JP2003501041A - 細胞特異的な感染およびゲノム組み込みのためのキメラファイバータンパク質を発現する組換えアデノウイルスベクター - Google Patents

細胞特異的な感染およびゲノム組み込みのためのキメラファイバータンパク質を発現する組換えアデノウイルスベクター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規キメラＡｄベクターを提供する。このベクターは、ＣＡＲおよび／またはανβ3/5に非依存的な様式で、多様な細胞型または組織への安定かつ効率よい遺伝子移入のために導入遺伝子または導入遺伝子の一部を有する。また、そのようなベクターを生成するための方法、およびそれを、特定の細胞型または組織へと遺伝子治療を標的化するための使用が提供される。特定の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、前記左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列および前記右側のアデノウイルス逆方向末端反復配列、ならびに前記パッケージング配列が、同一のアデノウイルス血清型由来である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、少なくとも部分的に、米国国立衛生研究所（助成金番号Ｒ０１ Ｃ
Ａ ８０１９２−０１およびＲ２１ ＤＫ ５５５９０−０１）からの資金をも
ってなされた。従って、米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、遺伝子治療の分野に関し、特に、遺伝子治療のために選択的に細胞
に感染する新規のアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、および任意のアデノウイル
ス血清型の再標的化を可能にするファイバータンパク質の改変を含むＡｄベクタ
ーに関する。
【０００３】 （発明の背景） 遺伝子移入ベクターは、標的細胞の効率的な形質導入、その宿主ゲノムとの安
定な会合、および関連する毒性または免疫学的な副作用のない適切な標的細胞に
おける適切な導入遺伝子発現を必要とする。現在利用可能なウイルスベクター系
（組換えレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含む）は
、多くの細胞型への効率よい遺伝子移入には適切ではない。レトロウイルスは、
安定な組み込みのために細胞分裂を必要とする。組換えアデノウイルスベクター
は、遺伝子治療のために重要な多くの細胞型に感染し得ない。これらの細胞には
、造血幹細胞、単球、Ｔリンパ球およびＢリンパ球が含まれる。さらに、組換え
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、低頻度で組み込まれる。
【０００４】 第一世代のアデノウイルスは、それを遺伝子移入のために魅力的なビヒクルと
させる多数の特性を有する（Ｈｉｔｔ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３７−２０５）。これら
には、非分裂性細胞を含む多量の種々の細胞型へインビボで、８ｋｂまでの長い
発現カセットの高度に効率的な遺伝子移入と共同して、高力価で精製されたウイ
ルスを生成する能力が含まれる。第一世代アデノウイルスの限定は、毒性および
ウイルスの排除を排除する、発現されたウイルスタンパク質に対する免疫応答の
発達を含む。形質導入された細胞内のアデノウイルスＤＮＡのエピソーム状態は
、第一世代Ａｄベクターの別の限定である。宿主ゲノムへのアデノウイルスＤＮ
Ａの安定な組み込みは、特定の亜型の野生型形態についてのみ報告されており、
そしてインビトロおよびインビボでの遺伝子移入のために広汎に使用されている
Ｅ１／Ｅ３欠損Ａｄ５（アデノウイルス血清型５）ベクタでは検出可能な様式で
生じないようである［Ｈｉｔｔ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３７−２０５］。
【０００５】 組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は、宿主にコンカテマーとしてランダムに
低頻度で（およそ２０，０００ゲノムのうち約１ゲノム）組み込まれる（Ｒｕｔ
ｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．；Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．１９９７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，７１，８４２９−８４３６）。２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）およ
びまだ知られていない宿主細胞因子は、ベクター組み込みのために唯一の要件で
あるようである（Ｘｉａｏ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，７１，９４１−９４８；Ｂａｌａｇｕｅ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１，３２９９−３３０６；Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｃ．１９９７
，Ｊ．Ｉ ｉｒｏｌｏｇｙ，７１，９２３１−９２４７）。大きなＡＡＶ Ｒｅｐタンパク
質の存在下で、ＡＡＶは、ヒト第１９染色体のＡＡＶＳＩと呼ばれる特定の部位
へと優先的に組み込まれる（Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．，１９９６，Ｆｉｅｌｄｓ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄ）Ｖｏｌ．２，
Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２１７
３−２２２０）。このＡＡＶキャプシドは、３つの皮膜タンパク質（ＶＰ１ ３）によって形成され、これは、細胞表面の特定のヘパリン硫酸と相互作用し、
そしておそらく特定のレセプターと相互作用する。しかし、多くの細胞型（造血
幹細胞を含む）は、これらの構造を欠如し、その結果、ＡＡＶ２に基づくｒＡＡ
Ｖベクターは、これらの細胞に感染も形質導入もし得ない（Ｍａｌｉｋ Ｐ．ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１，１７７６−１７８３；Ｑ
ｕｉｎｇ，Ｋ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，１
５９３−１５９９）。ｒＡＡＶベクターの他の欠点としては、すべてのウイルス
遺伝子を欠如するｒＡＡＶベクターに収容され得る限定された挿入の大きさ（４
．５−５ｋｂ）、およびｒＡＡＶ調製物の低い形質導入力価が挙げられる。 アデノウイルス感染は、そのファイバータンパク質を介して、Ａｄ５の細胞表
面を付着させることによって開始する（概説について、以下を参照のこと：Ｓｈ
ｅｎｋ，Ｔ．１９９６ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｆｉｅ
ｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄ）Ｖｏｌ．２，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒ
ａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２１１１−２１４８）。三量体フ
ァイバー分子の遠位のＣ末端ドメインは、ノブ（ｋｎｏｂ）において終結し、こ
のノブは、コクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）として最近同定さ
れた特定の細胞レセプターに結合する（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１３２０−１３２３）。結合後、ウイルス接着に
は依存しない事象において、ペントンベースにおいてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（
ＲＧＤ）モチーフは、α３およびβ５の細胞インテグリンと相互作用する。この
相互作用は、細胞インターナリゼーションを開始し、それによって、そのビリオ
ンは、エンドソーム内への局在化を達成する。このエンドソーム膜は、ペントン
ベースによって媒介されるプロセスにおいて溶解し、そのエンドソームの内容物
を細胞質へと放出する。これらのプロセスの間、このビリオンは徐々に皮膜が解
かれ、そしてそのアデノウイルスＤＮＡが核へと輸送され、そこで複製が行われ
る。末端タンパク質（これは、ウイルスゲノムに共有結合される）およびコアタ
ンパク質Ｖ（これは、そのコアの表面上に局在化される）は、核局在化シグナル
（ＮＬＳ）を有する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ，Ｂ．１９９５，Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒ−ｏｆ Ａｃｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖ
ｏｌ．２，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ，Ｐ．（ｅｄ．），Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１−３１）。これらのＮＬＳは、
核へのアデノウイルスゲノムの指向において重要な役割を果たし、そしておそら
く、アデノウイルスが非分裂細胞に形質導入されることを可能にする構造要素を
表す。二本鎖の直鎖状のＤＮＡが核に到達するとき、それは、その末端タンパク
質を介して核マトリクスに結合する。
【０００６】 Ａｄ５またはＡｄ２のベクターに感染し得る細胞型は、ＣＡＲおよび特定のイ
ンテグリンの存在によって拘束されていることから、Ａｄベクターの親和性を広
げるようにする試みがなされた。アデノウイルス被覆タンパク質の遺伝子改変を
して新規細胞表面レセプターを標的化することが、ファイバー（ｆｉｂｅｒ）（
Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，
１８４４ １８５２，Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ，７０，６８３９−６８４６，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅ
ｔ ａｌ．１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１，４７８２−４７９０），ペ
ントン塩基（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，７０，６８３１−６８３８；Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ
．１９９５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，６９，７５０−７５６）、およびヘキ
ソンタンパク質（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．７５，１３３−１３９）について報告されている。最も有望な改
変は、そのファイバータンパク質の機能的改変、またはより詳細にはその部分と
してファイバーノブ（これは、一次接着を媒介する）の機能的改変であるようで
ある。２つのグループがＡｄ５テイル／シャフトおよびＡｄ３のノブドメインか
らなるファイバーの生成を報告した（Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．１９
９６ 前出，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．１９９７，前出）。
最近、Ｃ末端ポリリジン、ガストリン放出ペプチド、ソマトスタチン、Ｅ−セレ
クチン結合タンパク質またはオリゴヒスチジンを含む組換えアデノウイルスが、
Ａｄ５のネイティブの親和性変化させるために産生された。Ｋｒａｓｎｉｋｈら
は、（Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．１９９８ 前出）は、異種ペプチド
リガンドがファイバーノブドメインのＨ１ループへと、そのファイバーの生物学
的機能に影響を与えることなく挿入され得ることを見出した。他のＡｄ血清型で
の研究に基づけば、そのファイバーシャフトの長さが重要な要因であり、細胞表
面インテグリンとの相互作用の効率およびインターナリゼーションプロセスを決
定するようである。これまでは、特定の細胞型についてＡｄ５の首尾よい再標的
化を実証するデータは報告されていない。
【０００７】 従って、種々の細胞型および組織へと効率よく標的化され得る、そして宿主へ
の最小限の抗原性を伴う宿主ゲノムに安定に組み込まれたままである、改良され
たアデノウイルスベクターに対する必要性が現在存在する。本発明は、ベクター
を特異的に標的化するためにそのキャプシド上に改変されたファイバータンパク
質を発現する、新規キメラアデノウイルス（Ａｄ）Ａｄ ＡＡＶベクターを開示
する。これらのベクターの作製方法、使用および利点が記載される。さらに、フ
ァイバータンパク質のノブおよびシャフトのドメインについて記載される偏向は
、細胞特異的感染のために、任意のアデノウイルス血清型を再標的化する新規ア
プローチを提供する。
【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、新規キメラＡｄベクターを提供する。このベクターは、ＣＡＲおよ
び／またはανβ3/5に非依存的な様式で、多様な細胞型または組織への安定か
つ効率よい遺伝子移入のために導入遺伝子または導入遺伝子の一部を有する。ま
た、そのようなベクターを生成するための方法、およびそれを、特定の細胞型ま
たは組織へと遺伝子治療を標的化するための使用が提供される。
【０００９】 本発明の組換えアデノウイルス（実施例１）は、「弱活力」（ｇｕｔｌｅｓｓ
）アデノウイルスベクターの容易な産生および送達を可能にする。ここで、導入
遺伝子を異なる細胞型の宿主ゲノムへの安定な組み込みというさらなる利点が伴
う。記載されるアデノウイルスベクターは、複製およびビリオンキャプシド化に
必要な５’および３’のシスエレメントを除き、すべてのアデノウイルス配列を
欠く。５’側（右側）および３’側（左側）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む
本発明のアデノ随伴ウイルス配列には、導入遺伝子カセットが隣接し、その結果
、このアデノ随伴ウイルス配列は、ウイルス複製の間の相同組換えおよび宿主ゲ
ノムへのウイルス組み込みを指示する。１つの実施形態において、ＡＡＶ−ＩＴ
Ｒ隣接配列が使用される。このベクターはまた、選択された調節エレメントおよ
びポリアデニル化終止シグナルに作動可能に連結された（これには次いで、上記
隣接配列が隣接する）、選択された導入遺伝子を含む。選択された導入遺伝子は
、同じ調節エレメントの下または互いに同じ方向もしくは反対の方向で別個の調
節エレメントの下で連結され得る。選択された導入遺伝子は、任意の遺伝子（単
数または複数）であり、これは、治療、レポーターまたは選択の目的のために宿
主細胞または組織において発現される。このベクターは、宿主細胞への高力価導
入遺伝子送達および宿主ゲノムへの導入遺伝子の安定な組み込みの能力によって
特徴づけられる。また、組み込み頻度および部位特異的組み込みを、組換えハイ
ブリッドベクターへのＡＡＶｒｅｐタンパク質の取り込みによって改良する方法
も提供される。
【００１０】 本発明はまた、キメラファイバータンパク質（実施例ＩＩ）を提供する。この
タンパク質は、天然に存在するファイバータンパク質を含み、ここでは、配列の
一部または複数の部分は、感染の細胞もしくは組織特異性を変更するように改変
されている。偏向されたファイバータンパク質配列は、他のまたは同じアデノウ
イルス血清型あるいはランダムに選択されたペプチドからの、ファイバータンパ
ク質ドメイン（ノブドメイン、シャフトドメインおよびテイルドメイン）を、含
み得る。キメラファイバータンパク質は、その全体が、天然に存在しない配列か
ら構成され得る。本発明はさらに、キメラファイバータンパク質をコードする核
酸配列に関する。これらの核酸配列は、天然に存在する配列、天然に存在する配
列と天然に存在しない配列との混合物、またはその全体が天然に存在しない配列
であってもよい。
【００１１】 本明細書において記載される異種ファイバータンパク質配列は、キャプシドを
含む、任意のアデノウイルスベースのベクターへと挿入され得、これにより、そ
のウイルスは、所定の細胞または組織に特異的に感染し得ることが付与される。
そのような異種ファイバー配列を有するアデノウイルスベクターを用いて、所望
の細胞への遺伝子移入を指示し得る。宿主ゲノムへの導入遺伝子カセットの安定
な組み込みのために、本発明において記載されるキメラＡｄ−ＡＡＶベクターが
使用するベクターとして好ましい。本発明はまた、そのファイバーノブにおいて
ランダムペプチドを提示するアデノウイルスのライブラリーを含む。これは、イ
ンビトロおよびインビボで、特定の細胞型に対する親和性を有するアデノウイル
ス改変体についてスクリーニングするためのリガンドとして用いられ得る。
【００１２】 本明細書において記載されるキメラＡｄベクターとしては、キャプシド上に発
現される、改変されたファイバータンパク質を含むＡｄ−ＡＡＶゲノムが挙げら
れる。これらのキメラベクターは、広汎な種々の細胞に感染するように設計され
、特に、一般に使用されるレトロウイルスＡＡＶおよびアデノウイルスベクター
によってはほとんど形質導入され得ない細胞に感染するように設計される。これ
らの細胞としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：造血幹細胞、肺
上皮細胞、樹状細胞、リンパ芽様細胞、および内皮細胞。造血幹細胞（例えば、
ＣＤ３４＋細胞）は、本明細書において記載されるベクターを用いて、鎌状赤血
球貧血およびサラセミアの遺伝子治療のために標的化され得る。遺伝子を内皮細
胞へと形質導入し得るキメラＡｄ−ＡＡＶベクターは、冠状動脈手術の後に、ア
テローム性動脈硬化または狭窄のような血管疾患のための遺伝子治療において使
用され得る。
【００１３】 （発明の詳細な説明） 本願において使用されるすべての科学的および技術的用語は、別に特定されな
い限り、当該分野で通常使用される意味を有する。本明細書中で用いられる場合
、以下の用語または句は、特定された意味を有する。
【００１４】 用語ベクターには、プラスミド、コスミド、ファージミド、および人工染色体
が含まれるがこれらに限定されない。ベクター配列は、ウイルスの「基本ベクタ
ー」配列として指定され得る。基本ベクター配列は、その基本ベクターが由来し
た特定のウイルスの型および血清型に依存する。基本ベクター配列は、非ベクタ
ー配列または導入遺伝子配列（例えば、異種配列）と連結され得る。
【００１５】 導入遺伝子配列は、原核生物または真核生物の宿主細胞との適合性を付与する
配列を含み得、ここで適合性とは、宿主細胞中でのベクター複製に関する。従っ
て、導入遺伝子配列は、宿主中でのベクターの複製を指示するレプリコン配列で
あり得、これは、自己複製ベクターをもたらす。あるいは、導入遺伝子配列は、
宿主細胞の複製機構に依存するベクター複製を可能にし得る。
【００１６】 基本ベクター配列は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド、ｒＲＮＡ、または
ｔＲＮＡ）をコードする導入遺伝子配列に作動可能に連結され得る。例えば、導
入遺伝子は、ポリペプチド（例えば、ウイルスキャプシドタンパク質またはウイ
ルスファイバータンパク質）をコードし得る。この導入遺伝子は、基本ベクター
配列と同じかまたは異なる血清型に由来し得る。
【００１７】 導入遺伝子の別の例には、選択マーカー（例えば、薬物耐性または比色マーカ
ー）として使用され得る遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、例えば、光学顕微鏡、免疫化学的アッセイ、または酵素的
アッセイによって容易に検出され得る遺伝子産物をコードし得る。好ましいレポ
ーター遺伝子は、レポーター遺伝子を発現する細胞を破壊しない非破壊的方法に
よって検出され得る遺伝子産物をコードする。
【００１８】 治療遺伝子は、導入遺伝子の別の例である。治療遺伝子は、宿主細胞において
発現された場合に、宿主細胞または宿主細胞を含む組織もしくは器官もしくは生
物に、治療的利点または所望の機能を提供する。治療的利点は、宿主ゲノムにお
いて遺伝子の機能を改変すること、または治療的なタンパク質、ポリペプチド、
またはＲＮＡによって提供されるさらなる機能から生じ得る。
【００１９】 基本ベクター配列は、調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー
、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列）である導入遺伝子配列に連結され得
る。調節エレメントは、直接的な転写または翻訳によって、遺伝子産物をコード
する導入遺伝子配列の直接的発現を指示し得る。調節エレメントは、導入遺伝子
配列の発現の量またはタイミングを調節し得る。調節エレメントは、特定の宿主
細胞または組織における導入遺伝子の発現（例えば、宿主特異的発現または組織
特異的発現）を指示し得る。
【００２０】 基本ベクター配列は、ベクターが別のヌクレオチド配列に組み込まれることを
可能にする導入遺伝子配列に連結され得る。この組み込み配列は、ベクター全体
またはベクターの一部の組み込みを指示し得る。この組み込み配列は、基本ベク
ター配列に関するかもしれないし、関しないかもしれない。例えば、組み込み配
列および基本ベクター配列は、同じウイルス血清型であり得るか、または異なる
ウイルス血清型であり得る。この組み込み配列は、アデノウイルス（Ａｄ）、ア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはＨＩＶ由来の逆方向反復配列（ＩＴＲ）で
あり得る。
【００２１】 基本ベクター配列は、宿主細胞のゲノムへのベクターの相同組換えを指示する
導入遺伝子配列に連結され得る。このような導入遺伝子配列は、基本ベクター配
列と同じウイルス血清型であってもよいし、そうでなくてもよい。
【００２２】 ベクターは、宿主細胞または宿主細胞のゲノムに異種配列を運搬するために使
用され得る。
【００２３】 ベクターは、外因性ＤＮＡ配列の簡便な挿入を可能にする複数のエンドヌクレ
アーゼ制限部位を含み得る。
【００２４】 用語「ハイブリッドベクター」とは、本発明において使用される場合、２つの
異なるウイルス（例えば、アデノウイルスおよびＡＡＶ）から組み合わせた核酸
配列を含むベクターをいう。
【００２５】 「キメラベクター」とは、基本ベクターに対して天然ではない核酸配列（すな
わち、天然には存在しない配列、または異種配列を含むそれらの天然のバックグ
ラウンドにはない配列）を含むベクターをいう。本発明において用いられるキメ
ラベクターはまた、ハイブリッドベクターであり得る。キメラベクターの例は、
改変されたファイバータンパク質をそのキャプシド上に発現するＡｄ，ＡＡＶで
ある。
【００２６】 用語「形質導入」または「感染」とは、ウイルス粒子中のウイルスＤＮＡを宿
主細胞中に導入する方法をいう。本明細書中のウイルスＤＮＡは、組換えウイル
スの形態にあり、これは、遺伝子が機能的タンパク質として発現され得るような
方法で、目的のＤＮＡのセグメントをウイルスゲノムに連結することによって生
成される。
【００２７】 用語「トランスフェクション」とは、宿主細胞にＤＮＡフラグメントを導入す
る方法をいう。
【００２８】 用語「異種」とは、本明細書中で使用される場合、基本アデノウイルスベクタ
ーまたは形質導入された細胞に対して内因性でない状況で、核酸配列またはペプ
チド配列が配置されることをいう。例えば、ペプチド配列は、１つのタンパク質
から別のタンパク質に移入され得、生じるタンパク質は、本明細書中では、異種
タンパク質と呼ばれる。キメラファイバータンパク質（例えば、血清型５テイル
ドメインおよび血清型３５シャフトおよびノブドメイン）は、Ａｄ５ベクターに
対して「異種」であるとみなされる。この用語はまた、アデノウイルスの１つの
種または血清型からアデノウイルスの異なる種に導入された核酸（例えば、コー
ド配列）を含む。
【００２９】 用語「調節エレメント」とは、プロモーター、エンハンサー、転写終結シグナ
ル、ポリアデニル化配列、および他の発現制御配列を含むことが意図される。本
発明において言及される調節エレメントには、特定の宿主細胞のみにおいて核酸
配列の発現を指示するエレメント（例えば、組織特異的調節配列）が含まれるが
、これに限定されない。
【００３０】 用語「作動可能に連結された」は、調節エレメント配列がポリヌクレオチド配
列の転写または翻訳またはその両方を制御および調節するような方法で、ポリヌ
クレオチド配列（例えば、コード配列または遺伝子）がその制御エレメントに連
結されていることを示す。調節エレメントの方向は異なり得る（例えば、右側Ｉ
ＴＲに対して逆方向）。この用語はまた、適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ
）を、発現されるポリヌクレオチド配列の前に有すること、および正しいリーデ
ィングフレームを維持して、発現制御配列の制御下でポリヌクレオチド配列の発
現および所望のポリペプチドまたはタンパク質の産生を可能にすることを含む。
制御配列はまた、正確な終結を保証する３’配列（例えば、ポリアデニル化停止
シグナル）を含み得る。
【００３１】 本明細書中で使用される用語「遺伝子治療」は、外因性核酸の発現によってレ
シピエント細胞に機能的改変を生じるような様式で、細胞への外因性核酸のセグ
メントを導入する方法をいう。外因性核酸は、コードされたタンパク質、ポリペ
プチド、またはＲＮＡの発現が遺伝子のエラーに起因する細胞の機能不全を修正
するか、またはより一般的には、遺伝的疾患または後天性疾患と関連する任意の
所望されない機能を相殺するという点で、代表的には治療剤である。用語「外因
性核酸」とは、処理された形質転換された細胞において通常には発現されないＤ
ＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語はまた、処理されていない形質転換
されていない細胞におけるよりもより高いか、より低いか、または他の異なるパ
ターンにある処理された形質転換された細胞において発現される、ＤＮＡ配列ま
たはＲＮＡ配列をいう。この非天然の発現もまた、異種発現と呼ばれ得る。
【００３２】 「遺伝子治療ベクター」とは、遺伝子治療のために、すなわち、外因性核酸を
レシピエントまたは宿主細胞中へと導入するために、使用されるベクターをいう
。この外因性核酸は、レシピエントまたは宿主細胞において、一過性発現されて
もよいし、または組み込まれて安定に発現されてもよい。
【００３３】 用語「プラスミド」とは、本明細書中にて使用される場合、宿主とは独立して
複製し、高コピー数を維持し、かつクローニングの道具として使用され得る、任
意の核酸分子をいう。
【００３４】 用語「ＤＮＡの平行鎖」および「ＤＮＡの逆行鎖」とは、二本鎖アデノウイル
スのＤＮＡ鎖の各々をいう。図面は、ＤＮＡの平行鎖上の特定のヌクレオチドの
位置を図示する。ＤＮＡの逆行鎖は、その二本のＤＮＡ鎖のうちのもう一方をい
い、図面に示されていない。ファイバータンパク質は、ＤＡＮの逆行鎖上にコー
ドされる。ベクター図を簡単にするために、その遺伝子は逆行鎖上に位置するけ
れども、そのファイバー配列を平行鎖上に示す。
【００３５】 用語「レポーター遺伝子」とは、例えば、視覚的アッセイ、顕微鏡アッセイ、
免疫化学的アッセイまたは酵素学的アッセイによって容易に検出され得るポリペ
プチドまたはタンパク質をコードする、任意の核酸配列をいう。好ましいレポー
ター遺伝子は、処理した形質転換細胞または組織を破壊しない非破壊的方法によ
って検出され得る、レポーター遺伝子である。
【００３６】 本明細書中で使用される用語「選択可能遺伝子」とは、細胞が所定のベクター
により形質転換された細胞であると示すためにその発現が使用される、ポリペプ
チドまたはタンパク質をコードする任意の核酸フラグメントをいう。
【００３７】 用語「治療遺伝子」とは、本明細書中において、宿主細胞において発現された
場合に、その宿主細胞またはその宿主細胞を含む器官もしくは生物に治療上の利
益または所望の機能を提供する、機能的ポリペプチド、タンパク質またはＲＮＡ
をコードするＤＮＡフラグメントをいう。この治療上の利益は、宿主中の天然の
遺伝子の機能の改変から生じてもよいし、またはその治療タンパク質、ポリペプ
チドまたはＲＮＡにより提供されるさらなる機能から生じてもよい。
【００３８】 用語「宿主組織」または「宿主細胞」とは、本明細書中で使用される場合、治
療遺伝子がその組織または細胞の機能を改変するように発現される、組織または
細胞をいう。
【００３９】 タンパク質配列において、特定のアミノ酸置換がそのタンパク質の機能に影響
することなくなされ得ることは、生物学分野において周知である。一般的には、
保存的アミノ酸置換または類似アミノ酸の置換は、タンパク質機能に影響するこ
となく許容される。類似アミノ酸は、サイズおよび／または電荷特性が類似する
アミノ酸であり得、例えば、アスパラギン酸とグルタミン酸、およびイソロイシ
ンとバリンは、両方とも類似アミノ酸の対である。アミノ酸対間の類似性は、多
数の様式で当該分野において評価されている。例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９
７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ、第５巻、補遺３、第２２章、３４５〜３５２頁（本明細書中に参
考として援用される）は、アミノ酸類似性の尺度として使用され得るアミノ酸置
換についての頻度表を提供する。Ｄａｙｈｏｆｆらの頻度表は、種々の進化的に
異なる供給源由来の同じ機能を有するタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づく
。従って、本発明の配列に対する（上記のような）アミノ酸配列における明らか
な任意の変化が、すでに意図される。
【００４０】 「実質的に類似」のポリペプチドは、上記のような配列を共有するが、ただし
、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化により異なり得る。保存的アミノ酸
置換とは、類似の側鎖を有する残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族−ヒド
ロキシル側鎖を有するアミノ酸の脂肪族を有するアミノ酸の群はセリンおよびス
レオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン酸および
グルタミン酸であり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チ
ロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン
、アルギニンおよびヒスチジンであり；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群は
システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群としては、
バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アル
ギニン、アラニン−バリン、アスパラギン−グルタミン、およびアスパラギン酸
−グルタミン酸が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明に記載
されるアミノ酸配列に対する（上記のような）「実質的に類似」の配列のポリペ
プチド置換が、すでに意図される。
【００４１】 本明細書中に記載される発明がより完全に理解され得るように、以下の説明を
示す。
【００４２】 本発明は、先行技術のベクターの制限の多くを克服する、独特の遺伝子移入ビ
ヒクルを提供する。本発明は、左側および右側のＡｄ ＩＴＲ、Ａｄパッケージ
ング配列、調節エレメントを伴う導入遺伝子カセット、およびその導入遺伝子カ
セットに隣接する一対のカセットＩＴＲ（ウイルス複製の間に予測可能なウイル
スゲノム再配置を指示し、宿主細胞ゲノムへのその導入遺伝子カセットの組み込
みを指示する）を含む第一世代アデノウイルスベクターを記載する。
【００４３】 ウイルス複製の間に生じる１つの予測可能な再配置は、弱活力（ｇｕｔｌｅｓ
ｓ）アデノウイルスベクター（本明細書中でΔＡｄとも呼ばれる）の生成であり
、このベクターは、左側および右側のＡｄ ＩＴＲ、Ａｄパッケージング配列、
カセットＩＴＲが隣接する導入遺伝子カセットを含み、そしてこの弱活力ベクタ
ーは、他の免疫原性ウイルス遺伝子すべてを欠く。
【００４４】 部位特異的組み込みの能力は、本発明の新規なＡｄベクターの重要な特徴であ
る。本発明の実施形態において、導入遺伝子カセットの組み込みは、例えば、ｒ
ｅｐ ７８タンパク質を発現するＡｄベクターとの同時感染により指示されて、
例えば、ヒト第１９染色体上のＡＡＶＳ１部位での部位特異的組み込みが達成さ
れる。
【００４５】 本発明はさらに、キャプシド上で発現されるアデノウイルスファイバータンパ
ク質を改変することによって選択された細胞へとこれらの組換えアデノウイルス
ベクターを標的化する、新規な方法を記載する。ファイバーシャフトドメインお
よびファイバーノブドメインの両方への変化は、Ａｄベクターを所望の細胞型へ
と首尾良く再標的化することを示した。さらに、ファイバーノブドメイン中のＧ
−Ｈループが、この組換えアデノウイルスベクターの結合親和性および特異性に
影響する新規な部位として同定された。このＧ−Ｈループへのペプチド配列の置
換は、この弱活力ベクターを所望の細胞型へと再標的化する。
【００４６】 ファイバータンパク質のＧ−Ｈループ内のランダムなペプチドを発現するアデ
ノウイルスディスプレイライブラリーが作製されている。この型のライブラリー
は、所望の細胞型に結合するアデノウイルスベクターについてスクリーニングす
るためのリガンドとして使用される。ファージディスプレイライブラリーに対す
るアデノウイルスディスプレイライブラリーを使用することの１つの利点は、一
旦所望の細胞へのアデノウイルスの親和性を同定すると、標的化されたアデノウ
イルスベクターは導入遺伝子カセットを受け入れる準備ができ、かつ、例えば、
遺伝子治療における使用のために、弱活力アデノウイルスベクターを作製するた
めに使用され得る。
【００４７】 下記のキメラＡｄベクターは、そのベクターが所望の細胞型に感染し得るよう
にする改変型ファイバータンパク質をアデノウイルスのキャプシド中に含む。従
って、本発明によると、弱活力キメラΔＡｄ−ＡＡＶベクターが、最も一般的に
使用される遺伝子治療ウイルスベクターに通常は抵抗性である任意の細胞または
組織中に任意の導入遺伝子を導入するために作製され得る。さらに、本発明のキ
メラΔＡｄ．ＡＡＶベクターは、アデノウイルス遺伝子を欠き、かつ導入遺伝子
カセットに隣接するＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、このＡＡＶ ＩＴＲ配列が、宿
主ゲノム中での安定な導入遺伝子組み込みを指示し、その導入遺伝子の長期発現
を可能にする。
【００４８】 本発明に記載の導入遺伝子カセットは、形質導入された細胞のインビトロ選択
もしくはインビボ選択用のレポーター遺伝子、選択可能な遺伝子、または治療遺
伝子のいずれかである、導入遺伝子を保有し得る。本発明の１つの実施形態にお
いて、このレポーター導入遺伝子は、β−ガラクトシダーゼであり得るが、これ
に限定はされない。多くのレポーター遺伝子が当該分野で一般的に使用されてお
り、その任意のものが、本発明のＡｄ．ＡＡＶベクターにおける導入遺伝子とし
て保有され得る。レポーター遺伝子の他の例は、ＧＦＰおよびアルカリホスファ
ターゼである。
【００４９】 以下は、野生型キャプシド、およびカセットＩＴＲが隣接する導入遺伝子カセ
ットを有する本発明の第一世代Ａｄベクターの実施形態；（ｂ）Ａｄベクターを
再標的化するように改変されているファイバータンパク質；および（ｃ）キメラ
ΔＡｄベクター（感染および導入遺伝子組み込みについて所望の細胞型への基本
ベクターを再標的化する、キャプシド上に発現される改変型ファイバータンパク
質を含む）の生成を可能にする両方の技術の組み合わせを記載する。
【００５０】 （Ａ．本発明のＡｄハイブリッドベクターの組み込み） ＡｄＥ１−ベクターのＥ１領域中に挿入された逆方向反復（ＩＲ）が、すべて
のウイルス遺伝子を欠く弱活力ベクターゲノムを生じる、予測可能なゲノム再配
置を媒介し得ることが、示されている。このようなＩＲ媒介性再配置の特定の実
施形態が、Ａｄｅｎｏ−ＡＡＶ（導入遺伝子カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末
端反復（ＩＴＲ）を含む、第一世代ハイブリッドアデノウイルスベクター）であ
る。このＡＡＶ ＩＴＲは、ΔＡｄ．ＩＲゲノムの形成と類似するゲノム形成を
媒介する（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒら、２０００ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ）。すべてのウイルス遺伝子を欠くΔＡｄベクターは、例えば、
ｒＡＡＶベクターに匹敵する効率で、培養細胞に安定に組み込みそして形質導入
する。本実施例は、サザンブロット分析によって、ΔＡｄベクターが宿主ゲノム
中にランダムに組み込むことを示す。
【００５１】 本発明のＡｄベクターは、左側Ａｄ ＩＴＲ、このＡｄ ＩＴＲの３’側に位
置するアデノウイルスパッケージング配列、このパッケージング配列の３’側に
位置しかつ一対のカセットＩＴＲに隣接する導入遺伝子カセット（ポリアデニル
化シグナル、導入遺伝子、および異種プロモーターを含む）を含む。複製に使用
されるアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）は、この右側
カセットＩＴＲの３’側に位置し、そして右側Ａｄ ＩＴＲが、この複製遺伝子
の３’側に位置する。本発明のベクターは、以下を処置するために特に適する：
遺伝的障害、癌、および感染性疾患（例えば、ＨＩＶ、塞栓、またはマラリア）
。治療可能な遺伝的疾患（例えば、血友病Ａおよび血友病Ｂ；嚢胞性線維症；筋
ジストロフィー、α１−抗トリプシン障害）が、本発明のベクターにより処置さ
れ得る遺伝的疾患の理想的候補である。遺伝的障害と闘うための治療遺伝子の特
定の例は、鎌状赤血球貧血を改善するためのγ−グロビンである。
【００５２】 形質導入細胞の選択を補助し、そして導入遺伝子カセットの組み込み部位を特
徴付けるために、本発明の実施形態は、細菌の複製起点および選択可能な遺伝子
を含む配列の付加を含む。この実施形態は、導入遺伝子カセットに付加されたＳ
Ｎｏｒｉ配列である。これにより、このΔＡｄがヒト細胞および細菌細胞におい
て発現されることが可能になり、従って、形質導入された細胞の選択、および形
質導入された哺乳動物細胞のゲノムにおける組み込み部位の特徴づけが可能にな
る。
【００５３】 部位特異的組み込みの能力は、本発明の新規なＡｄベクターの重要な特徴であ
る。本発明の１つの実施形態において、ΔＡｄ．ＡＡＶの組み込みは、２９３細
胞におけるｒｅｐ ７８タンパク質を発現するＡｄ ＡＡＶとの同時感染により
指示され、ヒト第１９染色体上のＡＡＶＳ１部位での部位特異的組み込みが達成
される。この型の部位特異的組み込みが２９３細胞以外の細胞において生じるた
めに、Ｅ４ ＯＲＦ６発現が必要である。ΔＡｄ．ＡＡＶ、ΔＡｄ．ｒｅｐ７８
、およびΔＡｄ．Ｅ４−ｏｒｆ６の同時感染により、ΔＡｄ．ＡＡＶ導入遺伝子
カセットの部位特異的組み込みが可能である。ΔＡｄ．ｒｅｐ ７８ゲノムおよ
びΔＡｄ．Ｅ４−ｏｒｆ６ゲノムは、形質導入後まもなく分解され、それにより
潜在的副作用が回避される。部位特異的組み込みは、ｒＡＡＶおよびΔＡｄ．Ａ
ＡＶを用いて観察されるランダムな組み込みよりも、挿入性変異誘発の危険を減
少するために好ましい。
【００５４】 染色体へのアデノウイルスベクターに含まれる導入遺伝子カセットの組み込み
は、導入遺伝子発現のサイレンシング（またはブロッキング）と関連し得る。導
入遺伝子のサイレンシングは、その導入遺伝子カセットに絶縁（ｉｎｓｕｌａｔ
ｏｒ）エレメントを付加することにより克服され得る。例えば、ニワトリグロビ
ンＬＣＲ由来のＨＳ−４絶縁エレメントが、アデノウイルスエンハンサーから異
種プロモーターを保護するように、Ａｄベクター中にて機能し得る。ＨＳ−４絶
縁またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｙｐｓｙ遺伝子もまた、導入遺伝子のサイレ
ンシングを防ぐために使用され得る。
【００５５】 本発明の別の実施形態は、その導入遺伝子カセットを、導入遺伝子の２つの部
分（各々が本発明の別の組換えアデノウイルスベクターに保有される）へと分割
することである。同じ導入遺伝子の各部分は、相同な重複領域を有する。両方の
ベクター（各々が、同じ導入遺伝子の異なるが重複する部分を保有する）での感
染の後、相同組換え事象が生じて、完全な導入遺伝子の再構成が生じ、次いでそ
れが発現される。この技術は、大きなインサート（鎌状赤血球貧血を改善するた
め（またはγ−グロビン変異を矯正（ｃｏｒｒｅｃｔ）するため）の１３ｋｂゲ
ノムｈＡＡＴ遺伝子または１２ｋｂ γ−グロビン ＬＣＲγ−グロビン発現カ
セットを含むが、これらに限定されない）を収容するハイブリッドアデノウイル
スベクターを生成するために使用される。ハイブリッドΔＡｄベクターゲノムの
形成は、２つのベクター間の組換えの後、その導入遺伝子内の相同な重複領域が
長いほどより効率がよい。
【００５６】 本発明の利点は、純粋な弱活力ハイブリッドアデノウイルスベクター（例えば
、ΔＡｄ．ＡＡＶベクターまたはΔＡｄ．ＡＡＶfxベクター）を迅速に単離する
ための方法である。第一世代ベクター（Ａｄベクター）によるΔＡｄの混入を最
小にするために、ストラテジーが実施例Ｉ Ｈに記載される。これらのアプロー
チは同じ力価のΔＡｄベクターを生じるが、全長ゲノムベクターによる混入がよ
り少ないことが理解される。この改良されたベクター単離は、インビボ適用後の
毒性副作用を回避するために非常に重要である。
【００５７】 （Ｂ．親和性改変型アデノウイルスベクター） 本発明のＡｄベクターは、それが目的の宿主細胞を標的とするように改変され
得る。５０個を越えるヒトＡｄ血清型（異なる組織選択性または親和性を有する
改変型を含む）が存在する（付表Ｉ）。異なるＡｄ血清型は異なる細胞レセプタ
ーに結合し、そして異なる侵入機構を使用することが、当該分野において認識さ
れる。ほとんどの組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型５を
基本ベクター血清型５（Ａｄ５）として使用する（Ｈｉｔｔ，Ｍ．Ｍ．ら、１９
９７、Ａｄｖ．ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０、１３７〜２０５）。Ａ
ｄ５感染は、主にＣＡＲへのそのファイバータンパク質結合により媒介され、第
２に、インテグリンへのそのペントンベースタンパク質結合により媒介される。
多くの細胞型および組織型におけるＣＡＲおよび／またはインテグリン発現の欠
失に起因して、Ａｄ５媒介性遺伝子移入は、遺伝子治療についての重要な標的で
ある多数の組織（内皮、平滑筋、皮膚、上皮、分化した気道上皮、脳組織、末梢
血細胞、または骨髄）において効率的でない。以下は、ファイバータンパク質配
列を改変することの結果として、感染性および親和性の変化を有する、本発明の
Ａｄ５ベクターを記載する。
【００５８】 異なるＡｄ血清型の感染性は、多数のヒト細胞株に限定される。感染性研究に
よって、Ａｄ５およびＡｄ３が内皮細胞またはリンパ系細胞に感染および標的化
するために特に適切であることが明らかになったが、Ａｄ９、Ａｄ１１およびＡ
ｄ３５は、ヒト骨髄細胞に効率的に感染した。従って、Ａｄ９、Ａｄ１１および
Ａｄ３５のファイバータンパク質のノブドメインは、Ａｄ５ベクターをヒト骨髄
細胞へと再標的化するための優秀な候補である。他の可能な血清型としては、Ａ
ｄ７が挙げられる。
【００５９】 本発明の改変型ファイバータンパク質において、Ａｄ５ファイバーのファイバ
ーノブドメインは、別のＡｄ血清型ファイバーノブドメインで置換されている。
本発明の１つの実施形態は、改変型Ａｄ５／３５ファイバータンパク質（Ａｄ５
のファイバーテイルドメイン、ならびにＡｄ３５のファイバーシャフトドメイン
およびノブドメインを含む、改変型ファイバータンパク質を発現する組換えＡｄ
５ベクター）である。このＡｄ５／３５キメラファイバータンパク質は、ＣＤ３
４＋細胞のサブセット（幹細胞活性を有するものを含む）に対する比較的広いス
ペクトルの感染を示す。このＡｄ５／１１キメラファイバータンパク質（Ａｄ５
のファイバーテイルドメイン、ならびにＡｄ１１のファイバーシャフトドメイン
およびノブドメインを含む、改変型ファイバータンパク質を発現する組換えＡｄ
５ベクター）は、類似の親和性を示した。
【００６０】 ノブドメイン改変に加え、本発明は、ファイバーシャフトドメインおよびファ
イバーノブドメインの両方を改変して短縮型ファイバータンパク質を作製する付
加的利点を記載する。ファイバーシャフトドメインの長さは、宿主細胞へのウイ
ルスベクター侵入に使用される宿主レセプターにおいて重要な役割を果たす。こ
れを示すために、Ａｄ５改変体、Ａｄ５／９改変体およびＡｄ５／３５改変体を
、長シャフト（２２β−シート）ファイバーおよび短シャフト（７β−シート）
ファイバーを用いて構築した。これらの分析は、Ａｄ５、Ａｄ５／９についてＣ
ＡＲを主要レセプターとして含む効率的ウイルス感染が長シャフトファイバータ
ンパク質を必要とするが、一方、Ａｄ５／３５（未だ特徴付けられていない非Ｃ
ＡＲレセプターに結合する）の細胞侵入ストラテジーがシャフトの長さに依存し
ないことを示した（図３）。ファイバーシャフトドメインの長さ（５＞１０個の
間のβ−シート）およびファイバーノブドメイン（基本ベクターと異なるＡｄ血
清型由来）の両方のおける改変が、Ａｄベクター親和性を改変する新規なモデル
である。
【００６１】 Ａｄベクターが感染し得る細胞型のレパートリーを広げるために、ノブドメイ
ン内の特定の結合領域（Ｇ−Ｈループ）が、結合親和性および特異性を改善する
ことが、本明細書中で新たに同定された。この領域内での改変は、Ａｄベクター
を所望の細胞型へ再方向付けする。例えば、本発明は、ファイバータンパク質ノ
ブドメイン内のＧ−Ｈループ配列を記載し、この配列は、そのベクターの結合親
和性および特異性を変更する同時に、Ａｄファイバーノブドメインの機能的に重
要な３次構造に影響しないで、異種ペプチドリガンド配列で置換され得る（図６
、７）。このＧ−Ｈループ領域は、ノブ表面の中心部分に曝露され、そしてノブ
のＣ末端の末梢のＨ−Ｉループよりも異種リガンドの取り込みのための戦略上良
い部位であり得る（Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．ら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７
２；１８４４〜６２）（ノブのＣ末端は、他者により使用されている置換部位）
（Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｓ．Ｉ．ら、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：６６０〜
８、Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１４：１５７０〜３）。従って、ファイバーノブドメイン内のこれらのＧ−Ｈル
ープ改変は、Ａｄベクターが所望の細胞型に感染するように再方向付けされるの
を可能にするが、それはこのＧ−Ｈループリガンド配列が所望の細胞型上の少な
くとも１つの表面タンパク質に結合する限りにおいてである。図７は、いくつか
の可能な置換を示す。実施例ＩＩ Ｊは、ビリオンが、ノブ表面上の曝露を可能
にする制限された二次構造を有する環状ペプチド（１２アミノ酸）の挿入を許容
することを示す。規定されたリガンド（ＲＧＤ）は、ＣＡＲおよびインテグリン
親和性のために除去されるＡｄ５キャプシドのＧ−ＨループおよびＨ−Ｉループ
に挿入され得る。感染性研究は、この新規な挿入部位の潜在的利点を示す。
【００６２】 （「遺伝子治療」のための本発明のベクターの使用） 肝臓は、タンパク質合成のための主要器官である。従って、遺伝子治療の重要
な目的は、遺伝子治療ベクターを肝臓に標的化することである。多くの方の変異
体タンパク質を遺伝的に矯正するために、肝細胞は、矯正された導入遺伝子を保
有する遺伝子治療ベクターに感染される必要がある。実施例ＩＩ Ｊは、ファイ
バータンパク質のノブドメイン中のＧ−Ｈループを、短シャフトファイバータン
パク質中の（マラリアＣＳ表面タンパク質の）ＲＩおよびＲＩＩ＋の両方により
置換すること（これにより、このベクターは肝細胞に対する親和性および特異性
を有するように指示される）を記載する。
【００６３】 実施例ＩＩ Ｋは、そのベクターを乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）に標
的化するペプチドを用いて、Ｇ−Ｈループ領域中でファイバーノブドメインを改
変する類似のプロトコルを適用する。本発明に記載されるベクターを再方向付け
するこれらの新規なアプローチは、より低用量の遺伝子治療ベクターが投与され
、より安全性プロフィールが高いことを可能にする。
【００６４】 実施例ＩＩ Ｌにおいて、Ｇ−Ｈループ中のランダムなペプチド配列のライブ
ラリーを提示するためにファイバーノブタンパク質を使用する、アデノウイルス
ディスプレイライブラリーを調製するためのプロトコルが記載される。改変型フ
ァイバータンパク質を有するこのアデノウイルスライブラリーは、所望の細胞型
についての親和性および特異性についてスクリーニングされる。このアデノウイ
ルスディスプレイライブラリーを、所望の細胞型への結合を可能にする標的ペプ
チドについてスクリーニングするために使用することの、ファージディスプレイ
ライブラリー系を超える２つの大きな利点が存在する。第１に、一旦、その所望
の細胞型に結合するリガンドペプチドが同定されると、それはすでに、遺伝子治
療送達のための選り抜きのベクターである。そのペプチドは、ファージディスプ
レイライブアリーベクターについての場合必要であるように、別ベクター中に操
作される必要がない。これは、所望の細胞型について標的化されたファイバータ
ンパク質を同定するために必要な工程を減らす。この方法の第２の利点は、その
アデノウイルスが、そのキャプシド上に改変型ファイバータンパク質の複数のコ
ピーを提示し得る点である。これにより、宿主細胞レセプターとのファイバータ
ンパク質の二量体化および三量体化が可能である。ファイバータンパク質の多量
体化は、宿主細胞レセプターとの三量体ファイバータンパク質の現実的インビボ
相互作用である。対照的に、ファージベクターは、その表面上に１つのファイバ
ーペプチド配列しか提示し得ず、このことは、宿主細胞表面レセプターとの相互
作用能力を有意に限定する。
【００６５】 （Ｃ．選択された親和性を有するキメラアデノウイルスベクター） 本発明のキメラベクターは、２つのベクターを組み合わせる：Ａｄ．ＩＴＲお
よびＡｄ．ｆｘ。ここでｆｘは、改変されたファイバータンパク質（ｆｉｂｅｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ）を示す。血清型５の第一世代アデノウイルスベクターは、異
種ＩＴＲに隣接する導入遺伝子カセットを保有する基本ベクター（ｂａｓｅ ｖ
ｅｃｔｏｒ）である。これらの特定の逆方向の末端反復配列（例えば、ＡＡＶ
ＩＴＲ）は、導入遺伝子カセットの宿主ゲノムへの安定な組み込みを方向付け、
そしてウイルス複製の間に生じる推定可能なゲノム再配置を制御する。このベク
ターはまた、（実施例ＩＩに記載の）改変されたファイバー遺伝子を保有する。
複製の間に、推定可能なゲノム再配置が起こり、キャプシド上に改変されたファ
イバータンパク質を発現する弱活力（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクター
（例えば、ΔＡｄ．ＡＡＶfx）の生成を生じる。この改変されたファイバータン
パク質は、弱活力ベクターを選択された細胞型に標的化することを可能にする。
標的化されたベクターは、宿主細胞に導入遺伝子を組み込み得るアデノウイルス
遺伝子が全くない弱活力アデノウイルスベクターである。この導入遺伝子カセッ
トは、レポーター遺伝子、選択可能な遺伝子または治療遺伝子を保有し得る。
【００６６】 本発明の１つの実施形態において、弱活力標的化ΔＡｄ．ＡＡＶfxは、βガラ
クトシダーゼのレポーター遺伝子を含む（ΔＡｄ．ＡＡＶfx-ＢＧ）。ハイブリ
ッドＡｄベクターで形質導入されたヒトおよび細菌細胞のインビトロ選択を容易
にするために、複製起点のための細菌の配列がハイブリッドＡｄベクターに付加
され得る。この一例は、ΔＡｄ．ＡＡＶfx−Ｓｎｏｒｉである。ΔＡｄ．ＡＡＶ fx −ＳｎｏｒｉにおいてＳＮｏｒｉ配列は、導入遺伝子カセットに付加されてい
る。この部位は、ΔＡｄ．ＡＡＶfx−Ｓｎｏｒｉに感染した細胞に対するＧ４１
８選択を可能にする。このインビトロ選択は、導入遺伝子組み込みの部位および
隣接する染色体領域を分析するためのツールを提供する。蛍光インサイチュハイ
ブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、ベクター組み込みを確認するするための別
の方法である。
【００６７】 遺伝子移入のためのΔＡｄキメラベクターの利点は、レトロウイルスベクター
の収容能力より有意に大きな、例えば、２２ｋｂまでの大きな導入遺伝子カセッ
トの効率的かつ安定な組み込みである。これは、遺伝子治療には特に興味深い。
例えば、鎌状赤血球貧血を改善するために、ΔＡｄ．ＡＡＶfx-γグロビン（標
的化し、そして組み込むγグロビン遺伝子を有する導入遺伝子カセット）は、γ
グロビン遺伝子の長期間発現のために骨髄幹細胞に挿入され得る。
【００６８】 部位特異的遺伝子組み込みを達成するために、ｒｅｐ７８タンパク質をＡＡＶ
Ｓ１部位に導入遺伝子を組み込むために使用する（実施例１Ｄに記載）。しかし
、これは、導入遺伝子発現をサイレントにし得る。組み込まれた導入遺伝子が宿
主細胞ゲノムエレメント（例えば、位置的効果または下流のエンハンサー）によ
りサイレントにされることを防止するために、ＬＣＲまたは絶縁エレメント（ｉ
ｎｓｕｌａｔｏｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）が導入遺伝子カセットに組み込まれる。
【００６９】 以下の実施例は、本発明を例示するために示され、そして本発明を用い、そし
て使用する際に当業者の補助となる。この実施例は、本発明の範囲を制限すると
は如何様にも意図されない。
【００７０】 （実施例１：新規なアデノウイルスベクターＡｄ．ＡＡＶ） （Ａ．全てのアデノウイルス遺伝子を欠いたΔＡｄ．ＡＡＶハイブリッドベク
ターの組み込み） ｒＡＡＶを用いたインビトロおよびインビボ研究により、ｒＡＡＶ組み込みに
必要な要件はＡＡＶ ＩＴＲのみであり、未だに知られていない宿主細胞因子で
あることが示される。ＡＡＶ ＩＴＲに存在する特定の配列または二次構造が宿
主染色体ＤＮＡに組み込まれやすいと考えられる。アデノウイルスベクター（高
力価、高い感染性、大きな収容能力）の利点およびＡＡＶ ＩＴＲの組み込み能
力を組合わせるために、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接したＡＡＶベクターＤＮＡを、分
泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）とカセットにし、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）レポーター遺伝子カセット（Ａｌｅｘａ
ｎｄｅｒ，Ｉ．Ｅ．ら，１９９６．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，８４１−８
５０）をＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＡＡＶ１）のＥ１領域
に組み込む（図１の上部）。
【００７１】 （方法） （ウイルスベクターの生成／特徴付け） （プラスミド） ＡＡＶ ＩＴＲおよびＳＥＡＰ／ｎｅｏ発現ユニットを含むＡＡＶ１ベクター
カセットを、プラスミドｐＡＬＳＡＰＳＮ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｅ．ら，
１９９６．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，８４１−５０）のＡｓ
ｅＩ／ＳｃａＩ消化により得る。４．４ｋｂ ＡＡＶベクターフラグメントを、
ＮｏｔＩアダプターリンカーを介してｐＸＪＣＬ１（Ｍｉｒｏｂｉｘ，Ｔｒｏｎ
ｔｏ，Ｃａｎａｄａ）にクローニングする（ｐＡｄ．ＡＡＶ１）。ＡＡＶ ＩＴ
Ｒを欠いた別のシャトルベクター（ｐＡｄ．ＡＡＶ１−Δ２ＩＴＲ）を、ｐＡＬ
ＳＡＰＳＮの３．７ｋｂ ＡｆｌＩＩ／ＢｓｍＩフラグメントをｐＸＪＣＬ１に
挿入することにより生成する。ｐＡｄ．ＡＡＶ１Δ１ＩＴＲに関しては、Ａ領域
とＡ’領域との間の左側のＡＡＶ ＩＴＲにおける自発的欠失が生じた構築物を
用いる。第２のハイブリッドベクター（Ａｄ．ＡＡＶ２）を作製するために、Ｅ
．Ｒｕｔｌｅｄｇｅにより開発されたＡＡＶＳＮｏｒｉカセットを用いる。ＡＡ
ＶベクターＤＮＡを、３．４ｋｂ ＢｓａＩ／ＳｃａＩフラグメントとしてｐＡ
ＳＮｏｒｉから得て（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，
１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：８４２９−８４３
６）、そしてｐＸＪＣＬ１のＥｃｏＲＶ部位に挿入する。ＡＡＶベクタープラス
ミドに関して一般に公知であるように、ＡＡＶ ＩＴＲは、再配置されやすい。
これらの機能的に重要な領域の欠失を最小限にするために、ハイブリッドベクタ
ーの生成に関する全ての構築物を、低コピー数プラスミド中に組み立てる。この
低コピー数プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０、ＪＣ８１１、またはＸＬ
１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）
中で増殖される。さらに、各クローニング工程または大規模プラスミド増殖の後
、両方のＡＡＶ ＩＴＲを、ＩＴＲ内部またはＩＴＲの隣接を切断する酵素を用
いた制限分析により注意深くマッピングする（ＢｓｓＨＩＩ、ＡｈｄＩ、Ｓｍａ
Ｉ、ＢｇｌＩ、ＢｓｍＩ、ＡｆｌＩＩおよびＳｃａＩ）。
【００７２】 （アデノウイルス） Ｅ１領域に組み込まれた異なる導入遺伝子カセットを有する第一世代のウイル
スを、先に記載されたように（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９６、Ｊ．ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ，７０，８７８２−８７９１）、ｐΔＥ１ａＳｐｌａ由来または
ｐＸＪＣＬ１由来のシャトルプラスミドとｐＪＭ１７（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）との
２９３細胞中での組換えにより生成する。各ウイルスについては、少なくとも２
０のプラークを拾い、増幅し、そして制限消化により分析する。２つのＡＡＶ
ＩＴＤＲを含むウイルスは、他のアデノウイルス配列と、または２９３細胞ゲノ
ムに存在するアデノウイルス配列とＩＴＲ内で再配置する傾向がある。インタク
トなＩＴＲを有するウイルスに由来するプラークのみが増幅され、ＣｓＣｌでバ
ンド形成され、そして先に記載のように力価測定される（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ら、
１９９５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２１：８１５−８１９；Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．
ら，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８９４４−８
９６０）。試験した全てのウイルス調製物は、ＲＣＡおよび細菌のエンドトキシ
ンに関して陰性であった（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：８７９８−８８０７）。ウイルスを、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＭｇＣｌ2−１０％グリセロール
中で−８０℃で保存する。
【００７３】 ΔＡｄ．ＡＡＶを生成するために、２９３細胞を、２５の多重感染度（ＭＯＩ
）でＡｄ．ＡＡＶ１に感染させ、そして感染させて４０時間後に採取する。４回
の凍結／融解サイクルにより細胞をＰＢＳ中で溶解する。溶解物を遠心分離して
細胞細片を除去し、そして１０ｍＭ ＭｇＣｌ2の存在下で５００ユニット／ｍ
ｌのＤＮａｓｅＡおよび２００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを用いて３７℃で３０
分間消化する。５ｍｌの溶解物をＣｓＣｌ段階勾配（０．５ｍｌ−１．５ｇ／ｃ
ｍ3、２．５ｍｌ−１．３５ｇ／ｃｍ3、４ｍｌ−１．２５ｇ／ｃｍ3）の上に重
層し、そして３５，０００ｒｐｍで２時間超遠心する（ローターＳＷ４１）。管
を穿刺することによりＣｓＣｌ画分を回収し、そしてウイルスＤＮＡについて分
析するか（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ ７０：８９４４−８９６０；Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．ら
、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：９３０３−１３）、または１．３２ｇ／ｃ
ｍ3 ＣｓＣｌを有する平衡勾配中で１８時間、３５，０００ｒｐｍの超遠心に
供する。欠失したウイルスΔＡｄ．ＡＡＶを含有するバンドを、全長Ａｄ．ＡＡ
Ｖゲノムを含有する他のバンド形成されたウイルス粒子から明らかに分離する（
０．５ｃｍの距離）。ΔＡｄ．ＡＡＶ１画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）−１ｍＭ ＭｇＣｌ2−１０％ グリセロールに対して透析し、そし
て−８０℃で保存する。ΔＡｄ．ＡＡＶ１調製物のゲノム力価を、先に示したプ
ロトコル（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら，１９９６，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７
０，８７８２−８７９１）に従ってｐＡＬＳＡＰＳＮの４．４ｋｂ ＡｓｅＩ／
ＳｃａＩフラグメントの種々の濃度と比較して、ウイルス粒子から精製したウイ
ルスＤＮＡの定量的サザン分析に基づいて決定する。合計で、１×１０3ゲノム
粒子のΔＡｄ．ＡＡＶ１の生成には、３時間未満の実際の作業しか必要としない
。
【００７４】 慣用的に得られた力価は、３〜８×１０12ゲノム／ｍｌの範囲である。１つの
ゲノムが１つのキャプシドにつきパッケージングされると仮定すると、ゲノム力
価は、粒子力価に等しい。Ａｄ．ＡＡＶ１を含有するレベルは、サザン分析によ
り決定された場合に０．１％未満である。これは、２９３細胞に対するプラーク
アッセイにより得られた結果と一致する（１０6の全ゲノムにつき５つのプラー
ク未満）。左側および右側のＩＴＲベクター接合部を配列決定するために使用し
たプライマーは、以下のとおりである： ５’ＧＧＣＧＴＴＡＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＡＴＣＴＧ（配列番号１）
および ５’ＣＴＣＴＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＡＣ（配列番号２）。
【００７５】 これらの研究において使用したＳＥＡＰ／ｎｅｏカセット（ＡＶ２／ＡＬＳＡ
ＰＳＮ［Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｅ．ら、１９９６、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：４８１−５０］）を含む組換えＡＡＶウイルスストッ
クをＤｕｓｔｙ Ｍｉｌｌｅｒ（ＦＨＣＲＣ，Ｓｅａｔｌｌｅ）から得た。この
ストックは夾雑する複製コンピテントＡＡＶ（５０粒子／ｍｌ未満）および野生
型アデノウイルス（１００粒子／ｍｌ未満）を含まない。このウイルスストック
のゲノム力価をＲｕｓｓｅｌｌら（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．ら、１９９４ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８９１５−８９１９）により
記載された定量的サザンブロットにより得た。
【００７６】 （電子顕微鏡） 透過型電子顕微鏡での研究におけるウイルス粒子の試験のために、以前に記載
されたように（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ７０：８９４４−８９６０）、ＣｓＣｌ精製ビリオンをグルタル
アルデヒドで固定し、そして酢酸ウラニルを用いて染色する。
【００７７】 （結果） ２９３細胞におけるこれらのハイブリッドベクターの複製の間に、５．５ｋｂ
ゲノム（ΔＡｄ．ＡＡＶ１）を効率的に生成し、そしてアデノウイルス（Ａｄ５
）キャプシドにパッケージングする。ΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムは、左側のアデノ
ウイルスＩＴＲおよびパッケージングシグナル、続いてＡＡＶ−ベクターカセッ
ト、ならびに２つのアデノウイルスパッケージングシグナルおよびＩＴＲを逆配
向で含む（図１、下部）。ハイブリッドベクターは、全てのウイルス遺伝子を欠
き、従って、毒性効果および細胞免疫応答の誘発が排除される。小さなハイブリ
ッドベクターゲノムΔＡｄ．ＡＡＶ１の自発的生成は、２つのインタクトなＡＡ
Ｖ ＩＴＲの存在を必要とし、そして部分的に欠失したＩＴＲに対しても、発現
カセットに隣接するオリゴ−ｄＣおよびオリゴ−ｄＧストレッチに対しても生じ
ない。
【００７８】 （異なる導入遺伝子を含むハイブリッドベクター） インサイチュで検出され得る導入遺伝子を含むハイブリッドベクターを構築す
るために、Ａｄ．ＡＡＶ１中のＳＥＡＰ／ｎｅｏ発現ユニットをＥ．ｃｏｌｉ
β−ガラクトシダーゼ遺伝子により置換する。このハイブリッドベクターをΔＡ
ｄ．ＡＡＶ１と名付ける。対応するプラスミド構築物の生成の間に、ＡＡＶ Ｉ
ＴＲ配列は、再配置され、そしてそれらの機能的特性が破壊される傾向にある。
この問題は、全ての組換えタンパク質が欠失した細菌株（例えば、ＪＣ８１１）
で増殖させたクローニングベクターとして低コピー数のプラスミドを用いること
により回避され得る。さらに、各クローニング工程後に両方のＡＡＶ ＩＴＲが
インタクトであることを、特徴的なエンドヌクレアーゼ消化について試験し得る
。最近、別のハイブリッドベクターΔＡｄ．ＡＡＶ１Ｎｏｒｉを生成した。これ
は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターならびにヒト細胞およ
び細菌細胞での発現のためのトランスポゾン５（Ｔｎ５）プロモーター両方の制
御下のｎｅｏ遺伝子、ならびにｐｒ１５Ａ細菌複製起点（リーディング鎖ＤＮＡ
合成の方向は、ｎｅｏ遺伝子転写の方向と反対である）を含む。従って、ＳＮｏ
ｒｉは、真核生物細胞中の組み込まれたベクターのＧ４１８選択ならびに組み込
み後の隣接宿主ＤＮＡとともにベクターのレスキューのために使用される。レト
ロウイルスプラスミドを、細菌複製起点およびｎｅｏ遺伝子に起因して、カナマ
イシンでの選択下でＥ．ｃｏｌｉにおいて増殖し得る。ＳＮｏｒｉ含有ベクター
は、Ｇ４１８耐性コロニーの数に基づいて、全組み込み事象の迅速な予測を可能
にする。さらに、隣接する染色体ＤＮＡをともに有するベクターＤＮＡを、単一
のＧ４１８クローン由来のプラスミドとしてレスキューし得、そして組み込み接
合部を決定するための配列決定を行うために使用し得る。両方のハイブリッドベ
クターを、約３×１０12ゲノム／ｍｌの力価で生成する。ゲノム力価 対 ΔＡ
ｄ．ＡＡＶＢＧについての形質導入粒子の比は、β−Ｇａｌ発現に基づくと、約
２００：１である。
【００７９】 （考察） ΔＡｄ．ＡＡＶ１が、アデノウイルス複製の間に自発的に形成し得る。ΔＡｄ
．ＡＡＶ１形成の別のあり得る機構は、アデノウイルスがそのゲノムを複製する
ことによる独特の機構に基づいている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ．Ｂ，１９
９５，ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒら（編）、第２巻、１〜３１頁，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（図１を参照のこと）。Ａｄ ＤＮＡ複製を、
直鎖状ゲノムの両方の末端にあるＩＴＲ内の特異的部位に結合し、そしてＡｄ
ｐｏｌとの複合体で５’ＣＴＰ（娘鎖の第１のヌクレオチド）の結合を触媒する
ＴＰ／ｐＴＰ（末端タンパク質）により開始する。ＤＮＡ合成はゲノムの他方の
末端に対して連続的な様式で進む（図１Ａ）。ＤＮＡ鎖のわずか１つが鋳型とし
て働く。複製産物のうちの１つは単鎖ＤＮＡであり、この単鎖ＤＮＡは、その自
己相補的ＩＴＲのアニーリングにより環状化する。得られた二重鎖の「取っ手（
ｐａｎｈａｎｄｌｅ）」は、二重鎖ウイルスゲノムの末端と同じ構造を有し、こ
の二重鎖ウイルスゲノムは、ｐＴＰの結合および鋳型として単鎖「取っ手」分子
を使用した相補鎖の合成の開始を可能にする（図１Ｃ）。Ａｄ．ＡＡＶ１の場合
、Ａｄ ｐｏｌは、左側のＡｄ ＩＴＲから開始して第２のＡＡＶ ＩＴＲに達
するまでアデノウイルスの単鎖を合成する。第２のＡＡＶ ＩＴＲの合成の間に
、特定の割合の単鎖分子が、早く複製された第１のＡＡＶ ＩＴＲ内の相補領域
にハイブリダイズするループを形成し、このことにより、Ａｄ ｐｏｌが左側の
ＩＴＲに戻って読むために同じウイルスＤＮＡ鎖を用いることを可能にする（図
１Ｂ）。得られた「取っ手」構造は、図１Ｃに示される全長中間体（Ａｄビリオ
ンにパッケージングされ得る上記の構造を有する直鎖状分子）と同様の様式で分
離（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）されて、二重鎖を生成し得る。ウイルスＤＮＡ 対 精
製ΔＡｄ．ＡＡＶ１粒子中のタンパク質濃度の比は、Ａｄ．ＡＡＶ１粒子から得
られた比と匹敵する。このことは、サイズがより小さいにも拘わらず、わずか１
つのΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムがパッケージングされ、わずかに上昇した密度（約
１．３２ｇ／ｃｍ3）を有する粒子を生じることを示す。電子顕微鏡により、Δ
Ａｄ．ＡＡＶ１粒子の二十面体形状が実証される（図２）。酢酸ウラニルで染色
すると、中心のウイルスコアの電子が濃く現れる。わずか１つの５．５ｋｂ ゲ
ノムが１つのキャプシドにつきパッケージングされたΔＡｄ．ＡＡＶは、予測さ
れるように斑点状の明るい濃い染色のみを有する。
【００８０】 （Ｂ．インビトロでのΔＡｄ．ＡＡＶ１生成） （欠失したアデノ−ＡＡＶベクター（ΔＡｄ．ＡＡＶ）の特徴） ΔＡｄ．ＡＡＶゲノム形成の機構を明らかにするために多くの実験を行う。特
に、レポーター遺伝子カセットに隣接する２つのインタクトなＡＡＶ ＩＴＲの
存在は、ΔＡｄ．ＡＡＶゲノムの効率的な形成に必要である。このプロセスは、
部分的に欠失したＩＴＲに対しても発現カセットに隣接するオリゴ−ｄＣおよび
オリゴ−ｄＧストレッチに対しても生じない。さらに、インビトロでの形質導入
研究を、種々のゲノム力価のΔＡｄ．ＡＡＶ１、Ａｄ．ＡＡＶ１およびＡｄ．Ａ
ＡＶ−Δ２ＩＴＲ（２つのＡＡＶ ＩＴＲが欠如している）を用いて行う。これ
により、選択の４週間後に形成されたＧ４１８耐性コロニーの数を決定する（表
１）。
【００８１】 ΔＡｄ．ＡＡＶ１を高力価（５×１０12ゲノム／ｍｌ（１つの２９３細胞につ
き１０4を超えるゲノムが生成された））かつ高純度で慣用的に生成する（組換
えアデノウイルスの増幅および精製に通常使用される技術により、０．１％未満
が全長Ａｄ．ＡＡＶ１ゲノムを含有する）。
【００８２】 （ＣＤ３４＋細胞および赤白血病細胞におけるハイブリッドベクターでのイン
ビトロ形質導入研究） ハイブリッドベクターが、鎌状細胞治療について標的化されねばならない細胞
型に対して遺伝子移入を可能にするか否かを試験するために、固定化末梢血およ
びヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２から得られたＣＤ３４＋富化骨髄細胞（εおよび
γグロビン遺伝子を発現する）を用いて、感染／形質導入研究を行う。
【００８３】 （方法） （細胞培養） ヒト肝臓由来の内皮細胞株であるＳＫＨｅｐ１細胞（ＨＴＢ−５２、アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）［Ｈｅｆｆｅｌ
ｆｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｃ．ら，１９９２，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．
Ｂｉｏｌ．２８Ａ，１３６−１４２］を、高濃度グルコースのダルベッコ改変イ
ーグル培地（１０％ウシ胎仔血清含有）において増殖させる。ＳＫＨｅｐ１細胞
を、プローブとしてｐＡＡＶ／Ａｄ（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、１９８９
，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３：３８２２−３９２８）から
得られたＡＡＶ１野生型ゲノム（Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎからの贈与）を用いて、ゲノムＤＮＡのサ
ザン分析により、組み込まれたＡＡＶプロウイルスについて分析する。未消化の
ＳＫＨｅｐ１ゲノムＤＮＡにも、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後のＳＫＨｅｐ１ゲ
ノムにも特異的バンドは検出されない。ウイルス感染については、コンフルエン
トな細胞を、種々のウイルス用量で２時間インキュベートし、次いで、徹底的に
洗浄する。Ｇ４１８選択のために、ΔＡｄ．ＡＡＶ１で感染させて２４時間後、
ＳＫＨｅｐ１細胞をトリプシン処理し、そしてＧ４１８の選択下で種々の希釈率
でプレートする（９００μｇ／ｍｌの活性化合物、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｍａｎｙ）。Ｇ４１８含有培養培地を３日ごとに交換する。
１０4を超える細胞を含有するコロニー数を選択の４週間後に計数し、そして最
初に播種した細胞数に分ける。この割合を用いて、ΔＡｄ．ＡＡＶ１の組み込み
頻度を表す。単一のコロニーを、９６ウェルプレート中、感染した細胞の限界希
釈により得る。コロニーを、Ｇ４１８の存在下で１×１０6細胞に拡大させる。
感染３日後にＳＫＨｅｐ１細胞において発現されたアデノウイルスタンパク質の
免疫蛍光分析を、先に記載したように行う［Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９６，
Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０，８７８２−８７９１］。
【００８４】 （結果） ２９３細胞を第一世代ベクターＡｄ．ＡＡＶ１に感染させる。Ａｄ．ＡＡＶ１
の複製の間、小さなΔＡｄ．ＡＡＶゲノムが自発的に形成し、そしてアデノウイ
ルスキャプシドにパッケージングされる。感染して３６時間後に細胞を回収し、
そしてウイルスを数サイクルの凍結／融解により放出させる。次いで、細胞溶解
物中のＡｄ．ＡＡＶ１およびΔＡｄ．ＡＡＶ粒子の混合物を、ＣｓＣｌ段階勾配
の超遠心により分離する。そのより軽い浮遊性の密度に起因して、ΔＡｄ．ＡＡ
Ｖ１粒子を含有するバンドは、全長ウイルスを含むバンドから明らかに分離され
る（０．８ｃｍの距離）（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ
７３：９３１４−２４）。ΔＡｄ．ＡＡＶ１をさらなるＣｓＣｌ平衡勾配により
さらに精製し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール
、１ｍＭ ＭｇＣｌ2中、−８０℃で保存する。合計で、２×１０13（ゲノム）
粒子のＡｄ．ＡＡＶ１の生成には３時間未満の作業しか必要としない。ΔＡｄ．
ＡＡＶ１複製および粒子形成のための全ての機能を、同じ細胞において増幅され
たＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムから提供する。ゲノム／細胞ベースに対して測定された
ベクター生成の効率は、ＡＡＶ生成のための労働集約的なより新たな技術に匹敵
するか、またはこの技術より高いが、これは信頼性があるとは未だ証明されてい
ない。ΔＡｄ．ＡＡＶ１についての形質導入／ゲノム力価の予測された比は、１
：２００である（感染して３日後のＳＥＡＰ発現に基づく）。それに対して、平
均のｒＡＡＶ調製物に関しては、１：１０3〜１：１０4の範囲である。１×１０ 5 のコンフルエントなＳＫＨｅｐ１細胞を、１００ｍｌの容量で、種々のＭＯＩ
のｒＡＡＶ１（ストック：１×１０10ゲノム／ｍｌ）、ΔＡｄ．ＡＡＶ１（スト
ック：５×１０12ゲノム／ｍｌ）、Ａｄ．ＡＤＡＶ１（ストック：１×１０13ゲ
ノム／ｍｌ）およびＡｄＡＡＶ１．２ＩＴＲ（ストック：９×１０12ゲノム／ｍ
ｌ）で感染させ、感染させて２４時間後に、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、
そして種々の希釈倍率でプレートする。Ｇ４１８を、プレートしてから２４時間
後に添加し、そして４週間にわたり選択を行う。Ｇ４１８耐性コロニーは、＞５
×１０4細胞の平均で含まれる（少なくとも１６回の細胞分裂）。有意な数の小
さなコロニー（感染して２週間後に視覚化可能）は、おそらく、エピソームベク
ター発現に起因して、連続した選択に生き残れない。１×１０4より大きなＭＯ
Ｉで第一世代のアデノウイルスに感染した細胞は、選択の１週目の間にＣＰＥを
発生する。ｒＡＡＶ力価は、１０4より大きなＭＯＩを用いた感染研究を行うに
は十分高くない。コロニー形成を、選択のために最初に播種した細胞数に対する
選択後のコロニー数の割合として表す（表１）。 （表１）
【００８５】
【表１】 （Ｋ５６２細胞を、異なるＭＯＩのΔＡｄ．ＡＡＶＢＧ（１〜１０8ゲノム／
細胞）で感染させる） 感染の３日後に、生存細胞の総数（トリパンブルー染色に基づく）および感染
された細胞のパーセンテージ（Ｘ−Ｇａｌ染色に基づく）を、全てのＭＯＩにつ
いて測定した。結果を、図４Ａに示す。
【００８６】 （最初の組み込み研究） Ｋ５６２細胞を、ΔＡｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉと共に、２×１０5ゲノム／細胞
のＭＯＩでインキュベートし、そしてＧ４１８選択の４週間後に形成したコロニ
ーを、９６ウェルプレート中で計数する。Ｇ４１８耐性コロニーは、平均＞５×
１０4細胞上に含まれ、これは、元々の細胞が、少なくとも１６回の細胞分裂を
起こしたことを意味する。
【００８７】 （ＣＤ３４＋細胞に対するＡｄ．ＡＡＶＢＧ（１〜１０8ゲノム／細胞）での
感染研究） ＣＤ３４＋に対する細胞感染は、Ｋ５６２細胞について記載したのと同様であ
る。ＣＤ３４＋細胞を、２０％ＦＣＳ、キットリガンド（幹細胞因子−ＳＣＦ）
（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充したＩＭＤＭ中で
培養する。多くの報告が、幹細胞分化を誘導する特定のサイトカイン（ＧＭ−Ｃ
ＳＦまたはＭ−ＣＳＦのような）がインテグリン発現を刺激し得、そして従って
、Ａｄ５ベクターのインターナリゼーションに影響し得るということを示唆する
ので、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）で前
刺激するかまたは前刺激せずに培養したＣＤ３４＋細胞について、Ａｄ５ベース
のハイブリッドベクターを用いて感染率を比較する。感染された細胞数を、感染
の３日後にＸ−Ｇａｌ染色に基づいて計数する。用量依存性の毒性について試験
するために、感染後３日目に生存細胞を計数する（トリパンブルー排除に基づい
て）。さらに、高いウイルス用量が、ＩＬ−３およびＳＣＦの存在下でのメチル
セルロースコロニーアッセイにおける、ＣＤ３４＋細胞が分化する能力に影響す
るか否かを、分析する。これらの結果を、生存細胞／Ｘ−Ｇａｌ陽性細胞 対
ＭＯＩとして表す（図４Ｂを参照のこと）。
【００８８】 （考察） 上記のデータは、ΔＡｄ．ＡＡＶが、ｒＡＡＶに匹敵する低頻度で不死化ヒト
細胞株を安定に形質導入するが、より大きいＭＯＩのΔＡｄ．ＡＡＶ１を使用す
ることによって、形質導入率を１００％にまでスケールアップし得、このΔＡｄ
．ＡＡＶ１は、ｒＡＡＶ１よりも高い力価で生成されることを実証する。第一世
代のベクターであるＡｄ．ＡＡＶ１での感染とは対照的に、ΔＡｄ．ＡＡＶ１で
の感染は、用量依存性の細胞傷害性に関連しない。なぜなら、ウイルスタンパク
質は、形質導入された細胞においてこれらのベクターから発現されないからであ
る。さらに、次のΔＡｄ．ＡＡＶ１粒子中に存在するウイルスタンパク質は、こ
の使用する用量範囲では問題にならない。ＡＡＶ ＩＴＲを欠失するベクターＡ
ｄ．ＡＡＶ１−Δ２ＩＴＲとのΔＡｄ．ＡＡＶ１／Ａｄ．ＡＡＶ１の形質導入率
の比較は、この２つのインタクトなＡＡＶ ＩＴＲの存在が、ハイブリッドベク
ターの組み込みに重要であるという仮説を支持する。
【００８９】 これらのデータは、白血病細胞株が、有意な毒性副作用を伴うことなく、ＭＯ
Ｉ ２×１０5ゲノム／細胞でのＡｄ５ベースハイブリッドベクターで、約９０
％の効率で感染され得ることを実証する。しかし、この用量は、ＨｅＬａ細胞、
肝癌（ｈｅｐａｓｔｏｍａ）細胞、初代血液細胞およびＡｄ５ベクター感染につ
いて許容性であると一般に考えられている他の細胞株を１００％感染するのに必
要とされる用量よりも、依然約１００倍高い。
【００９０】 ２×１０4ゲノム（すなわち、１００形質導入粒子／細胞）で感染させた細胞
におけるウイルスＤＮＡは、７回の細胞分裂後に損失されるはずなので、観察し
たコロニーにおけるＧ４１８耐性細胞の存在は、ΔＡｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉゲノ
ムが、この宿主ゲノム内に組み込まれるか、または安定に会合されることを示唆
する。Ｇ４１８耐性コロニー数に基づいて、２５，０００個のΔＡｄ．ＡＡＶＳ
Ｎｏｒｉゲノム中で１個のゲノムが、Ｋ５６２細胞に安定に組み込まれる。この
ことは、ＳＫ Ｈｅｐ１細胞において、ΔＡｄ．ＡＡＶ１を用いて先に得られた
結果と一致する。
【００９１】 ＣＤ３４＋細胞の感染に使用される最大用量（１×１０8）は、ＧＭ−ＣＳＦ
／Ｍ−ＣＳＦに関係なく、約１０％の細胞のみのＸ−Ｇａｌ染色を生じる。これ
は、Ａｄ５がＣＤ３４＋細胞を感染する能力の明らかな欠失を実証し、これはお
そらく、細胞表面上の特定のレセプターおよび／またはインテグリンの非存在に
よって引き起こされる。ＣＤ３４＋細胞は、細胞生存性および総細胞数に明らか
な影響を伴うことなく、広範囲のウイルス用量（１〜１０7）に耐性である。こ
れは、驚くべくことではない。なぜなら、毒性副作用を発生するためには、アデ
ノウイルスは、細胞に侵入し、そしてウイルス遺伝子を発現しなければならない
からである。ハイブリッドベクターは、５×１０12ゲノム／ｍｌの力価で生成さ
れ得る。従って、（１０4細胞の）感染に使用され得る最大のＭＯＩは、約５×
１０8（１００μｌ保存緩衝液中）である。ΔＡｄ．ＡＡＶＢＧでの感染研究に
基づいて、この用量は、ＣＤ３４＋細胞を効率的に形質導入するため、および適
切な数のＧ４１８耐性コロニーを得るために十分でないかもしれない。
【００９２】 （Ｃ．ΔＡｄ．ＡＡＶ１のインビボ特性） ウイルスＤＮＡを、ウイルス増幅の間にＢｒｄＵで標識し、細胞／核のベクタ
ー取り込みをインサイチュで調査する。形質導入研究のために、コンフルエント
なＳＫＨｅｐ１細胞（ヒト内皮細胞株）を、２０００ゲノム／細胞のΔＡｄ．Ａ
ＡＶ１またはＡｄ．ＡＡＶ１で感染させる。ＢｒｄＵタグ化ウイルスＤＮＡは、
両方のウイルスについて、感染後３時間で１００％の核において検出され、これ
は、ハイブリッドウイルスＤＮＡの効率的な細胞および核の取り込みを示す。
【００９３】 （結果） ΔＡｄ．ＡＡＶ１ベクターは、１×１０3ゲノム／細胞または１×１０4ゲノム
／細胞のＭＯＩでの感染後、それぞれ１７％または５８％の効率で、Ｇ４１８耐
性コロニーをインビトロで形成する細胞を形質導入する。約２×１０4ΔＡｄ．
ＡＡＶ１ゲノムが、１つの安定なトランスフェクタントを生じるために必要とさ
れる。全ての安定なコロニーは、組み込まれたΔＡｄ．ＡＡＶベクターＤＮＡを
含むので、この数は、ＳＫＨｅｐ１細胞におけるΔＡｄ．ＡＡＶ１の最小の組み
込み頻度を反映し、これは、ｒＡＡＶでの組み込み頻度に匹敵する（Ｒｕｔｌｅ
ｄｇｅ，Ｅ．Ａ．ら、１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７
１：８４２９−３６）。Ｇ４１８耐性コロニーの数は、組み込み事象の総頻度を
必ずしも表さない。なぜなら、染色体での位置の影響または不完全な組み込みに
起因して、必ずしも全ての組み込まれたコピーが、ネオマイシンホスホトランス
フェラーゼを発現するとは限らないからである。
【００９４】 感染後３日目でのΔＡｄ．ＡＡＶ１を形質導入された細胞における、アデノウ
イルス遺伝子産物の非存在は、主要後期タンパク質（ヘキソン、ファイバー）お
よび初期タンパク質（ＤＢＰ、Ｅ４−ｏｒｆ６）に対する抗体での免疫蛍光によ
って実証される。発現されるアデノウイルスタンパク質は、Ａｄ．ＡＡＶ１を感
染させた細胞においてのみ検出される。ΔＡｄ．ＡＡＶ１のみを感染させた細胞
が潜在的な細胞傷害性アデノウイルスタンパク質を発現しないというという事実
は、重要である。
【００９５】 １×１０4ゲノム／細胞のＭＯＩの第一世代のベクターＡｄ．ＡＡＶ１が、感
染後３日目にＳＫＨｅｐ１細胞において細胞変性効果を誘導するが、ＳＫＨｅｐ
１細胞を、１×１０8ゲノム／細胞までの用量でΔＡｄ．ＡＡＶ１を感染させる
場合には、毒性副作用は観察されない。形質導入効率は、明らかに用量依存性で
あるので、ΔＡｄ．ＡＡＶ１（＞５×１０12ゲノム／ｍｌの力価で生成され得る
）は、関連する毒性を伴うことなく１００％の効率で、Ａｄ５許容性の細胞株ま
たは組織を安定に形質導入し得る。
【００９６】 サザン分析は、ΔＡｄ．ＡＡＶ１が、右側のＡＡＶ ＩＴＲを介して、宿主細
胞ゲノム内にヘッド−テイル直列反復としてランダムに組み込まれることを示す
が、この染色体ＤＮＡとのもう一方の接合は可変性であり、この導入遺伝子カセ
ット内のどこかで生じる。ΔＡｄ．ＡＡＶ１ ＤＮＡの組み込まれた状態を確認
するために、高分子量染色体ＤＮＡを、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧ
Ｅ）によって分離し、その後、ＳＥＡＰ特異的プローブを用いてサザン分析を行
う（図３）。コントロールＳＫＨｅｐ１細胞由来の未消化ＤＮＡは、ウェルの直
ぐ下にある染色体ＤＮＡと共に移動する内因性のＳＥＡＰシグナルを与える（レ
ーン１および５）。高分子量のエピソーム形態のΔＡｄ．ＡＡＶ１ ＤＮＡは、
全く検出されないが、別の３５ｋｂのバンドが、第一世代のアデノウイルスＡｄ
．ＡＡＶ１での感染後３日目に単離したＳＫＨｅｐ１細胞由来のＤＮＡにおいて
現れる（レーン４および１３）。ＥｃｏＲＩでの消化は、４．４ｋｂフラグメン
トを示し、このフラグメントは、ＡＡＶカセットの組み込まれた直列コピーに特
異的である（レーン８および１２）。染色体ＤＮＡがウェル中に捕捉されている
可能性を排除するために、ＤＮＡサンプルを、それぞれ１１ｂｐまたは９ｂｐを
超える配列特異性を有する、イントロンコード（ｉｎｔｒｏｎ−ｅｎｃｏｄｅｄ
）エンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＣｅｕＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ
，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で消化する。ＰＩ−ＳｃｅＩでの消化は、
ＳＫＨｅｐ１細胞において＞２ｍｂの内因性ＳＥＡＰシグナル（レーン２）、お
よびΔＡｄ．ＡＡＶ１で形質導入したＧ４１８耐性コロニーにおいて約１ｍｂの
範囲にあるさらなるシグナル（レーン７）を生じる。Ｉ−ＣｅｕＩ消化は、ΔＡ
ｄ．ＡＡＶ１形質導入ＳＫＨｅｐ１細胞において２５０〜１０００ｋｂの間にス
メアを生じるが（レーン１０、１１）（これは、ランダムな組み込みを示す）、
内因性ＳＥＡＰ遺伝子に特異的な高分子量バンドが、コントロールＳＫＨｅｐ１
細胞において観察される（レーン９）。
【００９７】 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける１×１０12ΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムの門脈内注
入後１日目で、ＢｒｄＵ標識ベクターゲノムが、８５％の肝細胞において検出さ
れ得る（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７３：９３１４−
２４）。注入後２ヶ月で行った肝細胞ＤＮＡ分析は、ΔＡｄ．ＡＡＶ１ ＤＮＡ
が、マウスゲノム中に平均０．５コピー／細胞で組み込まれていることを示す（
Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７３：９３１４−２４）。
門脈内ΔＡｄ．ＡＡＶ１注入の潜在的な副作用を評価するために、血清グルタミ
ン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）（肝細胞損傷についての高感度
マーカー）を、肝臓切片の組織学的分析と共に、注入後７日間連続で測定する。
１×１０12または１×１０13のΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムの門脈内注入後に、ＳＧ
ＰＴレベルの有意な上昇も、組織学的異常も、全く検出されず、対して、同じ用
量の全長Ａｄ．ＡＡＶ１ベクターは、重篤な肝細胞傷害性または致命的結果に関
連する。このことは、マウスに投与するΔＡｄ．ＡＡＶ１の用量を増加させて、
第一世代のアデノウイルスでは可能でなかった、有害な副作用を伴わないインビ
ボでのより高い形質導入効率を獲得し得ることを示唆する。重要なことに、ΔＡ
ｄ．ＡＡＶ１は、インビボで静止肝細胞を形質導入し、これは、ハイブリッドベ
クターＤＮＡの組み込みが、細胞増殖を必要としないかもしれないことを示唆す
る。最近、Ａｄ．ＡＡＶ１およびΔＡｄ．ＡＡＶ１でのより詳細なインビボ形質
導入研究がＢａｌｂ／ｃマウス中で行われ、ΔＡｄ．ＡＡＶ１を感染させた細胞
におけるアデノウイルス遺伝子発現の非存在が、抗ウイルス免疫応答を回避し得
、そしてベクターの持続性を延長し得るか否かが研究されている。このマウス系
統において、ベクターＤＮＡは、第一世代のアデノウイルスの注入後４〜６週間
で肝臓から排除され、これは、形質導入された細胞において生成されたウイルス
タンパク質に対するＣＴＬ応答にほぼ起因する。ベクターＤＮＡを、１×１０12 ゲノムのＡｄ．ＡＡＶ１またはΔＡｄ．ＡＡＶ１の注入後１２週間で、肝臓ＤＮ
Ａのゲノムサザンブロットによって分析する。この時点で、ベクター特異的シグ
ナルは、第一世代ベクターＡｄ．ＡＡＶ１を注入したマウス由来の肝臓ＤＮＡに
おいて検出可能でないが、約０．３コピー／細胞のΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムが、
ハイブリッドベクターを受けたマウスの肝臓中に存在し、これはまた、このハイ
ブリッドベクターの優れたインビボ特性を示す。
【００９８】 （Ｄ．ΔＡｄ．ＡＡＶ組み込みに対するＲｅｐ同時発現の効果） （プラスミドトランスフェクション後のＲｅｐ発現） Ｒｅｐ発現が、ヒト細胞におけるΔＡｄ．ＡＡＶ１の部位特異的組み込みを増
強するか否かを試験するために、一連のＲｅｐ発現プラスミドを構築する。
【００９９】 （方法） 内部ｐ１９プロモーターおよびｐ４０プロモーターを含むＲｅｐ ＯＲＦ６８
／７８（ヌクレオチド２８５〜２３１３）は、ｐＡＡＶ／Ａｄ（Ｓａｍｕｌｓｋ
ｉ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９１、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ，第２巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）から、ＢｓａＩ／ＢｓｒＩでの消化によって
得られる。ＡＡＶ ｐ５プロモーターが欠失されたこのフラグメントを、ｐＡｄ
．ＲＳＶ内またはｐＡｄ．ＰＧＫ内に、それぞれＲＳＶプロモーター下またはＰ
ＧＫプロモーター下の、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＰＡ）の
前に、アダプターリンカーを介してクローニングする（Ｌｉｂｅｒ，Ａ．および
Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，１９９６，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０，３１５３−
３１５８；Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９５、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ，６，５−１１）。
【０１００】 （結果） 得られたプラスミド（ｐＲＳＶｒｅｐ、ｐＰＧＫｒｅｐ）を、２９３細胞また
はＳＫＨｅｐ１細胞にトランスフェクトし、この異種プロモーター（ＲＳＶまた
はＰＧＫ）から発現されるＲｅｐタンパク質のほとんどが、Ｒｅｐ６８およびＲ
ｅｐ７８であり、一方、ａＰ５プロモーター（ｐＡＡＶ／Ａｄ）下でのｒｅｐ遺
伝子のトランスフェクションは、優性なＲｅｐ ５２／４０の発現を生じる。従
って、ｐＲＳＶｒｅｐおよびｐＰＧＫｒｅｐのトランスフェクションが、より顕
著であり、これは、２９３細胞において産生されるＥｌａによるＡＡＶプロモー
ターの強力なトランス活性化を示唆する。この結果は、ｒｅｐタンパク質の最小
限の発現が、アデノウイルス複製の妨害を回避するために必要であることを示す
。
【０１０１】 （ΔＡｄ．ＡＡＶ１のＲｅｐ媒介部位特異的組み込み） 部位特異的組み込みの能力は、本発明の新規Ａｄ．ＡＡＶベクターの重要な特
徴である。本発明の１つの実施形態において、ΔＡｄ．ＡＡＶの組み込みは、ヒ
ト第１９染色体上のＡＡＶＳ１部位内への部位特異的組み込みを達成するための
、ｒｅｐ ７８タンパク質を発現するＡｄ．ＡＡＶとの同時感染によって指示さ
れる。この型の部位特異的組み込みが２９３細胞以外の細胞で生じるために、Ｅ
４ ＯＲＦ６発現が必要とされる。ΔＡｄ．ＡＡＶ、ΔＡｄ．ｒｅｐ ７８およ
びΔＡｄ．Ｅ４−ｏｒｆ６の同時感染は、このΔＡｄ．ＡＡＶ導入遺伝子カセッ
トの部位特異的組み込みを可能にする。ΔＡｄ．ｒｅｐ７８およびΔＡｄ．Ｅ４
−ｏｒｆ６ゲノムは、形質導入のすぐ後で分解され、従って、潜在的な副作用を
回避する。部位特異的組み込みは、挿入性変異誘発の危険性を減少するために、
ｒＡＡＶおよびΔＡｄ．ＡＡＶで見い出されるランダムな組み込みよりも好まし
い。
【０１０２】 予備試験を行って、ΔＡｄ．ＡＡＶ１の部位特異的組み込みを媒介する、ｐＲ
ＳＶｒｅｐから発現されるＲｅｐ ６８／７８の機能的活性を確認し得る（図５
および６）。ヒトＳＫＨｅｐ１細胞を、ｐＲＳＶｒｅｐまたはコントロールプラ
スミド（ｐＲＳＶｂＧａｌ（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９５、Ｈｕｍａｎ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，６，５−１１））でトランスフェクトし（トランスフ
ェクション効率は、約２０％）、その後、ΔＡｄ．ＡＡＶ（２０００ゲノム／細
胞）を感染させる。感染後３日で、細胞を、トリプシン処理し、アガロースで包
理し、インサイチュで溶解し、Ｉ−ＣｅｕＩ（１０ヌクレオチドを超える認識配
列を有する、イントロンコードエンドヌクレアーゼ）で消化し、１％アガロース
ゲル中でのパルスフィールドゲル電気泳動に供し、そしてサザンブロットにより
分析する。ＡＡＶＳ１組み込み部位を含むプローブ（第１９染色体座由来の１．
７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら
、１９９１、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
，第２巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｐｈｉｌ
ａｄｅｌｐｈｉａ））でのハイブリダイゼーションは、コントロールプラスミド
トランスフェクション（ｐＣｏ）＋ΔＡｄ．ＡＡＶ１感染後の細胞由来のＩ−Ｃ
ｅｕＩ消化ＤＮＡ中に、ＡＡＶＳ１に特異的なバンド（約２４０ｋｂ）を明らか
にする。２８０ｋｂの範囲中のさらなるシグナルが、ΔＡｄ．ＡＡＶ１で感染し
たｒｅｐ発現細胞（ｐＲＳＶｒｅｐ＋ＶＡｄ．ＡＡＶ１）中に現れ、これは、特
定のパーセンテージの細胞におけるＡＡＶＳ１部位への部位特異的挿入を示す。
この２８０ｋｂバンドにおけるベクターＤＮＡの存在は、導入遺伝子（ＳＥＡＰ
）特異的プローブでの同じフィルターの再ハイブリダイゼーションで確認される
。ランダムに組み込まれたΔＡｄ．ＡＡＶ１ベクターは、２８０〜６８０ｋｂの
範囲の広がったシグナルとして現れる（ｐＣｏ＋ΔＡｄ．ＡＡＶ１、ｐＲＳＶｒ
ｅｐ＋ΔＡｄ．ＡＡＶ１）。ＳＥＡＰプローブをハイブリダイズさせたブロット
上の特異的な約１．９ｍｂのバンドは、内因性ヒトＳＥＡＰ遺伝子を含むＩ−Ｃ
ｅｕＩフラグメントを表す。
【０１０３】 Ｒｅｐ過剰発現によって部位特異的組み込みを刺激するための、ハイブリッド
ベクターへのＲｅｐ ６８／７８機能の組み込みは、アデノウイルスＤＮＡ複製
を阻害し、これは、従来のストラテジーを使用してのｒｅｐ発現Ａｄベクターの
生成を妨げる。この問題を解決するために、部位特異的組み込みを媒介するため
に標的細胞（ＨＳＣ）において一過性のＲｅｐ発現を維持しながら、ウイルスプ
ロデューサー（２９３）細胞におけるハイブリッドベクターからの有意なＲｅｐ
６８／７８発現が、妨げられなければならない。本発明者らの仮説は、ΔＡｄ
．ＡＡＶハイブリッドウイルスの特異的な構造を使用して、このｒｅｐ遺伝子
６８／７８を、２９３細胞におけるウイルス複製の後期においてのみ、ＨＳＣ特
異的プロモーターの制御下の転写活性位置にもたらし得るということである。こ
れは、この組み込まれたＲｅｐ ６８／７８機能をＨＳＣにおいてのみ活性化す
る高力価ウイルスを生成して、２９３細胞においてハイブリッドベクターを増幅
させる。Ｒｅｐ発現ハイブリッドベクターを生成するための本発明者らのストラ
テジーの一般的概略を、図７に例示する。ｒｅｐ／導入遺伝子カセットを、組換
えアデノウイルス生成のために使用されるレフトハンド（ｌｅｆｔ−ｈａｎｄ）
シャトルプラスミドに基づいて構築する。Ｒｅｐ ６８／７８をコードする遺伝
子を、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子発現カセットの前に３’から５’の
方向にクローニングする。この導入遺伝子カセットと右側ＡＡＶ ＩＴＲとの間
に、ＨＳＣ特異的プロモーターを、アデノウイルスＥ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子
に対する方向で挿入する。組換えゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での組換えによって
生成され、そして２９３細胞へのトランスフェクションにより、ウイルス（Ａｄ
．ＡＡＶ−ｒｅｐ）を生成する。ＡＶ ＩＴＲに隣接する２組の配列を有するΔ
Ａｄ．ＡＡＶの特異的構造を使用して、このｒｅｐ遺伝子を、２９３細胞におけ
るウイルスＤＮＡ複製の後期においてのみ、ＨＳＣ特異的プロモーターの制御下
の転写活性位置にもたらす。Ａｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐの増幅の間に、より小さいゲ
ノムΔＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐが形成され、そして粒子にパッケージングされる。
この粒子は、ＣｓＣｌ勾配中での超遠心分離によって分離され得る。ΔＡｄ．Ａ
ＡＶ−ｒｅｐの特異的構造は、このｒｅｐ遺伝子を、ＨＳＰ特異的プロモーター
に対して５’から３’方向にもたらし、これは、標的細胞中でのｒｅｐ転写を可
能にする。精製したΔＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐ粒子でのＨＳＣの形質導入後、ｒｅ
ｐ発現が達成され、そしてアデノウイルスベクター骨格からのＡＡＶ−ＩＴＲ／
導入遺伝子カセットのレスキューおよび部位特異的組み込みを媒介する。この仮
説は、ＡＡＶＳ１へのＲｅｐ媒介組み込みが、右側または両側のＡＡＶ／ＩＴＲ
を介して生じ、このことが、このベクターが一旦組み込まれると、このｒｅｐ遺
伝子を、肝細胞特異的プロモーターから離れるようにする（図７）。従って、ｒ
ｐｅ発現は、この宿主細胞に対して重大な細胞傷害性副作用を伴うことなく、単
に一過性になるはずである。
【０１０４】 （ｒｅｐ発現を調節し得るプロモーター） ＨＳＣに対する高い特異性および２９３細胞における最小限の活性を有するｒ
ｅｐ発現を駆動するための潜在的な候補プロモーターは、イニシエーター（また
はＨＩＶ ＬＴＲ）と組み合わせた、４５４ヌクレオチドのＣＤ３４プロモータ
ー（Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．Ｓ．ら、１９９７、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍ
ａｔｏｌｏｇｙ，２５，１０５１−１０６１；Ｙａｍａｇｕｃｈｉａ，Ｙ．ら、
１９９７、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．，
１３５０：１４１−６）、３００ヌクレオチドのＨＳ ４０エンハンサー（Ｃｈ
ｅｎ，Ｈ．Ｌ．ら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２
９１７−２９２２）または３ｋｂのＣＤ３４エンハンサー（Ｍａｙ，Ｇら、１９
９５、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：５６４−７４）である。最適なプロモーターは、
２９３細胞および肝細胞におけるプラスミドトランスフェクション後の一過性の
レポーター遺伝子発現の研究に基づいて選択される。試験される全てのプロモー
ターを、アデノウイルスシャトルプラスミドｐＣＲ２（ｐＡｄ．−ｈＡＡＴ）内
へ、ヒトα1−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）−ウシ成長ホルモンポリアデニル化シ
グナル（ｂＰＡ）の前にクローニングする。プロモーター活性は、ＣＤ３４＋お
よび２９３細胞における一過性のプラスミドトランスフェクションアッセイにお
いて試験し得る。ＣＤ３４＋細胞またはＫ５６２細胞における最も高いｈＡＡＴ
レベルおよび２９３細胞における最も低いｈＡＡＴ発現を有するプロモーターを
、さらなる研究のために選択する。これらのプロモーターからの２９３細胞にお
ける高いバックグラウンド発現が見られる場合、Ａｄシャトルプラスミドになお
存在するＥｌａエンハンサーからＨＳＣ特異的プロモーターを遮蔽するインシュ
レーター（遮断因子）を使用する。
【０１０５】 （Ｒｅｐ遺伝子） 大きなＲｅｐ６８／７８タンパク質は、レスキューおよび部位特異的組み込み
の媒介に十分である。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８のＯＲＦ内部に位置するＡＡ
Ｖ ｐ１９プロモーターからの無秩序なＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０の発現は、
妨げられるはずである。なぜなら、２９３細胞におけるこれらのより小さなＲｅ
ｐタンパク質の産生が、細胞生存およびアデノウイルスＤＮＡ合成に影響を及ぼ
すからである。これを行うために、ＣＭＶプロモーターの下で個々にＲｅｐ６８
およびＲｅｐ７８を発現するための変異したＲｅｐ５２／４０開始コドンを含む
、Ｓｕｒｏｓｋｙらから得た構築物を使用し得る。これらの構築物からＲｅｐ６
８またはＲｅｐ７８を一過性に発現する２９３細胞を、ΔＡｄ．ＡＡＶ１を用い
て同時感染し得る（ＭＯＩ ２×１０5ゲノム／細胞でのｐＣＭＶＲｅｐトラン
スフェクションから２４時間後の感染）。ΔＡｄ．ＡＡＶ１感染から３日後、細
胞性ＤＮＡを、上記のようなＰＣＲおよびＰＦＧＥによって、ＡＡＶＳ１特異的
組み込み事象について分析する。効率的なＲｅｐ媒介性のＡＡＶカセットの切除
および隣接するアデノウイルス配列を伴わない部位特異的組み込みが期待され、
そしてプラスミドｐＣＭＶＲｅｐ６８またはｐＣＭＶＲｅｐ７８が、対応するｒ
ｅｐ遺伝子についての供給源として用いられ得、そしてこの遺伝子をハイブリッ
ドベクターにクローニングし得る。
【０１０６】 （ベクター） ｒｅｐ／導入遺伝子カセットを、ｐＸＣＪＬ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ、Ｔｏｒｏｎ
ｔｏ）に基づいて構築し得る。コントロールのハイブリッドベクターのセットを
、ｒｅｐ遺伝子のみ含まないＡＡＶ−ＩＴＲ−導入遺伝子カセットを用いて作製
し得る。組換えＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐゲノムを、ｐＣＤ１、ｐＢＨＧ１０（Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｘ、Ｔｏｒｏｎｔｏ）誘導体との左側のシャトルプラスミドの組換え
によって作製し得る。これらの誘導体は、ｒｅｃＡ+Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＥ１
／Ｅ３領域について欠失したＡｄ５ゲノムを含む（Ｃｈａｒｔｉｅｒ，Ｃ．，ら
、１９９６、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０，４８０５−４８１０）。２９
３細胞におけるプラスミド組換えに基づいた標準的な技術と比較して、このアプ
ローチは、組換えウイルスを含むプラークが、３倍速いようであり、そして異常
な組換えの産生が最小化されるという利点を有する。これは、効率的なウイルス
ＤＮＡの増幅およびパッケージングの、Ｒｅｐ発現がアデノウイルス複製を潜在
的に抑制するレベルに達する前に生じることを可能にする。すべてのアデノウイ
ルスのウイルス性遺伝子について欠失したベクターのアウトプットの最大化にお
ける臨界変数は、感染の初期の多重度および収集の時間である。これらのパラメ
ータは、ΔＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐハイブリッドベクターの産生について最適化さ
れ得る。ｒｅｐ遺伝子を組み込んだ多くのΔＡｄ．ＡＡＶベクターが構築され得
る。アデノウイルスゲノムの５’−３４２ｎｔに存在する隠れたプロモーターお
よびエンハンサーエレメントは、異種プロモーターからの導入遺伝子発現を干渉
し得る。これは、２９３細胞におけるΔＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐゲノムからのｒｅ
ｐ発現を回避する戦略のために重大である。効率的な導入遺伝子発現を確実にす
るために、インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）フラグメント（例えば、ニ
ワトリのβグロブリンインシュレーター）が、選択されたプロモーターとともに
、構成的または誘導可能に使用され得る。
【０１０７】 （Ｒｅｐタンパク質の同時パッケージング） ｒｅｐ６８／７８遺伝子を含むハイブリッドベクターを産生するための代替と
して、Ｒｅｐタンパク質が、ΔＡｄ．ＡＡＶキャプシドに同時パッケージングさ
れ得るか否か、そしてこれらの同時パッケージングされたＲｅｐ分子が、レスキ
ューおよびＡＡＶ−ＩＴＲ−導入遺伝子カセットの部位特異的組み込みを媒介す
るに十分であるか否かを確認するために研究を設計する。本発明者らの仮説は、
Ｒｅｐ６８／７８が、二本鎖のΔＡｄ．ＡＡＶゲノムに存在するＲｅｐ付着部位
（ＲＢＳ）に付着し、そしてこの複合体が、余分なタンパク質を適応させるに十
分な広さを有するアデノウイルスキャプシドに同時パッケージングされるという
ことである。精製された粒子において以前に行われたタンパク質／ＤＮＡ比分析
に基づいて、ただ１つの５．５ｋｂのΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムが、１キャプシド
あたりパッケージされる。これは、ΔＡｄ．ＡＡＶ１粒子の電子顕微鏡によって
確認され、これは、ウイルス性コアおよび伸長した遊離の管腔空間に付着したた
だ点状の電子の密集した染色を明らかにする（図２を参照のこと）。
【０１０８】 ２９３細胞を、ＣＭＶプロモーターの下で、Ｒｅｐ６８／７８を発現するプラ
スミドでトランスフェクトし、そしてｒｅｐ発現の動力学を、トランスフェクシ
ョン後の異なる時点で収集した細胞溶解物を用いたウエスタンブロットによって
決定する。次に、これらの２９３細胞を、Ｒｅｐ発現動力学に依存したＲｅｐプ
ラスミドのトランスフェクション後の特定の時点（例えば、トランスフェクショ
ン後３、６、１２、２４−−−時間）に、Ａｄ．ＡＡＶ（ＭＯＩ １、１０、１
００ｐｆｕ／細胞）で感染する。Ａｄ．ＡＡＶ感染の時間設定を正確に行うこと
が重要である。なぜなら、Ｒｅｐ産生がピークレベルに達する前に、ウイルスＤ
ＮＡの複製が生じるか、または終了するはずであるからである。一般的に、２９
３細胞におけるアデノウイルスＤＮＡ複製（ＭＯＩ １０で感染した）は、感染
後１８時間で最大であり、その後、構造タンパク質が産生され、ウイルスゲノム
がパッケージングされ、そして細胞膜構造が破壊される（これは、〜３６−４８
時間のｐ．ｉ．に終わる）（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，１９９６，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄ
ｓら（編）、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ
−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；ｖａｎ ｄｅ
ｒ Ｖｌｉｅｔ，Ｂ．，１９９５，Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒら（編）、第２巻、１
〜３１頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）。ウイルスを、感
染から４８時間後に収集し、そしてＣｓＣｌ超遠心分離によって分離（ｂａｎｄ
）する。ΔＡｄ．ＡＡＶに対応する精製されたバンド由来のウイルス性物質を溶
解し、ＤＮＡｓｅ処理し（ＤＮＡ会合Ｒｅｐを解離するために）、そしてＲｅｐ
特異的抗体を用いて免疫沈降−ウエスタンブロットに供し、同時パッケージング
されたＲｅｐを検出する。２つのＲｅｐ分子が、１つのＡｄゲノム当たり付着す
ると仮定する理論上の計算に基づいて、〜１−１０ｎｇのＲｅｐタンパク質が、
１０10粒子の溶解物由来であると期待される。これは、ウエスタンブロットによ
る検出の範囲内である。あるいは、同時パッケージングされたＲｅｐは、レスキ
ューおよびＡＡＶＩＴＲ導入遺伝子カセットの部位特異的組み込みを媒介する機
能的活性に基づいて検出され得る。機能的Ｒｅｐタンパク質が、ハイブリッドベ
クター粒子に同時パッケージングされるか否かを試験するために、Ａｄ／ＡＡＶ
１感染後にＲｅｐを同時発現する２９３細胞において産生されたＣｓＣｌ精製Δ
Ａｄ．ＡＡＶ１粒子（ΔＡｄ．ＡＡＶ１＋Ｒｅｐ）を、形質導入研究について使
用し得る。ヒト細胞株Ｋ５６２のΔＡｄ．ＡＡＶ１＋Ｒｅｐ感染から３日後、細
胞性ＤＮＡを、ＰＣＲおよびＰＦＧＥによって、ＡＡＶＳ１特異的組み込み事象
について分析する。切除されたＡＡＶカセットの効率的なＲｅｐ媒介性部位特異
的組み込みが成功する場合、次いで、導入遺伝子としてβ−ＧａｌおよびＳＮｏ
ｒｉを含む他のΔＡｄ．ＡＡＶ＋Ｒｅｐハイブリッドベクターが産生され得る。
【０１０９】 （赤血球におけるＲｅｐベクターを用いた組み込み研究） ｒｅｐ発現ハイブリッドベクター（ΔＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐ）の理論を支持す
る仮説は、以下の通りである：（１）ΔＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐベクターからの一
過性のＲｅｐ同時発現が、ヒト細胞における部位特異的ベクター組み込みを増大
し得る、そして（２）組み込みは、ｒｅｐ遺伝子を含まないＡＡＶ ＩＴＲを介
して生じ、これは、ＡＡＶカセットの外側に位置し、従って、ベクター組み込み
の際のｒｅｐ発現を排除する。仮説１を試験するために、ΔＡｄ．ＡＡＶ／ｒｅ
ｐ対ΔＡｄ．ＡＡＶベクターの形質導入頻度を、Ｇ４１８耐性コロニーの形成に
基づいて比較し得、そしてＰＦＧＥおよびＰＣＲによるヒトおよびマウス細胞の
感染後の異なる時点の部位特異的組み込み事象を定量し得る。仮説２を試験する
ために、形質導入された細胞集団および単一のコロニーにおける組み込まれたベ
クター構造を、サザン分析およびベクター／染色体ＤＮＡ接合点の配列決定によ
って正確に概説され得る。これらの研究を、ヒトＫ５６２またはＨＥＬ細胞株（
ＡＡＶＳ１組み込みについて）およびマウスＭＥＬ細胞株において、ΔＡｄ．Ａ
ＡＶ−ｒｅｐ、ΔＡｄ．ＡＡＶおよびΔＡｄ．ＡＡＶ＋Ｒｅｐ（同時パッケージ
ングされたタンパク質）を用いて行い得る。
【０１１０】 ΔＡｄ．ＡＡＶ−ＳＮｏｒｉ、ΔＡｄ．ＡＡＶ−ＳＮｏｒｉ＋ＲｅｐまたはΔ
Ａｄ．ＡＡＶ−Ｓｎｏｒｉ−ｒｅｐを用いて感染した細胞を、Ｇ４１８選択に供
し得る。Ｇ４１８耐性コロニー数を、最初に感染した細胞の数に関して、選択の
４週間後に決定した。潜在的なｒｅｐ媒介性細胞傷害性またはエピソームのベク
ター発現に起因して、選択を継続された生存しないコロニーについての選択プロ
セスをモニターし得る。ΔＡｄ．ＡＡＶ−ＳＮｏｒｉ ｒｅｐからのｒｅｐ発現
は、細胞生存および増殖に影響を与えず、次いで、より多くのＧ４１８耐性コロ
ニーが、ΔＡｄ．ＡＡＶ−ＳＮｏｒｉ−ｒｅｐおよびΔＡｄ．ＡＡＶ−Ｓｎｏｒ
ｉ＋Ｒｅｐにおいて出現するはずである。組み込まれたベクターの構造を、サザ
ンブロットおよび組み込まれた接合点の配列決定によって決定し得る。
【０１１１】 潜在的な選択を明らかにするために、ΔＡｄ．ＡＡＶ／ｒｅｐ．部位特異的組
み込み事象およびランダムベクター組み込み事象を用いた形質導入後の細胞を産
生するｒｅｐに対する偏りを、感染後の異なる時点（例えば、０．５日、１日、
３日、７日、１４日）で細胞集団から単離した細胞性ＤＮＡにおいて定量化し得
る。これを行うために、ＰＦＧＥ−サザンに基づいた技術を利用し得る。ヒト細
胞を感染したΔＡｄ．ＡＡＶ／ｒｅｐにおけるＡＡＶＳ１特異的組み込みについ
てのシグナルが、感染後１日の間に増加し、次いで、時が経過しても一定のまま
であることが予期される。
【０１１２】 別の研究において、ベクターＤＮＡの組み込み状態（ＰＦＧＥまたはＰＣＲに
よって分析される）と、β−Ｇａｌハイブリッドベクターを用いて形質導入され
た単一のクローンにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現レベルを有する組み込ま
れたコピー数（サザンブロットによって分析される）（ΔＡｄ．ＡＡＶ−ＢＧ、
ΔＡｄ．ＡＡＶ−ＢＧ＋ＲｅｐまたはΔＡｄ．ＡＡＶ−ＢＧ−ｒｅｐ）を相関し
得る。明細書に記載される研究において得られたデータとともに、これは、転写
サイレンシングが、ＡＡＶＳ１部位への部位特異的ベクター組み込みに関連する
か否かを評価し得る。
【０１１３】 ベクターのレスキュー、コンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ）および組み込みについての特定のＲｅｐ機能が、非Ｓ期の細胞または非分裂
細胞において効率的に生じ得るか否かは明らかである。ΔＡｄ．ＡＡＶfx、ΔＡ
ｄ．ＡＡＶまたはΔＡｄ．ＡＡＶ−ｒｅｐ／＋Ｒｅｐベクターが、非分裂細胞に
組み込まれ得るか否かを試験するために、細胞周期を阻止する細胞培養物におけ
る形質導入研究が、上記のように行われ得る。
【０１１４】 （考察） 検出可能なレベルでＲｅｐ６８／７８を発現する安定な細胞株の確立は不可能
であり、これは、ｒｅｐ媒介性細胞傷害性におそらく起因する。従って、異所性
のｒｅｐ発現と組み合わせた長期の形質導入研究（例えば、単一のコロニーにお
けるＧ４１８選択または研究）を行うことは不可能である。さらに、アデノウイ
ルス複製に対するｒｅｐの阻害効果に起因して、現在、ＲＳＶまたはＰＧＫプロ
モーターの下でｒｅｐを発現するアデノウイルスベクターを生成することは不可
能である。
【０１１５】 まとめると、これは、同時発現されたＲｅｐは、部位特異的導入遺伝子組み込
みを刺激し得ることを示す。
【０１１６】 （Ｅ．赤血球細胞株におけるハイブリッドベクターの形質導入／組み込みの詳
細な研究） 赤血球細胞株へのハイブリッドベクターの形質導入および組み込み頻度を改善
するために、種々のハイブリッドベクターを比較する詳細な研究が、下記のよう
に行われなければならない。この形質導入研究を、赤血球への遺伝子転移ビヒク
ルを研究するための適切なモデルと考えられているＫ５６２細胞において行う（
Ｆｌｏｃｈ，Ｖ．，ら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ．ａｎｄ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２３，６９〜８７）。最適なベクターは、高い頻度で細胞ゲ
ノムへ組み込まれ得るはずであり、これは、実施例４に記載されるようなパルス
フィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）およびサザンブロットによって決定される
。さらに、以下の研究からの結果は、所定のハイブリッドベクターが、宿主ゲノ
ムにおける部位特異的組み込みについて改変される必要があるか否かを評価する
のに役立つ。
【０１１７】 （組み込み接合点の配列決定） ベクター組み込みについての究極の証明は、ＳＮｏｒｉベクターＤＮＡと染色
体ＤＮＡとの間の接合点の配列決定である。さらに、これは、ＡＡＶ ＩＴＲが
、組み込みのための基質を提示するか否かという問題を明らかにする。特に、公
知のΔＡｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉ組み込み構造を有する（サザンブロットによって
分析した）クローン由来のＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化した。ＥｃｏＲＩは、Ｓ
Ｎｏｒｉカセットの内部で切断しない。得られたフラグメントを円形にし、そし
て特定のＥ．ｃｏｌｉ系統に形質転換する（ＲｕｔｌｅｄｇｅおよびＲｕｓｓｅ
ｌｌによって記載されるプロトコル（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．ら、１９９７
、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：８４２９−３６）に従って
）。カナマイシン耐性細菌性クローンは、組み込まれたＳＮｏｒｉカセットを含
むはずである。レスキューされたプラスミドにおける隣接する染色体ＤＮＡを、
導入遺伝子に特異的なプライマーを用いて配列決定し得る。
【０１１８】 少数の形質導入された細胞におけるベクター組み込みを確認するために、ゲノ
ムＤＮＡを抽出し、そしてＥｃｏＲＩで消化する。ＥｃｏＲＩフラグメントを、
特定のプライマー結合部位を含むリンカーに連結し、次いで、ＮｏｔＩで消化し
、Ｅ．ｃｏｌｉ中で再連結しかつ増殖させる。代表的な数の細菌性クローン由来
のプラスミドＤＮＡを配列決定し、ベクター／染色体ＤＮＡ接合点を決定する。
【０１１９】 （用量依存性毒性） 形質導入頻度が、用量依存性であることを試験するために、ΔＡｄ．ＡＡＶベ
クター（これは、あらゆるアデノウイルス遺伝子を欠失する）を使用して、より
高い用量で、初代アデノウイルスよりも少ない細胞傷害性で細胞を感染し得る。
Ｋ５６２細胞を、異なるＭＯＩ（１〜１０8）のΔＡｄ．ＡＡＶＢＧおよび初代
ベクターＡｄ．ＡＡＶＢＧ（これは、同じβ−Ｇａｌ発現カセットを含む）で感
染する。感染から４日後、細胞総数、生細胞のパーセンテージ（トリパンブルー
排除に基づく）およびＸ−Ｇａｌ陽性細胞のパーセンテージを計数する。感染細
胞の画分を、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔキットを使用して、β−Ｇａｌ発現に
ついて計量する。導入遺伝子発現のレベルを、２つのベクター間で比較できるこ
とが期待される。Ｋ５６２細胞は、ウイルス遺伝子を発現するＡｄ．ＡＡＶＢＧ
よりも良好なより高い用量のΔＡｄ．ＡＡＶＢＧを許容すると推測される。
【０１２０】 （Ｇ４１８選択を伴う組み込み頻度およびＧ４１８選択を伴わない組み込み頻
度） 異なるベクターの組み込み頻度を研究し、そして二本鎖アデノウイルスＤＮＡ
ゲノムに存在するＡＡＶ ＩＴＲが、ｒＡＡＶベクターに匹敵する頻度で、ベク
ター組み込みを媒介し得ることを確認するために、組み込み研究を、細胞当たり
、２×１０5ゲノムおよび２×１０6ゲノムでの感染後に、ΔＡｄ．ＡＡＶＳＮｏ
ｒｉ、ＡｄＳＮｏｒｉ、Ａｄ．ＳＮｏｒｉＩＴＲおよびｒＡＡＶＳＮｏｒｉを含
むＧ４１８耐性コロニーの形成に基づいて行う（図８）。感染後、細胞を、限界
希釈の下で９６ウェルプレートにプレーティングし、そしてＧ４１８を用いて選
択して、Ｇ４１８耐性コロニーの形成の頻度を概算する。別のセットの細胞を、
Ｇ４１８を用いずにプレーティングする。代表的な数のクローン（ｗ／ Ｇ４１
８選択およびｗ／ｏ Ｇ４１８選択）を、１０6細胞を超えるまで拡張し（培養
の３〜４週間後）、そしてサザンブロットならびにＰＦＧＥ分析によって、ウイ
ルスＤＮＡの存在について分析し、エピソームベクターＤＮＡと、染色体ＤＮＡ
と安定に結合したベクターゲノムとの間を識別する。これは、本発明者らが、異
なるベクターの組み込み頻度を概算することを可能にし、組み込みについてのＧ
４１８選択の効果を評価し、そして総組み込み頻度の算出におけるｎｅｏ発現に
対する位置効果を考慮する。少なくとも１×１０-4の頻度で組み込まれたベクタ
ーコピーを、ΔＡｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉおよびｒＡＡＶＳＮｏｒｉについてのみ
予測する。コロニーの総数は、発現されたアデノウイルスタンパク質の毒性効果
に起因して、初代ベクターであるＡｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉＩＴＲおよびＡｄ．Ｓ
Ｎｏｒｉの両方においてより低いかもしれない；しかし、より高い組み込み頻度
が、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクター（Ａｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉＩＴＲ）について
予測される。
【０１２１】 （組み込みの動力学） ｒＡＡＶと比較して、ΔＡｄ．ＡＡＶゲノムに入る二本鎖の性質は、分解に対
するより強力な保護を提供する。さらに、一本鎖ゲノム由来の転写活性な二本鎖
中間体の合成（これは、ｒＡＡＶ形質導入における限定段階を考慮する）は、Δ
Ａｄ．ＡＡＶ形質導入に必要ではない。従って、ｒＡＡＶベクターを用いて見ら
れた感染と発現との間の遅れた段階（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）（これは、二本鎖合
成／組み込みに原因となって連結する）は、ΔＡｄ．ＡＡＶベクターでの感染よ
り短いか、または存在しないかもしれない。さらに、アデノウイルス粒子にパッ
ケージングされた９ｋｂのミニアデノウイルスゲノムが、感染から３日後までに
、ただ短命であり、そして完全に分解されることが以前に示された。対照的に、
５．５ｋｂのΔＡｄ．ＡＡＶ１（図１）を用いた形質導入ゲノムは、長期の発現
を可能にし、このことは、どちらのＡＡＶ ＩＴＲも、組み込まれるかまたは組
み込みが感染直後に生じるまで、エピソームのようにウイルスゲノムを安定化し
得ることを示唆する。
【０１２２】 ベクターＤＮＡの状態を、ΔＡｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉ、ＡｄＳＮｏｒｉ、Ａｄ
．ＡＡＶＳＮｏｒｉＩＴＲまたはｒＡＡＶＳＮｏｒｉ（ＭＯＩ ２×１０5）で
の感染後に、異なる時点でＫ５６２細胞において試験し得る。感染細胞を、感染
後１時間、５時間、１日、３日、７日および１４日で収集し、そして染色体ＤＮ
Ａを、ＰＦＧＥによって分析し、その後、導入遺伝子特異的プローブを用いてハ
イブリダイゼーションする。この技術により、本発明者らは、明瞭な５．０ｋｂ
のバンドとして現れるエピソームベクターＤＮＡと組み込まれたＤＮＡとの間を
識別することが可能である。さらに、余分な染色体の高分子量ベクターコンカテ
マーが検出され得る。ランダム組み込みの場合、Ｉ−ＣｅｕＩまたはＰＩ−Ｓｃ
ｅＩを用いた染色体ＤＮＡの消化後に、１〜２ｍｂの範囲のベクター特異的シグ
ナルが観察されるはずである。エピソームおよび組み込まれたベクターシグナル
の強度を、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）分析を使用して
、各々の時点について定量する。これは、感染したＫ５６２細胞の集団における
ハイブリッドベクターの組み込みの動力学についての情報およびハイブリッドベ
クターゲノムの細胞内安定性についての情報を与える。
【０１２３】 （組み込まれたベクターＤＮＡおよび染色体ＤＮＡとの組み込み接合点の構造
） ΔＡｄ．ＡＡＶ１は、以前に示されるように、コンカテマーとして宿主ＤＮＡ
にランダムに組み込む。どれくらい多くのベクターコピーが、１つのコンカテマ
ーに存在し、そしてタンデム形成の程度および動力学が、用量依存性であるか否
かは、いまだ不確かなままである。別の答えの出ていない疑問は、どのようにΔ
Ａｄ．ＡＡＶが組み込むのか：１つまたは両方のＩＴＲが関与するのか否か、組
み込まれたＩＴＲが、なおインタクトであるか否か、そしてアデノウイルス配列
が、同様に組み込むのか否か、である。これらの問題は、ハイブリッドベクター
ゲノムへｒｅｐ遺伝子を含める戦略に重要である。さらに、インタクトなＡＡＶ
ＩＴＲが、組み込まれたベクターコピー内に存在する場合、インビボでのヘル
パーウイルス（アデノウイルスまたはＨＳＶ）感染は、組み込まれたＡＡＶ−Ｉ
ＴＲベクターカセットを起動し得、そして導入遺伝子発現の安定性に影響を及ぼ
し得る。
【０１２４】 これらの疑問に答えるために、Ｋ５６２細胞を、ΔＡｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉ、
ＡｄＳＮｏｒｉ、Ａｄ．ＡＡＶＳＮｏｒｉＩＴＲおよびｒＡＡＶＳＮｏｒｉで、
細胞当たりＭＯＩ ２×１０5、２×１０6または２×１０7ゲノムで感染し得る
。感染細胞を、Ｇ４１８の存在または非存在下で、９６ウェルプレートにプレー
ティングする。Ｇ４１８の非存在下でのプレーティングも含まれる。なぜなら、
Ｇ４１８は、組み込まれたベクターＤＮＡの増幅を引き起こし得るからである（
Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．ら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，７１：８４２９−３６）。単離されたクローン由来のゲノムＤＮＡを、
実施例の節に記載されるように、通例のサザンブロットによって分析し、ベクタ
ーコンカテマーの存在を確認し得、そして組み込まれたベクターコピー数を算出
し得る。組み込まれたベクターコピーおよび染色体ＤＮＡとのその接合点の配列
決定がより有益である。組み込み接合点の構造は、ベクター組み込みにおけるＡ
ＡＶ ＩＴＲの役割および形質導入後の挿入的な変異誘発の程度を使用して、明
確にされ得る。このデータは、臨床試験に使用されるハイブリッドベクターの潜
在的な危険性についての情報を提供する。
【０１２５】 （細胞周期停止細胞の形質導入） 本明細書中に記載されるハイブリッドベクターに対する最終的な標的は、静止
性造血幹細胞である。本発明者らは、ΔＡｄ．ＡＡＶゲノムの二本鎖の性質およ
び特定の核内移行機構は、非分裂細胞の形質導入を可能にし得るということを仮
定している。このことは、インビボでの静止性肝細胞におけるΔＡｄ．ＡＡＶ１
を用いる形質導入研究によって部分的に支持されている。このデータを確認する
ために、初期の線維芽細胞は、Ｒｕｓｓｅｌ（Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄら、１９９５、
ＰＮＡＳ，９２：５７１９−２３）によって記載されるプロトコルに従ってハイ
ブリッドベクターを感染させる前の血清／増殖因子飢餓によってＧ0期に入るこ
とを余儀なくされ得る。細胞は、血清／増殖因子剥奪下で感染後３日間維持され
る。この時点において、ゲノムＤＮＡを単離し、そして増殖細胞との比較におい
てＰＦＧＥにより組み込み事象について分析される。別系列の組み込み研究は、
アフィディコリン（以前に記載された組み込み反応速度論に依存するハイブリッ
ドベクターでの感染の１日前に添加し、そして感染後、数日間維持される）で細
胞周期のＧ1／Ｓ期で停止されているＫ５６２細胞について実施され得る。ＤＮ
Ａ損傷薬剤が、ハイブリッドベクターの形質導入頻度が増加するか否かを調べる
ために、細胞周期停止Ｋ５６２細胞または初期の線維芽細胞を、Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒおよびＲｕｓｓｅｌ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｅ．ら、１９９４、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．，６８：８２８２−８７；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄら、１９９５、ＰＮＡ
Ｓ，９２：５７１９−２３）により記載されるプロトコルに従うウイルス感染の
前に、シスプラチンまたは3Ｈ−チミジンで処理し得る。さらに、ハイブリッド
ベクターの形質導入効率に対する染色体ＤＮＡ脱圧縮（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓａｔ
ｉｏｎ）の効果は、ピューロマイシン、スタウロスポリン、ヘキスト３３２８、
ディストラマイシン（ｄｉｓｔｒａｍｙｃｉｎ）またはバンデート（ｖａｎｄａ
ｔｅ）処理後の停止細胞において研究され得る。
【０１２６】 （Ｆ．ΔＡｄ．ＡＡＶ産生および精製における改善） 全長ゲノムのパッケージングを阻害するために、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉの改変された
形態（非パリンドローム１８ｂｐ認識配列を有する酵母ミトコンドリアイントロ
ンエンドヌクレアーゼは、２９３細胞において発現される。哺乳動物細胞におけ
るこの酵素の構成的な発現は、おそらく、ゲノムにおけるＩ−Ｓｃｅ Ｉ部位の
欠如またはそれらの十分な修復いずれかに起因して、毒性ではない（Ｒｏｕｅｔ
Ｐら、１９９４、ＰＮＡＳ．９１：６０６４−８）。酵母Ｉ−Ｓｃｅ Ｉは、
ＳＶ−４０抗原核局在化シグナルおよび最適なＫｏｚａｋ配列で改変されて、哺
乳動物細胞におけるその機能を増強させる（Ｒｏｕｅｔ Ｐら、１９９４．ＰＮ
ＡＳ．９１：６０６４−８）。別の酵母エンドヌクレアーゼについて、形質導入
されたＡｄゲノム内の認識部位は、ヒトＡ５４９細胞内で発現された場合、有効
（全ての形質導入されたゲノムの３０％）であったということが示された。重要
なことには、形質導入されたＡｄゲノムから発現されたＥ４ ＯＲＦ６およびＯ
ＲＦ３の発現は、エンドヌクレアーゼにより媒介される二本鎖破壊修復を阻害し
た（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ａ．Ｌら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６６：２１１
−２４）。このことは、他のものによる観察と一致し、ここでこれらのＥ４タン
パク質は、ウイルスゲノムのコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ）を防止する（Ｂｏｙｅｒ，Ｊら、１９９９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６３：
３０７−１２）。このことに基くと、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ認識部位を含む全長ウイル
スのパッケージングは、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉを構成的に発現する２９３細胞において
減少される。その１８マーのＩ−ＳｃｅＩ部位を、Ａｄ．ＩＲベクターのＥ３領
域内へ挿入する。これらのベクターは、２９３細胞において生成されて、そして
増幅され、次にＩ−ＳｃｅＩを発現する２９３細胞の大規模（ｌａｒｇｅ−ｓｃ
ａｌｅ）感染が行われる。あるいは、エンドヌクレアーゼＸｈｏＩに対する発現
カセットを、Ａｄ．ＩＲまたはＡｄ．ＡＡＶベクターのＥ３領域内に挿入する。
ＸｈｏＩ遺伝子は、哺乳動物細胞内で最適な機能について改変される。ＸｈｏＩ
を発現するベクターは、ＸｈｏＩイソシゾマーＰａｅＲ ７メチルトランスフェ
ラーゼ（ＰＭＴ）を発現する２９３細胞において、生成され、そして増幅される
（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｅら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：８９０２−７
）。これは、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）のアデニン塩基のＮ６位上へのメチ
ル基の付加を媒介する。これは、ＸｈｏＩ切断から、ウイルスおよび細胞ゲノム
を保護する。メチル化Ａｄベクターを高い力価において産生する。次いで、ΔＡ
ｄ．ＡＡＶベクターを２９３細胞をＡｄ．ＡＡＶ−ＸｈｏＩベクターで大規模感
染することによって得る。この段階において、ウイルスゲノムは、メチル化され
ず、そしてＸｈｏＩ部位にて消化される。導入遺伝子カセット内に存在するＸｈ
ｏＩ部位は、アミノ酸配列の変更を伴わずに、部位定方向突然変異誘発により検
出される。（ＸｈｏＩは、ウイルス複製における後期段階においてのみ蓄積され
て、そして複製が終了した場合に、大部分のＡｄ ＤＮＡに対してのみ作用する
はずである。さらに、超遠心分離は、ΔＡｄ．ＩＲとΔＡｄ．ＩＲ粒子との間の
分離を最適化する（Ｂｌａｇｕｅ，Ｃら、２０００、Ｂｌｏｏｄ．９５：８２０
−８）。
【０１２７】 （実施例ＩＩ） （改変型ファイバータンパク質） （Ａ．ヒト骨髄細胞に対する、異なるヒト血清型または動物血清型の感染性の
試験） ファイバーノブ領域のアミノ酸配列は、〜５０の公知の血清型の中でかなり変
わるので、異なるアデノウイルス血清型は、異なる細胞レセプタータンパク質と
結合するか、または異なる侵入機構を使用するということが考えられる（Ｓｈｅ
ｎｋ，Ｔ．，１９９６，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，第２巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；Ｍａｔｈｉａｓ．Ｐら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８：６８１１−１４；Ｄｅｆｅｒ，Ｍら、１９
９３、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６４、３６６１−３６７３）。ほとんどの
アデノウイルスは、ペントン塩基タンパク質内にＲＧＤモチーフを含むが、この
保存された配列を伴わない多数の血清型（例えば、Ａｄ ４０、４１）が存在す
る。これらの型は、ウイルスのインターナリゼーションのためにインテグリン□
ｖ−非依存性経路を使用し得る（Ｄａｖｉｓｏｎ．Ａ．Ｊら、１９９３、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３４、１３０８−１３１６；Ｍａｔｈｉａｓ，Ｐら、１９
９４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８：６８１１−１４）。ヒ
ト骨髄に存在する他のＡｄ血清型が幹細胞亜集団に感染し得るか否かを試験する
ために、一連の異なるヒトＡｄ血清型および動物ウイルスについての研究が実施
され得る（表ＩＩを参照のこと）。Ａｄ血清型を用いる効率的な形質導入を立証
するための手段として、ウイルスＤＮＡを感染の前にタグ化し、そして形質導入
細胞の核内のウイルスゲノムの存在を調査する。さらに、ウイルスＤＮＡが、形
質導入細胞内で複製されるか否かは、初期のウイルス遺伝子発現についての間接
的な証拠として分析され得る。発現されたウイルスタンパク質の直接検出は、本
研究において含まれる全ての血清型に対する抗体の利用不能性に起因して不可能
である。感染アッセイと同時に、形質導入されたヒト骨髄細胞を、ＨＳＣまたは
先祖亜集団に特徴的な形態学的特徴および免疫組織化学的特徴について分析し得
る。再び標的化するために、最も低いＭＯＩにて骨髄細胞のＣＤ３４＋サブセッ
トに感染し得る血清型を選択する。次の工程と同様に、ファイバー遺伝子が、潜
在的ＨＳＣ／ＣＤ３４＋親和性を有する血清型からＰＣＲクローン化し、そして
Ａｄ５ベクター生成のための標準的なシャトルプラスミド内へ挿入し、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ組換え系を使用して、Ａｄ５遺伝子を複製する（図９）。
【０１２８】 （方法） （細胞およびウイルス） Ｈｅｌａ（ヒト頸癌、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２）、ＣＨＯ（チャイニーズハ
ムスター卵巣、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、Ｋ５６２（ヒト造血、ＡＴＣＣ ４
５５０６）、ＨＥｐ−２（ヒト喉頭癌、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２３）、２９３（ヒ
ト胚性腎臓、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｃａｎａｄａ）細胞をＤＥＭ
Ｅ、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中に維持した。
ＣＨＯ細胞のための培養培地を、２００μＭアスパラギンおよび２００μＭプロ
リンと共に補充した。ヒトＣＤ３４＋富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）骨髄細胞を、製
造業者の指示に従って、ＭｉｎｉＭＡＣＳ ＶＳ+分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙ
ｉ Ｂｉｏｔｅｃ．Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して可動化した後、末梢血から
精製した。アリコートを液体窒素中に保存した。実験の１６時間前に、細胞を凍
結ストックから回収し、そして２０％ＦＣＳ、１０-4Ｍ β−メルカプトエタノ
ール、１００μｇ／ｍｌ ＤＮＡａｓｅＩ、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌ
ＩＬ−３、および５０ｎｇ／ｍｇ幹細胞因子（ＳＣＦ）または２ｎｇ／ｍｌトロ
ンボポエチン（Ｔｐｏ）を補充されたＩＭＤＭ培地中で一晩インキュベートした
。ＣＤ３４＋調製物の純度を、フローサイトメトリーにより確認し、そしてその
純度は、一貫して９０％よりも高かった。
【０１２９】 （フローサイトメトリー） 非組織培養処理された１０ｃｍシャーレ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ
Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において増殖した接着細胞（ＣＨＯ、Ｈｅｌａ）を１ｍＭ
ＥＤＴＡを用いて処理することによって剥離させ、そして１％ＦＣＳを補充され
たＰＢＳからなる洗浄緩衝液（ＷＢ）で３回洗浄した。懸濁物（Ｋ５６２、ＣＤ
３４＋）中で増殖した細胞をＷＢを用いて３回洗浄した。洗浄後、細胞を２×１
０6細胞／ｍｌにてＷＢ中に再懸濁した。２×１０4細胞を、３７℃にて１時間、
αv−インテグリン[Ｌ２３０、ＡＴＣＣ：ＨＢ−８４４８．（Ｒｏｄｒｉｇｕｅ
ｚ，Ｅ．，Ｅｖｅｒｉｔｔ，Ｅ．１９９９．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４４：７
８７−７９５）（１／３０最終希釈）、ＣＡＲ[ＲｍｃＢ（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ
，Ｊ．Ｍら、１９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７５：１３２０−１３２３；Ｈｓｕ
，Ｋ．−Ｈ．，Ｌら、１９８８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２：１６４７−１６
５２）（１／４００最終希釈）]、またはＢｒｄＵ[（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌ
ｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）（１／１００最終希釈）]に特異的なモ
ノクローナル抗体と共にＷＢ中でインキュベートした。引き続き、細胞をＷＢで
洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化ウマ抗マ
ウスＩｇＧ抗体[（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ．ＣＡ）
（１／１００最終希釈）]またはフィコエリトリン（ＰＥ）標識化ヤギ抗マウス
ＩｇＧ抗体[（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）１：１００希
釈]と共に４℃にて３０分間インキュベートした。二次抗体を用いてインキュベ
ートした後、細胞をＷＢで２回洗浄し、そしてサンプル毎に１０4細胞を、フロ
ーサイトメトリーにより二連で分析した。
【０１３０】 形質導入されたＣＤ３４＋細胞に対するＣＤ３４およびｃ−ｋｉｔ発現の分析
ならびに蛍光性活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）のために、精製されたヒトＣＤ３４
＋細胞を、製造業者のプロトコルに従って、フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化
抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）
またはＰＥ標識化抗−ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）モノクローナル抗体（ＭＡｂ
９５Ｃ３、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍａｒｓ
ｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）と共にインキュベーションし、次にフローサイトメ
トリー分析を行った。全ての分析および分類分けを、４８８ｎｍアルゴンレーザ
ーおよび６３３ｎｍＨｅＮｅレーザーを装備するＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓ ｆ
ｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ．Ｆｒａｎｋ
ｌｉｎ Ｌａｋｅｓ．ＮＪ）に対して行った。ＣＤ３４＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞の
ｃ−ｋｉｔ発現およびＦＡＣＳ精製の分析のために、ＣＤ３４＋細胞の培養の間
ＳＣＦを培地に添加しなかった。
【０１３１】 （結果） （試験細胞に対するＣＡＲ／αv−インテグリン発現） 一般的に、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄再増殖活性を所有するということが認めら
れている。従って、本発明者らは、ＨＳＣ親和性を有するＡｄ血清型を同定して
、そして新しいウイルスベクターを構築するために本発明者らの研究の標的とし
てヒトＣＤ３４＋細胞を使用した。研究を、ＣＤ３４＋細胞を静止期に維持する
ことが公知である条件下で、動員されたＣＤ３４陽性の末梢血細胞（一人のドナ
ーに由来する）に対して実施した（Ｌｅｉｎｅｒ，Ａら、１９９６．Ｂｒ．Ｊ．
Ｈａｅｍａｔｏｌ．９２：２５５−２６２；Ｒｏｂｅｒｔｓ．Ａ．Ｗ．，Ｍｅｔ
ｃａｌｆ．Ｄ．１９９５．Ｂｌｏｏｄ．８６：１６００−１６０５）。９０％よ
りも多くの精製された細胞は、フローサイトメトリーによりＣＤ３４陽性であっ
た。さらに、本発明者らは、本発明者らのＡｄ親和性研究に細胞株Ｋ５６２（こ
れは、ヒト造血細胞への遺伝子導入を研究するための適切なモデルであると考え
られている）を含めた（ＭｃＧｕｃｋｉｎら、１９９６．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，９５：４５７−４６０）。ＨｅＬ
ａ細胞（これは、Ａｄ５により容易に感染可能である）およびＣＨＯ細胞（これ
は、Ａｄ５感染に不応性である）（Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｍら、１９９８、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６：７２１−９）をそれぞれ、陽性コントロ
ール細胞株および陰性コントロール細胞株として使用した。
【０１３２】 Ａｄ５に関して、本来のレセプターならびにα3β5およびαωβ5インテグリ
ンの両方に結合することは、標的細胞の高い効率の感染のために重要である。試
験細胞上のＣＡＲおよびαvインテグリンの発現を、ＣＡＲ（ＲｍｅＢ（Ｂｅｒ
ｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍら、１９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７５；１３２０−１３
２３；Ｈｓｕ，Ｋ．−Ｈ．，Ｌら、１９８８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２：１
６４７−１６５２））およびαvインテグリン（Ｌ２３０（Ｒｏｅｌｖｉｎｋ．
Ｐ．Ｗら、１９９６．Ｊ．ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：７６１４−７６２１））に
対するモノクローナル抗体を使用してフローサイトメトリーにより分析した（図
１０）。予期されるように、ほとんど全てのＨｅＬａ細胞は、高いレベルのＣＡ
Ｒおよびαv−インテグリンを発現したが、ＣＨＯ細胞は、有意なＣＡＲおよび
αv−インテグリン発現を欠如した。１５％および７７％のＫ５６２細胞は、そ
れぞれＣＡＲおよびαv−インテグリンを発現した。本発明者らの研究において
使用された〜６％のＣＤ３４＋細胞のみが、ＣＡＲを発現し、そして１７％が、
αv−インテグリンについて陽性であった。特に、ＣＤ３４＋細胞の調製は、異
なる細胞型の混合物を示す。非細胞周期性（ｎｏｎ−ｃｙｃｌｉｎｇ）ヒトＣＤ
３４＋細胞上の一次Ａｄ５レセプターおよび二次Ａｄ５レセプターの非存在また
は少ない発現は、以前の報告と一致している（Ｈｕａｎｇ，Ｓら、１９９６．Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：４５０２−４５０８；Ｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓ．Ｊら、
１９９６．．Ｂｌｏｏｄ．８８：１１４７−１１５５；Ｔｏｍｋｏ，Ｒ．Ｐら、
１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：３３５２−
３３５６）。
【０１３３】 （野生型Ａｄ５およびＫ５６２細胞を使用する、感染アッセイ） 感染細胞の核におけるウイルスＤＮＡの存在は、効率的なウイルス付着、イン
ターナリゼーション、および核輸送を実証するための間接的な手段である。ウイ
ルスゲノムの核限局化は、導入遺伝子転写および組み込みのために必須である。
２つの技術を利用して、インサイチュ分析のためにウイルスＤＮＡをタグ化する
。感染アッセイを最適化するために、野生型Ａｄ５ウイルスおよびＡｄ５感染を
許容するＫ５６２細胞を使用し得る。第１のプロトコル（Ｃｈａｌｂｅｒｇ，Ｓ
．Ｓ．およびＫｅｔｎｅｒ，Ｓ．１９８１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１４、１９６
−２０９）は、ウイルスＤＮＡの32Ｐ標識に基いている。野生型Ａｄ５およびＡ
５４９細胞の増幅の間、32Ｐ−ホスフェート（４０μＣｉ／ｍｌ）をホスフェー
トを含まない培地に添加する。ＣＰＥの発生後、32Ｐ−タグ化ウイルスを収集し
、ＣｓＣｌ勾配において帯状（ｂａｎｄ）にし、標準的なプロトコルに従ってＨ
ｅＬａ細胞に対して力価を測定した。ヒト骨髄細胞の感染のための状態を刺激す
るために、Ｋ５６２細胞を、３７℃における攪拌下で２、４、６または８時間、
１、１０または１００の32Ｐ−Ａｄ５のＭＯＩを有する懸濁物においてインキュ
ベートする。これは、吸収、インターナリゼーションおよび核輸送のために必要
な期間をカバーする。洗浄後、細胞を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）を使
用して顕微鏡スライドに移すか、またはパラフィン中に包理するかのいずれかに
よって固定し、そして切片にする（ＶＥＣＴＯＲ実験室、Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ
，ＣＡに由来するプロトコルに従って）。後者は、同じ細胞の複数の連続切片（
５μｍ）を、異なる方法により分析し得る（例えば、32Ｐタグ化ウイルスＤＮＡ
について、特定の組織学的染色について、免疫蛍光法について）という潜在的な
利点を有し、これは感染を骨髄に存在する特定の細胞型に相関させることを可能
にする。細胞をオートラジオグラフィーのためにＫｏｄａｋ ＮＴＢ−２写真乳
剤中でインキュベートする。露光時間（ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｉｍｅ）を最適化
して、バックグランドまたは非核局在化シグナルを最小にする。核の銀色粒子の
線量（ｄｏｓｅ）および時間依存性の出現は、最適化された条件下で予期される
。32Ｐ−ホスフェートは、ウイルスタンパク質を同様に標識するので、細胞質バ
ックグランドシグナルが出現し得る。検出を促進ために、切片についてＨＳＣ特
異的抗体で免疫蛍光を実施し得る。代替的方法として、ウイルスＤＮＡについて
ＢｒｄＵ−標識技術を使用し得る（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒ
ｏｌ ７３：９３１４−２４；Ｌｉｅｂｅｒ，Ａら、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７０：８９４４−６０）。この場合において、ｗｔ
Ａｄ５ウイルス増殖の間、異なる量のＢｒｄＵをＡ５４９培養培地に添加する。
ＢｒｄＵ標識化ウイルスＤＮＡは、ＢｒｄＵに対して特異的なモノクローナル抗
体を用いて検出され得る。そのシグナルは、ビオチン／アビジンおよび蛍光マー
カーを組み合わせて、種特異的ポリクローナル抗体の層を使用して増強され得る
。ＢｒｄＵタグ化ウイルスＤＮＡは、２重または３重の免疫蛍光によって、細胞
表面マーカーと一緒に骨髄細胞のサイトスピン上に検出され得る。
【０１３４】 （考察） 選択されたＡｄ血清型とＣＤ３４＋細胞との相互作用を試験した。このスクリ
ーニングの結果として、本発明者らは、第一世代（Ａｄ３５に由来するファイバ
ーで置換されたＡｄ５ベースのベクター）を構築した。本発明者らは、このカプ
シド改変が、対応するキメラＡｄベクターによる潜在的なＨＳＣの効率的ウイル
ス形質導入を可能にしたことを実証した。
【０１３５】 全ての親和性および形質導入研究を、ＨＳＣを含むと考えられる非細胞周期性
（ｎｏｎ−ｃｙｃｌｉｎｇ）ＣＤ３４＋細胞を用いて実施した。動員血液から精
製した静止期のＣＤ３４＋細胞は重要である。なぜなら、細胞増殖の誘導は、造
血を再構成する能力の欠如および細胞レセプターのスペクトル変化に関連するか
らである（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｐ．Ｓら、１９９９．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７
：５３３−５４１）。サイトカインまたは増殖因子を用いる造血細胞の処理が、
αv−インテグリンを含む特定のインテグリン（これは、Ａｄ感染に対する細胞
の感受性を最終的に変更するか、または感染細胞の生存に影響を及ぼし得る）の
発現を変えるということが公知である（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒら、１９９９．Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．６：３１４−３２０；Ｈａｎｇ，Ｓら、１９９５、Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６９：２２５７−２２６３）。形質導入研究の解釈を複雑
にする別の事実は、形態学および機能に関してＣＤ３４＋細胞の異常な不均一性
である。
【０１３６】 （Ｂ．ＨＳＣに対する親和性を確立するための異なるアデノウイルスのスクリ
ーニング） ＡＴＣＣは、７０よりも多くのヒトアデノウイルスまたは動物アデノウイルス
を提供する（付録（Ａｐｐｅｎｄｉｘ）Ｉを参照のこと）。１５ヒト血清型およ
び６動物アデノウイルスの収集（表ＩＩ参照のこと）は、以下の判定基準に基い
て選択される：（ｉ）ＮＩＨ遺伝子バンク（ｂａｎｋ）に由来する完全ゲノム配
列またはファイバー配列の有効性（ｉｉ）ＣＡＲレセプター使用が非存在または
未知であること（ｉｉｉ）異なるサブグループ、および（ｉｖ）中程度または低
い腫瘍形成能（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，１９９６，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄら、（編）、
Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。しかし、この点に関して
、付録において示される任意の血清型を、記載される本発明のために使用し得る
。動物ウイルスは、感染性アッセイに含まれる。なぜなら、これは、ヒトＡｄ５
ファイバーに対する予め存在している体液性免疫（これはＡｄベクターを用いる
臨床試験について重大な障害を表わす）を回避する手段を提供し得るからである
。
【０１３７】 （方法） （ウイルス） 以下のヒトアデノウイルス血清型を、ＡＴＣＣ：３（ＶＲ−３）、４（ＶＲ１
０８１）、５（ＶＲ−５）、９（ＶＲ１０８６）、３５（ＶＲ−７１６）および
４１（ＶＲ−９３０）から購入した。アデノウイルス番号ＶＲ−７１６を血清型
３４と標識されたＡＴＣＣから購入した。しかしファイバー領域を配列決定する
際に、血清型３５であることが見出された。増幅のために、対応するＡｄｓを、
相互汚染（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）を予防した条件下で、Ｈ
ｅＬａ細胞、２９３細胞、またはＨＥｐ−２細胞に感染させた。ウイルスを、Ｃ
ｓＣｌ勾配において帯状にし、透析し、そして他で記載されるようなアリコート
において貯蔵した（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，Ｃ−Ｙら、１９９６．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：８９４４−８９６０）。プラーク力価測定を
以下のように実施した：６ウェルプレートにプレートされたコンフルエントな２
９３細胞を総容量１ｍｌにおいてウイルスと共に２４時間インキュベートした。
感染させてから２週間後、１％アガロース／ＭＥＭ／１０％ＦＣＳ．０をオーバ
ーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）した培地上でプラークを計数した。
【０１３８】 （ＥＭ研究） ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｅｄ）Ａｄストックを解凍し、そして０．５％グ
ルタルアルデヒドで希釈した。グリッド（ｇｒｉｄ）を以前に記載されたように
調製した（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ，Ｎら、１９９６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７
０：７４９８−７５０９）。２％タングステン酸メチルアミン（Ｎａｎｏｐｒｏ
ｂｅｓ，Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ，ＮＹ）で染色後、カーボンコートしたグリッ
ドをＰｈｉｌｌｉｐｓ４１０電子顕微鏡で調べて、そして顕微鏡写真を撮った（
８０ｋＶにて操作した（最終倍率８５，０００×））。各々の特定のＡｄ血清型
について、１００粒子当たりの形態学的に欠損しているウイルス粒子の数を、５
つの無作為な視野（ｆｉｅｌｄ）において計数した。
【０１３９】 （結果） （電子顕微鏡検査） Ａｄ５以外の血清型に由来する粒子の安定性についてはほとんど知られていな
い。ウイルス粒子の完全性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）は、比較相互作用研究のた
めに非常に重要であったという理由で、上記の特定の血清型に由来するビリオン
を、電子顕微鏡（ＥＭ）より分析した。陰性コントラスト（ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒａｓｔ）染色したＡｄ懸濁物のＥＭ研究は、不完全粒子の割合（正二
十面体形状またはルミナル（ｌｕｍｉｎａｌ）染色の欠如）は、５％を超えなか
ったということを実証し、これは、血清型調製物が、同等の性質を有したことを
示した。代表的なＥＭ写真は、Ａｄｓ５、９、および３５（図１１）について示
される。
【０１４０】 （血清型スクリーニング） 異なるＡｄ血清型は、異なる細胞レセプタータンパク質に結合し、異なる侵入
機構を使用すると考えられる（Ｄｅｆｅｒ，Ｃら、Ｐ．１９９０．Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ．６４：３６６１−３６７３；Ｍａｔｈｉａｓ．Ｐら、１９９４．Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６８：６８１１−６８１４）。ヒトアデ
ノウイルスのセットを、ＣＤ３４＋細胞に対する親和性について試験されるべき
ＡＴＣＣから入手した。これらは、異なるサブタイプを表わす血清型３、４、５
、９、３５および４１を含んだ（表１）。本発明者らは、これらの血清型は、フ
ァイバーシャフト（ｆｉｂｅｒ ｓｈａｆｔ）の異なる長さ（Ｃｈｒｏｂｏｃｚ
ｅｋ，Ｊら、１９９５．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｉｂｅｒ，Ｐ．１６３−２０
０．ａ．Ｐ．Ｂ．Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ（編）、Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、第１巻、Ｓｐｒｉｎｇ
Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ；Ｒｏｅｌｖｉｎｋ，Ｐ．Ｗら、１９９８．Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ．７２：７９０９−７９１５）、ペントン塩基内のＲＧＤモチー
フの存在もしくは非存在、および異なる組織親和性に起因して異なる細胞接着お
よびインターナリゼーションストラテジーを有すると考えた。相対的にほとんど
特徴付けられていないＡｄ３５を選択した。なぜなら、それは免疫無防備状態の
宿主（特に、骨髄レシピエントにおいて）において見出されていたからである（
Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇ，Ｐら、１９９４．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．１６９：７７５−７８１；Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇ
，Ｐ．Ｒら、１９８７．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ．１５５：１１２７−１１３４；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ａ．Ｆら、１９８
５ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３１
２：５２９−５３３）。後者の知見は、本発明者らが、骨髄細胞はＡｄ３５につ
いての天然レザバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の中にあると考えることを促した。
【０１４１】
【表２】 増幅のために、所定の時間において１つのウイルス型のみが別個の層流フード
において処理され、そしてＨｅｐａフィルター濾過されたビン、優先的に、相互
汚染を避けるために別個のＣＯ2インキュベーターにおいて培養されるように、
対応するアデノウイルスストックをＨｅＬａ細胞またはＡ５４９細胞に感染させ
得る。増殖の間、ウイルスＤＮＡを、以前に記載された技術の１つを使用してタ
グ化する。ウイルスＤＮＡは、精製された粒子から単離され得る。ＸｈｏＩ制限
パターンを、放射性プローブとして対応するウイルス型の完全なゲノムを使用す
るサザンブロットによって、メチル化されたウイルスＤＮＡおよび非メチル化さ
れたウイルスＤＮＡについて分析する。
【０１４２】 （考察） ２、９、４、および４１Ｌ由来のファイバーノブがＣＡＲに結合し得ることが
スロットブロットアッセイによってより早くに報告されたが（Ｒｏｅｌｖｉｎｋ
，Ｐ．Ｗ．ら、１９８８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２：７９０９−７９１５）
、この結合が、生理学的に関連性がある親和性を用いて生じるのか否か、および
この付着が、細胞侵入を付与するのか否かが明らかではない。さらに、ペントン
とインテグリンとの間のＡｄ５相互作用について示されたように、第２のレセプ
ターが、ウイルスのインターナリゼーションを誘導するのに必要である。本発明
者らは、異なる血清型が、Ｋ５６２標的細胞またはＣＤ３４＋標的細胞と異なっ
て相互作用したことを実証した。Ａｄ５、Ａｄ４、およびＡｄ４１は、Ｋ５６２
細胞およびＣＤ３４＋細胞に効率的に付着し得ず、そしてこれらの細胞によって
インターナリゼーションし得なかった。Ａｄ４は、別個のサブグループ（Ｅ）に
属するが、Ａｄ４は、Ａｄ５に関連するファイバーを有するサブグループＢウイ
ルスとＣウイルスとの間の天然の雑種を示す（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｗ．Ｃ．ら、１９
９３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９６：６０３−６１１）。従って、Ａｄ４がＡｄ５
に類似の付着特性を有することは、驚くべきことではなかった。サブグループＦ
のＡｄ４１の血清型は、異なるファイバー（長ファイバーおよび短ファイバー）
を含むことが示された。これらのファイバーは、異なる細胞侵入経路を可能にす
る（Ｔｉｅｍｅｓｓｅｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｋｉｄｄ，Ａ．Ｈ．１９９５，Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．７６：４８１−４９７）。Ａｄ４１ペントン塩基は、ＲＧＤモチ
ーフを含まない。このことは、このウイルスが、細胞侵入のためのαv−インテ
グリン独立性経路を使用し得ることを示唆する。しかし、これらの特徴は、ＣＤ
３４＋細胞との相互作用を改善しなかった。Ａｄ９、Ａｄ３、およびＡｄ３５は
、Ａｄ５よりも効率的にＣＤ３４＋細胞と相互作用した。試験した全ての血清型
以外に、Ａｄ３５は、最も効率的な付着およびＫ５６２細胞およびＣＤ３４＋細
胞とのインターナリゼーションを実証した。短Ａｄ９は、ＣＡＲに付着し得るが
、細胞侵入のためにαv−インテグリンを優先的に使用する（Ｒｏｅｌｖｉｎｋ
，Ｐ．Ｗ．ら、１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：７６１４−７６２１）
。従って、ＣＤ３４＋細胞の特定のサブセットでの低レベルのαv−インテグリ
ン発現は、Ａｄ９に対する観察された感受性について説明し得る。
【０１４３】 （Ｃ．Ａｄ血清型のＫ５６２細胞およびＣＤ３４＋細胞への付着およびインタ
ーナリゼーション） （方法） （Ａｄの［3Ｈ］−メチルチミジンでの標識） 血清型は、他に詳細に記載のように［3Ｈ］−メチルチミジンで標識した（Ｒ
ｏｅｌｖｉｎｋ，Ｐ．Ｗ．ら、１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：７６１
４−７６２１）。簡潔には、５×１０7ＨｅＬａ細胞または２９３細胞を、１５
ｍｌ ＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳを含む１７５ｓｑ．ｃｍのフラスコにおいて増
殖し、そして５０以上のＭＯＩで野生型アデノウイルスで感染した。感染から１
２時間後、１ｍＣｉの［3Ｈ］−メチルチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を、この培地に添加し、そして細胞をさら
に完全なＣＰＥが観察されるまで３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を
、収集し、ペレット化し、冷ＰＢＳで１回洗浄し、そして５ｍｌのＰＢＳ中に再
懸濁した。ウイルスを、４回の凍結融解サイクルによってこの細胞から放出した
。細胞の破片を、遠心分離によって除去し、そしてウイルス物質をＣｓＣｌ勾配
における超遠心分離に供し、かつその後、以前に記載のような透析に供した（Ｌ
ｉｅｂｅｒ，Ａ．，Ｃ．−Ｙ．ら、１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ．７０：８９４４−８９６０）。ウイルス精製および透析により、取り
込まれなかった放射能を除去した。野生型のＡｄ粒子濃度を、野生型Ａｄ５につ
いての吸光係数 ε260＝９．０９×１０-13ＯＤｍｌ ｃｍ ビリオン-1を利用
して）ＯＤ260を測定することによって分光光学的に決定した。（Ｍａｉｚｅｌ
，Ｊ．Ｖ．ら、１９６８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３６：１１５−１２５）。ビリオ
ン特異的放射能活性を、液体シンチレーションカウンターによって測定し、そし
て常に１×１０-5〜１×１０-4ｃｐｍ／ビリオンの範囲であった。選択された改
変体について、ファイバー遺伝子を、ＰＣＲ増幅し、そして配列決定して、交差
汚染（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の同定および非存在を確実に
した。
【０１４４】 （メチラーゼでタグ化したウイルスＤＮＡおよびゲノムのサザンブロットによ
る複製のための試験） 形質導入を最終的に確認するために、感染細胞においてアデノウイルス複製を
検出するためのプロトコルを、確立し得る。ウイルスＤＮＡ合成は、アデノウイ
ルス早期遺伝子のデノボでの発現後のみ生じ得る。部位特異的メチル化ストラテ
ジーを、感染細胞内でのウイルスＤＮＡ複製をモニターするために利用する（Ｎ
ｅｌｓｏｎ，Ｊ．ら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７
１：８９０２−０７）。メチル化で印を付けられたアデノウイルスは、ＸｈｏＩ
部位（ＣＴＣＧＡＧ）のアデニン塩基のＮ６部位上のメチル基の付加により、Ｘ
ｈｏＩイソシゾマーＰａｅＲ７メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）を発現する
ＨｅＬａ細胞またはＡ５４９細胞におけるウイルスの伝播によって作製され得る
（Ｋｗｏｈ，Ｔ．Ｊ．ら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８３，７７１３−７７１７）。メチル化は、ベクター作製に影響しない
が、ＸｈｏＩによる切断を妨げることは、公知である。ウイルス複製を介するメ
チル化の欠失は、ＸｈｏＩ切断を回復し、そしてネイティブな非メチル化ウイル
スゲノムとの比較において感染細胞由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットによっ
て検出され得る。
【０１４５】 （結合アッセイおよびインターナリゼーションアッセイ） これらの研究は、他に発行されたプロトコルに基づいて実行された（Ｗｉｃｋ
ｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９３，Ｃｅｌｌ．７３：３０９−３１９）。予備実験
において、本発明者らは、標識したＡｄ５ビリオンが、細胞あたり４００ｐｆｕ
のＭＯＩで４℃で４５分間後にＨｅＬａ細胞への結合において平衡に達した。結
合研究について、３．５×１０5細胞を、１００μｌの氷冷接着緩衝液（２ｍＭ
ＭａＣｌ2、１％ ＢＳＡ、および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳで補充したダルベッ
コ改変イーグル培地）においてＡｄ５について４００ｐｆｕ／ｃｅｌｌのＭＯＩ
に相当する等量の［3Ｈ］−標識化アデノウイルスＯＤ粒子とともに氷上で１時
間インキュベートした。次に、この細胞を、１０００×ｇで４分間遠心分離によ
ってペレット化し、そして０．５ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後の洗浄
後、この細胞を、１５００×ｇでペレット化し、上清を除去し、そして細胞に結
合した放射能を、シンチレーションカウンターによって決定した。細胞あたりに
結合したウイルス粒子の数を、ビリオン特異的放射能および細胞数を用いて算定
した。インターナリゼーション［3Ｈ］−標識アデノウイルス粒子の画分を決定
するために、細胞を、上記のように対応するウイルスとともに氷上で１時間イン
キュベートし、ＰＢＳで洗浄し、１００μｌの接着緩衝液中に再懸濁し、次いで
３７℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞を、冷
０．０５％トリプシン−０．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で３倍に希釈し、そしてさら
に５〜１０分間３７℃でインキュベートした。この処置は、９９％の結合した放
射能を除去した。最後に、この細胞を、１５００×ｇで５分間ペレット化し、上
清を除去し、そして１分あたりのプロテアーゼ耐性数を測定した。このプロトコ
ルは、インターナリゼーションデータがレセプター再生により影響された可能性
を最小化する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅ．，Ｅｖｅｒｉｔｔ．Ｅ．１９９９，Ａ
ｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４４：７８７−７９５）。氷上でのＡｄ粒子の細胞への
非特異的結合を、１００倍過剰の未標識ウイルスの存在下で決定した。この値は
、０．１％未満のウイルス負荷を慣用的に示した。
【０１４６】 （結果） （Ａｄ粒子の標的細胞への付着およびインターナリゼーション） 選択された血清型を、［3Ｈ］−チミジンを用いて代謝的に標識した。［3Ｈ］
−チミジンは、複製の間にウイルスＤＮＡに取り込まれる。付着およびインター
ナリゼーションは、低温（０〜４℃）では、ウイルス細胞付着のみが起るが、こ
れに対して、インターナリゼーションはより高温でのインキュベーションが必要
であるという観察の利点を利用することによって実験的に分離し得る。細胞あた
りの付着またはインターナリゼーションされた粒子数を、ビリオン特異的放射能
を使用して算定し、そしてＡｄ３、４、５、９、３５、および４１の、ＣＤ３４
＋細胞、Ｋ５６２細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞との相互作用を定量する
ために用いた（図１２）。この血清型は、その異なる細胞株に付着する能力およ
びその異なる細胞株によってインターナリゼーションされる能力において有意に
改変した。Ａｄ５について、試験された細胞株への付着の程度は、ＣＡＲ発現の
レベルと相関した。Ａｄ５感染に対して無反応性を以前に示したＣＨＯ細胞にお
いて、付着およびインターナリゼーションのレベルは、細胞あたり約５０〜７０
ウイルス粒子であった。この数を以後、所定の細胞型のＡｄ５についての感受性
に関して陰性と仮定した。他の血清型のＣＨＯ細胞との相互作用は、有意により
高くなかった。これは、対応するレセプターが、ＣＨＯ細胞上に非存在であるこ
とを示した。試験した全ての血清型は、ＨｅＬａ細胞と相互作用し、Ａｄ３およ
びＡｄ３５が最も効果的な改変体であった。ＨｅＬａ細胞上の明白なＡｄ３レセ
プターおよびＡ３５レセプターの存在は、以前に実証された（Ｓｔｅｖｅｎｓｏ
ｎ，Ｓ．Ｃ．ら、１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６９：２８５０−２８５７
）。Ａｄ４、５、および４１は、Ｋ５６２細胞に付着しなかった。対照的に、Ａ
ｄ９ならびにサブグループＢのメンバー（Ａｄ３およびＡｄ３５）は、Ｋ５６２
細胞と効率的に相互作用し、Ａｄ３５が、最も多い付着粒子およびインターナリ
ゼーション粒子を有した。Ａｄ５と比較して、約２５倍多いＡｄ３５粒子が付着
し、これらの３／４が、Ｋ５６２細胞によってインターナリゼーションされた。
ＣＤ３４＋細胞とのウイルス相互作用は、一般的により弱い。試験した血清型中
、Ａｄ９およびＡｄ３５のみが、非循環ＣＤ３４＋細胞によって有意にインター
ナリゼーションされた。Ａｄ９およびＡｄ３５のインターナリゼーションを、そ
れぞれ、Ａｄ５粒子についてよりも４倍および８倍効率的であった。ＣＤ３４＋
細胞によってインターナリゼーションされたＡｄ３５ビリオンの数は、Ａｄ５ベ
ースのベクターで容易に感染され得るＨｅＬａ細胞におけるＡｄ５について見ら
れた数のほとんど半分であった。
【０１４７】 （アデノウイルス血清型３、５、９、３５および４１の、ＨｅＬａ細胞、２９
３細胞およびＣＨＯ細胞への付着およびインターナリゼーション） ヒトアデノウイルスのための第１レセプターおよび第２レセプターを高レベル
で発現するＨｅｌａ細胞および２９３細胞を、ウイルス付着およびインターナリ
ゼーションのための陽性コントロールとして用いる。陰性コントロールとして、
ＣＨＯ細胞を用いる。ＣＨＯ細胞は、検出可能なレベルで第１のアデノウイルス
レセプターを発現せず、従って、アデノウイルス感染に対して無反応性である。
付着研究のために、これらの接着細胞株を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液（Ｃａ２＋お
よびＭｇ２＋を含まない）を用いて１０ｃｍ皿から離し、氷冷ＰＢＳを用いて３
回洗浄し、接着緩衝液中に再懸濁し、そして実施例の節において上記のようにウ
イルスとインキュベートする。予期したように、試験した全てのアデノウイルス
血清型は、Ｈｅｌａ細胞に効率的に付着され、そしてインターナリゼーションさ
れる（表ＩＩＩ）（図１３）。アデノウイルス血清型３、５、３５、４１は、２
９３細胞により効率的に付着し、そしてインターナリゼーションされるが、アデ
ノウイルス血清型９では、このようにならない。対照的に、ほとんどのアデノウ
イルス血清型の乏しい付着およびインターナリゼーションが、ＣＨＯ細胞で観察
される。ＣＨＯに対する付着のレベルは、アデノウイルス血清型５および４１に
ついて細胞あたり約５０〜７０ウイルス粒子であり、アデノウイルス血清型３に
ついては、細胞あたり１１５ウイルス粒子であり、そしてアデノウイルス血清型
９および３５については細胞あたり約１８０粒子である。さらなる分析について
、効率的なアデノウイルスの形質導入のための特定の細胞株の感受性に関して、
細胞あたり３００より多い数のウイルス粒子は、陽性として仮定され、そして細
胞あたり７０未満の数のウイルス粒子は、陰性として仮定される。
【０１４８】
【表３】 （アデノウイルス血清型３、５、９、３５および４１の、ヒトＣＤ３４＋骨髄
細胞およびＫ５６２赤白血病細胞株への付着およびインターナリゼーション） 以前の研究は、ヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２が非常に高いＭＯＩでＡｄ５ベー
スのアデノウイルスベクターで形質導入され得ることを示した。図１４において
示されるように、４００のＭＯＩでアデノウイルス血清型５の細胞あたり約６０
のウイルス粒子のみがこれらの細胞に付着し、さらにより少ない粒子がこれらの
細胞にインターナリゼーションされる。Ａｄ５とは対照的に、Ａｄ９の細胞あた
り約３２０のウイルス粒子およびＡｄ３５の細胞あたり１５００のウイルス粒子
が、Ｋ５６２細胞に付着し、そしてそれらの約２／３がインターナリゼーション
される（図１４Ｂ）。凍結ストックから得られたヒト未刺激ＣＤ３４＋富化骨髄
細胞を、サイトカイン刺激なしで増殖培地において一晩インキュベートする。次
の日、生存可能な細胞数を、算定する。付着研究のために、細胞を、氷冷ＰＢＳ
で３回洗浄し、接着緩衝液中に再懸濁し、そしてアデノウイルスとともにインキ
ュベートする。試験したアデノウイルス血清型中、Ａｄ９のアデノウイルス粒子
（細胞あたり約１５０のウイルス粒子）およびＡｄ３５（細胞あたり約３２０の
ウイルス粒子）のみが、Ａｄ５（細胞あたり６０のウイルス粒子のみ）と比較し
てこのレベルで未刺激ＣＤ３４＋細胞に付着し得る。これらのうち４／５のウイ
ルス粒子が、この細胞によってインターナリゼーションされ得る。興味深いとに
、ＣＤ３４＋細胞のＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯ／ＴＰＯでの２週間の刺激におい
て、Ａｄ９ウイルス粒子の付着およびインターナリゼーションは、有意に増加す
る（細胞あたり３００粒子まで）。同時に、細胞のＧＭ−ＣＳＦでの２日間の一
過性の刺激は、この細胞へのウイルスの付着のレベルを上昇し得なかった。
【０１４９】 試験したいくつかの血清型中で最も効率的にＡｄ３５血清型がＣＤ３４＋細胞
に付着し、そしてインターナリゼーションし得るという上記の発見に基づいて、
血清型Ａｄ３５を、さらなる研究のために選択した。添付物ＩＩに記載のように
、Ａｄ５キャプシド中に短Ａｄ３５ファイバー配列を含むキメラベクター（Ａｄ
５ ＧＦＰ／Ｆ３５）は、ＣＡＲ／インテグリン非依存性様式で広範囲のＣＤ３
４＋細胞を標的化し得た。
【０１５０】 （考察） 要約すれば、試験した全ての血清型からＡｄ９、Ａｄ３、およびＡｄ３５は、
Ｋ５６２細胞およびＣＤ３４＋細胞との最も効率的な付着およびインターナリゼ
ーションを実証した。付着／インターナリゼーションデータに基づいて、サブグ
ループＤおよびＢの代表としてＡｄ９およびＡｄ３５を、さらなる親和性研究の
ために選択した。
【０１５１】 （Ｄ．Ｋ５６２細胞およびＣＤ３４＋細胞におけるＡｄベクター複製の特徴付
け） Ａｄ５、ならびにＡｄ９およびＡｄ３４の、２９３細胞、Ｋ５６２細胞および
ＣＤ３４＋細胞における感染および複製のための比較分析。Ａｄ９ファイバーノ
ブドメインが比較可能な親和性を有するＡｄ５として細胞表面上の同一の主要な
レセプターを認識する能力が以前に記載された。従って、Ａｄ９ウイルス粒子が
、２９３細胞に弱く付着し得るだけという発見は、むしろ予期されない。どのよ
うに付着およびインターナリゼーションデータが異なる血清型のアデノウイルス
の生物学的活性を反映するかを見出すために、Ａｄ５、Ａｄ９およびＡｄ３５の
ストックを、２９３細胞に対する電子顕微鏡、プラークアッセイ、ならびにＫ５
６２細胞およびＣＤ３４＋細胞における定量的複製アッセイによってより詳細に
特徴付ける。
【０１５２】 （方法） （定量的複製アッセイ） １×１０5ＣＤ３４＋細胞またはＫ５６２細胞を、ＸｈｏＩ ＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼイソシゾマーＰａｅＲ７を発現する２９３細胞において増幅さ
れた異なるＭＯＩのＡｄ５、９、３５を含む１００μｌの増殖培地において感染
した（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７１：８９０２−８９０７）。３７℃でのインキュベーシ
ョンの２時間後、この細胞を、１０００×ｇで５分間遠心分離し、このウイルス
含有培地を、除去した。この細胞を、１００μｌの新鮮な培地に再懸濁し、次い
でそれらを収集するまで３７℃でインキュベートした。Ｋ５６２細胞について感
染から１６時間後、またはＣＤ３４＋細胞について感染から３６時間後に、５μ
ｇのｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）プラスミドＤＮ
Ａを、キャリアとして添加した。このキャリアはまた、負荷コントロールとして
も使用され得る。ゲノムＤＮＡを、以前に記載のように抽出した（Ｌｉｅｂｅｒ
，Ａ．，Ｃ．−Ｙ．ら、１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．
７０：８９４４−８９６０）。精製した細胞性ＤＮＡの１／４（２．５×１０4
細胞に相当する）を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩを用いて、またはＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＸｈｏＩを一緒に用いて３７℃で一晩消化し、その後、１％アガロース
ゲルにおいて分離し、続いてキメラＡｄ５／９ＤＮＡプローブまたはＡｄ５／３
５ＤＮＡプローブを用いてサザンブロットを行った。Ａｄ５およびＡｄ９（Ａｄ
５／９）またはＡｄ５およびＡｄ３５（Ａｄ５／３５）の配列を含むこのキメラ
プローブを、Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および鋳型として精製した粒子由来のウイルスＤＮ
Ａを用いる２段階ＰＣＲ増幅によって作製した。以下のプライマーを、ＰＣＲの
ために使用した（Ａｄ５配列およびヌクレオチド番号には、下線を付した）：
【０１５３】
【化１】 ヌクレオチド番号を、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（Ａｄ５に関する登録番号Ｍ
７３２６０／Ｍ２９９７８、Ａｄ９についてはＸ７４６５９、およびＡｄ３５に
ついてはＵ１０２７２）から入手した配列に従って与える。第１の増幅の後、フ
ァイバー遺伝子に対応する９６８ｂｐ長のＡｄ９ ＤＮＡフラグメント、８５９
ｂｐ長のＡｄ３５ ＤＮＡフラグメント、ならびにＡｄ５ Ｅ４領域（Ａｄ５フ
ァイバー遺伝子の直ぐ下流に位置する）に対応する８７６ｂｐ長のＡｄ５フラグ
メントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。キメラＤＮＡプローブを
作製するために、増幅されたＡｄ５ＤＮＡを、第１段階のＰＣＲ中に得られたＡ
ｄ９フラグメントまたはＡｄ３５フラグメントと混合し、Ａｄ５／９ＦまたはＡ
ｄ５／３５ＦプライマーおよびＡｄ５Ｒ１プライマーを用いて第２のＰＣＲ増幅
に供した。得られるＡｄ５／９キメラＤＮＡフラグメントまたはＡｄ５／３５キ
メラＤＮＡフラグメント（図１５を参照のこと）を、精製し、そしてそれらの濃
度を、分光光学的に測定した。対応するキメラＤＮＡフラグメントを、濃度標準
としてアガロースゲルにロードするか、または［32Ｐ］−ｄＣＴＰで標識し、そ
してサザン分析のためのプローブとして使用した。ＤＮＡサンプルあたりのウイ
ルスゲノムの数を定量的Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｅｒ分析後に算定した。予備
実験において、キメラＤＮＡプローブの、任意の特定のウイルス血清型のＤＮＡ
への優先的ハイブリダイゼーションを、検出しなかった。
【０１５４】 （結果） （Ｋ５６２細胞およびＣＤ３４＋細胞における選択された血清型の複製） 付着／インターナリゼーション研究は、宿主細胞におけるウイルス遺伝子発現
または異種遺伝子発現を可能にするウイルス形質導入（遺伝子移入としてしばし
ば定義されるプロセス）を最終的に証明しない。エンドソーム溶解、核への輸送
、およびウイルスゲノムの核の取り込みを含む細胞内トラフィッキングは、構造
キャプシドタンパク質に依存し、従って異なる血清型間で変化する（Ｄｅｆｅｒ
，Ｃ．ら、Ｐ．１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６４：３６６１−３６７３；
Ｍｉｙａｚａｗａら、１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３：６０５６−６０
６５）。本発明者らは、ウイルス遺伝子発現の分析がウイルスゲノムの首尾よい
核の取り込みを証明することを意味し、そしてこれは、本発明者らの標的細胞を
効率的に感染し得る血清型の選択のための優れた基準であると考えた。この分析
を行うために、本発明者らは、感染細胞におけるＡｄ複製の検出を可能にするプ
ロトコルを使用した。ウイルスＤＮＡ合成は、アデノウイルス初期遺伝子のデノ
ボでの発現後に生じ得るのみである。本発明者らは、感染細胞におけるウイルス
ＤＮＡ複製をモニターするために部位特的メチル化ストラテジーを利用した（Ｎ
ｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ．７１：８９０２−８９０７）。メチル化Ａｄ血清型を、ＸｈｏＩイ
ソシゾマーＰａｅＲ７メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）を発現する２９３細
胞（Ｋｗｏｈ，Ｔ．Ｊ．ら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８３，７７１３−７７１７）（２９３ ＰＭＴ細胞）におけるウイル
スの伝播の間、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）のアデニン塩基のＮ６位上へのメ
チル基の付加によって産生した。ウイルス複製を介するメチル化の欠失は、Ｘｈ
ｏＩ切断を回復し、そして感染細胞由来のＸｈｏＩ消化したゲノムＤＮＡのサザ
ンブロットによって検出され得る。
【０１５５】 Ａｄ複製研究を、Ａｄ５との比較においてＡｄ９およびＡｄ３５を用いてＫ５
６２細胞およびＣＤ３４＋細胞において行った。複製研究について、感染力価（
ｐｆｕ／ｍｌ）およびゲノム力価（ゲノム／ｍｌ）を、メチル化および非メチル
化のＡｄ５、Ａｄ９、およびＡｄ３５について（それぞれ、２９３細胞における
プラークアッセイによってか、または定量的サザンブロットによって）決定した
（表２）。ゲノム力価に対するｐｆｕの比は、メチル化および非メチル化したウ
イルスについて比較可能であった。このことにより、ＤＮＡのメチル化が形質導
入特性を改変しなかったことを実証した。感染に使用される（Ａｄ５、９、およ
び３５）ウイルスの約８５％を、ウイルス負荷において存在するメチル化および
非メチル化したウイルスＤＮＡに特異的なフラグメントの強度に基づいて算定し
たとおりメチル化した（図１５）。付着（１時間、０℃）またはインターナリゼ
ーション（２時間、３７℃）後に検出されたゲノム数は、図１２に示される研究
と十分に相関した。Ａｄ９およびＡｄ３５は、Ｋ５６２細胞およびＣＤ３４＋細
胞と、Ａｄ５より効率的に相互作用した。Ｋ５６２細胞およびＣＤ３４＋細胞に
おける用量依存性複製研究を、同一のゲノム数のＡｄ５、９、および３５を用い
て行った（図１５）。複製率を、異なるＭＯＩ（細胞あたり２１００、４２０、
および１０５のゲノム）で感染後の、ウイルスＤＮＡのメチル化から脱メチル化
への速度に基づいて測定した。Ｋ５６２細胞において、効率的な複製（メチル化
ＤＮＡから非メチル化ＤＮＡへの１００％の変換）を、ＭＯＩ＞／＝２１００で
Ａｄ５について、ＭＯＩ＞／＝４２０でＡｄ９について、およびＭＯＩ＞／＝１
０５でＡｄ３５について検出した。これは、Ａｄ３５が、最も高い効率でＫ５６
２細胞に形質導入することを実証した。ＣＤ３４＋細胞において、複製率は、Ｍ
ＯＩ４２０で感染後、Ａｄ５について１００％およびＡｄ９について３１％であ
った。メチル化したＡｄ３５ウイルスＤＮＡがＣＤ３４＋細胞において存在する
が、ウイルスの複製は、Ａｄ３５について検出されなかった。要約すると、Ｋ５
６２細胞におけるウイルス複製研究は、Ａｄ５、９、ならびに３５の付着および
インターナリゼーションについて得られたデータを確認する一方、以前の結果と
ＣＤ３４＋細胞におけるＡｄ９および特にＡｄ３５の乏しい複製との間に矛盾が
存在した。以下で概説するように、異種細胞集団（ＣＤ３４＋細胞のような）に
おける複製分析は、特定の血清型の親和性に対する決定的な結果を与え得ない。
【０１５６】 全てのスクリーニングデータを一緒に解釈して、Ａｄ９およびＡｄ３５は、Ｋ
５６２細胞およびＣＤ３４＋細胞について強力な親和性を有する改変体として現
れる。Ａｄ９はＣＡＲに付着し得るが、細胞侵入のためにαv−インテグリンを
優先的に用いる（Ｒｏｅｌｖｉｎｋ，Ｐ．Ｗ．ら、１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ．７０：７６１４−７６２１）。この侵入ストラテジーは、ＣＤ３４＋細胞
の効率的な感染のために最適であり得ない。なぜなら、その細胞の１７％未満だ
けがαv−インテグリンを発現するからである（図１０）。従って、本発明者ら
は、Ａｄ５骨格に基づくキメラベクターの構築のために用いられる異種ファイバ
ーのための供給源としてＡｄ３５に焦点をあわせることを決定した。
【０１５７】
【表４】 （考察） Ｋ５６２細胞でのウイルス複製研究により、Ａｄ５，Ａｄ９，およびＡｄ３５の
付着およびインターナリゼーションについて得たデータを確認した。しかし、Ｃ
Ｄ３４＋細胞における相互作用データと複製データとの間には矛盾が存在した。
ここでは、Ａｄ９は、ほんのわずかにしか複製されず、そしてＡｄ３５について
は、複製は全く見られなかった。Ａｄ複製は、初期ウイルスタンパク質の重要な
開始の産物によってのみ開始され、次には、感染した細胞の核に存在するウイル
スゲノムの数に直接依存する。従って、複製研究の結果は、ウイルスゲノムの核
輸送の速度により、ウイルスプロモーターの活性により、および／またはウイル
スＤＮＡ／ＲＮＡの細胞内安定性により、影響され得る。これらのパラメーター
は、一方では、ＣＤ３４＋の異なるサブセットの間で、および／または、他方で
は、異なるＡｄ血清型の間で、変化し得る。結論として、ＣＤ３４＋細胞におけ
る異なるＡｄ血清型を用いて実施したウイルス複製分析では、Ａｄ５骨格に基く
キメラベクターの実際の形質導入特性を予測できない。このことは、Ａｄ５以外
のＡｄゲノムに基いて遺伝子移入ベクターを産生する試みは慎重に行われるべき
であるということを意味する。
【０１５８】 近年、Ａｄ血清型スクリーニングストラテジーを用いて、初代胎児ラットＣＮ
Ｓ皮質細胞またはヒト臍帯静脈内皮細胞に対して親和性を有する改変体が同定さ
れている。感染後４８時間のヘキソン産生についての免疫組織化学に基いて、至
適の血清型（Ａｄ１７）を選択した（Ｃｈｉｌｌｏｎ，Ｍら、１９９９．Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ．７３：２５３７〜２５４０）。しかし、このアプローチは、問
題がある。なぜなら、少なくとも本発明者らの場合は、Ａｄ５ヘキソンに対して
生じた抗体は、他の血清型と交差反応しなかったからである。また、ヘキソンは
、複製の開始後にのみ発現する。上記に概説したように、細胞内移動の動態、ウ
イルス遺伝子発現、および複製は、血清型の間で有意に異なる（Ｄｅｆｅｒ，Ｃ
ら、Ｐ．１９９０．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６４：３６６１〜３６７３；Ｍｉｙ
ａｚａｗａら、１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７３：６０５６〜６０６５）
。
【０１５９】 ＣＤ３４＋細胞との相互作用に関して、最も有効な血清型であることに加えて
、Ａｄ３５はまた、興味深い。なぜなら、ＡＤ３５は、Ａｄ５およびＡｄ３とは
異なるレセプターと相互作用するからである。Ａｄ３５およびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ
３５付着は、Ａｄ５または抗ＣＡＲ抗体によって阻害されなかった。このことは
、Ａｄ３５付着がＣＡＲに依存しないことを示唆する。第１に、Ａｄ５は、イン
ターナリゼーションおよび感染の間、Ａｄ３５およびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５と競
合しなかった。このことは、αωβ3/5インテグリンがウイルス進入に関与しな
いことを示す。第２に、αvインテグリンに対する機能ブロッキング抗体は、Ｋ
５６２細胞へのインターナリゼーションについて、Ａｄ３５およびＡｄ５ＧＦＰ
／Ｆ３５と競合しないが、これらの抗体はＡｄ５インターナリゼーションを阻害
する。そして第３に、Ａｄ５に基くベクターと比較して、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５
での感染後のＧＦＰ発現は、αvインテグリン発現ＣＤ３４＋細胞に限定されな
い。これらの事実から、本発明者らは、Ａｄ３５およびキメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ
３５ベクターでの感染がαvインテグリンに関与しないと結論する。この文脈に
おいて、Ａｄ３５ペントンベース内のＲＧＤモチーフの存在または非存在は、対
応するゲノム領域を配列決定することにより決定されねばならないままである。
交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）アッセイは、Ａｄ３５および
Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５が、Ａｄ３レセプターとは異なるレセプターに付着するこ
とを実証した。Ａｄ３およびＡｄ３５は同じサブグループに属するが、このサブ
グループは、２つのＤＮＡ相同なクラスターであるＢ１およびＢ２に分けられて
いる；それらのファイバーを構成するアミノ酸は、相同性が６０％しかない。さ
らに、両方のウイルスについての標的組織は、異なる；Ａｄ３は、急性呼吸器感
染を生じ得るが、Ａｄ３５は、腎臓感染と関連している（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．
Ｓ．１９９６．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｐ２１４９〜２１７１．、Ｂ．Ｎ．
Ｆｉｅｌｄｓ，Ｋｎｉｐｅ．Ｄ．Ｍ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（編），Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ、第２巻，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。従って、Ａｄ３およびＡｄ５が異
なるレセプターを認識することが見られても驚くことではない。
【０１６０】 結論として、Ａｄ３５およびキメラベクターは、ＣＡＲ−およびαv−インテ
グリン非依存性径路により細胞に侵入する。本発明者らは、Ａｄ３５およびキメ
ラベクターは、主にそのファイバーレセプターに付着し、そしてこの相互作用は
、インターナリゼーションを誘発するのに十分であると考えている。他方では、
Ａｄ３５インターナリゼーションは、αvインテグリン以外の細胞性タンパク質
に関与し得る。これらの膜タンパク質は、Ａｄ３インターナリゼーションのため
のタンパク質および代表的β２インテグリン（αvインテグリンよりも細胞表面
から突出する）と重複し得る（Ｈｕａｎｇ、Ｓら、１９９６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ．７０：４５０２〜４５０８）。
【０１６１】 ネガティブ対比染色したアデノウイルス懸濁物のＥＭ研究に従って、試験した
全てのアデノウイルス血清型についての不完全粒子のパーセンテージは、５％を
超えなかった。しかし、プラークアッセイにより、２９３細胞中でプラークを形
成する能力が、試験した血清型については有意に異なることが示される。得られ
た光学粒子対ＰＦＵ（ＯＰＵ／ＰＦＵ）の比は、Ａｄ５について１３である。こ
の値は、このアデノウイルス血清型について以前に見積もられた比と良好に一致
する。重要なことに、この比は、アデノウイルス血清型３５については約３倍高
く、そしてアデノウイルス血清型９については１５０倍高い。さらに、キメラＡ
ｄ５／９ＤＮＡプローブおよびＡｄ５／３５ＤＮＡプローブを用いる定量的サザ
ンブロットを用いて、ゲノムと形質転換力価との間の比を決定する。この研究に
より、プラーアッセイにより得られたデータを確認する。Ｋ５６２細胞およびＣ
Ｄ３４＋細胞におけるこれらのアデノウイルスの定量的複製アッセイによっても
、Ａｄ９およびＡＤ３４がこれらの細胞型により効率的に付着する能力を確認す
る。ウイルスゲノムの複製が、Ａｄ９およびＡＤ３４について、Ａｄ５に比べて
、低い感染ＭＯＩで観察される。結論として、付着およびインターナリゼーショ
ンについて異なる血清型で得られたデータは、標的細胞における感染性データと
良好に一致している。
【０１６２】 （Ｅ．初代樹状細胞，ＪＡＷＳＩＩ，ＭＣＦ−７およびＲＥＶＣ細胞への、異
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーション） 原理的には、Ａｄ５感染に不応性である他の重要な標的細胞については、血清
型スクリーニングストラテジーを用い得る。
【０１６３】 （結果） ＲＥＣＶ細胞は、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、炎症などの遺伝子治療を
目的とするアプローチのための標的となるべき内皮細胞である。ＭＣＦ−７細胞
は、肝臓転移から単離された乳癌細胞であり、腫瘍の遺伝子治療についての重要
な標的である。ヒトアデノウイルス血清型３、５、９、３５および４１を試験し
て、それぞれの血清型が、マウス初代樹状細胞、ＪＡＷＳＩＩ細胞、ＭＣＦ−７
ヒト乳癌細胞およびＲＥＶＣ内皮細胞に付着し得るか、そしてインターナリゼー
ションし得るか否かを確認する。試験したいずれのアデノウイルス血清型も、初
代樹状細胞には効率的に付着し得ない。アデノウイルス血清型３は、ＲＥＶＣ内
皮細胞に効率的に付着し得る（１細胞あたり約４００ウイルスが付着し、そして
約３００ウイルスがインターナリゼーションする）。対照的に、Ａｄ５粒子は、
わずか５０しか付着し得ず、そしてこれらのＲＥＶＣにはなおわずかしかインタ
ーナリゼーションしない。ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）は、低ＭＯＩでの、ＡＤ
５感染に対しては不応性であることが以前に示されている。しかし、Ａｄ３は、
そしてＡｄ３５は、より効率的に、ＭＣＦ−７細胞に付着し、そしてインターナ
リゼーションする。
【０１６４】 （考察） 本明細書において示すデータは、異なるヒトアデノウイルス血清型が、異なる
細胞レセプターを認識し、従って、Ａｄ５感染に対して不応性である細胞型に感
染し得ることを示す。ヒトＣＤ３４＋細胞、ＲＥＶＣ、Ｋ５６２およびＭＣＦ−
７細胞に対して、Ａｄ５よりも効率的に付着し、そしてインターナリゼーション
し得るアデノウイルス血清型が存在する。この知見は、Ａｄ５ベクターが他の血
清型に由来するレセプターリガンドを含む、キメラアデノウイルスベクターの構
築についての基礎を提供する。
【０１６５】 （Ｆ．初代ヒト骨髄細胞における感染研究） 樹立された赤白血病細胞株は、遺伝子改変された細胞との長期再構成を達成す
るために患者において標的とされるべき、最終的な造血幹細胞についての適切な
モデルを示さないので、最初の感染／再標的化研究のためには、正常な初代ヒト
骨髄細胞を用いる。
【０１６６】 （結果） 異なるＡｄ血清型を有する親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）研究の第１のセットにお
いて、骨髄細胞懸濁物全体が事前選択なしに用いられ得る。これは利点である。
なぜなら、種々のアデノウイルス血清型または遺伝子再標的化ベクターの親和性
は、骨髄系列、赤血球系列、巨核球系列、リンパ球系列、樹状細胞系列および単
球系列を意味する広範なスペクトルの前駆体小集団上で分析され得るからである
。短期間（＜５時間）の感染研究のために、細胞の生存度を保証するため、１０
％ＦＣＳ、βメルカプトエタノールおよび１０ｕ／ｍｌのＩＬ−３を補充した、
ＩＭＤＭ中で骨髄懸濁物を培養する。
【０１６７】 （単核化細胞アッセイ） 単核化骨髄細胞を、以下のＭＯＩ：１、１０、１００または１０００ｐｆｕ／
細胞の種々のアデノウイルス型とともに、短時間インキュベートし得る。感染し
た骨髄細胞のパラフィン切片またはサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）を、核局
在化、標識ウイルスＤＮＡについて分析し得る。ＢｒｄＵ標識は、抗−ＢｒｄＵ
抗体での免疫蛍光により可視化され得る；32Ｐ−標的化ウイルスＤＮＡは、光−
エマルジョンでのインキュベーションにより検出され得る。さらに、特異的組織
染色（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｈｅｍｏ３染色）後、小細胞物質を形態学的に分
析し得る。所望の場合、異なる蛍光色素（ＦＩＴＣ（緑）、ＴＲＩＴ、ＲＰＥ（
赤）、ＲＰＥ−Ｖｙ５、ＡＭＣＡ（青））に直接付着体化した特定の細胞表面マ
ーカーに対して、市販の抗体を用い、感染した骨髄小集団を完全に特徴付け得る
。特定の細胞型のメンブレンマーカー表示感染（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍａｒｋｅ
ｒ ｓｉｇｎｉｆｙｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を用いたＢｒｄＵ標識ウイル
スＤＮＡのコロニー化（例えば、ＦＩＴＣシグナルとして）が実証され得る；例
えば、潜在的な幹細胞／早期前駆体（ＣＤ３４＋，ＣＤ３８＋）、巨核球（ＣＤ
４ｌａ＋）、赤血球系細胞（グリコホリンＡ＋）、樹状細胞（ＣＤｌａ＋）、単
球（ＣＤ１４＋）、または骨髄細胞（ＣＤ１５＋）など。感染骨髄サブセットの
形態学的分析により、特定のアデノウイルス血清型が最初の細胞型を標的し得る
か否かに関する最初の情報を得る。
【０１６８】 （考察） 異なる野生型アデノウイルスは、均一なマーカー遺伝子を発現せず、統合して
いないので、そして、タグ化ウイルスＤＮＡの検出は、生きた細胞上では行われ
得ないので、この時点で、クローン原性能力または再増殖能力について感染細胞
を特徴付けることは不可能である。従って、再標的化研究のためのアデノウイル
ス血清型を、各血清型が低ＭＯＩで、精製したＣＤ３４＋細胞にインビトロで感
染する能力に基いて選択する。骨髄細胞のこのサブセットは、長期再構成する細
胞を含むことが公知である。異なるアデノウイルス血清型での感染研究は、上記
のように、精製されたＣＤ３４＋細胞（ＩＭＤＭ＋１０％ ＦＣＳ，βメルカプ
トエタノールおよび１０単位／ｍｌ ＩＬ−３において培養した）で繰り返され
得る。ＣＤ３４＋細胞の精製は、Ｐａｐｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ（Ｐａｐｙａｎ
ｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔら、１９９６、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ，２４：６６０−６９；Ｐａｐｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｔら、１９９
３，Ｂｌｏｏｄ．８１：２２９）に記載のように、抗ＣＤ３４モノクローナル抗
体被覆化プレート上での、またはＭｉｎｉＭａｃｓカラム上での直接免疫結合に
より実施され得る。単離されたＣＤＣ３４＋細胞の純度は、通常、８０〜９５％
にわたる。アナログ感染研究を、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−サブセット上で選択し
たアデノウイルス型を用いて反復し得る。
【０１６９】 生産的感染を確認するため、選択した（メチラーゼ−タグ化）血清型を用いて
、精製したＣＤ３４＋細胞を感染させ、そしてウイルスＤＮＡ複製を分析し得る
。精製したヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞の培養物を、ＨＳＣについてのモデルとして
、形質導入研究およびインテグリン研究に用い得る。
【０１７０】 ＨＳＣ活性がＣＤ３４−陰性のヒト骨髄サブセットにおいて存在することが、
最近、実証された（Ｂａｔｈｉａ，Ｍら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ，４：１０３８〜４５；Ｏｓａｗａ，Ｍら、１９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．
２７３：２４２〜５；Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ．３：１３３７〜４５：Ｚａｎｊａｎｉ、Ｅ．Ｄ．ら、１９９８，Ｅ
ｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２６：３５３〜６０）。Ｌｉｎ-ＣＤ３４-３８-
細胞を、ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスにおける再増殖アッセイと組合せて、再標的化
研究および形質導入研究において試験し得る。
【０１７１】 （Ｇ．ファイバー遺伝子のクローニングおよび挿入） （方法） （内因性ＡＤ５ファイバーの代わりに、Ａｄ５に基くシャトルプラスミドへの
対応するファイバー遺伝子のＰＣＲクローニングおよび挿入） ＣＤ３４＋または他のＨＳＣ含有集団に対する親和性を有する１つまたはいくつ
かのアデノウイルスを、本明細書に記載のさらなる研究のために選択する。ファ
イバーについての完全なコード領域は、ウイルス型に依存して、１〜２ｋｂの間
で変化する。配列をコードするファイバーは、選択されたウイルス型の精製され
た粒子から単離されたウイルスＤＮＡ由来のＰｆｕポリメラーゼでのＰＣＲによ
り得られ得る。対応するプライマーは、ＥＭＢＬ遺伝子バンクから入手可能なフ
ァイバー配列に基いて設計され得る。ＰＣＲ産物をＰａｃＩ−ＢＡｌＩフラグメ
ントとしてｐＣＤ４（ＲｅｃＡ＋Ｅ．ｃｏｌｉの組換えのためのシャトルベクタ
ー）にクローニングする（図１０）。ｐＣＤ４において、異種ファイバー遺伝子
は、Ａｄ５配列と両側で隣接している。Ａｄ５配列は、Ａｄ５においてファイバ
ー読み取りフレームに直接隣接する領域に相同である。組換えのためのＡｄ５（
シャトルベクター）誘導テンプレートとして、ｐＢＨＧ１０（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ
，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）誘導体であるｐＣＤ１を用い得る。組換えア
デノウイルス生成に慣用的に用いられるプロトコールに従って、組換え手順を実
施する（Ｃｈａｒｔｉｅｒ，Ｃら、１９９６，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７
０，４８０５〜４８１０）。慣用的に、得られたプラスミドの９０％が、正確に
組み替えられる。異種ファイバー（Ｘ）とＡｄ５配列との間の接合を配列決定し
て、組み込みの正確性を確認し得る。得られたプラスミドを、ｐＡｄ５ｆｉｂｅ
ｒＸ（ｐＡｄ５fx）と名付ける。得られた産物を用いて、異種ファイバー遺伝子
を含む、ｐＡｄ５fxに基くＡｄ．ＡＡＶを生成する。
【０１７２】 （キメラＡｄベクターの構築） 形質導入研究のため、以下の２つのＡｄベクターを構築した：Ａｄ５ＧＦＰお
よびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５（キメラＡｄ５／３５ファイバー遺伝子を含む）。両
方のアデノウイルスベクターは、Ａｄ５のＥ３領域に挿入された、２．３ｋｂの
ＣＭＶプロモーター誘導ＥＧＦＰ遺伝子［ｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．ＣＡ）から誘導］を含んだ。ＥＧＦＰ発現カセットを、シ
ャトルプラスミド中のＡｄ５配列２５，１９１−２８，１９１と３０，８１８−
３２，５０７との間にクローニングした。このシャトルプラスミドは、ｐＢＨＧ
１０（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）について記載された
Ｅ３欠失を含んだ。得られたプラスミドをｐＡｄＧＦＰと名付けた。キメラベク
ターのために、ｐＡｄＧＦＰ中のＡｄ５ファイバー遺伝子を、上記に概説した２
段階ＰＣＲプロトコールにより生成したＡｄ５／３５キメラファイバー遺伝子で
置換した。最初のＰＣＲ工程において、以下：ｉ）Ａｄ５ファイバー５’−非翻
訳領域およびファイバーテイルドメインの最初の１３２ｂｐ（ヌクレオチド３０
，８１８−３１，１７４）、ｉｉ）Ａｄ３５シャフトおよびノブドメイン（ヌク
レオチド１３２−９９１）、およびｉｉｉ）Ａｄ５ファイバーポリアデニル化シ
グナルを含むＡｄ５ Ｅ４領域（ヌクレオチド３２，７７５−３３，６５１）に
相当する３つのＤＮＡフラグメントをＰｆｕ−Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ
により増幅した。以下のプライマーを用いた：Ａｄ５テイルについて、Ａｄ５Ｆ
−２（ヌクレオチド３０，７９８−３０，８２５）５’−ＣＧＣ ＧＡＴ ＡＴ
Ｃ ＧＡＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＣＴＡ−３’（配列番号９）お
よびＡｄ５Ｒ−２（ヌクレオチド３１，１７４−３１，１５３）５’−ＣＡＧ
ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＣＣ ＣＡＴ Ｔ−３’（配列番
号１０）；Ａｄ３５シャフトおよびノブについて、プライマーＡｄ５／３５Ｆお
よびＡｄ５／３５Ｒ（上記参照）；Ａｄ５Ｅ４およびポリＡについて、プライマ
ーＡｄ５Ｆ−１およびＡｄ５Ｒ−１（上記参照）。１０のＰＣＲサイクル後、ア
ガロースゲル電気泳動によりこの生成物を精製し、合わせて、次いで、プライマ
ーＡｄ５Ｆ−２およびＡｄ５Ｒ−１とともに第２のＰＣＲに供した。得られた２
１１５ｂｐ長のキメラファイバー遺伝子は、Ａｄ５テイルおよびＡｄ３５シャフ
トおよびノブドメインを含んだ。この生成物をｐＡｄＧＦＰ中にフラグメントを
含むＳａｌＩ／ＸｂａＩ Ａｄ５ファイバー遺伝子のための置換物として用いた
。得られたプラスミドをｐＡｄＧＦＰ／Ｆ３５と名付けた。全長Ｅ１／Ｅ３ベク
ターゲノムを生成するために、ｐＡｄＧＦＰおよびｐＡｄＧＦＰ／Ｆ３５を、Ｅ
．ｃｏｌｉ中の組換えにより、ｐＡＤＨＭ４（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｋａ
ｙ，Ｍ．Ａ．１９９８．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：２５７７
〜２５３８）に挿入した（Ｃｈａｒｔｉｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、１９９６．Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：４８０５〜４８１０）。これを行うた
めに、ＲｅｃＡ＋Ｅ．ｃｏｌｉ．株ＢＪ５１８３を、ＸｂａＩフラグメントと混
合した、ＳｒｆＩにより直線化したｐＡｄＨＭ４を用いて同時形質転換した。こ
のフラグメントはＧＦＰ遺伝子、Ａｄ５またはＡｄ５／３５のファイバー遺伝子
、およびＡｄ５相同領域を含む。得られた組換え体を制限分析により分析した。
正しい組換え体をＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１中で増幅し、そして２重ＣｓＣｌ勾
配結合により精製した。このプラスミドをｐＡＤ５ＧＦＰおよびｐＡｄ５ＧＦＰ
／Ｆ３５と名付けた。Ａｄ５／３５キメラファイバー遺伝子の正しい構造を、ｐ
Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５の一部をエンドヌクレアーゼ消化しそして配列決定するこ
とにより確認した。対応するウイルスを生成するため、記載（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ
，Ｃ．Ｙ．ら，１９９６．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：８
９４４〜８９６０）のように、ｐＡｄ５ＧＦＰおよびｐＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５を
ＰａｃＩで消化し、ウイルスゲノムを遊離し、そして２９３細胞に形質転換した
。プラークは、重層された培養物中で、トランスフェクション後、７〜１０日発
達した。組換えウイルスを２９３細胞中で増殖させ、そして他に記載の標準的方
法（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．Ｃ．−Ｙら、１９９６．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ．７０：８９４４〜８９６０）により精製した。
【０１７３】 （血球凝集反応アッセイ） ＭｃＩｌｖａｉｎｅ−ＮａＣｌ緩衝液（０．１Ｍ クエン酸，０．２Ｍ Ｎａ 2 ＨＰＯ4［ｐＨ７．２］（０．８７％ ＮａＣｌで１：５０稀釈））中で階段稀
釈した、Ａｄ５、Ａｄ３５またはキメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ビリオンの各２５
μｌを、９６ウェルプレートにロードした。各稀釈に、２５μｌの１％サル赤血
球懸濁液（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ−ＮａＣｌ緩衝液）を添加した。３７℃１時間の
インキュベーション後、沈降パターンを決定した。全ての試験を、少なくとも２
つの独立した実験において４連で実行した。
【０１７４】 （サザンブロット） ゲノムＤＮＡの抽出、ＤＮＡフラグメントの標識、およびハイブリダイゼーシ
ョンを、前記のように実施した（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，Ｃ−Ｙ．ら、１９９６．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０：８９４４〜８９６０）。
【０１７５】 （結果） （キメラファイバーの構築／特徴付け） 以前に、ファイバーノブを交換することが、キメラＡｄベクターの親和性を変
更するのに十分であることが示されている（Ｃｈｉｌｌｏｎ，Ｍら、１９９９．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７３：２５３７〜２５４０；Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．，
ら、１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２：１８４４〜１８５２；Ｓｔｅｖｅ
ｎｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７１：４７８２〜４
７９０）。上記で概説したように、ファイバーシャフトの長さは、特定の血清型
の進入ストラテジーを決定的に決し得る。従って、本発明者らは、Ａｄ５ファイ
バーノブだけでなく、シャフトも置換することを決めた。このキメラＡｄ５／３
５ファイバーは、７βシートおよびノブとともにシャフトを含む、Ａｄ３５由来
の２７９アミノ酸に結合したＡｄ５ペントン塩基との相互作用に必要なＡｄ５テ
イル（アミノ酸：１〜４４）を含んだ（図１６Ａ）。内因性Ａｄ５ファイバーポ
リＡシグナルを用いて、キメラファイバーＲＮＡの転写を終止した。ペントン塩
基を含むＲＧＤモチーフを含むＡｄ５カプシドと短シャフト化ファイバーの組合
せは、危険であり得る。なぜなら、ファイバーノブとＲＧＤモチーフとの間の自
然な距離は妨害されているからである。Ｅ１／Ｅ３欠失Ａｄベクターに基くキメ
ラファイバー配列でＡｄ５ファイバーを置換した。このベクターは、挿入された
ＣＮＶプロモーター−ＧＦＰレポーター遺伝子カセットをＥ３領域に運んだ。対
応するキメラウイルス（Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５）を、１ｍｌあたり２×１０12ゲ
ノムの力価で、２９３細胞において産生した。比較のために、もともとのＡｄ５
ファイバー遺伝子およびＧＦＰ発現カセットを含むＥ１／Ｅ３欠失Ａｄベクター
を作成した（Ａｄ５ＧＦＰ）。自然の粒子対感染粒子の力価および比は、Ａｄ５
ＧＦＰとＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５との間で類似であり、このことは、ファイバー改
変が、キメラベクターの安定性および／または増殖特性を有意に変更しなかった
ことを示す。ファイバー改変の正確さを、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ウイルスゲノム
の制限分析により、続いて、サザンブロットハイブリダイゼーション（図１６Ｂ
）、ファイバーコーディング領域の直接配列決定、およびサル赤血球の血球凝集
反応（ＨＡ）についての機能試験により確認した。赤血球の凝集は、ファイバー
ノブ媒介である：ＡＤ５は、サル赤血球を凝集しないが、Ａｄ３５は効果的に凝
集することが公知である（Ｐｒｉｎｇ−Ａｋｅｒｂｌｏｍ．Ｐら、１９９８．Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２：２２９７〜２３０４）。ＨＡ試験において、Ａｄ５
ＧＦＰ／Ｆ３５は、１：５１２までの稀釈で、Ａｄ３５と同じ効率でサル赤血球
を凝集した。対照的に、Ａｄ５の等価の稀釈では血球凝集反応は観察されなかっ
た。このことは、Ａｄ５カプシドに組み込まれたキメラＡｄ５／３５ファイバー
の機能的活性を明確に確認した。
【０１７６】 異種ファイバー分子を用いるキメラアデノウイルスベクター（Ａｄ．ＡＡＶfx ）の生成：キメラＡｄ５−Ａｄ３ファイバーを有するアデノウイルスは、生存可
能であり、そして高力価で産生され得る（Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖら、１９９６，
Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０，６８３９〜６８４６；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ
，Ｓ．Ｃ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７１：４７８２〜９０）。本
明細書において記載されるファイバー置換物がアデノウイルスの産生または安定
性に影響するか否かを試験するため、２つのＥ１欠失第１生成物であるアデノウ
イルスベクターを、標準的プロトコールを用い、２９３細胞におけるＡＡＶβｇ
ａｌカセットを用いて生成する。このベクターを、ｐＣＤ１（内因性Ａｄ５ファ
イバーを含む）を用いたｐＡｄ．ＡＡＶ−ＢＧ（図１７）の組換えにより生成す
る；他のベクター（異種ファイバーを有する）は、ｐＡｄ．ＡＡＶβＧａｌおよ
びｐＡｄ５ｆｉｂｅｒＸ（ｐＡｄ５fx）の組換え産物である。単一のプラークに
由来するウイルスを、２９３細胞で増幅する。１つの２９３細胞についての産生
収率は、２９３細胞溶解物のプラーク滴定（ｐｌａｑｕｅ−ｔｉｔｅｒｉｎｇ）
により決定し得る。ファイバー改変は、キメラベクターの安定性に深刻な影響は
しないことが理解される。結局、骨髄細胞は、再標的化ベクターで感染され得る
。感染の２日後、基質としてフルオレセインジ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤ
Ｇ）を用いて、β−ｇａｌ発現について、生細胞サイトメトリーを実施し（Ｃａ
ｎｔｗｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９６ Ｂｌｏｏｄ ８８，４６７６〜４６８３
；Ｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓら、１９９６，Ｂｌｏｏｄ ８８：１１４７〜５５；Ｆｉ
ｅｒｉｎｇ，Ｓ．Ｎ．ら、１９９１，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１２：２９１；Ｍｏ
ｈｌｅｒ，Ｗら、１９９６．ＰＮＡＳ，９３：５７）、そして、感染した細胞を
形態学および表面マーカーについて特徴付ける。感染の前および感染の間、ＨＳ
Ｃの生存を支持する、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）を補充したＩＭＤＭ／ＦＣＳ
中で、骨髄細胞を培養し得る（Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔら、１９９８，Ｂｌｏｏ
ｄ，９２：４５２〜６１；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｔら、１９９６，
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：６６０〜６９）。あ
るいは、再標的化したベクターは、ＡＡｖ−ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）
カセットで生成され得、そしてＧＦＰおよび表面マーカー発現に基いて、形質導
入された細胞上でＦＡＣＳ分析を実施し得る。
【０１７７】 （Ｈ．キメラファイバータンパク質Ａｄ５／３５の競合研究） （競合研究） 付着およびインターナリゼーションについてのＡｄ５．３５．とＡｄ５ＧＦＰ
／Ｆ３５との間の交差競合研究（図１８）を行い、標的細胞を感染するためにキ
メラベクターによって使用される経路をより詳細に研究した。野生型Ａｄ３５お
よびキメラベクターＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５は、Ｋ５６２細胞への付着について互
いに競合する場合、同じ第１のレセプターを認識し得る（図１９Ａ、上のパネル
）。この第１のレセプターは、Ａｄ５によって使用されるレセプターとは異なる
。なぜなら、Ａｄ５ウイルス粒子も抗ＣＡＲモノクローナル抗体も（図１９Ｂ、
上のパネル）、Ａｄ３５もＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５の付着も抑止し得ないからであ
る。インターナリゼーションについての競合研究において、Ａｄ３５およびＡｄ
５ＧＦＰ／Ｆ３５は、互いに等しい効率で競合した。Ａｄ５および抗αV−イン
テグリンモノクローナル抗体（Ｌ２３０）（図１９Ｃ、Ｄ；下のパネル）は、Ａ
ｄ３５およびキメラウイルスのインターナリゼーションを阻害しなかった。この
データを強固にするために、抗ＣＡＲまたは抗αV−インテグリンモノクローナ
ル抗体を用いた細胞の前培養後に、Ｋ５６２細胞を、Ａｄ５ＧＦＰおよびＡｄ５
ＦＧＰ／Ｆ３５で感染し、続いてＧＦＰ発現細胞を分析した。この形質導入デー
タは、付着／インターナリゼーション研究において得られた結果を反映する。要
約すれば、これは以下のことを実証する：Ａｄ３５およびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５
は、Ｋ５６２細胞の感染のためにＣＡＲおよびαV−インテグリン−依存性経路
を使用する；これらの特異的な特徴の原因となる構造的エレメントは、Ａｄ３５
ファイバー内に位置し、そしてファイバーの置換によってＡｄ５へ移植され得る
。
【０１７８】 Ａｄ３は、Ｋ５６２細胞と効果的に相互作用し（図１２）、Ａｄ３およびＡｄ
３５は、同じサブグループ（Ｂ）に属するが、これらのファイバーのアミノ酸配
列間の相同性は、約６０％のみである。従って、本発明者らは、Ａｄ３が付着お
よびインターナリゼーションについてＡｄ３５およびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５と競
合し得るかどうかを試験することを決定した（図２０）。これらの研究は、Ａｄ
３５の付着が、Ａｄ３によって阻害されなかったことを実証し、異なるレセプタ
ーの使用を示す。興味深いことに、Ａｄ３は、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５の付着をわ
ずかに阻害した（図２０Ａ、左のパネル）。Ａｄ３５およびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３
５ファイバーのための共通するレセプターへの付着に加えて、キメラカプシド（
例えば、Ａｄ５ペントンＲＧＤモチーフ）はまた、Ａｄ３の付着に関連するエレ
メントンと重複する第２の細胞性レセプターと相互作用し得る。インターナリゼ
ーションについての交差競合において、Ａｄ３５およびキメラウイルスとの３７
℃での細胞の前培養は、［3Ｈ］標識Ａｄ３のインターナリゼーションを有意に
減少した（図２０Ｄ、右のパネル）。逆の実験において、競合者としてのＡｄ３
は、Ａｄ３５およびキメラウイルスの両方についてインターナリゼーションのレ
ベルを３０％減少した（図２０Ｂ、右のパネル）。予想どおりに、Ａｄ５および
Ａｄ３は、付着およびインターナリゼーションについて競合しなかった。上に示
されるように（図１９Ｂ）、抗ＣＡＲおよび抗αV−インテグリン抗体は、Ｋ６
５２細胞とのＡｄ３のインターナリゼーションをブロックしなかった。要約すれ
ば、本発明者らは以下のことを結論した：Ａｄ３５およびＡｄＧＦＰ／Ｆ３５は
、Ａｄ３のレセプターとは異なるレセプターに付着するが、それらは、インター
ナリゼーションに共通の構造的エレメント（αV−インテグリンとは異なる）を
使用し得る。
【０１７９】 （キメラウイルスでの感染研究） Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５は、ＣＡＲおよびαＶ−独立性経路によって、Ｋ５６２
細胞を感染することが確立された。以下のことが可能である：この特性は、ＣＡ
ＲおよびαV−インテグリンをほとんど発現しない非サイクリング（ｃｙｃｌｉ
ｎｇ）ＣＤ３４＋細胞の効率的な形質導入を可能にする。これを試験するために
、Ａｄ５ＧＦＰおよびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクターの形質導入の特性を、ＣＤ
３４＋細胞、Ｋ５６２およびＨｅＬａ細胞について分析した。図２１は、感染に
使用されたＭＯＩに依存する形質導入されたＧＦＰ発現細胞のパーセントを示す
。およそ１００％のＨｅＬａ細胞を、２５以上のＭＯＩでＡｄ５ＧＦＰおよびＡ
ｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５を用いて形質導入した。９５％より多くのＫ５６２細胞を、
１００以上のＭＯＩでＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５で形質導入したが、形質導入率は、
Ａｄ５で有意により低かった。ここで４００のＭＯＩでの感染後、形質導入率は
増加し、約７０％のＧＦＰ−陽性細胞でＭＯＩはプラトーに達した。ＣＤ３４＋
細胞の形質導入は、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５で、Ａｄ５ＧＦＰよりも、分析された
すべてのＭＯＩで約３倍より効果的であった。興味深いことに、より高いＭＯＩ
で、形質導入率は、ウイルス用量に伴い比例的に増加せず、そしてすぐにプラト
ーに達した。このことは、両方の場合において、ＣＤ３４＋細胞の特定のサブセ
ットのみが感染を許容したことを示した。これらの特性をより詳細に特徴付ける
ために、許容的なサブセットのさらなる形質導入研究を行った。第１に、ＧＦＰ
発現細胞のパーセントを、αV−インテグリンまたはＣＡＲについて染色された
ＣＤ３４＋画分で決定した（図２２）。小数のＣＡＲ陽性ＣＤ３４＋細胞は、正
確な同時標識研究を複雑にし、そしてＣＡＲ発現と、Ａｄ５ＧＦＰまたはＡｄ５
ＧＦＰ／Ｆ３５で感染されたＣＤ３４＋細胞のうちの形質導入された細胞の割合
との間の相関は存在しなかった。興味深いことに、Ａｄ５ＧＦＰについては、す
べてのＧＦＰ発現細胞の６５％が、αV−インテグリンについて陽性であったが
、キメラウイルスで感染されたＧＦＰ陽性細胞の２２％以下は、□V−インテグ
リン発現について陽性に染色された。全体のＣＤ３４＋集団の１７％のみが、Ａ
ｄ５ＧＦＰの感染後にＧＦＰを発現しが、ＣＤ３４＋／□V−インテグリン陽性
画分におけるＧＦＰ発現細胞のパーセントは、５０％であった。これは、以下の
ことを示す：Ａｄ５ＧＦＰベクター媒介性ＧＦＰ発現は、αV−インテグリン陽
性ＣＤ３４＋サブセットに優先的に局在化したが、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクタ
ーでの感染後、ＧＦＰはＣＤ３４＋細胞の広い領域に発現し、それらのほとんど
はαV−インテグリン−陰性であった。
【０１８０】 次に、形質導入された細胞を、ＧＦＰならびにＣＤ３４およびＣＤ１１７マー
カーについて同時に分析した。上記のように、本分析で使用されたすべての細胞
の約９０％のみが、感染時にはＣＤ３４について陽性であった。それ故、Ｄ３４
およびＧＦＰについて多パラメーターをＣ分析した。ＣＤ３４＋細胞の集団は、
形態学および幹細胞の能力において異常に不均一であった。ＣＤ３４＋およびＣ
Ｄ１１７＋細胞の亜集団は、非常に原始的な造血性細胞と似ている（Ｉｋｕｔａ
，Ｋ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１５０２−１５０６；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ら、
１９９４．Ｅｘｐｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．２２：１５７−１６５）。図２３
は、これらの特異的幹細胞マーカーと相関するＧＦＰ発現の分析を要約する。キ
メラベクターで感染された細胞の５４％はＧＦＰおよびＣＤ３４＋について陽性
であったが、Ａｄ５ＧＦＰで感染された細胞の２５％のみが、導入遺伝子および
ＣＤ３４＋マーカーを発現した（図２３Ａ、下のパネル）。より重要には、ＧＦ
Ｐの発現に基づいて、キメラウイルスは、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の８０％を形質導
入したが、Ａｄ５に基づくベクターは、３６％のみを形質導入した（図２３Ａ、
中間のパネル）。さらなる実験において、ＣＤ３４＋細胞を、Ａｄ５ＧＦＰまた
はＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５での感染の前に、ＣＤ１１７発現について分類し、そし
て感染の２４時間後、この特異的な画分においてＧＦＰ発現を分析した（図２３
Ｂ）。この分析より、キメラベクターが、Ａｄ５ＦＧＰベクターよりも４倍より
高いＣＤ３４＋／ＣＤ１１７を形質導入したことが明らかとなった。
【０１８１】 要するに、これらの結果は以下のことを実証した：キメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３
５ベクターは、ＣＤ３４＋細胞の標的化および形質導入においてＡｄ５ＧＦＰベ
クターに明らかに優れた。さらに、このデータは以下のことを示唆する：Ａｄ感
染を許容するＣＤ３４＋細胞サブセットの領域は、Ａｄ５ベクターよりもキメラ
ベクターについて有意に異なった。
【０１８２】 （Ａｄ５およびキメラベクターで感染されたＣｄ３４＋細胞内のウイルスゲノ
ムの分析） 従来、ＣＤ３４＋細胞の形質導入率を、Ａｄ５ＧＦＰおよびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ
３５での感染後のＧＦＰ発現に基づいて測定した。形態学的および機能的パラメ
ーターにおけるＣＤ３４＋の異常な不均一性を考慮すると、ＧＦＰは、効率的に
感染されたすべての細胞型において発現されなくともよい。これについての理由
としては、以下のことが挙げられる：ＣＭＶプロモーターはすべての細胞型にお
いて活性でなくてもよいか、または導入遺伝子発現の調節は、転写後または翻訳
後レベルにおいて、サブセット間で異なり得る。これを試験するために、本発明
者らは、Ａｄ５ＧＦＰおよびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５で感染されたＣＤ３４＋細胞
のＧＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性画分内の細胞内（形質導入された）ウイルスゲノ
ムの数を定量した。これを行うために、感染の２４時間後、ＣＤ３４＋細胞をＧ
ＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性画分ついて分類し、引き続いて形質導入されたウイル
スＤＮＡと一緒に、ゲノムＤＮＡを単離するために使用した。ウイルスゲノムの
数を、図１５に記載される定量的サザンブロットによって決定した。ＧＦＰ陽性
ＣＤ３４＋細胞あたり、約２７０コピーのＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ウイルスゲノム
を検出した。興味深いことに、注目すべき２００コピーのＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５
ウイルスゲノムを見出した（ＧＦＰ陰性ＣＤ３４＋細胞あたりに）（図２４Ａお
よび２５）。これは、以下のことを実証する：すべての感染された細胞が、ＧＦ
Ｐを発現するわけではない。そして以下のことを意味する：実際の形質導入率は
、５４％よりも高かった（ＧＦＰ陽性細胞）。本発明者らは、以下のことを結論
する：ＣＭＶプロモーターは、すべての形質導入されたＣＤ３４＋サブセットに
おいて活性ではなかった。Ａｄ５ＧＦＰベクター特異的シグナルを、感染された
ＣＤ３４＋（ＧＦＰ陽性または陰性）画分内で、サザンブロット（細胞あたり１
４ウイルスゲノムの検出限界を有する）によって検出した。これより、本発明者
らは、以下のことを結論し得る：形質導入された細胞あたりのベクターＤＮＡ濃
度は、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５について、Ａｄ５ＧＦＰよりも少なくとも２０倍高
い。
【０１８３】 Ａｄ５ＧＦＰ ＤＮＡは、ベクターに特異的なプライマーでの前ＰＣＲ増幅後
の、感染されたＣＤ３４＋細胞由来のＤＮＡサンプルにおいてのみ、サザンブロ
ットによって検出可能である（図２４Ｂおよび２５）。これは以下のことを示す
：複製欠損Ａｄ５ベクターは存在するが、非常に低コピー数であり、細胞内ゲノ
ムの安定性によって限定され得る。ＰＣＲサザン検出方法を使用して、Ａｄ５ベ
クターＤＮＡをまた、ＧＦＰ陰性細胞において検出した。このことは、以下のこ
とを支持する：ＣＭＶプロモーターが、形質導入研究の最適な選択であった必要
はない。Ａｄ５ベクターを用いたＣＤ３４＋細胞の感染後のウイルスゲノムの分
析における他による研究が、前ＰＣＲ増幅後にのみ行われたことに注目すべきで
ある（Ｍｉｔａｎｉ，Ｋ．ら、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ，５：９４１−９４８；Ｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．ら、１９９６．、Ｂｌｏｏ
ｄ，８８：１１４７−１１５５）。
【０１８４】 （考察） キメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクターは、Ａｄ３５に類似の付着およびインタ
ーナリゼーション特性を有する。従って、ファイバー置換は、Ａｄ５からＡｄ３
５へ、細胞の親和性を交換するのに十分であった。Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５カプシ
ドキメラは、天然に生じる長くシャフトしたＡｄ５ファイバーの代わりに、Ａｄ
５カプシドに取り込まれた短シャフト（ｓｈｏｒｔ−ｓｈａｆｔｅｄ）Ａｄ３５
ファイバーを含んだ。Ａｄ５の感染の間、ペントン塩基とインテグリンとの間の
相互作用は、ウイルスインターナリゼーションを誘導するために必要とされる。
この相互作用について、ファイバーシャフトの長さおよびノブおよびＲＧＤモチ
ーフの正確な空間配置は、ウイルスの侵入ストラテジーに重要である。天然の空
間配置は、短くシャフトした異種のファイバーが、Ａｄ５カプシドに挿入された
場合に妨害される。興味深いことに、Ａｄ５／３５カプシドキメラは、効率的な
感染を可能にする。このことは以下のことを示す：Ａｄ５ペントン塩基において
突出するＲＧＤモチーフは、第１のＡｄ３５レセプターとの相互作用に影響しな
い。従来、ほとんどのキメラウイルスは、長Ａｄ５ファイバーシャフトを維持す
る間、Ａｄ５ノブのみの置換によって産生された（Ｃｈｉｌｌｏｎ，Ｍ．ら、１
９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２：２５３７−２５４０；Ｋｒａｓｎｙｋｈ
，Ｖ．Ｎ．ら、１９９６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：６８３９−６８４６；
Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．ら、１９９５．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６９：２
８５０−２８５７；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．ら、１９９７ Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ．７１：４７８２−４７９０）。例外は、Ａｄ５／７キメラウイルスで
あり（Ｇａｌｌ，Ｊ．ら、１９９６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０；２１１６−
２１２３）、ここで全体のＡｄ５ファイバーは、短くシャフトしたＡｄ７ファイ
バーによって置換された。しかし、親のＡｄ５と同様に、Ａｄ５／７キメラは、
なおαV−インテグリンを感染に必要とされる。
【０１８５】 このＡｄ５ＧＦＰ／Ｆキメラは、始めに以下のことを実証する；Ａｄ５ペント
ン内のＲＧＤモチーフの存在にも関わらず、キメラウイルスは、短くシャフトし
た異種ファイバーのレセプター特異性によって、主に決定された細胞侵入経路を
使用する。これは、第２のレセプターとの相互作用が付着親和異性を増加し得る
ことを排除しない。後者は、以下の観察によって支持される：Ａｄ３５およびＡ
ｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５は、付着について、Ａｄ５またはＡｄ３と競合する能力にお
いてわずかに異なる。Ａｄ５／３５の付着は、高親和性のファイバー付着に加え
てＡｄ３およびＡｄ５によって使用されるレセプターと重複するＡｄ５カプシド
タンパク質（例えば、ＲＧＤモチーフ）と第２のレセプターとの間の相互作用に
関与することは可能である。
【０１８６】 このデータは、Ａｄ５に基づくベクターでの感染は、ＣＤ３４＋細胞の特定の
サブセットに制限されることを示す。ＣＤ３４＋細胞のＡｄ５ＧＦＰ感染後のＧ
ＦＰ発現細胞のパーセントは、１００より高いＭＯＩでプラトーに達した。この
ことは以下のことを示す：ＣＤ３４＋細胞の限定された画分のみが、Ａｄ５に対
して許容的であった。また、感染されたＣＤ３４＋細胞における野生型Ａｄ５の
強力な複製は、ウイルスの複製を開始するのに十分なレベルで、初期ウイルス遺
伝子の発現を生じるＣＤ３４＋の特定の亜集団の優先的な形質導入の結果であり
得る。Ａｄ５ベクター感染に対して許容的なＣＤ３４＋細胞の特異的な亜集団の
存在は、他（Ｂｙｋ，Ｔ．ら、１９９８．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ．９：２４９３−２５０２；Ｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．ら．１９９６、Ｂｌｏ
ｏｄ．８８：１１４７−１１５５）によって示唆された。このレポートにおいて
、本発明者らはさらに、この亜集団を特徴付け、そして以下のことを実証した：
Ａｄ５に基づくベクターは、αV−インテグリン陽性ＣＤ３４＋細胞を優先的に
感染した。インテグリン（αVを含む）は、移植された造血細胞のホーミングお
よび輸送に重要であると考えらるが、しかし、αV−インテグリン発現と造血細
胞の分化状態との間の相関についてはほとんどしられていない（Ｐａｐａｙａｎ
ｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｔ．，Ｃｒａｄｄｏｃｋ．Ｃ．１９９７．Ａｃｔａ Ｈａｅ
ｍａｔｏｌ．９７：９７−１０４；Ｒｏｙ，Ｖ．，Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ｃ．
Ｍ．１９９９．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７：３０２−３１２）。ＣＡＲとＧ
ＦＰ発現との間には明白は相関は存在せず、このことは以下のことを実証する：
Ａｄ５ＧＦＰは、第１のレセプターとして別の膜タンパク質を使用し得る。ある
いは、２００〜４００のＭＯＩで観察されたＡｄ５ＧＦＰ形質導入は、ＣＡＲの
存在しない好ましい経路であり得るウイルスとαV−インテグリン誘発性インタ
ーナリゼーションとの間の直接の相互作用の結果であり得る（Ｌｅｇｒａｎｄ，
Ｖ．ら、１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７３：９０７−９１９）。重要なこ
とに、キメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクターでの感染は、αV−陽性ＣＤ３４＋
亜集団に制限されなかった。
【０１８７】 ＣＤ３４＋細胞の中で、ＣＤ３４＋およびＣＤ１１７＋細胞の亜集団は、非常
んに原始的な造血細胞に類似である（Ｉｋｕｔａ，Ｋ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ
．Ｌ．１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１５
０２−１５０６；Ｓｉｍｍｏｎｓ．Ｐ．Ｊ．ら、１９９４．Ｅｘｐｌ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌｏｇｙ．２２：１５７−１６５）。幹細胞因子についてのレセプター、Ｃ
Ｄ１１７（ｃ−ｋｉｔ）は、チロシンキナーゼファミリーに属する。以下のこと
は以前に示された：ｃ−ｋｉｔ＋、ＣＤ３４＋臍帯血細胞は、造血先祖の高い画
分（１６％）を含む（Ｎｅｕ，Ｓ．ら、１９９６．Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅ
ａｃｈ．２０：９６０−９７１）。個体発生の初期に、３４＋／ＣＤ１１７＋細
胞は、長期の再増殖活性を有する（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９６．Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ．５：５１３−５２５）。平均して、ＣＤ３４＋細胞の５０〜６
０％が、ＣＤ１１７陽性であることが報告された（Ｉｋｕｔａ．Ｋ．，Ｗｅｉｓ
ｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
．８９：１５０２−１５０６；Ｎｅｕ，Ｓ．ら、１９９６．Ｌｅｕｋｅｍｉａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０：９６０−９７１；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ら、１９
９４．Ｅｘｐｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．２２：１５７−１６５）。本研究にお
いて、キメラベクターは、５４％のＣＤ３４＋細胞および８０％のＣＤ３４＋／
ｃ−ｋｉｔ＋細胞においてＧＦＰを発現した。実際のウイルス形質導入率はさら
に高くなり得る。なぜなら、形質導入されたＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクターＤＮ
Ａはまた、感染された細胞のＧＦＰ陰性画分において見出されたからである。こ
れは以下のことを示す：本発明のベクターにおいてＧＦＰ発現を駆動するのに使
用されたＣＭＶプロモーターは、形質導入された細胞のすべてにおいて活性でな
かった。本発明者らは、公開されたデータに基づいて導入遺伝子発現のためのＣ
ＭＶプロモーターを選択した。このデータは、ＰＧＫおよびＣＭＶプロモーター
は、ＣＤ３４＋細胞における効率的な導入遺伝子発現を可能にするが、ＨＴＬＶ
−１およびＲＳＶプロモーターはほとんど活性でなかったことを実証する（Ｂｙ
ｋ，Ｔ．ら、１９９８．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．９：２４９３
−２５０２；Ｃａｓｅ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：２９８８−２９９３）。一方で、Ｗａｔａｎａｂｅら
による研究（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔら、１９９６．Ｂｌｏｏｄ．８７：５０３２
−５０３９）は、以下のことを示唆する：ＣＭＶプロモーターは、特定のＣＤ３
４＋サブセットにおいて、活性でないか、または容易に停止する。本発明者らの
データは、この知見を強調する。レトロウイルス形質導入研究を考慮すると、レ
トロウイルスＭＬＶプロモーターは、造血細胞における形質導入研究の優れた候
補であり得た（Ｂｒｅｇｎｉ，Ｍ．ら１９９８．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．５
：４６５−４７２）。
【０１８８】 Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクターが、幹細胞特異的マーカーを保有する細胞を、
効率的に形質導入したことを実証した後、次の論理的なステップは、予め分類さ
れたＧＦＰ陽性／陰性細胞を用いてコロニーアッセイを行うことである。しかし
、このアッセイは以下の事実によって複雑にされる；第一世代のＡｄベクターで
の感染は、細胞毒性であり、そしてＭＣ−培養における先祖コロニーの形成およ
び増殖に影響する（Ｍｉｔａｎｉ，Ｋ．ら、１９９４．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ．５：９４１−９４８；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ら、１９９６．
Ｂｌｏｏｄ．８７：５０３２−５０３９）。この副作用は、形質導入された細胞
内のＡｄタンパク質の発現によって引き起こされる（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．Ｃ．−
Ｙ．ら１９９６．Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｌｏｇｙ．７０：８９４４−８９
６０：Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ，Ｇ．ら、１９９８．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ．１８：１８０−１８３；Ｙａｎｇ，Ｙ．ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：４４０７−４４１１）。これらのタンパク
質のいくつか（例えば、Ｅ４−ｏｒｆ４、ｐＴＰ、またはＥ３−１１．６ｋ）は
、プロアポトーシス活性を有する（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈａａｋ．Ｊ
．１９９６．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２２１：１７２−１７９；Ｌｉｅｂｅｒ．Ａ．
ら、１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２：９２６７−９２７７；Ｓｈｔｒｉ
ｃｈｍａｎｎ．Ｒ．，Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｌｏ
ｇｙ．７２：２９７５−２９８３；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ、Ａ．Ｅ．，Ａら、１９
９６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０：２２９６−２３０６）。明瞭に、これはＡ
ｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５での形質導入研究の結果を影響し、ウイルスタンパク質の有
意な発現を暗示するウイルスゲノムのＣＤ３４＋細胞への効率的な移転を可能に
する。さらに、最近公開されたデータは、以下のことを示す：短期のコロニーア
ッセイは、ほとんど、成熟先祖を測定し、そして潜在的な幹細胞の形質導入につ
いての厳密な試験を示さない。
【０１８９】 Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５に基づくベクターが、ＨＳＣを形質導入し得るという明
白な照明は、コロニーアッセイ、または好ましくは、ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに
おける再増殖アッセイを必要とする。本発明者らは、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５キメ
ラカプシドに基づいて作製された弱活力（ｇｕｔｌｅｓｓ）ベクターを用いて（
Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．ら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：９
３０３−１３）、およびすべてのウイルス遺伝子を欠く□Ａｄ．ＡＡＶベクター
を組み込んで（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：９３
１４−２４）、これらの研究を行い得る。あるいは、弱活力再標的化ベクターは
、ＣＤ３４＋細胞でレトロウイルスレセプターを過渡的に発現するために使用さ
れ、本発明者らが先に公開したアプローチ（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．ら、１９９５．
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．６：５−１１）に基づくレトロウイル
スベクターを用いた感染に対するそれらの感受性を増加し得る。
【０１９０】 Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５が、潜在的な幹細胞の能力を用いて造血細胞を効果的に
形質導入し得るというこの知見は、以下を示す：ＨＳＣへの安定な遺伝子転移へ
の重要なステップおよび血液障害の遺伝子治療。さらに、本発明のウイルス学の
局面は、アデノウイルス細胞相互作用のよりよい理解に寄与する。
【０１９１】 （Ｉ：ＨＳＣおよび他の細胞型について特定のリガンドペプチドを保有する改
変されたファイバーを有するＡｄ５に基づくベクターの再標的化） ＨＳＣ遺伝子治療のために、Ａｄ５−カプシドに基づくベクターを作製する別
の代替法は、Ａｄ５ファイバー遺伝子のＨ１ループ領域に、ＨＳＣ特異的ペプチ
ドのコード配列を組み込むことである。Ｈ１ループの改変を、７のアミノ酸長の
ＦＬＡＧペプチド（ＤＹＤＤＤＤＫ）（配列番号１１）を用いて、Ｋｒａｓｎｙ
ｋｈらによって連続して行った。ファージペプチドライブラリーを使用して（Ｐ
ａｓｃｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ，３８０：３６４−６
６）、Ｒｅｎａｔａ Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）は、Ａｍｅｒｉｃｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ Ｇｅｎｅ ＴｈｅｒａｐｙのＦｉｒｓｔ Ｍｅｅｔｉｎｇで、骨髄細胞
に特異的な小ペプチドリガンドの同定を最近報告した。これらのペプチドをコー
ドする対応する配列は、部位特異的変異誘導を使用するためにＨ１ループ配列を
改変するために添加され得る。最適には、リガンドは、ＣＡＲおよびインテグリ
ン独立性経路に基づくアデノウイルス粒子の効率的なインターナリゼーションを
可能にする。ＡＡＶＢＧカセットを含む改変されたアデノウイルスベクターは、
産生され、そして上記のようにＨＳＣ親和性について試験され得る。
【０１９２】 （アデノウイルスペプチドディスプレイ） 任意の型の目的の細胞に対してアデノウイルスを再標的化するために、ストラ
テジーを提供する。このストラテジーは、リガンドとして、それらのファイバー
ノブにおいて、アデノウイルスディスプレイランダムペプチドのライブラリーを
作製する工程、およびインビトロならびに潜在的にインビボで特定の細胞型に対
する親和性を有するアデノウイルス変異体についてこのライブラリーをスクリー
ニングする工程を包含する。
【０１９３】 アデノウイルスペプチドディスプレイ技術の発達は、以下の考えに基づく。（
ｉ）Ａｄ５ファイバーノブの立体構造は既知であるが、どのドメインがレセプタ
ー付着に関与するのかは明瞭でないままである。レセプター付着ドメインが、赤
血球凝集反応ドメインと部分的に重複し、このドメインは多くの血清型について
優れて特徴付けられることを示唆するデータが存在する。従って、潜在的なレセ
プター付着部位を表す３つの細胞内ループ領域が、ランダムペプチドライブラリ
ーによって置換され得る。ＧＦまたはＧＨループの中心の８のアミノ酸残基は、
八量体ランダムペプチドによって置換され得る（図２６および２７）。これらの
置換は、ＣＡＲ親和性を置換し、そして無反応性の細胞型の感染を可能にする。
（ｉｉ）ペプチドライブラリーをコードするオリゴヌクレオチドを合成するため
に、すべての２０のアミノ酸についてのコドンを表す、予め合成されたトリヌク
レオチドを構築するための、新規の技術を使用する。これは、末端コドンを避け
、そしてヒト細胞における最適なコドン使用および翻訳を保証する。完全なラン
ダム化ライブラリーの合成は、同じ確率で組み込まれるすべての２０アミノ酸で
可能であり、そしてランダムな位置で、八量体あたりランダムなアミノ酸の、３
（平均して）のランダムアミノ酸置換のみを有する部分的にランダム化されたラ
イブラリーであり、形質導入変動性の間、３次ノブ構造の特定の重要な特徴を維
持する。最近のモデルは、免疫グロブリンの超可変ＣＤＲ１または２領域に存在
するアミノ酸の分布に基づく。（ｉｉｉ）改変されたループあたり、約１０10の
異なる八量体の代表的なライブラリーサイズを維持するために、新しいクローニ
ングストラテジーを使用し、置換部位にさらなるアミノ酸の導入なしに、そして
細菌における形質転換なしに、野生型Ａｄ５ゲノムへのライブラリーの挿入を可
能にする。このストラテジーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎより利用可能な「継ぎ目の
ない（ｓｅａｍｌｅｓｓ）」クローニング技術に基づく。（ｉｖ）ウイルスのラ
イブラリーを産生するために、改変ファイバー配列を含むウイルスゲノムＤＮＡ
を、ライブラリーサイズを減少しないで、２９３細胞にトランスフェクトする。
この重要なステップは、ウイルスライブラリーＤＮＡを、キャリアＡＤ５に基づ
くアデノウイルスに、ポリリジンを介して付着することによってなし、１００％
のトランスフェクション効率を確実にする。この技術は、約１μｇのプラスミド
ＤＮＡ（または約１×１０10アデノウイルスゲノム）の１０10のウイルス粒子へ
の付着を可能にする。このウイルス粒子は、１０〜１００のＭＯＩで２９３／ｃ
ｒｅ細胞を感染するために使用され得る。重要なことに、キャリアアデノウイル
スゲノムは、リコンビナーゼ（２９３／ｃｒｅ）を発現する２９３細胞の感染後
に、キャリアウイルスＤＮＡのパッケージングを妨げるｌｏｘ部位に隣接したパ
ッケージングシグナルを有する。このヘルパーウイルス系は、従来的に使用され
、弱活力アデノウイルスと呼ばれるものを産生する。従って、このウイルス子孫
は、好ましくはＡｄ５ファイバーを含むカプシドにパッケージングされたライブ
ラリーゲノムを表す。これは、ファイバーがパッケージングされたゲノムによっ
てコードされるカプシドに基づく同種のファイバー集団を確実にするために１の
ＭＯＩでの２９３細胞への次の感染ステップのために重要である。
【０１９４】 （Ｊ．肝細胞に対する増加した親和性を有するアデノウイルスベクターの産生
） 肝細胞にＡｄ５を標的化するためのＧ−Ｈループ置換の例は成功した。予備試
験は、ＲＩおよびＲＩＩ＋と呼ばれるマラリアスポロゾイト周囲表面タンパク質
（ＣＳ）内の２つの進化的に保存された領域が肝細胞との特異的な相互作用を媒
介するが、他の器官（脾臓、肺、心臓および脳を含む）との特異的な相互作用は
、媒介しないで、またクップファー細胞、肝臓内皮細胞または肝細胞膜のほかの
領域との特異的な相互作用も媒介しないことを実証した（Ｃｅｒａｍｉ．Ｃ．ら
、１９９２，Ｃｅｌｌ，７０：１０２１−３３；Ｓｈａｋｉｂａｅｉ，Ｍ．およ
びＵ．Ｆｒｅｖｅｒｔ，１９９６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：１６９９−
７１１）。これらの領域は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ、Ｐ．ｃｙ
ｎｏｍｏｇｌｉ、およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（それぞれ、マウス、サルお
よびヒトの肝細胞に感染する）を含む異なる種間で保存されている（Ｃｅｒａｍ
ｉ，Ｃ．ら、１９９２，Ｃｅｌｌ，７０：１０２１−３３；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅ
ｅ，Ｓ．ら、１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，６３：４３７５−８１）
。ＲＩ（ＫＬＫＱＰＧ）（配列番号１２）またはＲＩＩ（ＥＷＳＰＣＳＶＴＣＧ
ＮＧＩＱＶＲＩＫ）（配列番号１３）由来のペプチドは、肝細胞へのＣＳ付着お
よびインビボでスポロゾイトによる感染をブロックした（Ｃｅｒａｍｉ，Ｃ．ら
、１９９２，Ｃｅｌｌ，７０：１０２１−３３；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．ら
、１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，６３：４３７５−８１）。ＲＩペプチ
ドおよびＲＩＩ＋ペプチドを、ＣＡＲインテグリンおよびαｖ−インテグリンへ
の付着をなくす変異を含むＡｄ５−ファイバーノブ（Ｈ−ＩおよびＧ−Ｈループ
）に別個に挿入した（Ｋｉｒｂｙ，Ｌ．ら、２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４
：２８０４−１３；Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．，２：７５０−６）。予備データに基づいて、短ファイバーを使用し、これ
によりウイルス侵入ストラテジーは、優先的に第１（肝細胞特異的レセプター）
との相互作用に依存する。肝細胞特異的リガンドは、フレキシビリティーを提供
する短いグリシンストレッチに隣接され、そして２つのシステインによって形成
されるループに組み込まれる。これは、リガンドをタンパク質の足場（ｓｃａｆ
ｆｏｌｄ）に組み込むため（Ｄｏｉ，Ｎ．およびＨ．Ｙａｎａｇａｗａ，１９９
８，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５４：３９４−４０４；Ｋｏｉｖ
ｕｎｅｎ，Ｅ．ら、１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），１３：２
６５−７０）およびタンパク質表面におけるリガンドの提示を保証するための古
典的なストラテジーの１つである。最良の改変体の生体分布を、異なる器官にお
いてベクターＤＮＡのためのサザンブロットまたはＰＣＲに基づいてＣ５７Ｂ１
／６マウスにおいてインビボで試験する。このマウス系統は、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅ
ｉでの感染に感受性であることが公知である（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓら、１
９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，６３：４３７５−８１）。
【０１９５】 （Ｋ．腫瘍細胞に対する上昇した親和性を有するアデノウイルスベクターの作
製） 同様のストラテジーは、繊維状ファージ上のランダムペプチドを示すことによ
る腫瘍親和性のための選択後に得られる２つのペプチドを挿入することである。
第１の二重サイクリックペプチド（ＲＧＤ−４）は、腫瘍脈管構造上に存在する
インテグリンへの特異的な付着を提供する（Ｅｌｌｅｒｂｙ Ｈ．Ｍ．ら、１９
９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ，５：１０３２−８）。第２のペプチドは、乳癌細胞株Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−４３５について示されたように転移性腫瘍細胞に付着する特異的な
マトリックス金属付着プロテイナーゼを標的化する（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｅ．ら
、１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：７６８−７４）。親和性改
変ベクターを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞由来の肝性転移を有する動物モデルに
おいて試験する（図２８）。
【０１９６】 （Ｌ．アデノウイルスに基づくペプチドディスプレイ技術の開発） アデノウイルスベクターがファイバーノブドメインのＧ−Ｈループにおいて、
ランダムペプチドを発現することを可能にする合成ペプチドライブラリーを、記
載する。ファージディスプレイライブラリーの技術を最適化し、これらのファイ
バーノブにおいて、ランダムペプチドをディスプレイするアデノウイルスのライ
ブラリーを作製する。次いで、アデノウイルス改変体のこのライブラリーを、イ
ンビトロ、および潜在的にインビボで、特定の細胞型に対する親和性についてス
クリーニングする。ペプチドライブラリーをコードするオリゴヌクレオチドは、
新規の技術を使用して、全部で２０個のアミノ酸についてのコドンを示す、予め
合成されたトリヌクレオチドを会合する。これは、終止コドンをやめそして最適
なコドンの使用およびヒト細胞における翻訳を保証する。代表的なライブラリー
サイズを維持するために、新たな「シームレス（ｓｅａｍｌｅｓｓ）」クローニ
ングストラテジーは、このライブラリーの野生型Ａｄ５ゲノムへの挿入を、置換
部位におけるさらなるアミノ酸の導入および細菌への形質転換なしで可能にする
。２９３細胞へのトランスフェクションを、ウイルスライブラリーＤＮＡをポリ
リジンを介してキャリアＡｄ５−ベースのアデノウイルスに結合体化することに
よって行い、１００％のトランスフェクション効率を保証する。重要なことに、
このキャリアアデノウイルスゲノムは、ｌｏｘ部位に隣接するそのパッケージン
グシグナルを有する。ｌｏｘ部位は、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する２９３細
胞（２９３／ｃｒｅ）の感染後のキャリアウイルスＤＮＡのパッケージングを防
ぐ。ＣＡＲおよびインテグリン親和性が枯渇されたＥ１陽性イルスを有するライ
ブラリーを産生する。目的の細胞型に首尾よく感染した改変体のみが複製し、デ
ノボで産生されたウイルス生じる。次いで、特定の親和性が付与されたペプチド
リガンドの配列を、デノボで産生されたウイルスにおいて分析する。
【０１９７】 （実施例ＩＩＩ） （新規のアデノウイルスベクターおよび改変ファイバータンパク質の組み合わ
せ） 本実施例は、全てのアデノウイルス遺伝子を欠失するアデノウイルスベクター
の組み込み技術を、静止性のＨＳＣに対してベクターを再標的化する改変ファイ
バータンパク質とを組み合わせる以下の研究を記述する。
【０１９８】 （Ａ．ＨＳＣにおける再標的化ベクターを用いる形質導入研究） 静止性のＨＳＣを形質導入し、かつ染色体ＤＮＡに組み込むために、再標的化
されたΔＡｄ．ＡＡＶfxベクターを、レポーター遺伝子発現、およびそれらの腫
瘍細胞感受性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）能力を分析する一方、同時にベクター組
み込みについて試験する。改変ΔＡｄ．ＡＡＶfxハイブリッドベクターは、全て
のアデノウイルス遺伝子を欠失するゲノムを含み（「弱活力（ｇｕｔｌｅｓｓ）
」アデノウイルスベクター）、これは、改変されたファイバーを有するＡｄ５キ
ャプシドにパッケージングされる。Ｒｅｐは、これらのΔＡｄ．ＡＡＶfxベクタ
ーに取り込まれ、ＡＡＶＳ１への部位特異的組み込みを可能にし得る。
【０１９９】 （形質導入研究） ＩＭＤＭ／ＦＣＳ＋ＩＬ−３およびＳＣＦにおいて精製されたヒトＣＤ３４＋
細胞を、異なる用量のΔＡｄ．ＡＡＶfx−ＢＧ（細胞あたり１〜１０7ゲノム）
で感染する。ΔＡｄ．ＡＡＶfx−βＧａｌで感染されたＣＤ３４＋細胞を、懸濁
液の状態で２日間培養し、基質としてＦＤＧを用いるＦＡＣＳによってβ−Ｇａ
ｌ＋細胞を選別する。これは、感染効率を決定する。次いで、β−ｇａｌ発現細
胞を、多数のサイトカイン（ＩＬ−３、ＳＣＦ、Ｅｐｏ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、ＩＬ−７、Ｔｐｏ）の存在下で半固体培養（ＭＯＩあたり２つの皿）にお
いて試験管内腫瘍細胞感受性試験にかける。半固体培養の第１のセットを、７日
後に評価し得る；別のセットは、１４日後に分析し得る。半固体培養において形
成されたコロニーを、光学顕微鏡によって特徴付け得、そしてその後、Ｘ−Ｇａ
ｌ染色で染色した。ほとんどのベクターゲノムは、エピソームのままであり、そ
して連続的な細胞分裂により失われ得る。従って、ほとんどの細胞は、感染から
２日または７日後にＸ−Ｇａｌ陽性であり得るが、より大きなコロニーのほとん
ど（感染後１４日で分析された）は、β−Ｇａｌについて均一に染色し得ない。
代表的な数のＸ−Ｇａｌ陽性コロニーおよびＸ−Ｇａｌ陰性コロニーを拾い、そ
してエピソームおよび組み込まれたベクターＤＮＡについて分析した。この結果
は、感染に用いたＭＯＩおよびベクターの組み込み状況に依存する。これらの研
究は、ハイブリッドベクターが、初代始原細胞を感染し得るか否かを決定する。
【０２００】 （ハイブリッドベクターの組み込みの詳細な特徴付） ＣＤ３４＋細胞を、ΔＡｄ．ＡＡＶfx−ＳＮｏｒｉ（ＭＯＩ １〜１０7）で
感染し得、そしてメチルセルロース（ＭＣ）培養において増殖因子（ＩＬ−３お
よびＳＣＦ）の存在下でＧ４１８選択に供し得る。得られるコロニーは、主に骨
髄性細胞の混合物である。Ｇ４１８耐性コロニーの数および形態学を、選択から
２週間後に決定し得る。このストラテジーでは、用いた特定の培養条件下で、適
切な幹細胞が分裂し得ず、かつＧ４１８耐性コロニーを形成し得ないという不都
合があり得る。さらに、このストラテジーは、異種細胞の集団に対してＧ４１８
選択を実行することが困難であり得、これは、Ｇ４１８に対するこれらの細胞の
感受性において変化する。従って、ΔＡｄ．ＡＡＶfx−ＳＮｏｒｉ感染ＣＤ３４
＋細胞の別のセットを、Ｇ４１８選択なしでメチルセルロース（＋ＩＬ−３、Ｓ
ＣＦ）において培養し得る。２〜３週間後、単一コロニーを、両方（ｗ／および
ｗ／ｏ Ｇ４１８）のＭＣ培養物から拾い、形態学的に特徴付け、そして少数の
細胞における組み込み研究のために開発された改変プロトコルを用いて組み込み
ベクターについて分析し得る（図８を参照のこと）。このストラテジーは、ハイ
ブリッドベクターが増殖因子の存在下で培養されたＣＤ３４＋細胞のゲノムに組
み込まれているか否かの評価を可能にする。この研究は、本発明者に組み込みベ
クターのコピー由来のｎｅｏまたはβｇａｌ発現に影響する潜在的な位置効果に
ついて、および組み込みベクターおよび隣接する染色体領域の構造についてのア
イデアを与える。
【０２０１】 （ベクターの取り込みを確認する代替方法） 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を、ＭＣコロニー
由来の個々の細胞において実施し得る。ＣＤ３４＋細胞を、増殖因子の存在下で
ＭＣにおいて培養して細胞分裂を誘導し、引き続いてコルヒチンを用いて処理し
た。中期染色体の拡散を、βＧａｌまたはＳＮｏｒｉ遺伝子に特異的なビオチン
ＡＴＰ標識プローブおよび内部コントロールとしてヒトＸ染色体に対するジゴキ
シゲニン−ＵＴＰ標識プローブを用いて分析する（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｄｉｓ
ｔｅｃｈｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎにより提供さ
れる）。特異的なハイブリダイゼーションを、異なる蛍光色素（例えば、ＦＩＴ
ＣおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）を用いて標識される、対応する抗ビオチンまたは
抗ＤＩＧ抗体を用いて可視化し得る。ハイブリッドベクターＤＮＡは、コンカテ
マーとして組み込み得、これは、ＦＩＳＨによる検出を容易にする。この技術は
、ハイブリッドベクターの染色体組み込み部位を局在化することを可能にするも
のである。
【０２０２】 （静止性の骨髄副集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）への試験形質導入） これまで記載されたハイブリッドベクターを、静止性のＣＤ３４＋細胞が安定
に形質導入され得るか否かを理解するかを調べるために試験し得る。有意な細胞
増殖を避けるために、精製されたＣＤ３４＋細胞をトロンボポイエチン（Ｔｐｏ
）を補充したＩＭＤＭを含まない血清中で培養する。Ｔｐｏは、単独で、幹細胞
の活性な細胞増殖を刺激することなく、幹細胞の生存を補助し得る（Ｍａｔｓｕ
ｎａｇａ， Ｔ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９２：４５２−６１；Ｐａｐａｙ
ａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｔ．ら，１９９６，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍ
ａｔｏｌｏｇｙ，２４：６６０−６９）。ハイブリッドベクターΔＡｄ．ＡＡＶ fx ＢＧを用いた感染時点で、ＣＤ３４＋細胞の増殖状態を分析するために、Ｂｒ
ｄＵを、感染の２時間前に培養培地へ添加する。１組の細胞を、２日間、Ｔｐｏ
のみを含むＩＤＡＭにおいて懸濁培養として維持する。別の組の細胞を、複数の
サイトカインを用いて補充されたＩＤＡＭ＋Ｔｐｏにおいて増殖する。感染４８
時間後、ＣＤ３４＋細胞を、ＦＤＧを用いてβＧａｌ発現についてＦＡＣＳによ
り分類し得る。ＦＤＧ陽性細胞を、ＢｒｄＵの組み込みに基づいて細胞性ＤＮＡ
複製についてさらに分析し得る。これをするために、ＦＤＧ＋細胞由来のサイト
スピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）を、および特異的なＣＤ３４＋サブセットマーカー
について、ＢｒｄＵ特異的抗体を用いて、かつ特異的細胞表面マーカー（例えば
、ＣＤ３８、ＣＤ４１）に対する抗体を用いて、免疫蛍光にかけ得る。あるいは
、同じ細胞の連続パラフィン切片を、以下について分析し得る：（ａ）Ｘ−Ｇａ
ｌ染色による導入遺伝子発現、（ｂ）ＢｒｄＵの組み込みに基づくＤＮＡ合成、
および（ｃ）特異的表面マーカー。これは、Ｔｐｏを単独で含む培養条件が有意
なゲノムＤＮＡ複製およびそれに続く細胞増殖を妨げることを確認し、ならびに
静止性のＣＤ３４＋細胞に、ＢｒｄＵ標識が存在しない細胞におけるβＧａｌ発
現に基づいて、感染し得るか否かを決定することを可能にするものである。
【０２０３】 （静止性のＣＤ３４＋細胞への試験ハイブリッドベクターの組み込み） ＣＤ３４＋細胞の２つのセットに感染させる。ΔＡｄ．ＡＡＶfxＳＮｏｒｉに
感染された細胞の第１のセットを、サイトカインの存在下で５〜７日間培養し；
他方のセットをサイトカインなしで培養する。この期間、サイトカインなしでＣ
Ｄ３４＋細胞を生育可能に維持するために、細胞を、Ｔｐｏの存在下で培養する
か、または下に間質細胞株（ＡＦＴ０２４）を置いた（Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．ら，１
９９７，Ｂｌｏｏｄ ８９：４３３７−４７）。これにより、４〜７週間生存可
能なＨＳＣを維持し得る。この特定の期間の後、両方のセットを、Ｇ４１８選択
と組み合わせてか、または選択なしのいずれかで、試験管内腫瘍細胞感受性試験
（複数のサイトカインの存在下）にかける。単一のコロニーを、形態学的に分析
し、かつゲノムＤＮＡ分析（図８）に供して、ベクター組み込み状態を決定する
。幹細胞の形質導入についての最終試験は、インビボ生存アッセイ／増殖アッセ
イである。これを行うために、βＧａｌを発現するＣＤ３４＋細胞を、移植実験
のために使用する。ＦＤＧ＋細胞の数が不十分である場合、総ΔＡｄ．ＡＡＶfx ＢＧ感染細胞ならびに全てのΔＡｄ．ＡＡＶfxＳＮｏｒｉ感染細胞を、選択なし
に直接使用し得る。移植を、致死量以下で照射されたＳＣＩＤ ＮＯＤマウスに
、尾静脈注射を介して実施し得る（Ｄａｏ，Ｍ．Ａ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ
，４，１２４３−１２５５；Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏ
ｄ，９２：４５２−６１）。移植後の異なる時点（４〜８週）で、マウスを、骨
髄細胞を得るために屠殺し得る。次いで、この骨髄細胞を、以前に記載されるよ
うなＸ−Ｇａｌおよび細胞マーカーについての種々のアッセイを実施するまで、
懸濁中で培養し得る。これらの細胞をまた、ＳＣＩＤ ＮＯＤマウスへのＭＣま
たは２次移植において、２次コロニーアッセイにかけ得る。さらに、これらの細
胞由来のＭＣコロニーを、図８において例示される方法により、組み込まれたベ
クターの存在について分析し得る。この発現データおよび組み込みデータと合わ
せて、再増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）効果についておよび潜在的な位置効
果についての結論を可能にする。
【０２０４】 （Ｂ．造血幹細胞におけるγ ｒ−グロビン発現のためのΔＡｄ．ＡＡＶfxベ
クターの最適化） 本発明の１つの特定の実施形態は、（ａ）赤血球系細胞特異的プロモーターの
制御下の導入遺伝子としてのγ−グロビンを有する再標的化ハイブリッドベクタ
ーを構築すること、（ｂ）インビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて
ハイブリッドベクターでの形質導入の後のγ−グロビン発現のレベルおよび動態
（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を分析すること、（ｃ）必要な場合、ハイブリッドベクタ
ーに組み込まれたγ−グロビンＬＣＲまたはインシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔ
ｏｒ）を用いて、位置効果から遺伝子発現を保護すること、および（ｄ）γ−グ
ロビンイントロンまたは異種イントロンが、γ−グロビン発現を上昇し得るか否
かを研究することである。
【０２０５】 本発明の別の主要な問題は、ハイブリッドベクターが、ｒＡＡＶおよびレトロ
ウイルスよりもより大きな導入遺伝子に適応し得ることを実証することである。
これらのベクターの挿入サイズの制限は、５ｋｂである。８ｋｂまでの導入遺伝
子カセットを、記載のようにハイブリッドベクターに挿入し得る。ハイブリッド
ベクターを、対応するパッケージング細胞株におけるＥ２ａおよび／またはＥ４
欠失ｒＡｄベクターに基づいて作製する場合、最大の挿入サイズは、約１４ｋｂ
であり得る。ハイブリッドベクターにおける最大の挿入サイズは、ラージスケー
ルでのハイブリッドウイルスの作製のために必要な中間体である第１の作製ベク
ター（Ａｄ．ＡＡＶ）（＜３６ｋｂ）のパッケージング制限によって決定される
。８ｋｂのグロビン遺伝子カセットを有するＡｄ．ＡＡＶベクターの安定性およ
び力価は、Ａｄ．ＡＡＶＢＧ、Ａｄ．ＡＡＶ１、およびＡＤ．ＡＡＶＳＮｏｒｉ
において使用される２．５〜３．５ｋｂのカセットを含むベクターに相当する。
以下の実施例の実験は、これらの問題に取り組む。
【０２０６】 （ラージグロビン発現カセットを有するΔＡｄ．ＡＡＶfxの作製） 鎌状赤血球症の状態を改善するために、移入されたγ−グロビン遺伝子の発現
レベルは、各内因性β遺伝子の少なくとも５０％でなければならない。これらの
導入遺伝子の発現レベルを、γ遺伝子を含む伸張したＬＣＲおよびイントロンを
含む最適な発現カセットを用いることによってのみ達成し得る。（Ｆｏｒｒｅｓ
ｔｅｒ，Ｗ．Ｃ．ら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３，１３５９−１３６３；Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．ら、１９９８，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、１０，３６１−３６５；Ｇｒｏｓ
ｖｅｌｄ，Ｆ．ら、１９９８，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ
，３５，１０５−１１１；Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．ら、１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，
６：４８８−９５）。現在までに、γ−グロビン発現カセットのほとんどが、レ
トロウイルスベクターおよびｒＡＡＶベクターのために設計され、従って５ｋｂ
未満であり、かつ内部スプライシング部位またはポリアデニル化シグナルを欠失
していなければならない。本明細書中に記載の組み込みベクターにおいて、この
サイズの制限を超えることが可能である。これは、適切な発現レベルかつ長期間
の持続性に関して骨髄細胞におけるγ−グロビン発現を改善することを可能にす
る。この目的のために、Ｌｉら（Ｅｍｅｒｙ，Ｄ．Ｗ．ら、１９９９ Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：８７７−８８；Ｌｉ、Ｑ．ら、１９９９，Ｂｌｏｏ
ｄ ９３：２２０８−１６）によって開発されたγ−グロビン構築物またはＥｌ
ｌｉｓら（Ｅｌｌｉｓ，Ｊら、１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５，５６２−５６８
；Ｅｌｌｉｓ，Ｊら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，
１２９６−１３０２）によって開発されたγ−グロビン構築物を選択する。
【０２０７】 （ｉ）第１のカセットは、レトロウイルスベクターにおいて使用されたγ−グ
ロビン発現単位を含む。これは、２つの系の間の直接の比較を可能にする。この
構築物は、βプロモーター（−１２７からβ開始コドンまで）を含み、このプロ
モーターは、γコード領域とインフレームで連結される。このβプロモーターは
、ヒトαグロビン遺伝子座（これは、グロビン発現のための強力なエンハンサー
として作用する）由来の３００ｂｐのＨＳ４０と結合される。このグロビン遺伝
子は、イントロン１および部分的に欠失したイントロン２を有する１．１ｋｂバ
ージョンである。完全な３．３ｋｂのγグロビン遺伝子を有するＨＳ４０βプロ
モーターおよびγグロビン遺伝子を含む第２のカッセトを作製する。
【０２０８】 （ｉｉ）第２の構築物は、６．５ｋｂのβμＬＣＲを含む。このβμＬＣＲは
、優性のクロマチンオープニング（ｏｐｅｎｉｎｇ）活性およびトランスジェニ
ックマウスにおけるγグロビン発現の適切なレベルを付与する。このＬＣＲは、
短い１．１ｋｂバージョンのγグロビン遺伝子または完全な３．３ｋｂのγ遺伝
子に連結される。
【０２０９】 （ｉｉｉ）インシュレーター、ＭＡＲまたはＳＡＲ、ならびに組み込みベクタ
ー由来の導入遺伝子の発現またはトランスジェニック動物における導入遺伝子の
発現を改善し得る他のエレメント（ＨＰＲＴ遺伝子またはｈＧＨ遺伝子由来のイ
ントロンのような）を含むさらなるグロビン発現カセットを作製し得る（Ｃｈｕ
ｎｇ，Ｊ．Ｈ．ら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９４，５７５−５８０；Ｄｕｎａｗａｙ，Ｍ．ら、１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，１８２−１８９；Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，Ｇ．ら、１９
９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，９３８４０−９
３８８；Ｋｌｅｈｒ，Ｄ．ら、１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１
２６４−１２７０）。
【０２１０】 （ΔＡｄ．ＡＡＶｆｘ−グロビンベクターを用いる形質導入研究） グロビンハイブリッドベクターを用いる形質導入研究を、以前に記載のように
実行する（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．ら、１９９９，Ｊ Ｖｉｒｏｌ
７３：９３０３−１３）。形質導入したＣＤ３４＋細胞は、コロニーアッセイ
において分化を受けるか、またはＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスにおいてインビボ増殖
アッセイで分析される。実験マウス由来のＭＣコロニーまたは骨髄細胞を、グロ
ビン発現について分析する。γグロビン発現を、蛍光抗γグロビン抗体を用いて
測定する。ＲＮＡａｓｅ保護研究を行い、グロビンＲＮＡと比較してγグロビン
ｍＲＮＡを特異的に定量し得る。これらの研究について、およそ１０4〜１０5細
胞が、試験１回あたり必要である。
【０２１１】 （位置効果） ＬＣＲの非存在において、グロビン遺伝子を、培養ＣＤ３４＋細胞株または赤
白血病株に移入する場合、グロビン遺伝子は、強力な位置効果に供される（Ｆｒ
ａｓｅｒ，Ｐ．ら、１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏ．，１０，３６１−３６５；Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．ら、１９９８，Ｓｅｍ
ｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３５，１０５−１１１）。別の問題
は、ＡＡＶＳ１への、ΔＡｄ．ＡＡＶ／ｒｅｐベクターの部位特異的組み込みが
、導入遺伝子発現を封じ込め（ｓｉｌｅｎｃｅ）得るということである。封じ込
めが起る場合、６．５ｋｂのγグロビンμＬＣＲ（Ｅｌｌｉｓ，Ｊら、１９９６
，ＥＭＢＯ Ｊ．１５，５６２−５６８；Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．ら、１９９８
，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３５，１０５−１１１）の
ようなＬＣＲまたはインシュレーターのΔＡｄ．ＡＡＶベースの発現単位への組
み込みによって克服され得る。インシュレーターは、染色体位置効果から組み込
まれたレポーター遺伝子を保護するか、または下流のプロモーターからエンハン
サー活性化転写をブロックするＤＮＡエレメントである。インシュレーターエレ
メントは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ遺伝子（Ｇｙｐｓ
ｙ，Ｈａｉｒｙ ｗｉｎｇのサプレッサー、ｓｃｓ、ｓｃｓ’、Ｆａｂ−７）に
ついて、ニワトリβグロビン遺伝子（ＨＳ４）について、およびＴ細胞レセプタ
ー（ＢＥＡＤ１；１４，２１．２５）について公知である。詳細には、Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａ ｇｙｐｓｙまたはβグロビンインシュレーターを、グロビン発現
カッセトに隣接する２つのコピーとしてハイブリッドベクターに挿入し得る。こ
の位置効果を、組み込まれたベクターＤＮＡの分析（図２９を参照のこと）およ
びγグロビンｍＲＮＡの定量化に基づいて、形質導入されたＭＣコロニーにおい
て試験し得る。類似の研究を、感染したＣＤ３４＋細胞のＳＣＩＤ−ＮＯＤマウ
スへの移植後に得られた形質導入されたヒト骨髄細胞対して実行し得る。
【０２１２】 （γグロビン発現に対するイントロン効果） 多数の報告は、グロビンイントロン、特にβ遺伝子およびγ遺伝子の第２のイ
ントロンの欠失が、グロビンｍＲＮＡの安定性（従って発現レベル）を減少させ
ることを示す（Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｍら、１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．，２６：７２１−９）。ＲＮＡウイルス（例えば、オンコレトロウイ
ルス、レンチウイルス、およびホーミー（ｆｏａｍｉ）ウイルス）は、イントロ
ン含有導入遺伝子のためのビヒクルとして問題がある。ΔＡｄ．ＡＡＶは、ＤＮ
Ａウイルスであるので、必要な場合、これは、力価の減少およびレトロウイルス
ベクターとともに観察される再配列なしにグロビンイントロンおよびＬＣＲをパ
ッケージングするべきである。
【０２１３】 （付録Ｉ） （アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能な、ヒトおよび動物のア
デノウイルス）
【０２１４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｃは、ΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムの形成のための提唱される機構を表
示する。
【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、ハイブリッドウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。図
２Ａは、Ａｄ．ＡＡＶ１を示し、そして図２Ｂは、ΔＡｄ．ＡＡＶ１を示す。
【図３】 図３は、ＳＫＨＨｅｐ１細胞の形質導入後のΔＡｄ．ＡＡＶ１ゲノムの分析を
示す。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）。１×１０６コントロールＳ
ｋ Ｈｅｐ１細胞（ＳＫＨｅｐ１）（レーン１〜３、５、９）、Ｇ４１８耐性プ
ールからのＳＫＨｅｐ１細胞（ΔＡｄ．ＡＡＶ１）（ｈＡｄ．ＡＡＶ１に感染さ
せ、そして４週間にわたり選択した）（レーン６−８、１０−１２）、またはＳ
ＫＨｅｐ１細胞を、２０００ゲノムのＡｄ．ＡＡＶ１（Ａｄ）での感染後４日で
収集した（レーン４、１３））は、インサイチュで溶解され、そして制限エンド
ヌクレアーゼでの消化のあるなしでＰＦＧＥに供されるアガロースプラークに封
入される。サザンブロットを、ＳＥＡＰ特異的プローブで行う。Ｕ＝消化せず、
Ｐ＝ＰＩ−ＳｃｅＩで消化する、Ｉ＝Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＥＩ。
【図４】 図４Ａおよび４Ｂは、ｈＡｄ．ＡＡＶＢＧで感染した後の、それぞれＫ５６２
およびＣＤ３４＋の応答を示す。細胞を、振盪下でウイルスと６時間にわたりイ
ンキュベートする。感染後３日目に、形質導入頻度をＸ−Ｇａｌ陽性細胞の数に
基づいて算出する。生存率をトリパンブルー排除により試験する。Ｎ＝３、ＳＥ
Ｍ＜１０％。
【図５】 図５は、ＳＫＨｅｐ１および２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクシ
ョン後のＲｅｐ発現を示す。５×１０5細胞を、リン酸カルシウムとの共沈によ
りｐＡＡＶ／Ａｄ．、ｐＲＳＶｒｅｐ、またはｐＰＧＫｒｅｐでトランスフェク
トする。トランスフェクション後３日で、細胞を採取する。溶解物を１０％ＰＡ
ゲル上で分離し、続いてＲｅｐ特異的抗体（０３−６５１６９、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）でウェスタンブロットし、そしてＥ
ＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させる。
【図６】 図６は、ＰＦＧＥによるＡＡＶＳ１へのベクター組み込みの検出を示す。
【図７】 図７は、部位特異的な組み込みをし得るｈＡｄ．ＡＡＶハイブリッドベクター
を作製するための戦略を示す。矢印は、プロモーターを示す。（ＰＡ）＝ポリア
デニル化シグナル。Ｔ＝アデノウイルスパッケージングシグナル。
【図８】 図８Ａ−８Ｂは、発現単位としてＳＮｏｒｉを用いた形質導入研究のためのベ
クター、および少数の細胞数からのＤＮＡゲノムにおけるベクター組み込みの分
析を示す。類似のベクターのセットは、β−ガラクトシダーゼ（ＢＧ）または緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をレポーター遺伝子を用いて生成し得る。
【図９】 図９は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えに、異種ファイバーＸ遺伝子によって、
Ａｄ５ファイバーを置換するための戦略を示す。
【図１０】 図１０は、ＣＡＲの発現およびαvインテグリンの試験細胞における発現を示
す。フローサイトメトリー分析のために、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、Ｋ５６２、および
ＣＤ３４＋ の細胞をモノクローナル抗ＣＡＲ（ＲｍｃＢ、１：４００希釈）ま
たは抗αＶインテグリン抗体（Ｌ２３０、１：３０希釈）とともにインキュベー
トした。陰性コントロールとして、細胞は、無関係なモノクローナル抗体（抗Ｂ
ｒｄＵ１：１００希釈）とともにインキュベートした。一次抗体の結合を、抗マ
ウスＩｇＧ ＦＩＴＣ標識された結合体（１：１００希釈）．を用いて発色した
。示すデータは、１０4細胞で行われた４連の分析の平均の結果を示す。
【図１１】 図１１は、アデノウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。Ａｄ５．９および３
５から精製された粒子は、陰性のコントラストで染色され、そして８５，０００
倍で分析した。欠損粒子は、矢印で強調する。
【図１２】 図１２は、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、５６２、およびＣＤ３４＋の細胞に対する、異
なる血清型の付着およびインターナリゼーションの分析を示す。Ａｄ３、Ａｄ４
，Ａｄ５、Ａｄ９、Ａｄ３５およびＡｄ４１の、等量の［3Ｈ］チミジン標識し
たビリオン（ＯＤ２６０によって測定され、Ａｄ５について１細胞あたり４００
ｐｆｕのＭＯＩと等価である）を、材料および方法に記載されるように氷上で１
時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そして１細胞あたりに付着し
た、標識されたビリオンの数を、決定した。インターナリゼーション研究につい
て、ビリオンをまず、氷上で細胞に１時間付着させる。次いで、付着していない
ウイルス粒子を洗浄して出す。次いで細胞を３７℃で３０分間インキュベートし
、次いでトリプシン−ＥＤＴＡで処理し、そして洗浄してインターナリゼーショ
ン化していないウイルス粒子を取り除く。そのデータは、３連で行った２〜４の
独立した実験から得た。ＣＤ３４＋細胞についてのＹ軸における異なるスケール
に留意のこと。
【図１３Ａ】 図１３Ａ〜１３Ｃは、それぞれＨｅｌａ、ＣＨＯおよび２９３細胞に対する異
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
【図１３Ｂ】 図１３Ａ〜１３Ｃは、それぞれＨｅｌａ、ＣＨＯおよび２９３細胞に対する異
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
【図１３Ｃ】 図１３Ａ〜１３Ｃは、それぞれＨｅｌａ、ＣＨＯおよび２９３細胞に対する異
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
【図１４】 図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれＣＤ３４＋細胞およびＫ５６２細胞に対す
る異なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
【図１５】 図１５Ａ〜１５Ｃは、メチル化されたウイルスＤＮＡのサザンブロット分析に
よる、Ｋ５６２細胞およびＣＤ３４＋細胞におけるウイルス複製の分析を示す。
複製研究を、メチル化Ａｄ５、ＡＤ９またはＡｄ３５に感染させた、１×１０5
のＫ５６２細胞（Ａ）またはＣＤ３４＋細胞（Ｂ）を用いて行った。「ロード」
と標識されたレーンは、指定されたウイルス用量を細胞に添加した直後に培地／
細胞混合物から抽出されたＤＮＡを示す。メチル化およびメチル化されていない
ウイルスＤＮＡに対応するバンドの強度は、入力したウイルスの約８５％がメチ
ル化されたことを示す。吸収およびインターナリゼーションを定量するために、
０℃（吸収）または３７℃（インターナリゼーション）で細胞とウイルスとのイ
ンキュベーションの前に、ＤＮＡ分析を行った。用量依存複製研究のために、イ
ンキュベートされたウイルス用量（ゲノム数として表す）をその細胞へと添加し
、そして細胞ゲノムＤＮＡをウイルスＤＮＡとともに、感染後１６時間または３
６時間、それぞれＫ５６２およびＣＤ３４＋細胞について抽出した。同一量のサ
ンプルＤＮＡをサザンブロットによって分析した。定量の目的のために、Ａｄ９
複製を、両方の血清型のＤＮＡとハイブリダイズする、Ａｄ５／９キメラプロー
ブを用いて、Ａｄ５とともに分析した（Ｃ）。Ａｄ５対Ａｄ３５複製の分析を、
対応するＡｄ５／３５キメラプローブを用いて行った。Ａｄ５／３５およびＡｄ
５／９プローブとの別個のハイブリダイゼーションは、Ａｄ５ ＤＮＡについて
同一のシグナル強度を与えた。１つのみのパネルを試験細胞におけるＡｄ５複製
のために示す。ウイルスゲノムのメチル化された状態またはメチル化されていな
い状態について特異的な識別可能なフラグメントを生成するために、Ａｄ５ Ｄ
ＮＡをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩとともに消化した。メチル化された（複製
されていない）ウイルスＤＮＡについて特異的なバンドは、Ａｄ９について約１
２ｋｂであり、Ａｄ５について約３５ｋｂであり、そしてＡｄ３５について約１
２ｋｂであった。メチル化されていないＤＮＡについて特異的なフラグメントは
、Ａｄ９について５．８ｋｂであり、Ａｄ５について６．１ｋｂであり、そして
Ａｄ３５について９．５ｋｂであった。キメラＡｄ５／９およびＡｄ５／３５の
ＤＮＡフラグメント（１．８ｋｂ）を、定量標準として用いて、そしてウイルス
／細胞ＤＮＡとともにゲル上に適用した（図の左部に示す）。
【図１６】 図１６Ａ〜図１６Ｂは、ＡＤ５ＧＦＰベクターおよびキメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ
３５ベクターの構造を示す。Ａ）ＧＦＰ発現カセットがＥ３領域に挿入された（
Ａｄ５ＧＦＰ）もとのＥ１／Ｅ３欠失Ａｄ５ベースのベクターおよびＡｄ５／３
５ファイバー遺伝子を含むキメラベクターＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５の模式図。２．
２ｋｂのＡｄ５ファイバー遺伝子は、ＰＣＲクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉに
おける組換えを含む技術によって、Ａｄ３５の短シャフトおよびノブをコードす
る０．９ｋｂキメラファイバー遺伝子によって置換される。ファイバー遺伝子内
または周りに配置されるＫｐｎＩ（Ｋ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）部位が示さ
れる。下のパネルは、キメラファイバー領域の詳細な構造を示す。Ａｄ５ファイ
バーテイル（アミノ酸（ａａ）：１−４４）を、その最初の２アミノ酸（ＧＶ）
から始まるＡｄ３５ファイバーシャフトに対してインフレームで連結した。これ
は、多くの血清型の間で保存される。保存されたストレッチのアミノ酸ＴＬＷＴ
は、Ａｄ３５シャフトの最後のβシートと、球状ノブとの間の境界を示す。この
Ａｄ３５ファイバー鎖末端コドンのに続き、Ａｄ５ファイバーポリアデニル化シ
グナルが存在する。キメラファイバーをコードするＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５の領域
は、Ａｄ５特異的プライマー（材料および方法を参照のこと）を用いて完全に配
列決定した。Ｂ）ウイルスゲノムの制限分析。ウイルスＤＮＡを、精製されたＡ
ｄＧＦＰ粒子およびＡｄＧＦＰ／Ｆ３５粒子から他の場所に記載されるように単
離した。１μｇのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩまたはＫｐｎＩを用いて消化し、そし
てエチジウムブロミド染色したアガロースゲル（左のパネル）中で分離し、これ
を次いでブロットし、そしてＡｄ５ Ｅ４特異的プローブ（ｎｔ３２．７７７５
−３３．６５１）を用いてサザンブロットにより分析した（右のパネル）。特異
的なパターン（これは両方のウイルスベクターについて正しい構造を示す）が検
出された。Ａｄ５ＧＦＰおよびＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５に対して特異的なＨｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントは、それぞれ２．９ｋｂおよび４．９ｋｂであった。正しい
Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５構造を確認したＫｐｎＩフラグメントは、７．６ｋｂ Ａ
ｄ５ＧＦＰフラグメントに対して１．６ｋｂであった。Ｍ−１ｋｂラダー（Ｇｉ
ｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）。
【図１７】 図１７は、反転した相同性領域の間の組換えによるΔＡｄ．ＡＡＶゲノムの生
成を示す。１つのＡｄ．ＡＡＶベクター中に存在する２つの逆方向反復（ＩＲ）
。第一世代のＡｄ．ＡＡＶベクター（約３４ｋｂ）は、導入カセットに隣接する
、２つの１．２ｋｂ逆方向相同性エレメントを含む。１つのＡＡＶ−ＩＴＲは、
Ａｄパッケージングシグナル（Ψ）と左側のＩＲとの間に挿入される。Ａｄ複製
の間、Ｉｒの間の組換えは、Ｉｒに隣接する導入遺伝子、ＡＡＶＩＴＲ、Ａｄパ
ッケージングシグナルおよびＡｄ ＩＴＲを含むΔＡｄ．ＡＡＶゲノムの形成を
媒介する。これらのゲノムは、Ａｄキャプシドへと効率よくパッケージングされ
る。
【図１８】 図１８は、Ａｄ５／１１、Ａｄ５／３５の構造を示す。ＧＦＰ発現カセットが
Ｅｒ領域に挿入された、もとのＥ１／Ｅ３欠損Ａｄ５０ベースのベクター（Ａｄ
５ＧＦＰ）およびＡｄ５／３５ファイバー遺伝子を含むキメラベクターＡｄ５Ｇ
ＦＰ／Ｆ３５の模式図。２．２ｋｂ Ａｄファイバー遺伝子を、ＰＣＲクローニ
ングおよびＥ．ｃｏｌｉにおける組換えを含む技術によって、Ａｄ３５の短シャ
フトおよびノブをコードする０．９ｋｂのキメラファイバー遺伝子により置き換
える。ファイバー遺伝子内またはその周りに局在化するＫｐｎＩ（Ｋ）およびＨ
ｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）部位を示す。下のパネルは、キメラファイバー領域の詳細な
構造を示す。Ａｄ５ファイバーテイル（アミノ酸（ａａ）：１−４４）を、その
最初の２アミノ酸（ＧＶ）で始まるＡｄ３５ファイバーシャフトにインフレーム
で連結した。これは、多くの血清型で保存される。保存されたストレッチのアミ
ノ酸ＴＬＷＴは、Ａｄ３５シャフトの最後のβシートと、球状ノブとの間の境界
を示す。このＡｄ３５ファイバー鎖末端コドンのに続き、Ａｄ５ファイバーポリ
アデニル化シグナルが存在する。
【図１９】 図１９は、標識されたＡｄ５ＧＦＰビリオン、Ａｄ３５ビリオン、およびキメ
ラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ビリオンの、標識されていないウイルス、および抗ＣＡ
Ｒまたは抗αv−インテグリンＭａｂとの付着およびインターナリゼーションに
ついての交差競合を示す。（Ａ）付着研究のために、１０5のＫ５６２細胞を、
１００倍過剰の標識されていない競合物ウイルスとともに４℃で１時間プレイン
キュベートした。次いで、等量の［3Ｈ］標識ウイルスを、Ａｄ５ＧＦＰについ
て決定された、細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩに等価な用量で細胞に加えて、
その後４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷冷したＰＢＳで洗
浄し、ペレット化し、そして付着したウイルスのパーセンテージ（１分間あたり
に細胞に接着した数）を決定した。インターナリゼーションについての交差競合
の分析のために、細胞を、１００倍過剰の競合物ウイルスとともに３７℃で３０
分間インキュベーションし、その後ウイルスを添加する。３７℃で３０分間のさ
らなるインキュベーションの後、細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡで５分間３７℃
で処理し、氷冷したＰＢＳで洗浄し、ペレット化し、そしてインターナリゼーシ
ョンしたウイルスのパーセンテージを決定した。コントロールのために、細胞を
、いかなるインヒビターをも含まない標識したウイルスとともにインキュベート
した。予備的は実験は、競合研究のために選択された条件が、すべての標識され
ていない競合物について、Ｋ５６２細胞上の付着／インターナリゼーションにお
いて飽和を可能にすることを示した。（Ｂ）１０5のＫ５６２細胞を、抗ＣＡＲ
ＭＡｂ（ＲｍｃＢ、１：１００希釈）または抗αvインテグリン ＭＡｂ（Ｌ
２３０、１：３０希釈）とともに４℃で１時間プレインキュベートし、続いて、
上記のように、付着のためのプロトコルまたはインターナリゼーションのための
プロトコルに従って、標識したウイルスとともにインキュベートした。各特定の
血清型について、付着／インターナリゼーションウイルスのパーセンテージを、
コントロールの設定と比較した。ここでは、細胞を、１：１００希釈の関連しな
い抗体（抗ＢｒｄＵ Ｍａｂ）を用いる同じ条件下でプレインキュベートし、そ
の後、標識したウイルスを添加する。特定の競合物は、公開されたデータ（５９
）と一致する程度まで有意にＡｄ５インターナリゼーションを阻害したが、対応
するコントロールは阻害しなかったことに注目のこと。Ｎ＞／＝４。
【図２０】 図２０は、［3Ｈ］標識したＡｄ５ＧＦＰビリオン、Ａｄ３５ビリオン、およ
びキメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ビリオンの、標識されていないＡｄ３ウイルスに
ついての付着およびインターナリゼーションについての交差競合（Ａ）、ならび
に［3Ｈ］標識したＡｄ３ビリオンの、標識されていないウイルスについての付
着およびインターナリゼーションについての交差競合（Ｂ）を示す。１０5のＫ
５６２細胞を、図６に記載される付着のためのプロトコルまたはインターナリゼ
ーションのためのプロトコルに従って、１００倍過剰の未標識のウイルス粒子と
ともにプレインキュベートした。等量の［3Ｈ］標識したＡｄ５ＧＦＰ、Ａｄ５
ＧＦＰ／Ｆ３５、およびＡｄ３５（Ａ）または［3Ｈ］標識したＡｄ３（Ｂ）を
、Ａｄ５ＧＦＰについての細胞あたり１００ｐｆｕのＭＯＩに等価な用量で細胞
に添加した。コントロールの設定において、細胞をいかなる競合物も伴わない標
識したウイルスとともにインキュベートした。Ｎ＝４。
【図２１】 図２１は、Ａｄ５ＧＦＰベクターおよびキメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクター
での、ＣＤ３４＋、Ｋ５６２、およびＨｅＬａ細胞への形質導入を示す。１×１
０5の細胞に、異なるＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）のウイルスを、１００μｌの培地
中、３７℃で６時間感染させた。次いで、ウイルスを含有する培地を取り除き、
そして細胞を新鮮な培地に再懸濁し、続いて３７℃で１８時間インキュベートし
た。ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定し
た。Ｎ＝３。
【図２２】 図２２は、ＣＡＲまたはαvインテグリンを発現するヒトＣＤ３４＋細胞の亜
集団中のＧＦＰ陽性細胞の分布を示す。１×１０5ＣＤ３４＋細胞にＡｄ５ＧＦ
ＰまたはＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５を、図８について記載されたように、２００ｐｆ
ｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、
抗ＣＡＲ一次ＭＡｂ（１：１００最終希釈）または抗αvインテグリン一次ＭＡ
ｂ（１：３０最終希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体
の結合を、抗マウスＩｇＧ−ＰＥ標識二次抗体（１：１００最終希釈）で、４℃
で３０分間発色させた。各改変体について、１０4細胞をフローサイトメトリー
によって分析した。偽性感染改変体は、ウイルス希釈緩衝液のみとともにインキ
ュベートした細胞を表す。象限の境界は、ＧＦＰに一致する陰性コンロトールお
よびＰＥに一致する陰性コントロールの両方を用いて得られたバックグラウンド
に基づいて設定した。各象限において見出された染色された細胞のパーセンテー
ジが示される。示されるデータは、３つの独立した実験を表した。
【図２３Ａ】 図２３Ａ〜２３Ｂは、ＣＤ３４およびＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）を発現するヒ
トＣＤ３４＋細胞の亜集団におけるＧＦＰ陽性細胞の分布を示す。（Ａ）ＧＦＰ
発現のＣＤ３４またはＣＤ１１７との同時局在化：ＣＤ３４＋細胞にＡｄ５ＧＦ
ＰまたはＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５を、図８について記載された条件下で、２００ｐ
ｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。感染２４時間後、細胞を、抗ＣＤ３４ ＰＥ
結合体化ＭＡｂ（最終希釈１：２）または抗ＣＤ１１７ ＰＥ結合体化ＭＡｂ（
最終希釈１：５）とともに、氷上で３０分間インキュベートし、そして改変体あ
たり１０4細胞を、二色フローサイトメトリー分析に供した。陰性コントロール
染色のために、分析の前には細胞に抗体を添加しない。偽性感染改変体は、ウイ
ルス希釈緩衝液のみとインキュベートした細胞を表す。象限の境界は、ＧＦＰに
一致する陰性コンロトールおよびＰＥに一致する陰性コントロールの両方を用い
て得られたバックグラウンドに基づいて設定された。各象限において見出された
染色された細胞のパーセンテージが示される。実験は、２回、３連で行われ、そ
して代表的に得られた結果を示す。ＳＥＭは、統計的平均の１０％未満であった
。
【図２３Ｂ】 図２３Ａ〜２３Ｂは、ＣＤ３４およびＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）を発現するヒ
トＣＤ３４＋細胞の亜集団におけるＧＦＰ陽性細胞の分布を示す。（Ｂ）ＣＤ３
４＋／ＣＤ１１７＋細胞の、Ａｄ５ＧＦＰおよびキメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ウ
イルスベクターでの形質転換：ＳＣＦを有さない培地中での染色の前に一晩培養
したＣＤ３４＋細胞を、ＰＥ標識した抗ＣＤ１１７ ＭＡｂと氷上で３０分間イ
ンキュベートした。ＣＤ１１７陽性細胞の画分をＦＡＣＳによって分別した。分
別した細胞の９７％より多くがＣＤ１１７について陽性であった。１×１０5
ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋細胞に、Ａｄ５ＧＦＰまたはＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５を
、図８と同様に、細胞あたり２００ｐｆｕのＭＯＩで感染させた。感染２４時間
後、ＧＦＰ陽性のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定した。
偽性感染については、ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋細胞を、ウイルス希釈緩衝液の
みとともにインキュベートした。感染を３連で行い、対応するヒストグラム上に
ＧＦＰ発現細胞の平均パーセンテージを示した。ＳＥＭは、統計的平均の１０％
未満であった。
【図２４】 図２４は、Ａｄ５ＧＦＰベクターおよびキメラＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ベクター
に感染したＣＤ３４＋細胞のＧＦＰ陽性画分およびＧＦＰ陰性画分におけるウイ
ルスゲノムのサザン分析を示す。ＣＤ３４＋細胞に、図２１について記載されよ
うに、ウイルスを１００のＭＯＩで感染させた。感染２４時間後、細胞をＧＦＰ
陽性画分およびＧＦＰ陰性画分についてＦＡＣＳによって分別した。各画分から
の１０5細胞を使用して、ウイルスＤＮＡと一緒にゲノムＤＮＡを単離した。細
胞溶解の前に、トリプシンおよびＤＮａｓｅを用いて厳しい処理を行い、その後
洗浄を実行して、細胞外ウイルスＤＮＡによって混入したゲノムＤＮＡサンプル
を排除した。Ａ）上のパネルは、同様の量のゲノムＤＮＡがロードされたことを
示す、ブロッティング前のエチジウムブロミド染色した１％アガロースゲルを示
す。この量は、約２５，０００ ＧＦＰ＋細胞またはＧＦＰ−細胞から単離され
たＤＮＡに対応する。Ａｌｏａｄ＠と標識したレーンは、キャリアとしてｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を混合した、Ａｄ
５ＧＦＰビリオンまたはＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ビリオンから精製され、そして２
５，０００細胞を感染させるために実際に使用された量でゲルに適用されたウイ
ルスＤＮＡを表す。濃度の標準として、Ａｄ５ＧＦＰゲノムの段階希釈をゲル上
にロードした（左側）。サザン分析（下のパネル）のために、Ａｄ５のＥ２領域
に対応する８ｋｂ長のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、標識したプローブとして
使用した。ハイブリダイズされたフィルターを、ＰｈｏｓｐｈｏｌＩｍａｇｅｒ
分析に供し、次いで、Ｋｏｄａｋ−Ｘ−ＯＭＡＴフィルムに、Ｂ７０℃で４８時
間さらした。細胞／ウイルスゲノムＤＮＡを矢印で示す。（Ｂ）形質転換させた
細胞中でＡｄ５ＧＦＰゲノムを検出するために、サザンブロットハイブリダイゼ
ーションの前にＰＣＲ増幅を同じサンプル上で実行し、これを（Ａ）における定
量的サザンブロットハイブリダイゼーションのために使用した。約２，５００細
胞から精製したＤＮＡをＰＣＲ（９５℃Ｂ１分間、５３℃−１分間、７２℃Ｂ
１分間、２０サイクル、プライマーＡｄ５−Ｆ１およびＡｄ５−Ｒ１を使用）に
供した。ＰＣＲ反応物の１／５をアガロースゲル電気泳動に供した（上のパネル
）。Ａｄ５のＥ４領域に特異的な０．９ｋｂ長のＤＮＡフラグメントを、形質転
換されたＡｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５ゲノムについて検出した。次いで、ＤＮＡを、Ｎ
ｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレンにブロットし、そして、Ａｄ５ Ｅ４特異的ＤＮＡ
プローブを使用して、サザンブロットハイブリダイゼーション（下のパネル）を
実行した。ＰＣＲプライマーは、０．９ｋｂ ＤＮＡフラグメントに加えて、こ
れもまたＥ４領域プローブとハイブリダイズするより小さな０．５ｋｂ長フラグ
メントを生成する。
【図２５】 図２５は、Ａｄ感染ストラテジーにおけるファイバーシャフトの長さの役割を
示す。ＣＡＲ付着（Ａｄ５およびＡＤ９）改変体およびＡｄ３５（これは、非Ｃ
ＡＲレセプターと相互作用する）を、ＣＡＲ発現細胞（２９３、Ｙ７９）および
Ｋ５６２細胞（これは、有意なＣＡＲ量を発現しない）上で分析した。すべての
ベクターは、改変されたファイバーを有するＡｄ５キャプシドにパッケージされ
たＧＦｐ発現カセットを含む。
【図２６】 図２６は、Ａｄ５ノブの三次構造：ＣＡＲ付着部位、Ｈ−１ループ、およびＧ
−Ｈループの位置を示す
【図２７】 図２７は、異種ペプチドとのＧ−Ｈループの置換を示す。
【図２８】 図２８は、ヒト細胞株を用いての、代謝的に標識された血清型の付着およびイ
ンターナリゼーションを示す。
【図２９】 図２９Ａ−Ｄは、２つのベクター間での組換えによるＡｄベクターを発現する
Ｒｅｐ７８の生成を示す。（Ａ）ｒｅｐ７８を導入遺伝子として用いるベクター
について、図１５に概説されているのと同じストラテジーを使用した。Ａｄ５’
ｒｅｐベクターもまた、ＨＳ−４絶縁物（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）によってシール
ドされているＡｐｏＥｈＡＡＴプロモーターを含んだ。ｒｅｐ７８遺伝子の２つ
のフラグメント間の相同性の領域は、６５８ｎｔ長であった。Ｒｅｐ７８ ＯＲ
Ｆは、ｐ５プロモーターについて検出された。内部のＲｅｐ４０／５２開始コド
ン（９９３位）を変異させて、小さなＲｅｐタンパク質の産生を破壊した。さら
に、ｎｔ１９０５のスプライシング部位を欠失させ、Ｒｅｐ６８の産生を除去し
た。Ｒｅｐ７８の個々の発現を実証した。（Ｂ）ΔＡｄ．ｒｅｐ７８ゲノムの形
成。サザンによって実証されるように、Ａｄ５’ｒｅｐおよびＡｄ３’ｒｅｐの
両方の２９３細胞への同時感染の際に、予測された５．８ｋｂ ΔＡｄｒｅｐ７
８ゲノムのみを観察した。（Ｃ）ｐＣＭＶｒｅｐ７８およびΔＡｄ．ｒｅｐ７８
から発現されるＲｅｐ７８によって、プラスミドＤＮＡからの組換えＡＡＶゲノ
ムのレスキューのためのサザンブロット分析。予測されたレスキュー産物は３．
８ｋｂ（Ｒ−プラスミド）である。（Ｄ）Ａｄ．ＡＶＶウイルスベクターゲノム
からの組換えＡＡＶゲノムのレスキューについてのサザンブロット分析。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月１１日（２００１．１２．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ａ】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ｂ】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ｃ】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２１】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３Ａ】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３Ｂ】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５】
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６】
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７】
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２８】
【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２９】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 35/00 7/04 Ｃ１２Ｎ 7/00 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ファーラー， デニス アメリカ合衆国 ワシントン 98119， シアトル， ダブリュー． エマーソン ストリート 1324 (72)発明者 パパヤンノポーロー， タリア アメリカ合衆国 ワシントン 98122， シアトル， 35ティーエイチ アベニュー 702 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA01 DA02 EA02 FA02 FA10 GA11 GA30 HA17 HA20 4B063 QA00 QA18 QQ10 QQ42 QQ79 QR77 QS40 QX01 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA01 BA02 BA14 BA25 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA44 CA53 CA56 DA27 DB52 DB55 DB56 NA14 ZA512 ZA532 ZA542 ZA552 ZB262 ZB272 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA14 ZA51 ZA53 ZA54 ZA55 ZB26 ZB27

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第一世代の組換えアデノウイルスベクターであって、以下： ａ）左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列； ｂ）該左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列に対して３’側にあるアデノ
    ウイルスパッケージング配列； ｃ）該アデノウイルスパッケージング配列に対して３’側にある第１の逆方向
    反復配列； ｄ）該第１の逆方向反復配列に対して３’側にある導入遺伝子カセット配列； ｅ）該導入遺伝子カセットに対して３’側にある、（ｃ）におけるような第２
    の逆方向反復配列； ｆ）右側の逆方向反復に対して３’側にある、アデノウイルスの複製を指示す
    る、少なくとも１つのアデノウイルス配列；および ｇ）該アデノウイルス複製遺伝子に対して３’側にある右側のアデノウイルス
    逆方向末端反復配列、 を含む、第一世代の組換えアデノウイルスベクター。
  2. 【請求項２】 前記左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列および前記右
    側のアデノウイルス逆方向末端反復配列、ならびに前記パッケージング配列が、
    同一のアデノウイルス血清型由来である、請求項１に記載のアデノウイルスベク
    ター。
  3. 【請求項３】 前記第１の逆方向反復配列が、左側の逆方向末端反復配列で
    あり、そして前記第２の逆方向反復配列が、右側の逆方向末端反復配列である、
    請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  4. 【請求項４】 前記第１の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウイルスの左側の
    逆方向末端反復配列を含み、そして前記第２の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウ
    イルス右側の逆方向末端反復配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスベク
    ター。
  5. 【請求項５】 アデノウイルス親和性を指示する配列が、逆行鎖上に、ファ
    イバーテイル、ファイバーシャフト、およびファイバーノブを含む、アデノウイ
    ルスファイバータンパク質をコードする配列を含み、ここで該ファイバーノブが
    Ｇ−Ｈループ領域を含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  6. 【請求項６】 アンチセンス鎖上で、前記ファイバーテイルをコードする配
    列が、アデノウイルス逆方向反復配列と同じ血清型由来である、請求項５に記載
    のアデノウイルスベクター。
  7. 【請求項７】 前記導入遺伝子カセット配列が、目的の遺伝子の５’部分を
    含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  8. 【請求項８】 前記導入遺伝子カセット配列が、目的の遺伝子の３’部分を
    含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  9. 【請求項９】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下： ａ）ポリアデニル化配列； ｂ）該ポリアデニル化配列に対して３’側にある導入遺伝子配列；および ｃ）該導入遺伝子配列に対して３’側にあるプロモーター配列 を含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  10. 【請求項１０】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下： ａ）プロモーター配列； ｂ）該プロモーター配列に対して３’側にある導入遺伝子配列；および ｃ）該導入遺伝子配列に対して３’側にあるポリアデニル化配列 を含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  11. 【請求項１１】 前記導入遺伝子配列が、治療遺伝子、選択可能遺伝子、お
    よびレポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の
    アデノウイルスベクター。
  12. 【請求項１２】 前記治療遺伝子が、γグロビン、およびヒトα−１抗トリ
    プシンからなる群から選択される、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター
    。
  13. 【請求項１３】 前記選択可能遺伝子が、ネオマイシン、アンピシリン、ペ
    ニシリン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンからなる群から選択される
    、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
  14. 【請求項１４】 前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、βガラク
    トシダーゼ、アルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項１１に
    記載のアデノウイルスベクター。
  15. 【請求項１５】 絶縁エレメントをさらに含む、請求項９または１０に記載
    の導入遺伝子カセット。
  16. 【請求項１６】 細菌の複製起点をさらに含む、請求項９または１０に記載
    の導入遺伝子カセット。
  17. 【請求項１７】 アデノウイルスの複製を指示するアデノウイルス配列が、
    Ｅ２およびＥ４；Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４；Ｅ２およびＥ４；ならびにＥ２、Ｅ
    ３、およびＥ４、からなる群から選択される、請求項１に記載のアデノウイルス
    ベクター。
  18. 【請求項１８】 目的の宿主細胞を標的化する第一世代の組換えアデノウイ
    ルスベクター、およびそのように標的化された宿主細胞のゲノム中に組み込むそ
    の部分であって、２つのＤＮＡ鎖を含み、各鎖は互いに対して逆行しており、第
    １鎖は、以下： ａ）左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列； ｂ）該左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列に対して３’側にあるアデノ
    ウイルスパッケージング配列； ｃ）該アデノウイルスパッケージング配列に対して３’側にある第１の逆方向
    反復配列； ｄ）該アデノウイルスパッケージング配列に対して３’側にある導入遺伝子カ
    セット配列； ｅ）該導入遺伝子カセットに対して３’側にある、第２の逆方向反復配列； ｆ）該第２の逆方向反復配列に対して３’側にアデノウイルスの複製を指示す
    る、少なくとも１つのアデノウイルス配列；および ｇ）複製を指示する該アデノウイルス配列に対して３’側にある右側のアデノ
    ウイルス逆方向末端反復配列、 を含み、ここで該左側の末端反復配列および該右側の末端反復配列は、該導入遺
    伝子カセット配列が該宿主細胞ゲノム中に組み込まれることを可能にし、そして
    ここで、第２鎖が、目的の宿主細胞中に該ベクターを標的化することを可能にす
    るアデノウイルスファイバータンパク質をコードする配列を含む、第一世代の組
    換えアデノウイルスベクター。
  19. 【請求項１９】 前記アデノウイルスタンパク質が、ファイバーテイル、フ
    ァイバーシャフト、およびファイバーノブを含み、ここで該ファイバーノブが、
    Ｇ−Ｈループ領域を含む、請求項１８に記載のアデノウイルスベクター。
  20. 【請求項２０】 前記左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列および前記
    右側のアデノウイルス逆方向末端反復配列、ならびに前記パッケージング配列が
    、同一のアデノウイルス血清型由来である、請求項１８に記載のアデノウイルス
    ベクター。
  21. 【請求項２１】 前記ファイバーテイルが、前記左側のアデノウイルス逆方
    向反復配列および前記右側のアデノウイルス逆方向反復配列と同じ血清型由来で
    ある、請求項１９に記載のアデノウイルスベクター。
  22. 【請求項２２】 前記ファイバーシャフトが、前記左側のアデノウイルス逆
    方向反復配列および前記右側のアデノウイルス逆方向反復配列とは異なる血清型
    由来である、請求項１９に記載のアデノウイルスベクター。
  23. 【請求項２３】 前記ファイバーシャフトが、血清型３、血清型７、血清型
    ９、血清型１１、および血清型３５からなる群から選択される血清型由来である
    、請求項２２に記載のアデノウイルスベクター。
  24. 【請求項２４】 前記ファイバーシャフトが、短縮化された長さを含む、請
    求項１９に記載のアデノウイルスベクター。
  25. 【請求項２５】 前記ファイバーノブが、前記左側のアデノウイルス逆方向
    反復配列および前記右側のアデノウイルス逆方向反復配列とは異なる血清型由来
    である、請求項１９に記載のアデノウイルスベクター。
  26. 【請求項２６】 前記ファイバーノブが、血清型３、血清型７、血清型９、
    血清型１１、および血清型３５からなる群から選択される血清型由来である、請
    求項２５に記載のアデノウイルスベクター。
  27. 【請求項２７】 前記ファイバーノブが、目的の宿主細胞上の少なくとも１
    つの表面タンパク質に結合する異種ペプチドリガンド配列で置換されたＧ−Ｈル
    ープを含む、改変型ファイバーノブタンパク質である、請求項１９に記載のアデ
    ノウイルスベクター。
  28. 【請求項２８】 前記第１の逆方向反復配列が、左側の逆方向末端反復配列
    であり、そして前記第２の逆方向反復配列が、右側の逆方向末端反復配列である
    、請求項１８に記載のアデノウイルスベクター。
  29. 【請求項２９】 前記第１の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウイルスの左側
    の逆方向末端反復配列を含み、そして前記第２の逆方向反復配列が、アデノ随伴
    ウイルスの右側の逆方向末端反復配列を含む、請求項１８に記載のアデノウイル
    スベクター。
  30. 【請求項３０】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下： ａ）ポリアデニル化配列； ｂ）該ポリアデニル化配列に対して３’側にある導入遺伝子配列；および ｃ）該ポリアデニル化配列に対して３’側にあるプロモーター配列 を含む、請求項１８に記載のアデノウイルスベクター。
  31. 【請求項３１】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下： ａ）プロモーター配列； ｂ）該プロモーター配列に対して３’側にある導入遺伝子配列；および ｃ）ポリアデニル化配列 を含む、請求項１８に記載のアデノウイルスベクター。
  32. 【請求項３２】 前記導入遺伝子配列が、治療遺伝子、選択可能遺伝子、お
    よびレポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項３０または３１に記載
    のアデノウイルスベクター。
  33. 【請求項３３】 前記治療遺伝子が、γグロビン、およびヒトα−１抗トリ
    プシンからなる群から選択される、請求項３２に記載のアデノウイルスベクター
    。
  34. 【請求項３４】 前記選択可能遺伝子が、ネオマイシン、アンピシリン、ペ
    ニシリン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンからなる群から選択される
    、請求項３２に記載のアデノウイルスベクター。
  35. 【請求項３５】 前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、βガラク
    トシダーゼ、アルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項３２に
    記載のアデノウイルスベクター。
  36. 【請求項３６】 前記左側の逆方向末端反復配列に対して３’側に位置付け
    られる逆方向反復配列または前記右側の逆方向末端反復配列に対して５’側に位
    置付けられる逆方向反復配列をさらに含む、請求項３０または３１に記載の導入
    遺伝子カセット。
  37. 【請求項３７】 絶縁エレメントをさらに含む、請求項３０または３１に記
    載の導入遺伝子カセット。
  38. 【請求項３８】 細菌の複製起点をさらに含む、請求項３０または３１に記
    載の導入遺伝子カセット。
  39. 【請求項３９】 アデノウイルスの複製を指示するアデノウイルス配列が、
    Ｅ２およびＥ４；Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４；Ｅ２およびＥ４；ならびにＥ２、Ｅ
    ３、およびＥ４、からなる群から選択される、請求項１８に記載のアデノウイル
    スベクター。
  40. 【請求項４０】 一部分が宿主細胞ゲノム中に組み込まれる、組換え弱活力
    アデノウイルスベクターであって、以下： ａ）左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列； ｂ）該左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列に対して３’側にある第１の
    アデノウイルスパッケージング配列； ｃ）該アデノウイルスパッケージング配列に対して３’側にある第１の逆方向
    反復配列； ｄ）該第１の逆方向反復配列に対して３’側にある導入遺伝子カセット配列； ｅ）該導入遺伝子カセットに対して３’側にある第２の逆方向反復配列；およ
    び ｆ）該第２の逆方向反復配列に対して３’側にある第２のアデノウイルスパッ
    ケージング配列；および ｇ）該第２のアデノウイルスパッケージング配列に対して３’側にある右側の
    アデノウイルス逆方向末端反復配列、 を含み、ここで該左側の末端反復配列および該右側の末端反復配列は、該導入遺
    伝子カセット配列が該宿主細胞ゲノム中に組み込まれることを可能にする、組換
    え弱活力アデノウイルスベクター。
  41. 【請求項４１】 前記左側のアデノウイルス逆方向反復配列および前記右側
    のアデノウイルス逆方向反復配列、ならびに前記パッケージング配列が、同一の
    アデノウイルス血清型由来である、請求項４０に記載のアデノウイルスベクター
    。
  42. 【請求項４２】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下： ａ）ポリアデニル化配列； ｂ）該ポリアデニル化配列に対して３’側にある導入遺伝子配列；および ｃ）該ポリアデニル化配列に対して３’側にあるプロモーター配列 を含む、請求項４０に記載のアデノウイルスベクター。
  43. 【請求項４３】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下： ａ）プロモーター配列； ｂ）該プロモーター配列に対して３’側にある導入遺伝子配列；および ｃ）該導入遺伝子カセットに対して３’側にあるポリアデニル化配列 を含む、請求項４０に記載のアデノウイルスベクター。
  44. 【請求項４４】 前記第１の逆方向反復配列が、左側の逆方向末端反復配列
    であり、そして前記第２の逆方向反復配列が、右側の逆方向末端反復配列である
    、請求項４０に記載のアデノウイルスベクター。
  45. 【請求項４５】 前記第１の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウイルスの左側
    の逆方向末端反復配列を含み、そして前記第２の逆方向反復配列が、アデノ随伴
    ウイルスの右側の逆方向末端反復配列を含む、請求項４０に記載のアデノウイル
    スベクター。
  46. 【請求項４６】 前記導入遺伝子配列が、治療遺伝子、選択可能遺伝子、お
    よびレポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項４２または４３に記載
    のアデノウイルスベクター。
  47. 【請求項４７】 前記治療遺伝子が、γグロビン、およびヒトα−１抗トリ
    プシンからなる群から選択される、請求項４６に記載のアデノウイルスベクター
    。
  48. 【請求項４８】 前記選択可能遺伝子が、ネオマイシン、アンピシリン、ペ
    ニシリン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンからなる群から選択される
    、請求項４６に記載のアデノウイルスベクター。
  49. 【請求項４９】 前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、βガラク
    トシダーゼ、アルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項４６に
    記載のアデノウイルスベクター。
  50. 【請求項５０】 絶縁エレメントをさらに含む、請求項４２または４３に記
    載のアデノウイルスベクター。
  51. 【請求項５１】 細菌の複製起点をさらに含む、請求項４２または４３に記
    載のアデノウイルスベクター。
  52. 【請求項５２】 適切な細胞において分離された弱活力アデノウイルスベク
    ターを生成する方法であって、該方法は、適切な条件下で、請求項１または１８
    に記載の第１のアデノウイルスベクターゲノムおよび第２のアデノウイルスベク
    ターゲノムを、該細胞内に導入し、その結果、該組換えアデノウイルスベクター
    が相同組換えを受けることによって、分離された弱活力アデノウイルスベクター
    を生成する工程を包含する、方法。
  53. 【請求項５３】 請求項５２に記載の方法によって生成された、分離された
    弱活力アデノウイルスベクター。
  54. 【請求項５４】 前記第１のアデノウイルスベクターが、目的の遺伝子の５
    ’部分を有する導入遺伝子カセットを含み、そして前記第２のアデノウイルスベ
    クターが、目的の遺伝子の３’部分を有する導入遺伝子カセットを含み、そして
    該５’部分の一部が該３’部分の一部と重複し、その結果相同組換えが生じる、
    請求項５２に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 適切な細胞において、相同組換えによって分離された弱活
    力組換えＡｄベクターを生成する方法であって、該方法は、２つの親の組換えＡ
    ｄベクターを接触させる工程を包含し、各々は、重複する相同な領域を有する選
    択された導入遺伝子の一部を含む導入遺伝子カセットを含み、その結果、第１お
    よび第２の親の組換えＡｄベクターは、該重複する相同な領域で相同組換えを受
    けて、選択された導入遺伝子の両方の部分を有する、分離された組換え弱活力Ａ
    ｄベクターを生じ、そしてここで該選択された導入遺伝子は、一対のＩＴＲによ
    って隣接される導入遺伝子カセット内にある、方法。
  56. 【請求項５６】 請求項５５に記載の方法によって生成された、分離された
    弱活力アデノウイルスベクター。
  57. 【請求項５７】 無作為なペプチドの挿入によって提示され、そして改変さ
    れたファイバータンパク質を発現する、請求項１、１８、または４０に記載の複
    数のアデノウイルスベクターを含む、アデノウイルスライブラリー。
  58. 【請求項５８】 上記のように提示された前記ファイバータンパク質が、フ
    ァイバータンパク質ノブドメインのＧ−Ｈループ内において置換された無作為ペ
    プチドを含む、請求項５７に記載のライブラリー。
  59. 【請求項５９】 遺伝子治療のための標的化アデノウイルスベクターをスク
    リーニングする方法であって、請求項５７に記載のアデノウイルスライブラリー
    を、複数の細胞と接触させる工程であって、その結果、該細胞は、形質導入の生
    じるアデノウイルスライブラリーのアデノウイルスベクターで形質導入される、
    工程、およびそのように形質導入された細胞を検出する工程、を包含する、方法
    。
  60. 【請求項６０】 ｒｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさ
    らに含む、請求項９、１０、３０、３１、４２、または４３に記載のアデノウイ
    ルスベクター。
  61. 【請求項６１】 前記逆方向末端反復配列が、同一のアデノウイルス血清型
    由来である、請求項３、２８、および４４に記載のアデノウイルスベクター。
  62. 【請求項６２】 前記左側の逆方向末端反復配列に対して３’側に位置付け
    られた逆方向反復配列または前記右側の逆方向末端反復配列に対して５’側に位
    置付けられた逆方向反復配列をさらに含む、請求項４２または４３に記載のアデ
    ノウイルス。
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