CN101484583A - 用于癌症治疗的溶瘤腺病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的溶瘤腺病毒，其含有隔开启动子的人DNA序列，所述启动子赋予腺病毒基因以选择性表达。所述腺病毒还可含有优化赋予肿瘤选择性的启动子所调节之腺病毒基因的蛋白质表达的序列。本发明适用于治疗癌症。

Description

用于癌症治疗的溶瘤腺病毒
技术领域
本发明的领域主要涉及肿瘤生物学领域。特别地，本发明涉及在肿瘤中选择性复制的腺病毒(称为溶瘤腺病毒，oncolytic adenovirus)及其用于抑制癌症的用途。
背景技术
癌症的现有治疗方法主要是基于化学疗法、放射疗法和手术。尽管早期癌症有很高的治愈率，但是大部分的晚期癌症病例是无法治愈的，因为它们不能通过手术移除，或者因为由于放射疗法或化学疗法对正常细胞的毒性而使其施用剂量受到限制。为了减轻这一状况，人们已经开发了寻求提高癌症治疗的功效和选择性的生物技术。其中，基因疗法和病毒疗法使用病毒来治疗癌症。在基因疗法中，对病毒进行修饰，以防止其复制，并使其作为治疗性遗传材料的媒介或载体。另一方面，病毒疗法使用在肿瘤细胞中选择性复制和增殖的病毒1。在病毒疗法中，肿瘤细胞由于细胞病变效应而死亡，与治疗性基因的作用相比，所述效应更大程度上是由于病毒的内部复制所致。肿瘤细胞中的偏好性复制被称为肿瘤向性(oncotropism)，肿瘤的溶解被称为溶瘤作用(oncolysis)。在肿瘤中选择性复制的病毒被称为溶瘤病毒。
癌症的病毒治疗远早于基因治疗。首先观察到病毒对肿瘤的治疗要追溯到上个世纪前期。在1912年，De Pace就观察到在子宫颈癌中接种狂犬病毒后的肿瘤抑制2。从那时起，许多类型的病毒被注射进肿瘤中以对其进行治疗3。存在表现出天然肿瘤向性的病毒，例如自主性细小病毒(autonomous parvovirus)、泡状口炎病毒5和呼肠孤病毒6。可对其它病毒进行遗传操作以实现在肿瘤中的选择性复制。例如，在缺失核糖核苷酸还原酶基因后单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)具有了肿瘤向性，所述酶在活跃增殖的细胞(例如肿瘤细胞)中不是必需的7。但是，考虑到其低致病性和感染肿瘤细胞的高能力，腺病毒是癌症的病毒疗法及基因疗法中最常用的病毒。
5型人腺病毒(Ad5)是由二十面体蛋白衣壳形成的病毒，其中包含36kb的线性DNA8。在成人中，Ad5的感染通常是无症状的，在儿童中，它造成普通感冒和结膜炎。Ad5一般感染上皮细胞，在其天然感染过程中是支气管上皮细胞。它通过尾丝(fiber，像天线一样从衣壳的十二个角伸出的病毒蛋白)与称为柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie-Adenovirus Receptor，CAR)的参与胞间粘附的细胞蛋白之间的相互作用而进入细胞。当病毒DNA到达核内之后，早期病毒基因开始有序转录。首先表达的病毒基因对应于早期1A(E1A)区域的基因。E1A与Rb细胞蛋白结合，Rb细胞蛋白与E2F转录因子形成复合物。这样，E2F被释放，以激活其它病毒基因(例如E2、E3和E4)的转录及激活细胞周期的细胞基因的转录。另外，E1B与p53结合，以激活细胞周期并阻止受感染细胞凋亡。E2编码病毒的复制蛋白，E3编码抑制抗病毒免疫应答的蛋白质，E4编码转运病毒RNA的蛋白质。这些早期基因的表达引起病毒DNA复制，并在复制后激活调节晚期基因或形成衣壳的结构基因表达的启动子。
以下方法已用于构建溶瘤腺病毒：选择在肿瘤细胞中非必需的病毒功能，以及用肿瘤选择性启动子替换病毒启动子1。在两种策略中，意图选择的基因或者常规基因优选属于E1区域，特别是影响E1a，因为它控制其它病毒基因的表达。至于病毒功能的选择，则例如去除了蛋白质E1b-55K。此蛋白质失活p53，以诱导受感染的细胞进入细胞周期的S期，并阻止细胞凋亡。称为Onyx-015的E1b-55K突变的腺病毒已用于治疗缺少p53的肿瘤，尽管由于其低增殖能力或溶瘤效力而很少在临床上成功。为实现在肿瘤中的选择性复制而在腺病毒基因组中进行的另一种突变影响E1a的CR2区。这个E1a区介导与视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma，Rb)家族蛋白的结合。pRb蛋白阻断了细胞周期从G0/G1期向S期的转化，与E2F形成复合转录抑制子。当E1a与pRb结合时，pRb-E2F复合体的E2F转录因子被释放，E2F作为下述基因的转录激活子起作用：负责前进到S期的基因以及病毒基因(例如E2)。因此，E2F的释放是腺病毒复制中的关键步骤。在肿瘤细胞中，细胞周期是失控的，因为pRb不存在或由于过度磷酸化而失活，并且E2F是游离的。在这些细胞中，E1a对pRb的失活不是必需的。因此，在E1a中具有阻止其与pRb结合的突变(称为Delta-24)的腺病毒可以在pRb失活的细胞中正常增殖9，10。
就用肿瘤选择性启动子替换病毒启动子的策略而言，E1a启动子已经用多种启动子进行了替换，例如甲胎蛋白(α-fetoprotein)启动子、前列腺特异性抗原(prostatic-specific antigen，PSA)、激肽释放酶、粘蛋白1(Mucine1)和骨钙蛋白11-15。但是，细胞启动子在病毒背景的应用中发现了一个重要的问题：存在干扰启动子的正确调节并降低选择性的病毒序列16，17。已经尝试了通过调节其它病毒基因和E1a(例如E1b、E2和E4)来修正这种选择性的丧失18，19。可对于每个病毒基因使用不同的启动子来实现对多种病毒基因的调节，例如将E2F1启动子用于E1a并将端粒酶启动子用于E4。
在这种情况下，两个启动子必须以高水平表达以允许病毒复制，从而使得溶瘤效力可在许多肿瘤细胞中保持降低20。或者，两个病毒基因可以被相同的启动子调节，例如在E1a和E4被E2F1启动子调节的溶瘤腺病毒Onyx411中21。但是，已经证明，腺病毒基因组中启动子序列的重复会通过这些重复序列之间的重组而造成基因组不稳定22。这个问题难以解决，因为对E4区域的任何修饰似乎都造成溶瘤腺病毒的基因组不稳定22。另外，腺病毒基因的转录调节是受时序控制的，使得E1a激活其它早期病毒基因的表达。这种调节对于病毒周期是最佳的，如果除E1a以外的病毒基因启动子被肿瘤特异性启动子所替换，那么此调节会丧失。另一方面，由于在末端重复和腺病毒包装信号中具有增强子和局部转录起点，因此当需要调节E1a和E4转录时，病毒序列与用于控制腺病毒复制的特异性启动子之间干扰的问题是特别重要的23-25。在非溶瘤载体的领域中，已经通过在启动子和增强子之间插入来源于鸡B珠蛋白基因HS4基因座的分隔序列而减轻了这种干扰26，27。这种HS4绝缘机制是基于蛋白CTCF联合，其抑制增强子与启动子中所存在因子之间的相互作用28。本发明描述了来源于人基因组的绝缘序列在溶瘤腺病毒背景中的用途。
用于设计溶瘤腺病毒的特别有意义的启动子是E2F1启动子20，21，29，30。此启动子中存在两个E2F结合位点。E2F转录因子家族调节允许细胞周期进入S期的基因转录。这些因子在它们被释放时作为激活子，当它们与pRb视网膜母细胞瘤蛋白结合时作为抑制子31。pRb与E2F的结合受pRb磷酸化的调节，使得pRb的磷酸化阻止了它与E2F的结合。
肿瘤在信号转导途径中发生改变，导致pRb的过磷酸化以及游离E2F的增加。因此，在肿瘤中，基因应答于E2F(例如E2F1基因)而表达。另一方面，在正常静息细胞中，pRb是非磷酸化的并保持与E2F结合，形成发挥转录抑制子作用的复合物。但是，在溶瘤腺病毒中，E2F1启动子对E1a的简单调节导致在肿瘤中低水平的选择性复制，数量级为10倍20。除E1a外还对其他病毒基因的调节可能是这种低选择性的解决方案，但是存在上文所述的问题。例如，OAS403是E1a受E2F1启动子调节且E4受端粒酶启动子调节的溶瘤腺病毒，其另外还包括多聚腺苷酸化信号以消除ITR(inverted terminal repetition，倒置末端重复)的转录，其中包装信号被重置于基因组的最右边以减少对E1a启动子的干扰20。在OAS403的扩增中，已经发现，包装信号和毗邻E4的序列改变了在基因组中的位置22。此外，还报道了甚至E4区中的微小修饰即会导致基因组不稳定性，因此已经放弃了基于E4区修饰的策略22。除了选择性之外，E2F1启动子的另一个问题是缺乏效力。除了选择性不太强之外，E1a受E2F1启动子调节的溶瘤腺病毒丧失其补救腺病毒(salvage adenovirus)方面的裂解效力，如Ryan等20以及本发明实施例中所示。
本发明描述了合适的DNA序列用于实现溶瘤腺病毒基因组启动子正确功能的用途。使用这些序列设计了表现出更高选择性和抗肿瘤能力的溶瘤腺病毒。本发明所述元件的用途允许仅使用肿瘤特异性启动子就实现高肿瘤选择性和溶瘤能力。单启动子的使用降低了与腺病毒基因组中相同启动子重复相关的基因组不稳定的问题。另外，仅受E1a调节而避免其它病毒基因的调节，这样允许对腺病毒基因进行正确的时序调节，防止了与E4区域修饰相关的基因组不稳定性。
发明内容
本发明涉及用于癌症治疗的溶瘤腺病毒，其含有分隔启动子的人DNA序列，所述启动子赋予腺病毒基因以选择性表达。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明还涉及溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含优化腺病毒基因的蛋白质翻译的序列，所述腺病毒基因受赋予肿瘤选择性的启动子调节。特别地，此序列是kozak序列。
本发明的另一个目的是用于癌症治疗的溶瘤腺病毒，其含有分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的人DNA序列，以及优化同一腺病毒基因的蛋白质翻译的序列。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的又一个目的是腺病毒，其含有分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的人DNA序列，以及优化同一腺病毒基因的蛋白质翻译的序列，并且所述腺病毒在E1a、E1b和E4组的一个或多个基因中具有突变，以实现在肿瘤中的选择性复制。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的又一个目的是溶瘤腺病毒，其含有分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的人DNA序列，以及优化同一腺病毒基因的蛋白质翻译的序列，并在衣壳中含有提高感染性或将其引导至肿瘤细胞中所存在受体的修饰。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的又一个目的是溶瘤腺病毒，其含有分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的人DNA序列，以及优化同一腺病毒基因的蛋白质翻译的序列，并且继而还含有通常用于癌症基因疗法领域中的其它一些基因，如前药激活剂、肿瘤抑制剂或免疫激活剂。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的又一个目的是溶瘤腺病毒，其含有分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的人DNA序列，以及优化同一腺病毒基因的蛋白质翻译的序列，其中所述腺病毒是来源于血清型1-50的人腺病毒。特别地，所述腺病毒是人腺病毒血清型5。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的又一个目的是溶瘤腺病毒，其含有分隔通过加入与E2F结合的位点来调节腺病毒基因表达的经修饰人E2F1基因的启动子的人DNA序列以及优化同一基因的蛋白质翻译的序列。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的又一个目的是包含有效量的溶瘤腺病毒和一种或多种可药用载体或赋形剂的药物组合物，所述溶瘤腺病毒含有分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的人DNA序列，以及优化同一腺病毒基因的蛋白质翻译的序列。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的又一个目的是溶瘤腺病毒在制备用于治疗或预防癌症或其癌前病症的药物中的用途，所述溶瘤腺病毒含有分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的人DNA序列以及优化同一腺病毒基因的蛋白质翻译的序列。特别地，所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
本发明的腺病毒可任选地与其它癌症治疗方法例如化学疗法或放射疗法相组合。
本发明描述了溶瘤腺病毒，其含有人DNA序列(特别是来源于强直性肌营养不良基因座的序列)作为分隔调节腺病毒基因的选择性表达启动子的序列，还含有优化相同腺病毒基因的蛋白质翻译的序列，还描述了所述溶瘤腺病毒用于治疗或预防癌症或其癌前病症的用途。之前已经描述了来源于鸡B珠蛋白的分隔序列在腺病毒载体中的用途26，27。与本发明中不同的是，之前描述的分隔子不是人类来源的，并且没有用于溶瘤腺病毒情形中。强直性肌营养不良基因座位于人13号染色体的19q13.3位置。此基因座含有两个CTCF蛋白结合位点以及数目依各个个体而可变的CTG重复，其共同作为增强子或激活子对启动子作用的高效隔离子32。在本发明之前，从未在病毒基因组中分析过它的活性。它在病毒基因组中的活性不是显而易见的，因为其活性仅在相关组蛋白可在其功能中起作用的细胞染色体情形中得到过证明。其人类来源为鸡HS4序列提供了更好的替代方案，因为非人来源序列的转移可产生生物安全性问题。
另外，本发明描述了对蛋白质翻译进行了优化的序列用于提高受肿瘤特异性启动子调节的腺病毒蛋白的产生水平的用途。用肿瘤选择性启动子调节病毒基因表达存在表达水平通常低于在Ad5中观察到的表达水平的问题。这种较低的表达导致溶瘤腺病毒的复制能力较低。在选择性启动子所调节基因的翻译起点处插入kozak序列能够恢复所调节基因的表达水平。
本发明还描述了在E2F1人启动子序列中增加结合E2F的位点数从而更好地控制溶瘤腺病毒中E1a的表达的策略。这种结合E2F的位点的增加导致在肿瘤细胞中更高的E1a表达以及在正常细胞中更低的E1a表达，这导致肿瘤选择性和腺病毒复制的提高。
本发明针对于寻找更好的癌症治疗方法的需求，所述癌症包括但不限于胰腺、结肠和肺的癌症。可以使用在用腺病毒进行基因疗法和病毒疗法的领域中的标准方法，通过直接注射到肿瘤内部或通过在癌症患者体内全身性静脉注射来使用含有人DNA序列和优化蛋白质翻译的序列的溶瘤腺病毒治疗癌症。
附图说明
本发明中包括的附图目的在于使本发明的特征、优点和结构更为清晰，并对其更详细地进行理解。这些附图构成说明书的一部分并且展示一些优选发明，但是不应认为限制本发明的范围。
图1.肿瘤中选择性复制腺病毒的结构，其特征是含有分隔调节腺病毒基因之选择性表达启动子的强直性肌营养不良基因座序列以及优化同一腺病毒基因蛋白质表达的序列。Icovir2含有强直性肌营养不良(myotonic dystrophy，MD或DM)基因座序列，其分隔调节E1a的人E2F1启动子。Icovir5还在E1a翻译起点处含有kozak序列，以优化其翻译，从而提高E1a在肿瘤细胞中的表达水平。Icovir7还存在E2F1启动子与E2F结合的两种其他形式。
图2.含有强直性肌营养不良基因座MD序列的溶瘤腺病毒功能示意图，所述MD序列分隔了调节E1a的E2F1启动子。E1a含有优化蛋白质翻译的序列。可通过插入另外的E2F结合位点来修饰E2F1启动子，以增加其选择性和效力。在正常细胞中，pRb-E2F复合物通过组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)的作用发挥E2F1启动子的阻遏物作用，E1a不表达。在肿瘤细胞中，pRb是过磷酸化的或者不存在，E2F是游离的。在此形式中，它作为E1a的转录激活剂起作用。E1a中的kozak序列允许E1a的正确表达水平。分隔性MD在经修饰的E2F1启动子中防止了ITR和腺病毒包装信号的干扰。
图3.证明对E1a表达的影响是由于在E2F1启动子前插入了MD分隔序列。
所示每种细胞类型由所示的病毒所感染。24小时后，裂解细胞，通过western印迹检测E1a。E2F1启动子(ICOVIR1)的存在能够降低正常细胞中E1a的表达。但是，观察到MD序列使得E2F启动子(ICOVIR2)更好地控制E1a的表达。在肿瘤细胞中，ICOVIR1和ICOVIR2都能够表达E1a，但是在Fadu、SCC25和SKMel-28中，E1a的表达小于使用其中E1a不受E2F1调节的腺病毒所得到的表达。这表明，不论是否用MD隔开，E2F1启动子都没有使肿瘤细胞中E1a的表达水平与补救腺病毒相当的必要能力。本发明通过在E1a中插入kozak序列和修饰E2F1启动子解决了此问题。
图4.MD序列使得带有受E2F1启动子调节之E1a的溶瘤腺病毒的抗肿瘤选择性提高。
为了证明带有受由MD序列分隔开的E2F1启动子调节之E1a的溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中选择性复制，用ICOVIR1和ICOVIR2感染所述细胞。感染五天后，收集所述细胞及其培养基，使之冻融三次以释放病毒。通过以下步骤来测定细胞提取物中的病毒量：感染HEK293，并用单克隆抗体2Hx-2(ATCC)和二抗——大鼠Alexa488抗IgG(Molecular Probes，Eugene，OR)进行抗六邻体染色。ICOVIR2中MD分隔序列的存在使得在正常细胞中的病毒复制低于具有未分隔E2F1启动子的ICOVIR1。需要注意的是，在大多数肿瘤系中，它的复制能力低于AdwtRGD。本发明描述了通过在E1a中插入kozak序列以及修饰E2F1启动子来提高复制能力的方法。
图5.插入kozak序列提高具有MD之分隔启动子的能力的效果。
用图上部所示的病毒感染图左边所示的每种细胞类型。24小时后，裂解细胞并通过western印迹检测E1a。ICOVIR5与ICOVIR2的区别在于前者在E1a翻译起点处含有kozak序列。结果显示，在正常细胞中，ICOVIR5由于存在被MD隔开的E2F启动子而不表达E1a。在肿瘤细胞中，ICOVIR5中E1a的表达水平高于ICOVIR2，这证明了kozak序列在提高被MD隔开的启动子效力方面的效果。
图6.腺病毒的体外溶瘤效力，所述腺病毒含有受由MD序列分隔开之E2F1启动子所调节的E1a，以及优化E1a翻译的kozak序列。
将含有E1a中kozak序列和由MD分隔的E2F1启动子的腺病毒(ICOVIR5)在肿瘤细胞中的溶胞效力与补救病毒以及相似但不含kozak序列的溶瘤病毒(ICOVIR2)进行比较。病毒造成的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)以受感染细胞单层中蛋白量的降低来进行衡量(BCA方法33)。将细胞接种于96孔板，每孔30000个细胞。第二天，用高至1000空斑形成单位/细胞的连续稀释病毒感染所述细胞。孵育受感染的细胞5天，用PBS洗涤，检测孔中剩余蛋白质的量。整体来看，结果显示ICOVIR5具有比ICOVIR2更强的裂解能力，这证明了kozak序列所赋予的增强效应。
图7.当被MD序列隔开时E2F1启动子修饰提高其效力的效果
溶瘤腺病毒ICOVIR7与ICOVIR5的区别在于具有经修饰的E2F1启动子。在图的上半部分中，显示了通过western印迹对黑素瘤肿瘤细胞系1.36.1.5中E1a表达的分析。ICOVIR7中E1a的表达水平高于ICOVIR5，这证明了在ICOVIR7中其它结合E2F的位点的增强作用。下方显示了肿瘤细胞系1.36.1.5中ICOVIR7、ICOVIR5和ICOVIR2的病毒产生水平。使用E1a不受调节的AdwtRGD病毒作为最大产生对照。ICOVIR7能够自我增殖，其具有与对照AdwtRGD相同的效力。
图8.含有受由MD序列隔开的E2F1启动子调节的E1a以及位于E1a翻译起点处的kozak序列的腺病毒可用于治疗肿瘤。
图上部显示带有NP9肿瘤的Balb/c株无胸腺大鼠的体内实验。在所述大鼠背面每侧皮下注射总共1.2×107个肿瘤细胞。15天后，将形成的肿瘤(达到70-80立方毫米)分配到不同的实验组(每组n＝10)。用PBS(？)或109个ICOVIR-2(？)或AdwtRGD(
Figure A200780009189D0012101912QIETU
)病毒颗粒注射肿瘤。图显示肿瘤体积的发展。ICOVIR2能够抑制肿瘤生长。照片显示，与用PBS处理相比，用ICOVIR-2处理的肿瘤中存在病毒。下部显示使用ICOVIR5对带有黑素瘤SKMel-28肿瘤的大鼠进行全身性静脉内处理。处理：PBS(■)。第0天注射25×1010个ICOVIR-5病毒颗粒(virus particle，vp)(▲)。第0天注射1×1011个ICOVIR-5vp(◆)。第0天注射3×1010个vp以及相隔1小时再注射1×1011vp(●)。平均肿瘤生长为8-10个肿瘤/组±SD。所有ICOVIR-5的处理方案均显示了溶瘤活性，其导致了明显不同于对照组(PBS)(p<0.05)的肿瘤生长抑制。照片显示在用ICOVIR5处理的肿瘤中存在病毒。
图9.静脉内注射腺病毒后毒性降低的体内证明，所述腺病毒含有受由MD序列分隔的E2F1启动子所调节的E1a以及优化E1a翻译的kozak序列。
将在受由MD隔开的E2F1启动子所调节的E1a中含有kozak序列的腺病毒(ICOVIR5)的体内毒性与补救病毒和在补救启动子控制下表达E1a的溶瘤病毒AdD24RGD进行比较。以不同剂量(1010、5×1010和1011)在Balb/c有免疫能力大鼠静脉内施用所述病毒。注射后三天，评估与动物存活毒性(致死剂量50)、体重、血清转氨酶水平和血液计数相关的参数。与施用ICOVIR5相关的毒性即使在最高剂量下也低得多。
图10.静脉内注射腺病毒后非肿瘤组织中E1a表达和毒性降低的体内证明，所述腺病毒含有受由MD序列分隔的E2F1启动子所调节的E1a以及优化E1a翻译的kozak序列。
如图9中所述施用所示病毒。注射3天后，通过免疫组化评估肝切片中的E1a表达(上图)。在用ICOVIR5注射的动物中未检测到E1a。用苏木精-伊红染色的肝切片解剖生理学评估表明，注射了ICOVIR5的大鼠肝表观正常(下图)。
发明详述
A.含有受被MD序列所隔开的E2F1启动子调节的E1a、优化E1a翻译的kozak序列以及E2F1启动子中另外的E2F结合位点的腺病毒结构。
本发明描述了含有受被MD序列所隔开的E2F1启动子调节的E1a、优化E1a翻译的kozak序列以及E2F1启动子中另外的E2F结合位点的腺病毒在癌症治疗中的用途。所述治疗是基于这些病毒在具有改变的视网膜母细胞瘤途径的肿瘤中的选择性复制。
视网膜母细胞瘤途径是从细胞膜至细胞核的蛋白质相互作用组，用于调节视网膜母细胞瘤pRb蛋白的磷酸化水平。癌症的特征是此途径发生改变，使得pRb蛋白过磷酸化或丧失。这种pRb改变造成在肿瘤细胞核中pRb与E2F转录因子结合的丧失以及游离E2F的增加。此转录因子通过特异性E2F结合位点与启动子(如E2F1启动子)结合，以提高其表达。
含有受被MD序列所隔开的E2F1启动子所调节的E1a、位于E1a翻译起点的kozak序列以及E2F1启动子中另外的E2F结合位点的腺病毒在肿瘤中的选择性复制机制是基于以下想法并示于图2：肿瘤中游离E2F的存在激活此病毒中E2F1启动子的表达。MD序列的存在使得所述启动子能够正确激活。kozak序列的存在使得可以合成足以维持所述溶瘤病毒适当的复制及裂解能力的E1a量。同样地，E2F1启动子中另外的E2F结合位点的存在使得E1a表达水平提高，以维持溶瘤病毒的适当的复制及裂解能力。
来源于强直性肌营养不良基因座的MD分隔性人序列由SEQ.ID1表示(从序列1的368位到1096位)。MD序列的特征是含有CTCF因子的结合位点以及可变数量的CGT序列重复，其共同发挥转录干扰的有效隔离物的功能32。在本发明中，所述MD序列用于隔离位于E1a启动子附近的腺病毒包装序列中的增强子的作用。E1a启动子被肿瘤选择性启动子(例如E2F1启动子)替换，并且为了将此启动子与腺病毒包装序列中存在的增强子隔离，将MD序列插入到所述包装序列和E2F1启动子之间。E2F1启动子序列在SEQ.ID1中显示(序列1的1283位至1564位)。此启动子的特征是存在两个以不完全回文形式排布的E2F结合位点以及4个Sp1结合位点34。在本发明中，通过在人补救启动子(SEQ ID 3的1321位至1447位)中已存在的E2F结合序列之前插入另外的E2F结合序列来修饰E2F启动子序列。这使得正常细胞中的转录抑制和肿瘤细胞中的转录激活都得到提高。可通过在第一个翻译的ATG密码子之前插入序列CCA/GCC来优化真核细胞核糖体的ARNm翻译35。此序列是由Marylin Kozak所鉴定的，并命名为kozak。在本发明中，此序列用于补偿当被MD序列所隔开的肿瘤选择性启动子例如E2F1启动子用于控制E1a表达时在实验中所观察到的低效力(SEQ ID2的1558位至1562位)。
有多种操作腺病毒基因组的方法。在使用腺病毒的基因疗法和病毒疗法领域，遗传修饰腺病毒构建物的方法是完善的36-41。最常使用的方法是基于以下步骤，首先在含有待修饰腺病毒区域的质粒中构建所需的遗传修饰，然后在细菌中与含有所述病毒基因组的质粒进行同源重组41。此方法可以如下所述：
已经进行了与下列本发明所述用MD序列隔开的E2F1启动子调节E1a表达、插入kozak序列以优化E1a翻译和在E2F1启动子中加入E2F结合位点不同的其它类型遗传突变和操作，以获得肿瘤中的选择性复制1，42-44。它们可以是插入不同于E2F1的其它在肿瘤细胞中有活性并且还可用于控制病毒基因表达的启动子。本发明的一个特征是组合使用这些其它启动子以及MD分隔序列和kozak序列。
已描述的实现肿瘤中选择性复制的另一种修饰是阻断RB途径的早期E1功能的选择。这些突变体的选择性复制已得到证实9，10。其它与pRb直接相互作用的病毒基因(例如E445和E4orf6/746)分别是实现肿瘤细胞中选择性复制的候选缺失。
在本发明的另一个特征中，病毒基因表达受MD序列隔开的选择性启动子调节且由kozak序列增强的腺病毒可含有对其衣壳的修饰，以提高其无效性(inefficacy)或者将其引导至肿瘤细胞中存在的受体。腺病毒衣壳的蛋白质经遗传修饰而包含提高其无效性或者将其介导至肿瘤细胞中受体的配体47-53。使用一侧与所述病毒结合另一侧与肿瘤受体结合的双功能配体也可实现将所述腺病毒引导至肿瘤53-56。另一方面，为了提高腺病毒在血液中的稳定性，并从而提高到达弥散性肿瘤结节的可能性，可用聚合物(例如聚乙二醇)覆盖衣壳57-60。可以在含有受MD序列所隔开E2F1启动子调节的E1a、在E1a翻译起点处的kozak序列和在E2F1启动子中加入的E2F结合位点的腺病毒中构建这些修饰。
本发明的另一个特征是含有受MD序列所隔开E2F1启动子调节的E1a、在E1a翻译起点处的kozak序列和在E2F1启动子中加入的E2F结合位点的腺病毒，但是其来源于除Ad5之外的其它腺病毒血清型。
本发明的另一个特征涉及含有受MD序列所隔开的E2F1启动子调节的E1a、在E1a翻译起点处的kozak序列和在E2F1启动子中加入的E2F结合位点的腺病毒，其还含有提高对肿瘤细胞的细胞毒性的其它基因，例如胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、促凋亡基因、免疫激活剂或肿瘤抑制剂基因。
B.产生、纯化和配制含有受MD序列所隔开的E2F1启动子调节的E1a、在E1a翻译起点处的kozak序列和在E2F1启动子中加入的E2F结合位点的腺病毒。
按照下述腺病毒学和腺病毒载体领域的标准方法对本发明所述腺病毒进行增殖36，37。优选增殖方法是通过感染允许含有受用MD序列隔开的E2F1启动子调节的E1a、在E1a翻译起点处的kozak序列和在E2F1启动子中加入的E2F结合位点的腺病毒进行复制的细胞系来进行。肺腺病毒A549细胞系是这种细胞系的一个实例。例如，按照如下进行增殖：将A549细胞培养于塑料细胞培养板中，用50个病毒颗粒/细胞进行感染。两天后，观察到细胞聚簇的细胞病变效应，这反映了病毒的产生。收集细胞并保存于管中。1000rpm离心5分钟后，将细胞沉淀冻融三次以破裂细胞。所得细胞提取物以1000rpm离心5分钟，将带有病毒的上清液上样到氯化铯梯度上，35000rpm离心1小时。将梯度上的病毒带上样到另一个氯化铯梯度上，35000rpm离心16小时。收集病毒带并用PBS-10％甘油透析。将透析的病毒分为等份并保存于-80℃。按照标准方案对颗粒的数量和空斑形成单位进行定量39。
含10％甘油的磷酸盐缓冲液是保存腺病毒的标准制剂。但是，已经描述了改善病毒稳定性的新制剂61，62。
C.含有受MD序列所隔开的E2F1启动子调节的E1a、在E1a翻译起点处的kozak序列和在E2F1启动子中加入的E2F结合位点的腺病毒用于治疗癌症的用途。
本发明描述了含有受MD序列所隔开的E2F1启动子调节的E1a、在E1a翻译起点处的kozak序列和在E2F1启动子中加入的E2F结合位点的腺病毒在癌症治疗上的用途。所述治疗是基于这些病毒在具有活性RB途径的细胞中的选择性复制。
在癌症治疗中使用本发明所述病毒的方案遵从使用腺病毒的病毒疗法和基因疗法领域中所使用的相同步骤。在基因疗法领域中使用非复制型和复制型腺病毒已经十分广泛。特别地，除本发明所述之外的选择性复制腺病毒法已被用于治疗癌症9，37，63-68。已有多个出版物涉及培养物、动物模型和人患者临床实验中治疗肿瘤细胞。对于体外培养物中细胞的治疗，将任何上文所述形式的纯化腺病毒加入到培养基中，以感染肿瘤细胞。为了治疗动物模型或人患者中的肿瘤，腺病毒可通过注射入肿瘤或肿瘤所在体腔来局部施用，或者甚至通过注射入血流来全身施用。像使用其他腺病毒时那样，复制产物可通过注射入肿瘤或肿瘤所位于的体腔来局部施用，或者甚至通过注射入血流来全身施用。像其它选择性复制型腺病毒那样，使用作为本发明主题的腺病毒的肿瘤治疗可与其它治疗方法例如化疗或放疗相结合。
实施例
实施例1
E1a受MD序列所隔开的E2F1启动子调节的溶瘤腺病毒表达E1a，并在肿瘤细胞中选择性复制。
按照如下构建E1a受用MD序列隔开的E2F1启动子调节的腺病毒：为了产生ICOVIR-1(Ad-E2F-Δ24RGD)，通过人外周血单核细胞的PCR来获得人E2F1启动子，其中使用从E2F1启动子的-218碱基对延伸至+51碱基对的寡核苷酸(+1位表示转录起点)。所述寡核苷酸含有用于克隆进质粒pGL3(Promega，Southampton，UK)中的KpnI和HindIII限制性靶标。所得质粒被称为pGL3-E2F。由此通过与含有腺病毒基因组最左端除E1a的(nt)122和129核苷酸(来源于pXC1-Δ24，其在Ad5基因组的nt 348和nt 522之间具有HindIII位点9)以外的5766对碱基的质粒进行重组而获得了pE2F-Δ24。pE2F-Δ24与pShuttle41进行重组得到pShuttle-E2F-Δ24。用PmeI将此质粒线性化，然后与pVK503(其含有用RDG进行尾丝修饰的Ad5序列69)进行重组，产生质粒pAd-E2F-Δ24RGD或pICOVIR-1。将E2F1启动子和本发明中所描述的其它修饰与称为Δ24的E1a突变和尾丝中的RGD肽插入进行组合，以证明本发明的修饰提高了病毒的溶瘤选择性和效力，所述病毒被认为是在Rb途径中具有选择性，并在溶瘤中有效(腺病毒Ad-Δ24RGD70)。通过用PacI消化此质粒和转染HEK293细胞来产生ICOVIR1病毒。使用平行的方案来产生ICOVIR-2(Ad-MD-E2F-Δ24RGD)。通过人外周血单个核细胞的PCR来获得MD-1分隔序列，其中使用从MD1基因座(序列公开于GenBank，序列号为L08835)13006碱基延伸至13474碱基的寡核苷酸。设计包含侧翼XhoI位点的PCR寡核苷酸。如上所述将MD-1亚克隆进pShuttle-E2F-Δ24的XhoI，以获得pShuttle-MD-E2F-Δ24。通过BamHI、HindIII、XhoI和SmaI的限制性消化来检查MD1片段的正确方向。将pShuttle-MD-E2F-Δ24与pVK503进行重组，产生pICOVIR2。通过PacI消化此质粒并转染到HEK293细胞来产生病毒ICOVIR2。ICOVIR1和ICOVIR2在A549细胞系中增殖，并通过基因疗法和病毒疗法中所述方法进行纯化36。分别通过用KpnI和HindIII进行限制性消化来检查ICOVIR-1和ICOVIR-2基因组的正确结构。另外，对MD-1区域、E2F启动子、E1A-Δ24突变和含有RGD的尾丝区域进行测序。用于这些测序的寡核苷酸是：MD1-上游(5’-GGGCAGATGGAGGGCCTTTTATTC-3’)，E2F-上游(5’-GTGTTACTCATAGCGCGTAA-3’)，△24-下游(5’-CCTCCGGTGATAATGACAAG-3’)和尾丝上游(5’-CAAACGCTGTTGGATTTATG-3’)。所获得的序列在SEQ.ID1中显示。
为了证明E1a受MD序列所分隔的E2F1启动子调节的溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中选择性表达E1a，我们用ICOVIR1和ICOVIR2感染正常细胞(小鼠和人肝细胞、人成纤维细胞和人HUVEC内皮细胞)和肿瘤样细胞(tumoral cell)(NP9胰腺癌细胞)和肿瘤细胞(胰腺癌NP9、肺癌A549、头颈癌FaDu和SCC25以及黑色素瘤SK-Mel-28和1.36.1.5的细胞)的细胞培养物，其中使用多次感染，使超过80％的细胞被感染。感染后20个小时，在4℃的裂解缓冲液(含400mM NaCl、1mM EDTA、5mM NaF、10％甘油、1mM原钒酸钠、0.5％ Nonidet P-40、100微克/毫升苯甲基磺酰氟、1微克/毫升亮肽素和10微克/毫升抑酶肽的10mM Tris-HCl，pH7.4)中裂解所述细胞1个小时。以14000rpm离心裂解液，含蛋白质的上清液通过10％SDS-PAGE(25微克/道，由Bradford，BioRad，CA，USA所确定)的电泳分离，转移至硝酸纤维素(Schleicher and Schuell，Dassel，Germany)。膜用含5％脱脂乳、0.05％吐温20和0.9％ NaCl的50mM Tris(pH7.5)封闭，在4℃用多克隆抗体抗腺病毒-2-E1a(克隆13S-5，SantaCruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，USA)孵育16小时。用二抗抗兔IgG抗体(DAKOA/S)以及辣根过氧化物酶和Amersham的增强化学发光方案(Amersham，Arlington Heights，IL，USA)检测E1a。结果在本发明图3中显示。其显示E2F1启动子(ICOVIR1)的存在能够降低正常细胞中E1a的表达。但是MD序列赋予E2F启动子对E1a表达更强的控制(ICOVIR2)。在肿瘤细胞中，ICOVIR1和ICOVIR2都能够表达E1a，但是重要的是应注意在一些肿瘤细胞系例如FaDu、SCC25和SKMel-28中，E1a的表达小于E1不受E2F1调节的补救腺病毒和溶瘤AdD24RGD。这表明，无论是否被MD隔开，E2F1启动子都不具有使得肿瘤细胞中E1a的表达水平与补救腺病毒相当的必要能力。
为了证明E1a受被MD序列所分隔的E2F1启动子调节的溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中选择性表达E1a，我们如前所述用ICOVIR1和ICOVIR2感染细胞。感染后五天，收集所述细胞及其培养基，使之冻融三次以释放病毒。通过感染HEK293以及用单克隆抗体2Hx-2(ATCC)和二抗大鼠Alexa488抗IgG(Molecular Probes，Eugene，OR)进行抗六邻体染色来测定细胞提取物中的病毒量。结果在图4中显示。ICOVIR1中E2F1启动子的存在降低了正常细胞(成纤维细胞和HUVEC)中的病毒复制。但是ICOVIR2中的分隔序列导致更低的病毒复制。在某些肿瘤细胞系例如A549中，ICOVIR1和ICOVIR2显示的复制水平与补救腺病毒Adwt相似，但是在大多数肿瘤细胞系中，其复制能力低于Adwt。
实施例2
kozak序列使得E1a受MD所隔开E2F1启动子调节的溶瘤腺病毒的E1a表达提高。
构建带有受MD序列所隔开E2F1启动子调节的E1a以及增强其翻译的kozak序列的溶瘤腺病毒。为此，通过KpnI限制性消化而从实施例1描述的pShuttle-MD-E2F-D24中分离含有MD序列、E2F1启动子和E1a的DNA片段，并亚克隆进pGEM3Z(Promega)，获得质粒pGEM-E2F-d24。此质粒用于使用含kozak序列的寡核苷酸替换E1a翻译起点，获得pGEM-E2F-KD24。将这样修饰的KpnI片段重新克隆进pShuttle-MD-E2F-D24的KpnI中，获得pShuttle-DM-E2F-KD24。最后，将pShuttle-MD-E2F-KD24与pVK503重组获得pICOVIR5。通过用PacI消化此质粒来产生ICOVIR5病毒，并转染进HEK293细胞。ICOVIR5在A549细胞系中增殖，通过基因疗法和病毒疗法中所述的方法纯化36。其结构在本发明图1中显示。通过限制性处理和测序来检查启动子和E1a的正确序列。所得序列在SEQ ID 2中显示。
为了证明当E1a的表达受MD序列所隔开E2F1启动子的调节时E1a在肿瘤细胞中有条件地表达，并且其表达被kozak序列优化，如实施例1中所述分析E1a表达。在此情况下，它包含在溶瘤腺病毒ICOVIR5中，其不同于ICOVIR2的地方在于它含有位于E1a翻译起点的kozak序列。结果在本发明图5中显示。在正常细胞中，由于E2F启动子被MD隔开，ICOVIR5不表达E1a。在肿瘤细胞中，ICOVIR5中的E1a表达水平高于ICOVIR2，这证明kozak序列提高了被MD隔开的启动子的能力。
实施例3
kozak序列使得E1a表达受MD所隔开的E2F1启动子调节的腺病毒的溶瘤效力提高。
我们在96孔板中培养来自肿瘤细胞系SKMel-28和FaDu的细胞，其中可见ICOVIR2复制能力的降低(如实施例1和图4中所述)。用量逐渐增加的ICOVIR5、ICOVIR2和AdwtRGD(后者用作最大裂解能力的对照)感染这些细胞。感染后五天，通过光谱测定蛋白质量，作为细胞存活的反映。结果在本发明图6中显示。ICOVIR5在SKMel-28中的裂解能力与AdwtRGD相同，并高于ICOVIR2。在FaDu中，它也高于ICOVIR2，尽管达不到AdwtRGD的水平。
实施例4
当E1a受到被MD序列隔开的E2F1启动子调节并且其翻译被kozak序列优化时，通过插入E2F结合位点来修饰E2F1启动子使得E1a在肿瘤细胞中的表达提高。
构建E1a受E2F1启动子调节的溶瘤腺病毒，所述E2F1启动子通过插入四个E2F结合位点而进行了修饰。为此，在实施例2所述质粒pGEM-E2FKE1ad24中，我们通过定向诱变在E2F1启动子中引入BsiWI的靶标(1326位)。在此位点，BsiWI将两个拷贝的寡核苷酸连接在一起，所述寡核苷酸具有结合E2F的回文序列，并具有与BsiWI相容的末端。将这样修饰的启动子亚克隆进pShuttle-MD-E2F-D24的KpnI中，获得pShMDE2FBsiE2F2KE1ad24。将此质粒与AdwtRGD基因组同源重组，获得质粒pICOVIR7。在A549细胞系中通过消化产生ICOVIR7病毒，并通过基因疗法和病毒疗法中所述对其进行纯化36。它的结构在本发明图1中显示。通过限制性消化和测序来检查所述启动子和E1a的序列正确性。所得序列在SEQ ID NO3中显示。
为了证明在被MD隔开的背景下经修饰E2F1启动子的作用，我们如实施例1所述通过western印迹分析了黑素瘤肿瘤细胞系1.36.1.5中E1a的表达。溶瘤腺病毒ICOVIR7与ICOVIR5的不同在于具有修饰的E2F1启动子。结果在本发明图7中显示。ICOVIR7的E1a的表达水平较高，这证明了ICOVIR7中两个额外E2F结合位点的增强作用。另外，ICOVIR5中E1a的表达高于ICOVIR2，这再次证明了kozak序列在通过被MD所隔开的启动子能力上的作用。
实施例5
含有受被MD序列隔开的E2F1启动子所调节的E1a和E1a翻译起点处的kozak序列的腺病毒可用于有效治疗癌症。
用含有NP9肿瘤的来自Balb/c株的无胸腺大鼠进行体内实验。在大鼠背面每侧皮下注射来自SKMel-28细胞系的总共1.2×107肿瘤细胞。15天后，将已形成肿瘤(达到70-80立方毫米)的大鼠分为不同实验组(每组n＝10)。对照组肿瘤接受肿瘤内注射缓冲盐溶液(2×10微升)。用icovir5治疗的组接受肿瘤内注射(2×10微升)icovir5(109个病毒颗粒/肿瘤)。每天测量肿瘤，根据下式估计其体积：V(立方毫米)＝A(毫米)×B2(平方毫米)×π/6，其中B是横向长度。图8显示相比于治疗开始时(第0天)的肿瘤体积。结果以平均值±SD显示。使用非匹配数据的Mann-Whitney非参数检验来计算结果之间是否存在显著差异。使用方差分析比较生长曲线。如果p<0.05则认为结果是显著的。用统计软件包SPSS(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行计算。在第16天和21天肿瘤尺寸具有显著差异。
在另一个实验中，通过全身性注射ICOVIR5来进行治疗。将人黑素瘤SKMel-28(1×107个细胞/肿瘤)细胞系的肿瘤植入到Balb C nu/nu无胸腺大鼠中，一旦建立，则通过尾静脉施用下列项来进行治疗：PBS、在第0天单次注射2.5×1010病毒颗粒(vp)或1×1011vp的ICOVIR-5，或者间隔一小时注射3×1010vp和另外的1×1011vp。结果显示于本发明图8的下部。所有用ICOVIR-5治疗的方案均显示出导致肿瘤生长抑制的溶瘤活性，其与对照组(PBS)具有显著差异，p<0.05。在注射1×1011vp之前预先施用3×1010vp的剂量使得此方案比其它模式明显更加有效(p<0.05)。用α-六邻体抗体(来源于腺病毒衣壳的蛋白)处理OCT中冷冻肿瘤的不同切片，用4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚进行复染。ICOVIR-5的抗肿瘤活性与腺病毒在肿瘤中的复制一致，在注射后第22天获得的肿瘤中进行评估。所有ICOVIR5处理组样品的腺病毒存在均为阳性，所述腺病毒位于肿瘤坏死区中。
实施例6
当使用含有受MD序列所隔开的E2F1启动子调节的E1a和位于E1a翻译起点的kozak序列的腺病毒时，与全身性施用腺病毒相关的毒性降低。
将E1a中含有kozak序列以及被MD隔开的E2F1启动子的腺病毒(ICOVIR5)的体内毒性与补救病毒以及在补救启动子控制下表达E1a的溶瘤病毒AdD24RGD进行比较。以不同剂量静脉内施用所述病毒，注射后第五天，评估与毒性相关的参数，例如动物存活、体重、血清转氨酶水平和血液计数。结果显示于本发明的图9。注射后第5天，AdwtRGD或AdΔ24RGD在有免疫能力的Balb/c大鼠中的致死剂量50值(LD50)是5×1010个病毒颗粒(vp)/大鼠，而此剂量的两倍(1×1011vp/大鼠)仅对于10％的注射了ICOVIR-5的大鼠是致死的(LD10)。在注射后第5天，注射了5×1010vp的AdwtRGD或Ad Δ 24RGD的大鼠发生严重的体重减轻，而注射了ICOVIR-5的大鼠体重增加。于此平行地，在注射后第5天，血浆中肝转氨酶的测定(平均值±SD；n＝5-10/组)也显示了显著的差异，ICOVIR-5在相同剂量下具有明显更低的肝毒性。第5天，大鼠的血液特征谱显示，施用5×1010vp的ICOVIR-5未使血液计数发生明显改变，也未发生与施用相同剂量AdwtRGD相关的血小板显著减少。通过对注射后第5天获得的冷冻切片免疫检测对大鼠肝脏中腺病毒蛋白E1A进行的表达分析显示，在ICOVIR-5中分隔形式E2F-1启动子的存在有效的限制了病毒蛋白的表达，甚至是在施用剂量增加时也是如此(图10)。对注射后第3天的肝脏石蜡切片进行苏木精/伊红染色的组织学评估也证实了ICOVIR-5的低毒性(图10)。因此，尽管接受5×1010vp AdwtRGD或Ad Δ 24RGD的大鼠之肝脏显示爆发型肝炎的明显症状(大泡性脂肪变(macrosteatosi)、大量Councilman小体并存在坏死点)，但注射ICOVIR-5的动物的肝脏具有事实上正常的表型，只是在最外部区域少量存在Councilman小体。
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序列表
<110>德那翠丝有限公司
<120>用于肿瘤治疗的溶瘤腺病毒
<130>icovir
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1641
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>重组腺病毒
<400>1
Figure A200780009189D00301
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<210>2
<211>1556
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>重组腺病毒
<400>2
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<210>3
<211>1680
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>重组腺病毒
<400>3
Figure A200780009189D00322
Figure A200780009189D00331

Claims (12)

1.用于治疗癌症的溶瘤腺病毒，其特征在于赋予腺病毒基因以选择性表达的启动子处含有绝缘性人DNA序列。
2.根据权利要求1的溶瘤腺病毒，其特征在于所述人DNA序列是来源于强直性肌营养不良基因座的序列。
3.根据权利要求1至2中任一项的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒含有kozak序列，其优化由赋予肿瘤选择性的启动子所调节的腺病毒基因的蛋白质翻译。
4.根据权利要求1至3中任一项的溶瘤腺病毒，其特征在于它在E1a、E1b和E4组中的一个或多个基因中含有突变，以获得在肿瘤中的选择性复制。
5.根据权利要求1至3中任一项的溶瘤腺病毒，其特征在于其衣壳中包含改变，以提高其感染性或者将其引导至肿瘤细胞中存在的受体。
6.根据权利要求1至3中任一项的溶瘤腺病毒，其特征在于它含有通常用于癌症基因治疗领域的作为前药激活剂、肿瘤抑制剂或免疫激活剂的其它基因。
7.根据权利要求1至3中任一项的溶瘤腺病毒，其特征在于所述腺病毒是来源于1至50血清型的人腺病毒。
8.根据权利要求7的溶瘤腺病毒，其特征在于所述腺病毒为人腺病毒血清型5。
9.根据权利要求1至3中任一项的溶瘤腺病毒，其特征在于所述赋予肿瘤选择性的启动子是E2F1人基因的启动子。
10.根据权利要求9的溶瘤腺病毒，其特征在于所述赋予肿瘤选择性的启动子是通过插入另外的E2F结合位点而进行了修饰的E2F1启动子。
11.药物组合物，其包含有效量的权利要求1至10中任一项所述溶瘤腺病毒以及一种或多种载体或可药用赋形剂。
12.根据权利要求1至10中任一项的溶瘤腺病毒用于制备治疗或预防癌症或者其癌前病症的药物中的用途。
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