CN100462438C - 用于防御人体免疫缺陷病毒感染的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体 - Google Patents

用于防御人体免疫缺陷病毒感染的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种嵌合的5型/11型或35型腺病毒载体，该载体包括：复制缺陷的5型腺病毒和编码人体免疫缺陷病毒(HIV)包被蛋白、或与其同功的其突变体的基因，所述基因以可表达的方式整合入5型腺病毒，其中所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因被编码11型或35型腺病毒的纤维蛋白、或与其同功的突变体的基因以可表达的方式取代。该载体表现降低的肝毒性，能够诱导很强的HIV特异性细胞免疫反应，并且作为用于防御HIV感染的药物非常有效。

Description

用于防御人体免疫缺陷病毒感染的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体
技术领域
本发明涉及一种用于防御人体免疫缺陷病毒感染的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体。具体而言，本发明涉及一种嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体及其医药应用，该载体包括：复制缺陷的5型腺病毒；以及以可表达的方式整合于所述5型腺病毒内的编码人体免疫缺陷病毒(HIV)的包被蛋白的基因，其中所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因以可表达的方式被编码11型或35型腺病毒的纤维蛋白的基因所取代。
背景技术
高活性抗逆转录病毒疗法(Highly active anti-retroviraltherapy，HAART)已在降低HIV感染病人的死亡率方面取得了很好的效果。然而，在HAART中具有高副作用和抗药性发生率的问题，且以发展中国家的现有条件很难获得该病的治疗药物。
另外，HAART不能作为抗HIV感染的预防药物发挥作用，因此在AIDS控制的未来措施中，开发安全高效的疫苗将变得非常重要。许多文献已报道，与中和抗体相比，细胞毒素T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)在抗HIV感染的防御机制中起着更加重要的作用(非专利文献1，非专利文献2，非专利文献3)。为了提高细胞的免疫性，在过去的十年里开发了多种生产免疫原HIV疫苗的策略。这些策略包括制备HIV亚单位肽疫苗；DNA疫苗；重组病毒载体疫苗，包括修饰的牛痘安卡拉株(modified vaccinia Ankara，rMVA)(非专利文献3，和非专利文献4)、腺病毒(非专利文献5)、狂犬病毒(非专利文献6)、黄热病病毒(非专利文献7)、友好鼠白血病病毒(非专利文献8)，委内瑞拉马脑炎病毒(非专利文献9)、疱疹性口炎病毒(非专利文献10)、腺伴随病毒(非专利文献11、12)及细菌载体疫苗(Calmette.Guerin细菌)(非专利文献13)；和乳酸菌(非专利文献14)。单独使用或结合使用，每一种策略都在动物模型中表现出一些有前途的结果，并且，据报道，其中一些方法在非人类的灵长类动物的实验感染中中断了AIDS的蔓延(非专利文献3、4、5、8、15、以及16)。一种包括DNA初回免疫、随后rMVA追加免疫的结合疫苗是取得巨大成功的接种预防方法之一，并且现已投入第一阶段的临床研究。
与rMVA(非专利文献5)相比，预期为病毒载体的5型腺病毒(Ad5)为更致免疫的，其具有产生高病毒效价、以及关于其包括DNA序列在内的生物学特征的充分分析的信息的优点。然而，Ad5与肝细胞有强亲和性(非专利文献17)，并且据报道一位鸟氨酸氨甲酰基转移酶(orni thine transcarbamylase，OTC)缺陷的病人经Ad5载体治疗后致死(非专利文献18)，因此作为临床目的应用该载体已被限制。
腺病毒有51种不同的血清型，划分为A至F6个亚属。应用腺病毒载体的基因传递系统现采用2型腺病毒(Ad2)及5型腺病毒(Ad5)(二者均属于C亚属)，因为它们被充分鉴定，且其DNA序列被充分分析(非专利文献19、和20)。已知除3型腺病毒(Ad3)、11型腺病毒(Adll)、35型腺病毒(Ad35)和50型腺病毒(Ad50)外(非专利文献21、22)的大多数腺病毒与柯萨奇病毒(coxsackievirus)和腺病毒受体(adenovi rusreceptor，CAR)结合(非专利文献7、9、13、15、22、23、24、25和26)。CAR在人类的心脏、胰腺、中枢和外周神经、前列腺、睾丸、肺、肝及肠中表达，特别地，相当大量的CAR在肝中表达。由此，Ad5被认为易于感染人类和动物的肝脏。
据报道一种包括DNA初回免疫、随后Ad5载体追加免疫的结合疫苗在猴子中表现出显著的抗SHIV实验感染的防御效果(非专利文献27)。然而，由于Ad5尤其对肝细胞具有很强的趋向性，因此，易于产生肝毒性。由于该原因，从而其作为病毒载体疫苗的安全性需要考虑。
非专利文献1 Haynes，B.F.et al.，Science 271：324-328，1996
非专利文献2 Miedema，F.et al.，Science 272：505-506，1996
非专利文献3 Robinson，H.et al.，Nat.Med.5：526-534，1999
非专利文献4 Amara，R.R.et al.，Science 292：69-74，2001
非专利文献5 Shiver，J.W.et al.，Nature 415：331-335，2002
非专利文献6 Schnell，M.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：3544-3549，200
非专利文献7 Mandl，C.W.et al.，Nat.Med.4：1438-1440，1998
非专利文献8 Matano，T.et al.，Vaccine 18：3310-3318，2000
非专利文献9 Caley，I.J.et al.，Vaccine 17：3124-3135，1999
非专利文献10 Rose，N.F.et al.，Cell 106：539-549，2001
非专利文献11 Xin，K.-Q.et al.，Hum.Gene Ther.13：1571-1581，2002
非专利文献12 Xin，K.-Q.et al.，Hum.Gene Ther.12：1047-1061，2001
非专利文献13 Aldovini，A.et al.，Nature 351：479-482，1991
非专利文献14 Xin，K.-Q.et al.，Blood 102：223-228，2003
非专利文献15 Barouch，D.H.et al.，J.Viol.75：5151-5158，2001
非专利文献16 Barouch，D.H.et al.，Science 290：486-495，2000
非专利文献17 Adams，J.Y.et al.，Nat.Med.8：891-896，2002
非专利文献18 Thomas，C.E.et al.，Nat.Reviews Genetics4：346-358，2003
非专利文献19 Chroboczek，J.et al.，Virol.186：280-285，1992
非专利文献20 van Ormondt，H.et al.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.110：73-142，1984
非专利文献21  Shayakhmetov，D.M.et al.，J.Viol.74：2567-2583，2000
非专利文献22 Stevenson，S.C.et al.，J.Viol.69：2850-2857，1995
非专利文献23 Amara，R.R.et al.，J.Viol.76：7625-7631，2002
非专利文献24 Farina，S.F.et al.J.Virol 75：11603-13，2001
非专利文献25 Jounai，N.et al.，J.Gene Med.，5，609-617，2003
非专利文献26 Lieber，A.et al.，J.Viol.70：8944-8960，1996
非专利文献27 Lubeek，M.D.et al.，Cell 106：539-549，1997
发明内容
技术问题
本发明的任务是提供一种新型的应用Ad5的病毒载体，该载体可更加安全高效地用于HIV疫苗。另外，该任务是提供一种用于防御HIV感染的包括所述的病毒载体作为活性成分的药物组合物、HIV疫苗以及HIV结合疫苗。并且，本发明的任务也是提供预防HIV感染的方法、或应用所述病毒载体的HIV疫苗。
技术方案
本发明者针对于更加安全高效的HIV疫苗的开发进行锐意研究。因此，我们构建了一种表达HIV基因的带有Ad35纤维的嵌合的5型腺病毒。当在鼠BALB/c中评估由该嵌合型载体引起的抗原特异性免疫反应时，很明显，通过肌肉内施用嵌合载体，强HIV特异性细胞免疫反应增加，其与通过施用同效价的重组牛痘病毒载体(安卡拉株)或增殖型牛痘病毒载体(WR株)所引起的增强相比要高得多。并且，在追加免疫后七周时，包括DNA疫苗初回免疫、随后的追加嵌合型载体的免疫表明完全防御表达HIV基因的牛痘病毒感染。该证据表明，包括DNA疫苗和该嵌合型载体的结合疫苗能够成为控制AIDS蔓延的突破疫苗。本发明基于这些证据完成。
因此，本发明涉及一种嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体，该载体包括复制缺陷的5型腺病毒；和编码人体免疫缺陷病毒(HIV)包被蛋白、或与该包被蛋白同功的突变体的基因，所述基因以可表达的方式整合至5型腺病毒内，其中，所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因以可表达的方式被编码11型或35型腺病毒的纤维蛋白、或与该纤维蛋白同功能的突变体的基因所取代。
进而，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性组分的如上所述的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体。该药物组合物可用于预防人体免疫缺陷病毒的感染，以及进一步用于抗人体免疫缺陷病毒的疫苗。该药物足组合物也可以与人体免疫缺陷病毒基因以可表达的方式整合其中的复制缺陷的病毒载体或非病毒载体一起作为结合疫苗。该医药组成物也可与抗HIV药物并用。
此外，本发明涉及一种用于防御HIV感染、或用于抗HIV疫苗的方法，该方法包括施用上述嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体和复制缺陷的病毒载体或非病毒载体，所述病毒载体或非病毒载体包含以可表达的方式整合的编码HIV包被蛋白、或与该包被蛋白同功的突变体的基因。进而，本发明涉及一种用于防御HIV感染、或用于抗HIV疫苗的方法，该方法包括施用上述嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体和抗HIV药物。
发明效果
本发明提供的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体能够引起很强的抗原特异性细胞免疫反应。该反应强于由被认为是HIV疫苗首选后备的MVA载体诱导的免疫反应。此外，本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体与DNA疫苗组成的结合疫苗能够在鼠感染模型中诱导长效抗病毒保护反应。因此，本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体表现出用于控制AIDS蔓延的划时代的抗HIV疫苗的开发潜能。另外，当与高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)过程中施加的抗HIV药物并用时，本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体能够强烈发挥治疗和预防HIV感染的作用。此外，由于编码5型腺病毒的纤维蛋白的基因被11型或35型腺病毒的纤维蛋白编码基因取代，所以本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体已降低了对肝的毒性、并提高了对树状细胞的亲和性。
实施例
本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体包括：复制缺陷的5型腺病毒；和编码人体免疫缺陷病毒包被蛋白、或与该包被蛋白同功的突变体的基因，所述基因以可表达的方式整合至5型腺病毒内，其中所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因以可表达的方式被编码11型或35型腺病毒的纤维蛋白、或与该纤维蛋白同功的突变体的基因所取代。
优选其早期基因E1被去除或早期基因E1及E3均被去除的5型腺病毒用于构建嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体。HIV1或HIV2的HIV包被蛋白均可作为在5型腺病毒中表达的HIV包被蛋白(env)。
已知HIV1型存在多种分枝(亚型)。A亚型、B亚型、C亚型、D亚型或E亚型的包被蛋白均可使用。编码包被蛋白的基因序列及其氨基酸序列是公开的，并且在下列文献中有描述：Gao，F.，et al.，J.Virol.70(3)，1651-1667(1996)；Ratner，L.，et al.，Nature 313(6000)，277-284(1985)；Jounai，N.et al.，J.Gene Med.，5，609-617(2003)；Kim，F.M.et al.，J.Virol.69(3)，1755-1761(1995)；Rodenburg，C.M.，et al.，AIDSRes.Hum.Retroviruses 17(2)，161-168(2001)；Gao，F.，et al.，J.Virol.72(7)，5680-5698(1998)；Gao，F.et al.，J.Virology 70(10)，7013-7029(1996).并且，那些序列也可以以No.U51190、K03455、U39362、AF286224、U88822、U51188的遗传信息号从NCBI中获得。
在本发明中，包被蛋白并不局限于编码该包被蛋白的基因本身，而编码与该包被蛋白同功的突变体的基因也包括在内。
作为该突变体的一个示例，包括在包被蛋白的氨基酸序列中去除、取代和/或插入一个或几个残基、且具有与包被蛋白同等的免疫原性的蛋白质。或者，也可以包括编码具有与包被蛋白同等的免疫原性的蛋白质、且能够在严格条件下与编码包被蛋白的基因杂交的基因。例如，在Southern Blot杂交中，能够在65℃下，在含有6×SSPE、2×Denhart溶液、0.5％ SDS、0.1mg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中杂交12小时的基因可作为在严格条件下杂交的基因的示例。
在本发明中，优选编码HIV B亚型、C亚型的包被蛋白或与该包被蛋白同功的突变体的基因。
进而，本发明包括一种整合有编码HIV gag或其突变体的基因、并同时整合有编码包被蛋白或其突变体的基因的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体。Gag基因编码HIV的核心蛋白，其DNA序列及由此推导的氨基酸序列是众所周知的。它们在下列文献中有描述：Gao，F.，et al.，J.Virol.70(3)，1651-1667(1996)；Ratner，L.，et al.，Nature 313(6000)，277-284(1985)；Jounai，N.et al.，J.Gene Med.，5，609-617(2003)；Kim，F.M.etal.，J.Virol.69(3)，1755-1761(1995)；Rodenburg，C.M.，et al.，AIDS Res.Hum.Retroviruses 17(2)，161-168(2001)；Gao，F.，et al.，J.Virol.72(7)，5680-5698(1998)；Gao，F.et al.，J.Virology 70(10)，7013-7029(1996).那些序列也可以以No.U51190、K03455、U39362、AF286224、U88822、U51188的遗传信息号从NCBI的GENEBANK中获得。
Gag基因的突变体也可包括在内。此处描述的突变基因定义为编码具有与由gag基因编码的蛋白同等功能的蛋白的基因。如以上在包被蛋白部分所述，突变基因被定义为编码其一个或几个残基被去除、取代和/或插入由gag基因编码的氨基酸序列中、且具有与由gag基因编码的蛋白同等功能的蛋白质的基因，或定义为编码具有与由gag基因编码的蛋白同等功能的蛋白质、且能够在严格条件下与gag基因杂交的基因。
编码包被蛋白或其突变体的基因、或编码gag蛋白或其突变体的基因可以基于广泛已知的遗传信息通过PCR或其他方法合成。例如，这些根据《分子克隆》第二版(冷泉港实验室出版社(1989))教材及其他类似教材的合成对于本领域技术人员可以容易地操作。进而，例如，编码上述突变体的基因或在严格条件下杂交的基因可以通过定点突变方法、普通杂交方法以及其他相关的方法制备，并且更具体而言，可以参考如上述《分子克隆》及其他的教材进行制备。
在本发明中，rev基因，即HIV的调节基因，可以与编码包被蛋白或其突变体的基因并用。关于rev基因的信息可从下列文献中获得：Gao，F.，et al.，J.Virol.70(3)，1651-1667(1996)；Ratner，L.，et al.，Nature 313(6000)，277-284(1985)；Jounai，N.et al.，J.Gene Med.，5，609-617(2003)；Kim，F.M.et al.，J.Virol.69(3)，1755-1761(1995)；Rodenburg，C.M.，et al.，AIDS Res.Hum.Retroviruses 17(2)，161-168(2001)；Gao，F.，et al.，J.Virol.72(7)，5680-5698(1998)；Gao，F.et al.，J.Virology 70(10)，7013-7029(1996)；序号为No.U51190、K03455、U39362、AF286224、U88822、U51188的来自NCBI GENEBANK的遗传信息。
为了以可表达的方式将编码HIV包被蛋白或其突变体的基因和编码gag基因或其突变体的基因与根据需要的rev基因一起整合至复制缺陷的5型腺病毒中，gag基因或其突变体、rev基因及env基因或其突变体被置于CMV启动子(细胞巨化病毒启动子)或CAG启动子(CMV启动子与鸡β-肌动蛋白启动子的嵌合型启动子)的下游。例如，5型腺病毒的基因组被连接于由poly A序列组成的表达单元的两端，然后通过同源重组的方法转染至源于人胚胎肾细胞的HEK293细胞内。
在本发明中利用的编码11型或35型腺病毒的包被蛋白的基因序列及其氨基酸序列已公开且在如下文献中有描述：Mei，Y.F.et al.，Virology206(1)，686-689，1995；Dmitry M.et al.，J.Virology，Mar.2000，vol.74，2567-2583；NCBI U10272；NCBI AAA66361.1；Stone，D.et al.，Virology，2003，Vol.309，152-156.纤维蛋白由柄和凸起组成，并且编码具有上述组成的纤维蛋白的基因通常用于本发明。
在本发明中，编码纤维蛋白的基因不局限于其本身，而编码具有与纤维蛋白同等的粘附性的该纤维蛋白突变体的基因也可以包括在内。这里描述的纤维蛋白的突变体也被定义为其突变体，即其一个或几个氨基酸残基被去除、取代和/或插入，且具有与纤维蛋白相同的对靶细胞的粘附性。该纤维蛋白也包括编码其粘附性与纤维蛋白相同的纤维蛋白的突变体、且能够与编码纤维蛋白的基因在严格条件下杂交的基因。例如，严格条件包括与以上在HIV包被蛋白部分所述的同样的条件。如编码包被蛋白或其突变体的情况，编码纤维蛋白或其突变体的基因易于通过众所周知的方法合成。
为了将复制缺陷的5型腺病毒的纤维蛋白编码基因置换为11或35型腺病毒的纤维蛋白或其突变体编码基因，并以可表达的方式将它们整合至该复制缺陷的5型腺病毒内，除纤维外的腺病毒基因被连接于编码11型或35型腺病毒或其突变体的基因的两端，并转染至源于人胚胎肾细胞的HEK293细胞内，由此构建嵌合的5/11型或5/35型腺病毒载体。
本发明中的嵌合的5/11型或5/35型腺病毒载体也易于通过如下的市售可得的试剂盒构建。
更具体地说，例如，本发明中嵌合的5/11型或5/35型腺病毒载体易于通过使用Avior Therapeutics，Inc(Seattle，WA)的试剂盒构建，其中以可表达的方式将HIVIIIB的rev基因和env基因整合至E1和E3缺失的复制缺陷的5型腺病毒内，且所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因被35型腺病毒的纤维蛋白编码基因取代。具体地，例如，包含CAG启动子-HIVIIIB rev/env-polyA的5.2k bp Sa II/PstI片段从Jounai，N.et al.，J.Gene Med.5：609-617，2003中描述的pCAGrev/env中分离。
作为构建试剂盒从Avior Therapeutics，Inc(Seattle，WA)获得一种包含Ad5 22-342位以及3523-5790位、大肠杆菌复制起点、以及阿莫西林抗性基因的左手穿梭质粒(pLHSP)和包括E1、E3缺失的复制缺陷的5型腺病毒的右手嵌合型穿梭质粒(pRHSP5/35)，其中编码所述5型腺病毒的纤维蛋白的基因以可表达的方式被编码35型腺病毒的基因(Ad35柄及Ad35凸起)所取代。
包含CAG启动子-HIVIIIB rev/env-polyA的5.2k bp Sa II/Pst I片段被亚克隆至包含Ad5 22-342位以及3523-5790位、大肠杆菌复制起点以及阿莫西林抗性基因的pLHSP质粒的多克隆位点之一，即EcoRI位点，以形成pLHSP-HIV穿梭质粒。该pLHSP-HIV穿梭质粒以PacI被线性化，并通过钙沉淀法与嵌合型穿梭质粒载体(pRHSP5/35)一起共转染入HEK293细胞内。
本发明的目标，即嵌合的5/35型腺病毒-HIV(Ad5/F35-HIV)可通过转染后在琼脂糖平板上培养7-14天获得。利用类似的方法，本发明的另一目标，即其他的嵌合的5型/11型或35型腺病毒载体也可制备。
本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体可以引发很强的HIV特异性细胞免疫反应。进而，由于本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体是通过将5型腺病毒的纤维蛋白编码基因置换为11型或35型腺病毒的纤维蛋白编码基因而构建的，因此达到了提高的对树状细胞的趋向性和降低的肝毒性。
因此，本发明提供的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体作为抗HIV感染的保护药物和作为HIV疫苗是高效的。
当嵌合型腺病毒载体与常规的复制缺陷的病毒载体或非病毒载体结合使用时，所述病毒或非病毒载体编码以可表达的方式整合的HIVenv基因、或编码与该基因同功的突变体的基因，可诱导较高的HIV特异性细胞免疫反应。因此，这种由嵌合型腺病毒载体与常规的复制缺陷的病毒载体或非病毒载体并用的结合疫苗作为HIV疫苗是非常有效的。
这些常规的复制缺陷的病毒载体包括重组的2型或5型腺病毒，其中早期E1基因被编码HIV env基因的表达单元取代；或复制缺陷的牛痘病毒载体，其中编码HIV env基因的表达基因簇被转导。
非病毒载体包括通常用于哺乳动物细胞的表达载体，如pCAGGS(Gene 108：193-200，1991)、pBK-CMV、pcDNA3.1以及pZeoSV(InvitronInc.，Stratagene Inc.)，其中表达HIV包被蛋白的基因簇被转导。
进而，本发明中的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体可与用于HAART的抗HIV药物并用。反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂是人们熟知的抗HIV药物。反转录酶抑制剂是用于抑制其中在辅助T细胞中病毒RNA被转变为正常DNA的反转录过程的药物。在各种反转录酶抑制剂中，叠氮胸苷(azidothymidine，AZT)、去羟肌苷(didanos ine，ddl)、拉米呋啶(lamivudine，3CT)、奈韦拉平(nevirapine，NVP)以及其它药物是众所周知的。
蛋白酶抑制剂能够阻断蛋白酶，即一种HIV为了利用从DNA合成的蛋白质而产生新的病毒所需酶，所述DNA由HIV RNA反转录而来的。在各种已知的蛋白酶抑制剂中，茚地那韦(indinavir，IDV)、沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)以及其它是众所周知的。
关于向人体给药嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体的方法，可考虑如下方法。
更具体地说，例如，在本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体被溶解于合适的溶剂(如PBS缓冲液、盐水或无菌水)后，如果必要的话进行过滤灭菌。然后通过将其填充至无菌容器中，从而制备可注射的溶液，并对人类施用。这里制备的可注射的溶液可以被添加常用的载体或进行冷冻干燥制剂。
本发明提供的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体可以通过静脉、肌肉内、腹膜内、皮下或皮内注射，也可通过鼻内或口服施用。
本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体的剂量根据施用对象、施用方法以及施用模式而改变，但通常每个成年人考虑服用109-1012个、1011-1012个病毒颗粒的范围。
当本发明的嵌合的5型/11型或5型/35型病毒载体与上述复制缺陷的病毒载体或非病毒载体或与抗HIV药物并用时，可采用与上述类似的施用方法，并且复制缺陷的病毒载体或非病毒载体、或抗HIV药物可以以通常采用的施用方法与剂量的方式被施用。
参考下列实施例将对本发明进行更详细的描述，然而没有限制本发明的范围。
实施例1
(1)本发明的嵌合的5型/35型腺病毒载体的构建
通过使用如下所述的Avior Therapeutics，Inc(Seattle，WA)的试剂盒构建本发明的嵌合的5型/35型腺病毒载体，其中HIV B亚型的HIVIIIB的rev基因和env基因以可表达的方式被整合至E1、E3缺失的复制缺陷的5型腺病毒中，所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因被35型腺病毒的纤维蛋白编码基因取代。
购自Avior Therapeutics，Inc(Seattle，WA)的构建试剂盒中包括一种包含Ad522-342位以及3523-5790位、大肠杆菌复制起点以及阿莫西林抗性基因的左手穿梭质粒(pLHSP)和包括E1和E3缺失的复制缺陷的5型腺病毒的右手嵌合型穿梭质粒(pRHSP5/35)，其中所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因以可表达的方式被编码35型腺病毒(Ad35柄及Ad35凸起)的基因所取代。
首先，包含CAG启动子-HIVIIIB rev/env-polyA的5.2k bp Sa II/Pst I片段被亚克隆入包含Ad522-342位以及3523-5790位、大肠杆菌复制起点、以及阿莫西林抗性基因的pLHSP质粒的多克隆位点EcoRI，形成pLHSP-HIV穿梭质粒。然后，该pLHSP-HIV穿梭质粒以PacI被线性化，并通过钙沉淀法与嵌合的穿梭质粒(pRHSP5/35)共转染入HEK293细胞内。
嵌合的5/35型腺病毒-HIV(Ad5/35-HIV)的噬菌斑可通过转染后在平板上培养7-14天获得。本发明的目标，即嵌合的5/35型腺病毒-HIV在HEK293细胞中扩增，并通过两次重复CsCl方法被纯化。
(2)其他重组载体
用于后续实验中的其他载体采用如下方法获得：
表达HIV env基因的复制缺陷的牛痘病毒(安卡拉株系，MVA-HIV)(Amara，R.R.et al.，Science 292：69-74，2001；Amara R.R.etal.，J.Viol.76：7625-7631，2002；Robinson，H.et al.，Nat.Med.5：526-534，1999)由Moss博士(病毒疾病实验室，国家健康中心(National Institutes of Health)MD)提供。增殖型牛痘病毒载体(WR株系，vPE16)购于国家健康中心(MD)的AIDS药物计划(Cat.No.362)。这些重组牛痘病毒分别在初级鸡胚胎纤维原细胞和CV1细胞中扩增。
先前已报道了嵌合的5型/35型腺病毒载体(Ad5/F35-LacZ)，其中半乳糖苷酶Z(lacZ)以可表达的方式整合入E1和E3缺失的复制缺陷的5型腺病毒内，所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因被35型腺病毒的纤维蛋白编码基因取代；以及表达半乳糖苷酶Z(lacZ)的E1和E3缺失的复制缺陷的5型腺病毒(Ad5-LacZ)(Mizuguchi，H.et al.，Gene 285：69-77，2002)。
各制剂中的病毒粒子的总浓度通过采用公式1OD260＝1×1012个病毒颗粒/ml＝1×1010个噬菌斑形成单位(PFU)/ml、由260nm处的光密度(OD260)来计算。包含HIVIIIB及env的DNA疫苗(pCAGrev/env)先前已有报道(Jounai，N.J.Gene Med.，5：609-617，2003)。
(3)重组病毒的表达
1)方法
为了证实重组病毒的表达，MVA-HIV溶液、vPE16(表达HIV env的增殖型牛痘病毒WR株)及Ad5/F35-HIV溶于等量的2×SDS缓冲液(125mM Tris-HCl、pH 6.8、4％ SDS、20％甘油、0.01％溴酚蓝、10％ β-巯基乙醇)中。煮沸10分钟后，该溶液进行4-12％的密度梯度丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，蛋白转移至Hybond ECL硝酸纤维素膜(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)，然后通过鼠抗HIV gp120单克隆抗体(杂交瘤902，AIDS研究和参考药物计划(AIDS Research and Reference Reagent Program)，国家健康中心，MD)添加gp160。在添加亲和纯化的辣根过氧化氢酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的鼠免疫球蛋白(ICN Pharmaceuticals，Inc，OH)后，有色产物通过ECL Western Blotting检测系统(Amer shamPharmacia Biotech)显影。
2)结果
在MVA-HIV的体外表达中，vPE16与Ad5/F35均被证实。结果参照图1。如图1所示，gp160可以在由感染的细胞制备的溶菌液中检测到，而在未感染的HEK293细胞中则检测不到，因此，作为病毒载体感染结果的HIV基因的表达被证实。
实施例2
重组病毒的评估
(1)方法
1)实验动物与免疫
8周龄的雌性BALB/c鼠购自日本的SLC Inc.、日本的Shizuoka，并以12小时昼夜轮流保存于动物便利中心。免疫方法参考图2。在0、1、2周时，通过在鼠肌内注射100μg溶于磷酸缓冲液(PBS)的pCAGrev/env或pCAG空质粒(rev/env被去除的质粒)DNA对鼠进行免疫，并通过肌内注射1010vp的Ad5/F35-LacZ或、肌内或皮内注射1010vp的Ad5/F35-HIV来追加免疫。对于单独以病毒载体免疫的组，溶于PBS的1010vp的Ad5/F35-LacZ或Ad5/F35-HIV通过肌内、腹腔内、皮下或皮内注射被服用。
2)四聚物实验
四聚物检验在最终免疫后1周进行。结合PE的H-2Dd/p18四聚物(RGPGRAFVTI)购于国家健康中心(MD)的AIDS研究和参考药物计划。
如Xin，K.-Q.et al.，Hum.Gene Ther.13：1571-1581，2002所述进行四聚物检验。分离的淋巴细胞在4％的溶于PBS的标准血清中、在4℃下封闭30分钟，并且以结合FITC的抗鼠CD8抗体(0.5μg/106个细胞)(Ly-2，PharMingen)、在4℃下染色30分钟。以染色缓冲液(3％ FCS，0.1％ NaN3，溶于PBS)清洗两次后，细胞与四聚物药物在37℃下共培养15分钟，然后进行流式细胞分析(Becton Dickinson)。
3)细胞内的细胞活素染色检测
分泌IFNγ的CD8+T细胞通过厂商推荐的方案检测(Cytofix/CytoPerm Plus kit，PharMingen，San Diego，CA，USA)。
将淋巴细胞从鼠脾脏中分离。单细胞悬浮液与10μg/ml的HIV V3肽(NNTRKRIQRGPGRAFVTIGKIGN)在37℃下共培养24小时。在共培养结束前2小时加入1μg/ml的GolgiPlus。细胞以染色缓冲液(3％胎牛血清(FCS)，0.1％叠氮化钠(NaN)3，溶于PBS)清洗两次，以4％标准鼠血清封闭，以结合藻红蛋白(PE)的抗鼠CD8抗体(Ly-2，PharMingen)染色。然后细胞于250μl Cytofix/CytoPerm溶液中在4℃下悬浮20分钟，以Perm/Wash溶液清洗，并且以与FITC结合的抗鼠IFN-g抗体(PharMingen)、在4℃下染色30分钟，然后进行流式细胞检测。
4)用于激发实验的重组牛痘病毒
病毒激发实验是根据Belyakov，I.M.等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：1709-1714，1998以及Xin，K.-Q.等在Hum.Gene Ther.13：1571-1581，2002中所述的方法进行。表达HIV IIIB基因的牛痘病毒vPE16(AIDS药物计划，NIH，MDCat.No.362)被用于感染。首先，在本发明的嵌合的腺病毒载体Ad5/F35-HIV免疫后2或7周时，由以108PFU的vPE16腹腔内激发鼠。在激发后6日时，将鼠杀死，其卵巢超声破碎，并且，vPE的效价通过在CV1细胞的平板上连续10倍稀释测定。感染后的细胞通过以水晶紫染色检测，并且每次稀释时计数噬菌斑数。
5)数据分析
所有值以平均±标准误差(S.E.)的形式表示。数据通过一元配置分散分析进行处理，P<0.05作为统计分析中显著水平的标准。
(2)结果
1)腺病毒载体对肝与肾细胞的毒性
对鼠静脉或腹腔内注射1011个Ad5-LacZ及Ad5/F35-LacZ毒粒(高于免疫剂量的10倍)。施用后6天时，将鼠转移至Kitayama Rabes Corp.，Nagano，Japan，在此进行肝肾毒性研究。如图3所示，施用Ad5-LacZ的组的GOT和GPT值分别较施用Ad5/F35-LacZ的组高出5倍和2倍。并未观察到Ad5-LacZ和Ad5/F35-LacZ组之间对肾脏毒性的较大差异。
2)免疫反应的时间-效应研究
在0日，通过肌内、皮内或皮下注射Ad5/F35-HIV(1010个毒粒/鼠)对鼠进行免疫，并且以肌内注射Ad5/F35-LacZ(1010个毒粒/鼠)的组作为负对照。被免疫鼠的HIV特异性免疫反应通过四聚物结合实验、以及细胞内的细胞活素染色实验(introcellular cytokine stainingassay，ICCS)来检测。如图4所示，在免疫后的14日检测到最大四聚物结合活性，此后其活性逐渐降低。图4中的四聚物结合值以肌内>皮内>腹腔>皮下的顺序增加，并且反映了HIV特异性细胞调节免疫反应的强度。类似的结果也出现在ICCS实验中(图5)。背景值(Ad5/F35-LacZ组)在四聚物结合实验中低于0.15％，在ICCS实验中低于0.13％。由这些研究结果，选择肌内及皮内施用用于后续实验。
3)由pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV免疫引起的长期性细胞调节免疫反应
两种方法(四聚物实验与细胞内的细胞活素实验)被用于检测HIV特异性细胞调节免疫反应。在最终免疫后两周，与DNA疫苗(pCAGrev/env)组相比，Ad5/F35-HIV肌内和皮内注射施用组诱导高出六倍多的HIV特异性的分泌IFNγ的CD8+T细胞(图6)。Ad5/F35-HIV诱导出较被认为是第一候选HIV疫苗的MVA-HIV和vPE16约强2倍的细胞免疫性。并且，由pCAGrev/env和Ad5/F35-HIV组成的结合疫苗较单独的Ad5/F35-HIV提高了多于3倍强的免疫反应。在ICCS实验中可观察到类似的结果(图7)。并且，当对以pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV免疫的鼠追加免疫时，HIV特异性免疫反应并未增加很多(对于皮内施用仅从18％提高到20％，对于腹腔内施用仅从19％提高到21％)。由这些观察表明几乎最高的抗原特异性免疫反应是由接种疫苗引起的。
为了确定由施用Ad5/F35-HIV所诱导的免疫反应是否有利于预防感染，在最终免疫后两周，以表达HIV env基因的vPE16腹腔内激发接种疫苗的鼠。如图9所示，施用Ad5/F35-HIV和pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV的两组鼠完全可防御病毒感染，因此显然这些疫苗有助于宿主防御系统。
下一步，进行研究，以观察这些疫苗是否能够产生和保持长期性免疫反应。即使在最终免疫后7周，施用pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV疫苗的组仍被证实保持高水平的HIV特异性细胞调节免疫反应(对于皮内施用和肌内施用分别为8％和9％)(图10)。在最终免疫后7周时进行的vPE16激发实验揭示通过施用pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV疫苗实现了对病毒感染的完全防御(图11)。因此，很明显该疫苗能够诱导长期性免疫反应。如图12所示，本发明的Ad5/F35-HIV具有比MVA-HIV高出1000倍的病毒效价。
实施例3
(1)包含HIV C亚型Env基因/Gag基因的嵌合的5型/35型腺病毒载体的构建
通过下述同源重组的方法构建本发明的嵌合的5型/35型腺病毒载体，其中HIV C亚型(96ZM651.8株系)的env基因(gp120，2kbp)和gag基因(1.5kbp)以可表达的方式整合至E1和E3缺失的复制缺陷的5型腺病毒，所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因被35型腺病毒的纤维蛋白编码基因取代。
完整的HIV C亚型gp120编码基因(2kbp，C/gp120)和gag编码基因(1.5kbp，C/gag)(GeneBank No.AF286224)在重组牛痘病毒vT331株中得到扩增(Gao F.et al.，J.Virol.，1998，Vol.72，5680-5690)。使用以下引物通过PCR合成C/gp120和C/gag的DNA片段：
C/gp120-5’引物：aagaattcctcgagaaaatgagagtgagggagatact
C/gp120-3’引物：aatctagatttttctctctccaccactctcc
C/gag-5’引物：aagtcgacaaaatgggtgcgagagcgtcaatat
C/gag-3’引物：aatctagattgagacaaggggtcgctgccaaa
得到的C/gp120和C/gag片段与IgG Fc片段融合(Barouch，D.H.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，4192-4197(2000))，从而产生C/gp120-Ig和C/gag-Ig。C/gp120-Ig和C/gag-Ig亚克隆入pIRES质粒(CloneteckInc.)的Xho I和SalI位点，以产生C/gp120-Ig-IRES-C/gag-Ig。该C/gp120-Ig-IRES-C/gag-Ig片段被亚克隆至质粒pCAGGS的Xho I位点(Jounai，N.et al.，J.Gene Med.，5，609-617(2003))。CAG启动子-C/gp120-Ig-IRES-C/gag-Ig-polyA片段被亚克隆入购于Avior Therapeutics Inc.的LHSP载体的EcoR I多克隆位点，从而生成pLHSP-HIVC亚型穿梭载体质粒。pLHSP-C亚型HIV穿梭载体质粒和pRHSP穿梭载体以脂染试剂(Lipofectamine 2000)转染入HEK293细胞。病毒噬菌斑在转染后7-10天从琼脂糖平板上的培养物中获得。重组病毒在HEK293细胞中繁殖，并且通过两次重复CsCl方法被纯化。由此分离到携带HIV C亚型的Ad5/35-HIV C亚型/env/gag载体。
(2)IFN-γ ELISpot实验
在最终免疫后一周，根据产品指南通过ELISpot实验(Cat.3321-2A-2，MabTech，Nacka，Sweden)评价鼠的分泌IFN-γ的T细胞。多屏的IP平板(Millipore，Bedford，MA)以70％的酒精和PBS清洗。在平板上涂覆10μg/ml的溶于PBS的抗鼠IFN-γ单克隆抗体(An18)，4℃过夜保存。然后清洗平板并在室温下以含有10％的FCS的RPMI1640培养基封闭2小时。从脾或淋巴腺分离的淋巴细胞(1-10×105)添加到各孔中。淋巴细胞以10μg/ml的HIV C亚型V3肽(NNTRQSIRIGPGQTFYATGDIIGD)和HIVC亚型gag肽(DIKQGPKESFRDYVDRFFKTLR)在37℃下刺激24小时。在无刺激物的孔内的淋巴细胞作为负对照。
培养后，清洗平板，并且细胞以1μg/ml的生物素化的抗鼠IFN-γ抗体(R4-6A2)孵育，然后添加碱性磷酸酶链霉亲和素和50μl/孔的BCIP/NBT磷酸酶底物(Kirkegaare和Perry实验室，Gaithersburg，MD)。
斑点的数目由Comuter视图分析器(Comuter Video ImageAnalyzer)(KS Elispot，Carl Zeiss，Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)自动确定。所有实验均进行三次重复。
通过肌内注射1010个Ad5/35-LacZ或Ad5/35-HIV C亚型/env/gag毒粒对BALB/c鼠进行免疫。免疫后两周检测到HIV特异性的分泌IFN-γ脾细胞。结果如图13所示。
(3)结果
如图13所示的结果，只有低于50SPC/百万个分泌IFN-γ脾细胞在非免疫鼠和施用了Ad5/35-LacZ的鼠中均被检测到。另一方面，由env或gag多肽刺激的Ad5/35-HIV C亚型/env/gag组可检测到显著较高的分泌IFN-γ的脾细胞。
工业实用性
本发明已证明携带HIV env基因的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体可以诱导很强的抗原特异性细胞调节免疫反应。由本发明诱导的免疫反应较由被认为是第一候选HIV疫苗的MVA载体诱导的免疫反应强。另外，由嵌合型Ad5/F35-HIV载体和DNA疫苗组成的结合疫苗在鼠实验模型中表现诱导长期性防御病毒感染的保护免疫反应。这些结果表明了开发HIV疫苗以控制AIDS蔓延的可能性。
抗原特异性细胞调节免疫性和中性抗体在防御HIV感染中起着重要作用。很明显，通过采用本发明提供的DNA疫苗和表达HIV env基因的嵌合的5/11型或5型/35型腺病毒载体的组合，可以诱导几乎最高的抗原特异性抗原的细胞调节免疫性。另外，该结合疫苗可诱导长期性保护免疫反应。
并且，本发明提供的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体可与抗HIV药物并用于高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)。本发明提供的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体降低了对肝细胞的毒性、并与人树状细胞有高亲和力。肝毒性是采用常规Ad5载体用于临床治疗的最关键的障碍。基于这些有利方面，可预期该疫苗可在临床试验中取得很好的效果。
安全、高效、低廉的可诱导细胞和体液免疫性的HIV疫苗对于控制HIV感染的蔓延是非常重要的。因此，本发明提供的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体可成为具有控制AIDS蔓延的巨大潜能的下一代疫苗。
附图说明
图1说明HIV gp160蛋白的表达被证实。将重组MVA-HIV、vPE16和Ad5/F35-HIV电泳，然后转移到硝酸纤维素膜、并以鼠抗HIV gp120单克隆抗体染色。
图2说明鼠中不同种重组病毒的免疫方案。
图3说明Ad5载体(Ad5-LacZ)和Ad5/F35载体(Ad5/F35-LacZ)的毒性研究结果。在对BALB/c鼠静脉或腹腔内注射1011个Ad5载体(Ad5-LacZ)颗粒或Ad5/F35载体(Ad5/F35-LacZ)毒粒(高于免疫剂量10倍的病毒颗粒)后7日，分析鼠血清，以测定载体对肝肾的毒性。
图4说明当鼠以重组Ad5/F35-HIV免疫时由四聚物结合实验所检测到的HIV特异性免疫反应的时间-效应研究。在0日时，通过各种施用方式施用1010个Ad5/F35-HIV毒粒。如图所示，在不同时间点处检测HIV特异性CD8细胞的比率(％)。各曲线图为由4-5只鼠计算的平均值。在图4中，i.m.、i.d.、i.p.、s.c.分别代表肌内、皮内、腹腔内和皮下施用。Ad5/F35-LacZ为表达LacZ蛋白的Ad5/F35载体，因此作为负对照。
图5说明当鼠以重组Ad5/F35-HIV免疫时，由ICCS实验检测到的HIV特异性免疫反应的时间-效应研究。在0日时，通过不同的施用方式施用1010个Ad5/F35-HIV毒粒。如图所示，在不同时间点处检测HIV特异性CD8细胞的比率(％)。各曲线图为由4-5只鼠计算的平均值。在图5中，i.m.、i.d.、i.p.、s.c.分别代表肌内、皮内、腹腔内和皮下施用。Ad5/F35-LacZ为表达LacZ蛋白的Ad5/F35载体，因此作为负对照。
图6在说明本发明的Ad5/F35-HIV最终免疫后的免疫反应。通过肌内或皮内单独或同时注射DNA疫苗(pCAGrev/env)和/或病毒载体(Ad5/F35-HIV)(1010个毒粒/鼠)对鼠进行免疫。在最终免疫后2周，通过四聚物结合实验检测HIV特异性免疫反应。
图7说明在本发明的Ad5/F35-HIV最终免疫后的免疫反应。通过肌内或皮内单独或同时注射DNA疫苗(pCAGrev/env)和/或病毒载体(Ad5/F35-HIV)(1010个毒粒/鼠)对鼠进行免疫。在最终免疫后2周，通过ICCS实验检测HIV特异性免疫反应。
图8说明在本发明的Ad5/F35-HIV最终免疫后、随后进行病毒感染的免疫反应。通过肌内或皮内单独或同时注射DNA疫苗(pCAGrev/env)和/或病毒载体(Ad5/F35-HIV)(1010个毒粒/鼠)对鼠进行免疫。免疫按照图2所示的方案进行。在最终免疫后2周(第5周)，通过腹腔内注射108pfu/鼠的牛痘病毒vPE16激发鼠。图8说明在激发后1周(第6周)时的免疫反应。
图9说明在本发明的Ad5/F35-HIV最终免疫后、随后进行病毒激发的免疫反应。通过肌内或皮内单独或同时注射DNA疫苗(pCAGrev/env)和/或病毒载体(Ad5/F35-HIV)(1010个毒粒/鼠)对鼠进行免疫。免疫按照图2所示的方案进行。在最终免疫后2周(第5周)时，通过腹腔内注射108pfu/鼠的牛痘病毒vPE16激发鼠。图9显示了在激发后1周(第6周)时鼠卵巢中的vPE16效价。各点代表各鼠的病毒效价。图中的条代表10只鼠的病毒效价的平均值。
图10显示在最终免疫后7周的免疫反应和感染实验。通过肌内或皮内单独或同时注射DNA疫苗(pCAGrev/env)和/或病毒载体(Ad5/F35-HIV)(1010个毒粒/鼠)对鼠进行免疫。图10显示最终免疫后7周时，通过四聚物结合实验检测到的HIV特异性免疫反应。
图11说明最终免疫后7周的免疫反应和感染实验。通过肌内或皮内单独或同时注射DNA疫苗(pCAGrev/env)和/或病毒载体(Ad5/F35-HIV)(1010个毒粒/鼠)对鼠进行免疫。图11说明在最终免疫后7周时，鼠卵巢中牛痘病毒vPE16效价。各点代表各鼠的病毒效价。图中的条代表10只鼠的病毒效价的平均值。
图12说明由20个15厘米圆盘培养物获得的病毒载体(Ad5/F35-HIV，MVA-HIV，vPE16)的效价。
图13显示从经本发明的Ad5/35-LacZ、Ad5/35-HIV C亚型/env/gag免疫的鼠以及未免疫鼠中分离的HIV特异性分泌IFN-γ脾细胞的细胞数目。
amended   序列表20060529091858.txt
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<120>Title：用于防御人体免疫缺损病毒感染的嵌合型5型/11型或35型腺病毒载体
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            20

Claims (10)

1.一种嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体，该载体包括：复制缺陷的5型腺病毒和编码人体免疫缺陷病毒HIV包被蛋白、或编码与该包被蛋白同功的突变体的基因，所述基因以可表达的方式整合入5型腺病毒内，其中，所述5型腺病毒的纤维蛋白编码基因被编码11型或35型腺病毒的纤维蛋白或编码与该纤维蛋白同功的突变体的基因以可表达的方式取代。
2.根据权利要求1所述的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体，其具有以可表达的方式被整合的编码HIV B亚型或C亚型包被蛋白、或编码与该包被蛋白同功的突变体的基因。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体，与所述编码HIV包被蛋白或与该包被蛋白同功的突变体的基因一起，其进一步包括以可表达的方式被整合至其内的HIV gag基因或与该基因同功的突变基因。
4.根据权利要求1或2所述的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体，其中，所述的5型腺病毒的纤维蛋白编码基因以可表达的方式被编码35型腺病毒的纤维蛋白、或与该纤维蛋白同功的突变体的基因取代。
5.根据权利要求1或2所述的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体，其中所述复制缺陷的5型腺病毒为E1缺陷的复制缺陷5型腺病毒或E1和E3缺陷的复制缺陷5型腺病毒。
6.一种药物组合物，其包括作为活性组分的根据权利要求1至5中任意一项所述的嵌合的5型/11型或5型/35型腺病毒载体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，用于对抗HIV感染。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其是一种HIV疫苗。
9.根据权利要求6至8中任意一项所述的药物组合物，其与复制缺陷的病毒载体或非病毒载体结合使用，其中所述病毒载体或非病毒载体包括以可表达的方式整合在其内的编码HIV包被蛋白、或与该包被蛋白同功的突变体的基因。
10.根据权利要求6至8中任意一项所述的药物组合物，其进一步包括选自反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂中的至少一种抗HIV药物。
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