JP2009525036A

JP2009525036A - 癌の処置のための腫瘍崩壊性アデノウイルス

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Publication number: JP2009525036A
Application number: JP2008552833A
Authority: JP
Inventors: ボナストレ，ラモンアレマニー; ピケラス，マネルマリアカスカリョ; エクスポシト，ファンホセロハス
Original assignee: ディーエヌエートリックスインコーポレイテッド
Priority date: 2006-02-01
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2027-01-31
Also published as: WO2007088229A1; CN101484583A; EP1990418B1; EP1990418A1; US20160354420A1; US10016470B2; US20190183946A1; ES2304281A1; CA2640528C; US20150071881A1; US20090311219A1; CA2640528A1; ES2304281B1; AU2007211434A1; JP5075839B2; EP1990418A4

Abstract

本発明は、アデノウイルス遺伝子に選択的発現を付与するプロモーターとは孤立したヒトＤＮＡ配列を含む、癌を治療するための腫瘍崩壊アデノウイルスに関する。このアデノウイルスは、腫瘍選択性を付与するプロモーターによって調節されるアデノウイルス遺伝子のタンパク質の翻訳を最適化する配列もまた含み得る。本発明は、癌の治療において使用するために適している。有効量のこの腫瘍崩壊アデノウイルス、及び１種以上の担体又は薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物もまた提供される。

Description

（発明の分野）
本発明の分野は、一般的に腫瘍生物学の分野に関する。特に、本発明は、腫瘍崩壊アデノウイルスとして知られている、腫瘍における選択的複製アデノウイルス、及び癌抑制のためのそれらの使用に関する。

（発明の背景）
現在、癌の治療は、主に化学療法、放射線療法、及び手術による。初期の癌の高い治癒率にも関わらず、外科的に除去することができず、正常細胞に対する毒性のために放射線療法又は化学療法の投与量に限界があるので、大多数の癌の進行したケースは不治である。このような事態を改善するため、癌治療の効力及び選択性を追求する生物工学的戦略が展開されてきた。これらのうち、ウイルスを用いる遺伝子治療及びウイルス療法は癌治療を目的としている。遺伝子療法において、ウイルスを改善してその複製を阻止し、治療的遺伝物質の媒体又はベクターとして機能させる。一方、ウイルス療法は、腫瘍細胞において複製され、選択的に増殖するウイルスを用いる（非特許文献１）。ウイルス療法において、腫瘍細胞は、治療遺伝子の効果よりもむしろウイルスの内部の複写で更に引き起こされた細胞変性効果の結果、死滅する。腫瘍細胞における優先的な複製はオンコトロピズムと呼ばれ、腫瘍の溶解は腫瘍崩壊と呼ばれる。腫瘍において選択的に複製されるウイルスは腫瘍崩壊ウイルスと呼ばれる。

癌ウイルス療法は、遺伝子療法よりも有意に以前から存在する。ウイルスを用いた腫瘍治癒は、前世紀の初期に初めて見られる。１９１２年には既に、ＤｅＰａｃｅは、子宮頸癌における狂犬病ウイルスの植菌後の腫瘍の退行を観察している（非特許文献２）。それ以来、腫瘍を治療するために、多くのタイプのウイルスが腫瘍に注射されてきた（非特許文献３）。自然のオンコトロピズムを表わすウイルス、例えば、自律性パルボウイルス（非特許文献４）、水疱性口内炎ウイルス（非特許文献５）、及びレオウイルス（非特許文献６）が存在する。他のウイルスは、腫瘍において選択的複製のために遺伝的に操作することができる。例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、リボヌクレオチドレダクターゼ、腫瘍細胞等の増殖中の細胞における可欠酵素活性の遺伝子の選択において腫瘍親和性である（非特許文献７）。しかし、アデノウイルスは、その低い病原性、及び腫瘍細胞を感染させる高い能力を考慮し、癌のウイルス療法及び遺伝子療法の両方において最も多く用いられているウイルスである。

ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）は、３６キロダルトンの直鎖ＤＮＡを含む正二十面体のタンパク質キャプシドにより形成されるウイルスである（非特許文献８）。成人及び子供において、Ａｄ５による感染は、通常、無症候性であり、風邪及び結膜炎を引き起こす。一般に、Ａｄ５は、自然感染の間、気管支上皮細胞である上皮細胞に感染する。それは、線維、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる細胞内接着において必要な細胞タンパク質を有するキャプシドの１２個の頂点からアンテナのように伸びるウイルスタンパク質の相互作用を用いて細胞に入る。ウイルスＤＮＡは核の内部に達する時、ウイルス初期遺伝子の秩序だった転写が開始する。発現するウイルス初期遺伝子は、初期１Ａ（Ｅ１Ａ）領域の遺伝子に相当する。Ｅ１Ａは、Ｅ２Ｆ転写因子と複合体を形成するＲｂ細胞タンパク質と結合する。従って、Ｅ２Ｆは、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４及び細胞周期を活性化する細胞遺伝子等の他のウイルス遺伝子の転写を活性化するために遊離される。また、Ｅ１Ｂは、細胞周期を活性化し、感染細胞のアポトーシスを阻止するためにｐ５３に結合する。Ｅ２は、抗ウイルス免疫応答を抑制するＥ３、及びウイルスＲＮＡを輸送するＥ４のウイルスタンパク質の複製を体系化する。これらの初期遺伝子は、ウイルスＤＮＡの複製をもたらし、いったん複製されると、プロモーターを活性化しキャプシドを形成する後期又は構造遺伝子の発現を制御する。

腫瘍崩壊アデノウイルスを構築するために、腫瘍細胞において必要でないウイルス機能を選択し、腫瘍選択的プロモーターを有するウイルスプロモーターを置換する方法が用いられた（非特許文献１）。両方の戦略において、選択されたか、又は標準的な遺伝子は好ましくはＥ１領域に属する遺伝子は、特に、他のウイルス遺伝子の発現を制御するため、Ｅ１ａに作用する。ウイルス機能選択において、例えばタンパク質Ｅ１ｂ−５５Ｋは除かれる。このタンパク質は、感染細胞の細胞周期のＳ期への侵入を誘導し、細胞アポトーシスを阻止するために、ｐ５３を不活性化する。増殖能力又は腫瘍崩壊能力が乏しいため、臨床的効果はほとんど無いものの、Ｏｎｙｘ−０１５として知られるＥ１ｂ−５５Ｋ中の突然変異アデノウイルスは、ｐ５３が欠損した腫瘍の治療に用いられてきた。腫瘍の選択的複製を達成するためにアデノウイルスゲノムにおいて実施される他の変異は、Ｅ１ａのＣＲ２領域に影響を及ぼす。このＥ１ａ領域は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）ファミリーのタンパク質への結合を仲介する。ｐＲｂタンパク質は、細胞周期のＧ０／Ｇ１のＳ期への移行を妨害し、Ｅ２Ｆとの転写阻害複合体を形成する。Ｅ１ａがｐＲｂに結合する場合、ｐＲｂ−Ｅ２Ｆ複合体のＥ２Ｆ転写因子は遊離し、Ｅ２Ｆは、Ｓ期への移行に関与する遺伝子、及びＥ２等のウイルス遺伝子の転写活性化因子として作用する。従って、Ｅ２Ｆの遊離は、アデノウイルスの複製における重要な段階である。腫瘍細胞において、ｐＲｂが存在しないか、又は過剰リン酸化により不活性化され、Ｅ２Ｆはフリーであるため、細胞周期は制御不能である。これらの細胞において、Ｅ１ａによるｐＲｂの不活性化は必要ない。従って、ｐＲｂとの結合を防止するデルタ−２４と呼ばれるＥ１ａにおける変異を有するアデノウイルスは、不活性化ｐＲｂを有する細胞中で正常に増殖することができる（非特許文献９および１０）。

腫瘍選択的プロモーターを有するウイルスプロモーターを複製する戦略に関して、Ｅ１ａプロモーターは、アルファ−フェトプロテインプロモーター、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、カリクレイン、ムチン１及びオステオカルシン等の種々のプロモーターによって置換される（非特許文献１１〜１５）。しかし、プロモーターの適切な制御を防止し、選択性を低下させるウイルス配列が存在するというウイルスとの関連で、主要な問題は、細胞プロモーターの使用において確認された（非特許文献１６および１７）。他のウイルス遺伝子、及びＥ１ｂ、Ｅ２及びＥ４等のＥ１ａを制御することによって、この選択性の損失を補正することが試まれた（非特許文献１８および１９）。種々のウイルス遺伝子の制御は、Ｅ１ａについてＥ２Ｆ１プロモーター、及びＥ４についてテロメラーゼプロモーター等の、それぞれのウイルス遺伝子ごとに種々のプロモーターを用いて実施することができる。この場合、２種のプロモーターは、多くの腫瘍細胞内で腫瘍崩壊能力が減少したままであるように、ウイルス複製を許容するための高レベルで発現される必要がある（非特許文献２０）。また、２種のウイルス遺伝子は、例えば、Ｅ１ａ及びＥ４がＥ２Ｆ１プロモーターによって制御される、腫瘍崩壊アデノウイルスＯｎｙｘ４１１中で、同じプロモーターで制御され得る（非特許文献２１）。しかし、アデノウイルスゲノム中のプロモーター配列の複製が、これらの反復配列の間の組み換えによりゲノム不安定性を引き起こすことが証明されている（非特許文献２２）。Ｅ４領域のあらゆる改善が、腫瘍崩壊アデノウイルスのゲノム不安定性を引き起こすと思われるため、この問題を解決することは困難である（非特許文献２２）。更に、アデノウイルス遺伝子の転写制御は、Ｅ１ａが他の初期ウイルス遺伝子の発現を活性化するよう、一時的に制御される。この制御はウイルスのサイクルに最適であり、Ｅ１ａ以外のウイルス遺伝子のプロモーターが腫瘍特異的プロモーターに置換される場合に欠失している。一方、エンハンサーがあり、転写開始点を、末端重複中、及びアデノウイルスパッケージングシグナル中に局在化させることを考えると、Ｅ１ａ及びＥ４の転写を制御することが好ましい場合、ウイルス配列と、アデノウイルス複製を制御するために用いられる特異的プロモーターとの間の障害の問題は、特に重要である（非特許文献２３〜２５）。非腫瘍崩壊ベクターの分野において、この障害は、ニワトリのＢ−グロビン遺伝子のＨＳ４遺伝子座に由来する分離した配列のプロモーターと、これらのエンハンサーの間への挿入により、軽減する（非特許文献２６および２７）。ＨＳ４の隔離メカニズムは、エンハンサー及びプロモーターに存在する因子間の相互作用を阻害するタンパク質ＣＴＣＦ結合に基づく（非特許文献２８）。本発明は、腫瘍崩壊アデノウイルスの設計の関連で、ヒトゲノム由来の隔離配列の使用を開示する。

腫瘍崩壊アデノウイルスの設計において用いられる特に興味深いプロモーターはＥ２Ｆ１プロモーターである（非特許文献２０、２１、２９および３０）。このプロモーターは２つのＥ２Ｆ結合部位を示す。Ｅ２Ｆ転写因子のファミリーは、細胞周期のＳ期に入ることを可能にする遺伝子の転写を制御する。これらの因子は、それらが遊離される時に活性化因子としての機能を果たし、ｐＲｂ網膜芽細胞腫タンパク質と結合する時にリプレッサーとしての機能を果たす（非特許文献３１）。ｐＲｂのＥ２Ｆへの結合は、ｐＲｂのリン酸化が、そのＥ２Ｆへの結合を防止するように、ｐＲｂのリン酸化によって制御される。腫瘍は、ｐＲｂの過剰リン酸化、及びフリーのＥ２Ｆの増加をもたらすシグナル−翻訳経路における変化を表す。従って、腫瘍においては、Ｅ２Ｆ１遺伝子等のＥ２Ｆに対応する遺伝子が発現する。一方、正常な静止細胞では、ｐＲｂはリン酸化されず、Ｅ２Ｆに結合したままであり、転写レプレッサーとして作用する複合体を形成する。しかし、腫瘍崩壊アデノウイルスにおいて、Ｅ２Ｆ１プロモーターを有するＥ１ａの単純な調整は、１０倍のオーダーの腫瘍における低レベルの選択的複製をもたらす（非特許文献２０）。上の段落で述べた問題点はあるものの、Ｅ１ａに加えて他のウイルス遺伝子の調節はこのような低選択性の可能な解決法である。例えば、ＯＡＳ４０３は、Ｅ２Ｆ１のプロモーターで制御されるＥ１ａ、及びテロメラーゼのプロモーターで制御されるＥ４を有する腫瘍崩壊アデノウイルスであり、逆方向末端反復（ＩＴＲ）からの転写を排除するためのポリアデニル化シグナルを更に含み、パッケージングシグナルは、Ｅ１ａプロモーターによる干渉を減らすために、ゲノム右橋に再度移動する（非特許文献２０）。ＯＡＳ４０３の増幅の間、パッケージングシグナル、及びＥ４に隣接する配列はゲノム内で位置を変える（非特許文献２２）。更に、Ｅ４領域のマイナーな改善でさえ遺伝的不安定性を引き起こし、Ｅ４領域の改善に基づくこのような戦略は放棄される（非特許文献２２）。その選択性から離れたＥ２Ｆ１プロモーターで見られた他の問題は効力の欠如である。非常に選択的であるのに加え、Ｅ２Ｆ１プロモーターによって制御されるＥ１ａを有する腫瘍崩壊アデノウイルスはＲｙａｎら（非特許文献２０）、及び本発明の実施例に示されるように、サルベージアデノウイルスに関してその腫瘍崩壊能力を失う。
ＡｌｅｍａｎｙＲ，ＢａｌａｇｕｅＣ，ＣｕｒｉｅｌＤＴ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８：７２３−７２７ＤｅＰａｃｅＮ．Ｓｕｌｌａｓｃｏｍｐａｒｓａｄｉｕｎｅｎｏｒｍｅｃｒａｎｃｏｖｅｇｅｔａｎｔｅｄｅｌｃｏｌｌｏｄｅｌｌ’ｕｔｅｒｏｓｅｎｚａｃｕｒａｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ．Ｇｉｎｅｃｏｌｏｇｉａ．１９１２；９：８２−８９ＳｉｎｋｏｖｉｃｓＪ，ＨｏｒｖａｔｈＪ．Ｎｅｗｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｖｉｒｕｓｔｈｅｒａｐｙｏｆｃａｎｃｅｒ：ａｈｉｓｔｏｒｉｃａｌｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９３；３６：１９３−２１４ＤｕｐｒｅｓｓｏｉｒＴｅｔａｌ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙｐａｒｖｏｖｉｒｕｓＨ１ｏｆｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｓｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅａｎｄｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｖｉｔｒｏｂｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｈｕｍａｎｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９８９；４９：３２０３−３２０８ＳｔｏｊｄｌＤＦｅｔａｌ．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇｔｕｍｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｆｅｃｔｓｉｎｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐａｔｈｗａｙｗｉｔｈａｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｕｎｋｎｏｗｎｏｎｃｏｌｙｔｉｃｖｉｒｕｓ．ＮａｔＭｅｄ．２０００；６：８２１−８２５ＮｏｒｍａｎＫＬ，ＬｅｅＰＷ．Ｒｅｏｖｉｒｕｓａｓａｎｏｖｅｌｏｎｃｏｌｙｔｉｃａｇｅｎｔ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０００；１０５：１０３５−１０３８ＭａｒｋｅｄＪＭｅｔａｌ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｍｕｔａｎｔ，Ｇ２０７ｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｇｌｉｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｐｈａｓｅＩｔｒｉａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０００；７：８６７−８７４ＳｈｅｎｋＴ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：ＴｈｅＶｉｒｕｓｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６ＦｕｅｙｏＪｅｔａｌ．ＡｍｕｔａｎｔｏｎｃｏｌｙｔｉｃａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅＲｂｐａｔｈｗａｙｐｒｏｄｕｃｅｓａｎｔｉｇｌｉｏｍａｅｆｆｅｃｔｉｎｖｉｖｏ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００；１９：２−１２ＨｅｉｓｅＣｅｔａｌ．ＡｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥ１Ａｍｕｔａｎｔｔｈａｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｐｏｔｅｎｔａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍｉｃａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌｅｆｆｉｃａｃｙ．ＮａｔＭｅｄ．２０００；６：１１３４−１１３９ＡｌｅｍａｎｙＲｅｔａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｏｎｃｏｌｙｓｉｓ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．１９９９；６：２１−２５ＨａｌｌｅｎｂｅｃｋＰＬｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｔｕｍｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｆｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．１９９９；１０：１７２１−１７３３ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＲｅｔａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（ＡＲＣＡ）ＣＮ７０６：ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｆｏｒｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｐｏｓｉｔｉｖｅｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９７；５７：２５５９−２５６３ＫｕｒｉｈａｒａＴ，ＢｒｏｕｇｈＤＥ，ＫｏｖｅｓｄｉＩ，ＫｕｆｅＤＷ．ＳｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｆｏｒｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅＭＵＣ１ａｎｔｉｇｅｎ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：７６３−７７１ＭａｔｓｕｂａｒａＳｅｔａｌ．Ａｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ，ＡｄＯＣＥ１ａ，ｔｏｃｏｔａｒｇｅｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒａｎｄｂｏｎｅｓｔｒｏｍａｉｎａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｏｆａｎｄｒｏｇｅｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｂｏｎｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００１；６１：６０１２−６０１９ＲｉｎｇＣＪ，ＨａｒｒｉｓＪＤ，ＨｕｒｓｔＨＣ，ＬｅｍｏｉｎｅＮＲ．Ｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒａｌ，ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌａｎｄｐｌａｓｍｉｄｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅＥＲＢＢ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１９９６；３：１０９４−１１０３ＳｈｉＱ，ＷａｎｇＹ，ＷｏｒｔｏｎＲ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎａｎａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．１９９７；８：４０３−４１０ＢｒｕｎｏｒｉＭ，ＭａｌｅｒｂａＭ，ＫａｓｈｉｗａｚａｋｉＨ，ＩｇｇｏＲ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓｔｈａｔｔａｒｇｅｔｔｕｍｏｒｓｗｉｔｈｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｗｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．ＪＶｉｒｏｌ．２００１；７５：２８５７−２８６５ＤｏｒｏｎｉｎＫｅｔａｌ．Ｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｔｕｍｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｆｏｒｃａｎｃｅｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＪＶｉｒａｌ．２００１；７５：３３１４−３３２４ＲｙａｎＰＣｅｔａｌ．ＡｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｔｕｍｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈａｓｉｎｇｌｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＯＡＳ４０３，ａｎｏｎｃｏｌｙｔｉｃａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｗｏｐｒｅｖａｌｅｎｔａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｏｒ．２００４；１１：５５５−５６９ＪｏｈｎｓｏｎＬｅｔａｌ．ＳｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄＥ２Ｆａｃｔｉｖｉｔｙａｒｅｐｏｔｅｎｔ，ｓｙｓｔｅｍｉｃａｎｔｉｔｕｍｏｒａｇｅｎｔｓ．ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ．２００２；１：３２５−３３７ＷｏｒｋｉｎｇＰＫ，ＬｉｎＡ，ＢｏｒｅｌｌｉｎｉＦ．Ｍｅｅｔｉｎｇｐｒｏｄｕｃｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｃｌｉｎｉｃａｌｇｒａｄｅｏｎｃｏｌｙｔｉｃａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５；２４：７７９２−７８０１ＨｅａｒｉｎｇＰ，ＳｈｅｎｋＴ．Ｔｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ５Ｅ１Ａｅｎｈａｎｃｅｒｃｏｎｔａｉｎｓｔｗｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｄｉｓｔｉｎｃｔｄｏｍａｉｎｓ：ｏｎｅｉｓｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＥｌＡａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｍｏｄｕｌａｔｅｓａｌｌｅａｒｌｙｕｎｉｔｓｉｎｃｉｓ．Ｃｅｌｌ．１９８６；４５：２２９−２３６ＢｕｖｏｌｉＭ，ＬａｎｇｅｒＳＪ，ＢｉａｌｉｋＳ，ＬｅｉｎｗａｎｄＬＡ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓｕｓｅｄａｓｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｎｓｕｌａｔｏｒｓｉｎａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００２；９：２２７−２３１ＹａｍａｍｏｔｏＭｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｌｅｆｔｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｅ１ｄｅｌｅｔｅｄ．ＪＶｉｒｏｌ．２００３；７７：１６３３−１６３７ＳｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒＤＳ，ＬｉｅｂｅｒＡ．Ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｖｉｒａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｍｐｒｏｖｅｓｉｎｄｕｃｉｂｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒｏｍａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０００；７：５５６−５６７ＭａｒｔｉｎＤｕｑｕｅＰ，ＪｅｚｚａｒｄＳ，ＫａｆｔａｎｓｉｓＬ，ＶａｓｓａｕｘＧ．Ｄｉｒｅｃｔｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｉｎｓｕｌａｔｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｗｏｇｅｎｅｔｉｃｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎａｎａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００４；１５：９９５−１００２ＷｅｓｔＡＧ，ＧａｓｚｎｅｒＭ，ＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄＧ．Ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ：ｍａｎｙｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｍａｎｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２００２；１６：２７１−２８８ＴｓｕｋｕｄａＫｅｔａｌ．ＡｎＥ２Ｆｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｔｈｅｄｅｆｅｃｔｉｖｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｉｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ：ｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌｅｆｆｉｃａｃｙｂｕｔｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｏｎｏｒｍａｌｃｅｌｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００２；６２：３４３８−３４４７ＪａｋｕｂｃｚａｋＪＬｅｔａｌ．Ａｎｏｎｃｏｌｙｔｉｃａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｌｅｃｔｉｖｅｆｏｒｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎｐａｔｈｗａｙｄｅｆｅｃｔｉｖｅｔｕｍｏｒｓ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｎＥ１Ａ，ｔｈｅＥ２Ｆ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｎｄｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００３；６３：１４９０−１４９９ＤｙｓｏｎＮ．ＴｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＥ２ＦｂｙｐＲＢｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１９９８；１２：２２４５−２２６２

本発明は、腫瘍崩壊アデノウイルスのゲノムプロモーターの正しい機能を達成するための適切なＤＮＡ配列の使用を開示する。これらの配列を用いて、腫瘍崩壊アデノウイルスは、より大きな選択性及び抗腫瘍活性を表わすように設計される。本発明に開示される成分の使用は、腫瘍特異的プロモーターのみを用いた、高い腫瘍選択性及び腫瘍崩壊能力の獲得を可能にする。単一のプロモーターの使用は、アデノウイルスゲノムにおける、同一のプロモーターの反復に関するゲノム不安定性の問題を減少する。更に、他のウイルスゲノムの制御を回避する、Ｅ１ａのみの制御は、アデノウイルス遺伝子の正確な一時的な制御を可能にし、Ｅ４領域の改善に関連するゲノム不安定性を防止する。

（発明の説明）
本発明は、アデノウイルス遺伝子に選択的発現を付与するプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列を含む、癌を治療するための腫瘍崩壊アデノウイルスに関する。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

また、前記アデノウイルスが、腫瘍選択性を付与するプロモーターによって制御されるアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する、腫瘍崩壊アデノウイルスに関する。特に、この配列はコザック配列である。

本発明の他の目的は、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含む、癌を治療するための腫瘍崩壊アデノウイルスである。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明の他の目的は、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含み、腫瘍において選択的複製を達成するためのＥ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ４の１種以上の遺伝子群中の変異を示すアデノウイルスである。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明のなお他の目的は、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含み、感染力を高めるためにキャプシド中に改善を含むか、又は腫瘍細胞中に存在する受容体に配向している腫瘍崩壊アデノウイルスである。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明のなお他の目的は、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含み、前記アデノウイルスはプロドラッグ活性化因子、腫瘍抑制因子又は免疫賦活剤として癌の遺伝子療法の分野において通常に用いられる他の遺伝子を順番に含む腫瘍崩壊アデノウイルスである。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明のなお他の目的は、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含む腫瘍崩壊アデノウイルスであって、前記アデノウイルスが、血清タイプ１〜５０に由来するヒトアデノウイルスである腫瘍崩壊アデノウイルスである。特に、前記アデノウイルスはヒトアデノウイルス血清型５である。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明のなお他の目的は、アデノウイルス遺伝子の発現を制御するためのＥ２Ｆと結合する部位を加えることによる、改善されたヒトＥ２Ｆ１遺伝子のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含む腫瘍崩壊アデノウイルスである。特に、ヒトＤＮＡ配列は筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明の他の目的は、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含む有効量の腫瘍崩壊アデノウイルス、及び１種以上の薬学的に許容され得る担体及び賦形剤を含む医薬組成物である。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明の他の目的は、癌又はその前癌状態を治療又は予防するための薬剤を製造するための、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離するヒトＤＮＡ配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を含む腫瘍崩壊アデノウイルスの使用である。特に、ヒトＤＮＡ配列は、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する。

本発明のアデノウイルスは、場合により化学療法又は放射線療法等の癌治療の他の方法と併用してもよい。

本発明は、アデノウイルス遺伝子を制御する選択的発現のプロモーターを分離する配列として、ヒトＤＮＡ配列、特に、筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来する配列、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を順番に含む腫瘍崩壊アデノウイルス、並びに、癌又はその前癌状態を治療又は予防するための前記腫瘍崩壊アデノウイルスの使用を開示する。既に、アデノウイルスベクターにおけるニワトリのＢ−グロビンに由来する分離配列の使用は開示されている^{２６，２７}。本発明とは異なり、以前開示されたアイソレーターはヒト起源でなく、腫瘍崩壊アデノウイルスにおいて用いられていない。筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座はヒト染色体の第１３番の１９ｑ１３．３の位置に位置する。この遺伝子座は、ＣＴＣＦタンパク質、プロモーターにおけるエンハンサー又は活性化因子の効果の強力なアイソレーターとして一緒に機能する個々のＣＴＧ反復配列に従う変数についての２個の結合部位を含む^３２。本発明より前には、ウイルスゲノム中のその活性は解析されていなかった。ウイルスゲノムにおけるその活性は明らかでなく、その活性は、関連するヒストンがその機能において役割を果たす、細胞染色体との関連においてのみ証明される。非ヒト起源配列の移行が生物学的安全性を意味することができるように、ヒト起源は、ニワトリのＨＳ４配列の使用に対し、優れた代替物を提供する。

更に、本発明は、腫瘍特異的プロモーターの下で制御されるアデノウイルスタンパク質の生産レベルを上げるためのタンパク質翻訳のための最適化配列の使用を開示する。腫瘍選択的プロモーターを用いた、ウイルス遺伝子発現の制御は、発現のレベルが、通常はＡｄ５において観察される発現レベルよりも低いという問題を示す。この低い発現は、腫瘍崩壊アデノウイルスの複製能力の低下をもたらす。選択的プロモーターで制御される遺伝子の翻訳開始点でのコザック配列の挿入は、制御される遺伝子の発現レベルを回復することができる。

本発明は、腫瘍崩壊アデノウイルスにおけるＥ１ａの発現の良好な制御のための、Ｅ２Ｆ１のヒトプロモーターの配列におけるＥ２Ｆ結合部位の数を増加させる戦略も開示する。これは、Ｅ２Ｆ産物結合部位での腫瘍細胞中のＥ１ａの発現の増加、及び正常細胞でのＥ１ａの低い発現を強化し、腫瘍選択性及びアデノウイルス複製における増加をもたらす。

本発明は、膵臓癌、結腸癌及び肺癌を含むがこれらに限定されない癌のより良い治療法を見出す必要性に向けられている。ヒトＤＮＡ配列、及びタンパク質翻訳を最適化する配列を含む腫瘍崩壊アデノウイルスを用いた癌の治療は、遺伝子療法、及びアデノウイルスを用いたウイルス療法の分野における標準的方法を用いた、癌患者における腫瘍内部への直接注入、又は全身性静脈注射により実施することができる。

本発明に含まれる図面は、本発明の特徴、利点及び構成を明らかにし、詳細な理解の目的で含まれる。これらの図面は、明細書の一部を構成し、好ましい発明を説明するが、本発明の範囲を限定すると考えるべきでない。

（発明の詳細な説明）
Ａ．ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、及びＥ１ａ翻訳を最適化するコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中でのＥ２Ｆの結合のための追加部位を含むアデノウイルスの構造
本発明は、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、及びＥ１ａ翻訳を最適化するコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中でのＥ２Ｆの結合のための追加部位を含むアデノウイルスの癌治療における使用を開示する。該処置は、変質した網膜芽細胞腫経路を有する腫瘍内のこれらのウイルスの選択的複製をベースとする。

網膜芽細胞種経路は、網膜芽細胞種ｐＲｂのタンパク質のリン酸化のレベルを制御するために細胞膜から核に発生するタンパク質相互作用のセットである。癌は、ｐＲｂタンパク質が過剰リン酸化されるか、又は失われるという、この経路の変化によって特徴づけられる。ｐＲｂの変化は、Ｅ２Ｆ転写因子に対するｐＲｂの結合の喪失、及び腫瘍細胞の核内のフリーのＥ２Ｆの増加を引き起こす。この転写因子は、その発現を増加させるため、Ｅ２Ｆ１プロモーターとして、特定のＥ２Ｆ結合部位と共にプロモーターに結合する。

ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、及びＥ１ａ翻訳開始点のコザック配列、ならびにＥ２Ｆ１プロモーター中でのＥ２Ｆの結合のための追加部位を含むアデノウイルスの腫瘍における選択的複製のメカニズムは、腫瘍中のフリーのＥ２Ｆの存在が、ウイルス中のＥ２Ｆ１プロモーターの発現を活性化するという考えに基づき、本発明の図２に示される。ＭＤ配列の存在はプロモーターの正しい活性化を可能にする。コザック配列の存在は、腫瘍崩壊ウイルスの適切な複製及び腫瘍崩壊能力の維持に十分な量のＥ１ａの合成を可能にする。同様に、Ｅ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆへの結合のための追加の部位の存在は、腫瘍崩壊ウイルスの適切な複製及び腫瘍崩壊能力の維持のためのＥ１ａの発現レベルの上昇を可能にする。

筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座に由来するヒト配列から隔離されるＭＤは配列番号１によって表わされる（配列番号１の３６８位〜１０９６位）。ＭＤ配列は、ＣＴＣＦ因子に結合するための部位、及び転写干渉の強力なアイソレーターとして一緒に機能する様々な長さのＣＧＴ反復配列を含むことによって特徴づけられる^３２。本発明において、ＭＤ配列はＥ１ａプロモーター近くのアデノウイルスのパッケージング配列中に位置するエンハンサーの効果を隔離するのに役立つ。Ｅ１ａプロモーターは、例えば、Ｅ２Ｆ１プロモーター等の腫瘍選択的プロモーターによって置換され、このプロモーターはアデノウイルスパッケージング配列中に存在するエンハンサーから隔離され、ＭＤ配列は、前記パッケージング配列及びＥ２Ｆ１プロモーターの間に挿入される。Ｅ２Ｆ１プロモーター配列を配列番号１に示す（配列番号１の１２８３位〜１５６４位）。このプロモーターは、不完全な回文配列中に組織されるＥ２Ｆに結合する２つの部位、及びＳｐ１との結合のための４つの部位の存在によって特徴づけられる^３４。本発明において、Ｅ２Ｆプロモーター配列は、サルベージヒトプロモーター（配列番号３の１３２１位〜１４４７位）に既に存在する配列の上端のＥ２Ｆへの結合のための追加部位の挿入によって改善される。これは、正常細胞における転写抑制、及び腫瘍細胞における転写活性化の両方における上昇を達成する。真核細胞リボソームによるＡＲＮｍ翻訳は、最初に翻訳されるＡＴＧコドンの前に配列ＣＣＡ／ＧＣＣを挿入することによって最適化することができる^３５。この配列はＭａｒｙｌｉｎＫｏｚａｋによって同定され、コザックと命名された。本発明において、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーター等の腫瘍選択的プロモーターを、Ｅ１ａ（配列番号２の１５５８位〜１５６２位）の発現を制御するために用いた場合、この配列は、実験的に観察された弱い効力を補正するのに役立つ。

アデノウイルスゲノムの操作には、様々な方法がある。アデノウイルス構築の一般的な改善方法は、遺伝子療法及びアデノウイルスを用いたウイルス療法の分野において十分に確立されている^{３６−４１}。最もよく用いられる方法は、最初に、改善されるべきアデノウイルス領域を含むプラスミド内で所望の遺伝的改善を構成し、次いで、最初のウイルスゲノムを含むプラスミドと細菌との相同的組換えを実施することをベースとする^４１。この方法は以下の通りであり得る。

ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターとＥ１ａの発現制御とは異なる、他のタイプの遺伝的変異及び操作、本発明に開示された、Ｅ２Ｆ１プロモーター中のＥ１ａの翻訳を最適化するためのコザック配列の挿入、及びＥ２Ｆへの結合のための部位の追加が、腫瘍内での選択的複製を得るために実施された^{１，４２−４４}。これらは、腫瘍細胞内で活性であり、ウイルス遺伝子の発現を制御するためにも用いられる、Ｅ２Ｆ１とは異なる他のプロモーターの挿入であってもよい。本発明の特徴は、これらの他のプロモーターと組み合わせた、ＭＤと隔離された配列及びコザック配列の使用である。

腫瘍内で選択的複製を実現するために開示された他の改善は、ＲＢ経路を断つ初期Ｅ１機能の選択である。これらの変異の選択的複製は既に証明されている^９，１０。Ｅ４^４５、及びＥ４ｏｒｆ６／７^４６等のｐＲｂと直接相互作用する他のウイルス遺伝子は、それぞれ、腫瘍細胞中での選択的複製を実現する検出のための候補である。

本発明の他の特徴において、ＭＤ配列で隔離され、コザック配列により増強された選択的プロモーターによって制御されるウイルス遺伝子の発現を伴うアデノウイルスは、その無効力を増強するためのそのキャプシドの改善を含むことができ、又は腫瘍細胞中に存在する受容体に配向され得る。アデノウイルスキャプシドのタンパク質は、無効力を増強するか、腫瘍細胞中の受容体にウイルスを配向するリガンドを含むように、遺伝的に改善される^{４７−５３}。アデノウイルスの腫瘍に対する配向は、一面でウイルスに結合し、他面で腫瘍受容体と結合する二官能性リガンドを用いても達成することができる^{５３−５６}。一方、血液中のアデノウイルスの持続性を増し、その結果、播種性腫瘍小結節に到達する可能性を高めるために、キャプシドをポリエチレングリコール等のポリマーで覆うことができる^{５７−６０}。これらの改善は、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆに結合するための追加の部位を含むアデノウイルス中で構成することができる。

本発明の他の特徴は、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆに結合するための追加の部位を含むが、Ａｄ５以外のアデノウイルスの他の血清型に由来するアデノウイルスである。

本発明の他の特徴は、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆに対して結合するための追加の部位、及び、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、プロアポトーシス遺伝子、免疫賦活剤、又は腫瘍抑制剤等腫瘍細胞に対するの細胞毒性を増すための他の遺伝子を順番に含むアデノウイルスに関する。

Ｂ．ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆに結合するための追加の部位を含むアデノウイルスの製造、精製及び製剤化。

本発明に開示されるアデノウイルスは、アデノウイルス学及びアデノウイルスベクターの分野における標準的方法に従って増殖させる^{３６，３７}。好ましい増殖方法は、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆに結合するための追加の部位を含むアデノウイルスの複製を可能にする細胞系の感染による。肺腺癌Ａ５４９の系は、この系の具体例である。増殖は、例えば以下のように実施する。細胞培養のためのプラスチックプレート上で、Ａ５４９細胞を増殖させ、細胞あたり５０個のウイルス粒子を用いて感染させる。２日後、ウイルスの生産に影響を及ぼす細胞変性効果が、細胞のクラスターとして観察される。細胞を集め、試験管内に保存した。１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞沈殿物を、３回凍結及び解凍して細胞を破壊する。得られた細胞抽出物を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ウイルスを含む上清を塩化セシウムの勾配に載せ、３５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離する。勾配中のウイルスのバンドを前記塩化セシウムの別の勾配に再び載せ、３５，０００ｒｐｍで１６時間遠心分離する。ウイルスのバンドを集め、ＰＢＳ−１０％グリセロールで透析する。透析したウイルスを一定量ずつにわけ、−８０℃に保存する。粒子の数及びプレート形成単位を標準的プロトコール^３９に従って定量化する。

グリセロールを１０％含む食塩水リン酸緩衝液は、アデノウイルスの保存のための標準的製剤である。しかし、ウイルスの安定性を向上させる、新しい製剤が開示されている^{６１，６２}。

Ｃ．癌の治療のための、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆに結合するための追加の部位を含むアデノウイルスの使用。

本発明は、癌の治療のための、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列、及びＥ２Ｆ１プロモーター中のＥ２Ｆに結合するための追加の部位を含むアデノウイルスの使用を開示する。該治療は、活性化ＲＢ経路による、細胞内でのこれらのウイルスの選択的複製に基づく。

癌の治療において本発明で開示されるウイルスを用いるためのプロトコールは、アデノウイルスを用いたウイルス療法、及びアデノウイルスを用いた遺伝子療法の分野において用いられる手順に従う。遺伝子療法の分野における非複製的及び複製的使用における幅広い経験がある。特に、本発明において提案されるもの以外の選択的複製法を用いたアデノウイルスは、癌の治療に用いられてきた^{９，３７，６３−６８}。培養、動物モデル、及びヒト患者の臨床試験における腫瘍細胞の処置を扱う多くの出版物がある。ｉｎｖｉｔｒｏ培養における細胞の治療のために、前述したあらゆる形態における精製したアデノウイルスを、腫瘍細胞を感染させるため培地に加える。動物モデル又はヒト患者における腫瘍を治療するため、アデノウイルスを注射で、腫瘍に、又は腫瘍が局在する体腔に局所領域的に投与することができ、又は注射によって血流に全身的にでも投与することができる。他のアデノウイルスを用いて実施されるように、複製物を、腫瘍、又は腫瘍が局在する体腔に、注射によって局所領域的に、又は注射によって血流に全身的に投与することができる。他の選択的複製アデノウイルスを用いて実施されるように、本発明の主題である、開示されたアデノウイルスを用いた腫瘍の処置は、化学療法又は放射線療法等の他の治療法と併用することができる。

（実施例１）
（ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａを含む腫瘍崩壊アデノウイルスは、Ｅ１ａを発現し、腫瘍細胞で選択的に複製される。）
ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａを含むアデノウイルスは、以下のようにして構築した。ＩＣＯＶＩＲ−１（Ａｄ−Ｅ２Ｆ−Δ２４ＲＧＤ）を生成するため、ヒトＥ２Ｆ１プロモーターを、Ｅ２Ｆ−１プロモーター（位置＋１は転写開始点を表わす）の−２１８〜＋５１塩基の対を形成するオリゴヌクレオチドストレッチングを用いて、ヒト末梢血の単核細胞のＰＣＲによって得た。オリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）中でのクローニングのためのＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ標的を含んでいた。得られたプラスミドはｐＧＬ３−Ｅ２Ｆと呼ばれた。これから、Ｅ１ａの１２２及び１２９ヌクレオチド（ｎｔ）を除くアデノウイルスゲノム（Ａｄ５ゲノム^９の３４８ヌクレオチドと５２２ヌクレオチドとの間のＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いたｐＸＣｌ−Δ２４に由来する）の左端から５，７６６塩基対を含むプラスミドとの組換えによってｐＥ２Ｆ−Δ２４を得た。ｐＥ２Ｆ−Δ２４を、ｐＳｈｕｔｔｌｅ^４１と再結合し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ２Ｆ−Δ２４を得た。このプラスミドをＰｍｅｌで直線化し、ｐＶＫ５０３（ＲＤＧ^６９で改善される線維と共にＡｄ５配列を含む）と再結合して、プラスミドｐＡｄ−Ｅ２Ｆ−Δ２４ＲＧＤ又はｐＩＣＯＶＩＲ−１を得た。本発明における改善が、Ｒｂ経路における選択としてウイルスの腫瘍崩壊選択性及び効力、ならびに腫瘍崩壊の分野における効力を増強させることを証明するため、Ｅ２Ｆ１プロモーター、及びΔ２４と呼ばれるＥ１ａ変異、及び線維中へのペプチドＲＧＤの挿入を伴う本発明に開示される他の改善の組み合わせを実施した（アデノウイルスＡｄ−Δ２４ＲＧＤ^７０）。ＩＣＯＶＩＲ１ウイルスは、このプラスミドのＰａｃＩ消化、及びＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションによって生成した。ＩＣＯＶＩＲ−２（Ａｄ−ＭＤ−Ｅ２Ｆ−Δ２４ＲＧＤ）を生成するために、類似のプロトコールを用いた。ＭＤ１遺伝子座の１３００６ヌクレオチド〜１３４７４ヌクレオチド（番号Ｌ０８８３５を有するＧｅｎＢａｎｋで公開された配列）のオリゴヌクレオチドストレッチングを用いて、ヒト末梢血の単核細胞のＰＣＲにより、ＭＤ−１分離配列を得た。ＰＣＲオリゴヌクレオチドは、フランキングＸｈｏＩ部位を組み入れるように設計された。前述したようにして、ＭＤ−１をｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ２Ｆ−Δ２４のＸｈｏＩ部位にサブクローニングし、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＭＤ−Ｅ２Ｆ−Δ２４を得た。ＭＤ１断片の正しい方向を、ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ及びＳｍａＩの制限酵素によりチェックした。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＭＤ−Ｅ２Ｆ−Δ２４をｐＶＫ５０３と再結合してｐＩＣＯＶＩＲ２を生成した。ウイルスＩＣＯＶＩＲ２は、このプラスミドのＰａｃＩを用いた消化、及びＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションによって生成した。ＩＣＯＶＩＲ１及びＩＣＯＶＩＲ２をＡ５４９細胞系内で増殖させ、遺伝子療法及びウイルス療法^３６において開示された方法によって精製した。ＩＣＯＣＩＲ−１及びＩＣＯＶＩＲ２ゲノムの正しい構造は、それぞれＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩを用いた制限切断によりチェックした。更に、ＭＤ−１領域、Ｅ２Ｆプロモーター、Ｅ１Ａ−Δ２４変異、及びＲＧＤを含む線維領域の配列を決定した。これらの配列に用いられたオリゴヌクレオチドは：ＭＤ１−Ｕｐ（５’−ＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＡＴＴＣ−３’）、Ｅ２Ｆ−ｕｐ（５’−ＧＴＧＴＴＡＣＴＣＡＴＡＧＣＧＣＧＴＡＡ−３’）、Δ２４−ｄｏｗｎ（５’−ＣＣＴＣＣＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧ−３’）及びＦｉｂｅｒＵｐ（５’−ＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧ−３’）である。得られた配列を配列番号１に示す。

ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａを含む腫瘍崩壊アデノウイルスが、腫瘍細胞内でＥ１ａを選択的に発現することを証明するため、８０％以上の感染を可能にする多重感染を用いて、ＩＣＯＶＩＲ１及びＩＣＯＶＩＲ２で、正常細胞（マウス及びヒト肝細胞、ヒト線維芽細胞、及びヒトＨＵＶＥＣ内皮細胞）、及び腫瘤細胞（ＮＰ９膵臓癌細胞）、及び腫瘍細胞（膵臓癌ＮＰ９、肺癌Ａ５４９、頭頸部癌ＦａＤｕ及びＳＣＣ２５、ならびにメラノーマＳＫ−Ｍｅｌ−２８及び１．３６．１．５の細胞）の培養細胞を感染させた。感染の２０時間後、溶解バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の４００ｍＭＮａＣｌ、ＩｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＮａＦ、１０％グリセロール、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１００μｇ／ｍＬのフッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇ／ｍＬロイペプチン、及び１０μｇ／ｍＬアプロチニン）中、４℃で１時間、細胞を溶解させた。溶解物を１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、タンパク質を含む上清を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２５μｇ／トラック、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＢｉｏＲａｄ，ＣＡ，ＵＳＡにより検出）中で電気泳動により分離し、ニトロセルロース（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。膜を、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中の、５％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．９％ＮａＣｌでブロックし、抗アデノウイルス−２−Ｅ１ａポリクローナル抗体（クローン１３Ｓ−５、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）で４℃にて１６時間インキュベートした。ポリオキシダーゼと結合した、抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＤＡＫＯＡ／Ｓ）、及びＡｍｅｒｓｈａｍ‘ｓＥｎｈａｎｃｅｄＣｈｅｍｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてＥ１ａを検出した。結果を、本発明の図３に示す。Ｅ２Ｆ１プロモーター（ＩＣＯＶＩＲ１）の存在が、正常細胞におけるＥ１ａの発現を減少し得ることが示された。しかし、ＭＤ配列は、Ｅ２Ｆプロモーター（ＩＣＯＶＩＲ２）によるＥ１ａの発現のより優れたコントロールを付与する。腫瘍細胞において、ＩＣＯＶＩＲ１及びＩＣＯＶＩＲ２の両方は、Ｅ１ａを発現し得るが、ＦａＤｕ、ＳＣＣ２５及びＳＫＭｅｌ−２８等のいくつかの腫瘍系におけるＥ１ａの発現が、Ｅ１ａがＥ２Ｆ１によって制御されていない、サルベージアデノウイルス及び腫瘍崩壊ＡｄＤ２４ＲＧＤで得られるよりも低いことに注意すべきである。これは、Ｅ２Ｆ１プロモーターが、ＭＤで隔離されていてもいなくても、Ｅ２Ｆ１が、サルベージアデノウイルスに比べ、腫瘍細胞中で、Ｅ１ａの発現レベルを上げるのに必要な効力を有していないことを示す。

ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａを含む腫瘍崩壊アデノウイルスが、腫瘍細胞中で選択的に複製されることを証明するため、細胞を、前記パラグラフに開示されたようにしてＩＣＯＶＩＲ１及びＩＣＯＶＩＲ２で感染させた。感染の５日後、細胞及び培地を集め、３回凍結−解凍して、ウイルスを遊離させた。ウイルスの量は、ＨＥＫ２９３への感染、及びモノクローナル抗体２Ｈｘ−２（ＡＴＣＣ）及びラットの二次抗体Ａｌｅｘａ４８８抗ＩｇＧ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いた抗ヘキソン染色により定量化した。結果を図４に示す。ＩＣＯＶＩＲ１中のＥ２Ｆ１プロモーターの存在は、正常細胞（線維芽細胞及びＨＵＶＥＣ）中のウイルス複製を減少させる。しかし、ＩＣＯＶＩＲ２中の隔離された配列は、ウイルス複製を低下させる。Ａ５４９、ＩＣＯＶＩＲ１及びＩＣＯＶＩＲ２等の特定の腫瘍細胞系では、サルベージアデノウイルスＡｄｗｔと同様の複製レベルを示すが大部分の腫瘍系においては、その複製能力はＡｄｗｔよりも低い。

（実施例２）
（コザック配列は、Ｅ１ａの発現がＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御される、腫瘍崩壊アデノウイルスＥ１ａの発現の増加を可能にする。）
腫瘍崩壊アデノウイルスは、ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、及びその翻訳を促進させるコザック配列を用いて構築された。このため、Ｋｐｎ１を用いた制限切断により、ＭＤ配列、Ｅ２Ｆ１プロモーター及びＥ１ａを含むＤＮＡの断片を、実施例１に開示したｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＭＤ−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４から分離し、ｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、プラスミドｐＧＥＭ−Ｅ２Ｆ−ｄ２４を得た。コザック配列を含むオリゴヌクレオチドを用いてＥ１ａ翻訳の開始を置換するために、このプラスミドを用いて、ｐＧＥＭ−Ｅ２４−ＫＤ２４を得た。このようにして改善されたＫｐｎ１断片を、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＤＭ−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４由来のＫｐｎ１中に再度クローニングし、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＤＭ−Ｅ２Ｆ−ＫＤ２４を得た。最終的に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＤＭ−Ｅ２Ｆ−ＫＤ２４をｐＶＫ５０３と再結合し、ｐＩＣＯＶＩＲ５を得た。ウイルスＩＣＯＶＩＲ５を、このプラスミドのＰａｃＩを用いた消化、及びＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションによって生成した。ＩＣＯＶＩＲ５をＡ５４９系で増殖させ、遺伝子療法及びウイルス療法が開示されている方法によって精製した^３６。その構造を本発明の図１に示す。プロモーター及びＥ１ａの正しい配列は、制限切断及び配列決定によってチェックした。得られた配列を配列番号２に示す。

Ｅ１ａが、その発現がＭＤ配列で隔離されるＥ２Ｆ１プロモーターで制御され、さらにその翻訳がコザック配列によって最適化される場合に腫瘍細胞内で条件付きで発現することを証明するため、実施例１に記載されたようにしてＥ１ａの発現を解析した。この場合、それは、Ｅ１ａの翻訳開始点にコザック配列を含むという事実によってＩＣＯＶＩＲ２から区別される、腫瘍崩壊ウイルスＩＣＯＶＩＲ５中に含まれる。結果を、本発明の図５に示す。正常細胞内でＩＣＯＶＩＲ５は、ＭＤで隔離されるＥ２Ｆプロモーターを示すことによってＥ１ａを発現しない。腫瘍細胞内では、ＩＣＯＶＩＲ５中でのＥ１ａの発現のレベルは、ＩＣＯＶＩＲ２中よりも高く、これは、ＭＤで隔離されるプロモーターの効果を増強するためのコザック配列の効果を証明する。

（実施例３）
（コザック配列は、Ｅ１ａの発現が、ＭＤ配列で隔離されるＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるアデノウイルスの腫瘍崩壊効果を増強することができる。）
我々は、（実施例１及び図４に示すように）ＩＣＯＶＩＲ２の複製能力の低下が見られる腫瘍系ＳＫＭｅｌ−２８及びＦａＤｕ由来の細胞を、９６カッププレートのカップ中で培養した。これらの細胞を、大量のＩＣＯＶＩＲ５、ＩＣＯＶＩＲ２及びＡｄｗｔＲＧＤで感染させた（最後のものは最大溶解能についてのコントロールとして用いた）。感染の５日後、タンパク質量を、細胞生存の反映として分光光度法によって評価した。結果を、本発明の図６に示す。ＳＫＭｅｌ−２８中でのＩＣＯＶＩＲ５の溶解能はＡｄｗｔＲＧＤと同じであり、ＩＣＯＶＩＲ２よりも高い。ＦａＤｕにおいては、ＩＣＯＶＩＲ２よりも高いが、ＡｄｗｔＲＧＤのレベルには達していない。

（実施例４）
（Ｅ１ａが、ＭＤ配列で隔離されるＥ２Ｆ１プロモーターによって制御され、さらにその翻訳がコザック配列で最適化される場合に、Ｅ２Ｆへの結合のための部位の挿入によるＥ２Ｆ１プロモーターの改善は、腫瘍細胞内でのＥ１ａ発現の増加を可能にする。）
腫瘍崩壊アデノウイルスは、Ｅ２Ｆへの結合のための４つの部位の挿入によって改善されるＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａを用いて構築された。このため、実施例２に記載されたプラスミドｐＧＥＭ−Ｅ２ＦＫＥ１ａｄ２４において、我々は、Ｅ２Ｆ１プロモーター（１３２６位）中にＢｓｉＷＩに対する標的を定方向突然変異誘発によって導入した。この部位で、ＢｓｉＷＩは、Ｅ２Ｆへの結合の回文配列を有するオリゴヌクレオチドの２個のコピーと結合し、それはＢｓｉＷＩと極度の適合性を有する。その結果、改善されたプロモーターはｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＭＤ−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４のＫｐｎ１中にサブクローニングされ、ｐＳｈＭＤＥ２ＦＢｓｉＥ２Ｆ２ＫＥ１ａｄ２４を得た。このプラスミドとＡｄｗｔＲＧＤゲノムとの相同的組換えのため、プラスミドｐＩＣＯＶＩＲ７が得られた。ウイルスＩＣＯＶＩＲ７は、Ａ５４９系内での消化によって生成され、遺伝子療法及びウイルス療法において開示された方法^３６によって精製された。その構造を、本発明の図１に示す。プロモーター及びＥ１ａの正確な配列を、制限酵素、及び配列決定によりチェックした。得られた配列を配列番号３に示す。

ＭＤを用いて得られた隔離との関連における、改善Ｅ２Ｆ１プロモーターの役割を証明するため、我々は、実施例１に記載されたようなウェスタンブロットにより、メラノーマの腫瘍系１．３６．１．５におけるＥ１ａの発現を解析した。腫瘍崩壊ＩＣＯＶＩＲ７は、改善Ｅ２Ｆ１プロモーターを有することによってＩＣＯＶＩＲ５から区別される。結果を、本発明の図７に示す。ＩＣＯＶＩＲ７におけるＥ１ａの発現レベルは高く、これは、ＩＣＯＶＩＲ７におけるＥ２Ｆへの結合のための２つの追加部位の増強された役割を証明する。更に、Ｅ１ａの追加はＩＣＯＶＩＲ２よりもＩＣＯＶＩＲ５で多く、これは、ＭＤで隔離されるプロモーターの能力の増強におけるコザック配列の効果を再度証明する。

（実施例５）
（ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されたＥ１ａ、及びＥ１ａ翻訳の開始点におけるコザック配列を含むアデノウイルスは、腫瘍を効率的に治療するために用いることができる。）
実験は、ＮＰ９腫瘍を含むＢａｌｂ／ｃストックの無胸腺ラットを用いてｉｎｖｉｖｏで実施した。ＳＫＭｅｌ−２８系由来の合計１．２×１０^７細胞を、ラットの各背部に皮下注射した。１５日後、腫瘍を形成した（７０〜８０ｍｍ^３に到達）ラットを異なる実験群（ｎ＝１０／群）に分けた。コントロール群の腫瘍は、生理食塩水バッファー（２×１０μＬ）の腫瘍内投与を受けた。ｉｃｏｖｉｒ５で処置される群のラットは、ｉｃｏｖｉｒ５（腫瘍あたり１０^９ウイルス粒子）の腫瘍内投与（２×１０μＬ）を受けた。腫瘍を毎日測定し、その容量を以下の式：Ｖ（ｍｍ^３）＝Ａ（ｍｍ）×Ｂ^２（ｍｍ^２）×π／６（Ｂは横軸の長さ）に従って評価した。図８は、処置開始時（０日）と比較した腫瘍体積を示す。結果は平均±ＳＤとして表わす。結果間の有意な相違の存在は、不対データのノンパラメトリックなマン・ホイットニーの検定を用いて計算した。増殖曲線を、分散分析を用いて比較した。結果は、ｐ＜０．０５で有意とした。計算は、統計的パッケージＳＰＳＳ（ＳＰＳＳＩｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて実施した。１６日及び２１日の腫瘍サイズに有意な相違が見られる。

他の実験において処置は、ＩＣＯＶＩＲ５の全身注射によって実施した。ヒトメラノーマＳＫＭｅｌ−２８（１．１０^７細胞／腫瘍）の細胞系の腫瘍を、Ｂａｌｂ／Ｃｎｕ／ｎｕ無胸腺ラットに移植し、いったん定着させ、尾静脈への、ＰＢＳ、０日に２．５．１０^１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、又は１．１０^１１個のｖｐの単回投与、又は３．１０^１０ｖｐ及び１時間あけて１．１０^１１のＩＣＯＶＩＲ５の投与により処置した。結果を、本発明の図８の下の部分に示す。ＩＣＯＶＩＲ５を用いた全ての治療計画は、コントロール群（ＰＢＳ）と比べて有意に異なる腫瘍増殖の抑制をもたらす腫瘍崩壊活性を示した（ｐ＜０．０５）。１．１０^１１のｖｐの注入前の３．１０^１０ｖｐの前投与によりこの治療計画歯は、他のモデルよりも有意に効果的となった（ｐ＜０．０５）。ＯＣＴ中で凍結させた腫瘍の種々の切片をα−ヘキソン抗体（アデノウイルスキャプシド由来のタンパク質）で、４’，６’−ジアミニジン−２−フェニルインドールを用いて対比染色した。ＩＣＯＶＩＲ−５の抗腫瘍活性は腫瘍中のアデノウイルスの複製に対応し、注入後２２日において得られる腫瘍によって評価した。ＩＣＯＶＩＲ−５で処置した全ての群の試料は、腫瘍壊死領域に局在するアデノウイルスに陽性である。

（実施例６）
（ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、Ｅ１ａの翻訳開始点におけるコザック配列を含むアデノウイルスを用いる場合に、アデノウイルスの全身投与に関連する毒性は減少する。）
Ｅ１ａ中にコザック配列、及びＭＤにより隔離されるＥ２Ｆ１プロモーターを含むアデノウイルス（ＩＣＯＶＩＲ５）のｉｎｖｉｖｏ毒性を、サルベージウイルス、サルベージプロモーターの下でＥ１ａを発現する腫瘍崩壊ウイルスＡｄＤ２４ＲＧＤの毒性と比較した。ウイルスを、種々の濃度及び注入の５日後に静脈投与し、動物の生存、体重、血清トランスアミナーゼのレベル、及び血球数等の毒性に関連するパラメーターを評価した。結果を、本発明の図９に示す。免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃラット中でのＡｄｗｔＲＧＤ又はＡｄΔ２４ＲＧＤについての致死量５０値（ＬＤ_５０）は、注入の５日後に５．１０^１０ウイルス粒子（ｖｐ）／ラットであるが、２倍の濃度（１．１０^１１ｖｐ／ラット）はＩＣＯＶＩＲ−５を注入したラットの１０％のみに致死である（ＬＤ_１０）。５．１０^１０ｖｐのＡｄｗｔＲＧＤ又はＡｄΔ２４ＲＧＤを注入したラットは、注入５日後に有意な体重減少を経験したが、ＩＣＯＶＩＲ−５を注入したラットの体重は増加した。同時に、注入５日後の血漿中の肝臓トランスアミナーゼの測定（平均値±ＳＤ；ｎ＝５〜１０／群）は、同じ投与量で明らかに肝臓毒性が少ないＩＣＯＶＩＲ−５と有意な相違をも示した。５日目のラットの血液プロフィールは、５．１０^１０ｖｐのＩＣＯＶＩＲ−５の投与が血球数に有意な変化を与えず、同量のＡｄｗｔＲＧＤ投与と関連する有意な血小板減少症の再現がないことを示した。注入の５日後に得られる凍結切片中の免疫検出によるラットの肝臓中のアデノウイルスタンパク質Ｅ１Ａの発現の解析は、ＩＣＯＶＩＲ−５中のＥ２Ｆ−１プロモーターの隔離バージョンの存在が、投与量を増加した場合でさえ、ウイルスタンパク質の発現を制限するのに効果的であることを示す（図１０）。注入３日後の肝臓のパラフィン中の切片のヘマトキシリン／エオシンを用いた染色による組織学的評価も、ＩＣＯＶＩＲ−５の低い毒性を裏付けた（図１０）。従って、５．１０^１０ｖｐのＡｄｗｔＲＧＤ又はＡｄΔ２４ＲＧＤを受けたラットの肝臓は、劇症肝炎（マクロな脂肪変性、好酸体の欠如、及び壊死点の存在）の明らかな症状を示し、ＩＣＯＶＩＲ−５を注入された動物は、ほとんどの外部領域に最低限の好酸体を示すのみの、実用的に正常な表現形の肝臓を有している。

アデノウイルス遺伝子、及び同様のアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化する配列を制御する、選択的発現のプロモーターを分離する筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座の配列を含むことによって特徴づけられる、腫瘍における選択的複製アデノウイルスの構造。Ｉｃｏｖｉｒ２は、Ｅ１ａを制御するヒトＥ２Ｆ１プロモーターを分離する筋緊張性ジストロフィー（ＭＤ）の遺伝子座の配列を含む。Ｉｃｏｖｉｒ５は、その翻訳を最適化し、それによって腫瘍細胞中のＥ１ａの発現レベルを上げるための、Ｅ１ａの翻訳開始点においてコザック配列も含む。Ｉｃｏｖｉｒ７は、Ｅ２Ｆ１プロモーターとＥ２Ｆとの結合の追加のスタイルも表わす。Ｅ１ａを制御するＥ２Ｆ１プロモーターを分離する筋緊張性ジストロフィーの遺伝子座のＭＤ配列を含む腫瘍崩壊アデノウイルスの機能図。Ｅ１ａは、タンパク質翻訳を最適化する配列を含む。Ｅ２Ｆ１プロモーターは、その選択性及び効力を上げるためのＥ２Ｆに結合する追加の部位の挿入によって改善することができる。正常細胞において、ｐＲｂ−Ｅ２Ｆ複合体は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の作用によってＥ２Ｆ１プロモーターのリプレッサーとして作用し、Ｅ１ａは発現されない。腫瘍細胞において、ｐＲｂは過剰リン酸化されているか又は存在せず、Ｅ２Ｆはフリーであることがわかる。この形態において、それはＥ１ａの転写活性化因子として作用する。Ｅ１ａにおけるコザック配列は、Ｅ１ａの正常なレベルの発現を可能にする。分離ＭＤは、改善Ｅ２Ｆ１プロモーター内での、ＩＴＲとアデノウイルスパッケージングシグナルの干渉を防止する。Ｅ２Ｆ１プロモーターの前のＭＤ分離配列の挿入に起因するＥ１ａの発現における効果の証明。示される各細胞タイプは、示されるウイルスで感染した。２４時間後、細胞を溶解し、Ｅ１ａをウェスタンブロットにより検出した。Ｅ２Ｆ１プロモーター（ＩＣＯＶＩＲ１）の存在は、正常細胞においてＥ１ａの発現を減少させることができる。しかし、ＭＤ配列が、Ｅ２Ｆプロモーター（ＩＣＯＶＩＲ２）によりＥ１ａの発現のより優れた制御を付与することが観察された。腫瘍細胞において、ＩＣＯＶＩＲ１及びＩＣＯＶＩＲ２は両方ともＥ１ａを発現することができるが、Ｆａｄｕ、ＳＣＣ２５、及びＳＫＭｅｌ−２８においてＥ１ａの発現は、Ｅ１ａがＥ２Ｆ１によって制御されないアデノウイルスで得られるよりも少ない。これは、ＭＤと共に分離されているかどうかに関係なく、Ｅ２Ｆ１のプロモーターが、サルベージアデノウイルスと比較して腫瘍細胞におけるＥ１ａの発現レベルを上げるのに必要な力を有していないことを示す。本発明は、Ｅ１ａ中でのコザック配列の挿入、及びＥ２Ｆ１プロモーターの改善によりこの問題を解決する。ＭＤは、Ｅ１ａがＥ２Ｆ１プロモーターと共に制御されている状態で、腫瘍崩壊アデノウイルスの抗腫瘍選択性が上昇することを可能にする。Ｅ２Ｆ１プロモーターがＭＤ配列で隔離されている状態でＥ１ａが制御されている腫瘍崩壊アデノウイルスが、腫瘍細胞内で選択的に複製されることを証明するため、細胞をＩＣＯＶＩＲ１及びＩＣＯＶＩＲ２で感染させた。感染の５日後、細胞及び培地を集め、ウイルスを遊離させるため、凍結融解を３サイクル繰り返した。細胞抽出物中のウイルスは、ＨＥＫ２９３中での感染、及びモノクローナル抗体２Ｈｘ−２（ＡＴＣＣ）及び二次抗体、ラットのＡｌｅｘａ４８８抗ＩｇＧ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いた抗ヘキソン染色によって定量化した。ＩＣＯＶＩＲ２におけるＭＤ分離配列の存在により、非分離型Ｅ２Ｆ１プロモーターを有するＩＣＯＶＩＲ１と比較して、正常細胞におけるウイルス複製が減少した。大部分の腫瘍株においてその複製能力は、ＡｄｗｔＲＧＤの複製能力よりも低いことに注意すべきである。本発明は、Ｅ１ａ中にコザック配列を挿入し、Ｅ２Ｆ１プロモーターを改善することによって、この複製能力を高める方法を開示する。ＭＤを有する分離プロモーターの能力を増強するための、コザック配列挿入の効果。図の左側に示す、各細胞タイプを、図の上部に示すウイルスで感染させた。２４時間後、細胞を溶解し、Ｅ１ａをウェスタンブロットにより検出した。ＩＣＯＶＩＲ５は、Ｅ１ａ翻訳の開始点においてコザック配列を含むことによって、ＩＣＯＶＩＲ２から区別される。結果、正常細胞においてＩＣＯＶＩＲ５は、ＭＤによって分離されたＥ２Ｆプロモーターが存在することによって、Ｅ１ａを発現しない。腫瘍細胞におけるＥ１ａの発現レベルは、ＩＣＯＶＩＲ２よりもＩＣＯＶＩＲ５において高く、これは、ＭＤで分離されたプロモーターの能力を増強させるコザック配列の効果を証明する。ＭＤ配列で分離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、及びＥ１ａの翻訳を最適化するコザック配列を含むアデノウイルスのｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍崩壊効果。Ｅ１ａ中のコザック配列、及びＭＤ（ＩＣＯＶＩＲ５）によって分離されたＥ２Ｆ１プロモーターを含むアデノウイルスの腫瘍細胞における細胞溶解能を、サルベージウイルス、及び同じであるが、コザック配列を有しない腫瘍崩壊ウイルス（ＩＣＯＶＩＲ２）の能力と比較した。ウイルスが引き起こす細胞変性効果（ＣＥ）を、感染細胞単層におけるタンパク質の量（ＢＣＡ法^３３）の減少として測定した。細胞を、９６カップのプレートに、カップあたり３０，０００細胞となるように播種した。次の日に、細胞あたり１０００プレート形成単位の濃度まで、ウイルスの連続希釈液で細胞を感染させた。感染細胞を５日間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、カップ中に残留したタンパク質の量を測定した。全体として、結果は、ＩＣＯＶＩＲ５がＩＣＯＶＩＲ２よりも優れた溶解能力を有することを示し、これは、コザック配列によって付与される増強効果を証明する。ＭＤ配列で分離した場合の、効力を上げるＥ２Ｆ１プロモーターの改善の効果。腫瘍崩壊アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ７は、改善されたＥ２Ｆ１プロモーターを有することによって、ＩＣＯＶＩＲ５と区別される。図面の上部において、解析は、ウェスタンブロットによるメラノーマの腫瘍株１．３６．１．５におけるＥ１ａの発現を示す。Ｅ１ａの発現レベルはＩＣＯＶＩＲ５よりもＩＣＯＶＩＲ７において高く、これは、ＩＣＯＶＩＲ７におけるＥ２Ｆに結合する追加の部位の増強的役割を証明する。以下に、腫瘍株１．３６．１．５におけるＩＣＯＶＩＲ７、ＩＣＯＶＩＲ５及びＩＣＯＶＩＲ２のウイルス生産レベルを示す。最大生産コントロールとして、Ｅ１ａが制御されていないＡｄｗｔＲＧＤウイルスを用いた。ＩＣＯＶＩＲ７は、コントロールＡｄｓｔＲＧＤとして同等の能力で、それ自身増殖することができる。ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されたＥ１ａ、及びＥ１ａ翻訳の開始点にコザック配列を含むアデノウイルスを、腫瘍の治療に用いることができる。図の上部に、ＮＰ９腫瘍を含むＢａｌｂ／ｃストックの無胸腺ラットを用いたｉｎｖｉｖｏ実験を示す。合計１．２×１０^７個の腫瘍細胞を、ラットの各背面に皮下注射した。１５日後、形成された腫瘍（７０〜８０ｍｍ^３に到達）を種々の実験群に分配した（ｎ＝１０／群）。腫瘍を、ＰＢＳ（|）又はＩＣＯＶＩＲ−２（？）又はＡｄｗｔＲＧＤ（）の１０^９個のウイルス粒子を用いて注射した。グラフは腫瘍体積の進行を示す。ＩＣＯＶＩＲ２は腫瘍の増殖を阻害することができる。写真は、ＰＢＳで処置された腫瘍と比較し、ＩＣＯＶＩＲ−２で処置された腫瘍中のウイルスの存在を示す。下図に、メラノーマＳＫＭｅｌ−２８腫瘍を有するラットのＩＣＯＶＩＲ５を用いた、全身性静脈注射による処置を示す。処置：ＰＢＳ（■）。２５．１０^１０のウイルス粒子（ｖｐ）のＩＣＯＶＩＲ−５の０日における注射（▲）。１．１０^１１ｖｐのＩＣＯＶＩＲ−５の０日における注射（◆）。３．１０^１０ｖｐ、及び１時間あけて１．１０^１１ｖｐの０日における注射（●）。平均の腫瘍増殖は８〜１０腫瘍／群±ＳＤである。ＩＣＯＶＩＲ−５を用いた全ての治療プログラムは、コントロール群（ＰＢＳ）とは有意に異なる腫瘍増殖の抑制をもたらす腫瘍崩壊活性を示した（ｐ＜０．０５）。写真は、ＩＣＯＶＩＲ５で処置された腫瘍内のウイルスの存在を示す。ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されたＥ１ａ、及びＥ１ａ翻訳を最適化するコザック配列を含むアデノウイルスを静脈注射した後の毒性の減少のｉｎｖｉｖｏでの証明。ＭＤによって隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターのＥ１ａ中のコザック配列を含むアデノウイルス（ＩＣＯＶＩＲ５）のｉｎｖｉｖｏ毒性を、サルベージウイルス、及びサルベージプロモーターの下でＥ１ａを発現する腫瘍崩壊ウイルスＡｄＤ２４ＲＧＤの毒性と比較した。ウイルスを、Ｂａｌｂ／ｃ免疫応答ラットに、種々の濃度（１０^１０、５×１０^１０及び１０^１１）で静脈注射した。注射の３日後、動物−生存毒性（ａｎｉｍａｌ−ｓｕｒｖｉｖａｌｔｏｘｉｃｉｔｙ）（５０％致死濃度）、体重、血清トランスアミナーゼ濃度、及び血球数と関連するパラメーターの評価を行った。ＩＣＯＶＩＲ５の投与に関連する毒性は、最高濃度でも低い。ＭＤ配列で隔離されたＥ２Ｆ１プロモーターで制御されるＥ１ａ、及びＥ１ａ翻訳を最適化するコザック配列を含むアデノウイルスを静脈注射した後の非腫瘍組織におけるＥ１ａ発現、及び毒性の減少のｉｎｖｉｖｏでの証明。示されるウイルスを、図９に示すようにして投与した。注射の３日後、Ｅ１ａの発現を、免疫組織化学によって肝臓切片内で評価した（下段のパネル）。ＩＣＯＶＩＲ５を注射した動物ではＥ１ａは検出されない。エオシン−ヘマトキシリンで染色した肝臓切片の解剖病理学的評価では、ＩＣＯＶＩＲ５を注射したラットの肝臓は正常な外観を示した（下段のパネル）。

Claims

アデノウイルス遺伝子に選択的発現を付与するプロモーターにおいて、ヒトＤＮＡを隔離する配列を含むことを特徴とする、癌を治療するための腫瘍崩壊アデノウイルス。
前記ヒトＤＮＡ配列が、筋緊張性ジストロフィー遺伝子座に由来する配列であることを特徴とする、請求項１記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
前記アデノウイルスが、腫瘍選択性を付与するプロモーターによって制御されるアデノウイルス遺伝子のタンパク質翻訳を最適化するコザック配列を含むことを特徴とする、請求項１〜２のいずれかに記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
腫瘍において選択的複製を得るためのＥ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ４群のうちの１種以上の遺伝子中に変異を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
感染力を上昇させるためか又は腫瘍細胞内に存在する受容体に指向させるための変化をキャプシド中に含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
プロドラッグ活性化因子、腫瘍抑制因子又は免疫賦活剤として癌の遺伝子療法の分野において通常に用いられる他の遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
前記アデノウイルスが、血清タイプ１〜５０に由来するヒトアデノウイルスであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
前記アデノウイルスが、ヒトアデノウイルス血清型５であることを特徴とする、請求項７記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
前記腫瘍選択性を付与するプロモーターが、Ｅ２Ｆ１ヒト遺伝子のプロモーターであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
前記腫瘍選択性を付与するプロモーターが、Ｅ２Ｆへの追加の結合部位の挿入によって修飾されるＥ２Ｆ１プロモーターであることを特徴とする、請求項９記載の腫瘍崩壊アデノウイルス。
請求項１〜１０のいずれかに記載の有効量の腫瘍崩壊アデノウイルス、及び１種以上の担体又は薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
癌又はその前癌状態の治療又は予防のための薬剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の腫瘍崩壊アデノウイルスの使用。