ES2466415T3 - Construcción de recombinante de adenovirus oncolítico que expresa específicamente el factor inmunomodulador GM-CSF en células tumorales y usos del mismo - Google Patents

Abstract

Un recombinante de adenovirus oncolítico, en donde dicho recombinante comprende un virus esencial, un elemento regulador específico de células tumorales en donde el elemento regulador específico de células tumorales es el promotor hTERT selectivo de células tumorales de SEQ. ID NO: 2 y un gen inmunorregulador seleccionado de los genes IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF, INF-alfa e INF-beta, siendo dicho virus esencial un adenovirus o una variante de adenovirus genéticamente mejorada seleccionada de: i) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES); ii) un adenovirus en el cual su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus se ha reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus; iii) un adenovirus en el cual un elemento terminal de la transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT; iv) un adenovirus en el cual la secuencia codificante para 10,4 K, 14,5 K y 14,7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada; y v) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y un elemento terminal de la transcripción se ha insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.

Description

Construcción de recombinante de adenovirus oncolítico que expresa específicamente el factor inmunomodulador GM-CSF en células tumorales y usos del mismo

Campo de la Invención

5 La presente invención se refiere a una terapia génica para tumores. Más específicamente, la invención se refiere a adenovirus oncolíticos recombinantes, que se replican preferentemente en células tumorales y expresan factores imunoestimulantes para inducir respuestas inmunes específicas de tumor en el cuerpo humano.

Antecedentes de la Invención

Hace más de un siglo desde que se utilizó por primera vez un virus para tratar una enfermedad neoplástica. Algunos

10 médicos observaron que ocasionalmente un paciente se curaba después de una infección por virus. Este rompecabezas no se resolvió hasta el comienzo de los años 1920, y desde entonces ha atraído la atención de los científicos y médicos de clínica. Éste fue el comienzo de la viroterapia (utilización de virus para tratar el cáncer). Hacia los años 1950, habían sido ensayados más de 50 virus respecto a actividad antitumoral en animales o pacientes (Mullen y Tanabe (2002) The Oncologist 7:106-119; McCormick F (2001) Nature Review Cancer

15 1:130.141). En 1956, el doctor Smith y su equipo trataron más de 30 pacientes de cáncer cervical con lisado de células HeLa o células KB que estaban infectadas con 10 serotipos de adenovirus de tipo salvaje por inyección intratumoral, inyección arterial intrahepática o inyección intravenosa. No se observó efecto secundario grave alguno, excepto síntomas de gripe en la mayoría de los pacientes; por el contrario, los tumores de varios pacientes se contrajeron y se volvieron necróticos. Lamentablemente, debido a la limitación de la producción y purificación de los

20 virus, este trabajo no progresó ulteriormente. El trabajo del doctor Smith había estimulado a muchos científicos a explorar la posibilidad de utilizar virus para tratar cánceres (Chiocca EA (2002) Nature-Review Cancer 2:938-950).

Junto con el proceso realizado en biología molecular e ingeniería genética, en particular, con mejores conocimientos en virus en relación con el ser humano, los científicos han logrado manipular genéticamente el genoma viral desde finales del pasado siglo, lo que incluye el éxito en la creación de mutantes de virus que pueden replicarse 25 específicamente en células tumorales (McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1:130-141). Por ejemplo, el mutante del virus del herpes simple específico de glioma G207 (Martuza et al., (1991) Science 252:854-856), el adenovirus Add11520 (Onyx-015), un mutante de adenovirus que se replica preferentemente en células tumorales deficientes en p53 (Bischoff et al., (1996) Science 274:373-376) y CV706, un mutante de adenovirus específico de las células de cáncer de próstata (Rodriguez et al. (1997) Cancer Research 57: 2559-2563). Este trabajo ha sentado las

30 bases para la formación de un nuevo campo: La Viroterapia del Cáncer. En la actualidad, existen más de 20 variantes de virus en pruebas clínicas (Mullen y Tanabe (20002) The Oncologist 7:106-119).

Existen varios enfoques para la producción de virus oncolíticos específicos de células tumorales. Un enfoque para producir una variante de virus que se replica selectivamente en células tumorales consiste en la utilización de elementos reguladores específicos de células tumorales tales como promotores e intensificadores que controlan la 35 expresión de genes virales esenciales, por ejemplo, los genes E1A, E1B, E2 y E4 de adenovirus (DeWeese et al. (2001) Cancer Research 61:7464-7472). Por este enfoque, genes virales esenciales y en última instancia la replicación de los virus podrían ponerse bajo control de elementos reguladores específicos de células tumorales; tales elementos reguladores incluyen el promotor e intensificadores del antígeno específico de próstata (PSA), el promotor e intensificadores de la alfa-feto-proteína (AFP), el promotor de E2F-1 humano, etc. (McCormick F (2001)

40 Nature Review Cancer 1:130-14).

La telomerasa en una enzima importante para controlar la longitud del extremo de los cromosomas celulares, capaz de regular la longitud del extremo del cromosoma durante el proceso de la fisión celular. La telomerasa está constituida principalmente por las tres partes, en donde RNA y el gen de la transcriptasa inversa de telomerasa (hTERT), que tiene actividad catalítica, controlan la actividad de telomerasa, mientras que el promotor hTERT

45 determinará la expresión y actividad de la telomerasa.

Investigaciones ulteriores han indicado que la telomerasa tiene actividad nula o muy baja en las células normales adultas. (Kim N W et al. Science. 1994 Dec. 23; 266(5193):2011-5; Shay J W et al. European Journal of Cancer 1997, 33;271-282), en tanto que tiene un alto nivel de suministro en más de 90% de las células tumorales (Hahn y Weinberg (2002) Nature Review Cancer 2:331-341; Shay y Wright (1996) Current Opinion Oncology 8:66-71). Ba

50 sándose en estas características de hTERT, los científicos han generado con éxito varios vectores en los cuales el promotor hTERT se incorporaba en el genoma viral para suministro de genes, con inclusión de los trabajos publicados recientemente que describen el uso del promotor hTERT para replicación condicional de adenovirus oncolíticos (Lanson et al. (2003) Cancer Research 63:7936-7941; Kawashima et al., (2004) Clinical Cancer Research 10:285-292; Kim et al. (2003) Oncogene 22: 370-380; Irving et al. (2004) Cancer Gene Therapy 174-185).

55 Existen un pequeño número de elementos reguladores endógenos en el genoma adenoviral, que regula la expresión de genes virales, por ejemplo, el promotor e intensificador del gen E1A, entre estos elementos reguladores endógenos, la secuencia del intensificador E1A se solapa con la señal de empaquetamiento viral. Con objeto de minimizar el impacto de los elementos reguladores endógenos sobre la regulación de un promotor heterólogo, los científicos han reubicado la señal de empaquetamiento a la rama derecha desde el sitio nativo en el extremo de la izquierda (Bristol et al. (2003) Molecular Therapy 7(6):755-764; Jakubczak et al. (2003) Cancer Research 63:14901499). Lamentablemente, esta clase de reubicación de la señal de empaquetamiento viral desde el sitio nativo al extremo de la derecha ha desestabilizado el genoma viral, dando como resultado la generación de muchos mutantes

5 virales (WO 02/067861; ASGT 2003 Annual Meeting, Molecular Therapy). Por tanto, la reubicación arriba indicada de la señal de empaquetamiento viral no es un enfoque viable para minimizar el impacto de los elementos reguladores endógenos. ¿Cómo minimizar el impacto de los reguladores virales endógenos sobre los elementos heterólogos y prevenir la generación no deseada de muchos mutantes virales, en tanto que se mantiene estable el genoma viral?

10 Con respecto al nivel de expresión de la telomerasa en humanos, durante el desarrollo y la diferenciación del embrión, los científicos han llegado a reconocer también que existe un determinado nivel de actividad de telomerasa en algunas células que incluyen células del miembro cervical, progenitores, y células madre (Wright et al. (1996) Development Genetics 18:173-179; Sharma et al. (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12343-12346; Kolquist et al. (1996) British Journal of Cancer 80:1156-1161; Tahara et al. (1999) Oncogene 18:1561-1567; Tanaka et al. (1998)

15 American Journal of Pathology 153:1985-1991). El bajo nivel de la actividad de expresión de telomerasa ha aconsejado a los científicos cuando los mismos utilizaban el promotor hTERT para suministrar un gen terapéutico en el vector de terapia génica, o para generar adenovirus oncolíticos específicos de células tumorales por control de genes virales esenciales (Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10: 1203-1205). Debido al bajo nivel de expresión de telomerasa en las células distintas de la diana, tales como los progenitores, los adenovirus oncolíticos

20 controladores del promotor hTERT pueden replicarse masivamente en las células progenitoras, dando como resultado efectos secundarios graves (Huang et al. (2004) Clinical Cancer Research 10:1439-1445; Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10:1203-1205; Masutomi et al. (2003) Cell 114: 241-253). Por tanto, el aumento de la especificidad de células tumorales del promotor hTERT es uno de los proyectos fundamentales en la generación de adenovirus oncolítico utilizando el promotor hTERT.

25 Varios documentos consideran la generación y uso de vector de adenovirus oncolítico. Li et al. (Cancer Research, 2001, 61, p. 6428-6436) dan a conocer una variante de adenovirus específico de carcinoma hepatocelular, CV890, que elimina los tumores hepáticos humanos distantes cuando se administra en combinación con doxorrubicina. Green et al. (Int. J. Cancer, 2003, 104, p. 104-112) dan a conocer un vector de adenovirus bicistrónico y su uso para intensificación inmune de la citotoxicidad inducida por nitrorreductasa. Kawashima et al. (Clinical Cancer Research,

30 2004, 10, p. 285-292) construyen un vector número 5 de adenovirus en el cual el elemento promotor hTERT impulsa la expresión de genes E1A y E1B para viroterapia selectiva de replicación. WO 03/013555 da a conocer un método para amplificación de la expresión de un promotor específico de células tal como hTERT que puede proporcionar método de terapia del cáncer. WO 02/067861 se refiere a vectores oncolíticos de adenovirus y su uso en métodos de terapia génica, vectores que comprenden un promotor sensible a E2F. WO 2005/112541 se refiere a un vector de

35 expresión génica de adenovirus híbrido que comprende una secuencia promotora específica de tejido así como usos de la misma. CN-A-1.381.582 da a conocer un adenovirus recombinante para expresión de GM-CSF humano y su uso para inmunoterapia. La Patente US número 6.627.190 describe vectores de adenovirus que sobreexpresan una proteína de muerte de adenovirus y que están preferiblemente restringidos en replicación a células que expresan telomerasa. WO 96/09399 describe un adenovirus quimérico capaz de transducir células de mamífero con DNA,

40 adenovirus que puede ser útil para tratamiento de enfermedades y trastornos genéticos de mamífero. La Patente US número 6.348.450 se refiere a técnicas de terapia génica no invasiva direccionada a la piel, en donde el vector es un vector de adenovirus que codifica un gen de interés. CN-A-1.382.218 describe un adenovirus oncolítico que destruye preferentemente las células neoplásticas pero no las normales, comprendiendo preferiblemente el vector un promotor sensible a E2F. La Patente US número 6.713.055 se refiere a vectores, que pueden ser vectores

45 adenovirales, que comprenden una secuencia codificante de una glicosil-transferasa bajo el control de un elemento de control de la transcripción específico de tumor o de tejido. WO 99/46371 se refiere a vectores adenovirales que contienen genes proapoptóticos y el uso de tales vectores en terapia del cáncer.

Sumario de la Invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.

50 Adenovirus oncolíticos específicos de células tumorales pueden obtenerse por combinación del adenovirus oncolítico con un elemento regulador específico de una célula tumoral por un método de ingeniería genética, y el recombinante puede construirse por incorporación del promotor específico de células tumorales de SEQ ID NO: 2 y el gen inmunorregulador en el genoma del adenovirus por tecnología de clonación de DNA, obteniéndose así una secuencia fusionada capaz de replicarse en las células tumorales y expresar el gen inmunorregulador en las células

55 tumorales.

En otro aspecto, esta invención proporciona un uso del recombinante de adenovirus oncolítico reivindicado en la fabricación de un medicamento para prevención y/o tratamiento de un tumor.

En otro aspecto, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el recombinante reivindicado, v.g. como un medicamento para prevención y/o tratamiento de un tumor.

En otro aspecto, esta invención proporciona un promotor que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.

El recombinante conforme a la presente invención puede utilizarse para controlar los adenovirus en tal grado que estos adenovirus se repliquen únicamente en las células tumorales. Por modificación genética del promotor hTERT, el recombinante de la invención tiene una especificidad sustancialmente mejorada del promotor hTERT para las

5 células tumorales.

El recombinante del virus oncolítico que tiene especificidad de células tumorales, conforme a la invención, se puede preparar por ingeniería genética de un gen de factor inmuno-estimulante, que es capaz de inducir una respuesta inmuno-estimulante específica del cuerpo humano a las células tumorales, con el genoma viral replicante específico de las células tumorales. El recombinante de virus resultante puede replicarse selectivamente en una población

10 específica de células y puede replicarse y propagarse en células tumorales, y por consiguiente destruir las células tumorales, por lo que el recombinante puede utilizarse para tratar el cáncer y prevenir el tumor.

En la técnica anterior, la construcción y propagación de adenovirus oncolítico replicante condicionalmente o vectores virales modificados por ingeniería genética se encuentra en líneas de células modificadas por ingeniería genética, tales como la línea de células 293. Una línea de células de este tipo expresa proteínas adenovirales E1 para 15 complementar la función del vector adenoviral delecionado en E1 y deficiente en replicación o un recombinante de adenovirus oncolítico replicante condicionalmente en el cual el gen E1 viral se encuentra bajo el control de un elemento regulador selectivo de células tumorales. Lamentablemente, el recombinante producido en una línea de células de este tipo contiene usualmente cierta cantidad de adenovirus de tipo salvaje o recombinados (a los que se hace referencia como adenovirus competente en replicación, RCA). La razón para la generación de RCA en el 20 producto recombinante es que en las células de generación tales como la clase de línea de células 293, se contiene la secuencia génica del adenovirus; esta pieza de secuencia de adenovirus “tipo salvaje” se recombinará en la célula con el adenovirus delecionado en E1 o intensificado en E1, dando como resultado un adenovirus “tipo salvaje” o un adenovirus recombinante. Un producto de este tipo puede no cumplir las especificaciones de producto y puede causar efectos secundarios inesperados con problemas de seguridad. La célula utilizada para construcción del

25 recubrimiento reivindicado puede seleccionarse de modo que no contenga secuencia alguna de gen adenoviral y por consiguiente puede evitar el RCA y resolver el problema de seguridad como se ha mencionado arriba.

En una realización, la invención proporciona un recombinante de adenovirus oncolítico de replicación condicional como se reivindica en esta memoria en el cual la proteína de la cápsida se ha mejorado para aumentar la afinidad de fijación del recombinante a las células tumorales, dando como resultado un aumento de infectividad del 30 recombinante para la célula tumoral. Muchos estudios recientes han demostrado una expresión baja o nula del receptor 5 de adenovirus (el receptor del virus B de Coxsackie y el receptor de adenovirus, CAR) en células tumorales. No obstante, todas las células tumorales expresan un alto nivel de CD46 (Shayakhmetov et al., 2002. Cancer Research 62:1063-1068). Estudios ulteriores han demostrado que el receptor del serotipo 35 de adenovirus es la molécula de proteína CD46 (Sirena et al. (2004) Journal of Virology 78(9):4454-4462). Por tanto, los autores de

35 esta invención proponen reemplazar el botón de fibra de la secuencia proteínica en el recombinante del virus serotipo 5 de adenovirus con el de serotipo 35 de adenovirus, el último de los cuales es capaz de fijar el receptor de la proteína CD46, a fin de construir un recombinante que tiene un adenovirus fusionado capaz de fijar el receptor. Se cree que un recombinante de este tipo tendrá infectividad mejor en un espectro más amplio de células tumorales.

El virus oncolítico de replicación condicional de acuerdo conforme a la invención puede ser uno cualquiera de los

40 serotipos de adenovirus que incluyen el serotipo 5, 2, 35, 41, etc., preferiblemente el serotipo 5 o un adenovirus mejorado. Por ejemplo, un recombinante de adenovirus en el cual el gen E1A y el gen E1B están ligados uno a otro por el sitio de entrada de cromosoma interno (IRES); un recombinante de adenovirus en el cual el botón de fibra del adenovirus tipo 5 está reemplazado con el del serotipo 35 de adenovirus; un recombinante de adenovirus en el cual está insertada una secuencia terminal de la transcripción aguas abajo de la ITR viral y el sitio de empaquetamiento y

45 aguas arriba del promotor hTERT; estando delecionado el adenovirus con su secuencia codificante para 10,4 K, 14,5K y 14,7K en la región E3. Dicha secuencia terminal de la transcripción puede terminar la transcripción génica mediada por cualquier RNA-polimerasa, tal como la secuencia señal temprana SV40 poli(A); tal como el recombinante de adenovirus con sus secuencias para codificación de 10,4K, 14,5K y 14,7K en el fragmento E3 estando delecionadas.

50 Dicho elemento regulador de genes que es específico de las células tumorales es el promotor hTERT mejorado de SEQ ID NO: 2, y este promotor tiene un sitio de fijación para el factor de transcripción E2F-1.

Dicho elemento inmunorregulador puede ser cualquier gen o sus variantes que puedan simular o inducir respuesta inmune, seleccionado de IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF e INF-alfa, INF-beta, con preferencia

GM-CSF, con inclusión de sus formas secretadas y fijadas a la membrana, así como sus variantes.

55 Un recombinante de adenovirus preferible de acuerdo con la invención es un recombinante de este tipo, en el cual el vector del virus esencial es un adenovirus mejorado tal que, en la secuencia del adenovirus, está insertada una secuencia terminal de la transcripción aguas abajo de la ITR viral y el sitio de empaquetamiento, pero aguas arriba del promotor hTERT de SEQ ID NO: 2, el gen inmuno-estimulante es GM-CSF que tiene una secuencia representada en SEQ ID NO: 3 (KH-901) o que se encuentra en un GM-CSF fijado a la membrana (KH-902).

Otro recombinante de adenovirus preferible conforme a la invención es un recombinante de este tipo en el que el vector del virus esencial es un adenovirus mejorado tal que, en su secuencia, el botón de fibra es del serotipo 35 de

5 adenovirus en sustitución del serotipo 5 de adenovirus, y el elemento regulador específico de células tumorales es el promotor hTERT que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, y el gen inmunoestimulador es GM-CSF (KH-904), preferiblemente un GM-CSF fijado a la membrana (KH-905).

En otra realización preferida, el gen E1A y el gen E1B están unidos por IRES, el botón de fibra es de serotipo 35, está insertado un elemento terminal de la transcripción aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas

10 arriba del promotor hTERT de SEQ ID NO: 2, en el cual el gen inmunoestimulador es GM-CSF, preferiblemente en su forma fijada a la membrana.

Otro recombinante preferible de adenovirus conforme a la invención es uno de este tipo, en el cual el vector de virus esencial es un adenovirus mejorado tal que, en la secuencia de adenovirus, una secuencia terminal de la transcripción está insertada aguas abajo de la ITR viral y el sitio de empaquetamiento pero aguas arriba del

15 promotor hTERT; estando delecionado el adenovirus con su secuencia codificante para 10,4K 14,5K y 14,7K en la región T3; el elemento regulador específico de células tumorales es el promotor hTERT de SEQ ID NO: 2, el gen estimulante del tumor es GM-CSF, preferiblemente el GM-CSF fijado a la membrana (KH-903).

Otro recombinante de adenovirus preferible de acuerdo con la invención es uno de este tipo en el cual una secuencia terminal de la transcripción está insertada aguas abajo de la ITR viral y el sitio de empaquetamiento de

20 aguas arriba del promotor hTERT, y el gen adenoviral E1A y el gen E1B están unidos por IRES, el elemento regulador específico de células tumorales es el promotor hTERT de SEQ ID NO: 2, y el gen inmunoestimulador es GM-CSF (KH-906).

Los recombinantes de adenovirus conforme a la invención incluyen, pero sin carácter limitante, KH-901, KH-902, KH-903, KH-904, KH-905 y KH-906, en los cuales la secuencia para KH-901 se muestra en SEQ ID NO: 3, en

25 donde

1) 1-103: ITR izquierda adenoviral {serotipo 5 de adenovirus de secuencia representado en Genbank No. BK000408};

2) 194-358: secuencia de empaquetamiento de adenovirus y la secuencia intensificadora para E1;

3) 362-534: secuencia señal SV40 poli(A) y el enlazador (la secuencia de serotipo 5 de adenovirus de la 30 que se han delecionado los np 362 a 551);

4) 525-811: la secuencia del promotor hTERT mejorado genéticamente y el enlazador;

5) 812 a la derecha: secuencia de adenovirus que incluye E1A, E1B, E2, etc.;

6) 28995-29436: gen inmunoestimulador GM-CSF;

7) 29437 a la derecha: secuencia de adenovirus del gen E4 y el extremo de la derecha.

35 La secuencia de KH-200 es similar a la secuencia representada en SEQ ID NO: 3, mientras que su secuencia del promotor hTERT se encuentra en el tipo salvaje sin transversión de bases (se ruega referirse a SEQ ID NO: 1 y 2). No existe secuencia señal SV40 poli(A) alguna entre el sitio de empaquetamiento y el promotor hTERT.

La secuencia de KH-902 es similar a KH-901, pero el gen inmunoestimulador GM-CSF está reemplazado por su forma fijada a la membrana con la secuencia representada en SEQ ID NO: 4.

40 La secuencia de KH-903 es similar a KH-901, excepto que la secuencia codificante para 10,4 K, 14,5K y 14,7K ha sido delecionada, siendo la secuencia delecionada la parte del genoma adenoviral desde NT21804 a 30857. Las proteínas de estas secuencias codificantes inhiben la respuesta inmune, particularmente la respuesta inmune mediada por el factor de necrosis tumoral (TNF). Por tanto, la deleción de estas regiones codificantes mejorará las respuestas inmunes direccionadas al tumor inducidas por los adenovirus oncolíticos que se replican

45 condicionalmente.

La secuencia de KH-904 es similar a KH-901, excepto que el botón de fibra está cambiado del serotipo 5 adenovirus al serotipo 35, representándose la secuencia en SEQ ID NO: 5. Investigaciones ulteriores han revelado que muchas células tumorales no expresan la proteína receptora CAR del serotipo 5 de adenovirus, pero expresan un alto nivel de molécula CD46. La molécula CD46 es el receptor del serotipo 35 de adenovirus. Por tanto, la presencia del botón

50 de fibra del serotipo 35 de adenovirus mejorará la infectividad de los recombinantes de adenovirus oncolítico que se replican condicionalmente.

KH-905 es similar a KH-904 excepto que el gen inmunoestimulador GM-CSF se ha cambiado de la forma secretada a la forma fijada a la membrana.

KH-906 se produce a partir de KH-901 por reemplazamiento del promotor endógeno E1B con un sitio de entrada de ribosoma interno (Li et al., (2001) Cancer Research 62; Zhang et al. (2002) Cancer Research 62: 3743-3750).

5 Se proporciona también la secuencia del promotor hTERT mejorado de SEQ ID NO: 2, teniendo este promotor sitio de fijación para el factor de transcripción E2F-1.

El promotor hTERT mejorado arriba indicado se generó como sigue. Se sintetizaron dos cebadores basados en la secuencia del promotor hTERT como se muestra en la Figura 1:

A. 5’-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3’

10 B. 5’-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3’ El promotor hTERT se amplificó por PCR con DNA genómico humano activado como el molde, y los cebadores fueron los arriba indicados. La condición para la reacción PCR es como sigue: para el primer ciclo, 94ºC durante 5 minutos para desnaturalización, 81ºC durante 1 minuto para reasociación, 72ºC durante 2 minutos para extensión; para cada uno de los 35 ciclos siguientes: 93ºC durante 1 minuto para desnaturalización, 68ºC durante 1 minuto

15 para reasociación, 72ºC durante 2 minutos para extensión. El producto PCR se analizó en gel de agar y el fragmento del promotor hTERT se recuperó para confirmación por secuenciación. La secuencia se confirmó como se ha publicado (Figura 1). El DNA del fragmento PCR purificado se clonó al vector pUC19. Con el método de mutagénesis descrito por Stratagene (mutagénesis orientada), la secuencia del promotor hTERT se cambió a la representada en la Figura 2.

20 Esta invención proporciona también por tanto el promotor hTERT mejorado con la secuencia de SEQ ID NO: 2, que puede obtenerse por dicho método anterior.

En el promotor hTERT conforme a la invención, no existe ningún par de bases TATA conservado, pero existen dos secuencias semejantes a la caja E de CACGTG y regiones de fijación de Sp-I ricas en GC. Estas secuencias conservadoras son cruciales para la expresión de la telomerasa, dado que la transcripción de la telomerasa está regula

25 da por el promotor hTERT a través de C-Myc/Max y Sp-I (Cong et al (1999) Human Molecular Genetics 8(1):137-142; Kyo et al (2000) Nucleic Acids Research 28(3):669-677). Muchos estudios han revelado que Myc juega un papel importante en la proliferación celular y el ciclo celular, por lo que la modificación arriba indicada del promotor hTERT causará impacto ulterior en la transcripción y expresión de la telomerasa. Con objeto de minimizar la actividad del promotor hTERT en las células normales tales como las progenitoras y

30 aumentar su selectividad para las células tumorales, los inventores han analizado en detalle los sitios de fijación del factor de transcripción en el promotor hTERT por modelización mediante computadora. Basándose en la modelización por computadora, los inventores han realizado análisis sobre una serie de mutagénesis, entre las cuales identificaron un mutante en el que la cuarta Sp-I se había cambiado al sitio de fijación E2F-1, habiéndose cambiado la secuencia desde ‘...TTTCCGCGGCCCCGGCC...’ (Figura 1) a ’...TTTCCGCGGCAACGCCC...’ (Fig. 2).

35 El estudio in vitro demostró que el promotor hTERT mejorado mantiene la actividad en las células tumorales y reduce significativamente la actividad “promotora” en las células normales. Por tanto, el promotor mejorado tiene una actividad de trasncripción significativamente reducida en las células normales con inclusión de las células progenitoras. Se demostró en un experimento de transfección transitoria que utilizaba el gen consignado que, en las células tumorales, el promotor hTERT mejorado tiene una actividad aproximadamente 5 a 10 veces mayor que la del

40 promotor hTERT de tipo salvaje, mientras que en las células normales, el promotor hTERT mejorado tiene una actividad muy reducida (Figura 6). Se construyó luego un adenovirus oncolítico de replicación condicional por control del gen viral esencial con el promotor hTERT mejorado, careciendo el virus oncolítico resultante de toxicidad para las células madre (Figura 7); por tanto el adenovirus oncolítico resultante tiene una seguridad notablemente mejorada para aplicación clínica.

45 Dado que el promotor E2F-1 es activo en las células tumorales deficientes en el camino pRb/E2F/p16, el mismo ha sido ampliamente utilizado en terapia génica, particularmente en la construcción de adenovirus oncolítico de replicación condicional (Parr et al. (1997) Nature Medicine 3(10):1145-1149; Jakubczak et al. (2003) Cancer Research 63:1490-1499; Bristol et al. (2003) Molecule Therapy 7(6):755-763). El promotor hTERT mejorado tiene no sólo sitios de fijación para los factores de transcripción E2F-1, sino también sitios de fijación Sp-I y NF-1 que están poseídos en

50 el promotor E2F-1, por lo que el promotor hTERT mejorado es activo en células tumorales que están reguladas en sentido creciente por la telomerasa y son deficientes en el camino Rb. Por tanto, el promotor hTERT mejorado es activo en estas dos clases de células tumorales, pero inactivo en células normales tales como las células madre; esto representa una alta especificidad tumoral. En una realización, la invención proporciona un recombinante de adenovirus oncolítico de replicación condicional

55 como se reivindica en esta memoria en el cual el gen E1A y el gen E1B están ligados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) y por tanto lleva la transcripción de los dos genes importantes E1A y E1B del recombinante de adenovirus bajo el control del promotor hTERT mejorado tal como KH-906.

En una realización adicional, la invención proporciona un recombinante de adenovirus oncolítico como se reivindica en esta memoria en el cual una señal de terminación de la transcripción está ubicada aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento viral y aguas arriba del promotor hTERT específico de las células tumorales. La señal de terminación de la transcripción tal como SV40 poli(A) temprana puede bloquear cualquier transcripción mediada por RNA-polimerasa. Estudios in viro han demostrado que, debido a la presencia de la señal de terminación de la transcripción tal como SV40 poli(A) temprana, la ITR y la secuencia, que está solapada en el sitio de

5 empaquetamiento y tiene efecto como intensificador, tiene sólo un impacto menor sobre el promotor hTERT.

Los recombinantes de adenovirus oncolíticos conforme a la invención tienen genes inmunorreguladores. En varios recombinantes de adenovirus oncolíticos conocidos, el gen GM-CSF se utilizó como gen inmunoestimulador, conteniendo también los recombinantes de adenovirus oncolíticos descritos en esta invención el gen GM-CSF como gen inmunoestimulador, aunque sin estar limitados al gen GM-CSF, y podrían utilizarse también otros genes 10 inmunoestimuladores tales como citoquinas. Sin embargo, es bien conocido que GM-CSF es un inductor de respuestas inmunes de larga duración (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539-3543). Se trata de una glicoproteína secretada que puede estimular la diferenciación de granulocitos, monocitos, macrófagos y células dendríticas, y aumentar la expresión de MHC y la molécula co-estimulante B7 en las células presentadoras de antígeno. El GM-CSF puede intensificar también la infiltración de células inmunes en los tejidos y la diferenciación 15 de las células B. Debido a la propiedad de GM-CSF arriba descrita, los científicos han utilizado en los últimos años GM-CSF en combinación con quimioterapia para el tratamiento de cánceres. Muchas vacunas tumorales constituidas por células de tumor capaces de expresar GM-CSF se encuentran actualmente en pruebas clínicas (Armitage (1998) Blood 92:4491-4508; Mach et al. (2000) Cancer Research 60:3239-3246; Gilboa (2004) Nature Reviews Cancer 4:401-411). Un adenovirus oncolítico de replicación condicional que expresa GM-CSF puede no sólo 20 destruir las células del cáncer, sino expresar también GM-CSF en células tumorales para inducir respuestas inmunes específicas de células tumorales, dando como resultado efectos de inmunoterapia del cáncer. Por consiguiente, este proceso de establecimiento de una vacuna tumoral autóloga no sólo ha eliminado el proceso complicado de preparación de una vacuna tumoral, sino que mantiene también la alta integridad de las células tumorales sin manipulación in vitro, con inclusión de la expresión de antígeno, que ha hecho más eficaz la vacuna

25 del cáncer in situ. Por consiguiente, el virus oncolítico arriba descrito puede destruir las células tumorales en el sitio en el que se suministra el virus y destruirá también al mismo tiempo las células tumorales distantes por respuestas inmunes mediadas por GM-CSF. El método de la invención descrito en esta memoria es un enfoque singular de producción de virus oncolíticos mejores.

Dos recombinantes de adenovirus oncolíticos, entre los que están conformes con la invención, contienen y expresan

30 el GM-CSF fijado a la membrana (mbGM-CSF). Estudios previos han revelado que GM-CSF fijado a la membrana puede mejorar la interacción con células dendríticas e inducir respuestas inmunes mejores que el GM-CSF secretado. (Soo Hoo et al. (1999) Journal of Immunology 169:7343-7349; Yei et al. (2002) Gene Therapy 6:1302-1311). No se ha publicado que el GM-CSF fijado a la membrana se exprese en un recombinante de adenovirus oncolítico de replicación condicional a fin de obtener un ingrediente activo recombinado genéticamente.

35 Esta invención proporciona también un método de producción de recombinantes de virus oncolíticos como se reivindica en esta memoria, que comprende los pasos siguientes:

a) construir la rama izquierda de adenovirus que contiene la secuencia promotora hTERT de SEQ ID NO: 2;

b) construir la rama derecha de adenovirus que contiene el gen inmunorregulador; y

40 c) co-transfectar los plásmidos que contienen la rama derecha y la rama izquierda del genoma adenoviral en células 293, células HeLa, células HeLa-S3 o células A549, generándose el recombinante por recombinación homóloga.

El recombinante de la invención puede obtenerse por el proceso siguiente: se produce el recombinante viral en células de mamífero por recombinación homóloga. En primer lugar, el promotor endógeno del gen E1A se deleciona

45 de pXC.1 (un plásmido que contiene el extremo izquierdo del serotipo 5 de adenovirus, adquirido de Microbix, Canadá) y se reemplaza con la señal de terminación SV40 poli(A) y el promotor hTERT mejorado por técnicas de clonación comunes, dando como resultado pKH-901ª. Entretanto, la secuencia codificante de gp19K en pBHGE3 (un plásmido que contiene la porción derecha de adenovirus, adquirido de Microbix, Canadá) se reemplaza con el gen GM-CSF, dando como resultado un plásmido denominado pKH-901b.

50 El DNA plasmídico de pKH-901ª y pKH-901b se somete a co-transfección en células HeLa, seleccionándose un clon individual de la formación de placas y designándose KH-901. Siguiendo el mismo procedimiento, se construyeron los recombinantes KH-900, KH-902, KH-903, KH-904, KG-905 y KH-906.

De hecho, los recombinantes pueden producirse en cualesquiera células de mamífero o de animal no mamífero.

Siguiendo el plan arriba reseñado, un fragmento de DNA de nucleótido se amplificó por PCR a 362 hasta 551 de

55 pXC.1 respectivamente con las endonucleasas de restricción SspI y PinAI (AgeI). El fragmento de DNA del promotor hTERT se amplificó a partir de DNA genómico humano por PCR, ligado a poli(A). Se añadieron dos endonucleasas de restricción SspI y PinAI a los dos extremos del fragmento de DNA. El fragmento de DNA se digirió con SspI y PinAI y se ligó a pXC.1 que se digirió con la misma enzima. La ligación se transformó en células de E. coli DH5-alfa (Invitrogen EE.UU.). Se seleccionaron 10 colonias, y se cultivaron en una incubadora durante 24 horas. Se extrajo el DNA y se analizó con enzimas de restricción, y el plásmido se confirmó por secuenciación y se designó pKH-901ª.

Utilizando los cebadores de 5’-ATAACCATGTGGCTGC-3’ y 5’-AAATTACTCCTGGACTGG-3’, se amplificó un fragmento de DNA que codificaba GM-CSF por PCR a partir del cDNA molde extraído de macrófagos activados. El

5 gen GM-CSF de longitud total se clonó en pUC19 y se confirmó por secuenciación. Subsiguientemente, el fragmento de cDNA del gen GM-CSF se clonó en pBHGE3 en la región codificante para gp19k, y el plásmido resultante, designado HK-901b, se secuenció y se confirmó por análisis con enzimas de restricción.

El DNA plasmídico de pKH-901ª y pKH-901b se co-transfectaron en células HeLa para recombinación homóloga. Antes de la transfección, el DNA plasmídico se linealizó por ClaI y se transfectó en células HeLa mediadas por 10 Lipofectina (USA, Invitrogen). Diez días después de la transfección, se cosecharon las células, y se realizaron tres ciclos de congelación-descongelación, tomándose 100 ml para extensión en placas sobre células HeLa. Ocho días después de la formación de las placas, las placas aisladas eran visibles bajo el agar. Se seleccionaron 6 placas, y se inocularon en células HeLa. El lisado de células se cosechó 4 a 6 días después de la inoculación. Se extrajo el DNA adenoviral a partir del lisado de células (kit de Qiagen), y se confirmó la estructura viral por digestión con enzimas de

15 restricción, PCR y análisis por transferencia Southern. El virus resultante se designó KH-901.

El recombinante vírico conforme a la invención puede utilizarse para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de cánceres y/o para prevención de cánceres. El recombinante vírico puede utilizarse en combinación con radiación y quimioterapia para conseguir mejor eficacia terapéutica.

El recombinante vírico conforme a la invención puede formularse en composiciones inyectables para administración

20 intravenosa, inyección intratumoral, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intra-orgánica, inyección intraperitoneal, etc.

Para preparación en gran escala, el recombinante vírico de la invención puede fabricarse en células HeLa, células HeLa-S3 o células A549 por cultivo de células, infección de virus, propagación, concentración, y purificación. El recombinante vírico fabricado por este proceso puede utilizarse como materia prima para formulación en

25 composiciones clínicamente inyectables, junto con portadores farmacéuticamente aceptables por tecnología convencional de formulación.

Experimentos que muestran la aplicación potencial y los efectos favorables de la presente invención se describen a continuación:

Experimento 1: Actividad del promotor hTERT y comparación de la especificidad de células tumorales entre el 30 tipo salvaje y los promotores hTERT mejorados

Para testar la especificidad de la versión mejorada del promotor hTERT, se ligaron el promotor hTERT de tipo salvaje (telo) y el promotor hTERT mejorado (Mtelo) a una Luciferasa de gen informador (luc), y los plásmidos resultantes se transfectaron a un panel de células de cáncer humanas y células humanas normales. Las células se cosecharon 48 horas después de la transfección y se utilizaron los lisados de células para determinar el nivel de 35 expresión de luciferasa. Durante la transfección, se utilizó un plásmido informador LacZ de gel informador secundario para normalizar la eficiencia de transfección entre diferentes tipos de células. El resultado presentado en Fig. 6 demostró que (1) en las células tumorales, el promotor mejorado Mtelo exhibía una actividad de luciferasa mucho mayor que lo hacía el promotor hTERT de tipo salvaje (telo). Por ejemplo, en células Hep3B (telomerasa regulada en sentido creciente y deficiente en el camino Rb), Mtelo producía una actividad de luciferasa 6 veces 40 mayor que la de telo, y en células LNCaP (telomerasa regulada en sentido creciente y deficiente en el camino Rb), Mtelo producía 0una actividad de luciferasa 18 veces mayor que la del promotor hTERT de tipo salvaje; (2) en las células humanas normales, el promotor hTERT de tipo salvaje conducía a un nivel bajo de actividad de transcripción, mientras que el promotor hTERT mejorado Mtelo tenía sustancialmente un nivel de actividad de transcripción básico. Por ejemplo, en células MRC-5 (negativas a la telomerasa y normales para el camino Rb), el promotor Mtelo exhibía

45 una actividad 6 veces menor que la del promotor hTERT telo de tipo salvaje. Este resultado indicaba que la adición de los sitios de fijación E2F tiene una selectividad para las células tumorales y capacidad de transcripción notablemente incrementadas del promotor hTERT.

Esta conclusión se confirmó ulteriormente por los tests, en los cuales la selectividad mejorada del promotor hTERT mejorado, la actividad de transcripción del promotor se determinó en las células infectadas con recombinantes por 50 medida del número de copias del mensaje E1A. Se incluyeron en el estudio cuatro virus: adenovirus de tipo salvaje como control positivo, adenovirus deficiente en replicación d1312 (delecionado de E1A) como control negativo, KH900 (con el promotor hTERT de tipo salvaje) y KH-901 (con el promotor hTERT mejorado). Se utilizaron para los tests queratinocitos de prepucio humano (hFKs) y kFKs-E6, las células hFK transformadas con el gen E6 del virus del papiloma humano tipo 16 (HPV-16). Se había demostrado previamente que hFKs-E6 tenían actividad de 55 telomerasa regulada en sentido creciente (Horikawa et al. (2001) Journal of Virology 75 (9): 4467-4472). Las células se infectaron con los virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 unidad formadora de placa (pfu) por célula y se determinó el número de RNA de mensaje E1A por PCR de transcripción inversa (RT-PCR). El resultado presentado en Fig. 7 demostró que no se detectaba cantidad alguna de mRNA de mensaje E1A en las células hFKs infectadas con d1312 y hFKs-E6; se detectaron aproximadamente 4000 copias de RNA de mensaje E1A en células infectadas con Ad5 y no había diferencia significativa alguna en las copias de mRNA entre las células hKFs y las células hFKs-E6. En cambio, en las células infectadas con KH-900, se detectó un pequeño número de copias de mRNA E1A en las células hGKs, mientras que se detectaron 20 veces más copias de mRNA E1A en las células 5 hFKs-E6. Y lo que es más interesante, se detectó una cantidad más de 100 veces mayor de mRNA E1A en las células hKFs-E6 infectadas con KH-901 que en las células hFKs. Entretanto, el número de copias de mRNA E1A era aún menor en las células hFKs infectadas con KH-901 que en las células hFKs infectadas con KH-900. Considerado en su conjunto, se demuestra que el promotor Mtelo, cuando está enlazado con un gen informador, tiene un nivel mayor de actividad y selectividad para las células tumorales que la del promotor telo; al mismo tiempo, la

10 selectividad tumoral mejorada es real cuando el promotor se inserta en el genoma del adenovirus. El promotor Mtelo tiene mejor especificidad tumoral que el promotor de tipo salvaje cuando aquél se utiliza para controlar los genes virales esenciales.

Este resultado se confirmó adicionalmente en células de médula ósea humana cultivadas. En un ensayo de viabilidad celular, se utilizaron KH-900 y KH-901 para infectar células 293 y células madre mesenquimáticas de

15 médula ósea humana (hBMsc) a MOI de 1. El resultado presentado en Fig. 8 demostró que KH-901 destruía las células 293 tan eficientemente como KH-900; sin embargo, KH-900 tenía cierto nivel de destrucción celular en células hBMsc, mientras que KH-901 no tenía actividad de destrucción alguna.

Experimento 2: Comparación de la Capacidad de Destrucción de Células Tumorales de Cuatro Recombinantes de Adenovirus Oncolíticos que se Replicaban Condicionalmente

20 Se utilizó la línea de células de cáncer de pulmón A549 para comparar la capacidad de destrucción de cuatro adenovirus oncolíticos que se replicaban condicionalmente. Se sembraron las células en cápsulas de 6-cem y se aplicaron los virus a una MOI de 1 cuando las células se dejaron crecer hasta 85% en confluencia. Se determinó la viabilidad celular en diversos momentos después de la infección (Hallenbeck et al. (1997) Human Gene Therapy 11:1172-1179). El resultado presentado en Fig. 9 demostró que KH-904 destruía las células más eficientemente que

25 KH-901 y KH-902, mientras que KH-900 era el más débil.

Este resultado indicaba que el promotor hTERT mejorado tiene actividad más fuerte que el promotor hTERT de tipo salvaje. Indicaba también que el reemplazamiento del botón en el gen de fibra del serotipo 35 puede tener mejor inefectividad que el serotipo 5. Esta conclusión se confirmó en un panel de células de cáncer y células humanas normales (Tabla 1). Un panel de células humanas tumorales y normales se infectó con variantes diferentes de 30 adenovirus durante 72 horas y se midió la viabilidad celular como se ha descrito arriba. Se calculó la EC50 para la cantidad de virus requerida para destruir el 50% de las células. Cuanto menor es la EC50, tanto más eficiente es un virus para destruir las células. El resultado presentado en la Tabla 1 indicaba que (1) KH-901 destruía las células tumorales más eficientemente que KH-900, lo que confirmaba adicionalmente que el promotor hTERT mejorado tiene mejor especificidad tumoral; (2) KH-902 y KH-903 destruían las células análogamente a KH-901, mientras que

35 KH-904 era el más fuerte. En contraste, el promotor Mtelo mejorado que contenía los virus (KH-901, KH-902, KH903 y KH-904) destruía menos células normales comparado con KH-900, teniendo el virus el promotor hTERT de tipo salvaje. Para KH-906, en el cual el gen viral E1B estaba enlazado a E1A por el IRES, tenía una especificidad satisfactoria para las células tumorales, aunque la capacidad de destrucción era relativamente menor.

Tabla 1. Expresión de GM-CSF en células infectadas con KH-901

Célula

Unidad infectada con KH-901/célula ELISA (ng/106 células/24horas) Bioensayo (ng/106 células/24horas)

LNCaP

10 231±21 195±34

LNCaP

1 30±9 15±4

Hep3B

10 422±13 355±44

Hep3B

1 94±6 85±12

SW680

10 527±19 325±44

SW680

1 214±4 135±21

A549

10 748±17 625±94

A549

1 83±2 55±24

HeLa

10 120±11 105±56

HeLa

1 9±1 2±0,3

hFKs

10 5±0,25 3,5±0,4

Célula

Unidad infectada con ELISA (ng/106 Bioensayo (ng/106

KH-901/célula

células/24horas) células/24horas)

hFKs

1 indetectable indetectable

Tabla 2. EC50 de KH-900, KH-901, KH-902, KH-903, KH-904, y KH-906

Célula

KH-900 KH-901 KH-902 KH-903 KH-904 KH-906

LoVo

1,25 0,92 0,85 0,97 0,35 1,01

A549

0,58 0,19 0,28 0,49 0,08 0,39

LNCaP

2,31 0,22 0,36 0,15 0,01 1,75

Hep3B

4,03 0,31 0,53 0,71 0,03 1,71

HeLa

3,85 0,62 0,55 0,73 0,25 0,89

SW 620

2,04 0,20 0,34 0,23 0,04 2,53

CA-33

3,40 1,15 1,17 0,75 0,20 3,15

HepG2

0,91 0,37 0,41 0,97 0,21 1,17

SCC4

9,21 2,10 3,28 2,30 0,61 8,10

HUVEC

27,9 99,3 130,4 83,5 70,6 268,3

BJ

60,8 295,4 260,5 75,4 1801,8 435,4

RPE

35,4 231,7 295 431,7 295,3 531,7

W I38

46,5 92,33 79,5 82,33 69,2 192,33

MRC5

51,54 121,20 135,84 91,20 61,74 266,23

Es sumamente interesante que, para la célula humana normal, los recombinantes virales que se han modificado por

5 ingeniería genética para incluir el promotor Mtelo genéticamente mejorado, que incluyen KH-901, KH-902, KH-903, KH-904, muestran todos ellos una capacidad de destrucción mucho más débil (indicada por una EC50 mayor) que KH-900, que se ha modificado genéticamente para incluir el promotor hTERT de tipo salvaje.

Adicionalmente, los recombinantes de adenovirus KH-906, en los cuales se había insertado un sitio de entrada de ribosoma interno entre los genes E1A y E1B, y por consiguiente la transcripción de los genes E1A y E1B se

10 encuentra bajo el control del promotor Mtelo mejorado, han demostrado una mayor selectividad para las células tumorales que los otros recombinantes virales, aunque su capacidad de destrucción frente a las células tumorales era algo más débil que la de los otros.

Experimento 3: KH-901 produce un alto nivel de GM-CSF biológicamente activo en células tumorales

Se infectaron 5 líneas de células tumorales y una línea de células humanas normales con KH-901 a una MOI de 1 ó

15 10. 48 horas después de la infección, se cosecharon las células para determinación de la concentración de GM-CSF por ELISA y el ensayo TF-1 como se ha descrito previamente (Li et al. (2001) Cancer Research 61: 6428-6436). El resultado presentado en Fig. 14 demostraba que 5 células tumorales infectadas con KH-901 producían un nivel elevado de GM-CSF. Por ejemplo, en células LNCaP infectadas con KH-901, la cantidad de MG-CSF detectada en las células era 231 ng/106 células/24 horas. En contraste, había un nivel muy bajo de GM-CSF detectable en las

20 células humanas normales infectadas con KH-901. El bioensayo reveló adicionalmente que el GM-CSF expresado en las células tumorales era biológicamente activo (véase por favor la Tabla 2).

Experimento 4: Eficacia anti-tumoral de los recombinantes de adenovirus oncolítico en modelos de tumor

Se evaluó la eficacia antitumoral de adenovirus oncolíticos en el modelo de tumor LNCaP de cáncer de próstata del ratón lampiño. Se inocularon 6 millones de células LNCaP subcutáneamente en ratones lampiños y se inyectaron los

25 virus 3 veces por vía intratumoral los días 1, 5 y 9 a una dosis de 3 x 1010 partículas de diversos virus (KH-901, KH904 y add11520, un adenovirus oncolítico delecionado en E1B-p55) cuando el volumen del tumor alcanzó 200 mm3 en el transcurso de 4 semanas. El volumen del tumor se midió dos veces por semana y el resultado se presenta en Fig. 10.

En este test, se utilizaron tres recombinantes, a saber, KH-901, KH-904 y KH-907 (no representado, el mismo que KH-901 pero sin el gen GM-CSF), para inyección del tumor; se testó también Add 1520 como control.

Como puede verse por Fig. 10, el tumor crecía muy rápidamente para el tratamiento con placebo, alcanzando el volumen del tumor en 48 días 1200% de la línea base. En el grupo tratado con KH-901, el tumor se mantiene igual

5 que la línea base, mientras que los tumores tratados con KH-904 se reducían en volumen hasta el 15% de la línea base. Durante el mismo periodo de tiempo, los tumores tratados con add 11520 habían crecido hasta el 850% de la línea base.

Este resultado indicaba que KH-901 y KH-904 tenían mejor actividad antitumoral que Add 11520 (Onyx-015). Es interesante, como se demostró en el estudio in vitro, que KH-904 tenía mejor eficacia anti-tumor que KH-901.

10 En el mismo estudio, se documentó también la expresión de GM-CSF. No se detectó cantidad alguna de GM-CSF en los animales tratados con KH-907 y add 11520, mientras que era detectable un nivel elevado de GM-CSF en los animales tratados con KH-901 o KH-904. Por ejemplo, el día 14, la cantidad de GM-CSF detectada en los animales tratados con KH-901 o KH-904 era 2322 g/ml o 2776 g/ml, respectivamente. Este resultado sugería que el virus oncolítico KH-901 y afines producían GM-CSF no sólo en células tumorales, sino también una alta expresión in vivo

15 en los animales portadores de tumor.

Los resultados de estos estudios muestran la replicación de KH-901 y afines en una diversidad de células tumorales que se detectan niveles elevados de expresión de GM-CSF después de la infección.

Los otros adenovirus oncolíticos arriba descritos se caracterizaron también siguiendo un procedimiento similar, y se describirán con mayor detalle en los ejemplos respectivos.

20 Los adenovirus oncolíticos recombinantes replicantes descritos en esta memoria tienen las características siguientes:

1. Características estructurales

Estos recombinantes son virus vivos, y pueden replicarse y propagarse en células tumorales. Los mismos son diferentes de los medicamentos sintetizados y modificados por ingeniería genética. Son capaces de replicarse en

25 células tumorales, expresan genes extraños y tienen actividad biológica y actividad antitumoral elevadas. Estos recombinantes tienen genes inmunoestimuladores, por lo que el gen inmunoestimulador puede expresarse en las células infectadas por el virus e inducir respuestas inmunes específicas de las células tumorales. Los mismos son seguros debido a la presencia de un elemento regulador específico del tumor.

2. Posibles Aplicaciones

30 Los elementos reguladores específicos de tumor en los virus recombinantes son activos en más del 90% de las células tumorales, es decir, en la mayoría de las células tumorales, el gen crítico de estos virus recombinantes se encuentran bajo el control del promotor específico del tumor, por lo que estos virus recombinantes pueden replicarse en la mayoría de las células tumorales y destruirlas. Así, estos virus recombinantes tienen diversas aplicaciones potenciales, que incluyen el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de

35 próstata, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, y cáncer de hígado, etc.

Dado que estos virus recombinantes tienen el gen inmunoestimulador como se ha descrito arriba, los virus no sólo tendrán efectos oncolíticos por destrucción de las células tumorales, sino que estimularán también las respuestas inmunes específicas del tumor después de la expresión de la citoquina en las células tumorales. Así, estos virus no sólo serán eficaces para tumores locales, sino que serán eficaces también para células tumorales distantes.

40 Los virus recombinantes descritos en esta memoria tienen las características siguientes: 1) son más específicos para las células tumorales, mientras que no son infecciosos para las células somáticas normales, y las células madre; por tanto, estos virus pueden tener menos efectos secundarios en aplicación clínica; 2) expresan el gen inmunoestimulador, con inclusión de las formas secretadas y fijadas a la membrana. Esta citoquina estimulará respuestas inmunes específicas del tumor, por lo que los mismos pueden ser eficaces también para tumores

45 distantes; 3) por la modificación a la cápsida viral, estos adenovirus tienen mejor inefectividad celular, por lo que pueden tener mejor actividad antitumoral.

Esta invención aporta la contribución siguiente:

1) Por modificación mediante mutagénesis direccionada, el promotor hTERT del elemento regulador específico del tumor tiene mayor actividad de transcripción y especificidad tumoral, el promotor resultante tiene mejor capacidad de

50 direccionamiento, tiene una actividad de transcripción significativamente reducida del gen enlazado en las células somáticas normales, especialmente en las células sexuales, los progenitores y las células madre. Los adenovirus oncolíticos, cuyo gen crítico se encuentra bajo el control del promotor hTERT mejorado, no pueden replicarse en las células de la médula ósea, pero es sumamente potente en muchas células tumorales.

2) El GM-CSF inmunoestimulador se ha modificado por ingeniería genética en los adenovirus recombinantes, de tal modo que GM-CSF se expresará únicamente en las células infectadas por el virus. Un virus de este tipo puede destruir las células tumorales por efectos oncolíticos después de inyección intratumoral, entretanto, después de la lisis oncolítica, las células infectadas por el virus expresan GM-CSF, que estimula respuestas inmunes fuertes contra las células tumorales. Particularmente, GM-CSF que expresa un adenovirus oncolítico tendrá también efecto de prevención debido a que el virus instruirá el sistema inmune del paciente por la combinación de efecto oncolítico (destrucción de las células y presentación de antígeno) y respuesta inmune por instrucción de las células inmunes del paciente. Por tanto, un virus de este tipo puede ser capaz de prevenir la recurrencia de tumores en el paciente.

3) Por la modificación de la cápsida, el adenovirus oncolítico recombinante resultante tiene mejor infectividad tumoral. Debido a la expresión nula o baja del receptor de adenovirus CAR del serotipo 5 de adenovirus, es muy frecuente que el Ad5 no pudiera infectar satisfactoriamente la célula tumoral. En cambio, cuando el genoma de Ad5 se incorpora con el sitio de fijación y la secuencia para el receptor del serotipo 35 de adenovirus, la infectividad para la mayoría de las células tumorales puede incrementarse notablemente. Estudios in vitro e in vivo han confirmado esta observación.

Descripción de las secuencias en el Listado de Secuencias

SEQ ID NO: 1 es un fragmento de pb que contiene secuencias del promotor TERT humano, que tiene varios sitios de fijación de factores de transcripción que incluyen SP-1 (cajas GC), Cajas E (el sitio de fijación para Myc), NF-1 (el sitio para fijación del factor NF).

SEQ ID NO: 2 es un promotor TERT humano mejorado por mutagénesis, que tiene una mayor selectividad y actividad de transcripción para las células tumorales; E2F-1: sitio de fijación del factor de transcripción E2F.

SEQ ID NO: 3 es una secuencia para la longitud total de KH-901, en la cual

1) 1-103: ITR del lado izquierdo de adenovirus {secuencia del serotipo 5 de adenovirus, representada en GenBank NO. BK000408};

2) 194-358: secuencia de empaquetamiento de adenovirus y la secuencia intensificadora para E1;

3) 362-534: secuencia señal de SV40 poli(A) y enlazador (la secuencia del serotipo 5 de adenovirus de la que se han delecionado los nucleótidos 362 a 551);

4) 525-811: las secuencias del promotor hTERT mejorado y el enlazador;

5) 812 a la derecha: secuencia de adenovirus que incluye E1A, E1B, E2, etc.;

6) 28995-29436: gen GM-CSF inmunoestimulador humano;

7) 29437 a la derecha: secuencia de adenovirus que incluye el gen E4 y el extremo de la derecha;

SEQ ID NO: 4 es un elemento inmunorregulador GM-CSF en forma fijada a la membrana (mbGM-CSF), contenido en el genoma del recombinante.

SEQ ID NO: 5 es una secuencia de proteína de fibra quimérica en el genoma del recombinante KH-904, en la cual el botón de fibra del gen de fibra es el serotipo 35 de adenovirus humano.

Breve Descripción de los Dibujos

Fig. 1 representa la secuencia del promotor de transcriptasa inversa de la telomerasa humana y sitios de fijación para factores de transcripción. SP-1 (cajas GC): sitios de fijación de SP1, cajas E: sitio de fijación Myc, NF-1: sitio de fijación NF.

Fig. 2 representa el promotor TERT humano mejorado por mutagénesis, que tiene una mayor selectividad para las células tumorales y actividad de transcripción inversa; E2F-1: sitio de fijación del factor de transcripción E2F.

Fig. 3-1 y Fig. 3-2: representan las estructuras de los recombinantes conforme a la invención.

Fig. 4-1, Fig. 4-2 y Fig. 4-3: representa el proceso de generación de la variante de adenovirus recombinante KH

901.

Fig. 5 muestra los detalles de construcción del recombinante KH-901.

Fig. 6 muestra la actividad promotora para el promotor hTERT de tipo salvaje (telo) y los promotores mhTERT mejorados (Mtelo).

Fig. 7 muestra la expresión de RNA del mensaje E1A del adenovirus recombinante en células hFK y hKFs-E6, que es capaz de transformar el gen HPV E6.

Fig. 8 muestra la actividad citolítica de adenovirus recombinantes para las células madre mesenquimáticas normales de la médula ósea humana.

Fig. 9 muestra la actividad citolítica de adenovirus recombinantes en células A549 (% de viabilidad celular).

Fig. 10 muestra la eficacia anti-tumoral en el modelo de xenoinjerto LNCaP de cáncer de próstata después de 5 inyección intratumoral de adenovirus recombinantes.

Realizaciones Específicas

Se proporcionan los ejemplos siguientes que sirven para describir adicionalmente los detalles de la invención, lo cual no representará limitación alguna de esta invención.

Ejemplo 1:

10 1. Construcción del recombinante KH-901 de adenovirus oncolítico replicante y su análisis (Figura 4 y Figura 5).

2. Conforme a la secuencia del promotor hTERT representada en Figura 1, se sintetizaron los dos cebadores siguientes:

A. 5’-GTC TGG ATC CGC TAG CCC CAC G-3’

B. 5’-CGA CCG GTG ATA TCG TTT AAT TCG C-3’

15 Para la amplificación del promotor hTERT por el método PCR, en el que se utilizó como molde RNA humano activado. Las condiciones para la reacción PCR eran como sigue: para el primer ciclo, desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, reasociación a 81ºC durante 1 minuto y 72ºC para extensión durante 2 minutos. Para cada uno de los ciclos sucesivos, desnaturalización a 93ºC durante 1 minuto, seguido por sometimiento a análisis en gel de agar y recuperación del fragmento promotor hTERT. Se indicó por secuenciación que el fragmento promotor

20 obtenido es el mismo que el descrito (Fig. 1). Este fragmento de DNA se clonó luego en el vector pUC19, y se modificó el mismo a la secuencia que se muestra en Fig. 2 por mutagénesis con ayuda de un kit de Stratagene (Stratagene, CA).

3. La secuencia señal poli(A) se amplificó por PCR con los cebadores siguientes:

A. 5’-TAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGGATCTCTGC-3’

25 B. 5’-GGATCCAGACATGATAAGATACATTGAGAG-3’ en donde se utilizó Pcmv/CERO (Invitrogen, EE.UU.) como molde, y las condiciones para la reasociación durante la reacción PCR eran las mismas que anteriormente. El fragmento PCR se purificó y confirmó por secuenciación.

4. El fragmento promotor hTERT purificado y el fragmento de DNA poli(A) se desnaturalizaron juntos a 95ºC durante 5 minutos y se enfriaron a la temperatura ambiente como molde. Un fragmento de DNA que tenía aproximadamente

30 500 pares de bases se amplificó con los cebadores A y D, y el fragmento PCR purificado y secuenciado se digirió con SspI y AgeI, y el fragmento ulteriormente purificado que contenía la secuencia señal poli(A) y el promotor hTERT se utilizó para el proceso de clonación subsiguiente.

5. Se utilizó pXC.1 (adquirido de Microbyx, Canadá) como molde y se añadieron dos sitios de enzima en el nucleótido 339 (SspI) y 551 (PinAI) por mutagénesis. El pXC.1 mutado se digirió con SspI y PinAI y se purificó, con 35 el fragmento grande como vector. El fragmento poli(A)/hTERT tal como se insertó se ligó con el vector pXC.1, y se transformó en E. coli DH5 por técnicas comunes de clonación después de 20 horas. Después de una incubación a 4ºC durante 30 minutos, choque térmico a 42ºC durante 30 segundos, e incubación ulterior a 4ºC durante 2 minutos, se cultivó luego el mismo a 37ºC durante 45 minutos con 1 ml de solución de cultivo LB. Se desplazó luego a una placa de cultivo de agar que contenía ampicilina para cultivo durante 24 horas; se seleccionaron las bacterias

40 individuales utilizando palillos de dientes esterilizados y se desplazaron a un frasco de cultivo limpio que contiene 1 ml de LB durante 24 horas. El DNA plasmídico se purificó a partir de E. coli cultivado y confirmó la estructura por digestión enzimática, designándose pKH-901ª. Este proceso contiene la ITR del lado izquierdo, la señal de empaquetamiento, la secuencia poli(A), el promotor hTERT (Mtelo), E1A, y E1B parcial.

6. Construcción del extremo derecho del adenovirus

45 Vector pGEM-7 (disponible de la sociedad Promega). Se utilizaron luego los dos pares de cebadores para amplificar dos fragmentos de DNA:

C. 5’-AACCAAGGCGAACCTT-3’

D. 5’-CCACATGGTTATCTTGG-3’

E. 5’-CCAGTCCAGGAGTAATTTAC-3’

50 F. 5’-TGCGCTTTAGGCAGCAGATG-3’ Para clonar el gen GM-CSF, se utilizaron los cebadores siguientes:

M. 5’-CCACCCAAGATAACCATGTGGCTGC-3’

N. 5’-AACTTAGTAAATTACTCCTGGACTGG-3’. Una gran cantidad de fragmento de cDNA del GM-CSF se amplificó a partir del molde de cDNA preparado partiendo de los macrófagos activados por PCR con una condición de amplificación similar a la arriba descrita. La secuencia del cDNA se confirmó por secuenciación subsiguiente a purificación, el fragmento de cDNA se mezcló con dos

5 fragmentos de DNA amplificados a partir de pBHGE3 como molde para amplificación ulterior por PCR con los cebadores E y H a fin de producir un gran fragmento de DNA. La secuencia de este fragmento de DNA resultante se confirmó por secuenciación, y el fragmento de DNA se clonó en el vector pGEM-7 después de digestión con BsiWI y NotI, se ligó subsiguientemente a pBHGE3, dando como resultado un plásmido pKH-901b. Este plásmido del extremo izquierdo contiene la mayor parte del gen E1B, el gen E2 entero, los genes E3 enteros, el gen GM-CSF y el gen E4.

7. Construcción del adenovirus recombinante KH-901

Se linealizaron DNAs plasmídicos pKH-901ª y pKH-901b con las endonucleasas de restricción NdeI y ClaI, y se cotransfectaron en células HeLa (con transfectina de Invitrogen) después de purificación del DNA plasmídico. Las células se cosecharon después de incubación a 37ºC durante 10 días. Se tomaron 100 μl de sobrenadante para

15 ensayo en placa después de 3 ciclos de congelación/descongelación. Se observaron las placas individuales bajo agar de punto de fusión bajo 8 a 12 días después de la adición del sobrenadante. Se seleccionaron 10 μl de líquido bajo el agar por 10 μl de auto-pipeteman y se añadieron a las células HeLa previamente sembradas. Se observó el lisado de células y se recogió 4 a 8 días después de la inoculación. Se utilizaron 200 μl del lisado de células para extracción del DNA. La estructura viral se confirmó por PCR y transferencia Southern. Las placas individuales se purificaron ulteriormente en células HeLa y se cultivaron en células HeLa para stock de virus. El stock de virus se guardó a -80ºC en un congelador. Se tomó una parte alícuota de stock de virus para confirmación de la secuenciación, y el virus se designó KH-901.

El método para producción en gran escala de KH-901 se describirá por separado; sin embargo, se indica aquí abreviadamente. Se cultivaron células HeLa-S3 (las células HeLa se adaptaron para ser capaces de crecer en

25 medio exento de suero) en un biorreactor de 3 litros, cuando el número de células alcanza 3 millones por litro, se infectaron las células con KH-901, y se continuó el cultivo durante 2-3 días. Se cosecharon luego las células y se purificó el virus por purificación en gradiente de CsCl2 o columna de intercambio iónico. El producto purificado se guardó en tampón apropiado tal como PBS y glicerol.

Ejemplo 2 (ejemplo comparativo)

Se construyó KH-900 siguiendo una rutina similar a la empleada para KH-901, excepto que no estaba contenida cantidad alguna de poli(A) en el plásmido pKH-901ª ni cantidad alguna de mutante en el fragmento promotor hTERT; la secuencia es la misma que la de SEQ. ID NO: 1. El plásmido resultante se designa pKH-900ª; se co-transfectó pKH-900ª con pKH-901b en células HeLa para generar KH-900.

Ejemplo 3

35 Para la construcción de KH-902, el cDNA de GM-CSF en pKH-901b con la versión fijada a la membrana como se muestra por SEQ. ID NO: 4, dando como resultado pKH-902b. Se co-transfectaron pKH-901ª y pKH-902b en células HeLa para generar KH-902.

Ejemplo 4

Para producción de KH-903, se delecionaron las regiones codificantes para 10,4 k, 14,5 k y 14,7 k en pKH-901b por método convencional de ingeniería genética, dando como resultado un plásmido denominado KH-903b. Se cotransfectaron pKH-901ª y pKH-903b en células HeLa para generar KH-903.

Ejemplo 5

Para producción de KH-904, el botón del gen de fibra, es decir el serotipo 5 de adenovirus se reemplazó con el botón del serotipo 35 de adenovirus, como se muestra en SEQ. ID NO: 5, dando como resultado un plásmido

45 designado pKH-904b.

Ejemplo 6

Para producción de KH-905, el cDNA del gen GM-CSF en pKH-904b se reemplazó con la versión fijada a la membrana, como se muestra en SEQ. ID NO: 4, dando como resultado un plásmido designado pKH-905b. Se cotransfectaron pKH-901ª y pKH-905b en células HeLa para generar KH-905. La estructura viral se confirmó por PCR y secuenciación.

Ejemplo 7

Para generar KH-906, el promotor endógeno para E1B se reemplazó con la señal de entrada de ribosoma interno, dando como resultado un plásmido designado pKH-906ª. Se co-transfectaron pKH-906ª y pKH-901b en células HeLa para generar KH-906 (Li et al. (2001) Cancer Research 62: 2667-2674). La estructura viral se confirmó por PCR y secuenciación.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. 5

<120> Construcción de recombinante de adenovirus oncolítico que expresa específicamente el factor inmunomodulador GM-CSF en células tumorales y usos del mismo

<130> 489.48.93546 10

<140> 04797352.4

<141>

<150> CN20041046237 15 <151>

<160> 5

<170> PatentIn versión 3.3 20

<210> 1

<211> 252

<212> DNA

<213> Homo sapiens 25

<400> 1

30 <210> 2

<211> 253

<212> DNA

<213> Artificial

35 <220>

<223> Promotor

<400> 2

40

<210> 3

<211> 36152

<212> DNA

<213> Artificial

45

<220>

<223> Recombinante

<400> 3

<210> 4

<211> 582 5 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Recombinante 10

<400> 4

15 <210> 5

<211> 1772

<212> DNA

<213> Artificial

20 <220>

<223> Recombinante

<400> 5

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un recombinante de adenovirus oncolítico, en donde dicho recombinante comprende un virus esencial, un elemento regulador específico de células tumorales en donde el elemento regulador específico de células tumorales es el promotor hTERT selectivo de células tumorales de SEQ. ID NO: 2 y un gen inmunorregulador seleccionado de

   5 los genes IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF, INF-alfa e INF-beta, siendo dicho virus esencial un adenovirus o una variante de adenovirus genéticamente mejorada seleccionada de:

   i) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES);

   ii) un adenovirus en el cual su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus se ha reemplazado por el 10 botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus;

   iii) un adenovirus en el cual un elemento terminal de la transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT;

   iv) un adenovirus en el cual la secuencia codificante para 10,4 K, 14,5 K y 14,7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada; y

   15 v) un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y un elemento terminal de la transcripción se ha insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.
2. 2. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el adenovirus se selecciona de los serotipos de adenovirus: 20 Ad2, Ad5, Ad35 y Ad41.

3. 3.

   El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES).

4. 4.

   El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus.

   25 5. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual un elemento terminal de la transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.

5. 6. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual la secuencia codificante para 10,4 K, 14,5 K y 14,7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada.

   30 7. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus en el cual sus genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y se ha insertado un elemento terminal de la transcripción aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT.

6. 8. El recombinante de la reivindicación 5, en donde dicho elemento terminal de la transcripción es la secuencia 35 señal temprana poli(A) de SV40.
7. 9. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual un elemento terminal de la transcripción se ha insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT, la secuencia codificante para 10,4 K, 14,5 K y 14,7 K en la región E3 del adenovirus ha sido delecionada y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

   40 10. El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

8. 11.

   El recombinante de la reivindicación 1, en donde el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF humano.

9. 12.

   El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicho GM-CSF se encuentra en forma fijada a la membrana.

   45 13. El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual los genes E1A y E1B están enlazados por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), y su botón de fibra del serotipo 5 de adenovirus ha sido reemplazado por el botón de fibra del serotipo 35 de adenovirus, y un elemento terminal de transcripción está insertado aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

10. 14.

    El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual se ha insertado un elemento terminal de la transcripción aguas abajo de la ITR y el sitio de empaquetamiento y aguas arriba del promotor hTERT y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.

11. 15.

    El recombinante de la reivindicación 1, en donde el virus esencial es un adenovirus mejorado, en el cual se

    5 ha reemplazado el botón de fibra del serotipo 5 por el botón de fibra del serotipo 35, el elemento regulador específico de las células tumorales es el promotor hTERT y el gen inmunorregulador es el gen GM-CSF.
12. 16. El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el gen inmunorregulador es GM-CSF en su forma fijada a la membrana.
13. 17. Un promotor, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 2. 10 18. Una composición farmacéutica, que comprende el recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
14. 16.

15. 19.

    La composición farmacéutica de la reivindicación 18, formulada para aplicación por inyección.

16. 20.

    La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en donde la composición es para aplicación junto con quimioterapia y radioterapia.

    15 21. El uso del recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la fabricación de un medicamento para prevención y/o tratamiento de tumores.

17. 22.

    El recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para prevención y/o tratamiento de tumores.

18. 23.

    Un método de preparación del recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende los pasos siguientes:

    20 a) generar la rama izquierda de adenovirus que contiene la secuencia promotora hTERT de SEQ ID NO: 2;

    b) generar la rama derecha de adenovirus que contiene el gen inmunorregulador; y

    c) co-transfectar el DNA plasmídico de la rama derecha y la rama izquierda en células 293, HeLa, HeLa-S3 o A549, y generar el recombinante por recombinación homóloga.

    38 39 40 41 42 43