KR102107602B1

KR102107602B1 - 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물

Info

Publication number: KR102107602B1
Application number: KR1020170066120A
Authority: KR
Inventors: 최동호; 정재민; 김요한; 강교진
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-29
Filing date: 2017-05-29
Publication date: 2020-05-08
Also published as: WO2018221904A2; KR20180130625A; WO2018221904A3; US20200147143A1

Abstract

본 발명은 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 화학물질의 조합을 통해 인간 성체 간세포로부터 간 전구세포를 유도하는 방법을 제공한다.

Description

인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물{Media composition for reprogramming of human hepatocytes}

본 발명은 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

간 이식은 만성 간 질환을 치료할 수 있는 유일한 치료법이다. 재생 의학은 이러한 문제를 극복하기 위한 가장 유용한 획기적인 기술 중 하나이다. 최근에는 환자의 특정 줄기세포가 간 재생 의학의 신뢰할 수 있는 출처로 간주될 수 있다. 줄기세포와 유사한 간세포는 유도만능줄기세포(iPSCs), 직접 리프로그래밍된 세포 및 작은 간세포에서 유래되었지만 만성 간 질환에 대한 확실한 치료 가능성을 보이지는 않는다. 최근에 설치류에서 유래된 화학 물질에 의해 유도된 간 전구세포는 다양한 종류의 간 질환에 대한 세포 치료 및 약물 검사를 개발할 수 있는 잠재적인 원천이 되고 있다.

직교 간 이식(orthotropic liver transplantation)은 말기 간 질환의 치료 옵션 중 하나로 승인되어, 간 이식 수술 결과가 크게 개선되었으며 여러 종류의 말기 간 질환에 대한 표준 치료법으로 인정받고 있다. 1년 동안 수천 건의 간 이식이 있었지만 오랫동안 장기 기증을 기다려야 하고 기증자로부터 신선한 기관이나 간세포를 얻지 못하는 환자가 여전히 많다. 새로운 간세포의 관점에서, 줄기세포연구에서의 최근의 발전은 세포 대체 요법에 대한 유망한 가능성을 보여주었다. 그러나 프라이머리 간세포는 세포 사멸이 쉽고, 시험관내 배양 조건을 다루기가 어려우며, 기능적으로 증식하는 간세포의 배양 조건을 확립하는 것이 간 재생 의학의 필수적인 부분이다.

비록 많은 연구자가 간세포의 대안적인 세포 공급원으로 인간 배아줄기세포(hESCs) 및 유도만능줄기세포(iPSCs)를 보고하였지만, 이러한 세포들은 몇 가지 한계가 존재한다. 말단 분화 세포로부터 직접 변환된 간세포는 최근에 개발된 세포 공급원이며 간세포 특이적인 마커 유전자 및 단백질을 발현한다. 그들은 상대적으로 원시적이고 더 많은 조작이 필요하다. 또한, 많은 연구자가 이러한 문제를 극복하기 위해 간 전구세포/줄기세포를 찾고 있다. 지금까지 여러 연구에서 간세포/줄기세포가 마우스와 랫트에서 유래될 수 있다고 제안했다. 또한, 몇몇 논문은 몇몇 작은 분자의 조합, 특히, Y-27632, A83-01 및 CHIR99021의 조합이 마우스 및 랫트의 간세포에서 간 전구세포/줄기세포로 유도됨을 보여주었으나, 사람 성체 간세포에서는 확립되어 있지 않았다.

Katsuda T et al. Cell Stem Cell 2017;20:41-55 Chen Y et al. Hepatology 2012;55:563-574 Fougere-Deschatrette C et al. Stem Cells 2006;24:2098-2109 Koenig S et al. J Hepatol 2006;44:1115-1124 Krause P et al. Cell Transplant 2014;23:805-817

본 발명의 목적은 인간 성체 간세포에 여러 가지 화학물질을 첨가하여 간 전구세포로 리프로그래밍하기 위한 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 성체 간세포를 상기 리프로그래밍을 위한 배지 조성물에서 배양하여 간 전구세포로 리프로그래밍하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리프로그래밍을 통해 유도된 간 전구세포와 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유효량의 상기 간 전구세포를 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 인간 성체 간세포에서 유래되고, 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 간 전구세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환 치료방법을 제공한다.

본 발명은 인간 성체 간세포에 여러 가지 화학조합물을 첨가하여 간 전구세포로 리프로그래밍하고, 상기 간 전구세포는 간세포와 담즙 상피 세포로 분화될 수 있는 이분화능을 가지고 있어 간 재생을 위한 간 전구체의 공급원으로 제공될 수 있으므로 간질환 치료에 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 인간 간세포로부터 화학적으로 파생된 간 전구세포의 제조방법을 도시한 것이다.
도 2는 세포분화 과정에서 14일 동안 HGF를 포함하며 AC(+) 및 AC(-) 조건에서 배양된 인간 간세포의 형태학적 변화(A), AC(+) 및 AC(-) 조건에서 0일에서 15일 사이의 인간 간세포 성장 곡선(그림에서 A는 A83-01의 약어이고, C는 CHIR99021의 약자임. 스케일 바=500 ㎛ 및 100 ㎛)(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄, 배양배지에 HGF가 첨가되어있음)(B), 14일간 AC 조건에서 배양된 인간 간세포의 간 전구 마커의 면역 형광 분석 결과(스케일 바=50 ㎛)(C), AC(+) 및 AC(-) 조건에서 배양된 인간 간세포에서 간 전구 마커의 상대적 유전자 발현 수준의 정량적 비교 결과(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄)(D), AC 조건에서 배양된 인간 간세포의 핵형 이미지 분석 결과(E)를 나타낸 것이다.
도 3은 9일 동안 HGF를 포함하며 AC 조건에서 배양된 인간 간세포의 저속 촬영 결과(A), 화학 물질(Y27632,A83-01, CHIR99021)로 배양한 인간 간세포의 형태학적 변화(그림에서 Y는 Y27632의 약어이고, A는 A83-01의 약어이고, C는 CHIR99021의 약자임. 스케일 바=100 ㎛)(B), HGF를 포함하며 AC(+) 및 AC(-) 조건에서 배양된 마우스 간세포의 형태학적 변화 (스케일 바=100 ㎛)(C), HGF(+) 및 HGF(-) 조건에서 AC 또는 A, C 단독 조건의 인간 간세포의 형태학적 변화 (스케일 바=100 ㎛)를 나타낸 것이다.
도 4는 CdH의 간세포 및 담관 상피세포로의 이분화성을 나타낸 것으로, (A)는 CdH의 시험관 (in vitro)내 간 분화(화살표는 담즙 정낭을 나타냄), PAS 염색에 의한 글리코겐 저장 분석, ICG 섭취 분석(스케일 바=100 ㎛), 간세포 분화된 CdH(CdH-Hep)에서 간 표지자의 면역형광분석 결과이다(스케일 바=50 ㎛). (B)는 CdH, 간세포 분화된 CdH(CdH-Hep) 및 인간 간세포(hPH)에 대한 간세포 마커의유전자 발현 수준 정량적 비교 결과이다(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄). (C)는 CdH의 담관세포 유도 위상차 대비 이미지이다(CdH-Chol). (D)는 CdH의 담관세포 분화 시 담관세포 마커의 면역형광분석 결과를 나타낸다. (E)는 CdH, 담관세포로 분화된 CdH(CdH-Chol) 및 인간 간세포(hPH)에 대한 담관세포 마커의 상대적 유전자 발현 수준 양적 비교 결과이다.
도 5A는 간세포 분화된 CdH (CdH-Hep)의 투사 전자 현미경 이미지이고, 도 5B는 간세포 유도 중 분비된 알부민 수치의 평가 결과이며, 도 5C는 마이크로어레이를 분석하여 인간 간세포(hPH), CdH 및 간세포 유도된 CdH(CdH-Hep) 간의 간세포 특이 유전자의 발현을 비교한 결과이다.
도 6은 계대배양 후 CdH의 장기 유지 및 안정된 상태를 보여주는 도면으로, (A)는 계대배양에 따른 CdH 형태의 안정적인 유지(스케일 바=100 ㎛) 및 CdH의 간 전구세포 마커의 면역형광분석 결과이고(스케일 바=50 ㎛), (B)는 계대배양에 따른 CdH의 간 전구세포 마커의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내고(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄), (C)는 계대배양에 따라 간세포분화된 CdH(CdH-Hep)의 간세포 마커 단백질의 면역형광분석 결과이며, (D)는 간세포 분화된 CdH (CdH-Hep)에서의 간세포 마커 유전자 발현 양상을 CdH와 비교해 나타낸 것이다(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄).
도 7A는 계대배양에 따른 CdH의 성장 곡선을 나타내고(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄), 도 7B는 계대배양에 따른 CdH의 핵형 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 CdH의 생체 내 이식 및 생착을 도시한 것으로, (A)는 인간 CdH 및 생체 내 세포 이식 분석을 수립하기 위한 실험 절차의 도식도이고, (B)는 NOD.Cg-Prkdc ^scid 의 간에서 이식한 CdH의 간세포 분화능을 확인할 수 있는 간세포 마커 단백질에 대한 면역형광분석 결과(Il2rg ^tm1Wjl /SzJ 마우스에 이식된 CdH는 hALB, HNF4a를 발현하고, mCherry로 표지되어 있어 14일에 함께 확인할 수 있음, 스케일 바=250㎛)이며, (C)는 NOD.Cg-Prkdc ^scid 의 간에서 CdH의 담관세포 분화능을 확인할 수 있는 담관세포 마커 단백질에 대한 면역형광분석결과(Il2rg ^tm1Wjl /SzJ 마우스에 이식된 CdH는 CK19, CK7을 발현하고 mCherry로 표지되어 있어 14일에 함께 확인할 수 있음, 스케일 바=250㎛)이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법을 제공한다.

본 발명은 간세포 성장 인자인 HGF(Hepatocyte Growth Factor;H), ALK 저해제인 A83-01(A), GSK(Glycogen Synthase Kinase) 3 저해제인 CHIR99021(C)을 첨가하여 인간 프라이머리 간세포에서 화학적으로 유도된 간 전구세포(CdH)로 안정적으로 유도하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법은,

전통적인 2 단계 콜라게나제 관류법을 통해 정상 및 간 질환 환자의 간으로부터 인간 프라이머리 간세포를 분리하는 단계; 및

상기 인간 프라이머리 간세포를 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 배지 조성물에서 배양하여 간 전구세포를 유도하는 단계를 포함한다.

상기 인간 프라이머리 간세포를 분리하는 단계의 경우, 인간의 프라이머리 간세포에 두 가지 다른 화학 제제를 처리한 후 며칠 동안 상동의 다각형 세포가 나타나고 빠르게 성장하는 반면 공존하는 인간의 프라이머리 간세포는 죽는다. 이들 화학적 파생 세포는 간 및 담관 상피 혈통 계통의 유전자를 발현하고 간 전구세포 특이 마커로 염색된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 간 전구세포는 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가하였다.

차세대 시퀀싱(NGS) 연구에 따르면 빠르게 성장하는 간전구세포(CdH)는 사람의 간모세포와 유사한 유전자 발현 패턴을 보였다. 인간의 간으로부터 화학물질에 의해 유래된 간 전구세포(CdH)는 간세포와 담즙 상피 세포로 분화할 수 있으므로 이분화성(bipotent) 간줄기세포의 성질이 있음을 시사한다. 10번째 계대배양 후에도, CdH는 성장 패턴과 간 전구성 표현형을 잃지 않는다. CdH는 또한 비장내 경로를 통한 이식 후 면역억제 마우스 모델에서 몇 주간 생착 및 기능을 한다. 따라서, CdH 유도 기술은 간 재생 의학 분야에서 치료제로서 사용할 수 있다.

본 발명에서 인간 성체 간세포를 이용한 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에는 HGF, A83-01 및 CHIR99021이 포함되며 HGF는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 2 내지 100 ng/mL 의 농도로 포함될 수 있다. 상기 함량이 100 ng/mL를 초과하는 경우 세포사멸에 영향을 주고, 상기 함량이 2 ng/mL 미만인 경우, 간 전구세포가 생성되지 않는다.

상기 A83-01는 TGF-beta 신호전달의 저해제인 ALK 저해제로 알려져 있으며, 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.4 내지 4 μM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 함량이 4 μM을 초과하는 경우사포사멸이 유도되고, 상기 함량이 0.4 μM 미만인 경우, 간 전구세포의 생성이 미약하였다.

상기 CHIR99021는 GSK(Glycogen Synthase Kinase)-3의 저분자 저해제로 알려져 있으며, 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.3 내지 3 μM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 함량이 3 μM을 초과하는 경우, 세포사멸이 유도되고, 상기 함량이 0.3 μM 미만인 경우, 간 전구세포의 생성이 미약하다.

상기 HGF, A83-01 및 CHIR99021는 간세포 리프로그래밍 배지에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물은 간세포 리프로그래밍 배지 및 성장 배지를 포함할 수 있다.

상기 간세포 리프로그래밍 배지는 당해 분야에서 체세포 배양뿐 아니라 줄기세포(stem cell) 및 전구세포(progenitor cell) 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 0.1μM dexamethasone, 10 mM nicotinamide, 1% ITS(insulin-transferrin-selenium) premix, 및 penicillin/streptomycin/glutamine이 보충된 DMEM/F-12 배지를 사용하였고, 이 외에도 세포의 배양에 있어서 필요한 요소들은 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명의 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포는 3 내지 14일 동안 배양되어 간 전구세포로 유도될 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 간 전구세포의 생성이 되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 10% FBS, 0.1 μM dexamethasone, 10 mM nicotinamide, 1% ITS(insulin-transferrin-selenium) premix, penicillin/streptomycin/glutamine, 20 ng/mL의 EGF, 20 ng/mL의 HGF, 4 μM A-83-01 및 3 μM CHIR99021이 보충된 DMEM/F-12 배지에서 3일 내지 14일간 배양할 경우, 간 전구세포로 유도되었고, 간 전구세포의 특성 즉, 간 전구세포 특이적 마커의 발현은 7일부터 증가하기 시작하여 14일 이상 유지되었다.

본 발명의 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포에서 유도된 간 전구세포는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포에 비해 증가하고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성 줄기세포 특성을 가지고 있는 신규한 세포이다.

따라서, 본 발명은 인간 성체 간세포에서 유래되고, 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 간 전구세포를 제공한다.

상기 간 전구세포는 이분화성 줄기세포 특성으로 인해 간 재생을 위한 간 전구체의 공급원으로 제공될 수 있다는 점에서 간질환 치료제로 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 제공한다.

상기 간 질환 치료용 조성물은 세포치료제일 수 있다.

이러한 간질환의 예로, 만성간염, 간경화, 대사성 간질환, 간암, 또는 선천성 유전성 간질환 등을 들 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

본 발명의 간질환 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조 및 투여할 수 있다. 예컨대, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 적어도 약 10⁴ 내지 10⁶ 및 전형적으로 1×10⁸ 내지 1×10¹⁰개의 간 전구세포를 70kg의 환자에게 대략 60분 내지 120분에 걸쳐 정맥내 또는 복강내로 주입할 수 있다. 투여의 경우, 개체의 전반적 건강상태 및 체중을 고려하면서, 간 전구세포를 세포의 유형에 따른 LD-50(또는 기타 독성 측정 방법) 및 다양한 농도에서의 세포의 유형에 따른 부작용에 의해 결정된 비율로 투여한다. 투여는 한번에 또는 여러 회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 유효량의 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환 치료방법에 관한 것이다.

상기 대상체는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐, 인간 등일 수 있다.

본 발명에서 "치료" 란 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한, 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.

본 명세서에서, “유효량”은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 간세포에서 화학물질에 의한 간 전구세포의 유도

본 발명자들은 인간 성체 간세포의 직접적인 리프로그래밍에 관여할 수 있는 소분자의 조합을 조사하기 위해, 직접 리프로그래밍을 위한 간세포 배양 배지를 기초로 다양한 조합으로 인간 프라이머리 간세포를 배양하여 간세포의 리프로그래밍을 확인하였다(도 1). 이와 관련된 실험 방법은 다음과 같다.

(인간 프라이머리 간세포의 분리)

프라이머리 간세포는 2단계 콜라게나제 관류법을 사용하여 정상적인 환자의 간에서 정보에 입각한 동의하에 분리하였다(표 1). 간략하게, 단계 1에서 간은 37℃에서 5분 동안 칼슘 킬레이트제로서 EDTA로 구성된 용액 A로 관류되었다. 2단계에서 간은 37℃에서 8분 동안 트립신 저해제와 콜라게나제로 구성된 용액 B로 관류되었다. 이어서, 간을 추출하고 접시에서 잘게 잘랐다. 프라이머리 간세포를 Williams의 Medium E(Gibco, NY, USA)로 세척하고 25% Percoll(GE Healthcare, Bucks, UK)로 치료하였다. 이렇게 얻어진 프라이머리 간세포는 80-90 %의 생존력을 보였다.

간 기증자의 임상 정보

번호	연령	성별	진단	수술	무게
1	80	여성	간암	우후구역 절제술	4.02g
2	56	남성	간암	좌후구역 절제술	5.95g
3	86	여성	대장암 간 전이	쐐기절제술	0.74g
4	75	남성	간암	복강경 쐐기	1.01g
5	54	여성	간 내 담석	좌외측구역 절제술	0.54g
6	64	남성	지방간		0.7g
7	31	여성	정상		0.71g

(화학적으로 유도된 간 전구세포의 확립)

William의 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 인간 프라이머리 간세포를 10mM 니코틴아마이드(Sigma-Aldrich, MO, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco), 20ng/mL의 HGF(Peprotech, NJ, 미국), 20ng/mL의 EGF(Peprotech) 및 4μM A83-01(Gibco) 및 3μM CHIR99021(StemCell Technologies)가 첨가된 DMEM/F-12(11965, Gibco, CA, USA)에서 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 매일 배지를 교체하였다.

(렌티바이러스 생성)

mCherry는 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포에서 psPAX2 렌티 바이러스 패키징 플라스미드 및 pCMV-VSV-G 플라스미드와의 동시 형질 감염에 의해 패키징 되었다. 48시간 및 72시간 후에 배양 상등액을 수확하고 -80℃에서 보관하였다. mCherry의 렌티 바이러스 형질 도입은 8㎍/mL의 폴리브렌(Sigma-Aldrich)이 보충된 배양 배지에서 수행되었다.

(mRNA 분리 및 RT-PCR 분석)

트리졸 시약(Gibco)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche, PA, USA)로 1㎍의 RNA 샘플을 역전사하고 qPCR PreMix(Dyne bio, Korea) 10㎕, cDNA 1㎕ 및 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 2)를 사용하여 CFX Connect Real-Time PCR Detection system(Bio-rad, CA, USA)에서 실시간 PCR을 수행하였다. 반응은 각 유전자에 대해 3반복 분석하였다. PCR 사이클은 95℃에서 20초, 60℃에서 40초의 40사이클로 구성된다. 용융 곡선 및 용융 피크 데이터를 수득하여 PCR 산물을 특성화하였다.

실시간 PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 목록

유전자	정방향 프라이머 서열 (5’-3’)	역방향 프라이머 서열 (5’-3’)
AFP	AGACTGCTGCAGCCAAAGTGA	GTGGGATCGATGCTGGAGTG
SOX9	GAGGAAGTCGGTGAAGAACG	ATCGAAGGTCTCGATGTTGG
EpCAM	GAACAATGATGGGCTTTATG	TGAGAATTCAGGTGCTTTTT
FOXJ1	CCTGTCGGCCATCTACAAGT	AGACAGGTTGTGGCGGATT
CD44	CATCTACCCCAGCAACCCTA	CTGTCTGTGCTGTCGGTGAT
ITGA6	TCGCTGGGATCTTGATGCTTGC	TGAGCATGGATCTCAGCCTTGTGA
HNF6	AGGGTGCTCTGCCGCTCCCAGG	CATGCTGCTAAGCGGAGCGCGGAC
HNF1β	GGGGCCCGCGTCCCAGCAAA	GGCCGTGGGCTTTGGAGGGGG
CK19	TCCGAACCAAGTTTGAGACG	CCCTCAGCGTACTGATTTCC
CD90	CTAGTGGACCAGAGCCTTCG	ACAGGGACATGAAATCCGTG
CK7	GATAAAAGGCGCGGAGTGTC	GAAACCGCACCTTGTCGATG
CFTR	AGTTGCAGATGAGGTTGGGC	AAAGAGCTTCACCCTGTCGG
AE2	GGGGAAAGTTGAGTTGGGAGA	CTGGCTCTGGCGTACAGAAA
AQPR1	GGCCAGCGAGTTCAAGAAGAA	TCACACCATCAGCCAGGTCAT
Alb	CACAGAATCCTTGGRGAACAGG	ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA
HNF1α	AGAGAGGGGTGTCCCCATCA	CTTGTGCCGGAAGGCTTCTT
HNF4α	CCAAAACCCTCGTCGACATG	GCACATTCTCAAATTCCAGG
ASGR1	CAGCAACTTCACAGCCAGCA	AGCTGGGACTCTAGCGACTT
CYP1A2	CGGACAGCACTTCCCTGAGA	AGGCAGGTAGCGAAGGATGG
CYP2A6	CAGCACTTCCTGAATGAG	AGGTGACTGGGAGGACTTGAGGC
CYP2C9	CTACAGATAGGTATTAAGGACA	GCTTCATATCCATGCAGCACCAC
CYP3A4	TTCAGCAAGAAGAACAAGGACAA	GGTTGAAGAAGTCCTCCTAAGC
GAPDH	TGCACCACCAACTGCTTAGC	GGCATGGACTGTGGTCATGAG

(주사전자현미경)

조직 샘플을 파라포름알데히드와 글루타알데히드로 고정한 후, 사산화 오스뮴(OsO₄)으로 다시 한번 고정하였다. 레진에 고정된 조직샘플을 충전 후 초박절편 하여 아세트산 우라닐과 납시트레이트로 염색하여 사진 촬영하였다.

(시간 경과 이미징)

시간 경과 이미징은 JuLi stage 시스템 (나노앤택)을 사용하여 수행하였다. 세포 배양접시를 현미경에 올린 후 5% CO₂, 37℃에서 배양하며 간 전구세포의 생성을 시간 경과에 따라 60분에 한 번씩 사진을 찍었다. 데이터 분석은 JuLi stage 소프트웨어 v1.0을 사용하였다.

(FACS 소팅)

mCherry 형광발현된 CdH 세포를 분리하기 위해, 10% FBS와 2mM EDTA가 포함된 PBS에 재현탁하고 고속 분류를 위해 Turbo Sort가 장착된 FACS AriaⅢ(BD Bioscience)로 분류하였다. 분류 후, 생존률은 트리판 블루에 의해 결정되었고, 전형적으로 90% 이상이었다.

(면역조직화학)

매회 5분 동안 크실렌으로 3회 세척하여 4㎛ 단면을 탈파라핀화 시켰다. CdH를 에탄올로 재수화하고, 마지막으로 증류수로 세척하였다. 세척 후, 슬라이드를 pH 6.0 및 10mM 시트르산 나트륨 완충액에서 오토클레이브하여 항원을 노출시킨 후 회수하였다. 슬라이드를 5분 동안 증류수에서 배양하고 밤새 4℃에서 1차 항체를 첨가한 후 일정습도가 유지되는 챔버에 넣었다. 다음날, 절편을 1% FBS가 보충된 PBS인 염색 용액으로 5분 동안 3회 세척한 후, 실온에서 1시간 30분 동안 2차 항체와 함께 배양하였다. 항체는 표 3에 나타내었다. 핵을 PBS에 녹인 Hoechst 33342(1:10000, Molecular Probes)로 대조 염색하였다. 2차 항체와 함께 항온 배양한 후, 슬라이드를 흐르는 수돗물로 세척하고, 탈수시키고, 맑게 하고, 장착시켰다. 샘플을 TCS SP5 공초점 현미경(Leica)으로 영상화하였다.

항체 목록

단백질	회사	상품번호
Albumin	Abcam	ab19194
CK19	Santa Cruz Biotechnology	sc-376126
OV-6	Santa Cruz Biotechnology	sc-101863
EpCAM	Abcam	ab32392
CD44	Cell Signaling	5640S
CD90	Abcam	ab92574
AFP	Abcam	ab3980
SOX9	Abcam	ab185966
HNF4α	Santa Cruz Biotechnology	sc-8987
CK18	Abcam	ab668
CYP3A4	Santa Cruz Biotechnology	sc-27639
AE2	Abcam	ab42687
CK7	Abcam	ab9021
CFTR	Almone	Acl006
mCherry	Abcam	ab167453

(마이크로어레이 분석)

총 RNA 샘플을 트리졸 시약(Gibco)로 추출하고 분석을 위해 LAS, Inc(LAS, Korea)에 제공하였다. 간단히 말하면, 마우스 Ref-8v3 Sentrix 비드 칩(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하고 모든 샘플에서 양자 표준화 방법으로 표준화하였다. Illumina Bead Array Reader 공초점 스캐너를 사용하여 어레이를 스캔하였다. 마이크로어레이 데이터는 NCBI Gene Expression Omnibus에 기탁되어 있다. 유전자는 Cluster 3.0으로 클러스터링 되었으며, 히트맵은 Tree View 3.0으로 생성되었다.

(간 유도)

간세포 분화를 위해 이전에 발표된 논문의 간세포 성숙법에 따라 CdH를 4×10⁵ ~ 5×10⁴ cells/cm²의 콜라겐 타입 I 코팅 접시에서 배양하였다. CdH 배지로 2일간 배양한 후, 20ng/mL의 oncostatin M(R&D systems) 및 10^- ⁷ mol/L Dex(Sigma-Aldrich)로 구성된 간세포 유도 배지로 교체하였고 간 유도 배지를 2일마다 제공하였다. 6일 배양 후, 배지를 matrigel(BD Bioscience)과 간 유도 배지의 1:7 혼합물로 교체하였다. 8일째, Hank 's Balanced Salt Solution(HBSS)로 세척하여 혼합물을 제거하였다.

(담관세포 유도)

담관세포의 생성을 위해서는 콜라겐 타입 I(BD)을 이용한 3차원 배양 시스템을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 간단히 말해서, 800㎕의 콜라겐 타입 1, 100㎕의 10×PBS, 20㎕의 1N NaOH 및 80㎕의 H₂O를 얼음 위에 혼합하였다. 이 혼합물을 cholangiocytic differentiation medium(CDM)(10% 태아소혈청, 20ng/mL의 HGF[BD]가 보충된 DMEM F-12 배지)에 현탁된 동일한 부피의 1×10⁵ 복제된 CdH와 혼합하였다. 세포 현탁액을 6-웰 플레이트로 옮기고 37℃에서 30분 동안 방치하였다. 겔이 형성된 후, CDM을 겔에 부드럽게 첨가하였다.

(Periodic Acid Schiff(PAS) 염색 및 인도시아닌 그린)

유도된 세포를 디스파제(dispase)에 의해 matrigel gel의 꼭대기에서 수확한 후 PAS(periodic acid Schiff) 염색, indocyanine green(ICG) 염색에 사용하였다. PAS kit(abcam)를 사용하여 37℃에서 15분간 타액 디아스타제 전처리 유무와 상관없이 글리코겐 검출을 위해 PAS 염색을 시행하였다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색은 표준 절차를 사용하여 수행하였다. 유도된 세포에 indocyanine green(ICG, Dai-ichi Pharmaceutical) 염색을 시행하고 37℃에서 15분간 배양하였다. 세포를 PBS로 세정한 후, ICG 섭취를 위상차 현미경으로 관찰하였다.

(Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA))

알부민 분비 측정은 Human Albumin ELISA Kit(Bethyl Laboratories)에 의해 수행되었다. 알부민 분비능을 관찰하기 위해, 배양 컨디션드 배지를 2일마다 간 유도시간 동안 수집하였다. 검정 절차는 Human Albumin ELISA Kit의 프로토콜을 따랐다.

(핵형분석)

간 전구세포 (CdH)의 핵형분석은 이원의료재단에서 수행하였다.

(실험동물 모델)

NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg^tm1Wj1/SzJ 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여 실험 동물 관리 원칙 및 삼성 생명 의학 연구소의 실험실 동물 사용 안내서에 따라 특정 병원균이 없는 조건으로 보관하였다. 0.1-2.2 mg/kg 체중의 Jo2 항체/PBS(BD Pharmingen, CA, USA)를 복강 내 주사한 후 24시간 후에 CdH 및 인간 간세포 직접 재 프로그램된 간 전구세포(1×10⁶ 세포/10㎕)를 이식하였다. NSG 마우스의 비장 이식 후 감염을 예방하기 위해 음용수에 100mg/L 시프로플록사신(CJ Pharma, Korea)을 투여받았다. 종료 시, 마우스 간 조직을 10% 포르말린에 즉시 고정하였다.

(통계 분석)

정량적 데이터는 추론 통계치(p 값)와 함께 평균±표준 편차(SD)로 표시된다. 통계적 유의성은 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 설정한 유의미한 양측 t- 검정으로 평가하였다.

<실험예 1> 소분자에 의한 간 전구세포 생성

상기와 같이, 인간 성체 간세포의 직접적인 리프로그래밍에 관여할 수 있는 소분자의 조합을 조사한 결과, 소분자를 처리하지 않은 간세포는 인 비트로에서 증식하지 않고 섬유 형태로 변하였고, AC 조건(HGF, A83-01 및 CHIR99021의 조합)에서 배양된 간세포는 7일 후에 상피 형태로 증식하였다. AC 조건에서 배양된 간세포는 3일까지 성장 속도에 유의한 변화를 보이지 않았으나 이후 빠른 성장 속도를 보였다. 2주 동안 증식능력은 22.6 내지 26.4배와 단일세포 증식능력을 형성함을 확인하였다(도 2A 및 2B).

CdH의 단백질 수준에서 간 전구세포의 특성을 조사하기 위해, 면역세포화학법을 실시하여 다양한 간전구 마커의 양을 시각화하였다. 이미지는 알부민, CK19, OV-6, EpCAM, CD44, CD90, AFP 및 SOX9와 같은 다양한 전구 마커가 안정적으로 발현되었음을 보였다(도 2C). 이러한 결과는 인간 간세포가 다시 전구세포로 리프로그래밍되어 변하는 것을 의미한다.

qRT-PCR에 의한 간세포로부터 CdH로의 전환 시점을 확인한 결과, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90의 발현이 7-14일에서 상승되는 것을 발견하였다(도 2D). 따라서 인간 간세포는 AC 조건하에서 7일에서 14 일간 배양 하였을 때 CdH로 분화되었고 CdH의 간 전구세포의 특성은 7일부터 나타나기 시작하여 14일까지 유지되었다.

또한, 분석된 20개의 중기 세포에서 클론성 염색체 이상은 관찰되지 않았고 모두 정상 핵형을 보였다(도 2E).

9일 동안 AC 조건에서 배양된 인간 간세포를 저속 촬영한 결과, AC 조건 하에서 배양된 간세포는 3일 후에 급격한 증식을 보였다(도 3A).

인간 간세포가 마우스에서 발견된 YAC 조건에서 간 전구세포로 전환되었는지를 확인하기 위해 YAC를 함유한 배지에서 인간 간세포를 배양하고, 2일마다 배지를 교체하였다.

그 결과, YAC 조건하에서 9일 동안 배양된 인간 간세포는 CdH로 형성되지 않고 섬유화되어 사멸되었다(도 3B).

또한, 반대로 마우스 간세포가 AC(+) 조건에서 CdH로 변할 수 있는지를 확인하기 위해 2단계 콜라게나제 관류법으로 마우스 프라이머리 간세포를 분리하고 AC(+) 또는 AC(-) 조건하에서 배양하였다. 그 결과, AC(+) 조건하에서 7일간 배양한 마우스의 프라이머리 간세포는 CdH로 분화됨을 확인하였다(도 3C). 마우스 CdH는 프라이머리 간세포와 비교하여 높은 수준의 간 전구 마커를 나타냈다(미도시됨).

인간 간세포에서 CdH로의 전환은 AC(+) 조건하에서 발생하였지만, YAC 조건 하에서는 일어나지 않았다. 따라서 인간 간세포가 CdH로 전환될 때 주요 인자를 결정하기 위해 인간 간세포와 함께 YAC 배양 조건을 달리하여 조사하였다.

그 결과, HGF(+), AC(+) 조건하에서 CdH의 형태가 관찰되었다(도 3D). 그러나 HGF(-) 조건인 경우에는 CdH의 성장 속도가 감소하여 결국 증식능을 상실하게 되었다. 따라서 HGF와 AC의 조합은 인간 간세포의 간 전구세포로의 전환에 중요한 역할을 하는 것으로 보이며 HGF는 간 전구세포의 유지 및 증식에 관여하는 것으로 보인다.

<실험예 2> CdH의 간세포 및 담관 상피로의 이분화성 분화

간세포와 담관세포로 분화할 수 있는 간 전구세포의 가장 중요한 이분화 특징을 확인하기 위해 이전에 보고된 간세포와 담관세포 분화 프로토콜을 사용하였다.

간에서 유도된 CdH는 담즙 캐뉼러 구조를 갖는 전형적인 간세포를 보였다. 또한, 글리코겐 저장, 인도시아닌 녹색 흡수 및 알부민 분비 결과는 유도된 CdH가 간세포의 기능적 특성을 획득하였음을 보여 주었다. 또한, 면역 염색의 결과는 간세포 특이적 단백질, 알부민, HNF4α, CK18 및 CYP3A4의 발현이 CdH 유도된 간세포 분화에서 발현되었음을 보여준다(도 4A). 또한, 간 기능에 관련된 알부민, HNF1α, HNF4α, ASGR1, CYP 유전자와 같은 간 유전자의 mRNA 발현은 간세포 분화를 유도하지 않은 CdH의 mRNA 발현보다 유의하게 높았다(도 4B).

또한, 간세포 유도 중 분비된 알부민의 수치 평가 결과, CdH의 알부민 분비의 변화가 거의 없었으나 간세포 분화된 CdH의 알부민 분비는 서서히 증가하였다(도 5B).

마이크로어레이 분석 결과, 간세포 분화된 CdH (CdH-Hep)은 분화전인 CdH와는 완전히 다른 글로벌 유전자 발현 패턴을 보였으며, 그 패턴은 사람의 간에서 분리 추출한 간세포와 매우 유사하였다(도 5C).

CdH를 3차원(3D) 타입 I 콜라겐 젤 배양 시스템에서 배양했을 때 대표적인 분지 구조를 가진 담관세포로 분화하고 (도 4C) 유도 9일 후에 담관세포 마커인 CK19, AE2, CK7, CFTR를 확인하였다(도 4D). 분지 구조에서 많은 CdH-유래 세포는 기능적 담관세포 마커 CK19, CK7, AE2 및 CFTR가 인간 담낭과 더불어 관찰되었으며(도 4D), 마커 유전자 발현도 증가하였다(도 4E). 이것은 CdH가 담관세포 유사 세포로 분화되었다는 것을 시사하는 것이다.

<실험예 3> 계대배양 후 CdH의 장기 유지 및 안정한 상태

CdH가 장기간의 계대배양에서도 간 전구성 특성을 유지하는지 확인하기 위해 5번째 및 10번째 계대배양에서 CdH의 특성을 확인하였고, CdH의 계대배양은 적어도 15 번째 계대배양 까지도 안정적이었다.

형태학적으로, CdH는 동질의 다각형 형태를 10번째 이상까지 유지하였다(도 6A).

계대배양 후에도 CdH가 간 전구세포로서 잘 특징지어졌는지 확인하기 위해 10번째 계대배양 후 간 전구세포 특이적 단백질을 면역염색하였다. OV6, EpCAM, CD44, CD90, AFP 및 SOX9와 같은 간 전구세포 특이적 단백질의 발현은 1, 5 및 10번째 계대배양에서 거의 유사하였다(도 6A).

간 전구성 유전자인 EpCAM, FOXJ1, ITGA6, HNF1β, CD44 및 CD90의 발현을 qRT-PCR 분석을 통해 비교하여 장기간 계대배양에서 mRNA 수준에서 간 전구성 유전자의 발현을 확인하였다. 결과적으로, 10번째 계대배양 후에도 전구성 마커가 일관되게 발현된다는 것이 확인되었다(도 6B).

또한, CdHs의 증식 능력은 계대배양 후 거의 비슷한 속도였고 계대배양이 지나갈수록 더 빨리 성장하였다(도 7A).

CdH의 염색체 결함 상태를 알아보기 위해 1, 5, 10번째 계대배양의 20개의 중기 세포의 핵형 분석을 수행하였다. 1, 5, 10번째 계대배양의 20개의 중기 세포에서 클론형성능이 있는 염색체 이상은 관찰되지 않았고 모두 정상 핵형을 보였다(도 7B). 이러한 결과는 CdH가 안정적으로 염색체 전좌로의 변형 없이 전파된다는 것을 의미한다.

다음으로, CdH가 장기적인 계대배양에서 간세포 분화능을 안정적으로 가지고 있는지를 조사한 결과, 5, 10번째 계대배양한 CdH가 간세포로 안정적으로 분화되었음을 확인하였다(도 6C). 간세포 특이적 단백질인 알부민, HNF4α, CK18 및 CYP3A4는 단백질 수준에서 CdH 유도 간세포에서 잘 발현되었으며, 이 결과는 간세포 분화능이 장기간의 계대배양에서 잘 유지된다는 것을 보여 주는 것이다(도 6C). 계대배양에 따라 간 기능과 관련된 다양한 유전자의 mRNA 발현 수준이 변동되었으나 간세포 분화능을 유지함으로써 이들 유전자의 발현이 증가하고 P450 관련 유전자가 계대배양으로 증가하는 것으로 나타났다(도 6D). 이러한 결과는 CdH가 안정적으로 계대배양되어 장기간에 걸쳐 간세포로 분화하는 능력을 갖추고 있음을 시사한다.

<실험예 4> 생체 내 이식 및 CdH의 생착

CdH를 Jo2 항체가 처리된 NSG(NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg^tm1Wj1/SzJ) 마우스에 주사하였다(도 8A). CdH가 이식된 NSG 마우스의 간은 albumin과 Hnf4a 단백질의 염색을 통하여 mCherry 발현된 CdH가 간세포로 생착 또는 분화됨을 확인하였으며(도 8B), 담관세포 표지자 CK19, CK7 단백질의 염색을 통하여 mCherry 발현된 CdH가 담관세포로도 분화됨을 확인하였다(도 8C).

상기 결과로부터, 현재 주요 문제점으로 남아있는 공여자 부족 및 프라이머리 간세포의 증식 능력 부족으로 인한 간세포 공급 부족이 자가 재생 능력을 갖춘 간줄기세포인 CdH에 의해 해결될 수 있음을 시사할 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 상당량의 간세포 및 담즙 상피 세포를 생성하기 위한 강력한 배양 시스템의 화학적으로 리프로그래밍된 인간 간 전구세포 (CdH)의 최초 보고이며, 면역결핍 마우스의 간으로의 이식 시, CdH는 테라토마의 발생 없이 성체 간세포의 분화된 성질 및 성장 패턴을 획득하여 간 재생을 위한 간 전구체의 귀중한 공급원이 될 수 있다.

Claims

리프로그래밍 인자로서 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 유효성분으로 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물.
제1항에 있어서,
간 전구세포는 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 것인, 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물.
리프로그래밍 인자로서 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 유효성분으로 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법.
제3항에 있어서,
HGF는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 2 내지 100 ng/mL의 농도로 포함되는, 방법.
제3항에 있어서,
A83-01는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.4 내지 4 μM 의 농도로 포함되는, 방법.
제3항에 있어서,
CHIR99021는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.3 내지 3 μM 의 농도로 포함되는, 방법.
제3항에 있어서,
인간 성체 간세포는 3 내지 14일 동안 배양하는, 방법.
제3항의 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법으로부터 리프로그래밍되고, 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1βCK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되며, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 인간 간 전구세포.
제8항의 인간 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물.
제9항에 있어서,
간질환은 만성간염, 간경화, 대사성 간질환, 간암 또는 선천성 유전성 간질환 중 어느 하나인, 간질환 치료용 조성물.