JP6315478B2 - 薬物代謝酵素誘導および細胞毒性の評価方法、ならびにそのためのベクターおよび細胞 - Google Patents
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Description
(ア)前記ベクターを含む細胞を培養する工程、および
(イ)工程(ア)における培養の際の前記細胞中の第1のレポーター遺伝子の発現量を指標として細胞を選択する工程
を含む方法によって選択された、細胞を提供するものである。
(a)前記の細胞中の第1のレポーター遺伝子の発現を評価する工程、および
(b)前記の細胞と被験物との接触の前後における、前記の細胞中の第2のレポーター遺伝子の発現の変化を評価する工程
を含む、方法を提供するものである。
(1)CYP3A4およびCYP3A7のタンパク質翻訳領域(ORF)を含む細菌人工染色体の作製:
11.6kbのBACクローンベクターpBACe3.6のEcoRIサイトに、CYP3A4からCYP3A7にいたる遺伝子発現制御領域の全長123,778bpを挿入した、CYP3A4およびCYP3A7の遺伝子発現制御領域およびタンパク質翻訳領域を含む細菌人工染色体であるRP11−757A13BACを以下の実験に用いた。BACクローンRP11−757A13の塩基配列は、GenBankにおいて、登録番号AC069294.5として開示されている。
a.DsRed置換用ベクターの作製:
pDsRed−Express−1ベクターを基本ベクターとし、DsRed遺伝子のORF直前にあるBglII−SalI部位にhCYP3A7の5’領域(left arm、LA)を挿入し、カナマイシン耐性遺伝子の直後のBsaI部位にCYP3A7の3’領域(right arm、RA)を挿入することで、DsRed置換用ベクターであるLA−DsRed−pA−RA CYP3A7ノックイン(以下、単にKIともいう)ベクターを構築した。
pHygEGFPベクターを基本ベクターとし、pAとアンピシリン耐性遺伝子を含むBglII部位にCYP3A4のLAおよびRAを挿入し、開鎖後にEGFP遺伝子がLAとRAの間に位置するようにして、EGFP置換用ベクターであるLA−EGFP−pA−RA−CYP3A4 KIベクターを構築した。
(a)相同組換え用の細胞への細菌人工染色体の導入:
DY380をLBプレートに線画し、32℃で一晩加温した。コロニーをピックアップして振盪培養(32℃、180−200rpm、14時間)した液を、50mlのLBに移し振盪培養した(32℃、180−200rpm、3〜4時間)。O.D.が0.4になったら振盪を止め、42℃のウォーターバスの中で5分間撹拌し、5分間静止した。氷中に10分静置した後、遠心機でDY380を集めた(4℃、3500rpm、10分)。MQで2回洗浄したあと、前述の200ngのRB11−757A13 BAC DNAと混合し、Gene Pluserでエレクトロポレーションした(1750V、25uF、200Ω、pulse no.1)。32℃で1.5時間回復振盪した後、LBプレートに塗り、32℃で一晩加温した。このようにして、細菌人工染色体RB11−757A13を相同組換え用の細胞であるDY380に導入し、CYP3A4とCYP3A7を共に含む(CYP3A4+/7+)BACクローンを得た。
前述のDsRed置換用ベクターであるLA−DsRed−pA−RA CYP3A7 KIベクターから必要なDNA断片を切り出し、その100ngのDNA断片をエレクトロポレーションにより前述のCYP3A4+/7+ BACクローンに導入し、薬剤添加LBプレートに塗布した。得られたカナマイシン耐性クローンについて、相同組換えを確認するためのプライマーを用いてgenomic PCRを行った。用いたプライマーを表2に示す。すべてのBACクローンにおいて予想した長さのPCR産物が得られた。このようにして、CYP3A7のORFをDsRedに置換したクローンであるCYP3A4+/7R BACクローンを取得した。
前述したLA−EGFP−pA−RA−CYP3A4 KIベクターをXhoIで直鎖化し、得られた直鎖DNAをエレクトロポレーションによって、前述のようにして得たCYP3A4+/7R BAC上のCYP3A4 ORF領域にノックインし、EGFP遺伝子を挿入した。得られたアンピシリン耐性クローンにおいて相同組換えを確認するための9対のプライマーを用いて、genomic PCRを行ったところ、得られた全てのクローンにおいて予想した長さのPCR産物が確認された。このようにして、CYP3A7のORFがDsRedに置換されCYP3A4のORFがEGFPに置換されたBACクローンであるCYP3A4G/7R BACクローンを取得した。なお、genomic PCRに用いたプライマーを上の表2に示す。
Cre/loxPシステムを介してBAC DNAをMAC(マウス人工染色体)または予めloxP配列を挿入された任意の染色体上に搭載するため、公知の方法にしたがって、前述のようにして得たCYP3A4G/7R BAC上にloxP配列をノックインした(Sternberg and Hamilton, 1981; Hoess et al., 1982; Nagy, 2000)。
(1)loxP tg−HepG2の作製:
HPRT exon1−2、loxPおよび薬剤選択用マーカーとしてHyg耐性遺伝子を含むプラスミドベクター(VH21−12#8−3)を制限酵素(NotI)処理して直鎖化した。このベクターのHepG2への導入にはLipofectamine LTX試薬を使用した。まず、5μgVH21−12#8−3を2.5mlOpti−MEMにて希釈し、12.5μgのPLUS試薬を加え、室温で5分静置した。68.75μlのLTX試薬を添加し、室温で25分静置後、HepG2(10cmディッシュ、約1×107)上に添加した。10%ウシ胎仔血清入りD−MEM5mlにて1日培養したのち、HepG2をトリプシン処理により培養皿から剥がし、10cmディッシュ5枚に播種した。ハイグロマイシン(400μg/ml)を培地に添加し、3日おきに培地交換した。ハイグロマイシンの添加から14日目にコロニーを単離して、14番染色体長腕上に1箇所のloxPサイトを持つトランスジェニックHepG2細胞株であるloxP tg−HepG2を取得した。遺伝子の導入は、HPRT exon2末端からハイグロマイシン領域を増幅するプライマーセットを用いてPCRにより確認した。なお、作製にあたりHepG2を細胞培養する場合、培養にはL−グルタミン、フェノールレッド含有D−MEM(High−glucose)にウシ胎仔血清を10%添加したものを使用した。また、継代時は、0.04%EDTA添加0.1%トリプシン溶液を用いて細胞を剥離した。
前述のCYP3A4G/7R−BACをCre−loxPシステムにより前述のloxP TG−HepG2に挿入するため、Lipofectamine LTX試薬を用いてリポフェクションを行った。まず、5μgのCYP3A4G/7R−BACと2μgのpCAG−Creを1.25mlOpti−MEMにて希釈し、6.25μlのPLUS試薬を加え、室温で5分静置した。25μlのLTX試薬を添加し、室温で25分静置後、HepG2(6cmディッシュ、約80%コンフルエント)上に添加した。1日培養したのち、トリプシン処理によりディッシュから剥がし、10cm培養皿3枚に播種した。ネオマイシン(800μg/ml G418)を培地に添加し、3日おきに培地交換し、添加から10日目にコロニーを単離して、loxP tg−HepG2にCYP3A4G/7R BACが導入された細胞株であるCYP3A4G/7R BAC導入HepG2細胞を取得した。安定発現株取得の確認は、BACベクターのEGFPおよびDs−Red領域を増幅する表2のプライマーセットを用いたPCRおよびFISH解析により確認した(図1、ヒト14番染色体長腕基部、矢印)。
前述のCYP3A4+/7R−loxP BACを精製し、Cre酵素発現ベクターと共にリポフェクション法によって、MACを保持するCHO細胞へトランスフェクションした。DsRed、EGFPや、CYP3A4およびCYP3A7の制御領域をgenomic PCRによって確認した。さらにFISH解析を行い、CHO細胞内のMAC、およびそのMACに搭載されたCYP3A4+/7R BACを確認できるクローンとして、CYP3A4+/7R MACを取得した(図2、赤色、MAC;緑、BAC)。同様に、CYP3A4G/7R−loxP BACをCre酵素によってMACへ導入して、CYP3A4G/7R MACクローンを取得した。なお、MACとして、CYP3A4G/7R BAC搭載には、EGFPレポーターのないものを使用した。一方、CYP3A4+/7R BAC搭載には、EGFPレポーターがloxPサイト上流に挿入されているMACを使用した。
実施例3で取得したCHO細胞内のCYP3A4+/7R MACを微小核融合法によってマウスES細胞(TT2F)へ導入した。表2のプライマーを用いて、DsRed、EGFP、CYP3A4やCYP3A7の制御領域をgenomic PCRによって確認した。さらにFISH解析を行い、TT2F細胞内のMAC上にBAC DNAが搭載されたことを確認した(図3−2)。このようにしてCYP3A4+/7R ES細胞を得た。このCYP3A4+/7RES細胞クローンは、TT2Fの核型(39,X0)に準じて、マウス雌の正常核型39、X0、+MACを示した(図3−1)。また、このES細胞は、MAC上のEGFP発現により、緑に光った(図4)。実施例3で取得したCHO細胞内のCYP3A4G/7R MACを導入したマウスA9細胞の作製も、同様の方法によって行った。A9細胞は、CHO細胞よりも微小核細胞融合法に適したMACベクター供与細胞として提供できる。
(1)CYP3A4+/7R ES細胞からのキメラマウスの作製:
実施例4で得たCYP3A4+/7RマウスES細胞を用いて高キメラ産仔を得た。一日目のキメラ個体のあらゆる組織、例えば、肝臓、皮膚、脳、肺、小腸、脾臓、膵臓などがMACベクターに搭載されているEGFP蛍光を示し、CYP3A4+/7R ES細胞の組織発生への寄与を確認できた。一方、CYP3A7発現を反映するDsRed蛍光は、肝臓および小腸で強く観察された(図5、肝臓)。薬物代謝酵素誘導性の試験に適した肝臓細胞はDsRed蛍光を指標として効率的に選択することができた。
(2) CYP3A4+/7R MAC導入マウスの作製:
実施例5(1)で作製したキメラマウスを交配してCYP3A4+/7R MAC導入マウス系統を得た。このCYP3A4+/7Rマウスの生後1日目の肝臓でのDsRed発現を確認した(図17)。
(1)loxP tg−HepaRGの作製:
HPRT exon1−2、loxPおよび薬剤選択用マーカーとしてHyg耐性遺伝子を含むプラスミドベクター(VH21−12#8−3)を制限酵素(NotI)処理して直鎖化した。このベクターのHepaRGへの導入やハイグロマイシン(400μg/ml)耐性クローンの取得は、loxP tg−HepG2の作製と同様に行った。なお、HepaRGを増殖培養する場合、培養液はBIOPREDIC社の増殖専用培地(710 Growth medium: MIL700基本培地にADD710添加剤を加えたもの)のみを用いた。また、継代時は、0.02%EDTA添加0.005%トリプシン溶液を用いて細胞を剥離した。BIOPREDIC社の培養液の組成は非公開になっている。
前述のCYP3A4G/7R−BACをCre−loxPシステムにより前述のloxP TG−HepaRGに挿入するため、Lipofectamine LTX試薬を用いてリポフェクションを行った。このベクターのHepaRGへの導入やネオマイシン(800μg/ml G418)耐性クローンの取得は、loxP tg−HepG2の作製と同様に行った。loxP tg−HepaRGにCYP3A4G/7R BACが導入された細胞株であるCYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞を取得した。安定発現株取得の確認は、BACベクターのEGFPおよびDsRed領域を増幅する表2のプライマーセットを用いたPCRおよびFISH解析により確認した(図10、ヒト15番染色体短腕、または、ヒト16番染色体短腕)。
実施例2で取得したCYP3A4G/7R BAC導入HepG2細胞でEGFPの発現量が高くDsRedの発現量が低い細胞を、Cellmatrix(新田ゼラチン)でコートした6ウェル培養皿(φ35mm)の各ウェルに5×105細胞を播種し、翌日から48時間に、CYP誘導剤として、50μM、100μMのデキサメタゾン(DEX)またはリファンピシン(RIF)を添加した。その結果、CYP3A4G/7R BAC導入HepG2細胞は、CYP誘導剤非添加では、DsRedもEGFPも発現が低いが、CYP誘導剤添加後には、DsRedもEGFPも共に発現量が増加する様子が観察された(図6)。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつデキサメタゾンとリファンピシンの添加によってレポーター遺伝子の発現が観察されたことから、本発明のベクターを用いれば、薬物代謝酵素誘導能を正確に評価できることが分かる。また、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域下のDsRedの発現量が低い細胞は薬物代謝酵素誘導の正確な評価に適していることが分かる。
試験例1と同様の培養条件で、48時間、25μM、50μM、100μMのDEXまたはRIFを添加した場合に、DsRed陽性およびEGFP陽性を判定される細胞数の増加をFACS解析によって試験した。実施例2で作製したBAC挿入前のトランスジェニック細胞株であるloxP tg−HepG2をネガティブコントロールとして用い、その値を1としたときの相対値として結果を図7に示す。CYP3A4G/7R BAC導入HepG2細胞でのEGFP蛍光量の増加は、DEX添加の場合には、非処理の2−3倍の増加であり、RIF添加の場合には非処理の16倍の増加であった。このとき、DsRedも同様に15倍程度に増加していた。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつデキサメタゾンとリファンピシンの添加によってレポーター遺伝子の発現が観察されたことから、本発明のベクターを用いれば、薬物代謝酵素誘導能を正確に評価できることが分かる。また、第2のレポーター遺伝子であるDsRedは、リファンピシンやデキサメタゾンの投与量が多くて細胞毒性が強い条件下において飛躍的に発現が向上しており、細胞毒性のマーカーとして有用であることが分かる。
ヒトCYP3A4およびCYP3A7が移入されたヒト型CYP3Aモデルマウスを用いた70%生体部分肝切除後の肝再生の方法、同じマウスを用いたCYP誘導剤投与による肝障害の方法、および肝障害モデルマウスへのヒト凍結肝臓細胞移植の方法によって、肝臓細胞の障害時におけるCYP3A7の発現を調べた。部分肝切除後の肝再生の方法では、70%の肝臓を紐で結紮して切除後飼育したマウスを作製し、1日目から5日目に順に解剖し肝臓を取得し遺伝子発現を調べた。CYP誘導剤投与による肝障害の方法では、PCN投与群とコーンオイル投与コントロール群のマウスから肝臓を取得し遺伝子発現を調べた。マウス生体内でのヒト凍結肝臓細胞移植の方法では、PhenixBio社からヒト化マウス肝臓の一部を入手し遺伝子発現を調べた。その結果、肝障害後の肝細胞の再生時に、CYP3A7の発現が一過的に増加したことが確認された。
試験例1と同様の培養条件で、48時間、1μM、10μM、25μM、100μMのRIFを添加し、DsRed陽性およびEGFPのエリア総蛍光量を蛍光顕微鏡で測定した。実施例2で作製したBAC挿入前のトランスジェニック細胞株であるloxP tg−HepG2をネガティブコントロールとして用い、その値を1としたときの相対値を図8に示す。CYP3A4G/7R BAC導入HepG2細胞でのEGFP蛍光量の増加は、非処理の35倍まで増加した。このとき、DsRedも同様に10倍程度に増加していた。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつリファンピシンの添加によってレポーター遺伝子の発現誘導が観察されたことから、本発明のベクターを用いれば、細胞培養状態で薬物代謝酵素誘導能を評価できることが分かる。このことは、本発明の細胞を用いることでハイスループットスクリーニング型の薬物代謝酵素誘導評価系を構築できることを示す。
試験例1と同様の培養条件で、48時間、100μMのDEXとRIFを添加した場合に、DsRedおよびEGFPの蛍光量変化と内在性のCYP3A4およびCYP3A7の遺伝子発現量変化に相関がみられるか定量性RT−PCRで解析した。非処理群をネガティブコントロールとして用い、その値を1としたときの相対値として結果を図9に示す。CYP3A4G/7R BAC導入HepG2細胞でのEGFP蛍光量の増加は、C87クローンでDEX処理により非処理の100倍まで増加した。このとき、C6ではEGFPに加えDsRedも同様に増加がみられた。また、内在性のCYP3A7遺伝子発現は、DsRedの発現量変化に極めて類似していた。一方、内在性CYP3A4に比べEGFPの遺伝子発現増加率は高く、誘導率は一致せず高感度であるが、被検物質が発現誘導性を有する可能性を評価することが容易になることが分る。
実施例6で取得したCYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞を2週間(2W)の増殖培養(Growing)後に分化培養(Differentiation)した。なお、HepaRGを増殖培養する場合、培養液はBIOPREDIC社の増殖専用培地(710 Growth medium: MIL700基本培地にADD710添加剤を加えたもの)のみを用いた。一方、分化培養する場合、培養液はBIOPREDIC社の分化専用培地(720 differentiation medium: MIL700基本培地にADD720添加剤を加えたもの)のみを用いた。HepaRGは分化すると小型の肝細胞様細胞となり細胞集団上層に出現する。図11は、この肝細胞様細胞集団はCYP3A4とCYP3A7を共に認識する抗体に対して強陽性であり、いずれかの発現が高いことを示す。HepaRG細胞の培養過程での内在性CYP3A4とCYP3A7の遺伝子発現変化を定量性RT−PCRにより解析したところ、増殖培養14日目、分化培養後1、2、3、7、15日目のHepaRG細胞では、細胞分化に伴うCYP3A7発現の減少とCYP3A4の増加が見られた(図12)。よって、図11で示された細胞集団上層に出現する小型のCYP3A4/7抗体陽性肝細胞様細胞は、CYP3A4を発現する薬物代謝酵素誘導性評価に適した細胞であることが分かる。
実施例6で取得したCYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞クローン(C3)をCellmatrixでコートした96ウェル培養皿に播種し、14日間増殖培養後(G14d)、14日間分化培養した。図13は、分化後5日目(D5d)と10日目(D10d)のCYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞のDsRed陽性細胞数の減少とEGFP陽性細胞量の増加を示している。HepaRG細胞は増殖期には胎児期型肝細胞のレポーターであるDsRedを発現していることから、増殖中は薬物代謝酵素誘導の評価に適さない胎児期型の細胞である。しかし、BIOPREDIC社の分化用培地にて培養すると、CYP3A4に代表される薬物代謝酵素を充分に発現する肝臓細胞になることをEGFPレポーターの発現量を指標として可視化できる。このことから、本発明を用いて薬物代謝酵素誘導性評価に適した細胞を選択できることが分かる。
試験例7で用いたCYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞クローン(C3)の14日間増殖培養後5日間分化培養した細胞(D5d)の蛍光顕微鏡写真を詳細に解析した。胎児肝臓の肝実質細胞は、肝芽細胞でありCYP3A7を発現し、CYP3A4を発現していない。生後、CYP3A7が検出されなくなり、CYP3A4が主要なP450薬物代謝酵素となる。この過程で、1つの細胞がCYP3A7からCYP3A4へ発現シフトを起こすのか、CYP3A7を発現していない別の幹細胞からCYP3A4を発現する細胞が作りだされるのか未だ明らかになっていない。図14で示すように、CYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞は、当初全ての細胞がDsRed陽性であるが、分化に伴ってDsRed発現が消失し、DsRed陰性の細胞の一部からEGFP陽性の細胞が出現することが分かる。CYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞を用いて、CYP3A4陽性の代謝機能が高い肝細胞の発生過程が明らかになれば、ES細胞やiPS細胞などの他の幹細胞から薬物代謝酵素誘導性評価に適した細胞を作り出す細胞分化誘導法に転用できる。
試験例7で用いたCYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞クローン(C3)の増殖培養7日目(G7d)と14日目(G14d)、分化培養後1、3、5、7、10、12日目(D1d、D3d、D5d、D7d、D10d、D12d)のEGFPおよびDsRedのエリア総蛍光量の経日変化を蛍光顕微鏡で解析した結果を図15に示した。同日96ウェル培養皿に播種した6ウェルのエリア総蛍光量を解析した結果、CYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞は、極めて安定に細胞分化に伴うDsRed発現の減少とEGFPの増加を示した。
試験例7で用いたCYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞クローン(C3)の増殖培養14日後、12日間分化培養した細胞に、1%DMSOに溶解したCYP3A4発現誘導性薬剤(RIF:リファンピシン、DEX:デキサメタゾン、CLO:クロトリマゾール、NIF:ニフェジピン、PCN:pregnenolone 16a−carbonitrile)を添加し、48時間後(分化14日目に相当)のEGFPおよびDsRedのエリア総蛍光量を蛍光顕微鏡で解析した(図16)。EGFPは、PCN以外で、発現が誘導された。PCNはげっ歯類のCYP誘導剤として知られ、ヒトではCYP3A4を誘導しないことから、PCNによる非誘導性はヒトでの反応をEGFPで予測できていることを示す例となる。また、細胞障害度が高いCLO、NIF、PCNでDsRed蛍光量の増加がみられ、CYP3A7発現増加が細胞毒性評価の目安となることが分る。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつデキサメタゾンとリファンピシンの添加によって約2倍のレポーター遺伝子の発現が観察されたことから、実施例2で作製したCYP3A4G/7R BAC導入HepG2と同様に、CYP3A4G/7R BAC導入HepaRG細胞を用いれば、薬物代謝酵素誘導能を正確に評価できることが分かる。
実施例5で作製したCYP3A4+/7MAC導入マウスは、生後数週はDsRedを強発現しているが、8週令になると肝臓でのDsRed発現は極めて減少している。このマウスに、DMSOに溶解した5%四塩化炭素を投与し、細胞障害時におけるCYP3A7の発現を3日間観察した。結果、抑制されていた肝臓のDsRed蛍光量が増加することが蛍光顕微鏡で可視化できることが分かる(図18)。CYP3A4+/7R MAC導入マウスでは、EGFPは、細胞にMACが導入されていることを示すマーカーとして機能する。
試験例11で用いた5%四塩化炭素投与CYP3A4+/7R MAC導入マウスおよび非投与(day 0)マウスの肝臓から抽出したRNAを用いて、投与後1日目、2日目、3日目のDsRed発現増加を定量性RT−PCRによって解析した(図19)。CYP3A7−DsRedは、幼弱な肝芽細胞のマーカーであるαフェトプロテイン(Afp)とともに肝毒性後の肝再生マーカーとして利用できることが分る。
Claims (13)
- 被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞を製造するためのベクターであって、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域、第1のレポーター遺伝子、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域、および第2のレポーター遺伝子を含み、ここで、第1のレポーター遺伝子が胎児期特異的遺伝子の発現制御領域の下流に位置し、第2のレポーター遺伝子が薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流に位置し、該薬物代謝酵素遺伝子がCYP3A4であり、該胎児期特異的遺伝子が、CYP3A7である、ベクター。
- レポーター遺伝子が、光シグナルによって検出されるものである、請求項1に記載のベクター。
- レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードするものである、請求項1または2に記載のベクター。
- 被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞であって、請求項1〜3のいずれか1項に記載のベクターを含む、細胞。
- 肝腫瘍細胞由来細胞株に由来する、請求項4に記載の細胞。
- 成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質を有する、請求項4または5に記載の細胞。
- 請求項4〜6のいずれか1項に記載の細胞であって、
(ア)請求項1〜3のいずれか1項に記載のベクターを含む細胞を培養する工程、および
(イ)工程(ア)における培養の際の前記細胞中の第1のレポーター遺伝子の発現量を指標として細胞を選択する工程
を含む方法によって選択された、細胞。 - 工程(ア)における培養が、請求項1〜3に記載のベクターを含む細胞を肝細胞へ分化させるための培養である、請求項7に記載の細胞。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のベクターを含む、非ヒト動物。
- 被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価する方法であって、
(a)請求項4〜8のいずれか1項に記載の細胞中の第1のレポーター遺伝子の発現を評価する工程、および
(b)請求項4〜8のいずれか1項に記載の細胞と被験物との接触の前後における、請求項4〜8のいずれか1項に記載の細胞中の第2のレポーター遺伝子の発現の変化を評価する工程
を含む、方法。 - 工程(b)における第2のレポーター遺伝子の発現の変化の評価が、第2のレポーター遺伝子の発現の継続的な測定結果に基づくものである、請求項10に記載の方法。
- 被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するためのキットであって、請求項1〜3のいずれか1項に記載のベクターを含む、キット。
- さらに、成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質を有する細胞を含む、請求項12に記載のキット。
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