WO2005052165A1 - 抗ヒト免疫不全ウイルス感染防御用キメラ５型/１１型もしくは３５型アデノウイルスベクター - Google Patents

抗ヒト免疫不全ウイルス感染防御用キメラ５型/１１型もしくは３５型アデノウイルスベクター Download PDF

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Masaru Shimada
Kenji Okuda
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Aristo K.K.
Nichi-Iko Pharmaceutical Co. Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector for protection against anti-human immunodeficiency virus infection. More specifically, the present invention relates to a non-proliferating type 5 adenovirus incorporated so that a gene encoding an envelope protein of human immunodeficiency virus (HIV) can be expressed, and the type 5 adenovirus fiber.
  • the present invention relates to a chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector in which a gene encoding a protein is replaced so that it can be expressed by a gene encoding a type 11 or type 35 adenovirus fiber protein, and a pharmaceutical use thereof.
  • HAART Highly active antiretroviral therapy
  • HAART has shown remarkable effects in reducing mortality in HIV-infected patients.
  • HAART has a problem that the incidence of side effects and resistance is high, and it is currently difficult to obtain the drug in developing countries.
  • HAART has no effect as a preventive agent for HIV infection, and it can be said that the development of a safe and highly effective vaccine is a very important issue in the future AIDS countermeasures.
  • Non-patent document 1 Non-patent document 2 and Non-patent document 3.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • HIV subunit peptide vaccine DNA vaccine, recombinant virus vector vaccine (recombinant vaccine virus Ankara strain (rMVA)) (Non-Patent Document 3 and Non-Patent Document 4), Adenovirus (Non-Patent Document 5), Rabies virus (Non-patent document 6), flavivirus (Non-patent document 7), friend mouse leukemia virus (Non-patent document 8), Venezuelan equine encephalitis virus (Non-patent document 9), vesicular stomatitis virus (Non-patent document 10) ), Adeno-associated virus (Non-patent document 11 and non-patent document) 12), bacterial vector vaccine (bacille Calmette-Guerin) (non-patent document 13), lactic acid bacteria (non-patent document 14), and the like.
  • rMVA recombinant virus vector vaccine
  • rMVA recombinant vaccine virus Ankara strain
  • Non-patent document 3 Non-patent document 4, Non-patent document 5, Non-patent document 8, Non-patent document 15 and Non-patent document 16.
  • Conjugate vaccines with initial immunization with DNA and boosting with rMVA are one of the most successful methods and are currently undergoing Phase I clinical trials.
  • Ad5 The type 5 adenovirus (Ad5) has stronger immunogenicity than rMVA (Non-patent Document 5), and has the advantage of high virus titer, as well as DNA sequences and other organisms. Research has also been carried out on the scientific characteristics. However, Ad5 has a very high affinity for hepatocytes (Non-patent Document 17), and the patient who received Ad5 vector for the treatment of ortine 'trans-forced rubamylase (OTC) deficiency died. There are also reports of non-patent documents (18), and their use as clinical therapeutic vectors is limited. Adenoviruses have 51 serotypes, which are divided into 6 subgenera (A to F). being classified.
  • Non-patent document 19 and Non-patent document 20 are adenoviral vector gene transfer systems.
  • type 2 or type 5 adenoviruses both Ad2 and Ad5 belong to C. This is because Ad2 and Ad5 are well studied, and the DNA sequence has been clarified (Non-patent document 19 and Non-patent document 20).
  • CAR is expressed in the heart, spleen, central / peripheral nervous system, prostate, testicles, lung, liver, and intestine in humans, but it is highly expressed in the liver. Therefore, Ad5 is sensitive to the liver in humans and animals. Think of it as a trap.
  • Ad5 As a vaccine using Ad5, it is reported that a combined vaccine that performs primary immunization with DNA vaccine and booster immunization with Ad5 vector shows a remarkable infection protection effect in a SHIV infection experiment using monkeys (non-patent literature). 27).
  • Ad5 has a particularly high affinity for hepatocytes, it causes hepatotoxicity and is therefore a concern for safety as a viral vector vaccine.
  • Non-patent literature l Haynes, B. F. et al, Science 271: 324-328, 1996
  • Non-Patent Document 2 Miedema, F. et al., Science 272: 505-506, 1996
  • Non-Patent Document 3 Robinson, H. et al., Nat. Med. 5: 526-534,1999
  • Non-Patent Document 4 Amara, R.R. et al., Science 292: 69-74,2001
  • Non-Patent Document 5 Shiver, J. W. et al., Nature 415: 331-335,2002
  • Non-patent literature 6 Schnell, MJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3544-3549,200
  • Non-patent literature 7 Mandl, CW et al "Nat. Med. 4: 1438-1440, 1998
  • Non-Patent Document 8 Matano, T. et al., Vaccine 18: 3310-3318,2000
  • Non-Patent Document 9 Caley, I. J. et al "Vaccine 17: 3124-3135,1999
  • Non-Patent Document 10 Rose, N. F. et al., Cell 106: 539-549,2001
  • Non-patent literature ll Xin, K.-Q. et al., Hum. Gene Ther. 13: 1571-1581, 2002
  • Non-patent literature 12 Xin, K.-Q. et al., Hum. Gene Ther. 12 : 1047-1061, 2001
  • Non-Patent Document 13 Aldovini, A. et al., Nature 351: 479-482,1991
  • Non-Patent Document 14 Xin, K.-Q. et al., Blood 102: 223-228,2003
  • Non-Patent Document 15 Barouch, D.H. et al "J. Viol.75: 5151-5158,2001
  • Non-Patent Document 16 Barouch, D.H. et al., Science 290: 486-495,2000
  • Non-Patent Document 17 Adams, J. Y. et al., Nat. Med. 8: 891-896,2002
  • Non-patent document 18 Thomas, C. E. et al "Nat. Reviews Genetics 4: 346-358,2003
  • Non-patent document 19 Chroboczek, J. et al., Virol. 186: 280-285,1992
  • Non-Patent Document 20 van Ormondt, H. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol.
  • Non-patent document 21 Shayakhmetov, DM et al., J. Viol. 74: 2567-2583,2000
  • Non-patent document 22 Stevenson, SC et al., J. Viol. 69: 2850-2857,1995
  • Non-Patent Document 23 Amara, RR et al, J. Viol. 76: 7625-7631,2002
  • Non-Patent Document 24 Farina, S. F. et al "J. Virol 75: 11603-13,2001
  • Non-Patent Document 25 Jounai, N. et al., J. Gene Med. 5: 609-617, 2003
  • Non-Patent Document 26 Lieber, A. et al., J. Viol. 70: 8944-8960, 1996
  • Non-Patent Document 27 Lubeek, M.D. et al., Cell 106: 539-549,1997
  • An object of the present invention is to provide a new viral vector using Ad5 that can be used as a highly safe and highly effective HIV vaccine. Furthermore, another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the virus vector as an active ingredient, which is used for anti-HIV infection protection, HIV vaccine, and complex vaccine. Another object of the present invention is to provide a method for HIV infection protection or HIV vaccination using the virus vector. Means for solving the problem
  • the intramuscular administration of the chimeric vector resulted in the same titer as compared to the recombinant vaccine virus (Ankara strain) vector and the recombinant recombinant vaccine virus (WR strain) vector. It was revealed that a very strong HIV-specific cellular immune response was elicited. Furthermore, the first immunization with the DNA vaccine and the booster immunization with this chimeric vector completely prevented the infection of ⁇ Cintyvirus expressing the HIV gene 7 weeks after the booster immunization. This finding suggests that it can be a revolutionary vaccine that suppresses the spread of AIDS, a hybrid vaccine that uses DNA vaccines and this chimeric vector! The present invention has been completed based on strong knowledge.
  • the present invention is incorporated into a non-proliferating type 5 adenovirus so that a gene encoding the human immunodeficiency virus envelope protein or a variant thereof having the same function can be expressed.
  • the gene encoding the type 5 adenovirus fiber is the same as the type 11 or type 35 adenovirus fiber protein or the same.
  • the present invention relates to a chimera type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector which is substituted so that it can be expressed in a gene encoding the mutant having the same function.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the chimera type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector as an active ingredient.
  • This pharmaceutical composition can be used for anti-human immunodeficiency virus infection protection and further for anti-human immunodeficiency virus vaccine. Further, it can be used as a non-proliferating virus vector in which an anti-human immunodeficiency virus gene is incorporated so that it can be expressed, or as a combined vaccine used with a non-viral vector. Also used with anti-HIV agents! / You can do it.
  • the present invention is incorporated so that the gene encoding the chimeric 5 type / 11 type or 35 type adenovirus vector and the HIV envelope protein or a variant thereof having the same function can be expressed.
  • the present invention relates to a method for protecting against HIV infection or vaccination for HIV, which is also capable of administering a non-propagating virus vector or a non-virus vector.
  • the present invention relates to a method for protecting against HIV infection or vaccination for HIV, comprising administering the above-mentioned chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenoviral vector and an anti-HIV agent.
  • the chimeric type 5/11 type or type 35 adenoviral vector provided in the present invention can elicit a strong V-antigen-specific cellular immune response. This is a stronger immune response than the MVA vector, which is currently regarded as the most promising anti-human immunodeficiency virus (HIV) vaccine. Furthermore, in a mouse model, it is also possible to induce a long-term protective response against a virus infection of a combined vaccine that combines the chimeric type 5/11 type or type 35 adenovirus vector of the present invention with a DNA vaccine. Therefore, the chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenoviral vector of the present invention suggests the possibility of developing an innovative HIV vaccine that suppresses the spread of AIDS.
  • HIV anti-human immunodeficiency virus
  • the chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenoviral vector of the present invention can be used together with an anti-HIV agent used in highly active antiretroviral therapy (HAART) to treat and prevent HIV infection. The effect can also be exerted powerfully.
  • the chimeric 5 type / 11 type or 35 type adenovirus of the present invention In the vector, the type 5 adenovirus fiber gene is replaced with the type 11 or type 35 adenovirus fiber gene, which reduces the toxicity to the liver and improves the affinity to rod cells. .
  • the chimera type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector of the present invention is designed so that a gene encoding an HIV envelope protein or a variant thereof having the same function can be expressed in a non-propagating type 5 adenovirus. And the gene encoding the type 5 adenovirus fiber protein was replaced so that it could be expressed by the gene encoding the type 11 or type 35 adenovirus fiber protein or a variant thereof having the same function. Is.
  • the HIV envelope protein (env) may be any type of HIV envelope protein such as HIV type 1 and HIV type 2.
  • various clades (subtypes) are known for HIV type 1, and any type of HIV envelope protein such as clade A, clade B, clade C, clade D, grade E, etc. It may be.
  • the gene encoding the envelope protein and its amino acid sequence are well known, Gao, F., et al, J. Virol.
  • Such variants may include amino acids in which one or several amino acid residues have been deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of the envelope protein.
  • it may be a gene that is hybridized under stringent conditions with a gene encoding an envelope protein and encodes a protein having the same immunogenicity as the envelope protein. Examples of genes that can be hybridized under stringent conditions include, for example, 6 X SSPE, 2 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, and 0.1 mg / ml salmon testis DNA solution at 65 ° C for 12 hours.
  • the genes that hybridize by performing Southern hybridization under the conditions of In the present invention a gene encoding a clade type HIV or clade C HIV envelope protein or a variant thereof having the same function is preferred.
  • gag gene is a gene encoding the core protein of HIV, and its gene sequence and the amino acid sequence encoded thereby are known, Gao, F “et al” J. Virol. 70 (3), 1651-1667 (1996); Ratner, L., et al "Nature 313 (6000), 277-284 (1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609-617 (2003) Kim, FM, et al "J. Virol. 69 (3), 1755-1761 (1995); Rodenburg, CM., Et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 17 (2), 161-168 (2001) ; Gao, F "et al” J.
  • the mutated gene is a gene encoding a protein having the same function as the protein encoded by the gag gene, and the amino acid of the protein encoded by the gag gene is the same as the above-described mutant of the envelope protein.
  • a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted and / or added in the sequence and having the same function as the protein encoded by the gag gene Alternatively, a gene that hybridizes with the gag gene under stringent conditions and encodes a protein having the same function as the protein encoded by the gag gene can be mentioned.
  • a gene encoding an envelope protein or a mutant thereof, or a gag gene or a mutant gene thereof can be obtained by a known method using a PCR method or the like based on well-known gene information. These methods can be easily carried out by those skilled in the art according to basic books such as Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
  • a gene encoding the above-mentioned mutant or a gene that hybridizes under stringent conditions can be easily obtained by, for example, site-directed mutagenesis, ordinary hybridization, and the like. Can be performed with reference to the basic documents such as Molecular Cloning.
  • the rev gene (Gao, F “et al” J. Virol. 70 (3), 1651-1667 (1996), which is an HIV regulatory gene, together with a gene encoding an HIV envelope protein or a variant thereof.
  • gag gene or its mutant genes are included in the non-proliferating type 5 adenovirus so that they can be expressed together with the rev gene as necessary.
  • a gag gene or a mutant gene thereof, a rev gene, an envelope protein or a variant thereof is encoded downstream of a CMV promoter (a site megaloinores promoter) or a CAG promoter (a chimeric promoter of CMV promoter and chicken 13-actin promoter).
  • CMV promoter a site megaloinores promoter
  • CAG promoter a chimeric promoter of CMV promoter and chicken 13-actin promoter.
  • the same gene as the type 5 adenovirus is connected to both ends of the gene, followed by the poly A gene expression unit, and introduced by homologous recombination in 293 cells derived from human fetal kidney cells. .
  • the gene encoding the fiber protein of type 11 or type 35 adenovirus used in the present invention and its amino acid sequence are already known, Mei, YF et al., Virology 206 (1), 686-689, 1995; Dmitry M. et al "J. Virology, Mar. 2000, vol.74, 2567-2583; NCBI U10272; NCBI AAA66361.1; Stone, D. et al, Virology, 2003, Vol. 309, 152-156.
  • the fiber protein is composed of a shaft and a knob. In the present invention, a gene encoding a fiber protein composed of these is usually used.
  • the gene is not limited to a gene encoding a fiber protein, and may be a gene encoding a variant thereof having the same adhesion to a target cell as a fiber protein.
  • a variant is a protein having an amino acid sequence ability in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence of the fiber protein, and is the same target cell as the fiber protein.
  • a protein having adhesiveness to Alternatively, it may be a gene that codes for a protein that adheres to a target cell in the same manner as the fiber protein, and is hybridized under stringent conditions with the gene that codes the fiber protein. Examples of stringent conditions include the same conditions as those of the HIV envelope protein described above.
  • the gene encoding the fiber protein or a mutant thereof can be easily obtained by the above-mentioned well-known method as in the case of the gene encoding the envelope protein or the mutant.
  • the gene encoding the type 11 or type 35 adenovirus fiber protein or a variant thereof is replaced with the gene encoding the non-type 5 adenovirus fiber protein so that the gene can be expressed.
  • DNA in which a gene other than a type 5 adenovirus fiber is connected to both ends of a gene encoding a type 11 or type 35 adenovirus fiber protein or a variant thereof is used in human fetal kidney. This can be achieved by transfection into cell-derived 293 cells, and the chimera type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector can be constructed by force.
  • the chimeric type 5/11 type or type 35 of the present invention can also be constructed.
  • Adenovirus vectors can be easily constructed using commercially available kits as described below. It can also be.
  • an HIV IIIB rev gene and an env gene are introduced into an El, E3-deficient non-proliferative type 5 adenovirus so that the rev gene and env gene can be expressed, and the type 5 adenovirus fiber gene is a type 35 adenovirus.
  • Replacement for expression in the fiber gene The chimeric 5/35 adenoviral vector of the present invention can be easily prepared using a kit of Avior Therapeutics, Inc (Seattle, WA). More specifically, for example, a CAG promoter, HIV IIIB rev gene and env gene, and a gene fragment (CAG promotor-HIV IIIB rev / env-polyA) having a poly A gene were prepared by Jounai, N.
  • the kit of Avior Therapeutics, Inc includes a 22-342 site of type 5 adenovirus (Ad5) and Ad5 as a left hand shuttle plasmid.
  • E. coli ori plasmid vector pLHSP with ampicillin resistance gene
  • right hand shuttle plasmid El
  • E3 deficient non-proliferating type 5 adenovirus type 5 It contains the chimeric shuttle plasmid vector pRHSP 5/35 in which the adenovirus fiber gene has been replaced to allow expression of the type 35 adenovirus fiber gene (Ad35 shaft and Ad35 knob).
  • this 5.2 kbp fragment is inserted into the Eco RI site, which is one of the manocyclic sites of the plasmid vector pLHSP.
  • the obtained pLHSP-HIV shuttle plasmid is linearized by digestion with Pac I, and then transfected into HEK 293 cells together with the chimeric shuttle plasmid vector pRHSP 5/35 by the calcium phosphate method.
  • the target chimeric type 5/35 type adenovirus (Ad5 / F35-HIV) of the present invention can be obtained by culturing plaques on a plate medium for 7 to 14 days after the transfer. By such a method, other chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vectors of the present invention can be similarly prepared.
  • the chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector of the present invention can elicit a very strong HIV-specific cellular immune response. Furthermore, the chimeric type 5/11 or type 35 adenovirus vector of the present invention is toxic to the liver because the type 5 adenovirus fiber gene is replaced with the type 11 or type 35 adenovirus fiber gene. Reduced and improved affinity to rod cells. Therefore, the chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector of the present invention is extremely effective as a medicine for HIV infection protection and as a vaccine for HIV.
  • non-propagating viral vectors include, for example, thread-replaceable adenoviruses in which the early gene E1 of type 2 or type 5 adenovirus is replaced with a gene unit that expresses the HIV envelope protein, or HIV Examples include non-replicating recombinant vaccine viruses into which a gene unit that expresses an envelope protein is introduced.
  • Non-viral vectors for expression such as pCAGGS (Gene 108: 193-200, 1991)), pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene), which are commonly used for mammalian cells
  • the vector include a non-viral vector into which a gene unit that expresses HIV envelope protein is introduced.
  • the chimeric type 5/11 type or type 35 adenoviral vector of the present invention can be used together with an anti-HIV agent used in highly active antiretroviral therapy (HAART).
  • anti-HIV agents include reverse transcriptase inhibitors and protease inhibitors.
  • Reverse transcriptase inhibitors are drugs that block the action of the enzyme that reverse-transcribes HIV RNA genes into normal DNA in helper T cells, such as azidothymidine (AZT), didanosine (ddl), lambidine (3TC), nevirapine (NVP) is exemplified.
  • Protease inhibitors are those that inhibit proteases, which are enzymes that work when HIV viruses try to assemble proteins made from DNA transcribed from HIV virus.
  • Examples of a method for administering the chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenoviral vector of the present invention to humans include the methods described below.
  • the chimeric 5 type / 11 type or 35 type adenovirus vector of the present invention Dissolve in an appropriate solvent, for example, a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc., and if necessary, filter sterilize with a filter etc., then fill the sterile container with an injectable solution.
  • an appropriate solvent for example, a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.
  • filter sterilize with a filter etc. then fill the sterile container with an injectable solution.
  • an injectable solution for example, a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.
  • an injectable solution for example, a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.
  • the chimera type 5 / type 11 or type 35 adenovirus vector of the present invention can be administered intravenously, intramuscularly, abdominally, subcutaneously, intradermally, etc., and can
  • the dose of the chimeric type 5 / type 11 or type 35 adenoviral vector of the present invention varies depending on the administration subject, administration method, dosage form, etc., but is usually in the range of 10 9 to 10 13 viral particles per adult, preferably Is in the range of 10 11 — 10 12 virus particles.
  • adenovirus vector of the present invention when administered together with a normal non-propagating virus vector or non-viral vector, or an anti-HIV agent, the same as above.
  • the administration method and dosage can be administered, and the non-proliferating virus vector or non-viral vector, or the anti-HIV agent can be administered in the usual administration method and dosage.
  • ⁇ 3 deficient non-proliferative type 5 adenovirus was introduced so that the rev gene and env gene of HIV ⁇ ⁇ , which is a clade ⁇ type HIV strain, can be expressed, and the fiber gene of the type 5 adenovirus is type 35
  • the chimeric type 5/35 type adenovirus vector of the present invention which is operably substituted in the adenovirus fiber gene, is prepared using a kit of Avior Therapeutics, Inc (Seattle, WA) as described below. did. CAG promoter, HIV IIIB rev gene and env gene, and a gene fragment containing poly A gene (CAG promotor-HIV IIIB rev / env-polyA) are available from Jounai, N. et al., J. Gene Med. 5: 609 It was obtained by isolating from pCAG rev / env described in -617,2003 as a 5.2 kbp Sal I / Pst I fragment.
  • Avior Therapeutics, Inc (Seattle, WA) As plasmid, Ad5 22-342 site, Ad5 3523-5790 site, E. coli ori, plasmid vector pLHSP with ampicillin metabolite gene, and Right hand shuttle plasmid, El, E3 deficient non-propagating type 5 adenovirus Also included is a chimeric shuttle plasmid vector pRHSP 5/35 in which the fiber gene of the type 5 adenovirus is replaced so that it can be expressed in the fiber gene of the type 35 adenovirus (Ad35 shaft and Ad35 knob).
  • the obtained pLHSP-HIV shuttle plasmid was linearized with Pac I, and then transfected into HEK 293 cells by the calcium phosphate method together with the chimeric plasmid DNA pRHSP 5/35. Plaques were cultured in plate media for 7 to 14 days after transfection.
  • the target chimeric type 5/35 type adenovirus (Ad5 / F35-HIV) of the present invention was obtained by growing in HEK 293 cells and purifying twice by the CsCl purification method.
  • Non-proliferative type virus that expresses HIV env (Ankara strain,
  • MVA-HIV MVA-HIV
  • Dr. Moss Laboratory of Viral Diseases, National Institutes of Health, MD
  • the proliferative type virus that expresses HIV env (WR strain, vPE16) can also be purchased from AIDS Reagent Program, National Institutes of Health, MD (Cat. No. 362). These recombinant vaccine viruses were grown in primary chicken mouth cells and CV1 cells, respectively.
  • E3-deficient non-proliferating type 5 adenovirus is introduced so that a gene encoding galactosidase Z (LacZ) can be expressed, and the type 5 adenoviral fiber gene is a type 35 adenoviral fiber.
  • Chimeras substituted for gene expression 5 El / E3-deficient non-propagating type 5 adenovirus (Ad5_LacZ) that expresses type 35/35 adenovirus vector (Ad5 / F35-LacZ) and galactosidase Z (LacZ) has already been reported (Mizuguchi, H. et. al, Gene 285: 69-77,2002) 0
  • MVA-HIV, vPE16 HAV env expressing self-propagating type K virus virus WR strain
  • Ad5 / F35-HIV in the same amount of 2 x SDS buffer (125 mM Tris- HC1, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, 10% j8-mercaptoethanol). After boiling for 10 minutes, the solution was electrophoresed on a 4-12% gradient polyacrylamide gel.
  • HRP rifbenole anti-mouse Ig ICN
  • Fig. 1 The expression of MVA-HIV, vPE16, Ad5 / F35-HIV was confirmed in vitro. The results are shown in Fig. 1. As can be seen from Fig. 1, gpl60 was detected in lysates containing virus, but not in 293 cell lysates, and it was confirmed that the HIV gene was expressed!
  • Combined vaccines are administered 100 ⁇ g pCAG rev / env or pCAG empty DNA (plasma excluding rev / env from pCAG rev / env) dissolved in PBS at 0, 1 and 2 weeks , 10 1 in the third week. particles Ad5 / F35-LacZ was administered im and Ad5 / F35-HIV was administered im or id. The virus vector only administration group was dissolved in PBS 10 1 . Particles Ad5 / F35-LacZ or Ad5 / F35-HIV were administered by im, ip, sc or id.
  • Tetramer Atsey was performed one week after the final immunization.
  • PE-bound H-2Dd / pl8 tetramer (RGPGRAFVTI) was purchased from AIDb Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health, MD.
  • the tetramer atsey method used was the method shown in Xin, K.-Q. et al, Hum. Gene Ther. 13: 1571-1581, 2002.
  • the isolated lymphocytes were blocked with 4% mouse serum dissolved in PBS at 4 ° C for 30 minutes, and then 0.5 ⁇ g / 10 6 cells anti-mouse CD8-FITC antibody (Ly-2, PharMingen) was used. ° C dyed for 30 minutes. After washing twice with staining buffer (3% FCS, 0.1% NaN in PBS), tetramer solution
  • the mixture was incubated with the solution at 37 ° C for 15 minutes, and then analyzed with a flow cytometer (Becton Dickinson).
  • NNTRKRIQRGPGRAFVTIGKIGN 10 ⁇ g / ml and incubated at 37 ° C for 24 hours. GolgiPlug 1 ⁇ g / ml was added 2 hours before the end of incubation. After incubation, the cells are washed with staining buffer (3% FCS, 0.1% NaN in PBS) and 4%
  • the cells were stained with phycoerythrin (PE) -labeled anti-mouse CD8 antibody (Ly-2, PharMingen). After staining, the cells are lysed in Cytofix / Cytoperm solution 250 1. And left at 4 ° C for 20 minutes. After washing with Perm / Wash solution, it was stained with FITC-labeled anti-mouse IFN-antibody (PharMingen) for 30 minutes at 4 ° C and analyzed with a flow cytometer.
  • PE phycoerythrin
  • mice 2 or 7 weeks after inoculation with the chimeric adenovirus vector Ad5 / F35-HIV of the present invention were infected with 10 8 PFU of VPE16 by intraperitoneal administration.
  • the ovaries were also removed from the mouse, and the ovarian cells were thoroughly loosened by ultrasound, and then the virus titer of VPE16 was examined for each 10-fold dilution in a plate of CV1 cells. Infected cells were stained with crystal violet and the number of plaques at each concentration was counted.
  • Ad5 / F35—HIV (10 10 particles / mouse) was administered to mice by im, id, ip or sc, and Ad5 / F35- LacZ (10 10 particles / mouse) was administered as a negative control. im administered. HIV-specific immune responses in immunized mice were detected by tetramer and cytoplasmic cytodynamic force-in staining (ICCS) assay. As shown in Figure 4, the intensity of the immune response reached its maximum on day 14 for all dosing methods and gradually decreased thereafter. The size in Figure 4 (im>id>ip> sc) reflects the strength of the HIV-specific cellular immune response, and similar results were obtained in ICCS assembly ( Figure 5).
  • Knock ground (Ad5 / F35-LacZ administration group) values were 0.15% or less for Tetramer Atsei and 0.13% or less for ICCS Atsey. Therefore, im and id administration methods were used for subsequent immunization.
  • Ad5 / F35-HIV induces cellular immunity about twice as strong as MVA-HIV, vPE16, which is a promising candidate for HIV vaccine, and a combined vaccine with pCAGrev / env and Ad5 / F35-HIV Induced an immune response that was more than three times stronger than when Ad5 / F35-HIV alone was administered.
  • mice that had been immunized with pCAGrev / env / Ad5 / F35-HIV were further boosted, the HIV-specific cellular immune response did not increase significantly (id and ip administration, Increased to 18%, 19% to 20%, and 21%, respectively (Fig. 8), suggesting that this vaccine elicits an antigen-specific immune response that is close to the maximum value.
  • Ad5 / F35-HIV of the present invention has a virus titer 1000 times that of MVA-HIV.
  • El and E3 deficient non-proliferating type 5 adenovirus were introduced so that the env gene (gpl20, 2kbp) and gag gene (1.5kbp) of clade C type HIV (96ZM651.8 strain) can be expressed.
  • the chimeric type 5/35 type adenovirus of the present invention in which the type 5 adenovirus fiber was replaced so as to be capable of expressing the type 35 adenovirus fiber gene was prepared by the gene homologous recombination method as described below.
  • the full-length env gpl20 gene (2kbp, C / gpl20) and gag gene (1.5kbp, C / gag) are recombinant vaccinia virus vT331. It was amplified in the strain (Gao F. et al., J. Virol, 1998, Vol. 72, 5680-5690).
  • C / gpl20 and C / gag DNA fragments were prepared by PCR using the following primers.
  • C / gpl20-Ig and C / gag-Ig were prepared.
  • C / gpl20-Ig and C / gag-Ig are cloned at the Xhol and Sail positions of the pIRES plasmid (Cloneteck), respectively.
  • C / gpl20-Ig-IRES-C / gag-Ig was obtained.
  • CAG promoter- C / gp 120- Ig- IRES- C / gag- Ig-polyA fragment was inserted into the EcoRI site of the multicloning site of the LHSP vector purchased from Avior Therapeutics, Inc, and the pLHSP-HIV clade
  • the C shuttle plasmid was prepared pLHSP—HIV clade
  • the C shuttle plasmid was transfected into HEK293 cells using LipoFexion reagent (Lipofectamine 2000) together with the AdRH / 35 pRHSP shuttle vector. Plaques were cultured for 7 to 10 days to obtain plaques. The plaque solution was infected with HEK293 cells, expanded and then purified twice by CsCl purification method. -C-type HIV / env / gag vector was obtained.
  • multiscreen-IP plates (Millipore, Bedford, MA) were washed with 70% ethanol and PBS. Plates were 4 ° C-coated with 10 ⁇ g / ml anti-mouse IFN- ⁇ monoclonal antibody ( ⁇ 18) in PBS. The plates were then washed and blocked with RPMI-1640 and 10% FCS for 2 hours at room temperature. Lymphocytes (1-10 X 105) isolated from spleen or intestinal lymph nodes were added to each well.
  • Lymphocytes were stimulated with 10 g / ml HIV clade C V3 peptide (NNTRQSIRIGPGQTFYATGDIIGD) and HIV clade C gag peptide (DIKQGPKESFRDYVDRFFKTLR) for 24 hours at 37 ° C.
  • Control wells containing unstimulated cells were used as control wells.
  • the plates were washed and then 1 ⁇ g / ml piotinized anti-mouse IFN- ⁇ antibody (R4-6A2), streptavidin alkaline phosphatase and then 50 ⁇ 1 / well BCIP / NBT phosphatase substrate (R4-6A2)
  • Ad5 / 35- LacZ or Ad5 / 35-C HIV / env / gag 10 1 Particles into BALB / c mice Intramuscular injection. Two weeks after immunization, HIV-specific IFN- ⁇ secreting spleen cells were detected. The obtained results are shown in FIG.
  • mice administered Ad5 / 35-LacZ showed IFN- ⁇ -secreting spleen cells of 50 SPC / million or less and were not observed.
  • significantly higher HIV-specific IFN- ⁇ secreting spleen cells were detected in mice administered with Ad5 / 35-C HIV / env / gag stimulated with env peptide or gag peptide.
  • a chimeric type 5/11 type or type 35 adenovirus vector expressing the HIV env gene elicits a strong antigen-specific cellular immune response. This is a stronger immune response than the MVA vector currently regarded as the most promising HIV vaccine. Furthermore, in a mouse model, it was also found that a combined vaccine combining a chimeric Ad5 / F35-HIV vector and a DNA vaccine induces a long-term protective response against viral infection. These results suggest the possibility of developing an innovative HIV vaccine that suppresses the spread of AIDS.
  • Antigen-specific cellular immunity and neutralizing antibodies are very important for HIV infection protection.
  • the combination of a DNA vaccine and a chimeric type 5/11 or type 35 adenoviral vector expressing the HIV env gene of the present invention induces almost the highest level of cellular immunity against a specific antibody. However, it was divided. Furthermore, it has been shown that this complex type of vaccine can induce a long-term protective immune response.
  • the chimeric type 5/11 or type 35 adenoviral vector of the present invention can also be used with the anti-HIV agent used in highly active antiretroviral therapy (HAART).
  • Type 35 or type 35 adenovirus vectors have few side effects on the liver, which is the biggest barrier when using conventional Ad5 vectors for clinical treatment, and have a high affinity for human rod cells. However, remarkable results can be expected in human clinical trials.
  • a low-cost vaccine is very important for suppressing the spread of HIV. Therefore, the chimera type 5/11 of the present invention Type 35 or Type 35 adenoviral vectors can be the next generation of vaccines with great potential to suppress the spread of AIDS.
  • Fig. 1 shows the results of electrophoresis of recombinant viruses MVA-HIV, vPE16, Ad5 / F35-HIV, and then transcribed to -cellulose membrane and applied to X-ray film using mouse anti-HIV gpl20 monoclonal antibody. The figure which exposed to light and confirmed HIV gp160 protein is shown.
  • Figure 2 shows the immunization schedule when mice are immunized with various recombinant viruses.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the HIV-specific immunity reaction over time by tetramer assay when mice were immunized with the recombinant virus Ad5 / F35-HIV.
  • Ad5 / F35-HIV 10 1Q particles of Ad5 / F35-HIV vector were administered by various routes.
  • the percentage of HIV-specific CD8 + cells at the time in the figure was detected. Values are average values of 4 or 5 mice.
  • im indicates muscle
  • id indicates intradermal
  • ip indicates intraperitoneal
  • SC indicates subcutaneous administration
  • Ad5 / F35-LacZ is an Ad5 / F35-LacZ vector that expresses LacZ protein and was used as a negative control.
  • FIG. 5 shows the results of measurement of the HIV-specific immunity reaction over time by ICCS assay when mice were immunized with the recombinant virus Ad5 / F35-HIV.
  • Ad5 / F35-HIV 10 1Q particles of Ad5 / F35-HIV vector were administered by various routes.
  • the percentage of HIV-specific CD8 + cells at the time in the figure was detected. Values are average values of 4 or 5 mice.
  • im indicates muscle
  • id indicates intradermal
  • ip indicates intraperitoneal
  • SC indicates subcutaneous administration
  • Ad5 / F35-LacZ is an Ad5 / F35-LacZ vector that expresses LacZ protein and was used as a negative control.
  • FIG. 6 shows an immune response after final immunization with Ad5 / F35-HIV of the present invention.
  • DNA vaccine pCAGrev / env
  • viral vector Ad5 / F35—HIV
  • FIG. 7 shows an immune response after final immunization with Ad5 / F35-HIV of the present invention.
  • Mice were administered DNA vaccine (pCAGrev / env), viral vector (Ad5 / F35—HIV) (lOiOparticles / mouse) either or both i.m or i.d.
  • DNA vaccine pCAGrev / env
  • Ad5 / F35—HIV viral vector
  • LOiOparticles / mouse two weeks after the final immunization, an HIV-specific immune response was detected by ICCS.
  • the spot indicates the virus titer of each mouse, and the horizontal bar indicates the average value of 10 mice.
  • FIG. 8 shows final immunization with Ad5 / F35-HIV of the present invention, followed by immune response after virus infection.
  • DNA vaccine pCAGrev / env
  • viral vector Ad5 / F35-HIV
  • mice were administered to mice either im or id. Immunization is carried out according to the schedule shown in FIG. 2, and 10 8 pfo / mouse of vPE16 virus is administered ip two weeks after the final immunization (week 5), and the immune response is shown one week later (week 6). The value is shown as an average of 6-10 mice. The spot indicates the virus titer of each mouse, and the horizontal bar indicates the average value of 10 mice.
  • FIG. 9 Final immunization with Ad5 / F35-HIV of the present invention, followed by immune response after virus infection.
  • DNA vaccine pCAGrev / env
  • viral vector Ad5 / F35—HIV
  • FIG. 2 shows the virus virus titer in the ovaries of mice infected with weekly 6 mice administered ip with 10 8 pfo / mouse vPE16 virus virus at week 5 of the schedule shown in FIG.
  • the spot indicates the virus titer of each mouse, and the horizontal bar indicates the average value of 10 mice.
  • FIG. 10 shows the results of an immune response and an infection experiment 7 weeks after the final immunization. Immunization was carried out by administering DNA clones (pCAGrev / env) or viral vectors (Ad5 / F35—HIV) (101 () particles / mouse) to mice either im or id. The measurement results of the HIV-specific immune response detected by tetramer atsey 7 weeks after the final immunization are shown. The spot shows the virus titer of each mouse, and the horizontal bar is 10 The average value of mice is shown.
  • DNA clones pCAGrev / env
  • Ad5 / F35—HIV 101 () particles / mouse
  • FIG. 11 shows the results of an immune response and an infection experiment 7 weeks after the final immunization. Immunization was carried out by administering DNA vaccine (pCAGrev / env) or viral vector (Ad5 / F35—HIV) (10 10 particles / mouse), either or both to mice by im or id. Shown is the virus virus titer in infected mouse ovaries 7 weeks after the final immunization. The spot shows the virus titer of each mouse, and the horizontal bar shows the average value of 10 mice.
  • DNA vaccine pCAGrev / env
  • Ad5 / F35—HIV 10 10 particles / mouse
  • FIG. 12 shows the titers of virus vectors (Ad5 / F35-HIV, MVA-HIV, rPE16), and the titers of viruses obtained from 20 15 cm dishes.
  • FIG. 13 shows detection of HIV-specific IFN- ⁇ secreting spleen cells in non-immunized mice, Ad5 / 35-LacZ-administered mice and Ad5 / 35-C type HIV / env / gag-administered mice of the present invention. The results are shown.

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Abstract

　非増殖型 5 型アデノウイルスに、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子が発現可能なように組み込まれており、かつ当該 5 型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子が 11 型もしくは 35 型アデノウイルスのファイバー蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているキメラ 5 型/ 11 型もしくは 35 型アデノウイルスベクターは、肝臓への毒性が軽減され、かつ非常に強い HIV 特異的細胞性免疫応答を惹起することができ、HIV 感染防御用の医薬として極めて有効である。

Description

明 細 書
抗ヒト免疫不全ウィルス感染防御用キメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノ ウイ/レスベクター
技術分野
[0001] 本発明は、抗ヒト免疫不全ウィルス感染防御用キメラ 5型 /11型もしくは 35型アデ ノウィルスベクターに関する。更に詳細には、本発明は、非増殖型 5型アデノウィル スに、ヒト免疫不全ウィルス（HIV)のエンベロープ蛋白をコードする遺伝子が発現可 能なように組み込まれ、かつ当該 5型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする 遺伝子が 11型もしくは 35型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に 発現可能なように置換されてなるキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスべク ターおよびその医薬用途に関する。
背景技術
[0002] 高活性抗レトロウイルス療法（HAART)は、 HIV感染患者の死亡率減少にめざまし い効果を発揮している。し力しながら、 HAARTには副作用と抵抗性の発生率が高い という問題点があり、発展途上国においてはその治療薬の入手が困難であるのが現 状である。さらに、 HAARTには HIV感染の予防薬としての効果はなぐこれからの AIDS対策において、安全性かつ有効性の高いワクチンの開発は非常に重要な課題 であると言える。
HIV感染に対する防御機構において、細胞障害性 Tリンパ球（CTL)が中和抗体 以上に重要な役割を果たしているという報告が数多くなされている（非特許文献 1、 非特許文献 2および非特許文献 3)。そのため過去 10年間、細胞性免疫を増強する ことを目的とした多様なワクチンが開発されてきた。 HIVサブユニットペプチドヮクチ ン、 DNAワクチン、組換えウィルスベクターワクチン（組換えワクチ-ァウィルス Ankara株（rMVA)) (非特許文献 3および非特許文献 4)、アデノウイルス (非特許文 献 5)、狂犬病ウィルス (非特許文献 6)、フラビウィルス (非特許文献 7)、 friendマウス 白血病ウィルス (非特許文献 8)、ベネズエラ馬脳炎ウィルス (非特許文献 9)、水胞性 口炎ウィルス (非特許文献 10)、アデノ随伴ウィルス (非特許文献 11および非特許文 献 12)、細菌ベクターワクチン（bacille Calmette-Guerin) (非特許文献 13)、乳酸菌（ 非特許文献 14)などである。これらのワクチンは、単独あるいは複合で用いることによ つてウィルスに対する防御効果を示し、さらにこれらのうちいくつかはヒト以外の霊長 類でのウィルス感染実験において AIDSの進行を食い止めることが報告されている（ 非特許文献 3、非特許文献 4、非特許文献 5、非特許文献 8、非特許文献 15および 非特許文献 16)。 DNAで初回免疫を行い rMVAで追加免疫を行う複合型ワクチン は、もっとも成果をあげている方法のひとつであり、現在フェーズ I臨床試験が行わ れている。
ウィルスベクターとして期待されて!、る 5型アデノウイルス (Ad5)は rMVAよりも強 い免疫原性を持っており（非特許文献 5)、ウィルス力価が高いという利点をはじめ、 DNA配列など生物学的特徴についてもよく研究されている。し力しながら、 Ad5は肝 細胞に対する親和性が非常に高く（非特許文献 17)、オル-チン 'トランス力ルバミラ ーゼ（OTC)欠損症の治療のために Ad5ベクターを投与した患者が死亡した例も報 告されており（非特許文献 18)、臨床治療用ベクターとしては使用が制限されている アデノウイルスには 51の血清型があり、これらは 6つの亜属（Aから F)に分類され る。現在アデノウイルスベクターによる遺伝子導入系のほとんどは、 2型あるいは 5 型アデノウイルス (Ad2、 Ad5ともに Cに属する）を用いている。なぜなら、 Ad2および Ad5はもつともよく研究されており、 DNA配列まで明らかになつているためである（非 特許文献 19および非特許文献 20)。これまでの研究から、 3型アデノウイルス (Ad3) 、 11型アデノウイルス（Adll)、 35型アデノウイルス（Ad35)、 50型アデノウイルス（ Ad50) (非特許文献 21および非特許文献 22)以外のアデノウイルスの多くは (非特 許文献 7、非特許文献 9、非特許文献 13、非特許文献 15、非特許文献 22、非特許 文献 23、非特許文献 24、非特許文献 25、非特許文献 26)、 coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR)に結合することが知られている。 CARは、ヒトにおいて心 臓、脾臓、中枢 ·末梢神経系、前立腺、睾丸、肺、肝臓、腸に発現しているが、中でも 肝臓に極めて多く発現している。そのため Ad5はヒトおよび動物において肝臓に感
Figure imgf000004_0001
ヽと考えられて ヽる。 Ad5を利用したワクチンとして、 DNAワクチンによる初回免疫、 Ad5ベクターによる 追加免疫を行う複合型ワクチンは、サルを用いた SHIV感染実験においてめざまし い感染防御効果を示すことが報告されている (非特許文献 27)。しかしながら、 Ad5 は特に肝細胞に対する親和性が非常に高いために肝毒性を惹起しやすぐそのた めウィルスベクターワクチンとしての安全性が懸念されている。
非特許文献 l:Haynes, B. F. et al, Science 271:324-328,1996
非特許文献 2:Miedema, F. et al., Science 272:505-506,1996
非特許文献 3: Robinson, H. et al., Nat. Med.5:526-534,1999
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、より安全性が高ぐかつ有効性の高い HIVワクチンとして利用可 能な Ad5を用いた新たなウィルスベクターを提供することにある。更には、該ウィルス ベクターを有効成分とする医薬組成物であって、抗 HIV感染防御用、 HIVワクチン 用、複合型ワクチン用に用いる医薬組成物を提供することにある。また、該ウィルスべ クタ一を用いた HIV感染防御もしくは HIV用ワクチン化方法を提供することにある。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、より安全性が高ぐかつ有効性の高い HIVワクチンの開発を目指し て鋭意研究を進めた。そこで、 HIV遺伝子を発現し、 Ad35ファイバーを持つ Ad5キ メラベクターを作製した。このキメラベクターの誘導する抗原特異的免疫反応を
BALB/cマウスを用いて試験したところ、キメラベクターの筋注投与により、同力価の 組換えワクチ-ァウィルス (Ankara株）ベクターや増殖型組換えワクチ-ァウィルス ( WR株)ベクターに比べて、非常に強い HIV特異的な細胞性免疫反応が惹起される ことが明らかになった。さらに、 DNAワクチンによる初回免疫、このキメラベクターによ る追加免疫は、追加免疫後 7週間目において、 HIV遺伝子を発現するヮクチニァゥ ィルスの感染を完全に防いだ。この知見は、 DNAワクチンおよびこのキメラベクター を用いた複合型ワクチン力 AIDSの蔓延を抑制する画期的なワクチンになりうること を示唆して!/ヽる。本発明は力かる知見に基づ 、て完成されたものである。
[0007] 従って、本発明は、非増殖型 5型アデノウイルスに、ヒト免疫不全ウィルスのェンべ ロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子が発 現可能なように組み込まれており、かつ当該 5型アデノウイルスのファイバーをコード する遺伝子が、 11型もしくは 35型アデノウイルスのファイバー蛋白もしくはそれと同 様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子に発現可能なように置換されてい るキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターに関する。
更に、本発明は、上記キメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターを有 効効成分とする医薬組成物に関する。この医薬組成物は、抗ヒト免疫不全ウィルス感染 防御に、更には抗ヒト免疫不全ウィルス用ワクチンに用いることができる。また、抗ヒト 免疫不全ウィルス遺伝子が発現可能なように組み込まれた非増殖型ウィルスベクタ 一または非ウィルスベクターとともに用いる複合型ワクチンとして利用できる。また、抗 HIV剤とともに用！/、ることちできる。
更に、本発明は、上記のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターお よび HIVのエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコー ドする遺伝子が発現可能なように組み込まれた非増殖型ウィルスベクターまたは非ゥ ィルスベクターを投与すること力もなる、 HIV感染防御もしくは HIV用ワクチン化方 法に関する。
更に、本発明は、上記のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターお よび抗 HIV剤を投与することからなる、 HIV感染防御もしくは HIV用ワクチン化方 法に関する。
発明の効果
本発明で提供されるキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、強 Vヽ抗原特異的細胞性免疫反応を惹起することができる。これは現在抗ヒト免疫不全ゥ ィルス (HIV)ワクチンとして最有力視されている MVAベクター以上に強い免疫反応 である。さらに、マウスモデルにおいて、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型ァ デノウィルスべクタ一と DNAワクチンを組み合わせた複合型ワクチン力 ウィルス感 染に対する長期的な防御反応を誘導することもできる。従って、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、 AIDSの蔓延を抑制する画期的な HIVワクチンの開発の可能性を示唆している。また、本発明のキメラ 5型 /11型もしく は 35型アデノウイルスベクターは、高活性抗レトロウイルス療法（HAART)に用いら れている抗 HIV剤とともに用いることにより、 HIV感染の治療および予防効果を強力 に発揮することもできる。更には、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイ ルスベクターは、 5型アデノウイルスのファイバー遺伝子が 11型もしくは 35型アデノ ウィルスのファイバー遺伝子に置換されているため、肝臓に対する毒性が軽減され、 かつ榭状細胞への親和性が向上したものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、非増殖型 5型 アデノウイルスに、 HIVのエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその 変異体をコードする遺伝子が発現可能なように組み込まれ、かつ当該 5型アデノウ ィルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子が 11型もしくは 35型アデノウイルスの ファイバー蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子に 発現可能なように置換されたものである。
本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターを構築するために 用いる非増殖型 5型アデノウイルスとしては、初期遺伝子 E1あるいは初期遺伝子 E1および E3が除去された 5型アデノウイルスが好ましい。 HIVのエンベロープ蛋 白（env)としては、 HIV 1型、 HIV 2型などのいずれのタイプの HIVのエンベロープ 蛋白であってもよい。また、 HIV 1型については、種々のクレード（亜型）が知られて おり、クレード A型、クレード B型、クレード C型、クレード D型、グレード E型など のいずれのタイプの HIVのエンベロープ蛋白であってもよい。エンベロープ蛋白を コードする遺伝子およびそのアミノ酸配列は周知であり、 Gao, F., et al, J. Virol. 70(3), 1651-1667 (1996); Ratner, L.， et al., Nature 313 (6000), 277-284 (1985); Jounai, N. et al" J. Gene Med., 5, 609—617 (2003); Kim, F.M., et al., J. Virol.
69(3), 1755-1761 (1995); Rodenburg, CM., et al" AIDS Res. Hum. Retroviruses 17(2), 161-168 (2001); Gao, F" et al" J. Virol. 72(7), 5680-5698 (1998); Gao, F. et al., J. Virology 70(10), 7013-7029 (1996)などに記載されており、また NCBIのジー ンバンクから遺伝子情報 No. U51190、 K03455、 U39362、 AF286224, U88822, U51188として入手可能である。本発明では、エンベロープ蛋白をコードする遺伝子 に限られず、エンベロープ蛋白と同様の免疫原性を有するその変異体をコードする 遺伝子であってもよい。このような変異体としては、エンベロープ蛋白のアミノ酸配列 において 1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および/または付加されたアミ ノ酸配列からなる蛋白であってエンベロープ蛋白と同様の免疫原性を有する蛋白が 挙げられる。また、エンベロープ蛋白をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でノヽ イブリダィズし、エンベロープ蛋白と同様の免疫原性を有する蛋白をコードする遺伝 子でもよい。ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズする遺伝子としては、例えば、 6 X SSPE、 2 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 0. lmg/mlサケ精巣 DNAを含む溶液中 で 65°C、 12時間反応させる、という条件下でサザンハイブリダィゼーシヨンを行うこと により、ハイブリダィズする遺伝子などが挙げられる。本発明では、クレード B型 HIV またはクレード C型 HIVのエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するそ の変異体をコードする遺伝子が好まし 、。
また、 HIVのエンベロープ蛋白もしくはその変異体をコードする遺伝子とともに、 HIVの gag遺伝子もしくはその変異遺伝子が組み込まれたキメラ 5型 /11型もしく は 35型アデノウイルスベクターであってもよい。 gag遺伝子は、 HIVのコアタンパク 質をコードする遺伝子であり、その遺伝子配列およびそれによつてコードされるァミノ 酸配列は公知であり、 Gao, F" et al" J. Virol. 70(3), 1651-1667 (1996); Ratner, L.， et al" Nature 313 (6000), 277—284 (1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609-617 (2003); Kim, F.M., et al" J. Virol. 69(3), 1755-1761 (1995); Rodenburg, CM., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 17(2), 161—168 (2001); Gao, F" et al" J.
Virol. 72(7), 5680-5698 (1998); Gao, F. et al., J. Virology 70(10), 7013-7029 (1996)などに記載されており、また NCBIのジーンバンク力も遺伝子情報 No.
U51190、 K03455、 U39362、 AF286224, U88822, U51188として入手可能である。 gag 遺伝子の変異遺伝子であってもよい。ここで変異遺伝子とは、 gag遺伝子がコードす る蛋白質と同様の機能を有する蛋白をコードする遺伝子であり、上記したェンベロー プ蛋白の変異体の場合と同様に、 gag遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列に おいて 1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および/または付加されたァミノ 酸配列からなる蛋白であって gag遺伝子がコードする蛋白質と同様の機能を有する 蛋白をコードする遺伝子、あるいは gag遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、 gag遺伝子がコードする蛋白質と同様の機能を有する蛋白をコードする遺伝 子が挙げられる。 [0010] エンベロープ蛋白またはこれらの変異体をコードする遺伝子、あるいは gag遺伝子 またはその変異遺伝子は、周知の遺伝子情報に基づいて PCR法等を利用する周 知の方法により得ることができる。これらの方法は、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者なら ば容易に行うことができる。また、上記した変異体をコードする遺伝子あるいはストリン ジェントな条件でハイブリダィズする遺伝子は、例えば部位特異的突然変異誘発法、 通常のハイブリダィゼーシヨン法などにより容易に得ることができ、具体的には上記 Molecular Cloning等の基本書を参考にして行うことができる。
本発明では、 HIVのエンベロープ蛋白もしくはその変異体をコードする遺伝子と共 に HIVの調節遺伝子である rev遺伝子（Gao, F" et al" J. Virol. 70(3), 1651-1667 (1996); Ratner, L.， et al., Nature 313 (6000), 277—284 (1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609—617 (2003); Kim, F.M., et al., J. Virol. 69(3), 1755-1761 (1995);
Rodenburg, CM., et al" AIDS Res. Hum. Retroviruses 17(2), 161—168 (2001); Gao, F" et al" J. Virol. 72(7), 5680—5698 (1998); Gao, F. et al., J. Virology 70(10),
7013-7029 (1996); NCBIジーンバンクの遺伝子情報 No. U51190、 K03455、 U39362、 AF286224, U88822, U51188)を用いてもよい。
これらの HIVのエンベロープ蛋白もしくはその変異体をコードする遺伝子、更には gag遺伝子またはその変異遺伝子を、必要に応じて rev遺伝子と共に、発現可能な ように非増殖型 5型アデノウイルスに組み込むには、例えば、 CMVプロモーター（サ イトメガロウイノレスプロモーター）、 CAGプロモーター（CMVプロモーターとニヮトリ 13 ァクチンプロモーターのキメラプロモーター）の下流に、 gag遺伝子またはその変異 遺伝子、 rev遺伝子、エンベロープ蛋白もしくはその変異体をコードする遺伝子、次 いでポリ A遺伝子カゝらなる発現ユニットの両端に 5型アデノウイルスと同じ遺伝子を 接続し、ヒト胎児腎細胞由来の 293細胞中で相同組換えにより導入することにより行 うことができる。
[0011] 本発明で用いる 11型もしくは 35型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする 遺伝子およびそのアミノ酸配列は既に公知であり、 Mei, Y.F. et al., Virology 206 (1), 686-689, 1995; Dmitry M. et al" J. Virology, Mar. 2000, vol.74, 2567-2583; NCBI U10272; NCBI AAA66361.1; Stone, D. et al, Virology, 2003, Vol.309, 152-156な どに記載されている。ファイバー蛋白は、 shaftと knobから構成され、本発明では通 常これらから構成されるファイバー蛋白をコードする遺伝子を用いる。本発明では、フ アイバー蛋白をコードする遺伝子に限られず、ファイバー蛋白と同様の標的細胞への 接着性を有するその変異体をコードする遺伝子であってもよ 、。このような変異体とし ては、ファイバー蛋白のアミノ酸配列において 1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠 失、置換および/または付加されたアミノ酸配列力もなる蛋白であってファイバー蛋白 と同様の標的細胞への接着性を有する蛋白が挙げられる。また、ファイバー蛋白をコ ードする遺伝子とストリンジェントな条件でノヽイブリダィズし、ファイバー蛋白と同様の 標的細胞への接着性を有する蛋白をコードする遺伝子でもよい。ストリンゲントな条 件としては、例えば、上記した HIVのエンベロープ蛋白の場合と同様の条件などが 挙げられる。
ファイバー蛋白またはこれらの変異体をコードする遺伝子は、エンベロープ蛋白も しくはその変異体をコードする遺伝子の場合と同様に、上記した既に周知の方法に より容易に得ることができる。
これらの 11型もしくは 35型アデノウイルスのファイバー蛋白もしくはその変異体を コードする遺伝子を、非増殖型 5型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺 伝子と置換し、発現可能なように非増殖型 5型アデノウイルスに組み込むには、例え ば、 11型もしくは 35型アデノウイルスのファイバー蛋白もしくはその変異体をコード する遺伝子の両端に 5型アデノウイルスのファイバー以外の遺伝子を接続した DNA をヒト胎児腎細胞由来の 293細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成すること ができ、力べしてキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターを構築できる また、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、以下に 説明するように、市販されて ヽるキットを用いて容易〖こ構築することもできる。
即ち、例えば、 El、 E3欠損非増殖型 5型アデノウイルスに、 HIV IIIBの rev遺伝 子および env遺伝子が発現可能なように導入され、かつ該 5型アデノウイルスのフ アイバー遺伝子が 35型アデノウイルスのファイバー遺伝子に発現可能なように置換 された本発明のキメラ 5型 /35型アデノウイルスベクターは、 Avior Therapeutics, Inc (Seattle, WA)のキットを用いて容易に作製することができる。より詳細には、例えば、 CAGプロモーター、 HIV IIIBの rev遺伝子および env遺伝子並びにポリ A遺伝子 を有する遺伝子断片（CAG promotor-HIV IIIB rev/env- polyA)を、 Jounai, N. et al., J. Gene Med. 5:609-617,2003に記載された pCAGrev/envから 5.2k bp Sal I/Pst I 断片として単離する。 Avior Therapeutics, Inc (Seattle, WA)のキットには、 Left hand shuttle plasmidとして、 5型アデノウイルス（Ad5)の 22-342部位および Ad5
3523-5790部位を相同組換え用に有し、 E. coli ori、アンピシリン耐性遺伝子を持つ プラスミドベクター pLHSPと、 Right hand shuttle plasmidとして、 El、 E3欠損非増殖 型 5型アデノウイルスに、該 5型アデノウイルスのファイバー遺伝子が 35型アデノ ウィルスのファイバー遺伝子 (Ad35 shaftと Ad35 knob)に発現可能なように置換され たキメラシャトルプラスミドベクター pRHSP 5/35が含まれている。
[0013] まず、 Ad5 22-342部位、 Ad5 3523-5790部位、 E. coli ori、アンピシリン而性遺伝 子を持つプラスミド pLHSPに、 CAG promotor-HIV IIIB rev/env- polyAを有する 5.2k bp Sal I/Pst I断片が導入された pLHSP- HIVシャトルプラスミドを作製するため に、この 5.2kbp断片をプラスミドベクター pLHSPのマノレチクロ一-ングサイトの一 つである Eco R Iサイトに挿入する。次いで、得られた pLHSP- HIVシャトルプラスミ ドは Pac Iで切断して直鎖状にした後に、キメラシャトルプラスミドベクター pRHSP 5/35とともに、リン酸カルシウム法で HEK 293細胞にトランスフエクシヨンする。トラン スフエクシヨン後 7から 14 日間、プレート培地でプラークを培養することにより、 目的 とする本発明のキメラ 5型 /35型アデノウイルス (Ad5/F35-HIV)を得ることができる。 このような方法により、他の本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルス ベクターも同様に作製することができる。
[0014] 本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、非常に強い HIV特異的細胞性免疫反応を惹起することができる。更には、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、 5型アデノウイルスのファイバー遺伝 子が 11型もしくは 35型アデノウイルスのファイバー遺伝子に置換されているため、 肝臓に対する毒性が軽減され榭状細胞への親和性が向上したものである。 従って、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、 HIV 感染防御用の医薬として、また HIV用ワクチンとして極めて有効である。また、 HIV のエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードする遺伝 子が発現可能なように組み込まれた通常の非増殖型ウィルスベクターまたは非ウイ ルスベクターと共に用いることによって、一段とその強い HIV特異的細胞性免疫反 応を惹起することができるため、これらの通常の非増殖型ウィルスベクターまたは非ゥ ィルスべクタ一と共に用いる複合型の HIV用ワクチンとして極めて有効である。
これらの非増殖型ウィルスベクターとしては、例えば、 2型もしくは 5型アデノウィル スの初期遺伝子 E1を HIVのエンベロープ蛋白を発現する遺伝子ユニットで置換し た糸且換えアデノウイルス、あるいはヮクチ-ァゥイスに HIVのエンベロープ蛋白を発 現する遺伝子ユニットを導入した非増殖型組換えワクチ-ァウィルスなどが挙げられ る。非ウィルスベクターとしては、哺乳動物細胞用に通常用いられる pCAGGS (Gene 108: 193-200, 1991))、 pBK- CMV、 pcDNA3.1、 pZeoSV (インビトロゲン社、ストラタジ ーン社)などの発現用ベクターに、 HIVのエンベロープ蛋白を発現する遺伝子ュニッ トを導入した非ウィルスベクターなどが挙げられる。
また、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、高活性 抗レトロウイルス療法（HAART)に用いられている抗 HIV剤とともに用いることもでき る。抗 HIV剤としては、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。 逆転写酵素阻害剤は、 HIVの RNA遺伝子がヘルパー T細胞にある正常な DNA に逆転写する酵素の働きを阻害する薬剤であり、アジドチミヂン (AZT)、ジダノシン（ ddl)、ラブミジン (3TC)、ネビラピン (NVP)などが例示される。プロテアーゼ阻害剤は 、 HIVウィルスが転写された DNAから作られるタンパク質を新たに HIVウィルスに 組み立てようとするときに働く酵素であるプロテアーゼを阻害するものであり、インジ ナビル（IDV)、サキナビル (SQV)、リトナビル (RTV)、ネルフィナビル（NFV)などが例 示される。
本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターをヒトへ投与する 方法としては、以下に記載する方法が挙げられる。
即ち、例えば、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターを 適当な溶剤、例えば、 PBS等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等に溶解した後、必要 に応じてフィルタ一等で濾過滅菌し、次 、で無菌的な容器に充填して注射剤を調製 して、ヒトへ注射することにより投与される。注射剤には必要に応じて慣用の担体等を 加えてもよい。また、凍結乾燥して製剤化することもできる。本発明のキメラ 5型 /11 型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内等に投与 することもでき、また経鼻、経口投与することができる。
本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターの投与量は、投与 する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、通常成人 1人当たり 109— 1013 ウィルス粒子数の範囲、好ましくは 1011— 1012ウィルス粒子数の範囲である。
本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターを、上記したように 、通常の非増殖型ウィルスベクターまたは非ウィルスベクター、あるいは抗 HIV剤と ともに投与する場合にも、上記と同様の投与方法、投与量で投与することができ、ま た、非増殖型ウィルスベクターまたは非ウィルスベクター、あるいは抗 HIV剤は、通 常採用されている投与方法、投与量で投与することができる。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施 例によって何ら限定されるものではない。
実施例 1
(1)本発明のキメラ 5 ¾ί/35型アデノウイルスベクターの構築
El、 Ε3欠損非増殖型 5型アデノウイルスに、クレード Β型の HIV株である HIV ΙΙΙΒの rev遺伝子および env遺伝子が発現可能なように導入され、かつ該 5型ァ デノウィルスのファイバー遺伝子が 35型アデノウイルスのファイバー遺伝子に発現 可能なように置換された本発明のキメラ 5型 /35型アデノウイルスベクターを、以下 に記載するように、 Avior Therapeutics, Inc (Seattle, WA)のキットを用いて作製した。 CAGプロモーター、 HIV IIIBの rev遺伝子および env遺伝子並びにポリ A遺伝 子を有する遺伝子断片（CAG promotor-HIV IIIB rev/env- polyA)は、 Jounai,N. et al.， J. Gene Med. 5:609-617,2003に記載された pCAG rev/envから 5.2k bp Sal I/Pst I断片として単離することにより得た。
Avior Therapeutics, Inc (Seattle, WA)力ら購入したキットには、 Left hand shuttle plasmidとして、 Ad5 22-342部位、 Ad5 3523-5790部位、 E. coli ori、アンピシリン而ォ 性遺伝子を持つプラスミドベクター pLHSPと、 Right hand shuttle plasmidとして、 El 、 E3欠損非増殖型 5型アデノウイルスに、該 5型アデノウイルスのファイバー遺伝 子が 35型アデノウイルスのファイバー遺伝子（Ad35 shaftと Ad35 knob)に発現可 能なように置換されたキメラシャトルプラスミドベクター pRHSP 5/35が含まれている。
[0017] まず、 Ad5 22-342部位、 Ad5 3523-5790部位、 E. coli ori、アンピシリン而性遺伝 子を持つプラスミド pLHSPに、 CAG promotor-HIV IIIB rev/env- polyAを有する 5.2k bp Sal I/Pst I断片が導入された pLHSP- HIVシャトルプラスミドを作製するため に、この 5.2kbp断片をプラスミドベクター pLHSPのマノレチクロ一-ングサイトの一 つである Eco R Iサイトに挿入した。次いで、得られた pLHSP-HIVシャトルプラスミド は Pac Iで直鎖状にした後に、キメラプシャトルラスミドベクター pRHSP 5/35とともに 、リン酸カルシウム法で HEK 293細胞にトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨン 後 7から 14 日間、プレート培地でプラークを培養した。
目的とする本発明のキメラ 5型 /35型アデノウイルス（Ad5/F35-HIV)は HEK 293 細胞内で増殖させ、 CsCl精製法で 2回精製して得た。
[0018] (2)その他の組椽ぇベクター
以後の実験に用 、た組換えベクターは以下に示すようにして入手した。 HIV envを発現する非増殖型ヮクチ-ァウィルス（Ankara strain,
MVA-HIV)(Amara, R. R. et al, Science 292:69-74,2001; Amara, R. R. et al, J. Viol. 76:7625-7631,2002; Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526- 534,1999)は、 Dr. Moss (Laboratory of Viral Diseases, National Institutes of Health, MD)力ら提供され た。 HIV envを発現する増殖型ヮクチ-ァウィルス（WR strain, vPE16)は、 AIDS Reagent Program, National Institutes of Health, MD (Cat. No. 362)力も購入しァこ。こ れらの組換えワクチ-ァウィルスは、それぞれ初代培養チキンべ口細胞と CV1細胞 で増殖させた。
[0019] El、 E3欠損非増殖型 5型アデノウイルスに、ガラクトシダーゼ Z(LacZ)をコードする 遺伝子が発現可能なように導入され、かつ該 5型アデノウイルスのファイバー遺伝子 が 35型アデノウイルスのファイバー遺伝子に発現可能なように置換されたキメラ 5 型 /35型アデノウイルスベクター（Ad5/F35-LacZ)とガラクトシダーゼ Z (LacZ)を発現 する El、 E3欠損非増殖型 5型アデノウイルス (Ad5_LacZ)についてはすでに報告 されている（Mizuguchi, H. et al , Gene 285:69-77,2002) 0
組換えウィルスの力価はスぺクトロフォトメーターで測定し、 1 OD =1012
260
particles=1010 plaque forming unit (PFU)として算出した。 HIV IIIB revおよび env遺 伝子を持つ DNAワクチン（pCAG rev/env)についてはすでに報告されている（ Jounai, N. J. Gene Med. , 5:609—617, 2003)。
[0020] (3)組換えウィルスの発現
1)方法
組換えウィルスの発現を確認するために、 MVA-HIV、 vPE16 (HIV env発現自己増 殖型ヮクチ-ァウィルス WR株）、 Ad5/F35- HIVを同量の 2 x SDS緩衝液 (125 mM Tris- HC1、 pH 6.8、 4% SDS、 20%グリセロール、 0.01%ブロモフエノールブルー、 10% j8 -メルカプトエタノル)に溶解した。 10分間煮沸した後、この溶液を 4-12%勾配ポリ アクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後、 Hybond ECLニトロセルロース膜（ Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire , England)に ^"し、マウス饥 HIV gpl20モノクローナノレ 体 (hybridoma 902, AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health, MD)で gpl60を検出した。その後、 affinity-purified horseradish peroxidase (HRPリフべノレ抗マウス Ig (ICN
Pharmaceuticals, Inc, OH)で処¾し、 ECL Western Blotting Detection system (Amersham Pharmacia Biotech)を用 ヽて X線フイノレムに感光した。
[0021] 2)結果
MVA-HIV, vPE16、 Ad5/F35-HIVの発現を in vitroで確認した。その結果を図 1 に示した。図 1から分かるように、ウィルスを含む lysatesでは gpl60が検出されたが 、 293細胞 lysatesでは検出されず、ウィルスベクターの感染によって HIV遺伝子が 発現して!/ヽることが確認された。
実施例 2
[0022] 組椽ぇウィルスの評価
( 1)方法 1)実験動物と免疫方法
8週齢のメス BALB/cマウスは Japan SLC. Inc., Shizuoka, Japanから購入し、 12 時間ごとの昼夜サイクルが保たれている動物センターで飼育した。免疫方法は、図 2 に示したとおりである。複合型ワクチンは、 0週目、 1週目、 2週目に i.m.で PBSに 溶解した 100 μ g pCAG rev/envあるいは pCAG empty DNA (pCAG rev/envから rev/envを除いたプラスミド）を投与、 3週目に 101。 particles Ad5/F35- LacZを i.m. 投与、 Ad5/F35-HIVを i.m.あるいは i.d.で投与した。ウィルスベクターのみの投与 群は、 PBSに溶解した 101。 particles Ad5/F35- LacZあるいは Ad5/F35- HIVを i.m. 、 i.p.、 s.c.あるいは i.d.で投与した。
[0023] 2)テトラマーアツセィ
テトラマーアツセィは最終免疫から 1週間後に行った。 PE結合 H-2Dd/pl8テトラ マ ~~ (RGPGRAFVTI)は AIDb Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health, MDから購入した。テトラマーアツセィの方法は、 Xin, K.-Q. et al, Hum. Gene Ther. 13: 1571-1581 ,2002に示されている方法を用いた。単離したリ ンパ球は PBSに溶解した 4%マウス血清で 4°C 30分間ブロッキングし、その後、 0.5 μ g/106 cells抗マウス CD8- FITC抗体（Ly- 2, PharMingen)を用いて 4°C 30分間染 色した。 staining buffer (3% FCS, 0.1% NaN in PBS)で 2回洗浄した後、テトラマー溶
3
液とともに 37°Cで 15分間インキュベートし、その後フローサイトメーター（Becton Dickinson)で分析を行った。
[0024] 3)細胞質内サイト力イン染色 (ICCS)アツセィ
IFN y -産生 CD8+ T細胞の検出は、 the manufacturer's instructions
(Cytofix/CytoPerm Plus kit, PharMingen, San Diego, CA)に示されている方法で行つ た。マウスの脾臓からリンパ球を単離し、それを HIV V3ペプチド（
NNTRKRIQRGPGRAFVTIGKIGN) 10 μ g/mlとともに 37°Cで 24時間インキュベー トした。インキュベーション終了 2時間前に GolgiPlug 1 μ g/mlを加えた。インキュべ ーシヨン終了後、細胞は staining buffer (3% FCS, 0.1% NaN in PBS)で洗浄し、 4%マ
3
ウス血清でブロッキングした後、 phycoerythrin (PE)ラベル抗マウス CD8抗体（Ly-2, PharMingen)で染色した。染色後、細胞を Cytofix/Cytoperm solution 250 1に溶解し て 4°C 20分間静置した。 Perm/Wash solutionで洗浄した後、 FITCラベル抗マウス IFN-抗体（PharMingen)を用いて 4°C 30分間染色し、フローサイトメーターで分析し た。
[0025] 4)組換えワクチ-ァウィルスの感染実験
ウィルス感染実験は、 Belyakov, I. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 1709-1714,1998および Xin, K.-Q. et al., Hum. Gene Ther. 13:1571-1581,2002 に示されている方法で行った。感染には HIV-1 IIIB env遺伝子を発現する組換えヮ クチ-ァウィルス vPE16 (AIDS Reagent Program, NIH, MD; Cat. No. 362)を用いた 。まず、本発明のキメラアデノウイルスベクター Ad5/F35-HIV接種から 2または 7 週間後のマウスに、 108 PFUの VPE16を腹腔内投与で感染させた。感染後 6 日目 にマウス力も卵巣を摘出し、その卵巣細胞を超音波によってよくほぐした後、 CV1細 胞のプレートにおける 10倍希釈ごとの VPE16のウィルス力価を調べた。感染した細 胞はクリスタルバイオレットで染色し、おのおのの濃度におけるプラーク数を計測した
[0026] 5)データ解析
値はすべて平均士標準誤差 (S.E.)で示した。データは一元配置分散分析によって 統計処理し、有意水準 5%で検定を行った。
[0027] (2)結果
1)アデノウイルスベクターの肝臓および腎臓に対する細胞毒性
マウスに 1011 particles (免疫時の 10倍の濃度)の Ad5- LacZと Ad5/F35- LacZを 、 i.v.あるいは i.p.により投与した。投与後 6 日目に、 Kitayama Rabesu Corp., Nagano, Japanに依頼し、これらの肝臓および腎臓に対する毒性試験を行った。図 3 の結果から見て取れるように、 Ad5-LacZ投与群は Ad5/F35-LacZ投与群に比べて i.v.と i.p.でそれぞれ 10倍、 2倍高い GOT、 GPTを示した。腎臓に対する毒性は 、 Ad5-LacZ投与群、 Ad5/F35-LacZ投与群において大きな差はなかった。
[0028] 2)免疫反応のタイムコース
0 日目に Ad5/F35— HIV (1010particles/mouse)を i.m.、 i.d.、 i.p.あるいは s.c.でマ ウスに投与し、ネガティブコントロールとして Ad5/F35- LacZ (1010 particles/mouse)を i.m.投与した。免疫したマウスにおける HIV特異的免疫反応は、テトラマーおよび 細胞質内サイト力イン染色 (ICCS)アツセィで検出した。図 4に示すように、免疫反応 の強さは、全ての投与方法において 14 日目に最大になりそれ以降は徐々に減少し た。図 4における大きさ（i.m. > i.d. > i.p. > s.c.)は、 HIV特異的な細胞性免疫反応の 強さを反映しており、 ICCSアツセィにおいても同様の結果が得られた（図 5)。ノ ック グラウンド (Ad5/F35-LacZ投与群）値は、テトラマーアツセィでは 0.15%以下、 ICCS アツセィでは 0.13%以下であった。したがって以降の免疫には i.m.、 i.d.投与法を用 、ることにした。
[0029] 3) pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV免疫による長期性の細胞性免疫の惹起
HIV特異的な細胞性免疫を検出するために 2種類のアツセィ法 (テトラマー染色、 細胞質内サイト力イン染色 (ICCS) )を行った。最終免疫後 2週間目において、 i.d.あ るいは i.m.による Ad5/F35-HIV投与群は、 DNAワクチン（pCAGrev/env)投与群 の 6倍以上の IFN-産生 HIV特異的 CD8+ T細胞を誘導した（図 6)。また、 Ad5/F35- HIVは、 HIVワクチンの有望な候補である MVA- HIV、 vPE16よりも約 2 倍強い細胞性免疫を惹起し、さらに、 pCAGrev/envと Ad5/F35-HIVによる複合型 ワクチンは、 Ad5/F35-HIVのみ投与した場合と比較して 3倍以上強い免疫応答を 誘導した。これらの結果は ICCSアツセィでも同様に観察された（図 7)。また、 pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV免疫を行ったマウスにさらに追加免疫を行っても、 HIV 特異的な細胞性免疫応答はほとんど増カロしな力つたことから (i.d.と i.p.投与、それ ぞれ 18%、 19%から 20%、 21%に増カロ）（図 8)、このワクチンはほぼ最高値に近い抗原 特異的免疫反応を惹起させることが示唆された。
[0030] Ad5/F35-HIV投与によって誘導された免疫応答が実際に生体防御に寄与するか 確認するために、最終免疫後 2週間目のマウスに、 HIV env遺伝子を発現するワク チ-ァウィルス VPE16を腹腔内感染させた。その結果、図 9に示すように、
Ad5/F35-HIV投与群、 pCAGrev/env/Ad5/F35- HIV投与群ともに、ウィルスの感染 を完全に防御し、このワクチンが生体防御に寄与しうることが明らかになった。
次に、このワクチンが長期的な免疫応答を生み出すことができるかどうかにつ 、て 調べた。その結果、最終免疫後 7週間目においても、 pCAGrev/env/Ad5/F35-HIV ワクチン接種した群において高いレベルの HIV特異的な細胞性免疫応答が確認さ れた (i.d.と i.m.免疫でそれぞれ 8%と 9%) (図 10)。また、最終免疫後 7週間目に vPE16の感染実験を行ったが、 pCAGrev/env/Ad5/F35-HIVワクチンの投与によつ てウィルス感染は完全に防御され (図 11)、このワクチンが長期的な免疫応答を誘導 できることが明らかになった。
また、図 12に示すように、本発明の Ad5/F35- HIVは、 MVA- HIVの 1000倍もの ウィルス力価を有する。
実施例 3
Π )クレー C HTVの env遣伝早 gag遣伝早 含むキメラ 5型/ 35型アデノウ ィルスべクタ一の構築
El、 E3欠損非増殖型 5型アデノウイルスに、クレード C型 HIV (96ZM651.8株）の env遺伝子 (gpl20、 2kbp)と gag遺伝子 (1.5kbp)が発現可能なように導入され、かつ 該 5型アデノウイルスのファイバーが 35型アデノウイルスのファイバー遺伝子を発現 可能なように置換された本発明のキメラ 5型 /35型アデノウイルスを以下に記載するよ うに、遺伝子相同組換え法により作成した。
クレード C型 HIV (96ZM651.8株）の全長の env gpl20遺伝子 (2kbp、 C/gpl20)およ び gag遺伝子 (1.5kbp、 C/gag) (GeneBank No. AF286224)は、組換えワクシニアウイ ルス vT331株（Gao F. et al.， J. Virol, 1998, Vol. 72, 5680- 5690)で増幅した。 C/gpl20および C/gagの DNA断片は、以下のプライマーを用いて PCR法により作 成した。
し/ gpl20- 5ゾフィマ1 ~~ aagaattcctcgagaaaatgagagtgagggagatact
し/ gpl20- 3ゾフィマ1 ~~ aatctagatttttctctctccaccactctcc
し/ gag- 5プフ マ1 ~~ aagtcgacaaaatgggtgcgagagcgtcaatat
し/ gag- プフ マ1 ~~ aatctagattgagacaaggggtcgctgccaaa
得られた C/gpl20および C/gagの DNA断片のそれぞれを IgG F遺伝子（
c
Barouch, D.H. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4192-4197 (2000))にライゲー トし、 C/gpl20-Igおよび C/gag- Igを作成した。 C/gpl20- Igおよび C/gag- Igは、そ れぞれ pIRESプラスミド（Cloneteck社製）の Xholおよび Sailの位置でクローユング し、 C/gpl20- Ig- IRES- C/gag- Igを得た。次に C/gpl20- Ig- IRES- C/gag- Ig断片を、 pCAGGSプラスミド（Jounai, N. et al" J. Gene Med., 5, 609-617 (2003))の Xholの 位置にサブクローユングした。 CAG promoter- C/gp 120- Ig- IRES- C/gag- Ig-polyA 断片を Avior Therapeutics, Incから購入した LHSPベクターのマルチクロー-ング サイトの EcoRIサイトに挿入し、 pLHSP- HIVクレード Cシャトルプラスミドを作成した。 pLHSP— HIVクレード Cシャトルプラスミドは Ad5/35の pRHSPシャトルベクターととも に、リポフエクシヨン試薬（リポフエクトァミン 2000)を用いて HEK293細胞にトランスフエ タトした。トランスフエクシヨン後 7から 10日間、プレート培地で培養し、プラークを得た 。プラーク液を HEK293細胞に感染させ、拡大培養後、 CsCl精製法で 2回精製してク レード C型 HIVの挿入された Ad5/35- C型 HIV/env/gagベクターを得た。
(2) IFN- / ELISDotアツセィによる評価
マウス IFN— γ用の ELISポットアツセィキット（Cat. 3321— 2A— 2, MabTech.Nacka, Sweden)を用いて、最終免疫 1週間後に、製作者の指針に沿って IFN- γ 産生細胞 を定量した。
即ち、マルチスクリーン- IPプレート（Millipore, Bedford, MA)を 70%エタノールおよ び PBSで洗浄した。プレートを、 PBS中の 10 μ g/ml抗マウス IFN- γモノクローナル 抗体 (Αη18)で 4°Cー晚コート処理した。次いで、プレートを洗浄し、 RPMI-1640およ び 10% FCSで室温で 2時間ブロックした。脾臓もしくは腸リンパ節から単離したリン パ球（1-10 X 105)を各ゥエルに加えた。リンパ球を、 10 g/ml HIVクレード C V3ぺ プチド (NNTRQSIRIGPGQTFYATGDIIGD)および HIVクレード C gagペプチド（ DIKQGPKESFRDYVDRFFKTLR)で 37°Cで 24時間刺激促進した。非刺激促進細 胞を含むゥエルをコントロールゥエルとした。インキュベーション後に、プレートを洗浄 し、次いで、 1 μ g/mlピオチン化抗マウス IFN- γ抗体（R4- 6A2)、ストレプトアビジン アルカリホスファターゼ次いで 50 μ 1/well BCIP/NBTホスファタ一ゼ基質（
Kirkegaara and Perry Laboratories, Gaitherburg, MDJでインキュへ ~~トし 7こ。スポット 数を、コンピュータービデオイメージ分析器（KS Elispot, Carl Zeiss, Co. , Ltd., Tokyo, Japan)で自動計測した。すべての実験は 3回行った。
Ad5/35- LacZまたは Ad5/35-C型 HIV/env/gagの 101。粒子を BALB/cマウスに 筋肉内注射した。免疫後 2週間で、 HIV特異的 IFN- γ分泌脾臓細胞を検出した。 得られた結果を、図 13に示した。
[0033] (3) ^
図 13に示した結果力 分力るように、非免役マウスおよび Ad5/35-LacZ投与マウ スでは、 50 SPC/million以下の IFN- γ分泌脾臓細胞しカゝ観察されなカゝつた。他方、 envペプチドまたは gagペプチドで刺激し Ad5/35-C型 HIV/env/gag投与マウスで は、有意に高い HIV特異的 IFN- γ分泌脾臓細胞を検出した。
産業上の利用可能性
[0034] 本発明により、 HIV env遺伝子を発現するキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウ ィルスべクタ一が、強い抗原特異的細胞性免疫反応を惹起することを明らかにされた 。これは現在 HIVワクチンとして最有力視されている MVAベクター以上に強い免 疫反応である。さら〖こ、マウスモデルにおいて、キメラ Ad5/F35-HIVベクターと DNA ワクチンを組み合わせた複合型ワクチンが、ウィルス感染に対する長期的な防御反 応が誘導することも判明した。これらの結果は、 AIDSの蔓延を抑制する画期的な HIVワクチンの開発の可能性を示唆していると言える。
抗原特異的細胞性免疫および中和抗体は、 HIVの感染防御にぉ 、て大変重要で ある。 DNAワクチンと本発明の HIV env遺伝子を発現するキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターを組み合わせて用いることにより、特異的な抗体に対す るほぼ最高値の細胞性免疫が誘導されることが分力つた。さらに、この複合型ヮクチ ンは長期的な防御性免疫応答を誘導できることも明らかになった。
また、本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、高活性 抗レトロウイルス療法（HAART)に用いられている抗 HIV剤とともに用いることもでき る本発明のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、従来の Ad5 ベクターを臨床治療に用いる際の最大の障壁となっている肝臓への副作用が少なく 、ヒト榭状細胞に高い親和性を持っており、このことからもヒトでの臨床試験における めざましい成果が期待できる。
細胞性および体液性免疫を誘導できる安全で有効性の高! ヽ、かつ安価なワクチン は HIVの拡大を抑制するために大変重要である。そこで、本発明のキメラ 5型 /11 型もしくは 35型アデノウイルスベクターは、 AIDSの蔓延を抑制する大きな可能性を 秘めた次世代のワクチンとなりうるものである。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、組換えウィルス MVA-HIV, vPE16、 Ad5/F35-HIVを電気泳動後、 -ト ロセルロース膜に転写し、マウス抗 HIV gpl20モノクローナル抗体を用いて X線フィ ルムに感光させ、 HIV gp 160蛋白質を確認した図を示す。
[図 2]図 2は、各種組換えウィルスをマウスで免疫したときの免疫スケジュールを示す
[図 3]図 3は、 Ad5ベクター（Ad5-LacZ)および Ad5/F35ベクター（Ad5/F35- LacZ) の細胞毒性を調べた結果を示す。免疫時の 10倍の量である 1011 particlesの組換 え Ad5ベクター（Ad5-LacZ)または Ad5/F35ベクター（Ad5/F35- LacZ)を BALB/c マウスの静脈または腹腔内に投与した (n = 3)時の、肝臓および腎臓に対する細胞 毒性は、マウスの血清を用いて投与後 6日目に測定した。
[図 4]図 4は、組換えウィルス Ad5/F35-HIVをマウスに免疫した時の HIV特異的免 疫反応を経時的にテトラマーアツセィにより測定した結果を示す。 0 日目に 101Q particlesの Ad5/F35-HIVベクターを様々な経路で投与した。図中の時間における HIV特異的 CD8+細胞の割合を検出した。値は 4または 5匹のマウスの平均値で ある。図中、 i.m.は筋肉、 i.d.は皮内、 i.p.は腹腔内、 S.C.は皮下投与を示し、
Ad5/F35- LacZは LacZタンパクを発現する Ad5/F35- LacZベクターであり、ネガテ イブコントロールとして用 ヽた。
[図 5]図 5は、組換えウィルス Ad5/F35-HIVをマウスに免疫した時の HIV特異的免 疫反応を経時的に ICCSアツセィにより測定した結果を示す。 0 日目に 101Q particles の Ad5/F35-HIVベクターを様々な経路で投与した。図中の時間における HIV特 異的 CD8+細胞の割合を検出した。値は 4または 5匹のマウスの平均値である。図 中、 i.m.は筋肉、 i.d.は皮内、 i.p.は腹腔内、 S.C.は皮下投与を示し、
Ad5/F35- LacZは LacZタンパクを発現する Ad5/F35- LacZベクターであり、ネガテ イブコントロールとして用 ヽた。
[図 6]本発明の Ad5/F35-HIVで最終免疫した後の免疫応答を示す。 DNAワクチン（ pCAGrev/env)、ウィルスベクター（Ad5/F35— HIV) (lOiOparticles/mouse)を、どちらか あるいは両方を i.mあるいは i.d.でマウスに投与した。最終免疫後 2週間目に HIV 特異的免疫反応をテトラマーアツセィによる検出した。スポットはそれぞれのマウスの ウィルス力価を示しており、横棒は 10匹のマウスの平均値を示す。
[図 7]本発明の Ad5/F35-HIVで最終免疫した後の免疫応答を示す。 DNAワクチン（ pCAGrev/env)、ウィルスベクター（Ad5/F35— HIV) (lOiOparticles/mouse)を、どちらか あるいは両方を i.mあるいは i.d.でマウスに投与した。最終免疫後 2週間目に HIV 特異的免疫反応を ICCSにより検出した。スポットはそれぞれのマウスのウィルス力 価を示しており、横棒は 10匹のマウスの平均値を示す。
[図 8]本発明の Ad5/F35-HIVで最終免疫、それに続くウィルス感染後の免疫応答を 示す。 DNAワクチン（pCAGrev/env)、ウィルスベクター（Ad5/F35-HIV) (1010
particles/mouse)を、どちらかあるいは両方を i.mあるいは i.d.でマウスに投与した。 図 2に示したスケジュールで免疫し、最終免疫の 2週間後（週 5)に 108 pfo/mouse の vPE16ヮクチ-ァウィルスを i.p.で投与し、その 1週間後（週 6)免疫応答を示す 。値は 6-10匹のマウスの平均値で示した。スポットはそれぞれのマウスのウィルス力 価を示しており、横棒は 10匹のマウスの平均値を示す。
[図 9]本発明の Ad5/F35-HIVで最終免疫、それに続くウィルス感染後の免疫応答。
DNAワクチン (pCAGrev/env)、ウィルスベクター（Ad5/F35— HIV) (1010
particles/mouse)を、どちらかあるいは両方を i.mあるいは i.d.でマウスに投与した。 図 2に示したスケジュールの週 5に 108pfo/mouse vPE16ヮクチ-ァウィルスを i.p. で投与した週 6の感染させたマウスの卵巣におけるヮクチ-ァウィルス力価を示す。 スポットはそれぞれのマウスのウィルス力価を示しており、横棒は 10匹のマウスの平 均値を示す。
[図 10]図 10は、最終免疫後 7週間目の免疫応答と感染実験の結果を示す。 DNAヮ クチン（pCAGrev/env)、ウィルスベクター（Ad5/F35— HIV) (101()particles/mouse)を、 どちらかあるいは両方を i.mあるいは i.d.でマウスに投与して免疫を行った。最終免 疫後 7週間目にテトラマーアツセィによって検出した HIV-特異的免疫反応の測定 結果を示す。スポットはそれぞれのマウスのウィルス力価を示しており、横棒は 10匹 のマウスの平均値を示す。
[図 11]図 11は、最終免疫後 7週間目の免疫応答と感染実験の結果を示す。 DNAワク チン（pCAGrev/env)、ウィルスベクター（Ad5/F35— HIV) (1010particles/mouse)を、ど ちらかあるいは両方を i.mあるいは i.d.でマウスに投与して免疫を行った。最終免疫 後 7週間目の感染させたマウス卵巣におけるヮクチ-ァウィルス力価を示す。スポッ トはそれぞれのマウスのウィルス力価を示しており、横棒は 10匹のマウスの平均値を 示す。
[図 12]図 12は、ウィルスベクター（Ad5/F35-HIV、 MVA- HIV、 rPE16)の力価を示し、 20個の 15cmディッシュから得られたウィルスの力価を示した。
[図 13]図 13は、非免疫マウス、 Ad5/35- LacZ投与マウスおよび本発明の Ad5/35- C 型 HIV/env/gag投与マウスにおける、 HIV特異的 IFN- γ分泌脾臓細胞の検出し た結果を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 非増殖型 5型アデノウイルスに、ヒト免疫不全ウィルス (HIV)のエンベロープ蛋白も しくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子が発現可能なように 組み込まれており、かつ当該 5型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝 子が、 11型もしくは 35型アデノウイルスのファイバー蛋白もしくはそれと同様の機能 を有するその変異体をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているキメラ 5 型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクター。
[2] クレード B型 HIVまたはクレード C型 HIVのエンベロープ蛋白もしくはそれと同 様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子が発現可能なように組み込まれた 請求項 1に記載のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクター。
[3] 更に、 HIVのエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコ ードする遺伝子と共に、 HIVの gag遺伝子もしくはその変異遺伝子が発現可能なよ うに組み込まれた請求項 1または 2に記載のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウ イノレスベクター。
[4] 5型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子力 35型アデノウイルスの ファイバー蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードする遺伝子に 発現可能なように置換されている請求項 1から 3のいずれかに記載のキメラ 5型 /11 型もしくは 35型アデノウイルスベクター。
[5] 非増殖型 5型アデノウイルス力 E1欠損非増殖型 5型アデノウイルスまたは E1 および E3欠損非増殖型 5型アデノウイルスである請求項 1から 4のいずれかに記載 のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルスベクター。
[6] 請求項 1から 5のいずれかに記載のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルス ベクターを有効成分とする医薬組成物。
[7] 抗 HIV感染防御用である請求項 6に記載の医薬組成物。
[8] HIVワクチンである請求項 6または 7に記載の医薬組成物。
[9] HIVのエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変異体をコードす る遺伝子が発現可能なように組み込まれた非増殖型ウィルスベクターまたは非ウィル スベクターとともに用いるための請求項 6から 8のいずれかに記載の医薬組成物。
[10] 抗 HIV剤とともに用いるための請求項 6から 8のいずれかに記載の医薬組成物。
[11] 抗 HIV剤が、逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤から選ばれる少なくと も一種である請求項 10に記載の医薬組成物。
[12] 請求項 1から 5のいずれかに記載のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルス ベクターおよび HIVのエンベロープ蛋白もしくはそれと同様の機能を有するその変 異体をコードする遺伝子が発現可能なように組み込まれた非増殖型ウィルスベクタ 一または非ウィルスベクターを投与することからなる、 HIV感染防御もしくは HIV用 ワクチン化方法。
[13] 請求項 1から 5のいずれかに記載のキメラ 5型 /11型もしくは 35型アデノウイルス ベクターおよび抗 HIV剤を投与すること力もなる、 HIV感染防御もしくは HIV用ヮ クチン化方法。
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