TR201808595T4 - Kanser hastalıklarının tedavisi ve/veya profilaksisi için farmasötik bileşim. - Google Patents

Abstract

Bu buluşun hedeflerin, spesifik olarak kanser hücrelerinin yüzeyleri üzerinde eksprese olan CAPRIN-1'i hedef alan ve anti-tümör aktivitesi bakımından konvansiyonel antikorlardan daha üstün olan bir antikor hazırlamak ve bu antikorun kanser hastalıkları için bir terapötik ve/veya önleyici ajan olarak kullanımını sağlamak ve ortaya koymaktır. Bu buluş, spesifik olarak kanser hücrelerinin yüzeyleri üzerinde eksprese olan belirlenip tanımlanmış bir kanser antijenik proteinini hedef alan bir antikorun kanser hastalıklarına yönelik bir terapötik ve/veya önleyici ajan olarak kullanımı ile, daha somut ifade etmek gerekirse bir CAPRIN-1 proteinine karşı immünolojik reaktiviteye sahip olan bir antikor veya antikor fragmanını bir etkin bileşen olarak ihtiva eden ve ihtiva ettiği bu antikor veya antikor fragmanı SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslarının bulunduğu bir ağır zincir değişken bölgesini ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslarının bulunduğu bir hafif zincir değişken bölgesini içeren kanser hastalıklarının önlenmesi ve/veya tedavisine yönelik bir farmasötik bileşim ile ilgilidir.

Description

TARIFNAMEKANSER HASTALIKLARININ TEDAVISI VE/VEYA PROFILAKSISI ICIN FARMASOTIK BILESIMTeknik AlanBu bulus, istemlerde belirtildigi gibi, CAPRIN-l'i hedef alan bir antikorun veya böyle bir antikorun bir fragmaninin bir ilaç içerisinde kanser hastaliklarina yönelik bir terapötik ve/veya önleyici ajan olarakkullanimi ile ilgilidir.Bulus Hakkinda On BilgilerDünya genelinde meydana gelen ölümlerin baslica sebebi kanser hastaliklaridir. Günümüzde kanser hastaliklarina karsi yürütülen temel tedavi yaklasimi, radyasyon tedavisi ve/veya kemoterapiyle kombinasyon halinde uygulanan cerrahi tedaviye dayanmaktadir.

Geçtigimiz yillarda yeni cerrahi teknikler gelistirilmis olmasina veya yeni anti-kanser ajanlari ortaya konmus olmasina ragmen, bazi kanser çesitlerine karsi yürütülen tedaviler hariç olmak üzere, genel olarak kanser tedavilerinden alinan sonuçlarda son dönemde önemli bir gelisme kaydedileinemistir. Moleküler biyoloji veya kanser immünolojisi alanlarinda kaydedilen son gelismeler sayesinde, kanserle spesifik olarak reaksiyona girebilen antikorlar, sitotoksik Thücrelerinin algilayip tanidiklari kanser antijenleri, bu kanserantijenlerini kodlayan genler ve benzeri unsurlar belirlenip taniinlanmis ve bu kanser antijenlerini hedef alan tedavilerin yakin gelecekte gelistirilebilecegine dair beklentiler artmistir (PatentOlmayan Yayin 1).Kaiiser tedavisinde, yan etkilerin hafifletilmesi düsüncesinden hareketle, kanser antijenleri olarak taninan peptidler, polipeptidler veya proteinlerin spesifik olarak kanser hücrelerinde mevcut olmalari ve normal hücrelerde hemen hemen hiç bulunmamalari arzu edilir.

Boon ve arkadaslari (Ludwig Kanser Arastirma Enstitüsü, Belçika), 1991 senesinde, otolog kanser hücre hatlari ile kanser-reaktif T hücrelerinden istifade ederek uyguladiklari CDNA ekspresyon klonlama yöntemi çerçevesinde, CD8-pozitif T hücrelerinin algilayip taniyabildikleri bir insan melanom antijeni olan MAGEl'i izole etmislerdir (Patent Olmayan Yayin 2). Müteakip süreçte, bir kanser hastasinin vücudunda otolog kansere cevaben in vivo ortamda üreyen antikorlarin tanidigi tümör antijenlerinin gen ekSpresyon klonlama teknikleriyle belirlenip taniinlanmasina dayanan SEREX (rekombinan ekspresyon klonlama yoluyla serolojik anti jen kimliklemesi) yöntemi tanitilinis ve rapor edilmistir (Patent Olmayan Yayin 3 ve Patent Yayini 1). Bu yöntemden istifade edilerek, normal hücrelerde hemen hemen hiç eksprese olniayan fakat kanser hücrelerinde spesifik olarak eksprese olan bazi kanser anti jenleri izole edilmistir (Patent Olmayan Yayinlar 4-9). Bunlarin yani sira, bugüne dek izole edilmis olan kanser antijenlerinden bazilarinin hedef alindigi klinik deneyler çerçevesinde, kanser antijenleriyle spesifik olarak reaksiyona girenimmünositlerin kullanildigi hücre terapisi, asilariii kullanildigi kanser-spesifik immünoterapi ve kaiiser anti jenlerine dayanan benzeri tedaviseçenekleri degerlendirilmektedir.Geçtigimiz yillarda, dünya genelinde, kanser hücrelerinin üzerindeki antijenik proteiiileri hedef alan ve kanser tedavisi için gelistirilmis olan çesitli antikor-bazli ilaçlar ortaya çikmistir. Bu ilaçlar, kanser- spesifik terapötik ajanlar olarak belirli ölçüde bir etkinlige sahip olmalarindan ötürü epey ragbet görmüslerdir. Fakat bu ilaçlarin hedef aldiklari anti jenik proteinlerin birçogu kanser hücrelerinin yani sira norinal hücrelerde de eksprese olurlar. Bu sebeple, bu tip antikorlar uygulandiklarinda, kanser hücrelerinin yani sira antijenleri eksprese eden normal hücreler de hasar alirlar ve dolayisiyla istenmeyen advers reaksiyonlar meydana gelir. Dolayisiyla, kanser hücreleriiiin yüzeyinde spesifik olarak eksprese olan kanser aiitijenleri belirlenip bu antijenleri hedef alan antikorlar ilaç olarak kullanilacaksa, bu antikor bazli ilaçlarin mümkün oldugu kadar az sayida adversreaksiyona yol açmalari arzu edilir.Sitoplazmik-aktivasyon ve proliferasyon-baglantili protein l (CAPRlN-l), dinlenine fazindaki normal hücreler aktive olduklarinda ya da hücre bölünmesine ugradiklarinda eksprese olan ve intraselüler RNA'lar ile birlikte sitoplazmik stres granüllerini olusturup mRNA'larin aktarimi ve translasyonunun regülasyonunda rol oynayan bir intraselüler protein olarak bilinmektedir. Bu proteinin kanser hücrelerinin yüzeyinde spesifik olarak eksprese oldugu tespit edilmistir ve bu sebeple kaiiser tedavisine yönelik antikor bazli ilaçlarin hedef aldiklari unsurlardan biri olarak çalisilmaktadir (Patent Yayini 2).

Referans ListesiPatent Yayinlari5 Patent Yayini 1: 5.698.396 sayili ABD patenti Patent Yayini 2: WO 2010/016526Patent Olmayan Yayinlar10 Patent Olmayan Yayin l: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 511- 519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan) Patent Olmayan Yayin 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643- 1647 (1991) Patent Olmayan Yayin 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995) Patent Olmayan Yayin 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997) Patent Olmayan Yayin 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998) Patent Olinayan Yayin 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998) Patent Olmayan Yayin 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999) Patent Olmayan Yayin 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996) Patent Olmayan Yayin 9: Hum. Mol. Gene 6: 33-39, 199725 Bulusun OzetiTeknik ProblemBu bulusun hedefleri, spesifik olarak kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan CAPRIN-l'i hedef alan ve konvansiyonel antikorlardan daha iyi bir anti-tümör aktivitesine sahip olan bir antikor üretmek ve bu antikorun kanser hastaliklarina yönelik bir terapötikve/veya önleyici ajan olarak kullanimini saglamaktir.Problemin ÇözümüBulusun 'ozellikleri asagida belirtildigi gibidir:Bu bulus, SEKANS KOD NO.: 5, 6, ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslarinin bulundugu bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslarinin bulundugu bir hafif zincir degisken bölgesi ihtiva eden ve bir CAPRIN-l proteinine karsi immûnolojik reaktiviteye sahip olan birantikor veya antikor fragmani ortaya koyar.Bulusun bir diger yapisinda, söz konusu antikor bir hümanize antikordur, bir kimerik antikordur, bir tek zincirli antikordur ya da birbispesifik antikordur.Bu bulus, ayrica, bahsi geçen antikor veya antikor fragmanini bir etkin bilesen olarak içeren bir farmas'otik bilesim ve istemlerde tanimlandigi gibi olan bir farmasötik kombinasyon da ortaya koyar. Bu bulus, ayrica, bahsi geçen farmasötik bilesim ile bahsi geçen farmas'ötik kombinasyonun her birinin kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veya`Önlenmesine yönelik bir yöntem kapsaminda kullanimi ile de ilgilidir.Bulusun bir yapisinda, kanser hastaligi meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kalin bagirsak kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma,fibrosarkom, mastositoin ya da melanomdur.Bulusun Avantaj Saglayan EtkileriBu bulusta kullanilan CAPRIN-l'e yönelik antikor, kanser hücrelerine hasar verir. Dolayisiyla CAPRIN-l'i hedef alan bu antikor, kanserhastaliklariiiin tedavisi ve/veya önlenmesinde faydalidir.Bulusun Yapilarina Dair AçiklamalarBu bulusta kullanilan ve bir CAPRIN-l polipeptidini hedef alan söz konusu antikor, daha sonradan açiklanacagi üzere in vivo ortamda kanser bulunan bir hayvanda tümör proliferasyonunun inhibisyonu yönünde ortaya koydugu etkinlik incelenerek ya da ex vivo ortamda polipeptidi eksprese eden tümör hücrelerine karsi bir immünosit- veya komplemaii-aracili sitotoksik aktivite sergileyip sergilemedigiincelenerek anti-tümör aktivitesi bakimindan mercek altina alinabilir.Bu bulusta kullanilan ve CAPRIN-l'i hedef alan antikor, CAPRIN-l proteinine spesifik baglanan bir moiioklonal antikordur. Bu tarz bir inonokloiial antikor, anti-tümör aktivitesine sahip oldugu sürece herhangi bir antikor çesidine mensup olabilir ve bunlara örnek olarak, insan harici hayvanlara ait antikorlar (örnegin fare, siçan, tavsan vetavuk inonoklonal antikorlari), rekoinbinan antikorlar (örneginsentetik antikorlar, multispesifik antikorlar, hümanize antikorlar, kimerik antikorlar ve tek Zincirli antikorlar (scFV)), insan antikorlari ve bunlarin fragmanlari (örnegin Fab, F(ab')2 ve FV) gösterilebilir. Bu antikorlar ve bunlarin fragmanlari, sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca genel olarak bilinen yöntemler kullanilarak hazirlanabilirler. Denegin bir insan olmasi halinde, rejeksiyon riskinden kaçinmak ya da bu riski baskilamak adina bir hümanizeantikorun kullanilmasi tercih edilebilir.Antikor, immünoglobulin molekülü siniflarindan herhangi birine, örnegin IgG, IgE, IgM, IgA, IgD veya IgY sinifina ya da IgGl, IgGZ, IgG3, IgG4, IgAl ve IgA2'nin örnek gösterilebilecegi alt-siniflardanherhangi birine mensup olabilir.Antikor, glikozilasyonun yani sira, asetilasyon, formilasyon, amidasyon, fosforilasyon, PEGilasyon veya benzeri bir yolla damodifiye edilebilir.Burada geçen "CAPRlN-l proteinine spesifik baglanan" tabiri, antikorun diger proteinlere heinen hemen hiç baglanmaksizin spesifikolarak CAPRlN-l proteinine baglandigini ifade eder.Bu bulusa konu olan terapötik ve/Veya önleyici kanser tedavisinin uygulandigi denek bir memelidir, örnegin bir insan, bir pet hayvani,bir besi hayvani veya bir spor hayvanidir ve tercihen bir insandir.Takip eden kisimda, antijen hazirlama prosedürü, antikor hazirlama prosedürü ve bu bulusa uygun bir farmasötik bilesim anlatilacak veaçiklanacaktir.Bu bulusta kullanilinakta olup CAPRIN-l'i hedef alan antikoru elde etmek maksadi ile sensitizasyon anti jeni olarak kullanilan proteinler veya protein fragmanlari, aralarinda sadece bunlarla sinirli kalmaksizin insanlar, köpekler, sigirlar, atlar, fareler, siçanlar ve tavuklarin bulundugu hayvan türlerinin herhangi birinden elde edilebilirler. Bununla birlikte, bu proteinler veya protein fragmanlari, tercihen hücre füzyonunda kullanilacak parent hücrelerle geçimliliklerine bakilarak seçilirler. Genelde inemelilerden elde edilen proteinler tercih edilir. Özellikle de insan menseli proteinler tercih edilirler. Örnegin CAPRIN-l insan CAPRIN-l'i ise, insan CAPRIN-l proteinleri, onlarin kismi peptidleri ya da insan CAPRIN-l'ini eksprese hücrelerden sensitizasyon anti jenleri olarak istifadeedilebilir.Insan CAPRIN-l'inin ve onun homologlarinin nükleotid sekanslari ve amino asit sekanslari, örnegin GenBank'a (NCBI, ABD) erisim kurularak ve BLAST veya FAST gibi bir algoritma kullanilarak edinilebilirler (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; ve Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402, 1997).Bu bulusta, hedefler, insan CAPRlN-l'inin nükleotid sekansi (SEKANS KOD NO.: 1 veya 3) ya da amino asit sekansini (SEKANS KOD NO.: 2 veya 4) teskil eden referans sekansin ORF'sinin veya matür kisminin nükleotid sekansi veya ainino asit sekansi ile %70 ile %100 arasi, tercihen %80 ile %100 arasi, daha çok tercihen %90 ile %100 arasi, daha da çok tercihen %95 ile %100 arasi bir oranda, örnegin %97 ile %100 arasi, %98 ile %100 arasi, %99 ile %100 arasi veyahut %99,5 ile %100 arasi bir oranda sekans özdesligi sergileyen sekanslardan meydana gelen nükleik asitler veya proteinlerdir. Burada geçen "yüzde cinsinden sekans özdesligi" tabiri, iki sekans aralarindaki maksimum benzerlik veya özdeslik derecesini görmek maksadiyla bosluk sokularak veya sokulmadan hizalandiginda kaydedilen, toplam aniiiio asit (veya baz) adedine (bosluklar da dahil)göre özdes amino asit (veya baz) adedinin oranina (%) atif yapar.CAPRIN-l proteinleriiiin fragmanlari, antikorun algilayip taniyabilecegi asgari birimi teskil eden bir epitOpun (veya bir anti jenik determinant) amino asit uzunlugu ile proteinin tam boy uzunlugu arasi uzunluklara sahiptirler. Epitop, inemelilerde ve tercihen insanlarda anti jenisite veya immünojenisiteye sahip olan bir polipeptid fragmanina karsilik gelir. En küçük hali, yaklasik 7 ilâ 12 adet aminoasitten, örnegin 8 ilâ 11 adet amino asitteii olusur.Yukarida bahsi geçen insan CAPRlN-l proteinlerini ve onlarin kismi peptidlerini ihtiva eden polipeptidler, kimyasal sentez yöntemleriyle, örnegin Fmoc (florenilmetiloksikarbonil) ve tBoc (t-bütiloksikarbonil) yöntemleriyle (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical ExperimentationCourse in English) 1, the Japanese Biocheinical Society ed., Protein10Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japonya), 1981) sentezlenebilirler. Bu polipeptidler ayrica ticari piyasada mevcut bulunan çesitli peptid sentezleyiciler kullanilarak standart yönteinler çerçevesinde de sentezlenebilirler. Alternatif olarak, sektörde bilinen genetik mühendislik yaklasimlarina (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendiuin of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; ve benzeri) basvurularak bu polipeptidleri kodlayan polinükleotidler hazirlanabilir ve hazirlanan polinükleotidler ekspresyon vektörlerine yerlestirilip bu vektörler daha sonra konakçi hücrelere sokularak bu konakçi hücrelerin hedef polipeptidleri üretmeleri saglanabilir. Ilgiliinsan polipeptidler bu yolla da elde edilebilirler.Polipeptidleri kodlayan polinükleotidler, ticari piyasada mevcut bulunan nükleik asit sentezleyiciler kullanilarak standart yönteinlerle veya sektörde bilinen genetik mühendislik yaklasimlariyla kolayca hazirlanabilirler. Örnegin, insan CAPRIN-l geninin nükleotid sekansini içeren bir DNA, sablon olarak bir insan kromozomal DNA veya cDNA kütüphanesi ve SEKANS KOD NO.: 1'de gösterilen nükleotid sekansini amplifiye edebilecek sekilde tasarlanan bir primer çifti kullanilarak PCR ile hazirlanabilir. Bu PCR'de tatbik edilecek reaksiyon kosullari usulüne uygun sekilde tayin edilebilir. Reaksiyon kosullarina örnek olarak, isiya toleransli DNA polimeraz (ömegin Taq polimeraz veya Pfu polimeraz) ve bir Mg2+-içerikli PCR tainponukullanilarak 30 saniye boyunca 94°C sicakligin (denatürasyon), 3011saniye ilâ 1 dakika boyunca 55°C sicakligin (kaynastirma) ve 2 dakika boyunca 72°C sicakligin (elongasyon) uygulandigi reaksiyon basamaklari 30 defa tekrarlanip ardiiidan 7 dakika boyunca 72°C sicakligin uygulandigi bir reaksiyon gösterilebilir. PCR yaklasimi, reaksiyon kosullari ve benzeri konular hakkiiida bilgi almak için örnegin "Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons" (özellikle de Bölüin15) eserine bakilabilir.Ayrica, CAPRIN-l genlerinin nükleotid sekanslari ve CAPRIN-l proteinlerinin amino asit sekanslari hakkinda bilinenler temelinde uygun problar veya primerler hazirlanip, örnegin istenen DNA'nin izole edilmesi amaciyla bir insan cDNA kütüphanesinde yürütülen tarama çalismasinda kullanilabilirler. Bu gibi bir cDNA kütüphanesi tercihen CAPRIN-l proteinlerini eksprese eden hücreler, organlar veya dokulardan üretilir. Bu hücre ve dokulara verilebilecek örnekler arasinda, testisten ya da lösemi, meme kaiiseri, lenfoma, beyin tümörü, akciger kanseri, pankreas kanseri ve kalin bagirsak kanseri gibi kanserler veya tümörlerden elde edilen hücreler ve dokular sayilabilir. Problarin veya primerleriii hazirlanmasi, bir cDNA kütüphanesiniii yapimi, cDNA kütüphanesiriin taraniiiasi ve ilgili geniii klonlanmasiyla ilgili islemlerin nasil yürütülecegi sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca bilinir ve bu islemler örnegin "Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989)" eseri ile Ausubel ve arkadaslarina ait eserde (yukarida atif yapilan eser) açiklanan yöntemlere göregerçeklestirilebilirler. Bu sayede elde edilen DNA'lardan insan12CAPRlN-l proteinlerini ve onlarin kismi peptidlerini kodlayan DNA'lar elde edilebilir.Konakçi hücreler, yukarida bahsi geçen polipeptidleri eksprese etme kabiliyetine sahip olan herhangi bir hücreyi teskil edebilirler. Uygun prokaryotik hücrelere örnek olarak, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, E. coli hücreleri gösterilebilir, Okaryotik hücre örnekleri arasinda ise, yine sadece bunlarla sinirli kalinaksizin, maymun böbrek hücreleri COSl, Çin hainsteri yuinurtalik hücreleri CHO, bir insan embriyonik böbrek hücre hatti olan HEK293 ve bir fare einbriyonik deri hücre hatti olan NIH3T3 gibi memeli hücreleri, toinurcuklanan maya hücreleri ve bölünerek çogalan maya hücreleri gibi maya hücreleri, ipekböcegi hücreleri ve Xenopus yumurta hücrelerisayilabilir.Konakçi hücreler olarak prokaryotik hücrelerden istifade edilecekse, kullanilan ekspresyon vektörlerinde prokaryotik hücrelerde replikasyona izin veren bir kaynak, bir promotor, bir ribozom- baglanma yeri, bir çoklu klonlama yeri, bir terminatör, bir ilaç-direnç geni, bir oksotrofik tamamlayici gen ve benzeri unsurlar bulunabilir.

E. coli ekspresyon vektörlerine verilebilecek örnekler arasinda, pUC serisi, pBluescript II, pET ekspresyon sistemleri ve pGEX ekspresyon sistemi bulunur. Yukarida bahsi geçen polipeptidleri kodlayan DNA'lar bu gibi ekspresyon vektörlerinin içerisine sokulurlar; bu vektörler kullanilarak prokaryotik konakçi hücreler transforme edilirler; elde edilen transfomiantlar kültürlenirler ve böylelikle,DNA'larin kodladiklari polipeptidlerin prokaryotik konakçi hücreler13içerisinde eksprese olmalari saglanir. Polipeptidler, baska proteinlerleberaber füzyon proteinleri olarak da eksprese edilebilir.Konakçi hücreler olarak ökaryotik hücrelerden istifade edilecekse, ekspresyon vektörleri olarak, ökaryotik hücreler için bir promotor, bir uçbirlestirme bölgesi, bir poli(A) adisyon yeri ve benzeri unsurlar ihtiva eden ekspresyon vektörleri kullanilir. Bu gibi ekspresyon vektörlerine verilebilecek örnekler arasinda, pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 ve pYESZ vektörleri bulunur. Yukarida açiklanan prosedüre benzer sekilde, yukarida bahsi geçen polipeptidleri kodlayan DNA'lar bu gibi ekspresyon vektörlerine sokulurlar; bu vektörler kullanilarak ökaryotik konakçi hücreler transforme edilirler; elde edilen transformantlar kültürlenirler ve böylelikle, DNA'larin kodladiklari polipeptidlerin ökaryotik konakçi hücreler içerisinde eksprese olmalari saglanir. pIND/VS-His, pFLAG-CMV-Z, pEGFP-Nl veya pEGFP-Cl gibi ekSpresyon vektörleri kullanilacaksa, polipeptidler, His tagi (örnegin (His)6-(His)10), FLAG tagi, myc tagi, HA tagi, GFP veya benzeri taglar ile tagli çesitli füzyon proteinleri olarak ekspreseedilebilirler.Ekspresyon vektörlerini konakçi hücrelere sokmak için, elektroporasyon, bir kalsiyum fosfat yöntemi, bir lipozom yöntemi, bir DEAE dekstran yöntemi, mikroenjeksiyon, Viral enfeksiyon, lipofeksiyon ve hücre membraiiindan nüfus edebilen peptidlerebaglama gibi iyi bilinen teknikler kullanilabilir.Hedef polipeptidi koiiakçi hücrelerden izole etmek ve saflastirmak14için, sektörde bilinen separasyon teknikleri kombinasyon halinde kullanilabilirler. Bu tekniklere verilebilecek örnekler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, bir denatüran (örnegin üre) veya bir deterjan ile isleme, ultrasonikasyon, enzimatik sindirim, tuzla çökeltine, çözücü fraksiyonasyonu ve presipitasyonu, diyaliz, santrifûj, ultrafiltrasyon, jel filtrasyonu, SDS-PAGE, izoelektrik fokuslama elektroforezi, iyon degistirme kromatografisi, hidrofobik kromatografi, afinite kromatografisi ve ters faz kromatografisisayilabilir.Antikorlar, genelde, en az iki adet agir zincir ile en az iki adet hafif zincir ihtiva eden heteroniultiinerik glikoproteinleri teskil ederler. IgM disindaki immünoglobulinler, iki özdes hafif (L) zincir ve iki özdes agir (H) ziiicirden olusan yaklasik 150 kDa agirligindaki heterotetramerik glik0proteinlerdir. Normalde hafif zincirlerin her biri bir kovaleiit disülfür bagi araciligiyla agir zincirlerden birine bagli olur, fakat farkli iinmünoglobulin izotiplerinde agir zincirler arasindaki disülfur bagi adedi farkli olabilir. Hafif ziiicir veya agir zincirlerin her birinde bir zincir-içi disülfur bagi da bulunur. Her agir zincirin uçlarindan birinde bir degisken domain (VH bölgesi) bulunur Ve bu bölgeyi birkaç tane sabit bölge takip eder. Her hafif zincirin bir ucunda bir degisken domain (VL bölgesi), diger ucunda ise bir sabit bölge yer alir. Hafif zincirin sabit bölgesi agir zincirin ilk sabit bölgesi ile hizalidir ve hafif zincirin degisken domaini agir zincirin degisken domaini ile hizalidir. Antikor degisken domainlerinde yer alan vetainainlayicilik belirleme bölgeleri (CDR'ler) olarak adlandirilan15bölgeler spesifik degiskenlik sergilerler ve antikora baglanma spesifisitesi kazandirirlar. Degisken bölgelerdeki nispeten korunan kisimlara çerçeve bölgeleri (FR'ler) denir. Tam boy agir ve hafif zincir degisken domainlerinin her birinde, üç CDR ile birbirlerine bagli halde dört adet FR bulunur. Agir zincirde bulunan üç CDR'ye, agir zincirin N-terminal ucundan itibaren sirasiyla CDRHl, CDRH2 ve CDRH3 denir. Hafif zincirde bulunan CDR'lere de benzer sekilde CDRLl, CDRL2 ve CDRL3 denir. CDRH3, antikorun antijene karsi sahip oldugu baglanma spesifisitesi açisindan en fazla öiiem arz eden bölgedir. Öte yandan, bir zincirde bulunan CDR'ler aralarindaki FR bölgelerinin etkisiyle birbirlerine yakin konumlarda birlikte dururlar ve diger zincirde yer alan CDR'ler ile birlikte antikorun antijen- baglanma yerinin olusmasina katkida bulunurlar. Sabit bölgeler antikor-antijen baglaniminda direkt bir etki göstermezler, fakat antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC), bir Fcy reseptörüne baglanma araciligiyla gerçeklesen fagositoz, bir neonatal Fc reseptörünün (FcRn) aracililik ettigi yari-ömür/klirens hizi ve kompleman kaskadindaki bir Clq bileseniniii aracilik ettigi kompleman-bagimli sitotoksisite (CDC) gibi çesitli efektörfonksiyonlarda rol oynarlar.Bu bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikoru, bir tam boy CAPRIN-l proteinine veyahut onun bir fragmanina karsi immünolojikreaktiviteye sahip olan bir antikordur.Burada geçen "immünolojik reaktiVite" terimi, antikorun in vivo16ortamda CAPRIN-l antijenine baglanma kabiliyetine atif yapar.

Bulusa konu olan antikor bahsi geçen antikora baglanmak suretiyle tümöre hasar verme (örnegin öldürme, baskilama veya geriletme) yönündeki fonksiyonunu ortaya koyar. Somutlastirmak gerekirse, bu bulusta kullanilan antikor, CAPRIN-l proteinine baglanma özelligini ortaya koymasi sonucunda meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kalin bagirsak kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uteriii serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositom veya melanom gibi tüinörlere hasar verebilen bir antikoroldugu sürece herhangi bir antikor sinifina mensup olabilir.Takip edeii kisimda, çesitli monoklonal antikorlariii hazirlanisina istinaden, öriiek niteliginde olan çesitli hazirlama prosedürleri ortayakonacaktir.Omegin, her fareye immünizasyon için CAPRIN-l eksprese eden meme kanseri hücre hatlari SK-BR-3 uygulanir. Daha soiira farelerin dalaklari ekstrakte edilir. Dalak hücreleri ayrildiktan sonra, bu hücreler fare miyelom hücreleri ile füzyonlanirlar. Elde edilen füzyon hücreleri (hibridomlar) arasindan, kanser hücrelerine karsi aiitiproliferatif etki sergileyen antikorlari üreten klonlar seçilir. Kanser hücrelerine karsi antiproliferatif etkiye sahip olan monoklonal antikorlari üreten hibridomlar izole edilir ve kültürlenirler. Hedef antikor, bir genel afinite saflastirma yöntemiyle kültür üst fazindansaflastirma yapilmasi yoluyla hazirlanabilir.17Monoklonal antikor üreten hibridomlar, örnegin asagida tarif edildigi gibi hazirlanabilirler: öncelikle, hayvanlar sektörde bilinen bir yönteme göre sensitizasyon antijenleri ile immünize edilirler. Bu immünizasyon yöntemi bünyesinde sensitizasyon antijenleri memelilere genelde intraperitoneal veya subkütan yolla enjekte edilirler. Daha soinut bir dille ifade etmek gerekirse, sensitizasyon anti jenleri PBS (fosfat tamponlu salin), fizyolojik salin veya benzeri bir maddeyle uygun bir miktarda seyreltilir veyahut böyle bir madde içerisinde uygun bir miktarda süspanse edilip ardindaii istenirse uygun bir miktardaki bir konvansiyonel adjuvanla, örnegin bir tamamlanmis Freund adjuvaniyla karistirilirlar. Emülsifikasyondan sonra, elde edilen emülsiyon, her 4 ilâ 21 günde bir birkaç defa memelilere uygulanir. Alternatif olarak, sensitizasyon anti jenleriyleiminünizasyon için uygun bir tasiyici kullanilabilir.Immünize edilen hayvanin serumunda istenen antikorun seviyesinde bir artis söz konusu oldugu teyit edildikten soiira, hayvandan inimüiiositleri toplanir ve bunlar hücre füzyonuna tâbi tutulurlar.Bilhassa tercih edilen immünosit örnekleri dalak hücreleridir.Immünositler ile füzyonlanacak diger parent hücre partnerleri olarak örnegin memeli miyelom hücreleri kullanilir. Bu amaçla kullanilabilecegi bilinen çesitli hücre hatlari bulunmaktadir; örnegin P3Ul (P3-X63Ag8Ul), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Iinmunology (1978) 81, 1-7), NS-l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur.

J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-ll (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276,18269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) , 1-21), 8194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) ve R210'un (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) miyelomhücreleri olarak kullanilmalari tercih edilir.Iinmüiiositler ile miyelom hücreleri arasindaki hücre füzyonu, temel olarak sektörde biliiien bir yönteme göre, örnegin Kohler ve Milstein'in tarif ettikleri yönteme (Kohler, G. aiid Milsteiii, C.

Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) göre gerçeklestirilebilir.Daha somut bir dille ifade etmek gerekirse, hücre füzyonu, örnegin bir konvansiyonel besin vasati içerisinde bir hücre füzyonu promotoru esliginde gerçeklestirilir. Füzyon promotoru olarak örnegin polietilen glikol (PEG) ya da Japon hemaglütinasyon virüsü (HVJ) kullanilabilir. istenirse, füzyonun verimini artirmak ainaciyla diinetilsülfoksit gibi bir yardimci madde de katilabilir.Kullanilan immünositler ile miyelom hücreleri arasindaki oran keyfi olarak belirlenebilir. Örnegin, kullanilan iiiimünosit miktari tercihen kullanilan miyelom hücresi miktarinin 1 ilâ 10 kati olarak ayarlanir.

Hücre füzyonu için kullanilabilecek vasat örnekleri arasinda, miyelom hücre hatlarinin büyüyüp çogaltilmalari için uygun RPM11640 ve MEM vasatlari ve bu tip hücreleri kültürlemek için kullanima uygun konvansiyonel vasatlar bulunur. Bu hücreler ile birlikte ayrica fetalbuzagi serumu (FCS) gibi bir serum takviyesi de kullanilabilir.Hücre füzyonunda, immünositler ve miyelom hücreleri öiicedenbelirlenmis miktarda vasat içerisinde iyice karistirilirlar. Genelde19karisima %30 ile %60 (a/h) arasi bir konsantrasyoiida önceden 37°C sicakliga ulasana dek isitilmis olan bir PEG çözeltisi (ortalaina molekül agirligi: örnegin yaklasik 1000 ilâ 6000) ilave edilir ve onunla karistirilarak hedef hibridomlarin olusmasi saglanir.

Müteakiben uygun bir vasatin eklendigi ve üst fazin santrifüj yoluyla uzaklastirildigi birbirini takip eden prosedürler tercihen tekrarlanarak, hücre füzyonu ajanlari veyahut hibridoinlarin çogaltilinasi bakimindanmevcut olmasi istenmeyen benzeri maddeler uzaklastirilir.Bu sekilde elde edilen hibridomlar, seleksiyon için bir konvansiyonel selektif vasatta, Örnegin bir HAT vasatinda (hipoksantin, aminopterin ve timidin içeren vasat) kültürlenirler. HAT vasatinda gerçeklestirilen kültürleme islemine, hedef hibridoinlar disindaki hücreler (füzyona girineyen hücreler) ölene dek devam edilir (genelde birkaç gün ilâ birkaç hafta sürer). Akabinde hedef antikoru üreten hibridomlar taranirlar ve bir konvansiyonel sinirlandirici seyreltine yöntemiylebirbirinden ayri klonlar halinde klonlanirlar.Hibridomlarin insan harici hayvanlarda antijenlerle immünizasyon yapilarak elde edildigi bahsi geçen yaklasiinin yani sira, insan lenfositlerinin, örnegin EB virüsüyle enfekte edilmis insan lenfositlerinin proteinlerle, proteinleri eksprese eden hücrelerle veya onlarin lizatlariyla in vitro ortamda sensitize edilmeleri ve sensitize edilen lenfositlerin kalici olarak bölünme kabiliyetine sahip olan insan menseli miyelom hücreleriyle, örnegin U266 (Erisim No. TIB 196) ile füzyonlanmalari yoluyla, istenen aktiviteye (örnegin hücre proliferasyonunu önleyici aktivite) sahip olan insan antikorlariiiiüreten hibridomlar da elde edilebilir.20Bu sekilde hazirlanan monoklonal antikor üreten hibridoinlar, bir konvansiyonel vasatta alt-kültürlenebilirler ve ayrica sivi nitrojeniçerisinde uzun bir süre boyunca saklanabilirler.Somutlastirmak gerekirse, istenen anti jenler ya da istenen antijenleri eksprese eden hücreler bir konvansiyonel iminünizasyon yöntemi çerçevesinde iminünizasyonda sensitizasyon antijenleri olarak kullanilirlar. Elde edilen immünositler, bir konvansiyonel hücre füzyonu yöntemi çerçevesinde sektörde bilinen parent hücreler ile füzyonlanirlar. Monoklonal antikor üreten hücreler (hibridomlar) arasinda bir konvansiyonel taraina yöntemiyle tarama yapilarak hedefmonoklonal antikorlari üreten hibridomlar hazirlanabilir.Bu baglamda insan antikoru üreten fareler olarak örnegin KM fareler (Kirin Pharma C0., Ltd/Medarex) ve Xeno fareler (Aingen Inc.) kullanilabilir (örnegin bkz: WO 02/43478 ve W002/092812 sayili uluslararasi yayinlar). CAPRIN-l proteinleriyle veya onlarin fragmanlariyla iinmünize edilen bu gibi farelerin kanindan tam boy insan poliklonal antikorlari elde edilebilir. Alternatif olarak, bu sekilde immünize edilen farelerden dalak hücreleri izole edilip bu hücreler miyelom hücreleriyle füzyonlanabilirler. Bu yolla insan monoklonalantikorlari elde edilebilir.Anti jenler, hayvan hücrelerinin kullanildigi bir yönteme göre (2007- 530068 A (2007) sayili JP patent yayini (Kohy0)) ya da bakulovirüsün kullanildigi bir yönteme göre (WO 98/46777 sayili uluslararasi yayin)hazirlanabilirler. Düsük bir iinmünojenisiteye sahip olan antijenler,21immünizasyon için albümin gibi immünojenik makromoleküllerebaglanabilirler.Alternatif olarak, asagida belirtilen basamaklari içeren bir gen rekombinasyon teknigi kullaiiilarak üretilen rekombinan antikorlar kullanilabilir: antikor genlerinin hibridomlardan klonlanmalari; antikor genlerinin uygun vektörlere yerlestirilmeleri ve vektörlerin konakçilara sokulmalari (örnegin bkz: Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Daha somut bir dille ifade etmek gerekirse, ters transkriptaz uygulanarak hibridomlarin mRNA'larindan antikor degisken bölge (V bölge) cDNA'lari sentezlenir. Ilgili antikor V bölgelerini kodlayan DNA'lar elde edildikten sonra bu DNA'lar istenen antikor sabit bölgelerini (C bölgeleri) kodlayan DNA'lar ile ligate edilirler. Elde edilen ligasyon ürünleri ekspresyon vektörlerine yerlestirilirler. Alternatif olarak, antikor V bölgelerini kodlayan DNA'lar antikor C bölgesi DNA'larini içeren ekspresyon vektörlerine yerlestirilebilirler. Bu DNA'lar, ekspresyon vektörlerine, ekspresyon kontrol bölgelerinin, örnegin bir artirici ve bir promotorun kontrolü altinda eksprese olmalarini saglamak üzere yerlestirilirler. Akabinde konakçi hücreler bu ekspresyon vektörleriyle transforme edilipantikorlari eksprese etmeye birakilabilirler.Yukarida açiklandigi gibi, bu bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikoru, insan disindaki hayvanlara ait monoklonal antikorlarin ve rekombinan antikorlarin aralarinda bulundugu çesitli inonoklonalantikorlardan herhangi birini teskil edebilir.22Insan disindaki hayvanlara ait bu monoklonal antikorlar, CAPRlN-l proteinleri ile immünize edilmis insan disindaki hayvanlardan (örnegin fareler, insan antikoru üreten fareler, tavuklar veya tavsanlar) alinan dalak hücreleri miyelom hücreleri ile füzyonlamak suretiyleelde edilen hibridomlar kültürlenerek hazirlanabilirler.Burada bahsi geçen rekoinbinan antikor, yukarida belirtildigi gibi, kimerik antikorlari, hümanize antikorlari, tek Zincirli antikorlari, multispesifik antikorlari ve benzeri antikorlari içine alan bir anlaintasir.Kimerik antikor asagida tarif edildigi gibi hazirlanabilir: insan disindaki bir hayvandan (öriiegin fare, siçan, tavsan veya tavuk) elde edilen bir antikorun hafif veya agir zincir degisken bölgelerini kodlayan DNA'larin bir insan antikorundan elde edilen hafif zincir veya agir zincir sabit bölgelerini kodlayan DNA'lar ile ligate edilmeleri; elde edilen füzyon genlerinin ekspresyon vektörlerine sokulmalari ve ilgili antikorlarin üretilmelerini saglamak amaciyla buvektörlerin konakçilara yerlestirilineleri.Somutlastirmak gerekirse, kimerik antikor, örnegin, fare antikoru agir Zincir ve hafif Zincirlerinin degisken bölgeleri ile insan antikorlarinin agir ve hafif zincir sabit bölgelerinden olusan bir aiitikoru teskil eder.

Kimerik antikor, sektörde bilinmekte olup örnegin asagida belirtilen basamaklari içeren bir yöntem kullanilarak hazirlanabilir: fare antikoru V bölgelerini kodlayan DNA'larin insan antikoru C bölgelerini kodlayan DNA'lar ile ligate edilmeleri; elde edilenligasyon ürünlerinin ekspresyon vektörlerine sokulmalari ve ilgili23antikorlarin üretilmelerini saglamak amaciyla bu vektörlerin konakçilara yerlestirilmeleri. Asagida açiklanacak olan Orneklerde, insan-fare kimerik antikorlari hazirlanmis ve bunlarin bir anti-tümör etkiye sahip olduklari teyit edilmistir. Bu inonoklonal antikorlar, SEKANS KOD NO.: 8 ainino asit sekansina sahip olan bir agir zincir degisken (VH) bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 12 amino asit sekansina sahip olan bir hafif zincir degisken (VL) bölgesi ihtiva ederler ve bahsi geçen VH bölgesi, SEKANS KOD NO.: 5 amino asit sekansi ile temsil edilen bir CDRl, SEKANS KOD NO.: 6 ile teinsil edilen bir CDR2 ve SEKANS KOD NO.: 7 ile temsil edilen bir CDR3 içerir ve bahsi geçen VL bölgesi, SEKANS KOD NO.: 9 amino asit sekansi ile temsil edilen bir CDRl, SEKANS KOD NO.: 10 amino asit sekansi ile temsil edilen bir CDR2 ve SEKANS KOD NO.: 11ainino asit sekansi ile temsil edilen bir CDR3 içerir.Yeniden sekillendirilinis insan antikoru da denen hümanize antikor bir genetigi degistirilmis antikordur. Hümanize antikor, insan antikorunun CDR'leri bir immünize hayvandan elde edilen aiitikora tekabül edilen CDR'leri ile greftlenerek yapilir. Somutlastirmak gerekirse, bir insan antikorunun bir hafif veya agir zincir degisken bölgesini kodlayan DNA'lardaki CDR kodlama sekanslarinin insan disindaki bir hayvana (örnegin fare, siçan, tavsan veya tavuk) ait bir antikorun mütekabil CDR kodlama sekanslari ile degistirilmis oldugu DNA'lar hazirlanir ve bunlar, insan antikoru kaynakli hafif veya agir zincir sabit bölgelerini kodlayan DNA'lar ile ligate edilirler. Elde edilen füzyon genleri ekspresyon vektörlerine sokulup daha sonra bu vektörler antikor `üretiminin gerçeklesmesi içiii konakçilara yerlestirilerek hedefhümanize antikor hazirlanabilir.24Somutlastirmak gerekirse, örnegin, terminal kisimlari üst üste binen hazirlanan bir dizi oligonükleotid ile PCR gerçeklestirilerek, fare ve tavuk antikoru CDR'lerini insan antikoru çerçeve bölgelerine (FR'ler) baglayacak sekilde tasarlanmis DNA'lar sentezlenir. Elde edilen DNA'lar, insan antikoru sabit bölgelerini kodlayan DNA ile ligate edilirler. Ardindan elde edilen ligasyon ürünleri ekspresyon vektörlerine yerlestirilirler ve bu vektörler de antikor üretimi için konakçilara sokularak hedef antikor elde edilir (bkz: EP239400 sayili Avrupa patent basvurusu yayini ve WO 96/02576 sayili uluslararasi yayin). CDR'ler araciligiyla birbirlerine bagli bulunan insan antikoru FR'leri, CDR'lerin olumlu ve verimli bir antijen baglanma yeri olusturup olusturmadiklarina bakilarak seçilirler. Gerekirse, antikor degisken bölgelerinin çerçeve bölgelerinde yer alan amino asitlerde, elde edilen yeniden sekillendirilinis insan antikorunun CDR'lerinin uygun bir anti jen baglanma yeri olusturinasini saglayacak ikaineler yapilabilir (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Ayrica, bu çerçeve bölgeleri, çesitli insan antikorlarindan elde edilen çerçeve bölgeleriyle degistirilebilirler (bkz: WO 99/51743 sayiliuluslararasi yayin).CDR'ler araciligiyla birbirlerine baglanan insan antikoru çerçeve bölgeleri, CDR”lerin olumlu ve verimli bir antijen baglanma yeri olusturup olusturmadiklari göz önünde tutularak seçilirler. Gerekirse, antikor degisken bölgelerinin çerçeve bölgelerinde yer alan amino asitlerde, elde edilen yeiiiden sekillendirilmis insan antikorunun CDR'lerinin uygun bir antijen baglanma yeri olusturmalarini saglayacak ikameler yapilabilir (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).25Burada bahsi geçen tek zincirli antikor, ihtiva ettigi agir ve hafif zincirlerin degisken bölgelerinin birbirlerine bir baglayici araciligiyla lineer olarak bagli bulundugu bir antikor veya antikor fragmanini teskil eder. Tek zincirli antikoru kodlayan bir DNA, agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir DNA, baglayiciyi kodlayan bir DNA ve hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir DNA birbirlerine ligate edilerek hazirlanabilir. Bu baglamda, agir ve hafif zincirlerin degisken bölgelerinin her ikisi de bir insan antikorundan ya da CDR'leri insan disindaki bir hayvanin (örnegin fare siçan, tavsan veya tavuk) antikorunun CDR'leri ile ikame edilmis olan bir insan antikorundan elde edilir. Baglayici, 12 ilâ 19 adet amino asitten olusur. Buna verilebilecek örneklerden biri, 15 amino asitten olusan (G4S)3't'ur (GB. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).Multispesifik aiitikor, farkli birden çok epitope spesifik baglanma kabiliyetine sahip olan bir antikoru teskil eder. Omegin bISpesifik antikor (dimerik antikor fragmani), iki farkli epitopa Spesifik baglanma kabiliyetine sahip olan bir antikordur. Bispesifik antikor kodlayan bir DNA, örnegin, bir agir zincir degisken bölgesi A'yi kodlayan bir DNA, bir hafif zincir degisken bölgesi B'yi kodlayan bir DNA, bir agir zincir degisken bölgesi B'yi kodlayan bir DNA ve bir hafif zincir degisken bölgesi A'yi kodlayan bir DNA'nin bu sirayla birbirlerine ligate edilmeleri yoluyla (bir hafif zincir degisken bölgesi B'yi kodlayan DNA ile bir agir zincir degisken bölgesi B'yi kodlayan DNA'nin yukarida tanimlandigi gibi olan bir baglayici kodlayan bir DNA araciligiyla birbirlerine ligate edilmeleri sartiyla) hazirlanabilir.Burada bahsi geçen agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin hepsi bir26insan antikorundan ya da CDR'lerin insan disindaki bir hayvana (örnegin fare, siçan, tavsan veya tavuk) ait antikorun CDR'leri ileikame edilmis oldugu bir insan antikorundan elde edilir.Bu sekilde hazirlanan kimerik antikor veya hümanize antikorun degisken bölgeleri (örnegin FR'ler) veya sabit bölgelerinde yer alanamino asitler örnegin baska amino asitler ile ikame edilebilirler.Burada bahsi geçen amino asit ikamesi, örnegin 15'ten az sayida, 'dan az sayida, 8 veya daha az sayida, 7 veya daha az sayida, 6 veya daha az sayida, 5 veya daha az sayida, 4 veya daha az sayida, 3 veya daha az sayida ya da 2 veya daha az sayida, tercihen l ilâ 5 adet ve daha çok tercihen 1 veya 2 adet amino asidi ilgilendiren bir ikamedir.

Ikame yapilmis olan bir antikor, ikaiiie yapilmamis olan bir antikor ile islevsel açidan esdeger nitelikte olmalidir. Ikamenin konservatif amino asit ikamesi olmasi, yani ikamenin yük, yan zincirler, polarite ve aromatisite gibi özellikleri bakimindaii birbirlerine benzeyen aniiiio asitler arasinda yapilmasi arzu edilir. Amino asitler, tasidiklari benzer özellikler çerçevesinde örnegin asagida gösterildigi gibi siiiiflaiidirilabilirler: bazik ainino asitler (arjinin, lizin ve histidin); asidik amino asitler (aspartik asit ve glutamik asit); yüksüz polar amino asitler (glisin, asparajin, glutamin, serin, treonin, sistein ve tirozin); polar olmayan amino asitler (lösin, izolösin, alanin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan ve metionin); dallaiimis amiiio asitler (lösin, valin ve izolösin) ve aromatik amino asitler (fenilalanin,tirozin, triptofan ve histidin).27Modifiye antikorlara örnek olarak, polietilen glikol (PEG) gibi çesitli moleküllere bagli olan antikorlar gösterilebilir. Bulusa konu olan modifiye antikorda, antikorun bagli olabilecegi madde için belirlenmis herhangi bir sinirlama yoktur. Bu gibi bir modifiye antikor elde etmek için, elde edilen antikor kimyasal olarak modifiye edilebilir. Bu amaçla kullanilabilecek olan bir yöntem sektörde halihazirdamevcuttur.Burada geçen "islevsel açidan esdeger" tabiri, atif yapilan antikorun bulusa konu olan antikor ile benzer bir biyolojik veya biyokimyasal aktiviteye sahip oldugu, daha somut ifade etmek gerekirse, atif yapilan antikorun örnegin insanlara uygulandiginda tümörlere hasar verebildigi ve esasen herhangi bir rejeksiyon sorununa yol açmadigi anlainina gelir. Burada bahsi geçen aktivite, örnegin antiproliferatifaktivite ve baglanma aktivitesi olabilir.Belirli bir polipeptid ile islevsel açidan esdeger olan bir polipeptid hazirlamak için kullanilabilecek olup söz konusu polipeptidde bir mutasyon yapilmasina dayanan sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca iyi bilinen bir yöntein vardir. Örnegin, sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar bulusa konu olan antikora yer hedefli niutageiiez (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271- 275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468- 500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441- 9456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350- 367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) veya benzeri bir28yolla usulüne uygun sekilde bir mutasyon yerlestirerek bulusa konuolan antikora islevsel açidan esdeger olan bir antikor hazirlayabilirler.Bir CAPRIN-l proteininde yer alan ve yukarida tanimlanan anti- CAPRIN-l antikorlarindan her biri tarafindan algilanip taninan bir epitopu algilayip taniyan bir antikor, sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca genel olarak bilinen bir yöntem ile hazirlanabilir. Antikor, örnegin, anti-CAPRIN-l antikorunun CAPRIN-l proteininde algilayip taniyabildigi epitopun bir konvansiyonel yöntem (örnegin epitop haritalama) kullanilarak belirlenmesine ve epitoptaki amino asit sekansini barindiran bir polipeptid bir immünojen olarak kullanilarak bir antikorun hazirlanmasina dayanan bir yöntemle ya da bir konvansiyonel yöntemle hazirlanan bir antikorun hedef aldigi bir epitopun belirlenmesine ve anti-CAPRIN-l antikoru ile ayni epitopu algilayip taniyabilen bir antikorun seçilmesine dayanan bir yöntemleelde edilebilir.Bulusa konu olan antikor, tercihen en az 107 M'l, en az 108 M4, en az x 108 M`l, en az 109 M`l, en az 5 X109 M`l, en az 1010 M'1 en az 5 X 1010 M`1, en az 10” M4, en az 5 X 101'M", en az 1012 M'1 veya en az1013 M'1 düzeyinde bir Ka (kon/koff) afinite sabitine sahiptir.Bulusa konu olan antikor bir anti-tümör ajanina konjuge edilebilir.

Antikorun anti-tümör ajanina konjugasyonu, bir amino grubu, bir karboksil grubu, bir hidroksi grubu, bir tiol grubu veya benzeri bir gruba karsi reaktif olan bir grubun (örnegin bir süksinimidil grubu, birformil grubu, bir 2-piridilditi0 grubu, bir maleimidil grubu, bir29alkoksikarbonil grubu veya bir hidroksi grubu) bulundugu bir aralayiciaraciligiyla gerçeklestirilebilir.Anti-tümör ajanlarina verilebilecek 'Örnekler arasinda, literatürden bilinen asagidaki anti-tümör ajanlari ve benzeri maddeler bulunur: paklitaksel, doksorubisin, daunorubisin, siklofosfamid, metotreksat, 5- florourasil, tiotepa, busülfaii, improsi'ilfan, piposülfan, benzodopa, karbokuon, meturedOpa, uredOpa, altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforainid, triinetilolomelamin, bullatasin, bullatakinon, kamptotesin, briyostatin, kallistatin, kriptofisin 1, kriptofisin 8, dolastatin, duokarmisin, eleuterobin, pankratistatin, sarkodiktiin, spongistatin, klorambusil, klomafazin, kolofosfamid, estramustin, Ifosfamid, mekloretamin, inekloretamin oksit hidroklorür, melfalan, noveinbikin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, urasil mustard, karmustin, klorozotosin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin, kalikamisin, dinemisin, klodronat, esperamisin, aklasinomisin, aktinomisin, autramisin, azaserin, bleomisin, kaktinomisin, karabisin, karminomisin, karzinofilin, kromomisin, daktinomisin, detorbisin, 6-diazo-5-okso-L-norlösin, adrianiisin, epiiubisin, ezorubisin, idambisin, niarsellomisin, mitomisin C, mikofenolik asit, nogalamisin, olivomisin, peplomisin, potfiromisin, puromisin, kelamisin, rodorubisin, streptonigrin, streptozosin, tubersidin, ubenimeks, zinostatin, zorubisin, denopterin, pteropterin, trimetreksat, fludarabin, 6-merkapt0pürin, tiamiprin, tioguanin, ansitabin, azasitidin, 6-azaüridin, karmofur, sitarabin, dideoksiüridin, doksiflüridin, enositabin, floksüridin, androjenler (örnegin kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol,mepitiostan ve testolakton), aminoglutetimid, mitotan, trilostan,30frolinik asit, aseglaton, aldofosfamid glikozit, aminolevulinik asit, enilurasil, ainsakrin, bestrabusil, bisantren, edatraksat, defofamin, demekolsin, diazikuon, elfornitin, elliptinyum asetat, epotilon, etoglusid, lentinan, lonidamin, maytansin, ansamitosin, mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubisin, losoksantron, podofillinik asit, 2-etilhidrazit, prokarbazin, razoksan, rizoksin, sizofillan, spirogermanyum, tenuazonik asit, triazikuon, roridin A, anguidin, ûretan, vindesin, dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gasitozin, dosetaksel, klorambusil, gemsitabin, 6-tioguanin, merkaptopürin, sisplatin, oksaliplatin, karboplatin, vinblastin, etopozit, ifosfamid, mitoksantron, vinkristin, vinorelbin, novantron, tenipozit, edatreksat, daunomisin, aminopterin, kseloda, ibandronat, irinotekan, topoizomeraz inhibitörleri, diflorometiloritin (DMFO), retinoik asit, kapesitabin ve bunlarin farmakolojik açidan kabul edilebilir tuzlari vetürevleri.Alternatif olarak, bulusa konu olan antikor bir anti-tümör ajaniyla kombinasyon halinde uygulanarak daha kuvvetli bir terapötik etki olusmasi saglanabilir. Bu yaklasiin, CAPRIN-l eksprese eden bir kanser hastaliginin bulundugu bir hastada cerrahi müdahaleden önce veya sonra kullanilabilir. Bu yaklasim, tek basina bir anti-tümör ajani kullanilmasina dayanan konvansiyonel metotla tedavi edilmis olan CAPRIN-l eksprese eden bir kanser hastaliginda bilhassa cerrahiden sonra uygulanarak kanserin nüksetmesine karsi daha kuvvetli bir koruma olusturulabilir veyahut sag kalim süresinin uzamasinisaglayabilir.31Bulusa konu olan antikor ile birlikte uygulanabilecek anti-tümör ajani örnekleri arasinda da, literatürden bilinen asagidaki anti-tümör ajanlari ve benzeri maddeler bulunur: paklitaksel, doksorubisin, daunorubisin, siklofosfamid, inetotreksat, 5-fl0r0urasil, tiotepa, busülfan, improsülfan, piposülfan, benzodopa, karbokuon, meturedopa, uredopa, altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid, trimetilolomelamin, bullatasin, bullatakinon, kamptotesin, briyostatin, kallistatin, kriptofisin l, kriptofisin 8, dolastatin, duokarmisin, eleuterobin, pankratistatin, sarkodiktiin, spongistatin, klorainbusil, klornafazin, kolofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretamin oksit hidroklorür, melfalan, novembikin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, urasil mustard, karmustin, klorozotosin, fotemustin, lomustin, nimustin, raniinustin, kalikamisin, dinemisin, klodronat, esperamisin, aklasinomisin, aktinomisin, autramisin, azaserin, bleoinisin, kaktinomisin, karabisin, karminomisin, karzinofilin, kromomisin, daktinomisin, detorbisin, 6- diazo-S-okso-L-norlösin, adriamisin, epirubisin, ezorubisin, idarubisin, marsellomisin, mitomisin C, mikofenolik asit, nogalamisin, olivomisin, peplomisin, potfiromisin, puromisin, kelamisin, rodorubisin, streptonigrin, streptozosin, tubersidin, ubenimeks, zinostatin, zorubisin, denopterin, pteropterin, trimetreksat, fludarabin, 6-1nerkapt0pürin, tiamiprin, tioguanin, ansitabin, azasitidin, 6- azaüridin, karmofur, sitarabin, dideoksiüridin, doksiflüridin, enositabin, floksüridin, kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, aminoglutetimid, mitotan, trilostan, frolinik asit, aseglaton, aldofosfamid glikozit, aminolevulinik asit, enilurasil, amsakrin, bestrabusil, bisantren, edatraksat, defofamin,demekolsin, diazikuon, elfornitin, elliptinyum asetat, epotilon,32etoglusid, leiitinaii, lonidamin, maytansin, ansamitosin, mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubisin, losoksantron, podofilliiiik asit, 2-etilhidrazit, prokarbazin, razoksan, rizoksin, sizofillan, spirogermanyuin, tenuazonik asit, triazikuon, roridin A, anguidin, üretan, vindesin, dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gasitozin, dosetaksel, klorainbusil, gemsitabin, 6-tioguanin, merkaptop'ûrin, SiSplatin, oksaliplatin, karboplatin, vinblastin, et0pozit, ifosfamid, mitoksantron, vinkristin, vinorelbin, novantron, tenipozit, edatreksat, daunomisin, aminopterin, kseloda, ibandronat, irinotekan, topoizoineraz inhibitörleri, difloroinetiloritin (DMFO), retinoik asit, kapesitabin ve bunlarin farmakolojik açidan kabul edilebilir (sektörde bilinen) tuzlari ve (sektörde biliiien) türevleri. Yukarida verilen anti- tüm'Ör ajani 'örnekleri arasindan siklofosfamid, paklitaksel, dosetakselveya Vinorelbinin kullanilmasi özellikle tercih edilir.Alternatif olarak, bulusa konu olan antikor, literatürden veya baskakaynaklardan bilinen 211At, 1311, 1251, 90Y, 186Re, 188Re, 1538111, 212B1,32 175 176 P,Lu veya Lu gibi bir radyoizotopa baglaiiabilir. Tümör tani veya tedavisinde etkili olan bir radyoizotopun kullanilmasi tercihedilir.Bu bulusa konu olan antikor, CAPRIN-l ile immünolojik reaktiviteye sahip olan bir antikor, CAPRIN-l'i spesifik olarak algilayip taniyan bir antikor ya da CAPRIN-l'e spesifik baglanan bir antikordur ve kanser hastaliklarina karsi sitotoksik aktivite veya antiproliferatif etki sergiler. Söz konusu antikorun alici hayvanlarda rejeksiyona yolaçmayan ya da en fazla ufak bir rejeksiyona yol açan bir yapiya sahip33olmasi tercih edilir. Bu gibi antikorlara verilebilecek örnekler arasinda, alici hayvanlarin insanlar olmasi kaydiyla insan antikorlari, hümanize antikorlar, kimerik antikorlar (örnegin insan-fare kimerik antikorlari), tek Zincirli antikorlar ve bispesifik antikorlar bulunur. Bu antikorlar, (1) bir insan antikorundan elde edilen agir ve hafif zincir degisken bölgelerine ya da (2) insan disindaki bir hayvana ait bir antikordaii elde edilen agir ve hafif zincir CDR'lerinin (CDRl, CDR2, ve CDR3) bulundugu degisken bölgelere ve bir insan antikorundan elde edilen çerçeve bölgelerine sahiptirler ya da (3) insan disindaki bir hayvana ait bir antikordan elde edilen agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin ve bir insan antikorundan elde edilen agir ve hafif zincir sabit bölgelerinin bulundugu rekoinbinan antikorlari teskil ederler.

Bulusa konu olan antikorun (1) veya (2) numarali maddede belirtildigigibi olan bir antikor olmasi tercih edilir.Bu gibi rekombinan antikorlar asagida tarif edildigi gibi hazirlanabilirler: antikor üreten hücrelerden, örnegin hibridomlardan, insan CAPRIN-l'ini hedef alan monoklonal antikorlar (örnegin insan, fare, siçan, tavsan ve tavuk monoklonal antikorlari) kodlayan DNA'lar klonlaiiir ve bu DNA'lar sablon olarak kullanilarak, RT-PCR veya benzeri bir teknikle antikorlardaki hafif ve agir zincirlerin degisken bölgelerini kodlayan DNA'lar hazirlanir. Hafif ve agir zincir degisken bölgelerinin ilgili sekanslari ve her bölgedeki CDRl, CDR2 ve CDR3'ün ilgili sekanslari, Kabat AB numaralaiidirma sistemi (Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991))temelinde belirlenirler.34Degisken bölgeleri kodlayan DNA'lar veya CDR'leri kodlayan DNA'lar, bir gen rekombinasyon teknigi (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ya da bir DNA sentezleyici kullanilarak hazirlanirlar.

Yukarida bahsi geçen insan monoklonal antikoru üreten hibridomlar, insan antikoru üreten hayvanlar (örnegin fareler) insan CAPRIN-l'i ile immünize edilip ardindan bu immünize edilmis hayvanlardan kesilip alinan dalak hücreleri iniyelom hücreleri ile füzyoiilanarak hazirlanabilirler. Ayrica, eger gerekirse, bir gen rekombinasyon teknigi ya da bir DNA sentezleyici kullanilarak, bir insan antikorundan elde edilen hafif veya agir zincir degisken ve sabitbölgelerini kodlayan DNA'lar da hazirlanir.Hazirlanan rekombinan DNA'lar bir veya daha fazla sayida uygun vektöre sokulabilir ve bu vektörler daha sonra konakçi hücrelere (örnegin memeli hücreleri, maya hücreleri ve böcek hücreleri) yerlestirilirler ve DNA'lar (birlikte) ekSprese edilerek rekombinan antikorlari üretilirler (bkz: P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 W1LEY,P. Shepherd and C.

Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).Yukarida tarif edilen yöntemlerle hazirlanabilecek olan bulusa uygun antikor örneklerinden biri, asagida açiklanacak olan Omeklerde eldeedilen asagidaki (a) antikorudur:35(a) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslarinin bulundugu bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslarinin bulundugu bir hafif zincir degisken bölgesi ihtiva eden bir antikor veya antikor fragmani (örnegin SEKANS KOD NO.: 8 ile temsil edilen amino asit sekansindan mütesekkil bir agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 12 ile temsil edilen amino asit sekansindan mütesekkil bir hafif zincirdegisken bölgesinden olusan bir antikor).Burada bahsi geçen SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslari, Sirasiyla, bir fare antikorunun bir agir zincir degisken bölgesinde yer alan CDRl, CDRZ ve CDR3'e karsilik gelirler. SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslari ise, yine sirasiyla, bir fare antikorunun bir hafif zincir degisken bölgesinde yer alan CDRl, CDRZ ve CDR3'e tekabülederler.Bu bulusa konu olan hümanize antikor, kimerik antikor, tek zincirli antikor ya da multispesifik antikor için verilebilecek örneklerarasinda, asagidaki (i), (ii) ve (iii) nuinarali antikorlar bulunur:(i) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslari ile insan antikoru menseli çerçeve bölgelerinin amino asit sekanslarinin bulundugu bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve ll ile temsil edilen amino asitsekanslari ile insan antikoru menseli çerçeve bölgelerinin amino36asit sekanslarinin bulundugu bir hafif zincir degisken bölgesi ihtiva eden bir antikor veya antikor fragmani.(ii) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslari ile insan antikoru menseli çerçeve bölgelerinin amino asit sekanslarinin bulundugu bir agir zincir degisken bölgesi, insan antikoru menseli bir amino asit sekansinin bulundugu bir agir zincir sabit bölgesi, SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslari ile insan antikoru menseli çerçeve bölgelerinin amino asit sekanslarmm bulundugu bir hafif zincir degisken bölgesi ve insan antikoru menseli bir amino asit sekansinin bulundugu bir hafif zincir sabit bölgesi ihtiva eden bir antikor veya antikor fragmani; ve(iii) SEKANS KOD NO.: 8 ile temsil edilen amino asit sekansinm bulundugu bir agir zincir degisken bölgesi, insan antikoru menseli bir amino asit sekansinin bulundugu bir agir zincir sabit bölgesi, SEKANS KOD NO.: 12 ile temsil edilen amino asit sekansmin bulundugu bir hafif zincir degisken bölgesi ve insan antikoru menseli bir amino asit sekansinm bulundugu bir hafif zincir sabit bölgesi ihtiva eden bir antikorveya antikor fragmani.Insan antikoru agir ve hafif Zincirlerinin sabit ve degisken bölgelerinin sekanslari örnegin NCBI'da (ABD; GenBank, Unigene ve benzeri) bulunmaktadirlar. Ornegin asagida belirtilen sekanslar degerlendirilebilir: bir insan IgGl agir zincir sabit bölgesi olarak Erisim No. 100228; bir insan IgG2 agir zincir sabit bölgesi olarak Erisim No. J00230; bir insan IgG3 agir zincir sabit bölgesi olarak Erisim No. X03604; bir insan IgG4 agir zincir sabit bölgesi olarak37Erisim No. KOl316; bir insan hafif zincir K sabit bölgesi olarak Erisiin No. V00557, X64135 ve X64133 ve bir insan hafif zincir ?t sabit bölgesi olarak Erisim No. X64132 ve X641 34.Bu antikorlarin sitotoksik aktiviteye sahip olmalari ve buna bagliolarak bir anti-tümör etkisi ortaya koyabilmeleri tercih edilir.Yukarida bahsi geçen antikorlardaki agir ve hafif zincir degisken bölgeleri ve CDR'lerine istinaden yukarida belirtileii sekanslar sadece örnek vermek amaciyla sunulmaktadir. Dolayisiyla bulusa konu olan antikorun bu sekanslar ile sinirli olmadigi açiktir. Yukarida özel olarak tanimlanmakta olan antikorlardan farkli anti-insan CAPRIN-l 'i antikorlari veya insan menseli olmayan hayvan antikorlari (örnegin fare antikorlari) üretme kabiliyetine sahip olan hibridomlar hazirlanirlar ve bu hibridomlarin ürettikleri moiiokloiial antikorlar alinip, bu antikorlarin insan CAPRIN-l'ine karsi immünolojik baglanma aktivitelerine ve sitotoksik aktivitelerine bakilarak bu antikorlarin hedef antikorlar olduklari (ya da olmadiklari) belirlenir.

Böylelikle hedef monoklonal antikor üreten hibridomlar ayirt edilirler.

Daha sonra, yukarida açiklandigi gibi, bu hibridomlardan hedef antikorlarin agir ve hafif zincir degisken bölgelerini kodlayan DNA'lar hazirlanir ve hazirlanan DNA'lar sekanslanirlar. Bu DNA'lar fakliantikorlari hazirlamak için kullanilirlar.Bu bulusa konu olan mevzubahis antikor, CAPRIN-l'i spesifik olarak algilayip taniyabilmesini saglayacak ölçüde bir spesifisiteye sahip oldugu sürece, özellikle bir çerçeve bölgesi ve/veya bir sabit bölgeninsekansindaki amino asitler olinak üzere bir veya birkaç adet amino38asidi ilgilendiren bir ikame, silme veya eklemenin yapilmis oldugu (a) maddesine uygun bir antikor olabilir. Burada geçen "birkaç" kelimesi,tercihen 2 ilâ 5, daha çok tercihen 2 veya 3'e karsilik gelir.Bu bulus, ayrica, bulusa konu olan antikoru kodlayaii bir DNA, antikorun agir veya hafif zincirini kodlayan bir DNA ya da antikordaki agir veya hafif zincirin degisken bölgesini kodlayan bir DNA da ortaya koyar. Bu DNA, örnegin, (a) antikorunda oldugu gibi, SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslarini kodlayan nükleotid sekanslarinin bulundugu bir agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir DNA ya da SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslarini kodlayan nükleotid sekanslarinin bulundugu bir hafif zincir degisken bölgesini kodlayanbir DNA olabilir.Bu sekaiislari barindiran DNA'nin kodladigi CDR'ler, antikorun Spesifisitesini belirleyen bölgeleri teskil ederler. Dolayisiyla antikorun diger bölgelerini (yani sabit bölgeler ve çerçeve bölgeleri) kodlayan sekanslar baska antikorlardan elde edilmis olan sekanslar olabilirler.

Burada "baska antikorlar" tabiri ile atif yapilan antikorlar arasinda, insan olmayan organizmalardan elde edilen aiitikorlar da bulunur, fakat advers reaksiyonlarin düsük tutulmasi adina bunlarin insanlardan elde edilen antikorlar olmalari tercih edilir. Somutlastirmak gerekirse, bu bulusa konu olan DNA'da, agir ve hafif zincirlerdeki çerçeve bölgeleri ve sabit bölgeleri kodlayan bölgelerin mütekabil insan antikoru menseli amino asit sekanslarini kodlayan nükleotidsekanslarinin bulunmasi tercih edilir.39Bu bulusa konu olan antikoru kodlayan DNA için verilebilecek diger örnekler arasinda, SEKANS KOD NO.: 8 ile temsil edilen amino asit sekansini kodlayan bir nükleotid sekansinin bulundugu bir agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir DNA ve SEKANS KOD NO.: 12 ile teiiisil edilen aiiiino asit sekansini kodlayaii bir nükleotid sekansinin bulundugu bir hafif zincir degisken bölgesini kodlayaii bir DNA bulunur. Burada bahsi geçen SEKANS KOD NO.: 8 ile teinsil edilen amino asit sekansini kodlayan nükleotid sekansi, örnegin, SEKANS KOD NO.: 13 ile temsil edilen nükleotid sekansidir. SEKANS KOD NO.: 12 ile temsil edilen amino asit sekansini kodlayan nükleotid sekansi, örnegin, SEKANS KOD NO.: 14 ile temsil edilen nükleotid sekansidir. Bu DNA'lar için, agir ve hafif zincirlerdeki sabit bölgeleri kodlayaii bölgelerin insan antikorunun kaynaklik ettigi bir mütekabil amino asit sekansini kodlayan bir nükleotid sekansi içerineleri tercihedilir.Bu antikor DNA'lari, örnegin yukarida tarif edilen yöntemlerle ya da asagida açiklanan yöntemle elde edilebilirler: öncelikle, bulusa konu olan antikor ile iliskili hibridoinlardan ticari piyasadan edinilen bir RNA ekstraksiyon kiti kullanilarak toplam RNA'lar hazirlanir ve daha sonra ters transkriptaz ve randomize primerler veya benzeri unsurlar kullanilarak cDNA'lar seiitezlenir. Akabinde, antikor kodlayan cDNA'lar, bilinen fare antikoru agir ve hafif zincir genlerindeki degisken bölgelerin korunan sekanslarina yönelik oligonükleotid primerleri kullanilarak PCR ile amplifiye edilirler. Sabit bölgeleri kodlayan sekanslar, bilinen sekanslarda PCR ile amplifikasyonyapilarak elde edilebilirler. DNA'nin nükleotid sekansi, sekanslaninak40üzere örnegin bir plazmid veya bir faja sokulup bir standart yöntemegöre belirlenebilir.Bu bulusta kullanilan anti-CAPRIN-l antikorunun CAPRIN-l eksprese eden kanser hücreleri üzerindeki anti-tümör etkisinin CAPRIN-l eksprese eden hücrelere karsi gelisen hücre aracili antikor- bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) ve kompleman-bagimlisitotoksisiteden (CDC) ileri geldigi düsünülmektedir.Bahsi geçen mekanizmaya dayanan anti-tümör etkisinin kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan antikor baglanimli hedef molekül sayisiyla bagintili oldugu bilinmektedir (Niwa R., Clinical Cancer Research (2005) Mar 15; 11 (6): 2327-2336). Kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan hedef molekül sayisi, hücre yüzeyi üzerindeki molekül adedini ölçme yetkinligine sahip olan halihazirda mevcut bir esey kiti kullanilarak incelenebilir.

Somutlastirmak gerekirse, antikor baglaniinli hedef molekül adedi, kanser hücrelerinin 'Örnegin primer antikorlar olarak hedef molekülleri hedef alan antikorlar ile tepkiineye sokulmalari, ardindan onlarla birlikte primer antikorlari hedef alan floresan etiketli antikorlar ile tepkimeye sokulinalari ve ayrica baslangiçtan itibaren bilinen sayida niolekülle kapli kalibrasyon egrisi boncuklarinin kullanilmalari, numunelerin ortalama florcsans yogunlugunun ölçülmesi ve elde edilen kalibrasyon egrisi temelinde hedef molekül adedininbelirlenmesi yoluyla hesaplanabilir.Dolayisiyla, bu bulus kapsaminda kullanilacak olan anti-CAPRIN-lantikoru, asagidaki Örnekler ile spesifik olarak gösterilecegi üzere, ex41vivo ortamda CAPRlN-l eksprese eden kanser hücrelerine yönelik ADCC aktivitesi veya CDC aktivitesi belirlenerek ya da bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikorunun bir primer antikor olarak kullanilinasi sartiyla kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde eksprese olan CAPRIN-l molekülü adedi belirlenerek sahip oldugu aktivitebakimindan analiz edilebilir.Bulus kapsaminda kullanilacak olan anti-CAPRIN-l antikoru, kanser hücreleri üzerindeki CAPRIN-l proteinlerine baglaiiir ve sahip oldugu aktivite araciligiyla bir anti-tümör etkisi ortaya koyar. Dolayisiyla bu bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikorunun kanser hastaliklarinin tedavisinde veya önlenmesinde faydali oldugu düsünülmektedir.

Somut bir dille ifade etmek gerekirse, bu bulus, kanser hastaliklariiiin tedavisine ve/veya önlenmesine yönelik olan ve etkin bilesen olarak anti-CAPRlN-l antikoru ihtiva eden bir farmas'otik bilesim ortaya koymaktadir. Insanlarda kullanilacak (antikor tedavisi olarak) olan anti-CAPRIN-l antikorunun immünojenisitenin düsük tutulmasi adinabir insan antikoru ya da bir hümaiiize antikor olmasi tercih edilir.Kanser hücrelerinin yüzeyi üzerindeki bir CAPRIN-l proteinine karsi daha yüksek baglanma afinitesi sergileyen bir anti-CAPRlN-l aiitikoru daha kuvvetli bir anti-tümör aktivitesi ortaya koyar.

Dolayisiyla eger CAPRIN-l proteinine yönelik yüksek baglanma afinitesine sahip olan bir anti-CAPRIN-l antikoru söz konusu ise, daha kuvvetli bir anti-tümör etkisi beklenebilir. Bu gibi bir antikor, kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veya önlenmesi amaçli bir farmasötik bilesim bünyesinde kullanima uygun hale getirilebilir.Burada bahsi geçen yüksek baglanma afinitesinin yukarida belirtildigi42gibi bir Ka (kon/koff) birlesme sabiti (afinite sabiti) cinsinden en az 107M`1, en az 108M`1, en az 5 X 108 M4, en az 109 M", en az 5 X 109 M`1, en az 1010 M'l, en az 5 X 1010 M", en az 10” M'i, en az 5 x 10ll M4, en az 1012 M`i veya en az 1013 M`l düzeyinde olmasi tercihedilir.Anti-CAPRIN-l antikorlari kanser hücrelerinin üzerinde bulunan ne kadar çok CAPRIN-l molekülüiie baglanirlarsa elde edilen anti-tümör aktivitesi de 0 kadar kuvvetli olur. Arzu edilen, beklenen anti-tümör etkisinin üretilebilmesi adina, antikorlarin baglandiklari CAPRlN-l molekülü sayisinin bulusa konu olan anti-CAPRIN-l antikoru kullanilarak ölçülebilecegi üzere kanser hücresi basina 104 veya dahafazla, tercihen 105 veya daha fazla olmasidir.Antikorun CAPRIN-l'e baglanma kabiliyeti, asagidaki Omeklerde açiklandigi gibi 'Örnegin ELISA, Western blot, immünofloresans ve akis sitoinetrisi analizi gibi bir baglanma eseyi tatbik edilerekbelirlenebilir.CAPRIN-l'i algilayip taniyan antikor, bir hastadan cerrahi müdahale esnasinda alinan ya da CAPRIN-l eksprese edeii bir hücre hatti inoküle edilmis bir ksenogreft dokusu tasiyan bir hayvandan spontan olarak veya transfeksiyonu müteakiben elde edilen bir dokununparaformaldehit veya asetonda fiske edilip dondurulmus bir kesiti43veya paraformaldehitte fiske edilip parafine gömülmüs bir kesitinin kullanildigi sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca iyi bilinen bir immünohistokimyasal yöntem uygulanarak CAPRIN-l ile reaktiVitesibakimindan test edilebilir.Iinmünohistokimyasal boyamada, CAPRIN-l'e karsi reaktif olan antikor çesitli yöntemlerle boyanabilir. Örnegin antikor bir hayir turpu peroksidaz-konjuge keçi anti-fare antikoru veya keçi anti-tavukantikoru ile tepkiineye sokularak görüntülenebilir.Bu bulusa konu olan kanser hastaliklarina yönelik terapötik ve/Veya önleyici farinasötik bilesim ile hedef alinan hastalik, bir CAPRIN-l geni eksprese ettigi sürece herhangi bir kanser hastaligi (hücreleri)olabilir.Burada kullanildigi anlainiyla "tümör" ve "kanser" terimleri malign neoplazma atif yapmakta ve birbirleriyle esanlamli terimler gibikullanilinaktadirlar.Bu bulus kapsaminda hedef alinan kanser hastaligi bir CAPRIN-l proteini kodlayan genin eksprese oldugu bir kanser hastaligidir ve tercihen meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kalin bagirsak kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkoin, inastositom ya damelanomdur.44Bu kanser hastaliklarina verilebilecek somut örnekler arasinda, sadece bunlarla siiiirli kalmaksizin, meme adenokarsinomu, kompleks tip meme adenokarsinomu, malign mikst meme bezi tümörü, intraduktal papiller adenokarsinoin, akciger adenokarsinomu, skuainöz hücreli kanser, küçük hücreli kanser, büyük hücreli kanser, nöroepitelyal doku tümörü olan gliom, ependimom, nöroiial tümör, embriyonal nöroektodermal tümör, nörilemmom, nörofibrom, meiienjiyoin, kronik lenfositik lösemi, lenfoma, gastrointestinal lenfoma, sindirim sistemi lenfoinasi, küçük hücreli ilâ orta boy hücreli lenfoma, çekum kanseri, çikan kolon kanseri, inen kolon kanseri, transvers kolon kanseri, sigmoid kolon kanseri, rektum kanseri, epitelyal yumurtalik kanseri, germ hücreli tümör, stromal hücreli tümör, pankreatik duktal karsinom, invazif pankreatik duktal karsinom, pankreatik adenokarsinoin, asinar hücreli karsinom, adenoskuamöz karsiiiom, dev hücreli tüinör, intraduktal papiller- müsiiiöz neoplazin, müsinöz kistik neoplazin, pankreatoblastom, seröz kistadenokarsinom, kati-psödopapiller tümör, gastrinoin, glukagonom, insülinom, multipl endokrin neoplazileri tip-l (Wermer sendromu), fonksiyonel olmayan adacik hücreli tümör, somatostatinom ve VlPomsayilabilir.Alici test deneklerinin memeli, örnegin primat, pet hayvani, besi hayvani ve Spor hayvani olmalari ve özellikle de insan, köpek ve kediolmalari tercih edilir.Bulusa konu olan antikor bir farmasötik bilesim bünyesinde kullanilacaksa, bu farmasötik bilesiin sektörde bilgi ve beceri sahibiuzmanlarca genel olarak bilinen bir yöntein kullanilarak formüle45edilebilir. Ornegin farmasötik bilesim, su veya baska herhangi bir farmasötik açidan kabul edilebilir sivinin bulundugu bir parental enjeksiyonluk aseptik çözelti veya süspansiyon formunda kullanilabilir. Farmasötik bilesim, örnegin, sektör genelinde kabul gören farmasötik uygulama için gerekli bir birim dozaj formunda karistirilmis antikor ve onunla uygun bir kombinasyon halindeki farmakolojik açidan kabul edilebilir tasiyicilar veya vasatlar, somutlastirmak gerekirse sterilize su, fizyolojik salin, bitkisel yag, bir einülsifiye edici, bir süspanse edici ajan, bir deterjan, bir stabilizatör, bir aroma maddesi, bir yardimci madde, bir vehikül, bir koruyucu, bir baglayici veya benzeri baska bir madde ile formüle edilebilir. Bu gibi bir preparatta kullanilacak olan etkin bilesen miktari, belirtilen aralikdahilinde uygun bir doza ulasilmasi dikkate alinarak belirlenir.Bir enjeksiyonluk aseptik bilesim, enjekte edilebilir distile su gibi bir vehikül kullanilarak konvansiyonel farmasötik uygulamaya göreformüle edilebilir.En jeksiyonluk aköz çözeltilere verilebilecek örnekler arasinda, glukoz ve örnegin D-sorbitol, D-mannoz, D-mannitol ve sodyum klorür gibi baska adjuvanlar ihtiva eden izotonik çözeltiler ve fizyolojik salin bulunur. Bu çözeltiler, bir alkol (somutlastirmak gerekirse etanol) veya bir polialkol (örnegin propilen glikol ve polietilen glikol) veya bir iyonik olmayan deterjan, örnegin Polysorbate 80““ ve HCG-60 gibi uygun bir çözünürlestirici ile kombinasyon halindekullanilabilirler.Yagli çözeltilere verilebilecek örnekler arasinda, susam yagi ve soya46fasulyesi yagi sayilabilir. Bu çözeltiler, benzil benzoat veya benzil alkol gibi bir çözünürlestirici ile kombinasyon haliiide kullanilabilirler. Bu çözeltiler, ayrica bir tampon (örnegin bir fosfat tamponu çözeltisi ve bir sodyum asetat tamponu çözeltisi), bir yatistirici ajan (örnegin prokain hidroklorîir), bir stabilizatör (örnegin benzil alkol ve fenol) ve bir antioksidan ile de karistirilabilirler. Bu sekilde hazirlanan enjeksiyonluk çözeltiler genelde uygun ampulleredoldurulup öyle kullanilirlar.Bu bulusa konu olan farmasötik bilesim oral veya parenteral yolla ve tercihen parenteral yolla uygulanir. Dozaj formlariiia verilebilecek somut örnekler arasinda, enjeksiyonlar, intranazal uygulama ajanlari, transpulmoner uygulama ajanlari ve perkütan uygulama ajanlari sayilabilir. Enjeksiyon örnekleri arasinda, farmasötik bilesiinin ister sistemik ister lokal olarak uygulaiiabilecegi intravenöz enjeksiyon, intramüsk'ûler enjeksiyon, intraperitoneal enjeksiyon ve subk'utaiienjeksiyon bulunur.Ayrica, uygulama yöntemi, hastanin yasi, kilosu, cinsiyeti, semptomlari ve hastaya dair benzeri bilgi ve veriler temelinde seçilebilir. Antikoru içeren veya antikoru kodlayan bir polinükleotidi içeren bir farmasötik bilesimin dozu, örnegin 0,0001 ilâ 1000 mg/kg vücut agirligi araligindaki degerler arasindan seçilebilir. Alternatif olarak, doz, örnegin 0,001 ilâ 100.000 mg/kg hasta vücut agirligi araligi içerisinden de seçilebilir, ancak uygun degerler sadece bu sayisal degerler ile sinirli degildir. Doz ve uygulama yöntemi hastanin kilosu, yasi, cinsiyeti, semptomlari ve hastaya dair benzeri bilgi veverilere bagli olarak farklilik gösterebilecek olmasina ragmen,47sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar uygun doz ve uygulamayöntemini rahatlikla tayin edebilirler.Bulusa konu olan antikoru veya onun fragmanini içeren farmasötik bilesim, bir test denegine bir kanser hastaligini, tercihen ineine kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kalin bagirsak kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositom veya inelanomu tedavietmek ve/veya önlemek aniaciyla uygulanabilir.Bir kanser hastaligini tedavi etmek ve/veya önlemek için kullanilabilecek olan ve bulus konusu farmasötik bilesiinin yukarida örneklendirilen bir anti-tümör ajani veya bu gibi bir anti-tümör ajani ihtiva eden bir farmasötik bilesimle kombinasyon halinde bir test denegine uygulaiimasina dayanan bir yöntem de bu bulusun konusudur. Bulus konusu antikor veya onun fragmaiii ile bir anti- tümör ajani test denegine eszamanli olarak veya ayri ayri uygulanabilirler. Ayri ayri uygulanacaklarsa, söz konusu uygulamalarin hangi sirayla yapilacagi önem arz etmez. Uygulama araliklari, dozlar, uygulama yolu ve doz sayisi, bir uzman tarafindan kolayca belirlenebilir. Eszamanli uygulanacak ayri ilaçlarin dozaj formlarina örnek olarak, bulusa konu olan aiitikorun veya onun fragmaninin ya da anti-tümör ajaninin bir farmakolojik açidan kabul edilebilir tasiyici (veya vasat) içerisinde karistirilmasi yoluyla formüle edilen farmasötik bilesimler gösterilebilir. Bulusa konu olan antikoru ihtiva eden farmasötik bilesimler ve dozaj formlarinin reçetelemesi,formülasyonu, uygulama yollari, dozlari, endikasyonlari olan kanser48hastaliklari ve benzeri niteliklerine dair yukari verilen bilgiler, anti- ti'imör ajani ihtiva eden yukarida tanimli farmasötik bilesimler vedozaj formlarinin her biri için de geçerlidir.Dolayisiyla, bu bulus, bulusa konu olan farmasötik bilesimi ve örnekleri yukarida verilmis olan anti-tümör ajaninin bulundugu bir farmas'otik bilesimi ihtiva eden istemlerde tanimlandigi gibi bir farmasötik kombinasyon ile de ilgilidir. Bu bulus, ayni zamanda, bir farmakolojik açidan kabul edilebilir tasiyici ile birlikte bulusa konu olan antikoru veya oiiun fragmanini ve anti-tümör ajanini ihtiva eden kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veya 'Önlenmesine yönelik birfarmas'otik bilesim ile de ilgilidir.Bu bulus, ayrica, (a) antikoru ile iliskili asagida belirtilen polipeptidler ve DNA'lar ile de ilgilidir:(i) SEKANS KOD NO.: 8 ve '12 ile temsil edilen amino asit sekanslarini ihtiva eden bir polipeptid ve 0 polipeptidi kodlayan bir DNA, örnegin SEKANS KOD NO.: 13 ve 14 ile temsil edilen nükleotid sekanslarini ihtiva eden bir DNA;(ii) SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 ile temsil edilen amino asit sekanslari arasindan seçilen bir agir zincir CDR polipeptidi ve o polipeptidi kodlayan bir DNA; ve(iii) SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 ile temsil edilen amino asit sekanslari arasindan seçilen bir hafif zincir CDR polipeptidive o polipeptidi kodlayan bir DNA.49Bu polipeptidler ve DNA'lar, yukarida açiklandigi gibi olan genrekombinasyon teknikleri kullanilarak hazirlanabilirler.ÖrneklerTakip eden kisimda, bulus verilen Örnekler çerçevesinde daha somut bir dille açiklanacaktir. Bunlarin sadece `Örnek olduklari ve dolayisiyla bulusun kapsaminin bu Spesifik 'örnekler ile sinirli olmadigiunutulmamalidir.WO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Ornek l(4) altinda tarif edilen prosedüre göre köpek ve insanlara ait normal dokularda ve çesitli hücre hatlarinda RT-PCR ile CAPRIN-l geninin ekspresyonu incelendi. Sonuç olarak, saglikli köpek dokulari arasindan testiste kuvvetli bir ekspresyon görülürken, ayni zamanda köpek meme kanseri ve adenokarsinom dokularinda da ekspresyon görüldü. Insan dokularinda yapilan ekspresyon incelemesi sonucunda, köpek CAPRlN-l genine istinaden tespit edilmis oldugu gibi, normal dokular arasindan sadece insan testis dokusunda ekspresyon teyit edildi. Buna karsin, aralarinda 8 insan meme kanseri hücre hattinin (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA- MB-231V ve MRK-nu-l) ve 4 pankreas kanseri hücre hattinin (Çapan-2, MIAPaCa-Z, Panc-l ve BXPc-3) bulundugu birçok farkli kanser hücre hatti çesidinde ekspresyon tespit edildi. Bu sonuçlar,CAPRlN-l ekspresyonunun testis disindaki normal dokularda50bulunmadigini, ancak çesitli kanser hücrelerinde CAPRlN-lekspresyonunun söz konusu oldugunu kanitladi.SEKANS KOD NO.: 2 ainino asit sekansina sahip olan ve WO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Ornek 3 kapsaminda tarif edildigi gibi hazirlanan 100 ug insan CAPRIN-l proteinleri, esit miktarda MPL+TDM adjuvaniyla (Sigma-Aldrich Corp.) karistirildi.

Bu karisim bir anti jen çözeltisi olarak farelere uygulandi. Söz konusu antijen çözeltisi 6 haftalik Balb/c farelerinin (Japan SLC, lnc.) her birine intraperitoneal yolla uygulandi. Haftada bir defa olmak üzere toplamda yedi rapel uygulamasi yapilarak immünizasyon süreci tamamlandi. Son enjeksiyondan üç gün sonra farelerin dalaklari kesilip alindi ve iki sterilize lamin arasinda ezilerek ufalandi. Dalak hücrelerine ulasmak için, PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) ile yikama ve 10 dakika boyunca 1500 devir/dakika hizla santrifüj gerçeklestirerek üst fazi ayirina prosedürleri üçer defa tekrarlandi.

Elde edilen dalak hücreleri, fare miyelom hücreleri SP2/0 (ATCC'den satin alinmistir) ile 10:] oraninda karistirildilar. %10 oraninda FBS içeren 200 uL kadar bir RPM1160 vasati 37°C sicakliga ulasana dek isitilip 800 uL PEG1500 (Boehringer lngelheim GmbH) ile karistirildi ve bu sekilde hazirlanan PEG çözeltisi hücre karisiminin üzerine eklendi ve elde edilen karisim hücre füzyonunun gerçeklesmesine olanak saglamak içiii 5 dakika bekletildi. 5 dakika boyunca 1700 devir/dakika hizla santrifüj gerçeklestirilerek üst faz uzaklastirildiktansonra, hücreler, %2 esdegerinde bir HAT çözeltisi (Life Technologies,51Inc./Gibco) (HAT selektif vasati) takviye edilmis olan %15 oraninda FBS'nin bulundugu 150 mL kadar bir RPM1160 vasati içerisinde süspanse edildiler. Elde edilen süspansiyon, on bes adet 96 kuyucuklu plakaya (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) 100 uL/kuyucuk konsantrasyonunda inoküle edildi. Dalak hücreleri ile miyeloni hücreleri %5 C0; kosullari altinda 37°C sicaklikta 7 gün boyunca kültürlenip bu hücrelerin birbirlerine füzyonlanmalari saglanarakhibridoinlar elde edildi.Hazirlanan hibridomlar, ürettikleri antikorlarin CAPRlN-l proteinlerine yönelik baglanma afinitesinin bir indeks olarak temel alindigi bir taraniaya tâbi tutuldular. WO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Ornek 3'te tarif edileii yaklasimla hazirlanaii CAPRIN-l proteinlerinin bulundugu 1 ug/mL düzeyinde bir çözelti 96 kuyucuklu bir plakaya 100 pL/kuyucuk konsantrasyoiiunda ilave edildi ve takip eden 18 saat boyunca 4°C sicaklik altinda bekleineye birakildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, bir %0,5 bovin serum albümini (BSA) çözeltisi (Sigma-Aldrich Corp.) 400 uL/kuyucuk konsaiitrasyonunda ilave edildi ve elde edilen içerik müteakip 3 saat boyunca oda sicakligi altinda bekletildi. Her kuyucuktaki çözelti çikartildi ve her kuyucuk 400 uL PBS-T ile üç defa yikandi. Ardindan yukarida bahsi geçen hibridomlarin her birinin kültür üst fazi 100 uL/kuyucuk konsantrasyonuiida ilave edildi ve elde edilen içerik takip eden 2 saat boyunca oda sicakligi altinda bekletildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, PBS ile 5000 kat seyreltilmis olan HRP-etiketli anti-fare IgG (H+L) aiitikorlari (Invitrogen Corp.) 100 uL/kuyucuk konsantrasyonuiida ilave edildiler ve elde edileniçerik müteakip '1 saat boyunca oda sicakligi altiiida bekletildi. Her52kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Akabinde bir TMB substrati çözeltisi (Thermo Fisher Scientific Inc.) 100 uL/kuyucuk konsantrasyonunda eklendi ve elde edilen içerik renk reaksiyonu meydana gelene dek 15 ilâ 30 dakika boyunca bekletildi. Renk olusumu gerçeklestikten sonra 100 uL/kuyucuk konsantrasyonunda 1 N sülfürik asit ilave edilerek reaksiyon durduruldu. Bir absorbsiyon spektrometresi kullanilarak 450 nm ve 595 nm'de absorbans ölçüldü.

Sonuç olarak, yüksek absorbans sahibi antikorlar üreten bir dizihibridom seçildi.Seçilen hibridoinlar 96 kuyucuklu bir plakaya plakanin her kuyucuguna 0,5 hücre düsecek yogunlukta ilave edildiler ve plakada kültürlendiler. Bir hafta sonra, kuyucuklarda tekil koloniler olusturan hibridoinlar gözlemlendi. Bu kuyucuklardaki hücreler biraz daha kültürlendiler ve klonlanan hibridomlar, ürettikleri antikorlarin CAPRIN-l proteinine yönelik baglanma afinitesinin bir indeks olarak temel alindigi bir taramaya tâbi tutuldular. WO 2010/016526 sayili patent yayinindaki Ornek 3'te tarif edilen yaklasimla hazirlanan CAPRlN-l proteinlerinin bulundugu 1 ug/mL düzeyinde bir çözelti 96 kuyucuklu bir plakaya 100 uL/kuyucuk konsantrasyonunda ilave edildi ve takip eden 18 saat boyunca 4°C sicaklik altinda beklemeye birakildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, bir %0,5 BSA çözeltisi 400 uL/kuyucuk konsantrasyonunda ilave edildi ve elde edilen içerik müteakip 3 saat boyunca oda sicakligi altinda bekletildi. Her kuyucuktaki çözelti çikartildi ve her kuyucuk 400 uL PBS-T ile üç defa yikandi. Ardindan yukarida bahsi geçen hibridomlarin her birinin kültür üst fazi 100 uL/kuyucukkonsantrasyonunda ilave edildi ve elde edilen içerik takip eden 2 saat53boyunca oda sicakligi altinda bekletildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Daha sonra, PBS ile 5000 kat seyreltilmis olan HRP- etiketli anti-fare IgG (H+L) antikorlari (Invitrogen Corp.) 100 uL/kuyucuk yogunlugunda ilave edildiler ve elde edilen içerik müteakip 1 saat boyunca oda sicakligi altinda bekletildi. Her kuyucuk PBS-T ile üç defa yikandi. Akabinde bir TMB substrati çözeltisi (Thermo Fisher Scientific Inc.) 100 uL/kuyucuk konsantrasyonunda eklendi ve elde edilen içerik renk reaksiyonu meydana gelene dek 15 ilâ 30 dakika boyunca bekletildi. Renk olusuinu gerçeklestikten sonra 100 uL/kuyucuk konsantrasyonunda 1 N sülfürik asit ilave edilerek reaksiyon durduruldu. Bir absorbsiyon spektrometresi kullanilarak 450 nm ve 595 nm'de absorbans ölçüldü. Sonuç olarak, CAPRIN-l proteinlerine karsi reaktif monoklonal antikorlar üreten 112 adethibridom hatti elde edildi.Bir sonraki asamada, bu inonoklonal antikorlar arasinda tarama yapilarak, CAPRIN-l ekSprese eden meme kanseri hücrelerinin yüzeyiyle reaksiyona girebilen antikorlar ayirt edildi. Somutlastirmak gerekirse, bir insan ineme kanseri hücre hatti olan MDA-MB-231V'ye mensup 106 adet hücre 1,5 mL hacimli bir mikrosantrifûj tüpünde santrifuje tâbi tutuldu. Yukarida bahsi geçen hibridomlarin her birinden 100 uL kültür üst fazi üzerine eklendi ve elde edilen içerik buz üzeriiide 1 saat boyunca bekletildi. PBS ile yikama yapildiktan sonra, %0,1 FBS içeren PBS ile 500 kat seyreltilmis olan FITC- etiketli keçi anti-fare IgG antikorlari (Invitrogen Corp.) ilave edildi ve elde edilen içerik buz üzerinde 1 saat bekletildi. PBS ile yikaina yapildiktan sonra, FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)kullanilarak floresans yogunlugu ölçüldü. Diger yandan, bir kontrol54hazirlamak amaciyla, antikorlar yerine bir hibridom kültür vasati ile 500 kat seyreltilmis olan uygulama yapilmamis 6 haftalik Balb/c faresi serumu kullanilarak yukarida tarif edilen islemler tekrarlandi.

Sonuç olarak, kontrolden daha kuvvetli bir floresans yogunluguna sahip olan, yani meme kanseri hücrelerinin yüzeyiyle reaksiyonagirebilen bir fare monoklonal antikoru (#1) seçildi.Ornek 2'de elde edilen monoklonal antikorlari, WO 2010/016526 sayili yayindaki Ornek 5 kapsaminda anlatilan yönteme göre sahip olduklari nükleotid sekanslari ve 0 nükleotid sekanslarinin kodladiklari amino asit sekanslari bakimindan analiz edildiler. Elde edilen moiioklonal antikor #1, SEKANS KOD NO.: 8 ile temsil edilen amino asit sekansindan mütesekkil bir agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 12 ile temsil edilen amino asit sekansindan mütesekkil bir hafif zincir degisken bölgesinden olusuyordu.

Monoklonal antikor #1'in agir zincir degisken bölgesini kodlayan nükleotid sekansi SEKANS KOD NO.: 13'te, onun kodladigi amino asit sekansi ise SEKANS KOD NO.: 8'de gösterilmektedir. Ayni antikorun hafif zincir degisken bölgesini kodlayan nükleotid sekansi SEKANS KOD NO.: 14'te, onun kodladigi amino asit sekansi ise SEKANS KOD NO.: 12'de gösterilmektedir.Somutlastirmak gerekirse, monoklonal antikor #1'in SEKANS KOD NO.: 8 ile temsil edilen amino asit sekansindan mütesekkil agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 12 ile temsil edilen aininoasit sekansindan mütesekkil hafif zincir degisken bölgesinden55olustugu ve burada bahsi geçen agir zincir degisken bölgesindeki CDRl, CDR2 ve CDR3'ün sirasiyla SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 amino asit sekanslarindan olustuklari ve burada bahsi geçen hafif zincir degisken bölgesindeki CDRl, CDR2 ve CDR3'ün sirasiyla SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 amino asit sekanslarindan olustuklari teyit edildi.SEKANS KOD NO.: 13 ile temsil edilen bir nükleotid sekansindan olusmakta olup Ornek 3'te elde edilen fare monoklonal antikoru #1 'in agir zincir degisken bölgesini kodlayan nükleotidi barindiran gen ainplifikasyon fragmaniniii her iki ucuna da restriksiyon enziinleri uygulandi, daha sonra fragman saflastirildi ve bir standart yönteme göre, SEKANS KOD NO.: 37 sekansini içeren bir insan IgGl H zincir sabit bölgesinin ve bir fare antikoru kaynakli lider sekansin gen insertlerini halihazirda ihtiva eden bir pcDNA4/myc-His (Invitrogen Corp.) vektörüne sokuldu. Ayrica, SEKANS KOD NO.: 14 ile teinsil edilen bir nükleotid sekansindan olusan fare monoklonal antikoru #l'in hafif zincir degisken bölgesinin geninin bulundugu gen amplifikasyon fragmanina da her iki ucundan restriksiyon enzimleri uygulandi, daha sonra fragman saflastirildi ve bir standart yönteme göre, SEKANS KOD NO.: 38 sekansini içeren bir insan IgGi L zincir sabit bölgesinin ve bir fare antikoru kaynakli lider sekansin gen însertlerini halihazirda ihtiva eden bir pcDNA3.1/myc-His (InvitrogenCorp.) vektörüne sokuldu.56Daha sonra, fare inoiioklonal antikoru #l'in agir ziiicir degisken bölgesinin (SEKANS KOD NO.: 13) gen iiisertiniii bulundugu rekombinan vektör ve fare monokloiial antikoru #l'in hafif zincir degisken bölgesinin (SEKANS KOD NO.: 14) insertinin bulundugu rekombinan vektör, (Riken Cell Bank'tan edinilen) CHO-Kl hücrelerine yerlestirildiler. Somutlastirinak gerekirse, 2 x 105 adet CHO-Kl hücresi, %10 oraninda FBS ihtiva eden ve her kuyucukta l mL ölçüsünde buluiian bir Ham F12 vasatinin (Invitrogen Corp. üretimi) yer aldigi 12 kuyucuklu bir kültür plakasinda kültürlendi ve PBS(-) ile yikandi. Ardindan %10 oraninda FBS içeren bir taze Ham F12 vasatiiidan her kuyucuga l mL eklendi. Vektörlerin her birinden 250 ng alinip 30 uL OptiMEM'de (Invitrogen Corp.) lize edildi ve 30 uL Polyfect transfeksiyon reaktifi (Qiagen N.V.) ile karistirildi ve elde edilen karisim her bir kuyucuga ilave edildi. Rekoinbiiian vektörler ile ko-transfekte edilen CHO-Kl hücreleri, 200 ug/mL Zeocin (Invitrogen Corp.) ve 200 ug/mL Geneticin (Roche Diagnostics K.K.) takviyeli %10 FBS içeren bir Ham F12 vasatinda kültürlendiler ve daha sonra bu hücreler 96 kuyucuklu bir plakaya 0,5 hücre/kuyucuk yoguiilugunda inoküle edilerek, fare monoklonal antikoru #l'in degisken bölgelerini içerisinde barindiran bir insan-fare kimerik monoklonal antikoru #1'i (#1) stabil sekilde üretebilen bir hücre hattihazirlandi.Hazirlanan hücre hatti serum içermeyen 30 mL kadar bir OptiCHO vasatinin (Invitrogen Corp.) bulundugu 150 cm2 ebatlarindaki bir sisede 5 x 105 hücre/mL yogunlugunda 5 gün boyunca kültürlenerek, insan-fare kimerik monoklonal antikoru #1'i yer aldigi kültür üstfazlari elde edildi.57Ayrica, WO 2010/016526 sayili patent yayininda tanimlanmis olan asagida sirali anti-CAPRIN-l fare kaynakli monoklonal antikorlarini karsilastirma amaçli antikorlar olarak yukarida tarif edilen prosedüre göre kullanmak suretiyle, insan-fare kimerik karsilastirma amaçli monoklonal antikorlari 1 ilâ 11'i stabil sekilde üretebilen hücre hatlari hazirlandi: SEKANS KOD NO.: 15 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 16 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 1; SEKANS KOD NO.: 17 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 18 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 2; SEKANS KOD NO.: 19 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 20 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 3; SEKANS KOD NO.: 21 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 22 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 4; SEKANS KOD NO.: 23 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 24 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 5; SEKANS KOD NO.: 25 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 26 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 6; SEKANS KOD NO.: 27 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 28 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 7; SEKANS KOD NO.: 29 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 30 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 8; SEKANS KOD NO.: 31 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 32 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor 9; SEKANS KOD NO.: 33 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 34 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir58karsilastirma amaçli antikor 10; ve SEKANS KOD NO.: 35 agir zincir degisken bölgesi ile SEKANS KOD NO.: 36 hafif zincir degisken bölgesinden olusan bir karsilastirma amaçli antikor ll. Hazirlanan her hücre hatti seruin içermeyen 30 mL kadar bir OptiCHO vasatinin (Invitrogen Corp.) bulundugu 150 cm2 ebatlarindaki bir sisede 5 x 105 hücre/mL yogunlugunda 5 güii boyunca kültürlenerek, insan-fare kimerik monoklonal antikorlari l ilâ ll'den herhangi birini ihtiva edenkültür üst fazlari elde edildi. ekspresyonuna dair anti-CAPRIN-l antikoru #1 kullanilarakyapilan degerlendirme>Bir sonraki asamada, CAPRIN-l geni ekspresyoiiunun teyit edilinis oldugu insan meme kaiiseri hücre hatlari (ZR75-l, MCF7, T47D, SK- BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V ve MRK-nu-l), böbrek kanseri hücre hatlari (Caki-l, Caki-2, A498 ve ACHN), mesane kanseri hücre hatti (T24), yumurtalik kanseri hücre hatti (SKOV3), akciger kanseri hücre hatlari (QG56 ve A549), pankreas kanseri hücre hatlari (Capaii-2 ve MIAPaCa-Z), prostat kanseri hücre hatti (PC3), uterin serviks kanseri hücre hatti (SW756), fibrosarkom hücre hatti (HT1080), beyin tümörü hücre hatlari (T98Ci, U87MG, U251, SNBl9 ve U373), gastrik kanser hücre hatlari (MNK28, MNK45), kalin bagirsak kaiiseri hücre hatlari (HT29, Lovo, CaC02, SW480 ve HCT116), lösemi hücre hatti (AMLS) ve lenfoma hücre hatti (Ramos), Ornek 4'de elde edilen kültür üst fazlari kullanilarak CAPRIN-l proteinleriniii hücre yüzeyi üzerindeki ekspresyonubakimindan incelendiler. Her hücre hattindan 5 X 105 adet hücre alinip591,5 mL hacimli bir mikrosantrifüj tüpünde santrifuje tâbi tutuldu.

Antikor #1'i içeren her kültür üst fazi (100 uL) tüpe eklendi ve tüp takip eden 1 saat boyunca buz üzerinde bekletildi. PBS ile yikama yapildiktan sonra, %0,1 oraninda FBS içeren PBS ile seyreltilmis FITC-etiketli keçi anti-fare IgG (H+L) antikorlari (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) eklendi ve elde edilen içerik müteakip 30 dakika boyunca 4°C sicaklikta bekletildi. PBS ile yikaina yapildiktan sonra, FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) kullanilarak floresans yogunlugu ölçüldü. Negatif kontrol olarak, yalnizca sekonder antikorlar ile reaksiyona sokulmus olan hücreler kullanildi. Sonuç olarak, antikor #l takviyeli hücrelerde, negatif kontrolde saptanandan en az %35 oraninda daha kuvvetli bir tloresans yogunlugu tespit edildi. Bu sonuçlar, CAPRIN-l proteinlerinin insan kanser hücre hatlarinin hücre membrani yüzeyi üzerinde eksprese olduklarini kanitladi. Floresans yogunlugundaki bu artis orani, her hücre hatti için ortalaina floresans yogunlugundaki (MFI) artis oraniüzerinden gösterildi ve asagidaki denkleme göre hesaplandi:Ortalama floresans yogunlundaki artis orani (Floresans yogunlugundaki artis orani) (%) = ((Anti-CAPRlN-l antikorlari ile reaksiyona sokulan hücrelerin MF] degeri) - (Kontrol MF] degeri)) / (Kontrol MFI degeri) x 100Ornek 4'te elde edilen anti-CAPRIN-l insan-fare kiinerik monoklonalantikoru #1, ADCC aktivitesi eseyi ile, CAPRlN-l eksprese eden60kanser hücrelerine hasar verme kabiliyeti bakiinindan incelendi. #1 'ü üreten hücrelerin kültür üst fazi, Hitrap Protein A Sepharose FF (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) kullanilarak saflastirildi. PBS(-) ikamesi yapildiktan sonra, çözelti bir 0,22 um filtreden (Millipore Corp.) geçirilerek filtrelendi. Elde edilen antikor aktivite eseyi için kullanildi. CAPRIN-l ekspresyonunun teyit edilmis oldugu insan meine kanseri hücre hatti MCF7, insan kalin bagirsak kanseri hücre hatti HCT-116, insan pankreas kanseri hücre hatti MIAPaCa-2, insan böbrek kanseri hücre hatti Caki-2 ve insan akciger kanseri hücre hatti QG56'nin her birinden 106 adet hücre alinip 50 mL hacimli bir santritüj tüpünde toplandi ve daha sonra üzerine 100 uCi krom 51 eklendi ve takip eden 2 saat boyunca 37°C sicaklik altinda inkübasyon gerçeklestirildi. Akabinde hücreler %10 oraninda FBS içeren bir RPM1160 vasati ile üç defa yikanip 96 kuyucuklu V tabanli plakaya 2 x 103 hücre/kuyucuk yogunlugunda eklenerek hedef hücreler hazirlandi. Daha sonra, Ornek 4'te elde edilen saflastirilmis antikor 1 ve insan-fare kimerik karsilastirma amaçli antikorlari 1 ilâ 11'in her biri 1 ug/kuyucuk konsantrasyonunda ilave edildi. Müteakiben, insan perifera] kan lenfositlerinden bir standart yönteme göre ayrilan insan NK hücrelerinin buluiidugu bir hücre popülasyonu plakaya 2 x 105 hücre/kuyucuk yogunlugunda ilave edildi ve orada 5°C COZ kosullari altinda 37°C sicaklikta 4 saat boyunca kültürlendi. Kültür tamamlandiktan sonra, kültür üst fazinda hasarli tümör hücrelerinden salinan krom 51 miktari ölçülerek, her bir anti-CAPRIN-l antikorunun kanser hücrelerine karsi sahip oldugu sitotoksik aktivite hesaplandi. Negatif kontrol olarak, izotip kontrol antikorlarinin takviye edildigi hücreler kullanildi. Bu degerlendirmeden kullanilanNK hücrelerin bulundugu hücre popülasyonu asagida tarif edildigi61gibi hazirlandi: bir özgül agirlik separasyon çözeltisi olan insan periferal kan mononükleer hücre separasyonuna yönelik Histopaque (Sigma-Aldrich Corp.) kullanilarak bir standart yöntemle insan periferal kanindan ayrilmis olan insan periferal kan mononükleer hücreleri, çesitli FITC-etiketli antikorlar (anti-insan CD3 antikoru, anti-insan CD20 antikoru, anti-insan CD19 antikoru, anti-insan CDllc antikoru ve anti-HLA-DR antikoru (Becton, Dickinson and Company)) ile reaksiyona sokuldular ve bir hücre ayiklayici (FACS Vantage SE (Becton, Dickinson and C0mpany)) veya insan NK hücre separasyon kiti (Miltenyi Biotec KK.) kullanilarak, antikorlar ile boyanmamis olan bir hücre popülasyonu ayrildi. Kanser hücrelerine yönelik sitotoksik aktiviteye dair yapilan degerlendirme sonucunda, kullanilan izotip kontrol antikorlarinin ve kullanilan karsilastirma amaçli antikorlar 1 ilâ ll'in insan meme kanseri hücre hatti MCF7, insan akciger kanseri hücre hatti QG56, insan kalin bagirsak kaiiseri hücre hatti HCT-116, insan pankreas kanseri hücre hatti MIAPaCa-2 ve insan böbrek kanseri hücre hatti Caki-2'nin hepsine karsi %5'ten düsük bir sitotoksik aktiviteye sahip oldugu tepsi edildi. Diger yandan, antikor #1, insan meme kanseri hücre hatti MCF7, insan akciger kanseri hücre hatti QG56, insan kalin bagirsak kanseri hücre hatti HCT-l 16, insan pankreas kanseri hücre hatti MlAPaCa-2 ve insan böbrek kanseri hücre hatti Caki-2'ye karsi sirasiyla %21, %11, %21, %27 ve %23 düzeyinde sitotoksik aktivite sergiledi. Benzer sekilde, kullanilan kontrol aiitikorlari ve kullanilan karsilastirma amaçli antikorlar 1 ila 11, diger kanser hücrelerini teskil eden meme kanseri hücre hatlari ZR75-1, T47D, H5578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB- 231V ve MRK-nu-l, gliom hücre hatlari T98G ve U373, akcigerkanseri hücre hatti olan A549, böbrek kanseri hücre hatlari Caki-l ve62ACH, uterin serviks kanseri hücre hatti SW756, mesane kanseri hücre hatti T24, gastrik kanser hücre hatlari MKN28 ve MKN45, kalin bagirsak hücre hatti SW480, lösemi hücre hatti AML5 ve lenfoma hücre hatti hattinin hepsine karsi %4'ten düsük bir sitotoksik aktiviteye sahiplerdi. Diger yandan, antikor #1'in bu hücre hatlarina karsi %10 veya daha yüksek düzeyde bir sitotoksik aktiviteye sahip oldugu teyit edildi. Bu sonuçlar, elde edilen CAPRIN-l'i hedef alan monoklonal antikor #1'in sahip oldugu ADCC aktivitesi araciligiyla CAPRIN-l eksprese eden kanser hücrelerine hasar verdigini gösterdi ve antikor #l'in insan kanser hücrelerine karsi karsilastirma amaçli antikorlar 1 ilâ 11'in sergiledikleri sitotoksik aktiviteye kiyasla dahakuvvetli bir sitotoksik aktivite sergiledigini kanitladi.Sitotoksik aktivite hakkindaki bu sonuçlar, yukarida tarif edildigi gibi bu bulusta kullanilan CAPRIN-l'i hedef alan antikor, lenfosit hücreleri (NK hücrelerin bulundugu popülasyon) ve her kanser hücre hattindan krom 51 dahil edilmis olan 2 x 103 adet hücrenin birbirleriyle karistirilmalari, hücrelerin 4 saat boyunca kültürlenmeleri, kültür tamamlandiktan sonra vasata salinan krom 51 miktarinin ölçülmesi ve asagidaki denklem uyarinca her kanser hücre hattina karsi ortaya konan sitotoksik aktivitenin hesaplanmasi yoluylaelde edildi.Ekspresyon: Sitotoksik aktivite (%) = CAPRlN-l'i hedef alan antikorun ve lenfosit hücrelerinin (NK hücrelerin bulundugu popülasyon) uygulandigi hedef hücrelerden salinan krom 51 miktari / 1 N hidroklorik asidin uygulandigi hedef hücrelerden salinan krom 51 miktari x 10063Takip eden çalismada, Ornek 4'te elde edilen insan-fare kimerik inonokloiial antikoru #1, kanser tasiyan farelerde ortaya koydugu anti- tümör etkisi bakimindan in Vivo ortamda degerlendirildi. Kullanilan antikor, antikor #l 'i üreten her hücre hattiiiin kültür üst fazindan kolon ile saflastirildi. Benzer sekilde, Ornek 4'te hazirlanan anti-CAPRIN-l antikorlari insan-fare kiinerik karsilastirina amaçli monoklonal antikorlari '1 ilâ 1 1'de, kanser tasiyan farelerde ortaya koyduklari anti-tümör etkileri bakimindan in VIVO ortamda degerlendirildiler.Antikor #1'i anti-tümör etkisi bakimindan inceleyip çalismak için, bir CAPRIN-l eksprese eden insan kaynakli kanser hücre hattinin transplante edilmis oldugu kaiiser buluiian farelerden istifade edildi. 65 adet Balb/c tüysüz faresiniii (Japan SLC, Inc.) sirtlarina subkütan yolla fare basina 2 x 106 adet insan pankreas kanseri hücre hatti Çapan-2 hücresi (ATCC'den satin alinmistir) transplante edildi ve bu hücreler, tümör çap uzunlugu yaklasik 5 mm'yi bulana kadar büyütülüp çogaltildilar. Bu kanser bulunan farelerden (her bir antikor basina) 5'ine intraperitoneal yolla fare basina 200 ug (200 ul) dozunda aiitikor #1 veya insan-fare kiinerik karsilastirma amaçli antikorlari 1 ilâ ll'den biri uygulandi. Daha sonra, bahsi geçen antikorlar kaiiser bulunan farelere 2 gün oyunca toplamda üç defa yine yukarida belirtilen dozda intraperitoneal yolla uygulandilar. Tümör büyüklükleri her gün ölçüldü ve anti-tümör etkisi gözlemlendi. Diger yandan, kalaii 5 adet kaiiser tasiyan fareye antikorlar yerine PBS(-)uygulanarak bir kontrol grubu olusturuldu. Tümör büyüklükleri, 0,5 x64(Majör eksen x Minör eksen x Minör eksen) denklemine göre hacimcinsinden hesaplandi.Anti-tümör etkisine dair yapilan gözlemler sonucunda, CAPRIN-l'i hedef alan antikor #l'in verilmis oldugu test grubunda antikor uygulamasindan 29 gün sonra yapilan ölçüme göre tümör proliferasyonunun (ayni tarihte kontrol grubunda saptanaii tümör büyüklügü %100 olarak kabul edilip yapilan degerlendirmeye göre) %65'e düsmüs oldugu saptandi. Diger yandan, insan-fare kimerik karsilastirma amaçli antikorlari l ilâ ll'in verilmis oldugu farelerde tümör proliferasyonun yaklasik %85' düstügü gözlemlendi. Bu sonuçlar, elde edilen CAPRIN-l'i hedef alan antikor #1 'in CAPRlN-l eksprese eden kanser hücrelerine karsi bir in vivo anti-tümör etkisine sahip oldugunu kanitladi. Bu sonuçlar, ayni zamanda, antikor #l'in karsilastirma amaçli antikorlar l ilâ 11'e göre daha kuvvetli bir in vivoanti-tümör etkisi sergiledigini de kanitladi. hücrelerinin yüzeyleri üzerinde algilayip tanidigi CAPRIN-lmoleküllerinin sayisi>Insan meme kanseri hücre hatlari (ZR75-l, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V ve MRK-nu-l), böbrek kanseri hücre hatlari (Caki-l, Caki-2, A498 ve ACHN), bir mesane kanseri hücre hatti (T24), bir yumurtalik kanseri hücre hatti (SKOV3), akciger kanseri hücre hatlari (QG56 ve A549), pankreas kanseri hücre hatlari (MIAPaCa-2 ve Çapan-2), bir prostat kanseri hücre hatti (PC3),bir uterin serviks kanseri hücre hatti (SW756), bir fibrosarkom hücre65hatti (HT1080), beyin tümörü hücre hatlari (T98G, U87MG, U251, SNB19 ve U373), gastrik kanser hücre hatlari (MNK28 ve MNK45), kalin bagirsak kanseri hücre hatlari (HT29, Lovo, CaCoZ, SW480 ve HCT116), bir lösemi hücre hatti (AMLS) ve bir lenfoma hücre hatti (Ramos), anti-CAPRIN-l antikoru #l'in bu hücrelerin yüzeyleri üzerinde algilayip tanidigi CAPRIN-l moleküllerinin sayisini saptamak maksadiyla molekül sayisinin Ölçümüne yönelik bir esey kiti olan "QIFIKIT" (Dako Japan Inc.) kullanilarak inceleiidiler. Bu muhtelif kanser hücrelerinin yüzeyleri üzerindeki CAPRIN-l moleküllerinin sayisi benzer sekilde Ornek 4'te hazirlanan anti-CAPRIN-l monoklonal antikorlari 1 ilâ 11 kullanilarak da incelendi.Kit ile birlikte sunulan protokole göre, antikor #1 ve karsilastirma amaçli antikorlar l ilâ 11 PES ile 5 ug/mL (nihai konsantrasyon bakimindan) seviyesine varana dek seyreltildiler ve elde edilen seyrelti her bir hücre hattina ilave edilip onunla 30 dakika boyunca reaksiyona sokuldu. PBS ile yikama yapildiktan sonra, kit ile birlikte sunulan floresan etiketli anti-fare IgG antikorlari, yine kit ile birlikte sunulan kalibrasyon boncuklari ile beraber sekonder antikorlar olarak her bir hücre hattina ilave edildiler ve elde edilen içerik takip eden 45 dakika boyunca buz üzerinde bekletildi. Her bir hücre hatti ve kalibrasyon boncuklari PBS ile yikandi. Daha sonra FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) ile floresans yogunlugu ölçülerek bir ortalama floresans yogunlugu degeri (ortalama) elde edildi. Ayrica, ayni esey karsilastirma amaçli antikorlar için de tekrarlanip onlara iliskin bir ortalama deger de elde edildi. Negatif kontrol olarak, izotip kontrol antikorlari ile reaksiyona sokulan hücreler kullanildi ve bunlariçin de bir ortalama deger hesaplandi. Kit ile birlikte sunulan66protokole göre ortalama floresans yogunlugu degeri (ortalama) kullanilarak moleküllerin sayisi hesaplandi. Sonuç olarak, antikor #1 'in muhtelif kanser hücrelerinin yüzeyleri üzerinde algilayip tanidigi CAPRIN-l moleküllerinin sayisinin incelenen tüm insan kanser hücre hatlarina istinaden hücre basina 105 veya daha fazla oldugu tespit edildi. Diger yandan, karsilastirma amaçli antikorlar 1 ilâ 11'inalgilayip tanidiklari moleküllerin sayisi hücre basina 105'ten azdi.Endüstriyel UygulanabilirlikBu bulusa konu olan antikor, kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veyaönlenmesinde faydalidir ve bu amaçla kullanilabilir.30SEKANS LISTESI<110> Toray Industries, Inc.<120> Kanser Hastaliklarmm Tedavisi ve Önlenmesi Için Farmasötik Bilesim<130> CMD/FP6964613 EP12820091.2 <141> 2012-08-03<150> PCT/JP2012/069853 <151> 2012-08-03<150>JP 2011-171377 <151>2011-08-04<160> 38<170> Patentln versiyon 3.1<210> 1 <211> 5562 <212> DNA<213> Homo sapiens<220> <221> CDS<222> (190)..(2319) <223><400> 167 68cigimctg ctqgctgqct iigtccctcc cgctccogqi: tctcgcctu :tim ctctcqgtgc iqcgggicag qgcgaaqogg cctqcgccca cqqagogcgc qacactgoec mac oocaoccttq oucoctciqc tqcocictco tqitttoccq :wcctccqoatanan-co -tq :cc taç guc -cc Inc c-c ise 999 &9: 99: Ice ina toy Net !:0 Set ni. ru: si: His Ser ciy Ser Giy Se: Luc se: i s 10!cc ova coq eca oco ccv ::9 out to: tac evo not 9-9 909 90: vee sor Gly Pro Pro Pro Pro Sor Gly :or Sor Gly Sor Glu aii aii iio 1: 20 2: 30qoiqccmqccqccqeqccqocttczcwcaccocqcaiccqqcicc Biy Ala 0111 M.: ni AJ.. !to in sir (nn si. Pro ni 'l'hr Giy 'Hiz35 60 45goc get. qtc coq .cc gag goc ne ne coq au. cu: çoq qtq :tc qic Gly Al. ":1 Gb! ?hr Glu na M by. 6111 11. hu Gly Val Il.. Asp50 55 60::9 ua ctt 099 .ne ctq gag m ua .og çat uç ::tt çit çit. tac &ya iyi mu Mc aan ben 611: by. by: by: Gly by: !Au Mp Asp Trt 65 70 15en can ova itq cnc au m ona m ou: ant cu çit coq otq çat nin Oiu Mg Ile!. nn by. 01:( Giu uç Lou un Oin Mp Gin Lou up 80 85 90goc att. tct m tac 009 en gta uca u!. cat. &%9 gag m: 900 ne AJ.: Yil 8.:: iyi !yt Gin Giu Vii fl:: Mu un !an 611: Ph. A1: &ya 95 100 1.05 110TARIFNAME IÇERISINDE ATIF YAPILAN REFERANSLARBasvuru sahibi tarafindan atif yapilan referanslara iliskin bu liste, yalnizca okuyucunun yardimi içindir ve Avrupa Patent Belgesinin bir kismini olusturmaz. Her ne kadar referanslarin derlenmesine büyükönem verilmis olsa da, hatalar veya eksiklikler engellenememektedirve EPO bu baglamda hiçbir sorumluluk kabul etmemektedir.Tarifname içerisinde atifta bulunulan patent dökümanlari:. us 5698396 A [0006] . wo 2010016526 A [0006] [0116]

[0117] [0118] [0119] [0121] [0126] - wo 0243478 A [0050]. WO 02092812 A [0050]. .IP 2007530068 A [0051]. WO 9846777 A [0051]. EP 239400 A [0059] . wo 9602576 A [0059] . wo 9951743 A [0059] . EP 12820091 A [0136] . JP 2012069853 W [0136] . JP 2011171377 A [0136]Tarifnamede belirtilen patentlestirilmemis literatür:° TSUYOSHI AKIYOSHI. Japanese Journal of Cancer and Cheinotherapy, 1997, vol. 24, 511-519 [0007]° Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy. Publishers lnc, [0007] ° BRUGGEN P. et al. Science, 1991, vol. 254, 1643-1647 [0007]- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol.92,11810-11813 [0007]° lnt. J. Cancer, 1997, vol. 72, 965-971

[0007]° Cancer Res., 1998, vol. 58, 1034- 1041 [0007]o Int. J. Cancer, 1998, vol. 29, 652-658

[0007]° Int. J. Oncol., 1999, vol. 14, 703-708

[0007]° Cancer Res., 1996, v01. 56, 4766- 4772 [0007]o Hum. Mol. Gene, 1997, vol. 6, 33-39

[0007]° KARLIN ; ALTSCHUL. Proc. Natl.Acad. Sci. USA,1993, vol. 90, 5873-' Current Topics in Microbiology and Iininunology,1978, vol. 81, 1-7 [0041] o KOHLER. G. ; MILSTEIN, C. Eur.

J. Iininunol., 1976, vol. 6, 511-519

[0041]. MARGULIES. D.H. et al. Cell, 1976, vol. 8, 405-415 [0041]° SHULMAN, M. et al. Nature, 1978, vol. 276, 269-270 [0041]o GROTH, S.F. et al. J. lmmunol.

Methods, 1980, vol. 35, 1-21 [0041]- TROWBRIDGE, LS. J. Exp. Med., 1978, vol. 148, 313-323 [0041]- GALFRE, G. et al. Nature, 1979, vol. 277, 131-133 [0041]o KOHLER, G. ; MILSTEIN, C.

Methods Enzymol., 1981, vol. 73, 3-46

[0042]- CARL ; A.K. BORREBAECK ; JAMES ; W. LARRICK.

THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES. MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 [0052] 1085877 [0023]o ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 25, 3389-3402 [0023] 0 Seikagaku J ikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English).

Japanese Biochemical Society [0026]° Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis.

Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd,1981 [0026]° Molecular Cloning. SAMBROOK et al. Current Protocols in Molecular Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0026]° AUSUBEL et al. Short Protocols in Molecular Biology [0026]° Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1995

[0026]0 Short Protocols in Molecular Biology.

AUSUBEL et al. A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1995 [0027]° Molecular Cloning. SAMBROOK et al. Current Protocols in Molecular Biology. 1989 [0028]0 J. lmmunol., 1979, vol. 123, 1548- 1550 [0041]0 SAMBROOK et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989

[0077]° P.J. DELVES. ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. WILEY, 1997 [0078]o SATO K. et al. Cancer Research, 1993, vol. 53, 851-856 [0059] [0060]° G.B. KIM et al. Protein Engineering Design and Selection, 2007, vol. 20 (9), 425-432 [0061]0 HASHIMOTO-GOTOH, T. et al.

Gene, 1995, vol. 152, 271-275 [0067] - ZOLLER, MJ.; SMIT H, M.

Methods Enzyinol., 1983,vol. 100, 468-500 [0067]° KRAMER, W. et al. Nucleic Acids Res., 1984, vol. 12, 9441-9456 [0067] o KRAMER, W. ; FRITZ, HJ.

Methods Enzyinol., 1987,vol. 154, 350-367 [0067]o KUNKEL, TA. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA., 1985, vol. 82, 488-492 [0067]o KUNKEL. Methods Enzyinol., 1988, vol. 85, 2763-2766 [0067]o KABAT et al. Sequences of Proteins of linmunological Interest. Public Health Service, National Instituteof Health, 1991 [0076]° P. SHEPHERD ; C. DEAN.

Monoclonal Antibodies. OXFORD UNIVERSITY PRESS, 2000 [0078]' J.W. GODING. Monoclonal Antibodies: principles and practice.

ACADEMIC PRESS, 1993 [0078]- N [WA R. Clinical Cancer Research, March 2005, vol. 11 (6), 2327-2336

Claims (1)

1. ISTEMLER SEKANS KOD NO.: 5, 6 ve 7 tamamlayicilik belirleme bölgelerini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS KOD NO.: 9, 10 ve 11 tamamlayicilik belirleine bölgelerini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi ihtiva eden ve bir CAPRIN-l proteinine karsi immünolojik reaktiviteye sahip olan bir antikor veya onun bir fragmani. Bir hümanize antikor, bir kimerik antikor, bir tek Zincirli antikor ya da bir multispesifik antikoru teskil eden, istem l'e uygun antikor veya onun fragmani. Bir anti-tümör ajani ile kon juge olan, istein l”e veya 2'ye uygun antikor veya onuii fragmani. Kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veya önlenmesine yönelik bir yöntemde kullanim için, yukaridaki istemlerden herhangi birine uygun antikor veya onun fragmani. Kanser hastaligi meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kalin bagirsak kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serViks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesaiie kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositoin ya da melanom olmak uzere, istem 4'e uygun kullanim için antikor veya onun fragmani. Bir etkin bilesen olarak istemler l ilâ 3'ten herhangi birine uygun bir antikor veya onun bir fragmanini içeren bir farmasötik bilesim. Kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veya önlenmesine yönelik bir yöntemde kullanim için, istem 6'ya uygun famiasötik bilesim. Kanser hastaligi meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kalin bagirsak kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositom ya da melanom olmak üzere, istem 7'ye uygun kullanim için farmasötik bilesim. Istem 6'ya uygun bir famiasötik bilesim ile bir anti-tümör ajaninin bulundugu bir farmasötik bilesim ihtiva eden bir farmasötik kombinasyon. Kanser hastaliklarinin tedavisi ve/veya önlenmesine yönelik bir yöntemde kullanim için, istem 9'a uygun farinasötik kombinasyon. Kanser hastaligi meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, kalin bagirsak kanseri, akciger kanseri, beyin tümörü, gastrik kanser, uterin serviks kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, mesane kanseri, özofagus kanseri, lösemi, lenfoma, fibrosarkom, mastositom ya da melanom olmak üzere, istem lO'a uygun kullanim için farmasötik kombinasyon. Istem 1 ”e veya Z'ye uygun bir antikor veya onun bir fragmanini kodlayan bir DNA.