JPWO2018079714A1

JPWO2018079714A1 - ヒト肝前駆細胞の調製方法

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Publication number: JPWO2018079714A1
Application number: JP2018547784A
Authority: JP
Inventors: 毅勝田; 孝広落谷; 山田　哲正; 哲正山田
Original assignee: INTERSTEM CO., LTD.; National Cancer Center Japan
Current assignee: INTERSTEM CO., LTD.; National Cancer Center Japan
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-09-19
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: EP3533865A1; EP3533865A4; US20190302100A1; JP7481721B2; JP2022132606A; JP7134416B2; WO2018079714A1; CN109890956A

Abstract

生体外でヒト成熟肝細胞を、自己複製能をもつ肝前駆細胞へとリプログラミングする方法を提供する。ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することを含む、ヒト肝前駆細胞の調製方法。

Description

本発明は、ヒト肝前駆細胞の調製方法に関する。

重篤な肝疾患に対する有効な治療法は現在肝移植のみであるが、絶対的なドナー不足が問題である。これを代替するために、これまでｉＰＳ細胞から肝細胞を分化誘導し移植治療に用いる試みが続けられてきた。

しかしながら、ｉＰＳ細胞は分化全能性と高い増殖能をもつため、免疫不全マウスへの移植に伴い奇形種を形成するとの報告もあり、ｉＰＳ細胞から肝細胞製作時に未分化ｉＰＳ細胞がわずかでも混入すると移植後に腫瘍ができる危険性が生じる。また、ｉＰＳ細胞を用いた肝臓などの内胚葉細胞への効率的な分化誘導法はいまだ確立されておらず、肝機能を代替えできるほどの肝細胞をｉＰＳ細胞から作成することは現状では不可能である。

これに対して、成体肝臓内にごく少数存在する肝前駆細胞の利用も細胞ソースと考えられてきた。また、最近の研究から、慢性肝炎時に成熟肝細胞が、肝細胞および胆管上皮細胞への二分化能を有する前駆細胞へとリプログラミングされるという事実が明らかとなった（非特許文献１〜４）。

Yanger K. et. al., Genes & Development, pp.719-724, 27, 2013 Tanimizu N. et. al., Journal of Biological Chemistry, pp.7589-7598, 289(11), 2014 Yimlamai D. et. al., Cell, pp.1324-1338, 157, 2014 Tarlow B. D. et. al., Cell Stem Cell, pp.605-618, 15, 2014

本発明は、生体外でヒト成熟肝細胞を、自己複製能をもつヒト肝前駆細胞へとリプログラミングする方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、生体外でヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１（ＴＧＦ−βシグナル阻害薬）及びＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害薬）を含有する培地中で培養することにより、自己複製能をもつヒト肝前駆細胞へとリプログラミングすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記に掲げるヒト肝前駆細胞の調製方法を提供する。
項１．ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することを含む、ヒト肝前駆細胞の調製方法。
項２．前記ヒト成熟肝細胞が乳幼児由来である、項１に記載のヒト肝前駆細胞の調製方法。
項３．前記血清がウシ胎児血清である、項１又は２に記載のヒト肝前駆細胞の調製方法。
項４．ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することにより調製された、ヒト肝前駆細胞。
項５．項４に記載されたヒト肝前駆細胞から誘導された成熟肝細胞。
項６．項５に記載された成熟肝細胞を用いることを含む、被検物質のスクリーニング方法。
項７．項５に記載された成熟肝細胞を用いることを含む、肝炎ウイルスの培養方法。
項８．項５に記載された成熟肝細胞が非ヒト哺乳動物に移植された、ヒト肝臓モデル動物。
項９．ヒト肝前駆細胞又は成熟肝細胞を用いて、被検物質の代謝及び／又は肝毒性を評価するためのキットであって、
ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することにより調製されたヒト肝前駆細胞、又は該ヒト肝前駆細胞から誘導された成熟肝細胞を含む、キット。

本発明により、生体外でヒト成熟肝細胞を、自己複製能をもつ肝前駆細胞へとリプログラミングする方法を提供することができる。

図１は、ヒト成熟肝細胞をＡＣ−Ｆ培地（Ａ）、ＹＡＣ−Ｆ培地（Ｂ）又はＹＡＣ培地（Ｃ）で培養した結果を示す位相差顕微鏡写真である。図２は、ヒト成熟肝細胞をＡＣ−Ｆ培地で培養した結果を示す位相差顕微鏡写真である。図３は、ヒト成熟肝細胞をＡＣ−Ｆ培地又はＦＢＳ培地で培養した結果を示す位相差顕微鏡写真である。図４は、ヒト成熟肝細胞をＡＣ−Ｆ培地又はＦＢＳ培地で培養した結果を示す位相差顕微鏡写真である。図５は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへの肝前駆細胞の投与後における、血中ｈｕｍａｎ特異的アルブミンの経時変化を示すグラフである。図６は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへの肝前駆細胞の投与７０日後における、内側右葉でのＨｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ９の発現を示す免疫染色写真である。図７は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへの肝前駆細胞の投与７０日後における、内側左葉でのＨｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ９の発現を示す免疫染色写真である。図８は、ＴＫ−ＮＯＧマウスへの肝前駆細胞の投与後における、血清中ｈｕｍａｎ特異的アルブミンの経時変化を示すグラフである。図９は、ＴＫ−ＮＯＧマウスへの肝前駆細胞の投与６０日後における、肝臓でのＨｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ９の発現を示す免疫染色写真である。図１０は、ＴＫ−ＮＯＧマウスへの肝前駆細胞の投与６０日後における、肝臓でのＨｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ９の発現を示す免疫染色写真である。図１１は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の活性を示すグラフである。図１２は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、Ｏｍｅｐｒａｚｏｌによる誘導有り無しでの代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の活性比率を示すグラフである。図１３は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性を示すグラフである。図１４は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌによる誘導有り無しでの代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性比率を示すグラフである。図１５は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＡＬＢの遺伝子発現量を示すグラフである。図１６は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＴＡＴの遺伝子発現量を示すグラフである。図１７は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＴＤＯ２の遺伝子発現量を示すグラフである。図１８は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＴＴＲの遺伝子発現量を示すグラフである。図１９は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、Ｇ６ＰＣの遺伝子発現量を示すグラフである。図２０は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＮＴＣＰの遺伝子発現量を示すグラフである。図２１は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＣＹＰ１Ａ２の遺伝子発現量を示すグラフである。図２２は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＣＹＰ２Ｂ６の遺伝子発現量を示すグラフである。図２３は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子発現量を示すグラフである。図２４は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子発現量を示すグラフである。図２５は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子発現量を示すグラフである。図２６は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を示すグラフである。図２７は、本発明の肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）における、ＣＹＰ７Ａ１の遺伝子発現量を示すグラフである。図２８は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへ移植する前の、本発明の肝前駆細胞の写真である。図２９は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへ本発明の肝前駆細胞を移植した後、取り出し、４日間培養を行った細胞の写真である。図３０は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスから取り出した肝細胞におけるＣＹＰ１Ａ２の活性を示すグラフである。図３１は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスから取り出した肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の活性を示すグラフである。図３２は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへ移植する前の、本発明の肝前駆細胞の写真である。図３３は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへ本発明の肝前駆細胞を移植した後、取り出し、４日間培養を行った細胞の写真である。図３４は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスから取り出した肝細胞におけるＣＹＰ１Ａ２の活性を示すグラフである。図３５は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスから取り出した肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の活性を示すグラフである。図３６は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへ移植する前の、本発明の肝前駆細胞の写真である。図３７は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスへ本発明の肝前駆細胞を移植した後、取り出し、４日間培養を行った細胞の写真である。図３８は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスから取り出した肝細胞におけるＣＹＰ１Ａ２の活性を示すグラフである。図３９は、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスから取り出した肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の活性を示すグラフである。

本発明は、ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することを含む、ヒト肝前駆細胞の調製方法に関するものである。

［ヒト成熟肝細胞］
本発明に使用するヒト成熟肝細胞は、生体肝臓組織から既知の任意の方法にしたがって、取得することができる。なお、本明細書において、生体肝臓組織とは、出生後のヒト肝臓から取得した肝臓組織を意味する。生体肝臓組織の供給個体は、生存していても死亡していてもよい。生体肝臓組織の供給個体の年齢は限定されないが、細胞増殖の観点から、２０代以下が好ましく、さらに好ましくは１０才以下であり、より好ましくは、乳幼児（０才〜７才）であり、最も好ましくは乳児（０才〜２才）である。

また、本発明に使用するヒト成熟肝細胞は、成熟肝細胞として特徴を有していればよく、生体肝臓組織から取得した後に凍結保存された細胞でもよく、生体肝臓組織から取得した後に適宜、凍結保存及び融解を繰り返した細胞であってもよい。本発明に使用するヒト成熟肝細胞は、市販されているヒト由来成熟肝細胞をであってもよい。

さらに、本発明の方法に使用するヒト成熟肝細胞は、インビトロで増殖能を有しない、完全に分化した肝細胞を包含する。

本発明の方法に使用するヒト成熟肝細胞は、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、誘導多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、胚性幹細胞）等から分化誘導された肝細胞であってもよい。

［血清］
本発明に用いられる血清は、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清などが挙げられ、好ましくはＦＢＳ、仔ウシ血清、ウシ血清であり、さらに好ましくはＦＢＳである。また、本発明に用いられる血清とは、アルブミン(ウシ、ブタ、ヒト、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ等)、ヒト血小板溶解物等の血清成分由来の物質であってもよい。本発明に用いられる血清は、市販品であってもよい。

本発明に用いられる血清の含有量は、培地全体の量に対して、０．１ｖ／ｖ％〜３０ｖ／ｖ％、好ましくは１ｖ／ｖ％〜２０ｖ／ｖ％、さらに好ましくは５ｖ／ｖ％〜１５ｖ／ｖ％、さらにより好ましくは８ｖ／ｖ％〜１２ｖ／ｖ％、最も好ましくは１０ｖ／ｖ％である。

［Ａ−８３−０１］
Ａ−８３−０１（ＣＡＳＮｏ．９０９９１０−４３−６）はＴＧＦ−βシグナル阻害薬の一種であり、ＴＧＦ−β ｔｙｐｅＩ／ａｃｔｉｖｉｎ受容体様キナーゼ（ＡＬＫ５）、ｔｙｐｅＩａｃｔｉｖｉｎｇ／ｎｏｄａｌ受容体キナーゼ（ＡＬＫ４）、ｔｙｐｅＩｎｏｄａｌ受容体キナーゼ（ＡＬＫ７）を選択的に阻害することができる。Ａ−８３−０１は、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（３−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌ−４−（４−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｔｈｉｏａｍｉｄｅ）としても公知である。限定はされないが、Ａ−８３−０１は和光純薬工業株式会社等から入手することができる。

本発明に用いられるＡ−８３−０１の含有量は、培地全体の量に対して、０．０００１μＭ〜５μＭ、好ましくは０．００１μＭ〜２μＭ、さらに好ましくは０．０１μＭ〜１μＭ、さらにより好ましくは０．０５μＭ〜０．７μＭ、最も好ましくは０．５μＭである。

［ＣＨＩＲ９９０２１］
ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳＮｏ．２５２９１７−０６−９）はＧＳＫ−３β（ＧｌｙｃｏｇｅｎＳｙｎｔｈａｓｅＫｉｎａｓｅ３β）阻害剤の一種で、現在最も選択性の高い阻害剤として知られている。ＣＨＩＲ９９０２１は６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル（６−［［２−［［４−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）としても公知である。限定はされないが、ＣＨＩＲ９９０２１は和光純薬工業株式会社等から入手することができる。

本発明に用いられるＣＨＩＲ９９０２１の含有量は、培地全体の量に対して、０．００１μＭ〜２０μＭ、好ましくは０．０１μＭ〜１０μＭ、さらに好ましくは０．１μＭ〜５μＭ、さらにより好ましくは０．３μＭ〜４μＭ、最も好ましくは３μＭである。

［ＲＯＣＫインヒビター］
本発明において、ヒト成熟肝細胞を培養する培地は、さらにＲＯＣＫインヒビターを含有していてもよい。ここで、ＲＯＣＫインヒビターとしては、限定はされないが、Ｙ−２７６３２（ＣＡＳＮｏ．１４６９８６−５０−７）、ＧＳＫ２６９９６２（ＣＡＳＮｏ．８５０６６４−２１−０）、Ｆａｓｕｄｉｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳＮｏ．１０５６２８−０７−７）、Ｈ−１１５２（ＣＡＳＮｏ．８７１５４３−０７−６）が例示され、Ｙ−２７６３２が好ましい。Ｙ−２７６３２は選択的かつ強力なＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｉｌｅｄｆｏｒｍｉｎｇｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤である。Ｙ−２７６３２は、トランス−４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−４−ピリジニル−シクロヘキサンカルボキサミド（ｔｒａｎｓ−４−［（１Ｒ）−１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ］−Ｎ−４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）としても公知である。また、Ｙ−２７６３２はフリー体であっても、塩酸塩、硫酸塩等の塩の形であっても、水和物であってもよい。ＧＳＫ２６９９６２Ａは、Ｎ−［３−［［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾル−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ］フェニル］−４−［２−（４−モルフォリニル）エチオキシ］ベンザミド（Ｎ−［３−［［２−（４−Ａｍｉｎｏ−１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌ−３−ｙｌ）−１−ｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｃ］ｐｙｒｉｄｉｎ−６−ｙｌ］ｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］−４−［２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）としても公知である。Ｆａｓｕｄｉｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅは、ファスジル塩酸塩（１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＤｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）としても公知である。Ｆａｓｕｄｉｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅは、フリー体であっても、塩酸塩、硫酸塩等の塩の形であっても、水和物であってもよい。Ｈ−１１５２は、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−ヘキサハイドロ−１Ｈ−１，４−ヂアゼピンヂヒドロクロリド（（Ｓ）−（＋）−２−Ｍｅｔｈｙｌ−１−［（４−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−１，４−ｄｉａｚｅｐｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）としても公知である。限定はされないが、Ｙ−２７６３２は和光純薬工業株式会社等、ＳＫ２６９９６２ＡはＡｘｏｎｍｅｄｃｈｅｍ社等、ＦａｓｕｄｉｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅはＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社等、Ｈ−１１５２は和光純薬工業社等から入手することができる。

本発明に用いられるＲＯＣＫインヒビターの含有量は、培地全体の量に対して、０．００１μＭ〜５０μＭ、好ましくは０．０１μＭ〜３０μＭ、さらに好ましくは０．１μＭ〜２０μＭ、さらにより好ましくは１μＭ〜１５μＭ、最も好ましくは１０μＭである。

本発明において、ヒト成熟肝細胞を培養する培地には、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の誘導技術として公知の様々な遺伝子の内、１種類から複数種類の遺伝子、又はそれらの遺伝子産物（タンパク質やｍＲＮＡなど）或いは薬剤などを添加することができる。また、哺乳動物の細胞中にＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の誘導技術として公知の様々な遺伝子の内、１種類から複数種類の遺伝子、又はそれらの遺伝子産物（タンパク質やｍＲＮＡなど）を発現又は導入することができる。

本発明において、ヒト成熟肝細胞を培養する培地には、肝前駆細胞への誘導効率を上げるために、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等を誘導することが知られている薬剤、化合物、抗体を添加することができる。例えば、ＦＧＦレセプターチロシンキナーゼ、ＭＥＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）／ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ１および２）経路、ＧＳＫ（グリコーゲンシンターゼキナーゼ）３の三つの低分子阻害剤〔ＳＵ５４０２及びＰＤ１８４３５２〕、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＧＳＫ３の低分子阻害剤〔ＰＤ０３２５９０１〕、ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａの阻害剤である低分子化合物〔ＢＩＸ−０１２９４（ＢＩＸ）〕、アザシチジン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、７−ｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ、ｌｙｓｅｒｇｉｃａｃｉｄｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ、ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＴＧＦ−β ｒｅｃｅｐｔｏｒＩｋｉｎａｓｅ／ａｃｔｉｖｉｎ−ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ５（ＡＬＫ５）の阻害剤〔ＥＭＤ６１６４５２〕、ＴＧＦ−β ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（ＴＧＦ−βＲ１）ｋｉｎａｓｅの阻害剤〔Ｅ−６１６４５２及びＥ−６１６４５１〕、Ｓｒｃ−ｆａｍｉｌｙｋｉｎａｓｅの阻害剤〔ＥＩ−２７５〕、ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、ＰＤ０３２５９０１、ＳＵ５４０２、ＰＤ１８４３５２、ＳＢ４３１５４２、抗ＴＧＦ−β中和抗体、ＴＮｒ５ａ２、ｐ５３阻害化合物、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｐ５３経路の阻害剤等を、添加することができる。

また、ヒト成熟肝細胞を培養する培地には、肝前駆細胞への誘導効率を上げるため、更に、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等を作製するのに使用するマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を用いることも可能である。

本発明において、ヒト成熟肝細胞を培養する培地には、ＴＧＦ−βなどの活性を阻害又は中和する各々の阻害剤又は抗体などを使用することもできる。ＴＧＦ−βの阻害剤としては、例えば、ＴＧＦ−βＲＩ阻害剤、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼ阻害剤などが挙げられる。

本発明の培養において、コーティングをした培養ディッシュ上にて培養を行うこともまた好ましい。コーティングとして、マトリゲルコート、コラーゲンコート、ゼラチンコート、ラミニンコート、フィブロネクチンコート等を使用することができる。好ましくは、コーティングとして、マトリゲルコートを使用する。

本発明に用いることができる基本の培地としては、例えば、ＥＳ培地〔４０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、４０％のＦ１２培地（シグマ社製）、２ｍＭＬ−グルタミン又はＧｌｕｔａＭＡＸ（シグマ社製）、１％のｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄ（シグマ社製）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ社製）、１５〜２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（インビトロジェン社製）、４〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）〕（以下ＥＳ培地という）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを除いたＥＳ培地で、マウス胚性繊維芽細胞ＭＥＦを２４時間培養した上清である馴化培地に、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）を加えた培地（以下ＭＥＦ馴化ＥＳ培地）、ｉＰＳ細胞用最適培地（ｉＰＳｅｌｌｏｎ社製）、フィーダー細胞用最適培地（ｉＰＳｅｌｌｏｎ社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ〔登録商標〕ｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、アニマルプロテインフリーのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用無血清培地ＴｅＳＲ２〔ＳＴ−０５８６０〕（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル社）、ＲｅｐｒｏＳｔｅｍ（リプロセル社）、ＲｅｐｒｏＦＦ（リプロセル社）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社）などを例示することができるが、これらの培地に制限されることはない。これらの培地に、本発明の調製方法に必要な、血清、Ａ−８３−０１、およびＣＨＩＲ９９０２１が含まれていない場合には、適宜追加するものとする。

本発明において、ヒト成熟肝細胞を、ヒト肝前駆細胞へと調製する際の最適な培養条件は、常法に従い、適宜変更され得る。限定はされないが、ヒト成熟肝細胞をヒト肝前駆細胞へと調製する際の最適な培養条件は、例えば以下の通りである。
培養温度：１５℃〜４５℃が好ましく、２５℃〜４０℃がさらに好ましく、３７℃が最も好ましい。
ＣＯ_２濃度：１％〜１０％が好ましく、３％〜８％がさらに好ましく、５％が最も好ましい。
培養期間：１日（２４時間）〜３０日が好ましく、３日〜２０日がさらに好ましい。

本発明において、肝前駆細胞の増殖培養又は継代培養する手法は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の培養において当業者が通常用いるいずれかの方法を使用することができる。例えば、細胞から培地を除きＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、更に、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤、ｍＴｅＳＲ１及び１０μＭＹ−２７６３２を加え、ＭＥＦが播種してあるマトリゲルコート、ゼラチンコート又はコラーゲンコート培養皿に細胞懸濁液を播種することによって、継代培養する方法が例示できる。

本発明における肝前駆細胞は、成熟肝細胞、または胆管上皮細胞等に分化する能力を備えていればよい。肝前駆細胞は、凍結保存細胞であっても、適宜凍結保存及び融解を繰り返した細胞であってもよい。本発明において、凍結保存は、当業者に周知の凍結保存液へ肝前駆細胞を懸濁し、冷却することによって行い得る。懸濁は、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、凍結保存容器に移し、適宜、処理した後、凍結保存液を加えることによって行い得る。

凍結保存液は、凍害防御剤として、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含有していてもよいが、ＤＭＳＯは、細胞毒性を有することから、ＤＭＳＯ含有量を減らすことが好ましい。ＤＭＳＯの代替物として、グリセロール、プロピレングリコール又は多糖類が例示される。ＤＭＳＯを用いる場合、５％〜２０％の濃度、好ましくは５％〜１０％の濃度、より好ましくは１０％の濃度を含有する。この他にも、ＷＯ２００７／０５８３０８に記載の添加剤を含んでもよい。このような凍結保存液として、例えば、バイオベルデ社、日本ジェネティクス株式会社、リプロセル社、ゼノアック社、コスモ・バイオ社、コージンバイオ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社などから提供されている凍結保存液を用いてもよい。

上述の懸濁した細胞を凍結保存する場合、−８０℃〜−１００℃の間の温度（例えば、−８０℃）で保管することで良く、当該温度に達成しえる任意のフリーザーを用いて行い得る。特に限定されないが、急激な温度変化を回避するため、プログラムフリーザーを用いて、冷却速度を適宜制御してもよい。冷却速度は、凍結保存液の成分によって適宜選択しても良く、凍結保存液の製造者指示に従って行われ得る。

保存期間は、上記条件で凍結保存した細胞が融解した後、凍結前と同等の性質を保持している限り、特に上限は限定されないが、例えば、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、１年以上、又はそれ以上が挙げられる。より低い温度で保存することで細胞障害を抑制することができるため、液体窒素上の気相（約−１５０℃以下から−１８０℃以下）へ移して保存してもよい。液体窒素上の気相で保存する場合、当業者に周知の保存容器を用いて行うことができる。特に限定されないが、例えば、２週間以上保存する場合、液体窒素上の気相で保存することが好ましい。

凍結保存した肝前駆細胞の融解は、当業者に周知の方法によって行い得る。例えば、３７℃の恒温槽内又は湯浴中にて静置又は振とうすることによって行う方法が例示される。

本発明により得られた肝前駆細胞をさらに培養することにより、成熟肝細胞、あるいは胆管上皮細胞等に分化させることが可能である。

このようにして得られた成熟肝細胞(以下「分化成熟肝細胞」と言う)は、肝前駆細胞に比べ、ＡＬＢ（Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＡＦＰ（ＡｌｐｈａＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＡＴ（ＴｙｒｏｓｉｎｅＡｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＴＤＯ２（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、ＴＴＲ（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、Ｇ６ＰＣ（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＮＴＣＰ（ｓｏｄｉｕｍｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｃｎｘ３２、ＣＹＰ１Ａ１（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ１Ａ１）、ＣＹＰ１Ａ２（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ１Ａ２）、ＣＹＰ２Ｂ６（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ２Ｂ６）、ＣＹＰ２Ｃ９（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ２Ｃ９）、ＣＹＰ２Ｃ１９（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ２Ｃ１９）、ＣＹＰ２Ｄ６（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ２Ｄ６）、ＣＹＰ３Ａ４（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ３Ａ４）及びＣＹＰ７Ａ１（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ７Ａ１）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が著しく高くなる。限定はされないが、分化成熟肝細胞は、肝前駆細胞に比べ、前述の遺伝子の発現量が１０〜５０，０００倍に上昇することを特徴とする。

ヒト肝前駆細胞から分化成熟肝細胞への分化誘導（以下「分化」又は「誘導」とも言う）は、例えば、オンコスタチンＭ及びデキサメタゾンを基礎培地（上述の基本の培地等）に添加することによって行うことができる。分化誘導培地における各増殖分化因子の濃度を与えるのに必要な量のオンコスタチンＭは、例えば培地１Ｌあたり１μｇ〜１００μｇ、好ましくは５μｇ〜５０μｇである。分化誘導培地における各増殖分化因子の濃度を与えるのに必要な量のデキサメタゾンは、例えば培地１Ｌあたり０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭである。

ヒト肝前駆細胞から分化成熟肝細胞への分化誘導は、ヒト肝前駆細胞を、動物の肝臓もしくは、脾臓へ移植することによっても行う事がでる。移植される動物は、ヒト肝前駆細胞から分化成熟肝細胞への分化誘導ができる動物であれば特に限定はされないが、哺乳動物が望ましく、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ミニブタ、ウマ、ウシ及びサル等が挙がられるが、マウス、ラット、ミニブタ、サルがさらに好ましい。

また、肝前駆細胞から分化された成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）は、機能として、例えば、グルコース産生能、アンモニア代謝能、アルブミン生産能、尿素合成能等を有することが挙げられる。グルコース生産能は、例えば、グルコースオキシダーゼ法によって培養上清中のグルコースレベルを分析することで確認できる。アンモニア代謝能は、例えば、改変インドフェノール法（ＨｏｒｎＤＢ＆ＳｑｕｉｒｅＣＲ，Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１４：１８５−１９４．１９６６）によって、培養培地中のアンモニアレベルを分析することで確認できる。アルブミン生産能は、例えば、血清アルブミン濃度を測定する方法により、培養液中のアルブミン濃度を分析することで確認できる。また、尿素合成能は、例えば、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ（シグマ社）を使用して確認できる。

また、本発明は、本発明の方法により製造された肝前駆細胞及び肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）を提供することができる。本発明の方法により製造された肝前駆細胞及び肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）の機能や形態は、従来の方法により製造された肝細胞の機能や形態と比較して、ヒト成熟肝細胞に、より近いという特徴を有する。また、本発明の方法により製造された肝前駆細胞及び肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）は、インビボにおいても機能するという特徴を有する。よって、本発明の肝前駆細胞及び肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）は、例えば医療分野（例えば再生医療分野）において有用である。

例えば、本発明の肝前駆細胞を用いることで、肝疾患の治療ができる。例えば、肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）を直接的に肝門脈を通して移植する方法やコラーゲン、ポリウレタン、その他公知の生体親和性材料に包埋した形で移植する方法により、肝疾患を治療できる。このように、本発明は上記工程により製造された肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化した成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）の用途もまた提供する。より具体的には、肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化した成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）を含む肝疾患の治療剤を提供する。また、該細胞を用いた肝疾患の治療方法を提供する。具体的疾患としては、肝硬変、劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、肝線維症、自己免疫性肝炎、脂肪肝、薬剤アレルギー性肝障害、ヘモクロマトーシス、ヘモジデローシス、ウィルソン病、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、肝膿瘍、慢性活動性肝炎、慢性持続性肝炎胆道閉鎖症、肝癌等が挙げられるが、これらに限定されるものでない。

また、肝前駆細胞から分化された胆管上皮細胞は、その形態的特徴や上皮細胞のマーカーなどから、確認することができる。

また、本発明は、本発明の方法により製造された肝前駆細胞から分化させた胆管上皮細胞(以下「分化胆管上皮細胞」と言う)を提供することができる。本発明の方法により製造された分化胆管上皮細胞の機能や形態は、従来の方法により製造された細胞の機能や形態と比較して、ヒト胆管上皮細胞により近いという特徴を有する。また、本発明の方法により製造された分化胆管上皮細胞は、インビボにおいても機能するという特徴を有する。よって、本発明の肝前駆細胞及び肝前駆細胞から分化させた胆管上皮細胞（分化胆管上皮細胞）は、例えば医療分野（例えば再生医療分野）において有用である。

例えば、本発明の肝前駆細胞を用いることで、本発明の肝前駆細胞又は胆管上皮細胞を胆管疾患、例えば、胆石、胆嚢ポリープ、胆嚢がん、胆管癌、胆管炎、胆管肝炎、胆嚢炎、アラジール症候群（ＡＧＳ）、胆嚢結石、胆嚢腺筋症、胆嚢隆起性病変、無石胆管痛、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）等の治療に用いることができる。

また本発明の肝前駆細胞は、例えば肝疾患の治療を目的とした研究分野においても有用である。例えば、人工臓器（人工肝臓など）の研究開発において用いることができる。さらに、本発明のヒト肝細胞は、医薬品や食品等の開発の分野においても有用である。具体的には、被検物質の代謝や肝毒性の評価、肝疾患治療剤、肝炎ウイルス感染阻害剤、またはウイルス性肝炎治療剤のスクリーニングに利用できる。

本発明の方法により製造された肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）あるいは胆管上皮細胞（分化胆管上皮細胞）を利用することで、被検物質の代謝や肝毒性を評価することが可能である。

被検物質の代謝や肝毒性の評価には、従来、動物モデル等が用いられていたが、一度に評価できる被検物質の数に制限があり、また動物モデル等で得られた評価を、そのままヒトに適用できないという問題があった。そのため、ヒト肝がん細胞株や初代正常ヒト培養肝細胞を用いる評価方法が採用されつつある。しかしながら、ヒト肝がん細胞株はがん細胞であるため、ヒト肝がん細胞株で得られた評価が、ヒト正常肝細胞に適用できないという可能性が残る。また、初代正常ヒト培養肝細胞は安定供給やコストの面での問題がある。また、初代正常ヒト培養肝細胞を不死化した細胞株は、不死化していない場合と比較して、ＣＹＰ３Ａ４の活性が低下していることが示されている（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ１４：６６３−６６８，２００４，ＡｋｉｙａｍａＩ．ｅｔａｌ．）。本発明の方法により製造された肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）あるいは胆管上皮細胞（分化胆管上皮細胞）を利用することで、このような問題を解決しうる。

本発明の分化成熟肝細胞は、被検物質のスクリーニングに利用できる。本発明における被検物質のスクリーニングは、代謝酵素の解析、代謝経路の解析、代謝産物の解析、代謝活性の解析、細胞毒性の解析、遺伝毒性の解析、発がん性発現の解析、変異原性の解析、肝毒性発現の解析、肝臓に対する作用の解析等を指標にすることができる。

本発明は、被検物質の代謝を評価する方法を提供する。該方法では、本発明の方法により製造された肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）に被検物質を接触させる。次いで、該細胞に接触させた被検物質の代謝を測定する。

本発明で用いる被検物質としては、特に制限はない。例えば、生体異物、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、医薬品原料、化粧品原料、食品原料、医薬品添加物、化粧品添加物、食品添加物、サプリメント成分等が挙げられるが、これらに限定されない。

生体異物としては、例えば薬剤や食品の候補化合物、候補物質、既存の薬剤や食品が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、生体にとって異物である限り、本発明の生体異物に含まれる。より具体的には、Ｒｉｆａｍｐｉｎ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ、Ｃｉｇｌｉｒａｚｏｎｅ、Ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ、Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ、β−Ｎａｐｈｔｈｏｆｌａｖｏｎｅ、Ｏｍｅｐｒａｚｏｉｅ、Ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ、３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅなどが例示できる。

本発明における「接触」は、通常、培地や培養液に被検物質を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検物質がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。

被検物質の代謝は、当業者に周知の方法で測定することが可能である。例えば被検物質の代謝産物が検出された場合に、被検物質が代謝されたと判定される。また、被検物質の接触により、ＣＹＰ（チトクロムｐ４５０）、ＭＤＲ（ＭｕｌｔｉＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＡＢＣＢ１）、ＭＰＲ（ＭｕｌｔｉｄｒｕｇＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ、ＡＢＣＣ２）等の酵素遺伝子の発現が誘導された場合や、これら酵素の活性が上昇した場合に、被検物質が代謝されたと判定される。

代謝酵素の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞へ接触させた後に被検物質の構造の変化を解析することにより、被検物質の代謝に関与する酵素の解析が可能である。具体的には、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞への接触させた後に被検物質の構造の変化を各種酵素の阻害・拮抗物質あるいは各種酵素の中和抗体により解析することによる被検物質代謝に関与する酵素の同定、被検物質の細胞への接触による被検物質の構造の変化を解析することによる酵素反応機構の解析、基質特異性の解析などをあげることができる。

代謝経路の解析および代謝産物の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞への接触させた後に被検物質の構造の変化を解析することにより被検物質の代謝経路の解析および代謝産物の解析が可能である。被検物質の代謝産物を検出するための方法は、公知方法を用いることができる。例えば、被検物質と接触させた分化成熟肝細胞の培地等を、液体クロマトグラフィーや質量分析などによって分析することによって、代謝産物を検出することができる。

代謝活性の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞へ接触させ、被検物質代謝酵素活性の上昇、酵素量の増加または酵素をコードする遺伝子の転写量の上昇などを検出することにより被検物質代謝酵素の活性の促進の解析が可能である。具体的には、チトクロームＰ４５０酵素活性の上昇、タンパク量の増加、ｍＲＮＡの増加を検出することで解析が可能である。検出方法としては、各種Ｐ４５０に対応する酵素活性の測定、各種Ｐ４５０蛋白質に対応するウエスタンブロティング、各種Ｐ４５０ｍＲＮＡに対応するノザンハイブリダイゼーションあるいはＲＴ−ＰＣＲ法など公知の手法を使用することができる。

また、本発明は、被検物質の肝毒性を評価する方法を提供する。該方法では、本発明の方法により製造された肝前駆細胞及び肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）に被検物質を接触させる。次いで、被検物質を接触させた該細胞の障害の程度を測定する。障害の程度は、例えば該細胞の生存率やＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）やＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）などの肝障害マーカーを指標に測定できる。

肝毒性発現の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞に接触させ、該細胞毒性の発現を観察することにより、あるいは、被検物質を該細胞に接触させた後に、該細胞により変化した被検物質を他の肝細胞、肝切片、摘出肝または、実験動物へ投与しそれによる細胞、組織、生体の変化を観察することにより被検物質代謝による肝毒性を解析することが可能である。

例えば、肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）の培養液に被検物質を添加することにより、該細胞の生存率が低下する場合、該被検物質は肝毒性を有すると判定され、生存率に有意な変化がない場合、該被検物質は肝毒性を有さないと判定される。また、例えば、該細胞の培養液に被検物質を添加後、培養液中のＧＯＴやＧＰＴが上昇する場合、該被検物質は肝毒性を有すると判定され、ＧＯＴやＧＰＴに有意な変化がない場合、該被検物質は肝毒性を有さないと判定される。

なお、すでに肝毒性の有無が判明している物質を対照として用いることで、より正確に、被検物質が肝毒性を有するか否かを評価することができる。

細胞毒性の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞へ接触させ、被検物質の代謝物による細胞毒性の解析が可能である。具体的には、被検物質の接触による該細胞の形態の変化、生細胞数の変動、細胞内酵素の漏出、細胞表層構造の変化あるいは細胞内酵素の変動などを観察することにより解析される。

生遺伝毒性の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞に接触させ、該細胞を染色体異常試験、小核試験などに付すことより被検物質代謝による遺伝毒性の解析が可能である。また、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞に接触させた後に、該細胞により変化した被検物質を適切な評価系で評価することにより染色体異常試験、小核試験、復帰突然変異試験などに付すことにより解析が可能である。

発がん性発現の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞に接触させ、該細胞を染色体異常試験、ＤＮＡの修飾などに付すことにより被検物質代謝による発ガン性の解析が可能である。また、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞に接触させた後に、該細胞により変化した被検物質を適切な化学物質による発ガン評価系で評価することにより解析が可能である。

変異原性の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞に接触させ、該細胞を染色体異常試験、小核試験などに付すことにより被検物質代謝による変異原性の解析が可能である。また、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞に接触させた後に、該細胞により変化した被検物質を適切な評価系で評価することにより染色体異常試験、小核試験、復帰突然変異試験などに付すことにより解析が可能である。

また、本発明は、肝疾患または胆管疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供することが可能である。該方法では、本発明の方法により製造された肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）に被検物質を接触させる。次いで、被検物質を接触させた該細胞の機能を測定する。次いで、被検物質を接触させた該細胞の機能を亢進させる物質を選択する。

肝臓に対する作用の解析は、例えば、被検物質を本発明の分化成熟肝細胞への接触させた後に、該細胞の変化の発現を観察することにより、あるいは、被検物質を該細胞に接触させた後に、細胞により変化した被検物質を他の肝藏細胞、肝藏切片、摘出肝藏または、実験動物へ投与しそれによる細胞、組織、生体の変化を観察することにより肝藏への作用の発現を解析することが可能である。被検物質を接触させた分化成熟肝細胞において、細胞機能の亢進が見られた場合に、被検物質の肝臓に対する治療効果が期待される。

本発明における肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）の機能は、例えば、グルコース産生能、アンモニア代謝能、アルブミン生産能、尿素合成能、ＣＹＰ等の酵素の活性を指標に測定できる。

グルコース生産能は、例えば、グルコースオキシダーゼ法によって培養上清中のグルコースレベルを分析することで確認できる。アンモニア代謝能は、例えば、改変インドフェノール法（ＨｏｒｎＤＢ＆ＳｑｕｉｒｅＣＲ，Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１４：１８５−１９４．１９６６）によって、培養培地中のアンモニアレベルを分析することで確認できる。アルブミン生産能は、例えば、血清アルブミン濃度を測定する方法により、培養液中のアルブミン濃度を分析することで確認できる。また、尿素合成能は、例えば、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ（シグマ社）を使用して確認できる。本発明のＣＹＰは特に制限はないが、例えばＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４などが挙げられる。ＣＹＰの活性測定方法は、当業者に周知の方法を使用することができる。

本発明の方法により製造された肝前駆細胞及び肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）の機能や形態は、ヒト成熟肝細胞により近いため、肝炎ウイルスに感染しうる。

本発明は、肝炎ウイルス感染阻害剤のスクリーニング方法を提供する。該方法では、本発明の方法により製造された肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）に、被検物質の存在下において肝炎ウイルスを接触させる。次いで、肝炎ウイルスを接触させた該細胞における肝炎ウイルスの感染の有無を検査する。次いで、肝炎ウイルスの感染を阻害する物質を選択する。細胞への肝炎ウイルスの接触は、常法によって実施することができる。

肝炎ウイルスとしては、特に制限はないが、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスが含まれる。これら肝炎ウイルスは、株化されたものであってもよいし、肝炎ウイルス感染者から直接単離されたものでもよい。また、精製された状態であってもよいし、クルードな状態（例えば感染者から得られた血清の状態）であってもよい。

肝炎ウイルスの感染の有無は、例えば細胞中の肝炎ウイルス量を指標に検査することができる。細胞中の肝炎ウイルス量は、例えば細胞中の肝炎ウイルスのＲＮＡ量を指標に判定できる。肝炎ウイルスのＲＮＡ量は、常法に従って測定することができる。また、本発明者らが確立した方法によって測定してもよい（Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈｉｅｔａｌ．Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓＧｅｎｏｍｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１９９９，１１６：６３６−６４２）。

さらに、本発明は、ウイルス性肝炎治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。該方法では、本発明の方法により製造された肝前駆細胞または肝前駆細胞から分化させた成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）に、肝炎ウイルスを接触させる。次いで、肝炎ウイルスが感染した該細胞に、被検物質を接触させる。次いで、被検物質を接触させた細胞における肝炎ウイルスの増殖を測定する。次いで、肝炎ウイルスの増殖を阻害する物質を選択する。

肝炎ウイルスの増殖を阻害する物質には、１）被検物質を接触させていない場合と比較して、肝炎ウイルスの増殖を阻害する物質、２）肝炎ウイルスの増殖を完全に阻害する物質、３）肝炎ウイルスを消失させる物質の全てが含まれる。肝炎ウイルスの増殖や消失は、細胞中の肝炎ウイルス量を測定することで検査することができる。

本発明において、被検物質は、通常、分化成熟肝細胞の培地や培養液に被検物質を添加することによって、該細胞に接触させることができる。その他、分化成熟肝細胞内で被検物質をコードする遺伝子を発現させることによって、該細胞に接触させることができる。あるいは、被検物質を産生する細胞と分化成熟肝細胞を共培養することによっても、被検物質を該細胞に接触させることができる。

本発明の分化成熟肝細胞の機能や形態は、成熟肝細胞により近いため、肝炎ウイルスに感染しうる。よって、本発明は肝炎ウイルスの培養方法を提供することができる。本発明の肝炎ウイルスの培養方法において、ウイルスの種類は特に限定されないが、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス及びＥ型肝炎ウイルスが挙げられる。本発明の肝炎ウイルスの培養方法は、既に単離されたウイルスの継代や増幅に有用である。また、本発明の肝炎ウイルスの培養方法は、環境や患者に由来するサンプルから肝炎ウイルスを分離することができる。

本発明のヒト肝臓モデル動物は、本発明の分化成熟肝細胞を非ヒト哺乳動物に移植することによって得られる。非ヒト哺乳動物に対する移植のための、分化成熟肝細胞の投与経路としては、肝臓表面への直接投与、肝臓内投与、門脈内投与、脾臓内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、舌下投与、経直腸投与、経腟投与、経皮投与等が挙げられるが、本発明の分化成熟肝細胞の生着率の観点から、好ましくは肝臓表面への直接投与、肝臓内投与、脾臓内投与、動脈内投与及び静脈内投与であり、より好ましくは肝臓内投与、脾臓内投与、肝動脈内投与である。

本発明のヒト肝臓モデル動物における、分化成熟肝細胞の投与量は、非ヒト哺乳動物及び投与経路によって異なりうるが、通常、１ｘ１０〜１ｘ１０^１０個／個体、好ましくは１ｘ１０^２〜１ｘ１０^９個／個体、さらに好ましくは１ｘ１０^３〜１ｘ１０^８個／個体である。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与しても良い。

本発明における非ヒト哺乳動物としては、哺乳動物であれば特に限定されないが、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ミニブタ、ウマ、ウシ及びサル等が挙げられるが、マウス、ラット、ミニブタ、サルがさらに好ましい。

また、本発明は、ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することにより調製されたヒト肝前駆細胞、又は該ヒト肝前駆細胞から誘導された成熟肝細胞（分化成熟肝細胞）を含む、キットを提供することができる。このようなキットは、ヒト肝前駆細胞又は分化成熟肝細胞を用いて、被検物質の代謝及び／又は肝毒性を評価するために用いられる。別の実施形態においては、このようなキットは、被検物質のスクリーニング、具体的には、肝疾患または胆管疾患の治療剤のスクリーニング、肝炎ウイルス感染阻害剤のスクリーニング、ウイルス性肝炎治療剤のスクリーニング等に用いることも可能である。それぞれの具体的な評価方法、スクリーニング方法は、既述に順じる。

以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。以下において、用いた細胞に関する年齢・月齢情報は、それぞれ、「Ｍ」（Ｍｏｎｔｈ）、「Ｙ」（Ｙｅａｒ）の略称により表記する。

（実施例１）
ヒト凍結肝細胞（Ｌｏｔ．ＩＤ：ＨＣ３−１４、４５Ｙ、Ｍａｌｅ、Ｃａｕｃａｓｉａｎ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製）を、解凍用培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓＥ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、３２５５１−０２０）、１０％ＦＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１０^−４Ｍｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｘａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に懸濁し、５００ｒｐｍ（約４０ｘｇ）、４℃、２ｍｉｎの低速遠心にてヒト肝細胞回収した。回収した細胞を播種培地（Ｌ−１５培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、１１４１５−０６４）、１ｘａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に再度懸濁し、細胞数をカウントした。コラーゲンコートプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に、１ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内に入れ、細胞が接着した３−５時間後に播種培地から、基礎培地（以下、「ＳＨＭ培地」（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、１１３２００３３）、５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、３０ｍｇ／ＬＬ−ｐｒｏｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．０５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ／ｍＬｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ社製）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｅｒｉｎｅ（ＩＴＳ）−Ｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１０^−７Ｍｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄｅｘ）（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍＭｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｍＭａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ−２ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ社製）、１ｘａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に、１０％ＦＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．５μＭＡ−８３−０１（ＷＡＫＯ社製）及び３μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＡｘｏｎＭｅｄｃｈｅｍ社製）を加えたＡＣ−Ｆ培地、基礎培地に１０％ＦＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．５μＭＡ−８３−０１（ＷＡＫＯ社製）、３μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＡｘｏｎＭｅｄｃｈｅｍ社製）及び１０μＭＹ−２７６３２（ＷＡＫＯ社製）を加えたＹＡＣ−Ｆ培地、及び０．５ μＭＡ−８３−０１（ＷＡＫＯ社製）、３μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＡｘｏｎＭｅｄｃｈｅｍ社製）及び１０μＭＹ−２７６３２（ＷＡＫＯ社製）を加えたＹＡＣ培地に置き換えた。その後は２−３日に一回の頻度で各試験用培地を用いて培地交換を行い、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養を行った。

１７日後に位相差顕微鏡にて、培養細胞の形態の観察を行ったところ、ＡＣ−Ｆ培地及びＹＡＣ−Ｆ培地で培養した細胞では、小型の細胞が数多くみられ、これらはＮｕｃｌｅｉ／Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ（Ｎ／Ｃ）比が高く、白い核が認められたため、肝前駆細胞であることが確認できた（図１Ａ及び図１Ｂ）。これに対して、ＹＡＣ培地で培養した細胞は、１２日後においてＮ／Ｃ比が低く、核が黒く、２核の細胞も観察された（図１Ｃ）ことから、これらの細胞は肝前駆細胞ではないことが確認できた。また、ＡＣ−Ｆ培地及びＹＡＣ−Ｆ培地で培養した細胞は、ＹＡＣ培地で培養した細胞に比べ、増殖速度が速かった。

以上より、成熟肝細胞から肝前駆細胞を得るには、培地中に血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有することが必要であることが明らかとなった。

（実施例２）
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で培養を行ったところ、６日後（Ｄ６）、９日後（Ｄ９）及び１２日後（Ｄ１２）において、肝前駆細胞が観察された（図２）。図２において、矢印は肝前駆細胞から、一部自発的に分化し成熟化した細胞を示す。

（実施例３）
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（２Ｙ、Ｍａｌｅ、Ｃａｕｃａｓｉａｎ、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で培養を行ったところ、７日、及び１４日後において、肝前駆細胞が観察された。これに対して、試験培地を１０％ＦＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のみを含有するＦＢＳ培地として、培養を行った場合には、肝前駆細胞は観察されなかった（図３）。

同様にヒト凍結肝細胞（８Ｍ、Ｍａｌｅ、Ｃａｕｃａｓｉａｎ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で培養を行ったところ、７日、及び１４日後において、肝前駆細胞が観察され、試験培地をＦＢＳ培地として培養を行った場合には、肝前駆細胞は観察されなかった（図４）。

（実施例４）
ｕＰＡ遺伝子が肝細胞特異的に発現し、先天的に肝臓が障害を受け続けることで慢性肝障害を発症するｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスに、本発明の肝前駆細胞の移植を行い、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスの肝臓に、本発明の肝前駆細胞由来の肝細胞が生着することを確認する。

実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で４日間培養を行った細胞について、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＳＫＵ：１２６０４０１３）にて剥離回収して、細胞数の測定を行った。細胞懸濁液を遠心（２００ｘｇ、５分）した後、５ｘ１０^７ｃｅｌｌｓになるように、ＤＭＥＭ１０（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁した。

ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス（Ｔａｔｅｎｏｅｔ. ａｌ．、２０１５、２−４週齢）をイソフルラン麻酔下にて開腹し、脾臓を露出し、０．５ｘ１０^５〜２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで移植した後、開腹部を縫合した。１週間に１回、２０〜４０ｕＬの血液を眼窩から採取して、血清を分離して、血清中のｈｕｍａｎ特異的なアルブミンをＡＬＢＨｕｍａｎＡＬＢＥＬＩＳＡｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ社製、商品コード：Ｅ８８−１２９）で測定する。細胞移植後８週間に剖検を行い、全血および肝臓・脾臓の組織サンプル（パラフィンおよび凍結ブロック）を作製する。

（実施例５）
肝細胞特異的にｔｉｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅを発現するため、ガンシクロビル投与によって肝細胞特異的に細胞死を誘導し、肝障害を引き起こすことができる、ＴＫ−ＮＯＧｍｏｕｓｅに本発明の肝前駆細胞の移植を行い、ＴＫ−ＮＯＧｍｏｕｓｅの肝臓に、本発明の肝前駆細胞由来の肝細胞が生着することを確認する。

実施例４と同様にヒト凍結肝細胞（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）を用いて、細胞懸濁液を調製した。ＴＫ−ＮＯＧｍｏｕｓｅ（Ｈａｓｅｇａｗａｅｔ. ａｌ．、２０１１、７−８週齢、インビボサイエンス社製）に、細胞移植７日前および５日前に、ガンシクロビル（ＧＣＶ、Ｓｉｇｍａ社製、Ｇ２５３６−１００ＭＧ）１０ｍｇを測り取り、１６．７ｍＬのＰＢＳ（−）に溶かし、０．２２ｕｍフィルターにてろ過滅菌して、１０ｕＬ／ｇ体重（６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。ＴＫ−ＮＯＧｍｏｕｓｅをイソフルラン麻酔下にて開腹し、脾臓を露出し、０．５ｘ１０^５〜２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで投与した後、開腹部を縫合した。１週間に１回、２０〜４０ｕＬの血液を尾静脈から採取して、血清を分離して、血清中のｈｕｍａｎ特異的なアルブミンをＡＬＢＨｕｍａｎＡＬＢＥＬＩＳＡｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ社製、商品コード：Ｅ８８−１２９）で測定する。細胞投与後８週間に剖検を行い、全血および肝臓・脾臓の組織サンプル（パラフィンおよび凍結ブロック）を作製する。

（実施例６）
肝細胞へ分化されたことを確認する遺伝子発現の試験
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で培養を行い、肝前駆細胞を調製した後に、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎＭ（ＯＳＭ）及びデキサメサゾン（Ｄｅｘ）を含む培地で６日間培養を行い、その後マトリゲルで培養を行い、肝細胞へ分化させる。分化させた肝細胞について、取扱説明書に従って、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔＧ３ＲａｔＧＥ８ｘ６０ＫＫｉｔ（Ｇ４８５３Ａ）及びＳｕｒｅＰｒｉｎｔＧ３ＭｏｕｓｅＧＥ８ｘ６０ＫＶｅｒ２．０Ｋｉｔ（Ｇ４８５２Ｂ）を用い、ｏｎｅ−ｃｏｌｏｒｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によりデータを取得する。強度数値は２を底として対数変換して、ＰａｒｔｅｋＧｅｎｏｍｉｃｓＳｕｉｔｅ６．６（ＰａｒｔｅｋＩｎｃ製、Ｃｈｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、ＭＯ、ＵＳＡ）にデータを読み込む。遺伝子発現の解析にはｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡを用い、発現に差のある遺伝子を同定する。それぞれの解析において、Ｐ値及び変化量の比を算出する。ＰａｒｔｅｋＧｅｎｏｍｉｃｓＳｕｉｔｅ６．６を用い、全データセット又はソート済みのデータセットについて、選択したプローブセットを用いたＥｕｃｌｉｄｅａｎｄｉｓｔａｎｃｅｓｏｆａｖｅｒａｇｅｌｉｎｋａｇｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇの手法によって、Ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ及びヒートマップ作成を実施し、肝特異的遺伝子の発現の確認を行う。

（実施例７）胆管上皮細胞へ分化したことを確認する試験
セクレチンアッセイ
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で培養を行い、肝前駆細胞を調製した後に、ｍＴｅＳＲ１及びＹＡＣを含む培地で、ＭＥＦ上で、６日間培養を行い、その後２％マトリゲルを添加して２日間培養を行い、胆管上皮細胞へ分化させる。分化させた胆管上皮細胞について、ラットセクレチンを２ｘ１０^−７Ｍ（Ｗａｋｏ社製）にて添加して３０分培養したのち、位相差顕微鏡を用いて、胆管様構造における管腔領域の拡大を観察して、胆管上皮細胞への分化の確認を行う。

（実施例８）
フルオレセインジアセテートアッセイ
実施例７と同様に、肝前駆細胞から胆管上皮細胞へ分化させ、得られた胆管上皮細胞にフルオレセインジアセテートを添加して、１５分培養したのち、新しい培地に交換する。さらに３０分間培養を継続することで分解されたフルオレセインの管腔領域への輸送を促す。そののち、培地をＨＢＳＳ（＋）に置換し、蛍光顕微鏡にてフルオレセインの分布を観察して、胆管上皮細胞への分化の確認を行う。

（実施例９）
肝細胞へ分化させた際の肝特異的遺伝子の発現の確認試験
実施例６と同様に、肝前駆細胞から肝細胞へ分化させ、得られた肝細胞についてｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｖｅｎｌｏ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用い、トータルＲＮＡを抽出する。取扱説明書に従って、Ｈｉｇｈ−ＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて逆転写を行う。作製したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｌａｔｉｎｕｍＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲを行い、肝特異的遺伝子の発現の確認を行う。

（実施例１０）
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で１１日間培養を行った細胞について、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＳＫＵ：１２６０４０１３）にて剥離回収して、細胞数の測定を行った。細胞懸濁液を遠心（２００ｘｇ、５分）した後、５ｘ１０^７ｃｅｌｌｓになるように、ＤＭＥＭ１０（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁した。

ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス（Ｔａｔｅｎｏｅｔ．ａｌ．、２０１５、２−４週齢、ｎ＝３）をイソフルラン麻酔下にて開腹し、脾臓を露出し、１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで移植した後、開腹部を縫合した。１週間に１回、２０〜４０ｕＬの血液を眼窩から採取して、血中のｈｕｍａｎ特異的なアルブミンをＨｕｍａｎＡＬＢＥＬＩＳＡｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ社製、商品コード：Ｅ８８−１２９）で測定した。図５に示すようにマウス血中ｈｕｍａｎＡＬＢが存在することが確認でき、肝前駆細胞由来の肝細胞が生着することが確認された。なお、細胞投与後７０日における血中ｈｕｍａｎＡＬＢは、それぞれ１７．２ｍｇ／ｍＬ、１２．１ｍｇ／ｍＬ及び１２．０ｍｇ／ｍＬであった。

また、細胞投与後７０日のマウスの肝臓におけるＨｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ９の発現の確認を行ったところ、それぞれ９４．６〜９６．１％（Ｒｉｇｈｔｍｅｄｉａｌｌｏｂｅ）、９１．３〜９７．２％（Ｌｅｆｔｍｅｄｉａｌｌｏｂｅ）及び９３．１〜９６．０％（Ｔｏｔａｌ）発現していることが確認された（それぞれ図６及び７）。

（実施例１１）
実施例１０と同様にヒト凍結肝細胞（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で１１日間培養を行った細胞について、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＳＫＵ：１２６０４０１３）にて剥離回収して、細胞数の測定を行った。細胞懸濁液を遠心（２００ｘｇ、５分）した後、５ｘ１０^７ｃｅｌｌｓになるように、ＤＭＥＭ１０（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁した。ＴＫ−ＮＯＧｍｏｕｓｅ（Ｈａｓｅｇａｗａｅｔ．ａｌ．、２０１１、７−８週齢、インビボサイエンス社製、ｎ＝２）にガンシクロビル（ＧＣＶ）を投与し、投与１週間後にＡＬＴを測定して４００−１６００Ｕ／ｄＬの値を示した個体を被移植動物として使用した。なおＧＣＶの調製に当たっては５００ｍｇ（田辺三菱製薬、点滴静注用デノシン）を１０ｍＬの注射用蒸留水（大塚）で溶解（５０ｍｇ／ｍＬ）し、０．２ｍＬずつ分注したものをオリジナルストックとし、移植時にこれをＰＢＳ（−）で５倍希釈したものを用事調製し、マウス体重１０ｇあたり０．１ｍＬを腹腔内投与して、肝細胞特異的に細胞死を誘導した。ＴＫ−ＮＯＧｍｏｕｓｅをイソフルラン麻酔下にて開腹し、脾臓を露出し、１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで投与した後、開腹部を縫合した。１週間に１回、２０〜４０ｕＬの血液を尾静脈から採取して、血清を分離して、血清中のｈｕｍａｎ特異的なアルブミンをＡＬＢＨｕｍａｎＡＬＢＥＬＩＳＡｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ社製、商品コード：Ｅ８８−１２９）で測定した。図８に示すようにマウス血清中ｈｕｍａｎＡＬＢが存在することが確認でき、肝前駆細胞由来の肝細胞が生着することが確認された。なお、細胞投与後６０日における血清中ｈｕｍａｎＡＬＢは、それぞれの個体で８．１ｍｇ／ｍＬ及び２．２ｍｇ／ｍＬであった。

また、細胞投与後６０日におけるマウスの肝臓におけるＨｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ９の発現の確認を行ったところ、それぞれの個体で５７．５％及び３０．６％発現していることが確認された（図９及び１０）。

（実施例１２）
実施例１同様にヒト凍結肝細胞１（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）及びヒト凍結肝細胞２（８Ｍ、Ｍａｌｅ、Ｃａｕｃａｓｉａｎ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で培養を行い、肝前駆細胞（それぞれ「ＦＣＬ」、「ＤＵＸ」と言う）を調製した後に、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎＭ（ＯＳＭ、５ｎｇ／ｍｌ）及びデキサメサゾン（Ｄｅｘ、１０^−６Ｍ）を含む培地で６日間培養を行い、その後マトリゲルで２日間培養を行い、肝細胞へ分化させた。肝前駆細胞及び分化させた肝細胞について、メタノール（ＭｅＯＨ、１％濃度）及びオメプラゾール（ＯＭＰ、５０ μＭ）を用いて、代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の活性の測定を行った。また、蒸留水及びフェノバルビタール（１ｍＭ）を用いて、代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性の測定を行った。代謝酵素の活性は、プロメガ社のＬｕｃｉｆｅｒｉｎ１Ａ２キット及び、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡキットによりそれぞれ行った。肝前駆細胞を肝細胞に分化させることにより、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４が誘導されることが明らかとなった（図１１〜１４）。

（実施例１３）
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）を用いて、ＡＣ−Ｆ培地で培養を行い、肝前駆細胞を調製した後に、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎＭ（ＯＳＭ、５ｎｇ／ｍｌ）及びデキサメサゾン（Ｄｅｘ、１０^−６Ｍ）を含む培地で６日間培養を行い、その後マトリゲルで２日間培養を行い、肝細胞へ分化させた。肝前駆細胞及び分化させた肝細胞について、ＰＣＲを用いて、各代謝酵素等の発現量を測定した。肝前駆細胞を肝細胞に分化させることにより、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＴＤＯ２、ＴＴＲ、Ｇ６ＰＣ、ＮＴＣＰ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ７Ａ１が誘導されることが明らかとなった（図１５〜２７）。

（実施例１４）
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（１０Ｍ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ、Ｃｅｌｓｉｓ社製）を用いて、肝前駆細胞を調製した後に、ｃＤＮＡ−ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス（２−４Ｍ、Ｍａｌｅ、フェニクスバイオ社製）をイソフルラン麻酔下にて開腹し、脾臓を露出し、０．５ｘ１０^５〜２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで移植した後、開腹部を縫合した。移植後７３日目に、肝臓を摘出して肝細胞をかん流分離し、４ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４穴コラーゲンプレート（ＩＷＡＫＩ社製）上で２％ＦＢＳ−ＳＨＭ培地を用いて４日間培養を行った。図２８及び図２９はそれぞれ、移植前の肝前駆細胞及び移植後取り出し、４日間培養を行った細胞の写真であり、形態学的な観察から、移植された細胞がマウス肝臓内で完全に肝細胞へと成熟している様子がうかがえた。

マウスから取り出した肝細胞について、メタノール（ＭｅＯＨ、１％濃度）及びオメプラゾール（ＯＭＰ、５０μＭ）を用いて、代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の活性の測定を行った。また、リファンピシン（ＲＦ、１０μＭ）、メタノール（ＭｅＯＨ、１％濃度）、フェノバルビタール（１ｍＭ）及び蒸留水を用いて、代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性の測定を行った。代謝酵素の活性は、プロメガ社のＬｕｃｉｆｅｒｉｎ１Ａ２キット及び、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡキットによりそれぞれ行った。動物の肝に移植され、培養された肝前駆細胞についても、オメプラゾールによりＣＹＰ１Ａ２が、リファンピシン及びフェノバルビタールによりＣＹＰ３Ａ４が誘導されることが明らかとなった（図３０及び図３１）

（実施例１５）
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（８Ｍ、Ｍａｌｅ、Ｃａｕｃａｓｉａｎ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社製）を用いて、肝前駆細胞を調製し、実施例１４と同様に移植及び培養を行った。図３２及び図３３はそれぞれ、移植前の肝前駆細胞及び移植後取り出し、４日間培養を行った細胞の写真である。

マウスから取り出した細胞について、実施例１４と同様に、代謝酵素の活性測定を行ったところ、実施例１４と同様、オメプラゾールによりＣＹＰ１Ａ２が、リファンピシン及びフェノバルビタールによりＣＹＰ３Ａ４が誘導されることが明らかとなった（図３４及び図３５）

（実施例１６）
実施例１と同様にヒト凍結肝細胞（１Ｙ、Ｍａｌｅ）を用いて、肝前駆細胞を調製し、実施例１４と同様に移植及び培養を行った。図３６及び３７はそれぞれ、移植前の肝前駆細胞及び移植後取り出し、４日間培養を行った細胞の写真である。

マウスから取り出した細胞について、実施例１４と同様に、代謝酵素の活性測定を行ったところ、実施例１４と同様、オメプラゾールによりＣＹＰ１Ａ２が、リファンピシン及びフェノバルビタールによりＣＹＰ３Ａ４が誘導されることが明らかとなった（図３８及び図３９）

Claims

ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することを含む、ヒト肝前駆細胞の調製方法。
前記成熟肝細胞が乳幼児由来である、請求項１に記載のヒト肝前駆細胞の調製方法。
前記血清がウシ胎児血清である、請求項１又は２に記載のヒト肝前駆細胞の調製方法。
ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することにより調製された、ヒト肝前駆細胞。
請求項４に記載されたヒト肝前駆細胞から誘導された成熟肝細胞。
請求項５に記載された成熟肝細胞を用いることを含む、被検物質のスクリーニング方法。
請求項５に記載された成熟肝細胞を用いることを含む、肝炎ウイルスの培養方法。
請求項５に記載された成熟肝細胞が非ヒト哺乳動物に移植された、ヒト肝臓モデル動物。
ヒト肝前駆細胞又は成熟肝細胞を用いて、被検物質の代謝及び／又は肝毒性を評価するためのキットであって、
ヒト成熟肝細胞を血清、Ａ−８３−０１及びＣＨＩＲ９９０２１を含有する培地で培養することにより調製されたヒト肝前駆細胞、又は該ヒト肝前駆細胞から誘導された成熟肝細胞を含む、キット。