CN110741080A

CN110741080A - 多转基因重组腺病毒

Info

Publication number: CN110741080A
Application number: CN201880021787.6A
Authority: CN
Inventors: 托尼·R·雷德; 布莱恩·T·奥兰斯基; 克里斯托弗·拉森
Original assignee: Episinte Trex Co
Current assignee: Episinte Trex Co; Epicentrx Inc
Priority date: 2017-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2020-01-31
Also published as: SG11201906973TA; BR112019015600A2; MX2019008921A; WO2018140973A1; CA3052090A1; KR20190128634A; EP3574090A1; IL268291A; EP3574090A4; JP2020505049A; US20190352616A1; AU2018213417A1

Abstract

本发明提供了包含两个(或更多个)治疗性转基因例如CD80和CD137L的重组腺病毒。所述转基因优选被插入到E1b‑19K插入位点和/或E3插入位点中。

Description

多转基因重组腺病毒

与相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月30日提交的美国临时专利申请系列号62/452,342和2017年6月16日提交的美国临时专利申请系列号62/520,945的利益和优先权。

技术领域

本发明的领域是分子生物学和病毒学，具体来说是表达两个或更多个治疗性转基因的修饰的病毒。

背景技术

尽管对引起癌症的潜在分子机制已有广泛了解，但大多数晚期癌症仍不能使用当前的化疗和放射疗法治愈。溶瘤病毒已成为具有显著增强当前用于各种不同恶性肿瘤的标准治疗的潜力的平台技术(Kumar，S.等，(2008)，CURRENT OPINION IN MOLECULARTHERAPEUTICS 10(4)：371-379；Kim，D.，(2001)，EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY1(3)：525-538；Kim D.(2000)ONCOGENE 19(56)：6660-6669)。已显示，这些病毒有希望作为不仅通过感染-繁殖-裂解的链式反应直接破坏恶性细胞，而且间接地诱导抗肿瘤免疫力的溶瘤剂。这些免疫刺激性质，通过在每次病毒复制时复制并表达的治疗性转基因的插入而被增强。

以前开发的溶瘤病毒包括被称为TAV-255的溶瘤性5血清型腺病毒(Ad5)，其在正常细胞中被转录弱化但在癌细胞中有转录活性(参见PCT公布号W02010/101921)。据信TAV-255载体实现这种肿瘤选择性的机制是通过用于转录因子Pea3和E2F的三个转录因子(TF)结合位点的靶向缺失，所述转录因子是通过结合到特定DNA序列来调控病毒进入宿主细胞后将会转录的最早基因E1a的腺病毒表达的蛋白质。

尽管到目前为止已作出尝试，但对用于在人类患者中治疗癌症和过度增殖性障碍的改进的溶瘤病毒，仍存在需求。

发明内容

本发明部分是基于下述发现，即腺病毒例如溶瘤病毒出人意料地可以在不使用外源启动子的情况下高效表达插入到特定插入位点中的多个(两个或更多个)治疗性转基因，并且所述病毒可以无视并入到病毒基因组中的转基因的大小，复制并高效表达所述两个或更多个治疗性转基因。

因此，一方面，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含：(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19K插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间：和(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)。

在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-19K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例如202或203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核苷酸之间或对应于所述Ad5基因组的1714和1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQID NO：2)。

在某些实施方式中，所述E3插入位点包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500、或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063或1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQID NO：23)的29773和30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第二治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ IDNO：4)。在某些实施方式中，所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第二治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。

另一方面，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含：(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中；和(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间，并且其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被第一内部核糖体进入位点(IRES)隔开。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)。

在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-19K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250、或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例如202或203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核苷酸之间或对应于所述Ad5基因组的1714和1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含E3缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。在某些实施方式中，所述E3缺失位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500、或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失，例如所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063或1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500、或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列。所述第三治疗性转基因可以被插入到E1b-19k插入位点中，其中例如所述第二核苷酸序列和第三核苷酸序列被第二内部核糖体进入位点(IRES)隔开。在某些实施方式中，所述第一、第二和第三治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因、所述第二IRES、所述第三治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。所述第三治疗性转基因也可被插入到E3缺失位点中，即在某些实施方式中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其被插入到E3插入位点中。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组的29773和30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第三治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ IDNO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第三治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。

所述IRES可以例如选自脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、口蹄疫病毒(FMDV)IRES和脊髓灰质炎病毒IRES。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述重组腺病毒还包含E4缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与右侧末端反向重复序列(ITR)之间。在某些实施方式中，所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点之间。在某些实施方式中，所述E4缺失包含约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约2500、约1500至约2000、或约2000至约2500个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约250至约1500、约250至约1250、约250至约1000、约250至约750、约250至约500、500至约1500、约500至约1250、约500至约1000、约500至约750、750至约1500、约750至约1250、约750至约1000、约1000至约1500、或约1000至约1250个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1450个核苷酸的缺失，例如所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1449个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的34078-35526位核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因、所述第一、第二和/或第三治疗性转基因或所有所述治疗性转基因，不被可操作连接到外源启动子序列。

在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约4000至约5000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。

在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、或约5000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约1650个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约3100个核苷酸。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因、所述第一、第二和/或第三治疗性转基因或任何所述治疗性转基因，编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、p40、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、和TGF-β阱的治疗性多肽。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因、所述第一、第二和/或第三治疗性转基因或任何所述治疗性转基因，编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因分别编码异二聚体细胞因子的第一和第二亚基。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自CD80和CD137L，例如所述第一治疗性转基因编码CD80并且所述第二治疗性转基因编码CD137L。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：8的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一、第二和/或第三治疗性转基因选自CD80、CD137L和ICAM-1。例如，所述第一治疗性转基因编码CD80，所述第二治疗性转基因编码CD137L，并且所述第三治疗性转基因编码ICAM-1。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：32编码的氨基酸序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22的核苷酸序列。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自IL-23A/p19和p40，其构成异二聚体细胞因子IL-23。例如，在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因编码IL-23A/p19并且所述第二治疗性转基因编码p40。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自IL-27A/p28和IL-27B/EBI3，其构成异二聚体细胞因子IL-27。例如，在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因编码IL-27A/p28并且所述第二治疗性转基因编码IL-27B/EBI3。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自内皮抑素和血管抑素，例如所述第一治疗性转基因编码内皮抑素并且所述第二治疗性转基因编码血管抑素。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：37或SEQ IDNO：38编码的氨基酸序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码SEQID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44的氨基酸序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列。

在某些实施方式中，任何前述重组腺病毒可以包含至少一个Pea3结合位点或其功能部分的缺失，例如所述病毒可以包含对应于所述E1a的起始位点上游约-300至约-250位的核苷酸的缺失或对应于所述E1a的起始位点上游-305至-255或-304至-255位的核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，在任何前述组合物中，所述重组溶瘤腺病毒可以包含至少一个E2F结合位点或其功能部分的缺失。在某些实施方式中，所述重组溶瘤腺病毒可以包含至少一个E2F结合位点或其功能部分的缺失，并且不包含Pea3结合位点的缺失。

另一方面，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含SEQ ID NO：14或与SEQ ID NO：14具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

在某些实施方式中，每个前述重组腺病毒可以选择性地在过度增殖性细胞中复制。在某些实施方式中，任何前述重组腺病毒可以选择性地在过度增殖性细胞中表达两个或更多个治疗性转基因。所述过度增殖性细胞可以是癌细胞例如肺癌细胞、结肠癌细胞和胰腺癌细胞。在某些实施方式中，每个前述重组腺病毒可以是溶瘤腺病毒。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含每种前述重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。

另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的本文中描述的重组腺病毒，以在所述受试者中治疗所述癌症。在某些实施方式中，所述癌症选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胆管癌、脑癌、子宫内膜癌、神经内分泌癌、梅克尔细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤和胰腺癌。

另一方面，本发明提供了一种在受试者中抑制肿瘤细胞增殖的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的本文中描述的重组腺病毒，以抑制所述肿瘤细胞的增殖。

另一方面，本发明提供了一种在受试者中抑制肿瘤生长的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的本文中描述的重组腺病毒，以抑制所述肿瘤细胞的增殖。

在每个前述方法中，所述重组腺病毒可以例如与选自手术、放射、化疗、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法的一种或多种疗法相组合来给药。在每个前述方法中，所述重组腺病毒的有效量可以是例如10²-10¹⁵噬斑形成单位(pfu)。在每个前述方法中，所述受试者可以是例如人类如人类儿童或动物。

在每个前述方法中，所述重组病毒的有效量可以例如通过在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答来鉴定。在某些实施方式中，所述针对抗原的免疫应答通过在所述受试者皮肤上的注射位点处用所述抗原注射所述受试者并在所述注射位点处测量硬结的尺寸来测量。

另一方面，本发明提供了一种在靶细胞中表达两个或更多个治疗性转基因的方法。所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的本文中描述的重组腺病毒，以表达所述靶转基因。

本发明的这些和其他方面和优点，通过下面的附图、详细描述和权利要求书来说明。

附图说明

参考下面的附图，可以更完整地理解本发明。

图1描绘了在用指示的病毒以5的感染复数(MOI)感染后2天ADS-12细胞的小鼠CD80或小鼠CD137L染色。

图2描绘了在用指示的病毒以5的感染复数(MOI)感染后2天ADS-12细胞的小鼠CD80或小鼠CD137L染色。

图3描绘了在用指示的病毒感染后3天4T1细胞的小鼠CD80或小鼠CD137L染色。

图4描绘了在用指示的病毒感染后3天4T1细胞的小鼠CD80或小鼠CD137L染色。

图5描绘了在用指示的病毒以2的MOI感染后2天非癌性(WI-38和MRC5)或癌性(A549)细胞的人类CD80或人类CD137L染色。

图6描绘了在用指示的病毒以5的MOI感染后2天A549细胞的人类CD80或人类CD137L染色。

图7描绘了用或不用TAV-hCD80-hCD137L病毒以10的MOI感染的非癌性(WI-38和MRC5)或癌性(A549)细胞在所指示的时间点的结晶紫染色。

图8描绘了用或不用指示的病毒以10的MOI感染的ADS-12细胞在所指示的时间点的结晶紫染色。

图9描绘了通过噬斑测定法确定的指示的病毒在ADS细胞中的复制。

图10描绘了在第0、4和8天用5·10⁷PFU的指示的病毒进行三次肿瘤内注射治疗后小鼠中的皮下ADS-12肿瘤(n＝10)的平均肿瘤体积(±SEM)。肿瘤体积被估算为长度·宽度²/2。

图11描绘了在第0、4和8天用1·10⁷PFU的指示的病毒进行三次肿瘤内注射治疗后小鼠中的皮下ADS-12肿瘤(n＝3)的肿瘤体积。肿瘤体积被估算为长度·宽度²/2。

图12描绘了在第0、4和8天用5·10⁷PFU的指示的病毒进行三次肿瘤内注射治疗后小鼠的乳腺脂肪垫中的原位4T1肿瘤(n＝10)的平均肿瘤体积(±SEM)。肿瘤体积被估算为长度·宽度²/2。

图13描绘了在用指示的病毒以10的MOI感染后4天，ADS-12细胞的鼠类CD80、鼠类CD137L和鼠类ICAM-1染色。

图14描绘了在用指示的病毒以5的MOI感染后3天，F244细胞的鼠类CD80、鼠类CD137L和鼠类ICAM-1染色。

图15描绘了在用指示的病毒以5的MOI感染后3天，HT29细胞的鼠类CD80、鼠类CD137L和鼠类ICAM-1染色。

图16描绘了用缓冲液(图16A)、TAV-mCD80-137L(图16B)或TAV-mCD80-137L-ICAM(图16C)的肿瘤内注射进行治疗的带有皮下ADS-12肿瘤的129S4小鼠的肿瘤体积。每种治疗每四天以每剂1x 10⁹PFU的剂量给药，总共三剂。每条线表示单个小鼠的肿瘤体积，每个治疗组10只小鼠。

详细描述

因此，一方面，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含：(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19K插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的1714-1716位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的2019-2021位核苷酸)之间；和(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点(即编码pVIII的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的27855-27857位核苷酸)与Fiber的起始位点(即编码Fiber的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的31042-31044位核苷酸)之间。在整个本描述和权利要求书中，两个位点之间的插入，例如(i)第一基因(例如E1b-19k)的起始位点与第二基因(例如E1b-55K)的起始位点、(ii)第一基因的起始位点与第二基因的终止位点、(iii)第一基因的终止位点与第二基因的起始位点或(iv)第一基因的终止位点与第二基因的终止位点之间的插入，被理解为意味着在所述插入周围的构成给定起始位点或终止位点的全部或一部分核苷酸，可能存在或不存在于最终病毒中。同样地，两个核苷酸之间的插入被理解为意味着所述插入周围的核苷酸可能存在或不存在于最终病毒中。术语“转基因”是指外源基因或多核苷酸序列。术语“治疗性转基因”是指当在病毒中或被病毒复制和/或表达时，在靶细胞、体液、组织、器官、生理系统或受试者中提供治疗效果的转基因。

在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的1714-1716位核苷酸)与E1b-19K的终止位点(即编码E1b-19k的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的2242-2244位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250、或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例如202或203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714与1917位的核苷酸之间或对应于所述Ad5基因组的1714与1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。CTGACCTC(SEQ ID NO：1)和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)为所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)内的E1b-19K插入位点定义了独特的边界序列。在整个本描述和权利要求书中，邻近位点的缺失，例如邻近基因的起始位点的缺失或邻近基因的终止位点的缺失，被理解为意味着所述缺失可以包括构成给定起始位点或终止位点的全部或一部分核苷酸的缺失或不包括所述核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，所述E3插入位点包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点(即编码E3-10.5K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的29770-29772位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的30837-30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063或1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773与30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第二治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。CAGTATGA(SEQ ID NO：3)和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)为所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)内的E3插入位点定义了独特的边界序列。

在某些实施方式中，所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点(即编码E3-gp19K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的29215-29217位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的30837-30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218与30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第二治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第二治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)为所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的E3插入位点定义了独特的边界序列。

另一方面，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含：(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中；和(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19k的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的1714-1716位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的2019-2021位核苷酸)之间，并且其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被第一内部核糖体进入位点(IRES)隔开。

在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的1714-1716位核苷酸)与E1b-19K的终止位点(即编码E1b-19k的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的2242-2244位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例如202或203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917或1714-1916位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组的1714与1917位的核苷酸之间或对应于所述Ad5基因组的1714与1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述IRES、所述第二治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含E3缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000、或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失位于pVIII的终止位点(即编码pVIII的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的27855-27857位核苷酸)与Fiber的起始位点(即编码Fiber的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3缺失位点位于E3-10.5K的终止位点(即编码E3-10.5K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的29770-29772位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的30837-30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失，例如所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063或1064个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5 dl309E3缺失的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，所述E3缺失位于E3-gp19K的终止位点(即编码E3-gp19K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的29215-29217位核苷酸)与E3-14.7K的终止位点(即编码E3-14.7K的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的30837-30839位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失，例如所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列。所述第三治疗性转基因可以被插入到E1b-19k插入位点中，其中例如所述第二核苷酸序列和第三核苷酸序列被第二内部核糖体进入位点(IRES)隔开。在某些实施方式中，所述第一、第二和第三治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因、所述第二IRES、所述第三治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。所述第三治疗性转基因也可被插入到E3缺失位点中，即在某些实施方式中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其被插入到E3插入位点中。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQID NO：23)的29772与30837位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第三治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ IDNO：4)。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ IDNO：23)的29218与30839位的核苷酸之间。在某些实施方式中，所述第三治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第三治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。

所述IRES可以例如选自脑心肌炎病毒IRES、口蹄疫病毒IRES和脊髓灰质炎病毒IRES。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述重组腺病毒还包含E4缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点(即编码E4-ORF6/7的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的34075-34077位核苷酸)与右侧末端反向重复序列(ITR；例如对应于SEQ ID NO：23的35836-35938位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点(即编码E4-ORF1的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的35524-35526位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E4缺失包含E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点之间的核苷酸序列的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约2500、约1500至约2000、或约2000至约2500个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约250至约1500、约250至约1250、约250至约1000、约250至约750、约250至约500、500至约1500、约500至约1250、约500至约1000、约500至约750、750至约1500、约750至约1250、约750至约1000、约1000至约1500、或约1000至约1250个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1450个核苷酸的缺失，例如所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1449个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的34078-35526位核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒是溶瘤病毒，例如表现出肿瘤选择性的复制和/或病毒介导的裂解的病毒。在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒表现出治疗性转基因在过度增殖性细胞例如癌细胞中相对于非过度增殖性细胞中的选择性表达。在某些实施方式中，治疗性转基因在非过度增殖性细胞中的表达为所述基因在所述过度增殖性细胞中的表达的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在某些实施方式中，所述病毒在非过度增殖性细胞中不表现出治疗性转基因的可检测的表达。治疗性转基因的表达可以通过本领域中已知的任何适合方法例如Western印迹或ELISA来确定。

所述过度增殖性细胞可以是癌细胞例如上皮癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、胃肠道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、甲状腺癌、间皮瘤、肝癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌或脑癌细胞。

本发明的重组腺病毒的特点例如缺少外源启动子，可以允许相对于其他重组腺病毒表达额外的治疗性转基因或更大的治疗性转基因。例如，在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因、所述第一、第二和/或第三治疗性转基因或所有所述治疗性转基因不被可操作连接到外源启动子序列。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000、或约4000至约5000个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因的大小、所述第一、第二和第三治疗性转基因的大小或所有所述治疗性转基因的大小在组合时，包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。

在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：14或包含与SEQ ID NO：14具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

序列同一性可以以本领域技术之内的各种不同方式确定，例如使用公开可用的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所利用的算法的BLAST(局部序列比对检索基本工具)分析(Karlin等，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87：2264-2268；Altschul，(1993)J.MOL.EVOL.36，290-300；Altschul等，(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25：3389-3402，通过参考并入本文)，被定制用于序列相似性检索。对于检索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)NATURE GENETICS 6：119-129，其整体通过参考并入本文。本领域技术人员可以为用于测量对齐、包括在待比较的序列的整个长度上获得最大对齐所需的任何算法，确定适合的参数。用于直方图、描述、比对、期望值(即报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和筛选程序的搜索参数，采用缺省设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的缺省评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 89：10915-10919，其整体通过参考并入本文)。四种blastn参数可以如下调整：Q＝10(间隙生成罚分)；R＝10(间隙扩展罚分)；wink＝1(在沿着查询的每个wink位置处产生词命中数)；和gapw＝16(设置在其中产生带间隙的比对的窗口宽度)。等效的Blastp参数设置可以是Q＝9，R＝2，wink＝1和gapw＝32。检索也可以使用NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，间隙开放罚分[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，间隙扩展罚分[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配罚分[Integer]：缺省值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励[Integer]：缺省值＝1；-e，期望值[Real]：缺省值＝10；-W，词大小[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，以字节为单位的blast扩展的衰减(X)：缺省值＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，带间隙的比对的X衰减值(以字节为单位)：缺省值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和-Z，带间隙的比对的最终X衰减值(以字节为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。也可以将ClustalW用于成对蛋白质比对(缺省参数可以包括例如Blosum62矩阵和间隙开放罚分＝10和间隙扩展罚分＝0.1)。在GCG软件包10.0版中可用的序列之间的Bestfit比较，使用DNA参数GAP＝50(间隙生成罚分)和LEN＝3(间隙扩展罚分)，在蛋白质比较中的等同设置是GAP＝8和LEN＝2。

本发明还提供了一种5型腺病毒载体，其在E1、E3和E4位点中以右向和左向方向表达一个或多个治疗性转基因，特别是免疫调节性转基因。当在本文中使用时，“免疫调节性”是指调节受试者的免疫系统功能的治疗性转基因。免疫调节性转基因可以调节例如B-细胞、T细胞的功能和/或抗体的生产。示例性的免疫调节性转基因包括检验点抑制剂。示例性的免疫调节性转基因可以包括例如PD-1或PD-L1或调节其活性的任何转基因。其他示例性免疫调节性转基因可以包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。某些免疫调节性转基因可能包含肽连接物例如长度为2至5000或更多个氨基酸的肽连接物，其可能是免疫原性的，即易受中和抗体攻击。设想了可以通过用非免疫原性序列代替所述免疫原性序列来降低这些连接物的免疫原性。

本发明还提供了治疗方法，其包括与例如阻断免疫检验点或改进抗原呈递/抗原吞噬和/或增强肿瘤特异性T-细胞响应性的抗体相组合给药本公开的重组腺病毒。

I.病毒

术语“病毒”在本文中用于指称不具有蛋白质合成或能量产生机制的任何专性细胞内寄生物。病毒的基因组可以是RNA或DNA。在本发明的实践中有用的病毒包括重组修饰的有包膜或无包膜DNA和RNA病毒，优选地选自杆状病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、痘病毒或腺病毒。重组修饰的病毒在本文中被称为“重组病毒”。重组病毒可以通过重组DNA技术修饰成复制缺陷型、条件复制型或复制型，和/或通过重组DNA技术修饰成包含外源转基因的表达。利用每种母体载体性质的有利要素的嵌合病毒载体(参见例如Feng等，(1997)NATURE BIOTECHNOLOGY 15：866-870)也可用于本发明的实践。尽管使用来自于待治疗物种的病毒通常是有利的，但在某些情况下，使用源自于具有有利致病特点的不同物种的载体，可能是有利的。例如，在PCT公布号WO 98/27216中描述了将马疱疹病毒载体用于人类基因疗法。由于所述马病毒对人类不致病，因此所述载体被描述为可用于人类的治疗。同样地，绵羊腺病毒载体可用于人类基因疗法，因为它们据称避免了针对人类腺病毒载体的抗体。这些载体描述在PCT公布号WO97/06826中。

优选地，所述重组病毒是腺病毒。腺病毒是中等大小(90-100am)、无包膜(裸露的)二十面体病毒，由核衣壳和双链线性DNA基因组构成。腺病毒在哺乳动物细胞的核中使用宿主的复制机制复制。术语“腺病毒”是指腺病毒属包括但不限于人类、牛、绵羊、马、犬、猪、鼠和猴腺病毒亚属的任何病毒。具体来说，人类腺病毒包括A-F亚属及其各个血清型，所述各个血清型和A-F亚属包括但不限于人类1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11a和Ad11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型腺病毒。优选的是源自于人类2和5型腺病毒的重组病毒。除非另有陈述，否则所有5型腺病毒的核苷酸编号是相对于本文中描绘在SEQ ID NO：23中的NCBI参比序列AC_000008.1。

腺病毒复制周期具有两个阶段：早期阶段，在此期间四个转录单元E1、E2、E3和E4被表达；和晚期阶段，其在病毒DNA合成开始之后发生，此时晚期转录本主要从主要晚期启动子(MLP)表达。晚期讯息编码病毒的大多数结构蛋白质。E1、E2和E4的基因产物负责转录激活、细胞转化、病毒DNA复制以及其他病毒功能，并且对于病毒生长来说是必需的

术语“可操作连接”是指多核苷酸元件以有功能的关系连接。核酸序列当与另一个核酸序列以有功能的关系放置时，被“可操作连接”。例如，如果启动子或增强子影响基因的转录，则它被可操作连接到所述基因。可操作连接的核苷酸序列通常是毗连的。然而，由于增强子通常在与启动子相隔几千碱基时起作用并且内含子序列可能具有可变的长度，因此某些多核苷酸元件可能是可操作连接的但不直接在两侧，并且甚至可能从不同的等位基因或染色体反式起作用。

在某些实施方式中，所述病毒具有对调控序列或启动子的一个或多个修饰。对调控序列或启动子的修饰包括与所述调控序列或启动子的野生型序列相比一个或多个核苷酸的缺失、替换或添加。

在某些实施方式中，所述调控序列或启动子的修饰包括转录因子结合位点序列的修饰，以例如通过缺失其一部分或通过在所述结合位点中插入单个点突变来降低对所述转录因子的亲和性。在某些实施方式中，所述其他的修饰的调控序列增强在肿瘤细胞中的表达但减弱在正常细胞中的表达。

在某些实施方式中，所述修饰的调控序列被可操作连接到编码蛋白质的序列。在某些实施方式中，腺病毒E1a和E1b基因(编码区)中的至少一者被可操作连接到修饰的调控序列。在某些实施方式中，所述E1a基因被可操作连接到所述修饰的调控序列。

E1a调控序列含有用于转录因子Pea3的5个结合位点，被称为Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和Pea3 V，其中Pea3 I是最靠近E1a起始位点的Pea3结合位点，Pea3 V是最远离的。E1a调控序列也含有用于转录因子E2F的结合位点，因此被称为E2F I和E2F II，其中E2F I是最靠近E1a起始位点的E2F结合位点，E2F II更远离一些。从E1a起始位点起，所述结合位点的排列为：Pea3 I，E2F I，Pea3 II，E2F II，Pea3 III，Pea3 IV和Pea3 V。

在某些实施方式中，这七个结合位点中的至少一个或其功能部分被缺失。“功能部分”是所述结合位点的在被缺失时将所述结合位点的功能例如对其相应转录因子(Pea3或E2F)的结合亲和性与完整序列相比降低例如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％或甚至消除所述功能的部分。在某些实施方式中，一个或多个完整的结合位点被缺失。在某些实施方式中，一个或多个结合位点的功能部分被缺失。“缺失的结合位点”涵盖了完整结合位点的缺失和功能部分的缺失两者。当两个或更多个结合位点被缺失时，可以使用完整结合位点缺失和功能部分缺失的任何组合。

在某些实施方式中，至少一个Pea3结合位点或其功能部分被缺失。所述缺失的Pea3结合位点可以是Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 II和/或Pea3 III。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3II和Pea3 III两者。在某些实施方式中，Pea3 I结合位点或其功能部分被保留。

在某些实施方式中，至少一个E2F结合位点或其功能部分被缺失。在某些实施方式中，至少一个E2F结合位点或其功能部分被保留。在某些实施方式中，所述保留的E2F结合位点是E2F I和/或E2F II。在某些实施方式中，所述保留的E2F结合位点是E2F II。在某些实施方式中，全部缺失基本上由Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3 V或其功能部分中的一者或多者构成。在某些实施方式中，所述病毒具有位于E1a起始位点上游-304至-255位、例如对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的195-244位的50个碱基对区域的缺失，其在后文中被称为TAV-255缺失。在某些实施方式中，所述TAV-255缺失产生包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO：28)的E1a启动子。

腺病毒E1b-19k基因主要起到抗凋亡基因的作用，并且是细胞抗凋亡基因BCL-2的同源物。由于在子代病毒粒子成熟之前的宿主细胞死亡将限制病毒复制，因此E1b-19k作为E1盒式元件的一部分表达以防止过早的细胞死亡，由此允许感染继续并产生成熟病毒粒子。因此，在某些实施方式中，提供了包含E1b-19K插入位点的重组病毒，例如所述腺病毒具有插入到E1b-19K插入位点中的编码治疗性转基因的核苷酸序列。在某些实施方式中所述腺病毒包含编码治疗性转基因的核苷酸序列，其被插入到E1b-19K插入位点中，其中所述插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的1714-1716位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的2019-2021位核苷酸)之间。

II.病毒的生产方法

用于生产本发明的重组病毒的方法在本领域中是已知的。通常，本公开的病毒在适合的宿主细胞系中，使用常规的技术来生产，所述技术包括将转染或感染的宿主细胞在适合条件下培养，以便允许生产感染性病毒粒子。可以将编码病毒基因的核酸并入到质粒中，并通过常规的转染或转化技术引入到宿主细胞中。适合于生产本公开的病毒的示例性宿主细胞包括人类细胞系例如HeLa、Hela-S3、HEK293、911、A549、HER96或PER-C6细胞。具体的生产和纯化条件随着病毒和使用的生产系统而变。对于腺病毒来说，用于病毒粒子的产生的传统方法是穿梭质粒(通常含有少部分腺病毒的基因组并任选地含有可能的转基因表达盒)和腺病毒辅助质粒(含有完整腺病毒基因组的大部分)的共转染和随后的体内重组。

用于产生腺病毒的另一种技术包括使用细菌人工染色体(BAC)系统，利用含有互补腺病毒序列的两个质粒在recA÷细菌菌株中的体内细菌重组，以及酵母人工染色体(YAC)系统。

在生产后，将感染性病毒粒子从培养物回收并任选地纯化。典型的纯化步骤可以包括噬斑纯化、离心例如氯化铯梯度离心、澄清、酶处理例如全能核酸酶(benzonase)或蛋白酶处理、层析步骤例如离子交换层析或过滤步骤。

III.治疗性转基因

本公开的重组腺病毒可以包含编码治疗性转基因的核苷酸序列。在某些实施方式中，本公开的重组病毒可以包含分别编码第一和第二治疗性转基因的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。在某些实施方式中，本公开的重组病毒可以包含分别编码第一、第二和第三治疗性转基因的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列。

治疗性转基因可以编码治疗性核酸例如反义RNA或核酶RNA。所述治疗性转基因可以编码治疗性肽或多肽，例如癌蛋白、肿瘤抑制肽或多肽、酶、细胞因子、免疫调节肽或多肽、抗体、裂解肽、疫苗抗原、补足体细胞中的遗传缺陷的多肽或催化导致细胞死亡的过程的肽或多肽。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因、所述第一、第二和/或第三治疗性转基因或任何所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、p40、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一和/或第二治疗性转基因、所述第一、第二和/或第三治疗性转基因或任何所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因编码CD80，和/或所述第二治疗性转基因编码CD137L。在其他实施方式中，所述第一治疗性转基因编码CD137L，和/或所述第二治疗性转基因编码CD80。CD80是一种辅助刺激分子，其可以在活化幼稚CD8+T细胞中发挥作用。当T细胞受体(TCR)结合到呈递所述TCR识别的肽的抗原呈递细胞(APC)上的I类主要组织相容性复合物(MHC)时，CD8+T细胞被活化。除了所述TCR-MHC相互作用之外，所述T细胞还必须通过T细胞上的CD28分子结合到APC上的CD80或CD86来接受辅助刺激信号。然后所述T细胞变得被活化，分裂并获得对展示同一种肽的其他细胞产生应答的能力。活化也引起T细胞上的其他分子包括CTLA-4和CD137的表达。CTLA-4以比CD28更高的亲和性结合到CD80，并且CTLA-4结合到CD80导致所述T细胞的失活。CD137结合到CD137L，并且在结合后它进一步活化所述T细胞并促进细胞分裂和免疫应答的持续。

在某些实施方式中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自CD80和CD137L，例如所述第一治疗性转基因编码CD80并且所述第二治疗性转基因编码CD137L。编码人类CD80的示例性核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：5中，编码人类CD137L的示例性核苷酸序列描绘在SEQID NO：7中。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：8的核苷酸序列或与SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：8具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列或与SEQ ID NO：27具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述第一、第二和/或第三治疗性转基因选自CD80、CD137L和ICAM-1。例如，所述第一治疗性转基因编码CD80，所述第二治疗性转基因编码CD137L，并且所述第三治疗性转基因编码ICAM-1。编码人类ICAM1的示例性核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：32中。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：32编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5、SEQID NO：7和/或SEQ ID NO：32具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22的核苷酸序列或与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。

在某些实施方式中，所述第一和第二治疗性转基因分别编码异二聚体细胞因子的第一和第二亚基。例如，在某些实施方式中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自IL-23A/p19和p40，其构成异二聚体细胞因子IL-23。例如，所述第一治疗性转基因可以编码IL-23A/p19，并且所述第二治疗性转基因可以编码p40。编码人类IL-23A/p19的示例性核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：12中，并且编码人类p40的示例性核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：10中。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：12和/或SEQ ID NO：10具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述重组腺病毒包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列或与SEQ IDNO：13具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。

此外，在某些实施方式中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自IL-27A/p28和IL-27B/EBI3，其构成异二聚体细胞因子IL-27。例如，所述第一治疗性转基因可以编码IL-IL-27A/p28，并且所述第二治疗性转基因可以编码IL-27B/EBI3。

当肿瘤生长到直径、超过大约2mm³时，它们需要独立的血管网络的增殖以供应营养物和氧并移除废产物。这种新血管形成即新生血管化，被称为肿瘤血管生成。促血管生成因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素8(IL-8)和血管生成素。内皮抑素和血管抑素是天然存在的抗血管生成蛋白，其据报道抑制新生血管化。

在某些实施方式中，所述第一和/或第二治疗性转基因选自内皮抑素和血管抑素。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因是内皮抑素，并且所述第二治疗性转基因是血管抑素。在某些实施方式中，所述第一治疗性转基因是血管抑素，并且所述第二治疗性转基因是内皮抑素。

内皮抑素是胶原蛋白XVIII的蛋白水解片段。对应于NCBI参比序列NP_085059.2的示例性人类胶原蛋白XVIII的氨基酸序列，描绘在SEQ ID NO：33中。内皮抑素可以由胶原蛋白XVIII在不同位点处的蛋白水解切割产生。在胶原蛋白XVIII的C-端处的非胶原1(NC1)结构域通常被认为负责内皮抑素的抗血管生成效应。示例性的人类胶原蛋白XVIII NC1结构域的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：37中。因此，当在本文中使用时，术语“内皮抑素”被理解为意味着包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：37具有高于80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，或任何上述蛋白质的能够例如通过SEQ ID NO：37中呈现的缔合结构域非共价寡聚成三聚体的片段。寡聚化可以通过本领域中已知的任何方法来测定，例如孔径排阻层析、分析型超速离心、散射技术、NMR波谱术、等温滴定量热术、荧光各向异性和质谱术。

在某些实施方式中，本公开的重组病毒包含编码SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的核苷酸序列。

血管抑素是纤溶酶原的蛋白水解片段。对应于NCBI参比序列NP_000292.1的示例性人类纤溶酶原的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：34中。

血管抑素可以从纤溶酶原在不同位点处的蛋白水解切割产生。纤溶酶原具有5个三环(kringle)结构域，其通常被认为负责血管抑素的抗血管生成效应。人类纤溶酶原的第一三环结构域的示例性氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：39中，人类纤溶酶原的第二三环结构域的示例性氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：40中，人类纤溶酶原的第三三环结构域的示例性氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：41中，人类纤溶酶原的第四三环结构域的示例性氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：42中，并且人类纤溶酶原的第五三环结构域的示例性氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：43中。因此，当在本文中使用时，术语“血管抑素”被理解为意味着包含SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，或任何上述蛋白质的能够拮抗内皮细胞迁移和/或内皮细胞增殖的片段。内皮细胞迁移和/或增殖可以通过本领域中已知的任何方法来测定，包括例如在Guo等，(2014)METHODS MOL.BIOL.1135：393-402中描述的方法。

在某些实施方式中，本公开的重组病毒包含编码SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的核苷酸序列。

在某些实施方式中，本公开的重组病毒包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列或与SEQID NO：11具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。

IV.治疗方法

为了治疗性使用，优选地将重组腺病毒与可药用载体联用。当在本文中使用时，“可药用载体”意味着适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。所述载体应该在与配方的其他成分相容并对接受者无害的意义上是“可接受的”。可药用载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和药剂用于药物活性物质的使用在本领域中是已知的。

含有本文公开的重组腺病毒的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其目标给药途径相容。给药途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透黏膜和直肠给药。用于融合蛋白的优选的给药途径是IV输注。有用的配方可以通过制药技术领域中已知的方法来制备。例如参见《Remington制药学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第18版(Mack PublishingCompany，1990)。适合于肠胃外给药的配方组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如EDTA，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的药剂例如氯化钠或右旋糖。

对于静脉内给药来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体在制造和储存条件下应该是稳定的，并且应该针对微生物进行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。

药物配方优选为无菌的。除菌可以通过任何适合的方法例如通过除菌滤膜过滤来实现。当所述组合物被冷冻干燥时，过滤除菌可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行。

当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性组分的量(例如本发明的重组腺病毒的量)。有效量可以在一次或多次给药、施用或剂量中给药，并且不打算限于特定配方或给药途径。

在某些实施方式中，活性组分的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。在某些实施方式中，重组病毒的治疗有效量在10²至10¹⁵噬斑形成单位(pfu)例如10²至10¹⁰、10²至10⁵、10⁵至10¹⁵、10⁵至10¹⁰或10¹⁰至10¹⁵噬斑形成单位的范围内。给药的量取决于多种变量，例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、抗体的体内效能、药物配方和给药途径。初始剂量可以提高到超过上限，以便快速获得所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最适剂量，并且可以在治疗过程中逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计从0.5mg/kg运行到20mg/kg的常规I期升剂量研究中进行优化。给药频率可以随着多种因素而变，例如给药途径、剂量、抗体的血清半衰期和待治疗的疾病。示例性的给药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。优选的给药途径是肠胃外，例如静脉内输注。基于病毒的药物的配制在本领域的普通技术范围之内。在某些实施方式中，重组腺病毒被冷冻干燥，然后在给药时在缓冲盐水中重构。

本文公开的重组腺病毒可用于治疗各种不同的医学指征。例如，所述重组腺病毒可用于治疗癌症。将癌细胞暴露于治疗有效量的所述重组腺病毒，以便抑制或减少所述癌细胞的增殖。本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括向所述受试者单独地或与另一种治疗剂相组合给药有效量的本发明的重组腺病毒，以在所述受试者中治疗所述癌症。在某些实施方式中，向受试者给药有效量的重组腺病毒，将该受试者中的肿瘤负荷降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。

当在本文中使用时，“治疗”意味着受试者中例如人类中疾病的治疗。这包括：(a)抑制所述疾病，即停止其发展；和(b)缓解所述疾病，即引起疾病状态的消退。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠科动物、猴科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等)，更优选地包括人类。

癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系肿瘤和转移病灶。造血系肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或Richter’s综合征(Richter’s转化)。实体肿瘤的实例包括各种不同器官系统的恶性肿瘤例如肉瘤、腺癌和癌，例如影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴系、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和生殖泌尿道(例如肾、尿道上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞例如成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑素瘤)的恶性肿瘤。

在某些实施方式中，所述癌症选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胆管癌、脑癌、子宫内膜癌、神经内分泌癌和胰腺癌。

在某些实施方式中，将重组腺病毒与一种或多种疗法例如手术、放射、化疗、免疫疗法、激素疗法或病毒疗法相组合给药到所述受试者。

在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒与酪氨酸激酶抑制剂例如埃罗替尼相组合给药。

在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒与检验点抑制剂例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体相组合给药。示例性的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(

Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(

Merck Sharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011，Cure Tech)。示例性的抗PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗(Genentech)、duvalumab(AstraZeneca)、MEDI4736、avelumab和BMS 936559(Bristol Myers Squibb Co.)。

当在本文中使用时，术语“相组合”给药被理解为意味着在受试者患有所述障碍的过程中将两种(或更多种)不同治疗递送到所述受试者，使得所述治疗对所述患者的效果在时间点上交叠。在某些实施方式中，在一种治疗的递送仍在进行时开始第二种治疗的递送，使得在给药方面存在交叠。这有时在本文中被称为“同时”或“共同递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方式中，由于组合给药，所述治疗更加有效。例如，所述第二种治疗更加有效，例如使用更少的第二种治疗时观察到等同的效果，或与在不存在所述第一种治疗的情况下给药所述第二种治疗时观察到的相比，所述第二种治疗更大程度地减轻症状，或者对于所述第一种治疗来说观察到类似的情形。在某些实施方式中，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的减轻，大于在递送一种治疗而不存在另一种治疗的情况下观察到的减轻。所述两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加的。所述递送可以使得在递送第二种治疗时，递送的第一种治疗的效果仍然可检测。

在某些实施方式中，所述重组病毒的有效量通过在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答来鉴定，和/或治疗所述受试者的方法还包括在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答。过度增殖性疾病例如癌症可以通过免疫抑制来表征，并且在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答可以指示所述受试者中免疫抑制的水平。因此，在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答可以指示所述治疗的效能和/或所述重组病毒的有效量。所述受试者中针对所述抗原的免疫应答可以通过本领域中已知的任何方法来测量。在某些实施方式中，针对所述抗原的免疫应答通过在所述受试者皮肤上的注射位点处用所述抗原注射所述受试者，并在所述注射位点处测量硬结的大小或炎症的量来测量。在某些实施方式中，针对所述抗原的免疫应答通过在暴露于所述抗原后从所述受试者的细胞释放的细胞因子(例如干扰素-γ、IL-4和/或IL-5)来测量。

在整个本描述中，当病毒、组合物或系统被描述为具有、包括或包含特定组分时，或者当过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物、装置和系统，并且存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。

在本申请中，当要素或组分被称为包含在叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单时，应该理解所述要素或组分可以是所叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自两种或更多种所述叙述的要素或组分。

此外，应该理解，本文描述的病毒、组合物、系统、方法或过程的要素和/或特点可以以本文中明示或暗示的各种不同的方式组合，而不背离本发明的精神和范围。例如，当对特定化合物做出指称时，该化合物可用于本发明的组合物的各种不同实施方式中和/或本发明的方法中，除非从上下文理解不是如此。换句话说，在本申请中，实施方式以能够写出或画出清晰简明的申请的方式进行描述和描绘，但是意图是并且应该认识到的是，实施方式可以进行各种不同的组合或分离，而不背离本发明的教授。例如，应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点可以适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。

应该理解，表述“至少一个”包括在所述表述之后的单独的每个所叙述的物体以及两个或更多个所述叙述的物体的各种不同组合，除非从上下文和用法理解不是如此。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的意义，除非从上下文理解不是如此。

术语“包括”、“具有”或“含有”包括其语法等同语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非上下文另有具体陈述或从上下文理解不是如此。

在本说明书中的各个不同地方，病毒、组合物、系统、过程和方法或其特点成组或以范围公开。具体来说，所述描述包括这些组合和范围的成员的每一个单独的子组合。作为另一个实例，1至20范围内的整数打算单个地公开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。

当在定量值之前使用术语“约”时，本发明还包括所述特定定量值本身，除非另有具体陈述。当在本文中使用时，术语“约”是指从所述标称值变动±10％，除非另有指明或推断。

应该理解，步骤的顺序或用于执行某些行动的顺序并不重要，只要本发明仍然可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中任何和所有的实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅是打算更好地说明本发明，并且除非要求，否则不对本发明的范围做出限制。本说明书中的所有语言都不应该被解释为指示任何未提出权利要求的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。

实施例

下面的实施例仅仅是说明性的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1：表达CD80和CD137L的腺病毒的构建

本实施例描述了表达鼠类形式的CD80和CD137L的重组5型腺病毒(Ad5)的产生。

构建了带有位于E1a起始位点上游-304至-255位处的核苷酸区域的缺失的5型腺病毒病毒，所述缺失使E1a表达具有癌症选择性(正如以前在美国专利号9,073,980中描述的)。得到的病毒在后文中被称为TAV。

将TAV进一步修饰成在E1b-19k区的起始位点处带有SalI位点并在SalI位点的3′方向200个碱基对处带有XhoI位点，以便于治疗性转基因的插入。所述修饰的E1b-19k区的核苷酸序列如下，其中来自于融合的SalI和XhoI位点的残余碱基被下划线：

ATCTTGGTTACATCTGACCTCGTCGAGTCACCAGGCGCTTTTCCAA(SEQ ID NO：15)。

TAV被进一步修饰成带有E3区的RIDα、RIDβ和14.7k基因的dl309中断。所述修饰的E3区的核苷酸序列如下，其中连字符指示缺失的点：

TCTTTTCTCTTACAGTATGA-TAATAAAAAAAAATAATAAAGCATCACTTAC(SEQ ID NO：16)。

得到的包括修饰的E1b-19k区和修饰的E3区两者的病毒，在后文中被称为TAV-Δ19k。

在指明时，将鼠类CD80(mCD80)或人类CD80(hCD80)克隆到所述修饰的E1b-19k区中。

修饰的E1b-19k区中的mCD80的序列如下，其中编码区用小写字母表示，两侧的腺病毒序列包括SalI和XhoI位点用大写字母表示：

修饰的E1b-19k区中的hCD80的序列如下，其中编码区用小写字母表示，两侧的腺病毒序列包括SalI和XhoI位点用大写字母表示：

在指明时，将鼠类CD137L(mCD137L)或人类CD137L(hCD137L)克隆到所述修饰的E3区中。

修饰的E3区中的mCD137L的序列如下，其中编码区用小写字母表示，两侧的腺病毒序列用大写字母表示：

修饰的E3区中的hCD137L的序列如下，其中编码区用小写字母表示，两侧的腺病毒序列用大写字母表示：

此外，在指明时，将人类CD80和CD137L两者克隆到所述修饰的E1b-19k区中，用内部核糖体进入位点(IRES)隔开。在这些情况下，E1b-19k区含有包括终止密码子的人类CD80基因，然后是来自于脑心肌炎病毒的IRES，然后是人类CD137L基因。由于CD80和CD137L基因两者在E1b-19k区中的插入使病毒基因组的大小超过腺病毒的包装极限，因此该病毒在E3区中仍具有RIDα、RIDβ和14.7k基因缺失。

在修饰的E1b-19k区中被IRES隔开的hCD80和hCD137L的序列如下，其中编码区用小写字母表示，两侧的腺病毒序列用大写字母表示，并且中央的IRES用大写字母表示：

测试的病毒的详细情况示出在表1中。

表1

实施例2：CD80和CD137L基因表达

本实施例描述了从如实施例1中所述产生的重组腺病毒表达CD80和/或CD137L。

将ADS-12细胞(小鼠肺腺癌细胞)用TAV-Δ19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137L和TAV-mCD80-137L病毒感染，并将感染的细胞使用免疫细胞化学针对CD80和CD137L进行染色。如图1和图2中所示，在用TAV-mCD80或TAV-mCD80-137L感染后mCD80被表达，并且在用TAV-mCD137L或TAV-mCD80-137L感染后CD137L被表达。重要的是，两种基因均与TAV-mCD80-137L病毒一起被表达，证实了所述单一病毒驱动两种治疗性基因的表达。

将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)用TAV-A19k和TAV-mCD80-137L病毒感染，并将感染的细胞使用免疫细胞化学针对CD80和CD137L进行染色。与使用ADS-12细胞时相同，在用TAV-mCD80-137L感染后CD80和CD137L两者都被表达(图3和图4)。

将A549细胞(人类肺癌细胞)、WI-38细胞(非癌性人类肺成纤维细胞)和MRC5细胞(非癌性人类肺成纤维细胞)用TAV-A19k和TAV-hCD80-137L病毒感染，并将感染的细胞使用免疫细胞化学针对CD80和CD137L进行染色。如图5中所示，TAV-hCD80-137L病毒在癌性A549细胞中诱导人类CD80和人类CD137L的表达，并且在非癌性WI-38和MRC5细胞中诱导很低或不诱导表达。这些结果证实在人类以及鼠类细胞中可以实现双转基因的表达，并且转基因的表达可以对癌性细胞具有选择性。

将A549细胞(人类肺癌细胞)用TAV-Δ19k和TAV-hCD80-IRES-137L病毒感染，并将感染的细胞使用免疫细胞化学针对CD80和CD137L进行染色。如图6中所示，TAV-hCD80-IRES-137L病毒在癌性A549细胞中诱导人类CD80和人类CD137L两者的表达。这些结果证实通过将两个转基因插入到单一基因组区例如E1b-19k区中并用内部核糖体进入位点(IRES)隔开，可以实现双转基因的表达。

实施例3：表达CD80和CD137L的腺病毒的细胞毒性

本实施例描述了如实施例1中所述产生的表达CD80和CD137L的重组腺病毒的细胞毒性。

将A549细胞(人类肺癌细胞)、WI-38细胞(非癌性人类肺成纤维细胞)和MRC5细胞(非癌性人类肺成纤维细胞)用TAV-A19k和TAV-hCD80-137L病毒感染，并将感染的细胞在感染后指示的时间点用结晶紫染色，所述结晶紫将活细胞染为蓝色。

如图7中所示，TAV-hCD80-137L在A549细胞中是裂解性的，但在WI-38或MRC5细胞中不是。这些结果证实TAV-hCD80-137L病毒相比于非癌性细胞可以选择性裂解癌性细胞。

将ADS-12细胞用TAV-A19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137L和TAV-mCD80-137L病毒感染，并将感染的细胞在感染后指示的时间点用结晶紫染色，所述结晶紫将活细胞染为蓝色。图8中示出的结果证实TAV-mCD80、TAV-mCD137L和TAV-mCD80-137L病毒相比于非癌性细胞可以选择性裂解癌性细胞。

实施例4：表达CD80和CD137L的腺病毒的复制

本实施例描述了如实施例1中所述产生的表达CD80和CD137L的重组腺病毒在癌性细胞中的复制。

将ADS细胞一式三份用TAV-A19k、TAV-CD80、TAV-CD137L和TAV-CD80-137L病毒以1的MOI感染。在感染后5天收获细胞和培养基，并通过噬斑测定法确定病毒滴度。

如图9中所示，所述病毒可以在癌性细胞中有效复制。

实施例5：表达CD80和CD137L的腺病毒的抗癌活性

本实施例描述了如实施例1中所述产生的表达CD80和/或CD137L的重组腺病毒的抗癌活性。

将带有ADS-12肿瘤的129S4小鼠用TAV-Δ19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137L或TAV-mCD80-137L的三次肿瘤内注射进行治疗。结果示出在图10中。用TAV-mCD80治疗的小鼠具有与用TAV-Δ19k治疗的小鼠可比的肿瘤生长。用TAV-mCD137L治疗的小鼠显示出未达到统计显著性的肿瘤大小较小的趋势，用TAV-mCD80-137L治疗的小鼠的肿瘤明显更小。这些结果证实，表达CD80和137L的双基因腺病毒在减小肿瘤大小中最为有效。

在独立的实验中，将带有ADS-12肿瘤的129S4小鼠用TAV-A19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137L或TAV-mCD80-137L的三次肿瘤内注射进行治疗。结果示出在图11中。用TAV-mCD80-137L治疗的小鼠具有更小的肿瘤大小。这些结果证实，表达CD80和137L的双基因腺病毒在减小肿瘤大小中最为有效。

将带有原位植入到乳腺脂肪垫中的4T1肿瘤的BALB/c小鼠用TAV-A19k或TAV-mCD80-137L的三次肿瘤内给药进行治疗。同样地，用TAV-mCD80-137L治疗的小鼠与用对照病毒TAV-Δ19k治疗的小鼠相比具有明显更小的肿瘤(图12)。

实施例6：表达CD80、CD137L和ICAM-1的腺病毒的构建

本实施例描述了表达鼠类形式的CD80、CD137L和ICAM-1的重组5型腺病毒(Ad5)的产生。ICAM-1是一种细胞粘附分子，其由抗原呈递细胞(APC)表达，并通过结合到T细胞表面上的LFA1使APC与T-细胞之间的相互作用稳定。

构建了一种5型腺病毒病毒，其带有位于E1a起始位点上游-304至-255位处的核苷酸区的缺失，所述缺失使E1a的表达是癌症选择性的(如以前在美国专利号9,073,980中所述)。得到的病毒在后文中被称为TAV。

将TAV进一步修饰成在E1b-19k区的起始位点处带有SalI位点并在所述SalI位点3′方向200个碱基对处带有XhoI位点，以便于治疗性转基因的插入。所述修饰的E1b-19k区的核苷酸序列如下，其中来自于融合的SalI和XhoI位点的残余碱基被下划线：

ATCTTGGTTACATCTGACCTCGTCGAGTCACCAGGCGCTTTTCCAA(SEQ ID NO：15)。

将TAV进一步修饰，以从E3区缺失腺病毒死亡蛋白(ADP)、RIDα、RIDβ和14.7k基因。所述修饰的E3区的核苷酸序列如下，其中连字符指示缺失的点：

TTATTGAGGAAAAGAAAATGCCTTAA-TAAAAAAAAATAATAAAGCATCACTTAC(SEQ ID NO：24)。

将TAV进一步修饰，以缺失除了E4-ORF6/7之外的E4区。所述修饰的E4区的核苷酸序列如下，其中连字符指示缺失的点：

GAACGCCGGACGTAGTCAT-AACAGTCAGCCTTACCAGTAAA(SEQ ID NO：25)。

将鼠类CD80(mCD80)的蛋白质编码区、然后是EMCV IRES、然后是鼠类CD137L(mCD137L)的蛋白质编码区、然后是FMDV IRES、然后是鼠类ICAM-1(mICAM-1)的蛋白质编码区克隆到E1b-19k位点中。得到的病毒在后文中被称为TAV-mCD80-137L-ICAM

所述E1b-19k区中的mCD80-EMCV IRES-137L-FMDV IRES-ICAM插入片段的核苷酸序列如下，其中编码区用大写字母表示，IRES用小写字母表示，两侧的E1b-19k序列包括SalI和XhoI限制性位点被下划线：

此外，将人类CD80(hCD80)的蛋白质编码区、然后是EMCV IRES、然后是人类CD137L(hCD137L)的蛋白质编码区、然后是FMDV IRES、然后是人类ICAM-1(hICAM-1)的蛋白质编码区克隆到E1b-19k位点中。得到的病毒在后文中被称为TAV-hCD80-137L-ICAM。

所述E1b-19k区中的hCD80-EMCV IRES-137L-FMDV IRES-ICAM插入片段的核苷酸序列如下，其中编码区用大写字母表示，IRES用小写字母表示，两侧的E1b-19k序列包括SalI和XhoI限制性位点被下划线：

实施例7：CD80、CD137L和ICAM-1基因的表达

本实施例描述了从如实施例6中所述产生的重组腺病毒表达CD80、CD137L和ICAM-1。

将ADS-12细胞(小鼠肺腺癌细胞)用TAV-mCD80-137L-ICAM病毒以10的MOI感染或保持作为未感染的对照，并在感染后4天通过免疫细胞化学针对CD80、CD137L和ICAM-1进行染色。如图13中所示，使用TAV-mCD80-137L-ICAM病毒时每个基因被表达，证实了所述单一病毒驱动了三个治疗性基因的表达。

将F244细胞(小鼠肉瘤细胞)用TAV-mCD80-137L-ICAM病毒以5的MOI感染或保持作为未感染的对照，并在感染后3天通过免疫细胞化学针对CD80、CD137L和ICAM-1进行染色。如图14中所示，使用TAV-mCD80-137L-ICAM病毒时每个基因被表达，证实了所述单一病毒驱动了三个治疗性基因的表达。

将HT29(人类结肠直肠腺癌细胞)用TAV-mCD80-mCD137L-mICAM-1病毒以5的MOI感染或保持作为未感染的对照，并在感染后3天通过免疫细胞化学针对CD80、CD137L和ICAM-1进行染色。如图15中所示，使用TAV-mCD80-137L-ICAM病毒时每个基因被表达，证实了所述单一病毒驱动了三个治疗性基因的表达。

实施例8：表达CD80、CD137L和ICAM-1的腺病毒的抗癌活性

本实施例描述了表达CD80和CD137L的重组腺病毒和表达CD80、CD137L和ICAM-1的腺病毒的抗癌活性。

将带有ADS-12肿瘤的129S4小鼠用缓冲液、TAV-mCD80-137L(如实施例1中所述产生1)或TAV-mCD80-137L-ICAM(如实施例6中所述产生)的三次肿瘤内注射进行治疗。结果示出在图16中。与用缓冲液治疗相比，用TAV-mCD80-137L治疗的小鼠中的肿瘤更小。与用TAV-mCD80-m137L或缓冲液治疗相比，用TAV-mCD80-137L-ICAM治疗的小鼠的肿瘤更小，其中许多小鼠显示出肿瘤体积完全丧失。这些结果证实，表达CD80和137L的病毒和表达CD80、CD137L和mICAM-1的病毒在减小肿瘤大小中有效。

实施例9：表达内皮抑素和血管抑素的腺病毒的构建

本实施例描述了表达内皮抑素和血管抑素的重组5型腺病毒(Ad5)的构建。

对带有5型腺病毒基因组序列的5′部分的质粒进行修饰，以带有位于E1a起始位点上游-304至-255位处的核苷酸区的缺失，所述缺失使E1a的表达是癌症选择性的(如以前在美国专利号9,073,980中所述)。所述修饰的质粒在后文中被称为TAV质粒，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为TAV病毒。

将所述TAV质粒进一步修饰，以在E1b-19k区的起始位点处带有SalI位点并在所述SalI位点的3′方向200个碱基对处带有XhoI位点，以便于治疗性转基因的插入。为了缺失所述200个碱基对的E1b-19k区，将所述质粒用SalI和XhoI切开并自连。所述修饰的E1b-19k区的核苷酸序列如下，其中来自于所述融合的SalI和XhoI位点的残余碱基被下划线：

ATCTTGGTTACATCTGACCTCGTCGAGTCACCAGGCGCTTTTCCAA(SEQ ID NO：15)。

另外，将编码人类胶原蛋白XVIII的1-23位氨基酸残基(对应于信号肽)、然后是人类胶原蛋白XVIII的1318-1516位残基(对应于C-端片段)的核苷酸序列、然后是脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、然后是编码人类纤溶酶原的1-19位氨基酸残基(对应于信号肽)、然后是人类纤溶酶原的97-549位残基(对应于三环结构域1-5)的核苷酸序列克隆到所述修饰的E1b-19k区中。所有人类胶原蛋白XVIII的氨基酸残基编号是相对于在本文中被描绘为SEQ IDNO：33的NCBI参考序列：NP_085059.2。所有人类纤溶酶原的氨基酸残基编号是相对于在本文中被描绘为SEQ ID NO：34的NCBI参考序列：NP_000292.1。所述修饰的质粒在后文中被称为TAV-hEndo-IRES-hAng质粒，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为TAV-hEndo-IRES-hAng病毒。所述E1b-19k区中的TAV-hEndo-IRES-hAng质粒的核苷酸序列如下，其中编码区用大写字母表示，IRES用小写字母表示，并且两侧的E1b-19k序列包括SalI和XhoI限制性位点被下划线：

另外，将编码小鼠胶原蛋白XVIII的1-26位氨基酸残基(对应于信号肽)、然后是小鼠胶原蛋白XVIII的1577-1774位残基(对应于C-端片段)的核苷酸序列、然后是脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、然后是编码小鼠纤溶酶原的1-19位氨基酸残基(对应于信号肽)、然后是小鼠纤溶酶原的96-549位残基(对应于三环结构域1-5)的核苷酸序列克隆到所述修饰的E1b-19k区中。所述修饰的质粒在后文中被称为TAV-Endo-IRES-Ang质粒，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为TAV-Endo-IRES-Ang病毒。所述E1b-19k区中的TAV-Endo-IRES-Ang质粒的核苷酸序列如下，其中编码区用大写字母表示，IRES用下鞋子吗表示，并且两侧的E1b-19k序列包括SalI和XhoI限制性位点被下划线：

将所描述的各种不同质粒与带有5型腺病毒基因组序列(基于毒株dl309)的剩余部分的其他质粒一起，用于产生重组腺病毒。

通过参考并入

本文中提到的每个专利文献和科学论文的整个公开内容为所有目的通过参考并入本文。

等同性

本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方式应该在所有情况下被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且打算将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims

1.一种重组腺病毒，其包含：

(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19K插入位点中，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间；和

(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒是5型腺病毒(Ad5)。

3.如权利要求1或2所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-19K的终止位点之间。

4.如权利要求1-3任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。

5.如权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸的缺失。

6.如权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的202个核苷酸的缺失。

7.如权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的203个核苷酸的缺失。

8.如权利要求1-7任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917位核苷酸的缺失。

9.如权利要求1-7任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1916位核苷酸的缺失。

10.如权利要求1-9任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核苷酸之间。

11.如权利要求1-9任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1916位的核苷酸之间。

12.如权利要求1-11任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间。

13.如权利要求1-12任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。

14.如权利要求1-13任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。

15.如权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。

16.如权利要求1-15任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。

17.如权利要求1-16任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。

18.如权利要求1-17任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失。

19.如权利要求1-18任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063个核苷酸的缺失。

20.如权利要求1-18任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1064个核苷酸的缺失。

21.如权利要求1-18任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。

22.如权利要求1-21任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。

23.如权利要求1-22任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773和30836位的核苷酸之间。

24.如权利要求1-23任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间。

25.如权利要求1-24任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第二治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。

26.如权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。

27.如权利要求26所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失。

28.如权利要求26或27所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。

29.如权利要求26-28任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。

30.如权利要求26-29任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。

31.如权利要求26-30任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间。

32.如权利要求26-31任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第二治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。

33.一种重组腺病毒，其包含：

(a)编码第一治疗性转基因的第一核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中；和

(b)编码第二治疗性转基因的第二核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，

其中所述E1b-19k插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间，并且其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被第一内部核糖体进入位点(IRES)隔开。

34.如权利要求33所述的重组腺病毒，其中所述腺病毒是5型腺病毒(Ad5)。

35.如权利要求33或34所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点与E1b-19K的终止位点之间。

36.如权利要求33-35任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。

37.如权利要求33-36任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸的缺失。

38.如权利要求33-37任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的202个核苷酸的缺失。

39.如权利要求33-37任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的203个核苷酸的缺失。

40.如权利要求33-39任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1917位核苷酸的缺失。

41.如权利要求33-39任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1b-19K插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714-1916位核苷酸的缺失。

42.如权利要求33-41任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1917位的核苷酸之间。

43.如权利要求33至31任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的1714和1916位的核苷酸之间。

44.如权利要求33-43任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间。

45.如权利要求33-44任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述IRES、所述第二治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。

46.如权利要求33-45任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其被插入到E1b-19k插入位点中，其中所述第二核苷酸序列和第三核苷酸序列被第二内部核糖体进入位点(IRES)隔开。

47.如权利要求46所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：1)与TCACCAGG(SEQ ID NO：2)之间。

48.如权利要求46或47所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：1)、所述第一治疗性转基因、所述第一IRES、所述第二治疗性转基因、所述第二IRES、所述第三治疗性转基因和TCACCAGG(SEQ ID NO：2)。

49.如权利要求33-48任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒还包含E3缺失，其中所述E3缺失位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。

50.如权利要求49所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。

51.如权利要求49或50所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。

52.如权利要求49-51任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失位于E3-10.5K的终止位点和E3-14.7K的终止位点和Fiber的起始位点之间。

53.如权利要求49-52任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。

54.如权利要求49-53任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失。

55.如权利要求49-54任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063个核苷酸的缺失。

56.如权利要求49-54任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1064个核苷酸的缺失。

57.如权利要求49-54任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含对应于所述Ad5dl309 E3缺失的缺失。

58.如权利要求49-57任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。

59.如权利要求49-51任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。

60.如权利要求59所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失。

61.如权利要求59或60所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。

62.如权利要求59-61任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。

63.如权利要求33-45任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码第三治疗性转基因的第三核苷酸序列，其插入到E3插入位点中，其中所述E3插入位点位于pVIII的终止位点与Fiber的起始位点之间。

64.如权利要求63所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含约500至约3185、约500至约3000、约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约3185、约1000至约3000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约3185、约1500至约3000、约1500至约2000、约2000至约3185、约2000至约3000、约2000至约2500、约2500至约3185、约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。

65.如权利要求63或64所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-gp19K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。

66.如权利要求63-65任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点位于E3-10.5K的终止位点与E3-14.7K的终止位点之间。

67.如权利要求63-66任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约500至约1551、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1551、约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。

68.如权利要求63-67任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的约1050个核苷酸的缺失。

69.如权利要求63-68任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1063个核苷酸的缺失。

70.如权利要求63-68任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-10.5K的终止位点的1064个核苷酸的缺失。

71.如权利要求63-68任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5 dl309 E3缺失的缺失。

72.如权利要求63-71任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773-30836位核苷酸的缺失。

73.如权利要求63-72任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29773和30836位的核苷酸之间。

74.如权利要求63-73任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到CAGTATGA(SEQ ID NO：3)与TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)之间。

75.如权利要求63-74任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含CAGTATGA(SEQ ID NO：3)、所述第三治疗性转基因和TAATAAAAAA(SEQ ID NO：4)。

76.如权利要求63-65任一项所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约500至约1824、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约1824、约1000至约1500或约1500至约1824个核苷酸的缺失。

77.如权利要求76所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的约1600个核苷酸的缺失。

78.如权利要求76或77所述的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含邻近所述E3-gp19K的终止位点的1622个核苷酸的缺失。

79.如权利要求76-78任一项所示的重组腺病毒，其中所述E3插入位点包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218-30839位核苷酸的缺失。

80.如权利要求76-79任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的29218和30839位的核苷酸之间。

81.如权利要求76-80任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因被插入到TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)与TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)之间。

82.如权利要求76-81任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒以5’至3’的方向包含TGCCTTAA(SEQ ID NO：29)、所述第三治疗性转基因和TAAAAAAAAAT(SEQ ID NO：30)。

83.如权利要求33-82任一项所述的重组腺病毒，其中所述IRES选自脑心肌炎病毒IRES、口蹄疫病毒IRES和脊髓灰质炎病毒IRES。

84.如权利要求1-83任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒还包含E4缺失，其中所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与右侧末端反向重复序列(ITR)之间。

85.如权利要求84所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点之间。

86.如权利要求84或85所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约2500、约1500至约2000、或约2000至约2500个核苷酸的缺失。

87.如权利要求84-86任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约250至约1500、约250至约1250、约250至约1000、约250至约750、约250至约500、500至约1500、约500至约1250、约500至约1000、约500至约750、750至约1500、约750至约1250、约750至约1000、约1000至约1500、约1000至约1250或约1250至约1500个核苷酸的缺失。

88.如权利要求84-87任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的约1450个核苷酸的缺失。

89.如权利要求84-88任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含邻近所述E4-ORF6/7的起始位点的1449个核苷酸的缺失。

90.如权利要求84-89任一项所述的重组腺病毒，其中所述E4缺失包含对应于所述Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的34078-35526位核苷酸的缺失。

91.如权利要求1-90任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因不可操作连接到外源启动子序列。

92.如权利要求46-90任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因不可操作连接到外源启动子序列。

93.如权利要求1-90任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因都不可操作连接到外源启动子序列。

94.如权利要求1-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约4000至约5000个核苷酸。

95.如权利要求1-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000或约6000至约7000个核苷酸。

96.如权利要求46-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约4000至约5000个核苷酸。

97.如权利要求46-93任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。

98.如权利要求1-97任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000或约4000至约5000个核苷酸。

99.如权利要求1-97任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000或、约6000至约7000个核苷酸。

100.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000、或约4000至约5000个核苷酸。

101.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。

102.如权利要求46-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000、或约4000至约5000个核苷酸。

103.如权利要求46-99任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。

104.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约5000、约3000至约4000、或约4000至约5000个核苷酸。

105.如权利要求1-99任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小至少包含约500至约7000、约500至约6000、约500至约5000、约500至约4000、约500至约3000、约500至约2000、约500至约1000、约1000至约7000、约1000至约6000、约1000至约5000、约1000至约4000、约1000至约3000、约1000至约2000、约2000至约7000、约2000至约6000、约2000至约5000、约2000至约4000、约2000至约3000、约3000至约7000、约3000至约6000、约3000至约5000、约3000至约4000、约4000至约7000、约4000至约6000、约4000至约5000核苷酸、约5000至约7000、约5000至约6000、或约6000至约7000个核苷酸。

106.如权利要求1-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、或约5000个核苷酸。

107.如权利要求1-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。

108.如权利要求46-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、或约5000个核苷酸。

109.如权利要求46-105任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。

110.如权利要求1-109任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000或约5000个核苷酸。

111.如权利要求1-109任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含至少约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、或约7000个核苷酸。

112.如权利要求1-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约1650个核苷酸。

113.如权利要求1-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因的组合大小包含约3100个核苷酸。

114.如权利要求46-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约1650个核苷酸。

115.如权利要求46-111任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和第三治疗性转基因的组合大小包含约3100个核苷酸。

116.如权利要求1-115任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约1650个核苷酸。

117.如权利要求1-115任一项所述的重组腺病毒，其中每个所述治疗性转基因的组合大小包含约3100个核苷酸。

118.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。

119.如权利要求46-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。

120.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中任一所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1和TGF-β阱的治疗性多肽。

121.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

122.如权利要求46-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

123.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中任一所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23A/p19、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

124.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

125.如权利要求46-117任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

126.如权利要求1-117任一项所述的重组腺病毒，其中任一所述治疗性转基因编码选自CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、内皮抑素、血管抑素、ICAM-1、TGF-β阱、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、乙酰胆碱、干扰素-γ、DKK1/Wnt、p53、胸苷激酶、抗PD-1抗体重链或轻链、和抗PD-L1抗体重链或轻链的治疗性多肽。

127.如权利要求1-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和第二治疗性转基因分别编码异二聚体细胞因子的第一和第二亚基。

128.如权利要求1-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因选自CD80和CD137L。

129.如权利要求46-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一、第二和/或第三治疗性转基因选自CD80、CD137L和ICAM-1。

130.如权利要求127或128所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因编码CD80。

131.如权利要求127-130任一项所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因编码CD137L。

132.如权利要求128-131任一项所述的重组腺病毒，其中所述第三治疗性转基因编码ICAM-1。

133.如权利要求128-132任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列的核苷酸序列。

134.如权利要求128-133任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ IDNO：6的核苷酸序列。

135.如权利要求128-134任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的核苷酸序列。

136.如权利要求128-135任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ IDNO：8的核苷酸序列。

137.如权利要求128-136任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ IDNO：27的核苷酸序列。

138.如权利要求128-137任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码由SEQ ID NO：32编码的氨基酸序列的核苷酸序列。

139.如权利要求128-128任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ IDNO：31或SEQ ID NO：9的核苷酸序列。

140.如权利要求128-137任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ IDNO：31的核苷酸序列。

141.如权利要求128-137任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ IDNO：22的核苷酸序列。

142.如权利要求1-127任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因选自IL-27A/p28和IL-27B/EBI3。

143.如权利要求142所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因编码IL-27A/p28。

144.如权利要求142或143所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因编码IL-27B/EBI3。

145.如权利要求1-126任一项所述的重组腺病毒，其中所述第一和/或第二治疗性转基因选自内皮抑素和血管抑素。

146.如权利要求145所述的重组腺病毒，其中所述第一治疗性转基因编码内皮抑素。

147.如权利要求145或146所述的重组腺病毒，其中所述第二治疗性转基因编码血管抑素。

148.如权利要求145-147任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码SEQID NO：37或SEQ ID NO：38的氨基酸序列的核苷酸序列。

149.如权利要求145-148任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码SEQID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44的氨基酸序列的核苷酸序列。

150.如权利要求145-149任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含SEQ IDNO：11的核苷酸序列。

151.如权利要求1-150任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒还包含Pea3结合位点或其功能性片段的缺失。

152.如权利要求151所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于E1a的起始位点上游约-300至约-250位的核苷酸的缺失。

153.如权利要求151或152所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于E1a的起始位点上游-305至-255位的核苷酸的缺失。

154.如权利要求151或152所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含对应于E1a的起始位点上游-304至-255位的核苷酸的缺失。

155.一种重组腺病毒，其包含SEQ ID NO：14或与SEQ ID NO：14具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

156.如权利要求1-155任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖性细胞中复制。

157.如权利要求1-156任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖性细胞中表达所述第一和/或第二治疗性转基因。

158.如权利要求46-157任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在过度增殖性细胞中表达所述第一、第二和/或第三治疗性转基因。

159.如权利要求156-158任一项所述的重组腺病毒，其中所述过度增殖性细胞是癌细胞。

160.如权利要求1-159任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒是溶瘤病毒。

161.一种药物组合物，其包含权利要求1-160任一项的重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。

162.一种在靶细胞中表达两个治疗性转基因的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以表达所述两个治疗性转基因。

163.一种在靶细胞中表达三个治疗性转基因的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求46-160任一项的重组腺病毒，以便表达所述三个治疗性转基因。

164.一种抑制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以抑制所述肿瘤细胞的增殖。

165.一种在需要的受试者中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以抑制所述肿瘤的生长。

166.一种在需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-160任一项的重组腺病毒，以在所述受试者中治疗所述癌症。

167.如权利要求166所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、皮肤的鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、乳腺癌、肛门癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、胃食管癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胆管癌、脑癌、子宫内膜癌、神经内分泌癌、梅克尔细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤和胰腺癌。

168.如权利要求165-167所述的方法，其中所述重组腺病毒与选自手术、放射、化疗、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法的一种或多种疗法相组合给药。

169.如权利要求162-168任一项所述的方法，其中所述重组腺病毒的有效量是10²-10¹⁵噬斑形成单位(pfu)。

170.如权利要求165-169任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

171.如权利要求170所述的方法，其中所述受试者是人类儿童。

172.如权利要求165-171任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答。

173.如权利要求165-172任一项所述的方法，其中所述重组病毒的有效量通过在所述受试者中测量针对抗原的免疫应答来鉴定。

174.如权利要求172或173所述的方法，其中所述针对抗原的免疫应答通过在所述受试者皮肤上的注射位点处用所述抗原注射所述受试者并在所述注射位点处测量硬结的大小来测量。