CN102791857A - 小鼠人工染色体载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种小鼠人工染色体载体，涉及携带该载体的细胞或非人类动物以及该细胞或非人类动物的使用，所述小鼠人工染色体载体的特征在于，含有源自小鼠染色体的天然着丝粒、从着丝粒附近的小鼠染色体长臂部位中缺失长臂远端而成的源自小鼠染色体的长臂片段及端粒序列，以及可被稳定地携带在哺乳类的细胞及个体组织中。

Description

小鼠人工染色体载体
技术领域
本发明涉及一种稳定地携带在啮齿类体内且可进行子代传递(子孫伝達)的小鼠人工染色体载体。
本发明还涉及一种携带上述小鼠人工染色体载体的细胞。
本发明进一步涉及携带上述小鼠人工染色体载体的小鼠等非人类动物。
背景技术
转基因小鼠由于通过导入基因搭载载体来利用靶基因和表达产物而被广泛使用。但是，在迄今为止的转基因小鼠中，基因导入的位点是随机的，有时导入基因的表达由于导入的位置效应而被抑制，另外，对现有的基因导入法而言，无法控制拷贝数，尺寸也限定在200kb左右。由此，难以将对于哺乳动物基因并不罕见的超过200kb大小的基因或基因簇克隆到包含控制区域的载体上。因此，现有的基因导入法存在无法重现及检验导入基因原本的功能的限制。
针对这样的问题，本发明人等开发了使用染色体水平导入基因这样新的染色体导入法的染色体导入小鼠的制作技术(非专利文献1)。通过该技术将人类染色体或其片段导入小鼠胚胎干(ES)细胞来制作嵌合小鼠，结果显示人类染色体片段被独立携带，多个人类基因进行组织特异性表达，也存在经过减数分裂可片段性地进行子代传递的人类染色体。另外，本发明人等将人类21号染色体总长(约35Mb)导入小鼠，制作在实用方面也具有高价值的唐氏综合征模型小鼠(非专利文献2)。对该小鼠进行分析，结果导入的人类21号染色体上的基因重现生理性的表达模式，显示染色体载体的有效性。
进而，本发明人等利用染色体工程技术方法，即，使用人工端粒序列的端粒截短技术进行的染色体缺失以及Cre/loxP系统进行的染色体克隆，可构建仅含有目标区域的人类人工染色体，其结果也显示了成功地构建了含有兆碱基(Mb)大小的特定人类染色体区域的人类人工染色体(HAC，Human Artificial Chromosme)载体，该载体在小鼠个体中起作用(非专利文献3)。进而，应用上述技术构建了不含已知基因的新型HAC载体(非专利文献4)。另外，本发明者人等基于上述背景，将搭载有靶基因的HAC载体导入任何的细胞，成功实现了靶基因的稳定表达。进而，作为应用HAC载体建模人型小鼠的实例，将人类7号染色体上的药物代谢酶CYP3A基因簇(1Mb)和人类X连锁型肌营养不良症的致病基因即人类DMD基因(2.5Mb)分别克隆到HAC载体上(CYP3A-HAC，DMD-HAC)，导入小鼠ES细胞制作小鼠(专利文献1，非专利文献5)。
由导入有CYP3A-HAC的小鼠的组织携带率和表达分析表明，HAC上的CYP3A基因簇被携带在小鼠的各组织中(专利文献1的图8)，其表达模式与人类组织中的模式相同，在肝脏、小肠中特异性表达。进而，由DMD-HAC导入小鼠的组织携带率和表达分析的分析表明，在小鼠的各个组织中携带有DMD-HAC(非专利文献5的图4A)，已知在人类中组织特异性表达的剪接异构体中的至少3种以与人类同样的方式进行表达。由这一系列的结果暗示了作为代替以往的转基因小鼠的HAC导入小鼠用于新的基因(组)导入方法的有用性。
含有人类人工染色体的哺乳类人工染色体载体具有以往的载体体系(病毒、YAC、BAC、PAC、粘粒、质粒)中所没有的优点，因此，可期待用作新的基因的功能分析及人型模型动物的制作体系。例如在专利文献2及3中公开有一种HAC载体，其由改变人类14号染色体或人类21号染色体并缩小其大小而成的染色体的片段构成且较稳定地携带在细胞中。
但是，在使对以往的基因改造小鼠而言不可能的Mb单位的基因导入变为可能的人类21号染色体导入小鼠(唐氏综合征模型小鼠)或HAC载体导入小鼠中，存在如下等问题：这些人类染色体载体的携带率降低、在组织间或个体间变异、子代传递的频率不稳定。因此，常需要考虑HAC载体等的携带率，另外，在对特定的基因区域所具有的功能及与疾病的关系进行研究的情况下，有时也难以在组织细胞水平下详细且准确地对靶基因的表达动态及表达产物进行分析，阻碍高重现性的均匀分析。
进而，另外，在对小鼠细胞和人类细胞进行细胞融合时，已知人类染色体在小鼠细胞内不稳定。这样，由于含有人类人工染色体载体的人类染色体在小鼠细胞内携带率不恒定，因此，在将人类人工染色体载体导入小鼠细胞的情况及制作转基因小鼠的情况下，无法充分地发挥作为人工染色体载体的优点。在转基因小鼠细胞或制作转基因小鼠的基础上，今后通过提高导入基因的携带率或使其恒定，可进行更详细且准确并且重现性高的基因功能的分析或基因表达产物的有效的回收。
现有技术文献
专利文献
专利文献1国际公开WO2009/063722号小册子
专利文献2国际公开WO2004/031385号小册子
专利文献3日本特开2007-295860号公报
非专利文献
非专利文献1Tomizuka等，Nat Genet，16：133-143，1997
非专利文献2Shinohara等，HMG，10：1163-75，2001
非专利文献3Kuroiwa等，Nat Biotech，18：1086-1090，2000
非专利文献4Katoh等，BBRC，321：280-290，2000
非专利文献5Hoshiya等，Mol Ther，17：309-17，2009
发明内容
发明要解决的课题
迄今为止所报告的许多哺乳类人工染色体为人类人工染色体(日本特开2005-230020；日本特开2008-54501；日本特开2007-306928；日本特开2007-295860)，但也存在极少数关于小鼠人工染色体的报告，该人工染色体的特征在于，利用小鼠着丝粒的一部分的序列(S.Stewart等(2002)GeneTherapy 9：719-723)。
如上所述，在将天然人类染色体片段移入小鼠细胞时，人类染色体片段在小鼠细胞内不稳定(例如，Shinohara等(2000)Chromosome Research，8：713-725)。这在小鼠个体内也同样，人类人工染色体在小鼠各组织内不稳定，携带在小鼠组织细胞内的人类人工染色体的比例(携带率)有降低的趋势，小鼠组织细胞的携带率不恒定。或者，在小鼠个体间也同样，人类人工染色体在小鼠个体间的携带率不恒定。由于这样的在小鼠组织间及个体间的不均匀的携带率，难以使用通过人类人工染色体导入靶基因(组)的小鼠细胞或者小鼠个体对导入基因进行详细且准确并且重现性高的分析。
如上所述，对于源自包括小鼠的啮齿类的人工染色体，与其相关的报告非常少，不存在可稳定地维持在啮齿类细胞内或个体内的人工染色体。本发明的目的在于提供一种小鼠人工染色体载体，其中，所导入的靶基因(组)可稳定地维持在啮齿类细胞内或啮齿类个体内，由此可进行详细且准确并且重现性高的分析。
用于解决课题的手段
概括而言，本发明包含以下的特征。
(1)一种小鼠人工染色体载体，特征在于，含有源自小鼠染色体的天然着丝粒、从着丝粒附近的小鼠染色体长臂部位中缺失长臂远端而成的源自小鼠染色体的长臂片段及端粒序列，以及可被稳定地携带在哺乳类的细胞及组织中。
(2)根据上述(1)所述的小鼠人工染色体载体，其中，小鼠染色体为1～19号染色体中的任何一个。
(3)根据上述(1)或(2)所述的小鼠人工染色体载体，其中，源自小鼠染色体的长臂片段由从小鼠1～19号染色体中的任何一个的长臂中缺失其总内源性基因数的至少99.5％而成的剩余部分构成。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，含有保藏细胞株DT40 B6bT-1(FERM BP-11128)中所含的小鼠人工染色体作为基本结构。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，哺乳类为啮齿类。
(6)根据上述(5)所述的小鼠人工染色体载体，其中，啮齿类为小鼠、大鼠或仓鼠。
(7)根据上述(1)～(6)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，还含有一个或多个DNA序列插入位点。
(8)根据上述(7)所述的小鼠人工染色体载体，其中，DNA序列插入位点为位点特异重组酶的识别位点。
(9)根据上述(7)或(8)所述的小鼠人工染色体载体，其中，DNA序列插入位点为loxP序列、FRT序列、
Figure BDA00002103887500051
及
Figure BDA00002103887500052
序列、R4attB及R4attP序列、TP901-1attB及TP901-1attP序列或者Bxb1attB及Bxb1attP序列。
(10)根据上述(1)～(9)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，还含有报告基因、选择标记基因或两者。
(11)根据上述(1)～(10)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，还含有外源DNA序列。
(12)根据上述(1)～(11)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列的尺寸为200kb以上。
(13)根据上述(11)或(12)所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为人类DNA序列。
(14)根据上述(11)～(13)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为药物代谢相关基因的DNA序列。
(15)根据上述(14)所述的小鼠人工染色体载体，其中，药物代谢相关基因是编码参与第一相反应或第二相反应的酶的基因。
(16)根据上述(15)所述的小鼠人工染色体载体，其中，参与第一相反应的酶是编码选自由CYP1A、CYP1B、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B及它们的亚家族等CYP以及CES构成的组中的至少一个的酶。
(17)根据上述(15)所述的小鼠人工染色体载体，其中，参与第二相反应的酶是编码选自由UGT1及UGT2构成的组中的至少一个的酶。
(18)根据上述(14)所述的小鼠人工染色体载体，其中，药物代谢相关基因是编码转运蛋白的基因。
(19)根据上述(18)所述的小鼠人工染色体载体，其中，编码转运蛋白的基因是编码选自由MDR1、MDR2、MRP2、OAT、OATP、OCT及BCRP构成的组中的至少一个的基因。
(20)根据上述(14)所述的小鼠人工染色体载体，其中，药物代谢相关基因是编码核受体的基因。
(21)根据上述(20)所述的小鼠人工染色体载体，其中，编码核受体的基因是编码选自由PXR、AhR、CAR及PPARα构成的组中的至少一个的基因。
(22)根据上述(11)～(13)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为人类染色体的长臂或短臂的DNA序列。
(23)根据上述(11)～(21)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列含有选自由编码参与第一相反应的酶的基因、编码参与第二相反应的酶的基因、编码转运蛋白的基因及编码核受体的基因构成的组中的至少两个基因序列。
(24)根据上述(22)所述的小鼠人工染色体载体，其中，人类染色体为含有疾病基因的致病区域(疾患遺伝子の原因領域)的人类染色体的长臂或短臂的DNA序列。
(25)根据上述(11)～(13)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为编码细胞因子类、激素类、生长因子类、营养因子类、造血因子类、凝血·溶血因子类、免疫球蛋白类、G蛋白偶联受体类、酶类等多肽类的基因或DNA的序列，或者与肿瘤、肌营养不良症、血友病、神经变性疾病、自身免疫病、过敏性疾病、遗传性疾病等疾病相关的治疗用基因或DNA的序列。
(26)根据上述(1)～(25)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，细胞为肝细胞、肠细胞、肾细胞、脾细胞、肺细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、脑细胞、骨髓细胞、淋巴球细胞、巨核细胞、精子或卵子。
(27)根据上述(1)～(25)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，组织为源自肝脏、肠、肾脏、脾脏、肺、心脏、骨骼肌、脑、骨髓、睾丸或卵巢的组织。
(28)携带上述(1)～(27)中任一项所述的小鼠人工染色体载体的细胞。
(29)根据上述(28)所述的细胞，其中，细胞选自由体细胞、非人类生殖细胞、干细胞及前体细胞构成的组。
(30)根据上述(29)所述的细胞，其中，干细胞为胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干(iPS)细胞。
(31)根据上述(28)～(30)中任一项所述的细胞，其中，细胞为原代培养细胞、继代细胞或细胞系。
(32)根据上述(28)～(31)中任一项所述的细胞，其中，细胞为可产生人类抗体的细胞。
(33)一种医药组合物，含有携带含有疾病治疗用的外源DNA序列的小鼠人工染色体载体的上述(28)～(32)中任一项所述的细胞。
(34)一种非人类动物，特征在于携带上述(1)～(27)中任一项所述的小鼠人工染色体载体。
(35)根据上述(34)所述的非人类动物，该非人类动物为疾病模型动物。
(36)根据上述(34)所述的非人类动物，该非人类动物为可表达外源的人类药物代谢相关基因的动物。
(37)根据上述(34)所述的非人类动物，该非人类动物为可产生人类抗体的动物。
(38)根据上述(34)～(37)中任一项所述的非人类动物，其中，对应于小鼠人工染色体载体中所含的外源DNA的内源基因被破坏或内源基因的表达降低。
(39)一种蛋白质的生产方法，该方法包括对携带含有外源DNA序列的小鼠人工染色体载体的上述(28)～(32)中任一项所述的细胞进行培养并回收所产生的由该DNA所编码的蛋白质。
(40)一种人类抗体的制造方法，该方法包括使用携带含有人类抗体基因的小鼠人工染色体载体的上述(37)或(38)所述的非人类动物产生人类抗体并回收该抗体。
(41)一种筛选对于治疗疾病有效的物质的方法，该方法包括对作为疾病模型动物的上述(35)所述的非人类动物施用候选药剂，并对该药剂的治疗效果进行评价。
(42)一种药物或食品的药理作用及/或代谢及/或毒性的试验方法，该方法包括对携带含有人类药物代谢相关基因的小鼠人工染色体载体的上述(36)或(38)所述的非人类动物或者源自该动物的细胞、器官或组织施用药物或食品，并对该药物或食品的药理作用及/或代谢及/或毒性进行测定。
(43)一种药物或食品毒性的试验方法，该方法包括将由携带含有人类药物代谢相关基因的小鼠人工染色体载体的上述(36)或(38)所述的非人类动物得到的微粒体或微粒体级分S9与培养细胞或者细菌和药物及/或者食品一起进行培养，并测定药物或食品对该细胞或细菌造成的影响。
(44)一种细胞或个体内的大尺寸DNA的稳定化方法，该方法包括使用上述(1)～(27)中任一项所述的小鼠人工染色体载体，并将200kb以上的大尺寸的外源DNA以90％以上的携带率稳定地维持在啮齿类细胞或啮齿类个体内。
根据本发明，在将靶基因(组)导入啮齿类细胞内或啮齿类个体内的情况下，设有DNA序列插入位点的小鼠人工染色体载体可以使靶基因(组)稳定且以相同携带率携带在以往困难的全部的细胞或者组织中，另外，可以与作为目标的外源DNA序列或基因共同插入报告基因，因此，可将载体导入细胞可视化且可进行详细且准确并且重现性高的分析或表达产物的有效的回收。
本说明书包含本申请的优先权基础即日本专利申请2010-1425号的说明书及/或附图中所记载的内容。
附图说明
图1表示实施例1及2的步骤的示意图。图中的细胞名称等由以下的形式表示。细胞名称(细胞内基因改造；携带染色体片段名称，导入基因-携带染色体名称)。图中的记号等如下所述。BSr：杀稻瘟素(BS)抗性基因；puro：嘌呤霉素抗性基因；人工端粒：人工端粒(TTAGGG)重复序列；EGFP：绿色荧光蛋白表达基因；neo：新霉素(G418)抗性基因；loxP：位点特异性DNA序列插入位点；3’HPRT：HPRT基因的从第3号至第9号外显子的序列；
图2表示实施例3的步骤的示意图。图中的细胞名称等由以下的形式表示。细胞名称(细胞内基因改造；携带染色体片段名称，导入基因-携带染色体名称)。图中的记号等如下所述。hChr7：人类7号染色体；CYP3Acluster：人类CYP3A基因簇；5’HPRT：HPRT基因的第1号和第2号外显子的序列；loxP：位点特异性DNA序列插入位点；hyg：潮霉素抗性基因；hisD：组氨醇抗性基因；人工端粒：人工端粒(TTAGGG)重复序列；EGFP：绿色荧光蛋白表达基因；neo：新霉素(G418)抗性基因；3’HPRT：HPRT基因的第3号至第9号外显子的序列；puro：嘌呤霉素抗性基因；
图3表示实施例4的步骤的示意图。图中的细胞名称等由以下的形式表示。细胞名称(细胞内基因改造；携带染色体片段名称，导入基因-携带染色体名称)。图中的记号等如下所述。puro：嘌呤霉素抗性基因；人工端粒：人工端粒(TTAGGG)重复序列；5’HPRT：HPRT基因的第1号和第2号外显子的序列；hyg：潮霉素抗性基因；loxP：位点特异性DNA序列插入位点；
图4表示实施例5的步骤的示意图。图中的细胞名称等由以下的形式表示。细胞名称(细胞内基因改造；携带染色体片段名称，导入基因-携带染色体名称)。图中的记号等如下所述。puro：嘌呤霉素抗性基因；人工端粒：人工端粒(TTAGGG)重复序列；neo：新霉素(G418)抗性基因；loxP：位点特异性DNA序列插入位点；3’HPRT：HPRT基因的第3号至第9号外显子的序列；
图5表示实施例6的步骤的示意图。图中的细胞名称等由以下的形式表示。细胞名称(细胞内基因改造；携带染色体片段名称，导入基因-携带染色体名称)。图中的记号等如下所述。neo：新霉素(G418)抗性基因；loxP：位点特异性DNA序列插入位点；3’HPRT：HPRT基因的第3号至第9号外显子的序列；puro：嘌呤霉素抗性基因；人工端粒：人工端粒(TTAGGG)重复序列；EGFP：绿色荧光蛋白表达基因；5’HPRT：HPRT基因的第1号和第2号外显子的序列；
图6表示小鼠A9细胞(mouse A9(neo))(左)及小鼠A9细胞和小鼠成纤维细胞(小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast)(mChr11-BSr))的细胞融合克隆(小鼠A9x小鼠胚胎成纤维细胞杂种(neo；mChr11-BSr))；
图7表示以小鼠Cot-1DNA作为探针时DT40(mChr11-Bsr)克隆的FISH分析结果。
图8表示导入至鸡DT40细胞内的小鼠染色体(mChr11-BSr)为小鼠11号染色体的SKY FISH分析结果(左)以及SKY FISH染色质图像(右)；
图9表示小鼠11号染色体的AL671968区域中的端粒截短用的载体及利用该载体进行同源重组的小鼠11号染色体等位基因的部分结构；
图10表示使用pBS-TEL/puro MAC载体在小鼠11号染色体区域AL671968中进行端粒截短的含有小鼠人工染色体MAC的等位基因的DT40(MAC)[DT40(B6bT-1)]克隆的单色FISH分析结果(右)。左图的DT40(mChr11-BSr)表示端粒截短实施前的DT40(mChr11-BSr)克隆；
图11表示GFP-neo-loxP-3’HPRT型的loxP打靶载体(pMAC1)及利用该载体进行同源重组的小鼠人工染色体MAC的等位基因的部分结构；
图12表示将小鼠Cot-1DNA及GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT盒作为探针时DT40(MAC1)克隆的双色FISH分析结果；
图13表示将小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(HPRT-；MAC1)克隆的单色FISH分析结果；
图14表示将小鼠次要卫星(minor satellite)DNA作为探针时小鼠ES(MAC1)克隆的单色FISH分析结果；
图15表示用于在位于人类7号染色体上的CYP3A基因座附近且着丝粒侧(约300Kb着丝粒侧)的AC004922区域插入loxP的打靶载体(pMPloxPHyg)及利用该载体进行同源重组的人类7号染色体等位基因的部分结构(图15a)。另外，图15b表示对于用线性化的该载体转染后的含有人类7号染色体片段的DT40细胞克隆的潮霉素耐性株，利用DNA杂交分析同源重组体的结果。对于图15b中的箭头，上面的箭头表示非同源重组体(约10.9kb)，下面的箭头表示同源重组体(约8.9kb)；
图16表示用于在位于人类7号染色体上的CYP3A基因座附近且端粒侧(约150Kb端粒侧)的AC073842区域插入人类端粒序列的打靶载体(pTELhisD-PT)及利用该载体进行同源重组的人类7号染色体等位基因的部分结构；
图17表示将小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针时CHO(HPRT-，MAC1+hChr7-loxP-tel)克隆的双色FISH分析结果。
图18表示将人类CYP3A基因簇区域周边(AC004922-人类CYP3A基因簇-AC073842)约1Mb向MAC1进行转座克隆而成的小鼠人工染色体CYP3A-MAC的构建；
图19表示将人类Cot-1DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(CYP3A-MAC，hChr7-ΔCYP3A)克隆的双色FISH分析结果；
图20表示用于构建小鼠人工染色体载体MAC2的打靶载体(pMAC2)及利用该载体进行同源重组的小鼠人工染色体MAC的等位基因的部分结构；
图21表示将小鼠Cot-1DNA及5’HPRT-loxP-PGKhygro盒作为探针时DT40(MAC2)克隆的双色FISH分析结果；
图22表示将小鼠Cot-1DNA及5’HPRT-loxP-PGKhygro盒作为探针时CHO(HPRT-；MAC2)克隆的双色FISH分析结果；
图23表示将小鼠次要卫星DNA作为探针时小鼠ES(HPRT-，MAC2)克隆的单色FISH分析结果；
图24表示PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP打靶载体(pMAC3)及利用该载体进行同源重组的小鼠人工染色体MAC3的等位基因的部分结构；
图25表示将小鼠Cot-1DNA及小鼠次要卫星DNA作为探针时DT40(MAC3)克隆的双色FISH分析结果；
图26表示将小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(HPRT-；MAC3)克隆的单色FISH分析结果；
图27表示将小鼠次要卫星DNA作为探针时药剂耐性克隆B6(HPRT-；MAC3)的单色FISH分析结果；
图28表示B6(HPRT-；MAC3)克隆的长期培养的携带率分析结果。实线表示B6(HPRT-：MAC3)-3，虚线表示B6(HPRT-：MAC3)-s6的MAC载体携带率。
图29表示用于在小鼠人工染色体载体MAC3中将特定基因(例如GFP)通过Cre-loxP法进行位点特异性基因插入的步骤，表示GFP插入用载体及利用该载体进行同源重组的小鼠11号染色体等位基因的部分结构；
图30表示将小鼠Cot-1DNA及X6.1EGFP作为探针的携带有小鼠人工染色体GFP-MAC的CHO细胞即CHO(GFP-MAC)克隆的双色FISH分析结果；
图31表示将小鼠次要卫星DNA及GFP作为探针时小鼠ES细胞(B6-ES株)中的小鼠人工染色体GFP-MAC的长期培养后的FISH分析结果；
图32表示B6(GFP-MAC)克隆的长期培养的携带率分析结果。菱形表示进行了药剂选择的长期培养的携带率，四方形表示未进行药剂选择的长期培养的携带率；
图33表示由携带有小鼠人工染色体载体(GFP-MAC)的嵌合体小鼠生产的子代传递个体；
图34表示长期培养后(25PDL)的CHO细胞中21HAC1或21HAC2和MAC1的携带率；
图35表示长期培养后(75PDL)的ES细胞中21HAC2或MAC1的携带率；
图36表示TC(MAC1)小鼠(雌)组织中的实体荧光显微镜图像；
图37表示TC(MAC1)小鼠或TC(21HAC2)小鼠的源自骨髓的细胞的血液系统细胞中的GFP阳性率；
图38表示TC(MAC1)小鼠或TC(21HAC2)小鼠的源自脾脏的细胞的血液系统细胞中的GFP阳性率；
图39表示使用了小鼠次要卫星DNA探针的源自TC(MAC1)小鼠的尾部成纤维细胞的单色FISH分析结果；
图40表示使用了CYP3A-BAC(RP11-757A13)以及小鼠次要卫星DNA探针的A9(CYP3A-MAC)的双色FISH分析结果；
图41表示使用了CYP3A-BAC(RP11-757A13)DNA探针的TT2F(CYP3A-MAC)的单色FISH分析结果；
图42表示长期培养后(100PDL)的ES细胞中的CYP3A-MAC的携带率；
图43表示TC(CYP3A-MAC)小鼠(雄)组织中的实体荧光显微镜图像；
图44表示TC(CYP3A-MAC)小鼠或TC(CYP3A-HACΔ)小鼠的源自骨髓的细胞的血液系统细胞中的GFP阳性率；
图45表示TC(CYP3A-MAC)小鼠或TC(CYP3A-HACΔ)小鼠的各组织中的CYP3A-MAC或CYP3A-HACΔ的携带率；
图46表示使用了CYP3A-BAC(RP11-757A13)DNA探针的TC(CYP3A-MAC)杂合子小鼠或TC(CYP3A-MAC)纯合子小鼠中的单色FISH分析结果；
图47是表示TC(CYP3A-MAC)小鼠的各组织中CYP3A基因簇的组织特异性基因表达分析的结果的图。GAPDH表示甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase)；
图48是表示TC(CYP3A-MAC)小鼠肝脏中的CYP3A基因簇的时期特异性基因表达分析的结果的图；
图49表示使用了CYP3A-BAC(RP11-757A13)以及小鼠Cot-1DNA探针的大鼠ES(CYP3A-MAC)的双色FISH分析结果；
图50表示使用了小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA探针的CHO(HPRT-；MAC1，hChr21-loxP)的双色FISH分析结果；
图51表示将hChr21q区域的约33Mb向MAC1进行转座克隆而成的小鼠人工染色体hChr21q-MAC的构建；
图52表示将人类Cot-1DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(hChr21q-MAC，hChr21-hChr21q)克隆的双色FISH分析结果；
图53表示使用了人类Cot-1DNA以及小鼠次要卫星DNA探针的TT2F(hChr21q-MAC)克隆的双色FISH分析结果；
图54表示长期培养后(50PDL)的ES细胞中的hChr21q-MAC的携带率；
图55表示携带有hChr21q-MAC的嵌合体小鼠的荧光照片；
图56表示用于向人类21号染色体(hChr21)的DSCR(唐氏综合征致病区域)的近端的AP001721插入loxP序列的打靶载体(pCKloxPHyg)、靶序列及利用同源重组而产生的染色体等位基因；
图57表示DT40(hChr21q22.12-loxP)中的DNA印迹分析结果；
图58表示将人类Cot-1DNA及潮霉素DNA作为探针时DT40(hChr21q22.12-loxP)克隆的双色FISH分析结果；
图59表示将人类Cot-1DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(HPRT-；MAC1，hChr21q22.12-loxP)克隆的双色FISH分析结果；
图60表示将hChr21q22.12-qter区域的约12Mb向MAC1进行转座克隆而成的小鼠人工染色体hChr21q22.12-MAC的构建；
图61表示将人类Cot-1DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(hChr21q22.12-MAC，hChr21-hChr21q22.12)克隆的双色FISH分析结果；
图62表示使用了人类Cot-1DNA以及小鼠次要卫星DNA探针的TT2F(hChr21q22.12-MAC)克隆的双色FISH分析结果；
图63表示长期培养后(50PDL)的ES细胞中的hChr21q22.12-MAC的携带率；
图64表示长期培养后(25PDL)的CHO细胞中的21HAC1或21HAC2和MAC2的携带率；
图65表示1拷贝FVIII-PAC的结构；
图66表示1～16拷贝FVIII-PAC的构建方法；
图67表示CHO(FVIIIx1-MAC)1-3及CHO(FVIIIx1-HAC)1-2中的长期培养后的凝集测定(FVIII的活性比较)的结果；
图68表示CHO(FVIIIx1-MAC)及CHO(FVIIIx16-MAC)中的凝集测定的结果(FVIII的活性比较)；
图69表示用于构建多基因搭载位点(多整合酶平台，multi-integraseplatform)盒的进入载体(entry vector)构建方法；
图70表示多基因搭载位点(多整合酶平台)盒的构建方法；
图71表示MI-MAC载体的构建方法；
图72表示向MI-MAC载体插入基因的方法；
图73表示PXR-MAC的构建方法；
图74表示将源自小鼠cot-1DNA及人类PXR-BAC的DNA(RP11-169N13)(CHORI)作为探针时CHO(PXR-MAC)克隆的双色FISH分析结果；
图75表示将源自人类PXR-BAC的DNA(RP11-169N13)(CHORI)作为探针时TT2F(PXR-MAC)克隆的单色FISH分析结果；
图76表示GFP-5’HPRT-loxP-hyg型的loxP打靶载体(pMAC4)及利用该载体进行同源重组的小鼠人工染色体MAC4的等位基因的部分结构；
图77表示将小鼠cot-1DNA及GFP-5’HPRT-loxP-hyg盒作为探针时DT40(MAC4)克隆的双色FISH分析结果；
图78表示将小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(HPRT-；MAC4)克隆的单色FISH分析结果；
图79表示用于在位于人类4号染色体上的UGT2基因座附近且端粒侧(约150Kb端粒侧)的AC1252392区域插入人类端粒序列的打靶载体(pTELpuro-UGT2)及利用该载体进行同源重组的人类4号染色体等位基因的部分结构；
图80将人类cot-1DNA及嘌呤霉素DNA作为探针使用的DT40(hChr4-tel)的双色FISH分析结果。左图表示改造前的DT40(hChr4)，右图表示改造后的DT40(hChr4-tel)；
图81表示用于向人类4号染色体的AC074378插入loxP序列的打靶载体(pUGT2loxPneo)、靶序列及利用同源重组而产生的染色体等位基因；
图82表示将人类cot-1DNA及新霉素DNA作为探针使用的DT40(hChr4-loxP-tel)的双色FISH分析结果；
图83表示将人类Cot-1DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(HPRT-；MAC4，hChr4-loxP-tel)克隆的双色FISH分析结果；
图84表示将人类UGT2基因簇区域周边(AC074378-人类UGT2基因簇-AC125239)2Mb向MAC4进行转座克隆而成的小鼠人工染色体UGT2-MAC的构建；
图85表示将UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI)DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(UGT2-MAC，hChr4-ΔUGT2)克隆的双色FISH分析结果；
图86表示将UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI)及小鼠次要卫星DNA作为探针时A9(UGT2-MAC)克隆的双色FISH分析结果；
图87表示将UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI)DNA作为探针时TT2F(UGT2-MAC)克隆的单色FISH分析结果；
图88表示长期培养后(75PDL)的ES细胞中的UGT2-MAC的携带率；
图89表示用于在位于人类10号染色体上的CYP2C基因座附近且端粒侧(约150Kb端粒侧)的AL157834区域插入人类端粒序列的打靶载体(pTELpuro-CYP2C)及利用该载体进行同源重组的人类10号染色体等位基因的部分结构；
图90表示将人类cot-1DNA及嘌呤霉素DNA作为探针使用的DT40(hChr10-tel)的双色FISH分析结果。左图表示改造前的DT40(hChr10)，右图表示改造后的DT40(hChr10-tel)；
图91表示用于向人类10号染色体的AL138759插入loxP序列的利用打靶载体(pCYP2CloxPneo)、靶序列及利用同源重组而产生的染色体等位基因；
图92表示将小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针时(HPRT-；MAC4，hChr10-loxP-tel)克隆的双色FISH分析结果；
图93表示将人类CYP2C基因簇区域周边(AL138759-人类CYP2C基因簇-AL157834)380kb向MAC4进行转座克隆而成的小鼠人工染色体CYP2C-MAC的构建；
图94表示将CYP2C-BAC(RP11-466J14)(CHORI)DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(CYP2C-MAC，hChr10-ΔCYP2C)克隆的双色FISH分析结果；
图95表示用于向人类7号染色体的AC005045插入loxP序列的打靶载体(pMDR11oxPbs)、靶序列及利用同源重组而产生的染色体等位基因。
图96表示用于在位于人类7号染色体上的MDR1基因座附近且端粒侧(约50Kb端粒侧)的AC003083区域插入人类端粒序列的打靶载体(pTELpuro-MDR1)及利用该载体进行同源重组的人类7号染色体等位基因的部分结构；
图97表示将人类cot-1DNA及嘌呤霉素DNA作为探针使用的DT40(hChr7M-loxP-tel)的双色FISH分析结果；
图98表示将小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针时CHO(HPRT-；MAC4，hChr7M-loxP-tel)克隆的双色FISH分析结果；
图99表示将人类MDR1基因区域周边(AC005045-人类MDR1基因-AC003083)210kb进行MAC4载体转座克隆而成的小鼠人工染色体MDR1-MAC的构建；
图100表示将MDR1-BAC(RP11-784L5)(CHORI)DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针时CHO(MDR1-MAC，hChr7-ΔMDR1)克隆的双色FISH分析结果。
具体实施方式
以下，对本发明进行更详细的说明。
如上所述，本发明的第一方面的特征在于，含有源自小鼠染色体的天然着丝粒、从着丝粒附近的小鼠染色体长臂部位中缺失长臂远端而成的源自小鼠染色体的长臂片段及端粒序列，以及可被稳定地携带在哺乳类的细胞及组织中。
本说明书中使用的“源自小鼠染色体的天然着丝粒”这样的术语是指任一个小鼠染色体的着丝粒整体(完整的着丝粒)。因此，这样的着丝粒不包括使用小鼠染色体的着丝粒序列的一部分偶然或人工得到的具有着丝粒功能的结构体及其它的动物物种的染色体的着丝粒。
本说明书中使用的“小鼠人工染色体”或“小鼠人工染色体载体”为通过自上而下法构建的人工染色体，不是通过自下而上法构建的人工染色体。自上而下法是指通过染色体改造从自然染色体中缺失基因区域而构建具有天然着丝粒的人工染色体载体的方法。自下而上法为通过将着丝粒序列的一部分以克隆化DNA的形式取得并转染于哺乳类细胞来构建具有着丝粒功能的人工染色体的方法。
本说明书中使用的“从着丝粒附近的小鼠染色体长臂部位中缺失长臂远端而成的源自小鼠染色体的长臂片段”是指优选以本发明的载体在小鼠的细胞或个体组织中稳定地携带的方式且不妨碍小鼠的个体产生和子代传递的方式尽可能地排除内源基因的影响，因此，以除去小鼠染色体的长臂中的内源基因的方式在与着丝粒接近的长臂部位进行缺失而得到的长臂片段。这是指以总内源基因(数)的至少99.5％、优选至少99.7％、更优选至少99.8％、最优选99.9～100％被除去的方式在与着丝粒接近的长臂部位进行缺失而得到的长臂片段。
本说明书中的“DNA”只要没有特别说明，将适用于包括基因或者基因座、cDNA、化学修饰DNA的全部种类的DNA核酸。
本说明书中使用的“携带率”是指培养细胞或在小鼠的组织细胞中存在的含有人工染色体的细胞的比例。
本发明的染色体载体“稳定地携带”是指在细胞分裂时不易引起该染色体载体的脱落，即，即使在分裂后也可在细胞内稳定地携带，因此，该染色体载体可被有效地子代传递至子细胞或子代小鼠。
小鼠染色体可以为小鼠染色体1～19、X及Y中的任一种，但优选为1号～19号染色体中的任一种。在后述的实施例中，例示有11号染色体，但只要具有上述的构成，即使为其它的染色体也可同样地制作小鼠人工染色体载体。
在源自小鼠11号染色体片段的人工染色体载体的情况下，上述长臂片段是非限定的，例如由缺失比该11号染色体的长臂的AL671968或者BX572640(位于比AL671968更靠着丝粒侧。)、CR954170(位于比AL671968及BX572640更靠着丝粒侧。)或AL713875(位于比AL671968更靠着丝粒侧。)更远端的区域而成的长臂片段构成。或者，上述长臂片段为本说明书中的DT40(MAC)，可以含有保藏细胞株DT40B6bT-1(FERMBP-11128)中所含的小鼠人工染色体作为基本结构(参照图1、3、4)。另外，在例如源自小鼠15号染色体片段的人工染色体载体的情况下，上述长臂片段是非限定的，例如由缺失比AC121307、AC161799等的位置更远端的区域而成的长臂片段构成。在源自小鼠16号染色体片段的人工染色体载体的情况下，上述长臂片段是非限定的，例如由缺失比AC127687、AC140982等的位置更远端的区域而成的长臂片段构成。这些基本结构中还含有用于插入外源DNA或基因的loxP等DNA序列插入位点(例如参照MAC1、MAC2、MAC3、MAC4等；图1、3、4)。
本发明的载体可以含有用于插入外源DNA或基因序列的位点，因此，通过在该位点插入目标外源DNA或基因，可在该载体被导入任何的细胞时表达该目标外源DNA或基因，因此可应用于蛋白质生产、治疗用药剂的筛选、药物代谢试验、DNA的功能分析、iPS细胞的诱导、基因治疗、有用的非人类动物的制作等(例如参照CYP3A-MAC、GFP-MAC等；图2、5)。
本发明的载体还改造小鼠染色体，并将源自小鼠的天然着丝粒直接用于制作载体。作为现有公知的小鼠人工染色体载体，已知有利用着丝粒序列的一部分制作的基于卫星DNA的哺乳类人工染色体(称为Aces及SATAC)，但迄今为止尚未制作利用小鼠染色体的着丝粒整体制作的小鼠人工染色体。另外，上述哺乳类人工染色体与HAC载体同样地在小鼠个体的组织中携带率不均且不稳定(Co Do等，Chromosome Res.2000；8(3)：83-91)。
作为本发明的载体的有用且意外的特性，可以举出如下等特性：提高包括小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类的哺乳类的细胞或个体组织中的携带率，由此在细胞内稳定携带，因此，可以长期稳定地携带靶基因(组)，可以导入基因量均匀地在啮齿类个体间或组织间进行长时间表达，另外，可提高经由多能性细胞(例如ES细胞、iPS细胞等)分化的啮齿类的个体产生及子代传递的效率。作为与人类人工染色体(HAC)进行比较的有意思的特性，包括血液系统组织的低于20％的非常低的HAC携带率，组织间的不均极少，即使对于试验后的任何组织(例如源自肝脏、肠、肾脏、脾脏、肺、心脏、骨骼肌、脑或骨髓的组织)携带率也在90％以上，另外，本发明的小鼠人工染色体与HAC相比，可有效地进行繁殖，对HAC而言则不可能，细胞中可携带多个(多)拷贝的HAC。
定义：
本说明书中使用的术语的定义除本行业中所使用的一般的含义以外，具体而言，包含以下的含义。
在本说明书中，在称为“小鼠人工染色体”或“小鼠人工染色体载体”的情况下，该术语是指如上述例示所述的由源自小鼠的染色体片段制作的具有上述特征的人工染色体，是通过自上而下法构建的人工染色体，而不是通过自下而上法构建。重复上文，自上而下法是指通过染色体改造从自然染色体中缺失基因区域而构建具有天然着丝粒的人工染色体载体的方法。另一方面，自下而上法为通过将着丝粒序列的一部分以克隆化DNA的形式取得并转染于哺乳类细胞来构建具有着丝粒功能的人工染色体的方法。人工染色体可作为独立于应导入的细胞中原本的染色体的染色体稳定地进行复制及分配。源自小鼠的染色体片段为小鼠的1～19号、X及Y染色体中的任何的染色体的片段(缺失长臂的总内源基因数的至少99.5％而成的长臂片段)，该片段包括如上面所定义那样的从着丝粒附近的小鼠染色体长臂的部位缺失长臂远端而成的长臂片段。对于本发明的人工染色体的制作，后述的实施例、特别是实施例1～5记载于图1～图4，例示有由小鼠11号染色体片段制作人工染色体的方法。由其它的染色体片段制作小鼠人工染色体也可完全相同地进行实施。
小鼠的染色体的序列信息可由DDBJ/EMBL/GenBank，Santa CruzBiotechnology，Inc.等的染色体数据库获得。
本说明书中的染色体的“长臂”是指自小鼠染色体的着丝粒侧含有基因区域的染色体区域。另一方面，在小鼠染色体中几乎不存在短臂。
本说明书中的“远端”是指距着丝粒远的区域(即，端粒侧)。相反，接近着丝粒的区域(即，着丝粒侧)称为“近端”。长臂远端是指位于比长臂的特定部位更靠端粒侧的区域，长臂近端是指位于比长臂的特定部位更靠着丝粒侧的区域。该特定部位为缺失存在于源自小鼠的一个染色体的长臂的总内源基因(数)的至少99.5％、优选至少99.7％、更优选至少99.8％、最优选99.9～100％而成的位置。
本说明书中的“携带率”是指在培养细胞或小鼠的组织细胞的中存在人工染色体的细胞的比例。
本说明书中的“DNA序列插入位点”是指人工染色体中的可插入目的DNA(包括基因)序列的位点，例如位点特异性重组酶的识别位点等。这样的识别位点是非限定的，包括例如loxP(Cre重组酶识别位点)、FRT(Flp重组酶识别位点)、及
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(
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重组酶识别位点)、R4attB及R4attP(R4重组酶识别位点)、TP901-1attB及TP901-1attP(TP901-1重组酶识别位点)、或者Bxb1attB及Bxb1attP(Bxb1重组酶识别位点)等。
本说明书中的“位点特异性重组酶”为在这些酶的识别位点特异性地引起目标DNA序列重组的酶。其例子为Cre整合酶(也称为Cre重组酶。)、
Figure BDA00002103887500224
整合酶、R4整合酶、TP901-1整合酶、Bxb1整合酶等。
本说明书中的“端粒序列”为同种或异种的天然端粒序列，或者人工端粒序列。在此，同种是指与人工染色体载体的染色体片段所源自的小鼠同种的动物，另一方面，异种是指该小鼠以外的哺乳动物(其中包括人类)。另外，人工端粒序列是指(TTAGGG)n序列(n是指重复。)等人工制作的具有端粒功能的序列。向人工染色体的端粒序列的导入可以通过例如国际公开WO00/10383中记载那样的端粒截短(端粒序列的置换)进行。端粒截短可以用于在本发明的人工染色体的制作中缩短染色体。
本说明书中的“外源基因”或“外源DNA”为插入于载体的基因插入位点的搭载于载体的目标基因或DNA，是指本来不存在于作为对象的细胞内且将在作为对象的细胞内表达的基因或DNA或者它们的序列。
本说明书中的“哺乳动物”这样的术语包括人类、猴、黑猩猩等灵长类，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类，牛、猪、羊、山羊等有蹄类等，但并不限定于这些动物。
本说明书中的“胚胎干细胞”或“ES细胞”为由源自哺乳动物的受精卵的胚泡的内部细胞块所建立的备有分化多能性和半永久的增殖能力的干细胞(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981)Nature 292：154-156；J.A.Thomson等(1999)Science 282：1145-1147；J.A.Thomson等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844-7848；J.A.Thomson等(1996)Biol.Reprod.55：254-259；J.A.Thomson and V.S.Marshall(1998)Curr.Top.Dev.Biol.38：133-165)。具有与该细胞同等的性质且通过体细胞的重新编程来人工诱导的细胞为“诱导性多能干细胞”或“iPS细胞”(K.Takahashi and S.Yamanaka(2006)Cell 126：663-676；K.Takahashi等(2007)Cell 131：861-872；J.Yu等(2007)Science 318：1917-1920)。
小鼠人工染色体载体的制作及用途：
以下，对本发明的小鼠人工染色体载体的制作及其用途进行说明。具体而言，在后述的实施例1～5(图1～4)中记载有其步骤。
(1)小鼠人工染色体载体的制作
本发明的人工染色体载体可以通过含有以下的工序(a)～(c)的方法进行制作：
(a)得到携带有小鼠染色体的细胞的工序；
(b)以不含大部分(99.5％以上且100％以下)内源基因(数)的方式缺失小鼠染色体的长臂远端的工序及
(c)在长臂近端插入1个以上DNA序列插入位点的工序。在此，工序(b)及(c)的顺序可以反过来。
工序(a)：
为了制作本发明的人工染色体载体，首先，制作携带有小鼠染色体的细胞。例如将导入有携带有用药剂抗性基因(例如，杀稻瘟素S抗性基因(blasticidin S registance gene)(BSr))所标记的小鼠染色体的小鼠成纤维细胞即小鼠胚胎成纤维细胞(mChr11-BSr)和G418抗性基因即neo基因的小鼠A9细胞(ATCC VA20110-2209)即小鼠A9(neo)进行细胞融合，可以由携带有用药剂抗性基因所标记的小鼠染色体的小鼠A9杂种细胞即小鼠A9x小鼠胚胎成纤维细胞(neo；mChr11-BSr)并通过将该染色体移入同源重组率高的细胞中来制作。小鼠成纤维细胞可以基于文献所述的方法获得，例如小鼠成纤维细胞能够通过可从日本Clea获得的C57B6系统的小鼠建立。作为同源重组率高的细胞，例如可利用鸡DT40细胞(Dieken等，NatureGenetics，12：174-182，1996)。另外，上述移入可通过公知的染色体转移法，例如微核细胞融合法(Koi等，Jpn.J.Cancer Res.，80：413-418，1973)来进行。
工序(b)：
在携带有源自小鼠的单一染色体的细胞中，缺失该小鼠染色体的长臂远端。此时，重要的是构建缺失(或除去或者删除)存在于长臂上的大部分内源基因并携带有小鼠着丝粒的人工染色体。这以缺失(或除去或者删除)存在于长臂上的总内源基因的至少99.5％、优选至少99.7％、更优选至少99.8％、最优选99.9～100％的方式确定切断位置。由此，导入的人工染色体稳定且高携带率地携带在源自啮齿类等哺乳动物的、优选源自小鼠的细胞、组织或个体中，可用于靶基因(组)的正确的分析、物质生产等。上述内源基因的缺失例如可通过WO00/10383号中记载的端粒截短进行。具体而言，在携带有小鼠染色体的细胞中，构建携带有人工端粒序列的打靶载体，取得通过同源重组在染色体上的期望的位置插入有(人工)端粒序列的克隆，由此，可通过端粒截短得到缺失变异体。即，期望的位置(或位点)为应缺失的长臂远端的切断位置，人工端粒序列在该位置通过同源重组被取代、插入而缺失长臂远端。该位置可通过构建打靶载体时的靶序列的设计而适宜设定。例如，在后述的实施例中，基于小鼠11号染色体长臂的AL671968(GenBank登录号)的DNA序列设计靶序列，以在比其靶序列更靠端粒侧引起端粒截短的方式进行设定(参照图9)。由此，可得到缺失了大部分内源基因的小鼠11号染色体片段。在其它的染色体的情况下也可同样地实施端粒截短。
工序(c)：
作为DNA序列插入位点，可优选插入位点特异性重组酶的识别位点。即，已知某种酶识别特定的识别位点并特异性地在该识别位点引起DNA的重组的现象，在本发明的小鼠人工染色体载体中，利用由这样的酶和该酶的识别位点构成的体系，插入并搭载目标基因或DNA序列。作为这样的体系，例如可以举出：源自细菌噬菌体P1的Cre酶和其识别位点即loxP序列的体系(Cre/loxP体系；B.Sauerin Methods of Enzymology；1993，225：890-900)、源自出芽酵母的Flp酶和其识别位点即FRT(FlpRecombination Target)序列的体系(Flp/FRT体系)、源自链霉菌噬菌体的
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整合酶和其识别位点即
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attB/attP序列6的体系、R4整合酶和其识别位点即R4attB/attP序列的体系、TP901-1整合酶和其识别位点即TP901-1attB/attP序列的体系、Bxb1整合酶和其识别位点即Bxb1attB/attP序列的体系等，只要可作为DNA序列插入位点起作用，则不限定于上述体系。
为了插入这样的位点特异性重组酶的识别位点，可利用公知的方法，例如同源重组法，长臂近端及短臂近端内插入的位置及数目可适宜设定。
在本发明中，可插入一个单一种类识别位点或不同种类的识别位点。通过设定识别位点，可确定外源基因或外源DNA的插入位置，因此，插入位置恒定，不会受到预想外的位置效应(position effect)。在后述的实施例中所例示的小鼠人工染色体的情况下，可特异性地表达在小鼠11号染色体上的BX572640中所插入的位点特异性重组酶的识别位点loxP序列中所插入的基因(图11、图20、图24)。
在本发明的具有DNA序列插入位点的小鼠人工染色体载体中可优选保留目的基因或DNA序列的插入位点并预先插入报告基因。作为报告基因，没有特别限定，例如可以举出：荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP或EGFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)等)、标记蛋白编码DNA，β-半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因等，但优选GFP或EGFP。
在本发明的小鼠人工染色体载体中还可以含有选择标记基因。选择标记物在筛选通过该载体进行转化的细胞时有效。作为选择标记基因，可例示正选择标记基因及负选择标记基因中的任一种或两者。正选择标记基因包括药剂抗性基因，例如新霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因、杀稻瘟素S(BS)抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、庆大霉素(G418)抗性基因、潮霉素抗性基因等。另外，负选择标记基因包含例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、白喉毒素A片段(DT-A)基因等。通常HSV-TK可与更昔洛韦或昔洛韦(シクロビル)组合使用。
作为在本发明的小鼠人工染色体载体中插入报告基因或目标外源基因或者DNA的方法，可优选使用同源重组法。同源重组可使用打靶载体进行，所述打靶载体是在小鼠染色体上的插入位置的5’侧区域及3’侧区域的碱基序列(分别约1～4kb，优选约2～4kb)和相同的两序列(5’臂(arm)及3’臂之间连接应插入的DNA盒而得到的。作为出于该目的而使用的载体，例如可以举出质粒、噬菌体、粘粒、病毒等，优选为质粒。用于构建打靶载体的基本质粒的例子为V907或V913(Lexicon Genetics)等，但并不限定于这些。基本载体也可以含有启动子、增强子、选择标记基因、复制起点等载体构建中通常所插入的1或2个以上的序列或元件。
通过上述方法制作的小鼠人工染色体含有源自小鼠的染色体片段(其中含有天然着丝粒、缺失至少99％、优选至少99.5％的内源基因的长臂片段及(在存在的情况下)短臂。)和人工端粒序列。另外，上述着丝粒是为了制作人工染色体而被利用的小鼠染色体的着丝粒结构的整体。
本发明的小鼠人工染色体载体的例子为后述的实施例中制作的小鼠人工染色体载体，该人工染色体为在小鼠11号染色体中将长臂远端在AL671968中缺失而得到的载体(图1、图3、图4、图9、图10)。该载体含有本说明书中的DT40(MAC)即保藏细胞株DT40B6bT-1(FERMBP-11128)中所含的小鼠人工染色体作为基本结构。由于为基本结构，因此，可以在该DNA结构中插入如下所述的DNA序列插入位点、选择标记基因、外源基因(或DNA)等。
上述小鼠人工染色体载体中优选含有1个或多个DNA序列插入位点、例如位点特异性重组酶的识别位点(例如Cre酶识别位点即loxP序列)(图1、图3、图4、图11、图20、图24)。在此，位点特异性重组酶的识别位点为例如GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP序列或者5’HPRT-loxP-hyg型或者PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP序列或者GFP-5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP序列，但并不限定于这些。在此，GFP为绿色荧光蛋白基因，PGKneo为磷酸甘油酸激酶启动子/新霉素抗性基因盒，HPRT为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因，hyg为潮霉素抗性基因。
上述小鼠人工染色体载体中还可以含有报告基因、选择标记基因(正选择标记基因，负选择标记基因等)。该载体中还可以含有目标外源基因或DNA序列。
本发明的小鼠人工染色体载体具有与现有的人工染色体载体的优点相同的优点：1)未插入于宿主染色体而独立地维持，因此，不会破坏宿主基因；2)以一定的拷贝数(可为多个(多)拷贝)稳定地携带且受到宿主细胞的生理性表达控制，因此，不会引起所插入的基因的过量表达或表达消失；3)可导入的DNA大小没有限制，因此，除可导入含有表达调节区域的基因或多个基因/亚型以外，啮齿类细胞或者啮齿类个体中的携带率与现有的人工染色体相比提高，实现导入基因的长期间中的稳定表达，且子代传递率提高，由此，转基因小鼠的制作效率提高，(4)载体导入后组织间的不均少，即携带率即使在任何组织中均为90％以上，甚至HAC的情况下低于20％的携带率的血液系统组织也为90％以上的携带率等。
(2)外源基因或DNA的导入
也可以在本发明的小鼠人工染色体载体中导入外源基因或DNA。
外源基因或DNA序列的大小没有特别限制，可以为20kb以下，或者也可以超过20kb，例如为50kb以上、100kb以上、200kb以上、500kb以上、700kb以上、1Mb以上、10Mb以上、20Mb以上、30Mb以上、40Mb以上或50Mb以上。本发明的载体可与HAC载体同样地搭载对于BAC、PAC、YAC等人工染色体载体困难的尺寸，即1Mb以上的外源DNA(染色体片段)。因此，本发明的载体如上所述可将200kb以上、例如1Mb以上的大片段外源基因或DNA以比HAC稳定且高携带率(90％以上)携带在哺乳类的细胞内、组织内或非人类动物个体内、优选啮齿类的细胞内、组织内或个体内。
作为本发明的方式之一，本发明提供一种可将200kb以上的巨大的尺寸的外源基因或DNA在啮齿类细胞或啮齿类个体内以90％以上的携带率稳定地进行维持的载体以及制作该载体的方法。
外源基因或DNA为对作为对象的细胞而言从外部所导入的核酸序列，没有特别限定，为源自任何的生物物种或者源自任何的组织或细胞的基因或DNA，优选为源自哺乳动物的基因或DNA，更优选源自人类的基因或DNA。这样的基因或DNA包括对细胞因子类、激素类、生长因子类、营养因子类、造血因子类、免疫球蛋白类、G蛋白偶联受体类、酶类等多肽类进行编码的基因或DNA，另外的与包括肿瘤、肌营养不良症、血友病、神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、帕金森病等)、自体免疫性疾病、过敏性疾病、遗传性疾病等的各种疾病相关的治疗用基因或DNA，(人类)药物代谢酶的基因(群)或DNA(人类)药物代谢相关基因、人类染色体的长臂或短臂的DNA、(人类)基因组文库等，但并不限定于这些。
细胞因子类包括例如干扰素类(例如IF-α、IF-β、IF-γ等)、白介素类(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-11、IL-12等)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α、TNF-β)、TGF-β家族蛋白质(例如骨形态生成蛋白(BMP)等)等。
激素类包括例如生长激素、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘催乳素(hPL)、人垂体促性腺激素、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素释放因子、胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素、催乳激素等。
生长因子类或营养因子类包括例如胰岛素样生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)、白蛋白融合睫状神经营养因子、血小板源的神经营养因子(PDNF)、转化生长因子、神经生长因子(NGF)、TNF生长因子等。
凝血·溶血因子类包括例如第VII因子、第VIII因子、第X因子、t-PA等。
造血因子类包括例如红细胞生成素、(粒细胞)集落刺激因子、血小板生成素等。
免疫球蛋白类包括例如对于各种抗原的人类抗体类，人源化抗体类、嵌合抗体类、合成抗体等重组抗体类等。
G蛋白偶联受体类包括肾上腺素受体、毒蕈碱型乙酰胆碱受体、腺苷受体、GABA受体(B型)、血管紧张素受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、胰高血糖素受体、组胺受体、嗅觉受体、阿片受体、分泌素受体、生长激素抑制素受体、胃泌素的受体、P2Y受体等。
酶类包括例如天冬酰胺酶、超氧化物歧化酶、尿酸酶、链激酶、多巴胺合成酶、腺苷脱氨酶等。
与包括肿瘤、肌营养不良症、神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、帕金森病等)、自体免疫性疾病、过敏性疾病、遗传性疾病等的各种疾病相关的治疗用基因包括例如抗肌萎缩蛋白基因、IL-12基因、TNF-α基因、肿瘤抑制基因、多巴胺合成系酶基因、遗传性酶缺失(遺伝性欠損酵素)的基因类等。
药物代谢酶为与用于分解·排出药及毒物等异物的代谢反应相关的酶，含有与第一相反应(氧化、还原、水解)相关的酶及与第二相反应(结合)的酶。与第一相反应相关的酶包括例如细胞色素P450(“CYP”)等公知的酶，具体而言，CYP1A、CYP1B、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B及它们的亚家族以及CES等。作为CYP亚家族，例如CYP3A的亚家族包括CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5、CYP3A7等，另外，CYP2C的亚家族包括CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19等。即，后述的实施例中所记载的CYP3A-MAC是指CYP3A簇，由CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5及CYP3A7构成。另一方面，与第二相反应(结合)相关的酶包括例如UGT1及UGT2等。
药物代谢相关基因包括例如对转运蛋白进行编码的基因、对核受体进行编码的基因等。对转运蛋白进行编码的基因的例子为MDR1、MDR2、MRP2、OAT、OATP、OCT、BCRP等，对核受体进行编码的基因的例子为PXR、AhR、CAR、PPARα等。
如上所述，可导入于本发明的载体的与药物代谢相关的外源DNA序列可以含有选自对与第一相反应相关的酶进行编码的基因、对与第二相相关的酶进行编码的基因、对转运蛋白进行编码的基因及对核受体进行编码的基因构成的组中的至少1个基因的序列或者至少2个基因的序列。
可以使至少1个绝缘子序列存在于本发明的小鼠人工染色体载体中的外源基因或外源DNA的插入位点的附近或插入位点的两侧。绝缘子序列具有增强子阻断效应(即，相邻的基因互相不受影响)或染色体边界效应(将保证基因表达的区域和抑制基因表达的区域隔开进行区别)。这样的序列包含例如人类β珠蛋白HS1～HS5，鸡β珠蛋白HS4等。
外源基因或DNA的导入可利用作为上述的DNA序列插入位点插入的上面所例示那样的位点特异性重组酶的体系进行。例如构建携带有Cre酶的识别位点即loxP序列和外源基因或DNA的打靶载体或者携带有插入了Cre酶的识别位点即loxP序列的外源基因或DNA的染色体片段，在携带有本发明的小鼠人工染色体载体的细胞内使Cre酶表达，由此，通过在loxP序列中与该打靶载体或者该染色体片段的位点特异性重组，可以导入外源基因或DNA。
在本发明的小鼠人工染色体载体中也可以插入携带有位点特异性重组酶的识别位点(例如loxP序列、FRT序列等的环状DNA，也可以利用以大肠菌作为宿主的质粒或以酵母作为宿主的环状YAC等现存的载体插入经克隆化的DNA。优选的loxP序列为源自P1噬菌体的野生的序列，环状插入体(インサ一ト)向利用Cre酶得到的人工染色体载体上的loxP序列的插入反应是可逆的。一旦插入环状插入体时，在人工染色体载体上残留2个loxP序列。因此，再次使Cre酶表达时，也有可能引起切出环状插入体的逆反应，难以二次插入插入体来进一步改造人工染色体载体。但是，利用进行碱基取代的变异loxP序列及
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整合酶的识别位点即attB/attP序列的组合等，也可以构建依次插入多个环状插入体的体系且不会引起逆反应。
(3)小鼠人工染色体载体向细胞的移入及非人类动物的制造
本发明的小鼠人工染色体载体或者含有外源基因或者DNA的本发明的小鼠人工染色体载体可以移入或导入于任何细胞。用于移入或导入的方法包括例如微核细胞融合法、脂质转染法、磷酸钙法、显微注射法、电穿孔法等，优选的方法为微核细胞融合法。
微核细胞融合法为通过含有本发明的小鼠人工染色体载体的具有微核形成能力的细胞(例如小鼠A9细胞)和其它的期望的细胞的微核融合将该载体移入于该其它的细胞的方法。具有微核形成能力的细胞用多倍体诱发剂(例如秋水酰胺\秋水仙碱等)进行处理而微核多核细胞，进行通过细胞松弛素处理形成微核体的处理后，进行与期望的细胞的细胞融合。
上述可导入载体的细胞包含动物细胞、优选含有人类细胞的哺乳动物细胞，例如卵母细胞、精子细胞等生殖细胞，胚胎干(ES)细胞、精子干(GS)细胞、体性干细胞等干细胞，体细胞、胎儿细胞、成体细胞、正常细胞、疾病细胞、初代培养细胞、继代细胞或细胞系等。干细胞包括例如ES细胞、胚性生殖(EG)细胞、胚胎癌(EC)细胞、mGS细胞、人间充质干细胞等多能干细胞、诱导性多能干(iPS)细胞、核移植来源胚胎干(ntES)细胞等。优选的细胞选自源自哺乳动物(优选含有小鼠的啮齿类)的体细胞、非人类生殖细胞、干细胞及前体细胞构成的组。在细胞为源自啮齿类等的哺乳类的细胞的情况下，在导入有本发明的载体的哺乳类(例如小鼠等啮齿类)的细胞或组织中，可更稳定地携带载体，即载体自细胞的脱落显著降低或不会引起脱落。
细胞例如为肝细胞、肠细胞、肾细胞、脾细胞、肺细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、脑细胞、骨髓细胞、淋巴球细胞、巨核细胞、精子、卵子等。
组织为例如肝脏、肠、肾脏、脾脏、肺、心脏、骨骼肌、脑、骨髓、睾丸、卵巢等组织，
对ES细胞而言，可以从对象动物的受精卵的胚泡中取出内部细胞块并将丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层进行建立并维持(M.J.Evans和M.H.Kaufman(1981)Nature 292：154-156)。
对iPS细胞而言，通过在体细胞(含有体性干细胞)中导入某种特定的再编程因子(DNA或蛋白质)并用适当的培养基进行培养、继代培养，在约3～5周生成集落。再编程因子已知有例如由Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc构成的组合；由Oct3/4、Sox2及Klf4构成的组合；由Oct4、Sox2、Nanog及Lin28构成的组合；或者由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog及Lin28构成的组合等(K.Takahashi and S.Yamanaka，Cell 126：663-676(2006)；WO2007/069666；M.Nakagawa等，Nat.Biotechnol.26：101-106(2008)；K.Takahashi等，Cell 131：861-872(2007)；J.Yu等，Science 318：1917-1920(2007)；J.Liao等，Cell Res.18，600-603(2008))。培养实例包括将丝裂霉素C处理后的小鼠胚胎成纤维细胞株(例如STO)作为饲养细胞，在该饲养细胞层上使用ES细胞用培养基，在约37℃的温度下对载体导入体细胞(约104～105细胞/cm2)进行培养。饲养细胞不是必需的(Takahashi，K.等，Cell131：861-872(2007))。基本培养基为例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、Ham’s F-12培养基、它们的混合培养基等，ES细胞用培养基可以使用小鼠ES细胞用培养基、灵长类ES细胞用培养基(Reprocell(リプロセル)公司)等。
ES细胞及iPS细胞有助于生殖系列，因此，可以通过包括将导入有含有目标基因或DNA的本发明的小鼠人工染色体载体的这些细胞注入该细胞所源自的同种哺乳动物的胚的胚泡中，将该胚移植到寄养母体的子宫中使其进行生育的方法制造非人类动物(或转基因动物(除人类以外))。另外，通过使得到的雌雄转基因动物进行交配，可以制造纯合性动物、进而其子代动物。
经由本发明的小鼠人工染色体载体在ES细胞或iPS细胞等分化多能性细胞、其它的上述细胞类中导入人类抗体基因、疾病治疗用基因、药物代谢相关基因等外源的基因或者DNA，由此可制作可产生人类抗体的细胞或非人类动物，另外，可制作可产生治疗用蛋白质的细胞，另外，可制作药物代谢相关疾病等的疾病模型非人类动物。
在这样的非人类动物中，有时也优选与小鼠人工染色体载体中所含的外源基因对应的内源基因被破坏或内源基因的表达降低。破坏的方法可以使用基因打靶法。内源基因的表达的降低法可以使用RNAi法。例如，对这样的外源基因的例子而言，可以举出：药物代谢相关基因、人类抗体基因等。破坏了内源基因的非人类动物可以通过进一步使内源基因杂合缺失的动物彼此进行交配而制造，所述内源基因可以使携带有含有外源基因的小鼠人工染色体载体的嵌合体非人类动物或者其子代和对应的使内源基因每个簇缺失的嵌合体动物或者子代进行交配而得到。
通过上述方法可制作携带有小鼠人工染色体载体的细胞及转基因非人类动物。具体的非人类动物例子为携带有小鼠人工染色体载体的小鼠或大鼠等啮齿类。
即，本发明提供一种细胞及非人类动物，其特征在于，携带有小鼠人工染色体载体。
另外，对由本发明的非人类动物得到的细胞、组织或器官而言，也可以用于由这些制作通过外源基因表达产生蛋白质的细胞株。
(4)有用的蛋白质的生产法
本发明还提供一种蛋白质的生产方法，其含有：对携带有含有可表达外源DNA序列的小鼠人工染色体载体的细胞进行培养，回收所产生的由该DNA所编码的蛋白质。
作为蛋白质，可以举出例如上述医疗方面、农业方面等产业方面有用的蛋白质或多肽类。以将对这些蛋白质或多肽类进行编码的DNA在启动子(及根据必要使用的增强子)的存在下可表达的方式插入于小鼠人工染色体载体，对适当的细胞进行转化或者转染。对得到的细胞进行培养，使该DNA表达而产生该蛋白质或多肽，将其从细胞或培养基中回收。
细胞除哺乳动物细胞以外，也可以使用Sf细胞等昆虫细胞、鸟类细胞、酵母细胞、植物细胞等真核细胞。
包括培养基的培养条件可依据细胞的种类选择，作为培养条件，可使用公知的条件。例如，作为动物细胞的培养基，包括MEM培养基、DMEM培养基、Ham’s F12培养基、Eagle’s MEM培养基、Iscove’s EME培养基、RPMI1640培养基、这些的混合培养基等。
蛋白质或多肽类的回收(或分离)可将凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、HPLC、FPLC等色谱法、盐析法、硫酸铵沉淀法、有机溶剂沉淀法、超滤法、结晶等公知的方法单独或组合进行实施。
(5)人类抗体的制造法
本发明还提供一种人类抗体的制造方法，其含有：使用携带有含有人类抗体基因的小鼠人工染色体载体的上述非人类动物产生人类抗体并回收该人类抗体。
人类抗体基因为对人类IgG、IgM、IgA、IgD、IgE中的任一类或者人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2中的任一亚类进行编码的基因。优选的人类抗体基因为IgG类及其亚类。
人类抗体由2条相同序列的重链(H)和2条相同序列的轻链(L)构成，H链和L链均由可变区和恒定区构成。人类H链及L链的可变区均由3个超变区(从N末端侧至C末端侧以CDR1、CDR2、CDR3的顺序)和4个构架区(从N末端侧至C末端侧以FR1、FR2、FR3、FR4的顺序)构成，根据人类H链及L链的分别各3个CDR序列确定抗体的特异性。
在人类IgG抗体的情况下，由作为重链的μ链和作为轻链的λ链或者κ链构成，这些抗体链基因分别存在于人类14号染色体、22号染色体、2号染色体上。作为本发明中使用的人类抗体基因，使用含有各抗体基因座的人类染色体片段，将这些插入不同或相同的小鼠人工染色体中。抗体基因序列可由NCBI(美国)的数据库等获得。该一系列的方法为例如日本特开2005-230020号公报中所记载的技术的改良。
可生产完全人类抗体的非人类动物通过将携带有含有人类μ链基因座的小鼠人工染色体载体的非人类动物和携带有含有人类λ链基因座及/或人类κ链基因座的小鼠人工染色体载体的同种的非人类动物进行交配，可以得到持有两者的H链及L链基因座的嵌合体非人类动物及其子代动物。
通过包括免疫某特定的抗原肽或者抗原多肽且从该动物的血液中分离人类抗体的方法，可在如上制作的可产生完全人类抗体的非人类动物(例如小鼠等的啮齿类)中生产人类抗体。
或者，摘出用某特定的抗原免疫的非人类动物的脾脏，使其与骨髓瘤细胞融合，也可以得到产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
(6)治疗物质的筛选法
本发明还提供一种筛选对于治疗疾病有效的物质的方法，其包括对作为该疾病模型动物的上述非人类动物施用候选药剂并对该药剂的治疗效果进行评价。
疾病模型非人类动物为人工制作且具有以因某种蛋白质的缺损、变异等引起的生物功能异常、药物代谢异常、染色体异常等异常作为原因的疾病的动物。具有染色体异常的模型非人类动物的例子为但不限定于具有人类18号或21号染色体三倍体症的动物。
这样的非人类动物可通过如下方法制作：所述方法包括制作在基因或染色体中含有如上所述的异常的基因或染色体片段，将其插入本发明的小鼠人工染色体载体，导入于ES细胞或iPS细胞，注入于受精卵的胚泡，将该细胞移植到非人类动物的寄养母体的子宫中，使其生产。
通过对如上制作的非人类动物施用候选药剂并对该药剂的治疗效果进行评价，可以筛选对于治疗该疾病有效的物质。
候选药剂是非限定的，例如为低分子化合物、高分子化合物、(糖)蛋白质、肽、(磷或糖)脂质、糖类等。
(7)药物或食品的药理作用、代谢或毒性的试验方法
根据本发明的实施方式，本发明还提供一种药物或食品的药理作用及/或代谢及/或毒性的试验方法，其包括对携带有含有人类药物代谢相关基因的小鼠人工染色体载体的上述非人类动物或者源自该动物的细胞、器官或组织施用药物或食品并对该药物或食品的药理作用及/或代谢及/或毒性进行测定。
本发明还提供一种药物或食品的毒性的试验方法，其包括将由携带有含有人类药物代谢相关基因的小鼠人工染色体载体的上述非人类动物得到的微粒体或微粒体级分S9与培养细胞或者细菌及药物或者/及食品一起进行培养并测定药物或食品对该细胞或细菌造成的(不良)影响(例如变异等)。
人类药物代谢相关基因为上述例示的基因。另外，非人类动物的制作方法也与上述记载的方法相同。
在使用携带有具有人类药物代谢相关基因的小鼠人工染色体载体的上述的非人类动物的上述方法中，例如通过该动物状态的观察、对脏器及染色体造成的影响的试验等，可以对药物或食品的药理作用、代谢或毒性进行判定。
在本发明的另一方法中，将由该非人类动物得到的微粒体或者微粒体级分S9(9000g级分即含有催化水解、还原、氧化、结合等的多个酶的级分)与培养细胞(特别是动物细胞、优选哺乳类细胞)或细菌(优选沙门氏菌)一起在药物及/或食品的存在下进行培养。药物或食品对于细胞的毒性的检测可以通过艾姆斯试验或小核试验进行。在艾姆斯试验中，基于沙门氏菌的变异判定毒性。在小核试验中，基于细胞核的染色体的异常判定毒性。这些试验法是众所周知的，可在本发明的方法中使用。
以下，举出实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的范围并不限定于这些具体例。
实施例
[实施例1]
小鼠人工染色体载体MAC的构建
通过对小鼠染色体进行端粒截短来构建不含内源基因的小鼠人工染色体MAC[DT40(B6bT)](图1)。
[A]A9细胞和小鼠成纤维细胞(neo；mChr11-BSr)的杂交细胞建立
将含有用药剂抗性基因(Bsr基因)标记的小鼠11号染色体的小鼠成纤维细胞即小鼠胚胎成纤维细胞(mChr11-BSr)和在公知的小鼠A9细胞中插入有G418抗性基因即neo基因的小鼠A9(neo)细胞融合，建立携带有用药剂抗性基因标记的小鼠染色体的小鼠A9杂种细胞即小鼠A9x小鼠胚胎成纤维细胞杂种(neo；mChr11-BSr)。为了将用药剂抗性基因标记的小鼠染色体通过微核细胞融合法导入同源重组频率高的鸡DT40细胞，通过细胞融合在已知微核形成率高的小鼠A9细胞中导入用药剂抗性基因标记的小鼠染色体。
[A.1]细胞融合及双重药剂耐性克隆的分离
由可从日本CLEA获得的C57B6系统的小鼠胚胎进行建立，将在小鼠染色体上插入了药剂抗性基因(Bsr基因)的小鼠成纤维细胞即小鼠胚胎成纤维细胞(mChr11-BSr)和插入有作为G418抗性基因的neo基因的小鼠A9细胞即小鼠A9(neo)分别用PBS(-)清洗细胞表面后，通过添加胰蛋白酶来分散细胞，悬浮于培养液(10％FBS、DMEM)，将各种细胞1×106个同时植入培养用烧瓶(25cm2)进行一天培养。用PBS(-)清洗细胞表面2次后，用3ml的PEG(1∶1.4)溶液[使5g，PEG1000，cat：165-09085，wako溶解于无血清DMEM 6ml，添加二甲基亚砜1ml进行过滤灭菌]进行1分钟处理，再换成3ml的PEG(1∶3)溶液[使5g，PEG1000，cat：165-09085，wako溶解于无血清DMEM 15ml并进行过滤灭菌]进行1分钟处理。对PEG溶液进行抽吸后，用无血清DMEM清洗3次，用通常的培养液(10％FBS、DMEM)进行一天培养。用PBS(-)清洗细胞表面后，通过添加胰蛋白酶来分散细胞，将悬浮于含有G418(800μg/ml)及杀稻瘟素S(4μg/ml)的双重选择培养液(10％FBS，DMEM)的细胞植入塑料培养皿，进行2～3周选择培养。对通过2次细胞融合得到的合计3个耐性集落进行分离并使其增殖，进行以下的分析(克隆名：小鼠A9x小鼠胚胎成纤维细胞杂种(neo；mChr11-BSr))。
[A.2]杂种细胞的选择
[A.2.1]PCR
由双重药剂耐性克隆提取基因组DNA，使用以下的引物进行PCR，确认携带有用药剂抗性基因(Bsr基因)标记的小鼠染色体。
Bsr R1：5’CATGTGGGAGCGGCAATTC3’(序列号1)
Bsr L1：5’TTGAGTGGAATGAGTTCTTCAATCG3’(序列号2)
对PCR而言，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600作为热循环仪、Taq聚合酶使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性后，以94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒进行35循环。对PCR的结果而言，3个克隆中的3个克隆为阳性。
表1
Figure BDA00002103887500381
[A.2.2]喹吖因·Hoechst双重染色
对于通过上述PCR分析为阳性的克隆，进行喹吖因·Hoechst双重染色。对喹吖因·Hoechst双重染色而言，首先，将染色体制片浸渍到50ml的麦基尔文(マキルベン)溶液[使柠檬酸一水合物11.18g和磷酸氢二钠13.29g溶解在1L的水中，进行高压灭菌]中，接着，在于50ml的麦基尔文溶液中以成为60μg/ml的方式溶解喹吖因[cat：Q2876，SIGMA]而成的溶液中浸渍20分钟，用自来水清洗染色体制片的背面后，浸渍到麦基尔文溶液中，在于50ml的麦基尔文溶液中以成为0.5μg/ml的方式溶解Hoechst[cat：B-2883]而成的溶液中浸渍15分钟后，用盖玻片覆盖。利用荧光显微镜进行观察，结果在全部的3个克隆中，通常的核型为2n的地方大部分的核型为4n以上。特别是可知在克隆A9(21-B6b)7中，携带有用药剂抗性基因(Bsr基因)标记的小鼠染色体的小鼠成纤维细胞和插入有作为G418抗性基因的neo基因的小鼠A9细胞一对一进行细胞融合(图6)。
表2
Figure BDA00002103887500401
由以上的结果可得出如下结论：在小鼠A9x小鼠胚胎成纤维细胞杂种(neo；mChr11-BSr)中，携带有经标记的小鼠染色体。
[B]用药剂抗性基因标记的小鼠染色体向DT40细胞的导入
从含有用药剂抗性基因标记的小鼠染色体的小鼠A9杂种细胞即小鼠A9x小鼠胚胎成纤维细胞杂种(neo；mChr11-BSr)中将用药剂抗性基因标记的小鼠染色体导入鸡DT40细胞即DT40。为了有效地进行小鼠染色体号的鉴定及人工端粒的插入造成的染色体位点特异性切断即端粒截短及通过同源重组在小鼠染色体中插入DNA序列插入位点即loxP序列，通过微核细胞融合法将用药剂抗性基因标记的小鼠染色体导入同源重组频率高的鸡DT40细胞即DT40。
[B.1]微核细胞融合及药剂耐性克隆的分离
为了有效地进行染色体鉴定和染色体改造，将小鼠染色体从A9杂种细胞克隆即A9x小鼠胚胎成纤维细胞杂种(neo；mChr11-BSr)7中移入同源重组频率高的鸡DT40细胞即DT40。用烧瓶×24培养的供体细胞即A9x小鼠胚胎成纤维细胞杂种(neo；mChr11-BSr)7在各自的烧瓶中在汇合(confluent)70％的时刻，在37℃5％CO2的条件下进行48小时秋水酰胺处理(秋水酰胺0.05μg/ml、20％FCS、DMEM)。秋水酰胺处理结束后，吸取烧瓶内的培养基(medium)，用细胞松弛素B将该烧瓶充满至9成。将烧瓶插入大型高速离心机(BECKMAN)专用的容器，加入温水(34℃)至不覆盖烧瓶的程度，进行离心(Rortor ID10.500、8,000rpm、1h、34℃)。离心结束后，回收细胞松弛素B，将各烧瓶内的颗粒分别用2ml的无血清培养基DMEM回收到15ml管中。按照8μm→5μm→3μm过滤器的顺序慢慢地进行过滤后，对各个管进行离心(1,200rpm 5分钟R.T)，吸取上清液后，将各管的颗粒集中并回收，悬浮于5ml的无血清培养基DMEM中，进行离心(2000rpm 5分钟)。
受体细胞(recipient cell)即DT40细胞为浮游细胞，因此，需要形成一次附着状态。为了使DT40附着在6孔板(Nunc)中的1孔中，用调整成50μg/ml的多聚赖氨酸(SIGMA)1.5ml将1孔在37℃下培养一夜，由此进行包被(コ一テイング)。回收多聚赖氨酸，用PBS(-)对板进行清洗，将约1×107个DT40细胞用2ml的无血清培养液(DMEM)轻轻地接种在板中。将板一起设置于离心机(Beckman)，在37℃下以1200rpm离心3分钟制成附着DT40。
将精制的微核细胞再次悬浮于含有PHA-P(SIGMA)的无血清培养液2ml，轻轻地播种在除去了无血清培养液(DMEM)的附着DT40上。将板在37℃下以1200rpm离心3分钟。除去上清液，将PEG1000(Wako)[将5gPEG1000完全溶解在无血清DMEM培养基中，添加1ml二甲基亚砜并进行过滤灭菌]溶液用1ml正确地融合1分钟。将无血清培养液(DMEM)用4ml清洗4次，用通常的DT40的培养液3ml进行移液，使附着DT40返回至浮游状态，在37℃下接种于2张24孔板，培养一夜。以成为1500μg/ml的方式添加杀稻瘟素S，选择培养3～4周。分离通过一次微核细胞融合得到的合计2个耐性集落并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(mChr11-BSr))
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]FISH分析
对于上述得到的DT40(mChr11-BSr)的克隆，通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中记载的方法进行了以小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果，在DT40(mChr11-BSr)-1中，95％每正常核型(2n)的小鼠染色体数为1拷贝，因此进行了以后的分析(图7)。
表3
Figure BDA00002103887500431
[B.2.2]DT40中所导入的用药剂抗性基因标记的小鼠染色体的鉴定
通过Kai等(Cell Res，19：247-58，2009)的报告中记载的方法进行SKY-FISH，结果可知鸡DT40细胞中所导入的小鼠染色体为小鼠11号染色体(图8)。
[C]自鸡DT40细胞内的小鼠11号染色体区域AL671968利用远端的端粒截短的位点特异性切断
作为小鼠人工染色体载体，导入靶基因以外的内源基因少时，可减少对实验系统造成的影响，且需要如内源基因中印记基因那样需要尽可能不残留因基因表达量的变化对小鼠个体造成影响的基因，因此，缺失了小鼠长臂的大部分。
[C.1]端粒截短载体制作
短臂近端位点特异性切断用的基本载体使用pBS-TEL/puro构建体(コンストラクト)(Kuroiwa等Nature Biotech 2002)。由从GenBank数据库得到的小鼠11号染色体长臂近端的碱基序列(AL671968)设计同源重组靶序列。从DT40(mChr11-BSr)中提取基因组DNA作为模板，将用于PCR扩增同源重组靶序列的引物的序列示于以下。
m1117L：5’-CGAGGATCCCACATTGGTAGTCTTTTCACTGCCATCA-3’(序列号3)
m1117R：5’-CGAGGATCCCCACTTAACTTTTCCAGGCTTACGGAGA-3’(序列号4)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、65℃8分钟进行35个循环，将由此得到的PCR产物用BamHI(TAKARA)进行消化，利用琼脂糖凝胶进行分离精制后，克隆到pB S-TEL/puro的BamHI位点(载体名：pB S-TEL/puro_MAC)。打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图9。
[C.2]同源重组体的筛选
自小鼠11号染色体区域AL671968在远端进行位点特异性切断的载体使用上述pBS-TEL/puro_MAC进行转染，进行嘌呤霉素耐性及杀稻瘟素S非耐性克隆的分离及同源重组体的筛选。其结果，确认可切断小鼠11号染色体区域的5个克隆(克隆名：DT40(MAC))。打靶载体、靶序列、及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图9。
[C.3]利用单色FISH分析的药剂耐性克隆的筛选
对于上述中得到的DT40(MAC)的5个克隆，通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中记载的方法进行了以小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认在5个克隆中的2个克隆中小鼠11号染色体的长臂部分在着丝粒附近被切断(图10)。
表4
Figure BDA00002103887500461
由以上的结果可得出如下结论：可构建切除了多余的小鼠染色体长臂的小鼠人工染色体MAC。携带有小鼠人工染色体载体MAC的鸡DT40细胞即DT40(MAC)-1以识别名称作为DT40B6bT-1在独立行政法人类产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)在平成21年(2009年)5月14日基于布达佩斯条约的规定进行国际保藏，赋予保藏编号FERM BP-11128。
[实施例2]小鼠人工染色体载体MAC1的构建
通过在小鼠人工染色体MAC中插入作为DNA插入序列的GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP序列来构建小鼠人工染色体载体MAC1，对MAC1在小鼠ES细胞中的稳定性进行检验，进而通过制作导入有MAC1的子代传递小鼠，对个体组织中的稳定性进行检验。
[A]GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP序列向小鼠人工染色体载体MAC的插入
[A.1]GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP打靶载体制作
用于在DT40(MAC)中插入loxP序列的基本质粒使用V913(Lexicongenetics)。作为loxP插入位点的小鼠11号染色体的DNA序列由GenBank数据库得到(BX572640.9)。从药剂耐性克隆中提取基因组DNA作为模板，将用于同源重组的二个靶序列的扩增的引物的序列示于以下。
m115L：5’-TGACAGAGAGCTTCCTCCTGCCTCTGTA-3’(序列号5)
m115R：5’-CTAAAGACCCTCATGCTCCTGTGTGGAA-3’(序列号6)
m116L：5’-GTTCAACCTGAGCTCCACATCATGCTC-3’(序列号7)
m117R：5’-CACTCTTTACCCCTCACCGCTAACCTTG-3’(序列号8)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃5分钟进行35个循环。
将各个PCR产物用BglII(TAKARA)进行消化，通过琼脂糖凝胶进行分离精制后，克隆到V913的BglII或者BamHI位点(载体名：VH21-12)。3’HPRT-loxP将进行寡合成的loxP序列克隆到V820(Lexicon genetics)的XbaI位点。将HPRT基因的从第3号至第9号的外显子即3’HPRT-loxP克隆到V907(Lexicon genetics)的EcoRI和AscI(载体名：X3.1)。进而，将利用KpnI和NotI切出的PGKneo序列克隆到X3.1的KpnI位点和EcoRI(载体名：X4.1)。将利用KpnI和AscI从X4.1中切出的PGKneo-loxP-3’HPRT克隆到V913的KpnI位点和AscI位点(载体名：pVNLH)。在NotI和SalI消化后将平滑化的HS4-CAG-EGFP-HS4(由大阪大学的岗部博士及NIH的Felsenfeld博士赠与)克隆到pVNLH的EcoRV位点(载体名：pVGNLH)。将利用SalI和AscI从pVGNLH切出的GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT盒克隆到VH21-12的XhoI位点和AscI位点(载体名：pMAC1)。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图11。
[A.2]转染及G418耐性克隆的分离
鸡DT40细胞的培养在添加有10％胎牛血清(Gibco，以下记为FBS)、1％鸡血清(Gibco)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640培养基(Gibco)中进行。将DT40(MAC)-1的约107个细胞用无添加RPMI1640培养基清洗一次，悬浮于0.5ml的无添加RPMI1640培养基，添加25μg用限制酶NotI(TAKARA)线性化的打靶载体pMAC1，移入电穿孔法用的小槽(Cuvette)(BioRad)，在室温下静置10分钟。将小槽设置于基因脉冲仪(BioRad)，在550V、25μF的条件下施加电压。在室温下静置10分钟后，培养24小时。更换成含有G418(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于2张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过2次转染得到的合计14个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(MAC1))
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了提取G418耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否在小鼠11号染色体上位点特异性地引起重组。将其引物序列示于以下。
kj neo：5’-CATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3’(序列号9)
m11 7R(上述)
m11 5L(上述)
EGFP-F(L)5’-CCTGAAGTTCATCTGCACCA-3’(序列号10)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LA Taq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒，68℃7分钟进行35个循环。PCR的结果，88个克隆中的2克隆在全部的引物组中为阳性，因此，用该2个克隆进行以下的分析。
表5
Figure BDA00002103887500491
[A.3.2]双色FISH分析
在由上述得到的DT40(MAC1)-52和DT40(MAC1)-58中，依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行双色FISH分析。以小鼠cot-1DNA及GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT盒作为探针进行FISH分析，在打靶有loxP序列的小鼠11号染色体片段的着丝粒附近检测到源自探针的FITC信号，且检测到作为阴性对照的打靶前的小鼠11号染色体片段(例如DT40(MAC)-1)中未出现的信号，因此，可视觉性确认位点特异性地引起重组(图12)。由这些结果可得出如下结论：可得到携带有小鼠人工染色体载体MAC1的DT40细胞克隆。
表6
[B]从含有小鼠人工染色体载体MAC1的DT40细胞向CHO细胞的MAC1导入
为了经由CHO细胞将小鼠人工染色体载体MAC1导入小鼠ES细胞或者在CHO细胞内经由小鼠人工染色体载体MAC1的DNA序列插入位点即loxP稳定地插入靶基因(组)等，例如CYP3A簇等，将小鼠人工染色体载体MAC1导入于CHO细胞。
[B.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的DT40(MAC1)52及58，与上述同样地对CHOhprt缺陷细胞(由日本健康科学研究资源库(ヒユ一マンサイエンス研究資源バンク)获得、登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-)进行微核细胞融合法。将通过2次微核细胞融合得到的合计24个耐性集落进行分离以使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC1))
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]PCR分析
提取G418耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认小鼠人工染色体MAC1是否可导入于CHO细胞。将其引物序列示于以下。
kj neo(上述)
m11 7R(上述)
m11 5L(上述)
EGFP F(L)(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，24个克隆中的20个克隆在全部的引物组中为阳性，用该20个克隆进行以后的分析。
表7
Figure BDA00002103887500521
[B.2.2]单色FISH分析
对于上述得到的CHO(HPRT-；MAC1)的20个克隆，通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法进行了以小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认在20个克隆中的5个克隆中以95％的比例将小鼠人工染色体载体MAC1导入于CHO细胞(图13)。
表8
Figure BDA00002103887500541
由以上的结果可得出如下结论：小鼠人工染色体载体MAC1可导入于CHO细胞。
[C]小鼠人工染色体载体MAC1从含有小鼠人工染色体载体MAC1的CHO细胞向小鼠ES细胞的导入
为了检验小鼠ES细胞及小鼠个体内的小鼠人工染色体载体MAC1的稳定性，将小鼠人工染色体MAC1导入于小鼠ES细胞，制作含有小鼠人工染色体载体MAC1的嵌合体小鼠以及子代传递小鼠。
[C.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
将作为受体细胞的CHO(HPRT-；MAC1)-3、5、8、22在细胞培养皿中进行培养，在达到汇合的时刻更换成添加有20％FBS、0.1μg/ml秋水酰胺的F12培养基，进而在培养48小时后，用添加有20％FBS、0.1μg/ml秋水酰胺的F12培养基进行培养基更换，进而培养一夜形成微细胞。除去培养液，将预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液充满至离心用烧瓶中，在34℃下以8000rpm进行1小时的离心。将微细胞悬浮于无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm进行10分钟离心，悬浮于5ml的无血清DMEM培养基。将微细胞悬浮于5ml的无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm进行10分钟离心。
供体细胞使用对作为C57B6系统小鼠的ES细胞即B6-ES及B6-ES细胞进行了6TG处理的HPRT缺陷株即B6(HPRT-)，及C57B6xCBA系统F1小鼠的ES细胞即TT2F，及对TT2F细胞进行了6TG处理的HPRT缺陷株KO56(HPRT-)。对培养而言，在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium-high glucose：SIGMA)中添加10％FCS、LIF(Muerin LeukemiaInhibitory Factor)、1×10-5M 2-ME(2-巯基乙醇：SIGMA)、L-谷酰胺(3.5g/ml：GIBCO)、丙酮酸钠溶液(3.5g/ml：GIBCO)，MEM Nonessential amino acid(0.125mM：GIBCO)，在5％CO2、37℃下进行培养。将小鼠ES细胞用PBS(-)对细胞表面清洗2次后，利用胰蛋白酶处理使细胞分散，用在DMEM培养基中添加有10％FBS的培养液进行回收，以1500rpm进行离心，除去上清液，再次悬浮于5ml的无血清培养液，轻轻地添加于含有微细胞的离心后的颗粒的无血清培养基，再以1200rpm进行离心。除去上清液，将PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解于无血清DMEM培养基，添加1ml二甲基亚砜并进行过滤灭菌]用0.5ml正确地融合1分30秒。轻轻地添加13ml的无血清培养液(DMEM)并以1200rpm进行离心。除去上清液，通常的小鼠ES细胞的培养液，使用丝裂霉素处理后的G418耐性小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，接种于2个直径10cm细胞培养皿中并培养一夜。以成为250μg/ml的方式添加G418，进行3～4周选择培养(克隆名：B6-ES(MAC1)及B6(HPRT-；MAC1)及KO56(HPRT-；MAC1))。对于B6-ES(MAC1)及B6(HPRT-；MAC1)及KO56(HPRT-；MAC1)，将分别通过两次微核细胞融合而得到的合计32个耐性集落进行分离并使其增殖，进行以下的分析。对于TT2F(MAC1)，将通过4次微核细胞融合而得到的合计30个的耐性集落进行分离并使其增殖，进行FISH分析以后的分析。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取G418耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认小鼠人工染色体MAC1是否可导入于小鼠ES细胞。将其引物序列示于以下。
m11 5L (上述)
EGFP F(L)(上述)
kj neo(上述)
m11 7R (上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃10分钟进行30个循环。PCR的结果，32个克隆中的30个克隆在全部的引物组中为阳性，用其中的14个克隆进行以后的分析。
表9
Figure BDA00002103887500571
[C.2.2]单色FISH分析
对于上述得到的B6-ES(MAC1)及B6(HPRT-；MAC1)及KO56(HPRT-；MAC1)的克隆，通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法进行了以小鼠次要卫星DNA作为探针的FISH分析，结果确认14个克隆中的全部克隆中，以85％以上的比例将MAC1导入于小鼠ES细胞。另外，确认作为正常核型的内源小鼠染色体的条数在B6-ES的情况下为40条或在KO56的情况下为39条。在B6(HPRT-；MAC1)的情况下，无法得到40条核型克隆。另外，同样，对于TT2F(MAC1)，对7个克隆进行分析，确认在7个克隆中的全部克隆中，以90％以上的比例被导入。另外，另外，对于7个克隆中的3个克隆，确认作为正常核型的内源小鼠染色体的条数为39条。
由以上的结果可得出如下结论：小鼠人工染色体载体MAC1可导入于小鼠ES细胞(图14)。
表10
Figure BDA00002103887500591
[实施例3]小鼠人工染色体载体CYP3A-MAC的构建
对小鼠人工染色体载体MAC1而言，使用Cre/loxP系统对作为人类药物代谢酶基因群的CYP3A簇进行转座克隆，构建CYP3A-MAC。另外，对CYP3A-MAC在小鼠ES细胞中的稳定性进行检验，进而制作导入有CYP3A-MAC的子代传递小鼠，由此对个体组织中的稳定性进行检验。另外，在子代传递小鼠中，对CYP3A基因的组织特异性基因表达进行检验(图2)。
[A]loxP序列向人类7号染色体的AC004922的位点特异性插入
为了经由loxP序列转座插入于小鼠人工染色体载体MAC1，在DT40细胞内将loxP序列向人类7号染色体(hChr7)的CYP3A基因簇的近端的AC004922插入。
[A.1]打靶载体pMPloxPHyg的制作
如下制作用于在位于人类7号染色体上的CYP3A基因座附近且着丝粒侧(约300Kb着丝粒侧)的AC004922区域插入Cre重组酶的识别序列loxP的打靶载体pMPloxPHyg。首先，使用以下的引物并利用PCR扩增AC004922基因组区域。
p450loxP7L；5’-GGCCTAGAGCCTGGACTCATTCATTCAA-3’(序列号11)
p450loxP7R；5’-GACAGATGTCATGCCCCAGGTAGGTATG-3’(序列号12)
用于插入loxP序列的基本质粒使用V901(Lexicon genetics)。对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600，Taq聚合酶使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃7分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech(クロ一ンテツク))进行凝胶过滤。然后，用限制酶BamHI(勃林格)及EcoRI(ニツポンジ一ン)及BglII(ニツポンジ一ン)切断并用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段(3.7kb及3.0kb)克隆到V901质粒的EcoRI和BamHI或BglII位点(载体名：V901-NP21)。接着，将V901-NP21用限制酶AscI(NEB)以及KpnI切断，用限制酶AscI及KpnI从盒式载体5’HPRT-loxP-Hyg-TK(Kazuki等，Gene Therapy：PMID：21085194，2010)中切出含有loxP的DNA片段，进行连接。将loxP序列的方向与克隆的AC004922基因组片段同方向的载体作为打靶载体pMPloxPHyg。最终的loxP插入构建体的大小为12kb。示出了打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因(图15a)。
[A.2]转染及药剂耐性克隆的分离
与上述同样地用限制酶NotI(TAKARA)将上述制作的打靶载体pMPloxPHyg进行线性化后，转染于通过WO01/011951中记载的方法制作的携带有人类7号染色体片段(在AF006752座被位点特异性切断)的鸡DT40细胞(克隆DF141)，更换成含有潮霉素B(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于3张96孔培养板并进行约2周的选择培养。通过5次转染得到的合计96个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr7-loxP))。
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
使用Puregene DNA Isolation Kit(Gentra System公司)从潮霉素耐性克隆中提取基因组DNA，利用使用以下2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
利用使用以下2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
p450loxP14L；5’-AGTTCTTTTGAGGGCCTAGAGCCTGGAC-3’(序列号13)
p450loxP14R；5’-AAAGGACAGAAGGAGGGAGCAACAGGAT-3’(序列号14)
p450loxP16L；5’-TCTGGGCATCAGTGTCCTCTCCAGTAAA-3’(序列号15)
p450loxP16R；5’-TTGGCGACATCCAATGCTAGTGCTATTC-3’(序列号16)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃4分钟进行35个循环。筛选96个克隆的结果，36个克隆作为同源重组体被鉴定。
[A.3.2]DNA印迹分析
对通过上述PCR分析确认重组的6个克隆按以下进行DNA印迹分析。将该基因组DNA用限制酶EcoRI(TAKARA)进行处理，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，对GeneScreen PlusTM杂交转移膜(NENTM Life ScienceProducts，Inc.)进行碱印迹。对于该过滤器使用通过PCR对AC004922中的基因序列进行扩增的MPp探针进行DNA杂交并进行同源重组体的鉴定。MPp探针的制作如下进行：使用以下的引物并以DF141的基因组DNA作为模板进行PCR，将其PCR产物作为模板制作利用随机引物法的32p标记DNA探针(Amersham，依据标注的方案)。
MPp探针制作用引物：
MPp6L；5’-TGGAGACGTTGTTTAGCCTCTCCTCCTC-3’(序列号17)
MPp6R；5’-CACAGCTTAGAGGCCATTCCCATAGTCC-3’(序列号18)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用EXTaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在93℃5分钟的热变性后，以93℃1分钟，54℃1分钟，72℃1分钟作为1个循环进行35个循环。通过DNA杂交，可预测在非同源重组体中检测到约10.9kb、在同源重组体中检测到约8.9kb的条带(图15b)。DNA杂交的结果，6个克隆中全部的克隆为目标同源重组体。
[A.3.3]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及潮霉素作为探针对上述确认重组的克隆中的6个克隆进行FISH分析，结果人类7号染色体在全部的克隆中未转座于宿主染色体，由于在7q22附近检测到源自潮霉素的信号，因此，确认位点特异性地引起重组。由以上的结果可得出如下结论：在人类7号染色体片段中位点特异性地插入有作为基因导入位点的loxP序列。
[B]hChr7-loxP中的人类7号染色体区域AC073842中的位点特异性切断
如WO2009/063722(PCT/JP2008/068928)那样，为了缺失与距人类7号染色体的CYP3A基因簇远端侧产生强相关的小鼠个体的基因，进行位点特异性染色体缺失即端粒截短。
[B.1]打靶载体pTELhisD-PT的制作
如下制作用于在位于人类7号染色体上的CYP3A基因座附近且端粒侧(约150Kb端粒侧)的AC073842区域插入人类端粒序列的打靶载体pTELhisD-PT。首先，使用以下的引物并通过PCR对AC073842基因组区域进行扩增。
PT1L；5’-TGCGGTGAAGGTCCAAGGAGATAGATTT-3’(序列号19)
PT2R；5’-TCTAGCAGAGAGATGGTGGCAGGATTCA-3’(序列号20)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)进行凝胶过滤。然后，用限制酶BamHI(勃林格)及BglII(ニツポンジ一ン)切断，用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段克隆到质粒pTELhisD(Kuroiwa等，Nature Biotech.，20：88，2002)的BamHI位点。AC073842基因组序列的方向为端粒→着丝粒，因此，将经克隆的AC073842基因组片段与人类端粒序列同方向的载体作为目标打靶载体pTELhisD-PT。最终的长臂近端位点特异性切断用构建体的大小为14.4kb。示出了打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因(图16)。
[B.2]转染及组氨醇耐性克隆的分离
与上述同样地用限制酶SrfI(东洋纺)将上述制作的打靶载体pTELhisD-PT线性化后，转染于上述制作的克隆DT40(hChr7-loxP)122，更换成含有组氨醇(0.5mg/ml)的培养基，分别注入于10张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过5次转染得到的合计335个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr7-loxP-tel))。
[B.3]同源重组体的筛选
[B.3.1]PCR分析
为了以组氨醇耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，作为一次筛选，使用位于比切断位点更靠端粒侧的以下的引物进行PCR，确认是否引起位点特异性切断。将其引物序列示于以下。
COPS6-1L；5’-TGAGGGTACTTGAAGGGCTGATG-3’(序列号21)
COPS6-1R；5’-CAGGGGCTGCTCCCCTTTTATTA-3’(序列号22)
AP4M1-1L：5’-CCTAACATCGTGTCCCAGCTCA-3’(序列号23)
AP4M1-1R：5’-TCCTTTCAGACCCCTTCATCTTAG-3’(序列号24)
LRCH4-2L：5’-TTCAGCCCCAACCAAAGACACTA-3’(序列号25)
LRCH4-1R：5’-GCCCCGAACCCCTACAAATATAGA-3’(序列号26)
STAG3-1L：5’-GGGCCTCCAATAAGTGTCCCATA-3’(序列号27)
STAG3-1R：5’-TTGCTGACTTAGTTGCAGCAGGA-3’(序列号28)
PILRB-2L：5’-CCCATTGGCAAGATACATGGAGA-3’(序列号29)
PILRB-2R：5’-AGTGTGGATGCTCCTGGATGAAG-3’(序列号30)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性后，以95℃20秒、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环。PCR的结果，433个克隆中的2个克隆为阳性。
接着，使用PCR利用以下的引物对上述引物检测到的433个克隆中的2个克隆确认是否引起位点特异性同源重组。序列如下所述。
PT2R；(上述)
hisD2：5’-GTAAACGCCCTCAAGGAGCAAGCATGA-3’(序列号31)
hisD3：5’-TGTGACCAAAGATTTAGCGCAGTGCGT-3’(序列号32)
根据上述引物，PCR使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。仅在位点特异性地引起重组的2个克隆中检测到约8kb的条带。在阴性对照的DT40、DT40(hChr7-loxP)中未检测到条带。
表11
Figure BDA00002103887500651
[B.3.2]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)。以人类cot-1DNA及组氨醇作为探针对上述确认重组的克隆中的2个克隆进行FISH分析，结果插入有loxP序列的人类7号染色体在全部的克隆中未转座于宿主染色体，在人类7号染色体片段末端检测到源自组氨醇的信号，因此，确认位点特异性地引起重组。
由以上的结果可得出如下结论：在克隆DT40(hChr7-loxP-tel)608及748中，可在距比CYP3A基因簇区域更靠端粒侧的AC073842远端切断。
表12
Figure BDA00002103887500661
[C]hChr7-loxP-tel从含有hChr7-loxP-tel的DT40向含有MAC 1的CHO细胞的导入。
为了在CHO细胞内经由loxP序列将人类CYP3A基因簇区域转座插入于小鼠人工染色体载体MAC1，将hChr7-loxP-tel导入于含有小鼠人工染色体载体MAC1的CHO细胞。
[C.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的DT40(hChr7-loxP-tel)608及748，与上述同样地对含有MAC1的CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得，登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-；MAC1)进行微核细胞融合法。将通过5次微核细胞融合得到的合计48个耐性集落分离并使其增殖，进行以下的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC1，hChr7-loxP-tel))。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认人类7号染色体片段被导入于含有MAC1的CHO细胞。将其引物序列示于以下。
m11 5L(上述)
EGFP(F)L(上述)
kj neo(上述)
m11 6R：5’-CCCAGGAATCAGTCAGGAAGGCTGTAA-3’(序列号33)
P450 loxP14L：(上述)
Hyg F(244)：5’-GAATTCAGCGAGAGCCTGAC-3’(序列号34)
Hyg R(696)：5’-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3’(序列号35)
P450 loxP16R：(上述)
CYP3A4 R：5’-GGCTGCATCAGCATCATCTA-3’(序列号36)
CYP3A4 F：5’-GCAAGACTGTGAGCCAGTGA-3’(序列号37)
CYP3A5 R：5’-TCAGCTGTGTGCTGTTGTTTGC-3’(序列号38)
CYP3A5 F：5’-ATAGAAGGGTCTGTCTGGCTGG-3’(序列号39)
CYP3A7 R：5’-GAGTTAATGGTGCTAACTGGGG-3’(序列号40)
CYP3A7 F：5’-ACCCTGAAATGAAGACGGGC-3’(序列号41)
3A4 4L：5’-TCCCCCTGAAATTAAGCTTA-3’(序列号42)
3A4 3R：5’-TGAGGTCTCTGGTGTTCTCA-3’(序列号43)
3A7 3L：5’-TCCCCCTGAAATTACGCTTT-3’(序列号44)
3A7 3R：5’-CATTTCAGGGTTCTATTTGT-3’(序列号45)
PT2R：(上述)
hisD1：5’-GTATTGGTCACCACGGCCGAGTTTCCGC-3’(序列号46)
hisD2：(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，48个克隆中的19个克隆在全部的引物组中为阳性，用其中含有1个阴性克隆的20个克隆进行以后的分析。
表13A
Figure BDA00002103887500681
表13B
Figure BDA00002103887500691
[C.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC1，hChr7-loxP-tel)的19个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA为探针的FISH分析，结果在除上述1个阴性克隆以外的18个克隆中确认MAC1以及hChr7-loxP-tel以1拷贝或者2拷贝导入于CHO细胞(图17)。
表14
Figure BDA00002103887500701
由以上的结果可以得出如下结论：hChr7-loxP-tel可导入于含有小鼠人工染色体载体MAC1的CHO细胞。
[D]CHO(HPRT-；MAC1，hChr7-loxP-tel)克隆中的人类CYP3A基因簇区域周边(AC004922-人类CYP3A基因簇-AC073842)1Mb向MAC1载体的位点特异性转座
为了在小鼠个体内稳定地维持1Mb大小的DNA即人类CYP3A基因簇，转座插入于小鼠人工染色体载体MAC1(图18)。
[D.1]转染及HAT耐性克隆的分离
使用脂质转染法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC1，hChr7-loxP-tel)-6、9、12、47进行基因导入，对于达到90％汇合状态的6孔(well)的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre 3μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过4次导入得到的合计42个集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(CYP3A-MAC1，hChr7-ΔCYP3A))。
[D.2]药剂耐性克隆的筛选
[D.2.1]PCR分析
为了提取HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选相互转座克隆，使用以下的引物进行PCR，确认是否在人类7号染色体片段和MAC1上引起染色体相互转座。将其引物序列示于以下。
P450 loxP 16R(上述)
Hyg R(696)(上述)
kj neo(上述)
P450 loxP 14L(上述)
m11 5L(上述)
m11 6R(上述)
CYP3A4 R(上述)
CYP3A4 F(上述)
CYP3A5 R(上述)
CYP3A5 F(上述)
CYP3A7 R(上述)
CYP3A7 F(上述)
3A4 4L(上述)
3A4 3R(上述)
3A7 3L(上述)
3A7 3R(上述)
TRANS L1：5’-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC-3’(序列号47)
TRANS R1：5’-CCCCTTGACCCAGAAATTCCA-3’(序列号48)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，42个克隆中的27个克隆在全部的引物组中为阳性，用该27个克隆进行以后的分析。
表15
Figure BDA00002103887500741
[D.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(CYP3A-MAC1，hChr7-ΔCYP3A)的27个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果，在27个克隆中的25个克隆中以50％以上的比例含有loxP序列的由小鼠11号染色体片段构成的MAC1上观察到因源自人类7号染色体引起的信号(图19)。
表16
Figure BDA00002103887500761
Figure BDA00002103887500771
Figure BDA00002103887500781
由以上的结果可得出如下结论：在小鼠人工染色体载体MAC1上可利用相互转座克隆1Mb的插入有loxP序列的人类7号染色体片段上的CYP3A簇。
[实施例4]小鼠人工染色体载体MAC2的构建
构建在小鼠人工染色体载体MAC中插入有5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP序列作为DNA插入序列的小鼠人工染色体载体MAC2(图3)。5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP序列被插入于通过Kazuki等的报告(GeneTherapy：PMID：21085194，2010)中所记载的源自21号染色体的GFP搭载HAC载体(21HAC2)，可用相同的载体比较HAC和MAC的基因表达。另外，用于向21HAC2插入的基因导入载体不经过载体制作的步骤，可直接利用。
[A]5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP序列向小鼠人工染色体MAC的插入
[A.1]5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP打靶载体制作
用于插入loxP序列的基本质粒使用上述制作的VH21-12。将利用KpnI和AscI从上述X6.1中切出的5’HPRT-loxP-PGKhygro盒克隆到V907(Lexicon genetics)的KpnI和AscI位点(载体名：pV907-AML)。进而，利用XhoI和SalI从pV907-AML中切出5’HPRT-loxP-PGKhygro盒并克隆到VH21-12的XhoI位点(载体名：pMAC2)。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图20。
[A.2]转染及药剂耐性克隆的分离
与上述同样地用限制酶NotI(TAKARA)将上述制作的打靶载体pMAC2线性化后，转染于上述制作的克隆DT40(MAC)，更换成含有潮霉素(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于2张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过1次转染得到的合计45个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(MAC2))。
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否在小鼠人工染色体载体MAC上位点特异性地引起重组。将其引物序列示于以下。
TRANS-L(上述)
m11 6R(上述)
m11 7R(上述)
m11 4L：5’-ACTCCTAAGGGAGTTGGTGCTGTTGGTG-3’(序列号49)
m11 5L(上述)
hygF(244)：(上述)
hygR(696)：(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行35个循环。PCR的结果，45个克隆中的8个克隆在全部的引物组中为阳性，因此，可用随机选自该8个克隆的6个克隆进行以后的分析。
表17
Figure BDA00002103887500811
[A.3.2]双色FISH分析
在由上述得到的DT40(MAC2)的6个克隆中，依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行双色FISH分析。以小鼠cot-1DNA及5’HPRT-loxP-PGKhygro盒作为探针进行FISH分析，结果在阴性对照的进行打靶前的小鼠11号染色体片段即小鼠人工染色体载体MAC中，明显检测到源自探针的信号的比例为10％，与此相对，在DT40(MAC2)的6个克隆中，50％以上的比例中检测到源自探针的信号，因此，在上述6个克隆中，可视觉确认位点特异性地引起重组(图21)。由这些结果可得出如下结论：可得到携带有小鼠人工染色体载体MAC2的DT40细胞克隆。
表18
Figure BDA00002103887500831
[B]从含有小鼠人工染色体载体MAC2的鸡DT40细胞向CHO细胞的MAC2导入
为了将小鼠人工染色体载体MAC2稳定地导入于小鼠ES细胞，向CHO细胞进行导入。另外，为了经由小鼠人工染色体载体MAC2的DNA序列插入位点即loxP稳定地插入靶基因等(例如GFP基因等)，将小鼠人工染色体载体MAC2导入于CHO细胞。
[B.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的DT40(MAC2)-5及17，与上述同样地CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得、登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-)进行微核细胞融合法。将通过2次微核细胞融合得到的合计44个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC2))。
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否小鼠人工染色体载体MAC2可导入于CHO细胞。将其引物序列示于以下。
TRANS-L(上述)
m11 6R(上述)
m11 7R(上述)
m11 4L(上述)
m11 5L(上述)
hygF(244)：(上述)
hygR(696)：(上述))
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，44个克隆中的14个克隆在全部的引物组中为阳性，从该14个克隆随机选择进行以后的分析。
表19
Figure BDA00002103887500861
[B.2.2]双色FISH分析
通过依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)的方法对随机选自上述得到的CHO(HPRT-；MAC2)的14个克隆中的9个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA和5’HPRT-loxP-PGKhygro盒作为探针的FISH分析，结果确认9个克隆中的8个克隆中以95％的比例将MAC2导入于CHO细胞(图22)。
表20
Figure BDA00002103887500881
由以上的结果可以得出如下结论：在源自小鼠11号染色体的染色体片段即小鼠人工染色体MAC中插入有作为基因插入位点的loxP序列的小鼠人工染色体载体MAC2可导入于CHO细胞。
[C]小鼠人工染色体载体MAC2从含有小鼠人工染色体载体MAC2的CHO细胞向小鼠ES细胞的导入
[C.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
将作为受体细胞的CHO(HPRT-；MAC2)-13、18在细胞培养皿进行培养，在达到汇合的时刻更换成添加有20％FBS、0.1μg/ml秋水酰胺的F12培养基，再培养48小时，用添加有20％FBS、0.1μg/ml秋水酰胺的F12培养基进行培养基更换，在培养一夜形成微细胞。除去培养液，将预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液充满至离心用烧瓶中，在34℃下以8000rpm进行1小时的离心。将微核细胞(也称为“微细胞”)悬浮于无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm进行10分钟离心，悬浮于无血清DMEM培养基5ml。将微细胞悬浮于5ml的无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm进行10分钟离心。
供体细胞使用从日本Clea获得的C57B6系统小鼠的ES细胞即B6-ES，及对该ES细胞进行了6TG处理的HPRT缺陷株即B6(HPRT-)，及TT2F细胞的HPRT缺陷株即KO56(HPRT-)。对培养而言，在DMEM(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium-high glucose：SIGMA)中添加10％FCS、LIF(Muerin Leukemia Inhibitory Factor)、1×10-5M 2-ME(2-巯基乙醇：SIGMA)、L-谷酰胺(3.5g/ml：GIBCO)、丙酮酸钠溶液(3.5g/ml：GIBCO)、MEM非必需氨基酸(0.125mM：GIBCO)，在5％CO2、37℃下进行培养。将小鼠ES细胞用PBS(-)对细胞表面清洗2次后，通过胰蛋白酶处理使细胞分散，用在DMEM培养基中添加有10％FBS的培养液进行回收，以1500rpm进行离心，除去上清液，再次悬浮于无血清培养液5ml，轻轻地添加于含有微细胞的离心后的颗粒的无血清培养基中，再以1200rpm进行离心。除去上清液，将PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解于无血清DMEM培养基，添加1ml二甲基亚砜并进行过滤灭菌]用0.5ml正确地融合1分30秒。轻轻地添加13ml的无血清培养液(DMEM)，以1200rpm进行离心。除去上清液，添加通常的小鼠ES细胞的培养液，使用丝裂霉素处理后的G418耐性小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，接种于2个直径10cm细胞培养皿中，培养一夜。以成为250μg/ml的方式添加潮霉素，进行3～4周选择培养。将通过2次微核细胞融合得到的合计28个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：B6-ES(MAC2)及B6(HPRT-；MAC2)及KO56(HPRT-；MAC2))。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否小鼠人工染色体MAC2可导入于小鼠ES细胞。将其引物序列示于以下。
TRANS L(上述)
m11 6R(上述)
m11 4L(上述)
hyg R(696)(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃10分钟进行30个循环。PCR的结果，28个克隆中的27个克隆在全部的引物组中为阳性，用随机选自该27个克隆中的3个克隆进行以后的分析。
表21
Figure BDA00002103887500911
[C.2.2]单色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的小鼠ES(MAC2)的克隆进行了以小鼠次要卫星DNA作为探针的FISH分析，结果确认3个克隆中的1个克隆中以80％以上的比例将MAC2以1拷贝导入于小鼠ES细胞，且作为KO56细胞的通常核型的内源小鼠染色体的条数为39条。
由以上的结果可以得到如下结论：在源自小鼠11号染色体的染色体片段即小鼠人工染色体MAC中插入有作为基因插入位点的loxP序列的小鼠人工染色体载体MAC2可导入于小鼠ES细胞(图23)。
表22
Figure BDA00002103887500931
[D]如实施例8中记载的那样，可以使用携带有小鼠人工染色体载体MAC2的小鼠ES细胞检验体外的稳定性。另外，由上述ES细胞制作嵌合体小鼠，可以制作子代传递有MAC2的小鼠系统TC(MAC2)。另外，使用上述TC(MAC2)小鼠系统，可检验体细胞中的MAC2的稳定性。
[实施例5]小鼠人工染色体载体MAC3的构建
构建在小鼠人工染色体MAC中插入有PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP序列作为DNA插入序列的小鼠人工染色体载体MAC3(图4)。检验小鼠人工染色体载体MAC3在小鼠ES细胞中的稳定性，进而通过制作导入有MAC3的子代传递小鼠来检验个体组织中的稳定性。
[A]PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP序列向小鼠人工染色体MAC的插入
[A.1]PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP打靶载体的制作
用于插入loxP序列的基本质粒使用上述制作的VH21-12。将利用SalI和AscI从pVNLH中切出的PGKneo-loxP-3’HPRT盒克隆到VH21-12的XhoI位点和AscI位点(载体名：pMAC3)。示出了打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因(图24)。
[A.2]转染及G418耐性克隆的分离
鸡DT40细胞的培养在添加有10％胎牛血清(Gibco，以下记为FBS)、1％鸡血清(Gibco)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640培养基(Gibco)中进行。将DT40(MAC)-1的约107个细胞在无添加RPMI1640培养基中清洗一次，悬浮于0.5ml的无添加RPMI1640培养基，添加25μg用限制酶NotI(TAKARA)线性化的打靶载体pMAC3，移至电穿孔法用的小槽(BioRad)，在室温下静置10分钟。将小槽设置于基因脉冲仪(BioRad)，在550V、25μF的条件下施加电压。在室温下静置10分钟后，进行24小时培养。更换成含有G418(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于2张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过2次转染得到的合计14个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(MAC3))
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了提取G418耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否在小鼠11号染色体上位点特异性地引起重组。将其引物序列示于以下。
m11 17L(上述)
Puro-1：5’-GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACG-3’(序列号50)
kj neo(上述)
m11 6R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp9600，Taq聚合酶使用LA Taq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃9分钟进行35个循环。PCR的结果，17个克隆中的16个克隆在全部的引物组中为阳性，因此，随机从该16个克隆中选择2个克隆进行以后的分析。
表23
Figure BDA00002103887500961
[A.3.2]单色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的DT40(MAC3)的2个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果，在全部克隆中未引起染色体转座等且以90％以上的比例独立地携带。
表24
Figure BDA00002103887500971
[A.3.3]双色FISH分析
在从上述随机选择的DT40(MAC3)-160及187中，依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行双色FISH分析。以小鼠cot-1DNA及小鼠次要卫星DNA作为探针进行了FISH分析，结果可知小鼠人工染色体MAC3以1拷贝独立地存在(图25)。
由这些结果可得出如下结论：可得到携带有在小鼠着丝粒附近插入有loxP序列作为DNA插入序列的小鼠人工染色体载体MAC3的DT40细胞克隆。
[B]MAC3从含有小鼠人工染色体载体MAC3的鸡DT40细胞向CHO细胞的导入
为了将小鼠人工染色体载体MAC3的DNA序列插入位点即loxP经由稳定地插入于靶基因等(例如GFP基因等)，将小鼠人工染色体载体MAC3导入于CHO细胞。
[B.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
将作为受体细胞的DT40(MAC3)-160在细胞培养皿进行培养，在达到汇合的时刻，更换成添加20％FBS、1％鸡血清、10-4M 2-巯基乙醇、0.05μg/ml秋水酰胺的RPMI1640培养基，再培养12小时形成微细胞。将培养液取代为24ml的无血清DMEM培养基，在预先用100μ/ml的多聚赖氨酸涂层的12个离心用25cm2烧瓶(锥形)中分别各注入2ml，在37℃下培养30分钟，使细胞附着于烧瓶底。除去上清液，将预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液充满至离心用烧瓶中，在34℃下以8000rpm进行1小时的离心。将微细胞悬浮于无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以1700rpm进行10分钟离心，悬浮于无血清DMEM培养基5ml。
供体细胞使用CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得、登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-)。将精制后的微核再次悬浮于含有PHA-P(SIGMA)的无血清培养液2ml，轻轻地接种于除去了培养上清液[添加10％FBS的F12培养基(Invitrogen)]的CHO细胞上。将板在37℃下培养15分钟。除去上清液，将PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全地溶解于无血清DMEM培养基，添加1ml二甲基亚砜并进行过滤灭菌]用1ml正确地融合1分钟。将无血清培养液(DMEM)用4ml清洗4次，添加通常的CHO细胞的培养液5ml并培养一夜。用PBS(-)将细胞表面清洗2次后，通过胰蛋白酶处理使细胞分散，播种于5个直径10cm细胞培养皿，以成为800μg/ml的方式添加G418，进行3～4周选择培养。将通过2次微核细胞融合得到的合计12个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC3))。
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]PCR分析
为了提取G418耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否小鼠人工染色体载体MAC3可导入于CHO细胞。将其引物序列示于以下。
kj neo(上述)
m1 16R(上述)
m11 17L(上述)
Puro-1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃10分钟进行30个循环。PCR的结果，7个克隆中的6个克隆在全部的引物组中为阳性，用该6个克隆进行以后的分析。
表25
Figure BDA00002103887500991
[B.2.2]单色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到CHO(HPRT-；MAC3)的6个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认6个克隆中的3个克隆中以90％以上的比例将MAC3导入于CHO细胞(图26)。
表26
Figure BDA00002103887501001
由以上的结果可以得出如下结论：小鼠人工染色体载体MAC3可导入于CHO细胞。
[C]MAC3从含有小鼠人工染色体载体MAC3的CHO细胞向小鼠ES细胞的导入
为了检验小鼠ES细胞及小鼠个体内中的小鼠人工染色体载体MAC3的稳定性，将小鼠人工染色体MAC3导入于小鼠ES细胞，制作含有小鼠人工染色体载体MAC3的嵌合体小鼠以及子代传递小鼠。
[C.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
将作为受体细胞的CHO(HPRT-；MAC3)-1、6在细胞培养皿中进行培养，在达到汇合的时刻更换成添加有20％FBS、0.1μg/ml秋水酰胺的F12培养基，再培养48小时后，用添加有20％FBS、0.1μg/ml秋水酰胺的F12培养基更换培养基，再培养一夜形成微细胞。除去培养液，将预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液充满至离心用烧瓶中，在34℃下以8000rpm进行1小时的离心。将微细胞悬浮于无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm进行10分钟离心，悬浮于无血清DMEM培养基5ml。将微细胞悬浮于5ml的无血清DMEM培养基，用8μm，5μm，3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm进行10分钟离心。
供体细胞使用从日本CLEA获得的对C57B6系统小鼠的ES细胞进行了6TG处理的HPRT缺陷株即B6(HPRT-)。对培养而言，在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose：SIGMA)中添加10％FCS、LIF(Muerin Leukemia Inhibitory Factor)、1×10-5M 2-ME(2-巯基乙醇：SIGMA)、L-谷酰胺(3.5g/ml：GIBCO)、丙酮酸钠溶液(3.5g/ml：GIBCO)、MEM非必需氨基酸(0.125mM：GIBCO)，在5％CO2、37℃下进行培养。将小鼠ES细胞用PBS(-)对细胞表面清洗2次后，通过胰蛋白酶处理使细胞分散，用在DMEM培养基中添加有10％FBS的培养液进行回收，以1500rpm进行离心，除去上清液，再次悬浮于无血清培养液5ml，轻轻地添加于含有微细胞的离心后的颗粒的无血清培养基，再以1200rpm进行离心。除去上清液，将PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解于无血清DMEM培养基，添加1ml二甲基亚砜并进行过滤灭菌]用0.5ml正确地融合1分30秒。轻轻地添加13ml的无血清培养液(DMEM)，以1200rpm进行离心。除去上清液，添加通常的小鼠ES细胞的培养液，使用丝裂霉素处理后的G418耐性小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，接种于2个直径10cm细胞培养皿，培养一夜。以成为250μg/ml的方式添加G418，进行3～4周选择培养。将通过2次微核细胞融合得到的合计28个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：B6(HPRT-；MAC3))。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取G418耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否在小鼠11号染色体上引起位点特异性切断。将其引物序列示于以下。
kj neo(上述)
m11 6R(上述)
m11 17L(上述)
Puro-1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃10分钟进行30个循环。PCR的结果，28个克隆中的27个克隆在全部的引物组中为阳性，用该27个克隆进行以后的分析。
表27
[C.2.2]单色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的B6(HPRT-；MAC3)中的16个克隆进行了以小鼠次要卫星DNA作为探针的FISH分析，结果确认16个克隆中的5个克隆中以95％以上的比例将MAC3导入于小鼠ES细胞。
由以上的结果可以得出如下结论：小鼠人工染色体载体MAC3可导入于小鼠ES细胞(图27)。
表28
Figure BDA00002103887501041
[D]小鼠人工染色体载体MAC3在小鼠ES细胞中的稳定性
对于上述得到的小鼠ES克隆(例如B6(HPRT-；MAC3)-3、-s6，上述[C]中取得)，对0～100PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有MAC1的细胞的比例进行测量，结果即使在100PDL中也为95％以上的携带率(图28)。
由以上的结果表明，小鼠人工染色体载体MAC3在小鼠ES细胞(体外)中以95％以上的比例非常稳定地维持。
[E]携带有小鼠人工染色体载体MAC3的嵌合体小鼠的制作
使用上述得到的ES细胞克隆并依据(基因打靶，实验医学，1995)的方法制作嵌合体小鼠。作为宿主，使用通过MCH(ICR)(白色，从日本Clea公司购入)的雌雄交配而得到的桑椹胚。将注入胚移植于寄养母体，结果出生的仔小鼠可以通过毛色判定是否为嵌合体或可判定嵌合率作为ES细胞相对于ICR的胚细胞在形成个体的细胞中的贡献率。
将注入有B6(HPRT；MAC3)克隆(例如B6(HPRT；MAC3)-ES(MAC3)-s6上述中取得)的60个胚移植于寄养母体，结果诞生8只嵌合体小鼠(毛色确认浓茶色的部分)。8只中，2只为雄性且10％嵌合体小鼠为1只、5％嵌合体小鼠为1只，6只为雌性且10％嵌合体小鼠为4只、5％嵌合体小鼠为2只。即，表示携带有小鼠人工染色体MAC3的ES细胞株(B6HPRT-/-株)携带有嵌合体形成能力，即小鼠个体的正常组织携带有进行分化的能力。
[F]如实施例8中记载的那样，可以使携带有小鼠人工染色体载体MAC3的嵌合体小鼠和野生型小鼠进行交配而制作子代传递有MAC3的小鼠系统TC(MAC3)。另外，可以使用上述TC(MAC3)小鼠系统检验体细胞中的MAC3的稳定性。
[实施例6]小鼠人工染色体载体GFP-MAC的构建
作为小鼠人工染色体载体MAC3中编码有用蛋白质的基因的例子，可以使用Cre/loxP系统插入作为荧光基因的EGFP检验功能蛋白质的表达和长期稳定性(图5)。
[A]CHO细胞中含有的小鼠人工染色体载体MAC3载体含有的特定的基因(例如GFP)利用Cre/loxP系统向小鼠人工染色体载体MAC3的插入
可检测在小鼠人工染色体MAC中插入有PGKneo-loxP-3’HPRT型的loxP序列作为DNA插入序列的小鼠人工染色体载体MAC3中loxP是否工作且质粒DNA是否可位点特异性地插入。
[A.1]EGFP插入载体的制作
用于插入loxP序列的基本质粒使用V913(Lexicon genetics)。5’HPRT-loxP将进行寡合成的loxP序列克隆到V820(Lexicon genetics)的XbaI位点。将5’HPRT-loxP克隆到V907(Lexicon genetics)的ClaI和AscI，将PGKhygro克隆到ClaI和KpnI位点(载体名：pX6.1)。进而将利用NotI和SalI切出的HS4-CAG-EGFP-HS4(由大阪大学的冈部博士及NIH的Felsenfeld博士赠与)克隆到X6.1的NotI位点和SalI位点，作为HPRT再构建体系的GFP插入构建体(载体名：pX6.1EGFP)。将通过Cre/loxP系统插入通过利用HPRT再构建体系的GFP插入而产生的染色体位点特异性DNA示于图29。
[A.2]转染及HAT耐性克隆的分离
基因导入使用脂质转染法进行，对于达到90％汇合状态的6孔的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre 1μg和GFP插入载体2μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过2次导入而得到的合计22个集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(GFP-MAC))。
[A.3]药剂耐性克隆的筛选
[A.3.1]利用荧光显微镜观察的GFP插入体的确认
在荧光显微镜下对克隆的22个集落进行观察，结果在全部的克隆中可观察到GFP阳性细胞，其阳性率约为100％。
[A.3.2]PCR分析
为了将HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否位点特异性地引起GFP基因的插入。将其引物序列示于以下。
TRANS L1(上述)
TRANS R1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃10分钟的热变性后，以94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒进行35个循环。PCR的结果，22个克隆均为阳性，用该22个克隆进行以后的分析。
表29
Figure BDA00002103887501071
[A.3.3]双色FISH分析
在从上述的结果中随机选择的6个克隆中，依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行双色FISH分析。以小鼠cot-1DNA及X6.1EGFP作为探针进行了FISH分析，结果确认在6个克隆中的3个克隆中，以50％以上的比例携带有1拷贝GFP-MAC，进而，出现源自X6.1EGFP的信号，在作为阴性对照的位点特异性插入EGFP前的MAC3上未检测到信号，因此，位点特异性地插入有EGFP(图30)。
表30
Figure BDA00002103887501081
通过以上的实验在小鼠人工染色体MAC3上搭载GFP基因，由此，可观察到GFP表达，可确认得到携带有小鼠人工染色体载体GFP-MAC的CHO细胞。
[B]GFP-MAC从含有小鼠人工染色体载体GFP-MAC的CHO细胞向小鼠ES细胞的导入
[B.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
将作为受体细胞的CHO(GFP-MAC)-4、10、12在细胞培养皿中进行培养，在达到汇合的时刻更换成添加有20％FBS、0.05μg/ml秋水酰胺的F12培养基，再培养48小时后，用添加有20％FBS、0.05μg/ml秋水酰胺的F12培养基进行培养基更换，再培养一夜形成微细胞。除去培养液，将预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液充满至离心用烧瓶，在34℃下以8000rpm进行1小时的离心。将微细胞悬浮于无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm培养10分钟，悬浮于无血清DMEM培养基5ml。
将微细胞悬浮于5ml的无血清DMEM培养基，用8μm、5μm、3μm过滤器进行精制。精制后，以2000rpm进行10分钟离心。
供体细胞使用从日本Clea获得的由C57B6系统小鼠的ES细胞建立的野生型B6细胞及野生型TT2F细胞的小鼠ES细胞。对培养而言，在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose：SIGMA)中添加10％FCS，LIF(Muerin Leukemia Inhibitory Factor)、1×10-5M 2-ME(2-巯基乙醇：SIGMA)、L-谷酰胺(3.5g/ml：GIBCO)、丙酮酸钠溶液(3.5g/ml：GIBCO)、MEM非必需氨基酸(0.125mM：GIBCO)，在5％CO2、37℃下进行培养。将小鼠ES细胞用PBS(-)对细胞表面清洗2次后，通过胰蛋白酶处理使细胞分散，用在DMEM培养基中添加有10％FBS的培养液进行回收，以1500rpm进行离心，除去上清液，再次悬浮于无血清培养液5ml，轻轻地添加含有微细胞的离心后的颗粒的无血清培养基，再以1200rpm进行离心。除去上清液，将PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解于无血清DMEM培养基，添加1ml二甲基亚砜并进行过滤灭菌]用0.5ml正确地融合1分30秒。轻轻地添加13ml的无血清培养液(DMEM)，以1200rpm进行离心。除去上清液，添加通常的小鼠ES细胞的培养液，使用丝裂霉素处理后的G418耐性小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，接种于2个直径10cm细胞培养皿，培养一夜。以成为250μg/ml的方式添加G418，进行3～4周选择培养。将通过2次微核细胞融合得到的合计36个耐性集落并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：TT2F(GFP-MAC)及B6-ES(GFP-MAC))。
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]PCR分析
为了提取G418耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否在小鼠11号染色体上引起位点特异性切断。将其引物序列示于以下。
TRANS L1：(上述)
TRANS R1：(上述)
m11 6R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。TRANS L1/R1的温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃1分钟进行35个循环。TRANS L1/m11 6R的温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行35个循环。PCR的结果，36个克隆中的34个克隆在全部的引物组中为阳性，从其中随机选择24个克隆进行以后的分析。
表31
Figure BDA00002103887501111
[B.2.2]喹吖因·Hoechst双重染色
对于通过上述PCR分析为阳性的克隆，与上述的方法同样地进行喹吖因·Hoechst双重染色。利用荧光显微镜对喹吖因·Hoechst双重染色后的克隆的染色体图像进行观察，结果可知在24个克隆中的18个克隆中以100％的比例携带小鼠人工染色体GFP-MAC。
表32
Figure BDA00002103887501131
由以上的结果可以得出如下结论：导入有小鼠人工染色体GFP-MAC的小鼠ES细胞为通常核型且可用于长期培养及嵌合体小鼠制作。
[B.2.3]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的小鼠ES(GFP-MAC)的克隆进行了以小鼠次要卫星DNA及pX6.1E作为探针的FISH分析，结果确认在12个克隆中的6个克隆中以95％以上的比例将GFP-MAC导入于小鼠ES细胞。
表33
由以上的结果可以得出如下结论：小鼠人工染色体载体GFP-MAC可导入于小鼠ES细胞。
[C]小鼠人工染色体载体GFP-MAC在小鼠ES细胞中的稳定性
对于上述得到的小鼠ES克隆(例如B6-ES(MAC3)-9，上述[B]中取得)，对0～100PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有GFP-MAC3的细胞的比例进行测量，结果即使在100PDL中也为95％以上的携带率(图31，图32)。另外，在荧光显微镜下对集落进行了观察，结果在全部的克隆中观察到GFP阳性细胞，其阳性率约为100％。
表34
Figure BDA00002103887501171
由以上的结果可得出如下结论：利用Cre/loxP系统可有效地在小鼠人工染色体载体MAC3中位点特异性地插入20kb以下的外源基因(EGFP基因等)，另外，搭载有外源基因的MAC3在小鼠ES细胞中非常稳定，MAC3上的外源基因的表达也长时间稳定。
[D]携带有小鼠人工染色体载体GFP-MAC的嵌合体小鼠的制作
使用上述[B]得到的ES细胞克隆并依据(基因打靶，实验医学，1995)的方法制作嵌合体小鼠。作为宿主，使用通过MCH(ICR)(白色，从日本Clea公司购入)的雌雄交配而得到的桑椹胚及8细胞期胚。将注入胚移植于寄养母体，结果出生的仔小鼠通过毛色判断是否为嵌合体。
将分别注入有野生型雄B6(GFP-MAC)克隆及野生型(GFP-MAC)TT2F雌克隆(例如B6-ES(GFP-MAC)4及18、TT2F(GFP-MAC)-12，在上述中取得)的胚(野生型雄B6(GFP-MAC)克隆260个及野生型雌TT2F(GFP-MAC)克隆180个)移植于寄养母体，结果诞生嵌合体小鼠(在毛色中确认浓茶色的部分)。出生42只源自雄野生型B6(GFP-MAC)克隆的嵌合体小鼠，其中，20只为雄小鼠，GFP阳性50％嵌合体小鼠为1只、40％嵌合体小鼠为5只、30％嵌合体小鼠为1只、20％嵌合体小鼠为7只、10％嵌合体小鼠为3只、5％嵌合体小鼠为3只。另外，出生14只源自野生型TT2F(GFP-MAC)克隆的嵌合体小鼠，其中，1只为几乎观察不到白色的部分的嵌合率约100％且GFP阳性的个体。
如上所述，表示携带有小鼠人工染色体载体GFP-MAC的ES细胞株(B6及TT2F)具有嵌合体形成能力，即小鼠个体的正常组织携带有进行分化的能力。
[E]小鼠人工染色体从携带有小鼠人工染色体载体GFP-MAC的嵌合体小鼠的子代传递
在由将上述[D]制作的雌嵌合体小鼠(嵌合率约100％)与C57B6(黑色、从日本Clea公司购入)雄小鼠交配而成的嵌合体小鼠诞生的4只仔小鼠中，3只为源自ES细胞的GFP-MAC的显性遗传特征，观察到GFP的荧光。另外，对于3只中的1只仔小鼠，在全身观察到GFP的荧光，表示即使在小鼠个体中小鼠人工染色体也稳定(图33)。将子代传递有GFP-MAC的小鼠系统称为TC(GFP-MAC)。另外，如实施例8中所记载的那样，可以使用上述TC(GFP-MAC)小鼠系统检验体细胞中的GFP-MAC的稳定性。
[实施例7]小鼠人工染色体载体MAC1的稳定性
[A.1]小鼠人工染色体载体MAC1在CHO细胞中的稳定性
对于上述得到的CHO克隆(例如CHO(HPRT-；MAC1)-8、22，上述实施例2中取得)，对25PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有AC1细胞的比例进行测量，结果即使在25PDL中也为90％以上的携带率。另一方面，对Kazuki等的报告(Gene Therapy：PMID：21085194，2010)中所记载的携带有源自21号染色体的GFP搭载HAC载体(21HAC2)的CHO细胞而言，在25PDL中为70％以下的携带率。将其代表性的结果示于图34。
[A.2]小鼠人工染色体载体MAC1在小鼠ES细胞中的稳定性
对于上述得到的小鼠ES克隆(例如KO56(MAC1)-5及TT2F(MAC1)-23，上述实施例2中取得)，对0～75PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有MAC1的细胞的比例进行测量，结果即使在75PDL中也为90％以上的携带率。另一方面，对Kazuki等的报告(Gene Therapy：PMID：21085194，2010)中所记载的携带有源自21号染色体的GFP搭载HAC载体(21HAC2)的小鼠ES细胞而言，在75PDL中为70％以下的携带率。将其代表性的结果示于图35。
[A.3]携带有小鼠人工染色体载体MAC1的嵌合体小鼠的制作
使用上述实施例2中得到的ES细胞克隆并通过Tomizuka等的方法(Nature Genet.16：133，1997)制作嵌合体小鼠。作为宿主，使用通过MCH(ICR)(白色，从日本Clea公司购入)的雌雄交配而得到的8细胞期胚。将注入胚移植于寄养母体，结果出生仔小鼠通过毛色判定是否为嵌合体。将注入有携带有MAC1的ES克隆(例如KO56MAC1-5及TT2FMAC1-4，上述实施例2中取得)的1620个胚移植于寄养母体，结果诞生56只嵌合体小鼠(毛色中确认浓茶色的部分)。其中，13只为几乎观察不到白色的部分的嵌合率约100％的个体。即，表示携带有小鼠人工染色体载体MAC1的ES细胞株(KO56及TT2F)携带有嵌合体形成能力，即小鼠个体的正常组织携带有进行分化的能力。
[A.4]MAC1从携带有小鼠人工染色体载体MAC1的嵌合体小鼠的子代传递
将2只上述[A.3]制作的雌嵌合体小鼠(嵌合率约100％)与MCH(ICR)(白色，从日本CLEA公司购入)雄小鼠进行交配。在由嵌合体小鼠诞生的18只仔小鼠中，13只为表现携带有源自ES细胞的显性遗传特征的浓茶色。即表示携带有MAC1的ES细胞株在雌嵌合体小鼠中分化成功能性的卵细胞。另外，通过GFP荧光对MAC1的携带进行研究，结果在13只中的6只(46％)中为GFP阳性，确认嵌合体小鼠子代中的MAC1的携带。即，依据孟德尔遗传法则，确认MAC1特征约以50％的频率出现，表示卵子中的MAC1的携带率接近100％。将子代传递有MAC1的小鼠系统称为TC(MAC1)。
[A.5]TC(MAC1)小鼠系统的体细胞中的MAC1的稳定性
[A.5.1]实体荧光显微镜观察
在实体荧光显微镜下，对于上述得到的TC(MAC1)小鼠中的雄(5)及雌(2)各1只的脑、胸腺、心脏、肺、肝脏、肾脏，脾脏、小肠、肌肉、睾丸(或卵巢)进行了观察，在全部的组织中观察到GFP阳性，其阳性率为100％。将其雌(5)的代表性的结果示于图36。
[A.5.2]血液系统细胞的FACS分析
使用B细胞(CD19)、T细胞(CD4、CD8)、对于巨核细胞(CD41)的特异性抗体(Becton，Dickinson and Company)，对骨髓以及脾脏细胞中的GFP阳性率进行了研究，结果在全部的组织中阳性率为95％以上。另一方面，对Kazuki等的报告(Gene Therapy：PMID：21085194，2010)中所记载的携带有源自21号染色体的GFP搭载HAC载体(21HAC2)的小鼠而言，在全部的组织中阳性率为15％以下。将其代表性的结果示于图37、图38。
[A.5.3]荧光原位杂交(FISH)分析
另外，使用由与上述同样的个体制备的尾部成纤维细胞并通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法进行了以小鼠次要卫星DNA作为探针的FISH分析，可视觉性确认MAC1的存在，确认在95％以上的细胞中MAC1独立于小鼠染色体存在(图39)。
由以上的结果确认在小鼠ES细胞(体外)以及小鼠组织(体内)中以90％以上的比例非常稳定地维持有小鼠人工染色体载体MAC1。
[实施例8]携带有小鼠人工染色体载体CYP3A-MAC的小鼠的制作和稳定性
[A]CYP3A-MAC从CHO细胞向小鼠A9细胞的移入
为了制作携带有CYP3A-MAC的小鼠ES细胞，通过微核细胞融合法从上述实施例3中得到的携带有CYP3A-MAC的CHO细胞(CHO(CYP3A-MAC，hChr7-ΔCYP3A)22、26、34、35等)向对于小鼠A9细胞的微细胞形成能力高的小鼠A9细胞导入。将通过8次微核细胞融合得到的合计25个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：A9(CYP3A-MAC))。其结果，在使用了仅检测CYP3A-MAC区域的上述引物的PCR  中阳性的克隆为6个克隆。进而，使用CYP3A-BAC(RP11757A13)(CHORI)以及小鼠次要卫星DNA探针进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果在利用上述探针特异性地检测CYP3A-MAC存在的6个克隆中，在3个克隆中被确认(图40)。由以上可得出如下结论：可得到3个克隆的携带有CYP3A-MAC的A9细胞。
[B]CYP3A-MAC从A9细胞向小鼠ES细胞的移入
为了制作携带有CYP3A-MAC的嵌合体小鼠，通过微核细胞融合法从上述[A]得到的携带有CYP3A-MAC的A9细胞向小鼠ES细胞(野生型TT2F)导入。依据Tomizuka等(Nature Genet.16：133，1997)的方法由携带有约108个CYP3A-MAC的A9细胞(A9(CYP3A-MAC)8、9等)精制微细胞，悬浮于DMEM 5ml。通过胰蛋白酶处理剥下约107个小鼠ES细胞TT2F，用DMEM清洗三次后悬浮于DMEM 5ml，加入于离心后的微细胞中，以1250rpm进行10分钟离心，完全除去上清液。通过轻打充分解开沉淀，添加1∶1.4PEG溶液[将5g PEG1000(和光纯药)、1ml DMSO(Sigma)溶解于DMEM 6ml]0.5ml，充分搅拌约1分30秒。然后，慢慢地加入DMEM 10ml，以1250rpm进行10分钟搅拌，悬浮于30ml的ES培养基，分别注入于3个预先接种有饲养细胞的直径100mm皮氏培养皿(锥形)，进行培养。24小时后，更换成含有300μg/ml的G418的培养基，进行约1周选择培养。其结果，将合计34个集落分离并使其增殖，进行以后的分析。自A9(CYP3A-MAC)8的14个克隆、自A9(CYP3A-MAC)9的7个克隆在使用了仅检测CYP3A-MAC区域的上述引物的PCR中为阳性。进而，对于上述中的20个克隆，使用源自CYP3A-BAC(RP11-757A13)(CHORI)的DNA进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果利用上述探针特异性地进行检测，且小鼠的核型正常的克隆为8个克隆(图41)。由以上可以得到如下结论：可得到8个克隆的携带有CYP3A-MAC的TT2F细胞。
[C]CYP3A-MAC的小鼠ES细胞中的稳定性
对于上述[B]中得到的小鼠ES克隆(例如TT2F(CYP3A-MAC)8-5、8-22、9-4、9-7、9-9，上述[B]中取得)，对0～100PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有CYP3A-MAC的细胞的比例进行测量，结果即使在100PDL中也为95％以上的携带率。(图42)。
[D]携带有CYP3A-MAC的嵌合体小鼠的制作
使用上述[B]得到的携带有CYP3A-MAC的ES细胞克隆并通过Tomizuka等的方法(Nature Genet.16：133，1997)制作嵌合体小鼠。作为宿主，使用通过MCH(ICR)(白色，从日本Clea公司购入)的雌雄交配而得到的8细胞期胚。将注入胚移植于寄养母体，结果出生的仔小鼠可通过毛色判断是否为嵌合体。将注入有携带有MAC1的ES克隆(例如TT2F(CYP3A-MAC)8-5、8-16、8-22、9-4、9-7、9-9、9-10等，上述[B]中取得)的840个胚移植于寄养母体，结果诞生28只嵌合体小鼠(在毛色中确认浓茶色的部分)。其中，5只为几乎观察不到白色的部分的嵌合率约100％的个体。即，表示携带有小鼠人工染色体载体CYP3A-MAC的ES细胞株(TT2F)携带有嵌合体形成能力，即小鼠个体的正常组织携带有进行分化的能力。
[E]CYP3A-MAC从携带有CYP3A-MAC的嵌合体小鼠的子代传递
将5只上述[D]制作的雌嵌合体小鼠(嵌合率约100％)与MCH(ICR)(白色，从日本Clea公司购入)雄小鼠进行交配。在由嵌合体小鼠诞生的60只仔小鼠中，50只为显示携带有源自ES细胞的显性遗传特征的浓茶色。即表示携带有CYP3A-MAC的ES细胞株在雌嵌合体小鼠中分化成功能性的卵细胞。另外，通过GFP荧光对CYP3A-MAC的携带进行了研究，结果在50只中的29只(58％)中为GFP阳性，确认嵌合体小鼠子代中的CYP3A-MAC的携带。即，依据孟德尔遗传法则，确认CYP3A-MAC特征以约50％的频率出现，表示卵子中的CYP3A-MAC的携带率接近100％。将子代传递有CYP3A-MAC的小鼠系统称为TC(CYP3A-MAC)。
[F]TC(CYP3A-MAC)小鼠系统的体细胞中的CYP3A-MAC的稳定性
[F.1]实体荧光显微镜观察
在实体荧光显微镜下，对上述得到的TC(CYP3A-MAC)小鼠中的雄(2)1只、雌(14)1只的脑、胸腺、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、小肠、肌肉、睾丸进行了观察，结果在全部的组织中观察到GFP阳性，其阳性率为100％。将其雄(2)的代表性的结果示于图43。
[F.2]血液系统细胞的FACS分析
使用B细胞(CD19)、T细胞(CD4，CD8)、对于巨核细胞(CD41)的特异性抗体(Becton，Dickinson and Company)对骨髓中的GFP阳性率进行了研究，结果在全部的组织中阳性率为94％以上。另一方面，对WO2009/063722(PCT/JP2008/068928)中所记载的携带有源自14号染色体的HAC载体(CYP3A-HACΔ)的小鼠而言，在全部的组织中阳性率为20％以下。将其代表性的结果示于图44。
[F.3]荧光原位杂交(FISH)分析
另外，在与上述同样的个体及组织中，通过Shinohara等的报告(HumanMolecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法进行了以CYP3A-BAC(RP11-757A13)DNA作为探针的FISH分析，结果视觉上确认CYP3A-MAC的存在，确认90-98％的细胞中存在CYP3A-MAC。另一方面，对WO2009/063722(PCT/JP2008/068928)中所记载的携带有源自人类14号染色体的HAC载体(CYP3A-HACΔ)的小鼠而言，在全部的组织中阳性率为56-97％。将其代表性的结果示于图45。
[F.4]TC(CYP3A-MAC)系统的传递率
通过将TC(CYP3A-MAC)雌小鼠8只和MCH(ICR)(白色，从日本CLEA公司购入)雄小鼠8只进行交配来研究传递率。可得到81只仔小鼠，38只为GFP阴性、43只为GFP阳性个体(传递率53％)。即，传递率符合孟德尔遗传法则，确认CYP3A-MAC特征以约50％的频率出现，表示卵子中的CYP3A-MAC的携带率接近100％。
[F.5]携带有2条CYP3A-MAC的TC(CYP3A-MAC)纯合系统的制作和传递率
将上述得到的TC(CYP3A-MAC)雄小鼠和TC(CYP3A-MAC)雌小鼠进行交配，尝试建立携带有2条CYP3A-MAC的TC(CYP3A-MAC)纯合系统。使用18只仔小鼠的尾部成纤维细胞并通过Shinohara等的报告(HumanMolecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法进行了以CYP3A-BAC(RP11757A13)DNA作为探针的FISH分析，结果视觉上确认CYP3A-MAC的存在。对4x36的系统而言，在12只仔小鼠中，3只为2拷贝、5只为1拷贝、4只为0拷贝。对24x37的系统而言，在6只仔小鼠中，1只为2拷贝、3只为1拷贝、2只为0拷贝。可得到合计18只，CYP3A-MAC的2拷贝(4只)、1拷贝(8只)、0拷贝(6只)的比率为1∶2∶1.5，基本符合孟德尔遗传法则。将其代表性的结果示于图46。
由以上的结果可确认：对CYP3A-MAC而言，在小鼠ES细胞(体外)中，能够以95％以上的比例非常稳定地长时间维持，在小鼠组织(体内)中，能够以90％以上的比例非常稳定且以纯合系统维持。
[G]TC(CYP3A-MAC)小鼠系统中组织特异性CYP3A基因簇的基因表达
对于上述中TC(CYP3A-MAC)小鼠中的雄(2)及雌(14)各1只，在脑、胸腺、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、小肠、肌肉中，依据市售的方案(QIAGEN)提取总RNA后，依据市售的方案(Invitrogen)进行cDNA合成，将其作为模板进行PCR，检测人类CYP3A基因簇及小鼠Cyp3a基因簇的表达。将其引物序列示于以下。
人类CYP3A基因簇表达检测用引物：
3A4-1L：5’-gtatggaaaagtgtggggct-3’(序列号51)
3A4-1R：5’-atacttcaagaattgggatg-3’(序列号52)
3A4-2L：5’-ccaagctatgctcttcaccg-3’(序列号53)
3A4-2R：5’-tgaagaagtcctcctaagct-3’(序列号54)
3A5-1L：5’-ctctgtttccaaaagatacc-3’(序列号55)
3A5-1R：5’-tcaacatctttcttgcaagt-3’(序列号56)
3A7-1L：5’-agcttttaagatttaatcca-3’(序列号57)
3A7-1R：5’-gagctttgtgggtctcagag-3’(序列号58)
3A7-2L：5’-ctctcagaattcaaaagact-3’(序列号59)
3A7-2R：5’-agaagaagtcctccaaagcg-3’(序列号60)
3A43-2L：5’-tatgacacaactagcaccac-3’(序列号61)
3A43-2R：5’-agtgtctagtgttctgggat-3’(序列号62)
小鼠Cyp3a基因簇表达检测用引物：
3a11-1L：5’-tcaaacgcctctccttgctg-3’(序列号63)
3a11-1R：5’-gcttgcctttctttgccttc-3’(序列号64)
3a11-2L：5’-ggtaaagtacttgaggcaga-3’(序列号65)
3a11-2R：5’-agaaagggctttatgagaga-3’(序列号66)
3a13-1L：5’-agaaacatgaggcagggatt-3’(序列号67)
3a13-1R：5’-acaaggagacatttagtgca-3’(序列号68)
3a13-2L：5’-taccccagtatttgatgcac-3’(序列号69)
3a13-2R：5’-agataactgactgagccaca-3’(序列号70)
对照基因表达检测用引物：
GAPDH-F：5’-CCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’(序列号71)
GAPDH-R：5’-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3’(序列号72)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用EXTaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在93℃5分钟的热变性后，以93℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟作为1个循环进行35循环。
其结果，在携带有TC(CYP3A-MAC)的小鼠中，仅在肝脏和小肠中检测到CYP3A4，仅在肝脏、小肠和肺中检测到CYP3A5，仅在肝脏、小肠、肾脏和肺中检测到CYP3A7，仅在肝脏、小肠和肾脏中检测到CYP3A43，仅在肝脏和小肠中检测到Cyp3a11，仅在肝脏和小肠中检测到Cyp3a13。另外，在全部的组织中检测到对照的GAPDH。将其雌(14)的代表性的结果示于图47。这样确认如人类中所发现的那样的组织特异性表达，显示其变为人源化。
[H]TC(CYP3A-MAC)小鼠系统中时期特异性CYP3A基因簇的基因表达
自GFP阳性的TC(CYP3A-MAC)小鼠的雄及雌的胎龄14.5日、胎龄16.5日、胎龄18.5日、生后0日、4周龄、6周龄、12周龄、24周龄中肝脏依据市售的方案(QIAGEN)提取总RNA后，依据市售的方案(Invitrogen)进行cDNA合成，将其作为模板进行PCR，使用检测上述的人类CYP3A基因簇表达及小鼠Cyp3a基因簇表达的引物检测表达。
其结果，确认成体型表达的人类CYP3A4、人类CYP3A5、小鼠cyp3a11、小鼠Cyp3a13在成熟期中强表达，胎儿型的CYP3A7在胎儿中强表达。另外，对照的GAPDH在全部的胎龄、周龄中检测到同程度的表达量。将其代表性的结果示于图48。这样确认如人类中所发现的那样的时期特异性表达，显示其变为人源化。
[实施例9]TC(CYP3A-MAC)/Δcyp小鼠系统的制作
[A]携带有CYP3A-MAC，且内源性Cyp3a基因群的两等位基因均被破坏的小鼠系统的构建
将上述实施例8中制作的TC(CYP3A-MAC)与WO2009/063722(PCT/JP2008/068928)的实施例7中制作的Δcyp系统进行回交，对于得到的GFP阳性小鼠个体，使用上述记载的PCR法进行基因型的分析。切下交配而得到的仔小鼠51只中的尾部的一部分，由该试样制备基因组DNA。与上述同样地对得到的DNA进行使用CYP3A-MAC检测用引物及WO2009/063722(PCT/JP2008/068928)的表1中记载的引物的PCR，检测CYP3A-MAC的携带及Cyp3a基因簇的KO，结果确认24只小鼠系统中携带有CYP3A-MAC，且内源性Cyp3a基因群的一个等位基因被破坏(杂合(ヘテロ)KO)。进而将杂合的Cyp3a基因群被破坏且携带有CYP3A-MAC的小鼠和Δcyp系统进行回交，切下得到的GFP阳性小鼠38只中的尾部的一部分，由该试样制备基因组DNA，使用与上述同样的PCR法进行基因型的分析。其结果，确认18只小鼠系统中携带有CYP3A-MAC，且内源性Cyp3a基因群的两个等位基因被破坏(杂合KO)。(以下，记为TC(CYP3A-MAC)/Δcyp)。
[B]TC(CYP3A-MAC)/Δcyp小鼠系统中的代谢分析
将TC(CYP3A-MAC)/Δcyp小鼠、Δcyp小鼠个体的肝脏微粒体依据Omura等(J.Biol.Chem.，239，2370，1964)与已知用CYP3A4进行代谢的三唑仑(Triazolam)(200μM)进行混合，可以测定作为其代谢物的α-OH-三唑仑及4-OH-三唑仑。如WO2009/063722(PCT/JP2008/068928)中所记载那样，在TC(CYP3A-MACΔ)/Δcyp小鼠中，确认同系统的小鼠及人类(HLM：human liver microsome，人类肝脏微粒体)活性为同程度。如上确认在TC(CYP3A-MAC)/Δcyp小鼠系统中CYP3A-MAC上的人类CYP3A基因为功能性且与人类同等。
[C]因此，源自TC(CYP3A-MAC)/Δcyp小鼠系统的肝脏微粒体可用作用于调查医药品开发中的第一相反应的药效·毒性的试样。另外，TC(CYP3A-MAC)/Δcyp小鼠系统可重现人类的药物代谢，因此，可用作用于调查医药品开发中的第一相反应的药效·毒性的体内试验用的模型小鼠。
[实施例10]携带小鼠人工染色体载体CYP3A-MAC的大鼠的制作
[A]CYP3A-MAC从A9细胞向大鼠ES细胞的移入
为了制作携带有CYP3A-MAC的嵌合体大鼠，通过微核细胞融合法从上述实施例8中得到的携带有CYP3A-MAC的A9细胞向可传递的子代传递的大鼠ES细胞即rESWIv3i-1(Hirabayashi等，Mol Reprod Dev.2010Feb；77(2)：94.)导入。依据Tomizuka等(Nature Genet.16：133，1997)的方法，由约108个携带有CYP3A-MAC的A9细胞(A9(CYP3A-MAC)8、9等)精制微细胞，悬浮于DMEM 5ml。通过胰蛋白酶处理剥下约107个大鼠ES细胞rESWIv3i-1，用DMEM清洗3次后悬浮于DMEM 5ml，加入到离心后的微细胞中，以1250rpm进行10分钟离心，完全除去上清液。通过轻打充分地解开沉淀，添加1∶1.4PEG溶液[将5g PEG1000(和光纯药)、1mlDMSO(Sigma)溶解于DMEM 6ml]0.5ml，充分搅拌约1分30秒。然后，慢慢加入DMEM 10ml，以1250rpm进行10分钟离心，悬浮于30ml的ES培养基，分别注入3个预先接种有饲养细胞的直径100mm皮氏培养皿(锥形)，进行培养。24小时后，更换成含有300μg/ml的G418的培养基，进行约1周选择培养。其结果，将合计10个集落分离并使其增殖，进行以后的分析。自A9(CYP3A-MAC)8的2个克隆、自A9(CYP3A-MAC)8的3个克隆在使用仅检测CYP3A-MAC区域的上述引物的PCR中为阳性。进而，对于上述5个克隆，使用CYP3A-BAC(RP11-757A13)(CHORI)以及小鼠Cot-1DNA进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果利用上述探针被特异性地检测，且大鼠的核型正常的克隆为3个克隆(图49)。由以上可以得出如下结论：可得到3个克隆的携带有CYP3A-MAC的大鼠ES细胞。
[B]如实施例8中所记载那样，可以使用携带有小鼠人工染色体载体CYP3A-MAC的大鼠ES细胞检验体外的稳定性。另外，可以由从上述ES细胞制作的嵌合体大鼠的大鼠系统rTC(CYP3A-MAC)制作子代传递的大鼠。另外，可以使用上述rTC(CYP3A-MAC)大鼠系统检验体细胞中的CYP3A-MAC的稳定性。另外，源自rTC(CYP3A-MAC)大鼠系统的肝脏微粒体可用作用于调查医药品开发中的第一相反应的药效·毒性的试样。另外，rTC(CYP3A-MAC)大鼠系统可重现人类的药物代谢，因此，可用作用于调查医药品开发中的第一相反应的药效·毒性的体体内试验用的模型大鼠。
[实施例11]小鼠人工染色体载体hChr21q-MAC的构建
为了制作唐氏综合征模型小鼠，使用Cre/loxP系统对小鼠人工染色体载体MAC1转座克隆含有比人类21号染色体长臂的AP001657更靠远端的区域33Mb的DNA序列，与实施例3同样地构建hChr21q-MAC。
[A]hChr21-loxP从含有hChr21-loxP的DT40向含有MAC1的CHO细胞的导入
在CHO细胞内经由loxP序列转座插入比人类21号染色体长臂的AP001657更靠远端的区域于小鼠人工染色体载体MAC1，将插入loxP序列于AP001657而成的人类21号染色体即hChr21-loxP导入于含有小鼠人工染色体载体MAC1的CHO细胞。
[A.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用受体细胞即含有hChr21-loxP的DT40细胞、DT40(kk139)(日本特开2007-295860)，与上述同样地对含有MAC1的CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得，登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-；MAC1)进行微核细胞融合法。将通过14次微核细胞融合得到的合计114个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC1，hChr21-loxP))。
[A.2]药剂耐性克隆的筛选
[A.2.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，对于上述114个克隆中的60个克隆，使用以下的引物进行PCR，确认人类21号染色体片段是否被导入于含有MAC1的CHO细胞。将其引物序列示于以下。
m11 5L(上述)
EGFP(F)L(上述)
kj neo(上述)
m11 6R(上述)
#21CEN<1>2L：5’-aaatgcatcaccattctcccagttaccc-3’(序列号73)
PGKr1：5’-ggagatgaggaagaggagaaca-3’(序列号74)
D21S265-L：5’-gggtaagaaggtgcttaatgctc-3’(序列号75)
D21S265-R：5’-tgaatatgggttctggatgtagtg-3’(序列号76)
D21S261-L：5’-gagggggactgggacaagccctttgctggaagaga-3’(序列号77)
D21S261-R：5’-acattaggaaaaatcaaaaggtccaattattaagg-3’(序列号78)
D21S268-L：5’-CAACAGAGTGAGACAGGCTC-3’(序列号79)
D21S268-R：5’-TTCCAGGAACCACTACACTG-3’(序列号80)
D21S266-L：5’-ggcttggggacattgagtcatcacaatgtagatgt-3’(序列号81)
D21S266-R：5’-gaagaaaggcaaatgaagacctgaacatgtaagtt-3’(序列号82)
D21S1259-L：5’-GGGACTGTAATAAATATTCTGTTGG-3’(序列号83)
D21S1259-R：5’-CACTGGCTCTCCTGACC-3’(序列号84)
CBR-L：5’-gatcctcctgaatgcctg-3’(序列号85)
CBR-R：5’-gtaaatgccctttggacc-3’(序列号86)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，60个克隆中的11个克隆在全部的引物组中为阳性，用该11个克隆进行以后的分析。
[A.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC1，hChr21-loxP)的11个克隆中的6个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认6个克隆中的1个克隆以70％的比例将MAC1以及hChr21-loxP以1拷贝导入于CHO细胞(图50)。
由以上的结果可以得出如下结论：hChr21-loxP可导入于含有小鼠人工染色体载体MAC1的CHO细胞。
[B]向CHO(HPRT-；MAC1，hChr21-loxP)克隆中的比人类21号染色体长臂的AP001657更靠远端的区域33Mb的MAC1载体的位点特异性转座
为了在小鼠个体内更稳定地维持比33Mb大小的DNA即人类21号染色体长臂的AP001657更靠远端的区域，转座插入于小鼠人工染色体载体MAC1(图51)。
[B.1]转染及HAT耐性克隆的分离
使用脂质转染法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC1，hChr21-loxP)-37进行基因导入，对于达到90％汇合状态的6孔的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre 3μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过2次导入得到的合计2个集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(hChr21q-MAC，hChr21-hChr21q))。
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]PCR分析
为了提取HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选相互转座克隆，使用以下的引物进行PCR，确认是否在人类21号染色体片段和MAC1上引起染色体相互转座。将其引物序列示于以下。
kj neo(上述)
PGKr1(上述)
D21S265-L(上述)
D21S265-R(上述)
D21S261-L(上述)
D21S261-R(上述)
D21S268-L(上述)
D21S268-R(上述)
D21S266-L(上述)
D21S266-R(上述)
D21S1259-L(上述)
D21S1259-R(上述)
CBR-L(上述)
CBR-R(上述)
TRANS L1(上述)
TRANS R1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，2个克隆中的2个克隆在全部的引物组中为阳性，用该2个克隆进行以后的分析。
[B.2.2]双色FISH分析
使用Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(hChr21q-MAC，hChr21-hChr21q)的2个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认在2个克隆中的2个克隆中以90％以上的比例在MAC1上观察到源自人类21号染色体的信号(图52)。
由以上的结果可以得出如下结论：比人类21号染色体长臂的AP001657更靠远端的区域33Mb可在小鼠人工染色体载体MAC1上进行利用互相转座的克隆。
[C]hChr21q-MAC从CHO细胞向小鼠ES细胞的移入
为了制作携带有hChr21q-MAC的嵌合体小鼠，通过微核细胞融合法从上述[B]得到的携带有hChr21q-MAC的CHO细胞向小鼠ES细胞(野生型TT2F)导入。依据Tomizuka等(Nature Genet.16：133，1997)的方法，由约108个携带有hChr21q-MAC的CHO细胞(CHO(hChr21q-MAC，hChr21-hChr21q)1，2)精制微细胞，悬浮于DMEM 5ml。通过胰蛋白酶处理剥下约107个小鼠ES细胞TT2F，用DMEM清洗3次后，悬浮于DMEM5ml，加入到离心后的微细胞中，以1250rpm进行10分钟离心，完全除去上清液。通过轻打充分地解开沉淀，添加1∶1.4PEG溶液[将5g PEG1000(和光纯药)、1ml DMSO(Sigma)溶解于DMEM 6ml]0.5ml，充分搅拌约1分30秒。然后，慢慢地加入DMEM 10ml，以1250rpm进行10分钟离心，悬浮于30ml的ES培养基，分别注入于3个预先接种有饲养细胞的直径100mm皮氏培养皿(锥形)，进行培养。24小时后，更换成含有300μg/ml的G418的培养基，进行约1周选择培养。其结果，将合计24个集落分离并使其增殖，进行以后的分析。自CHO(hChr21q-MAC，hChr21-hChr21q)1的2个克隆、自CHO(hChr21q-MAC，hChr21-hChr21q)2的6个克隆在使用仅检测hChr21q-MAC区域的上述引物的PCR中为阳性。进而，对于上述中的8个克隆，使用人类Cot-1DNA以及小鼠次要卫星DNA进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果利用上述探针被特异性地检测，且小鼠的核型正常的克隆为2个克隆(图53)。如上可以得出如下结论：可得到2个克隆的携带有hChr21q-MAC的TT2F细胞。
[D]hChr21q-MAC的小鼠ES细胞中的稳定性
对于上述得到的小鼠ES克隆(例如TT2F(hChr21q-MAC)22、上述[C]中取得)，对0～50PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有hChr21q-MAC的细胞的比例进行了测量，结果即使在50PDL也为95％以上的携带率。(图54)。
[E]携带有hChr21q-MAC的嵌合体小鼠的制作
使用上述[C]得到的携带有hChr21q-MAC的ES细胞克隆并通过Tomizuka等的方法(Nature Genet.16：133，1997)制作嵌合体小鼠。作为宿主，使用通过MCH(ICR)(白色，从日本Clea公司购入)的雌雄交配而得到的8细胞期胚。将注入胚移植于寄养母体，结果出生的仔小鼠可通过毛色判定是否为嵌合体。将注入有携带有MAC1的ES克隆(例如TT2F(hChr21q-MAC)20、22等，上述[C]中取得)的220个胚移植于寄养母体，结果诞生18只嵌合体小鼠(毛色中确认浓茶色的部分)。其中2只为几乎观察不到白色的部分的嵌合率约100％的个体。另外，其中1只为GFP阳性的个体(图55)。即，表示携带有小鼠人工染色体载体hChr21q-MAC的ES细胞株(TT2F)携带有嵌合体形成能力，即小鼠个体的正常组织携带有进行分化的能力。
[F]如实施例8中所记载的那样，可以由携带有小鼠人工染色体载体hChr21q-MAC的嵌合体小鼠制作子代传递有hChr21q-MAC的小鼠系统TC(hChr21q-MAC)。另外，可以使用上述TC(hChr21q-MAC)小鼠系统检验体细胞中的hChr21q-MAC的稳定性。另外，TC(hChr21q-MAC)系统可用作唐氏综合征的模型小鼠，可用于唐氏综合征的症状发症的机制阐明及用于改善症状的治疗药物的开发。
[实施例12]小鼠人工染色体载体hChr21q22.12-MAC的构建
为了制作也出现唐氏综合征的小鼠，使用Cre/loxP系统对小鼠人工染色体载体MAC1转座克隆含有比人类21号染色体长臂的AP00172更靠远端的区域的DNA序列，与实施例3同样地构建hChr21q22.12-MAC。
[A]loxP序列向人类21号染色体的AP001721的位点特异性插入
为了经由loxP序列转座插入于小鼠人工染色体载体MAC1，在DT40细胞内向人类21号染色体(hChr21)的DSCR(唐氏综合征致病区域)的近端的AP001721插入loxP序列。
[A.1]打靶载体pCKloxPHyg的制作
如下制作用于在位于人类21号染色体上的AP001721附近且着丝粒侧(约50Kb着丝粒侧)的唐氏综合征致病基因区域(DSCR)插入Cre重组酶的识别序列loxP的打靶载体pCKloxPHyg。首先，使用以下的引物并通过PCR对AP001721基因组区域进行扩增。
AML5’.L1；5’-TAGAATTCGTAGGCTTGGAAGCAGTGAGAGAGAA-3’(序列号87)
AML5’.R2；5’-GAAGACTGGTAAATCTGGTGGCTGTC-3’(序列号88)
AML5’.L4；5’-ATTAGATCTCCTGCTGTTATCTCATGCACTCTCA-3’(序列号89)
AML5’.R4；5’-ATTAGATCTATGATGCCTGATACATGGTCTGTGA-3’(序列号90)
用于插入loxP序列的基本质粒使用V901(Lexicon genetics)。对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600，Taq聚合酶使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃5分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)对PCR片段(2.9kb及2.0kb)进行凝胶过滤。然后，用限制酶EcoRI(ニツポンジ一ン)及BglII(ニツポンジ一ン)切断并用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。接着，利用Rsr II(NEB)从V830(Lexicon genetics)中切出MC1-TK序列，克隆到V901质粒的限制酶HindIII的识别位点上(V901T-1)。将上述PCR片段(2.9kb及2.0kb)克隆到V901T-1质粒的EcoRI和BglII位点(V901T-1HR2)。接着，用KpnI和AscI从Kazuki等的报告(Gene Therapy：PMID：21085194，2010)中所记载的5’-HPRT-loxP-Hyg-TK载体中切出5’-HPRT-loxP-Hyg，克隆到V901T-1HR2的AscI和KpnI位点(pCKloxPHyg)。最终的loxP插入构建体的大小为11.2kb。示出了打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因(图56)。
[A.2]转染及潮霉素耐性克隆的分离
与上述同样地将上述制作的打靶载体pCKloxPHyg用限制酶NotI(TAKARA)进行线性化后，转染于携带有人类21号染色体的DT40杂种细胞(Kazuki等BBRC 2004，DT40(21-2-3))，更换成含有潮霉素B(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于3张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过4次转染得到的合计178个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr21q22.12-loxP))。
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
使用Puregene DNA Isolation Kit(Gentra System公司)从潮霉素耐性克隆中提取基因组DNA，利用使用以下的2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
利用使用以下的2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
AMLloxP-4L；5’-AGAAAGGCAGGTGAGTGTGGAGGTAGA-3’(序列号91)
AMLloxP-4R；5’-GAAGTGGGCTCACAGGAATTTTCCAA-3’(序列号92)
AMLloxP-8L；5’-GGGCCTCTTTATTTGGCAGAATATCACC-3’(序列号93)
AMLloxP-8R；5’-TTACACTGAGATTCAGGGCACGATGA-3’(序列号94)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃4分钟进行35个循环。对178个克隆进行筛选，结果71个克隆作为同源重组体被鉴定。
[A.3.2]DNA印迹分析
如下对通过上述PCR分析确认重组的10个克隆进行DNA印迹分析。将该基因组DNA用限制酶EcoRI(TAKARA)进行处理，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，向GeneScreen PlusTM杂交转移膜(NENTM Life ScienceProducts，Inc.)进行碱印迹。对于该过滤器，使用通过PCR对AP001721中的基因序列进行了扩增的SP7探针进行DNA杂交并进行同源重组体的鉴定。SP7探针的制作使用以下的引物并以DT40(21-2-3)的基因组DNA作为模板进行PCR，将其PCR产物作为模板并利用随机引物法制作32p标记DNA探针(Amersham，依据标注的方案)。
SP7探针制作用引物：
SP7L；5’-CAGCTGGGAAACACTGAGCAAGATTATG-3’(序列号95)
SP7R；5’-CTGCTAGACTGAAAATGCGTTTCCTCTG-3’(序列号96)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp9600，Taq聚合酶使用EXTaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在93℃5分钟的热变性后，以93℃1分钟、54℃1分钟、72℃1分钟作为1个循环进行35个循环。可预测通过DNA杂交，在非同源重组体中检测到约7.5kb、在同源重组体中检测到约9.4kb的条带(图56)。DNA杂交的结果，10个克隆中全部的克隆为目标同源重组体。将其代表性的结果示于图57。
[A.3.3]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及潮霉素作为探针对上述中确认重组的克隆中的10克隆进行了FISH分析，结果人类21号染色体在全部的克隆中未转座于宿主染色体，在21q22附近检测到源自潮霉素的信号，因此，确认位点特异性地引起重组(图58)。由以上的结果可以得出如下结论：基因导入位点即loxP序列位点特异性地插入于人类21号染色体片段。
[B]hChr21q22.12-loxP从含有hChr21q22.12-loxP的DT40向含有MAC1的CHO细胞的导入
为了在CHO细胞内经由loxP序列将比人类21号染色体长臂的AP001721更靠远端的区域转座插入于小鼠人工染色体载体MAC1，将插入loxP序列于AP001721而成的人类21号染色体即hChr21q22.12-loxP导入于含有小鼠人工染色体载体MAC1的CHO细胞。
[B.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的含有hChr21q22.12-loxP的DT40细胞，DT40(hChr21q22.12-loxP)47，与上述同样地对含有MAC1的CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得、登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-；MAC1)进行微核细胞融合法。将通过15次微核细胞融合得到的合计140个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC1，hChr21q22.12-loxP))。
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物对上述140个克隆中的20个克隆进行PCR，确认人类21号染色体片段是否被导入于含有MAC1的CHO细胞。将其引物序列示于以下。
m11 5L(上述)
EGFP(F)L(上述)
kj neo(上述)
m11 6R(上述)
D21S265-L：gggtaagaaggtgcttaatgctc(序列号97)
D21S265-R：tgaatatgggttctggatgtagtg(序列号98)
D21S261-L：gagggggactgggacaagccctttgctggaagaga(序列号99)
D21S261-R：acattaggaaaaatcaaaaggtccaattattaagg(序列号100)
D21S268-L：CAACAGAGTGAGACAGGCTC(序列号101)
D21S268-R：TTCCAGGAACCACTACACTG(序列号102)
D21S266-L：ggcttggggacattgagtcatcacaatgtagatgt(序列号103)
D21S266-R：gaagaaaggcaaatgaagacctgaacatgtaagtt(序列号104)
D21S1259-L：GGGACTGTAATAAATATTCTGTTGG(序列号105)
D21S1259-R：CACTGGCTCTCCTGACC(序列号106)
CBR-L：gatcctcctgaatgcctg(序列号107)
CBR-R：gtaaatgccctttggacc(序列号108)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，20个克隆中的13个克隆在全部的引物组中为阳性，用该13个克隆进行以后的分析。
[B.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC1，hChr21q22.12-loxP)的13个克隆中的6个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认6个克隆中的2个克隆以75％的比例将MAC1以及hChr21q22.12-loxP以1拷贝导入于CHO细胞(图59)。
由以上的结果可以得出如下结论：hChr21q22.12-loxP可导入于含有小鼠人工染色体载体MAC1的CHO细胞。
[C]向CHO(HPRT-；MAC1，hChr21q22.12-loxP)克隆中的比人类21号染色体长臂的AP001721更靠远端的区域12Mb的MAC1载体的位点特异性转座
为了在小鼠体内稳定地维持比12Mb大小的DNA即人类21号染色体长臂的AP001721更靠远端的区域，转座插入于小鼠人工染色体载体MAC1(图60)
[C.1]转染及HAT耐性克隆的分离
使用脂质转染法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC1，hChr21q22.12-loxP)-12、13进行基因导入，对达到90％汇合状态的6孔的的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre 3μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过2次导入得到的合计19个集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(hChr21q22.12-MAC，hChr21-hChr21q22.12))。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选相互转座克隆，使用以下的引物进行PCR，确认是否在人类21号染色体片段和MAC1上引起染色体相互转座。将其引物序列示于以下。
kj neo(上述)
PGKr1(上述)
D21S265-L(上述)
D21S265-R(上述)
D21S261-L(上述)
D21S261-R(上述)
D21S268-L(上述)
D21S268-R(上述)
D21S266-L(上述)
D21S266-R(上述)
D21S1259-L(上述)
D21S1259-R(上述)
CBR-L(上述)
CBR-R(上述)
TRANS L1(上述)
TRANS R1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，19个克隆中的8个克隆在全部的引物组中为阳性，用该8个克隆进行以后的分析。
[C.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(hChr21q22.12-MAC，hChr21-hChr21q22.12)的8个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认8个克隆中的8个克隆中以85％以上比例在MAC1上观察到源自人类21号染色体的信号(图61)。
由以上的结果可以得出如下结论：比人类21号染色体长臂的AP001721更靠远端的区域12Mb可对小鼠人工染色体载体MAC1进行利用相互转座的克隆。
[D]hChr21q22.12-MAC从CHO细胞向小鼠ES细胞的移入
为了制作携带有hChr21q22.12-MAC的嵌合体小鼠，通过微核细胞融合法从上述[C]得到的携带有hChr21q22.12-MAC的CHO细胞向小鼠ES细胞(野生型TT2F)导入。依据Tomizuka等(Nature Genet.16：133，1997)的方法，由约108个携带有hChr21q-MAC的CHO细胞(CHO(hChr21q22.12-MAC，hChr21-hChr21q22.12)1，12等)精制微细胞，悬浮于DMEM 5ml。通过胰蛋白酶处理剥下约107个小鼠ES细胞TT2F，用DMEM清洗3次后悬浮于DMEM 5ml，加入到离心后的微细胞中，以1250rpm进行10分钟离心，完全除去上清液。通过轻打充分地解开沉淀，加入1∶1.4PEG溶液[将5g PEG1000(和光纯药)、1ml DMSO(Sigma)溶解于DMEM 6ml]0.5ml，充分搅拌约1分30秒。然后，慢慢地加入DMEM 10ml，以1250rpm进行10分钟离心，悬浮于30ml的ES培养基，分别注入于3个预先接种有饲养细胞的直径100mm皮氏培养皿(锥形)3枚，进行培养。24小时后，更换成含有300μg/ml的G418的培养基，进行约1周选择培养。其结果，将合计13个集落分离并使其增殖，进行以后的分析。自CHO(hChr21q22.12-MAC，hChr21-hChr21q22.12)1的1个克隆、自CHO(hChr21q22.12-MAC，hChr21-hChr21q22.12)12的1个克隆在使用仅检测hChr21q22.12-MAC区域的上述引物的PCR中为阳性。进而，使用人类Cot-1DNA以及小鼠次要卫星DNA对上述中的2个克隆进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果利用上述探针被特异性地检测，且小鼠的核型正常的克隆为1个克隆(图62)。如上可以得出如下结论：可得到1个克隆的携带有hChr21q22.12-MAC的TT2F细胞。
[E]hChr21q22.12-MAC的小鼠ES细胞中的稳定性
对于上述得到的小鼠ES克隆(例如TT2F(hChr21q22.12-MAC)8，上述[D]中取得)，对0～50PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有hChr21q22.12-MAC的细胞的比例进行了测量，结果在50PDL中也为95％以上的携带率。(图63)。
[F]携带有hChr21q22.12-MAC的嵌合体小鼠的制作
使用上述[D]得到的携带有hChr21q22.12-MAC的ES细胞克隆并通过Tomizuka等的方法(Nature Genet.16：133，1997)制作嵌合体小鼠。作为宿主，使用通过MCH(ICR)(白色，日本Clea公司购入)的雌雄交配而得到的8细胞期胚。将注入胚移植于寄养母体，结果出生的仔小鼠可通过毛色判定是否为嵌合体。将注入携带有hChr21q22.12-MAC的ES克隆(例如TT2F(hChr21q22.12-MAC)8，上述[D]中取得)的80个胚移植于寄养母体，结果，诞生43只嵌合体小鼠(毛色中确认浓茶色的部分)。其中，3只为几乎观察不到白色的部分的嵌合率约100％的个体。即，表示携带有小鼠人工染色体载体hChr21q22.12-MAC的ES细胞株(TT2F)携带有嵌合体形成能力，即小鼠个体的正常组织携带有进行分化的能力。
[G]如实施例8中所记载的那样，可以由携带有小鼠人工染色体载体hChr21q22.12-MAC的嵌合体小鼠制作子代传递有hChr21q22.12-MAC的小鼠系统TC(hChr21q22.12-MAC)。另外，可以使用上述TC(hChr21q22.12-MAC)小鼠系统检验体细胞中的hChr21q22.12-MAC的稳定性。另外，hChr21q22.12-MAC系统可用作唐氏综合征的模型小鼠，可用于唐氏综合征的症状发症的机制阐明及用于改善症状的治疗药物的开发。另外，通过比较TC(hChr21q-MAC)小鼠系统和TC(hChr21q22.12-MAC)小鼠系统的表型，可以鉴定唐氏综合征的致病基因区域。
[实施例13]小鼠人工染色体载体MAC2的稳定性
[A]小鼠人工染色体载体MAC2的CHO细胞中的稳定性
对于上述得到的CHO克隆(例如CHO(HPRT-；MAC2)-13、18，上述实施例4中取得)，对0～25PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的MAC2携带细胞的比例进行了测量，结果即使在25PDL中也为90％以上的携带率。另一方面，对Kazuki等的报告(GeneTherapy：PMID：21085194，2010)中所记载的携带有源自21号染色体的GFP搭载HAC载体(21HAC2)的CHO细胞而言，在25PDL中为70％以下的携带率。将其代表性的结果示于图64。
[实施例14]小鼠人工染色体载体FVIII-MAC的构建
作为小鼠人工染色体载体MAC2中编码有用蛋白质的基因的例子，可以使用Cre/loxP系统插入作为血友病A的致病基因的第八因子(FVIII)并检验功能蛋白质的表达和长期稳定性。
[A]含有小鼠人工染色体载体MAC2载体的CHO细胞中的编码特定的有用蛋白质的基因(例如FVIII)利用Cre/loxP系统向小鼠人工染色体载体MAC2的插入
检验在小鼠人工染色体MAC中插入有5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP序列作为DNA插入序列的小鼠人工染色体载体MAC2中loxP是否工作且环状DNA是否可位点特异性地插入。
[A.1]FVIII插入载体的制作
将pCAGGS(由大阪大学冈部博士赠与)的启动子和polyA的区域用SalI和PstI位点切断，克隆到在改变了pBluescript KS(-)(Stratagene)多克隆位点的pB3的SalI和PstI位点(pB-CAG)。将pKF17K质粒中的B结构域缺陷FVIII cDNA(由自治医科大学坂田教授赠与)用XhoI和SalI位点切断，克隆到pB-CAG中的处于启动子和polyA之间的EcoRI位点(pB-CAGF8)。将pB-CAGF8的CAG-F8-pA区域通过SalI和AvrII位点分离，以夹在pB3ins2上的2个HS4绝缘子序列之间的方式克隆到SalI和AvrII位点(pB3-F8ins2)。接着，将pPAC4(Children’s Hospital Oakland Research Institute(CHORI)，BAC/PAC Resources)向插入有3’HPRT-loxP序列的载体进行导入。将pB3-F8ins2上的AscI和FseI区域即FVIII表达盒(HS4-CAG-F8-pA-HS4)克隆到pPAC4的AscI和FseI位点，作为HPRT再构建体系的1拷贝FVIII插入构建体(载体名：pPAC4F8ins2H3-9(1拷贝FVIII-PAC))(图65)。利用AvrII位点和NheI位点的相容性黏性末端的特征，通过从AvrII1的1个表达盒区域将1拷贝FVIII-PAC中的AscI从同载体中的AscI向NheI位点的再克隆来得到具有2个表达盒的2拷贝FVIII-PAC。另外，同样地通过将插入盒在AscI和AvrII、载体侧在AscI和NheI位点进行再克隆来制作具有多达2、4、8、16拷贝的FVIII表达盒的PAC载体(图66)。
[A.2]转染及HAT耐性克隆的分离
基因导入使用脂质转染法进行，对于达到90％汇合状态的6孔的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案将Cre 1μg和1拷贝FVIII-PAC载体10μg向上述CHO(HPRT-；MAC2)-13及Kazuki等的报告(GeneTherapy：PMID：21085194，2010)中所记载的CHO(HPRT-；21HAC2)导入(克隆名：CHO(FVIIIx1-MAC)及CHO(FVIIIx1-HAC))。另外，依据市售(Invitrogen)的方案将Cre 1μg和16拷贝FVIII-PAC载体10μg向上述CHO(HPRT-；MAC2)-13导入(克隆名：CHO(FVIIIx16-MAC))。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，对于通过4次导入得到的各个CHO(FVIIIx1-MAC)为46个克隆、对于CHO(FVIIIx16-MAC)为18个克隆、对于CHO(FVIIIx1-HAC)为19个克隆，将合计83个集落分离并使其增殖，进行以后的分析。
[A.3]药剂耐性克隆的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了以HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否位点特异性地引起FVIII基因的插入。将其引物序列示于以下。
TRANS L1(上述)
TRANS R1(上述)
FVIIIF：5’-ATACAACGCTTTCTCCCCAA-3’(序列号109)
FVIIIR：5’-TCTTGAACTGAGGGACACTG-3’(序列号110)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用ExTaq(Applied Biosystems)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃10分钟的热变性后，以94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。PCR的结果，对于CHO(FVIIIx1-MAC)来源4个克隆为阳性、对于CHO(FVIIIx1-HAC)来源17个克隆为阳性、对于CHO(FVIIIx16-MAC)来源3个克隆为阳性，用该24个克隆进行以后的分析。
[A.3.2]单色FISH分析
由上述的结果，在7个克隆中，依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行单色FISH分析。以小鼠cot-1DNA或人类cot-1DNA作为探针进行了FISH分析，结果，对于CHO(FVIIIx1-MAC)来源，1个克隆以90％以上的比例携带有FVIII-MAC，对于CHO(FVIIIx1-HAC)来源，2个克隆以90％以上的比例携带有FVIII-HAC，对于CHO(FVIIIx16-MAC)来源，1个克隆以90％以上的比例携带有FVIII-HAC。
[B]CHO细胞中的FVIII基因的基因表达分析
使用上述携带有FVIIIx1-MAC的CHO(FVIIIx1-MAC)1-3及携带有FVIIIx1-HAC的CHO(FVIIIx1-HAC)1-2及携带有FVIIIx16-MAC的CHO(FVIIIx16-MAC)16-1、16-2、16-3，为了检验FVIIImRNA是否表达，依据上述记载提取RNA并将其RNA作为模板进行cDNA合成，进而使用以下的引物(上述)进行PCR。温度、循环条件为在94℃10分钟的热变性后，以94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行25个循环。
FVIII F：(上述)
FVIII R：(上述)
GAPDH F：(上述)
GAPDH R：(上述)
其结果，对CHO(FVIIIx1-MAC)及CHO(FVIIIx1-HAC)而言，同等地进行表达，对CHO(FVIIIx16-MAC)而言，比上述CHO(FVIIIx1-MAC)及CHO(FVIIIx1-HAC)更高地进行表达。
[C]CHO细胞中的FVIII基因的基因功能分析
为了检验上述确认FVIIImRNA的表达的CHO(FVIIIx1-MAC)1-3及CHO(FVIIIx1-HAC)1-2中的FVIII蛋白表达是否为功能性，依据标注的方案进行了凝集测定(Cosmobio)。将通过0PDL及非选择培养培养至25PDL的上述细胞在6孔皿中进行培养并从100％汇合状态更换成新的培养基。回收24小时后培养上清液并测定由FVIII活性带来的FVIII的活性化程度。其结果，对0PDL而言，在CHO(FVIIIx1-MAC)1-3及CHO(FVIIIx1-HAC)1-2中几乎未发现活性的差异。另一方面，对CHO(FVIIIx1-MAC)1-3而言，即使在25PDL中活性也上升至1.8倍，与此相对，对CHO(FVIIIx1-HAC)1-2而言，在25PDL中活性降低至1/6倍(图67)。另外，与CHO(FVIIIx1-MAC)1-3相比，CHO(FVIIIx16-MAC)16-1、16-2、16-3的活性上升约10倍，确认活性依赖于拷贝数而上升(图68)。
通过以上的实验确认通过在小鼠人工染色体MAC2载体上搭载F VIII基因，观察到FVIII基因的功能性的表达，进而对携带有FVIII-MAC的CHO而言，与携带有FVIII-HAC的CHO相比，长时间稳定地呈现功能性表达。另外，通过PAC载体，可插入编码200kb以内的有用蛋白质的DNA。
[实施例15]可导入多个基因的小鼠人工染色体载体MI-MAC的构建
作为在小鼠人工染色体载体MAC2中可搭载多个基因的例子，使用Cre/loxP系统插入具有5个位点特异性重组酶识别位点(ΦC31attP、R4attP、TP901-1attP、Bxb1attP、FRT)的多整合酶平台，检验多个基因的导入·表达。
[A.1]多基因搭载位点(多整合酶平台)盒的制作
使用Multisite-Gateway试剂盒(Invitrogen)如下制作具有用于在小鼠人工染色体载体中导入多个基因的多基因搭载位点的盒。首先，将PGK-hyg(Clontech)作为模板，将基因导入位点即ΦC31attP位点、R4attP位点、TP901-1attP位点、Bxb1attP位点、FRT位点利用第一PCR(以下的各引物对F1-R1)添加于PGK启动子序列。对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600，Taq聚合酶使用kodplus(Toyobo)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃2分钟的热变性后，以94℃15秒、68℃30秒、72℃90秒进行20个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)进行精制。
B1-FRT-PGK-ΦC31 attP-B5rF1：
5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATTCTACCGGG TAGGGGAGGCGCTTTTCCC-3’(序列号111)
B1-FRT-PGK-ΦC31attP-B5rR1：
5’-CAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGCACTACGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGA-3’(序列号112)
B 5-PGK-R4 attP-B4F1：
5’-GGGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGATATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCC-3’(序列号113)
B5-PGK-R4 attP-B4R1：
5’-CACAAGCAGTACCACTGCTTCAAGTGGTATCGCTTTGGGGAACATGCGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGA-3’(序列号114)
B4r-PGK-TP901 attP-B3rF1：
5’-GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGATATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCC-3’(序列号115)
B4r-PGK-TP901 attP-B3rR1：
5’-CTTAATTGAAATAAACGAAATAAAAACTCGCAATTAAGCGAGTTGGAAGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGA-3’(序列号116)
B3-PGK-Bxb1 attP-B2F 1：
5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGTATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCC-3’(序列号117)
B3-PGK-Bxb1 attP-B2R1：
5’-AGACCGCGGTGGTTGACCAGACAAACCACGAAGACACAGGTCATCACGGCCATAGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGA-3’(序列号118)
以如上得到的第一PCR片段作为模板，进行对Multisite-Gateway BP反应添加必需的入门(gateway)attB序列的第二PCR(以下的各引物对F1-R2，仅ΦC31的F2-R2)。对PCR条件等而言，循环数为25个循环，除此以外，与上述相同。另外，对于引物F1的序列也如上所述。
B1-FRT-PGK-ΦC31 attP-B5rF2：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAA-3’(序列号119)
B1-FRT-PGK-ΦC31 attP-B5rR2：
5’-GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGACCCTACGCCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGT-3’(序列号120)
B5-PGK-R4 attP-B4R2：
5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGCACCCGCAGAGTGTACCCACAAGCAGTACCACTGCTTCAAGTGGTAT-3’(序列号121)
B4r-PGK-TP901 attP-B3rR2：
5’-GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTTAAAAGGAGTTTTTTAGTTACCTTAATTGAAATAAACGAAATAAAAACTCG-3’(序列号122)
B3-PGK-Bxb1 attP-B2R2：
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATGGGTTTGTACCGTACACCACTGAGACCGCGGTGGTTGACCAGACAAACCACG-3’(序列号123)
将与这些PCR片段对应的具有入门att P序列的供体载体(Invitrogen：pDONR221 P1-P5r、pDONR221 P5-P4、pDONR221 P4r-P3r、pDONR221 P3-P2)进行混合，通过使用BP clonase的试管内重组反应(BP反应)来制作进入载体(pENTR L1-FRT-PGK-ΦC31-R5、pENTRL5-PGK-R4-L4、pENTR R4-PGK-TP901-1-R3、pENTR L3-PGK-Bxb1-L2)(图69)。BP反应依据所推荐的条件进行。
接着，通过以下的顺序制作为了将这些基因导入位点导入于小鼠人工染色体载体所必需的插入有3’HPRT-loxP序列的质粒。将上述X3.1作为模板，使用以下的引物进行扩增。PCR条件与上述的条件(循环数25)相同。
PGK2362：5’-TGATTGTTCAGGAGGAGGAAGCCGGTGGCG-3’(序列号124)
loxP4548：5’-AGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCGAA-3’(序列号125)
将该PCR片段和DEST盒(Invitrogen：R1-ccdB-Cm-R2)进行平端连接，作为pDEST。接着，将该pDEST和上述制作的进入载体(pENTRL1-FRT-PGK-ΦC31-R5、pENTR L5-PGK-R4-L4，pENTRR4-PGK-TP901-1-R3、pENTR L3-PGK-Bxb1-L2)进行混合，通过使用LRclonase的试管内重组反应(LR反应)制作多基因搭载位点(多整合酶平台)盒(图70)。LR反应依据所推荐的条件进行。
[A.2]多基因搭载位点(多整合酶平台)盒向小鼠人工染色体载体的搭载
将多基因搭载位点(多整合酶平台)盒与上述CHO(HPRT-；MAC2)及下述记载的CHO(HPRT-；MAC4)如上进行Cre-loxP重组后，可通过取得HAT耐性克隆来插入于小鼠人工染色体载体MAC2或MAC4(称为MI-MAC)(图71)。
[A.3]基因导入盒的制作
如下制作用于在多整合酶平台中导入外源基因的盒式载体。首先，以pIRES Neo2(Clontech)作为模板并使用以下的引物对为了药剂选择所必需的无启动子的新霉素耐性基因进行扩增。PCR条件与上述的条件(循环数25)相同。
NeoF：5’-AAAGATATCAACTCGAGATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTG-3’(序列号126)
NeoR：5’-TTTGCTAGCCCCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGCC-3’(序列号127)
然后，在用限制酶EcoRV和SmaI位点切断后的SLR测试(Toyobo)上对该PCR片段进行平端克隆，制作pNeo。接着，将对应于各attP位点或FRT位点的重组序列(ΦC31 attB、R4 attB、TP901-1 attB、Bxb1 attB、FRT)进行重新合成(ΦC31、Bxb1、FRT：Integrated DNA technologies Inc.，R4，TP901-1：Invitrogen)。将pNeo用限制酶SalI切断，从上述合成的载体中用限制酶SalI切出含有ΦC31 attB或R4 attB的DNA片段并进行连接(pNeo-ΦC31 attB、pNeo-R4 attB)。同样地将pNeo用限制酶ClaI切断，从上述合成的载体中用限制酶ClaI切出含有TP901-1 attB或FRT的DNA片段并进行连接来制作pNeo-TP901-1 attB、pNeo-FRT或将pNeo用限制酶NheI切断，从上述合成的载体中用限制酶NheI切出含有Bxb1 attB的DNA片段并进行连接来制作pNeo-Bxb1 attB。这些载体可在BamHI位点插入任何的外源基因，将其形成可搭载于具有多基因搭载位点的小鼠人工染色体的盒式载体(图72)。
[A.4]位点特异性重组酶表达载体的制作
将引起各自对应的attB-attP间的重组的位点特异性重组酶(ΦC31整合酶、R4整合酶、TP901-1整合酶、Bxb1整合酶)(GenBank登录号：ΦC31，CAA07153；R4，BAA07372；TP901-1，CAA59475；Bxb1，AAG59740)进行重新合成(ΦC31：Codon device，其它：Invitrogen)。为了哺乳类细胞中的高表达，将密码子选择在哺乳类中进行最适化来合成这些整合酶。从该合成的载体中用限制酶KpnI-XbaI切出含有ΦC31整合酶的DNA片段，与用限制酶KpnI-XbaI切断的pVAX1(Invitrogen)连接来制作pCMV-ΦC31，或用限制酶NheI-XhoI切出含有R4整合酶或者TP901-1整合酶、Bxb1整合酶的DNA片段，与用限制酶NheI-XhoI切断的pVAX1(Invitrogen)连接来制作pCMV-R4、pCMV-TP901-1、pCMV-Bxb1(图72)。
[A.5]向MI-MAC载体的基因导入
通过导入上述各种位点特异性重组酶表达载体代替Cre表达载体和导入基因导入盒代替FVIII插入载体，可以将多个(1～5个)基因插入在小鼠人工染色体载体MI-MAC载体上。另外，也可以在小鼠人工染色体MAC载体上搭载多个多基因搭载位点(多整合酶平台)盒，因此，也可以无制限地插入基因(图72)。
[实施例16]小鼠人工染色体载体PXR-MAC的构建
使用Cre/loxP系统在小鼠人工染色体载体MAC3中插入作为核受体的人类PXR，构建PXR-MAC。
[A.1]人类PXR插入载体的制作
用于插入人类PXR基因及loxP序列的基本BAC载体使用含有人类PXR基因总长的RP11-169N13(CHORI)。依据Yamada等(J Hum Genet.2008；53(5)：447-53)的方法，通过同源重组在上述BAC载体上的卡那霉素抗性基因区域插入用于插入于小鼠人工染色体载体MAC3的Amp-5’HPRT-loxP序列(载体名：PXR-loxP)。
示出了利用Cre/loxP系统插入通过利用HPRT再构建体系的人类PXR插入产生的位点特异性DNA(图73)。
[A.2]转染及HAT耐性克隆的分离
基因导入使用脂质转染法进行，对于达到90％汇合状态的6孔的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre 1μg和PXR-loxP载体2μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过2次导入得到的合计11个集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(PXR-MAC))。
[A.3]药剂耐性克隆的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了以HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否位点特异性地引起PXR基因的插入。将其引物序列示于以下。
TRANS L1(上述)
TRANS R1(上述)
hPXR1L：5’-aaacagcaaggcaagcatcca-3’(序列号128)
hPXR1R：5’-tgctttaatccagccctggtg-3’(序列号129)
hPXR2L：5’-tgtttgctcaatcgtggtctcc-3’(序列号130)
hPXR2R：5’-acaaaagccgaatgtggtgga-3’(序列号131)
hPXR3L：5’-ccaagaggcccagaagcaaa-3’(序列号132)
hPXR3R：5’-tccccacatacacggcagatt-3’(序列号133)
hPXR4L：5’-acactgccaagagccgacaat-3’(序列号134)
hPXR4R：5’-gcaaccttgcctctctgatggt-3’(序列号135)
hPXR5L：5’-tcaaggtgtggaagggaccaa-3’(序列号136)
hPXR5R：5’-acaaagcagctcggaagagga-3’(序列号137)
hPXR6L：5’-gttgtcctggggctggaat-3’(序列号138)
hPXR6R：5’-caaggcaggcactttcataccc-3’(序列号139)
kj neo(上述)
m11 6R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为94℃10分钟的热变性后，以94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒进行35个循环。PCR的结果，11个克隆中的6个克隆在全部的引物中为阳性，用该6个克隆进行以后的分析。
[A.3.3]双色FISH分析
在选择由上述得到的结果的6个克隆中，依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行双色FISH分析。将小鼠cot-1 DNA及源自人类PXR-BAC的DNA(RP11-169N13)(CHORI)作为探针进行了FISH分析，结果确认在6个克隆中的5个克隆中以60％以上的比例携带有PXR-MAC，进而出现源自PXR-BAC的信号，在作为阴性对照的位点特异性插入PXR-BAC前的MAC3上未检测到信号，因此，位点特异性地插入有人类PXR基因(图74)。
通过以上的实验可以确认通过在小鼠人工染色体MAC3上搭载人类PXR基因，可得到携带有小鼠人工染色体载体PXR-MAC的CHO细胞。
[B]小鼠人工染色体载体PXR-MAC从含有小鼠人工染色体载体PXR-MAC的CHO细胞向小鼠ES细胞的导入
为了制作携带有PXR-MAC的嵌合体小鼠，通过微核细胞融合法从上述[A]得到的携带有PXR-MAC的CHO细胞向小鼠ES细胞(野生型TT2F)进行导入。依据Tomizuka等(Nature Genet.16：133，1997)的方法，约由108个携带有PXR-MAC的CHO细胞(CHO(PXR-MAC)7、9、10等)精制微细胞，悬浮于DMEM 5ml。通过胰蛋白酶处理剥下约107个小鼠ES细胞TT2F，用DMEM清洗3次后悬浮于DMEM 5ml，加入到离心后的微细胞中，以1250rpm进行10分钟离心，完全除去上清液。通过轻打充分地解开沉淀，加入1∶1.4PEG溶液[将5g PEG1000(和光纯药)、1ml DMSO(Sigma)溶解于DMEM 6ml]0.5ml，充分搅拌约1分30秒。然后，慢慢地加入DMEM 10ml，以1250rpm进行10分钟离心，悬浮于30ml的ES培养基，分别注入于3个预先接种有饲养细胞的直径100mm皮氏培养皿(锥形)，进行培养。24小时后，更换成含有300μg/ml的G418的培养基，进行约1周选择培养。其结果，将合计34个集落分离并使其增殖，进行以后的分析。自CHO(PXR-MAC)7的2个克隆、自CHO(PXR-MAC)9的2个克隆、自CHO(PXR-MAC)10的12个克隆在使用仅检测PXR-MAC区域的上述引物的PCR中为阳性。进而，对于上述的16个克隆，使用源自人类PXR-BAC的DNA(RP11-169N13)(CHORI)进行了FISH分析(Tomizuka等，NatureGenet.16：133，1997)，结果利用上述探针被特异性检测的克隆为16个克隆中的4个克隆。由上可以得出如下结论：可得到4个克隆的携带有PXR-MAC的TT2F细胞(图75)。
[C]如实施例8中所记载的那样，由携带有小鼠人工染色体载体PXR-MAC的小鼠ES细胞制作嵌合体小鼠，可以制作子代传递有PXR-MAC的小鼠系统TC(PXR-MAC)。另外，可以使用上述TC(PXR-MAC)小鼠系统检验体细胞中的PXR-MAC的稳定性。另外，TC(PXR-MAC)小鼠系统可重现人类中的利用药物得到的CYP基因表达诱导。另外，通过与上述TC(CYP3A-MAC)小鼠系统的交配，可以制作TC(CYP3A-MAC/PXR-MAC)系统，可用作医药品开发中的用于调查药效·毒性的体内试验用的模型小鼠。
[实施例17]小鼠人工染色体载体MAC4的构建
构建在小鼠人工染色体MAC中插入有GFP-5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP序列作为DNA插入序列的小鼠人工染色体载体MAC4。5’HPRT-loxP-PGKhyg型的loxP序列被插入于Kazuki等的报告(GeneTherapy：PMID：21085194，2010)中所记载的源自21号染色体的GFP搭载HAC载体(21HAC2)，可以用相同的载体比较HAC和MAC的基因表达。另外，用于向21HAC2插入的基因导入载体不经过载体制作的步骤，可直接利用。
[A]GFP-5’HPRT-loxP-hyg型的loxP序列向小鼠人工染色体MAC的插入
[A.1]GFP-5’HPRT-loxP-hyg型的loxP打靶载体的制作
用于插入loxP序列的基本质粒使用上述制作的pMAC2。将利用NotI和SalI切出的HS4-CAG-EGFP-HS4(由大阪大学的冈部博士及NIH的Felsenfeld博士赠与)平滑化，将上述pMAC2在XhoI切断以及平滑化后进行克隆(载体名：pMAC4)。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图76。
[A.2]转染及药剂耐性克隆的分离
与上述同样地将上述制作的打靶载体pMAC4用限制酶NotI(TAKARA)线性化后，转染于上述制作的克隆DT40(MAC)，更换成含有潮霉素(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于2张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过1次转染得到的合计36个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(MAC4))
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认是否在小鼠染色体载体MAC上位点特异性地引起重组。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：5’-AGATCTCGGCTAGAGGTACCCTAGAAGATC-3’(序列号140)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行35个循环。PCR的结果，36个克隆中的5个克隆在全部的引物组为阳性，因此，用该5个克隆进行以后的分析。
[A.3.2]双色FISH分析
在由上述得到的DT40(MAC4)的5个克隆中，依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行双色FISH分析。以小鼠cot-1DNA及GFP-5’HPRT-loxP-hyg盒作为探针进行了FISH分析，结果在作为阴性对照的打靶前的小鼠人工染色体载体MAC中，未检测到源自探针的信号，与此相对，在DT40(MAC4)的5个克隆中，以65％以上的比例检测到源自探针的信号，因此，在上述5个克隆中，可视觉上确认位点特异性地引起重组(图77)。由这些结果可以得出如下结论：可得到携带有小鼠人工染色体载体MAC4的DT40细胞克隆。
[B]MAC4从含有小鼠人工染色体载体MAC4的鸡DT40细胞向CHO细胞的导入
[B.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的DT40(MAC4)-B1-5及B1-74及B2-3及B2-4，与上述同样地对CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得、登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-)进行微核细胞融合法。将通过4次微核细胞融合得到的合计23个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC4))
[B.2]药剂耐性克隆的筛选
[B.2.1]PCR分析
为了提取潮霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认小鼠人工染色体载体MAC4是否可导入于CHO细胞。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：(上述)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，23个克隆中的7个克隆在全部的引物组为阳性，使用该7个克隆进行以后的分析。
[B.2.2]单色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC4)的7个克隆进行了以小鼠Cot-1 DNA作为探针的FISH分析，结果确认7个克隆中的4个克隆以95％以上的比例将MAC4导入于CHO细胞(图78)。
由以上的结果可以得出如下结论：小鼠人工染色体载体MAC4可导入于CHO细胞。
[C]如实施例8中所记载的那样，可以制作携带有小鼠人工染色体载体MAC4的小鼠ES细胞，使用其ES细胞检验体外的稳定性。另外，由上述ES细胞制作嵌合体小鼠，可以制作子代传递有MAC4的小鼠系统TC(MAC4)。另外，可以使用上述TC(MAC4)小鼠系统检验体细胞中的MAC4的稳定性。
[实施例18]小鼠人工染色体载体UGT2-MAC的构建
使用Cre/loxP系统对小鼠人工染色体载体MAC4转座克隆作为人类药物代谢酶基因群的UGT2簇，与实施例3同样地构建UGT2-MAC。另外，检验UGT2-MAC的小鼠ES细胞中的稳定性。
[A]人类4号染色体上的AC125239中的位点特异性切断
为了从人类4号染色体的UGT2基因簇中缺失远端侧的基因，进行位点特异性染色体缺失即端粒截短。
[A.1]打靶载体pTELpuro-UGT2的制作
如下制作用于在位于人类4号染色体上的UGT2基因座附近且端粒侧(约150Kb端粒侧)的AC125239区域插入人类端粒序列的打靶载体pTELpuro-UGT2。首先，使用以下的引物并通过PCR对AC125239基因组区域进行扩增。
UGT2tel4L；5’-ttctggcaagccttgaagggacaatact-3’(序列号141)
UGT2tel4R；5’-gcctattttgcctcataacccactgctc-3’(序列号142)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)进行凝胶过滤。然后，用限制酶PstI(ニツポンジ一ン)及BglII(ニツポンジ一ン)进行切断，用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段克隆到质粒pTELpuro(Kuroiwa等，Nature Biotech.，20：88，2002)的PstI及BamHI位点。AC125239基因组序列的方向为着丝粒→端粒，将经克隆的AC125239基因组片段与人类端粒序列同方向的载体作为目标打靶载体pTELpuro-UGT2。最终的长臂近端位点特异性切断用构建体的大小为11.9kb。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图79。
[A.2]转染及药剂耐性克隆的分离
通过Kazuki等BBRC 2004中所记载的方法由携带有人类4号染色体的A9(KM64-4)(Kugoh等DNA research 1999)制作携带有人类4号染色体的鸡DT40细胞(克隆名：DT40(hChr4))。接着，与上述同样地将上述制作的打靶载体pTELpuro-UGT2用限制酶PstI(ニツポンジ一ン)线性化后，转染于上述制作的克隆DT40(hChr4)1，更换成含有嘌呤霉素(0.3ug/ml)的培养基，分别注入于10张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过4次转染得到的合计96个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr4-tel))。
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了以嘌呤霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，作为一次筛选，使用位于比切断位点更靠端粒侧的以下的引物进行PCR，确认是否引起位点特异性切断。将其引物序列示于以下。
CSN1S1-1L；5’-tttctcctctcaaggaaaacca-3’(序列号143)
CSN1S1-1R；5’-gccctccatatggcaagaca-3’(序列号144)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)，缓冲液及dN TP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性后，以95℃20秒、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环。接着，对用上述引物未检测出的2个克隆而言，使用以下的引物并通过PCR确认是否引起位点特异性同源重组PCR。序列如下所述。
UGT2tel4L；(上述)
SK23：5’-ggccgctctagaactagtggatc-3’(序列号145)
UGT2A1-1L：5’-tcttctgcatcaagccacatca-3’(序列号146)
UGT2A1-1R：5’-agccaatgactaccttccattg-3’(序列号147)
UGT2A1-2L：5’-atcagggagccaccgtagga-3’(序列号148)
UGT2A1-2R：5’-gcaggcaagttatgccgtga-3’(序列号149)
UGT2A3-1L：5’-tgcgcccaaacacatggata-3’(序列号150)
UGT2A3-1R：5’-tggcagaaatgtaggccatga-3’(序列号151)
UGT2B4-1L：5’-aggctggaagctgggaaacc-3’(序列号152)
UGT2B4-1R：5’-cctgcatgaaatggatccaaag-3’(序列号153)
UGT2B7-1L：5’-ccagcaagaaagattgtgatgc-3’(序列号154)
UGT2B7-1R：5’-ttctaaccatgaactgggtggt-3’(序列号155)
UGT2B11-1L：5’-gggtttctgctggcctgtgt-3’(序列号156)
UGT2B11-1R：5’-tctggttttccagcttcaaatg-3’(序列号157)
UGT2B15-1L：5’-ggtctccttggcatgcacct-3’(序列号158)
UGT2B15-1R：5’-tgcaatgcttcttttccagttg-3’(序列号159)
UGT2B15-2L：5’-cagcatggagggttttaaatgg-3’(序列号160)
UGT2B15-2R：5’-atgttggcgtgctgcatcc-3’(序列号161)
UGT2B28-1L：5’-catttgaagctggaaaaccaga-3’(序列号162)
UGT2B28-1R：5’-cctgggtggtaaatctctgaaa-3’(序列号163)
根据上述引物，PCR使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。仅在位点特异性地引起重组的2个克隆中检测到约8kb的条带。对阴性对照的DT40、DT40(hChr4)1而言未检测到条带。
[A.3.2]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及嘌呤霉素DNA作为探针对上述中确认重组的克隆中的2个克隆进行了FISH分析，结果确认人类4号染色体在全部的克隆中未转座于宿主染色体，在人类4号染色体片段末端检测到源自嘌呤霉素的信号，在目的位点被切断，因此，位点特异性地引起重组(图80)。
由以上的结果可以得出如下结论：在克隆DT40(hChr4-tel)35及73中，可在距比UGT2基因簇区域更靠端粒侧的AC125239的远端切断。
[B]loxP序列向人类4号染色体的AC074378的位点特异性插入
为了经由loxP序列转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4，在DT40细胞内向hChr4-tel的UGT2基因簇的近端的AC074378插入loxP序列。
[B.1]打靶载体pUGT2loxPneo的制作
如下制作用于在位于人类4号染色体上的UGT2基因座附近且着丝粒侧(约300Kb着丝粒侧)的AC074378区域插入Cre重组酶的识别序列loxP的打靶载体pUGT2loxPneo。首先，使用以下的引物并通过PCR对AC074378基因组区域进行扩增。
UGT2loxP3L：5’-ggaacaatcccaatcaaaacctcagtgc-3’(序列号164)
UGT2loxP4R：5’-cgaggattcaagccacatccctaactct-3’(序列号165)
用于插入loxP序列的基本质粒使用V907(Lexicongenetics)。对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600，Taq聚合酶使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒，68℃7分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)进行凝胶过滤。然后，用限制酶KpnI(ニツポンジ一ン)及EcoRI(ニツポンジ一ン)及BglII(ニツポンジ一ン)进行切断并用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段(2.7kb及2.6kb)克隆到V907质粒的KpnI或EcoRI和BglII位点(载体名：V907-UGT2HR2)。接着，用EcoRI和BamHI从作为loxP-FRT-pGKneo-FRT-loxP盒的pNT1.1(由大阪大学遗传信息实验中心赠与)中切出FRT-pGKneo-FRT，克隆到上述X3.1的BglII位点(载体名：X3.1-FRT-pGKneo-FRT)。接着，将V907-UGT2HR2用限制酶EcoRI切断，用限制酶EcoRI从上述X3.1-FRT-pGKneo-FRT中切出含有loxP的DNA片段并进行连接。将loxP序列的方向与克隆的AC074378基因组片段同方向的载体作为靶载体pUGT2loxPneo。最终的loxP插入构建体的大小为11.1kb。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图81。
[B.2]转染及药剂耐性克隆的分离
与上述同样地将上述制作的打靶载体pUGT2loxPneo用限制酶NotI(TAKARA)线性化后，转染于携带有人类4号染色体的鸡DT40细胞(克隆DT40(hChr4-tel)35，更换成含有新霉素(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于3张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过2次转染得到的合计12个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr4-tel-loxP))。
[B.3]同源重组体的筛选
[B.3.1]PCR分析
使用Puregene DNA Isolation Kit(Gentra System公司)从新霉素耐性克隆中提取基因组DNA，通过使用以下2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
通过使用以下2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
UGT2loxP3L(上述)
TRANS R1(上述)
PGKr1(上述)
UGT2loxP4R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃4分钟进行35个循环。对12个克隆进行筛选，结果5个克隆作为同源重组体被鉴定。
[B.3.2]双色ISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及新霉素DNA作为探针对上述中确认重组的克隆中的4个克隆进行了FISH分析，结果确认人类4号染色体在全部的克隆未转座于宿主染色体，在4q13附近确认源自新霉素的信号，因此，位点特异性地引起重组(图82)。由以上的结果可以得出如下结论：作为基因导入位点的loxP序列被位点特异性地插入于人类4号染色体上的AC074378。
[C]hChr4-loxP-tel从含有hChr4-loxP-tel的DT40向含有MAC4的CHO细胞的导入。
为了在CHO细胞内经由loxP序列将人类UGT2基因簇区域转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4，将hChr4-loxP-tel导入于含有小鼠人工染色体载体MAC4的CHO细胞。
[C.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的DT40(hChr4-loxP-tel)5及10，与上述同样地对含有MAC4的CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得，登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-；MAC4)进行微核细胞融合法。将通过3次微核细胞融合得到的合计22个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC4，hChr4-loxP-tel))。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取新霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认人类4号染色体片段可被导入于含有MAC4的CHO细胞。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：(上述)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
UGT2tel4L；(上述)
SK23(上述)
UGT2A1-1L(上述)
UGT2A1-1R(上述)
UGT2A1-2L(上述)
UGT2A1-2R(上述)
UGT2A3-1L(上述)
UGT2A3-1R(上述)
UGT2B4-1L(上述)
UGT2B4-1R(上述)
UGT2B7-1L(上述)
UGT2B7-1R(上述)
UGT2B11-1L(上述)
UGT2B11-1R(上述)
UGT2B15-1L(上述)
UGT2B15-1R(上述)
UGT2B15-2L(上述)
UGT2B15-2R(上述)
UGT2B28-1L(上述)
UGT2B28-1R(上述)
UGT2loxP3L(上述)
TRANS R1(上述)
PGKr1(上述)
UGT2loxP4R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，22个克隆中的5个克隆在全部的引物组中为阳性，用该5个克隆进行以后的分析。
[C.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC4，hChr4-loxP-tel)的5个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认在1个克隆中以1拷贝或者2拷贝将90％以上的MAC1以及hChr4-loxP-tel导入于CHO细胞(图83)。
由以上的结果可以得出如下结论：hChr4-loxP-tel可导入于含有小鼠人工染色体载体MAC4的CHO细胞。
[D]CHO(HPRT-；MAC4，hChr4-loxP-tel)克隆中的人类UGT2基因簇区域周边(AC074378-人类UGT2基因簇-AC125239)2Mb向MAC4载体的位点特异性转座
为了在小鼠个体内稳定地维持2Mb大小的DNA即人类UGT2基因簇，转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4(图84)。
[D.1]转染及HAT耐性克隆的分离
使用脂质转染法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC4，hChr4-loxP-tel)8进行基因导入，对于达到90％汇合状态的6孔的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre 3μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过2次导入得到的合计6个集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(UGT2-MAC，hChr4-ΔUGT2))。
[D.2]药剂耐性克隆的筛选
[D.2.1]PCR分析
为了提取HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选相互转座克隆，使用以下的引物进行PCR，确认是否在人类4号染色体片段和MAC4上引起染色体相互转座。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：(上述)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
UGT2tel4L；(上述)
SK23(上述)
UGT2A1-1L(上述)
UGT2A1-1R(上述)
UGT2A1-2L(上述)
UGT2A1-2R(上述)
UGT2A3-1L(上述)
UGT2A3-1R(上述)
UGT2B4-1L(上述)
UGT2B4-1R(上述)
UGT2B7-1L(上述)
UGT2B7-1R(上述)
UGT2B11-1L(上述)
UGT2B11-1R(上述)
UGT2B15-1L(上述)
UGT2B15-1R(上述)
UGT2B15-2L(上述)
UGT2B15-2R(上述)
UGT2B28-1L(上述)
UGT2B28-1R(上述)
UGT2loxP3L(上述)
TRANS R1(上述)
PGKr1(上述)
UGT2loxP4R(上述)
TRANS L1(上述)
TRANS R1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，6个克隆中的全部的克隆在全部的引物组中为阳性，用该6个克隆进行以后的分析。
[D.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(UGT2-MAC，hChr4-ΔUGT2)的6个克隆进行了以UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI)DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认在6个克隆中的2个克隆中以50％以上的比例在MAC4上观察到源自人类UGT2的信号(图85)。
由以上的结果可以得出如下结论：人类4号染色体片段上的UGT2簇2Mb可对小鼠人工染色体载体MAC4进行利用相互转座的克隆。
[E]UGT2-MAC从CHO细胞向小鼠A9细胞的移入
为了制作携带有UGT2-MAC的小鼠ES细胞，通过微核细胞融合法从上述[D]得到的携带有UGT2-MAC的CHO细胞(CHO(UGT2-MAC，hChr4-ΔUGT2)4、5)向对于小鼠A9细胞微细胞形成能力高的小鼠A9细胞进行导入。将通过4次微核细胞融合得到的合计16个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：A9(UGT2-MAC))。其结果，在使用仅检测UGT2-MAC区域的上述引物的PCR中为阳性的克隆为5个克隆。进而，使用UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI)及小鼠次要卫星DNA探针进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果在5个克隆中的全部的克隆中确认利用上述探针被特异性地检测的UGT2-MAC的存在(图86)。如上可得出如下结论：可得到5个克隆的携带有UGT2-MAC的A9细胞。
[F]UGT2-MAC从A9细胞向小鼠ES细胞的移入
为了制作携带有UGT2-MAC的嵌合体小鼠，通过微核细胞融合法从上述[E]得到的携带有UGT2-MAC的A9细胞向小鼠ES细胞(野生型TT2F)进行导入。依据Tomizuka等(Nature Genet.16：133，1997)的方法，由约108个携带有UGT2-MAC的A9细胞(A9(UGT2-MAC)13、15等)精制微细胞，悬浮于DMEM 5ml。通过胰蛋白酶处理剥下约107个小鼠ES细胞TT2F，用DMEM清洗3次后悬浮于DMEM 5ml，加入到离心后的微细胞中，以1250rpm进行10分钟离心，完全除去上清液。通过轻打充分地解开沉淀，加入1∶1.4PEG溶液[将5g PEG1000(和光纯药)、1ml DMSO(Sigma)溶解于DMEM 6ml]0.5ml，充分搅拌约1分30秒。然后，慢慢地加入DMEM 10ml，以1250rpm进行10分钟离心，悬浮于30ml的ES培养基，分别注入于3个预先接种有饲养细胞的直径100mm皮氏培养皿(锥形社)，进行培养。24小时后，更换成含有300μg/ml的G418的培养基，进行约1周选择培养。其结果，将合计25个集落分离并使其增殖，进行以后的分析。自A9(UGT2-MAC)13的5个克隆、自A9(UGT2-MAC)15的4个克隆在使用仅检测UGT2-MAC区域的上述引物的PCR中为阳性。进而，使用UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI)以及小鼠次要卫星DNA对上述中的克隆进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果，利用上述探针被特异性性地检测，且小鼠的核型正常的克隆为7个克隆(图87)。如上可以得出如下结论：可得到7个克隆的携带有UGT2-MAC的TT2F细胞。
[G]UGT2-MAC的小鼠ES细胞中的稳定性
对于上述得到的小鼠ES克隆(例如TT2F(UGT2-MAC)9、10、19，上述[F]中取得)，对0～50PDL的非选择培养下长期培养后利用FISH分析得到的携带有UGT2-MAC的细胞的比例进行测量，结果即使在50PDL中也为95％以上的携带率。(图88)。
[H]如实施例8中所记载那样，由携带有小鼠人工染色体载体UGT2-MAC的小鼠ES细胞制作嵌合体小鼠，可制作子代传递有UGT2-MAC的小鼠系统TC(UGT2-MAC)。另外，可使用上述TC(UGT2-MAC)小鼠系统检验体细胞中的UGT2-MAC的稳定性。另外，TC(UGT2-MAC)小鼠系统可重现人类的药物代谢，因此，可用作医药品开发中的用于调查第二相反应的药效·毒性的体内试验用的模型小鼠。
[实施例19]小鼠人工染色体载体CYP2C-MAC的构建
使用Cre/loxP系统对小鼠人工染色体载体MAC4转座克隆作为人类药物代谢酶基因群的CYP2C簇，与实施例3同样地构建CYP2C-MAC。
[A]人类10号染色体上的AL157834中的位点特异性切断
为了从人类10号染色体的CYP2C基因簇中缺失远端侧的基因，进行位点特异性染色体缺失即端粒截短。
[A.1]打靶载体pTELpuro-CYP2C的制作
如下制作用于在位于人类10号染色体上的CYP2C基因座附近且端粒侧(约150Kb端粒侧)的AL157834区域插入人类端粒序列的打靶载体pTELpuro-CYP2C。首先，使用以下的引物并通过PCR对AL157834基因组区域进行扩增。
2Ctel2L；5’-GCTATGAGACACAGGGCAGCTGAAAGTC-3’(序列号166)
2Ctel2R；5’-TTGTGAACCACCATGCCTAGCTGAAAGT-3’(序列号167)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)进行凝胶过滤。然后，用限制酶BamHI(ニツポンジ一ン)及BglII(ニツポンジ一ン)切断并用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段克隆到质粒pTELpuro(Kuroiwa等，Nature Biotech.，20：88，2002)的BamHI位点。AL157834基因组序列的方向为着丝粒→端粒，将经克隆的AL157834基因组片段与人类端粒序列同方向的载体作为目标打靶载体pTELpuro-CYP2C。最终的长臂近端位点特异性切断用构建体的大小为11.6kb。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图89。
[A.2]转染及药剂耐性克隆的分离
通过Kazuki等BBRC 2004中所记载的方法由携带有人类10号染色体的A9(KM32-2)及A9(KM26-3)(Kugoh等DNA research 1999)制作携带有人类10号染色体的鸡DT40细胞(克隆名：DT40(hChr10))。接着，与上述同样地将上述制作的打靶载体pTELpuro-CYP2C用限制酶PstI(ニツポンジ一ン)线性化后，转染于上述制作的克隆DT40(hChr10)1、42，更换成含有嘌呤霉素(0.3ug/ml)的培养基，分别注入于10张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过4次转染得到的合计96个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr10-tel))。
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
为了以嘌呤霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，作为一次筛选，使用位于比切断位点更靠端粒侧的以下的引物进行PCR，确认是否引起位点特异性切断。将其引物序列示于以下。
h10yi_1F；5’-ACGGGGCTCCTACTCTTGTC-3’(序列号168)
h10yi_1R；5’-GCTTCCACCTGCATCTCAC-3’(序列号169)
h10yi_2F；5’-CAATGCCTTATGCATGTTGTG-3’(序列号170)
h10yi_2R；5’-TCCACAGCATACTGCTGACC-3’(序列号171)
h10yi_3F；5’-AAGGAAGGTGACCGCCTACT-3’(序列号172)
h10yi_3R；5’-CATCCGAGGACATCTTTGGT-3’(序列号173)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性后，以95℃20秒、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环。接着，使用以下的引物并通过PCR对用上述引物未检测出的3个克隆确认是否引起位点特异性同源重组。序列如下所述。
2Ctel4L；5’-ATCTGCAGGGAAGGGATCCAGTTTCAGCTTCCTAC-3’(序列号174)
SK23(上述)
CYP2C8-1F：5’-ACATGTCAAAGAGACACACA-3’(序列号175)
CYP2C8-1R：5’-TAGCATATTTCCAATAATAGGA-3’(序列号176)
CYP2C9-1F：5’-AGAAGGCTTCAATGGATTCTC-3’(序列号177)
CYP2C9-1R：5’-TGTCCTTAATACCTATCTGTAGG-3’(序列号178)
CYP2C 18-1F：5’-ACAGCTGGATCCATTGAAGG-3’(序列号179)
CYP2C 19-1F：5’-ACACACACTTAATTAGCATGGA-3’(序列号180)
CYP2C19-1R：5’-TTGGTTAAGGATTTGCTGACA-3’(序列号181)
根据上述引物，PCR使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。仅在位点特异性地引起重组的2个克隆中检测到约8kb的条带。对阴性对照的DT40、DT40(hChr10)1、42而言未检测到条带。
[B.3.2]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及嘌呤霉素DNA作为探针对上述中确认重组的3个克隆进行了FISH分析，结果确认人类10号染色体在全部的克隆未转座于宿主染色体，在人类10号染色体片段末端检测到源自嘌呤霉素的信号，在目的位点被切断，因此，位点特异性地引起重组(图90)。
由以上的结果可以得出如下结论：在克隆DT40(hChr10-tel)5及98及101中，可在距比CYP2C基因簇区域更靠端粒侧的AL157834的远端切断。
[B]loxP序列向人类10号染色体的AL138759的位点特异性插入
为了经由loxP序列转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4，在DT40细胞内向hChr10-tel的CYP2C基因簇的近端的AL138759插入loxP序列。
[B.1]打靶载体pCYP2CloxPneo的制作
如下制作用于在位于人类10号染色体上的CYP2C基因座附近且着丝粒侧(约300Kb着丝粒侧)的AL138759区域插入Cre重组酶的识别序列loxP的打靶载体pCYP2CloxPneo。首先，使用以下的引物并通过PCR对AL138759基因组区域进行扩增。
hloxP-SacII-EcoRI-F：5’-TCCCCGCGGATCTGCTCCATACTCTGTACC-3’(序列号182)
hloxP-1R：5’-CATTCAAGGGGTTCTGGGTCTGTAAACT-3’(序列号183)
用于插入loxP序列的基本质粒使用V907(Lexicon genetics)。对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600，Taq聚合酶使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃7分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)进行凝胶过滤。然后，用限制酶SacII(ニツポンジ一ン)及EcoRI(ニツポンジ一ン)及BamHI(ニツポンジ一ン)切断并用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段(1.5kb及3.0kb)克隆到V907质粒的SacII和EcoRI或EcoRI和BamHI位点(载体名：V907-CYP2CHR2)。接着，用限制酶EcoRI切断V907-CYP2CHR2，用限制酶EcoRI从上述X3.1-FRT-pGKneo-FRT中切出含有loxP的DNA片段并进行连接。将loxP序列的方向与克隆的AL138759基因组片段同方向的载体作为打靶载体pCYP2CloxPneo。最终的loxP插入构建体的大小为10.3kb。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图91。
[B.2]转染及药剂耐性克隆的分离
与上述同样地将上述制作的打靶载体pCYP2CloxPneo用限制酶NotI(TAKARA)线性化后，转染于携带有人类10号染色体的鸡DT40细胞(克隆DT40(hChr10-tel)1-98，更换成含有新霉素(1.5mg/ml)的培养基，分别注入于3张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过2次转染得到的合计15个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr10-tel-loxP))。
[B.3]同源重组体的筛选
[B.3.1]PCR分析
使用Puregene DNA Isolation Kit(Gentra System公司)从新霉素耐性克隆中提取基因组DNA，通过使用以下2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
通过使用以下2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
hloxP-SacII-EcoRI-F(上述)
TRANS R1(上述)
PGKr 1(上述)
hloxP-1R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃4分钟进行35个循环。对15个克隆进行筛选，结果1个克隆作为同源重组体被鉴定。
[B.3.2]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及新霉素作为探针对上述中确认重组的克隆中的1个克隆进行了FISH分析，结果确认人类10号染色体在全部的克隆中未转座于宿主染色体，在10q24附近检测到源自新霉素的信号，因此，位点特异性地引起重组。由以上的结果可以得出如下结论：作为基因导入位点的loxP序列被位点特异性地插入于人类10号染色体上的AL138759。
[C]hChr10-loxP-tel从含有hChr10-loxP-tel的DT40向含有MAC4的CHO细胞的导入。
为了在CHO细胞内经由loxP序列将人类CYP2C基因簇区域转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4，将hChr10-loxP-tel导入于含有小鼠人工染色体载体MAC4的CHO细胞。
[C.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的DT40(hChr10-loxP-tel)7，与上述同样地对含有MAC4的CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得、登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-；MAC4)进行微核细胞融合法。将通过3次微核细胞融合得到的合计8个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC4，hChr10-loxP-tel))。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取新霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认人类10号染色体片段是否被导入于含有MAC4的CHO细胞。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：(上述)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
2Ctel4L(上述)
SK23(上述)
CYP2C8-1F(上述)
CYP2C8-1R(上述)
CYP2C9-1F(上述)
CYP2C9-1R(上述)
CYP2C18-1F(上述)
CYP2C19-1F(上述)
CYP2C19-1R(上述)
hloxP-SacII-EcoRI-F(上述)
TRANS R1(上述)
PGKr1(上述)
hloxP-1R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，8个克隆中的全部的克隆在全部的引物组中为阳性，用该8个克隆进行以后的分析。
[C.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC4，hChr10-loxP-tel)的8个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认在2个克隆中以90％以上的比例将MAC1以及hChr10-loxP-tel以1拷贝或者2拷贝导入于CHO细胞(图92)。
由以上的结果可以得出如下结论：hChr10-loxP-tel可导入于含有小鼠人工染色体载体MAC4的CHO细胞。
[D]CHO(HPRT-；MAC4，hChr10-loxP-tel)克隆中的人类CYP2C基因簇区域周边(AL138759-人类CYP2C基因簇-AL157834)380kb向MAC4载体的位点特异性转座
为了在小鼠个体内稳定地维持380kb大小的DNA即人类CYP2C基因簇，转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4(图93)。
[D.1]转染及HAT耐性克隆的分离
使用脂质转染法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC4，hChr10-loxP-tel)1及5进行基因导入，对于达到90％汇合状态的6孔的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre3μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过2次导入得到的合计11个的集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(CYP2C-MAC，hChr10-ΔCYP2C))。
[D.2]药剂耐性克隆的筛选
[D.2.1]PCR分析
为了提取HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选相互转座克隆，使用以下的引物进行PCR，确认是否在人类10号染色体片段和MAC4上引起染色体相互转座。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：(上述)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
2Ctel4L(上述)
SK23(上述)
CYP2C8-1F(上述)
CYP2C8-1R(上述)
CYP2C9-1F(上述)
CYP2C9-1R(上述)
CYP2C18-1F(上述)
CYP2C19-1F(上述)
CYP2C19-1R(上述)
hloxP-SacII-EcoRI-F(上述)
PGKr 1(上述)
hloxP-1R(上述)
TRANS L1(上述)
TRANS R1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，11个克隆中的9个克隆在全部的引物组为阳性，用该9个克隆进行以后的分析。
[D.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(CYP2C-MAC，hChr10-ΔCYP2C)的9个克隆进行了以CYP2C-BAC(RP11-466J14)(CHORI)DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认9个克隆中的3个克隆中以50％以上的比例在MAC4上观察到源自人类CYP2C的信号(图94)。
由以上的结果可以得出如下结论：人类10号染色体片段上的CYP2C簇380kb可对小鼠人工染色体载体MAC4进行利用相互转座的克隆。
[E]CYP2C-MAC从CHO细胞向小鼠A9细胞的移入
为了制作携带有CYP2C-MAC的小鼠ES细胞，通过微核细胞融合法从上述[D]得到的携带有CYP2C-MAC的CHO细胞(CHO(CYP2C-MAC，hChr10-ΔCYP2C)2、8、10)向对于小鼠A9细胞微细胞形成能力高的小鼠A9细胞进行导入。将通过4次微核细胞融合得到的合计4个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：A9(CYP2C-MAC))。其结果，使用仅检测CYP2C-MAC区域的上述的引物的PCR中为阳性的克隆为4个克隆。进而，使用CYP2C-BAC(RP11-466J14)(CHORI)以及小鼠次要卫星DNA探针进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)，结果，4个克隆中的2个克隆中确认利用上述探针被特异性检测的CYP2C-MAC的存在。如上可以得出如下结论：可得到2个克隆的携带有CYP2C-MAC的A9细胞。
[F]如实施例8中所记载的那样，制作携带有小鼠人工染色体载体CYP2C-MAC的小鼠ES细胞，可以使用其ES细胞检验体外的稳定性。另外，由上述ES细胞直走嵌合体小鼠，可以制作子代传递有CYP2C-MAC的小鼠系统TC(CYP2C-MAC)。另外，可以使用上述TC(CYP2C-MAC)小鼠系统检验体细胞中的CYP2C-MAC的稳定性。另外，源自TC(CYP2C-MAC)小鼠系统的肝脏微粒体可用作医药品开发中用于调查第一相反应的药效·毒性的试样。另外，TC(CYP2C-MAC)小鼠系统可重现人类的药物代谢，因此，可用作医药品开发中的用于调查第一相反应的药效·毒性的体内试验用的模型小鼠。
[实施例20]小鼠人工染色体载体MDR1-MAC的构建
使用Cre/loxP系统对小鼠人工染色体载体MAC4转座克隆作为人类药物代谢酶基因群的MDR1基因，与实施例3同样地构建MDR1-MAC。
[A]loxP序列向人类7号染色体的AC005045的位点特异性插入
为了经由loxP序列转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4，在DT40细胞内向人类7号染色体(hChr7)的MDR1基因的近端的AC005045插入loxP序列。
[A.1]打靶载体pMDR1loxPbs的制作
如下制作用于在位于人类7号染色体上的MDR1基因座附近且着丝粒侧(约50Kb着丝粒侧)的AC005045区域插入Cre重组酶的识别序列loxP的打靶载体pMDR1loxPbs。首先，使用以下的引物并通过PCR对AC005045基因组区域进行扩增。
MDR1loxP2L：5’-gccaagtgtagctggagaatgattcgtg-3’(序列号184)
MDR1loxP1R：5’-acaaggcacttcaggataccaagcttcc-3’(序列号185)
用于插入loxP序列的基本质粒使用V901(Lexicongenetics)。对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600，Taq聚合酶使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP，dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒，68℃7分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE400(Clontech)进行凝胶过滤。然后，用限制酶BglII(ニツポンジ一ン)切断并用CHROMASPIN-TE1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段(2.5kb及5.3kb)克隆到V901质粒的BglII和BamHI位点(载体名：V901-MDR1HR2)。接着，将V901-MDR1HR2用限制酶AscI(NEB)以及KpnI切断，用限制酶AscI及KpnI从盒式载体Bs-loxP-3’HPRT(Hoshiya等，Mol Ther.2009；17(2)：309-17)中切出含有loxP的DNA片段并进行连接。将loxP序列的方向与克隆的AC005045基因组片段同方向的载体作为打靶载体pMDR1loxPbs。最终的loxP插入构建体的大小为13.0kb。将打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因示于图95。
[A.2]转染及药剂耐性克隆的分离
与上述同样地将上述制作的打靶载体pMDR1loxPbs用限制酶NotI(TAKARA)线性化后，转染于通过WO0I/011951中所记载的方法制作的携带有人类7号染色体的鸡DT40细胞(克隆DT40-#7)，更换成含有杀稻瘟素S(15μg/ml)的培养基，分别注入3张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过2次转染得到的合计9个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr7M-loxP))。
[A.3]同源重组体的筛选
[A.3.1]PCR分析
使用Puregene DNA Isolation Kit(Gentra System公司)从杀稻瘟素S耐性克隆中提取基因组DNA，通过使用以下的2组引物的PCR进行同源重组体的鉴定。
通过使用以下的2组引物的CR进行同源重组体的鉴定。
MDR1loxP2L(上述)
BsdR：5’-gctcaagatgcccctgttct-3’(序列号186)
hprt332F：5’-aaagatggtcaaggtcgcaa-3’(序列号187)
MDR1loxP1R(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃4分钟进行35个循环。对9个克隆进行筛选，结果3个克隆作为同源重组体被鉴定。
[A.3.3]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及杀稻瘟素DNA作为探针对上述中确认重组的3克隆进行了FISH分析，结果确认人类7号染色体在全部的克隆中未转座于宿主染色体，在7q21附近确认源自新霉素的信号，因此，位点特异性地引起重组。由以上的结果可以得出如下结论：作为基因导入位点的loxP序列被位点特异性地插入于人类7号染色体上的AC005045。
[B]人类7号染色体上的AC003083中的位点特异性切断
为了从人类7号染色体的MDR1基因中缺失远端侧的基因，进行位点特异性染色体缺失即端粒截短。
[B.1]打靶载体pTELpuro-MDR1的制作
如下制作用于在位于人类7号染色体上的MDR1基因座附近且端粒侧(约50Kb端粒侧)的AC003083区域插入人类端粒序列的打靶载体pTELpuro-MDR1。首先，使用以下的引物并通过PCR对AC003083基因组区域进行扩增。
MDR1tel5L；5’-ctattctaaaaagctgccttggcccaca-3’(序列号188)
MDR1tel5R；5’-tgtagcccagttcctaatgggacacaga-3’(序列号189)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。将PCR产物进行蛋白酶K(Gibco)处理后，用CHROMASPIN-TE 400(Clontech)进行凝胶过滤。然后，用限制酶EcoRI(ニツポンジ一ン)及PstI(ニツポンジ一ン)切断，用CHROMASPIN-TE 1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段克隆到质粒pTELpuro(Kuroiwa等，Nature Biotech.，20：88，2002)的EcoRI及PstI位点。AC003083基因组序列的方向为着丝粒→端粒，将经克隆的AC003083基因组片段与人类端粒序列同方向的载体作为目标打靶载体pTELpuro-MDR1。最终的长臂近端位点特异性切断用构建体的大小为13.1kb。示出了打靶载体、靶序列及通过同源重组产生的染色体等位基因(图96)。
[B.2]转染及药剂耐性克隆的分离
与上述同样地将上述制作的打靶载体pTELpuro-MDR1用限制酶EcoRI(ニツポンジ一ン)线性化后，转染于上述制作的克隆DT40(hChr7M-loxP)8、9，更换成含有嘌呤霉素(0.3ug/ml)的培养基，分别注入于10张96孔培养板并进行约2周的选择培养。将通过4次转染得到的合计96个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：DT40(hChr7M-loxP-tel))。
[B.3]同源重组体的筛选
[B.3.1]PCR分析
为了以嘌呤霉素耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，作为一次筛选，使用位于比切断位点更靠端粒侧的以下的引物进行PCR，确认引起位点特异性切断。将其引物序列示于以下。
CYP3A4 R(上述)
CYP3A4 F(上述)
CYP3A5 R(上述)
CYP3A5 F(上述)
CYP3A7 R(上述)
CYP3A7 F(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性后，以95℃20秒、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环。
接着，使用以下的引物对用上述引物未检测出的3个克隆确认是否引起位点特异性同源重组。序列如下所述。
MDR1tel5L；5’-ATCTGCAGGGAAGGGATCCAGTTTCAGCTTCCTAC-3’(序列号190)
SK23(上述)
MDR1-1L：5’-ctcctaggagtactcacttc-3’(序列号191)
MDR1-1R：5’-aacagaaacatggcttggcg-3’(序列号192)
MDR1-2L：5’-cgccaagccatgtttctgttt-3’(序列号193)
MDR1-2R：5’-aaggaaatgctttctgccttg-3’(序列号194)
MDR1-3L：5’-gtgcaacggaagccagaaca-3’(序列号195)
MDR1-3R：5’-agcggcctctgcttctttga-3’(序列号196)
MDR1-4L：5’-ctgattggctgggcaggaac-3’(序列号197)
MDR1-4R：5’-cttggaacggccaccaagac-3’(序列号198)
MDR1-5L：5’-ggtgctggttgctgcttaca-3’(序列号199)
MDR1-5R：5’-cccaacatcgtgcacatcaa-3’(序列号200)
MDR1-6L：5’-gtcagtgttgatggacagga-3’(序列号201)
MDR1-6R：5’-gcattggcttccttgacagc-3’(序列号202)
MDR1-7L：5’-ggttccaggcttgctgtaat-3’(序列号203)
MDR1-7R：5’-tctttcagtgcttgtccaga-3’(序列号204)
MDR1-8L：5’-ggcaaagaaataaagcgactg-3’(序列号205)
MDR1-8R：5’-cctcctttgctgccctcaca-3’(序列号206)
MDR1-9L：5’-tcttgtccaaactgcctgtga-3’(序列号207)
MDR1-9R：5’-tgcaagaatcagcaggatcaa-3’(序列号208)
根据上述引物，PCR使用LATaq(宝酒造)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃20秒、68℃8分钟进行35个循环。仅在位点特异性地引起重组的3个克隆中检测到约8kb的条带。对阴性对照的DT40，DT40(hChr7M-loxP)8、9而言，未检测到条带。
[B.3.2]双色FISH分析
FISH分析依据松原等(FISH实验方案，秀润公司，1994)进行。以人类cot-1DNA及嘌呤霉素DNA作为探针对上述中确认重组的3个克隆进行了FISH分析，结果确认人类7号染色体在全部的克隆中未转座于宿主染色体，在人类7号染色体片段末端检测到源自嘌呤霉素的信号，在目的位点被切断，因此，位点特异性地引起重组(图97)。
由以上的结果可以得出如下结论：在克隆DT40(hChr7M-loxP-tel)10及12及70中，可在距比MDR1基因区域更靠端粒侧的AC003083的远端切断。
[C]hChr7M-loxP-tel从含有hChr7M-loxP-tel的DT40向含有MAC4的CHO细胞的导入。
为了在CHO细胞内经由loxP序列将人类MDR1基因区域转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4，将hChr7M-loxP-tel导入于含有小鼠人工染色体载体MAC4的CHO细胞。
[C.1]微核细胞融合和药剂耐性克隆的分离
使用作为受体细胞的DT40(hChr7M-loxP-tel)10及70，与上述同样地对含有MAC4的CHOhprt缺陷细胞(从日本健康科学研究资源库获得，登录号JCRB0218)即CHO(HPRT-；MAC4)进行微核细胞融合法。将通过4次微核细胞融合得到的合计15个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(HPRT-；MAC4，hChr7M-loxP-tel))。
[C.2]药剂耐性克隆的筛选
[C.2.1]PCR分析
为了提取杀稻瘟素S耐性株的基因组DNA作为模板筛选重组体，使用以下的引物进行PCR，确认人类7号染色体片段被导入于含有MAC4的CHO细胞。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：(上述)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
MDR1loxP2L(上述)
BsdR：5’-gctcaagatgcccctgttct-3’(序列号209)
hprt332F：5’-aaagatggtcaaggtcgcaa-3’(序列号210)
MDR1loxP1R(上述)
MDR1tel5L(上述)
SK23(上述)
MDR1-1L(上述)
MDR1-1R(上述)
MDR1-2L(上述)
MDR1-2R(上述)
MDR1-3L(上述)
MDR1-3R(上述)
MDR1-4L(上述)
MDR1-4R(上述)
MDR1-5L(上述)
MDR1-5R(上述)
MDR1-6L(上述)
MDR1-6R(上述)
MDR1-7L(上述)
MDR1-7R(上述)
MDR1-8L(上述)
MDR1-8R(上述)
MDR1-9L(上述)
MDR1-9R(上述)
对CR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，15个克隆中的6个克隆在全部的引物组中为阳性，用该6个克隆进行以后的分析。
[C.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC4，hChr7M-loxP-tel)的6个克隆进行了以小鼠Cot-1DNA及人类Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认在2个克隆中以80％以上的比例将MAC1以及hChr7M-loxP-tel以1拷贝或者2拷贝导入于CHO细胞(图98)。
由以上的结果可得出如下结论：hChr7M-loxP-tel可导入于含有小鼠人工染色体载体MAC4的CHO细胞。
[D]CHO(HPRT-；MAC4，hChr7M-loxP-tel)克隆中的人类MDR1基因区域周边(AC005045-人类MDR1基因-AC003083)210kb向MAC4载体的位点特异性转座
为了在小鼠个体内稳定地维持210kb大小的DNA即人类MDR1基因，转座插入于小鼠人工染色体载体MAC4(图99)。
[D.1]转染及HAT耐性克隆的分离
使用脂质转染法对上述得到的CHO(HPRT-；MAC4，hChr7M-loxP-tel)7及15进行基因导入，对于达到90％汇合状态的6孔的细胞，依据市售(Invitrogen)的方案导入Cre 3μg。在HAT选择培养下进行2周培养时，出现耐性集落，将通过2次导入得到的合计10个集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：CHO(MDR1-MAC，hChr7-ΔMDR1))。
[D.2]药剂耐性克隆的筛选
[D.2.1]PCR分析
为了提取HAT耐性株的基因组DNA作为模板筛选相互转座克隆，使用以下的引物进行PCR，确认是否在人类7号染色体片段和MAC4上引起染色体相互转座。将其引物序列示于以下。
m11 4L：(上述)
V907-NotI-R：(上述)
hygF(244)：(上述)
m11 6R(上述)
MDR1loxP2L(上述)
BsdR：5’-gctcaagatgcccctgttct-3’(序列号211)
hprt332F：5’-aaagatggtcaaggtcgcaa-3’(序列号212)
MDR1loxP1R(上述)
MDR1tel5L(上述)
SK23(上述)
MDR1-1L(上述)
MDR1-1R(上述)
MDR1-2L(上述)
MDR1-2R(上述)
MDR1-3L(上述)
MDR1-3R(上述)
MDR1-4L(上述)
MDR1-4R(上述)
MDR1-5L(上述)
MDR1-5R(上述)
MDR1-6L(上述)
MDR1-6R(上述)
MDR1-7L(上述)
MDR1-7R(上述)
MDR1-8L(上述)
MDR1-8R(上述)
MDR1-9L(上述)
MDR1-9R(上述)
TRANSL1(上述)
TRANSR1(上述)
对PCR而言，作为热循环仪，使用Perkin-Elmer公司制的GeneAmp9600，Taq聚合酶使用LATaq(TAKARA)，缓冲液及dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根据标注的推荐条件使用。温度、循环条件为在94℃1分钟的热变性后，以98℃10秒、68℃7分钟进行30个循环。PCR的结果，10个克隆中的6个克隆在全部的引物组中为阳性，用该6个克隆进行以后的分析。
[D.2.2]双色FISH分析
通过Shinohara等的报告(Human Molecular Genetics，10：1163-1175，2001)中所记载的方法对上述得到的CHO(MDR1-MAC，hChr7-ΔMDR1)的6个克隆进行了以MDR1-BAC(RP11-784L5)(CHORI)DNA及小鼠Cot-1DNA作为探针的FISH分析，结果确认6个克隆中的3个克隆中以60％以上的比例在MAC4上观察到源自人类MDR1的信号(图100)。
由以上的结果可以得出如下结论：人类7号染色体片段上的MDR1基因210kb可对小鼠人工染色体载体MAC4进行利用相互转座的克隆。
[E]MDR1-MAC从CHO细胞向小鼠A9细胞的移入
为了制作携带有MDR1-MAC的小鼠ES细胞，通过微核细胞融合法从上述[D]得到的携带有MDR1-MAC的CHO细胞(CHO(MDR1-MAC，hChr7-ΔMDR1)1、2、4)向对于小鼠A9细胞微细胞形成能力高的小鼠A9细胞进行导入。将通过4次微核细胞融合得到的合计7个耐性集落分离并使其增殖，进行以后的分析(克隆名：A9(MDR1-MAC))。其结果，在使用仅检测MDR1-MAC区域的上述的引物的PCR中为阳性的克隆为5个克隆。进而，使用MDR1-BAC(RP11-784L5)(CHORI)以及小鼠次要卫星DNA探针进行了FISH分析(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)。结果，在5个克隆中的3个克隆中确认利用上述探针被特异性地检测的MDR1-MAC的存在。如上可以得到如下结论：可得到3个克隆的携带有MDR1-MAC的A9细胞。
[F]如实施例8中所记载的那样，制作携带有小鼠人工染色体载体MDR1-MAC的小鼠ES细胞，可以使用其ES细胞检验体外的稳定性。另外，由上述ES细胞制作嵌合体小鼠，可以制作子代传递有MDR1-MAC的小鼠系统TC(MDR1-MAC)。另外，可以使用上述TC(MDR1-MAC)小鼠系统检验体细胞中的MDR1-MAC的稳定性。另外，TC(MDR1-MAC)小鼠系统可重现人类中的药物的输送等。另外，通过与上述TC(CYP3A-MAC)小鼠系统的交配，可以制作TC(CYP3A-MAC/MDR1-MAC)系统，因此，可以用作医药品开发中的用于调查药效·毒性的体内试验用的模型小鼠。
工业上的可利用性
本发明的小鼠人工染色体载体具有与WO2009/063722中所记载的人类人工染色体同样的有用性，但通过进一步在啮齿类细胞或啮齿类个体中提高携带率，可在啮齿类细胞内稳定地携带，可长时间稳定地携带靶基因(组)，且小鼠等啮齿类的个体间及组织间中导入基因量没有不均，因此，可更精确地分析个体间或组织间的导入基因。本发明的小鼠人工染色体载体例如可用以下各种用途及目的：外源基因向受体细胞的导入、在iPS细胞的建立或再生医疗中的利用、表达外源基因的细胞及有用的非人类动物的制作、蛋白质的制造、基因功能的分析等。
保藏编号
DT40B6bT-1的保藏编号：FERMBP-11128
序列表自由文本(free text)
序列号1～212：引物
本说明书中引用的全部的出版物、专利及专利申请直接作为参考引用于本说明书中。
Figure IDA00002103888800011
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Figure IDA00002103888800501
Figure IDA00002103888800511
PCT/RO/134表
PCT
原件(申请用)
Figure QWB00000012460300011
由受理局填写
Figure QWB00000012460300012
由国际局填写
Figure QWB00000012460300013

Claims (44)

1.一种小鼠人工染色体载体，特征在于，含有源自小鼠染色体的天然着丝粒、从着丝粒附近的小鼠染色体长臂部位中缺失长臂远端而成的源自小鼠染色体的长臂片段及端粒序列，以及可被稳定地携带在哺乳类的细胞及组织中。
2.根据权利要求1所述的小鼠人工染色体载体，其中，小鼠染色体为1～19号染色体中的任何一个。
3.根据权利要求1或2所述的小鼠人工染色体载体，其中，源自小鼠染色体的长臂片段由从小鼠1～19号染色体中的任何一个的长臂中缺失其总内源性基因数的至少99.5％而成的剩余部分构成。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，含有保藏细胞株DT40 B6bT-1(FERM BP-11128)中所含的小鼠人工染色体作为基本结构。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，哺乳类为啮齿类。
6.根据权利要求5所述的小鼠人工染色体载体，其中，啮齿类为小鼠、大鼠或仓鼠。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的小鼠人工染色体载体，还含有一个或多个DNA序列插入位点。
8.根据权利要求7所述的小鼠人工染色体载体，其中，DNA序列插入位点为位点特异重组酶的识别位点。
9.根据权利要求7或8所述的小鼠人工染色体载体，其中，DNA序列插入位点为loxP序列、FRT序列、
Figure FDA00002103887400011
及
Figure FDA00002103887400012
序列、R4attB及R4attP序列、TP901-1attB及TP901-1attP序列或者Bxb1attB及Bxb1attP序列。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的小鼠人工染色体载体，还含有报告基因、选择标记基因或两者。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的小鼠人工染色体载体，还含有外源DNA序列。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列的尺寸为200kb以上。
13.根据权利要求11或12所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为人类DNA序列。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为药物代谢相关基因的DNA序列。
15.根据权利要求14所述的小鼠人工染色体载体，其中，药物代谢相关基因是编码参与第一相反应或第二相反应的酶的基因。
16.根据权利要求15所述的小鼠人工染色体载体，其中，参与第一相反应的酶是编码选自由CYP1A、CYP1B、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B及它们的亚家族等CYP以及CES构成的组中的至少一个的酶。
17.根据权利要求15所述的小鼠人工染色体载体，其中，参与第二相反应的酶是编码选自由UGT1及UGT2构成的组中的至少一个的酶。
18.根据权利要求14所述的小鼠人工染色体载体，其中，药物代谢相关基因是编码转运蛋白的基因。
19.根据权利要求18所述的小鼠人工染色体载体，其中，编码转运蛋白的基因是编码选自由MDR1、MDR2、MRP2、OAT、OATP、OCT及BCRP构成的组中的至少一个的基因。
20.根据权利要求14所述的小鼠人工染色体载体，其中，药物代谢相关基因是编码核受体的基因。
21.根据权利要求20所述的小鼠人工染色体载体，其中，编码核受体的基因是编码选自由PXR、AhR、CAR及PPARα构成的组中的至少一个的基因。
22.根据权利要求11～13中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为人类染色体的长臂或短臂的DNA序列。
23.根据权利要求11～21中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列含有选自由编码参与第一相反应的酶的基因、编码参与第二相反应的酶的基因、编码转运蛋白的基因及编码核受体的基因构成的组中的至少两个基因序列。
24.根据权利要求22所述的小鼠人工染色体载体，其中，人类染色体为含有疾病基因的致病区域的人类染色体的长臂或短臂的DNA序列。
25.根据权利要求11～13中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，外源DNA序列为编码细胞因子类、激素类、生长因子类、营养因子类、造血因子类、凝血·溶血因子类、免疫球蛋白类、G蛋白偶联受体类、酶类等多肽类的基因或DNA的序列，或者与肿瘤、肌营养不良症、血友病、神经变性疾病、自身免疫病、过敏性疾病、遗传性疾病等疾病相关的治疗用基因或DNA的序列。
26.根据权利要求1～25中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，细胞为肝细胞、肠细胞、肾细胞、脾细胞、肺细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、脑细胞、骨髓细胞、淋巴球细胞、巨核细胞、精子或卵子。
27.根据权利要求1～25中任一项所述的小鼠人工染色体载体，其中，组织为源自肝脏、肠、肾脏、脾脏、肺、心脏、骨骼肌、脑、骨髓、睾丸或卵巢的组织。
28.携带权利要求1～27中任一项所述的小鼠人工染色体载体的细胞。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中，细胞选自由体细胞、非人类生殖细胞、干细胞及前体细胞构成的组。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中，干细胞为胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干(iPS)细胞。
31.根据权利要求28～30中任一项所述的细胞，其中，细胞为原代培养细胞、继代细胞或细胞系。
32.根据权利要求28～31中任一项所述的细胞，其中，细胞为可产生人类抗体的细胞。
33.一种医药组合物，含有携带含有疾病治疗用的外源DNA序列的小鼠人工染色体载体的权利要求28～32中任一项所述的细胞。
34.一种非人类动物，特征在于携带权利要求1～27中任一项所述的小鼠人工染色体载体。
35.根据权利要求34所述的非人类动物，所述非人类动物为疾病模型动物。
36.根据权利要求34所述的非人类动物，所述非人类动物为可表达外源的人类药物代谢相关基因的动物。
37.根据权利要求34所述的非人类动物，所述非人类动物为可产生人类抗体的动物。
38.根据权利要求34～37中任一项所述的非人类动物，其中，对应于小鼠人工染色体载体中所含的外源DNA的内源基因被破坏或内源基因的表达降低。
39.一种蛋白质的生产方法，所述方法包括对携带含有外源DNA序列的小鼠人工染色体载体的权利要求28～32中任一项所述的细胞进行培养并回收所产生的由该DNA所编码的蛋白质。
40.一种人类抗体的制造方法，所述方法包括使用携带含有人类抗体基因的小鼠人工染色体载体的权利要求37或38所述的非人类动物产生人类抗体并回收该抗体。
41.一种筛选对于治疗疾病有效的物质的方法，所述方法包括对作为疾病模型动物的权利要求35所述的非人类动物施用候选药剂，并对该药剂的治疗效果进行评价。
42.一种药物或食品的药理作用及/或代谢及/或毒性的试验方法，所述方法包括对携带含有人类药物代谢相关基因的小鼠人工染色体载体的权利要求36或38所述的非人类动物或者源自该动物的细胞、器官或组织施用药物或食品，并对该药物或食品的药理作用及/或代谢及/或毒性进行测定。
43.一种药物或食品毒性的试验方法，所述方法包括将由携带含有人类药物代谢相关基因的小鼠人工染色体载体的权利要求36或38所述的非人类动物得到的微粒体或微粒体级分S9与培养细胞或者细菌和药物及/或者食品一起进行培养，并测定药物或食品对该细胞或细菌造成的影响。
44.一种细胞或个体内的大尺寸DNA的稳定化方法，所述方法包括使用权利要求1～27中任一项所述的小鼠人工染色体载体，并将200kb以上的大尺寸的外源DNA以90％以上的携带率稳定地维持在啮齿类细胞或啮齿类个体内。
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