JP2008501349A - 腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体、特に、腫瘍において免疫調節因子ｇｍ−ｃｓｆを発現する組換え体の構築およびその利用 - Google Patents

Abstract

本発明は腫瘍に対する遺伝子治療に関するものであり、特に、腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体の構築に関するものであり、該組換え体は、腫瘍細胞において特異的に複製され、ヒト体内における腫瘍特異的な免疫反応を誘導するための免疫刺激因子を発現する。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は腫瘍に対する遺伝子治療に関するものであり、特に、腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体の構築に関するものであり、該組換え体は、腫瘍細胞において特異的に複製され、ヒト体内における腫瘍特異的な免疫反応を誘導するための免疫刺激因子を発現する。

〔発明の背景〕
腫瘍性の疾患の治療のためにウイルスが用いられてから１世紀以上が経つ。医者は患者がウイルスに感染後、たまに快復することに気付いた。このパズルは、１９２０年代初頭まで解決されなかったが、その後、多くの科学者および臨床医の興味を引いた。これがウイロセラピー（癌治療のためのウイルスの使用）の始まりであった。１９５０年代までに、動物または患者において、５０以上のウイルスが抗癌活性を試験されている（Ｍｕｌｌｅｎ ａｎｄ Ｔａｎａｂｅ（２００２）Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ７：１０６−１１９；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｆ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ １：１３０−１４１）。１９５６年、スミス博士および彼のチームは、野生型アデノウイルスの１０のセロタイプが感染したＨｅＬａ細胞またはＫＢ細胞の溶解物を、腫瘍内注射、肝臓内動脈注射、または肝臓内静脈注射することにより、３０人以上の子宮頸癌患者を治療した。多くの患者における流感の症状を除けば、深刻な副作用は全く観察されなかった；一方、幾人かの患者の腫瘍は縮小し、壊死した。不幸なことに、ウイルスの生産および純化の限界から、この仕事はこれ以上進められなかった。スミス博士の業績は、癌治療のためのウイルスの使用可能性の探求へと、多くの科学者を後押しした（Ｃｈｉｏｃｃａ ＥＡ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ ２：９３８−９５０）。

分子生物学および遺伝子工学の進歩、特に、ヒトに関するウイルスをより深く理解するに従って、科学者らは先の世紀より、ウイルスゲノムを遺伝学的に操作し得るようになった。これには、腫瘍細胞において特異的に複製を行うウイルス変異体の作出に成功したこと（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｆ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ １：１３０−１４１）が含まれる。例えば、神経膠腫特異的ヘルペスウイルス変異体Ｇ２０７（Ｍａｒｔｕｚａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：８５４−８５６）、ｐ５３に欠陥のある腫瘍細胞において優先的に複製を行うアデノウイルス変異体Ａｄｄｌ１５２０（Ｏｎｙｘ−０１５）（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３−３７６）、および前立腺癌細胞特異的アデノウイルス変異体ＣＶ７０６（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：２５５９−２５６３）。上記業績は新規分野、癌ウイロセラピーの形成への土台を敷設した。現在、２０を超えるウイルス変異体が臨床試験中である（Ｍｕｌｌｅｎ ａｎｄ Ｔａｎａｂｅ（２００２）Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ７：１０６−１１９）。

腫瘍細胞特異的な腫瘍溶解性ウイルスを作成するためのアプローチはいくつか存在する。腫瘍細胞において選択的に複製を行うウイルス変異体を作成するための１つのアプローチは、例えば、アデノウイルスの、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、およびＥ４遺伝子のようなウイルスの主要な遺伝子の発現を制御するプロモーターやエンハンサーのような調節因子に腫瘍細胞特異的調節因子を用いることである（ＤｅＷｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：７４６４−７４７２）。このアプローチによれば、主要なウイルス遺伝子および最終的にはウイルスの複製が、腫瘍細胞特異的調節因子の制御下となる。上記調節因子には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーターおよびエンハンサー、ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏタンパク質（ＡＦＰ）プロモーターおよびエンハンサー、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーター等が含まれる（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｆ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ １：１３０−１４）。

テロメラーゼは、細胞の染色体末端の長さを制御するための重要な酵素であり、細胞分裂の過程において、染色体末端の長さを制御し得る。テロメラーゼは概ね３つの部分から構成される。ＲＮＡおよびテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ）は、触媒活性を有し、テロメラーゼの活性を制御する。一方、ｈＴＥＲＴプロモーターはテロメラーゼの発現と活性を決定する。

成体の正常細胞ではテロメラーゼの活性が低いか全くないことが、更なる研究によって示された（Ｋｉｍ Ｎ Ｗ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９４ Ｄｅｃ．２３；２６６（５１９）：２０１１−５；Ｓｈａｙ Ｊ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １９９７，３３；２７１−２８２）。一方、９０％以上の腫瘍細胞では、テロメラーゼは高い供給レベルにあった（Ｈａｈｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ ２：３３１−３４１；Ｓｈａｙ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８：６６−７１）。以上のｈＴＥＲＴの特性に基づいて、科学者らは遺伝子の供給のためにｈＴＥＲＴプロモーターをウイルスゲノム内に組み込んだいくつかのベクターの作成に成功した。制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスのためにｈＴＥＲＴプロモーターを使用することを記述する最近発行された論文もそのうちの１つである（Ｌａｎｓｏｎ ｓｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：７９３６−７６４１；Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：２８５−２９２；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：３７０−３８０；Ｉｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７４−１８５）。

アデノウイルスゲノムには、ウイルス遺伝子の発現を制御する少数の内在性の調節因子が存在する（例えば、Ｅ１Ａ遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー）。これら内在性の調節因子のうち、Ｅ１Ａのエンハンサーの塩基配列はウイルスのパッケージング配列に重なっている。異種性のプロモーターに対する内在性の調節因子の影響を最小化するために、科学者らはパッケージング配列を本来の左端から右腕へと再配置した（Ｂｒｉｓｔｏｌ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７（６）：７５５−７６４；Ｊａｋｕｂｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：１４９０−１４９９）。不幸なことに、この様なウイルスパッケージング配列の本来の位置から右端への再配置は、ウイルスゲノムを不安定化させ、大量のウイルス変異体を生成した（ＷＯ ０２／０６７８６１；ＡＳＧＴ ２００３ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）。したがって、上述したウイルスパッケージング配列の再配置は、内在性の調節因子の影響を最小化するアプローチとしては適したものではない。内在性のウイルスの調節因子の異種性の因子に対する影響を最小化し、望ましくない大量のウイルス変異体の生成を防ぎ、ウイルスゲノムを安定に保つにはどのようにすればよいのであろうか。

ヒトにおけるテロメラーゼの発現レベルについて、科学者らは、胚発生および分化期において、子宮頚部メンバー細胞、前駆体、および幹細胞を含む細胞で一定レベルのテロメラーゼ活性が存在することを認識するようになった（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８：１７３−１７９；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２３４３−１２３４６；Ｋｏｌｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８０：１１５６−１１６１；Ｔａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：１５６１−１５６７；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５３：１９８５−１９９１）。低レベルのテロメラーゼの発現活性は、遺伝子治療用ベクターにおいて治療用遺伝子を供給するため、または主要なウイルス遺伝子を成業することにより腫瘍細胞特異的腫瘍溶解性アデノウイルスを作成するために、ｈＴＥＲＴプロモーターを使用することへの警告を与えた（Ｈａｈｎ ＷＣ（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：１２０３−１２０５）。前駆体細胞のような、目標としない細胞における低いレベルのテロメラーゼ発現のため、ｈＴＥＲＴプロモーターが制御する腫瘍溶解性アデノウイルスは前駆体細胞において大量に複製し得、深刻な副作用をもたらす（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：１４３９−１４４５；Ｈａｈｎ ＷＣ（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：１２０３−１２０５；Ｍａｓｕｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１４：２４１−２５３）。したがって、ｈＴＥＲＴプロモーターを用いた腫瘍溶解性アデノウイルスの作成において、ｈＴＥＲＴプロモーターの腫瘍細胞特異性を向上することは鍵となる課題である。

〔発明の概要〕
１つの局面において、本発明はヒトアデノウイルスの主要なウイルス遺伝子の発現の制御のための組換え体を提供する。上記組換え体は、腫瘍細胞特異的調節因子をアデノウイルスに組み込むことにより取得される。

他の局面において、本発明を完成させるため、本発明は腫瘍細胞特異的腫瘍溶解性アデノウイルスに加えて、腫瘍溶解性アデノウイルスおよび免疫調節因子を、遺伝子工学的な手法により結合させることにより取得し得る組換え体を提供する。上記組換え体は、腫瘍細胞特異的プロモーターおよび免疫調節遺伝子をＤＮＡクローニング技術によりアデノウイルスのゲノムに組み込むことにより構築され、その結果得られたものは、腫瘍細胞において複製し得、かつ腫瘍細胞において免疫調節遺伝子を発現し得る融合された塩基配列となる。

他の局面において、本発明は免疫刺激因子を発現し得る腫瘍細胞特異的腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体を提供する。上記組換え体は概ね、主要ウイルスベクター、腫瘍細胞選択的調節因子、および免疫刺激因子からなる。

他の局面において、本発明は制限増殖型腫瘍溶解性ウイルス組換え体を生成する方法を提供する。

他の局面において、本発明は、腫瘍の予防および／または治療のための薬物の製造のための、制限増殖型腫瘍溶解性ウイルス組換え体の用途を提供する。

他の局面において、本発明は制限増殖型腫瘍溶解性ウイルス組換え体を含んでいる癌の予防および／または治療のための薬物を提供する。

他の局面において、本発明は、配列番号２に示される塩基配列のプロモーターを提供する。

本発明に係る組換え体は、これらアデノウイルスが腫瘍細胞中のみで複製するようにアデノウイルスを制御するために用い得る。ｈＴＥＲＴプロモーターを遺伝学的に改変することにより、本発明に係る組換え体はｈＴＥＲＴプロモーターの腫瘍細胞に対する特異性を実質的に強化している。

腫瘍細胞特異性を有する腫瘍溶解性ウイルス組換え体を調製する方法は、本発明に従えば、遺伝子工学を用いて、腫瘍細胞に対する人体の特異的な免疫刺激応答を誘導し得る免疫刺激因子遺伝子を、腫瘍細胞特異的複製型ウイルスのゲノム組み込む工程を包含する。得られるウイルス組換え体は、特異的な細胞集団内において選択的に複製され得、腫瘍細胞において複製され、増殖され得、その結果、該腫瘍細胞を死滅させ得る。したがって、上記組換え体は癌の治療および腫瘍の予防に用いられ得る。

本発明はまた、先行技術から知り得るものよりも優れた、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体を増殖させる新規な方法を提供する。先行技術においては、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体または遺伝子操作を受けたウイルスベクターの構築および増殖は、細胞株２９３のような遺伝子操作を受けた細胞株においておいて行われていた。このような細胞株は、Ｅ１が欠損した非増幅型のアデノウイルスベクター、またはウイルス性Ｅ１遺伝子が腫瘍細胞選択的な調節因子の制御の下にある制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体の機能を補完するために、アデノウイルスのＥ１タンパク質を発現する。不幸なことに、このような細胞株において生産される組換え体は、一定量の野生型または組換え型アデノウイルス（複製能力のあるアデノウイルス、ＲＣＡと称される）を通常含んでいる。組換え体の生産におけるＲＣＡの生成の原因は次のとおりである。すなわち、細胞株２９３のような生産細胞は、アデノウイルスの遺伝子配列を含んでおり、この「野生型」アデノウイルスの塩基配列の小片と、Ｅ１を欠損した、またはＥ１が改良されたアデノウイルスとが細胞内において組換えられ、「野生型」アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスが生じる。このような生産物は、製品規格を満たさない可能性があり、安全上の懸念として、予期しない副作用の原因になり得る。本発明に係る組換え体の構築に用いられる細胞は、アデノウイルス遺伝子配列を含んでおらず、したがって、ＲＣＡを避け得、上述した安全上の問題を解決し得る。

本発明は、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体であって、該組換え体の腫瘍細胞への結合親和力が向上するようにコートタンパク質が改良され、その結果、該組換え体の腫瘍細胞への感染力が向上された組換え体を提供する。腫瘍細胞において、アデノウイルス受容体５（コクサッキーウイルスＢおよびアデノウイルス受容体、ＣＡＲ）の発現は低いか、全く発現していない一方、すべての腫瘍細胞はＣＤ４６（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２００２．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２：１０６３−１０６８）を高レベルに発現していることを、最近の多くの研究は示している。さらなる研究は、アデノウイルスセロタイプ３５のための受容体はＣＤ４６タンパク質粒子（Ｓｉｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８（９）：４４５４−４４６２）であることを示している。以上より、本発明者らは、ＣＤ４６タンパク質受容体に結合し得る融合されたアデノウイルスを有する組換え体を構築するために、アデノウイルスセロタイプ５ウイルス組換え体におけるタンパク質配列のファイバーノブを、ＣＤ４６タンパク質受容体に結合し得る、アデノウイルスセロタイプ３５のファイバーノブに置換することを提案する。このような組換え体は、広範囲の腫瘍細胞におけるより優れた感染力を有すると考えられる。

本発明に係る制限増殖型腫瘍溶解性ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得、セロタイプ５、２、３５、４１等を含む任意のアデノウイルスセロタイプであり得、好ましくはセロタイプ５、または改良されたアデノウイルスであり得る。例えば、インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）によってＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が連結されているアデノウイルス組換え体；アデノウイルスタイプ５のファイバーノブがアデノウイルスセロタイプ３５のファイバーノブと置換されているアデノウイルス組換え体；ウイルスＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびにｈＴＥＲＴプロモーターのような異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されているアデノウイルス組換え体；Ｅ３領域における１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋをエンコードしている塩基配列が欠損しているアデノウイルス。なお、上記転写終結因子は、ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）シグナル配列のように、任意のＲＮＡポリメラーゼを介した遺伝子の転写を終結させ得る；例えば、Ｅ３領域における１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋをエンコードしている塩基配列が欠損しているアデノウイルス組換え体。

腫瘍細胞特異的である上記遺伝子調節因子は任意のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、またはこれらの組合せであり、好ましくは配列番号２に示されるような改良されたｈＴＥＲＴプロモーターである。このプロモーターは、転写因子Ｅ２Ｆ−１に対する結合部位を有している。

上記免疫調節因子は、免疫反応を刺激および誘導し得る任意の遺伝子またはその変異体であり得、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ および ＩＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＮＦ−ｂｅｔａ等であり得、好ましくはＧＭ−ＣＳＦであり得、分泌型、膜結合型、およびその他の変異体を含む。

本発明に係る好ましいアデノウイルス組換え体は、主要ウイルスベクターが改良されたアデノウイルスである組換え体であり、該改良されたアデノウイルスでは、そのアデノウイルスの塩基配列において、ウイルスＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されており、免疫刺激遺伝子が、配列番号３に示される塩基配列を有するＧＭ−ＣＳＦ（ＫＨ−９０１）、または膜結合型のＧＭ−ＣＳＦ（ＫＨ−９０２）である。

本発明に係る他の好ましいアデノウイルス組換え体は、主要ウイルスベクターが改良されたアデノウイルスである組換え体であり、該改良されたアデノウイルスでは、そのアデノウイルスの塩基配列において、ファイバーノブが、アデノウイルスセロタイプ５のそれに代わり、アデノウイルスセロタイプ３５由来であり、免疫刺激遺伝子が、配列番号３に示される塩基配列を有するＧＭ−ＣＳＦ（ＫＨ−９０１）、または膜結合型のＧＭ−ＣＳＦ（ＫＨ−９０２）である。

Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子がＩＲＥＳにより連結されており、ファイバーノブがセロタイプ３５由来であり、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されている；腫瘍細胞選択的調節因子は配列番号２に示される塩基配列を有するｈＴＥＲＴプロモーターであり、免疫刺激遺伝子がＧＭ−ＣＳＦであり、該ＧＭ−ＣＳＦは好ましくは膜結合型である。

本発明に係る他の好ましいアデノウイルス組換え体は、主要ウイルスベクターが改良されたアデノウイルスである組換え体であり、該改良されたアデノウイルスでは、そのアデノウイルスの塩基配列において、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されている；Ｅ３領域における１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋをエンコードしている塩基配列が欠損しているアデノウイルス；腫瘍細胞選択的調節因子は配列番号２に示される塩基配列を有するｈＴＥＲＴプロモーターであり、免疫刺激遺伝子がＧＭ−ＣＳＦであり、該ＧＭ−ＣＳＦは好ましくは膜結合型である（ＫＨ−９０３）。

本発明に係る他の好ましいアデノウイルス組換え体は、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されており、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子がＩＲＥＳにより連結されており、腫瘍細胞選択的調節因子は配列番号２に示される塩基配列を有するｈＴＥＲＴプロモーターであり、免疫刺激遺伝子がＧＭ−ＣＳＦである（ＫＨ−９０６）。

本発明に係るアデノウイルス組換え体は、ＫＨ−９０１、ＫＨ−９０２、ＫＨ−９０３、ＫＨ−９０４、ＫＨ−９０５、およびＫＨ−９０６を含んでいるが、これらに限定されるものではない。ＫＨ−９０１の塩基配列は配列番号３に示されており、
（１）１−１０３：アデノウイルスの左側にＩＴＲ （塩基配列がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＫ０００４０８に示されるアデノウイルスセロタイプ５）；
（２）１９４−３５８：アデノウイルスのパッケージング配列、およびＥ１のエンハンサー配列；
（３）３６２−５３４：ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、およびリンカー（ｎｐ３６２から５５１が欠損しているアデノウイルスセロタイプ５の塩基配列）；
（４）５２５−８１１：遺伝学的に改良されたｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列、およびリンカー；
（５）８１２から右：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２等を含んでいる、アデノウイルスの塩基配列；
（６）２８９９５−２９４３６：免疫を刺激するＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；
（７）２９４３７から右：Ｅ４遺伝子のアデノウイルス塩基配列、および右端；
ＫＨ−９００の塩基配列は、配列番号３に示される塩基配列と類似しているが、そのｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列は塩基置換なしの野生型のものである（配列番号１および２を参照）。また、パッケージング配列とｈＴＥＲＴプロモーターとの間にＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列も存在しない。

ＫＨ−９０２の塩基配列は、ＫＨ−９０１と類似しているが、免疫刺激遺伝子ＧＭ−ＣＳＦが配列番号４に示す塩基配列を有する膜結合型のものと置換されている。

ＫＨ−９０３の塩基配列は、ＫＨ−９０１と類似しているが、１０．４Ｋ、１４．５Ｋ、および１４．７Ｋをエンコードしている塩基配列が欠損している。欠損した上記塩基配列は、アデノウイルスゲノムのｎｐ２９８０４から３０８５７までの部分である。上記のエンコードしている塩基配列からのタンパク質は、免疫応答、特に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を介した免疫応答を抑制する。したがって、上記のエンコードしている領域の欠損は、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスにより誘導される、腫瘍を目標とする免疫応答を強化する。

ＫＨ−９０４の塩基配列はＫＨ−９０１と類似しているが、ファイバーノブが、アデノウイルスセロタイプ５のファイバーノブから、塩基配列が配列番号５に示される、アデノウイルスセロタイプ３５のファイバーノブに交換されている。多くの腫瘍細胞が、アデノウイルスセロタイプ５の受容タンパク質ＣＡＲを発現していないが、高レベルのＣＤ４６粒子を発現していることを最近の研究は明らかにしている。ＣＤ４６粒子は、アデノウイルスセロタイプ３５のための受容体である。したがって、アデノウイルスセロタイプ３５由来のファイバーノブの存在は、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体の感染力を強化する。

ＫＨ−９０５は、ＫＨ−９０４と類似しているが、免疫刺激遺伝子ＧＭ−ＣＳＦが分泌型から膜結合型へと交換されている。

ＫＨ−９０６は、内在性のＥ１Ｂプロモーターをインターナルリボソームエントリーサイト（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２：３７４３−３７５０）により置換することにより、ＫＨ−９０１から作成された。

本発明はまた、配列番号２に示されるような改良されたｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列を提供する。上記プロモーターは転写因子Ｅ２Ｆ−１への結合部位を有している。

本発明はまた、上記改良されたｈＴＥＲＴプロモーターを生成するための方法を提供する。図１に示されるようなｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列に基づいて２つのプライマーが合成された：
Ａ．５’−ＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＡＣＧ−３’
Ｂ．５’−ＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＣ−３’
活性化されたヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとした上記のプライマーを用いたＰＣＲ法によりｈＴＥＲＴプロモーターが増幅された。ＰＣＲ反応の条件は以下のとおりである：１サイクル目には、変性反応を９４℃で５分間、アニール反応を８１℃で１分間、伸張反応を７２℃で２分間；続く３５サイクルの各サイクルでは、変性反応を９３℃で１分間、アニール反応を６８℃で１分間、伸張反応を７２℃で２分間。ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル解析に供し、塩基配列決定法による確認のためにｈＴＥＲＴプロモーター断片が回収された。そして、塩基配列が公開された配列（図１）のとおりであることが確認された。純化されたＰＣＲ断片のＤＮＡが、ｐＵＣ１９ベクターにクローニングされた。Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ（部位特異的突然変異誘発法）により記述された突然変異誘発法により、ｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列が、図２に示されるような塩基配列へと変換された。

したがって、本発明はまた、上記の方法によって取得し得る、配列番号２に示される塩基配列を有する改良されたｈＴＥＲＴプロモーターを提供する。

本発明に係るｈＴＥＲＴプロモーターでは、ＴＡＴＡ保存配列は存在しないが、２つのＥ−ＢＯＸ様のＣＡＣＧＴＧ配列、および４つのＧＣリッチなＳｐ−Ｉ結合領域が存在する。これらの保存配列はテロメラーゼの発現のために極めて重要である。なぜなら、テロメラーゼの転写は、ｈＴＥＲＴプロモーターによりＣ−Ｍｙｃ／ＭＡｘおよびＳｐーＩを介して制御されている（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８（１）：１３７−１４２；Ｋｙｏ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（３）：６６９−６７７）からである。細胞増殖および細胞周期においてＭｙｃが重要な役割を果たしていることは、多くの研究が明らかにしている。したがって、上述したようなｈＴＥＲＴプロモーターの改変はテロメラーゼの転写および発現にさらなる影響を与える。

例えば前駆細胞のような正常細胞におけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性を最小化し、その腫瘍細胞選択性を向上させるために、本発明者らは、ｈＴＥＲＴプロモーターにおける転写因子の結合部位の詳細な解析を、コンピューターモデリングにより行った。本発明者らは、コンピューターモデリングに基づいて一連の突然変異群を解析し、その中に、第４のＳｐ−ＩがＥ２Ｆ−１結合部位に変換されており、塩基配列が’．．．ＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣ．．．’（図１）から’．．．ＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣ．．．’（図２）に変換されている突然変異体を見出した。

試験管内における研究は、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターが腫瘍細胞において活性を維持し、正常細胞において「促進（プロモート）」する活性を著しく低減させることを示した。したがって、改良されたプロモーターは、前駆体細胞を含む正常細胞における転写活性を著しく低減させる。レポーター遺伝子を用いた短期感染実験により、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターは、腫瘍細胞において野生型ｈＴＥＲＴプロモーターに比べて約５から１０倍高い活性を有している一方、正常細胞では、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターは非常に低減された活性を有していることが示された（図６）。本発明者らは、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターが主要なウイルス遺伝子を制御する制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスを構築した。得られた腫瘍溶解性ウイルスは幹細胞に対して有毒ではない（図７）。したがって、得られた腫瘍溶解性アデノウイルスは、臨床への適用に関して、著しく向上した安全性を有している。

Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、ｐＲｂ／Ｅ２Ｆ／ｐ１６パスウェイに欠陥を有する腫瘍細胞において活性を有しているため、広範囲の遺伝子治療、特に、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスの構築に用いられて来た（Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３（１０）：１１４５−１１４９；Ｊａｋｕｂｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：１４９０−１４９９；Ｂｒｉｓｔｏｌ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７（６）：７５５−７６３）。改良されたｈＴＥＲＴプロモーターは、転写因子Ｅ２Ｆ−１への結合部位を有しているだけでなく、Ｅ２Ｆ−１プロモーターが有しているＳｐ−Ｉ結合部位およびＮＦ−Ｉ結合部位を有している。したがって、テロメラーゼが正に制御されている腫瘍細胞、およびＲｂパスウェイに欠陥を有している腫瘍細胞において、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターは活性を有する。すなわち、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターは、これらの２つの種類の腫瘍細胞では活性を有し、幹細胞のような正常細胞では活性を有しない；このことは、高い腫瘍特異性を表す。

他方では、インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）によってＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が連結されており、そのためアデノウイルス組換え体の２つの重要な遺伝子であるＥ１ＡおよびＥ１Ｂの転写が、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターの制御下に引き起こされる例えばＫＨ−９０６のような、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体を、本発明は提供する。

本発明は、ＩＴＲおよびウイルスのパッケージング配列の下流、ならびにｈＴＥＲＴプロモーターのような異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されている腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体を提供する。ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）のような転写終結シグナルは任意のＲＮＡポリメラーゼを介した転写を阻害し得る。ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）のような転写終結シグナルの存在のおかげで、ＩＴＲ、およびパッケージング配列に重なる塩基配列であって、エンハンサーとしての効果を有する塩基配列の、ｈＴＥＲＴプロモーターに対して与える影響がごく小さくなることが、試験管内での研究により示された。

本発明に係る腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体は、免疫刺激遺伝子を有している。いくつかの知られている腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体では、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が免疫刺激遺伝子として用いられていた。本発明において説明される腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体もまた免疫刺激遺伝子としてＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含んでいるが、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子に限定されるものではなく、その他の免疫刺激遺伝子、例えばサイトカインも用いることができる。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦは長時間継続する免疫応答を誘導することでよく知られている（Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３５３９−３５４３）。分泌された糖タンパク質は、顆粒球、単球、マクロファージ、および樹状細胞の分化を刺激し得、抗原提示細胞におけるＭＨＣおよびＢ７副刺激分子の発現を増加させ得る。ＧＭ−ＣＳＦはまた、免疫細胞の組織への浸潤と、Ｂ細胞の分化とを促進する。上述したＧＭ−ＣＳＦの特性の故に、従来から、科学者は、癌の治療のために、化学療法との組合せにおいてＧＭ−ＣＳＦを用いてきた。ＧＭ−ＣＳＦを発現し得る腫瘍細胞からなる多くの腫瘍ワクチンが、現在臨床試験中である（Ａｒｍｉｔａｇｅ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２：４４９１−４５０８；Ｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：３２３９−３２４６；Ｇｉｌｂｏａ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ４：４０１−４１１）。ＧＭ−ＣＳＦを発現する制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌細胞を死滅させるだけでなく、腫瘍細胞においてＧＭ−ＣＳＦを発現して腫瘍細胞特異的な免疫応答を誘導し、その結果、癌の免疫治療効果を有する。したがって、このような自己腫瘍ワクチンの樹立の過程は、腫瘍ワクチンの調製のための複雑な過程を排除するだけでなく、試験管内での処理がなく腫瘍細胞を抗原の発現を含めてより完全な形に維持する。腫瘍細胞における抗原の発現は、癌ワクチンをその場所でより効果的にする。したがって、上述した腫瘍溶解性ウイルスは、該ウイルスが供給された場所にて腫瘍細胞を死滅させ得、同時に、ＧＭ−ＣＳＦを介した免疫応答により遠方の腫瘍細胞を死滅させ得る。本明細書に記述した本発明に係る方法は、より優れた腫瘍溶解性ウイルスを作成する独自のアプローチである。

本発明に係る腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体のうち２つは、膜結合型のＧＭ−ＣＳＦ（ｍｂＧＭ−ＣＳＦ）を含み、発現する。膜結合型のＧＭ−ＣＳＦは、樹状細胞との相互作用を促進し得、分泌型のＧＭ−ＣＳＦに比べてより優れた免疫応答を誘導し得ることを従来の研究が明らかにしている（Ｓｏｏ Ｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６９：７３４３−７３４９；Ｙｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１３０２−１３１１）。しかし、遺伝学的に組換えられた活性成分を得るための、制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体における膜結合型ＧＭ−ＣＳＦの発現は、未だ報告されていない。

本発明はまた、腫瘍溶解性ウイルス組換え体の作成方法を提供する。上記作成方法は、以下の工程を含んでいる：
（ａ）ｈＴＥＲＴプロモーターを含んでいるアデノウイルスゲノムの左腕部を構築する；
（ｂ）免疫刺激遺伝子を含んでいるアデノウイルスゲノムの右腕部を構築する；
（ｃ）アデノウイルスゲノムの左腕部を含んでいるプラスミド、およびアデノウイルスゲノムの右腕部を含んでいるプラスミドを、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞、またはＡ５４９細胞にコトランスフェクションする。組換え体が相同組換えにより生成される。

本発明に係る組換え体は、以下の過程により取得され得る：哺乳類細胞中においてウイルス組換え体が相同組換えを介して作成される。まず、一般的なクローニング技術により、内在性のＥ１Ａ遺伝子のプロモーターがｐＸＣ．１（アデノウイルスセロタイプ５の左端を含んでいるプラスミド、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｃａｎａｄａから購入）から削除され、ＳＶ４０ポリ（Ａ）終結シグナルおよび改良されたｈＴＥＲＴプロモーターにより置換され、その結果ｐＫＨ−９０１ａが得られた。他方で、ｐＢＨＧＥ３（アデノウイルスの右部分を含んでいるプラスミド、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｃａｎａｄａより購入）のｇｐ１９Ｋをエンコードする塩基配列が、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子により置換され、ｐＫＨ−９０１ｂと呼ばれるプラスミドが得られた。

ｐＫＨ−９０１ａおよびｐＫＨ−９０１ｂのプラスミドＤＮＡがＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションされ、プラークから単一クローンが拾い上げられ、ＫＨ−９０１と名づけられた。同様の手順に従い、組換え体ＫＨ−９００、ＫＨ−９０２、ＫＨ−９０３、ＫＨ−９０４、ＫＨ−９０５およびＫＨ−９０６が構築された。

実際には、組換え体は、任意の哺乳類細胞または非哺乳類細胞において作成し得る。

以上に概略を述べた計画に基づいて、ｐＸＣ．１の３６２から５５１（それぞれ制限酵素ＳｓｐＩおよびＰｉｎＡＩ（ＡｇｅＩ）に対応）のヌクレオチドからのＤＮＡ断片がＰＣＲにより増幅された。ｈＴＥＲＴプロモーターＤＮＡ断片がヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅され、ポリ（Ａ）に連結された。２つの制限酵素、ＳｓｐＩおよびＰｉｎＡＩが上記ＤＮＡ断片の両端に添加された。上記ＤＮＡ断片がＳｓｐＩおよびＰｉｎＡＩにより消化され、同じ制限酵素により消化されたｐＸＣ．１にライゲーションされた。ライゲーション産物により、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ＤＨ５−ａｌｐｈａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅ，ＵＳＡ）を形質転換した。１０のコロニーを拾い上げ、インキュベーター内で２４時間培養した。ＤＮＡが抽出され、制限酵素により解析され、プラスミドは塩基配列決定法により確認され、ｐＫＨ−９０１ａと名づけられた。

５‘−ＡＴＡＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣ−３’および５‘−ＡＡＡＴＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧ−３’のプライマーを用いて、ＧＭ−ＣＳＦをエンコードするＤＮＡ断片が、活性化されたマクロファージから抽出されたｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにより増幅された。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の全長はｐＵＣ１９にクローンされ、塩基配列決定法により確認された。続いて、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のｃＤＮＡ断片はｐＢＨＧＥ３におけるｇｐ１９ｋをエンコードする領域にクローニングされ、得られたプラスミドは、ＫＨ９０１ｂと名づけられ、塩基配列決定法に供され、制限酵素解析により確認された。

ｐＫＨ−９０１ａおよびｐＫＨ−９０１ｂのプラスミドＤＮＡが相同組換えのためにＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションされた。感染の前に、上記プラスミドＤＮＡはＣｌａＩにより直鎖化され、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＵＳＡ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に媒介されＨｅＬａ細胞に感染させられた。感染の１０日後、細胞は収穫され、３サイクルの凍結／融解を行い、ＨｅＬａ細胞上でのプラーキングのために１００ｍＬを収集した。プラーキングの８日後、アガロースの下に単離されたプラークが観察された。６のプラークが拾い上げられ、ＨｅＬａ細胞に接種された。接種から４から６日後に細胞溶解物が収穫された。上記細胞溶解物からアデノウイルスＤＮＡが抽出され（Ｑｉａｇｅｎ‘ｓ ｋｉｔ）、制限酵素による消化、ＰＣＲ、およびサザンブロット解析によりウイルス構造が確認された。得られたウイルスはＫＨ−９０１と名づけられた。

本発明に係るウイルス組換え体は、癌の治療および／または予防のための薬学的組成物を調製するために用い得る。上記ウイルス組換え体は、より優れた治療上の効果を得るために、放射線および化学療法と組合せて用い得る。

本発明に係るウイルス組換え体は、静脈内投与、腫瘍内注射、筋肉内注射、皮下注射、器官内注射、腹膜内注射等のための注射可能な組成物として処方され得る。

大規模調製のために、本発明に係るウイルス組換え体は、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞、またはＡ５４９細胞において、細胞培養、ならびにウイルスの感染、増殖、濃縮、および純化を経て製造され得る。上記過程を経て製造されたウイルス組換え体は、一般的な処方技術を用いて薬学的に受容可能な担体と共に臨床的に注射可能な組成物に処方するための原材料として用い得る。

本発明の適用可能性および好ましい効果を示す実験が以下に記載される：
〔実験１：ｈＴＥＲＴプロモーターの活性、および野生型ｈＴＥＲＴプロモーターと改良されたｈＴＥＲＴプロモーターとの間における腫瘍細胞特異性の比較〕
ｈＴＥＲＴプロモーターの改良版の特異性を試験するために、野生型ｈＴＥＲＴプロモーター（ｔｅｌｏ）および改良されたｈＴＥＲＴプロモーター（Ｍｔｅｌｏ）がレポーター遺伝子ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に連結され、その結果物のプラスミドが一連のヒト癌細胞およびヒト正常細胞に感染させられた。上記細胞は感染から４８時間後に収穫され、その細胞溶解物がルシフェラーゼの発現レベルを決定するために用いられた。上記感染の際に、様々なタイプの細胞における感染効率を正規化するために、第２のレポーター遺伝子ＬａｃＺのレポートプラスミドが用いられた。図６に示される結果が示すように、（１）腫瘍細胞において、改良されたプロモーターＭｔｅｌｏは野生型ｈＴＥＲＴプロモーター（ｔｅｌｏ）に比べて非常に高いルシフェラーゼ活性を示した。例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（正に制御されたテロメラーゼ、およびＲｂパスウェイ欠陥）において、Ｍｔｅｌｏはｔｅｌｏに比べて６倍以上のルシフェラーゼ活性を示し、ＬＮＣａＰ細胞（正に制御されたテロメラーゼ、およびＲｂパスウェイ欠損）において、Ｍｔｅｌｏは野生型ｈＴＥＲＴプロモーターに比べ１８倍以上のルシフェラーゼ活性を生み出した；（２）ヒト正常細胞において、野生型ｈＴＥＲＴプロモーターｔｅｌｏは低レベルの転写活性をもたらす一方、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターＭｔｅｌｏは実質的にバックグラウンドレベルの転写活性を有していた。例えば、ＭＲＣ−５細胞（テロメラーゼ陰性、および正常なＲｂパスウェイ）において、Ｍｔｅｌｏプロモーターは野生型のｈＴＥＲＴプロモーターｔｅｌｏに比べて６分の１以下の活性を示した。この結果が示すように、Ｅ２Ｆ結合部位の付加はｈＴＥＲＴプロモーターの著しく向上した腫瘍細胞特異性および転写能力をもたらす。

この結論は試験によってさらに確認された。上記試験では改良されたｈＴＥＲＴプロモーターの改良された選択性、および該プロモーターの転写活性が、組換え体が感染した細胞においてＥ１Ａメッセンジャーのコピー数を測ることにより決定された。４つのウイルスがこの研究に含まれる：ポジティブコントロールとして野生型アデノウイルス、ネガティブコントロールとして非増幅型アデノウイルスｄｌ３１２（Ｅ１Ａ欠損）、ＫＨ−９００（野生型ｈＴＥＲＴプロモーターを有する）、およびＫＨ−９０１（改良されたｈＴＥＲＴプロモーターを有する）。ヒト包皮角化細胞（ｈＦＫｓ）、およびヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６（ＨＰＶ−１６）のＥ６遺伝子により形質転換されたｈＦＫ細胞であるｈＦＫｓ−Ｅ６が試験に用いられた。ｈＦＫ−Ｅ６は正に制御されたテロメラーゼ活性を有することが以前に示されている（Ｈｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（９）：４４６７−４４７２）。細胞は、ウイルスに１プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染の多重度（ＭＯＩ）で感染させられ、Ｅ１ＡメッセンジャーＲＮＡの数は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定された。図７において示される結果が示すように、ｄｌ３１２が感染したｈＦＫおよびｈＦＫ−Ｅ６細胞では、Ｅ１ＡメッセンジャーｍＲＮＡは全く検出されなかった。Ａｄ５が感染した細胞では約４０００コピーのＥ１ＡメッセンジャーＲＮＡが検出されたが、ｈＦＫｓ細胞とｈＦＫｓ−Ｅ６細胞との間にｍＲＮＡコピー数の顕著な違いはなかった。しかし、ＫＨ−９００が感染した細胞では、少ないコピー数のＥ１Ａ ｍＲＮＡがｈＧＫ細胞において検出された一方、２０倍以上のコピー数のＥ１Ａ ｍＲＮＡがｈＦＫｓ−Ｅ６細胞において検出された。さらに興味深いことに、ｈＦＫ細胞に比べ１００倍以上のコピー数のＥ１Ａ ｍＲＮＡが、ＫＨ−９０１が感染したｈＦＫｓ−Ｅ６において検出された。一方、ＫＨ−９００が感染したｈＦＫ細胞に比べて、ＫＨ−９０１が感染したｈＦＫ細胞ではＥ１Ａ ｍＲＮＡのコピー数はむしろ低くなっていた。以上を併せれば、Ｍｔｅｌｏプロモーターは、レポーター遺伝子と連結されているとき、ｔｅｌｏプロモーターに比べ、高いレベルの活性および腫瘍細胞特異性を有していること；同時に、上記プロモーターがアデノウイルスのゲノムに挿入されたとき、改良された腫瘍選択性は事実であることが示された。主要的なウイルス遺伝子を制御するために用いられる場合、Ｍｔｅｌｏプロモーターは野生型プロモーターに比べてより優れた腫瘍特異性を有する。

この結果は、培養されたヒト骨髄細胞においてさらに確認された。細胞生存率測定において、２９３細胞およびヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭｓｃ）を、感染の多重度１で感染させるためにＫＨ−９００およびＫＨ−９０１が用いられた。図８に示される結果が示すように、ＫＨ−９０１は、ＫＨ−９００と同程度の効率で２９３細胞を死滅させた。しかし、ＫＨ−９００はｈＢＭｓｃ細胞について一定レベルの細胞を死滅させたにもかかわらず、ＫＨ９０１は全く死滅させなかった。

〔実験２：４種の制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体の、腫瘍細胞を死滅させる能力の比較〕
４種の制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスの、腫瘍細胞を死滅させる能力を比較するために、肺癌細胞株Ａ５４９が用いられた。細胞は６−ｃｅｍの培養皿に播種され、細胞が８５％コンフルエントになったときウイルスがＭＯＩ１にて適用された。細胞生存率は感染後の様々な時点において測定された（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１１７２−１１７９）。図９に示される結果が示すように、ＫＨ−９０４は、ＫＨ−９０１およびＫＨ−９０２に比べ細胞をより効果的に死滅させた。一方、ＫＨ−９００は最も弱いものであった。

この結果は、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターが、野生型ｈＴＥＲＴプロモーターに比べてより強力な活性を有していることを示唆した。また、ファイバー内のノブの遺伝子をセロタイプ３５由来のものに置換したものは、セロタイプ５に比べてより優れた感染力を有し得ることを示唆した。この結論は、一連の癌細胞およびヒト正常細胞において確認された（表１）。一連のヒト腫瘍細胞およびヒト正常細胞が、異なるアデノウイルス変異体に７２時間感染させられ、上述した方法で細胞生存率が測定された。５０％の細胞を死滅させるために必要なウイルスの量として、ＥＣ５０が計算された。ＥＣ５０が低い程、ウイルスはより効果的に細胞を死滅させる。表２に示される結果が示唆するように、（１）ＫＨ−９０１は、ＫＨ−９００に比べてより効果的に腫瘍細胞を死滅させる。これは、改良されたｈＴＥＲＴプロモーターが、よりすぐれた腫瘍特異性を有していることをさらに確認する；（２）ＫＨ−９０２およびＫＨ−９０３は、ＫＨ−９０１と同様に細胞を死滅させる一方、ＫＨ−９０４が最も強力であった。対照的に、改良されたＭｔｅｌｏプロモーターを含んでいるウイルス（ＫＨ−９０１、ＫＨ−９０２、ＫＨ−９０３、およびＫＨ−９０４）は、野生型のｈＴＥＲＴプロモーターを有するウイルスであるＫＨ−９００に比べて、少ない数の正常細胞を死滅させた。ウイルスのＥ１Ｂ遺伝子がＩＲＥＳによりＥ１Ａに連結されているＫＨ−９０６は、殺傷能力は比較的低かったが、良好な腫瘍細胞特異性を有していた。

（表１：ＫＨ−９０１に感染した細胞におけるＧＭ−ＣＳＦの発現）

（表２：ＫＨ−９００、ＫＨ−９０１、ＫＨ−９０２、ＫＨ−９０３、ＫＨ−９０４、およびＫＨ−９０５のＥＣ５０）

さらに興味深いことに、ＫＨ−９０１，ＫＨ−９０２、ＫＨ−９０３、およびＫＨ−９０４を含む、遺伝学的に改良されたＭｔｅｌｏプロモーターを含むように組換えられているウイルス組換え体はすべて、野生型ｈＴＥＲＴプロモーターを含むように組換えられているＫＨ−９００に比べ、ヒト正常細胞に対して非常に弱い殺傷能力（ＥＣ５０の高い値により示される）を示した。

さらに、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の間にインターナルリボソームエントリーサイトが挿入されており、したがって、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の転写は、改良されたＭｔｅｌｏプロモーターの制御下にあるアデノウイルス組換え体ＫＨ−９０６は、腫瘍細胞を死滅させる能力は他に比べてわずかに弱かったが、他のウイルス組換え体に比べてより高い腫瘍細胞選択性を示した。

〔実験３：ＫＨ−９０１は、腫瘍細胞において高レベルの生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦを生産する〕
５種の腫瘍細胞株および１種のヒト正常細胞株が、ＭＯＩ１または１０でＫＨ−９０１に感染させられた。ＥＬＩＺＡ、および従前に記述されたような（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：６４２８−６４３６）ＴＦ−１分析によるＧＭ−ＣＳＦ濃度の測定のために、感染の４８時間後細胞が収穫された。図１４に示される結果が示すようにＫＨ−９０１が感染した５種の腫瘍細胞は、高レベルのＧＭ−ＣＳＦを産生した。例えば、ＫＨ−９０１が感染したＬＮＣａＰ細胞において、細胞において検出されたＧＭ−ＣＳＦの量は２３１ｎｇ／１０⁶細胞・２４時間であった。対照的に、ＫＨ−９０１が感染したヒト正常細胞では、非常に低いレベルのＧＭ−ＣＳＦしか検出され得なかった。さらに、腫瘍細胞において発現したＧＭ−ＣＳＦが、生物学的に活性であったことが、生物学的検定法により明らかになった（表２を参照）。

〔実験４：腫瘍モデルにおける腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体の抗腫瘍効果〕
ヌードマウスの前立腺癌ＬＮＣａＰ腫瘍モデルにおいて、腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効果が評価された。６００万個のＬＮＣａＰ細胞をヌードマウスの皮下に接種し、４週間以内において、腫瘍の体積が２００ｍｍ³に達したときに、ウイルスが腫瘍内へと注射された。ウイルスの注射は、第１日目、第５日目、および第９日目の３回、様々なウイルス（ＫＨ−９０１、ＫＨ−９０４、およびＥ１Ｂ−ｐ５５欠損腫瘍溶解性アデノウイルスであるａｄｄｌ１５２０）の３×１０¹⁰粒子の投与量にて行われた。腫瘍の体積は週に２回測定され、結果が図１０に示された。

この試験において、３種の組換え体、すなわち、ＫＨ−９０１、ＫＨ−９０４、およびＫＨ−９０７（示さず、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有さないこと以外はＫＨ９０１に同じ）が腫瘍への注射に用いられた；また、Ａｄｄｌ１５２０がコントロールとして試験された。

図１０に示されるように、偽薬処置をした腫瘍は非常に速く成長し、４８日までに腫瘍の体積はベースラインの１２００％に達した。ＫＨ−９０１により処置したグループでは腫瘍はベースラインと同じ体積のまま維持され。一方、ＫＨ−９０４により処置された腫瘍は、ベースラインの１５％まで体積が減少した。同じ期間において、ａｄｄｌ１５２０により処置された腫瘍はベースラインの８５０％にまで成長した。

この結果は、ＫＨ−９０１およびＫＨ−９０４はＡｄｄｌ１５２０（Ｏｎｙｘ−０１５）に比べより優れた抗癌活性を有することを示した。興味深いことに、試験管内の研究において示されたように、ＫＨ−９０４はＫＨ−９０１に比べより優れた抗腫瘍効果を有していた。

同研究において、ＧＭ−ＣＳＦの発現もまた記録された。ＫＨ−９０７により処置された動物、およびＡｄｄｌ１５２０により処置された動物では、ＧＭ−ＣＳＦは検出されなかった。一方、ＫＨ−９０１またはＫＨ−９０４により処置した動物では高レベルのＧＭ−ＣＳＦが検出し得た。例えば、第１４日目において、ＫＨ−９０１またはＫＨ−９０４により処置された動物において検出されたＧＭ−ＣＳＦの量は、それぞれ２．３２２ｇ／ｍＬまたは２．７７６ｇ／ｍＬであった。この結果は、腫瘍溶解性ウイルスＫＨ−９０１およびその仲間が、ＧＭ−ＣＳＦを腫瘍細胞中だけで産生するのではなく、腫瘍を有する動物の生体内においても高レベルに発現させることを示唆した。

これらの研究の結果は、感染後に高レベルのＧＭ−ＣＳＦの発現が検出される様々な腫瘍細胞中において、ＫＨ−９０１およびその仲間が複製されていることを示した。

上述した他の腫瘍溶解性ウイルスもまた、同様の手順により特徴付けられ、それぞれの実施例においてより詳細に記述され得る。

本発明における組換え体である制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスは、以下の特徴を有している。

（１．構造上の特徴）
これらの組換え体は生きているウイルスであり、腫瘍細胞において複製および増殖し得る。これらは、合成された、または遺伝学的に操作された薬品とは異なっている。これらは腫瘍細胞中において複製し得、異種由来の遺伝子を発現し、抗癌活性と共に高い生物学的活性を有する。これらの組換え体は免疫刺激遺伝子を有しており、したがって、該免疫刺激遺伝子はウイルスが感染した細胞において発現し得、腫瘍細胞特異的免疫応答を誘導し得る。また、腫瘍特異的な調節因子が存在するため、これらは安全である。

（２．適用可能性）
組換え体ウイルスにおける腫瘍特異的調節因子は、９０％以上、すなわち大多数の腫瘍細胞において活性である。これらの組換え体ウイルスの重要な遺伝子は腫瘍特異的プロモーターの制御下にある。そのため、これらの組換え体ウイルスは、大多数の腫瘍細胞において複製し得、該腫瘍細胞を死滅させ得る。したがって、これらの組換え体ウイルスは、頭部および頸部癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌等の治療を含む様々な適用の可能性を有している。

これらの組換え体ウイルスは上述したような免疫刺激遺伝子を有しているため、該ウイルスは、腫瘍細胞を死滅させることによる腫瘍溶解効果を有するだけでなく、腫瘍細胞におけるサイトカインの発現に続く腫瘍特異的な免疫応答を刺激する。したがって、これらのウイルスは、局所的な腫瘍に効果的なだけでなく、遠方の腫瘍細胞に対しても効果を有する。

本発明に係る組換え体ウイルスは以下のような特性を有する：（１）これらは腫瘍細胞に対しより特異的であり、正常な体細胞および幹細胞には感染しない；したがって、これらのウイルスは臨床的な適用においてより少ない副作用を有し得る；（２）これらは、分泌型および膜結合型を含む免疫刺激遺伝子を発現する。このサイトカインは腫瘍特異的免疫応答を刺激する。そのため、遠方の腫瘍に対しても効果的である；（３）ウイルスのコートタンパク質に対する改変により、これらのアデノウイルスはより優れた細胞感染力を有する。そのため、より優れた抗癌活性を有し得る。

本発明は以下のような貢献をなす：
（１）部位特異的突然変異誘発法による改変により、腫瘍特異的調節因子ｈＴＥＲＴプロモーターがより高い転写活性および腫瘍得異性を有している。得られたプロモーターはより優れたターゲット能力を有し、正常体細胞、ならびに、特に、生殖細胞、前駆体細胞、および幹細胞における、連結した遺伝子の転写活性を著しく低減させる。重要な遺伝子が改良されたｈＴＥＲＴプロモーターの制御下にある腫瘍溶解性アデノウイルスは、骨髄細胞において複製し得ないが、多くの腫瘍細胞において高い効能を有する。

（２）ＧＭ−ＣＳＦがウイルスが感染した細胞でのみ発現するように、免疫刺激ＧＭ−ＣＳＦが組換え体アデノウイルス内に組換えられている。このようなウイルスは、腫瘍内注射に続いて腫瘍溶解効果により腫瘍細胞を死滅させ得、他方、腫瘍溶解作用に続いて、該ウイルスに感染した細胞が腫瘍細胞に対する強力な免疫応答を刺激するＧＭ−ＣＳＦを発現する。特に、ＧＭ−ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスは予防効果も有する。なぜなら、上記ウイルスは、腫瘍溶解効果（細胞の殺傷および抗原の提示）および患者の免疫細胞を教育することによる免疫応答の組合せを通して、患者の免疫システムを教育するからである。したがって、このようなウイルスは、腫瘍の再発から患者を予防し得る。

（３）ウイルスコートタンパク質（Ｃａｐｓｉｄ）の改変により、得られた組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、より優れた腫瘍への感染力を有する。アデノウイルスセロタイプ５へのアデノウイルス受容体ＣＡＲの低いまたは全く存在しない発現のために、Ａｄ５はしばしば腫瘍細胞に良好に感染し得ない。しかしながら、アデノウイルスセロタイプ３５の受容体のための結合部位および塩基配列が、Ａｄ５のゲノムに組み込まれた場合、大多数の腫瘍細胞への感染力が大幅に向上し得る。試験管内および生体内における研究が、上記の観察を確認した。

（配列表における配列の説明）
配列番号１は、ＳＰ−１（ＧＣ−ｂｏｘ）、Ｅ−Ｂｏｘ（Ｍｙｃへの結合部位）、およびＮＦ−１（ＮＦ因子への結合部位）を含むいくつかの転写因子結合部位を含んでいるヒトＴＥＲＴプロモーターからの塩基配列を含んでいる塩基配列を示す。

配列番号２は、より高い腫瘍細胞選択性および転写活性を有する、突然変異により改良されたヒトＴＥＲＴプロモーターを示す；Ｅ２Ｆ−１：転写因子Ｅ２Ｆへの結合部位。

配列番号３は、ＫＨ−９０１の全長からの塩基配列を示し、
（１）１−１０３：アデノウイルスの左側のＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＫ０００４０８に示されるアデノウイルスセロタイプ５の塩基配列）；
（２）１９４−３５８：アデノウイルスパッケージング配列およびＥ１へのエンハンサー配列；
（３）３６２−５３４：ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルシーケンスおよびリンカー（ｎｐ３５２から５５１が欠損したアデノウイルスセロタイプ５の塩基配列）；
（４）５２５−８１１：改良されたｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列およびリンカー；
（５）８１２から右：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２等を含んでいる、アデノウイルスの塩基配列；
（６）２８９９５−２９４３６：免疫を刺激するヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；
（７）２９４３７から右：Ｅ４遺伝子を含む、アデノウイルスの塩基配列、および右端。

配列番号４は、組換え体のゲノムに含まれる膜結合型の免疫調節因子ＧＭ−ＣＳＦ（ｍｂＧＭ−ＣＳＦ）を示す。

配列番号５は、ファイバー遺伝子のファイバーノブがヒトアデノウイルスのセロタイプ３５由来である、組換え体ＫＨ−９０４のゲノムにおけるキメラファイバータンパク質の塩基配列を示す。

〔実施例〕
以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明になんら限定を加えるものではない。

〔実施例１〕
１．増殖型腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体ＫＨ−９０１の構築物およびその解析（図４および図５参照のこと）。

２．図１に示したｈＴＥＲＴプロモーターの配列に従って、２つのプライマー：
Ａ． ５’−ＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＡＣＧ−３’；および
Ｂ． ５’−ＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＣ−３’
を合成した。

ＰＣＲ法によるｈＴＥＲＴプロモーターの増幅のために、活性化したヒトＲＮＡをテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応は、１サイクル目には以下の反応条件：変性反応を９４℃で５分間；アニール反応を８１℃で１分間；および伸張反応を７２℃で２分間、で行った。そして、２サイクル目以降のＰＣＲ反応においては、変性反応を９３℃で１分間行った。ＰＣＲ反応後の増幅物をアガロースゲル解析に供し、ｈＴＥＲＴプロモーター断片を回収した。塩基配列決定法によって、アガロースゲル解析で得られた上記ｈＴＥＲＴプロモーター断片が図１に示した配列と同一であることが示された。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＣＡ）が提供しているキットを用いた突然変異生成によって、上記ＤＮＡ断片をクローニングしたｐＵＣ１９ベクターを、図２に示した配列に再構築した。

３．以下の２つのプライマー：
Ｃ． ５’―ＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣ―３’；および
Ｄ． ５’―ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＡＧ―３’
を用いて、ポリ（Ａ）シグナル配列をＰＣＲ法によって増幅した。

ここで、Ｐｃｍｖ／ＺＥＲＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）をテンプレートとして用い、ＰＣＲ反応における増幅の条件は、上記ＰＣＲ反応の反応条件と同じである。ＰＣＲ反応後の断片を純化し、塩基配列決定法によってその塩基配列を確認した。

４．純化した上記ｈＴＥＲＴプロモーターおよびポリ（Ａ）ＤＮＡ断片を一緒に、９５℃で５分間変性し、室温にまで冷却した。この混合物をテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。約５００塩基対のＤＮＡ断片が、プライマーＡおよびプライマーＤで増幅された。純化および配列確認されたＰＣＲ断片をＳｓｐＩおよびＡｇｅＩを用いて消化した。そして、ポリ（Ａ）シグナル配列とｈＴＥＲＴプロモーターとを含み、かつ消化したＤＮＡ断片を、以下のクローニング工程に用いた。

５．ｐＸＣ．１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，カナダから購入した）をテンプレートとして用い、突然変異生成によって、ｐＸＣ．１に２つの制限酵素部位（ヌクレオチド番号３３９にＳｓｐＩ部位を、ヌクレオチド番号５５１にＰｉｎＡＩ部位）を導入した。変異を導入した上記ｐＸＣ．１をＳｓｐＩおよびＰｉｎＡＩで消化した後、ベクターである大きな断片として、ｐＸＣ．１を純化した。ポリ（Ａ）シグナル配列とｈＴＥＲＴプロモーターとを含む上記ＤＮＡ断片を挿入物として用いて、ｐＸＣ．１ベクターをライゲーションした。次の２０時間において、通常のクローニング技術を用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５を、ライゲーションした上記ｐＸＣ．１ベクターで形質転換した。４℃で３０分間インキュベートした後、４２℃で３０秒間熱刺激を与え、さらに４℃で２分間インキュベートした。その後、１ｍｌのＬＢ培養液を用いて、３７℃で４５分間培養した。培養液を、アンピシリンを含むアガロース培養プレートに移し、２４時間培養した。プレート上の細菌を滅菌した爪楊枝で拾い上げ、消毒した培養ビンに入れた１ｍｌのＬＢ培養液に移し、２４時間培養した。培養したＥ．ＣｏｌｉからプラスミドＤＮＡを純化し、酵素で消化することによってその構造を確認した。上記プラスミドＤＮＡをｐＫＨ−９０１ａと命名した。このプラスミドは、左側のＩＴＲ、パッケージング配列、ポリ（Ａ）配列、ｈＴＥＲＴプロモーター（Ｍｔｅｌｏ）、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの一部を備えている。

６．上記アデノウイルスの右末端の構築
ｐＧＥＭ−７ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａから購入可能）。以下の４つのプライマー：
Ｅ． ５’―ＡＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＡＣＣＴＴ―３’；
Ｆ． ５’―ＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＧＧ―３’；
Ｇ． ５’―ＣＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＡＣ―３’；および
Ｈ． ５’―ＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧ―３’
の内の２組を用いて２つのＤＮＡ断片を増幅した。

以下のプライマー：
Ｍ． ５’―ＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣ―３’；および
Ｎ． ５’―ＡＡＣＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧ―３’
を用いてＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をクローニングした。

２．の項に記載した反応条件でＰＣＲを行うことによって、活性化マクロファージから調製したｃＤＮＡテンプレートから大量のＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ断片を増幅した。ＧＭ−ＣＳＦの上記ｃＤＮＡ断片の配列を、該ｃＤＮＡ断片を純化した後、塩基配列決定法によって確認した。ＧＭ−ＣＳＦの上記ｃＤＮＡ断片を、ｐＢＨＧＥ３から増幅された２つのＤＮＡ断片と混合した。混合した３つのＤＮＡ断片を、大きなＤＮＡ断片を作成するための、プライマーＥおよびプライマーＨを用いて行うＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。プライマーＥおよびプライマーＨを用いて行ったＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の配列を塩基配列決定法によって確認し、該ＤＮＡ断片を、ＢｓｉＷＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＧＥＭ−７にクローニングした。プライマーＥおよびプライマーＨを用いて行ったＰＣＲで得られた上記ＤＮＡ断片とＢｓｉＷＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＢＨＧＥ３とをライゲーションすることによって、ｐＫＨ−９０１ｂを作製した。この右末端のプラスミドは、Ｅ１Ｂの大部分、Ｅ２遺伝子の全長、Ｅ３遺伝子の全長、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子およびＥ４遺伝子の全長を備えている。

７．組換えアデノウイルスＫＨ−９０１の構築
プラスミドＤＮＡであるｐＫＨ−９０１ａを、制限酵素であるＮｄｅＩを用いて直鎖状にし、かつプラスミドＤＮＡであるｐＫＨ−９０１ｂを制限酵素であるＣｌａＩを用いて直鎖状にした。直鎖状にした２つのプラスミドを純化した後、ＨｅＬａ細胞に（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを用いて）コトランスフェクションした。コトランスフェクション後、３７℃で１０日間培養したＨｅＬａ細胞を回収した。回収した細胞を３回、凍結融解することによって、プラーク試験法に用いる上清１００μｌを得た。上記上清を添加して８〜１２日間、低融点のアガロースで培養したところ、単一のプラークが観察された。１０μｌの自動ピペットマンで拾い上げたアガロースを含む１０μｌの液体を、予め蒔いておいたＨｅＬａ細胞に接種した。接種から４〜８日後に、細胞溶解物を観察および回収した。２００μｌの上記細胞溶解物をＤＮＡ抽出に用いた。ウイルス構成物を、ＰＣＲおよびサザンブロッティングで確認した。個々のプラークをＨｅＬａ細胞で純化し、ウイルスストックを得るためにＨｅＬａ細胞で増殖させた。ウイルスストックは、−８０℃のフリーザーで保存した。ウイルスストックの一定量を塩基配列の確認のために用いた。以上の操作によって得られたウイルスを、ＫＨ−９０１と命名した。

大量のＫＨ−９０１を産生させる方法について、別々に、しかしここでは簡単に説明する。細胞数が１リットルにつき３００万個に達するまで、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞（無血清培地で増殖できるように適応させたＨｅＬａ細胞）３リットルのバイオリアクターで培養した。培養した細胞にＫＨ−９０１を感染させ、２〜３日培養する。感染細胞を回収し、ウイルスをＣｓＣｌ２濃度勾配純化またはイオン交換カラムによって純化した。純化したウイルスを、ＰＢＳやグリセロールなどの適当なバッファーに希釈して保存した。

〔実施例２〕
ＫＨ−９００は、ＫＨ−９０１の作製方法と同様の方法で構築した。ただし、ＫＨ−９００の作製方法は、以下の点：ｐＫＨ−９００ａプラスミドにはポリ（Ａ）が含まれていないこと；ｈＴＥＲＴプロモーター断片に変異が導入されていないこと；およびＫＨ−９００ａに含まれる配列が配列番号１に示された配列と同じであること、においてＫＨ−９０１の作製方法とは異なっている。得られたプラスミドは、ｐＫＨ−９００ａと命名した。ｐＫＨ−９００ａは、ＫＨ−９００を作製するために、ｐＫＨ−９０１ｂとともにＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションした。

〔実施例３〕
ＫＨ−９０２の構築のために、ｐＫＨ−９００ｂに含まれているＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを、膜結合型のＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ（配列番号４で示された塩基配列）に置換した。得られたプラスミドを、ｐＫＨ−９０２ｂと命名した。ＫＨ−９０２を作製するために、ｐＫＨ−９００ａとｐＫＨ−９０２ｂとをＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションした。

〔実施例４〕
ＫＨ−９０３を作製するために、ｐＫＨ−９０１ｂにおける１０．４ｋ、１４．５ｋおよび１４．７ｋのためのコード領域を従来の遺伝子工学的手法によって欠損させたｐＫＨ−９０３ｂを作製した。ＫＨ−９０３を作製するために、ｐＫＨ−９００ａとｐＫＨ−９０３ｂとをＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションした。

〔実施例５〕
ＫＨ−９０４を作製するために、ファイバーのノブの遺伝子が、配列番号５に示されているように、つまりアデノウイルスセロタイプ５型のファイバー遺伝子のノブに対応する部分を、アデノウイルスセロタイプ３５型のファイバー遺伝子のノブに対応する部分に置換した。これによって得られたプラスミドをｐＫＨ−９０４ｂと命名した。

〔実施例６〕
ＫＨ−９０５を作製するために、ｐＫＨ−９０４ｂにおけるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のｃＤＮＡを、配列番号５に示されているように、膜結合型のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のｃＤＮＡに置換した。これによって得られたプラスミドをｐＫＨ−９０５ｂと命名した。ｐＫＨ−９０１ａとｐＫＨ−９０５ｂとをＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションすることによって、ＫＨ９０５を作製した。ウイルスの構造は、ＰＣＲ法および塩基配列決定法によって確認した。

〔実施例７〕
ＫＨ−９０６を作製するために、Ｅ１Ｂに対する内在性のプロモーターを、インターナルリボソームエントリーシグナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｇｎａｌ）と置換した。これによって得られたプラスミドをｐＫＨ−９０６ａと命名した。ｐＫＨ−９０６ａとｐＫＨ−９０１ｂとを、ＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションすることによってＫＨ−９０６を作製した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２：２６６７−２６７４を参照のこと）。ウイルスの構造は、ＰＣＲ法および塩基配列決定法によって確認した。

ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターの、塩基配列および転写因子への結合部位を示す図である。 より高い腫瘍細胞選択性および逆転者活性を有する、突然変異により改良されたヒトＴＥＲＴプロモーターを示す図である。 本発明に係る組換え体の構造を示す図である。 本発明に係る組換え体の構造を示す図である。 組換えアデノウイルス変異体ＫＨ−９０１を生成する過程を示す図である。 組換えアデノウイルス変異体ＫＨ−９０１を生成する過程を示す図である。 組換えアデノウイルス変異体ＫＨ−９０１を生成する過程を示す図である。 組換え体ＫＨ−９０１の構築の詳細を示す図である。 野生型ｈＴＥＲＴプロモーター（ｔｅｌｏ）および改良されたｍｈＴＥＲＴプロモーター（Ｍｔｅｌｏ）の両者のプロモーター活性を示す図である。 ｈＦＫ細胞、およびＨＰＶ Ｅ６遺伝子を変化し得るｈＦＫ−Ｅ６細胞における組換えアデノウイルスのＥ１ＡメッセンジャーＲＮＡの発現を示す図である。 正常ヒト骨髄間葉系幹細胞に対する組換えアデノウイルスの細胞溶解活性を示す図である。 Ａ５４９細胞における組換えアデノウイルスの細胞溶解活性（細胞生存率％）を示す図である。 組換えアデノウイルスの腫瘍内注射後の、前立腺癌ＬＮＣａＰ異種移植モデルにおける抗癌効果を示す図である。

符号の説明

ＳＰ−１（ＧＣ−ｂｏｘ） ＳＰ１結合部位
Ｅ−Ｂｏｘ Ｍｙｃ結合部位
ＮＦ−１ ＮＦ結合部位
Ｅ２Ｆ−１ 転写因子Ｅ２Ｆの結合部位

Claims (25)

1. 制限増殖型ウイルス組換え体であって、
   該組換え体は、主要ウイルス、腫瘍細胞特異的調節因子、および免疫調節遺伝子を含んでおり、
   該主要ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであることを特徴とする組換え体。
2. 上記主要ウイルスが、アデノウイルスまたは遺伝学的に改良されたアデノウイルス変異体であることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
3. 上記アデノウイルスが、以下のアデノウイルスセロタイプ：Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ３５およびＡｄ４１を含んでなる群から選ばれることを特徴とする請求項２に記載の組換え体。
4. 上記改良されたアデノウイルス変異体が、インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）により自らのＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が連結されているアデノウイルスであることを特徴とする請求項２に記載の組換え体。
5. 上記改良されたアデノウイルス変異体が、アデノウイルスセロタイプ３５のファイバーノブによって、自らのアデノウイルスセロタイプ５のファイバーノブが置換されているアデノウイルスであることを特徴とする請求項２に記載の組換え体。
6. 上記改良されたアデノウイルス変異体が、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されているアデノウイルスであることを特徴とする請求項２に記載の組換え体。
7. 上記改良されたアデノウイルス変異体が、自らのＥ３領域における１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋをエンコードしている塩基配列が欠損しているアデノウイルスであることを特徴とする請求項２に記載の組換え体。
8. 上記改良されたアデノウイルス変異体が、インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）により自らのＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が連結されており、アデノウイルスセロタイプ３５のファイバーノブによって、自らのアデノウイルスセロタイプ５のファイバーノブが置換されており、かつ、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されているアデノウイルスであることを特徴とする請求項２に記載の組換え体。
9. 上記転写終結因子が、ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）シグナル配列であることを特徴とする請求項６に記載の組換え体。
10. 上記腫瘍細胞特異的調節因子が、任意の腫瘍細胞選択的プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、またはこれらの組合せてあることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
11. 上記プロモーターが、配列番号２に示されるｈＴＥＲＴプロモーターであることを特徴とする請求項１０に記載の組換え体。
12. 上記免疫調節遺伝子が、ヒトの免疫応答を向上させ得る細胞因子の遺伝子であり、
    該細胞因子が、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＮＦ−ｂｅｔａ、およびこれらの変異体を含んでなる群より選ばれることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
13. 上記ヒトの免疫応答を向上させ得る細胞因子が、ヒトＧＭ−ＣＳＦであることを特徴とする請求項１２に記載の組換え体。
14. 上記ＧＭ−ＣＳＦが膜結合型であることを特徴とする請求項１３に記載の組換え体。
15. 上記主要ウイルスが、自らのアデノウイルス塩基配列において、インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）により自らのＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が連結されており、アデノウイルスセロタイプ３５のファイバーノブによって、自らのアデノウイルスセロタイプ５のファイバーノブが置換されており、かつ、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されている改良されたアデノウイルスであり、
    上記腫瘍細胞特異的調節因子が、配列番号２に示されるｈＴＥＲＴプロモーターであり、
    上記免疫調節遺伝子が、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
16. 上記主要ウイルスが、自らのアデノウイルス塩基配列において、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されている改良されたアデノウイルスであり、
    上記腫瘍細胞特異的調節因子が、配列番号２に示されるｈＴＥＲＴプロモーターであり、
    上記免疫調節遺伝子が、配列番号３に示される塩基配列からなるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
17. 上記主要ウイルスが、自らのアデノウイルス塩基配列において、アデノウイルスセロタイプ３５のファイバーノブによって、自らのアデノウイルスセロタイプ５のファイバーのノブが置換されている改良されたアデノウイルスであり、
    上記腫瘍細胞特異的調節因子が、配列番号２に示されるｈＴＥＲＴプロモーターであり、
    上記免疫調節遺伝子が、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
18. 上記主要ウイルスが、自らのアデノウイルス塩基配列において、ＩＴＲおよびパッケージング配列の下流、ならびに異種性のプロモーターの上流に転写終結因子が挿入されており、かつ、自らのＥ３領域における１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋをエンコードしている塩基配列が欠損している改良されたアデノウイルスであり、
    上記腫瘍細胞特異的調節因子が、配列番号２に示されるｈＴＥＲＴプロモーターであり、
    上記免疫調節遺伝子が、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
19. 上記ＧＭ−ＣＳＦが膜結合型であることを特徴とする請求項１５〜１８の何れか１項に記載の組換え体。
20. 配列番号２に示される塩基配列を有することを特徴とするプロモーター。
21. 請求項１〜１８の何れか１項に記載の組換え体を含んでいることを特徴とする薬学的組成物。
22. 注射として適用されるために処方されていることを特徴とする請求項２１に記載の薬学的組成物。
23. 化学療法および放射線治療と共に適用されることを特徴とする請求項２１に記載の薬学的組成物。
24. 腫瘍の予防および／または治療のための薬物の製造のために用いることを特徴とする請求項１に記載の組換え体。
25. 請求項１に記載の組換え体を調製する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含んでいることを特徴とする方法：
    （ａ）ｈＴＥＲＴプロモーター配列を含んでいる、アデノウイルスの左腕部を生成する工程；
    （ｂ）免疫刺激遺伝子を含んでいる、アデノウイルスの右腕部を生成する工程；ならびに
    （ｃ）２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬＡ−Ｓ３細胞またはＡ５４９細胞に、該アデノウイルスの左腕部および該アデノウイルスの右腕部のプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションし、相同組換えを介して該組換え体を生成する工程。

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