿入される
。リガンドをコードする配列の挿入はウイルスゲノムのいずれの部位で行っても
よいが、好ましい挿入部位はＣ末端の停止コドンの上流、または欠失させた残基
の代わりの部位である。また、このリガンド配列を他のウイルス配列、特にアデ
ノウイルスヘキソンまたはペントンなどの別のキャプシドタンパク質をコードす
るものに導入することも考えることができる。
れはそれらに化学的に結合させてもよい。しかし、そのリガンドをコードする配
列がウイルスゲノム、好ましくはアデノウイルスゲノムに挿入される変法が好ま
しい。これらの場合には、上記配列は好ましくは本発明の改変型繊維をコードす
る配列へ挿入され、さらの特には読み取り枠を保存するような位相に挿入される
。リガンドをコードする配列の挿入はウイルスゲノムのいずれの部位で行っても
よいが、好ましい挿入部位はＣ末端の停止コドンの上流、または欠失させた残基
の代わりの部位である。また、このリガンド配列を他のウイルス配列、特にアデ
ノウイルスヘキソンまたはペントンなどの別のキャプシドタンパク質をコードす
るものに導入することも考えることができる。
【００６８】
有利には本発明は、複製欠陥組換えアデノウイルス、すなわち宿主細胞で自律
的に複製できないアデノウイルスを含むアデノウイルス粒子に関する。この欠陥
は一以上のウイルス必須遺伝子、特にアデノウイルスゲノムのＥ１領域の総てま
たは一部の変異または欠失によって得られる。クローニング能力を高めるには、
Ｅ３領域での欠失が考えられる。しかし、宿主の免疫応答を調整するためにはｇ
ｐ１９ｋタンパク質をコードする配列(Gooding and Wood, 1990, Critical Revi
ews of Immunology 10, 53-71)を保存するのが有利であり得る。もちろん本発明
のアデノウイルスのゲノムはまた、他の領域、特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ
１−Ｌ５領域に作用するさらなる欠失または変異を含んでもよい（例えば、ＷＯ
９４／２８１５２またはＷＯ９４／１２６９４、またはＥ２のＤＢＰ遺伝子の熱
感受性変異を記載しているEnsinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339を参
照）。
的に複製できないアデノウイルスを含むアデノウイルス粒子に関する。この欠陥
は一以上のウイルス必須遺伝子、特にアデノウイルスゲノムのＥ１領域の総てま
たは一部の変異または欠失によって得られる。クローニング能力を高めるには、
Ｅ３領域での欠失が考えられる。しかし、宿主の免疫応答を調整するためにはｇ
ｐ１９ｋタンパク質をコードする配列(Gooding and Wood, 1990, Critical Revi
ews of Immunology 10, 53-71)を保存するのが有利であり得る。もちろん本発明
のアデノウイルスのゲノムはまた、他の領域、特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ
１−Ｌ５領域に作用するさらなる欠失または変異を含んでもよい（例えば、ＷＯ
９４／２８１５２またはＷＯ９４／１２６９４、またはＥ２のＤＢＰ遺伝子の熱
感受性変異を記載しているEnsinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339を参
照）。
【００６９】
好ましい具体例によれば、本発明の組換えウイルス（特に、組換えアデノウイ
ルス）はその宿主細胞での発現に必要なエレメントの制御下に置かれた一以上の
目的遺伝子を含んでなる。この目的遺伝子はいずれの起源のものであってもよく
、ゲノム、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）またはハイブリッド（一以上のイントロン
を欠くミニ遺伝子）であってもよい。それは従来の分子生物学の技術を用いて、
あるいは化学合成によって得ることができる。それはアンチセンスＲＮＡ、リボ
ザイムまたはその後目的のポリペプチドへと翻訳されるｍＲＮＡをコードしても
よい。このポリペプチドは細胞質内、核内、または膜結合性のものであってもよ
く、あるいは宿主細胞によって分泌されるものでもよい。また、天然に見られる
ポリペプチド、種々の起源の配列の融合によるキメラポリペプチド、または天然
配列を変異させ、改良および／または改変された生物学的特性を有するポリペプ
チドの総てまたは一部であってもよい。
ルス）はその宿主細胞での発現に必要なエレメントの制御下に置かれた一以上の
目的遺伝子を含んでなる。この目的遺伝子はいずれの起源のものであってもよく
、ゲノム、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）またはハイブリッド（一以上のイントロン
を欠くミニ遺伝子）であってもよい。それは従来の分子生物学の技術を用いて、
あるいは化学合成によって得ることができる。それはアンチセンスＲＮＡ、リボ
ザイムまたはその後目的のポリペプチドへと翻訳されるｍＲＮＡをコードしても
よい。このポリペプチドは細胞質内、核内、または膜結合性のものであってもよ
く、あるいは宿主細胞によって分泌されるものでもよい。また、天然に見られる
ポリペプチド、種々の起源の配列の融合によるキメラポリペプチド、または天然
配列を変異させ、改良および／または改変された生物学的特性を有するポリペプ
チドの総てまたは一部であってもよい。
【００７０】
本発明のおいては以下のポリペプチドをコードする遺伝子を使用するのが有利
である： サイトカイン類またはリンホカイン類（インターフェロン類およびインターロ
イキン類）、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ
など）； 細胞または核受容体、特に病原体（ウイルス、細菌または寄生虫）により、好
ましくはＨＩＶウイルスにより認識されるもの、あるいはそのリガンド； 遺伝子疾患に関わるタンパク質（因子VII、因子VIII、因子IX、ジストロフィ
ンまたはミニジストロフィン、インスリン、ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症トランスメ
ンブラン・コンダクタンス・レギュレーター）タンパク質、成長ホルモン（ｈＧ
Ｈ）； 酵素（ウレアーゼ、レニン、トロンビンなど）； 酵素阻害剤（１−アンチトリプシン）、アンチトロンビンIII、ウイルスプロ
テアーゼ阻害剤など）； 腫瘍または癌の発生または進行を少なくとも部分的に阻害し得る、抗腫瘍作用
を有するポリペプチド（抗体、細胞分裂または伝達シグナルに作用する阻害剤、
腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３もしくはＲｂの発現産物、免疫系を刺激するタン
パク質など）； クラスＩまたはII主要組織適合性複合体タンパク質、または相当する遺伝子の
発現に作用する調節タンパク質； ウイルス、細菌または寄生虫感染またはその進展を阻害し得るポリペプチド（
免疫原性を有する抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープ、抗体、競合により天
然タンパク質の作用を阻害し得る）； 毒素（単純ヘルペスウイルス１のチミジンキナーゼ（ＴＫ−ＨＳＶ−１）、リ
シン、コレラ毒、ジフテリア毒など）またはイムノトキシン；および マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）； 抗体、特にモノクローナル抗体の総てまたは一部。
である： サイトカイン類またはリンホカイン類（インターフェロン類およびインターロ
イキン類）、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ
など）； 細胞または核受容体、特に病原体（ウイルス、細菌または寄生虫）により、好
ましくはＨＩＶウイルスにより認識されるもの、あるいはそのリガンド； 遺伝子疾患に関わるタンパク質（因子VII、因子VIII、因子IX、ジストロフィ
ンまたはミニジストロフィン、インスリン、ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症トランスメ
ンブラン・コンダクタンス・レギュレーター）タンパク質、成長ホルモン（ｈＧ
Ｈ）； 酵素（ウレアーゼ、レニン、トロンビンなど）； 酵素阻害剤（１−アンチトリプシン）、アンチトロンビンIII、ウイルスプロ
テアーゼ阻害剤など）； 腫瘍または癌の発生または進行を少なくとも部分的に阻害し得る、抗腫瘍作用
を有するポリペプチド（抗体、細胞分裂または伝達シグナルに作用する阻害剤、
腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３もしくはＲｂの発現産物、免疫系を刺激するタン
パク質など）； クラスＩまたはII主要組織適合性複合体タンパク質、または相当する遺伝子の
発現に作用する調節タンパク質； ウイルス、細菌または寄生虫感染またはその進展を阻害し得るポリペプチド（
免疫原性を有する抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープ、抗体、競合により天
然タンパク質の作用を阻害し得る）； 毒素（単純ヘルペスウイルス１のチミジンキナーゼ（ＴＫ−ＨＳＶ−１）、リ
シン、コレラ毒、ジフテリア毒など）またはイムノトキシン；および マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）； 抗体、特にモノクローナル抗体の総てまたは一部。
【００７１】
この一覧は限定されるものではなく、他の遺伝子も使用してよいことを指摘し
ておくべきであろう。
ておくべきであろう。
【００７２】
また、本発明の組換えアデノウイルスは感染細胞を選択または同定することを
可能にする選択遺伝子も含んでよい。抗生物質Ｇ４１８耐性を付与するｎｅｏ遺
伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコード）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ
葉酸レダクターゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）遺
伝子またはｇｐｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）
遺伝子が挙げられる。一般に選択遺伝子は当業者に公知である。
可能にする選択遺伝子も含んでよい。抗生物質Ｇ４１８耐性を付与するｎｅｏ遺
伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコード）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ
葉酸レダクターゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）遺
伝子またはｇｐｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）
遺伝子が挙げられる。一般に選択遺伝子は当業者に公知である。
【００７３】
「宿主細胞での目的遺伝子の発現に必要なエレメント」とは、そのＲＮＡへの
転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を可能とするエレメントの総てを意味
するものとする。これらのうち、プロモーターが特に重要である。本発明におい
て、それは真核生物起源またはウイルス起源のいずれの遺伝子であってもよく、
構成型のものでも調節型のものでもよい。また、プロモーター活性を向上させる
、転写阻害領域を抑制する、構成プロモーターを調節型にする、あるいはその逆
、制限部位を導入するなどのために改変してもよい。あるいは、それは発現させ
る遺伝子の天然のプロモーターであってもよい。例としては、ＣＭＶ（サイトメ
ガロウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＨＳＶ−１ウイルスＴＫ遺伝
子、ＳＶ４０ウイルス（シミアン肉腫ウイルス４０）初期、およびＭＬＰアデノ
ウイルスプロモーター、またはネズミもしくはヒトＰＧＫ（ホスホグリセレート
キナーゼ）１−アンチトリプシン（肝特異的）および免疫グロブリン（リンパ球
特異的）遺伝子の真核生物プロモーターが挙げられる。
転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を可能とするエレメントの総てを意味
するものとする。これらのうち、プロモーターが特に重要である。本発明におい
て、それは真核生物起源またはウイルス起源のいずれの遺伝子であってもよく、
構成型のものでも調節型のものでもよい。また、プロモーター活性を向上させる
、転写阻害領域を抑制する、構成プロモーターを調節型にする、あるいはその逆
、制限部位を導入するなどのために改変してもよい。あるいは、それは発現させ
る遺伝子の天然のプロモーターであってもよい。例としては、ＣＭＶ（サイトメ
ガロウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＨＳＶ−１ウイルスＴＫ遺伝
子、ＳＶ４０ウイルス（シミアン肉腫ウイルス４０）初期、およびＭＬＰアデノ
ウイルスプロモーター、またはネズミもしくはヒトＰＧＫ（ホスホグリセレート
キナーゼ）１−アンチトリプシン（肝特異的）および免疫グロブリン（リンパ球
特異的）遺伝子の真核生物プロモーターが挙げられる。
【００７４】
もちろん本発明で使用される目的遺伝子はまた、発現に必要なさらなるエレメ
ント（イントロン配列、シグナル配列、核局在化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳ
または他のタイプの翻訳開始部位など）、あるいは宿主細胞でのその維持のため
に必要なさらなるエレメントを含んでもよい。かかるエレメントは当業者に公知
である。
ント（イントロン配列、シグナル配列、核局在化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳ
または他のタイプの翻訳開始部位など）、あるいは宿主細胞でのその維持のため
に必要なさらなるエレメントを含んでもよい。かかるエレメントは当業者に公知
である。
【００７５】
しかしながら本発明はまた、組み込まれるゲノムがアデノウイルスゲノムでは
ないウイルス粒子に関する。この場合、ウイルスゲノムは好ましくは非外被タン
パク質に相当するウイルスゲノムから選択される(Fields et al., 1990, Virolo
gy, Raven Press, NY)。この特定の具体例によれば、本発明の改変型繊維または
ペプチドは下記のいずれかにより粒子に組み込めばよい：
ないウイルス粒子に関する。この場合、ウイルスゲノムは好ましくは非外被タン
パク質に相当するウイルスゲノムから選択される(Fields et al., 1990, Virolo
gy, Raven Press, NY)。この特定の具体例によれば、本発明の改変型繊維または
ペプチドは下記のいずれかにより粒子に組み込めばよい：
【００７６】
（ｉ）相当する核酸配列を目的のウイルスゲノムにクローニングすることによ
る（例えば融合タンパク質の発現）、 （ii）目的のウイルスの生産に関して天然で得られた粒子を改変することによ
る（例えば、化学ポストグラフトによる）、または （iii）ウイルスゲノムを、本発明の改変型繊維を含んでなるアデノウイルス
起源の粒子中にその包膜に必要なシグナルを有するように改変することによる（
組み換えられたアデノウイルスキャプシドタンパク質を産生する補足細胞系およ
びヘルパーベクターの使用）。
る（例えば融合タンパク質の発現）、 （ii）目的のウイルスの生産に関して天然で得られた粒子を改変することによ
る（例えば、化学ポストグラフトによる）、または （iii）ウイルスゲノムを、本発明の改変型繊維を含んでなるアデノウイルス
起源の粒子中にその包膜に必要なシグナルを有するように改変することによる（
組み換えられたアデノウイルスキャプシドタンパク質を産生する補足細胞系およ
びヘルパーベクターの使用）。
【００７７】
本発明はまた本発明の繊維またはペプチド断片をコードするＤＮＡ断片に関し
、また、かかるＤＮＡ断片を含んでなる発現ベクターに関する。この目的のため
には、プラスミド起源のものであれウイルス起源のものであれ、組込み型のもの
であれ非組込み型のものであれ、いずれのタイプのベクターを用いてもよい。か
かるベクターは市販されているか、文献に記載されている。同様に、当業者なら
ば本発明のＤＮＡ断片の発現に必要な調節エレメントを採用することができる。
本発明の特定の例では、このベクターは好適な培養条件下で本発明のアデノウイ
ルス粒子、すなわちアデノウイルスまたは上記のような組換えアデノウイルスを
産生し得るアデノウイルスベクターである。
、また、かかるＤＮＡ断片を含んでなる発現ベクターに関する。この目的のため
には、プラスミド起源のものであれウイルス起源のものであれ、組込み型のもの
であれ非組込み型のものであれ、いずれのタイプのベクターを用いてもよい。か
かるベクターは市販されているか、文献に記載されている。同様に、当業者なら
ば本発明のＤＮＡ断片の発現に必要な調節エレメントを採用することができる。
本発明の特定の例では、このベクターは好適な培養条件下で本発明のアデノウイ
ルス粒子、すなわちアデノウイルスまたは上記のような組換えアデノウイルスを
産生し得るアデノウイルスベクターである。
【００７８】
本発明はまた、下記に従い本発明のアデノウイルス偽粒子を製造する方法に関
する： （ｉ）本発明の改変型繊維をコードするアデノウイルスゲノムを好適な細胞系
、例えば２９３系もしくはＰＥＲＣ６系、または誘導系もしくは同等系にトラン
スフェクトし； （ii）そのトランスフェクト細胞系を、上記アデノウイルスまたは組換えアデ
ノウイルスを産生させるのに好適な条件下で培養し、さらに （iii）細胞溶解物を密度勾配、特に例えば塩化セシウム勾配で精製すること
により、エンプティー偽粒子を回収する。 このエンプティー偽粒子沈降物は、例えば塩化セシウム１．３ｇ／ｍｌである
が、組換えアデノウイルス（アデノウイルスゲノムを含有する粒子）沈降物自体
は１．３４ｇ／ｍｌである(D'Hallivin, 1995, Cur. Top. Microbiol. Immunol,
199, 47-66)。
する： （ｉ）本発明の改変型繊維をコードするアデノウイルスゲノムを好適な細胞系
、例えば２９３系もしくはＰＥＲＣ６系、または誘導系もしくは同等系にトラン
スフェクトし； （ii）そのトランスフェクト細胞系を、上記アデノウイルスまたは組換えアデ
ノウイルスを産生させるのに好適な条件下で培養し、さらに （iii）細胞溶解物を密度勾配、特に例えば塩化セシウム勾配で精製すること
により、エンプティー偽粒子を回収する。 このエンプティー偽粒子沈降物は、例えば塩化セシウム１．３ｇ／ｍｌである
が、組換えアデノウイルス（アデノウイルスゲノムを含有する粒子）沈降物自体
は１．３４ｇ／ｍｌである(D'Hallivin, 1995, Cur. Top. Microbiol. Immunol,
199, 47-66)。
【００７９】
もう一つの方法によれば、改変型包膜配列を有し、本発明の改変型繊維をコー
ドするＤＮＡ断片も含むアデノウイルスゲノムを好適な細胞へ導入した後にエン
プティー偽粒子を得ることができる。包膜領域の改変により、アデノウイルスゲ
ノムの粒子への包膜現象を低下、またはなくすことさえ可能となる(Grable and
Hearing, 1992, J. Virol, 66, 723-731)。培養後の製造工程は上記の場合と同
じである。
ドするＤＮＡ断片も含むアデノウイルスゲノムを好適な細胞へ導入した後にエン
プティー偽粒子を得ることができる。包膜領域の改変により、アデノウイルスゲ
ノムの粒子への包膜現象を低下、またはなくすことさえ可能となる(Grable and
Hearing, 1992, J. Virol, 66, 723-731)。培養後の製造工程は上記の場合と同
じである。
【００８０】
本発明はまた、下記に従いアデノウイルスまたは組換えアデノウイルス（アデ
ノウイルス粒子または組換えアデノウイルス粒子）を製造する方法に関する： （ｉ）組換え体であってもなくてもよく、また、複製欠陥であってもなくても
よい上記アデノウイルスのゲノムを好適な細胞系（２９３、ＰＥＲＣ６、または
誘導系もしくは同等系）にトランスフェクトし、 （ii）そのトランスフェクト細胞系を、上記アデノウイルスまたは組換えアデ
ノウイルスを産生させるのに好適な条件下で培養し（アデノウイルス粒子につい
ても可能である）、さらに （iii）アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスをトランスフェクト細胞
系培養物から回収し、所望により （iv）アデノウイルスを精製する。
ノウイルス粒子または組換えアデノウイルス粒子）を製造する方法に関する： （ｉ）組換え体であってもなくてもよく、また、複製欠陥であってもなくても
よい上記アデノウイルスのゲノムを好適な細胞系（２９３、ＰＥＲＣ６、または
誘導系もしくは同等系）にトランスフェクトし、 （ii）そのトランスフェクト細胞系を、上記アデノウイルスまたは組換えアデ
ノウイルスを産生させるのに好適な条件下で培養し（アデノウイルス粒子につい
ても可能である）、さらに （iii）アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスをトランスフェクト細胞
系培養物から回収し、所望により （iv）アデノウイルスを精製する。
【００８１】
細胞系の選択は適当であれば本発明のアデノウイルスの欠損機能によって異な
る。トランスで欠損機能を提供し得る補足系が特に使用される。Ｅ１機能を補足
するには２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）またはＰＥＲＣ６（ＥＣＡＣＣ
９６０２２９４０）系が最も特に好適である(それぞれGraham et al., 1977, J.
Gen. Virol. 36, 59-72またはＷＯ９７／００３２６)。フランス特許出願ＦＲ
２７３７２２２（９６／０４４１３）に記載されているうちの一系統であるＥ１
およびＥ２またはＥ４の二重欠損も使用できる。また、いずれかの宿主細胞中で
本発明の欠陥アデノウイルスを補足する補助ウイルス、またはそのエレメントが
互いに依存的である補足細胞と補助ウイルスを用いる混合系を使用することもで
きる。欠陥アデノウイルスを増殖させる手段は当業者には公知であり、例えばGr
aham and Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, vol. 7, pp. 190-128
; Ed. E J Murey, The Human Press Inc. を参照することができる。アデノウイ
ルスゲノムはin vitroにて大腸菌(E. coli)中で、連結または相同組換えによる
再構築するのが好ましい（例えば、フランス出願ＦＲ２７２７６８９（９４／１
４４７０）参照）。精製方法も当技術の範囲内で記載されている。密度勾配遠心
分離法が挙げられる。
る。トランスで欠損機能を提供し得る補足系が特に使用される。Ｅ１機能を補足
するには２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）またはＰＥＲＣ６（ＥＣＡＣＣ
９６０２２９４０）系が最も特に好適である(それぞれGraham et al., 1977, J.
Gen. Virol. 36, 59-72またはＷＯ９７／００３２６)。フランス特許出願ＦＲ
２７３７２２２（９６／０４４１３）に記載されているうちの一系統であるＥ１
およびＥ２またはＥ４の二重欠損も使用できる。また、いずれかの宿主細胞中で
本発明の欠陥アデノウイルスを補足する補助ウイルス、またはそのエレメントが
互いに依存的である補足細胞と補助ウイルスを用いる混合系を使用することもで
きる。欠陥アデノウイルスを増殖させる手段は当業者には公知であり、例えばGr
aham and Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, vol. 7, pp. 190-128
; Ed. E J Murey, The Human Press Inc. を参照することができる。アデノウイ
ルスゲノムはin vitroにて大腸菌(E. coli)中で、連結または相同組換えによる
再構築するのが好ましい（例えば、フランス出願ＦＲ２７２７６８９（９４／１
４４７０）参照）。精製方法も当技術の範囲内で記載されている。密度勾配遠心
分離法が挙げられる。
【００８２】
本発明はまた、それを発現させるエレメントの制御下に置かれた本発明の繊維
をコードするＤＮＡ断片を、ゲノム組込み型またはエピソーム型のいずれかとし
て含んでなる細胞系に関する。この系統はＥ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１−Ｌ５領
域によりコードされるものから選択される一以上のアデノウイルスの機能を補足
する細胞に由来するものであってよい。２９３系またはＰＥＲＣ６系由来のもの
が好ましい。かかる系統はアデノウイルス、特に（非機能性繊維もしくは「再指
定(redirected)」繊維を産生させるように、または繊維を産生させないように）
そのゲノムが繊維をコードする配列の総てまたは一部を欠いた組換えアデノウイ
ルスを作製するのに有用である。
をコードするＤＮＡ断片を、ゲノム組込み型またはエピソーム型のいずれかとし
て含んでなる細胞系に関する。この系統はＥ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１−Ｌ５領
域によりコードされるものから選択される一以上のアデノウイルスの機能を補足
する細胞に由来するものであってよい。２９３系またはＰＥＲＣ６系由来のもの
が好ましい。かかる系統はアデノウイルス、特に（非機能性繊維もしくは「再指
定(redirected)」繊維を産生させるように、または繊維を産生させないように）
そのゲノムが繊維をコードする配列の総てまたは一部を欠いた組換えアデノウイ
ルスを作製するのに有用である。
【００８３】
このため、本発明はまた、繊維をコードする配列の総てまたは一部を欠くアデ
ノウイルスゲノムを含むアデノウイルス粒子の生産方法に関し、 （ｉ）そのゲノムを上記細胞系にトランスフェクトし、 （ii）そのトランスフェクト細胞をアデノウイルス粒子を産生させるのに好適
な条件下で培養し、 （iii）トランスフェクト細胞系培養物からアデノウイルス粒子を回収し、所
望により （iv）アデノウイルス粒子を精製する ことを特徴とする。
ノウイルスゲノムを含むアデノウイルス粒子の生産方法に関し、 （ｉ）そのゲノムを上記細胞系にトランスフェクトし、 （ii）そのトランスフェクト細胞をアデノウイルス粒子を産生させるのに好適
な条件下で培養し、 （iii）トランスフェクト細胞系培養物からアデノウイルス粒子を回収し、所
望により （iv）アデノウイルス粒子を精製する ことを特徴とする。
【００８４】
本発明はまた、本発明のアデノウイルスで感染可能であるか、または本発明の
方法を用いて得ることができる宿主細胞も包含する。哺乳類細胞、特にヒト細胞
であるのが有利である。それは一次細胞または腫瘍細胞であってもよく、例えば
造血系（全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球またはマクロファージなど）、筋
、鼻、肺、気管、肝、上皮、網膜（例えば、ＨＥＲ（ヒト胎児網膜細胞））また
は繊維芽起源などいずれを起源とするものであってもよい。
方法を用いて得ることができる宿主細胞も包含する。哺乳類細胞、特にヒト細胞
であるのが有利である。それは一次細胞または腫瘍細胞であってもよく、例えば
造血系（全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球またはマクロファージなど）、筋
、鼻、肺、気管、肝、上皮、網膜（例えば、ＨＥＲ（ヒト胎児網膜細胞））また
は繊維芽起源などいずれを起源とするものであってもよい。
【００８５】
本発明の課題はまた、治療薬または予防薬として、本発明の、または本発明の
方法を用いて得ることができる宿主細胞、ウイルス粒子、特にアデノウイルス粒
子、または偽粒子（ウイルス系または人工）を、医薬上許容される支持体と組み
合わせて含んでなる組成物でもある。本発明の組成物は特に、遺伝子疾患（血友
病、嚢包性繊維症、糖尿病またはデュシェーヌ筋障害、ベッカー筋障害など）、
発癌遺伝子またはウイルスによって引き起こされるものなどの癌、ＢまたはＣ型
肝炎およびＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染による後天性免疫不全症候群）、およびヘルペ
スウイルスによって引き起こされるウイルス感染などの再発性ウイルス病といっ
たウイルス病のような疾病の予防的または治療的処置に向けて意図される。
方法を用いて得ることができる宿主細胞、ウイルス粒子、特にアデノウイルス粒
子、または偽粒子（ウイルス系または人工）を、医薬上許容される支持体と組み
合わせて含んでなる組成物でもある。本発明の組成物は特に、遺伝子疾患（血友
病、嚢包性繊維症、糖尿病またはデュシェーヌ筋障害、ベッカー筋障害など）、
発癌遺伝子またはウイルスによって引き起こされるものなどの癌、ＢまたはＣ型
肝炎およびＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染による後天性免疫不全症候群）、およびヘルペ
スウイルスによって引き起こされるウイルス感染などの再発性ウイルス病といっ
たウイルス病のような疾病の予防的または治療的処置に向けて意図される。
【００８６】
特定の具体例によれば、また米国特許第５，９２８，９４４号に記載されてい
るように、本発明のウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子、またはウイルスも
しくは人工偽粒子を含有する組成物はまた、核酸、および例えば一価陽イオン脂
質（例えば、ＤＯＴＭＡ、リポフェクチン、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥなど）、多価
陽イオン脂質（ＤＯＧＳ、ｔトランスフェクタム、リポフェクタミンなど）、コ
レステロールもしくはその誘導体、リン脂質、ポリカルベン（ポリブレンなど）
、炭水化物（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアミノ酸など）、陽イオンポリマー
などのような陽イオン物質も含んでなる。それはまた中性または非荷電脂質を含
んでもよい。好ましくは、この核酸は、宿主細胞でのその発現に必要なエレメン
トの制御下に置かれた一以上の目的遺伝子および／または上記のような選択マー
カーを含む。
るように、本発明のウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子、またはウイルスも
しくは人工偽粒子を含有する組成物はまた、核酸、および例えば一価陽イオン脂
質（例えば、ＤＯＴＭＡ、リポフェクチン、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥなど）、多価
陽イオン脂質（ＤＯＧＳ、ｔトランスフェクタム、リポフェクタミンなど）、コ
レステロールもしくはその誘導体、リン脂質、ポリカルベン（ポリブレンなど）
、炭水化物（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアミノ酸など）、陽イオンポリマー
などのような陽イオン物質も含んでなる。それはまた中性または非荷電脂質を含
んでもよい。好ましくは、この核酸は、宿主細胞でのその発現に必要なエレメン
トの制御下に置かれた一以上の目的遺伝子および／または上記のような選択マー
カーを含む。
【００８７】
本発明の組成物は常法にて製造できる。特に治療薬または予防薬は医薬上許容
される支持体または希釈剤と組み合わせる。かかる支持体または希釈剤は患者に
無毒なものである。それは注射液、ｐＨがin vivoでの使用に適合している等張
液、またはデキストロース溶液、グリセロール溶液、マンニトール溶液などであ
ってよく、また所望により薬理上適合する分散剤および／または湿潤剤を含んで
もよい。
される支持体または希釈剤と組み合わせる。かかる支持体または希釈剤は患者に
無毒なものである。それは注射液、ｐＨがin vivoでの使用に適合している等張
液、またはデキストロース溶液、グリセロール溶液、マンニトール溶液などであ
ってよく、また所望により薬理上適合する分散剤および／または湿潤剤を含んで
もよい。
【００８８】
本発明の組成物は局所投与、全身投与、またはエアゾルにより、特に胃内、皮
下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、肺内、鼻内、または気管内経路
によって投与してもよい。投与は一回量で行っても、一定の期間をおいた後に一
回以上の反復用量で行ってもよい。好適な投与経路および用量は種々のパラメー
ター、例えば、個体または治療する疾病、あるいは導入する目的遺伝子によって
異なる。特に、本発明のウイルス粒子は１０４〜１０１４ｐｆｕ（プラーク形成
単位）、有利には１０５〜１０１３ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１２ｐｆｕ
の間の投与形で処方すればよい。この製剤にはまた、医薬上許容されるアジュバ
ントまたは賦形剤を含んでもよい。本発明の組成物はまた、選択される投与経路
に応じて、固体または半固体剤形、特にガス、錠剤、カプセル剤、散剤、ゼラチ
ンカプセル剤、顆粒剤、クリーム剤、水剤、坐剤、またはエアゾル剤の剤形で処
方してもよい。
下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、肺内、鼻内、または気管内経路
によって投与してもよい。投与は一回量で行っても、一定の期間をおいた後に一
回以上の反復用量で行ってもよい。好適な投与経路および用量は種々のパラメー
ター、例えば、個体または治療する疾病、あるいは導入する目的遺伝子によって
異なる。特に、本発明のウイルス粒子は１０４〜１０１４ｐｆｕ（プラーク形成
単位）、有利には１０５〜１０１３ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１２ｐｆｕ
の間の投与形で処方すればよい。この製剤にはまた、医薬上許容されるアジュバ
ントまたは賦形剤を含んでもよい。本発明の組成物はまた、選択される投与経路
に応じて、固体または半固体剤形、特にガス、錠剤、カプセル剤、散剤、ゼラチ
ンカプセル剤、顆粒剤、クリーム剤、水剤、坐剤、またはエアゾル剤の剤形で処
方してもよい。
【００８９】
本発明の医薬組成物では、有効成分は当業者に公知の通常の医薬支持体を用い
て処方してよい。
て処方してよい。
【００９０】
これらの支持体は特にゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネ
シウム、タルク、スクロース、アラビアガムなどのような医薬ビヒクルを含んで
なる。
シウム、タルク、スクロース、アラビアガムなどのような医薬ビヒクルを含んで
なる。
【００９１】
有効成分を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟カプセルまたは硬カプセルに
注ぐことで、ゼラチンカプセル製剤を得ることもできる。
注ぐことで、ゼラチンカプセル製剤を得ることもできる。
【００９２】
シロップまたはエリキシルの形態の製剤は、有効成分を甘味剤、防腐剤、また
香味剤および適当な着色剤とともに含んでよい。
香味剤および適当な着色剤とともに含んでよい。
【００９３】
水分散性の散剤または顆粒剤は、有効成分を分散剤もしくは湿潤剤、または沈
殿防止剤、また香味増強剤または甘味剤との混合物として含んでよい。
殿防止剤、また香味増強剤または甘味剤との混合物として含んでよい。
【００９４】
直腸投与には、直腸温度で融解する結合剤、例えばココアバターまたはポリエ
チレングルコールを用いて製造した坐剤が用いられる。
チレングルコールを用いて製造した坐剤が用いられる。
【００９５】
有効成分はまた、所望により一以上の添加支持体とともにマイクロカプセルの
形態に処方してもよい。
形態に処方してもよい。
【００９６】
それらを細胞へ高分子（特に核酸）を導入することを促進するのに用いるとい
う点では、本発明のウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子、または偽粒子はま
た、本願の導入節に、O'Riordan et al., (1999, Human Gene Therapy, 10, 134
9-1358)または特許出願ＷＯ９８／４４１４３または米国特許第５，９２８，９
４４号に記載されるように、合成化合物または天然化合物と複合化または組み合
わせてもよい。これらの文献の内容は引用することにより本発明の一部とされる
。
う点では、本発明のウイルス粒子、特にアデノウイルス粒子、または偽粒子はま
た、本願の導入節に、O'Riordan et al., (1999, Human Gene Therapy, 10, 134
9-1358)または特許出願ＷＯ９８／４４１４３または米国特許第５，９２８，９
４４号に記載されるように、合成化合物または天然化合物と複合化または組み合
わせてもよい。これらの文献の内容は引用することにより本発明の一部とされる
。
【００９７】
最後に、本発明は、ヒトまたは動物身体の治療を意図した医薬品を製造するた
めの、本発明のペプチド断片、改変型アデノウイルス繊維、ウイルス粒子、特に
アデノウイルス粒子、偽粒子、または宿主細胞、あるいは本発明の方法を用いて
得ることができるアデノウイルスの使用に関する。第一の可能性によれば、この
医薬製品はin vivoに直接投与してもよい（例えば、静脈注射により、接近可能
な腫瘍に、エアゾルにより肺へなど）。また、患者から細胞を取り出し（骨髄幹
細胞、末梢血リンパ球、筋細胞など）、それらを当業者に公知の技術でin vitro
にてトランスフェクトまたは感染させ、それらを患者に再び投与することからな
るex vivoアプローチを採用することもできる。
めの、本発明のペプチド断片、改変型アデノウイルス繊維、ウイルス粒子、特に
アデノウイルス粒子、偽粒子、または宿主細胞、あるいは本発明の方法を用いて
得ることができるアデノウイルスの使用に関する。第一の可能性によれば、この
医薬製品はin vivoに直接投与してもよい（例えば、静脈注射により、接近可能
な腫瘍に、エアゾルにより肺へなど）。また、患者から細胞を取り出し（骨髄幹
細胞、末梢血リンパ球、筋細胞など）、それらを当業者に公知の技術でin vitro
にてトランスフェクトまたは感染させ、それらを患者に再び投与することからな
るex vivoアプローチを採用することもできる。
【００９８】
本発明はまた、本発明のアデノウイルス、または宿主細胞、または医薬組成物
の治療上の有効量をかかる治療を必要とする患者に投与する治療方法も含む。か
かる治療上の有効量とは、処置された生物において、当業者に公知の種々の技術
を用いてモニタリングできる望ましい作用が観測できるような量である。例えば
、望まし作用は、宿主の標的細胞へ核酸を導入することからなり得る。かかる導
入は、上記の導入か上記核酸によりコードされる遺伝子の発現のいずれかを証明
するいずれの方法によって評価してもよい（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よる、ノーザンまたはサザンハイブリダイゼーション解析による、コードされる
ペプチドの免疫沈降によるなど）。当業者ならば最も好適な治療上の有効量を決
定するために必要な調整を行うことができる。
の治療上の有効量をかかる治療を必要とする患者に投与する治療方法も含む。か
かる治療上の有効量とは、処置された生物において、当業者に公知の種々の技術
を用いてモニタリングできる望ましい作用が観測できるような量である。例えば
、望まし作用は、宿主の標的細胞へ核酸を導入することからなり得る。かかる導
入は、上記の導入か上記核酸によりコードされる遺伝子の発現のいずれかを証明
するいずれの方法によって評価してもよい（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よる、ノーザンまたはサザンハイブリダイゼーション解析による、コードされる
ペプチドの免疫沈降によるなど）。当業者ならば最も好適な治療上の有効量を決
定するために必要な調整を行うことができる。
【００９９】
より一般的には、本発明は、in vivoまたはin vitroにおいて目的の核酸（プ
ラスミド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ウイルスゲノムなど）の標的細胞への導入
を可能とする、本発明のペプチド断片、改変型アデノウイルス繊維、ウイルス粒
子、特にアデノウイルス粒子、偽粒子、または宿主細胞、あるいは本発明の方法
を用いて得ることができるアデノウイルスの使用に関する。
ラスミド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ウイルスゲノムなど）の標的細胞への導入
を可能とする、本発明のペプチド断片、改変型アデノウイルス繊維、ウイルス粒
子、特にアデノウイルス粒子、偽粒子、または宿主細胞、あるいは本発明の方法
を用いて得ることができるアデノウイルスの使用に関する。
【０１００】
もう一つの具体例によれば、本発明は、本発明の改変型アデノウイルス繊維に
特異的に向けられた抗体に関する。かかる抗体、最も特にはモノクローナル抗体
は、同定されたペプチドまたはポリペプチドを用いて抗体製造の分野での通常の
実施に従って、本発明のペプチド配列または改変型繊維を免疫適格動物に感作さ
せることで容易に得られる。かかる抗体、特に特異的抗体は、例えば本発明の粒
子または偽粒子を投与する患者の治療状態のモニタリングを行うのに有用である
。それらはまた、かかる治療を中断させるために本発明の粒子または偽粒子で処
置した患者にin vivo投与することを意図した組成物を製造するのに使用しても
よい。この抗体はまた、例えば、標識、または基質、特に発色性基質と反応し得
る酵素を組み込むことによってその検出を可能とするよう修飾してもよい。かか
る適用は診断分野で周知である。
特異的に向けられた抗体に関する。かかる抗体、最も特にはモノクローナル抗体
は、同定されたペプチドまたはポリペプチドを用いて抗体製造の分野での通常の
実施に従って、本発明のペプチド配列または改変型繊維を免疫適格動物に感作さ
せることで容易に得られる。かかる抗体、特に特異的抗体は、例えば本発明の粒
子または偽粒子を投与する患者の治療状態のモニタリングを行うのに有用である
。それらはまた、かかる治療を中断させるために本発明の粒子または偽粒子で処
置した患者にin vivo投与することを意図した組成物を製造するのに使用しても
よい。この抗体はまた、例えば、標識、または基質、特に発色性基質と反応し得
る酵素を組み込むことによってその検出を可能とするよう修飾してもよい。かか
る適用は診断分野で周知である。
【０１０１】
以下の実施例の目的は本発明の種々の課題を説明することであって、本質的に
何ら限定されるものではない。
何ら限定されるものではない。
【０１０２】
下記の構築物は、Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に詳述される一般的な遺
伝子操作および分子クローニング技術に従うか、市販のキットを用いた場合には
製造業者の使用説明書に従って作製した。細菌プラスミドを用いたクローニング
工程は好ましくは大腸菌５Ｋ株(Hubacek and Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50,
111-127)またはBJ5183(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580)で行った
。後者の株は優先的に相同組換え工程で用いた。ＮＭ５２２株(Stratagene)はＭ
１３ファージベクターを増殖させるのに好適である。ＰＣＲ増幅法は当業者に公
知である（例えば、PCR Protocols - A guide to mathods and applications, 1
990, Innis, Gelfand, Sninsky and White編, Academic Press Inc.参照）。制
限部位の修復については、用いた技術としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ大
断片（クレノウ）を用いて５’凸末端を埋めることからなる。Ａｄ５ヌクレオチ
ド配列は参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎＢａｎｋデータベースで用いられて
いるものである。
Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に詳述される一般的な遺
伝子操作および分子クローニング技術に従うか、市販のキットを用いた場合には
製造業者の使用説明書に従って作製した。細菌プラスミドを用いたクローニング
工程は好ましくは大腸菌５Ｋ株(Hubacek and Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50,
111-127)またはBJ5183(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580)で行った
。後者の株は優先的に相同組換え工程で用いた。ＮＭ５２２株(Stratagene)はＭ
１３ファージベクターを増殖させるのに好適である。ＰＣＲ増幅法は当業者に公
知である（例えば、PCR Protocols - A guide to mathods and applications, 1
990, Innis, Gelfand, Sninsky and White編, Academic Press Inc.参照）。制
限部位の修復については、用いた技術としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ大
断片（クレノウ）を用いて５’凸末端を埋めることからなる。Ａｄ５ヌクレオチ
ド配列は参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎＢａｎｋデータベースで用いられて
いるものである。
【０１０３】
細胞生物学については、当業者の公知の標準法に従って細胞をトランスフェク
トする。リン酸カルシウム法(Maniatis et al.,上記)が挙げられるが、ＤＥＡＥ
−デキストラン法、エレクトロポレーション、浸透圧ショックを基にした方法、
マイクロインジェクション、または陽イオン脂質の使用を基にした方法など、他
のいずれのプロトコールを用いてもよい。培養条件としては通常のものである。
以下の例では、ヒト２９３系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）およびＳｗｉｓｓ
３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＲ６(Wells et al., 1990, Science 247:
962-964)およびＮＲ６−ｈＥＧＦＲ(Schneider et al., 1986, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 83, 333-336)ネズミ系が用いられる。他の細胞系も使用できると考
えられる。
トする。リン酸カルシウム法(Maniatis et al.,上記)が挙げられるが、ＤＥＡＥ
−デキストラン法、エレクトロポレーション、浸透圧ショックを基にした方法、
マイクロインジェクション、または陽イオン脂質の使用を基にした方法など、他
のいずれのプロトコールを用いてもよい。培養条件としては通常のものである。
以下の例では、ヒト２９３系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）およびＳｗｉｓｓ
３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＲ６(Wells et al., 1990, Science 247:
962-964)およびＮＲ６−ｈＥＧＦＲ(Schneider et al., 1986, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 83, 333-336)ネズミ系が用いられる。他の細胞系も使用できると考
えられる。
【０１０４】実施例１：ＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）の受容体を発現するに対して宿主 向性を示すアデノウイルスの構築
Ａ．ＧＲＰリガンドをコードする配列の挿入（繊維−ＧＲＰ）
プラスミドｐＴＧ６５９３はｐポリII(Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-20
1)から、Ａｄ５繊維をコードする完全な遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片（ヌ
クレオチド（ｎｔ）３００４９〜３３０９３）の形で導入することにより誘導す
る。ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片（ｎｔ３１９９４−３３０９３）を単離し、同
酵素で消化したＭ１３ＴＧ１３０(Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99)へクロ
ーニングしてＭ１３ＴＧ６５２６を得る。これに対して、オリゴヌクレオチドｏ
ＴＧ７０００（配列番号２）（Sculptor in vitro変異誘発キット, Amersham）
を用いて部位指定変異誘発を行い、配列ＰＳＡＳＡＳＡＳＡＰＧＳの１２のアミ
ノ酸スペサーアームをコードするリンカーを導入する。このようにして得られた
変異ベクターＭ１３ＴＧ６５２７について第二の変異誘発を行うと、１０残基の
ＧＰＲペプチド(ＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ；Michael et al., 1995, Gene Ther. 2,
660-668)をコードする配列を導入することができる。この目的でオリゴヌクレ
オチドｏＴＧ７００１（配列番号３）を用いる。ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を
変異型ファージＭ１３ＴＧ６５２８から単離し、相同組換え法(Chartier et al.
, 1996, J. Virol. 70, 4805-4810)を用いて、ｎｔ２７０８１〜３５９３５にわ
たるＡｄ５アデノウイルスゲノム断片を有するプラスミドｐＴＧ６５９０に導入
し、ＭｕｎＩで線状化する（ｎｔ３２８２５）。ＳｐｅＩ−ＳｃａＩ断片（Ａｄ
５ゲノムのｎｔ２７０８２〜３５９３５を有する、スペーサーアームおよびＧＲ
Ｐペプチドを導入することにより改変されたもの）をｐＴＧ８５９９と呼ぶ前述
のベクターから単離した後、同酵素であらかじめ消化したｐＴＧ６５９１の同等
の断片と交換する。つまり、ｐＴＧ６５９１は２１５６２番〜３５９３５番の野
生型アデノウイルス配列を含んでなる。ｐＴＧ４６００が得られ、これからＢｓ
ｔＥII断片（ｎｔ２４８４３〜３５２２３）が単離される。Ａｄ５ゲノムを含ん
でなるプラスミドｐＴＧ３６０２との相同組換え（国際出願ＷＯ９６／１７０７
０さらに詳細に記載されている）の後、ベクターｐＴＧ４６０１が得られる。
1)から、Ａｄ５繊維をコードする完全な遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片（ヌ
クレオチド（ｎｔ）３００４９〜３３０９３）の形で導入することにより誘導す
る。ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片（ｎｔ３１９９４−３３０９３）を単離し、同
酵素で消化したＭ１３ＴＧ１３０(Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99)へクロ
ーニングしてＭ１３ＴＧ６５２６を得る。これに対して、オリゴヌクレオチドｏ
ＴＧ７０００（配列番号２）（Sculptor in vitro変異誘発キット, Amersham）
を用いて部位指定変異誘発を行い、配列ＰＳＡＳＡＳＡＳＡＰＧＳの１２のアミ
ノ酸スペサーアームをコードするリンカーを導入する。このようにして得られた
変異ベクターＭ１３ＴＧ６５２７について第二の変異誘発を行うと、１０残基の
ＧＰＲペプチド(ＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ；Michael et al., 1995, Gene Ther. 2,
660-668)をコードする配列を導入することができる。この目的でオリゴヌクレ
オチドｏＴＧ７００１（配列番号３）を用いる。ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を
変異型ファージＭ１３ＴＧ６５２８から単離し、相同組換え法(Chartier et al.
, 1996, J. Virol. 70, 4805-4810)を用いて、ｎｔ２７０８１〜３５９３５にわ
たるＡｄ５アデノウイルスゲノム断片を有するプラスミドｐＴＧ６５９０に導入
し、ＭｕｎＩで線状化する（ｎｔ３２８２５）。ＳｐｅＩ−ＳｃａＩ断片（Ａｄ
５ゲノムのｎｔ２７０８２〜３５９３５を有する、スペーサーアームおよびＧＲ
Ｐペプチドを導入することにより改変されたもの）をｐＴＧ８５９９と呼ぶ前述
のベクターから単離した後、同酵素であらかじめ消化したｐＴＧ６５９１の同等
の断片と交換する。つまり、ｐＴＧ６５９１は２１５６２番〜３５９３５番の野
生型アデノウイルス配列を含んでなる。ｐＴＧ４６００が得られ、これからＢｓ
ｔＥII断片（ｎｔ２４８４３〜３５２２３）が単離される。Ａｄ５ゲノムを含ん
でなるプラスミドｐＴＧ３６０２との相同組換え（国際出願ＷＯ９６／１７０７
０さらに詳細に記載されている）の後、ベクターｐＴＧ４６０１が得られる。
【０１０５】
ＬａｃＺ遺伝子を発現させるカセットを、ＣｌａＩで線状化したプラスミドｐ
ＴＧ４６０１と、Ａｄ２ ＭＬＰプロモーターの制御下β−ガラクトシダーゼを
コードするＬａｃＺ遺伝子およびＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナルを含
んでなるＢｓｒＧＩ−ＰｓｔＩ断片間の相同組換えによってＥ１アデノウイルス
領域の代わりに導入する。この断片を、Ｅ１領域（ｎｔ４５９〜３３２８）がＬ
ａｃＺ発現カセットに置き換えられているウイルスのゲノムＤＮＡ（ｎｔ１〜６
２４１）の５’末端を含むベクターｐＴＧ８５２６から単離する。その構築も当
業者の範囲内にある。最終的なベクターはｐＴＧ４６２８と呼ぶ。
ＴＧ４６０１と、Ａｄ２ ＭＬＰプロモーターの制御下β−ガラクトシダーゼを
コードするＬａｃＺ遺伝子およびＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナルを含
んでなるＢｓｒＧＩ−ＰｓｔＩ断片間の相同組換えによってＥ１アデノウイルス
領域の代わりに導入する。この断片を、Ｅ１領域（ｎｔ４５９〜３３２８）がＬ
ａｃＺ発現カセットに置き換えられているウイルスのゲノムＤＮＡ（ｎｔ１〜６
２４１）の５’末端を含むベクターｐＴＧ８５２６から単離する。その構築も当
業者の範囲内にある。最終的なベクターはｐＴＧ４６２８と呼ぶ。
【０１０６】
相当するウイルスＡｄＴＧ４６０１およびＡｄＴＧ４６２８は、ＰａｃＩ消化
によりプラスミド配列から遊離したアデノウイルス断片を２９３系にトランスフ
ェクトすることにより得られる。つまり、ＡｄＴＧ４６０１は、その繊維遺伝子
がその３’末端においてＧＲＰペプチドの前にスペーサーアームを含んでなる完
全なＡｄ５ゲノムを有する。組換えウイルスＡｄＴＧ４６２８もまた、ＭＬＰア
デノウイルスプロモーターの制御下にＬａｃＺリポーター遺伝子の発現カセット
を有する。
によりプラスミド配列から遊離したアデノウイルス断片を２９３系にトランスフ
ェクトすることにより得られる。つまり、ＡｄＴＧ４６０１は、その繊維遺伝子
がその３’末端においてＧＲＰペプチドの前にスペーサーアームを含んでなる完
全なＡｄ５ゲノムを有する。組換えウイルスＡｄＴＧ４６２８もまた、ＭＬＰア
デノウイルスプロモーターの制御下にＬａｃＺリポーター遺伝子の発現カセット
を有する。
【０１０７】
Ｂ．繊維−ＧＲＰを有するウイルスの向性に関する研究
アデノウイルス繊維にＧＲＰペプチドが存在すると、それらの表面でＧＲＰの
受容体を発現する細胞をターゲッティングすることが可能となる。この受容体を
コードするメッセンジャーの発現は２９３細胞およびＳｗｉｓｓ−３Ｔ３ネズミ
細胞において(Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7
620)ノーザンブロッティングによって検討する。常法を用いて同位元素３２Ｐで
標識した、ＧＲＰの受容体をコードする配列と相補的な２つのＤＮＡ断片の混合
物をプローブとして用いる。つまり、これらの断片は、オリゴヌクレオチドｏＴ
Ｇ１０７７６（配列番号４）およびｏＴＧ１０７８１（配列番号５）を用い、全
細胞ＲＮＡから逆ＰＣＲによって作製する(Battey et al., 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88, 395-399; Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 187
71-18779)。検出されるｍＲＮＡの強度は２９３細胞の場合よりもＳｗｉｓｓ−
３Ｔ３細胞の場合で高いが、このことはネズミ系によるＧＲＰ受容体の過剰発現
を示す。
受容体を発現する細胞をターゲッティングすることが可能となる。この受容体を
コードするメッセンジャーの発現は２９３細胞およびＳｗｉｓｓ−３Ｔ３ネズミ
細胞において(Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7
620)ノーザンブロッティングによって検討する。常法を用いて同位元素３２Ｐで
標識した、ＧＲＰの受容体をコードする配列と相補的な２つのＤＮＡ断片の混合
物をプローブとして用いる。つまり、これらの断片は、オリゴヌクレオチドｏＴ
Ｇ１０７７６（配列番号４）およびｏＴＧ１０７８１（配列番号５）を用い、全
細胞ＲＮＡから逆ＰＣＲによって作製する(Battey et al., 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88, 395-399; Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 187
71-18779)。検出されるｍＲＮＡの強度は２９３細胞の場合よりもＳｗｉｓｓ−
３Ｔ３細胞の場合で高いが、このことはネズミ系によるＧＲＰ受容体の過剰発現
を示す。
【０１０８】
競合試験は２種類の細胞で行う。競合物は大腸菌で産生されたＡｄ５繊維のノ
ブからなり、そのアデノウイルス細胞受容体結合特性はすでに示されている(Hen
ry et al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246)。細胞単層を、２％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ培地(Gibco BRL)中、ＰＢＳ、または漸増濃度の
組換えＡｄ５ノブ（０．１〜１００μｇ／ｍｌ）の存在下で３０分間プレインキ
ュベートする。次ぎに、繊維にＧＲＰペプチドを含むＡｄＴＧ４６２８ウイルス
を３７℃、感染多重度０．００１感染単位／細胞にて２４時間添加する。同じ試
験条件下で天然型繊維の遺伝子を有する組換えＡｄＬａｃＺウイルス(Stratford
-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630)を対照として用い
る。次にこの細胞を固定し、ＬａｃＺ遺伝子の発現を評価する(Sanes et al., 1
986, EMBO J. 5, 3133-3142)。青色の細胞の数はウイルスの感染効率を表す。競
合による阻害の結果、非感染対照（ＰＢＳ）に比べ、染色細胞の数の減少をもた
らす。
ブからなり、そのアデノウイルス細胞受容体結合特性はすでに示されている(Hen
ry et al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246)。細胞単層を、２％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ培地(Gibco BRL)中、ＰＢＳ、または漸増濃度の
組換えＡｄ５ノブ（０．１〜１００μｇ／ｍｌ）の存在下で３０分間プレインキ
ュベートする。次ぎに、繊維にＧＲＰペプチドを含むＡｄＴＧ４６２８ウイルス
を３７℃、感染多重度０．００１感染単位／細胞にて２４時間添加する。同じ試
験条件下で天然型繊維の遺伝子を有する組換えＡｄＬａｃＺウイルス(Stratford
-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630)を対照として用い
る。次にこの細胞を固定し、ＬａｃＺ遺伝子の発現を評価する(Sanes et al., 1
986, EMBO J. 5, 3133-3142)。青色の細胞の数はウイルスの感染効率を表す。競
合による阻害の結果、非感染対照（ＰＢＳ）に比べ、染色細胞の数の減少をもた
らす。
【０１０９】
組換えＡｄ５ノブを１００μｇ／ｍｌの濃度で添加すると、２９３細胞のＡｄ
ＬａｃＺおよびＡｄＴＧ４６２８ウイルス感染を著しく阻害する（阻害程度は９
５および９８％）。このことは、競合物が存在すると、アデノウイルス繊維のそ
の天然型細胞受容体との相互作用が妨げられることを示唆する。他方、この二つ
のウイルスはＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞に対しては違った挙動をとる。競合物１０
０μｇ／ｍｌの存在下でのＡｄＴＧ４６２８ウイルスの感染は部分的に阻害され
るにすぎないが、同じ試験条件の下で、天然型繊維を有するＡｄＬａｃＺウイル
スの場合は全面的に阻害される。これらの結果はＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞のＡｄ
ＴＧ４６２８感染は一部、これらの細胞が過剰発現する独立した受容体、好まし
くはＧＲＰ受容体によって媒介される。結論として、ＧＲＰリガンドを繊維のＣ
末端に付加すると、天然型細胞受容体−繊維相互作用とは独立に、ＧＲＰ受容体
を発現する細胞の感染を促進する。
ＬａｃＺおよびＡｄＴＧ４６２８ウイルス感染を著しく阻害する（阻害程度は９
５および９８％）。このことは、競合物が存在すると、アデノウイルス繊維のそ
の天然型細胞受容体との相互作用が妨げられることを示唆する。他方、この二つ
のウイルスはＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞に対しては違った挙動をとる。競合物１０
０μｇ／ｍｌの存在下でのＡｄＴＧ４６２８ウイルスの感染は部分的に阻害され
るにすぎないが、同じ試験条件の下で、天然型繊維を有するＡｄＬａｃＺウイル
スの場合は全面的に阻害される。これらの結果はＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞のＡｄ
ＴＧ４６２８感染は一部、これらの細胞が過剰発現する独立した受容体、好まし
くはＧＲＰ受容体によって媒介される。結論として、ＧＲＰリガンドを繊維のＣ
末端に付加すると、天然型細胞受容体−繊維相互作用とは独立に、ＧＲＰ受容体
を発現する細胞の感染を促進する。
【０１１０】実施例２：ムチンを発現する腫瘍細胞に対して向性を示すアデノウイルスの構築
構築：米国特許第５，５９１，５９３号に記載されているようなＥＰＰＴペプ
チドを繊維のＣ末端に挿入する。この改変は腫瘍細胞で過剰発現するムチンに対
して結合性を付与する。
チドを繊維のＣ末端に挿入する。この改変は腫瘍細胞で過剰発現するムチンに対
して結合性を付与する。
【０１１１】
これを目的として、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９９２：配列番号３８を用
い、ベクターＭ１３ＴＧ６５２７を用いた実施例１に記載の変異誘発法を適用し
てベクターＭ１３ＴＧ６５７２を得た。ｐＴＧ４２１３（実施例４参照）との相
同組換えを行ってｐＴＧ４２７８を得た。
い、ベクターＭ１３ＴＧ６５２７を用いた実施例１に記載の変異誘発法を適用し
てベクターＭ１３ＴＧ６５７２を得た。ｐＴＧ４２１３（実施例４参照）との相
同組換えを行ってｐＴＧ４２７８を得た。
【０１１２】実施例３：α ４ β １ インテグリンを発現する腫瘍細胞に対して向性を示すアデノ ウイルスの構築
構築：米国特許第５，６２８，９７９号に記載されているようなＬＤＶペプチ
ドを繊維のＣ末端に挿入する。この改変は腫瘍細胞で過剰発現するα４β１イン
テグリンに対して結合性を付与する。
ドを繊維のＣ末端に挿入する。この改変は腫瘍細胞で過剰発現するα４β１イン
テグリンに対して結合性を付与する。
【０１１３】
これを目的として、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９９１：配列番号３９を用
い、ベクターＭ１３ＴＧ６５２７を用いた実施例１に記載の変異誘発法を適用し
てベクターＭ１３ＴＧ１３２６５を得た。
い、ベクターＭ１３ＴＧ６５２７を用いた実施例１に記載の変異誘発法を適用し
てベクターＭ１３ＴＧ１３２６５を得た。
【０１１４】実施例４：ＥＧＦ（上皮増殖因子）受容体を発現する細胞に対して宿主向性を示 すアデノウイルスの構築
この実施例では、そのＣ末端にＥＧＦ配列を有する繊維について記載する。こ
れを目的として、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６５（配列番号６）およびｏ
ＴＧ１１０６６（配列番号７）を用いて、プラスミドＭ１３ＴＧ６５２７からＨ
ｉｎｄIII−ＸｂａＩ断片を増幅する。オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６７（
配列番号８）およびｏＴＧ１１０６８（配列番号９）により、Ｍ１３ＴＧ６５２
７からのＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片（停止コドン〜ｎｔ３３０９３にわたる）の作
製が可能となる。ＡＴＣＣ（＃５９９５７）から入手されるＥＧＦ相補性ＤＮＡ
を、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６９（配列番号１０）およびｏＴＧ１１０
７０（配列番号１１）を用い、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片の形で増幅する。次ぎに
、適当な酵素で消化した３断片を連結して、繊維のＣ末端に融合したＥＧＦを含
むＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を得る。実施例１で記載したものと同じ相同組換
え法を適用してそのゲノム情報をこの断片で置き換える。
れを目的として、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６５（配列番号６）およびｏ
ＴＧ１１０６６（配列番号７）を用いて、プラスミドＭ１３ＴＧ６５２７からＨ
ｉｎｄIII−ＸｂａＩ断片を増幅する。オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６７（
配列番号８）およびｏＴＧ１１０６８（配列番号９）により、Ｍ１３ＴＧ６５２
７からのＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片（停止コドン〜ｎｔ３３０９３にわたる）の作
製が可能となる。ＡＴＣＣ（＃５９９５７）から入手されるＥＧＦ相補性ＤＮＡ
を、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６９（配列番号１０）およびｏＴＧ１１０
７０（配列番号１１）を用い、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片の形で増幅する。次ぎに
、適当な酵素で消化した３断片を連結して、繊維のＣ末端に融合したＥＧＦを含
むＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を得る。実施例１で記載したものと同じ相同組換
え法を適用してそのゲノム情報をこの断片で置き換える。
【０１１５】
しかしながら、オリゴｏＴＧ７２１３（配列番号５７）を用いてマトリックス
Ｍ１３ＴＧ６５２６に対する変異誘発の常法により、ターゲッティングされた領
域に特異なＢｓｔＢＩ部位を導入することで、クローニング工程を簡略化するこ
ともできる。実施例１に記載の一連のクローニング工程の終了時には、改変型Ａ
ｄ５の全ゲノムを有するプラスミドｐＴＧ４６０９が得られる。Ｅ１領域の代わ
りにＬａｃＺ発現カセットを有する同等物も実施例１に記載のようにして得られ
、ｐＴＧ４２１３と呼ぶ。ＢｓｔＢＩで線状化したｐＴＧ４６０９またはｐＴＧ
４２１３と、ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片との間の相同組換えによってそれぞれ
野生型Ｅ１領域またはＬａｃＺ発現カセットを有するプラスミドｐＴＧ４２２５
およびｐＴＧ４２２６が得られる。ＡｄＴＧ４２２５およびＡｄＴＧ４２２６ウ
イルスは、例えばＥＧＦ受容体を過剰発現する好適な細胞系をトランスフェクト
することで常法にて作製することができる。
Ｍ１３ＴＧ６５２６に対する変異誘発の常法により、ターゲッティングされた領
域に特異なＢｓｔＢＩ部位を導入することで、クローニング工程を簡略化するこ
ともできる。実施例１に記載の一連のクローニング工程の終了時には、改変型Ａ
ｄ５の全ゲノムを有するプラスミドｐＴＧ４６０９が得られる。Ｅ１領域の代わ
りにＬａｃＺ発現カセットを有する同等物も実施例１に記載のようにして得られ
、ｐＴＧ４２１３と呼ぶ。ＢｓｔＢＩで線状化したｐＴＧ４６０９またはｐＴＧ
４２１３と、ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片との間の相同組換えによってそれぞれ
野生型Ｅ１領域またはＬａｃＺ発現カセットを有するプラスミドｐＴＧ４２２５
およびｐＴＧ４２２６が得られる。ＡｄＴＧ４２２５およびＡｄＴＧ４２２６ウ
イルスは、例えばＥＧＦ受容体を過剰発現する好適な細胞系をトランスフェクト
することで常法にて作製することができる。
【０１１６】
これらのウイルスの感染の特異性を試験するためには、ＮＲ６ネズミ繊維芽細
胞およびヒトＥＧＦ受容体を発現するＮＲ６−ｈＥＧＦＲ細胞を用いればよい。
組換えＡｄ５ノブまたはＥＧＦとの競合により、ウイルス感染の媒介におけるＥ
ＧＦおよび天然型細胞受容体の関与を評価することができる。
胞およびヒトＥＧＦ受容体を発現するＮＲ６−ｈＥＧＦＲ細胞を用いればよい。
組換えＡｄ５ノブまたはＥＧＦとの競合により、ウイルス感染の媒介におけるＥ
ＧＦおよび天然型細胞受容体の関与を評価することができる。
【０１１７】実施例５：天然系細胞受容体との結合をなくることを目的とした繊維ノブの改変
繊維の天然型受容体と結合する能力を消失させるために、天然型細胞受容体と
の相互作用に関与するアデノウイルス繊維の領域の変異を起こしたが、リガンド
を付加することで相当するアデノウイルスの向性を改変することができる。
の相互作用に関与するアデノウイルス繊維の領域の変異を起こしたが、リガンド
を付加することで相当するアデノウイルスの向性を改変することができる。
【０１１８】
残基４４３〜４６２にわたる領域をコードするＡｄ５繊維配列に対して種々の
変異を起こした。シートＤの欠失にはオリゴヌクレオチドｏＴＧ７４１４（配列
番号１２）の、ループＣＤの欠失にはオリゴヌクレオチドｏＴＧＡ（配列番号１
３）の変異誘発を用いる。オリゴヌクレオチドｏＴＧＢ（配列番号１４）に関し
てはループＣＤおよびシートＤの欠失させる。これらのオリゴヌクレオチドは総
て変異を容易に検出できるようにし、かつ、リガンド、例えばＥＧＦペプチドを
コードする配列の挿入を可能とするＢａｍＨＩ部位を含む。
変異を起こした。シートＤの欠失にはオリゴヌクレオチドｏＴＧ７４１４（配列
番号１２）の、ループＣＤの欠失にはオリゴヌクレオチドｏＴＧＡ（配列番号１
３）の変異誘発を用いる。オリゴヌクレオチドｏＴＧＢ（配列番号１４）に関し
てはループＣＤおよびシートＤの欠失させる。これらのオリゴヌクレオチドは総
て変異を容易に検出できるようにし、かつ、リガンド、例えばＥＧＦペプチドを
コードする配列の挿入を可能とするＢａｍＨＩ部位を含む。
【０１１９】
もう一つの一連の改変は、これらの欠失領域をＡｄ３繊維に由来する同等配列
で置き換えることにある。実際に多くのデータが、Ａｄ５とＡｄ３が同じ受容体
には結合しないことから、このような置換がＡｄ５受容体、およびＡｄ３受容体
を有する標的細胞によって媒介される感染をなくすはずであることを示している
。Ａｄ５ループＣＤをＡｄ３のそれで置換するにはｏＴＧ１１１３５（配列番号
１５）を用い、Ａｄ５繊維のシートＤの、Ａｄ３繊維のそれでの置換は、オリゴ
ヌクレオチドｏＴＧ１０３５０（配列番号１６）を用いてなし、また、Ａｄ５の
シートＤおよびループＣＤの、Ａｄ３のそれでの置換は、ｏＴＧ１１１３６（配
列番号１７）を用いて前述の変異体に対して行う。
で置き換えることにある。実際に多くのデータが、Ａｄ５とＡｄ３が同じ受容体
には結合しないことから、このような置換がＡｄ５受容体、およびＡｄ３受容体
を有する標的細胞によって媒介される感染をなくすはずであることを示している
。Ａｄ５ループＣＤをＡｄ３のそれで置換するにはｏＴＧ１１１３５（配列番号
１５）を用い、Ａｄ５繊維のシートＤの、Ａｄ３繊維のそれでの置換は、オリゴ
ヌクレオチドｏＴＧ１０３５０（配列番号１６）を用いてなし、また、Ａｄ５の
シートＤおよびループＣＤの、Ａｄ３のそれでの置換は、ｏＴＧ１１１３６（配
列番号１７）を用いて前述の変異体に対して行う。
【０１２０】
このアデノウイルスノブの標的領域はまた、一連の点変異によっても改変され
る： ベンドａａＧＳＬＡの、ベンドａａＤＫＬＴでの置換：ｏＴＧＣ（配列番号１
８）、 ベンドａａＳＧＴＶの、ベンドａａＤＫＬＴでの置換：ｏＴＧＤ（配列番号１
８）、 Ｇ４４３からＤ：ｏＴＧＥ（配列番号２０）、 Ｌ４４５からＦ：ｏＴＧＦ（配列番号２１）、 Ｇ４５０からＮ：ｏＴＧＧ（配列番号２２）、 Ｔ４５１からＫ：ｏＴＧＨ（配列番号２３）、 Ｖ４５２からＮ：ｏＴＧＩ（配列番号２４）、 Ａ４５５からＦ：ｏＴＧＪ（配列番号２５）、 Ｌ４５７からＡ：ｏＴＧＫ（配列番号２６）、 Ｉ４５９からＡ：ｏＴＧＬ（配列番号２７）。
る： ベンドａａＧＳＬＡの、ベンドａａＤＫＬＴでの置換：ｏＴＧＣ（配列番号１
８）、 ベンドａａＳＧＴＶの、ベンドａａＤＫＬＴでの置換：ｏＴＧＤ（配列番号１
８）、 Ｇ４４３からＤ：ｏＴＧＥ（配列番号２０）、 Ｌ４４５からＦ：ｏＴＧＦ（配列番号２１）、 Ｇ４５０からＮ：ｏＴＧＧ（配列番号２２）、 Ｔ４５１からＫ：ｏＴＧＨ（配列番号２３）、 Ｖ４５２からＮ：ｏＴＧＩ（配列番号２４）、 Ａ４５５からＦ：ｏＴＧＪ（配列番号２５）、 Ｌ４５７からＡ：ｏＴＧＫ（配列番号２６）、 Ｉ４５９からＡ：ｏＴＧＬ（配列番号２７）。
【０１２１】
ｏＴＧＥからＩはＡｄ５とＡｄ３の間で非保存的なアミノ酸上のアデノウイル
ス繊維のループＣＤに変異を導入し、一方、ｏＴＧＣからＫは構造を安定化させ
る水素結合には関与しないシートＤのアミノ酸を考慮する。
ス繊維のループＣＤに変異を導入し、一方、ｏＴＧＣからＫは構造を安定化させ
る水素結合には関与しないシートＤのアミノ酸を考慮する。
【０１２２】
変異誘発はベクターＭ１３ＴＧ６５２６またはＭ１３ＴＧ６５２８に対して行
ってもよい。前者は野生型ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を有し、後者はＧＲＰ配
列の挿入によって改変されたこの同じ断片を有する。アデノウイルスゲノムを有
するプラスミドはプラスミドｐＴＧ４２２５（野生型Ｅ１）およびｐＴＧ４２２
６（Ｅ１領域の代わりにＬａｃＺ）に関してこれまでに記載したように再構成す
ればよい。これらのウイルスは２９３細胞、または考慮するリガンドと結合する
受容体を過剰発現する細胞をトランスフェクトすることで作製する。かかる細胞
は相当する相補的ＤＮＡをトランスフェクトすることで作製することができる。
アデノウイルスの天然型細胞受容体を天然では発現しない細胞、例えばＤａｕｄ
ｉ系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）を使用するのが好ましい。
ってもよい。前者は野生型ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を有し、後者はＧＲＰ配
列の挿入によって改変されたこの同じ断片を有する。アデノウイルスゲノムを有
するプラスミドはプラスミドｐＴＧ４２２５（野生型Ｅ１）およびｐＴＧ４２２
６（Ｅ１領域の代わりにＬａｃＺ）に関してこれまでに記載したように再構成す
ればよい。これらのウイルスは２９３細胞、または考慮するリガンドと結合する
受容体を過剰発現する細胞をトランスフェクトすることで作製する。かかる細胞
は相当する相補的ＤＮＡをトランスフェクトすることで作製することができる。
アデノウイルスの天然型細胞受容体を天然では発現しない細胞、例えばＤａｕｄ
ｉ系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）を使用するのが好ましい。
【０１２３】実施例６：天然型細胞受容体との結合をなくすことを目的とした繊維ノブの改変
Ａ．繊維配列の改変
繊維の天然型受容体と結合する能力を消失させるために、アデノウイルス繊維
のＡＢ領域（残基４０４〜４１８）の変異を起こしたが、リガンドを付加するこ
とで相当するアデノウイルスの向性を改変することができる。
のＡＢ領域（残基４０４〜４１８）の変異を起こしたが、リガンドを付加するこ
とで相当するアデノウイルスの向性を改変することができる。
【０１２４】
ループＡＢにおける、オリゴｏＴＧ１２４９９（配列番号４０）を用いた血清
型３の４０８番のセリンのグルタミン酸残基での置換； ループＡＢにおける、オリゴｏＴＧ１２４９８（配列番号４１）を用いた血清
型３の４０６番のアラニンのリジン残基での置換； ループＡＢにおける、オリゴｏＴＧ１２７４０（配列番号４２）を用いた血清
型３の４０４番のトレオニンのグリシン残基での置換。
型３の４０８番のセリンのグルタミン酸残基での置換； ループＡＢにおける、オリゴｏＴＧ１２４９８（配列番号４１）を用いた血清
型３の４０６番のアラニンのリジン残基での置換； ループＡＢにおける、オリゴｏＴＧ１２７４０（配列番号４２）を用いた血清
型３の４０４番のトレオニンのグリシン残基での置換。
【０１２５】
変異誘発はベクターＭ１３ＴＧ６５２６またはＭ１３ＴＧ６５２８に対して行
ってもよい。前者は野生型ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を有し、後者はＧＲＰ配
列の挿入によって改変されたこの同じ断片を有する。アデノウイルスゲノムを有
するプラスミドはプラスミドｐＴＧ４２２５（野生型Ｅ１）およびｐＴＧ４２２
６（Ｅ１領域の代わりにＬａｃＺ）に関してこれまでに記載したように再構成す
ればよい（プラスミドｐＴＧ４６０９またはｐＴＧ４２１３との相同組換え）。
これらのウイルスは２９３細胞、野生型繊維を発現する２９３細胞(Legrand et
al., 1999; J. Virol., 73, 907-919)、または考慮するリガンドと結合する受容
体を過剰発現する細胞をトランスフェクトすることで作製する。かかる細胞は相
当する相補的ＤＮＡをトランスフェクトすることで作製することができる。アデ
ノウイルスの天然型細胞受容体を天然では発現しない細胞、例えばＤａｕｄｉ系
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）を使用するのが好ましい。
ってもよい。前者は野生型ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ断片を有し、後者はＧＲＰ配
列の挿入によって改変されたこの同じ断片を有する。アデノウイルスゲノムを有
するプラスミドはプラスミドｐＴＧ４２２５（野生型Ｅ１）およびｐＴＧ４２２
６（Ｅ１領域の代わりにＬａｃＺ）に関してこれまでに記載したように再構成す
ればよい（プラスミドｐＴＧ４６０９またはｐＴＧ４２１３との相同組換え）。
これらのウイルスは２９３細胞、野生型繊維を発現する２９３細胞(Legrand et
al., 1999; J. Virol., 73, 907-919)、または考慮するリガンドと結合する受容
体を過剰発現する細胞をトランスフェクトすることで作製する。かかる細胞は相
当する相補的ＤＮＡをトランスフェクトすることで作製することができる。アデ
ノウイルスの天然型細胞受容体を天然では発現しない細胞、例えばＤａｕｄｉ系
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）を使用するのが好ましい。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】Ｂ．ウイルス粒子への改変型繊維の組込みおよび相当するアデノウイルスのエン トリーにおけるその使用
変異型ウイルスが実際にそれらのキャプシドに変異型繊維タンパク質を有する
ことを確認するために、２９３細胞で増幅した後に精製したウイルスを、変性条
件下の１０％アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にロードした。硝酸銀染
色により、種々のタンパク質を検出する。あるいは、繊維を、Ａｄ５繊維のノブ
に向けられた血清を用いてウエスタンブロッティングを行うことにより特異的に
検出する(Henry et al., 1994,上記)。予測されたサイズにおける強いシグナル
は、それらのウイルスが理論量の目的タンパク質を組み込んでいることを示す。
三量体繊維だけがペントンベースに結合することができ(Novelli and Boulanger
, 1991,上記)、粒子に組み込まれ得るとすると、上記試験のタンパク質の欠失は
、変異型繊維が依然として三量体を形成し得ることを示す。
ことを確認するために、２９３細胞で増幅した後に精製したウイルスを、変性条
件下の１０％アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にロードした。硝酸銀染
色により、種々のタンパク質を検出する。あるいは、繊維を、Ａｄ５繊維のノブ
に向けられた血清を用いてウエスタンブロッティングを行うことにより特異的に
検出する(Henry et al., 1994,上記)。予測されたサイズにおける強いシグナル
は、それらのウイルスが理論量の目的タンパク質を組み込んでいることを示す。
三量体繊維だけがペントンベースに結合することができ(Novelli and Boulanger
, 1991,上記)、粒子に組み込まれ得るとすると、上記試験のタンパク質の欠失は
、変異型繊維が依然として三量体を形成し得ることを示す。
【０１２８】
相当する変異型ウイルスのエントリーを可能とすることを目的とした変異型繊
維の使用は、実施例１Ｂに記載の組換えノブを用いた競合試験を行うことで検討
することができる。飽和濃度の野生型ペプチドの存在下での有効な感染は、天然
型一次受容体との結合の感染依存を示す。このことはその受容体に対するその改
変型変異の親和性の著しい低下を示唆する。
維の使用は、実施例１Ｂに記載の組換えノブを用いた競合試験を行うことで検討
することができる。飽和濃度の野生型ペプチドの存在下での有効な感染は、天然
型一次受容体との結合の感染依存を示す。このことはその受容体に対するその改
変型変異の親和性の著しい低下を示唆する。
【０１２９】実施例７：上記の繊維改変の一つと併用する繊維以外のキャプシドタンパク質へ のリガンドの挿入
この実施例では、ＥＧＦリガンドの、ヘキソンキャプシドタンパク質への挿入
について記載する。もちろん、相当するアデノウイルスにとっては天然型細胞受
容体に付着する能力を欠いていることが好ましい。そのゲノムは例えば、改変型
繊維遺伝子を含んでいてもよいし、あるいは繊維配列の少なくとも一部を欠いて
いてもよい。
について記載する。もちろん、相当するアデノウイルスにとっては天然型細胞受
容体に付着する能力を欠いていることが好ましい。そのゲノムは例えば、改変型
繊維遺伝子を含んでいてもよいし、あるいは繊維配列の少なくとも一部を欠いて
いてもよい。
【０１３０】
ヘキソン（ｎｔ１８８４２〜２１７００）をコードするＡｄ５ゲノムの領域に
わたる相同組換えのための導入キャプシドを構築する。Ａｄ５のＨｉｎｄIII−
ＸｈｏＩ断片（ｎｔ１８８３６−２４８１６）を同酵素で消化したｐＢＳＫ＋(S
tratagene)へクローニングしてプラスミドｐＴＧ４２２４を得る。ＰＣＲにより
キメラ断片：ヘキソン（ｎｔ１９０４３−１９４７）−ＸｂａＩ−ＥＧＦ−Ｂｓ
ｒＧＩ−ヘキソン（ｎｔ１９６９９０−２０３１２）を作出することで、ＥＧＦ
ペプチドをコードする配列をヘキソンの超可変ループＬ１に導入する。断片ｎｔ
１９０４３〜１９６４７は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１１０２（配列番号２
８）およびｏＴＧ１１１０３（配列番号２９）とともにプラスミドｐＴＧ３６２
０を用いたＰＣＲ増幅により得る。断片ｎｔ１９６９９〜２０３１２は、オリゴ
ヌクレオチドｏＴＧ１１１０４（配列番号３０）およびｏＴＧ１１１０５（配列
番号３１）を用いて同じＤＮＡから増幅する。ＥＧＦは、オリゴヌクレオチドｏ
ＴＧ１１１０６（配列番号３２）およびｏＴＧ１１１０７（配列番号３３）とと
もにｃＤＮＡを用いてクローニングすれば、ＥＧＦコード配列はフレーム内でヘ
キソンに置き換わることができる。このＰＣＲ産物を適当な酵素で消化した後に
連結する。次ぎに、このキメラ断片を相同組換えにより、ＮｄｅＩで線状化した
（ｎｔ１９５４９）プラスミドｐＴＧ４２２４に挿入してｐＲＧ４２２９を得る
。次ぎに、ＨｉｎｄIII／ＨｈｏＩ消化によってこの改変型ヘキソンをコードす
る配列が得られ、相同組換えによってゲノム情報に再度置く。ＳｇｆＩで線状化
したベクターｐＴＧ３６０２、ｐＴＧ４６０７またはｐＴＧ４６２９、あるいは
繊維配列を欠失したアデノウイルスゲノムを有する（下記のｐＴＧ４６０７など
）または変異型繊維を発現するベクターを使用することができる。
わたる相同組換えのための導入キャプシドを構築する。Ａｄ５のＨｉｎｄIII−
ＸｈｏＩ断片（ｎｔ１８８３６−２４８１６）を同酵素で消化したｐＢＳＫ＋(S
tratagene)へクローニングしてプラスミドｐＴＧ４２２４を得る。ＰＣＲにより
キメラ断片：ヘキソン（ｎｔ１９０４３−１９４７）−ＸｂａＩ−ＥＧＦ−Ｂｓ
ｒＧＩ−ヘキソン（ｎｔ１９６９９０−２０３１２）を作出することで、ＥＧＦ
ペプチドをコードする配列をヘキソンの超可変ループＬ１に導入する。断片ｎｔ
１９０４３〜１９６４７は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１１０２（配列番号２
８）およびｏＴＧ１１１０３（配列番号２９）とともにプラスミドｐＴＧ３６２
０を用いたＰＣＲ増幅により得る。断片ｎｔ１９６９９〜２０３１２は、オリゴ
ヌクレオチドｏＴＧ１１１０４（配列番号３０）およびｏＴＧ１１１０５（配列
番号３１）を用いて同じＤＮＡから増幅する。ＥＧＦは、オリゴヌクレオチドｏ
ＴＧ１１１０６（配列番号３２）およびｏＴＧ１１１０７（配列番号３３）とと
もにｃＤＮＡを用いてクローニングすれば、ＥＧＦコード配列はフレーム内でヘ
キソンに置き換わることができる。このＰＣＲ産物を適当な酵素で消化した後に
連結する。次ぎに、このキメラ断片を相同組換えにより、ＮｄｅＩで線状化した
（ｎｔ１９５４９）プラスミドｐＴＧ４２２４に挿入してｐＲＧ４２２９を得る
。次ぎに、ＨｉｎｄIII／ＨｈｏＩ消化によってこの改変型ヘキソンをコードす
る配列が得られ、相同組換えによってゲノム情報に再度置く。ＳｇｆＩで線状化
したベクターｐＴＧ３６０２、ｐＴＧ４６０７またはｐＴＧ４６２９、あるいは
繊維配列を欠失したアデノウイルスゲノムを有する（下記のｐＴＧ４６０７など
）または変異型繊維を発現するベクターを使用することができる。
【０１３１】
機能的天然型繊維を産生することができないアデノウイルスゲノムは、他のア
デノウイルスＯＲＦにはわたらない開始コドンに作用する欠失によって得られる
。以下の手順を行う：プライマーｏＴＧ７１７１およびｏＴＧ７２７５（配列番
号３４および３５）を用いてＰＣＲにより、欠失領域（ｎｔ３０５６４〜３１０
４１）の５’側においてアデノウイルス断片を増幅する。この断片の３’側（ｎ
ｔ３１１２９〜３３０９９）の増幅には、プライマーｏＴＧ７２７６およびｏＴ
Ｇ７０４９（配列番号３６および３７）を用いる。これらのＰＣＲ断片をＸｈｏ
Ｉで消化して連結した後、粗銅組換えにより、ＮｄｅＩで線状化したベクターｐ
ＴＧ６５９１に導入し、ｐＴＧ４６０２を得る。次ぎに、このプラスミドからＢ
ｓｔEII断片を単離し、ＳｐｅＩで消化したベクターｐＴＧ３６０２と相同組換
えを行う。ｐＴＧ４６０７が得られる。ベクターｐＴＧ４６２９はＥ１の代わり
にＬａｃＺ発現カセットもまた有すること以外はｐＴＧ４６０７と同じものであ
る。
デノウイルスＯＲＦにはわたらない開始コドンに作用する欠失によって得られる
。以下の手順を行う：プライマーｏＴＧ７１７１およびｏＴＧ７２７５（配列番
号３４および３５）を用いてＰＣＲにより、欠失領域（ｎｔ３０５６４〜３１０
４１）の５’側においてアデノウイルス断片を増幅する。この断片の３’側（ｎ
ｔ３１１２９〜３３０９９）の増幅には、プライマーｏＴＧ７２７６およびｏＴ
Ｇ７０４９（配列番号３６および３７）を用いる。これらのＰＣＲ断片をＸｈｏ
Ｉで消化して連結した後、粗銅組換えにより、ＮｄｅＩで線状化したベクターｐ
ＴＧ６５９１に導入し、ｐＴＧ４６０２を得る。次ぎに、このプラスミドからＢ
ｓｔEII断片を単離し、ＳｐｅＩで消化したベクターｐＴＧ３６０２と相同組換
えを行う。ｐＴＧ４６０７が得られる。ベクターｐＴＧ４６２９はＥ１の代わり
にＬａｃＺ発現カセットもまた有すること以外はｐＴＧ４６０７と同じものであ
る。
【０１３２】
２９３細胞、野生型繊維を発現する２９３細胞(Legrand et al., 1999,上記)
、またはＥＧＦ受容体を過剰発現する細胞のトランスフェクション後に相当する
ウイルスが得られる。感染の特異性に関する研究は、競合物としてＥＧＦを用い
、これまでに記載したようにして行えばよい（実施例１参照）。
、またはＥＧＦ受容体を過剰発現する細胞のトランスフェクション後に相当する
ウイルスが得られる。感染の特異性に関する研究は、競合物としてＥＧＦを用い
、これまでに記載したようにして行えばよい（実施例１参照）。
【０１３３】実施例８：特定の糖タンパク質、すなわち硫酸ヘパラン糖タンパク質を発現する 細胞に対して向性を示すアデノウイルスの構築
本実施例では、Ｃ末端において、配列番号２によりコードされるリンカーペプ
チド（ＰＳＡＳＡＳＡＳＡＰＧＳ）の後ろに７つのリジン残基を有する繊維につ
いて記載するが、これは「硫酸ヘパラン糖タンパク質」と呼ばれる糖タンパク質
との付着特性を付与するものである。この作用のため、オリゴヌクレオチドｏＴ
Ｇ１２１２５（配列番号４３）を構築物Ｍ１３ＴＧ６５２７とハイブリダイズし
て、変異誘発により構築物Ｍ１３ＴＧ６５７０を作製する。ＢｓｔＢＩでの切断
によって線状化したプラスミドｐＴＧ４２１３とＭ１３ＴＧ６５７０のＨｉｎｄ
III−ＳｍａＩ断片との間の相同組換え工程により、プラスミドｐＴＧ４２７４
を得ることができる。このプラスミドを２９３補足系にトランスフェクトし、通
常の培養条件下で培養した後に、相当するアデノウイルスＡｄＴＧ４２７４が得
られる。このウイルスの感染の特異性を評価するため、組換えアデノウイルスで
競合試験を行う（実施例１）。
チド（ＰＳＡＳＡＳＡＳＡＰＧＳ）の後ろに７つのリジン残基を有する繊維につ
いて記載するが、これは「硫酸ヘパラン糖タンパク質」と呼ばれる糖タンパク質
との付着特性を付与するものである。この作用のため、オリゴヌクレオチドｏＴ
Ｇ１２１２５（配列番号４３）を構築物Ｍ１３ＴＧ６５２７とハイブリダイズし
て、変異誘発により構築物Ｍ１３ＴＧ６５７０を作製する。ＢｓｔＢＩでの切断
によって線状化したプラスミドｐＴＧ４２１３とＭ１３ＴＧ６５７０のＨｉｎｄ
III−ＳｍａＩ断片との間の相同組換え工程により、プラスミドｐＴＧ４２７４
を得ることができる。このプラスミドを２９３補足系にトランスフェクトし、通
常の培養条件下で培養した後に、相当するアデノウイルスＡｄＴＧ４２７４が得
られる。このウイルスの感染の特異性を評価するため、組換えアデノウイルスで
競合試験を行う（実施例１）。
【０１３４】実施例９：ムチンを発現する腫瘍細胞に特異的に向けられた宿主特異性を示すア デノウイルスの構築
本実施例では、Ｃ末端に、特定の腫瘍細胞の表面で過剰発現するムチンに対す
る特異性を付与するＥＰＰＴペプチド（米国特許第５，５９１，５９３号に記載
）を有する繊維の生産について記載する。構築物Ｍ１３ＴＧ６５２７に対してオ
リゴヌクレオチド［欠文］（配列番号４４）を用いて位置指定変異誘発を行って
構築物Ｍ１３ＴＧ６５７２を作製する。プラスミドｐＴＧ４２７８は上記の手順
に従って得る。この変異を実施例８に記載のようにウイルスゲノムに導入する。
形質転換して２９３系で培養した後、ウイルスＡｄＴＧ４２７８が得られる。ア
デノウイルスノブを用いるウイルス感染に関して可溶性ＥＰＰＴペプチドとの競
合試験は、アデノウイルスの感染プロセスにおける天然型細胞受容体およびムチ
ンの関与が評価できることを示す。
る特異性を付与するＥＰＰＴペプチド（米国特許第５，５９１，５９３号に記載
）を有する繊維の生産について記載する。構築物Ｍ１３ＴＧ６５２７に対してオ
リゴヌクレオチド［欠文］（配列番号４４）を用いて位置指定変異誘発を行って
構築物Ｍ１３ＴＧ６５７２を作製する。プラスミドｐＴＧ４２７８は上記の手順
に従って得る。この変異を実施例８に記載のようにウイルスゲノムに導入する。
形質転換して２９３系で培養した後、ウイルスＡｄＴＧ４２７８が得られる。ア
デノウイルスノブを用いるウイルス感染に関して可溶性ＥＰＰＴペプチドとの競
合試験は、アデノウイルスの感染プロセスにおける天然型細胞受容体およびムチ
ンの関与が評価できることを示す。
【０１３５】実施例１０：α４β１インテグリンを発現する腫瘍細胞に対して特性を示すアデ ノウイルスの構築
本実施例では、タンパク質に、付着して特定の腫瘍細胞の表面で過剰発現する
α１β１インテグリンを発現する能力を付与するため、Ｃ末端にＬＤＶペプチド
配列（米国特許第５，６２８，９７９号参照）を有するアデノウイルス繊維につ
いて記載する。このために、ベクターＭ１３ＴＧ６５２７に対してｏＴＧ１１９
９１（配列番号４５）を用いて部位指定変異誘発を行って改変型ベクターＭ１３
ＴＧ１３２６５を作製する。この変異を実施例６に記載のプロトコールに従って
ウイルスゲノムに導入する。次ぎに、２９３補足系を用いてウイルスを産生させ
る。競合試験は、そのアデノウイルス細胞受容体結合特性が示されている(Henry
et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246)大腸菌で産生させたＡｄ５のノブを用
いるか、またはα４β１インテグリンと結合することにより媒介されるアデノウ
イルスの感染能の評価を可能とするＬＤＶ配列を含んでなる可溶性ペプチドを用
いて実施例１に記載のプロトコールに従って行う。
α１β１インテグリンを発現する能力を付与するため、Ｃ末端にＬＤＶペプチド
配列（米国特許第５，６２８，９７９号参照）を有するアデノウイルス繊維につ
いて記載する。このために、ベクターＭ１３ＴＧ６５２７に対してｏＴＧ１１９
９１（配列番号４５）を用いて部位指定変異誘発を行って改変型ベクターＭ１３
ＴＧ１３２６５を作製する。この変異を実施例６に記載のプロトコールに従って
ウイルスゲノムに導入する。次ぎに、２９３補足系を用いてウイルスを産生させ
る。競合試験は、そのアデノウイルス細胞受容体結合特性が示されている(Henry
et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246)大腸菌で産生させたＡｄ５のノブを用
いるか、またはα４β１インテグリンと結合することにより媒介されるアデノウ
イルスの感染能の評価を可能とするＬＤＶ配列を含んでなる可溶性ペプチドを用
いて実施例１に記載のプロトコールに従って行う。
【０１３６】実施例１１：天然型細胞受容体との結合をなくすことを目的とした繊維ノブの改 変
上記の変異はより詳しくはＭＨＣ−Ｉ分子への結合の阻害を意図したものであ
る。ＣＡＲに対する結合を実質的に低下させるために、他の変異を作出する。ノ
ブ構造の三次元解析ならびにＣＡＲ血清型と非ＣＡＲ血清型由来するアデノウイ
ルス繊維の配列の比較(Roelvink et al., 1988, J. Virol. 72, 7909-7915)によ
りＣＡＲとの結合の認識に関与するアミノ酸をさらに特異的に同定することがで
きる。これらの残渣以下のように改変する（括弧で示したものは部位指定変異誘
発実験に用いたオリゴヌクレオチド）： Ｔｙｒ４９１からＡｓｐ（Ｙ４９１Ｄ）：ｏＴＧ１２７２７（配列番号４６） Ａｌａ４９４からＡｓｐ（Ａ４９４Ｄ）：ｏＴＧ１２７２８（配列番号４７） Ｖａｌ４９５からＡｒｇ（Ｖ４９５Ｒ）：ｏＴＧ１２７２９（配列番号４８） Ｇｌｙ４９６からＳｅｒ（Ｇ４９６Ｒ）：ｏＴＧ１２７３０（配列番号４９） Ｐｈｅ４９７からＡｓｐ（Ｆ４９７Ｄ）：ｏＴＧ１２７３１（配列番号５０） Ｍｅｔ４９８からＡｓｐ（Ｖ４９８Ｄ）：ｏＴＧ１２７３２（配列番号５１） Ｐｒｏ４９９からＧｌｙ（Ｖ４９９Ｇ）：ｏＴＧ１２７３３（配列番号５２） Ａｓｎ５００からＡｓｐ（Ｎ５００Ｄ）：ｏＴＧ１２７３４（配列番号５３） Ａｌａ５０３からＡｓｐ（Ａ５０３Ｄ）：ｏＴＧ１２７３５（配列番号５４） Ｔｙｒ５０４からＡｓｐ（Ｖ５０４Ｄ）：ｏＴＧ１２７３６（配列番号５５） Ｐｒｏ５０５からＧｌｙ（Ｐ５０５Ｇ）：ｏＴＧ１２７３７（配列番号５６）
。
る。ＣＡＲに対する結合を実質的に低下させるために、他の変異を作出する。ノ
ブ構造の三次元解析ならびにＣＡＲ血清型と非ＣＡＲ血清型由来するアデノウイ
ルス繊維の配列の比較(Roelvink et al., 1988, J. Virol. 72, 7909-7915)によ
りＣＡＲとの結合の認識に関与するアミノ酸をさらに特異的に同定することがで
きる。これらの残渣以下のように改変する（括弧で示したものは部位指定変異誘
発実験に用いたオリゴヌクレオチド）： Ｔｙｒ４９１からＡｓｐ（Ｙ４９１Ｄ）：ｏＴＧ１２７２７（配列番号４６） Ａｌａ４９４からＡｓｐ（Ａ４９４Ｄ）：ｏＴＧ１２７２８（配列番号４７） Ｖａｌ４９５からＡｒｇ（Ｖ４９５Ｒ）：ｏＴＧ１２７２９（配列番号４８） Ｇｌｙ４９６からＳｅｒ（Ｇ４９６Ｒ）：ｏＴＧ１２７３０（配列番号４９） Ｐｈｅ４９７からＡｓｐ（Ｆ４９７Ｄ）：ｏＴＧ１２７３１（配列番号５０） Ｍｅｔ４９８からＡｓｐ（Ｖ４９８Ｄ）：ｏＴＧ１２７３２（配列番号５１） Ｐｒｏ４９９からＧｌｙ（Ｖ４９９Ｇ）：ｏＴＧ１２７３３（配列番号５２） Ａｓｎ５００からＡｓｐ（Ｎ５００Ｄ）：ｏＴＧ１２７３４（配列番号５３） Ａｌａ５０３からＡｓｐ（Ａ５０３Ｄ）：ｏＴＧ１２７３５（配列番号５４） Ｔｙｒ５０４からＡｓｐ（Ｖ５０４Ｄ）：ｏＴＧ１２７３６（配列番号５５） Ｐｒｏ５０５からＧｌｙ（Ｐ５０５Ｇ）：ｏＴＧ１２７３７（配列番号５６）
。
【０１３７】
変異誘発はこれまでに記載したベクターＭ１３ＴＧ６５２６、Ｍ１３ＴＧ６５
２８、Ｍ１３ＴＧ６５２８、Ｍ１３ＴＧ６５７０、Ｍ１３ＴＧ６５７２、または
Ｍ１３ＴＧ１３２６５を用い手行う。アデノウイルスゲノムを有するプラスミド
を上記のように作製し、トランスフェクションおよび下記での培養によりウイル
ス粒子を得る：
２８、Ｍ１３ＴＧ６５２８、Ｍ１３ＴＧ６５７０、Ｍ１３ＴＧ６５７２、または
Ｍ１３ＴＧ１３２６５を用い手行う。アデノウイルスゲノムを有するプラスミド
を上記のように作製し、トランスフェクションおよび下記での培養によりウイル
ス粒子を得る：
【０１３８】
２９３細胞系、
または野生型アデノウイルス繊維を発現する２９３細胞系(Legrand et al., 1
999, J. Virol. 73, 907-919)、 または用いたリガンドに対応する受容体を過剰発現する細胞。かかる細胞は対
応するｃＤＮＡでトランスフェクトすることにより作製すればよい。しかし、例
えばＤａｕｄｉ系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）またはＣＨＯ系（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｉ６１）などの天然型アデノウイルス受容体を発現しない細胞を作製するのが好
ましい。
999, J. Virol. 73, 907-919)、 または用いたリガンドに対応する受容体を過剰発現する細胞。かかる細胞は対
応するｃＤＮＡでトランスフェクトすることにより作製すればよい。しかし、例
えばＤａｕｄｉ系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）またはＣＨＯ系（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｉ６１）などの天然型アデノウイルス受容体を発現しない細胞を作製するのが好
ましい。
【０１３９】
変異ウイルスが実際にそれらのキャプシド内に本発明の改変型繊維のタンパク
質を有することを確認するため、改変型ウイルス粒子を１０％ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルにロードする。種々のウイルスタンパク質を銀染色により検出する
。次ぎに、繊維タンパク質をアデノウイルスノブに対して向けられた抗体を用い
てウエスタンブロッティングにより特異的に試験する(Henry et al., 1994,上記
)。この場合、移動度が予測されたサイズに相当するバンドに対して強いシグナ
ルが見られる。このことは明らかに、それらのウイルスが理論量の変異型繊維を
組み込んみ、なおかつそれが産生されていることを示す。三量体型の繊維だけが
ペントンベースに結合でき、包膜されるとすれば(Novelli and Boulanger, 1991
,上記)、予測された位置にこのシグナルが存在することは本発明の改変型繊維が
三量体形成がなお可能であることを示す。
質を有することを確認するため、改変型ウイルス粒子を１０％ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルにロードする。種々のウイルスタンパク質を銀染色により検出する
。次ぎに、繊維タンパク質をアデノウイルスノブに対して向けられた抗体を用い
てウエスタンブロッティングにより特異的に試験する(Henry et al., 1994,上記
)。この場合、移動度が予測されたサイズに相当するバンドに対して強いシグナ
ルが見られる。このことは明らかに、それらのウイルスが理論量の変異型繊維を
組み込んみ、なおかつそれが産生されていることを示す。三量体型の繊維だけが
ペントンベースに結合でき、包膜されるとすれば(Novelli and Boulanger, 1991
,上記)、予測された位置にこのシグナルが存在することは本発明の改変型繊維が
三量体形成がなお可能であることを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｐ 21/00 ４Ｈ０４５
21/00 31/10
31/10 31/18
31/18 31/22
31/22 35/00
35/00 Ｃ０７Ｋ 14/075 ＺＮＡ
Ｃ０７Ｋ 14/075 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 7/04
5/10 15/00 Ａ
7/04 5/00 Ｂ
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 DA05
DA06 DA11 EA02 EA04 FA20
GA11 HA08 HA11
4B065 AA01X AA57X AA90X AA95X
AA95Y AB01 BA02 CA24
CA44
4C084 AA13 CA01 NA14 ZA53 ZA75
ZA94 ZB26 ZB33 ZC35 ZC55
4C086 AA01 EA16 MA02 NA14 ZA53
ZA75 ZA94 ZB26 ZB33 ZC35
ZC55
4C087 AA01 BC83 MA02 NA14 ZA53
ZA75 ZA94 ZB26 ZB33 ZC35
4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 CA01
DA50 EA20 FA72 FA74
Claims (25)
- 【請求項１】 配列番号１の残基４９１〜５０５の領域の一以上の残基の変異によって改変さ
れたアデノウイルス繊維。 - 【請求項２】 以下の変異： ４９１番のチロシン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９４番のアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９５番のバリン残基のアルギニンでの置換、 ４９６番のグリシン残基のセリンでの置換、 ４９７番のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９８番のメチオニン残基のアスパラギン酸での置換、 ４９９番のプロリン残基のグリシンでの置換、 ５００番のアスパラギン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０３番のアラニン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０４番のチロシン残基のアスパラギン酸での置換、 ５０５番のプロリン残基のグリシン残基での置換 から選択される少なくとも一つの変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載
のアデノウイルス繊維。 - 【請求項３】 変異残基が４９４番のアラニン残基および５０３番のアラニン残基から選択さ
れる、請求項１および２のいずれかに記載のアデノウイルス繊維。 - 【請求項４】 ループＡＢ、ＣＤ、ＤＧ、ＧＨ、ＨＩおよび／またはＩＪの残基、および／ま
たは シートＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび／またはＪの残基 から選択される一以上の残基の変異によっても改変されている請求項１〜３のい
ずれか一項に記載のアデノウイルス繊維。 - 【請求項５】 ループＣＤからシートＩにわたるドメインにおける一以上の残基の変異によっ
ても改変されている、請求項４に記載のアデノウイルス繊維。 - 【請求項６】 変異が （ｉ）以下の置換： ４４３番のグリシン残基のアスパラギン酸での置換、 ４４４番のセリン残基のリジンでの置換、 ４４５番のロイシン残基のフェニルアラニンでの置換、 ４４６番のアラニン残基のトレオニンでの置換、 ４４９番のセリン残基のアスパラギン酸での置換、 ４５０番のグリシン残基のアスパラギンまたはリジンでの置換、 ４５１番のトレオニン残基のリジンまたはロイシンでの置換、 ４５２番のバリン残基のアスパラギンまたはトレオニンでの置換、 ４５５番のアラニン残基のフェニルアラニンでの置換、 ４５７番のロイシン残基のアラニンでの置換、 ４５９番のイソロイシン残基のアラニンでの置換 から選択される少なくとも一つの置換、および／または （ii）欠失： ４５４番のセリンから４６１番のフェニルアラニンまでにわたる領域の欠失、 ４４１番のバリンから４５３番のグルタミンまでにわたる領域の欠失、または ４４１番のバリンから４６１番のフェニルアラニンまでにわたる領域の欠失 から選択される欠失 からなる、請求項５に記載のアデノウイルス繊維。
- 【請求項７】 ループＡＢを含んでシートＡからシートＢにわたる繊維領域に含まれる一以上
の残基の変異によっても改変されている、請求項４に記載のアデノウイルス繊維
。 - 【請求項８】 変異が以下の置換： ４０８番のセリン残基の、少なくとも二つのカルボキシル基を有する残基、特
にアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される残基での置換、 ４０４番のトレオニン残基のグリシン残基での置換、 ４０６番のアラニン残基のリジン残基での置換 から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換からなる、請求項７に記載のアデ
ノウイルス繊維。 - 【請求項９】 非変異繊維の天然型細胞受容体とは異なる細胞性アンチリガンドを認識し得る
リガンドもまた含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアデノウイル
ス繊維。 - 【請求項１０】 リガンドが、抗体もしくは抗体フラグメント、ペプチド、オリゴヌクレオチド
、脂質、糖脂質、ホルモン、ポリマーまたは糖からなる群から選択される、請求
項９に記載のアデノウイルス繊維。 - 【請求項１１】 請求項１に記載のアデノウイルス繊維の改変領域を少なくとも含んでなる、ペ
プチド断片。 - 【請求項１２】 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアデノウイルス繊維または請求項１１
に記載のペプチド断片をコードするＤＮＡ断片または発現ベクター。 - 【請求項１３】 ゲノムへの組込み形態またはエピソームの形態として、その細胞系での発現を
可能とするエレメントの制御下に置かれた請求項１２に記載のＤＮＡ断片を含ん
でなる、細胞系。 - 【請求項１４】 Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１〜Ｌ５領域によりコードされる機能から選択され
る一以上の機能を欠いたアデノウイルスをまた補足し得る、請求項１３に記載の
細胞系。 - 【請求項１５】 機能的に天然型の繊維を欠き、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の繊維を
含んでなる、ウイルス粒子。 - 【請求項１６】 上記粒子の天然型細胞受容体とは異なる細胞性アンチリガンドを認識し得るリ
ガンドもまた含んでなる、請求項１５に記載のウイルス粒子。 - 【請求項１７】 リガンドが繊維以外のアデノウイルスキャプシドのタンパク質、特にヘキソン
またはペントンに挿入されている、請求項１５および１６のいずれかに記載のウ
イルス粒子。 - 【請求項１８】 請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のウイルス粒子であって、エンプティ
ーであるウイルス偽粒子。 - 【請求項１９】 アデノウイルスゲノムを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のウイ
ルス粒子。 - 【請求項２０】 アデノウイルスゲノムが複製欠陥組換えアデノウイルスゲノムである、請求項
１９に記載のウイルス粒子。 - 【請求項２１】 （ｉ）複製欠陥組換えアデノウイルスゲノムを好適な細胞系にトランスフェク
トし、 （ii）トランスフェクト細胞系をアデノウイルス粒子を産生させうる好適な条
件下で培養し、 （iii）ウイルス粒子をトランスフェクト細胞系の培養物から回収し、さらに
所望により （iv）アデノウイルス粒子を精製する、 請求項２０に記載のウイルス粒子の生産方法。 - 【請求項２２】 繊維をコードする配列の総てまたは一部を欠くアデノウイルスゲノムを含むウ
イルス粒子を生産する方法であって、 （ｉ）請求項１３および１４のいずれかに記載の細胞系にゲノムをトランスフ
ェクトし、 （ii）トランスフェクト細胞系をアデノウイルス粒子を産生させうる好適な条
件下で培養し、 （iii）アデノウイルス粒子をトランスフェクト細胞系の培養物から回収し、
さらに所望により （iv）アデノウイルス粒子を精製する、 方法。 - 【請求項２３】 請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子もしくは偽粒子、また
は請求項２１および２２のいずれかに記載の方法を用いて得られるものを、医薬
上許容される支持体と組み合わせて含んでなる組成物。 - 【請求項２４】 裸の核酸または少なくとも一種の陽イオン化合物と組み合わせた核酸から選択
される少なくとも一種の化合物もまた含んでなる、請求項２３に記載の組成物。 - 【請求項２５】 ヒトまたは動物の身体の治療を意図した医薬品を製造するための、請求項１５
〜２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子もしくは偽粒子、または請求項２１
および２２のいずれかに記載の方法を用いて得られるものの使用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9914842 | 1999-11-25 | ||
| FR99/14842 | 1999-11-25 | ||
| PCT/FR2000/003263 WO2001038361A1 (fr) | 1999-11-25 | 2000-11-23 | Fibre adenovirable modifiee et utilisations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003514577A true JP2003514577A (ja) | 2003-04-22 |
Family
ID=9552535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001540124A Pending JP2003514577A (ja) | 1999-11-25 | 2000-11-23 | 改変アデノウイルス繊維および使用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1242449A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003514577A (ja) |
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| CA (1) | CA2392272A1 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013538040A (ja) * | 2010-06-10 | 2013-10-10 | ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション | デスモグレイン２（ｄｓｇ２）とのアデノウイルスの相互作用のための方法およびシステム |
| JP2015532265A (ja) * | 2012-09-25 | 2015-11-09 | ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション | デスモグレイン２（ｄｓｇ２）結合タンパク質およびその使用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2491805A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-22 | Transgene S.A. | Modified adenoviral fiber with ablated binding to cellular receptors |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5928944A (en) * | 1994-02-04 | 1999-07-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of adenoviral-medicated cell transfection |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| FR2761689B1 (fr) * | 1997-04-02 | 1999-06-25 | Transgene Sa | Fibre adenovirale modifiee et adenovirus cibles |
| BR9908613A (pt) * | 1998-02-06 | 2000-10-31 | Uab Research Foundation | Vetor de adenovìrus contendo um epìtopo de peptìdeo heterólogo na alça hi do nódulo de fibra |
| US6455314B1 (en) * | 1998-09-11 | 2002-09-24 | Genvec, Inc. | Alternatively targeted adenovirus |
-
2000
- 2000-11-23 US US10/130,786 patent/US7560527B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-23 CA CA002392272A patent/CA2392272A1/fr not_active Abandoned
- 2000-11-23 AU AU21769/01A patent/AU783879B2/en not_active Ceased
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- 2000-11-23 JP JP2001540124A patent/JP2003514577A/ja active Pending
- 2000-11-23 WO PCT/FR2000/003263 patent/WO2001038361A1/fr active IP Right Grant
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013538040A (ja) * | 2010-06-10 | 2013-10-10 | ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション | デスモグレイン２（ｄｓｇ２）とのアデノウイルスの相互作用のための方法およびシステム |
| KR101915699B1 (ko) | 2010-06-10 | 2018-11-06 | 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 | 데스모글레인 2(디에스쥐2)와 아데노바이러스의 상호작용을 위한 방법 및 시스템 |
| JP2015532265A (ja) * | 2012-09-25 | 2015-11-09 | ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション | デスモグレイン２（ｄｓｇ２）結合タンパク質およびその使用 |
Also Published As
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