KR20060092861A - 인간 간세포 유사 세포 및 그의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종래의 시스템의 개변에 의해, 인간 간세포의 표현형에 더욱 가까운 인간 간세포 유사 세포를 제조하는 것을 과제로 한다. 또한, 상기 인간 간세포 유사 세포 및 그의 이용법을 제공하는 것도 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본원 발명자 등은 종래의 시스템에 있어서 총 배양기간을 연장하고, 추가로 배지 중에 덱사메타존을 첨가함으로써, 종래 보다도 인간 간세포에 가까운 세포형태를 갖는 인간 간세포 유사 세포를 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 상기 세포는 시토크롬 P450(CYP), 다제내성 관련 단백질(MRP) 및 다제내성(MDR) 단백질을 포함하는 초대 정상 인간 배양 간세포의 형태학적 특징 및 기능적 특징 양쪽을 나타내는 것이 판명되었다.

본 발명의 인간 간세포 유사 세포를 이용함으로써, 동물 모델을 필요로 하지 않고 후보 약제 등의 검사대상 화합물의 대사나 간독성을 평가할 수 있고, 또한, 간질환 치료제, 간염 바이러스 감염 저해제, 바이러스성 간염 치료제의 스크리닝을 할 수 있다.

인간 간세포 유사 세포, 덱사메타존, 시토크롬, 스크리닝

Description

인간 간세포 유사 세포 및 그의 이용{Human hepatocyte-like cells and uses thereof}

도 1은 접착 단층 배양에 있어서의 hMSC의 간장분화(肝臟分化)를 나타내는 도면 및 사진이다. A: 단층 배양에 있어서의 hMSC로부터의 간세포 유도에 관한 분화 프로토콜의 통합된 개략적 설명(공정 1~4)을 나타내는 도면이다. B: pALB-EGFP/hMSC로부터의 간세포 분화과정에 있어서의 형태학적 변화 및 GFP 발현의 유도를 나타내는 사진이다. C: HIFC 처리를 행하지 않은 hMSC를 나타내는 사진이다. D: HIFC 처리를 행한 hMSC의 형태를 나타내는 사진이다.

도 2는 간장-특이적 마커의 발현 및 hMSC-유래 간세포의 인비트로 기능을 나타내는 사진 및 도면이다. A: RT-PCR법에 의한 간세포-특이적 유전자 발현을 나타내는 사진이다. RNA는 HIPC 미처치의 hMSC(레인 1), HIFC로 자극한 hMSC(레인 2) 및 주형(鑄型) 없음(레인 3, 음성 대조)으로부터 단리(單離)하고, 인간 배양한 간세포의 cDNA(레인 4, 양성 대조; AFP는 HepG2 세포 scDNA)이다. B: 알부민 생성, C: 글루코오스 생성, D: 암모니아 분해 및 E: 요소 합성을 나타내는 도면이다. B~E에 있어서, (1): GFP-양성 hMSC, (2): HIFC 처리를 행하지 않은 hMSC, (3): 인간 배양한 간세포를 나타낸다. 데이터는 평균값±s.e.m.으로서 나타내고, ANOVA를 사용해서 해석하였다. 실험 수는 각 실험군마다 3회였다. F: HIFC-자극한 hMSC의 G- 밴드 형성한 핵형(核型)을 나타내는 사진이다.

도 3은 hMSC 유래 간세포에 있어서의 시토크롬(cytochrome) P450 활성을 나타내는 도면이다. CYP3A4(A), YP2C9(B) 및 CYP1A1(C)에 관한 P450 활성을, hMSC 유래 간세포, 초대(初代) 정상 인간 배양 간세포(양성 대조), HIFC 처리를 행하지 않은 hMSC(음성 대조)에 있어서 측정하였다. CYP3A4 및 CYP2C9는 리팜피신(Rif)에 의해 유도하였다. CYP1A1은 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene)(3MC)에 의해 유도하였다. 원데이터(raw data)는 평균 세포용량에 대해서 표준화하고, 세포수의 차를 보정하였다. 결과는, 평균값±s.e.m.(n=3)*로서 나타내고, P＞0.05였다.

도 4는 hMSC 유래 간세포의 MRP 및 MDR 유전자의 발현 패턴 및 mRNA 레벨을 나타내는 사진이다. A: RT-PCR법에 의한 MRP 유전자(MRP 1~3)의 발현을 나타내는 사진이다. HIFC 처리를 행하지 않은 hMSC(레인 1), HIFC-자극한 hMSC(레인 2), 초대 배양 인간 배양 간세포(레인 3, 양성 대조), 헬라세포(HeLa cell)(레인 4) 및 주형 없음(레인 5, 음성 대조)에 있어서의 유전자 발현을 나타낸다. B: RT-PCR법에 의한 MDR 유전자(MDR1, 3) 및 CD81의 발현을 나타내는 사진이다. HIFC 처리를 행하지 않은 hMSC(레인 1), HIFC-자극한 hMSC(레인 2), 초대 정상 인간 배양 간세포(레인 3, 양성 대조) 및 주형 없음(레인 4, 음성 대조)에 있어서의 유전자 발현을 나타낸다.

도 5는 본 발명에서 얻어진 간세포 유사 세포에 의한 HCV 감염실험의 결과를 나타낸다. 세로축은 HCV의 카피수를 나타내고, 가로축은 일수를 나타낸다.

도 6은 CCl₄-유도 간손상 마우스로의 hMSC-유래 간세포의 이식결과를 나타내는 사진이다. 연속 조직 절편을 항인간 알부민 항체에 의해 염색하였다. a. 생리식염액을 투여한 CCl₄-처치 마우스(n=4)의 간절편의 HE 염색. b. hMSC-유래 간세포의 이식 후 1일째에서의 CCl₄-처치 마우스 간절편 1의 HE-염색(n=6). c, d. a 및 b의 연속 절편의 인간 알부민 면역염색(FITC, 녹색). 화살표는 덩어리형상으로 간상(肝床)에 편입된 hMSC-유래 간세포를 가리킨다. PV, 문맥(門脈). 척도의 막대는 10 ㎛를 나타낸다.

본 발명은 인간 간세포 유사 세포 및 그의 이용에 관한 것이다.

인간 간엽계 간세포(間葉系幹細胞;mesenchymal stem cell)는 성인 골수에 존재하여 미분화 세포로서 복제할 수 있고, 또한 몇개의 상이한 조직계통이 되는 능력을 갖는 다능성(多能性) 세포인 것으로 생각되고 있다.

간엽계 간세포(MSC)는 맨처음 Friedenstein에 의해(1982), 골수(BM)로부터 소태아혈청 존재하에서의 플라스틱 위로의 단순한 파종(播種)에 의해 단리되었다(비특허문헌 1). 골수 천자액(穿刺液)으로부터 단리된 인간 MSC(hMSC)는, 전반적으로 면역 표현형을 공유하고, SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124에 대해서는 일률적으로 양성이지만, CD14, CD34 및 림프구 공통 항원 CD4518 에 대해서는 음성이다. hMSC는 다능성으로, 인비트로(in vitro)에 있어서 규정된 조건하에서 배양된 경우에, 적어도 3계통으로 분화 가능하다(골원성(骨原性), 연골원성 및 지질 생성성)(비특허문헌 1).

지금까지 hMSC(CD34-양성 세포획분)를 포함하는 성인 BM으로부터 성숙 간세포를 분화하고자 하는 시도가 보고되어 있다(비특허문헌 2~4). 그러나 인비트로에 있어서의 직접 분화에 의해서는, 기능성 간세포는 유도되고 있지 않다.

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[특허문헌 17] US 6,022,540

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[특허문헌 19] US 6,087,113

[특허문헌 20] US 6,149,906

[특허문헌 21] US 6,174,333

[특허문헌 22] US 6,225,119

[특허문헌 23] US 6,239,157

[특허문헌 24] US 6,255,112

[특허문헌 25] US 6,261,549

[특허문헌 26] US 6,281,012

[특허문헌 27] US 6,322,784

[특허문헌 28] US 6,328,960

[특허문헌 29] US 6,342,370

[특허문헌 30] US 6,355,239

[특허문헌 31] US 6,358,702

[특허문헌 32] US 6,368,636

[특허문헌 33] US 6,379,953

[특허문헌 34] US 6,387,367

[특허문헌 35] US 6,387,369

[특허문헌 36] US 6,482,231

[특허문헌 37] US 6,541,024

[특허문헌 38] US 6,685,936

[특허문헌 39] US 6,709,864

[특허문헌 40] US 6,761,887

[특허문헌 41] US 6,797,269

최근, 본 발명자 등은 간단한 접착 단층 배양조건을 사용하여, 마우스, 랫트 및 원숭이의 배성간(胚性肝;embryonic stem)(ES)세포로부터, 간세포 특이적 분화 유도를 직접할 수 있는 증식인자를 동정(同定)하였다(일본국 특허출원 제2004-059705). 본 발명자 등의 HIFC(간세포 유도인자 칵테일) 분화시스템은 3공정으로 되고 효율이 높아, 1.0×10⁵개의 미분화 마우스 ES 세포를 출발재료로서 사용하는 경우에는, 약 3.0×10⁶개의 기능적 성숙 간세포가 생산되었다. ES 세포-유래의 간세포는 RT-PCR에 의한 간세포 특이성 유전자의 발현 및 몇개의 대사활성에 관하여, 성숙 간세포의 특징을 명확하게 하였다. 더욱이 이들은, 동물에 있어서의 이식 가능성을 나타내었다.

본 발명은 이러한 상황에 비추어 이루어진 것으로, 그 목적은 종래의 시스템의 개변(改變)에 의해, 인간 간세포의 표현형에 더욱 가까운 인간 간세포 유사 세포를 제조하는 것에 있다. 상기 인간 간세포 유사 세포 및 그의 이용법을 제공하는 것도 과제로 한다.

본 발명자 등은 시행착오의 결과, 종래의 시스템에 있어서 총 배양기간을 연장하고, 추가로 배지 중에 덱사메타존(dexamethasone)을 첨가함으로써, 종래 보다도 인간 간세포에 가까운 세포형태를 갖는 인간 간세포 유사 세포를 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 상기 세포는 시토크롬 P450(CYP), 다제내성 관련 단백질(MRP) 및 다제내성(MDR) 단백질을 포함하는 초대 정상 인간 배양 간세포의 형태학적 특징 및 기능적 특징 양쪽을 나타내는 것이 판명되었다.

본 발명의 인간 간세포 유사 세포를 이용함으로써, 동물 모델을 필요로 하지 않고 후보 약제 등의 검사대상 화합물의 대사나 간독성(肝毒性)을 평가할 수 있고, 또한, 간질환 치료제, 간염 바이러스 감염 저해제, 바이러스성 간염 치료제의 스크 리닝을 할 수 있다.

즉, 본 발명은 이하의 [1]~[10]을 제공하는 것이다.

[1] 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하고, 총 배양기간이 약 2주일~약 13주일인 것을 특징으로 하는, 인간 간세포 유사 세포의 제조방법.

(a) 다분화능(多分化能)을 갖는 인간 유래의 세포를 이하의 (i)~(iii) 중 어느 하나의 증식인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정

(i) 산성 섬유아세포 증식인자, 섬유아세포 증식인자 4 및 간세포 증식인자

(ii) 액티빈 A(activin A), 상피세포 증식인자 및 β-신경생장인자로부터 선택되는 증식인자 및 산성 섬유아세포 증식인자

(iii) 액티빈 A 및 간세포 증식인자로부터 선택되는 증식인자 및 섬유아세포 증식인자 4

(b) 공정 (a)에서 배양된 세포를, 온코스타틴 M(oncostatin M)을 포함하는 배지에서 배양하는 공정

(c) 공정 (b)에서 배양된 세포를, 덱사메타존을 포함하는 배지에서 배양하는 공정

[2] [1]에 있어서, 콜라겐 코팅 배양접시를 사용하는 방법.

[3] [1]에 있어서, 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포가, 배성간세포, 성인 간세포, 간엽계 간세포, 제대혈세포, 또는 인위적으로 다분화능을 획득한 세포인 방법.

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세 포.

[5] [4]의 인간 간세포 유사 세포를 포함하는 간질환의 치료제.

[6] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 검사대상 화합물의 대사를 평가하는 방법.

(a) [4]의 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

(b) 인간 간세포 유사 세포에 접촉시킨 검사대상 화합물의 대사를 측정하는 공정

[7] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 검사대상 화합물의 간독성을 평가하는 방법.

(a) [4]의 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

(b) 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 장해 정도를 측정하는 공정

[8] 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 간질환 치료제의 스크리닝방법.

(a) [4]의 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

(b) 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 기능을 측정하는 공정

(c) 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 기능을 앙진(昻進)시키는 화합물을 선택하는 공정

[9] 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 간염 바이러스 감염 저해제의 스크리닝방법.

(a) [4]의 인간 간세포 유사 세포에, 검사대상 화합물의 존재하에 있어서 간염 바이러스를 접촉시키는 공정

(b) 간염 바이러스를 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포에 있어서의 간염 바이러스의 감염 유무를 검사하는 공정

(c) 간염 바이러스의 감염을 저해하는 화합물을 선택하는 공정

[10] 이하의 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 바이러스성 간염 치료제의 스크리닝방법.

(a) [4]의 인간 간세포 유사 세포에, 간염 바이러스를 접촉시키는 공정

(b) 간염 바이러스가 감염된 인간 간세포 유사 세포에, 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

(c) 검사대상 화합물을 접촉시킨 세포에 있어서의 간염 바이러스의 증식을 측정하는 공정

(d) 간염 바이러스의 증식을 저해하는 화합물을 선택하는 공정

본 발명은 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포로부터, 인간 간세포 유사 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서는 먼저 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포를 인간 간세포 유사 세포로 분화 유도시킨다.

다분화능을 갖는 인간 유래의 세포로부터 인간 간세포 유사 세포로의 분화 유도는, 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포를, 이하의 (i)~(iii) 중 어느 하나의 증식인자를 포함하는 배지에서 배양함으로써 실시할 수 있다(공정 (a): 실시예에 있어서의 공정 2에 대응).

(i) 산성 섬유아세포 증식인자(aFGF), 섬유아세포 증식인자 4(FGF4) 및 간세포 증식인자(HGF)

(ii) 액티빈 A, 상피세포 증식인자(EGF) 및 β-신경생장인자(βNGF)로부터 선택되는 증식인자 및 aFGF

(iii) 액티빈 A 및 HGF로부터 선택되는 증식인자 및 FGF4

본 발명에 있어서는, (i)에 기재된 증식인자를 사용함으로써, 보다 효율적으로 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포를 분화 유도할 수 있다. 또한, 산성 섬유아세포 증식인자(aFGF)는, 섬유아세포 증식인자 1(FGF1)이라 칭해지는 경우도 있다.

또한, 본 발명의 증식인자는 인간 유래가 아니어도, 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포를 분화 유도시키는 것이 가능하다.

본 발명의 방법은, 이어서 공정 (a)에서 배양된 세포를 온코스타틴 M을 포함하는 배지에서 배양한다(공정 (b): 실시예에 있어서의 공정 3에 대응). 이 공정에 있어서, 분화 유도한 세포를 성숙시킨다.

본 발명의 방법은, 이어서 공정 (b)에서 배양된 세포를 덱사메타존(DEX)을 포함하는 배지에서 배양한다(공정 (c): 실시예에 있어서의 공정 4에 대응). 보다 구체적으로는, 공정 (b) 후의 배양액에 DEX를 첨가하고, 추가로 배양을 계속한다. 또한, 본 발명에 있어서는 공정 (a), (b)에 DEX를 첨가해서 배양하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서, 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포로서는, 예를 들면 배 성간세포(ES 세포), 성인 간세포, 간엽계 간세포, 제대혈세포, 또는 인위적으로 다분화능을 획득한 세포를 들 수 있지만, 여러 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지고 있는 세포라면, 본 발명의 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포에 포함된다. 상기의 「인위적으로 다분화능을 획득한 세포」로서는, 예를 들면 유전자 조작을 포함하는 클론 기술에 의해 다분화능을 획득한 체세포를 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 간엽계 간세포를 사용하는 경우, 분화 유도 전에 실시예와 같이 전배양(前培養)(실시예에 있어서의 공정 1에 대응)해도 되지만, 이 공정을 생략하는 것도 가능하다. 이 전배양 공정에 있어서, 다분화능을 유지한 상태에서 미분화 간엽계 간세포를 증식시키는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서 ES 세포를 사용하는 경우, 공정 (a) 전에, 레티노인산(retinoic acid)(RA), 백혈병 저해인자(LIF) 및 HGF로부터 선택되는 적어도 하나의 증식인자를 포함하는 배지에서 전배양해도 된다. 이 전배양 공정을 실시함으로써, ES 세포를 보다 효율적으로 분화 유도할 수 있다. 전배양 공정에서는 RA에 더하여 LIF 및/또는 HGF를 포함하는 배지에서 배양함으로써, ES 세포를 보다 효율적으로 분화 유도할 수 있다.

본 발명에 있어서의 세포배양법은, 매트릭스 코팅이 상이한 배양접시, 또는 매트릭스 코팅의 유무가 상이한 배양접시를 사용한 2차원 배양법, 마트리겔(matrigel) 등의 소프트겔이나 콜라겐 스폰지 등을 사용한 3차원 배양법, 또는 그들을 병용하는 방법을 들 수 있지만, 바람직하게는 매트릭스 코팅이 상이한 배양접시, 또는 매트릭스 코팅의 유무가 상이한 배양접시를 사용한 2차원 배양법이다.

본 발명의 방법에 있어서 간엽계 간세포를 사용하는 경우, 전배양 공정에서는 비코팅 배양접시를 사용하고, 공정 (a), (b) 및 (c)에서는, 콜라겐 코팅 배양접시(바람직하게는 I형 콜라겐 코팅 배양접시, 이하 동일)를 사용하여 세포를 배양할 수 있다. 콜라겐 코팅 배양접시 대신에, 공정 (a)에서는 젤라틴 코팅 배양접시, 공정 (b) 및 (c)에서는, 라미닌(laminin) 코팅 배양접시, 아텔로콜라겐(atelocollagen) 배양접시, 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 코팅 배양접시를 사용하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서 ES 세포를 사용하는 경우, 전배양 및 공정 (a)에서 젤라틴 코팅 배양접시를 사용하고, 공정 (b)에서 콜라겐 코팅 배양접시 또는 라미닌 코팅 배양접시를 사용하며, 공정 (c)에서 콜라겐 코팅 배양접시, 라미닌 코팅 배양접시, 아텔로콜라겐 코팅 배양접시, 또는 히알루론산 코팅 배양접시를 사용하여 세포를 배양할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 간엽계 간세포나 ES 세포 이외의 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포를 사용하는 경우는, 간엽계 간세포나 ES 세포의 예를 참고로, 적절히 배양접시를 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 있어서, 공정 (a), (b), (c), 전배양 공정의 보다 상세한 배양조건이 개시되어 있지만, 본 발명의 방법의 배양조건은 이들 특정 조건에 한정되지 않고, 일반적으로 허용되는 조건을 취할 수 있다. 예를 들면, 분화 유도 개시의 세포수로서는, 5.0×10³~5.0×10⁶ 세포/배양접시의 범위를 예시할 수 있 다.

본 발명의 방법에 있어서의 배양기간은 특별히 제한은 없지만, 본 발명의 방법에 있어서, 간엽계 간세포를 사용하는 경우, 바람직하게는 공정 (a), (b), (c)의 총 배양기간이 약 2주일~약 13주일이고, 보다 바람직하게는 약 3주일~약 12주일이며, 더욱 바람직하게는 약 3주일~약 10주일, 특히 바람직하게는 약 3주일~약 8주일이다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서 간엽계 간세포를 사용하는 경우, 공정 (a), (b), (c)의 각 배양기간의 조합으로서, 이하의 1)~5)를 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

1) 공정 (a): 10일간~12일간, 공정 (b): 2일간~3일간, 공정 (c): 0일간

2) 공정 (a): 12일간~16일간, 공정 (b): 4일간~7일간, 공정 (c): 1일간~5일간

3) 공정 (a): 14일간~21일간, 공정 (b): 4일간~7일간, 공정 (c): 3일간~30일간

4) 공정 (a): 18일간~24일간, 공정 (b): 7일간~10일간, 공정 (c): 25일간~35일간

5) 공정 (a): 25일간~28일간, 공정 (b): 11일간~14일간, 공정 (c): 36일간~46일간

또한, 전배양 공정에서는 4일간~6일간의 배양기간을 예시할 수 있지만, 이것에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에 있어서, 간엽계 간세포 이외의 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포를 사용하는 경우, 공정 (a), (b), (c)의 총 배양기간 및 공정 (a), (b), (c), 전배양 공정의 각 배양기간은, 간엽계 간세포의 배양기간을 참고로, 적절히 설정할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 증식인자로서는 예를 들면, RA(all-trans-Retinoic Acid: 와코쥰야쿠 가부시키가이샤), LIF(ESGRO^TM(10⁷ units): 후나코시 가부시키가이샤), HGF(Human HGF: 가부시키가이샤 베리타스), aFGF(Human FGF-acidic: 가부시키가이샤 베리타스), FGF4(Human FGF-4: 가부시키가이샤 베리타스), OsM(Human Oncostatin M: 가부시키가이샤 베리타스) 및 DEX(Dexamethasone: 산코쥰야쿠)를 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서는, 상기 분화 유도방법에 의해 인간 간세포 유사 세포, 특히 인간 성숙 간세포 유사 세포를 제조할 수 있다.

분화 세포가 인간 간세포 유사 세포인 것은, 간세포 마커, 또는 간세포의 기능을 지표로 확인할 수 있다.

간세포 마커로서는, ALB, TTR, CYP3A4, CYP1A1, MRP1, MRP2, MRP3, MDR1, MDR3를 들 수 있다. 또한, 간세포의 기능으로서는 예를 들면, 글루코오스 생산능, 암모니아 대사능, 알부민 생산능, 요소 합성능 등을 들 수 있다. 글루코오스 생산능은, 글루코오스 옥시다아제법에 의해 배양상청 중의 글루코오스 레벨을 분석함으로써 확인할 수 있다. 암모니아 대사능은 개변 인도페놀법(Horn DB & Squire CR, Chim. Acta. 14:185-194, 1966)에 의해, 배양배지 중의 암모니아 레벨을 분석함으로써 확인할 수 있다. 알부민 생산능은 혈청 알부민 농도를 측정하는 방법에 의해, 배양액 중의 알부민 농도를 분석함으로써 확인할 수 있다. 또한, 요소 합성능은, 예를 들면 Colorimetric assay(시그마사)를 사용해서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포를 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포의 기능이나 형태는, 종래의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포의 기능이나 형태와 비교하여, 인간 성숙 세포에 보다 가깝다고 하는 특징을 갖는다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포는, 인 비보에 있어서도 기능한다고 하는 특징을 갖는다. 따라서, 본 발명의 인간 간세포 유사 세포는, 예를 들면 의약분야(예를 들면 재생의약분야)에 있어서 유용하다.

예를 들면, 본 발명의 인간 간세포 유사 세포를 사용함으로써 간질환을 치료할 수 있다(실시예 7을 참조). 예를 들면, 상기 인간 간세포 유사 세포를 직접적으로 간문맥(肝門脈)을 통해 이식하는 방법이나 콜라겐, 폴리우레탄, 기타 공지의 생체(生體) 친화성 재료에 포매(包埋)한 형태로 이식하는 방법에 의해 간질환을 치료할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 상기 공정에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포의 용도도 또한 제공한다. 보다 구체적으로는, 인간 간세포 유사 세포를 포함하는 간질환의 치료제를 제공한다. 또한, 상기 인간 간세포 유사 세포를 사용한 간질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명의 간질환으로서는, 간경변, 극증간염(劇症肝炎), 담도폐쇄증(膽道閉鎖症), 간암, 간염(예를 들면 바이러스성 간염 또는 알코올 성 간염)을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 인간 성숙 간세포 유사 세포는, 예를 들면 간질환의 치료를 목적으로 한 연구분야에 있어서도 유용하다. 예를 들면, 인공장기(인공간장 등)의 연구개발에 있어서, 본 발명의 인간 성숙 간세포 유사 세포를 사용할 수 있다. 더욱이, 이하에 기술하는 바와 같이, 본 발명의 인간 성숙 간세포 유사 세포는, 의약품이나 식품 등의 개발분야에 있어서도 유용하다. 구체적으로는, 검사대상 화합물의 대사나 간독성의 평가, 간질환 치료제, 간염 바이러스 감염 저해제, 또는 바이러스성 간염 치료제의 스크리닝에 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포를 이용함으로써, 검사대상 화합물의 대사나 간독성을 평가하는 것이 가능하다.

검사대상 화합물의 대사나 간독성의 평가에는, 종래, 동물 모델 등이 사용되고 있었지만, 한번에 평가할 수 있는 검사대상 화합물의 수에 제한이 있고, 또한 동물 모델 등에서 얻어진 평가를, 그대로 인간에게 적용할 수 없다고 하는 문제가 있었다. 그 때문에, 인간 간암 세포주나 초대 정상 인간 배양 간세포를 사용하는 평가방법이 채용되고 있다. 그러나, 인간 간암 세포주는 암세포이기 때문에, 인간 간암 세포주에서 얻어진 평가를, 인간 정상 간세포에 적용할 수 없다고 하는 가능성이 남는다. 또한, 초대 정상 인간 배양 간세포는 안정 공급이나 비용면에서의 문제가 있다. 또한, 초대 정상 인간 배양 간세포를 불사화(不死化)한 세포주는, 불사화하지 않은 경우와 비교하여, CYP3A4의 활성이 저하되어 있는 것이 나타내어져 있다(International Journal of Molecular Medicine 14: 663-668, 2004, Akiyama, I. et al.). 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포를 이용함으로써, 이러한 문제를 해결할 수 있다.

본 발명은 검사대상 화합물의 대사를 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 인간 간세포 유사 세포에 접촉시킨 검사대상 화합물의 대사를 측정한다.

본 발명에서 사용하는 검사대상 화합물로서는 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 생체 이물질, 천연 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩티드 등의 단일 화합물 및 화합물 라이브러리, 유전자 라이브러리의 발현산물, 세포 추출물, 세포 배양상청, 발효 미생물 생산물, 해양생물 추출물, 식물 추출물 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

생체 이물질로서는, 예를 들면 약제나 식품의 후보 화합물, 기존의 약제나 식품을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않고, 생체에 있어서 이물질인 한, 본 발명의 생체 이물질에 포함된다. 보다 구체적으로는, 리팜핀(Rifampin), 덱사메타존(Dexamethasone), 페노바르비탈(Phenobarbital), 씨글리라존(Ciglirazone), 페니토인(Phenytoin), 에파비렌즈(Efavirenz), 심바스타틴(Simvastatin), β-나프토플라본(β-Naphthoflavone), 오메프라졸(Omeprazole), 클로트리마졸(Clotrimazole), 3-메틸콜란트렌(3-Methylcholanthrene) 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서의 「접촉」은, 통상, 배지나 배양액에 검사대상 화합물을 첨가함으로써 행하지만, 이 방법에 한정되지 않는다. 검사대상 화합물이 단백질 등 인 경우에는, 상기 단백질을 발현하는 DNA 벡터를 상기 세포로 도입함으로써, 「접촉」을 행할 수 있다.

검사대상 화합물의 대사는, 당업자에게 주지의 방법으로 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면 검사대상 화합물의 대사산물이 검출된 경우에, 검사대상 화합물이 대사된 것으로 판정된다. 또한, 검사대상 화합물의 접촉에 의해 CYP(시토크롬 p450), MDR, MPR 등의 효소유전자의 발현이 유도된 경우나, 이들 효소의 활성이 상승한 경우에, 검사대상 화합물이 대사된 것으로 판정된다.

또한, 본 발명은 검사대상 화합물의 간독성을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 장해 정도를 측정한다. 장해 정도는, 예를 들면 인간 간세포 유사 세포의 생존률, GOT, GPT 등의 간장해 마커를 지표로 측정할 수 있다.

예를 들면, 인간 간세포 유사 세포의 배양액에 검사대상 화합물을 첨가함으로써, 인간 간세포 유사 세포의 생존률이 저하되는 경우, 상기 검사대상 화합물은 간독성을 갖는 것으로 판정되고, 생존률에 유의(有意)한 변화가 없는 경우, 상기 검사대상 화합물은 간독성을 갖지 않는 것으로 판정된다. 또한, 예를 들면, 인간 간세포 유사 세포의 배양액에 검사대상 화합물을 첨가 후, 배양액 중의 GOT나 GPT가 상승하는 경우, 상기 검사대상 화합물은 간독성을 갖는 것으로 판정되고, GOT나 GPT에 유의한 변화가 없는 경우, 상기 검사대상 화합물은 간독성을 갖지 않는 것으로 판정된다.

또한, 이미 간독성의 유무가 판명되어 있는 화합물을 대조로서 사용함으로써, 보다 정확하게 검사대상 화합물이 간독성을 갖는지의 여부를 평가할 수 있다.

또한, 본 발명은 간질환 치료제의 스크리닝방법을 제공한다. 상기 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 기능을 측정한다. 이어서, 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 기능을 앙진시키는 화합물을 선택한다.

본 발명에 있어서의 간세포 유사 세포의 기능은, 예를 들면 글루코오스 생산능, 암모니아 대사능, 알부민 생산능, 요소 합성능, CYP 등의 효소의 활성을 지표로 측정할 수 있다.

글루코오스 생산능은, 글루코오스 옥시다아제법에 의해 배양상청 중의 글루코오스 레벨을 분석함으로써 확인할 수 있다. 암모니아 대사능은, 개변 인도페놀법(Horn DB & Squire CR, Chim. Acta. 14: 185-194, 1966)에 의해, 배양배지 중의 암모니아 레벨을 분석함으로써 확인할 수 있다. 알부민 생산능은 혈청 알부민 농도를 측정하는 방법에 의해, 배양액 중의 알부민 농도를 분석함으로써 확인할 수 있다. 또한, 요소 합성능은, 예를 들면 Colorimetric assay(시그마사)를 사용하여 확인할 수 있다. 본 발명의 CYP는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 CYP1A1, CYP2C8, CYP2C9, CYP3A4 등을 들 수 있다. CYP의 활성 측정방법은 당업자에게 주지의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포의 기능이나 형태는, 인간 성숙 간세포에 보다 가깝기 때문에, 간염 바이러스에 감염될 수 있다.

본 발명은 간염 바이러스 감염 저해제의 스크리닝방법을 제공한다. 상기 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포에, 검사대상 화합물의 존재하에 있어서 간염 바이러스를 접촉시킨다. 이어서, 간염 바이러스를 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포에 있어서의 간염 바이러스의 감염 유무를 검사한다. 이어서, 간염 바이러스의 감염을 저해하는 화합물을 선택한다. 세포로의 간염 바이러스의 접촉은, 통상의 방법에 의해 실시할 수 있다.

간염 바이러스로서는 특별히 제한은 없지만, C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스가 포함된다. 이들 간염 바이러스는, 주화(株化)된 것이어도 되고, 간염 바이러스 감염자로부터 직접 단리된 것이어도 된다. 또한, 정제된 상태여도 되고, 천연(crude)상태(예를 들면 감염자로부터 얻어진 혈청의 상태)여도 된다.

지금까지 인비트로에 있어서의 고효율의 C형 간염 바이러스의 감염계는 미개발이었다. 그 때문에, 간세포를 사용하여 C형 간염 바이러스의 감염 저해제나 간염 치료제를 개발하는 것은 현실적이지 못하고, 또한, C형 간염 바이러스의 라이프 사이클의 연구가 진전되고 있지 않다고 하는 현상(現狀)이 있었다. 이에 대해, 본 발명자 등은 본 발명의 인간 간세포 유사 세포가 C형 간염 바이러스에 감염되는 것, 그 감염효율이 매우 높은 것을 발견하였다. 이 결과는, 본 발명의 인간 간세포 유사 세포를 사용함으로써, C형 간염 바이러스의 감염 저해제나 간염 치료제를 스크리닝할 수 있는 것, C형 간염 바이러스이 라이프 사이클의 해명이 가능한 것을 나 타내고 있다.

간염 바이러스의 감염 유무는, 예를 들면 세포 중의 간염 바이러스량을 지표로 검사할 수 있다. 세포 중의 간염 바이러스량은, 예를 들면 세포 중의 간염 바이러스의 RNA량을 지표로 판정할 수 있다. 간염 바이러스의 RNA량은 통상의 방법에 따라 측정할 수 있다. 또한, 본 발명자 등이 확립한 방법에 의해 측정해도 된다(T. Takeuch. et al. Real-Time Detection System for Quantification of Hepatitis C Virus Genome. Gastroenterology 1999, 116: 636-642).

더욱이, 본 발명은 바이러스성 간염 치료제의 스크리닝방법을 제공한다. 상기 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포에, 간염 바이러스를 접촉시킨다. 이어서, 간염 바이러스가 감염된 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 검사대상 화합물을 접촉시킨 세포에 있어서의 간염 바이러스의 증식을 측정한다. 이어서, 간염 바이러스의 증식을 저해하는 화합물을 선택한다.

본 발명의 간염 바이러스의 증식을 저해하는 화합물에는, 1) 검사대상 화합물을 접촉시키지 않은 경우와 비교하여, 간염 바이러스의 증식을 저해하는 화합물, 2) 간염 바이러스의 증식을 완전히 저해하는 화합물, 3) 간염 바이러스를 소실시키는 화합물 전부가 포함된다. 간염 바이러스의 증식이나 소실은, 세포 중의 간염 바이러스량을 측정함으로써 검사할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않는다. 본 실시예에 있어서는, 통계 해석을 시판의 소프트 웨어 패키지(StatView, SAS institute Inc.)를 사용해서 행하였다. 스튜던트 t-검정을 통계학적 평가를 위해 행하고, p＜0.05를 유의한 것으로 인정하였다. 2종류 보다도 많은 시료를 비교하는 경우는, 한쪽 ANOVA 검정을 행하고, 데이터는 평균값±s.e.m.으로서 표시하였다. 모든 인비트로에 있어서의 결과는, 적어도 3회의 독립된 실험에 기초하고 있다.

[실시예 1] 인간 간엽계 간세포(hMSC)주의 배양 및 분화의 유도

인간 간엽계 간세포(hMSC)주를 다카라(일본)로부터 입수하여, 5% 소태아혈청을 함유하는 DMEM에 있어서, 가습(加濕) 대기 중 5% CO₂ 함유하, 37℃에서 배양하였다. 마우스 알부민 프로모터/인핸서(enhancer)의 하류에 녹색 형광 단백질(GFP)을 연결한 벡터(pALB-EGFP)의 특징을 이용해서, 형광 활성에 의해 평가하였다(G. Quinn, T. Ochiya, M. Terada, T. Yoshida, Biochem. Biophys. Res. Commun. 276, 1089 (2000), C. H. Sellem, M. Frain, T. Erdos, J. M. Sala-Trapat, Dev. Biol. 102, 51 (1984)). 도입 유전자의 대비를 위해, pALB-EGFP 선형상화된 플라스미드 DNA를 사용하고, hMSC를 파종 후 48시간 일렉트로포레이션(electroporation) 하였다(420V, 25 μF, pALB-EGFP 벡터 50 ㎍). G418-저항성 pALB-EOFP/hMSC를 조제하고, 간엽계 간세포 증식배지(MSCGM: 10% 소태아혈청을 첨가한 배양액)가 들어 있는 플라스틱접시 위에서 배양하였다.

hMSC로부터 간세포를 최대로 유도하기 위해, 이하의 4개의 공정으로 배양·분화를 행하였다(도 1A).

공정 1: MSCGM에 의한 hMSC의 증식

pALB-EGFP/hMSC는 hMSC 배양배지를 동반하는 플라스틱접시 위에서 5일간 배양하였다.

공정 2: pALB-EGFP/hMSC의 14일간의 HIFC 처치

5일 후, 세포를 계대(繼代) 및 HIFC(FGF1, 5000 ng/㎖; FGF4, 40 ng/㎖; HGF, 250 ng/㎖; VERITAS, 도쿄, 일본)의 존재하에서, 100-mmI형 콜라겐 코팅 플레이트(아사히테크노가라스사) 1개당 10⁶개 세포로, 간세포 배양배지(HCM), 트랜스페린(5 mg/㎖), 헤미 호박산 히드로코르티존-21(10^-6M), 소혈청 알부민(0.5 mg/㎖), 아스코르브산(2 mM), 인슐린(5 ㎍/㎖) 및 겐타마이신(50 ㎍/㎖)(산코쥰야쿠, 도쿄, 일본)을 함유하는 개변 William E 배지에 의해 2주간 배양하였다.

공정 3: 4일간의 OsM 처치

그 후 세포를, 냉(冷)PBS(-)에 의해 3회 세정하고, 0.05% 콜라게나아제(기브코-BRL, 도쿄, 일본) 및 디스파아제 1000 U/㎖(고도슈세이, 도쿄, 일본)를 함유하는 PBS에 있어서 37℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 박리한 세포를, 무혈청 DMEM으로 2회 세정한 후, OsM(30 ng/㎖)을 함유하는 HCM 배지(William E 배지에, 트랜스페린, 헤미 호박산 히드로코르티존, 소혈청 알부민, 아스코르브산, 인슐린, 겐타마이신을 첨가한 용액) 중에, 100-mmI형 콜라겐 코팅 플레이트당 10⁶개 세포로 재현탁하였다.

공정 4: 덱사메타존(10^-8M)을 함유하는 HCM의 공급

파종 4일 후, 세포에 덱사메타존(10^-8M)을 함유하는 HCM을 공급하여 3일간 배양하였다.

또한, 본 발명자 등은 공정 2: 21일간, 공정 3: 7일간, 공정 4: 30일간의 배양기간 등이더라도, 이하에 나타내는 결과가 얻어지는 것을 발견하였다.

GFP 유전자 발현을 형광현미경으로 모니터링하였다. 매트릭스; 라미닌, 히드로넥틴 및 피브로넥틴을, 각각 10 ㎍/㎖, 6 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖로 사용하였다(아사히테크로가라스).

HIFC로 처치한 세포는, 매우 높은 비율로 GFP-양성 세포(73.2±5.7%)를 발생시키는 것을 발견하였다. 다른 한편으로, HIFC-음성 배지에서 처치한 세포에 있어서는, GFP 양성 세포는 출현하지 않았다(도 1B). HIFC 처리를 행한 hMSC를 현미경 분석한 바, 이핵(二核)세포를 동반하는 간세포 유사 형태가 명확해지고, 또한, 공정 2의 배양개시로부터 8주일 후에는 담소관(膽小管)이 빈번히 인지되었다(도 1C 및 D). 이들 결과는, 증식인자로 자극하면서 배양을 행하고, 미분화의 hMSC로부터 GFP-양성 간세포 유사 세포를 생산할 때, 이 분화시스템이 높은 효율을 나타내는 것을 나타내고 있다.

[실시예 2] RT-PCR 해석

GFP-양성 세포의 특징적 성질을 명확하게 하기 위해, 본 발명자 등은 RT-PCR 해석에 의해, 여러 간세포 마커 및 간장에서 고발현하고 있는 전사인자의 유전자 발현을 분석하였다(도 2A).

먼저, 미분화의 ES 세포 및 GFP-양성 세포로부터, ISOGEN 용액(닛폰진, 도쿄, 일본)을 사용하여 단리된 총 RNA를 제조업자의 가이드라인에 따라, DNaseI(증폭 그레이드 시약; 다카라, 교토, 일본)로 처리하였다.

RT-PCR 반응은, One-Step RT-PCR kit(QIAGEN, 도쿄, 일본)를 사용해서 행하였다.

성숙 간세포에 의해 합성되는 가장 풍부한 단백질인 알부민(ALB)의 발현은, 초기 태아 간세포(E12)에서 시작되어, 성인 간세포에 있어서 최고 레벨에 달한다(C. J. Pan, J. K. Lei, H. Chen, J. M. Ward, J. Y. Chou, Arch. Biochem. Biophys. 358, 17(1998)). 글루코오스-6-포스파타아제(G6P), 티로신 아미노 트랜스페라아제(TAT) 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TO)는, 주산기(周産期) 또는 생후의 간세포 특이적 분화가 우수한 효소 마커이다(O. Greengard, Science. 163, 891 (1969), M. Nagao, T. Nakamura, A. Ichihara, Biochem. Biophys. Acta. 867, 179 (1986), T. Thomas, B. R. Southwell, G. Schreber, A. Jaworowski, Placenta. 11, 413 (1990)). HNF4α는 간세포의 형태학적 및 기능적 분화, 간 글리코겐 저장의 축적 및 간 에피네프린의 생성에 필수이다(F. Parviz et al., Nat. Genet 34, 292 (2003)).

모두 단일 밴드의 cDNA 단편으로서 증폭하고, 그 마커의 동정은 서열결정에 의해 확인하였다(도 2A). 이 발현 패턴은 초대 정상 인간 배양 간세포에 있어서의 발현과 유사하다. 더욱이, HIFC 처리를 행한 hMSC는 분석한 모든 간세포 마커 유전 자를 발현하였지만, HIFC 처리를 행하지 않은 hMSC에 있어서 간세포 마커는 검출할 수 없었다.

[실시예 3] 배양세포의 생화학적 분석

GFP-양성 세포는 간세포 특이적 기능의 발휘 여부를 더욱 해명하기 위해, 본 발명자 등은 생화학적 분석을 행하였다.

2×10⁵개 세포/60-mm 접시로 파종한 1일 후, GFP-양성 간세포 또는 대조 ES 세포 및 정상 마우스 간세포를, 배양물 상청 중의 글루코오스 레벨에 대해서, 이미 보고된 글루코오스 옥시다아제법에 의해 분석하였다(H. Yamamoto et al., Hepatology. 37, 983 (2003), 도２C). 암모니아 분해의 세포활성을 시험하기 위해, GFP-양성 세포 또는 대조 ES 세포 및 정상 마우스 간세포를, 2.5 mM NH₄Cl을 함유하는 DMEM 1.0 ㎖ 중에 있어서, 2×10⁵개 세포/60-mm 접시로 배양한 후, 추가로 24시간 인큐베이션하였다. 이 배양배지를 0, 6, 12 및 24시의 시점에서, NH₄Cl 농도에 대해서 「Ammonia-Test Wako」(와코쥰야쿠가가쿠, 도쿄, 일본)에 의해 시험하였다(도 2D). 요소 합성능을 어세이하기 위해, 세포를 5 mmol/L NH₄Cl이 존재하는 HBSS에서 배양하였다. 0, 2, 4 및 6시간 인큐베이션한 후, 배지를 수집하여 제조업자의 가이드라인에 따라 어세이하였다(도 2E).

이들 결과로부터, 배양한 GFP-양성 세포는 알부민, 글루코오스 생산능 및 배양배지로부터 암모니아 분해능, 더 나아가서는 요소 합성능도 갖는 것을 알 수 있 었다(도 2B~E). GFP-양성 세포에 의해 생성된 알부민(공정 2의 배양개시로부터 21일째), 글루코오스(공정 2의 배양개시로부터 21일째) 및 요소의 레벨은, 초대 정상 인간 배양 간세포의 단층 배양 레벨과 유사하였다. 다른 한편으로, HIFC 처리를 행하지 않은 hMSC는 알부민, 글루코오스 또는 요소를 생성하지 않고, 상청으로부터 암모니아를 분해하는 능력을 나타내지 않았다(도 2B~E). G-밴드 형성은 GFP-양성 세포의 염색체수가 46이고, 염색체 총계의 변화는 인정되지 않는 것을 명확하게 하였다(도 2F). 따라서, 본 발명자 등의 신규 배양 시스템에 의해 hMSC로부터 분화된 간세포는, 정상의 성숙 간세포의 표현형, 생화학적 특성 및 기능활성을 나타내고 있다.

[실시예 4] 배양세포의 P450 활성측정

패밀리를 형성하는 CYP1, CYP2 및 CYP3의 시토크롬 P450(CYP)은, 산화 대사기구의 일원으로서, 발암성 물질 등의 약제를 산화하는 것에 있어서, 돌출된 역할을 하고 있다(W. F. Busby, J. M. Ackermann, C. L. Crespi, Drag Metab. Dispos. 27, 246 (1999)). CYP3A4는 성체(成體) 간에 있어서 발현된 주요한 CYP 단백질로, 성체 간에 있어서 총 CYP 단백질의 최대 60%를 차지하는 경우가 있다(T. Shimada, H. Yamazaki, M. Miura, Y. Inui, F. P. Guengerich, J. Pharmacol. Exp. Ther. 270, 414 (1994)). 본 발명자 등은 hMSC 유래 간세포에 있어서, 인듀서(inducer)(Rif: 리팜피신 및 3-MC: 3-메틸콜란트렌)에 반응한 CYP의 유도 활성화를 조사하였다(N. Chauret, A. Gauthier, D. A. Nicoll-Griffith, Drug Metab. Dispos. 26, 1 (1998))(도 3).

P450 활성은 P450-GLO 어세이(Promega)에 의해 측정하였다.

간엽계 간세포 유래의 간세포, 간엽계 간세포 및 초대 정상 인간 배양 간세포를, 많은 CYP 인듀서에 의해 2일간 처리하였다. 3-메틸콜란트렌의 작용을 1 mM으로 시험하고, 리팜피신 및 덱사메타존은 50 mM으로 시험하였다. 모든 인듀서는 DMSO에 용해하고, 최종 비히클 농도 0.1%(v/v)를 얻었다. 비히클 대조의 한 세트를 사용하여 기본적 P450 활성을 측정하고, 제2 세트를 사용하여 백그라운드의 발광을 측정하였다. 2일간 유도 처리한 후, P450-GLO 발광원 CYP450 기질(基質)을, 제조업자의 가이드라인에 따라 각 웰에 첨가하였다. 시토크롬 P450 반응 후, 추가로 1시간 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후 재구성한 루시페린(Luciferin) 검출시약(LDR)을 각 웰에 첨가하고, 20분간 인큐베이션하였다. 상대 광단위(RLU)를 플레이트 리더에 의해 기록하였다.

hMSC-유래 간세포에 있어서의 CYP3A4의 활성은, 초대 배양한 인간 간세포와 마찬가지로, 인듀서로의 폭로(曝露)시에 증대되었다(도 3A). 통상의 배양조건 하의 CYP3A4의 활성 레벨은, Rif 함유 배지에 있어서의 hMSC-유래 간세포에 있어서 약 2배 컸다. 더욱이, CYP3A4 발현 레벨은, 유도 후 인듀서를 포함하지 않는 배양배지에 있어서 정상 레벨로 회복되었다(데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, hMSC 유래 간세포(0.13±0.029 pmol) 및 초대 정상 인간 배양 간세포(0.13±0.014 pmol)에서의 CYP3A4의 농도가 동일한 것을 명확하게 하고 있다.

CYP1A1 및 CYP2C9의 활성 레벨은, 양쪽 모두 인듀서에 의해 증가하였다(도 3B 및 C). 다른 한편으로, CYP 활성은 수종류의 조건의 배지를 사용한 바, 미처리 의 hMSC에 있어서는 검출되지 않았다. 이들 결과는, 접착 단층 배양방식에서 사용된 hMSC-유래 간세포는, 시기를 얻은 효율적 양식으로, 인간 P450 효소의 유도를 위한 신규화합물 실체의 스크리닝을 촉진할 수 있는 것을 시사하고 있다.

[실시예 5] RT-PCR에 의한, hMSC-유래 간세포의 MRP 유전자 발현해석

CYP3A4와 마찬가지로, P-당단백질(P-gp) 수송체는, 정단측(頂端側)의 소장 상피세포 및 간세포에 있어서 발현된다. P-gp는 장벽으로부터 직접 및 간장으로부터 담낭을 매개로 하여 간접적으로, 장관으로 약물을 되돌리는 펌프로서 작용하고, 그 결과 경구 투여된 약물의 생체내 이용률(bioavailability)를 저하시킨다(J. H. Lin, M. Yamazaki, Clin. Pharmacokinet. 42, 59 (2003)). 패밀리를 형성하는 MRP1, MRP2 및 MRP3의 다제내성 관련 단백질(MRP)은, P-gp와 같은 유기 음이온의 담즙분비를 매개하는 주요한 간약물 수송체이다(L, Vernhet, M. P. Seite, N. Allain, A. Guillouzo, O. Fardel, J. Pharmacol. Exp. Ther. 298, 234 (2001)).

따라서, RT-PCR에 의해 hMSC-유래 간세포의 MRP 유전자 발현 프로파일을 해석하였다(도 4A). 더욱이 인간은, 2종류의 기지의 P-gp 유전자, 즉 다제내성 단백질 1(MDR1) 및 MRP를 동반하지 않는 MDR3를 갖는다(C. Chen et al., J. Biol. Chem. 265, 506 (1990), C. R. Lincke, J. J. Smit, T. Van der Velde-Koerts, P. Borst. J. Biol. Chem. 266, 5303 (1991)).

RT-PCR에 사용한 PCR 프라이머는 다음과 같다.

Human MRP1

F: 5'-cgtacttgaactggctggtt-3' (서열번호: 1)

R: 5'-tccagacttcttcatccgag-3' (서열번호: 2)

Human MRP2

F: 5'-tcacttgtgacatcggtagc-3' (서열번호: 3)

R: 5'-atcttcccgttgtctaggac-3' (서열번호: 4)

Human MRP3

F: 5'-actgtggagctcagtgtgtt-3' (서열번호: 5)

R: 5'-ggcatccaccttagtatcac-3' (서열번호: 6)

Human MDR1

F: 5'-acataaactcatgagctttgag-3' (서열번호: 7)

R: 5''-cacgagctatggcaatgcgt-3' (서열번호: 8)

Human MDR3

F: 5'-cgatttggtgcatatctcattgtga-3' (서열번호: 9)

R: 5'-cccttatctcccactcttgtttc-3' (서열번호: 10)

Human CD81

F: 5'-acactgactgctttgaccac-3' (서열번호: 11)

R: 5'-agcaccatgctcaggatcat-3' (서열번호: 12)

Human β-actine

F: 5'- agagcaagag aggtatcctg-3' (서열번호: 13)

R: 5'- agagcatagc cctcgtagat-3' (서열번호: 14)

RT-PCR 분석에 의해 hMSC-유래 간세포에 있어서 MDR1 및 MDR3의 유전자 발현 이 검출되는 것을 알 수 있었다(도 4B). hMSC-유래 간세포에 있어서의 모든 MRP 발현 레벨은, 초대 정상 인간 배양 간세포의 발현 레벨과 동등하였다. 따라서, hMSC로부터 분화된 간세포는, 초대 정상 인간 배양 간세포와, 동일한 발현 패턴 및 mRNA 레벨을 나타내고 있는 것이 명확해졌다.

[실시예 6] C형 간염 바이러스(HCV)의 감염실험

C형 간염 바이러스(HCV)의 감염, 복제과정, 세포외로의 방출기구는, 효율 좋은 in vitro 감염계가 없기 때문에, 전혀 명확해져 있지 않다.

지금까지, C형 간염 바이러스를 배양세포에 감염시키는 시도는 간장 유래의 배양세포에 감염시키고자 하는 시도와, 플라비바이러스(flavivirus)가 림프구계의 세포에서 증식하기 때문에 림프구 유래 세포에 감염시키는 시도가 행해지고 있었다. 림프구계의 세포인 Molt4-Ma 세포나 HPB-Ma 세포, MT-2 세포에 감염시켜 HCV가 증식 가능한 것이 보고되어 있다. 이 사실로부터 인간에게 감염되어 있는 HCV 중에는 림프구 향성(向性)의 바이러스주가 존재하는 것도 생각할 수 있다.

한편, 간암 유래의 배양세포에는 HCV는 감염되어도 거의 증식하지 않는다. 그러나 인간의 태아나, 침팬지의 간장의 초대 배양세포에서는 감염이 성립되어 HCV의 복제가 인정되고 있다. 또한 초대 간세포를 SV40의 large T 항원으로 불사화한 PH5CH8 세포에서 HCV가 감염 증식되고, 또한 배양상청 중에 바이러스 입자를 방출하는 것도 나타내어져 있다. 그러나, 이 배양상청 중에 방출된 바이러스는 새로운 PH5CH8 세포에 재감염시킬 수 없어, 역유전적인(reverse genetical) 해석을 진행시킬 수 없었다. 본 발명자 등은 간암 유래의 배양세포주인 HepG2 세포에 인간의 초 대 배양 간세포를 융합시켜서 IMY 세포를 수립(樹立)하고 HCV에 감염 감수성이 있는 세포주를 작성해서 보고하였다. 이 IMY 세포로부터 배양상청 중에 방출된 바이러스는 새로운 IMY 세포에 재감염시킬 수 있어, 역유전적인(reverse genetical) 해석을 진행할 수 있게 되었다(T. Ito et. al. Acquisition of Susceptibility to Hepatitis C Virus Replication in HepG2 Cells by Fusion with Primary Human Hepatocytes : Establishment of a Quantitative Assay for HCV Infectivity in a Cell Culture System. Hepatology　34:566-572,　2001). 그러나, 이들의 주화 간세포를 사용해도 그 감염 증식 가능한 바이러스량은 인간 초대 배양에 비교하여 현저히 낮아, 인간 간 초대 배양세포에 필적하는 세포계가 요망되고 있다.

따라서 본 발명에 있어서 간엽 간세포로부터 분화 유도된 간세포를 사용하여, 효율 좋은 HCV의 감염 배양계의 확립을 시도하였다.

콜라겐 또는 마트리겔을 코트한 12웰과 6웰의 세포배양 플레이트에 간엽 간세포로부터 분화 유도된 간세포를 파종하였다. 세포가 충분히 착상(着床)하면 Williams E 배지에서 1회 세정하였다. 이 세포에 감염성 HCV가 존재하고 있는 것이 확인되어 있는 HCV 감염자 혈청을 접종하였다. 접종 HCV량은 세포당 HCV 유전자량으로서, 각각 0.5 또는 1.0으로 한다. 37도의 CO₂ 인큐베이터로 3시간 바이러스를 세포에 흡착 후, Williams E 배지로 3회 세정하고, 미흡착의 HCV를 제거하였다. 여기에 간세포 배양액을 첨가하고, 37도의 CO₂ 인큐베이터로 배양을 행하였다. 바이러스 배양개시 후, 1~10일간에 걸쳐 매일 세포를 샘플링하였다. 샘플링의 방법은 세 포로부터 배양액을 제거하고, 5 M 농도의 염산 구아니딘을 첨가함으로써 행하였다. 염산 구아니딘으로 용해한 세포액은, HCV-RNA를 추출할 때까지 -80℃에 보존하였다. 염산 구아니딘으로 용해한 세포액으로부터 통상의 방법에 따라 RNA를 추출하고, 리얼 타임 PCR법에 의해 HCV-RNA량을 정량하였다. HCV-RNA량의 정량은, 본 발명자 등이 확립하여 보고한 방법에 따라 행하였다(T. Takeuch. et al. Real-Time Detection System for Quantification of Hepatitis C Virus Genome. Gastroenterology 1999, 116:636-642).

C형 간염 감염 환자 혈청을 사용한 감염실험의 결과, C형 간염 바이러스는 간엽계 간세포 유래의 간세포 유사 세포에 감염 증식되고, 장기에 걸쳐 지속 감염되는 것이 명확해졌다(도 5).

도 5에 나타내는 바와 같이, 환자 혈청을 첨가 후 1일째, 5일째, 8일째에 배지의 교환을 행한 후에도 세포 내의 C형 간염 바이러스 유전자의 증가가 보였기 때문에, 세포 내에서 바이러스가 증식하고 있는 것이 시사된다. 특히 1일째의 배지교환 후에서는 10,000 cories/ug RNA 이상의 바이러스의 증가가 보이고 있다. 이것은 지금까지 배양세포 중에서는 가장 고율(高率)로 C형 간염 바이러스에 감염된다고 하는 간암 유래의 배양세포주인 HepG2 세포에 인간의 초대 배양 간세포를 융합시킨 1MY 세포에 감염 증식시킨 경우에 비교하여, 약 10~100배의 고효율이다.

더욱이 8일째의 배지 교환 후에도 C형 간염 바이러스 유전자의 증가가 보였기 때문에, 장기에 걸쳐 세포 내에서 바이러스가 지속 감염되고 있는 것으로 생각된다. 초기의 증식과 비교하여, 2회째의 배지교환 이후 증식효율이 떨어지고 있는 것은, 감염세포가 인터페론 β를 분비하여 감염을 억제하고 있기 때문인 것으로 생각된다.

이상의 결과는, 본 발명에 의해 제작되는 간엽계 간세포 유래의 간세포 유사 세포가 C형 간염 바이러스의 감염 메커니즘 해석 및 항 C형 간염약의 스크리닝에 있어서 매우 유효한 세포일 가능성을 나타내고 있다.

최근, 골수 유래의 간세포는 숙주 간장 내에 있어서 세포 융합에 의해 손상된 간장을 수복할 수 있지만, 간세포로의 직접 전환에 의해서는 수복할 수 없는 것이 보고되었다(G. Vassilopoulos, P. R. Wang, D. W. Russell, Nature. 422, 823 (2003), X. Wang et al., Nature. 422, 897 (2003)). 유도된 세포 융합이 손상을 받은 간세포의 구제(rescue)를 달성하는 것은 생각할 수 있는 것이지만, 이러한 전략은 융합기구는 완전히 이해되고 있지 않기 때문에 무리라고 생각된다. 대조적으로, 본 발명의 HIFC 분화시스템은 단층 배양 조건하에서의 직접 분화에 의해, 간세포 유사 세포를 작성할 수 있었다. 더욱이, 본 발명의 HIFC 분화시스템은 태아 또는 성인 간세포와의 공배양 조건을 필요로 하지 않았다. 본 발명자 등은 hMSC-유래 간세포의 인터류킨(interleukin) 3을 함유하는 HCM에 있어서의 배양한 성인 간세포와의 혼합 및 콜라겐으로 코팅한 배양접시로의 파종의 결과를 조사하였다. 세포 융합은 G-밴드 형성법에서는 관찰되지 않았다. 이 데이터는, hMSC 유래 간세포는 숙주 간세포와의 세포 융합에 의해 작성될 가능성이 낮은 것을 시사하고 있다.

약물-약물의 상호작용을 추정하기 위한 신규분자 실체의 CYP를 유도하는 능력은, 여러 방법으로 평가할 수 있다(A. D. Rodrigues, Pharm. Res. 14, 1504 (1997), A. D. Rodrigues, Med. Chem. Res. 8, 422 (1998)). 효소 유도에 관련하고 있는 하나의 방법은, 동물 모델의 사용을 필요로 하고 있다. 유감스럽게도, 대부분의 경우에 있어서, 실험동물로부터 얻어진 정보는, 수종류의 CYP의 유도에 있어서는 결정적인 종차(種差)가 존재하기 때문에, 용이하게 인간의 경우의 추정의 기초로 할 수는 없다(J. L. Barwick et al., Mol. Pharmacol. 50, 10 (1996), H. Shin, G. V. Pickwell, D. K. Guenette, B. Bilir, L. C. Quattrochi, Hum. Exp. Toxicol. 18, 95 (1999)).

오늘날, 인간 태아 간세포는 성숙 간세포 연구에 있어서의 표준의 모델 시스템을 구성하고 있다. 그러나, 결점으로서 개인으로부터 얻을 수 있는 세포량이 한정되어 있는 것, 한정된 생존기간인 것 및 동결/해동수법에 견딜 능력이 없는 것을 들 수 있다. 더욱이, 인간 간세포의 초대 배양물은 효소 유도의 추정에 사용할 수 있다(P. Maurel, Adv. Drug Deliv. Rev. 22, 105 (1996), P. Maurel, Adv. Drug Deliv. Rev. 22, 105 (1996), E. LeCluyse et al., J. Biochem. Toxicol. 14, 177 (2000)). 그러나, 이 시스템에 관련한 제한이 존재한다. 초대 정상 인간 배양 간세포로부터 얻어진 결과는, P450 효소 인듀서에 반응하여, 현저한 시료마다의 변동을 나타내는 경우가 많고, 이것에 의해 수명으로부터 얻은 시료를 스크리닝하는 것이 중요해진다(E. LeCluyse et al., J. Biochem. Toxicol. 14, 177 (2000)). 간세포를 사용하는 다른 결점은, 고비용인 점과, 신선한 인간의 간장을 필요로 하는 점으로, 이들은 산발적으로 밖에 입수할 수 없다. 본 발명은 인비트로에 있어서의 직접 분화조건을 사용하여, CYP, MRP 및 MDR 활성을 나타내는 기능성 간세포를, hMSC로부 터 유도할 수 있는 것을 처음으로 나타내는 것이다. 본 발명자 등의 시스템은 인비트로에 있어서 간세포에 영향을 미치는 발생적 수법, 신규 약물후보의 스크리닝을 기초로 한 분자의 연구에 있어서 가치가 있는 도구를 제공하여, 간장 손상의 구제에 적용 가능한 세포요법의 기초를 형성한다.

[실시예 7] 분화 유도시킨 간세포 유사 세포의 이식 실험예

인 비트로에서 분화 배양한 hMSC-유래 간세포 유사 세포를 콜라게나아제-디스파아제 처리하여, 소량의 신선한 배지에 부유시켰다. 세포 부유액을 5분간 방치하여 세포응집물을 제거 후, 원심에 의해 세포를 상청으로부터 회수하였다. 세포를 인산완충 생리식염액(PBS(-))에 의해 세정하였다. 세포 주입 24시간 전, 웅성(雄性) 및 자성(雌性)의 10주령(週齡)의 누드 마우스(SLC Co, 시즈오카, 일본)에, 체중 20 g당 CCl₄ 10 ㎕를 포함하는 올리브유 100 ㎕를 복강 내에 주사하였다. 상기 누드 마우스 6마리에, 1.0×10⁷ 개/ml의 세포 부유액 0.2 ml를 꼬리정맥에 주사함으로써, 마우스 1마리당 hMSC-유래 간세포 유사 세포 2.0×10⁶ 개의 이식을 행하였다. 대조로서 CCl₄-처치 마우스(n=4), 미분화 hMSC 이식 마우스(n=4), 인간 초대배양 간세포 이식 마우스(n=6) 및 CCl₄-무처치 건강 마우스(n=6)를 사용하였다. 간조직의 조직학적 해석은, 세포 이식 후 1일째에 연속 조직 절편을 제작하고, 헤마톡실린-에오진에 의해 염색하거나, 또는 면역조직화학에 의해 염색하여, 현미경 하에서 관찰함으로써 행하였다.

간기능을 평가하기 위해, 세포이식 후 1일째에 채혈한 혈액을 5,000 rpm으로 20분간 원심함으로써 얻어진 혈청시료에 대해서 통상적인 방법에 의해 생화학적 분석을 행하여, 혈청 중의 알부민, 글루코오스, 트리글리세라이드, 락트산 데히드로게나아제 및 요소질소의 농도를 측정하였다.

이식한 hMSC-유래 간세포 유사 세포는, 인간 초대 간세포 이식 마우스와 마찬가지로, 세포이식 후 1일째에 바로 간장의 문맥 주위영역을 통해 확산되어, 각각 세포 2~5개의 덩어리형상으로 간상에 편입되었다(도 6). 조직 절편 5장에 있어서의 hMSC-유래 간세포 유사 세포(FITC-양성세포)수를 계수한 바, 숙주 간장에 유주(遊走)한 hMSC-유래 간세포 유사 세포의 수는, 약 1.4×10⁵ 개/마우스인 것으로 추정되었다. hMSC-유래 간세포 유사 세포(5.0×10⁶ 개/20 g 마우스, n=6)를 이식한 간손상 마우스에 대해, 알부민, 글루코오스, 트리글리세라이드, 락트산 데히드로게나아제 및 요소질소의 농도(n=6)를 이식 후 1일째에 측정한 바, hMSC-유래 간세포 유사 세포에 의한 간손상의 회복은, 동결 보존된 인간 초대 간세포를 이식한 경우(n=6)와 동등하였다(표 1). 한편, 미분화-hMSCs(n=4) 및 PBS(-)처치(n=4) 마우스에서는 유의한 회복을 나타내지 않았다. 이와 같이, 본 발명자 등의 hMSC-유래 간세포 유사 세포는, 그들을 이식하면 인 비보에서 기능하여, CCl₄ 처치 마우스의 간기능을 회복할 수 있다. 이들 결과를 고려하면, 인 비트로에서 hMSCs로부터 유도한 간세포는, 이식된 동물의 간장에 생착(生着)하여, 주위의 간세포와 동일한 세포배열을 모방하도록 삽입되고, 또한 간세포로서의 기능을 발휘하여, 간장해를 구제하는 것이 증명 되었다.

표 1은 간손상 마우스에 있어서의 hMSC-유래 간세포 유사 세포의 이식 효과를 나타낸다. hMSC-유래 간세포 유사 세포가 CCl₄ 처치 마우스에 있어서의 간기능을 개선할 수 있는지의 여부를 검토하기 위해, 이식 후 1일째의 검사 파라미터를 분석하였다. 결과는, 평균값±표준오차를 나타낸다. 괄호 안의 수치는 회복의 비율(%)이다. 시료는 모두 PBS(-)의 값에 대해 표준화하였다. 표의 「CCl₄ 처치」란에 있어서, 「+」는 체중 20 g당 CCl₄ 10 ㎕를 포함하는 올리브유 100 ㎕를 복강 내 주사한 것을 나타내고, 「-」는 체중 20 g당 올리브유 100 ㎕를 복강 내 주사한 것을 나타낸다. 「*」를 붙인 수치는 P<0.01이다.

본 발명의 방법은 세포 단위로 취급할 수 있기 때문에, 간세포로의 분화기구를 분자 레벨에서 해명하는 도구(tool)로서 유효하고, 또한 종래의 동물 개체를 사용한 발암실험이나 식품첨가물 및 항암제 등의 안전 평가시험에 대신하는 새로운 어세이 모델로서 사용 가능하며, 더욱이, 인공장기로의 응용이 기대된다. 예를 들면, 독성 평가시험이나 식품안전성 평가시험 등은 대부분의 경우, 랫트를 사용한 검사가 주류이고, 검사를 행할 수 있는 공간 관계상, 한번에 평가할 수 있는 수에는 한도가 있고, 또한, 인간과 랫트에서는 동물종이 크게 상이하기 때문에, 바로 랫트에서 얻어진 결과를 인간에게 반영시키는 것은 곤란하다. 따라서, 인간의 배양세포를 평가시험에 사용하는 방법으로 이행하면서, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 안정적이고 또한 비용적으로도 비교적 저렴하게 간세포를 얻는 것이 가능하다. 본 발명에서 얻어진 인간 간세포 유사 세포는, 간세포로의 바이러스의 감염 예방·치료방법의 연구에 사용할 수 있는 것도 기대된다. 특히, C형 간염 바이러스는 인간 간세포에만 감염되기 때문에, 종전에는 그 예방·치료방법의 연구를 위한 도구를 얻는 것에 있어서 이미 곤란한 점이 있었지만, 본 발명에 의해 연구를 in vitro의 계에서, 즉 세포 레벨에서 용이하게 행할 수 있는 것이 가능해질 것으로 기대된다. 한편, 인공투석이나 인공심폐에서 실제로 사용되고 있는 기술을 본 발명의 방법과 조합하여 사용함으로써, 예를 들면, 항원성이 적은 침투막을 사용한 용기 내에 본 발명의 방법에 의해 얻은 인간 간세포 유사 세포를 충전하고, 체외순환의 요령으로 혈중 노폐물을 세정하는 것이 가능해진다. 본 발명의 방법은 ES 세포나 골수세포 유래 간엽계 간세포를 사용한 분화 유도 연구로서는 세계적으로 최초의 시도로, 사회적 요구는 물론, 재생의료산업으로의 공헌도나 기대도는 이루 헤아릴 수 없고, 그 밖의 산업계에도 충분히 공헌할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> EFFECTOR CELL INSTITUTE, INC. OCHIYA, TAKAHIRO <120> Human hepatocyte-like cells and use thereof <130> KAN-X0401-KR2 <150> JP 2005-002606 <151> 2005-01-07 <150> KR 2005-0015272 <151> 2005-02-24 <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 1 cgtacttgaa ctggctggtt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 2 tccagacttc ttcatccgag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 3 tcacttgtga catcggtagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 4 atcttcccgt tgtctaggac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 5 actgtggagc tcagtgtgtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 6 ggcatccacc ttagtatcac 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 7 acataaactc atgagctttg ag 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 8 cacgagctat ggcaatgcgt 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 9 cgatttggtg catatctcat tgtga 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 10 cccttatctc ccactcttgt ttc 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 11 acactgactg ctttgaccac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 12 agcaccatgc tcaggatcat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 13 agagcaagag aggtatcctg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 14 agagcatagc cctcgtagat 20

Claims (10)

1. 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하고, 총 배양기간이 약 2주일~약 13주일인 것을 특징으로 하는, 인간 간세포 유사 세포의 제조방법.

   (a) 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포를 이하의 (i)~(iii) 중 어느 하나의 증식인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정

   (i) 산성 섬유아세포 증식인자, 섬유아세포 증식인자 4 및 간세포 증식인자

   (ii) 액티빈 A, 상피세포 증식인자 및 β-신경생장인자로부터 선택되는 증식인자 및 산성 섬유아세포 증식인자

   (iii) 액티빈 A 및 간세포 증식인자로부터 선택되는 증식인자 및 섬유아세포 증식인자 4

   (b) 공정 (a)에서 배양된 세포를, 온코스타틴 M을 포함하는 배지에서 배양하는 공정

   (c) 공정 (b)에서 배양된 세포를, 덱사메타존을 포함하는 배지에서 배양하는 공정
2. 제1항에 있어서, 콜라겐 코팅 배양접시를 사용하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 다분화능을 갖는 인간 유래의 세포가, 배성간세포, 성인 간세포, 간엽계 간세포, 제대혈세포, 또는 인위적으로 다분화능을 획득한 세포인 방 법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 인간 간세포 유사 세포.
5. 제4항의 인간 간세포 유사 세포를 포함하는 간질환의 치료제.
6. 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 검사대상 화합물의 대사를 평가하는 방법.

   (a) 제4항의 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

   (b) 인간 간세포 유사 세포에 접촉시킨 검사대상 화합물의 대사를 측정하는 공정
7. 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 검사대상 화합물의 간독성을 평가하는 방법.

   (a) 제4항의 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

   (b) 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 장해 정도를 측정하는 공정
8. 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 간질환 치료제의 스크리닝방법.

   (a) 제4항의 인간 간세포 유사 세포에 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

   (b) 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 기능을 측정하는 공정

   (c) 검사대상 화합물을 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포의 기능을 앙진시키는 화합물을 선택하는 공정
9. 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 간염 바이러스 감염 저해제의 스크리닝방법.

   (a) 제4항의 인간 간세포 유사 세포에, 검사대상 화합물의 존재하에 있어서 간염 바이러스를 접촉시키는 공정

   (b) 간염 바이러스를 접촉시킨 인간 간세포 유사 세포에 있어서의 간염 바이러스의 감염 유무를 검사하는 공정

   (c) 간염 바이러스의 감염을 저해하는 화합물을 선택하는 공정
10. 이하의 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 바이러스성 간염 치료제의 스크리닝방법.

    (a) 제4항의 인간 간세포 유사 세포에, 간염 바이러스를 접촉시키는 공정

    (b) 간염 바이러스가 감염된 인간 간세포 유사 세포에, 검사대상 화합물을 접촉시키는 공정

    (c) 검사대상 화합물을 접촉시킨 세포에 있어서의 간염 바이러스의 증식을 측정하는 공정

    (d) 간염 바이러스의 증식을 저해하는 화합물을 선택하는 공정

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