JP2011088864A - インフルエンザウイルスに対するベクターワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】幅広い種類のインフルエンザウイルスに対して高いワクチンの効力を示すベクターワクチンを提供する。
【解決手段】Ｅ１欠損非増殖型５型アデノウイルスのファイバータンパクをコードする遺伝子が３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているＡｄ５／３５アデノウイルスベクターへ、
１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）およびマトリクスタンパク質（Ｍ）由来のポリペプチド、またはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子、または
２）インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）および核タンパク質（ＮＰ）由来のポリペプチドまたはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子
のいずれかを発現できるように組み込んでなる、インフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを提供する。
【選択図】なし

Description

本願は新規インフルエンザウイルスワクチンに関する。詳細には、本願発明は幅広い種類のインフルエンザウイルスに対して高いワクチンの効力を示すベクターワクチンに関する。

近年、Ｈ５の鳥インフルエンザのヒトでの大流行の可能性が出現しつつあり、更にＨ１の変異した豚インフルエンザウィルスが、現にヒトで大流行を起こしているが、インフルエンザ、特にＡ型インフルエンザは、世界的規模で流行することがある重大なウイルス感染疾患の一つである。

インフルエンザウイルスは抗原変異の頻度が比較的高いために、変異した抗原を有するインフルエンザウイルスに十分に対応できインフルエンザウイルス感染を高い確率で予防できるワクチンは未だ開発されていないのが実情である。

現在までに開発および実用化されているインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンの主なものは、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質またはニューラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に対する中和抗体の誘導を目的とするものである。しかし、ＨＡタンパク質やＮＡタンパク質はウイルス株により抗原性の変異の度合いが大きいため、これらワクチンは、インフルエンザウイルスの変異への対応が不十分で、効果を十分に発揮できない場合があるという欠点があった。

また、最近になって、遺伝子工学技術の進歩によりＤＮＡワクチンが開発されている。ＤＮＡワクチンとしては組み換えプラスミドを用いたものが一般的であり、目的の抗原をコードするＤＮＡを含む組み換えプラスミドを生体内に投与することによって、生体内で当該ＤＮＡによってコードされる抗原性を有するアミノ酸配列が発現し、このアミノ酸配列により免疫反応が生体内で惹起される。しかし、ある特定のプラスミドＤＮＡワクチンを生体に投与しても、喚起される免疫反応の程度は一定ではなく、試験動物の種類、ＤＮＡの種類、並びに接種方法などにより免疫反応の程度は多様であり、ＤＮＡプラスミドがＤＮＡワクチンとして有用であるかどうかを予測することは一般に困難である。

インフルエンザウイルスに対するＤＮＡワクチンとしては、インフルエンザＡヌクレオプロテイン（ＮＰ）をコードするプラスミドＤＮＡがインフルエンザウイルス感染の予防に役立つことが報告されている（非特許文献１および２）。Ulmerらはウイルス内のタンパク質であるヌクレオプロテイン（ＮＰ）をコードするＤＮＡをワクチンとして用いることにより、抗原変異にほとんど影響を受けることなく細胞性免疫を誘導し、より強い感染防御効果を達成することに成功している。また、本発明者はインフルエンザウイルスのマトリックスプロテインまたはその抗原性エピトープをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを提案している（特許文献１）。

かかるＤＮＡワクチンは簡便で安全なワクチンとして実用が待たれているが、一方でＤＮＡワクチンはその低い発現量から接種回数が必然的に増えることが予測される。この点を解消できるワクチンとして、組換えウイルスベクターワクチンが提案されている。組み換えウイルスベクターワクチンを用いれば少ない接種回数で十分な量の遺伝子発現とそれから得られる免疫反応、特に抗体産生反応が増強されることが期待される。

組み換えウイルスベクターワクチンを調製するためのウイルスベクターとしては、種々のものが知られており、代表的なものとしてはワクチニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）およびアデノウイルスが挙げられる。

インフルエンザ感染防御のための組み換えウイルスベクターワクチンとしては、アデノウイルスベクターへインフルエンザのポリペプチドをコードする核酸を導入して得られるウイルスベクターワクチンが提案されている（特許文献２）。特許文献２ではワクチンの作成にインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）をコードする核酸が用いられている。また特許文献３にもアデノウイルスベクターへトリインフルエンザ抗原又は免疫原をコードする配列を導入してなる組み換えウイルスベクターワクチンが開示されている。特許文献３においては免疫原として様々のタンパク質を用いて良いことが提案されているが、実施例で確認されているのはＨＡをコードする核酸のみである。このほか、ＨＡの抗原遺伝子としてＨ１−Ｈ９の共通したコンセンサス配列を導入したインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンについても提案されている（非特許文献３および４）。

一方、本発明者は改変アデノウイルスベクターを用いたＨＩＶ感染防御用のワクチンを提案している（特許文献４）。非増殖型５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子が３５型アデノウイルスファバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているＡｄ５／３５ベクターを用い、ここへＨＩＶのエンベロープ蛋白もしくはそれと同等の機能を有するその変異体をコードする遺伝子が発現可能なように組み込まれたベクターワクチンである。このＡｄ５／３５ウイルスベクターを用いて作成したワクチンは非常に強い免疫増強能を有し、ヒト免疫不全ウイルス感染防御に有用であることが示されている。

特開２００１−１５１６９８号公報 特表２００８−５２２６２１号公報 特表２００９−５１２４２１号公報 特開２００７−３７４０２号公報

Ulmer, 1993, Science, 259, 1745-1749 Donnelly, 1995, Nature Med., 1, 583-587 Holman DH, Vaccine 2008, 19;26(21):2627-30 Chen MW, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008 Sep 9:105(36):13538-43

本発明は、幅広い型のインフルエンザウイルス感染を防御することができ、強い免疫増強能を有する、インフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを提供することを目的とする。

本発明は、Ｅ１欠損非増殖型５型アデノウイルスのファイバータンパクをコードする遺伝子が３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているＡｄ５／３５アデノウイルスベクターへ、
１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）およびマトリクスタンパク質（Ｍ）由来のポリペプチド、またはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子、または
２）インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）およびマトリクスタンパク質（Ｍ）由来のポリペプチド、またはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子
のいずれかを発現できるように組み込んでなる、インフルエンザウイルス感染防御用ウイルスベクターワクチンを提供する。

本発明において用いられるＡｄ５／３５アデノウイルスベクターとしては、Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターとしては、そのヘキソンの超可変領域５（ＨＶＲ５）を変化させた、改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターを用いることがより好ましい。

本発明において用いられるマトリクスタンパク質(Ｍ)としてはＭ１とＭ２を組合せて用いても、Ｍ２蚤を単独で用いてもよい。

本発明のインフルエンザウイルス感染防御用ウイルスベクターワクチンはヒトに対する安全性が非常に高く、強い免疫増強能を有しており、幅広い型のインフルエンザウイルスに対する防御が可能である。また、ヒトを含む哺乳類やニワトリを含む鳥類等、脊椎動物のインフルエンザ感染防御に用いることができる。

本発明で用いる改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターの模式図である。 本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンの模式図である。上段が旧来型のＡｄ５／３５アデノウイルスベクターワクチン、下段がＡｄ５／３５ヘキソンの超可変領域５（ＨＶＲ５）を変化させた改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターワクチンを示す。 本発明で用いるＡｄ５／３５アデノウイルスベクターを用いて作成した抗ＨＩＶワクチンによる抗体産生を、ＭＶＡウイルスベクターを用いたワクチン並びに蛋白抗原と比較した試験の結果を示す。 本発明で用いるＡｄ５／３５アデノウイルスベクターを用いて作成した抗ＨＩＶワクチンによる細胞性免疫増強能を、ＭＶＡウイルスベクターを用いたＨＩＶワクチン並びに蛋白抗原と比較した試験の結果を示す。 Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターと、改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターそれぞれへインフルエンザウイルスのＨＡをコードする核酸を組み込んでなるベクターワクチンの免疫原性の比較結果を示す図である。 Ａｄ５アデノウイルスベクターと、Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターと、改変Ａｄ５アデノウイルスベクターと、改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターそれぞれへインフルエンザウイルスのＨＡをコードする核酸を組み込んでなるベクターワクチンを組み合わせて初回免疫並びに追加免疫に用いた場合の細胞性免疫の増強能を示す図である。 実施例１で用いたベクターワクチンの遺伝子配列を示す図である。 改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターへ各種抗原を導入して調製したウイルスベクターワクチンの感染防御効果を示す図である。 改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターへ各種抗原を導入して調製したウイルスベクターワクチンの、複数のサブタイプのインフルエンザウイルスに対する感染防御効果を示す図である。 実施例２で用いたベクターワクチンの遺伝子配列を示す図である。 実施例２の結果を示す。

本明細書において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生じ得る物質を意味する。
本明細書において、「インフルエンザ」という用語は、特に断らない限り最も広義のインフルエンザウイルスを意味する。インフルエンザウイルスは一般的には、インフルエンザウイルス属（これはさらにＡ型とＢ型に分類される）とインフルエンザウイルスＣ型属とに分類されるが、本明細書で「インフルエンザウイルス」という用語を使用する場合には、特に断らない限り、これら全てを包含し、またインフルエンザウイルスのあらゆる変異体をも包含するものとする。
本明細書において、「ウイルスベクターワクチン」とは、ウイルスベクターへ抗原性タンパク質またはペプチド、もしくはそのエピトープをコードする核酸を組み込んでなるワクチンを言うものとする。

本明細書において、あるタンパク質の抗原性エピトープとしては、当該タンパク質の免疫原性に関連するエピトープ（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞が認識するエピトープ）であるペプチドを含む限りは、完全タンパク質でもあるいはその断片でもよい。従って、本発明で用いる特定のタンパク質またはその抗原性エピトープをコードする遺伝子は、当該タンパク質の全長をコードする必要はなく、エピトープを含む一部の断片をコードするものでもよい。

本明細書において単に「マトリックスタンパク質（Ｍ）」、「核タンパク質（ＮＰ）」および「ヘマグルチニン（ＨＡ）」という場合、その完全タンパク質のみならず、抗原性エピトープを有するその断片をも含む意味で用いられる場合がある。

本発明においては、Ｅ１欠損非増殖型５型アデノウイルスのファイバータンパクをコードする遺伝子が３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているＡｄ５／３５アデノウイルスベクターを用いる。ここで、「Ｅ１欠損非増殖型５型アデノウイルスのファイバータンパクをコードする遺伝子が３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているＡｄ５／３５アデノウイルスベクターへ特定のタンパク質、ペプチドまたはその抗原性エピトープをコードする遺伝子の何れかを発現できるように組み込んでなる」とは、最終的なウイルスベクターワクチンの構成がＥ１欠損型非増殖型アデノウイルスのファイバータンパクをコードする遺伝子が３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されており、かつ、特定のタンパク質等が発現できるように当該遺伝子が組み込まれているものであれば、どのような手順で調製されたものであってもよい。例えば一旦Ｅ１欠損非増殖型５型アデノウイルスのファイバータンパクをコードする遺伝子が３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているＥ１欠損型Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターを作成した後に所望のタンパク質等をコードする遺伝子を組み込んで調製する、Ｅ１欠損型Ａｄ５アデノウイルスベクターへ所望のタンパク質等をコードする遺伝子を組み込んだ後あるいはそれと同時にファイバータンパク質をコードする遺伝子を置換して調製する、等の手順が考えられる。アデノウイルスベクターワクチンの調製方法は知られており、例えば特開２００７−３７４０２号公報に記載の方法に準じて行えばよい。

具体的には初期遺伝子Ｅ１が除去された５型アデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子を３５型アデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子にて、該３５型アデノウイルスのファイバータンパク質をコードする遺伝子が発現可能なように置換する。この置換は遺伝子組み換えの常套法により行えばよく、かかる方法は例えば特開２００７−３７４０２に説明されている。なお、３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子およびそのアミノ酸配列は既に公知であり、Mei, Y.F. et al., Virology 206 (1), 686-689, 1995: Dmitry M. et al., J. Virology, Mar. 2000, 2567-2583; NCBI U10272; NCBI AAA66361.1 などに記載されている。ファイバー蛋白は、シャフトとノブから構成され、本発明では通常これらから構成されるファイバー蛋白をコードする遺伝子を用いる。また本発明において、より好適にはＥ１領域に加えてＥ３領域もまた欠損している、Ｅ１／Ｅ３欠損Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターを用いる。例えば、Ｅ１／Ｅ３領域欠損で全長のＡｄ５／３５ゲノムを含むｐＡｄＨＭ４プラスミド(Mizuguchi, H., Kay, M. A. 1998. Human Gene Therapy. 9:2577 2583)を用いてウイルスベクターワクチンを調製すればよい。

本発明においてＡｄ５／３５アデノウイルスベクターとしては、そのヘキソンのhyper variable region（ＨＶＲ）５を変化させた、改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターを用いることがより好ましい。この改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターとしては、１４アミノ酸からなるネイティブのＨＶＲ５部分へスペーサーを導入する、アミノ酸を一部変異させる、等が例示される。改変Ａｄ／３５アデノウイルスベクターとしては例えばJ. Gene Med. 2009: 11:570-579に記載のものが例示され、例えば、２６９ＴＴＥＡＴＡＧＮＡＧＤＮＬＴＰ２８２をＴＴＡＡＴＡＧＡＧＡＮＬＴＰやＬＧＳＨＨＨＨＨＨＬＧＳとしたものなどが好適に用いられるがこれらに限定されるものではない。

本発明において好適に用いられる改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターは、ヒトに存在するＡｄ５型に対する抗体の大部分を回避し、強い免疫原性を与えることが出来る。また、Ａｄ５／３５のヒト樹状細胞への親和性が強化されており、非常に免疫原性が強い。またＡｄ５／３５アデノウイルスベクターは体内で増殖しない為に、安全性は非常に高いという利点を有する。

本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンは、Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターへ
１）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）およびマトリクスタンパク質（Ｍ）由来のポリペプチド、またはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子、または
２）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）由来のポリペプチド、またはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子
のいずれかを発現できるように組み込んで調製する。

多くのサブタイプのインフルエンザウイルスのＭ（Ｍ１およびＭ２）、ＮＰ、ＨＡの配列は公知である。かかる配列としては防御の対象とするサブタイプのインフルエンザウイルスより得られる配列を用いればよいが、好適には多くのインフルエンザウイルスのサブタイプ間で保存されているコンセンサス配列を使用する。かかる配列を使用することによって、より広範囲の型のインフルエンザウイルスを防御可能なインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを得ることができる。コンセンサス配列としては、現在までに報告されているものを採用しても、新たに検索してもよい。実際に本願発明者らがトリ、ヒト、ブタなど、今まで報告されている約２００種のウイルスのシークエンスを検討した結果、ＮＰは９２−９５％、Ｍは９２−９７％（Ｍ１；９５−９７％、Ｍ２；９２−９５％）と、それぞれ今まで分離され報告されているものはほぼ同一のアミノ酸配列を持っていることを確認した。またＨＡについてもそのコンセンサス配列が例えばChen MWら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13538-43.に報告されており、これらの情報に基づいて適宜好適な配列を選択すればよい。

本発明のＭ（Ｍ１および／またはＭ２）、ＮＰ、およびＨＡまたはその抗原性エピトープをコードする遺伝子としては、任意のインフルエンザウイルスのサブタイプより単離されるインフルエンザウイルスのゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであってもよい。また、本発明において、ヒトのインフルエンザ感染を防御するためにインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを調製する場合は、Ｍ（Ｍ１、Ｍ２）、ＮＰおよびＨＡまたはそのエピトープをコードする遺伝子は、そのＤＮＡコドンをヒト型化されたものであることが好ましい。ＤＮＡ配列のヒト型化については良く知られており（例えばNakamura Y ら、Nucleic Acids Res.2000 28;292,又はwww.kszusa.or.jp/codon/）、かかる情報に基づき適当なソフトウエアを用いて得ることが可能である。

インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ）の配列は例えばLAMB,RA.,1981, Virology, 112, 746-751等に開示されており公知である。本発明において用いられるマトリックスタンパク質としては、Ｍ１およびＭ２の何れを用いても、または両者組み合わせて用いてもよい。好適にはＭ２単独、またはＭ１およびＭ２を組合せて用いるのがよい。Ｍ２タンパク質のエピトープ領域を含む配列として、例えばＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＧＷＧＣＳＣＳＤＳＳＤＬＩＬＷＩＬＤＲＬＦＦＫＣＩＹＲＲＬＫＹを用いることが可能である。

ＮＰタンパク質及びその発現遺伝子は公知であり、ＮＰ発現遺伝子は、1993年に入りUlmer 等によりＤＮＡワクチンで使用されてきた(Ulmerら,Science 1993, 259,1745, , Fuら J.Virology 1997 71; 2715)。ＮＰタンパク質は多くの細胞性免疫誘導エピトープ(Townsendら J.Exp.Med.. 1984,160; 552, Yewdwll ら PNAS 1985 82; 1785)や、インフルエンザウイルスに対する高い抗体価を誘導することが知られている（ChenらJ.Virology, 2001 ,75; 11630）。

本発明において用いられるＨＡタンパク質およびその発現遺伝子についても数多くの報告があり、コンセンサス配列を用いたワクチンの製造については例えば（ChenらJ.Virology, 2001 ,75; 11630）に開示されている。

一例としては、下記実施例で用いたＨＡ、ＭおよびＮＰのアミノ酸配列、これらの配列に１又は複数の置換、欠失、付加アミノ酸を有し、同等の効力を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。

本発明においてＡｄ５／３５アデノウイルスベクターまたは改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターへ本発明の特定の遺伝子を組み込むには、標準的な遺伝子組み換え法を用いて行えばよく、特に限定されない。本発明においては各抗原をコードする遺伝子の転写がそれぞれに特有の別個のプロモーターによって指令を受けることができるように、抗原をコードする遺伝子とプロモーター配列とをベクター内に配置することができる。あるいは、１つのプロモーターが、互いにインフレームで接続された２以上の抗原をコードする遺伝子の発現を駆動し、融合タンパク質を発現するように、抗原をコードする遺伝子とプロモーター配列とを配置してもよい。プロモーターの種類、並びに抗原をコードする遺伝子配列とプロモーターとの配置関係は当業者により適宜設定することができる。

本発明において、好ましくは１つのプロモーターがインフレームで接続された上記抗原をコードする遺伝子の発現を駆動するようデザインされているものが特に好適に用いられる。本発明において用いられるインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンの模式図を図２に示す。上が従来型のＡ５／３５アデノウイルスベクターワクチンであり、下が改変Ａ５／３５アデノウイルスベクターワクチンの模式図である。

また、本発明のベクターワクチンを製造するにあたって、ＮＰとＭ、またはＨＡ、ＭとＮＰを配する順は特に限定されず、任意の順とすればよい。例えば、プロモーター配列に続けてＨＡ―Ｍ―ＮＰ、ＮＰ−Ｍ、ＨＡ−ＮＰ−Ｍ２等の順とすることが例示される。また、所望により配列の間に発現を増強するエンハンサー部分をさらに導入してもよい。

本発明のベクターワクチンの調製法として、一例として下記のような手順が挙げられる。ＣＡＧプロモーターを含んだ発現カセットをシャトルベクターｐＨＭ５のＳａｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｌＩ−ＰｓｔＩ配列間に組み込み、さらにＡｄ５／３５型ウイルスベクターのＤＮＡコスミドであるｐＡｄＨＭ３４のＰＩ−ＳｃｅＩ−Ｉ−ＣｅｕＩ配列間に組み込み，得られたＤＮＡを精製してＥ１遺伝子を持っているＨＥＫ２９３細胞にFuGene 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, 米国）を用いて遺伝子導入し、そこから得られるＡｄ５／３５型ウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に感染し大量に培養させる。次にＡｄ５／３５型ウイルスの感染した細胞を超音波法で破壊した後、大きな細胞破壊物を１５００ｒｐｍの遠心機にかけ大きな細胞の破片を取り除く。その後、上清部を超遠心塩化セシウム濃度勾配法によって精製し、透析して塩化セシウムを除去した後にＰＢＳで適宜希釈してベクターワクチン溶液とすればよい。

または、Ａｄ５／３５ウイルスベクターに代えて、Ａｄ５／３５のヘキソンのＨＶＲ５領域を例えばＬＧＳＨＨＨＨＨＨＬＧＳをコードする遺伝子で置き換えられるよう、ヘキソン領域のＸｂａＩサイトを置換した改変Ａｄ５／３５プラスミド遺伝子ｐＡｄＨＭ６２へ上記と同様にして発現カセットをＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩサイトに挿入してもよい。

こうして得られるプラスミド遺伝子を、ＦｕＧＥＮＥ６Ｔ遺伝子挿入試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス、インディアナポリス、米国）を使用することによって、ヒトのＥ１遺伝子を持っている胚腎臓（ＨＥＫ２９３）(Microbix Biosystems Inc.、トロント、オンタリオ、カナダ)の中に遺伝子導入して、増殖させることができる。

増殖した細胞を超音波法で破壊した後、１５００ｒｐｍの遠心機にかけ大きな細胞の破片を取り除く。その後、上清部を超遠心塩化セシウム濃度勾配法によって精製し，透析して塩化セシウムを除去してベクターワクチンを得ることができる。ＰＢＳで適宜希釈してベクターワクチン溶液とすればよい

本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンはヒトを含む哺乳類やニワトリ等鳥類を含む脊椎動物に投与され、投与を受けた動物にはインフルエンザに対する免疫が生じる。本発明で用いるＤＮＡによってコードされるインフルエンザウイルスの由来のタンパク質またはそのエピトープペプチドが、これが抗原となって細胞傷害性Ｔ細胞が活性化されて細胞性免疫が喚起され（場合によってはＢ細胞も抗体産生細胞へと分化し、体液性免疫も喚起される）、インフルエンザに対する免疫が生じる。本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを用いる免疫は、インフルエンザの発症を予防することのみならず、インフルエンザ感染による症状の軽減化に役立つものである。

本発明のワクチンの投与方法としては、例えば、本発明のワクチンを適当な溶剤、例えば、ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填して注射剤を調製して、注射することにより投与される。注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えてもよい。本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンは、静脈、筋肉、腹腔、鼻腔、皮膚等に投与することができる。

本発明はまた、本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンと医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬上許容される担体としては、特に制限はなく、本発明のワクチンの効力を阻害しない限り通常の注射剤に配合される成分のいずれを含んでいてもよい。その他の成分、例えばアジュバント、安定剤、ｐＨ調整剤、保存剤などを含んでいてもよい。

本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンの投与量は、インフルエンザウイルス感染から宿主を保護するために効果的な免疫応答を誘発するのに有効なベクターワクチンの量であり、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なる。通常成人１人当たり１０^９〜１０^１３ウイルス粒子数の範囲、好ましくは１０^１１〜１０^１２ウイルス粒子数の範囲である。

本発明のベクターワクチンの投与回数は、インフルエンザウイルス感染から宿主を保護するために効果的な免疫応答を誘発するのに有効であるよう、適宜定めればよい。本願発明のベクターワクチンは、免疫増強能が高く、１回又は２回投与にて高い効果が期待される。

本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンは他のワクチンと組み合わせて用いても良い。この場合、第２のワクチンは本発明のワクチンとは別のベクター、例えばＥ１欠損アデノウイルスベクターＡｄ５やＥ１欠損アデノウイルスベクターのヘキソンのＨＶＲ５を本発明に用いる改変Ａｄ５／３５ベクターと同様に改変した改変Ａｄ５ベクター、その他公知のベクターワクチンの製造に用いられるベクター等を用いて調製されるベクターワクチンであっても、不活性化ワクチン等の抗原ワクチンであってもよい。また、本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンは、ベクターＡｄ５／３５および改変Ａｄ５／３５をそれぞれ用いたものを別個に作成し、これらを組み合わせて用いてもよい。

本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを２種類併用する場合、あるいは本発明のワクチンと第２のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを併用する場合、その投与の順は特に制限されず、どちらを先に投与してもよい。

本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンと第２のワクチンとは単一の医薬組成物に配合することなく、それぞれ別個の医薬組成物として調製し、同時あるいは逐次的に、あるいは同時に被験者に投与することができる。即ち、本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンは、本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンとは異なる第２のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンと併用することができる。この場合、本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンと第２のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンとを含むワクチンキットの形態で提供することもできる。本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを第２のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンと併用する場合、それらの投与の順番は制限されず、どちらを先に投与してもよい。また、第２のワクチンは、ＤＮＡワクチンでも抗原ベースのワクチン（すなわち、組換えタンパク質あるいは全死病原体など）の何れでもよい。一つの好ましい実施態様においては、第２のワクチンは抗原ベースのワクチンであり、本発明のベクターワクチンは、抗原ベースの第２のワクチンと同時に投与される。あるいはまた、別の実施態様においては、まず、本発明のベクターワクチンを投与して免疫応答を感作し、次いで、２週間から８週間後に、抗原ベースの第２のワクチンを投与することによって、免疫応答を高めることができる。また本願発明のワクチンと組み合わせる第２のワクチンとしては、この他にも蛋白ワクチン、強い抗原性を有するＭＡＰ法にて作成したＭ２やＮＰの合成ワクチン、あるいはホルマリン不活化ワクチン等が例示される。かかる第２のワクチンは上記のように数週間の間に追加免疫をしてもよく、または数年後に追加免疫をすることもあり得る。

本発明のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンについて、参考例並びに実施例に基づきさらに詳細に説明する。なお、以下の参考例並びに実施例においてインフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/1934株H1N1とA/SWNは横浜市立衛生研究所、神奈川県より、他のＨ3Ｎ2ウイルスは国立感染研究所ウイルス部より提供された株を用いた。

また、以下の参考例及び実施例においては、インフルエンザAウイルスA/Puerto Rico/8/1934株（H1N1）由来のＨＡ、ＮＰ、Ｍ１およびＭ２配列をコードするＤＮＡを用いてベクターワクチンを調製した。実施例で用いた遺伝子にコードされる各アミノ酸配列は下記のとおりである。

［参考例１］
改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターの性質：
本願発明で用いられる改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターにより調製されるベクターワクチンと、ベクターワクチンによく用いられるワクチニア（ＭＶＡ）ベクターワクチンと比較した。本参考例においては、ＨＩＶ−１のＥｎｖ抗原タンパク質を両ベクターへ導入してベクターワクチンを調製し、その免疫能を比較した。改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターワクチンは、Ａｄ５／３５のヘキソンのＨＶＲ５領域を例えばＬＧＳＨＨＨＨＨＨＬＧＳをコードする遺伝子で置き換えられるよう、ヘキソン領域のＸｂａＩサイトを置換した改変Ａｄ５／３５プラスミド遺伝子ｐＡｄＨＭ６２を用いて作成した。

改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクター、ワクチニアベクターへＨＩＶ−１のＥｎｖ抗原を組み込んだベクターワクチン、並びにＨＩＶ−１のＥｎｖタンパク抗原を用いた。各群６匹のアカゲザルへそれぞれのベクターワクチンを０週および８週の２度免疫した。抗体産生能並びに細胞性免疫増強能を図３に示す。図３より明らかなように、改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターを用いて調製したベクターワクチンはＭＶＡを用いたワクチンと比しても極めて強い免疫能を示した。

［参考例２］
Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターと改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターの免疫能の比較：
Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターと改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターそれぞれを用い、ＨＡ抗原遺伝子を発現可能なように含むベクターワクチンを調製した。ＨＡ抗原遺伝子は、インフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/1934株H1N1（以下A/PR/8とする）より得た配列であって、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子を用いた。

Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターワクチンは、ＨＡタンパク質の発現カセットをシャトルベクターｐＨＭ５のＳａｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｌＩ−ＰｓｔＩ配列間に組み込み、さらにＡｄ５／３５型ウイルスベクターのＤＮＡコスミドであるｐＡｄＨＭ３４のＰＩ−ＳｃｅＩ−Ｉ−ＣｅｕＩ配列間に組み込み，得られたプラスミドを精製してＥ１遺伝子を持っているＨＥＫ２９３細胞に導入し、増殖したものから得た。

改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターワクチンは、ＨＡタンパク質の発現カセットをシャトルベクターｐＨＭ５のＳａｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｌＩ−ＰｓｔＩ配列間に組み込み、Ａｄ５／３５のヘキソンのＨＶＲ５領域をＬＧＳＨＨＨＨＨＨＬＧＳをコードする遺伝子で置き換えられるよう、ヘキソン領域のＸｂａＩサイトを置換した改変Ａｄ５／３５プラスミド遺伝子ｐＡｄＨＭ６２へ組み込み、得られたプラスミドを精製してＨＥＫ２９３細胞へ導入し、増殖したものから得た。

増殖した細胞を超音波法で破壊した後、１５００ｒｐｍの遠心機にかけ大きな細胞の破片を取り除いた。その後、上清部を超遠心塩化セシウム濃度勾配法によって精製し，透析して塩化セシウムを除去してベクターワクチンを得た。ＰＢＳで適宜希釈してベクターワクチン溶液とした。吸光時計でＯＤ２６０ｎｍを測定し、１ＯＤ２６０ｎｍ＝１０^１２ｖｐ（ウイルス粒子）／ｍｌでウイルス濃度を決定した。

Ｂａｌｂ／Ｃマウスに０週に各々Ａｄ５／３５ウィルスベクターワクチンを１×１０^１１ＶＰ／マウス免疫し、追加免疫として２週間後、同じ量のＡｄ５／３５ウィルスベクターワクチンまたは改変Ａｄ５／３５ウィルスベクターワクチンを免疫し、８週、１４週、２４週後の抗ＨＡ抗体価を測定した。ＨＡ抗原は遺伝子操作にてＡ／ＰＲ８より作製したものであり、その抗原によるＥＬＩＳＡで抗体価を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すようにＡｄ５／３５ＨＡで免疫し、改変Ａｄ５／３５ＨＡで追加免疫したとき（黒丸）、最も強い抗体価が得られた。

［参考例３］
Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターと改変Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターの細胞性免疫増強能の比較：
参考例２と同様にして、ＨＡをコードする遺伝子を発現できるよう組み込んでなる、Ａｄ５ウイルスベクターワクチン、改変Ａｄ５ウイルスベクターワクチン、Ａｄ５／３５ウイルスベクターワクチン並びに改変Ａｄ５／３５ベクターウイルスワクチンを調製した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに初回免疫としてＡｄ５ウイルスベクターワクチンを投与し、２週間後に追加免疫として改変Ａｄ５／３５ウイルスベクターワクチンまたはＡｄ５／３５ウイルスベクターワクチンを投与した。２８週後に各マウスより脾臓細胞を取り、その抗原（抗原はＨＡのタンパク）を脾臓細胞と同時に４８時間培養した後、特異的に反応するＩＮＦ−γ ＳＦＣ（INF-γ spot forming cells）を測定してその細胞性免疫活性化能を測定した。
図５に示すように、改変Ａｄ５／３５ウイルスベクターを使用して得たベクターワクチンは強い抗体産生が見られた。以前の報告よりかなり多くのヒトが持つＡｄ５型の抗体はＡｄ５／３５あるいはＡｄ５に対する免疫阻止反応が極めて高いことが知られているが、本願発明で用いた改変Ａｄ５／３５ウイルスベクターは、生体内に存在するＡｄ５に対する抗体の作用があまり影響せず強い免疫活性化能を発揮するものと考えられる。

改変Ａｄ５／３５ベクターＤＮＡを含むｐＡｄＨＭ６２にＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）のＮＰ，Ｍ２，ＨＡをコードする遺伝子をそれぞれ挿入し、またはＮＰ−Ｍ２をコードする遺伝子を挿入してベクターワクチンを作成した。具体的にはＣＡＧプロモーターを含んだ発現カセットをシャトルベクターｐＨＭ５のＳａｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｌＩ−ＰｓｔＩ配列間に組み込み、ｐＡｄＨＭ６２のＰＩ−ＳｃｅＩ−Ｉ−ＣｅｕＩ配列間に組み込み，得られたＤＮＡを精製してＥ１遺伝子を持っているＨＥＫ２９３細胞にFuGene 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, 米国）を用いて遺伝子導入し、そこから得られる改変Ａｄ５／３５型ウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に感染し大量に培養させた。次に，改変Ａｄ５／３５型ウイルスの感染した細胞を超音波法で破壊した後、大きな細胞破壊物を１５００ｒｐｍの遠心機にかけ大きな細胞の破片を取り除く。その後、上清部を超遠心塩化セシウム濃度勾配法によって精製し，透析して塩化セシウムを除去し、PBSに希釈してウイルス溶液とした。吸光時計でＯＤ２６０ｎｍを測定し、１ＯＤ２６０ｎｍ＝１０^１２ｖｐ（ウイルス粒子）／ｍｌでウイルス濃度を決定した。実施例１のベクターワクチンの遺伝子構成を図６に示す。

得られたワクチンを各群１０匹のＢａｌｂ／Ｃマウスへ１×１０^１１ＶＰ（ウイルス粒子）を経鼻投与にて免疫した。１０日後に１０ＬＤ_５０のＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）ウイルスをネンブタノールにて麻酔した後経鼻的に投与して感染させた。感染後の生存率を調べた。結果を図７に示す。

また各ベクターワクチンにて同様に免疫したＢａｌｂ／Ｃマウスへ、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｕｄｒｏｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）のＬＤ_５０量を経鼻的に感染させ、１５日後の生存率を観察した。結果を図８に示す。改変Ａｄ５／３５にＮＰ−Ｍ２をコードする遺伝子を挿入したベクターワクチンはＡ／ＰＲ／８のみならずＡ／ＳＷＮ（Ｈ１Ｎ１）やＡ／Ｕｄｒｏｎ（Ｈ３Ｎ２）に対しても高い感染防御能を示したが、一方でＨＡのみを導入したベクターワクチンはそのような広い防御能は認められなかった。

改変Ａｄ５／３５ベクターＤＮＡを含むｐＡｄＨＭ６２にＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）のＨＡ−ＮＰ−Ｍ２をコードする遺伝子を挿入（実施例３）、又はＨＡ、ＮＰ、Ｍ２をそれぞれコードする遺伝子を挿入したベクターワクチンを実施例１と同じ方法にて調製した。実施例３のベクターワクチンの遺伝子構造を図９に示す。

また不活化ワクチンとしては、発育鶏卵で培養したＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを約1％のフォルマリンにて24時間室温にて反応させたものを2度生理的食塩液にて洗浄したものを使用した。

各ベクターワクチンを１×１０¹¹ＶＰ（ウイルス粒子、２種類または３種類のベクターワクチンを投与する場合には、それぞれ１／２、１／３量ずつを同時に投与）をＢａｌｂ／Ｃマウス筋肉内に免疫した。１０日後、１０ＬＤ_５０のインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｇｕｉｚｈｏｕ−Ｘ（Ｈ３Ｎ２）を経鼻的に感染させ、１５日後の生存率を測定した。結果を図１０に示す。

改変Ａｄ５／３５にＨＡ−ＮＰ−Ｍ２をコードする遺伝子を挿入した実施例３のワクチンは両方の型のインフルエンザウイルスに１００％の感染防御能を示した。しかしＨＡのみで作製したワクチンや、不活化ワクチンではこの様な作用は認められなかった。

上記実施例においてはＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ、ＮＰ、Ｍ２配列を用いたが、多くの型に見られる共通遺伝子配列を基にして配列を最適化した。ＨＡ、ＮＰ、Ｍ１およびＭ２として特に、下記アミノ酸配列をコードする遺伝子配列、特に好ましくはヒト化遺伝子配列を用い、これをプロモーター以下ＨＡ―Ｍ２−Ｍ１―ＮＰの順で実施例１の手順に基づき導入して改変Ａｄ５／３５ベクターワクチンを調製する。本実施例のベクターワクチンは、Ａ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）のみならず、他の型のインフルエンザウイルスに対する防御において幅広く使用することが可能である。

M2 1-97 配列番号６
MSLLTEVETPTRNGWECRCSDSSDPLVIAASIIGILHLILWILDRLFFKCIYRRLKYGLKRGPSTEGVPESMREEYRQEQQNAVDVDDGHFVNIELE

M1 1-252 配列番号７
MSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDRAVKLYKKLKREITFHGAKEVALSYSTGALASCMGLIYNRMGTVTTEVALGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLTSTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKDDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK

NP 1-228 配列番号８
RASVGRMVGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNKYLEIRRIWAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRVAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTRVVPRGQLSTARPEDVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN

Claims (12)

1. Ｅ１欠損非増殖型５型アデノウイルスのファイバータンパクをコードする遺伝子が３５型アデノウイルスのファイバー蛋白をコードする遺伝子に発現可能なように置換されているＡｄ５／３５アデノウイルスベクターへ、
   １）インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）およびマトリクスタンパク質（Ｍ）由来のポリペプチド、またはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子、または
   ２）インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）および核タンパク質（ＮＰ）由来のポリペプチドまたはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子
   のいずれかを発現できるように組み込んでなる、インフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
2. Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターのヘキソンの超可変領域５（ＨＶＲ５）のアミノ酸が改変されている、請求項１記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
3. Ａｄ５／３５アデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質の超可変領域５（ＨＶＲ５）の２６９ＴＴＥＡＴＡＧＮＡＧＤＮＬＴＰ２８２がＴＴＡＡＴＡＧＡＧＡＮＬＴＰまたはＬＧＳＨＨＨＨＨＨＬＧＳに置き換わっている、請求項１記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
4. インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）および核タンパク質（ＮＰ）由来のポリペプチドまたはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子を発現できるように組み込んでなる、請求項１〜３いずれかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
5. インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）および核タンパク質（ＮＰ）由来のポリペプチドまたはこれらの抗原性エピトープがＡ型インフルエンザに由来するものであり、Ａ型インフルエンザを防御するために用いられる、請求項１〜４何れかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
6. Ａ型インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１タイプである、請求項５に記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
7. インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）およびマトリクスタンパク質（Ｍ）由来のポリペプチドまたはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子の少なくとも１つが、複数の型のインフルエンザウイルスにおけるコンセンサス配列である、請求項１〜６いずれかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
8. インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）および核タンパク質（ＮＰ）由来のポリペプチドまたはこれらの抗原性エピトープをコードする遺伝子の少なくとも１つが、ヒト化された遺伝子である、請求項１〜７何れかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
9. プロモーターに続いてＮＰ−Ｍ２がこの順で導入されている、請求項１〜８何れかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
10. プロモーターに続いてＨＡ−ＮＰ−Ｍ２がこの順で導入されている、請求項１〜８何れかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
11. プロモーターに続いてＨＡ―Ｍ―ＮＰがこの順で導入されている、請求項１〜８何れかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチン。
12. 請求項１〜１１何れかに記載のインフルエンザウイルスに対するベクターワクチンを含む医薬組成物。

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