WO2022059801A1 - コロナウイルスに対する抗体 - Google Patents

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WO2022059801A1
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antibody
sars
protein
coronavirus
rbd
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PCT/JP2021/035212
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French (fr)
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宜聖 高橋
大志 小野寺
悠 安達
光雄 押村
康宏 香月
博幸 里深
隆生 橋口
勝実 前仲
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株式会社Trans Chromosomics
国立感染症研究所長が代表する日本国
国立大学法人鳥取大学
国立大学法人京都大学
国立大学法人北海道大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
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    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Definitions

  • the present invention relates to an antibody against coronavirus, which is an antibody produced using a human antibody-producing mouse.
  • Antibodies are used in the medical field as therapeutic agents for cancer, rheumatoid arthritis and the like.
  • trastuzumab is used in the treatment of breast cancer as a molecular-targeted antibody drug against HER2 (or ErbB2) on the surface of cancer cells.
  • tocilizumab is a humanized anti-IL-6 receptor antibody and is used as a therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
  • the antibody is preferably a human antibody in order to enhance the therapeutic effect and safety when administered to humans.
  • the present inventor has previously prepared a mouse artificial chromosome vector (MAC) (Patent No.
  • Patent Document 1 WO2019 / 171763 (Patent Document 2)
  • a human antibody heavy chain was added to the vector.
  • Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV2) is an emerging coronavirus that has caused a pandemic (global epidemic) due to the ongoing new coronavirus infection (COVID-19). It caused a large number of infected and dead people in it. Efforts to find vaccines and remedies have become a top priority in order to prevent the spread of the pandemic caused by this zoonotic virus.
  • SARS-CoV-2 spike (S) glycoprotein is the main target of neutralizing antibodies because it promotes the invasion of viruses into host cells, and for monoclonal antibodies that target the S glycoprotein of SARS-CoV2. There is a report (Wang1 C.
  • Non-Patent Document 1 NATURE COMMUNICATIONS (2020) 11: 2251
  • Non-Patent Document 2 Pinto D. et al., Nature, Vol. 583, 290-295, 2020
  • Non-Patent Document 3 It has also been reported that an antibody having neutralizing activity was obtained from a patient who recovered from a new coronavirus infection (Wu Y. et al., Science 10.1126, 2020 (Non-Patent Document 3)).
  • the present inventor has succeeded in obtaining an antibody having desired properties by using a human antibody-producing mouse in which a human antibody gene is loaded on an artificial chromosome vector.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • Antibodies to the spike protein of coronavirus (2) The antibody according to (1), wherein the spike protein is a protein in the extracellular region or receptor binding domain.
  • the epitope of the spike protein is R403, D405, E406, R408, T415, G416, K417, D420, Y449, Y453, L455, F456, G485, Y486, N487, among the full-length amino acid sequences of the receptor binding domain.
  • the antibody according to (1) or (2) which is at least two amino acid residues selected from the group consisting of Y489, Q493, S494, Y495, G496, Q498, N501, G502, V503, G504 and Y505.
  • the antibody according to any one of (1) to (6), wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region is represented by SEQ ID NO: 14 or 18.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region is represented by SEQ ID NO: 16 or 20.
  • a reagent for detecting coronavirus which comprises the antibody according to any one of (1) to (10).
  • a method for detecting coronavirus which comprises a step of contacting the antibody according to any one of (1) to (10) with a collected biological sample.
  • the present invention provides a human antibody against coronavirus.
  • the antibody of the present invention is a fully human antibody obtained by immunizing a fully human antibody-producing mouse with the S protein of coronavirus, and is excellent in affinity and neutralizing activity, such as coronavirus infection. Useful for treatment or prevention.
  • FIG. 1 is a diagram showing an immune schedule of human antibody-producing mice by RBD.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of isolation of memory B cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of isolation of antibodies against each coronavirus.
  • FIG. 4 is a diagram showing measurement results of neutralizing activity using a pseudovirus.
  • FIG. 5-1 Two RBS antibody clones show different SARS cross-neutralizing activities.
  • the CoV2S-binding monoclonal antibody was established by a single cell culture approach from immune mice expressing only human antibodies. Binding of monoclonal antibodies in culture medium The indicated S and RBD proteins were evaluated by ELISA. Evaluation was performed using a CoV2 neutralizing active pseudovirus system in culture.
  • FIG. 5-2 is a diagram showing the structure of the NT-193 Fab-S-RBD complex.
  • A Left. The model of the outline picture of the NT-193 complex at two angles is shown (magenta: NT-193 heavy chain, pink: NT-193 light chain, orange: S-RBD, numbers 1 to 3 are CDR-1 respectively. , 2 and 3). right. The structure (PDB: 6m0j) angle of the ACE2-S-RBC complex is the same as the right of the NT-193 complex. ACE2 is shown in light blue.
  • the model on the left is shown at the same angle as the one on the right of the NT-193 complex in (A). The left and right angles are rotated approximately 90 degrees.
  • D Comparison between ACAnd NT-193 binding sites on RBS.
  • ACE binding regions of ACE only, NT-193 only, and both (overlapping) are shown in light blue, purplish red, and yellow, respectively.
  • E SEQ ID NO of RBS between SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 conserveed conserveed reddish purple, similar: pink, unconserved: gray.
  • F ⁇ I Detailed recognition mode of CDR-H3 (F), CDR-L1 (G) of NT-193, DE loop (H) of L chain and CDR-H3 (I). The coloring is the same as (A). Dotted lines are indicated by polar interactions.
  • NT-193 is a diagram showing a neutralizing activity even in a mutant strain.
  • A 501Y.
  • FIG. 5-4 shows the prophylactic and therapeutic effects of NT-193 and NT-193 + NT-108 cocktails.
  • A Schematic diagram of experimental desgin for evaluating the prophylactic and therapeutic effects of NT-193 and NT-193 + NT108 cocktails.
  • B, D The body weight of CoV2-loaded hamsters receiving either prophylactic (B) or therapeutic (D) mAbs at the indicated doses was monitored daily.
  • C, E CoV2 viral load in lung tissue of hamsters administered either prophylactic (C) or therapeutic (E) mAbs at the indicated doses.
  • 6-1 is a diagram showing a method and process of isolating a CoV2 RBD-binding monoclonal antibody (mAb) by unicellular culture of memory B cells.
  • A Schematic diagram of an experimental workflow for isolating RBD mAbs from TC-mAb mice.
  • B Serum human IgG antibody titers against RBD from CoV2 (red), SARS (blue), MERS (grey) were evaluated after priming and continuous boosting with several coronavirus antigens as shown.
  • C Single cell selection of CoV2 RBD-bound memory B cells Class-switched memory B cells were enriched by the MACS system from splenocytes and subsequently stained with fluorescent Abs and probes.
  • FIG. 6-2 shows heavy chain variable region (VH) / light chain variable region (VL) usage, mutations, and clonal types of NT-108 and NT-193. The heavy chain is shown in the upper figure and the light chain is shown in the lower figure.
  • FIG. 6-3 is a diagram showing hACE2 binding inhibition by S309 mAb. After preincubation with serially diluted S309 (class 3) mAbs, the amount of CoV2 RBD bound to the hACE coated plate was evaluated. Antibody-mediated inhibition of hACE2-RBD-binding is plotted as a percentage.
  • FIG. 6-3 shows heavy chain variable region (VH) / light chain variable region (VL) usage, mutations, and clonal types of NT-108 and NT-193. The heavy chain is shown in the upper figure and the light chain is shown in the lower figure.
  • FIG. 6-3 is a diagram showing hACE2 binding inhibition by S309 mAb. After preincubation with serially diluted
  • FIG. 6-5 shows the results of SPR analysis of binding of NT-108 and NT-193Fab to SARS-CoV RBD. Binding of NT-108 or NT-193 serially diluted Fab fragments to immobilized SARSCoV-1 RBD or SARS-CoV-2 RBD was evaluated by SPR analysis.
  • FIG. 6-6 shows that NT-108 and NT-193 increase neutralizing activity in the context of IgG3 subclasses.
  • A ELISA plates were coated with low (0.2 ⁇ g / ml) and high (5 ⁇ g / ml) CoV2S-trimers. The amount of NT-108 and NT-193 bound to the S-trimer of each IgG subclass was determined by O.D. D. Plotd at.
  • B, C Neutralizing activity against CoV2 virus was measured by pseudovirus (B) and authentic virus (C). The IC50 is shown above.
  • FIG. 6-7 is a diagram showing a structural comparison of an S-RBD complex.
  • a model of a comparative picture of the NT-193 complex with the Class 1 antibody complex, RBS-A (dark blue and gray) and RBS-B (dark and light brown) subclasses is shown (reddish purple: NT-). 193 heavy chains, pink: NT-193 light chains, orange: S-RBD).
  • the model on the left is shown at the same angle as the one on the right of the NT-193 complex in FIG. 2 (A). The left and right angles are rotated by almost 90 degrees.
  • FIG. 6-8 is a diagram showing a binding site of the NT-193 Fab-S-RBD complex.
  • A Comparison of ACE binding site and NT-193 binding site on RBS The binding sites of ACE only, NT-193 only and both (overlapping) are shown in light blue, magenta and yellow, respectively.
  • FIG. 6-9 shows the mapping of antibody binding residues of S-RBD.
  • S-RBD binding residues of each antibody are color coded.
  • SARS-CoV-2 residues that are not conserved in CoV-1 are shown in yellow.
  • the reported mutation (pink) is shown in the column between the SARS-CoV-1 and CoV-2 sequences.
  • FIG. 6-10 shows the amino acid sequences of the heavy chain (HC) and light chain (LC) of NT-193. Binding residues are indicated by asterisks. Shows secondary structure.
  • FIG. 6-11 shows screening for escape variants against NT-193.
  • SARS-CoV-2 virus was passaged three times in the presence of the indicated antibody, followed by validation for escape. Viral RNA was recovered from the wells using CPE for sequencing. Mutant amino acid residues in RBD are shown.
  • B The neutralizing activity against the mutant virus was evaluated.
  • the present invention relates to antibodies against coronavirus.
  • the present inventor focused on the spike protein of coronavirus and succeeded in producing a human human antibody against the spike protein by using a fully human antibody-producing mouse into which a human antibody gene was introduced.
  • the corona virus targeted in the present invention is a severe respiratory syndrome virus (SARS-CoV1 or SARS-CoV), a Middle East respiratory syndrome virus (MERS-CoV), and a new type severe respiratory syndrome virus (SARS-CoV2 or SARS).
  • SARS-CoV1 or SARS-CoV severe respiratory syndrome virus
  • MERS-CoV Middle East respiratory syndrome virus
  • SARS-CoV2 new type severe respiratory syndrome virus
  • the antibody of the present invention binds to the extracellular space or receptor binding domain (RBD) of the spike protein. And even in the initial stage of coronavirus infection, it is possible to detect a living virus existing in a body fluid such as blood, saliva, and runny nose with high sensitivity. This makes it possible to test for the presence or absence of coronavirus infection (whether or not it is positive).
  • RBD receptor binding domain
  • Antigen protein used as an antigen for producing the antibody of the present invention is, in the present invention, the extracellular region and receptor binding domain (RBD) of the coronavirus spike protein (S protein). It is a protein in the region. These proteins can be prepared by genetic engineering techniques.
  • the viral protein may be a natural protein purified from tissues or cells such as mice, rats, and humans, or may be a genetically engineered protein.
  • the method for producing a protein (polypeptide) as an antigen may be chemical synthesis or synthesis by a genetic engineering method using Escherichia coli or the like, and a method well known to those skilled in the art can be used.
  • chemically synthesizing a polypeptide it can be synthesized by a well-known peptide synthesis method.
  • solid-phase synthesis method or the liquid phase synthesis method can be applied to the synthesis.
  • a commercially available peptide synthesizer for example, manufactured by Shimadzu Corporation: PSSM-8, etc. may be used.
  • a recombinant vector for protein expression is obtained by ligating the above DNA to an appropriate vector, and a transformant is obtained by introducing this recombinant vector into a host so that the target gene can be expressed (Sambrook). J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).
  • the extracellular region of the S protein of SARS-CoV2, SARS-CoV1 and MERS-CoV, and the base sequence encoding the RBD region protein are artificially synthesized.
  • a protein purification tag for example, Histag
  • Histag is inserted into the inserted vector to prepare an expression vector.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the gene of interest. Examples thereof include bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.), insect cells or insects. It is also possible to use a mammal such as a goat as a host.
  • a method for introducing a recombinant vector into a host is known (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).
  • the above expression vector is introduced into a predetermined cell for protein expression, and the recombinant protein is purified from the culture supernatant. Purification is performed by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., alone or in combination as appropriate. Can be isolated and purified.
  • an antigen protein can also be obtained by in vitro translation using a commercially available cell-free synthesis system such as Expressway TM system.
  • the protein used as an antigen may be all or at least a part of the amino acid sequence shown in the following SEQ ID NO:, and is not limited, but may be at least a part of the extracellular region or a receptor binding domain. preferable.
  • the amino acid sequence of the spike protein of each coronavirus and the base sequence of the DNA encoding the protein are shown in Table 1.
  • the antigen in addition to (a) a protein (polypeptide) containing the amino acid sequence represented by the above-mentioned SEQ ID NO:, (b) one or several (for example) in the amino acid sequence represented by the above-mentioned SEQ ID NO:.
  • mice mice, rats, rabbits, goats, horses, which are generally used for antibody production, are used.
  • sheep and the like can be used, it is preferably a fully human antibody-producing mouse (TC mouse).
  • the present inventor has succeeded for the first time in the world in producing a mouse that retains a full-length human Ig locus and produces a fully human antibody by transchromosomic (TC) mouse production technology (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics). , (1997) 16, 133-143; Tomizuka, K. et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727).
  • TC transchromosomic
  • the artificial chromosome vector used here is of human origin, subsequent studies have succeeded in producing TC mice using the mouse artificial chromosome vector (MAC) (WO2018 / 079857).
  • the mouse artificial chromosome vector means a mini-chromosome that is shortened by removing unnecessary genes from a natural mouse chromosome and consists only of telomeres, centromeres, and origins of replication.
  • a cloning site, loxP sequence can be introduced into this mouse artificial chromosome vector.
  • Mouse artificial chromosome vectors are constant in mammalian cells, including (ii) mice and rats, which can (i) carry any new gene, (ii) be maintained independently without being inserted into the host chromosome, and can transmit offspring. It has advantages such as stable retention for a long period of time with the number of copies of (iv) and no limitation on the length of DNA that can be introduced.
  • Two cloning methods, circular insert type and chromosomal translocation type, can be used for loading the target gene (for example, human antibody gene) into a mouse artificial chromosome vector (References: Uno N, Abe S, Oshimara M, Kazuki Y.J. Hum Genet. 2018 Feb; 63 (2): 145-156. Doi: 10.1038 / s10038-0117-0378-7.). Since ES cells and iPS cells are known to contribute to the germline, these cells into which a mouse artificial chromosome vector containing a human antibody gene of interest has been introduced are injected into the blastocyst of a mouse embryo.
  • Transchromosomic mice are produced by transplanting embryos into the uterus of foster mothers and giving birth. Furthermore, by mating the obtained male and female TC mice, the offspring mice (these are referred to as TC mice) are produced (WO2018 / 079857).
  • the TC mouse is used as the subject of immunization.
  • the above MAC vector was introduced into mice (referred to as TC mice) for human Ig heavy chains and light chains ( ⁇ and / or ⁇ ), and the endogenous mouse Ig genes of TC mice were disrupted. By doing so, you can create it.
  • the human antibody-producing mouse can be obtained according to the above-mentioned known method, but can also be obtained as a commercially available product (TC-mAb TM mouse: Trans Chromosomics Co., Ltd.).
  • the prepared antigen is administered to an animal for immunization.
  • an animal to be immunized for example, a fully human antibody-producing mouse (TC mouse) can be used in the present invention.
  • the antigen protein prepared as described above is immunized by administration to an animal (for example, TC mouse) by itself or together with a carrier and a diluent.
  • the dose of antigen per animal is 1 ⁇ g to 10 mg when an adjuvant is used.
  • the adjuvant include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), aluminum hydroxide adjuvant and the like.
  • Immunization is mainly performed by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or the like.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 2 to 20 times at intervals of several days to several weeks, preferably 1 to 2 weeks.
  • Antibody isolation Blood was collected from an immunized animal (for example, TC mouse), and the blood IgG antibody titer against the S protein (extracellular region, RBD region) of each virus was measured by sandwich ELISA, and the IgG antibody was obtained. Collect the induced mouse spleen cells. The collected spleen cells are treated with an anti-Fc ⁇ RII / III antibody, stained with the following antibody and an S protein fluorescent probe, and memory B cells bound to the S protein fluorescent probe are separated by flow cytometry. The separated memory B cells are cultured, and the culture supernatant 10 days after the culture is collected. At the time of culturing, sprinkle at 1 cell / well on feeder cells expressing appropriate mouse CD40L, BAFF. Further, as the medium, an RPMI medium supplemented with various cytokines (for example, mouse IL-2, IL-4, IL-5) can be used.
  • various cytokines for example, mouse IL-2, IL-4, IL-5
  • a monoclonal antibody by a usual hybridoma method.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler et al.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • myeloma cells include P3X63-Ag8 and P3X63-Ag8U. 1, SP2 / O-Ag14, PAI, P3U1, NSI / 1-Ag4-1, NSO / 1 and other mouse myeloma cell lines and the like can be mentioned.
  • the target hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment.
  • a selective medium such as HAT medium
  • HAT medium added to each well, and then appropriately. Change the selective medium and culture.
  • cells that grow after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • cDNA is synthesized from memory B cells whose binding to each S protein is confirmed by the ELISA method, and the antibody is obtained.
  • the gene (heavy chain, light chain V region) is cloned by the PCR method.
  • the cloned heavy chain V region is introduced into a human IgG1 or IgG3, and the light chain V region is introduced into a mammalian expression vector containing the C region of human Ig ⁇ or Ig ⁇ to prepare each antibody expression vector.
  • the prepared antibody expression vector is gene-introduced into a host cell, and the recombinant antibody is purified from the culture supernatant.
  • the antibody of the present invention may be a recombinant antibody or an antigen-binding fragment prepared and expressed by recombinant means.
  • the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody.
  • the recombinant antibody of the present invention can be produced by recombinant expression of heavy chain and light chain.
  • a mouse-human chimeric antibody an antibody gene is isolated from mouse cells that produce an antibody against the S protein of the virus, and the heavy chain (H chain) constant region thereof is recombined into the H chain constant region gene of human IgG. It can be prepared by introduction into mouse myeloma cells.
  • a humanized antibody can be prepared, for example, by transplanting a gene for an antigen-binding site of an antibody isolated from a mouse cell producing an antibody against the S protein into a human-derived antibody molecule.
  • human antibodies can be prepared by immunizing a mouse whose immune system has been replaced with a human by immunizing the S protein.
  • the antibody protein obtained by the present invention is, for example, a fully human antibody and a monoclonal antibody.
  • the fragment of the antibody means a region of a part of the antibody of the present invention, and examples thereof include Fab, Fab', F (ab') 2 , Fv, diabodies, dsFv, scFv (single chain Fv) and the like. ..
  • the antibody fragment can be obtained by cleaving the antibody of the present invention with various proteolytic enzymes according to the purpose.
  • Fab can be obtained by treating the antibody molecule with papain
  • F (ab') 2 can be obtained by treating the antibody molecule with pepsin.
  • Fab' can be obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab') 2 .
  • scFv the cDNA encoding the heavy chain variable region (H chain V region) and the light chain variable region (L chain V region) of the antibody is obtained, and the DNA encoding scFv is constructed. ScFv can be produced by inserting this DNA into an expression vector and introducing the expression vector into a host organism for expression.
  • the cDNA encoding the H chain V region and the L chain V region of the antibody is obtained, and the DNA encoding scFv is constructed so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less.
  • Diabody can be produced by inserting this DNA into an expression vector and introducing the expression vector into a host organism for expression.
  • the cDNA encoding the H chain V region and the L chain V region of the antibody is obtained, and the DNA encoding dsFv is constructed. By inserting this DNA into an expression vector and introducing the expression vector into a host organism for expression, dsFv can be produced.
  • NT-108 (NTCOV-1) VH (SEQ ID NO: 13)
  • NT-108 VH AA seq (SEQ ID NO: 14)
  • NT-108 (NTCOV-1) V ⁇ (SEQ ID NO: 15)
  • NT-108 V ⁇ amino acid sequence (SEQ ID NO: 16)
  • NT-193 (NTCOV-2) VH (SEQ ID NO: 17)
  • NT-193 (NTCOV-2) VH amino acid sequence (SEQ ID NO: 18)
  • NT-193 (NTCOV-2) Vk (SEQ ID NO: 19)
  • NT-193 (NTCOV-2) Vk amino acid sequence (SEQ ID NO: 20)
  • a neutralizing test using VSV pseudovirus can be performed in order to evaluate the SARS-CoV2 virus infection protective effect of the antibody.
  • an antibody monoclonal antibody
  • VSV pseudovirus expressing the virus S protein diluted in the medium are mixed and cultured.
  • TMPRSS2 a type II transmembrane serine protease
  • Vero cells and VeroE6 cells (Vero / TMPRSS2 cells and VeroE6 / TMPRSS2 cells) in which TMPRSS2 is constitutively expressed by genetic engineering are known (Shirogane Y, et al., J Virol 82: 8942-8946, 2008). Nao N, et al., PLoS One 14: e0215822, 2019). Recently, these cell lines (particularly VeroE6 / TMPRSS2 cells) have been shown to be very beneficial for the isolation and proliferation of SARS-CoV2 (Matsuyama S, et al., Proc Natl Acad Sci USA 117: 7001-7003, 2020).
  • a mixed solution of an antibody and a virus is added to coronavirus-sensitive cells (for example, Vero E6 / TMPRSS2 cells) and further cultured. Then, the luciferase activity is measured using a commercially available assay system or kit.
  • the epitope recognized by the antibody of the present invention and the epitope (antigen determinant) of the antibody of the present invention that binds to the epitope are not limited as long as they are at least a part of the coronavirus S protein which is an antigen. , Extracellular region or at least a portion of the receptor binding domain (RBD) is preferred, eg RBD.
  • Antibodies that recognize the region (bind to the region) have high neutralizing activity against coronavirus in biological samples, and are extremely useful for the prevention or treatment of coronavirus infections.
  • Examples of the epitope of the antibody of the present invention include R403, D405, E406, R408, T415, G416, K417, D420, Y449, Y453, L455, F456, among the full-length amino acid sequences of the receptor-binding domain (for example, SEQ ID NO: 2). At least two amino acid residues selected from the group consisting of G485, Y486, N487, Y489, Q493, S494, Y495, G496, Q498, N501, G502, V503, G504 and Y505.
  • the alphabet is the one-letter notation of the amino acid, and the number is the position of the amino acid in the full-length amino acid sequence of the receptor binding domain.
  • R403 means arginine at position 403 of the full-length amino acid sequence of the receptor-binding domain (eg, SEQ ID NO: 2). The same applies to other positions and amino acid residues, and can be expressed as such throughout the present specification.
  • the antibody of the invention binds to an epitope containing two amino acid residues, R403 and K417.
  • binding affinity and neutralization activity The binding affinity can be determined by the binding constant (KA) and the dissociation constant (KD).
  • the affinity equilibrium constant (K) is expressed by the ratio of KA / KD.
  • the binding affinity can be detected as follows.
  • the binding affinity has a dissociation constant (KD) of at least 1 ⁇ 10 -10 M, and the dissociation constant is, for example, 2 to 5 times, 5 to 10 times, 10 to 100 times, 100 to 1000 times. Or it has 1000 to 10,000 times higher affinity.
  • the antibody of the present invention has a dissociation constant (KD) of 1 ⁇ 10 -10 M, 5 ⁇ 10 -11 M, 1 ⁇ 10 -11 M, 5 regarding the binding affinity of the S protein of coronavirus.
  • ⁇ 10 -12 M 1 ⁇ 10 -12 M, 5 ⁇ 10 -13 M, 1 ⁇ 10 -13 M, 5 ⁇ 10 -14 M, 1 ⁇ 10 -14 M, 5 ⁇ 10 -15 M, or 1 It is ⁇ 10 -15 M, and more preferably 1 ⁇ 10 -12 M to 1 ⁇ 10 -15 M.
  • the value may be lower than these KDs and the affinity may be high.
  • the dissociation constant (KD) of the antibody to be measured for affinity is within about 1 to 100 times the KD of the antibody of the present invention, the antibody is substantially the same as the antibody of the present invention. Is included in the present invention.
  • the binding constant (KA) and dissociation constant (KD) can be measured using surface plasmon resonance (SPR), and known equipment and methods can be used to detect and further monitor the binding rate in real time. Yes (eg, Biacore® T200 (GE Healthcare), ProteON XPR36 (Bio-Rad), etc.).
  • the neutralizing activity of the antibody of the present invention against coronavirus is less than 2 ng / ml (for example, less than 1 ng / ml) as an IC50 which is an index of virus growth suppression.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the antibody of the present invention as an active ingredient, and is effective for the prevention and treatment of SARS virus infection.
  • peptided antibodies or conjugates of these peptides and BBB permeable carriers may be made to cross the blood-brain barrier (BBB).
  • BBB blood-brain barrier
  • the antibody of the present invention can be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, and the administration thereof can be performed once or in several divided doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a method known to those skilled in the art.
  • it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injectable suspension.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically sterile water or physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives.
  • the amount of the active ingredient in these formulations is set so as to obtain an appropriate volume in the specified range.
  • the sterile composition for injection can be formulated according to the usual formulation practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • Appropriate solubilizing agents such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), and nonionic surfactant (polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and / or benzyl alcohol may be used in combination as a solubilizing agent. It may also be blended with a buffer (eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, prokine hydrochloride), a stabilizer (eg, benzyl alcohol and phenol), and an antioxidant.
  • a buffer eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • a soothing agent eg, prokine hydrochloride
  • a stabilizer eg, benzyl alcohol and phenol
  • antioxidant eg, benzyl alcohol and phenol
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
  • parenteral administration can be an injection type, a nasal administration type, a pulmonary administration type, or a transdermal administration type composition.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method can be appropriately selected according to the patient's age and symptoms.
  • the dose of the antibody or the pharmaceutical composition containing the polynucleotide encoding the antibody can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per 1 kg of body weight at a time. Alternatively, for example, the dose may be 0.001 to 100,000 mg per patient, but the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms and the like of the patient, but those skilled in the art can set an appropriate dose and administration method in consideration of these conditions.
  • various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate, and glycine can be used together with disintegrants, binders, and the like.
  • disintegrant include starch, alginic acid, certain silicic acid double salts
  • binder include polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, and gum arabic.
  • lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, and talc are very effective for tablet formation.
  • an aqueous suspension or elixir for oral administration When making an aqueous suspension or elixir for oral administration, it can be used in combination with an emulsifier, a suspending agent, water, ethanol, propylene glycol, glycerin, etc., and a diluent in combination thereof, if necessary. ..
  • the detection or diagnostic reagents of the present invention contain the antibodies of the invention or fragments thereof. Since the antibody of the present invention can specifically bind to coronavirus, the reagent of the present invention containing the antibody can be used for detection or diagnosis of coronavirus infection. Examples of the coronavirus to be detected or diagnosed in the present invention are SARS-CoV2, SARS-CoV1 and MERS-CoV.
  • the reagent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antibody of the present invention.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” is any carrier (liposomes, lipid vesicles, micelles, etc.) suitable for the reagents of the present invention, diluents, excipients, wetting agents, buffers, suspensions, lubricants. , Adjuvants, emulsifiers, disintegrants, absorbers, preservatives, surfactants, colorants, flavoring agents and the like.
  • the invention provides the use of a human antibody against coronavirus or a fragment thereof for the detection of coronavirus infections or the production of diagnostic reagents.
  • the method for detecting or diagnosing a coronavirus infection of the present invention comprises the human antibody of the present invention or a fragment thereof and a biological sample collected from a subject (hereinafter, also simply referred to as "biological sample”). ), A method comprising the step of detecting the coronavirus protein in the sample. In this case, it is preferable to associate the detection result of the coronavirus protein with the possibility of coronavirus infection (positive for coronavirus infection).
  • examples of the "subject” include mammals such as humans, cats, dogs, goats, pigs, sheep, cows, horses, monkeys, and hamsters, and humans are preferable.
  • the subject is a human, the subject includes a healthy person and a patient positive for coronavirus infection.
  • the biological sample means, for example, a tissue or cell derived from a mammal, a crushed product or extract thereof, a body fluid, excrement itself or a sample containing these, and is not particularly limited.
  • biological samples can be obtained by subjecting animal-derived tissues, cells, crushed products or extracts thereof, body fluids, excretion, etc. to arbitrary treatments such as dilution, separation, and protein denaturation. Samples are also included.
  • the biological sample is preferably body fluid, particularly saliva, mucous membrane, or blood. Any biological sample can be applied with appropriate pretreatment.
  • contact means that the antibody of the present invention and the biological sample collected from the subject are present in the same reaction system.
  • the antibody of the present invention and the biological sample are used.
  • Adding the antibody of the present invention to the biological sample adding the other to a carrier on which either the antibody of the present invention or the biological sample is immobilized, and the like.
  • for the detection, measurement or evaluation of the expression level of coronavirus for example, enzyme-linked immunosorbent assay (EIA, ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA), chemiluminescence immunoassay. Methods (CIA), latex agglutination, western blots, immunostaining, immunoprecipitation, immunochromatography, radioimmunoassay (FPIA) and the like can be used.
  • the device used for such detection and the like is not particularly limited, and for example, a microwell plate, an array, a chip, a flow cytometer, a surface plasmon resonance apparatus, an immunochromatographic strip, and the like can be used.
  • signals such as color development amount, fluorescence amount, and light emission amount are detected, measured, and / or evaluated, and the detection, measurement, or evaluation result is associated with the possibility of coronavirus infection. be able to.
  • the reaction may be directly detected as a fluorescent signal by labeling the antibody of the present invention with an enzyme or a fluorescent substance, or the signal may be detected by using a labeled secondary antibody that binds to the antibody of the present invention. It may be detected indirectly. Further, as the detection method, any method such as a competitive method, a sandwich method or a direct adsorption method may be used. Then, the strength of the reaction and the ratio of the virus bound to the antibody in the whole virus in the reacted sample are measured, and a preset reference value or index is set as a cut-off value, and the cut-off value is set. By comparing with, the possibility of suffering from a coronavirus infection can be determined or diagnosed.
  • the cut-off value can be obtained, for example, as follows. First, the expression level of coronavirus in a biological sample derived from a coronavirus-positive patient and the expression level of coronavirus in a biological sample derived from a healthy person are measured (in this case, it is expected to be below the detection limit). At this time, the number of target patients is 2 or more, respectively, for example, 10 or more and 100 or more. Then, the cut-off value of the expression level of the coronavirus is obtained by statistical processing from both the biological sample group derived from the positive patient and the biological sample group derived from the healthy subject. As the statistical processing, for example, a logistic regression analysis method, a method using a ROC curve, or the like can be used.
  • the critical value (cut-off value) of the expression level of the coronavirus S protein (extracellular region) in the blood sample material can be appropriately set as the serum concentration.
  • the expression level of coronavirus S protein is measured under the above conditions, it can be determined that coronavirus has been detected when the expression level is equal to or higher than the cut-off value, or the subject may be positive for coronavirus. It can be diagnosed as being.
  • the certainty (probability) of the detection result when the S protein of coronavirus is detected is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, preferably 99% or more.
  • the above-mentioned detection result can be used as a main material or an auxiliary material in the case of performing a test for a coronavirus infection or a definitive diagnosis of a therapeutic effect, for example.
  • the present invention comprises a step of contacting a human antibody against the S protein of coronavirus or a fragment thereof with a biological sample collected from a subject to detect the S protein of coronavirus in the sample. It also provides a method to assist in the detection or diagnosis of virus.
  • the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
  • each recombinant protein expression vector was prepared by inserting into a vector (pCMV vector).
  • the expression vector prepared in Expi293 cells was gene-introduced and cultured at 37 ° C., 8% CO 2 , and 125 rpm shaking culture for 5 days. From the culture supernatant, each recombinant protein was purified on a TALON column (Clontech).
  • SARS-CoV2 recombinant S protein (extracellular region, RBD region) 10 ⁇ g incomplete Freund's adjuvant 100 ⁇ l and Phosphorothioate-ized CpG (ATAATCGAGTTCAAGCAAG) 21))
  • a solution mixed with 10 ⁇ g was injected intraperitoneally into a fully humanized antibody-producing mouse (TC mouse).
  • SARS-CoV1 recombinant S protein (extracellular region, RBD region) and MERS recombinant S protein (extracellular region, RBD region) were prepared in the same manner, and booster immunization was performed every 2 weeks.
  • the immune schedule is shown in FIG.
  • the separated memory B cells were sprinkled on the feeder cells expressing mouse CD40L and BAFF at 1 cell / well, and mouse IL-2 (4 ng / mL), IL-4 (2 ng / mL), IL-5 (5 ng / mL).
  • the cells were cultured in RPMI medium supplemented with (mL) at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was collected 10 days after the culture.
  • RNA prepared from cells using RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) was synthesized by cDNA (42 ° C., 120 minutes) using SuperScript TM VILO TM Master Mix (invitrogen).
  • PCR was performed with the following reagents and cycle conditions. Amplification was performed using PrimeSTAR (registered trademark) Max DNA Polymerase (TAKARA) under the conditions of 98 ° C. (5 seconds), 55 ° C. (5 seconds), 72 ° C.
  • the cloned heavy chain V region was introduced into a human IgG1, and the light chain V region was introduced into a mammalian expression vector (pIgvector) containing the C region of human Igkappa or Iglambda to prepare antibody expression vectors for each.
  • the prepared antibody expression vector was gene-introduced into Expi293 cells (Thermo Fisher Scientific), and a recombinant antibody was purified from the culture supernatant using Protein G.
  • each well was washed 3 times with phosphate buffered saline, and 110 ⁇ l of phosphate buffered saline containing 1% bovine serum albumin was added. After allowing to stand at room temperature for 1 and a half hours, each well was washed 3 times with phosphate buffered saline (containing 0.1% of Tween 20), and phosphate buffered containing 0.1% Tween 20 and 1% bovine serum albumin. 50 ⁇ L of the monoclonal antibody serially diluted with the solution was added.
  • each well was washed 3 times with phosphate buffered saline (containing 0.1% of Tween 20), and phosphate containing 0.1% Tween 20 and 1% bovine serum albumin. 50 ⁇ L of peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (Southern Biotech) diluted with buffered saline was added to each well. After allowing to stand at room temperature for 1 hour, each well was washed 3 times with phosphate buffered saline (containing 0.1% of Tween 20), and o-phenyllendiamine was added to 20 mL of citric acid buffer (pH 5.0) as a substrate.
  • citric acid buffer pH 5.0
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of isolation of memory B cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of isolation of antibodies against each coronavirus.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of the neutralizing activity using the pseudovirus.
  • # 108 (NTCOV2-1) is specific for SARS-CoV2 and # 193 (NTCOV2-2) shows a cross-reactivity to SARS-CoV2 / CoV1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of isolation of memory B cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of isolation of antibodies against each coronavirus.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of the neutralizing activity using the pseudovirus.
  • # 108 (NTCOV2-1) is specific for SARS-CoV2
  • # 193 (NTCOV2-2) shows a cross-reactivity to SARS-CoV2 / CoV1.
  • FIG. 1 shows a cross-reactivity to SARS-CoV2 / CoV1.
  • the IC50 of the neutralizing activity of each antibody against SARS-CoV2 is 1.3 ng / mL for NTCOV2-1, 0.56 ng / mL for NTCOV2-2, 52 ng / mL for VHH72, and 3460 ng / mL for B38. H4 was 426 ng / mL. The IC50 of the neutralizing activity of each antibody against SARS-CoV was 13 ng / mL for NTCOV2-2. [Example 2]
  • CoV2 SARS-CoV-2 pandemic
  • RBS receptor binding site
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • CoV2 and other coronaviruses include SARS-CoV (CoV1), reduces the likelihood of cross-neutralization by RBS antibodies against multiple CoVs.
  • existing RBS antibodies are susceptible to escape mutations under monotherapy (References 4-6). Therefore, since such structural data advances novel antibody therapies and vaccine designs, CoV2 RBS antibodies with neutralization margin and escape resistance are needed.
  • a soluble version of the spike protein (amino acid: 1-1201 (SEQ ID NO: 34)) containing the T4 Foldon trimerization domain, histidine tag, and strip-tag was cloned into the mammalian expression vector pCMV.
  • the amino acid sequence of the protein was modified to remove the multibasic cleavage site (A from RRAR) and two stabilizing mutations were also introduced (K986P and V987P; wild type numbering) (Reference 32).
  • SARS-CoV-1 GenBank: EU371563, amino acid: 15-1195 (SEQ ID NO: 25)
  • MERS-CoV GenBank: KF192507, amino acid: 13-1296 (SEQ ID NO: 26)
  • HCoV-NL63 GenBank: NC_005831, Amino acid: 22-1293 (SEQ ID NO: 27)
  • HCoV-OC43 GenBank: NC_006213, amino acid: 12-1299 (SEQ ID NO: 28)
  • HCoV-229E GenBank: NC_002645, amino acid: 12-1109 (SEQ ID NO: 29)).
  • HCoV-HKU1 GenBank: NC_006577, amino acid 13-1293 (SEQ ID NO: 30)
  • HCoV-HKU1 GenBank: NC_006577, amino acid 13-1293 (SEQ ID NO: 30)
  • the RBD of the SARS-CoV-1 (amino acid: 310-509) and MERS-CoV (amino acid: 367-606) S proteins along with the histidine tag was also cloned into the mammalian expression vector pHLsec.
  • RBD mutants of SARS-CoV-2 at positions A475V, E484K, Q493R, R346S, N440K, and Y453F were directly site-based with primers introduced with a Gibson assembly (NEB) based on the relevant nucleotide substitutions and RBD expression vectors. Made by mutagenesis. Recombinant proteins were produced using Drosophila expression systems or Expi293F cells (Thermo Fisher Scientific).
  • the supernatant from the transfected cells was collected and the recombinant protein was purified using Ni-NTA agarose (Qiagen) and / or streptactin sepharose (Sigma aldrich).
  • Recombinant RBD and S protein of SARS-CoV-2 were coupled with APC and PE (Dojindo) to make S protein-fluorescent dye probes.
  • mice and immune TC-mAb mice were established as previously described (reference 7). Mice were treated with recombinant RBD (10 ⁇ g / body) of SARS-CoV-2 peplomer with the adjuvant AddaVax (InvivoGen) i. p. Immunized and continuously boosted with recombinant RBD or S protein of SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 and MERS-CoV at 21-day intervals. Serum was collected 7 days after booster immunization and tested for antigen-specific human IgG antibody titers. All mice were maintained under SPF conditions and used at 7-14 weeks of age. All rat work was performed according to the guidelines of the Animal Care and Use Committee of the National Institute of Infectious Diseases of Japan.
  • ELISA method ELISA plates, SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, and MERS-CoV S protein RBD, SARS-CoV-2 RBD, and SARS-CoV-2 RBD mutants, E484, Any of the trimeric S proteins Q493R, R346S, N440K, and Y453F, or SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-229E, and HCoV-HKU1. It was coated with 2 ⁇ g / ml. In some experiments, the concentration of coating antigen was varied to 0.2 ⁇ g / ml or 5 ⁇ g / ml.
  • TC-mAb mouse splenocytes were pretreated with anti-Fc ⁇ RII / III mAb, followed by mouse CD43, CD90, CD3, c-kit, F4 / 80, Gr-1, CD4, CD8, CD11b, Ter119, Incubated with biotinylated mAbs to CD93, CD11c, CD138 and human IgD.
  • Class switch memory B cells were enriched by a MACS system with streptavidin microbeads (Miltenyi Biotec). This was subsequently stained with B220-BV786, CD38-AF700, PE-labeled CoV2-S, APC-labeled CoV2-RBD, streptavidin-efluor450, and DAPI. Stained cells were analyzed and sorted into 96-well plates with single cells using a FACSAria device (BD Bioscience).
  • Single cell culture Feeder lineage cells (NB21.2D9 cells) were subjected to B cell medium (BCM; 10% Cyclone FBS, 1 mM sodium pyruvate, 10 mM HEEPS, MEM non-selection) 1 day prior to single B cell selection.
  • BCM B cell medium
  • RPMI-1640 containing essential amino acids, 100 IU / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, and 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol
  • 1000 NB21.2D9 cells per well were seeded in 96-well plates.
  • mouse IL-4 (Peprotech: 2 ng / mL) in BCM was added to the culture and mouse / human B cells were sorted directly into 96-well plates with 1 cell per well and then co-cultured with feeder cells. .. After culturing, the culture supernatant was collected and subjected to ELISA for mapping the secreted mAb epitope. In addition, cultured cloned B cells were frozen, and V (D) J sequence analysis and V (D) J gene recovery were performed to produce recombinant mAbs.
  • VH / VL gene of a B cell sample selected from a single cell culture or published mAbs is a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 heavy chain and ⁇ or ⁇ . It was cloned into a light chain expression vector. A pair of heavy and light chain vectors was transfected into Expi293F cells (Thermo Fisher Scientific, Cat #: A14527) according to the manufacturer's instructions. Antibodies were then purified from the culture supernatant using a Protein G column (Thermo Fisher Scientific) and subjected to further analysis after dialysis against PBS.
  • Expi293F cells Thermo Fisher Scientific, Cat #: A14527
  • Binding of SARS-CoV2 RBD to ACE2 was developed using streptavidin-HRP (Southern Biotech) and OPD-substrate (Sigma-Aldrich). Absorbance at 490 nm was read using a microplate reader (BioRad). The inhibition percentage was calculated as (OD value of positive control sample OD value) / (OD value of positive control OD value of negative control) x 100. The semi-maximum effective concentration (EC50) was determined using a non-linear regression curve fit (GraphPad Prism).
  • VSV pseudovirus with SARS-CoV2 or SARS-CoV1 peplomer was incubated with serially diluted antibody at 37 ° C. for 1 hour.
  • the mixture was inoculated with VeroE6 or VeroE6 / TMPRSS2 cells seeded on 96-well solid white flat bottom plates (Corning) and then incubated with 5% CO2 at 37 ° C. for 24 hours.
  • Luciferase activity in cultured cells was measured using the Bright Gluciferase Assay System (Promega) using the GroMax Navigator Microplate Liminometer (Promega).
  • the neutralization percentage was calculated as (virus control signal-sample signal) / (virus control signal-cell-only control signal) x 100.
  • the semi-maximum inhibition concentration (IC 50 ) was determined using a non-linear regression curve fit (GraphPad Prism).
  • Crystallization, data acquisition, and structure determination Crystals of the S-RBD-NT-108 complex were grown at 293K by the sitting drop vapor diffusion method.
  • the final crystallization conditions were 0.1 M HEPES pH 7.5, 10% (w / v) PEG 8000, and 8% (w / v) ethylene glycol.
  • the crystals were frozen in liquid nitrogen, and X-ray diffraction experiments were performed at the beamline BL-17A of Photon Factory (Tsukuba, Japan).
  • the X-ray diffraction data set was processed with XDS and scaled with Aimless in the CCP4 program package.
  • the structure was elucidated by a molecular replacement method using the Phaser program of the PHENIX package using the S-RBD structure (PDB ID: 7jpp) as a search probe. Structural refinement was performed using refine and COOT. The stereochemical properties of the structure were evaluated using Molprobity.
  • FIGS. 5-2, 6-7 and 6-8 were prepared using PyMOL (http://PyMOL. SourceForge.net). Intramolecular contact atoms were analyzed using PISA and CONTACT in the CCP4 program package.
  • RNA Viral load was measured by qRT-PCR to detect the nucleocapsid genomic RNA of SARS-CoV-2.
  • Total lung RNA was extracted from lung homogenates using the Direct-sol miniprep kit (Zymo580 research, Cat. No. R2050). Total lung homogenates were prepared using TissueLyser LT (Qiagen). The qRT-PCR reaction was performed using the QuantiTect Probe RT-PCR kit (Qiagen # 204443) in the following cycle protocol: 30 minutes 50 ° C, 15 minutes 95 ° C, then 15 seconds 95 ° C, 1 minute 60 ° C in 45 cycles. Duplicated.
  • the primer and probe sequences used for qRT-PCR are forward: 5'-AAATTTTGGGGACAGGAAC-3'(SEQ ID NO: 31), reverse: 5'-TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC-3' (SEQ ID NO: 32), probe: 5'FAM. -ATGTCGCGCATTGGACATGGA-BHQ-3'(SEQ ID NO: 33).
  • a calibration curve is constructed using a continuous 10-fold dilution of purified PCR product with a known number of copies ( 10-106 copies / ⁇ L).
  • One clone (# 108) was strain-specific for CoV2 RBD and another clone (# 193) was cross-reactive for CoV2 / CoV1 RBD.
  • # 108 and # 193 clones are referred to as NT-108 and NT-193, respectively.
  • RBS antibodies are often encoded by the public VH gene (Reference 9; Reference 10), but NT-108 and NT-193 utilize the atypical IGHV6-1 and IGHV4-34 genes, respectively ( Figure). 6-2).
  • IGHV4-34 a representative VH gene for self-reactive antibodies (Reference 11)
  • CoV1 cross-reactivity was detected in two of the 11 V4-34-encoded RBD antibodies (Ref 13), and this VE gene could promote CoV1 cross-reactivity. There is sex.
  • RBS epitopes can be subdivided by two types of classification; classes 1 and 2 in one classification (reference 14), and A, B, and C in another classification (reference 2).
  • classes 1 and 2 in one classification (reference 14)
  • A, B, and C in another classification (reference 2).
  • non-RBS epitopes within the spike RBD that are indicated as either class 3/4 or S309-latent / CR3022-proteoglycan sites.
  • Class 4 (CR3022-proteoglycan) epitopes were generally targeted by inadequately or non-neutralized clones (Ref 15), thereby excluding antibodies against this class from further analysis.
  • Recombinant human IgG1 / ⁇ antibody was expressed based on NT-108 and NT-193V H / VL sequences.
  • NT-108 and NT-193 A distinct feature between NT-108 and NT-193 is the cross-reactivity to CoV1 (FIG. 5-1A).
  • CoV1 cross-reactivity to CoV1
  • Fig. 6-4 We further investigated their cross-reactivity to various CoVS trimers, including MERS and four seasonal CoVs (Fig. 6-4). No cross-reactivity to any CoV was detected from NT-108, and the cross-reactivity of NT-193 was limited to CoV1 only.
  • NT-193 bound to CoV1 RBD with high affinity (Fig. 6-5) and neutralized CoV1 with the same intensity as the CoV2 virus (Fig. 5-1G).
  • CoV1 / CoV2 cross-neutralizing antibodies have been isolated from several groups (References 13, 18-20), their neutralizing activity against either CoV1 or CoV2, or both, is generally NT-193 (6). It is weaker than .1 ng / mL IC 50 ) (> 100 ng / mL IC 50 ). Therefore, NT-193 is a unique RBS antibody that neutralizes both CoV2 and CoV1 viruses potently and equally.
  • NT-193 recognizes the upper region of S-RBD that widely overlaps the binding site of ACE2 (FIG. 5-2A).
  • Class 1 / RBS-A / B antibodies (References 2, 14) also recognize the upper region, but the mode of recognition of NT-193 is clearly different and unique (FIGS. 5-2B and FIG. 6-7A).
  • the NT-193 antibody utilizes not only the light chain CDR-L1 and CDR-L3, but also the frame region, DE loop for recognition of the ACE2 binding site (FIGS. 5-2C and 5-2D, Tables. 2-2).
  • These structural features are atypical binding modalities of the antibody complex (FIG. 6-7B), presumably contributing to strong neutralization activity and cross-reactivity to CoV2 and CoV1. ..
  • Tyr505 of the S-RBD is surrounded by a hydrophobic patch containing Trp97 and Leu95 of CDR-L3, as well as Tyr33 of CDR-H1 (FIG. 6-8B).
  • Tyr33 of CDR-L1 has a hydrophobic interaction with Leu455 and a polar interaction with Lys417 and Tyr453 (FIG. 5-2H).
  • the backbone of the DE loop is hydrogen bonded to S-RBD and is also sandwiched between Tyr-489 and Phe-486 (FIGS. 5-2C and 5-2I).
  • the heavy chain CDR-H3 three continuous tyrosine, Tyr-103, Tyr-104, Tyr-105 (Fig.
  • VOCs Variant of Concern
  • the V3 strain has a mutation of bear K417 that allows escape from REGN10933 and LY-COV016 (references 4, 26, 27). Despite these mutations, NT-193 neutralized all of these VOCs, even at lower concentrations required to neutralize the original Wuhan strain (data not submitted). Will be replaced by IC50). These data highlight the increased resistance of NT-193 to the emergence of escape mutations from conventional RBS antibodies.
  • the Syrian hamster model was used to examine the prophylactic and therapeutic efficacy of NT-193 monotherapy or NT-108 / NT-193 cocktails.
  • This cocktail prevented the appearance of escape variants under in vitro escape screening (Fig. 6-8).
  • Hamsters were given two doses (5 mg / kg and 1.25 mg / kg) 2 hours (prophylactic) or 1 day (therapeutically) after intranasal (therapeutic) inoculation of SARS-CoV-2 ( Figure). 5-4A).
  • Single-agent or cocktail prophylaxis prevented severe weight loss in hamsters until day 6 after infection (Fig. 5-4B).
  • the preventive effect was more remarkable with the antibody of 5 mg / kg than with 1.25 mg / kg, and the effect was clarified as early as the second day after infection.
  • the difference in body weight between the treated and untreated groups further increased at a later point in time. Similar to prophylaxis, all therapeutic treatments prevented hamster weight loss by day 6 after infection (Fig. 5-4C), but the effect was slightly diminished compared to the prophylactic effect.
  • the preventive and therapeutic effects of SARS-CoV-2 on the pathological condition of the lung were also evaluated. On day 6, the lungs of antibody-treated hamsters had less inflammatory damage than the lungs of control hamsters, whether single-agent or cocktail-treated (FIGS. 5-4D and 6-9).
  • a distinct feature of the NT-193 binding mode is bimodal antigen recognition that is unique among virus neutralizing antibodies. Cross-reactivity is acquired primarily by heavy chain recognition of conservative sites, and neutralization is achieved by light chain recognition of RBS (FIGS. 5-2C and 6-7B). Important contact sites that allow high affinity binding by NT-193 are R403 and K417 at the CoV / CoV2 conservative site. The non-conservative nature of these amino acids is probably due to the lack of NT-193 cross-reactivity to MERS (P403 and P417) (FIGS. 5-2D and 5-2E, and FIG. 6-9).
  • Clade 1b such as SARS-CoV-2
  • Clade 1a such as SARS-CoV
  • Clade 2 HKU3 Clade 3
  • Clade 3 such as BM48-31
  • Neutralized RBS antibodies are often encoded by public VE genes that share a similar binding mode and footprint (references 9 and 10). Such intensive antibody responses can increase the risk of developing antibody escape mutations due to the limited diversity.
  • persistent infections in immunocompromised COVID-19 patients have produced several variants, including those with E484K mutations (reference 29), allowing them to escape from convergent neutralizing antibodies (reference 30). I made it.
  • NT-193 it is desirable to increase broad neutralizing activity against SARS-like CoV, which has the potential for a pandemic circulating in the animal reservoir.
  • the present inventors consider NT-193 to be one of the candidates having such activity through a unique binding mode. Further structural information on the mode of binding can lead a wide range of vaccines and therapeutics to multiple SARS-like CoVs and emerging escape variants.
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  • SEQ ID NO: 21 Synthetic DNA
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  • SEQ ID NO: 32 Synthetic DNA
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Abstract

コロナウイルスのスパイクタンパク質、特に細胞外領域又は受容体結合ドメインのタンパク質に対するヒト抗体を提供する。

Description

コロナウイルスに対する抗体
　本発明は、コロナウイルスに対する抗体であって、ヒト抗体産生マウスを用いて作製した抗体に関する。
　抗体は、癌、関節リウマチなどの治療薬として医療分野で使用されている。例えばトラスツズマブは、癌細胞表面のＨＥＲ２（又はＥｒｂＢ２）に対する分子標的抗体医薬として乳癌の治療に使用されている。また、トシリズマブは、ヒト化抗ＩＬ−６受容体抗体であり、関節リウマチの治療薬に使用されている。
　抗体は、ヒトに投与する際に治療効果及び安全性を高めるために、ヒト抗体であることが望ましい。本発明者は、以前、マウス人工染色体ベクター（Ｍｏｕｓｅ　Ａｒｔｉｃｉｆｉｃａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＭＡＣ）を作製し（特許第５５５７２１７号（特許文献１）、ＷＯ２０１９／１７７１６３号（特許文献２））、当該ベクターにヒト抗体重鎖遺伝子及びヒト抗体軽鎖遺伝子（κ遺伝子及び／又はλ遺伝子）を組み込んで、これをマウスに保持させることにより、完全ヒト抗体産生マウスの作出に成功した（ＷＯ２０１８／０７９８５７号（特許文献３））。
　一方、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）は、現在進行中の新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）によるパンデミック（世界的大流行）を引き起こした新興のコロナウイルスであり、世界中で多数の感染者と死者をもたらした。この人獣共通感染症ウイルスによるパンデミックの広がりを阻止するために、ワクチンや治療薬を見つけ出す取り組みが最優先課題となっている。
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイク（Ｓ）糖タンパク質は、ウイルスの宿主細胞への侵入を促進することから、中和抗体の主な標的であり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２のＳ糖タンパク質を標的とするモノクローナル抗体について報告がある（Ｗａｎｇ１　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ　ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ（２０２０）１１：２２５１（非特許文献１）；Ｐｉｎｔｏ　Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５８３，２９０−２９５，２０２０（非特許文献２））。
　また、新型コロナウイルス感染から回復した患者から、中和活性を有する抗体を取得したことも報告されている（Ｗｕ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１０．１１２６，２０２０（非特許文献３））。
特許第５５５７２１７号 ＷＯ２０１９／１７７１６３号 ＷＯ２０１８／０７９８５７号
Ｗａｎｇ１　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ　ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ（２０２０）１１：２２５１ Ｐｉｎｔｏ　Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５８３，２９０−２９５，２０２０ Ｗｕ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１０．１１２６，２０２０
　しかしながら、コロナウイルスに対する上記の公知抗体よりも、ヒトに安全に適用することができ、さらに親和性、中和活性、血中動態、製造コスト等に優れた抗体の開発が求められる。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒト抗体遺伝子を人工染色体ベクターに搭載したヒト抗体産生マウスを用いることにより、所望の性質を有する抗体を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）コロナウイルスのスパイクタンパク質に対する抗体。
（２）スパイクタンパク質が、細胞外領域又は受容体結合ドメインのタンパク質である（１）に記載の抗体。
（３）スパイクタンパク質のエピトープが、受容体結合ドメインの全長アミノ酸配列のうち、Ｒ４０３、Ｄ４０５、Ｅ４０６、Ｒ４０８、Ｔ４１５、Ｇ４１６、Ｋ４１７、Ｄ４２０、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｌ４５５、Ｆ４５６、Ｇ４８５、Ｙ４８６、Ｎ４８７、Ｙ４８９、Ｑ４９３、Ｓ４９４、Ｙ４９５、Ｇ４９６、Ｑ４９８、Ｎ５０１、Ｇ５０２、Ｖ５０３、Ｇ５０４及びＹ５０５からなる群から選ばれる少なくとも２個のアミノ酸残基である、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）２個のアミノ酸残基がＲ４０３及びＫ４１７である（３）に記載の抗体。
（５）コロナウイルスが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２又はＭＥＲＳ−ＣｏＶである請求項１に記載の抗体。
（６）中和活性が、ウイルスの増殖抑制の指標であるＩＣ５０として１ｎｇ／ｍｌ未満である、（１）~（５）のいずれか１項に記載の抗体。
（７）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４又は１８で示されるものである、（１）~（６）のいずれか１項に記載の抗体。
（８）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１６又は２０で示されるものである、（１）~（６）のいずれか１項に記載の抗体。
（９）（１）~（８）のいずれか１項に記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体。
（１０）抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、（１）~（９）のいずれか１項に記載の抗体。
（１１）（１）~（１０）のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
（１２）コロナウイルス感染症治療のための（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）（１）~（１０）のいずれか１項に記載の抗体を含む、コロナウイルス検出用試薬。
（１４）（１）~（１０）のいずれか１項に記載の抗体を採取された生体試料と接触させる工程を含む、コロナウイルスの検出方法。
　本発明により、コロナウイルスに対するヒト抗体が提供される。本発明の抗体は、完全ヒト抗体産生マウスをコロナウイルスのＳタンパク質を用いて免疫することにより得られた完全ヒト抗体であり、親和性や中和活性に優れており、コロナウイルス感染症などの治療又は予防に有用である。
　［図１］ヒト抗体産生マウスをのＲＢＤによる免疫スケジュールを示す図である。
　［図２］メモリーＢ細胞の分離結果を示す図である。
　［図３］各コロナウイルスに対する抗体の単離結果を示す図である。
　［図４］シュードウイルスを用いた中和活性の測定結果を示す図である。
　［図５−１］２つのＲＢＳ抗体クローンが異なるＳＡＲＳ交差中和活性を示す図である。
　（Ａ）ＣｏＶ２　Ｓ結合モノクローナル抗体は、ヒト抗体のみを発現する免疫マウスからの単一細胞培養アプローチによって確立された。培養液中のモノクローナル抗体の結合指示されたＳおよびＲＢＤ蛋白質にＥＬＩＳＡ法で評価した。培養液中のＣｏＶ２中和活性シュードウイルスシステムを用いて評価した。２つのクローン（＃１０８；ＮＴ−１０８、＃１９３；ＮＴ−１９３）は中和活性を示した。
　（Ｂ）ｈＡＣＥコーティングプレートに結合したＣｏＶ２　ＲＢＤ量を連続希釈ＮＴ‐１０８／ＮＴ‐１９３でプレインキュベーション後に評価した。ｈＡＣＥ２−ＲＢＤ結合に対する抗体媒介阻害をパーセンテージとしてプロットした。
　（Ｃ，Ｄ）ＣｏＶ２に対する中和活性を、シュードウイルス（Ｃ）および真正ウイルス（Ｄ）を用いて評価した。上にＩＣ５０を示す。
　（Ｅ）ＲＢＤ結合プレートを競合抗体でマスクした後、ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３をロードし、マスクされていないＲＢＤへの結合を評価した。
　（Ｆ）ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３のＣｏＶ２　ＲＢＤに対する結合親和性は、ＳＰＲ分析により評価する。
　（Ｇ）ＣｏＶ１に対する中和活性は、シュードウイルスを用いて評価した。
　［図５−２］ＮＴ−１９３　Ｆａｂ−Ｓ−ＲＢＤ複合体の構造を示す図である。
　（Ａ）左。２つの角度でのＮＴ−１９３複合体の概要絵のモデルを示す（赤紫：ＮＴ−１９３重鎖、ピンク：ＮＴ−１９３軽鎖、オレンジ：Ｓ−ＲＢＤ、番号１~３はそれぞれＣＤＲ−１、２、３で示す）。右。ＡＣＥ２−Ｓ−ＲＢＣ複合体の構造（ＰＤＢ：６ｍ０ｊ）角度はＮＴ−１９３複合体の右と同じである。ＡＣＥ２を水色で示す。
　（Ｂ）ＮＴ−１９３複合体（（（Ａと同じ色で着色））と代表的なクラス１抗体複合体、ＣＣ１２．１（濃青色および灰色、ＲＢＳ−Ａサブクラス）およびＣＯＶＡ２−３９（暗色および明褐色、ＲＢＳ−Ｂサブクラス）サブクラスとの比較。左側のモデルは（Ａ）のＮＴ−１９３複合体の右側の１つと同じ角度で示してある。左右の角度はほぼ９０度回転している。
　（Ｃ）Ｓ−ＲＢＤ（灰色）の受容体結合部位（ＲＢＳ）の表面モデルにＣＤＲ結合部位（絵模型、赤紫色とピンク色）を示した。（Ｃ）~（Ｅ）のＲＢＳの角度は同じである。
　（Ｄ）ＲＢＳ上のＡＣＥａｎｄ　ＮＴ−１９３結合部位間の比較。ＡＣＥのみ、ＮＴ−１９３のみおよび両者（重複）の結合領域をそれぞれ水色、赤紫色および黄色で示す。
　（Ｅ）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１とＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２間のＲＢＳの配列番号保存性保存されているもの赤紫色、類似：ピンク色、保存されていないもの：灰色。
　（Ｆ~Ｉ）ＮＴ−１９３のＣＤＲ−Ｈ３（Ｆ）、ＣＤＲ−Ｌ１（Ｇ）、Ｌ鎖のＤＥループ（Ｈ）およびＣＤＲ−Ｈ３（Ｉ）の詳細な認識様式。着色は（Ａ）と同じである。点線は極性相互作用で示す。
　［図５−３］ＮＴ−１９３は変異株にも中和活性を示す図である。
　（Ａ）５０１Ｙ．Ｖ１および５０１Ｙ．Ｖ３ウイルスに対する抗体中和活動を、原ウイルス（ＷＫ−５２１）に対するものと比較した。
　［図５−４］ＮＴ−１９３およびＮＴ−１９３＋ＮＴ−１０８カクテルの予防および治療効果を示す図である。
　（Ａ）ＮＴ−１９３およびＮＴ−１９３＋ＮＴ１０８カクテルの予防効果および治療効果を評価するための実験的デスギンの模式図。
　（Ｂ，Ｄ）指示された用量で予防的（Ｂ）または治療的（Ｄ）ｍＡｂのいずれかを投与されたＣｏＶ２負荷ハムスターの体重を毎日モニターした。
　（Ｃ，Ｅ）指示された用量で予防的（Ｃ）または治療的（Ｅ）ｍＡｂのいずれかを投与されたハムスターの肺組織における、ＣｏＶ２ウイルス負荷量。
　［図６−１］メモリーＢ細胞の単細胞培養によるＣｏＶ２　ＲＢＤ結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の単離方法・過程を示す図である。
　（Ａ）ＴＣ−ｍＡｂマウスからＲＢＤ　ｍＡｂを単離するための実験ワークフローの模式図。
　（Ｂ）ＣｏＶ２（赤色）、ＳＡＲＳ（青色）、ＭＥＲＳ（灰色）由来のＲＢＤに対する血清ヒトＩｇＧ抗体価を、示されているようにいくつかのコロナウイルス抗原によるプライミングおよび連続ブースト後に評価した。
　（Ｃ）ＣｏＶ２　ＲＢＤ結合記憶Ｂ細胞の単一細胞選別
　クラススイッチ記憶Ｂ細胞は、脾細胞からのＭＡＣＳシステムによって濃縮され、続いて蛍光Ａｂおよびプローブによる染色が行われた。クラススイッチ記憶Ｂ細胞中のＣｏＶ２　Ｓ／ＲＢＤ結合記憶Ｂ細胞の頻度は示されたとおりであった。
　［図６−２］ＮＴ−１０８及びＮＴ−１９３の重鎖可変領域（ＶＨ）／軽鎖可変領域（ＶＬ）使用量、変異、クローン型を示す図である。
　重鎖は上図に、軽鎖は下図に示してある。
　［図６−３］Ｓ３０９　ｍＡｂによるｈＡＣＥ２結合阻害を示す図である。
　連続希釈Ｓ３０９（クラス３）ｍＡｂでプレインキュベーションした後、ｈＡＣＥ被覆プレートに結合したＣｏＶ２　ＲＢＤ量を評価した。ｈＡＣＥ２−ＲＢＤ−結合に対する抗体媒介阻害をパーセンテージとしてプロットする。
　［図６−４］いくつかのコロナウイルスＳ−三量体抗原に対するＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３　ｍＡｂの交差反応性を示す図である。
　いくつかのコロナウイルス由来のＳ−三量体抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、段階希釈したＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３の結合を評価した。ヒトＩｇＧ１型を左、ヒトＩｇＧ３型を右の図に示す。
　［図６−５］ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３ＦａｂのＳＡＲＳ−ＣｏＶ　ＲＢＤへの結合のＳＰＲ解析の結果を示す図である。
　ＮＴ−１０８またはＮＴ−１９３の連続希釈Ｆａｂ断片の固定化ＳＡＲＳＣｏＶ−１　ＲＢＤまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ＲＢＤへの結合をＳＰＲ分析により評価した。
　［図６−６］ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３が、ＩｇＧ３サブクラスとの関連において中和活性を増加させることを示す図である。
　（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートを低濃度（０．２μｇ／ｍｌ）および高濃度（５μｇ／ｍｌ）のＣｏＶ２　Ｓ‐三量体でコーティングした。各ＩｇＧサブクラスのＳ‐三量体に結合したＮＴ‐１０８とＮＴ‐１９３の量をＯ．Ｄ．でプロットした。
　（Ｂ，Ｃ）ＣｏＶ２ウイルスに対する中和活性は、シュードウイルス（Ｂ）および真正ウイルス（Ｃ）により測定した。上にＩＣ５０を示す。
　［図６−７］Ｓ−ＲＢＤ複合体の構造比較を示す図である。
　（Ａ）クラス１抗体複合体、ＲＢＳ−Ａ（濃青色および灰色）およびＲＢＳ−Ｂ（暗色および明褐色）サブクラスとのＮＴ−１９３複合体の比較絵のモデルを示した（赤紫：ＮＴ−１９３重鎖、ピンク：ＮＴ−１９３軽鎖、オレンジ：Ｓ−ＲＢＤ）。左のモデルは図２（Ａ）のＮＴ−１９３複合体の右１つと同じ角度で示してある。左右の角度はほぼ９０度回転している。
　（Ｂ）Ｓ−ＲＢＤ上のＮＴ１９３のＣＤＲおよびＤＥループの位置
　（Ｃ）ＮＴ−１９３（左、（Ａ）と同じ色で）、ＲＥＧＮ１０９３３（中央）およびＲＥＧＮ１０９８７（右）とＳ−ＲＢＤ複合体の概要。手書きによる模型の図で示した（緑色：ＲＥＧＮ１０９３３、青色：ＲＥＧＮ１０９８７）。
　［図６−８］ＮＴ−１９３　Ｆａｂ−Ｓ−ＲＢＤ複合体の結合部位を示す図である。
　（Ａ）ＲＢＳ上のＡＣＥ結合部位とＮＴ−１９３結合部位の比較ＡＣＥのみ、ＮＴ−１９３のみおよび両者（重複）の結合領域をそれぞれ水色、赤紫色および黄色で示す。
　（Ｂ~Ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１／Ｌ３（Ｂ）、ＣＤＲ−Ｈ３（Ｃ）、ＣＤＲ−Ｈ１／Ｈ２（Ｄ）のＣＤＲ結合部位を詳しく知る。スティックモデルを示します（赤紫：ＮＴ−１９３重鎖、ピンク：ＮＴ−１９３軽鎖、オレンジ：Ｓ−ＲＢＤ）。点線は極性相互作用として示す。
　［図６−９］Ｓ−ＲＢＤの抗体結合残基のマッピングを示す図である。
　各抗体のＳ−ＲＢＤの結合残基を色分けする。ＣｏＶ−１で保存されていないＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２残基は黄色で示す。報告されている突然変異（ピンク）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１とＣｏＶ−２配列の間の欄に示されている。
　［図６−１０］ＮＴ−１９３の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列を示す図である。
　結合残基は星印で示す。二次構造を示す。
　［図６−１１］ＮＴ−１９３に対するエスケープ変異体のスクリーニングを示す図である。
（Ａ）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスを示された抗体の存在下で３回継代し、続いてエスケープについて検証した。ウイルスＲＮＡは、配列決定のためにＣＰＥを用いてウェルから回収した。ＲＢＤにおける変異アミノ酸残基が示される。　（Ｂ）変異ウイルスに対する中和活性を評価した。
１．概要
　本発明は、コロナウイルスに対する抗体に関する。
　本発明者は、コロナウイルスのスパイクタンパク質に着目し、ヒト抗体遺伝子が導入された完全ヒト抗体産生マウスを用いることにより、当該スパイクタンパク質に対するヒトヒト抗体を作出することに成功した。
　本発明において対象となるコロナウイルスは、重症呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１又はＳＡＲＳ−ＣｏＶという）、中東呼吸器症候群ウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶという）、新型重症呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２又はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２という）である。
　上記抗体の中和活性、親和性、交差反応性、について鋭意検討を行った結果、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に対する中和活性が既存抗体と比較して顕著であることを見出した。また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に特異的なクローン、並びにＳＡＲＳ−ＣｏＶ１及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に交差反応性を示すクローンに加え、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に結合する抗体を見出した。
　本発明の抗体は、スパイクタンパク質の細胞外領域又は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する。そして、コロナウイルス感染の初期段階においても、例えば、血液、唾液、鼻水等の体液中に存在する生きたウイルスを高感度に検出することができる。これにより、コロナウイルスの感染の有無（陽性か否か）を検査することが可能である。
２．コロナウイルスに対する抗体
（１）抗原タンパク質
　本発明の抗体を作製するために抗原として使用するタンパク質は、本発明においてはコロナウイルスのスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）の細胞外領域及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域のタンパク質である。これらのタンパク質は、遺伝子工学的手法により調製することができる。
　ウイルスタンパク質は、マウス、ラット、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のタンパク質でもよいし、遺伝子工学的に生産されたタンパク質でもよい。
　また、抗原とするタンパク質（ポリペプチド）の作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
　ポリペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチド合成法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
　ポリペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを設計及び合成し、所望のＤＮＡ領域を増幅するように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
　例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１及びＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の細胞外領域、及びＲＢＤ領域タンパク質をコードする塩基配列を人工合成する。これに必要に応じてタンパク精製用タグ（例えばＨｉｓｔａｇ）を挿入したベクターに挿入し、発現ベクターを作製する。
　形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
　タンパク質発現用の所定の細胞に上記発現ベクターを遺伝子導入し、培養上清から組換えタンパク質を精製する。精製は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的の抗原タンパク質を単離精製することができる。
　なお、本発明においては、市販の無細胞合成システム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム等を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳により抗原タンパク質を得ることもできる。
　本発明において、抗原として用いるタンパク質としては、下記配列番号に示されるアミノ酸配列の全部でも少なくとも一部でもよく、限定はされないが、細胞外領域の少なくとも一部、あるいは受容体結合ドメインであることが好ましい。
　本発明において、各コロナウイルスのスパイクタンパク質のアミノ酸配列、及び当該タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、本発明において、抗原としては、（ａ）上記配列番号で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ポリペプチド）のほか、（ｂ）当該配列番号で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば１~１０個、１~５個、１~３個、１~２個等）のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、（ｃ）当該配列番号で示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
（２）免疫動物
　本発明において抗体を製造するに際し、免疫の対象となる動物は、特に限定されるものではなく、一般に抗体作製のために用いられるされるマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等を使用することができるが、完全ヒト抗体産生マウス（ＴＣマウス）であることが好ましい。
　本発明者は、トランスクロモソミック（ＴＣ）マウス作製技術により完全長のヒトＩｇ遺伝子座を保持し完全ヒト抗体を産生するマウス作製に世界で初めて成功した（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９７）１６，１３３−１４３；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７）。ここで使用されている人工染色体ベクターはヒト由来であるが、その後の研究により、マウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）を用いたＴＣマウスの作出に成功した（ＷＯ２０１８／０７９８５７号）。
　ここで、マウス人工染色体ベクターとは、天然のマウス染色体から不要な遺伝子を取り除いて短くし、テロメア、セントロメア及び複製起点のみからなるミニ染色体を意味する。このマウス人工染色体ベクターには、クローニングサイトであるｌｏｘＰ配列を導入することができる。マウス人工染色体ベクターは、（ｉ）新たな任意の遺伝子を搭載できる、（ｉｉ）宿主染色体に挿入されず独立して維持され、子孫伝達ができる、（ｉｉｉ）マウスやラットを含む哺乳類細胞において一定のコピー数で長期間安定に保持される、（ｉｖ）導入可能なＤＮＡの長さの制限がない、等の利点を有する。
　目的遺伝子（例えばヒト抗体遺伝子）のマウス人工染色体ベクターへの搭載は、環状インサート型及び染色体転座型の二つのクローニング方法を利用できる（文献：Ｕｎｏ　Ｎ，Ａｂｅ　Ｓ，Ｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｍ，Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ．Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ．２０１８　Ｆｅｂ；６３（２）：１４５−１５６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ１００３８−０１７−０３７８−７．）。
　ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は生殖系列に寄与することが知られているため、目的のヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを導入したこれらの細胞を、マウスの胚の胚盤胞に注入し、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させることによって、トランスクロモソミック（Ｔｒａｎｓ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ：ＴＣ）マウスを作製する。さらに、得られた雌雄のＴＣマウスを交配することによって、その子孫マウス（これらをＴＣマウスという）を作出する（ＷＯ２０１８／０７９８５７号）。
　本発明の一態様において、免疫の対象として、上記ＴＣマウスを使用する。
　完全ヒト抗体産生マウスは、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖（κおよび／またはλ）について、上記ＭＡＣベクターをマウスへ導入し（ＴＣマウスという）、加えてＴＣマウスの内因性マウスＩｇ遺伝子群を破壊することで、作出することができる。
　ヒト抗体産生マウスは、上記公知方法に従って得ることができるが、市販品として得ることもできる（ＴＣ−ｍＡｂＴＭマウス：株式会社Ｔｒａｎｓ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃｓ）。
（３）マウスへのウイルス抗原の免疫
　本発明においては、作製された抗原を動物に投与して免疫を行う。免疫を行う動物として、本発明では例えば完全ヒト抗体産生マウス（ＴＣマウス）を使用することができる。
　前記のようにして作製した抗原タンパク質をそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に動物（例えばＴＣマウス）に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは１μｇ~１０ｍｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１~２週間間隔で、２~２０回免疫を行う。
（４）抗体単離
　免疫された動物（例えばＴＣマウス）から採血を行い、それぞれのウイルスのＳタンパク質（細胞外領域、ＲＢＤ領域）に対する血中ＩｇＧ抗体価をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、ＩｇＧ抗体が誘導されたマウスの脾臓細胞を採取する。採取された脾臓細胞を抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ抗体で処理後、下記抗体、及びＳタンパク質蛍光プローブにより染色し、Ｓタンパク質蛍光プローブに結合する記憶Ｂ細胞をフローサイトメトリーにより分取する。分取した記憶Ｂ細胞を培養し、培養後１０日目の培養上清を回収する。培養の際には、適当なマウスＣＤ４０Ｌ，ＢＡＦＦを発現させたフィーダー細胞上に１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで撒く。また、培地として、各種サイトカイン（例えばマウスＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５）を添加したＲＰＭＩ培地を用いることができる。
　また、本発明においては、通常のハイブリドーマ法によりモノクローナル抗体を作製することも可能である。
　ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳＯ／１などのマウスミエローマ細胞株などが挙げられる。
　そして、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液をで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上０．３個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルにＨＡＴ培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
（５）遺伝子工学的手法による抗体タンパク質の作製
　抗体タンパク質を遺伝子工学的手法により作製する場合は、ＥＬＩＳＡ法によりそれぞれのＳタンパク質への結合性が認められた記憶Ｂ細胞からｃＤＮＡを合成し、抗体遺伝子（重鎖、軽鎖Ｖ領域）をＰＣＲ法によりクローニングする。クローニングした重鎖Ｖ領域をヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３、軽鎖Ｖ領域をヒトＩｇκ又はＩｇλのＣ領域を含む哺乳類発現用ベクターに導入し、それぞれの抗体発現ベクターを作製する。作製した抗体発現ベクターを宿主細胞に遺伝子導入し、培養上清から組換え抗体を精製する。
　本発明の抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体又は抗原結合断片であってもよい。例えば、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト型化抗体、又は完全ヒト抗体であってもよい。本発明の組換え抗体は、重鎖及び軽鎖の組換え発現によって製造することができる。例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ウイルスのＳタンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、その重鎖（Ｈ鎖）定常領域をヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。ヒト型化抗体は、例えば、Ｓタンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から単離した抗体の抗原結合部位の遺伝子をヒト由来の抗体分子に移植することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＳタンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
　本発明により得られた抗体タンパク質は、例えば完全ヒト抗体であり、モノクローナル抗体である。
（６）抗体断片の作製
　本発明においては、上記の通り作製された抗体から断片化することも可能である。
　抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
　例えば、Ｆａｂは、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
　ｓｃＦｖの場合は、抗体の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）及び軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
　ｄｉａｂｏｄｙの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
　ｄｓＦｖの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｓＦｖを製造することができる。
　本発明のヒト抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び当該領域をコードするＤＮＡの塩基配列を以下に示す。
ＴＣ　ｍｉｃｅ　ａｎｔｉ−ＣｏＶ２　ｍＡｂ　ＶＨ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＮＴ−１０８（ＮＴＣＯＶ−１）ＶＨ（配列番号１３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
ＮＴ−１０８（ＮＴＣＯＶ−１）ＶＨ　ＡＡ　ｓｅｑ（配列番号１４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
ＮＴ−１０８（ＮＴＣＯＶ−１）Ｖκ（配列番号１５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
ＮＴ−１０８（ＮＴＣＯＶ−１）Ｖκ　アミノ酸配列（配列番号１６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
ＮＴ−１９３（ＮＴＣＯＶ−２）ＶＨ（配列番号１７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
ＮＴ−１９３（ＮＴＣＯＶ−２）ＶＨ　アミノ酸配列（配列番号１８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
ＮＴ−１９３（ＮＴＣＯＶ−２）Ｖｋ（配列番号１９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
ＮＴ−１９３（ＮＴＣＯＶ−２）Ｖｋ　アミノ酸配列（配列番号２０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
（７）ＥＬＩＳＡによる抗体結合性の確認
　モノクローナル抗体の、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２　ＲＢＤ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１　ＲＢＤ及びＭＡＲＳ　ＲＢＤに対する結合活性は、例えばＥＬＩＳＡ法により測定する。
（８）中和試験
　本発明においては、抗体によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ウイルス感染防御効果を評価するために、ＶＳＶシュードウイルスを用いた中和試験を行うことができる。
　中和試験は、例えば、培地にて段階希釈した抗体（モノクローナル抗体）と、培地で希釈したウイルスＳタンパク質を発現したＶＳＶシュードウイルスとを混合し、培養する。
　ところで、気道内で呼吸器ウイルスを活性化している主要なプロテアーゼの一つはＴＭＰＲＳＳ２（ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼの一種）であることが知られている（Ｓａｋａｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　８８：５６０８−５６１６，２０１４；竹田　誠，ウイルス　６９：６１−７２，２０１９）。そして、遺伝子工学的にＴＭＰＲＳＳ２を恒常発現させたＶｅｒｏ細胞やＶｅｒｏＥ６細胞（Ｖｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞とＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞）が知られている（Ｓｈｉｒｏｇａｎｅ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　８２：８９４２−８９４６，２００８；Ｎａｏ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　１４：ｅ０２１５８２２，２０１９）。最近、これらの細胞株（特にＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞）が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２の分離、増殖に非常に有益であることが明らかになっている（Ｍａｔｓｕｙａｍａ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１１７：７００１−７００３，２０２０）。
　そこで本発明においては、上記培養後、コロナウイルス高感受性細胞（例えばＶｅｒｏ　Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞）に抗体とウイルスとの混合液を添加し、さらに培養する。その後、市販のアッセイシステム又はキットを用いてルシフェラーゼ活性を測定する。
（９）本発明の抗体が認識するエピトープ、及び当該に結合する抗体
　本発明の抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるコロナウイルスＳタンパク質の少なくとも一部であればよく限定はされないが、細胞外領域又は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の少なくとも一部が好ましく、例えば、ＲＢＤである。当該領域を認識する（当該領域と結合する）抗体は、例えば、生体試料中のコロナウイルスに対する中和活性が高く、コロナウイルス感染症の予防又は治療用途に極めて有用なものである。
　本発明の抗体のエピトープとしては、受容体結合ドメインの全長アミノ酸配列（例えば配列番号２）のうち、Ｒ４０３、Ｄ４０５、Ｅ４０６、Ｒ４０８、Ｔ４１５、Ｇ４１６、Ｋ４１７、Ｄ４２０、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｌ４５５、Ｆ４５６、Ｇ４８５、Ｙ４８６、Ｎ４８７、Ｙ４８９、Ｑ４９３、Ｓ４９４、Ｙ４９５、Ｇ４９６、Ｑ４９８、Ｎ５０１、Ｇ５０２、Ｖ５０３、Ｇ５０４及びＹ５０５からなる群から選ばれる少なくとも２個のアミノ酸残基である。
　上記アミノ酸残基のうち、アルファベットはアミノ酸の１文字表記であり、数字は受容体結合ドメインの全長アミノ酸配列のうちアミノ酸の位置である。例えば「Ｒ４０３」は、受容体結合ドメインの全長アミノ酸配列（例えば配列番号２）の４０３番目のアルギニンを意味する。他の位置及びアミノ酸残基についても同様であり、本明細書全体を通してこのように表記することができる。
　本発明の一態様において、本発明の抗体は、Ｒ４０３及びＫ４１７の２つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
（１０）結合親和性及び中和活性
　結合親和性は、結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋ）はＫＡ／ＫＤの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
　結合親和性は、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）を有しており、この解離定数に対し、例えば２~５倍、５~１０倍、１０~１００倍、１００~１０００倍又は１０００~１０，０００倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、コロナウイルスのＳタンパク質の結合親和性に関する解離定数（ＫＤ）が、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１×１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１×１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１×１０−１５Ｍであり、１×１０−１２Ｍ~１×１０−１５Ｍであることがより好ましい。あるいはこれらのＫＤよりも低い値であり高親和性であってもよい。
　ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数（ＫＤ）が、本発明の抗体のＫＤの約１~１００倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
　結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮ　ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）など）。
　本発明の抗体のコロナウイルスに対する中和活性は、ウイルスの増殖抑制の指標であるＩＣ５０として、２ｎｇ／ｍｌ未満（例えば１ｎｇ／ｍｌ未満）である。
３．医薬組成物
　本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を有効成分として含有するものであり、ＳＡＲＳウイルス感染症の予防、治療に有効である。さらに、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させるために、ペプチド化した抗体又はこれらのペプチドとＢＢＢ透過性運搬体との結合体を作製してもよい。
　本発明の抗体は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体または希釈剤等と共に投与することができ、またその投与は１回または数回に分けて行うことができる。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等）を併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
　本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
　投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり０．００１~１０００００ｍｇの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
　経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用することができる。崩壊剤としては、澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸複塩などが挙げられ、結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムなどが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤は錠剤形成に非常に有効である。経口投与用として水性懸濁液又はエリキシルにする場合は、必要により乳化剤、懸濁化剤を併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
　経皮剤の場合には皮膚表面の角質層に多くの微細な孔（穴）を開け、粘着テープに薬物を加えて皮膚に貼り付けることにより従来皮膚から吸収させることができなかった抗体を吸収させることが可能になった。穴の数や大きさ、テープ製剤の組成を調整することで、注射のように短時間で投与することも、長時間かけて薬剤を放出させることも可能になってきている。
４．コロナウイルス検出用又は診断用試薬及びキット
　本発明の検出用又は診断用試薬は、本発明の抗体又はその断片を含有するものである。本発明の抗体は、コロナウイルスに対して特異的に結合することができるため、当該抗体を含む本発明の試薬はコロナウイルス感染症の検出又は診断のために使用することができる。
　本発明における検出又は診断の対象となるコロナウイルスとしては、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１及びＭＥＲＳ−ＣｏＶである。
　本発明の試薬は、本発明の抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、本発明の試薬に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、又は着香料などを指す。
　また別の態様において、本発明は、コロナウイルス感染症の検出用又は診断用試薬の製造のためのコロナウイルスに対するヒト抗体又はその断片の使用を提供する。
５．コロナウイルス感染症の検出又は診断方法
　本発明のコロナウイルス感染症の検出又は診断方法は、本発明のヒト抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料（以下、単に「生体試料」ともいう）とを接触させ、前記試料におけるコロナウイルスタンパク質を検出する工程を含む方法である。この場合、コロナウイルスタンパク質の検出結果とコロナウイルス感染症（コロナウイルス感染の陽性）の可能性とを関連づけることが好ましい。
　本発明において、「被験者」としては、例えばヒト、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。被験者がヒトの場合、被験者には健常者、及びコロナウイルス感染の陽性患者が含まれる。
　また、生体試料としては、例えば、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、体液、排泄物そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。また、生体試料には、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液、排泄物に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、タンパク質の変性等を行うことにより得られた試料も含まれる。生体試料は、体液が好ましく、特に唾液、粘膜、血液であることが好ましい。いずれの生体試料も適切な前処理を行うことによって適用可能である。
　本発明において、「接触」とは、本発明の抗体と被験者から採取された生体試料とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、反応用ウェルにおいて本発明の抗体と生体試料とを混合すること、当該生体試料に本発明の抗体を添加すること、本発明の抗体又は生体試料のいずれか一方を固定した担体に他方を添加すること等が含まれる。
　本発明において、コロナウイルスの検出、発現量の測定又は評価には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、ラテックス凝集法、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）などを利用できる。
　このような検出等に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出、測定及び／又は評価し、その検出、測定又は評価結果とコロナウイルス感染症の可能性等とを関連づけることができる。
　本発明においては、コロナウイルスの検出結果（発現量の測定結果）に基づいて、被験者がコロナウイルス感染症に罹患している可能性の有無（陽性の有無）を診断することができる。
　この場合、本発明の抗体を酵素や蛍光物質で標識することにより反応を蛍光シグナルとして直接検出してもよく、あるいは、本発明の抗体に結合する標識された二次抗体を用いることによりシグナルを間接的に検出してもよい。また、検出方法は、競合法、サンドイッチ法または直接吸着法など、いずれの方法を用いてもよい。そして、反応の強さや、反応させたサンプル中の全体のウイルスの中で、抗体と結合したウイルスの割合を測定し、予め設定した基準値や指標をｃｕｔ−ｏｆｆ値として定め、ｃｕｔ−ｏｆｆ値と比較することによって、コロナウイルス感染症に罹患している可能性を判定又は診断することができる。
　ｃｕｔ−ｏｆｆ値は、例えば、次のようにして求めることができる。まず、コロナウイルス陽性患者由来の生体試料におけるコロナウイルスの発現量、及び健常者由来の生体試料におけるコロナウイルスの発現量を測定する（この場合検出限界以下であることが予想される）。このとき対象となる患者の例数は、それぞれ２例以上であり、例えば、１０例以上、１００例以上である。そして、陽性患者由来の生体試料群と健常者由来の生体試料群の両方から、コロナウイルスの発現量のｃｕｔ−ｏｆｆ値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、ロジスティック回帰分析法、ＲＯＣ曲線を使用する方法などを用いることができる。
　本発明において、血液試料料中のコロナウイルスのＳタンパク質（細胞外領域）の発現量の臨界値（ｃｕｔ−ｏｆｆ値）は、血清中濃度として適宜設定することができる。
　上記条件下でコロナウイルスＳタンパク質の発現量を測定した場合において、発現量が上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値以上であるときに、コロナウイルスが検出されたと判定でき、又は被験者がコロナウイルス陽性の可能性があると診断することができる。
　本発明において、コロナウイルスのＳタンパク質を検出したときの当該検出結果の確からしさ（確率）は、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、好ましくは９９％以上である。
　上記検出結果は、例えば、コロナウイルス感染症の検査又は治療効果の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。
　すなわち、本発明は、コロナウイルスのＳタンパク質に対するヒト抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるコロナウイルスのＳタンパク質を検出する工程を含む、コロナウイルス感染症の検出又は診断を補助する方法も提供する。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
１）リコンビナント抗原の作製
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２、ＳＲＡＲ−ＣｏＶ１及びＭＥＲＳ−ＣｏＶのリコンビナントＳタンパク質の細胞外領域、及びＲＢＤ領域タンパク質の塩基配列を人工合成後、タンパク精製用タグ（９ｘＨｉｓｔａｇ）を挿入した哺乳類発現用ベクター（ｐＣＭＶ　ｖｅｃｔｏｒ）に挿入し、それぞれのリコンビナントタンパク質発現ベクターを作成した。Ｅｘｐｉ２９３細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に作製した発現ベクターを遺伝子導入し、３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ振とう培養で５日間培養した。
　培養上清から、それぞれのリコンビナントタンパク質を、ＴＡＬＯＮカラム（クロンテック社）にて精製した。
２）完全ヒト抗体産生マウス（ＴＣマウス）へのリコンビナントウイルス抗原の免疫
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２リコンビナントＳタンパク質（細胞外領域、ＲＢＤ領域）１０μｇを不完全フロイントアジュバント１００μｌ、及びＰｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化したＣｐＧ（ＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧ（配列番号２１））　１０μｇと混合した溶液を、完全ヒト抗体産生マウス（ＴＣマウス）の腹腔内へ注射した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１リコンビナントＳタンパク質（細胞外領域、ＲＢＤ領域）、及びＭＥＲＳリコンビナントＳタンパク質（細胞外領域、ＲＢＤ領域）を同様の方法で調製し２週間おきに追加免疫を行った。
　免疫スケジュールを図１に示す。
３）ＲＢＤ抗原プローブの作製
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１及びＭＥＲＳ−ＣｏＶのリコンビナントＳタンパク質（細胞外領域、ＲＢＤ領域）に蛍光色素（ＰＥ（同仁堂）、ＡＰＣ（同仁堂）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ａｂｃａｍ社）を結合させ、蛍光プローブ化した。
４）ＴＣマウスからのＳタンパク結合性記憶Ｂ細胞の分取とモノクローナル抗体単離
　ＴＣマウスから採血を行い、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１及びＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質（細胞外領域、ＲＢＤ領域）に対する血中ＩｇＧ抗体価をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、すべてのＳタンパク質へＩｇＧ抗体が誘導されたマウスの脾臓細胞を採取した。
　脾臓細胞を抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ抗体で処理後、下記抗体、及びＳタンパク質蛍光プローブにより染色し、Ｓタンパク質蛍光プローブに結合する記憶Ｂ細胞をフローサイトメトリーにより分取した。
　分取した記憶Ｂ細胞をマウスＣＤ４０Ｌ，ＢＡＦＦを発現させたフィーダー細胞上に１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで撒き、マウスＩＬ−２（４ｎｇ／ｍＬ），ＩＬ−４（２ｎｇ／ｍＬ），ＩＬ−５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養し、培養後１０日目の培養上清を回収した。
５）抗体タンパクの作製
　ＥＬＩＳＡ法によりそれぞれのＳタンパク質への結合性が認められた記憶Ｂ細胞からｃＤＮＡを合成し、抗体遺伝子（重鎖、軽鎖Ｖ領域）をＰＣＲ法によりクローニングした。
　ｃＤＮＡの合成は以下の通り行った。
　細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調整したＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＶＩＬＯＴＭ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡ合成（４２℃、１２０分）を行った。
　ＰＣＲは，以下の試薬及びサイクル条件により行った。
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、９８℃（５秒）、５５℃（５秒）、７２℃（３０秒）、３０サイクルの条件で増幅を行った。
　クローニングした重鎖Ｖ領域をヒトＩｇＧ１、軽鎖Ｖ領域をヒトＩｇｋａｐｐａもしくはＩｇｌａｍｂｄａのＣ領域を含む哺乳類発現用ベクター（ｐＩｇ　ｖｅｃｔｏｒ）に導入し、それぞれの抗体発現ベクターを作成した。
　作製した抗体発現ベクターをＥｘｐｉ２９３細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に遺伝子導入し、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇを用いてリコンビナント抗体を精製した。
６）ＥＬＩＳＡによる抗体結合性の確認
　ＥＬＩＳＡ法により、モノクローナル抗体の、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２　ＲＢＤ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１　ＲＢＤ及びＭＡＲＳ−ＣｏＶ　ＲＢＤに対する結合を測定した。以下、ＥＬＩＳＡ法の詳細な実施例を示す。
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２　ＲＢＤ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１　ＲＢＤ又はＭＡＲＳ−ＣｏＶ　ＲＢＤをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ　７．３）に溶解し、９６ウェルプレートに５０μＬずつ添加した。４℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水にて各ウェルを３回洗浄し、１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を１１０μｌずつ添加した。室温で１時間半静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含む）にて各ウェルを３回洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液にて段階希釈したモノクローナル抗体を５０μＬずつ添加した。４℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含む）にて各ウェルを３回洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温で１時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含む）にて各ウェルを３回洗浄し、基質としてクエン酸緩衝液（ｐＨ　５．０）２０ｍＬにｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ　ｔａｂｌｅｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）１０ｍｇと８μＬの３０％過酸化水素水（和光純薬工業）を加えたものを調整し、それを各ウェルに１００μＬずつ添加した。発色後５０μｌの２Ｎ硫酸（和光純薬工業）で反応を止め、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ　４５０型（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて４９０ｎｍの吸光値を測定した。
７）中和試験
　モノクローナル抗体によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ウイルス感染防御効果を評価するために、ＶＳＶシュードウイルスを用いた中和試験を行った。以下に中和試験の詳細な実施例を示す。
　ＤＭＥＭ培地（１０％仔牛血清と０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）にて段階希釈したモノクローナル抗体と、ＤＭＥＭ培地で希釈したＣｏＶ２　Ｓタンパク質を発現したＶＳＶシュードウイルスを混合し、インキュベーター（５％　ＣＯ２、３７℃）内で１時間反応させた。培養後、９６ウェルプレートにて培養したＶｅｒｏ　Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に抗体とウイルスの混合液を添加した。インキュベーター（５％　ＣＯ２、３７℃）内で２４時間培養した後、１０μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、ＧｌｏＭａｘ　ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図２~４に示す。
　図２は、メモリーＢ細胞の分離結果を示す図である。図３は、各コロナウイルスに対する抗体の単離結果を示す図である。図４は、シュードウイルスを用いた中和活性の測定結果を示す図である。
　図３において、＃１０８（ＮＴＣＯＶ２−１）はＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に特異的であり、＃１９３（ＮＴＣＯＶ２−２）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２／ＣｏＶ１に交差反応を示す。
　図４において、各抗体のＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に対する中和活性のＩＣ５０は、ＮＴＣＯＶ２−１は１．３ｎｇ／ｍＬ、ＮＴＣＯＶ２−２は０．５６ｎｇ／ｍＬ、ＶＨＨ７２は５２ｎｇ／ｍＬ、Ｂ３８は３４６０ｎｇ／ｍＬ、Ｈ４は４２６ｎｇ／ｍＬであった。
　また、各抗体のＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する中和活性のＩＣ５０は、ＮＴＣＯＶ２−２は１３ｎｇ／ｍＬであった。
［実施例２］
中和幅及び逃避耐性を増加させるためのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体のバイモーダルストラテジー（二峰性戦略）
（１）概略
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の受容体結合部位（ＲＢＳ）は強力な中和抗体の重要な標的であるが、エピトープの変異性は複数のコロナウイルスの交差中和および逃避変異体に対する耐性を妨げる。今回、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルスとＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスの両方を超強力に交差中和するヒトＲＢＳ抗体を同定した。交差中和は、保存部位への重鎖およびＲＢＳへの軽鎖の二峰性結合によって達成された。ユニークな結合様式は超可変領域との最小の相互作用を通して広範なＲＢＳマスキングを可能にし、関心のある新興変異体を含む抗体逃避変異体に対する耐性を増強した。さらに、抗体処置は、予防的および治療的設定下でハムスターモデルにおいて保護を提供した。本実施例はでは、広範に中和する治療薬およびワクチンを意味する広範かつ強力な中和活性を獲得するための新規な抗体戦略を明らかにする。
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（ＣｏＶ２）パンデミックは、２０２１年１月２７日現在（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ）、世界中で１億以上の感染症を引き起こし、２００万人以上が死亡している。回復期の個体およびヒト化マウスから、４００を超えるＣｏＶ２中和抗体が単離されており（参考文献１）、エピトープ構造のいくつかは、有効なワクチンおよび治療薬を導くために解決されている（参考文献２）。超強力な中和抗体の代表的な標的は、ヒト細胞のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と直接接触するスパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合部位（ＲＢＳ）である（参考文献３）。ＣｏＶ２とＳＡＲＳ−ＣｏＶ（ＣｏＶ１）を含む他のコロナウイルス（ＣｏＶ）間のＲＢＳ配列の保存性が低いと、複数のＣｏＶに対するＲＢＳ抗体による交差中和の可能性が低下する。さらに、既存のＲＢＳ抗体は、単剤療法の使用下でエスケープ突然変異に感受性である（参考文献４~６）。したがって、このような構造データは新規な抗体療法およびワクチン設計を進歩させるので、中和幅および逃避耐性を有するＣｏＶ２　ＲＢＳ抗体が必要とされている。
（２）材料及び方法
組換えＳタンパク質抗原
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２分離株のスパイク（Ｓ）タンパク質をコードするヒトコドン最適化ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９９４４６７、ヌクレオチド：２１５６３~２５３８４（配列番号２２））を商業的に合成した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）。ＲＢＤ（アミノ酸：３２２~５３６（配列番号２３））を、シグナルペプチド（アミノ酸：１~２０；ＭＩＨＳＶＦＬＬＭＦＬＬＴＰＴＥＳＹＶＤ（配列番号２４））およびヒスチジンタグと共に、哺乳動物発現ベクターｐＣＡＧＧＳにクローニングした。Ｔ４フォールドン三量体化ドメイン、ヒスチジンタグ、およびｓｔｒｅｐ−ｔａｇを含むスパイクタンパク質の可溶性バージョン（アミノ酸：１−１２０１（配列番号３４））を、哺乳類発現ベクターｐＣＭＶにクローニングした。タンパク質のアミノ酸配列を改変して、多塩基性切断部位（ＲＲＡＲからＡ）を除去し、２つの安定化突然変異も導入した（Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ；野生型番号付け）（参考文献３２）。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ３７１５６３、アミノ酸：１５−１１９５（配列番号２５））、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ１９２５０７、アミノ酸：１３−１２９６（配列番号２６））、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００５８３１、アミノ酸：２２−１２９３（配列番号２７））、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００６２１３、アミノ酸：１２−１２９９（配列番号２８））、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００２６４５、アミノ酸：１２−１１０９（配列番号２９））、および
ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００６５７７、アミノ酸：１３−１２９３（配列番号３０））のスパイクタンパク質も、Ｔ４フォールドン三量体化ドメイン、ヒスチジンタグ、およびｓｔｒｅｐ−ｔａｇを含むｐＭＴベクターにクローニングした。
ヒスチジンタグと共にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１（アミノ酸：３１０−５０９）およびＭＥＲＳ−ＣｏＶ（アミノ酸：３６７−６０６）のＳタンパク質のＲＢＤもまた、哺乳動物発現ベクターｐＨＬｓｅｃにクローニングした。位置Ａ４７５Ｖ、Ｅ４８４Ｋ、Ｑ４９３Ｒ、Ｒ３４６Ｓ、Ｎ４４０Ｋ、およびＹ４５３ＦにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＢＤ突然変異体を、関連するヌクレオチド置換およびＲＢＤ発現ベクターに基づくＧｉｂｓｏｎアセンブリ（ＮＥＢ）を導入したプライマーを用いた部位直接突然変異誘発によって作製した。組換えタンパク質を、ショウジョウバエ発現系またはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して産生した。トランスフェクション後５日目にトランスフェクション細胞からの上清を採取し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）および／またはストレプトアクチンセファロース（Ｓｉｇｍａ　ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて組換えタンパク質を精製した。Ｓタンパク質−蛍光色素プローブを作製するために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の組換えＲＢＤおよびＳタンパク質をＡＰＣおよびＰＥ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）と結合させた。
マウスと免疫
ＴＣ−ｍＡｂマウスを、以前に記載されたように確立した（参考文献７）。マウスをアジュバントＡｄｄａＶａｘ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）とともにＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質の組換えＲＢＤ（１０μｇ／ｂｏｄｙ）でｉ．ｐ．免疫化し、２１日間隔でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２およびＭＥＲＳ−ＣｏＶの組換えＲＢＤまたはＳタンパク質で連続的にブーストした。追加免疫後７日目に血清を採取し、抗原特異的ヒトＩｇＧ抗体価を検査した。すべてのマウスをＳＰＦ条件下で維持し、７~１４週齢で使用した。全てのネズミの作業は、日本国立感染症研究所の動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡプレートを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２、およびＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質のＲＢＤ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＢＤ、およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＢＤ突然変異体、Ｅ４８４Ｋ、Ｑ４９３Ｒ、Ｒ３４６Ｓ、Ｎ４４０Ｋ、およびＹ４５３Ｆ、またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ、およびＨＣｏＶ−ＨＫＵ１の三量体Ｓタンパク質のいずれかで２μｇ／ｍｌでコーティングした。いくつかの実験では、コーティング抗原の濃度を０．２μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌに変化させた。１％　ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした後、連続希釈した血清、単一細胞の培養上清、またはｍＡｂをプレートに適用し、次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃：２０４０−０５，１：５０００）と共にインキュベートした。ＨＲＰ活性をＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ）で可視化し、ｉＭａｒｋ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＯＤ４９０を測定した。
フローサイトメトリー解析
ＴＣ−ｍＡｂマウスの脾細胞を抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ　ｍＡｂで前処理し、次いでマウスＣＤ４３、ＣＤ９０、ＣＤ３、ｃ−ｋｉｔ、Ｆ４／８０、Ｇｒ−１、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ９３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３８およびヒトＩｇＤに対するビオチン化ｍＡｂとインキュベートした。クラススイッチ記憶Ｂ細胞を、ストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたＭＡＣＳシステムによって濃縮した。これに続いてＢ２２０−ＢＶ７８６，ＣＤ３８−ＡＦ７００，ＰＥ標識ＣｏＶ２−Ｓ，ＡＰＣ標識ＣｏＶ２−ＲＢＤ，ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｅｆｌｕｏｒ４５０，ＤＡＰＩで染色した。染色した細胞を分析し、ＦＡＣＳＡｒｉａ装置（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて単一細胞で９６ウェルプレートに選別した。
単一細胞培養
フィーダー系細胞（ＮＢ２１．２Ｄ９細胞）を、単一Ｂ細胞選別の１日前に、Ｂ細胞培地（ＢＣＭ；１０％　Ｈｙｃｌｏｎｅ　ＦＢＳ、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および５５μＭ　２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ−１６４０）中、１ウェルあたり１０００ＮＢ２１．２Ｄ９細胞で９６ウェルプレートに播種した。翌日、ＢＣＭ中のマウスＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：２ｎｇ／ｍＬ）を培養物に添加し、マウス／ヒトＢ細胞をウェル当たり１細胞で９６ウェルプレートに直接選別し、次いでフィーダー系細胞と共培養した。培養後、培養上清を回収し、分泌されたｍＡｂのエピトープをマッピングするためにＥＬＩＳＡに供した。また、培養クローンＢ細胞を凍結し、組換えｍＡｂを作るためのＶ（Ｄ）Ｊ配列解析およびＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子回収を行った。
ｍＡｂｓの生成
組換えモノクローナル抗体を、既報の知見に基づいて調製した（参考文献８、３３）。簡潔には、単細胞培養物または公表されたｍＡｂ（ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７、Ｓ３０９）から選択されたＢ細胞サンプルのＶＨ／ＶＬ遺伝子を、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖およびκまたはλ軽鎖発現ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖ベクターの対を、製造者の指示に従ってＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃：Ａ１４５２７）にトランスフェクトした。次いで、プロテインＧカラム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して培養上清から抗体を精製し、ＰＢＳに対する透析後にさらなる分析に供した。
ＡＣＥ２結合阻害
抗体によるＡＣＥ２へのＳＡＲＳ−ＣｏＶ２　ＲＢＤ結合の阻害を決定するために、組換えヒトＡＣＥ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に４℃で一晩コーティングした。１％　ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした後、Ａｖｉｔａｇを有する組換えＳＡＲＳ−ＣｏＶ２　ＲＢＤを、連続希釈抗体と共にＲＴで２時間予備インキュベートした。混合物をＡＣＥ２被覆プレートのウェルに移し、次いで４℃で一晩インキュベートした。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２　ＲＢＤのＡＣＥ２への結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）およびＯＰＤ−基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて開発された。４９０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して読み取った。阻害百分率は（陽性対照のＯ．Ｄ．値試料のＯ．Ｄ．値）／（陽性対照のＯ．Ｄ．値陰性対照のＯ．Ｄ．値）×１００として計算した。半最大有効濃度（ＥＣ５０）を、非線形回帰曲線フィット（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ）を用いて決定した。
ウイルス中和アッセイ
偽ウイルスウイルス中和アッセイのために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ１スパイクタンパク質を有するＶＳＶ　ｐｓｕｅｄｏｖｉｒｕｓを、連続希釈抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。混合物に、９６ウェル固体白色平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種したＶｅｒｏＥ６またはＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を接種し、次いで、５％　ＣＯ２と共に３７℃で２４時間インキュベートした。ＧｒｏＭａｘ　Ｎａｖｉｇａｔｏｒ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｌｉｍｉｎｏｍａｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、培養した細胞におけるルシフェラーゼ活動をブライトグルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。中和パーセンテージは、（ウイルスコントロールシグナル−サンプルシグナル）／（ウイルスコントロールシグナル−細胞のみのコントロールシグナル）×１００として計算した。半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を、非線形回帰カーブフィット（グラフパッドプリズム）を用いて決定した。
真正ウイルス中和試験のために、１００　ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ＪＰＮ／ＴＹ／ＷＫ−５２１株および連続希釈抗体を３７℃で１時間インキュベートした後、９６ウェル平底プレート（ＴＰＰ）に播種したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１９、ＪＣＲＢセルバンク）上に置いた。３７℃、５％　ＣＯ２で５日間培養後、２０％ホルマリン（富士フイルム）で固定し、クリスタルバイオレット液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、Ｅｐｏｃｈ２（Ｂｉｏｔｅｋ）で５９５ｎｍの吸光度を測定した。中和パーセントは、（サンプルシグナル−ウイルス制御シグナル）／（細胞のみの制御シグナル−ウイルス制御シグナル）×１００として計算した。
ＳＰＲ
ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３の全長フラグメントおよびＦａｂフラグメントを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）に溶解した。ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００またはＴ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて行った。ビオチン化したＳ−ＲＢＤタンパク質を、標準的なアミンカップリングキットを使用してアミンカップリングによってストレプトアビジンを固定化したＣＭ５センサーチップあるいはＣＡＰチップ（Ｃｙｔｉｖａ）に流すことにより固定化した。陰性対照タンパク質としてβ２−ミクログロブリンを用いた。ＮＴＣＯＶ抗体を、３０μｌ／分の流速で、固定化Ｓ−ＲＢＤタンパク質上に注入した。データは、ＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン４．１．１、Ｔ２００　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン１．０およびＯＲＩＧＩＮバージョン２０１７ソフトウェアを用いて分析した。
結晶化、データ収集、および構造決定
Ｓ−ＲＢＤ−ＮＴ−１０８錯体の結晶を、２９３Ｋで、シッティングドロップ蒸気拡散法により成長させた。最終結晶化条件は、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　７．５、１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ　８０００、８％（ｗ／ｖ）エチレングリコールであった。結晶を液体窒素中で凍結し、Ｘ線回折実験をフォトンファクトリー（筑波、日本）のビームラインＢＬ−１７Ａで行った。Ｘ線回折データセットをＸＤＳで処理し、ＣＣＰ４プログラムパッケージにおいてＡｉｍｌｅｓｓでスケーリングした。Ｓ−ＲＢＤ構造（ＰＤＢ　ＩＤ：７ｊｍｐ）を探索プローブとするＰＨＥＮＩＸパッケージのＰｈａｓｅｒプログラムを用いた分子置換法により構造を解明し、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅとＣＯＯＴを用いて構造精密化を行った。Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙを用いて構造の立体化学的性質を評価した。図５−２、図６−７及び図６−８は、ＰｙＭＯＬ（ｈｔｔｐ：／／ＰｙＭＯＬ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を用いて調製した。分子間接触原子を、ＣＣＰ４プログラムパッケージにおいてＰＩＳＡおよびＣＯＮＴＡＣＴを用いて分析した。
ｉｎ　ｖｉｖｏ負荷試験
ハムスターモデルにおける抗体処理によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ウイルス感染に対する防御を決定するために、シリアンハムスター（ｉ）にケタミン塩酸塩／キシラジンを腹腔内注射し、次いでＳＡＲＳ−ＣｏＶ２ウイルスＪＰＮ／ＴＹ／ＷＫ−５２１／２０２０に８０μＬの容量で１０４　ＴＣＩＤ５０の投与量で感染させたｉ．ｎ．（鼻腔内）で麻酔した。抗体を、２００μＬの一定体積中、５または１．２５ｍｇ／ｋｇ体重のＰＢＳで希釈し、次いで、予防的処置のためのウイルスチャレンジの２時間前または治療的処置のためのウイルスチャレンジの１日後のいずれかに、腹腔内注射によって投薬した。すべてのハムスターについて、感染後６日まで生存率および体重減少を毎日モニターした。ヒトエンドポイントを、ウイルスチャレンジ時（０日目）の初期体重に対する２５％体重減少として設定した。
ウイルスＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析
ウイルス量は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のヌクレオカプシドゲノムＲＮＡを検出するｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ　ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ５８０　ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ２０５０）を用いて肺ホモジネートから肺の全ＲＮＡを抽出した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ　ＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全肺ホモジネートを調製した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｏｂｅ　ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ　＃２０４４４３）を用いて、次の周期プロトコール：３０分５０℃、１５分９５℃、次いで１５秒９５℃、１分６０℃の４５周期で複製した。ｑＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマーおよびプローブ配列は、順方向：５’−ＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣ−３’（配列番号３１）、逆方向：５’−ＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＧＧＴＣＡＡＣ−３’（配列番号３２）、プローブ：５’ＦＡＭ−ＡＴＧＴＣＧＣＧＣＡＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡ−ＢＨＱ−３’（配列番号３３）である。検量線は、既知のコピー数（１０~１０６コピー／μＬ）を有する精製ＰＣＲ産物の連続１０倍希釈を用いて構築する。
（３）結果及び考察等
本実施例では、マウスＩｇノックアウトバックグラウンド下で、全ヒトＩｇ重鎖およびκ鎖遺伝子座を含む遺伝子操作された染色体を安定に維持するＴＣ−ｍＡｂマウスを利用している（参考文献７）。図６−１に示すように複数の抗原で連続的に免疫化した後、ＣｏＶ２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合するＢ細胞を、前述のように単一細胞培養のために選別した（参考文献８）。高親和性ＣｏＶ２　ＲＢＤバインダーのうち、ＣｏＶ２中和活性は、ＶＳＶベースの偽ウイルスアッセイに基づく２つのクローンから検出された（図５−１Ａ）。１つのクローン（＃１０８）はＣｏＶ２　ＲＢＤに株特異的であり、別のクローン（＃１９３）はＣｏＶ２／ＣｏＶ１　ＲＢＤに交差反応性であった。以下、＃１０８および＃１９３クローンをそれぞれＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３と表記した。
ＲＢＳ抗体はしばしば、公共のＶＨ遺伝子（参考文献９；参考文献１０）によってコードされるが、ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３はそれぞれ、非定型ＩＧＨＶ６−１およびＩＧＨＶ４−３４遺伝子を利用する（図６−２）。ＣＯＶＩＤ−１９患者（２０２１年１月１７日現在）からの６５８のＣｏＶ２　ＲＢＤ抗体のうち、２つのＩＧＨＶ６−１コード抗体のみがＣｏＶ−ＡｂＤａｂデータベースに寄託されている（参考文献１）。対照的に、自己反応抗体（参考文献１１）の代表的なＶＨ遺伝子であるＩＧＨＶ４−３４は、ＣＯＶＩＤ−１９患者（参考文献１２）のＢ細胞からより頻繁に回収され、ＣｏＶ−ＡｂＤａｂデータベース（参考文献１）の１１のＣｏＶ２　ＲＢＤ抗体によって利用された。注目すべきことに、ＣｏＶ１交差反応性は、１１のＶ４−３４にコードされたＲＢＤ抗体（参考文献１３）のうちの２つで検出され、このＶＨ遺伝子がＣｏＶ１交差反応性を促進する可能性がある。
ＲＢＳエピトープは、２つのタイプの分類；１つの分類（参考文献１４）におけるクラス１および２、ならびに別の分類（参考文献２）におけるＡ、Ｂ、およびＣによって細分され得る。さらに、スパイクＲＢＤ内には、クラス３／４またはＳ３０９−潜在性／ＣＲ３０２２−プロテオグリカン部位のいずれかとして示される非ＲＢＳエピトープが存在する。クラス４（ＣＲ３０２２−プロテオグリカン）エピトープは一般に、不十分にまたは非中和クローンによって標的化され（参考文献１５）、それによって、本発明者らは、さらなる分析からこのクラスに対する抗体を除外した。組換えヒトＩｇＧ１／κ抗体を、ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３　ＶＨ／ＶＬ配列に基づいて発現させた。比較のために、ヒト化マウス由来ＲＥＧＮ１０９３３およびヒト由来ＲＥＧＮ１０９８７抗体も調製した（参考文献４）がこれは、抗体カクテルが治療的使用のために動物モデルおよびヒトにおいて有効であるからである（参考文献１６、１７）。さらに、クラス３エピトープに対するＳ３０９抗体を、ＣｏＶ１／ＣｏＶ２交差中和抗体の代表として発現させた（参考文献１５、１８）。ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３の両方のＩｇＧ１は、ヒトＡＣＥ２へのＲＢＤ結合を阻害したが（図５−１Ｂ）、非ＲＢＳ抗体であるＳ３０９は阻害しなかった（図６−３）。それらのエピトープクラスについてのさらなる洞察を得るために、ＲＢＤクラス１−３エピトープが各クラスの代表的な抗体によってマスクされた競合ＥＬＩＳＡを実施した（図５−１Ｃ）。クラス２抗体（Ｃ００２）による強力な競合は、ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３の両方が実際にＲＢＳ抗体であることを強化した。クラス１抗体によるさらなる競合は、ＮＴ−１９３がクラス１および２を包含するエピトープを認識することを示唆する。ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３は、おそらく、互いに競合する際に部分的に重複するエピトープを認識する。重要なことに、両方の抗体はＣｏＶ２偽型ウイルスおよび真正ウイルスに対して非常に強力な中和活性を示し、このＩＣ５０は、ＲＥＧＮ抗体（一桁または二桁ｎｇ／ｍＬ）と同程度に強力である（図５−１Ｄおよび５−１Ｅ）。強力な中和活性は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析によって実証されるように、ＲＢＤに対する顕著な高親和性（見かけの親和性は~１０−１１~−１２Ｍ）によって支持されるよう（図５−１Ｆ）。従って、従来のＶＨ使用ではないにもかかわらず、ＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３の両方は、高度に中和するＲＢＳ抗体である。
ＮＴ−１０８とＮＴ−１９３との間の明確な特徴は、ＣｏＶ１に対する交差反応性である（図５−１Ａ）。本発明者らはさらに、ＭＥＲＳおよび４つの季節性ＣｏＶを含む種々のＣｏＶＳ三量体に対するそれらの交差反応性を調べた（図６−４）。ＮＴ−１０８からはいずれのＣｏＶに対する交差反応性も検出されず、ＮＴ−１９３の交差反応性はＣｏＶ１のみに限定された。注目すべきことに、ＮＴ−１９３はＣｏＶ１　ＲＢＤと高い親和性で結合し（図６−５）、ＣｏＶ２ウイルスと同等の強さでＣｏＶ１を中和した（図５−１Ｇ）。ＣｏＶ１／ＣｏＶ２交差中和抗体はいくつかの群（参考文献１３、１８~２０）から単離されているが、ＣｏＶ１またはＣｏＶ２のいずれか、あるいはその両方に対する中和活性は一般にＮＴ−１９３（６．１ｎｇ／ｍＬ　ＩＣ５０）よりも弱い（〉１００ｎｇ／ｍＬ　ＩＣ５０）。したがって、ＮＴ−１９３は、ＣｏＶ２およびＣｏＶ１ウイルスの両方を強力かつ同等に中和する独特のＲＢＳ抗体である。
個々のＣｏＶ２ビリオン（参考文献２１）の表面には２４±９Ｓの三量体しか提示されていない。このような低密度のＳタンパク質はＨＩＶ−１（参考文献２２）で以前に観察されたように、インターＳタンパク質架橋に必要な抗体による二価結合を妨害する可能性がある。ＨＩＶ−１では、長く柔軟なヒンジ領域をもつＩｇＧ３サブクラスに関連するＥｎｖ結合抗体によって、架橋の上昇が達成された（参考文献２３）。ＣｏＶ２ビリオン上の低密度のＲＢＳエピトープを模倣するために、ＲＢＤタンパク質を非飽和濃度でＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした（図６−６）。その後、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスのＮＴ−１０８およびＮＴ−１９３を、結合結合活性を評価するためにプレートに添加した。サブクラス依存性の差はＲＢＤの飽和濃度に対する結合曲線では観察されなかったが、他のＩｇＧサブクラスと比較して、ＲＢＤの非飽和濃度に結合したＩｇＧ３サブクラスの量が増加した。偽型および真正ＣｏＶ２ウイルスを用いたウイルス中和アッセイにより、ＩｇＧ３サブクラスにおける優れた活性が確認された（図６−６）。
Ｓタンパク質と抗体との相互作用の構造的側面を解明するために、ｘ線結晶解析を行った。Ｓ−ＲＢＤタンパク質とＮＴ−１９３のＦａｂ断片との複合体の結晶を得ることに成功した。錯体の構造を２．８Å分解能で決定した（表２−１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
ＮＴ−１９３は、ＡＣＥ２の結合部位と広く重複するＳ−ＲＢＤの上部領域を認識する（図５−２Ａ）。クラス１／ＲＢＳ−Ａ／Ｂ抗体（参考文献２、１４）もまた、上部領域を認識するが、ＮＴ−１９３の認識様式は明らかに異なるものであり、かつ独特である（図５−２Ｂおよび図６−７Ａ）。特に、ＮＴ−１９３抗体は、ＡＣＥ２結合部位に対する認識のために、軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３だけでなく、フレーム領域、ＤＥループも利用する（図５−２Ｃ及び５−２Ｄ、表２−２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
一方、重鎖の突出したＣＤＲ−Ｈ３ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ１とＣＤＲ−Ｈ２のほんの一部と一緒になってＡＣＥ２結合部位に隣接するＣｏＶ１／ＣｏＶ２保存領域と結合する（図５−２Ｅ及び５−２Ｆ、並びに図６−８及び図６−９）。これらの構造的特徴は、抗体複合体の非定型的な結合様式であり（図６−７Ｂ）、おそらく、強力な中和活性およびＣｏＶ２およびＣｏＶ１に対する交差反応性に寄与するものである。。
ＣＤＲ領域の結合界面について詳細に見ると（表２−３）、ＣＤＲ−Ｌ３に関しては、Ｐｈｅ−９４がＳ−ＲＢＤのＴｙｒ−４４９とπ−π相互作用を行う（図５−２Ｇ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
さらに、Ｓ−ＲＢＤのＴｙｒ５０５は、ＣＤＲ−Ｌ３のＴｒｐ９７およびＬｅｕ９５、ならびにＣＤＲ−Ｈ１のＴｙｒ３３を含む疎水性パッチによって囲まれている（図６−８Ｂ）。一方、ＣＤＲ−Ｌ１のＴｙｒ３３はＬｅｕ４５５と疎水性相互作用を行い、Ｌｙｓ４１７およびＴｙｒ４５３と極性相互作用を行う（図５−２Ｈ）。興味深いことに、ＤＥループの主鎖はＳ−ＲＢＤと水素結合し、Ｔｙｒ−４８９とＰｈｅ−４８６の間にも挟まれている（図５−２Ｃ及び５−２Ｉ）。次に、重鎖ＣＤＲ−Ｈ３では、大きな疎水性相互作用が観察され、ＣｏＶ−１／２保存領域を認識する３つの連続チロシン、Ｔｙｒ−１０３、Ｔｙｒ−１０４、Ｔｙｒ−１０５（図５−２Ｆ）が含まれる。特に、Ｔｙｒ−１０４は深く突出し、Ｓ−ＲＢＤのＬｙｓ−４１７およびＡｒｇ−４０３とπ−カチオン相互作用をする（図６−８Ｃ）。以上により、ＮＴ−１９３の軽鎖のＣｏＶ２　Ｓ−ＲＢＤ上のエピトープはＡＣＥ２結合部位の大部分をカバーし、一方、その重鎖のＣＤＲ−Ｈ３は膜融合前三量体の形成に関連するであろうＣｏＶ−１／２保存領域を認識する（図６−８Ａ）。他の報告されている抗体の重鎖とは対照的に、ＮＴ−１９３は脆弱性の部位を必要最小限のフットプリントで選択的に標的とし、強力な中和活性と交差反応性の両方を可能にしている（図６−９）。
近年、いくつかの変異株が出現し、懸念される変異株（ＶＯＣ）と呼ばれる病原性、伝播性、抗原性が潜在的に交代している。次に、いくつかのＶＯＣ株（５０１Ｙ．Ｖ１から３株、５０１Ｙ．Ｖ３から１株）に対するＮＴ−１９３の交差中和活性を評価した（図５−３Ａ）。５０１Ｙ．Ｖ３株はモノ治療用途（参考文献２５）により、ＲＥＧＮ１０９３３やＬＹ−ＣｏＶ５５５を含むＲＢＳ抗体の中和活動を１０−１０００倍減少させるＥ４８４Ｋミューテーションを持っていることに注意する必要がある。さらに、５０１Ｙ．Ｖ３株はＲＥＧＮ１０９３３およびＬＹ−ＣＯＶ０１６（参考文献４，２６，２７）からの脱出を可能にするベアＫ４１７のミューテーションを有している。これらの突然変異にもかかわらず、ＮＴ−１９３は、元の武漢株を中和するために必要とされるより低い濃度であっても、これらのすべてのＶＯＣを中和した（データーは提出前にＩＣ５０に置き換えられる）。これらのデータは、従来のＲＢＳ抗体からの逃避突然変異の出現に対するＮＴ−１９３の耐性の増加を強調している。
シリアンハムスターモデルを用いて、ＮＴ−１９３単独療法またはＮＴ−１０８／ＮＴ−１９３のカクテルの予防的および治療的有効性を検討した。このカクテルは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ逃避スクリーニング下で逃避変異体の出現を防止した（図６−８）。ハムスターにＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を鼻腔内（治療的）攻撃接種する２時間前（予防的）または１日後（治療的）に２用量（５ｍｇ／ｋｇおよび１．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した（図５−４Ａ）。単剤投与またはそのカクテルによる予防は、感染後６日目までハムスターの重度の体重減少を予防した（図５−４Ｂ）。その予防効果は１．２５ｍｇ／ｋｇよりも５ｍｇ／ｋｇの抗体の方が顕著であり、その効果は感染後２日目という早期に明らかとなった。処置群と未処置群との間の体重の差は、後の時点でさらに拡大した。予防と同様に、全ての治療処置は感染後６日目までにハムスターの体重減少を予防した（図５−４Ｃ）が、その効果は予防効果と比較してわずかに減弱した。また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２による肺の病態に対する予防効果および治療効果も評価した。６日目では単剤投与またはカクテル投与にかかわらず、抗体投与ハムスターの肺は対照ハムスターの肺よりも炎症性損傷が少なかった（図５−４Ｄおよび図６−９）。
ＮＴ−１９３結合様式の明確な特徴は、ウイルス中和抗体の間でユニークである二峰性抗原認識である。交差反応性は主に保存部位の重鎖認識によって獲得され、中和はＲＢＳの軽鎖認識によって達成される（図５−２Ｃおよび図６−７Ｂ）。ＮＴ−１９３による高親和性結合を可能にする重要な接触部位は、ＣｏＶ／ＣｏＶ２保存部位におけるＲ４０３およびＫ４１７である。これらのアミノ酸における非保存性は、おそらく、ＭＥＲＳに対するＮＴ−１９３交差反応性の欠如の原因である（Ｐ４０３およびＰ４１７）（図５−２Ｄ及び５−２Ｅ、並びに図６−９）。対照的に、クレード１ｂ（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２など）、クレード１ａ（ＳＡＲＳ−ＣｏＶなど）、クレード２　ＨＫＵ３、およびクレード３（ＢＭ４８−３１など）ウイルスにおけるこれらのアミノ酸の相対的保存性は、複数のクレード（参考文献２８）におけるこれらのＳＡＲＳ様ウイルスに対するＮＴ−１９３の広範なカバーを意味している。
中和ＲＢＳ抗体は、類似の結合様式およびフットプリントを共有する公共のＶＨ遺伝子によってしばしばコードされる（参考文献９、１０）。このような集中的な抗体応答は限定された多様性のために、抗体エスケープ突然変異を生じるリスクを増加させることができる。実際、免疫不全に陥ったＣＯＶＩＤ−１９患者における持続性感染はＥ４８４Ｋミューテーションのあるもの（参考文献２９）を含むいくつかの変種を生み出し、収束中和抗体（参考文献３０）からの脱出を可能にした。新興のＶＯＣはＥ４８４Ｋミューテーション（参考文献３１）を保有しており、ワクチン誘発型免疫と治療用抗体からのウイルス脱出の懸念を引き起こしている。そのため、エスケープ変異に抵抗性のある対策を講じる必要がある。さらに、動物リザーバー中を循環しているパンデミックの可能性を有するＳＡＲＳ様ＣｏＶに対する広範な中和活性を増加させることが望ましい。本発明者らは、ＮＴ−１９３がユニークな結合様式を介してこのような活性を有する候補の１つと考える。結合様式に関するさらなる構造情報は、広範囲のワクチンおよび治療薬を、複数のＳＡＲＳ様ＣｏＶおよび出現しつつある脱出変異体に導くことができる。
（４）参考文献
　本実施例中に記載の参考文献１~３３の詳細を以下に示す。
　参考文献１．Ｍ．Ｉ．Ｊ．Ｒａｙｂｏｕｌｄ，Ａ．Ｋｏｖａｌｔｓｕｋ，Ｃ．Ｍａｒｋｓ，Ｃ．Ｍ．Ｄｅａｎｅ，ＣｏＶ−ＡｂＤａｂ：ｔｈｅ　Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２０２０）．
　参考文献２．Ｍ．Ｙｕａｎ，Ｈ．Ｌｉｕ，Ｎ．Ｃ．Ｗｕ，Ｉ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ　ｂｙ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，（２０２０）．
　参考文献３．Ｌ．Ｐｉｃｃｏｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　Ｓｉｔｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｄｏｍａｉｎ　ｂｙ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｇｕｉｄｅｄ　Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｓｅｒｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ　１８３，１０２４−１０４２．ｅ１０２１（２０２０）．
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　参考文献５．Ｑ．Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　Ｓｐｉｋｅ　ｏｎ　Ｖｉｒａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ　１８２，１２８４−１２９４．ｅ１２８９（２０２０）．
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　参考文献７．Ｈ．Ａ．Ｓａｔｏｆｕｋａ，Ｓ．；Ｍｏｒｉｗａｋｉ，Ｔ．；Ｏｋａｄａ，Ａ．；Ｋａｚｕｋｉ，Ｋ．；Ｔａｎａｋａ，Ｈ．；Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｋ．；Ｈｉｃｈｉｗａ，Ｇ．；Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．；Ｔａｋａｙａｍａ，Ｈ．；Ｎａｋａｙａｍａ，Ｙ．；Ｈａｔａｎｏ，Ｓ．；Ｂａｂａ，Ｙ．；Ｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．；Ｋａｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ　ｍｉｃｅ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｍｅｇａｂａｓｅ−ｓｉｚｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｌｏｃｉ．Ｐｒｅｐｒｉｎｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ　１）ａｖａｉｌａｂｌｅ　ａｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｑｕａｒｅ，（２０２０）．
　参考文献８．Ｙ．Ａｄａｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｏｆ　ａｎ　ｏｃｃｌｕｄｅｄ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｄｒｉｖｅｓ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　１０，３８８３（２０１９）．
　参考文献９．Ｄ．Ｆ．Ｒｏｂｂｉａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ｉｎ　ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ　５８４，４３７−４４２（２０２０）．
　参考文献１０．Ｍ．Ｙｕａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｓｈａｒｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３６９，１１１９−１１２３（２０２０）．
　参考文献１１．Ｃ．Ｍ．Ｔｉｐｔｏｎ，Ｊ．Ｒ．Ｈｏｍ，Ｃ．Ｆ．Ｆｕｃｉｌｅ，Ａ．Ｆ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｉ．Ｓａｎｚ，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　Ｂ−ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：Ａ　Ｂ−ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ　ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｖ　２８４，１２０−１３１（２０１８）．
　参考文献１２．Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｔｒａｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　Ｂ　ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ｉｎ　ＣＯＶＩＤ−１９．Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２１，１５０６−１５１６（２０２０）．
　参考文献１３．Ｓ．Ｊ．Ｚｏｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｒａｐｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐａｎｅｌ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ｓｐｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２６，１４２２−１４２７（２０２０）．
　参考文献１４．Ｃ．Ｏ．Ｂａｒｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｉｎｆｏｒｍ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ　５８８，６８２−６８７（２０２０）．
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［配列表フリーテキスト］
　配列番号２１：合成ＤＮＡ
　配列番号２４：合成ペプチド
　配列番号３１：合成ＤＮＡ
　配列番号３２：合成ＤＮＡ
　配列番号３３：合成ＤＮＡ

Claims (14)

  1. コロナウイルスのスパイクタンパク質に対する抗体。
  2. スパイクタンパク質が、細胞外領域又は受容体結合ドメインのタンパク質である請求項１に記載の抗体。
  3. スパイクタンパク質のエピトープが、受容体結合ドメインの全長アミノ酸配列のうち、Ｒ４０３、Ｄ４０５、Ｅ４０６、Ｒ４０８、Ｔ４１５、Ｇ４１６、Ｋ４１７、Ｄ４２０、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｌ４５５、Ｆ４５６、Ｇ４８５、Ｙ４８６、Ｎ４８７、Ｙ４８９、Ｑ４９３、Ｓ４９４、Ｙ４９５、Ｇ４９６、Ｑ４９８、Ｎ５０１、Ｇ５０２、Ｖ５０３、Ｇ５０４及びＹ５０５からなる群から選ばれる少なくとも２個のアミノ酸残基である、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. ２個のアミノ酸残基がＲ４０３及びＫ４１７である請求項３に記載の抗体。
  5. コロナウイルスが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２又はＭＥＲＳ−ＣｏＶである請求項１に記載の抗体。
  6. 中和活性が、ウイルスの増殖抑制の指標であるＩＣ５０として１ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項１~５のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４又は１８で示されるものである、請求項１~６のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１６又は２０で示されるものである、請求項１~６のいずれか１項に記載の抗体。
  9. 請求項１~８のいずれか１項に記載の抗体が結合するエピトープに結合する抗体。
  10. 抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項１~９のいずれか１項に記載の抗体。
  11. 請求項１~１０のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
  12. コロナウイルス感染症治療のための請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 請求項１~１０のいずれか１項に記載の抗体を含む、コロナウイルス検出用試薬。
  14. 請求項１~１０のいずれか１項に記載の抗体を採取された生体試料と接触させる工程を含む、コロナウイルスの検出方法。
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