KR20050062663A - 인간 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 인간 인공 염색체 및자손 전달 가능한 상기 인간 인공 염색체를 포함하는비인간 동물 - Google Patents

인간 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 인간 인공 염색체 및자손 전달 가능한 상기 인간 인공 염색체를 포함하는비인간 동물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차세대에 고효율로 자손 전달 가능한 인간 인공 염색체와 그의 이용 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 인간 22번 염색체 유래의 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 약 3.5 Mb 내지 약 1 Mb 영역과, 비인간 동물의 생식계열을 경유하여 자손 전달될 수 있는 다른 인간 염색체 유래의 염색체 단편이 결합된 인간 인공 염색체, 상기 인간 인공 염색체를 보유하는 비인간 동물 및 그의 자손, 상기 비인간 동물의 제조 방법, 상기 비인간 동물 또는 그의 자손을 이용하는 인간 항체의 제조 방법, 및 인간 인공 염색체를 포함하는 인간 항체 생산 마우스에 관한 것이다.

Description

인간 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 인간 인공 염색체 및 자손 전달 가능한 상기 인간 인공 염색체를 포함하는 비인간 동물 {Artificial Human Chromosome Containing Human Antibody λ Light Chain Gene}
염색체 단편을 포함하는 미크로셀(microcell)과 분화 다능성을 갖는 세포와의 융합에 의해 얻어지는 하이브리드 세포로부터 키메라 동물을 제조하는 기술(WO97/07671)의 개발에 의해, 종래 불가능하였던 장대한 외래 유전자를 보유하는 비인간 동물의 제조가 가능해졌다.
비인간 동물에게 도입되는 염색체 단편을 개변함으로써, (1) 불필요한 유전자의 제거, (2) 원하는 유전자의 부가, (3) 염색체 단편의 안정화 등을 행할 수 있는 것은 유용하다. WO98/37757에는 비인간 동물에게 도입되는 염색체 단편의 개변 방법의 개요 및 닭 유래의 DT-40 세포에 보유된 인간 염색체에 텔로미어(telomere) 서열을 표적화하고, 고효율로 원하는 결실 염색체를 수득할 수 있음이 기재되어 있다. 또한, 마우스 ES 세포 및 마우스 개체에 있어서 안정적으로 보유되면서 자손 전달 효율이 높은 인간 염색체 단편에 대하여 기재되어 있다. 또한, WO00/10383에는 인간 염색체 상의 원하는 영역을 안정한 염색체 단편(염색체 벡터)에 전좌시킨, 보다 안정한 인간 인공 염색체(Human Artificial Chromosome; 이하, HAC로 약기함)의 제조 방법이 기재되어 있다.
최근, 구로이와(Kuroiwa) 등[Nature Biotech. 18:1086, 2000]은 메가베이스(Mb) 크기의 특정 인간 염색체 영역을 삽입체로서 보유하는 인간 인공 염색체(HAC)의 제조를 세계 최초로 성공하였다. 이 HAC(λ HAC)는 안정하면서 자손 전달 가능한 인간 14번 염색체 유래의 SC20 단편을 염색체 벡터로서 이용하고, 이 벡터에 인간 22번 염색체 상의 인간 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 10 Mb 크기의 염색체 영역을 삽입체로서 전좌하여 클로닝함으로써 얻어진 인공 염색체이다. 그들은 상기 λ HAC가 벡터로서 이용한 SC20 단편과 거의 동등한 안정성을 갖는 것으로 나타났고, 여러가지 불안정 염색체 유래의 영역을 SC20으로 전좌 클로닝함으로써 안정화시킬 수 있는 가능성을 나타내었다. 또한, 이 λ HAC를 마우스에 도입하여 안정적으로 λ HAC를 보유하는 키메라 마우스의 제조에 성공하였다.
비인간 동물에 있어서 도입 인간 염색체의 차세대로의 자손 전달은, 교배에의한 균일한 성질을 갖는 트랜스염색체 동물(transchromosomic animal; 이종 염색체 단편이 생식계열을 경유하여 자손 전달된, 비인간 동물의 것을 말함)의 대량 생산이라는 점 뿐만 아니라, 도입 인간 염색체의 생식계열을 통한 구조ㆍ기능 분석이라는 점에서도 중요하다. 지금까지 수종류의 인간 염색체가 마우스에 도입되어 왔지만, 그의 자손 전달능은 도입 인간 염색체의 구조에 의존하고 있다고 생각된다. 자손 전달을 위해서는, 첫째로 ES 세포가 높은 효율로 생식 세포에 기여하고 있는 키메라 비율이 높은 키메라 마우스를 얻는 것이 필수 조건이지만, 상기 키메라 비율은 도입 염색체 상에 어떤 인간 유전자가 존재하는가라는 도입 인간 염색체의 구조가 관여되어 있다고 생각된다. 예를 들면 인간 2번, 14번 염색체 단편을 도입한 경우에는 100 ％ 키메라 비율에 가까운 키메라 마우스가 얻어지고, 그의 자손 전달 효율도 높은 데[Tomizuka 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-727, 2000] 반하여 인간 22번 염색체 단편을 도입한 경우에는 50 ％ 이하의 낮은 키메라 마우스가 대부분이다. 이것은 인간 22번 염색체 상에는 마우스의 발생에 악영향을 주는 유해한 인간 유전자가 존재하는 것에서 기인하는 지도 모른다. 실제로, 인간 항체 Igλ 유전자가 존재하는 인간 22번 염색체 상의 22q11 영역에는 캣 아이 증후군 (cat eye syndrome), 디조지(DiGeorge) 증후군, der22 증후군 등의 유전자 발현량 의존성의 유전병 원인 영역이 존재하고 있는 것이 보고되어 있다[예를 들면, A.Puech 등, PNAS 97:10090, 2000]. 상술한 바와 같이 이러한 유전병 영역을 제거하고, 인간 22번 염색체 상의 HCF2 유전자좌로부터 LIF 유전자좌까지의 10 Mb만을 SC20 염색체 벡터에 전좌 클로닝하여 λ HAC를 구축하고 마우스에 도입한 결과, λ HAC를 보유하는 ES 세포로부터 탄생한 키메라 마우스의 키메라 비율은 인간 22번 염색체 전장을 도입한 경우와 비교하면 높아진 것으로 보고되어 있다.
[문헌 1] WO97/07671
[문헌 2] WO98/37757
[문헌 3] WO00/10383
[문헌 4] Kuroiwa et al., Nature Biotech. 18:1086, 2000
[문헌 5] Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-727, 2000
[문헌 6] A. Puech et al., PNAS 97:10090, 2000
이러한 상황하에, 본 발명자들은 종래의 λ HAC에 비해 보다 효율적인 자손 전달을 달성할 목적으로, 한층 더 인간 인공 염색체의 개량을 시도하고, 그의 자손 전달 효율에 대한 검토를 행하였다.
즉, 본 발명은 인간 22번 염색체 또는 그의 단편을 개변하여, 차세대에 고효율로 자손 전달 가능한 인간 인공 염색체, 및 상기 인간 인공 염색체를 보유하는 비인간 동물 및 그의 자손을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 비인간 동물 또는 그의 자손을 이용하여 인간 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 인간 22번 염색체를 개변하여, 항체 λ 경쇄 유전자(Igλ) 영역을 포함하는 구조가 분명한 2종류의 영역을 선출하고, 상기 선출 영역 각각을 인간 14번 염색체 단편에 전좌시킨 인간 인공 염색체를 구축하여 이들을 보유하는 높은 키메라 비율의 마우스를 제조하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 키메라 마우스에 있어서, 상기 인간 인공 염색체가 감수 분열을 경유하여 차세대 자손에게 고효율로 전달되는 것을 관찰하고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 인간 22번 염색체 유래의 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 약 3.5 Mb 내지 약 1 Mb 영역과, 비인간 동물의 생식계열을 경유하여 자손 전달될 수 있는 다른 인간 염색체 유래의 염색체 단편이 결합된 인간 인공 염색체를 제공한다.
그 중 하나의 실시 양태에 있어서, 상기 다른 인간 염색체 유래의 염색체 단편은 안정하면서 자손 전달 가능한 임의의 인간 염색체 단편이라면 어떤 것이라도 좋고, 예를 들면 인간 14번 염색체 단편, 인간 21번 염색체 또는 그의 단편, 또는 인간 1번 염색체 1p22 영역을 포함하는 SAC(small accessory chromosome) [Genome Res., 11:124-136, 2001] 등이 있고, 바람직하게는 인간 14번 염색체 단편, 예를 들면 인간 14번 염색체 유래의 SC20 염색체 벡터(구로이와 등의 상기 문헌 참조)가 있다. 이 SC20 염색체 벡터는 예를 들면 14p12 부위에 위치하는 RNR2 유전자좌에 loxP 서열을 상동성 재조합에 의해 삽입함으로써 원하는 염색체 단편을 클로닝하는 데 사용할 수 있다[구로이와 등의 상기 문헌 참조]. SC20 염색체 벡터를 보유하는 닭 DT-40 세포(SC20)는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이6)에 2001년 5월 9일자로 국제 기탁되어 수탁 번호 FERM BP-7583이 부여되었다. 상기 다른 인간 염색체 유래의 염색체 단편은 WO97/07671에 개시된 방법에 의해, 바람직하게는 크기가 약 20 Mb 이하인 여러가지 인간 염색체 단편에 대하여 상기 염색체 단편을 보유하는 키메라 비인간 동물을 제조하고, 상기 키메라 비인간 동물의 자손에 있어서 상기 인간 염색체 단편이 안정적으로 보유되는 것을 선별함으로써도 수득할 수 있다. 상기 인간 22번 염색체 유래의 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 영역과, 자손 전달 가능한 인간 염색체 단편과의 결합은 loxP 서열 등의 부위 특이적 재조합 서열을 통한 전좌 또는 삽입에 의해 행해진다. 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 영역이 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 텔로미어 서열과 loxP 서열을 양말단으로 하여 잘라내진 경우에는 전좌에 의한 결합이 발생한다. 한편, 양말단에 loxP 서열을 삽입함으로써 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 영역이 잘라내진 경우에는, 자손 전달 가능한 인간 염색체 단편 상의 loxP 서열 부위에의 삽입이 일어난다.
다른 실시 양태에 있어서, 인간 22번 염색체 유래의 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 영역은 약 2.5 Mb 내지 약 1.5 Mb의 크기이다.
다른 실시 양태에 있어서, 인간 22번 염색체 유래의 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 영역은 약 2.5 Mb 또는 약 1.5 Mb의 크기이다. 이러한 크기의 상기 영역의 구체예는 각각 수탁 번호 FERM BP-7582인 닭 DT-40 세포(ΔHAC)에 보유된 ΔHAC 및 수탁 번호 FERM BP-7581인 닭 DT-40 세포(ΔΔHAC)에 보유된 ΔΔHAC로 이루어지는 인간 인공 염색체이다(후술하는 실시예 참조).
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 상기한 본 발명의 인간 인공 염색체를 보유하는 비인간 동물을 제공한다. 본 명세서 중 비인간 동물이란 인간을 제외한 척추 동물, 바람직하게는 포유동물을 말한다.
그 중 하나의 실시 양태에 있어서, 비인간 동물은 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 중 어느 하나의 인간 인공 염색체를 보유한다.
그 중 다른 실시 양태에 있어서, 비인간 동물이 포유동물이다. 바람직한 포유동물은 마우스이다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 상기한 본 발명의 인간 인공 염색체를 비인간 동물의 배아 간세포(ES 세포) 중에 미크로셀법에 의해 도입하는 것, 얻어진 ES 세포를 상기 비인간 동물의 배에 주입하는 것, 얻어진 주입 배를 가임신 모체에게 이식하는 것, 상기 가임신 모체로부터 키메라 비인간 동물의 출산에 의해 얻는 것, 상기 키메라 비인간 동물을 상기 인간 인공 염색체에 대하여 스크리닝하는 것을 포함하는 비인간 동물의 제조 방법을 제공한다.
ES 세포에의 도입에 있어서, 인간 인공 염색체를 보유하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 제조하고, 이 CHO 세포를 통해 상기 인간 인공 염색체를 ES 세포에 도입할 수도 있다.
그 중 하나의 실시 양태에 있어서, 상기 방법은 상기 스크리닝된 키메라 비인간 동물의 자손을 제조하고, 상기 자손을 상기 인간 염색체에 대하여 스크리닝하는 것을 추가로 포함한다.
다른 실시 양태에 있어서, 상기 방법에 의해 얻어지는 비인간 동물은 인간 항체 면역글로불린 중쇄 및 λ쇄 단백질을 발현할 수 있다.
또다른 실시 양태에 있어서, 비인간 동물이 포유동물, 바람직하게는 마우스이다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 상기한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 상기한 본 발명의 인간 인공 염색체를 보유하는 비인간 동물을 제공한다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 상기한 본 발명의 비인간 동물의 자손 동물을 제공한다. 자손 동물은 본 발명의 인간 인공 염색체를 보유하는 것을 특징으로 한다.
그 중 하나의 실시 양태에 있어서, 자손 동물은 인간 항체 면역글로불린 중쇄 및 λ 경쇄 단백질을 발현할 수 있다.
다른 실시 양태에 있어서, 자손 동물은 인간 항체 면역글로불린 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 단백질을 발현할 수 있다.
다른 실시 양태에 있어서 자손 동물은 마우스이다.
또한, 본 발명은 상기한 본 발명의 비인간 동물 또는 상기한 본 발명의 자손 동물을 원하는 항원으로 면역화시키고, 상기 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 폴리클로날 항체를 얻는 것을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
그의 실시 양태에 있어서, 상기 인간 폴리클로날 항체는 동물의 혈액으로부터 얻어진다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 상기한 본 발명의 마우스 또는 상기한 본 발명의 자손 마우스를 원하는 항원으로 면역화시키고, 계속해서 상기 마우스로부터의 비장 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하고, 상기 항원에 대한 인간 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이루어지는 인간 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 상기한 본 발명의 마우스 또는 상기한 본 발명의 자손 마우스를 원하는 항원으로 면역화시키고, 계속해서 상기 마우스로부터의 비장 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하고, 이 하이브리도마로부터 인간 항체 유전자를 단리하여 상기 인간 항체 유전자를 동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포에 도입하고, 이 세포를 인간 항체 유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 배양하여 항원에 대한 인간 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이루어지는 인간 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 상기한 본 발명의 마우스 또는 상기한 본 발명의 자손 마우스를 원하는 항원으로 면역화시키고, 계속해서 상기 마우스의 B 세포 유래의 항체 유전자를 파지 디스플레이법에 의해 선별하여, 선별된 인간 항체 유전자를 동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포에 도입하고, 이 세포를 인간 항체 유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 배양하여 항원에 대한 인간 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이루어지는 인간 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
여기서 상기 발현을 위한 방법은 공지된 방법(예를 들면, [Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Manual, second ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재된 방법)에 의해 실시할 수 있다. 숙주로서의 동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포는, 예를 들면 CHO 세포, BHK 세포, 간암 세포, 골수종 세포, 빵 효모 세포, SF9 세포 등이다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 혈청 중에 인간 항체 Igγ 아이소타입(isotype)을 포함하는 인간 항체 중쇄, 인간 항체 κ 경쇄 및 인간 항체 λ 경쇄를 발현하는 인간 항체 생산 마우스를 제공한다. 상기 인간 항체 생산 마우스는 재배열되어 있지 않은 인간 항체 중쇄 유전자좌, 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌 및 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌를 보유하고, 적어도 내인성 항체 중쇄 및 κ 경쇄의 양쪽 대립유전자가 파괴 또는 불활성화되어 있다.
상기 인간 항체 생산 마우스로서는, B 세포의 분화에 따라 인간 항체 유전자의 재배열에 의한 특정 가변 영역 단편의 연결(중쇄로서는 V-D-J, 경쇄로서는 V-J)이 발생하고, 바람직하게는 B 세포의 성숙에 따라 항체 유전자의 가변 영역에서의 체세포 변이를 경유한 후, 혈청 중에 상기 유전자 산물인 인간 항체가 생산된다.
즉, 「재배열되어 있지 않다」란, 항체 유전자좌가 중쇄에 있어서는 V-D-J 재조합, 경쇄에 있어서는 V-J 재조합을 일으키지 않고, B 세포의 분화에 따라 중쇄에 있어서는 V-D-J 재조합, 경쇄에 있어서는 V-J 재조합을 일으킬 수 있는 상태로 마우스의 미분화된 B 세포에 보유되어 있는 것을 말한다. 그 중 하나의 실시 양태에 있어서, 상기 인간 항체 생산 마우스는 인간 항체 κ 경쇄의 가변 영역 중 적어도 40 ％를 보유한다.
다른 실시 양태에 있어서, 상기 인간 항체 생산 마우스는 인간 항체 중쇄, 인간 항체 κ 경쇄, 및 인간 항체 λ 경쇄의 모든 가변 영역을 보유한다.
또다른 실시 양태에 있어서, 인간 항체 중쇄 유전자좌, 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌 및 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌가 인간 유래의 염색체 단편 상에 보유된다.
또다른 실시 양태에 있어서, 인간 항체 중쇄 유전자좌 및 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌가 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 중 어느 하나의 인간 인공 염색체 상에 보유된다.
또다른 실시 양태에 있어서, 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌가 인간 유래의 염색체 단편 상에 보유된다.
또다른 실시 양태에 있어서, 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌가 마우스 염색체에 삽입된다.
또한, 또다른 실시 양태에 있어서, 상기 인간 항체 생산 마우스는 키메라 마우스가 아닌 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 상기 인간 항체 중쇄 유전자좌, 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌 및 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌를 자손 전달할 수 있다.
1. 인간 인공 염색체(HAC) 및 트랜스염색체 비인간 동물의 제조와 그의 이용
본 발명은 인간 22번 염색체 상의 Igλ 유전자를 포함하는 단편을 인간 14번 염색체에서 유래한 염색체 단편에 전좌, 클로닝한 신규 인간 인공 염색체의 구축, 상기 인간 인공 염색체의 마우스에서의 자손 전달 및 상기 인간 인공 염색체를 보유하는 트랜스염색체 비인간 동물(예를 들면, 마우스 등의 포유동물)의 제조에 관한 것이다.
본 명세서 중에 있어서 인간 인공 염색체란, 인간 염색체 상의 원하는 영역을 안정한 염색체 단편(염색체 벡터)에 전좌시켜 제조된 인공 염색체(HAC: Human Artificial Chromosome)를 말한다. 또한, 트랜스염색체 비인간 동물이란, 이종 염색체 단편이 생식계열을 경유하여 자손 전달된 인간 이외의 동물을 말한다.
인간 인공 염색체는 예를 들면 loxP 서열 및 인간 텔로미어 서열을 인간 염색체 상의 목적 유전자 영역 근방에 상동성 재조합에 의해 삽입하고, 양쪽 서열 사이에 개재되는 목적 유전자 영역 주변만을 다른 염색체 단편(안정하면서 자손 전달 가능한 염색체 단편인 것이 바람직함; 인간 14번 염색체 유래 SC20 염색체 벡터 등) 상의 대응 loxP 서열 삽입 부위에 특이적으로 전좌시킴으로써, 목적 유전자 영역 주변만을 삽입체(염색체 삽입체)로서 보유하는 인간 인공 염색체로서 제조된다[구로이와 등, Nature Biotech., 18:1086, 2000].
본 발명자들은 인간 인공 염색체의 제조에 있어서, 마우스 등의 피염색체 도입 동물의 발생에 악영향을 주지 않도록, 악영향을 주는 것으로 추정되는 염색체 영역을 염색체 삽입체로부터 가능한 한 제거하는 것이 바람직하다고 생각해왔다. 그러나, 종래에는 인간 염색체의 상세한 서열 등의 구조에 관한 정보가 없거나 또는 부족하였기 때문에, 목적 유전자의 근방에 예를 들면 loxP 서열 및 인간 텔로미어 서열을 삽입하기가 곤란한 경우가 있었다. 이 경우, 양쪽 서열 사이에 개재되는 영역에는 목적 유전자 이외에도 기타 많은 유전자가 포함되기 때문에, 이들 잉여 유전자가 마우스 등에 도입된 경우에 발생에 악영향을 미치는 것이 우려되었다. 또한, 목적 유전자를 포함하는 염색체 삽입체의 크기와 피염색체 도입 동물의 키메라 비율 및 자손 전달 효율과의 관계가 불분명하였다.
본 발명자들은 Igλ 유전자가 존재하는 인간 22번 염색체의 구조에 관한 정보[예를 들면, I. Dunham 등, Nature 402:489, 1999]에 기초하여, 어떤 특정 크기 범위의 Igλ 유전자 함유 염색체 삽입체에 대하여 피염색체 도입 동물의 키메라 비율 및 자손 전달 효율이 모두 유의하게 상승하는 것을 본 발명에서 발견하였다. 이와 같이 잉여 유전자를 인간 인공 염색체로부터 제거함으로써, 특정한 Igλ 유전자 영역 주변을 삽입체로서 보유하는 신규 인간 인공 염색체를 제조하는 것이 가능해졌다. 본 명세서 중 잉여 유전자란, 피염색체 도입 동물의 발생에 악영향을 주는 유해 유전자를 가리키고, 예를 들면 유전자 발현량 의존성의 유전병 원인 영역 등이 있다. 본 발명의 인간 인공 염색체는 종래의 Igλ 유전자 영역 주변 10 Mb를 삽입체로서 보유하는 λ HAC와 비교하여, 그의 전체 크기가 축소되어 있으며 높은 자손 전달 효율을 가지고 있다.
이와 같이 인간 22번 염색체의 개변에 의해 마우스 등의 발생에 악영향을 줄 수 있는 유해 유전자가 제거되므로, 특정한 목적 Igλ 유전자 영역만을 삽입체로서 보유하는 인간 인공 염색체를 제조할 수 있다. 또한, 상기 개변의 결과, 도입되는 인간 인공 염색체 전체 크기 축소화를 가져옴과 동시에 감수 분열시 이상 염색체(이 경우, 도입 인간 인공 염색체)의 배제 메카니즘(예를 들면, [P.Hunt 등, Hum. Mol. Genet., 4:2007, 1995])을 피할 수 있다. 또한, 종래의 λ HAC(구로이와 등의 상기 문헌 참조)와 비교하여 도입 인간 인공 염색체를 인간 인공 염색체 도입 동물(예를 들면, 마우스)의 자손에게 전달시키는 것이 보다 쉬워지고, 인간 항체 중쇄ㆍλ 경쇄 전체 영역을 보유하는 트랜스염색체 비인간 동물의 제조를 보다 효율적으로 행하는 것이 가능하다.
상기한 바와 같이하여 얻어지는 트랜스염색체 비인간 동물을 이용하여, 외래 염색체 또는 그의 단편 상의 유전자를 발현시키고, 그의 산물을 회수함으로써 생물학적으로 활성인 물질을 제조할 수 있다. 구체적으로는 트랜스염색체 비인간 동물 개체를, 외래 염색체 또는 그의 단편 상의 유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 사육하고, 그 후 발현 산물을 동물의 혈액, 복수 등으로부터 회수할 수 있다.
또한, 트랜스염색체 비인간 동물의 조직, 세포 또는 그것을 무한증식화시킨 것(예를 들면, 골수종 세포와의 융합에 의해 무한증식화시킨 하이브리도마) 등을, 외래 염색체 또는 그의 단편 상의 유전자가 발현할 수 있는 조건하에서 배양하고, 그 후 발현 산물을 배양물로부터 회수할 수 있다.
또는, 이들 트랜스염색체 비인간 동물의 조직, 세포 또는 그것을 무한증식화시킨 것으로부터 추출한 외래 염색체 또는 그의 단편, 이 외래 염색체 또는 그의 단편을 구성하는 DNA, 또는 트랜스염색체 비인간 동물의 조직, 세포 또는 그것을 무한증식화시킨 것에 보유된 외래 염색체 또는 그의 단편에서 유래하는 cDNA를, 동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포(예를 들면 CHO 세포, BHK 세포, 간암 세포, 골수종 세포, 빵 효모 세포, SF9 세포 등)에 도입하여, 이 세포를 외래 염색체 또는 그의 단편 상의 유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 배양하고, 그 후 발현 산물(예를 들면, 특정한 항원 특이적인 항체 단백질 등)을 배양물로부터 회수할 수 있다. 발현 산물은 원심분리 등의 공지된 방법에 따라서 회수할 수 있고, 황산암모늄 침전법, 분배 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 분취 박층 크로마토그래피 등의 공지된 방법에 따라서 정제할 수 있다. 생물학적으로 활성인 물질은 외래 염색체 상에 코딩되어 있는 모든 물질을 포함하고, 예를 들면 항체, 특히 인간 항체 등을 들 수 있다. 예를 들면 얻어진 트랜스염색체 비인간 동물의 비장 세포 또는 그의 하이브리도마 등의 무한증식 세포로부터 상기 염색체 상의 인간 항체 유전자를 클로닝하고, 챠이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)나 골수종 세포에 도입하여 인간 항체를 생산할 수 있다[Lynette 등, Biotechnology, 10:1121, 1992; Bebbington 등, Biotechnology, 10:169, 1992; Babcook 등, PNAS, 93: 7843, 1996].
하이브리도마를 선별함으로써 원하는 항체 생산 세포를 선별한다고 하는 종래의 방법에 더하여, 최근 개발된 파지 디스플레이법에 의해 원하는 항체를 선별하는 것도 가능하다[Winter 등, Annu. Rev. Immunol., 12:433, 1994]. 여러가지 특이성을 갖는 인간 항체를 그의 표면에 발현하는 파지 라이브러리를 얻기 위해서는, 항원 미감작 또는 특정한 항원을 감작한 본 발명의 트랜스염색체 비인간 동물의 비장이나 림프 조직 유래의 인간 면역글로불린 유전자 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 사용할 수 있다.
이하, 자손 전달 효율이 높은 인간 인공 염색체의 제조 방법에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
목적하는 인간 염색체 영역을 포함하여 그것을 안정하게 보유하고 자손 전달하는 비인간 동물을 제조하기 위해서는, 우발적으로 생긴 염색체 단편이 아니라 인간 염색체를 원하는 부위에서 절단함으로써 유해 유전자를 제거하거나, 원하는 염색체 단편만을 안정하면서 자손 전달 가능한 다른 염색체에 연결하는 등, 염색체를 가능하게 가공하는 기술이 요망된다. 이러한 기술은 염색체 공학이라고 불리고, 지금까지 주로 마우스 ES 세포 중에서 내재성 마우스 염색체를 부위 특이적으로 절단하거나(WO 98/54348), 상동 염색체 사이에서 재조합(전좌)시킴으로써 특정한 유전자 영역을 결실ㆍ역위ㆍ부가시키고, 그와 같은 개변 염색체를 갖는 변이 마우스가 제조되어 왔다[R. Ramirez-Solis 등, Nature 378:720, 1995]. 본 발명에 있어서도, 이 기술을 이용할 수 있다.
인간 염색체 또는 그의 단편을 보유하는 ES 세포가 생식 세포에 기여하는 높은 키메라 비율의 비인간 동물(예를 들면, 마우스 등의 포유동물)이 얻어진 경우, 다음은 도입 인간 염색체가 감수 분열에서 제외되지 않고 도입 인간 염색체를 보유하는 정자 또는 난자가 형성되는지가 문제이다. 상술한 바와 같이, 일반적으로 이상 염색체를 감수 분열시에 제외시키는 메카니즘이 있다고 생각되고 있고, 도입 인간 염색체를 보유하는 세포는 감수 분열에서 제외되어, 결과적으로 정자 또는 난자로 분화할 수 없는 가능성을 생각할 수 있다. 이것은 감수 분열시에는 상동 염색체 사이에서의 페어링(pairing)이 필요하지만, 도입 인간 염색체는 1개밖에 존재하지않기 때문에 기본적으로는 페어링을 할 수 없다고 생각된다. 그 때문에, 도입 인간 염색체는 감수 분열로부터 제외될 가능성이 있다. 실제, 도미즈까 등[Nature Genet., 16:133, 1997]은, 대략 50 Mb 이상의 인간 14번 염색체 단편의 도입은 수컷 키메라 마우스의 불임을 가져왔다고 보고하고 있다. 한편, 크기가 10 내지 20 Mb 전후로 추정되는 인간 2번, 14번 염색체 단편(SC20)의 자손 전달에서는, 감수 분열의 통과를 위해서 도입 염색체의 크기가 중요한 인자임이 시사된다[Tomizuka 등, Nature Genet., 16:133, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000]. SC20 염색체 벡터(10 내지 20 Mb)는 자손 전달이 가능함과 동시에 마우스 ES 세포 및 개체에 있어서 높은 안정성을 가지고 있다[Shinohara 등, Chromosome Res., 8: 713-725, 2000]. 이러한 자손 전달이 가능하면서 마우스 개체에서 안정한 자연 발생 염색체 단편은 WO97/07671 및 WO98/37757에 기록된 방법으로 수득, 선별할 수 있다. 또한, 자손에게 전달되고 마우스 개체에서 안정한 자연 발생 인간 염색체 단편에 대해서는 보에트(Voet) 등의 보고[Genome Res., 11: 124-136, 2001]에도 기재되어 있다. 또한, 키메라 마우스에 있어서 안정적으로 보유되는 인간 14번 염색체(약 100 Mb), [Tomizuka 등, Nature Genet., 16:133, 1997]나 21번 염색체(약 50 Mb), [시노하라 등, 제45회 일본 인류 유전학회 대회, 2000년 10월]를 출발 재료로 하여, 이것을 염색체 공학적 수법[Kuroiwa 등, Nature Biotech. 18:1086, 2000]에 의해 10 내지 20 Mb 이하의 크기로 축소화할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기한 수법을 이용하여 도입 염색체를 특정한 크기 범위로 축소함으로써, 마우스 개체에 있어서 안정하면서 자손 전달 효율이 높은 인공 염색체를 얻을 수 있다.
예를 들면, 자손 전달 가능한 SC20 벡터에 특정 크기 범위의 목적 유전자 영역만을 전좌, 클로닝하여 구축된 HAC는, SC20 단편의 벡터 효과에 의해 자손에게 전달하는 것이 가능해진다. 이 경우, 전좌에 의해 SC20의 안정 구조가 변화하는 것, 또는 HAC 전체의 크기가 원래 SC20 벡터보다 커질 가능성도 생각할 수 있기 때문에, 전좌시키는 염색체 삽입체(인간 22번 염색체 상의 면역글로불린 λ 유전자를 포함함)의 크기는 λ HAC(10 Mb)보다 작은 크기, 통상 약 3.5 Mb 내지 약 1 Mb, 바람직하게는 약 3 Mb 내지 약 1.2 Mb, 더욱 바람직하게는 약 2.5 Mb 내지 약 1.5 Mb로 할 수 있다. 상기 전좌시키는 염색체 삽입체의 센트로미어(centromere)측의 말단은, 바람직하게는 HCF2 유전자좌이고, 보다 바람직하게는 AP000553 영역[I. Dunham 등, Nature 402:489, 1999]이다. 이러한 엄밀한 염색체의 개변을 위해서는, 인간 22번 염색체와 같이 개변해야 할 염색체의 전체 서열의 해명이 크게 공헌한다. 즉, 전체 인간 염색체의 서열이 분명해지면, 인간 22번 염색체 뿐만 아니라 여러가지 인간 염색체 상의 목적 유전자를 포함하는 주변 영역만을 엄밀하게 SC20 염색체 벡터로 전좌, 클로닝하여 효율적으로 자손 전달시키는 것이 가능해진다.
상술한 바와 같이, 도입 인간 염색체를 마우스 등의 비인간 동물의 자손에게 전달하기 위해서는 몇몇의 장해가 있기 때문에, 특히 인간 22번 염색체 상의 Igλ 유전자 영역을 효율적으로 자손 전달시키기가 곤란하다고 생각되어 왔지만, 본 발명에 의해 상기 과제가 해결된다.
구체적으로는, 본 발명에 의해 인간 22번 염색체 상의 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 2.5 Mb 및 1.5 Mb 영역을 SC20 염색체 벡터에 전좌, 클로닝하여 얻어진 인간 인공 염색체(ΔHAC 및 ΔΔHAC)를 제조하고, 계속해서 ΔHAC 및 ΔΔHAC 각각을 마우스 개체에 도입하고, 키메라 마우스에서의 키메라 비율에 대하여 λ HAC(구로이와 등의 상기 문헌 참조)와 비교하여 키메라 비율의 향상과 인간 인공 염색체의 효율적인 자손 전달의 달성을 확인하였다. 키메라 비율은 키메라 동물에서의 ES 세포의 기여율을 나타내는 것으로, 통상 키메라 동물의 체표면에 있어서 ES 세포에서 유래하는 체모색이 차지하는 비율을 시각적으로 평가함으로써 결정될 수 있다. 이하, 상기 특정예에 대하여 구체적으로 설명한다.
2. ΔHAC, ΔΔHAC 및 트랜스염색체 마우스의 제조와 그의 이용
인간 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 인간 22번 염색체 또는 그의 단편은 이미 알려진 방법으로 수득할 수 있다. 즉, 미크로셀법에 의해 인간 염색체 또는 그의 단편을 마우스 A9세포로 라이브러리화할 수 있다[Koi 등, Jpn. J. Cancer Res. 80:413-418, 1989]. 얻어진 라이브러리로부터, PCR 등에 의해 인간 항체 λ 경쇄 유전자에 특이적인 서열을 검출함으로써 인간 22번 염색체 또는 그의 단편을 보유하는 클론을 선별할 수 있다. 인간 22번 염색체 또는 그의 단편은, 그 후 개변의 편의를 위해, 또는 미크로셀법에 의해 바람직하게는 닭 DT-40 세포(리겐 셀뱅크: RCB1464, ATCC:CRL-2111)에 이입시킬 수 있다.
인간 항체 λ 경쇄 유전자 클러스터는 22번 염색체 상의 22q11.2에 존재한다(예를 들면, [J. E. Collins 등, Nature 377:367, 1995]). 상술한 λ HAC에서는, HCF2 유전자좌로부터 LIF 유전자좌까지의 10 Mb 영역이 염색체 삽입체로서 전좌 클로닝되어 있었다. 상기 10 Mb 삽입체에 있어서, Igλ 유전자 영역보다 텔로미어측에는 7 Mb의, 센트로미어측에는 1 Mb의 여분의 염색체 영역이 포함되어 있다. 따라서, 우선 7 Mb 영역을 제거하기 위해서, 22번 염색체 또는 그의 개변 단편(loxP 서열이 HCF2 유전자좌에 삽입되고, LIF 유전자좌에서 텔로미어 말단절단(truncation)되어 있는 단편)을 Igλ 유전자 영역의 극히 근방 또는 텔로미어측(약 400 Kb 텔로미어측)에 존재하는 AP000344 영역[I. Dunham 등, Nature 402:489, 1999]으로 텔로미어 말단절단(예를 들면, [Kuroiwa 등, Nucleic Acid Research, 26:3447, 1998])함으로써 절단한다. 다음으로, Igλ 유전자 영역의 극히 근방 또는 센트로미어측(약 300 Kb 센트로미어측)에 위치하는 AP000553 영역[I. Dunham 등, Nature 402:489, 1999]에 loxP 서열을 상동성 재조합에 의해 삽입한다. 이러한 개변에 의해 HCF2-Igλ-AP000344 단편(약 2.5 Mb) 또는 AP000553-Igλ-AP000344 단편(약 1.5 Mb)만을 염색체 삽입체로서 SC20 염색체 벡터에 전좌 클로닝할 수 있다. 구축된 HAC는 종래의 방법으로 마우스 ES 세포에 도입한 후 키메라 마우스를 제조할 수 있다. 키메라 마우스에서의 HAC의 보유를 확인한 후 교배하여 자손 마우스를 얻는다. 얻어진 자손 마우스에 있어서 HAC의 보유를 확인함으로써 HAC의 자손 전달을 판정할 수 있다.
본 발명에 의해, ΔHAC에 의한 인간 항체 λ 경쇄 유전자 Igλ 전체 영역의 자손 전달을 통해, 인간 항체 중쇄 유전자와 λ 경쇄 유전자를 모두 보유하는 트랜스염색체 비인간 동물(예를 들면, 마우스 등의 포유동물)의 효율적인 제조가 가능해진다. 이것은 의약품의 후보가 될 수 있는 인간 항체를 생산하는 비인간 동물로서 유용하다고 생각된다. 인간 혈청 중에서 λ 경쇄를 포함하는 항체는 약 40 ％를 차지하는 것, Vλ 유전자 단편의 수(70 개)가 Vκ쇄 유전자(76 개)와 동등한 수가 존재하는 것 등으로 인해, 인간 항체의 다양성 구축에는 λ쇄를 포함하는 항체가 크게 기여하고 있다고 생각된다[Popov, AV., J. Exp. Med., 189:1611, 1999]. 한편, 현재 세계에서 의약품으로서 이용되고 있는 인간화 항체나 인간 항체의 대부분은 그의 경쇄가 κ 경쇄로 이루어져 있다. 본 발명의 ΔHAC, ΔΔHAC 트랜스염색체 마우스는 λ 경쇄를 포함하는 인간 항체 의약 개발에 유용하다. ΔHAC, ΔΔHAC 트랜스염색체 마우스는 이종 염색체 단편의 자손 전달이 가능하기 때문에, 교배에 의해 균일한 형질을 갖은 트랜스염색체 마우스의 대량 생산이 가능하게 될 것이다. 또한, 인간 항체 κ 경쇄 유전자를 포함하는 염색체 단편을 보유하는 마우스[Tomizuka 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, 722-727, 2000], 또는 인간 항체 κ 경쇄 유전자를 포함하는 유전자 변형 마우스[Fishwild et al., Nature Biotechnol., 14: 845-851, 1996]; [Mendez et al., Nature Genet., 15: 146-156, 1997]와 상기 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 트랜스염색체 마우스를 교배시킴으로써, 인간 항체 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 모두로 이루어지는 인간 항체를 생산하는 인간 항체 생산 마우스를 제조하는 것도 가능해진다. 인간 중쇄, κ쇄, λ쇄를 동시에 발현하는 마우스 계통에 대해서는 니콜슨(Nicholson) 등의 보고[J. Immunol., 163: 6898, 1999]가 있다. 그들은 인간 Ig 중쇄, κ쇄, λ쇄의 일부를 각각 포함하는 효모 인공 염색체(YAC)를 도입한 유전자 변형 마우스와 내재성 Ig 중쇄, κ쇄 녹아웃(knock-out) 마우스의 조합으로부터 인간 중쇄/κ쇄, 인간 중쇄/λ쇄 분자를 면역글로불린의 주된 성분으로 하는 마우스를 구축하였다. 그러나, 상기 마우스 계통으로써 발현하는 인간 면역글로불린의 다양성, 분자 구성은 원래 인간의 것과 크게 다르다. 예를 들면 ① 인간 Ig 중쇄 YAC에는 μ, δ 정상 영역만이 포함되고, 상기 마우스 계통에 있어서는 다른 아이소타입, 특히 가장 큰 성분인 Igγ 아이소타입이 발현되지 않으며, ② 3종의 YAC에 포함되어 있는 가변 영역의 수가 적고, 상기 마우스 계통에서 발현하는 인간 항체의 다양성도 한정적이라고 추정된다.
본 명세서에서 개시되는 인간 Ig 중쇄, κ쇄, λ쇄를 동시에 발현하는 마우스 계통에 있어서는, 인간에서 발현되고 있는 항체의 다양성, 분자 구성 등이 보다 충실하게 재현된다. 예를 들면 ① Igγ 아이소타입(4개의 서브클래스 전부)이 발현되고 있고, ② 중쇄, λ쇄, κ 쇄에 대하여 모든 가변 영역을 포함하기 때문에 인간에서의 경우와 동일한 다양성이 재현된다.
이러한 인간 항체 생산 트랜스염색체 마우스를 적당한 항원에 의해 면역화시키고, 그 비장 세포와 마우스 골수종을 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마[안또, 지바, 단클론 항체 실험 조작 입문, 강담사 사이언티픽, 1991]를 ELISA에 의해 스크리닝함으로써, 인간 면역글로불린 중쇄 및 λ 경쇄로 이루어지는 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 의약품용 항체로서 사용할 수 있다.
또한, 감염증 등의 치료용 항체 의약으로서는, 모노클로날 항체보다 폴리클로날 항체 쪽이 치료 효과는 크다고 생각된다. 또한, 인간 폴리클로날 항체는 소위 γ 글로불린 제제로서 개발할 수도 있다. 본 발명에 의해서 구축되는 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 보유하는 ES 세포로부터, 실제로 높은 키메라 비율(약 80 ％ 내지 100 ％, 바람직하게는 약 85 ％ 내지 100 ％)의 키메라 마우스가 얻어지고, 도입 인간 인공 염색체는 고효율로 자손에게 전달되며, 수정란 단계에서부터 자손 마우스로서 태어나는 전체 발생 과정에서 계속 보유되는 것으로 나타났다. 마우스 등의 비인간 동물에게 그것과 이종의 항원을 면역화시킴으로써 대량의 항원 특이적 인간 폴리클로날 항체(인간 λ경쇄 함유 항체)를 생산할 수 있고, 이것은 대량 생산이 어려운 모노클로날 항체를 대신하는 항체 의약으로서 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 인공 염색체는 마우스 뿐만 아니라 다른 비인간 동물, 예를 들면 래트, 돼지 등의 포유류에 도입할 수 있다. 마우스 이외의 동물종에 있어서의 ES 세포 또는 ES형 세포의 수립은, 래트의 경우 문헌[Iannaccone 등, Dev. Biol., 163:288, 1994]에, 돼지의 경우 문헌[Wheeler 등, Reprod. Fertil. Dev., 6:563, 1994]에 보고되어 있고, 송사리, 닭 등에서도 시도되고 있다[트랜스제닉 동물, 단백질 핵산 효소, 1995년 10월호 증간, 공립 출판]. 이러한 ES 또는 ES형 세포를 수용 세포로 하여 인간 인공 염색체를 이입하면, 마우스의 경우와 같이 인간 인공 염색체 또는 그의 단편을 보유하여 상기 인간 인공 염색체 상의 유전자를 발현하는 비인간 동물이 제조 가능하다. 또한, 이러한 비인간 동물을 이용하여 인간 λ 경쇄 함유 항체의 제조도 가능하다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2001-142371호의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
<실시예>
이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예 1 내지 실시예 14에서 인간 22번 염색체 상의 항체 λ 경쇄 유전자 주변 영역 2.5Mb와 1.5Mb를 SC20 염색체 벡터로 전좌 클로닝한 인간 인공 염색체 ΔHAC, ΔΔHAC의 제조에 대하여 설명한다(도 1). 또한, 제조된 각 HAC의 마우스 개체로의 도입 및 HAC의 키메라 마우스 자손으로의 전달에 대하여 설명한다.
<실시예 1> 카세트 벡터 pTELhisD의 제조
카세트 벡터 pTELPuro[구로이와 등, Nature Biotech., 18:1086-, 2000]를 제한 효소 NotI(베링거)로 절단하고, DNA 블런팅 키트(Bluntingkit; 도요보)를 이용하여 72 ℃에서 5 분간 말단을 평활화하였다. 평활화 후, 박테리아 유래 알칼리포스파타제(다까라 슈조)를 이용하여 65 ℃에서 1 시간 동안 탈인산화하였다. 그 후, 제한 효소 BglII 링커(다까라 슈조)를 첨가하고, 라이게이션 키트(다까라 슈조)를 사용하여 라이게이션을 행하였다. 여기서 pTELPuro 플라스미드 중의 PGKPuro 카세트가 BglII 링커로 치환된 플라스미드 pTELBg가 제조되었다. 이 플라스미드를 제한 효소 BglII로 절단하여 동일하게 탈인산화한 후, CHROMA SPIN-TE400(클론테크)을 사용하여 겔 여과함으로써 정제하였다. 이어서, 플라스미드 #1-132(교또 대학, 다께다 쥰이찌 교수로부터 분여)로부터 제한 효소 BamHI로 절단된 hisD 단편을 첨가하고, 동일하게 라이게이션 반응을 행하였다. 여기서 pTELPuro 플라스미드 중의 PGKPuro 카세트가 hisD 카세트로 치환된 카세트 벡터 pTELhisD가 제조되었다(도 2).
<실시예 2> 표적화 벡터 pTELhisDlI의 제조
인간 22번 염색체 상의 Igλ 유전자좌의 극히 근방이면서 텔로미어측(약 400Kb 텔로미어측)에 위치하는 AP000344 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하기 위한 표적화 벡터 pTELhisDλI을 이하와 같이 하여 제조하였다. 우선, AP000344 게놈 영역을 이하의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
<서열 1>
1269D1-F; 5'-TCGAGGATCCGACAAGTTCTCTTCTCTTTTCCTTCTGCCC-3'
<서열 2>
1269D1-R; 5'-TCGAGGATCCGCTGCTAAGCTACTGTTCTCTTTTTTCCCC-3'
PCR은 써멀 사이클러(thermal cycler)로서 퍼킨 엘머(Perkin-Elmer)사 제조의 GeneAmp9600을, Taq 중합효소는 LA Taq(다까라 슈조)를 사용하고, 완충액이나 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 추천되는 조건에 따라 사용하였다. 온도, 사이클 조건은 94 ℃에서 1 분의 열 변성 후, 98 ℃에서 10 초, 68 ℃에서 11 분을 35 사이클행하였다. PCR 산물을 프로테아제 K(깁꼬) 처리한 후, CHROMA SPIN-TE400(클론 테크)로 겔 여과하였다. 그 후, 제한 효소 BamHI(베링거)로 절단하고, CHROMA SPIN-TE1000(클론테크)로 겔 여과하였다. 이 PCR 단편을 플라스미드 pTELhisD의 BamHI 부위에 클로닝하였다. AP000344 게놈 서열의 방향은 센트로미어→텔로미어이기 때문에 클로닝된 AP000344 게놈 단편이 인간 텔로미어 서열과 동일 방향인 것을 목적하는 표적화 벡터 pTELhisDλI로 하였다(도 3).
<실시예 3> 표적화 벡터 p553loxPHyg의 제조
인간 22번 염색체 상의 Igλ 유전자좌의 극히 근방이면서 센트로미어측(약 300Kb 센트로미어측)에 위치하는 AP000553 영역에 Cre 재조합 효소의 인식 서열 loxP을 삽입하기 위한 표적화 벡터 p553loxPHyg를 이하와 같이 하여 제조하였다. 우선, AP000553 게놈 영역을 이하의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
<서열 3>
553-F3; 5'-TCGAGTCGACTGTAGCTGACTTTAGCCACCCACAAGTAC-3'
<서열 4>
553-R3; 5'-TCGAGTCGACCTTGCTGATTATACCTCATCTCCTTCCCTC-3'
PCR은 써멀 사이클러로서 퍼킨-엘머사 제조의 GeneAmp9600을, Taq 중합효소는 LA Taq(다까라 슈조)를 사용하고, 완충액이나 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 추천되는 조건에 따라 사용하였다. 온도, 사이클 조건은 94 ℃에서 1 분의 열 변성 후, 98 ℃에서 10 초, 68 ℃에서 15 분을 35 사이클 행하였다. PCR 산물을 프로테아제 K(깁꼬) 처리한 후, CHROMA SPIN-TE400(클론테크)으로 겔 여과하였다. 그 후, 제한 효소 SalI(베링거)로 절단하고, CHROMA SPIN-TE1000(클론테크)로 겔 여과하였다. 이 PCR 단편을 플라스미드 pBluescriptII(미리 NotI 부위를 결실시킨 후, SacII 부위에 SrfI 링커를 삽입한 것)의 SalI 부위에 클로닝하였다 (pBS553). 이어서, pBS553을 제한 효소 HpaI(베링거)로 절단하여 탈인산화한 후, NotI 링커를 라이게이션에 의해 삽입하였다(pBS553N). pBS553N을 제한 효소 NotI로 절단하여 탈인산화한 후, 카세트 벡터 ploxPHyg로부터 제한 효소 NotI(베링거)에 의해 loxP를 포함하는 DNA 단편을 절단하여 라이게이션하였다. LoxP 서열 방향이 클로닝된 AP000553 게놈 단편과 동일한 방향인 것을 표적화 벡터 p553loxPHyg로 하였다(도 4).
<실시예 4> 닭 DT-40 세포 중에서의 인간 22번 염색체의 부위 특이적 절단
WO98/37757에 기재된 방법으로 제조된 인간 22번 염색체 전장을 보유하는 닭 DT-40 세포(클론 52-18)와 이미 LIF 유전자좌에서 절단을 끝낸 인간 22번 염색체 단편을 보유하는 DT-40 세포(클론 HF38)에 상기 실시예 2에서 제조한 표적화 벡터 pTELhisDλI을 형질감염시키고, AP000344 게놈 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입함으로써 그 삽입 부위에서 22번 염색체를 절단하는 것을 시도하였다.
닭 DT-40 세포의 배양은 10 ％ 소태아 혈청(깁꼬, 이하 "FBS"라고 함), 1 ％ 닭 혈청(깁꼬), 10-4M 2-머캅토에탄올(시그마)을 첨가한 RPMI1640 배지(깁꼬) 중에서 행하였다. 약 107개의 세포를 무첨가 RPMI1640 배지에서 1회 세정하고, 0.5 ㎖의 무첨가 RPMI1640 배지에 현탁하고, 제한 효소 SrfI(도요보)로 선형화된 표적화 벡터 pTELhisDlI를 25-30 ㎍ 첨가하여 전기천공용 큐벳(바이오래드)에 옮겨 실온에서 10 분간 정치하였다. 큐벳을 진 펄서(Gene Pulser; 바이오래드)에 세팅하고, 550 V, 25 μF의 조건으로 전압 인가하였다. 실온에서 10 분간 정치한 후, 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 히스티딘올(0.5 mg/㎖)을 포함하는 배지로 교환하고, 96웰 배양 플레이트 10장에 분주하여 약 2 주간 선택 배양을 행하였다. 히스티딘올 내성 클론으로부터 퓨어진 DNA 단리 키트 (Puregene DNA Isolation Kit; Gentra System사)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하여 HCF2[구로이와 등, Nature Biotech. 18:1086, 2000], Igλ[도미즈까 등, Nature Genet., 16:133, 1997), D22S1174, D22S315, D22S275(BIOS사), LIF[구로이와 등, Nucleic Acid Research, 26:3447-3448, 1998]를 검출하는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 인간 22번 염색체가 AP000344 게놈 영역에서 절단되어 있는 것을 확인하였다.
PCR은 써멀 사이클러로서 퍼킨-엘머사 제조의 GeneAmp9600을, Taq 중합효소는 LA Taq(다까라 슈조)를 사용하고, 완충액이나 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 추천되는 조건에 따라 사용하였다. 온도, 사이클 조건은 94 ℃에서 1 분의 열 변성 후, 98 ℃에서 10초, 56 ℃에서 30 초, 72℃에서 30 초를 35 사이클 행하였다. 52-18을 형질감염시켰을 경우, 48개의 클론을 스크리닝했을 때 1개의 클론(T32)이 목적 클론이었다. HF38을 형질감염시켰을 경우, 96개의 클론을 스크리닝했을 때 2개의 클론(HT69, HT72)이 목적 클론이었다.
또한, AP000344 영역에서 22번 염색체의 절단이 발생했는지의 여부를 FISH 분석에 의해 확인하였다.
인간 22번 염색체가 AP000344 게놈 영역에서 절단되어 있는 것을 시각적으로 판단하기 위해 표적화 벡터 중의 hisD 내성 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 이용한 FISH 분석을 행하였다. 방법은 구로이와 등[Nucleic Acid Research, 26: 3447-3448, 1998]에 따랐다. COT1 염색(로다민 표지, 적색)에 의해 전장의 인간 22번 염색체와 비교하여 T32, HT69, HT72에서는 22번 염색체가 단편화되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, hisD 프로브 유래의 시그널(FITC 표지, 황색)이 텔로미어의 말단에서 검출되었다. 이것은 표적화 벡터가 삽입된 AP000344가 22번 염색체 단편의 텔로미어 말단이 된 것을 나타낸다.
이상의 결과로부터 T32, HT69, HT72에서 인간 22번 염색체가 AP000344 영역에서 절단되어 있다고 결론지었다.
<실시예 5> 닭 DT-40 세포 중에서의 loxPHyg 카세트의 인간 22번 염색체 상으로의 부위 특이적 삽입
상기 HT69, 72에서는 이미 HCF2 유전자좌(Igλ 유전자좌보다도 약 1 Mb 센트로미어측)에 loxP 서열이 삽입되어 있다. 따라서, 클론 T32에서 Igλ 유전자좌의 극히 근방이면서 센트로미어측(약 300Kb 센트로미어측)에 위치하는 AP000553 영역에 상기 실시예 3에서 제조한 표적화 벡터 p553loxPHyg를 형질감염시키고, loxP 서열의 삽입을 시도하였다.
상기와 동일하게 하여 제한 효소 SrfI(도요보)로 선형화된 표적화 벡터 p553loxPHyg를 클론 T32에 형질감염시키고, 하이그로마이신 B(1 mg/㎖)를 포함하는 배지에서 약 2 주간 선택 배양을 행하였다. 하이그로마이신 B 내성 클론으로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이하의 2조의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동성 재조합체의 동정을 행하였다.
<서열 5>
553-F4; 5'-GCTAAGGCACTTCGGTTCTCTTTGTGTTC-3'
<서열 6>
553-R4; 5'-GGTTGTCTTTAAAAGCAGGGATAAGGATG-3'
<서열 7>
553-F5; 5'-AGAAGAAAGGAGTGGGTGCTAAACATTCAG-3'
<서열 8>
553-R5; 5'-GGTTAGATGGCACCAAATGAAAGGAGAAG-3'
PCR은 써멀 사이클러로서 퍼킨-엘머사 제조의 GeneAmp9600을, Taq 중합효소는 LA Taq(다까라 슈조)를 사용하고, 완충액이나 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 추천되는 조건에 따라 사용하였다. 온도, 사이클 조건은 94 ℃에서 1 분의 열 변성 후, 98 ℃에서 10 초, 68 ℃에서 15 분을 35 사이클 행하였다. 69개의 클론을 스크리닝한 결과, 3 클론(553-2, 6, 14)이 상동성 재조합체로서 동정되었다.
<실시예 6> 인간 항체 λ 경쇄 유전자 영역 주변(HCF2-Igλ-AP000344) 2.5Mb를 SC20 염색체 벡터로 전좌 클로닝한 인간 인공 염색체 ΔHAC의 구축
우선, 처음에 상기 실시예 4에서 얻어진 클론 HT72를, SC20 염색체 벡터를 보유하는 DT-40 세포 R 클론[구로이와 등, Nature Biotech. 18: 1086, 2000]과 세포 융합함으로써 인간 22번 염색체 단편과 14번 염색체 단편 SC20 단편 두가지를 보유하는 DT-40 하이브리드를 제조하였다.
(1) 인간 22번 염색체 단편과 SC20 염색체 벡터 두가지를 보유하는 DT-40 하이브리드의 제조
R 클론은 블라스트사이딘 S(10 ㎍/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서, HT72 클론은 하이그로마이신 B(1 mg/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 1 내지 2×107개의 두 클론을 혼합하여 원심분리한 후, 무혈청 RPMI1640 배지에서 2회 세정하였다. 잔량 배지를 완전히 제거한 후, 미리 37 ℃로 보온해 둔 50 ％ PEG 1500(베링거) 0.5 ㎖를 서서히 첨가하여 약 2 분간 피펫으로 세차게 혼합하였다. 그 후, 무혈청 RPMI1640 배지 1 ㎖를 1 분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 이어서 무혈청 RPMI1640 배지 9 ㎖를 약 3 분에 걸쳐 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 정치하였다. 그 후, 1,200 rpm으로 5 분간 원심분리하고, 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 24 내지 48 시간 배양하였다. 그 후, 블라스트사이딘 S(10 ㎍/㎖)ㆍ하이그로마이신 B(1 mg/㎖) 함유 RPMI1640 배지로 교환하고, 24웰 배양 플레이트 5장에 분주하여 3 내지 4 주간 배양하였다. 이중 내성 클론으로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이하의 프라이머를 이용하여 PCR을 행하여 인간 14번 염색체 단편(SC20 염색체 벡터), 22번 염색체 단편 두가지가 보유되어 있는 것을 확인하였다.
인간 14번 염색체 검출용 프라이머:
<서열 9>
VH3-F; 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3'
<서열 10>
VH3-R; 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3'
인간 22번 염색체 검출용 프라이머:
<서열 11>
Igλ-F; 5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3'
<서열 12>
Igλ-R; 5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3'
PCR은 써멀 사이클러로서 퍼킨-엘머사 제조의 GeneAmp9600을, Taq 중합효소는 Ex Taq(다까라 슈조)를 사용하고, 완충액이나 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 추천되는 조건에 따라 사용하였다. 온도, 사이클 조건은 94 ℃에서 1 분의 열 변성 후, 98 ℃에서 10 초, 56 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초를 35 사이클 행하였다. PCR 결과, 6개의 클론(56HT2, 3, 4, 5, 6, 7)이 양성이었다. 또한, 인간 COT1 DNA를 프로브에 사용하여 FISH 분석을 행한 결과, 이들 클론은 모두 2개의 인간 염색체 단편을 독립된 상태로 보유하고 있는 것이 밝혀졌다. 이상의 결과로부터 이들 6개의 하이브리드 클론은 인간 14번 염색체 단편(SC20 염색체 벡터), 22번 염색체 단편 두가지를 보유하고 있다고 판단되었다.
(2) DT-40 하이브리드 클론(56HT2)에서의 인간 22번 염색체 영역(HCF2-Igλ-AP000344) 2.5Mb의 SC20 염색체 벡터로의 부위 특이적 전좌
(2)-1 Cre 재조합 효소 안정 발현 벡터 pBS185Puro의 구축
구로이와 등(상술)의 방법에 따라 인간 염색체간의 부위 특이적 전좌는 Cre-loxP 시스템을 이용하여 행하였다. 이 시스템에서도 이번과 같이 비상동 염색체 사이에서의 재조합 효율은 매우 낮을 것이 예상되기 때문에, Cre 효소를 일시적 발현이 아니라 안정 발현시키는 것을 고려하여 이하와 같은 발현 벡터를 구축하였다.
플라스미드 PGKPuro(WHITEHEAD INSTITUTE, Dr. Peter W. Laird로부터 분여) 중의 NotI 부위를 EcoRI 부위로 치환한 플라스미드로부터 제한 효소 EcoRI로 절단한 PGKPuro 단편을 Cre 재조합 효소 발현 벡터 pBS185(깁꼬) 중의 EcoRI 부위로 클로닝하였다(pBS185Puro).
(2)-2 Cre-loxP 시스템을 이용한 DT-40 하이브리드 클론에서의 인간 22번 염색체 영역(HCF2-Igλ-AP000344) 2.5Mb의 SC20 염색체 벡터로의 부위 특이적 전좌
상기와 동일하게 하여 제한 효소 KpnI(베링거)로 선형화된 Cre 재조합 효소 안정 발현 벡터 pBS185Puro를 56HT2 하이브리드 클론에 형질감염시키고, 24웰 플레이트로 분주하여 퓨로마이신(3 ㎍/㎖)의 존재하에서 약 2 주간 선택 배양하였다. 각각의 웰로부터 게놈을 추출하고, 이하의 2조의 프라이머를 이용한 네스티드 (nested) PCR을 행하여 SC20 염색체 벡터와 인간 22번 염색체 단편 사이에서 전좌가 일어났는가를 검토하였다.
<서열 13>
PGK-1; 5'-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3'
<서열 14>
GFP-1; 5'-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3'
<서열 15>
PGK-2; 5'-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3'
<서열 16>
GFP-2; 5'-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3'
PCR은 써멀 사이클러로서 퍼킨-엘머사 제조의 GeneAmp9600을, Taq 중합효소는 Ex Taq(다까라 슈조)를 사용하고, 완충액이나 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 추천되는 조건에 따라 사용하였다. 우선, 제1 PCR은 94 ℃에서 1 분의 열 변성 후, 98 ℃에서 10 초, 61 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분을 PGK-1과 GFP-1을 프라이머로서 35 사이클 행하였다. 이 반응액의 일부를 주형으로서 98 ℃에서 10 초, 59 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30초를 PGK-2와 GFP-2를 프라이머로서 35 사이클 행하였다. PCR 양성으로 전좌가 확인된 웰 중의 세포 풀(pool)을 107 세포수가 될 때까지 늘려, 풀을 5 ％ FBS와 1 ㎍/㎖의 프로피디움 요오다이드(PI; propidium iodide)를 첨가한 PBS(인산 완충 용액) 4 ㎖에 현탁하고, FACS Vantage(벡톤ㆍ디킨슨)에 의해 분석하였다. 구로이와 등(상술)의 보고에 나타나 있는 바와 같이 loxP 사이에서의 재조합 전좌가 일어나면 GFP 유전자가 재구축되어 발현되기 때문에 전좌가 일어난 세포를 FACS로 검출할 수 있다. GFP 양성이라고 여겨지는 세포 분획의 분류를 2 회 반복하였다. 매회 분류 후의 배향은 하이그로마이신 B(1 mg/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서 행하였다. 그 결과, GFP 양성 세포를 98 내지 99 ％의 순도로 농축할 수 있었다.
이어서, FACS로 클로닝된 GFP 양성 클론(ΔH21)에서 기대한 바와 같이 loxP 사이에서 재조합이 일어난 것을 상기 PGK-2와 GFP-2를 프라이머로서 사용한 PCR에 의해 확인하였다. 또한, 클론 ΔH21에 대하여, 인간 14번 염색체 특이적 프로브(로다민 표지)와 인간 22번 염색체 특이적 프로브(FITC 표지)를 이용한 FISH 분석(구로이와 등, 상술)을 행한 결과, 확실히 인간 22번 염색체 영역이 SC20 염색체 벡터(인간 14번 염색체 단편)로 전좌된 인공 염색체의 존재가 확인되었다.
이상의 결과로부터 클론 ΔH21에서 인간 항체 λ 경쇄 유전자 영역 주변 (HCF2-Igλ-AP000344) 2.5Mb가 SC20 염색체 벡터로 전좌 클로닝된 인간 인공 염색체 ΔHAC가 구축되었다고 결론지었다.
ΔHAC를 보유하는 닭 DT-40 세포(ΔHAC)는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이6)에 2001년 5월 9일자로 국제 기탁되어 수탁 번호 FERM BP-7582가 부여되었다.
<실시예 7> 인간 항체 λ 경쇄 유전자 영역 주변(AP000553-Igλ-AP000344) 1.5Mb를 SC20 염색체 벡터로 전좌 클로닝한 인간 인공 염색체 ΔΔHAC의 구축
상기 ΔHAC에서는 Igλ-HCF2 사이에 약 1Mb의 여분 영역이 아직 잔존하고 있다. 따라서, 엄밀하게 여분의 염색체 영역을 제거하고, Igλ 유전자 영역 주변만을 전좌 클로닝할 목적으로 AP000553-Igλ-AP000344 영역 1.5Mb를 SC20 염색체 벡터로 전좌 클로닝한 인간 인공 염색체 ΔΔHAC를 구축하는 것을 시도하였다.
우선, 처음에 실시예 5에서 얻어진 클론 553-2를 R 클론과 세포 융합함으로써, 인간 22번 염색체 단편과 14번 염색체 단편 SC20 염색체 벡터 두가지를 보유하는 DT-40 하이브리드를 제조하였다.
(1) 인간 22번 염색체 단편과 SC20 염색체 벡터 두가지를 보유하는 DT-40 하이브리드의 제조
R 클론은 블라스트사이딘 S(10 ㎍/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서, 클론 553-2는 하이그로마이신 B(1 mg/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 1 내지 2×107개의 두 클론을 혼합하여 원심분리한 후, 무혈청 RPMI1640 배지에서 2회 세정하였다. 잔량 배지를 완전히 제거한 후, 미리 37 ℃로 보온해 둔 50 ％ PEG 1500(베링거) 0.5 ㎖를 서서히 첨가하여 약 2 분간 피펫으로 세차게 혼합하였다. 그 후, 무혈청 RPMI1640 배지 1 ㎖를 1 분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 이어서 무혈청 RPMI1640 배지 9 ㎖를 약 3 분에 걸쳐 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 정치하였다. 그 후, 1,200 rpm으로 5 분간 원심분리하여 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 24 내지 48 시간 배양하였다. 그 후, 블라스트사이딘 S(10 ㎍/㎖)ㆍ하이그로마이신 B(1 mg/㎖) 함유 RPMI1640 배지로 교환하고, 24웰 배양 플레이트 5장에 분주하여 3 내지 4 주간 배양하였다. 얻어진 하이브리드 클론(예를 들면, 클론 553R1)으로부터 게놈 DNA를 추출하고, 실시예 6과 동일한 프라이머를 사용하여 PCR을 행하여 인간 14번 염색체 단편, 22번 염색체 단편 두가지가 보유되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 인간 COT1 DNA를 프로브에 사용하여 FISH 분석을 행하여 2개의 인간 염색체 단편이 독립된 상태로 존재하고 있는 것을 확인하였다. 이상의 실험으로부터 하이브리드 클론 553R1이 인간 14번 염색체 단편(SC20 염색체 벡터), 22번 염색체 단편 두가지를 보유하고 있다고 결론지었다.
(2) DT-40 하이브리드 클론(553R1)에서의 인간 22번 염색체 영역(AP000553-Igλ-AP000344) 1.5Mb의 SC20 염색체 벡터로의 부위 특이적 전좌
상기와 동일하게 하여 제한 효소 KpnI(베링거)로 선형화된 Cre 재조합 효소 안정 발현 벡터 pBS185Puro를 553R1 하이브리드 클론에 형질감염시키고, 12혈 플레이트로 분주하여 퓨로마이신(3 ㎍/㎖)의 존재하에서 약 2 주간 선택 배양하였다. 각각의 웰로부터 게놈을 추출하고, 이하의 2조의 프라이머를 이용한 네스티드 PCR을 행하여 SC20 염색체 벡터와 인간 22번 염색체 단편 사이에서 전좌가 발생했는가를 검토하였다.
<서열 13>
PGK-1; 5'-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3'
<서열 14>
GFP-1; 5'-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3'
<서열 15>
PGK-2; 5'-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3'
<서열 16>
GFP-2; 5'-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3'
PCR은 써멀 사이클러로서 퍼킨-엘머사 제조의 GeneAmp9600을, Taq 중합효소는 Ex Taq(다까라 슈조)를 사용하고, 완충액이나 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 추천되는 조건에 따라 사용하였다. 우선, 제1 PCR은 94 ℃에서 1 분의 열 변성 후, 98 ℃에서 10 초, 61 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분을 PGK-1과 GFP-1을 프라이머로서 35 사이클 행하였다. 이 반응액의 일부를 주형으로서 98 ℃에서 10 초, 59 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초를 PGK-2와 GFP-2를 프라이머로서 35 사이클 행하였다. PCR 양성으로 전좌가 확인된 웰 중의 세포 풀(DDH5, 6의 2개 풀)을 107 세포수가 될 때까지 늘려, 풀을 5 ％ FBS와 1 ㎍/㎖의 프로피디움 요오다이드 (PI)를 첨가한 PBS(인산 완충 용액) 4 ㎖에 현탁하고, FACSVantage(벡톤ㆍ디킨슨)에 의해 분석하였다. GFP 양성이라고 여겨지는 세포 분획의 분류를 2회 반복하였다. 매회 분류 후의 배양은 하이그로마이신 B(1 mg/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서 행하였다. 그 결과, GFP 양성 세포를 98 내지 99 ％의 순도로 농축할 수 있었다.
이어서, FACS로 클로닝된 GFP 양성 클론(ΔΔH5, 6)에서 기대한 바와 같이 loxP 사이에서 재조합이 일어난 것을 상기 PGK-2와 GFP-2를 프라이머로서 이용한 PCR에 의해 확인하였다. 또한, 클론 ΔΔH5, 6에 대하여 인간 14번 염색체 특이적 프로브(로다민 표지)와 인간 22번 염색체 특이적 프로브(FITC 표지)를 이용한 FISH 분석(구로이와 등, 상술)을 행한 결과, 두 클론 모두 확실히 인간 22번 염색체 영역이 SC20 염색체 벡터(인간 14번 염색체 단편)에 전좌된 인공 염색체의 존재가 확인되었다.
이상의 결과로부터 2개의 클론 ΔΔH5, 6에서 인간 항체 λ 경쇄 유전자 영역 주변(AP000553-Igλ-AP000344) 1.5Mb가 SC20 염색체 벡터로 전좌 클로닝된 인간 인공 염색체 ΔΔHAC가 구축되었다고 결론지었다.
ΔΔHAC를 보유하는 닭 DT-40 세포(ΔΔHAC)는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이6)에 2001년 5월 9일자로 국제 기탁되어 수탁 번호 FERM BP-7581이 부여되었다.
<실시예 8> ΔHAC 함유 DT-40 하이브리드 세포와 챠이니즈 햄스터 CHO 세포와의 세포 융합
구로이와 등(상술)의 보고에 나타나 있는 바와 같이, 구축된 HAC를 마우스 ES 세포에 도입하기 위해, 우선 CHO 세포로의 도입을 시도하였다. 그러나, ΔHAC 함유 DT-40 하이브리드 세포 ΔH21은 미크로셀 형성능이 낮아 ΔHAC의 미크로셀법에 의한 CHO 세포로의 도입(WO00/10383)은 성공하지 못하였다. 따라서, 새로운 시도로서 ΔHAC 함유 DT-40 하이브리드 세포 ΔH21과 CHO 세포와의 세포 융합에 의한 ΔHAC의 CHO 세포로의 도입을 시도하였다.
1 내지 2×107개의 ΔH21 클론과 1×107개의 CHO 세포를 혼합하여 원심분리한 후, 무혈청 DMEM 배지에서 2회 세정하였다. 잔량 배지를 완전히 제거한 후, 미리 37 ℃로 보온해 둔 50 ％ PEG 1500(베링거) 0.5 ㎖를 서서히 첨가하여 약 2 분간 피펫으로 세차게 혼합하였다. 그 후, 무혈청 DMEM 배지 1 ㎖를 1 분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 이어서 무혈청 DMEM 배지 9 ㎖를 약 3 분에 걸쳐 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 정치하였다. 그 후, 1,200 rpm으로 5 분간 원심분리하고, 혈청을 포함하는 F12 배지(깁꼬)에서 24 시간 배양하였다. 그 후, G418(1 mg/㎖)ㆍ하이그로마이신 B(0.6 mg/㎖) 함유 f12 배지로 교환하고, 24웰 배양 플레이트 3장에 분주하여 3 내지 4 주간 배양하였다.
내성 클론으로부터 게놈을 추출하고, 상기 실시예 6과 동일하게 VH3과 Igλ 검출용 프라이머를 이용하여 PCR을 행하였다. 그 결과, 2개의 클론(D15, ΔC30)이 PCR 양성이었다. 또한, 이들 2개의 클론에 대하여 상기 실시예 6과 동일하게 하여 인간 14번 염색체 특이적 프로브와 인간 22번 염색체 특이적 프로브를 이용한 2중 염색에 의한 FISH 분석을 행하여 ΔHAC의 존재를 확인하였다. DT40과 CHO의 융합 세포이지만, DT40 유래의 염색체는 거의 탈락되어 있고, 핵형은 야생형 CHO 세포와 거의 동일하였다. 이로부터 DT40 세포와 CHO 세포의 세포 융합에 의해, 결과적으로는 ΔHAC를 보유한 CHO 클론을 얻을 수 있었다. DT40 클론의 미크로셀 형성능이 낮은 경우의 대체법으로서 유용한 가능성이 시사되었다.
<실시예 9> ΔΔHAC 함유 DT-40 하이브리드 세포로부터의 CHO 세포로의 ΔΔHAC의 도입
ΔΔHAC 함유 DT-40 하이브리드 클론 ΔΔH5, 6의 미크로셀 형성능은 나빠지지 않았기 때문에, 구로이와 등(상술)의 보고에 나타나 있는 바와 같이 미크로셀법을 이용하였다.
DT-40 하이브리드 클론 ΔΔH5, 6을 각각 T225 플라스크(스미론) 8개에서 배양하고, 융합된 시점에서 20 ％ FBS, 1 ％ 닭 혈청, 10-4M 2-머캅토에탄올, 0.05 ㎍/㎖ 콜세미드를 첨가한 RPMI1640 배지로 교환하여 24 시간 더 배양하여 미크로셀을 형성시켰다. 세포를 24 ㎖의 혈청 RPMI1640 배지에 현탁하고, 미리 100 ㎍/㎖의 폴리 L-리신으로 코팅한 원심분리용 25 cm2 플라스크 12개(코닝)에 2 ㎖씩 분주하여 37 ℃에서 1 시간 배양하고, 세포를 플라스크 바닥에 부착시켰다. 배양액을 제거하고, 미리 37 ℃에서 보온한 사이토카라신 B(cytocharacin B)(10 ㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심분리용 플라스크에 채워 34 ℃에서 8000 rpm으로 1 시간 동안 원심분리하였다. 미크로셀을 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터로 정제하였다. 정제 후, 1700 rpm으로 10 분간 원심분리하고, 무혈청 DMEM 배지 5 ㎖에 현탁하였다. 한편, 약 107개의 CHO 세포를 트립신 처리에 의해 떨어뜨리고, 무혈청 DMEM 배지에서 2 회 세정하여 무혈청 DMEM 배지 5 ㎖에 현탁하였다. 다시, 미크로셀을 1700 rpm으로 10 분간 원심분리하고, 상층액을 제거하지 않고 상기 CHO 현탁액 5 ㎖를 서서히 첨가하였다. 원심분리 후, 배양액을 제거하고 PEG1500 용액(베링거) 0.5 ㎖를 첨가하여 약 2 분간 피펫으로 세차게 교반하였다. 그 후, 무혈청 DMEM 배지 10 ㎖를 약 3 분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 37 ℃에서 10 분간 정치하였다. 원심분리 후, 10 ％ FBS 첨가 F12 배지(깁꼬)에 세포를 현탁하고, 24웰 배양 플레이트 5 내지 6장에 분주하여 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 그 후, G418 800 ㎍/㎖ 함유 F12 배지로 교환하여 3 내지 4 주간 선택 배양하였다.
G418 내성 클론으로부터 게놈 DNA를 추출하고, Igλ와 VH3 검출용 프라이머 및 PGK-2, GFP-2 프라이머를 이용하여 상술한 것과 동일한 조건에서 PCR을 행하여 ΔΔHAC를 보유하는 CHO 클론을 동정하였다(예를 들면, ΔΔC10, 13). 또한, 상기 PCR에서 양성이었던 클론에 대하여 인간 14번 염색체, 22번 염색체 특이적 프로브를 이용하여 FISH 분석을 행하고, 시각적으로 ΔΔHAC의 존재를 확인하였다. 이들의 결과로부터 ΔΔHAC를 보유하는 CHO 세포 클론이 얻어졌다고 결론지었다.
<실시예 10> CHO 세포로부터의 ΔHAC 또는 ΔΔHAC의 마우스 ES 세포로의 이입
ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 보유하는 키메라 마우스를 제조하기 위해, 실시예 8, 실시예 9에서 얻어진 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 보유하는 CHO 세포로부터 마우스 ES 세포(야생형 TT2F)로 미크로셀법에 의해 도입하였다.
도미즈까 등[Nature Genet. 16: 133, 1997]의 방법에 따라 약 108개의 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 보유하는 CHO 세포(D15, ΔΔC10, ΔΔC13 등)로부터 미크로셀을 정제하여 DMEM 5 ㎖에 현탁하였다. 약 107개의 마우스 ES 세포 TT2F를 트립신 처리에 의해 떨어뜨리고, DMEM으로 3 회 세정한 후 DMEM 5 ㎖에 현탁하고, 원심분리한 미크로셀에 첨가하여 1250 rpm으로 10 분간 원심분리하여 상층액을 완전히 제거하였다. 침전물을 태핑에 의해 충분히 현탁시키고, 1:1.4 PEG 용액(5 g PEG 1000(와꼬 쥰야꾸), 1 ㎖ DMSO(시그마)를 DMEM 6 ㎖에 용해함) 0.5 ㎖를 첨가하여 약 1 분 30 초간 충분히 교반하였다. 그 후, DMEM 10 ㎖를 서서히 첨가하여 1250 rpm으로 10 분간 원심분리하고, 30 ㎖의 ES 배지에 현탁하여 미리 공급 (feeder) 세포를 뿌려 놓은 직경 100 mm 페트리 접시(코닝) 3 개에 분주하여 배양하였다. 24 시간 후, 300 ㎍/㎖의 G418을 포함하는 배지로 교환하여 약 1 주간 선택 배양하였다.
그 결과, D15 클론(ΔHAC 보유)으로부터는 14개 클론, ΔΔC10(ΔΔHAC 보유)으로부터는 8개 클론, ΔΔC13(ΔΔHAC 보유)으로부터는 8개 클론이 Igλ와 VH3 검출용 프라이머를 이용한 PCR에서 양성이었다. 또한, 인간 COT1 DNA 프로브를 이용하여 FISH 분석(도미즈까 등, Nature Genet. 16:133, 1997)을 행한 결과, COT1 프로브에 의해 특이적으로 검출되는 ΔHAC 또는 ΔΔHAC의 존재가 확인되었다.
이상의 점으로부터 ΔHAC 보유 TT2F 세포가 14개 클론, ΔΔHAC 보유 TT2F 세포가 16개 클론 얻어졌다고 결론지었다.
<실시예 11> 인간 인공 염색체 ΔHAC, ΔΔHAC를 보유하는 키메라 마우스의 제조
실시예 10에서 얻어진 ES 세포 클론을 사용하여 도미즈까 등의 방법[Nature Genet., 16:133, 1997]으로 키메라 마우스를 제조하였다. 숙주로서는 MCH(ICR)(백색, 닛본 구레아사로부터 매입) 또는 항체 중쇄 녹아웃 마우스(도미즈까 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000)의 자웅 교배에 의해 얻어지는 8 세포기 배아를 사용하였다. 주입 배아를 가임신 모체에게 이식한 결과 태어난 자손 마우스는 털색에 의해 키메라인가를 판정할 수 있다. 야생형 TT2F/ΔHAC 클론(TΔ#6, 실시예 10에서 취득)을 주입한 400개의 배아를 가임신 모체에게 이식한 결과, 7 마리의 키메라 마우스(털색에 진한 갈색 부분이 확인됨)가 탄생하였다. 즉, 인간 인공 염색체 ΔHAC를 보유하는 ES 세포주(TT2F)는 키메라 형성능을 보유하고 있음, 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있음이 확인되었다.
상기와 동일하게 하여 실시예 10에서 얻어진 야생형 TT2F/ΔΔHAC 클론(TΔΔ#21)을 주입한 180개의 배아를 가임신 모체에게 이식한 결과, 2 마리의 키메라 마우스 (털색에 진한 갈색 부분이 확인됨)가 탄생하였다. 그 중 1 마리는 백색 부분이 거의 관찰되지 않는 키메라 비율 약 100 ％의 개체였다. 즉, 인간 인공 염색체 ΔΔHAC를 보유하는 ES 세포주(TT2F)는 키메라 형성능을 보유하고 있음, 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있음이 확인되었다.
<실시예 12> 인간 인공 염색체 ΔHAC, ΔΔHAC를 보유하는 ES 세포로부터 제조된 키메라 마우스 체세포에서의 인공 염색체의 보유
실시예 11에서 TT2F/ΔHAC 클론(TΔ#6)으로부터 제조된 키메라 마우스(키메라 비율 약 85 ％)의 꼬리로부터 도미즈까 등의 보고[Nature Genet., 16:133, 1997]에 기재된 방법으로 게놈 DNA를 제조하고, Igλ 및 VH3 검출용 프라이머를 이용한 PCR을 상기와 동일하게 행하여 ΔHAC의 보유를 검토하였다. 그 결과, 2 종의 프라이머 모두 양성이고, 키메라 마우스 체세포에서의 ΔHAC의 보유가 확인되었다. 또한, 키메라 마우스(키메라 비율 약 85 ％) 및 TΔ#6으로부터 제조된 다른 키메라 마우스(키메라 비율 약 90 ％)로부터 혈청을 채취하고, ELISA법[도미즈까 등, Nature Genet., 16:133, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000]에 의해 인간 μ쇄 및 인간 λ쇄 단백질의 발현을 검토하였다. 그 결과, 2 마리의 키메라 마우스 모두 인간 μ쇄, λ쇄 두가지가 양성이었다.
마찬가지로 ΔΔHAC를 보유하는 ES 세포 클론(TΔΔ#21) 유래의 키메라 마우스(키메라 비율 약 100 ％, 실시예 11)의 꼬리 유래 DNA에서도 상기 2종의 프라이머가 양성이고, ΔΔHAC의 보유가 확인되었다. 또한, 상기와 동일한 ELISA 분석에 의해 이 ΔΔHAC 보유 키메라 마우스 혈청에서는 인간 μ쇄, λ쇄 두가지가 양성인 것으로 확인되었다.
λHAC를 보유하는 ES 세포로부터 얻어진 λHAC 보유 키메라 마우스의 키메라 비율은 최고로 약 80 ％였지만, ΔHAC에서는 약 85 ％ 및 90 ％, ΔΔHAC에서는 약 100 ％의 키메라 비율을 갖는 키메라 마우스가 얻어졌다. 보다 높은 키메라 비율의 키메라 마우스의 사용은 보다 높은 효율의 도입 염색체 보유 ES 세포의 생식 세포로의 분화와 이 도입 염색체의 자손 전달을 초래한다고 여겨진다. 즉 ΔHAC, ΔΔHAC의 사용에 의해 항체 면역글로불린 λ쇄 유전자를 포함하는 인간 22번 염색체 단편의 마우스에서의 자손 전달 효율이 높아지는 것이 기대된다.
<실시예 13> 인간 인공 염색체 ΔHAC, ΔΔHAC를 보유하는 키메라 마우스로부터의 인공 염색체 자손 전달
실시예 11에서 TT2F/ΔHAC 클론(TΔ#6)으로부터 제조된 암컷 키메라 마우스 (키메라 비율 약 85 ％)를 MCH(ICR)(백색, 닛본 구레아사로부터 매입) 수컷 마우스와 교배하였다. 키메라 마우스로부터 탄생된 10 마리의 자손 마우스 중 4 마리가 ES 세포 유래의 우성 유전 형질을 보유함을 나타내는 진한 갈색이었다. 즉 ΔHAC를 보유하는 ES 세포주, TΔ#6은 암컷 키메라 마우스에서 기능적인 난세포로 분화된 것이 확인되었다. 진한 갈색 자손 마우스 4 마리 중의 꼬리를 일부 절단하여 그 시료로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 얻어진 DNA에 대하여 Igλ 및 VH3 검출용 프라이머를 이용한 PCR을 상기와 동일하게 행하여 ΔHAC의 보유를 검토한 결과, 4 마리 모두에서 2 종의 프라이머 모두 양성이고, 키메라 마우스 자손에서의 ΔHAC의 보유가 확인되었다. 또한, 4 마리 중 3 마리의 혈청을 채취하여 ELISA법[도미즈까 등, Nature Genet., 16:133, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000]에 의해 인간 μ쇄 및 인간 λ쇄의 발현을 검토하였다. 그 결과, 조사한 3 마리 모두에서 인간 μ쇄, λ쇄 두가지가 양성이었다. 실시예 11에서 TT2F/ΔΔ HAC 클론으로부터 제조된 키메라 마우스로부터의 ΔΔHAC 자손 전달도 동일한 방법으로 확인된다.
ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 각각 보유하고, 자손 전달하는 마우스 계통에서의 각 HAC의 안정적인 보유를 꼬리로부터 제조한 섬유아 세포의 FISH 분석 등으로 검토하였다. 그 결과, 해당 마우스 계통 체세포에서의 각 HAC의 안정 보유가 확인되었다.
또한, ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 보유하여 자손에게 전달하는 마우스 계통에 있어서, 인간 Igλ쇄/중쇄를 포함하는 완전한 인간 항체 분자의 발현은 ELISA법 등으로 확인된다. 또한, ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 보유하여 자손에게 전달하는 마우스 계통을 내재성 항체 중쇄, 경쇄 κ 유전자가 결손된 마우스 계통과 반복하여 교배하고, 각 HAC를 보유하며 내재성 항체 중쇄 및 κ쇄 유전자 결손에 대하여 호모 접합체인 마우스 계통을 얻을 수 있다. 이들 마우스 계통에서는 주로 인간 Ig 중쇄와 λ쇄를 포함하는 완전한 인간 항체가 생산된다.
<실시예 14> 인간 면역글로불린 중쇄, 경쇄 λ, 경쇄 κ를 동시에 발현하는 마우스 계통의 구축
인간 Ig 중쇄, 경쇄 κ, 경쇄 λ를 동시에 생산하고, 인간 Ig 중쇄와 경쇄 κ 또는 경쇄 λ를 포함하는 분자를 주성분으로 하는 항체를 생산하는 마우스 계통은 이하의 (A), (B) 계통간의 교배에 의해 제조할 수 있다.
(A) ΔHAC를 보유하여 자손 전달하는 마우스 계통 TC(ΔHAC), 또는 ΔΔHAC를 보유하여 자손 전달하는 마우스 계통 TC(ΔΔHAC)(실시예 13 참조).
(B) 내인성 항체 중쇄, κ쇄 유전자 결손에 대하여 호모 접합체이고, 2번 염색체 단편 W23을 보유하여 자손에게 전달하는 마우스 계통 TC(W23)/ΔH/Δκ[도미즈까 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000].
계통 (A)와 계통 (B)의 교배에 의해 얻어지는 자손 마우스는 실시예 13 및 도미즈까 등의 보고[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000]에 기재된 방법으로 분석한다. 이 교배에 의해 얻어지는 자손 마우스는 모두 내인성 항체 중쇄 결손, κ쇄 결손에 대하여 헤테로 접합체이지만, 그 중 ΔHAC(또는 ΔΔHAC)를 보유하는 개체와 W23 단편을 보유하는 개체를 교배하여 더 자손을 얻는다. 최종적으로는 내인성 항체 중쇄 결손, κ쇄 결손에 대해서 모두 호모 접합체이고, 또한 ΔHAC(또는 ΔΔHAC) 및 W23 단편을 동시에 보유하는 개체(계통 (D))를 선별한다.
계통 (D)에서의 인간 면역글로불린 중쇄, κ쇄, λ쇄의 발현은 도미즈까 등의 보고[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000] 및 WO98/37757에 기재된 방법으로 확인된다.
<실시예 15> ΔHAC를 보유하며, 내인성 Ig 중쇄, κ쇄 유전자의 두 대립유전자가 모두 파괴된 마우스 계통의 구축
실시예 13에서 제조된 TC(ΔHAC)를 도미즈까 등의 보고[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000]에 기재된 내인성 Ig 중쇄, κ쇄 녹아웃 마우스 계통과 되돌려 교배하고, 얻어진 마우스 개체에 대하여 PCR법, ELISA법을 이용하여 유전자형을 분석하였다(실시예 12 및 도미즈까 등의 보고 참조).
그 결과, ΔHAC를 보유하고, 내인성 Ig 중쇄 녹아웃에 대하여 호모 접합체이며, 또한 내인성 Igκ쇄 녹아웃에 대하여 호모 접합체인 개체(이하, TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ라고 함)를 얻었다.
2 마리의 TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ 개체(8 주령)의 혈청 중에서의 인간 Ig 중쇄 및 λ쇄 단백질의 발현을 구로이와 등의 보고[Nature Biotechnol., 18:1086-, 2000]에 기재된 ELISA법으로 분석한 결과, 각각 인간 Igμ쇄: 430 ㎍/㎖, Igγ쇄: 180 ㎍/㎖, Igλ쇄: 330 ㎍/㎖ 및 인간 Igμ쇄: 720 ㎍/㎖, Igγ쇄: 320 ㎍/㎖, Igλ쇄: 520 ㎍/㎖이었다.
<실시예 16> ΔHAC 및 인간 Igκ쇄 유전자를 포함하는 인간 2번 염색체 단편을 보유하며, 내인성 Ig 중쇄, κ쇄 유전자의 두 대립유전자가 모두 파괴된 마우스 계통의 구축
도미즈까 등의 보고[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000]에 기재된 내인성 Ig 중쇄, κ쇄 녹아웃 마우스의 유전적 배경에 인간 Igκ쇄 유전자를 포함하는 인간 2번 염색체 단편(hCF(W23))을 보유하는 마우스 계통(이하, TC(W23)/ΔH/Δκ라고 함)과 실시예 15에서 제조된 TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ 계통을 교배하고, 얻어진 마우스 개체에 대하여 실시예 15와 동일하게 유전자형을 분석하였다.
그 결과, ΔHAC 및 hCF(W23)를 동시에 보유하고, 내인성 Ig 중쇄 녹아웃에 대하여 호모 접합체이며, 또한 내인성 Igκ쇄 녹아웃에 대하여 호모 접합체인 개체(이하, TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ라고 함)를 얻었다.
또한, TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ 개체의 혈청을 도미즈까 등의 보고[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000] 및 구로이와 등의 보고[Nature Biotechnol., 18:1086-, 2000]에 기재된 ELISA법으로 분석함으로써 인간 Igμ쇄, γ쇄, λ쇄, κ쇄 단백질의 발현이 검출되었다.
<실시예 17> ΔHAC 및 인간 Igκ쇄 유전자를 포함하는 효모 인공 염색체를 보유하며, 내인성 Ig 중쇄, κ쇄 유전자의 두 대립유전자가 모두 파괴된 마우스 계통의 구축
피쉬윌드(Fishwild) 등의 보고[Nature Biotechnol., 14: 845-851, 1996]에 기재된 내인성 Ig 중쇄, κ쇄 녹아웃 마우스의 유전적 배경에 인간 Igκ쇄 유전자를 포함하는 트랜스 유전자(transgene)(KCo5: 인간 κ 경쇄 유전자의 가변 영역의 약 40 ％를 포함함)를 보유하는 마우스 계통(미국 메다렉스(Medarex)사로부터 입수, 이하 KCo5/ΔH/Δκ라고 함)과 실시예 15에서 제조된 TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ 계통을 교배하여 얻어진 마우스 개체에 대하여 실시예 15와 동일하게 PCR법, ELISA법을 이용하여 유전자형을 분석하였다.
그 결과, ΔHAC 및 KCo5를 동시에 보유하고, 내인성 Ig 중쇄 녹아웃에 대하여 호모 접합체이며, 또한 내인성 Igκ쇄 녹아웃에 대하여 호모 접합체인 개체(이하, TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ라고 함)를 얻었다.
또한, 트랜스 유전자 KCo5를 구성하는 효모 인공 염색체와 플라스미드를 보유하는 미생물은 미국 ATCC에 기탁되어 있다. 수탁 번호는 하기와 같다. 효모 인공 염색체 y17을 보유하는 효모: ATCC PTA-3842, 플라스미드 pKV4를 보유하는 대장균: ATCC PTA-3843, 플라스미드 pKCIB를 보유하는 대장균: ATCC PTA-3844.
TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ 개체의 혈청을 실시예 16과 동일하게 ELISA법으로 분석한 결과, 인간 Igμ쇄, γ쇄, λ쇄, κ쇄 단백질이 검출되었다. 또한, 측정한 3 개체에서의 γ쇄의 값의 평균치는 μ쇄의 평균치보다도 높았다.
<실시예 18> TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ 마우스 계통에서의 항 G-CSF 항체 생산
실시예 15에서 제조된 TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ 마우스 2 개체를 인간 G-CSF에 의해 면역화시켰다. 면역보강제로서는 TiterMaxGold(CytRx)를 사용하였다. 첫회에는 총 37.5 ㎍의 인간 G-CSF를 3 군데로 나누어 피하에 면역화시켰다. 2 회째 및 3 회째에는 첫회 면역화 후 14 일째 및 38 일째에 총 10 ㎍를 첫회 면역화와 마찬가지로 3 군데로 나누어 피하에 면역화시켰다. 첫회 면역화 후 48 일째의 최종 면역화는 10 ㎍의 G-CSF를 면역보강제없이 정맥 주사하였다. 최종 면역화로부터 3일 후에 채혈을 행하고, 혈청 중의 항 G-CSF 인간 IgG 항체 역가 및 인간 Igλ 항체 역가를 구로이와 등의 보고[Nature Biotechnol., 18:1086-, 2000]에 기재된 ELISA법으로 측정하였다. 그 결과, 2 개체 모두 항 인간 G-CSF 인간 IgG 항체 역가 및 인간 Igλ 항체 역가의 상승이 관찰되었다.
또한, 상기 면역화된 마우스 개체의 비장 세포와 마우스 골수종 세포를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마[안또, 지바, 단클론 항체 실험 조작 입문, 강담사 사이언티픽, 1991]를 ELISA법에 의해 스크리닝함으로써 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 λ를 포함하는 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있었다.
<실시예 19> TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ 마우스 계통에서의 항 G-CSF 항체 생산
실시예 16에서 제조된 TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ 마우스 개체를 실시예 18과 동일하게 인간 G-CSF에 의해 면역화시켰다. 이 마우스 혈청 중의 항 G-CSF 인간 IgG 항체 역가, 인간 Igλ 항체 역가 및 인간 Igκ 항체 역가를 ELISA법으로 측정하고, 항 인간 G-CSF 인간 IgG 항체 역가, 인간 Igλ 항체 역가 및 인간 Igκ 항체 역가의 상승을 확인하였다.
또한, 실시예 18과 동일하게 상기 면역화된 마우스 개체의 비장 세포와 마우스 골수종 세포를 융합함으로써 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 λ 또는 경쇄 κ를 포함하는 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있었다.
<실시예 20> TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ 마우스 계통에서의 항 G-CSF 항체 생산
실시예 17에서 제조된 TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ 마우스 개체를 실시예 18과 동일하게 인간 G-CSF에 의해 면역화시키고, 혈청 중의 항 G-CSF 인간 IgG 항체 역가, 인간 Igλ 항체 역가 및 인간 Igκ 항체 역가를 ELISA법으로 측정하였다. 그 결과, 항 인간 G-CSF 인간 IgG 항체 역가, 인간 Igλ 항체 역가 및 인간 Igκ 항체 역가의 상승이 확인되었다.
또한, 실시예 18과 동일하게 상기 면역화된 마우스 개체의 비장 세포와 마우스 골수종 세포를 융합함으로써 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 λ 또는 경쇄 κ를 포함하는 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있었다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 삽입된 것으로 간주한다.
본 발명에 의해 인간 항체 중쇄 및 λ 경쇄 유전자 전 영역을 보유하며, 고효율로 차세대에 자손 전달이 가능한 인간 인공 염색체가 제공된다. 또한, 본 발명에 의해 이 인간 인공 염색체를 고효율로 차세대로 자손 전달하는 비인간 동물 및 그의 자손이 제공된다. 또한, 본 발명에 의해 인간 항체의 제조가 가능해진다.
도 1은 인간 인공 염색체 ΔHAC, ΔΔHAC의 제조를 나타낸다.
도 2는 카세트 벡터 pTELhisD를 나타낸다.
도 3은 표적화 벡터 pTELhisDλI을 나타낸다.
도 4는 표적화 벡터 p553loxPHyg를 나타낸다.
<서열목록의 설명>
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<110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> Human artificial chromosomes comprising human antibody light chain λ gene, and non-human animals retaining human artificial chromosome transmittable to progeny <130> PH-1574-PCT <150> JP 2001-142371 <151> 2001-05-11 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 tcgaggatcc gacaagttct cttctctttt ccttctgccc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 tcgaggatcc gctgctaagc tactgttctc ttttttcccc 40 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 tcgagtcgac tgtagctgac tttagccacc cacaagtac 39 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 tcgagtcgac cttgctgatt atacctcatc tccttccctc 40 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gctaaggcac ttcggttctc tttgtgttc 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 ggttgtcttt aaaagcaggg ataaggatg 29 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 agaagaaagg agtgggtgct aaacattcag 30 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 ggttagatgg caccaaatga aaggagaag 29 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 agtgagataa gcagtggatg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 gttgtgctac tcccatcact 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 gagagttgca gaaggggtga ct 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 12 ggagaccacc aaaccctcca aa 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 atagcagctt tgctccttcg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 14 ttctctcctg cacatagccc 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 15 tgttctcctc ttcctactct cc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 16 tgaaggtagt gaccagtgtt gg 22

Claims (15)

  1. (a) 재배열되어 있지 않은 인간 항체 중쇄 유전자좌, (b) 재배열되어 있지 않은 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌 및 (c) 재배열되어 있지 않은 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌 중 하나 이상이 인간 유래 염색체 단편 상에 보유되어 있고, 상기 (a), (b) 및 (c) 중 하나 이상이 마우스 염색체에 삽입되어 있으며, 또한 적어도 내인성 중쇄의 양쪽 대립유전자 및 내인성 κ 경쇄의 양쪽 대립유전자가 불활성화되어 있고, 상기 마우스의 혈청 중에 인간 항체 중쇄, 인간 항체 κ 경쇄 및 인간 항체 λ 경쇄를 발현하는, (a), (b) 및 (c)를 보유하는 인간 항체 생산 마우스.
  2. 제1항에 있어서, 인간 유래 염색체 단편 상에 보유된 재배열되어 있지 않은 인간 항체 중쇄 유전자좌, 마우스 염색체에 삽입된 재배열되어 있지 않은 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌, 및 인간 유래 염색체 단편 상에 보유된 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌를 보유하는 인간 항체 생산 마우스.
  3. 제1항에 있어서, 인간 항체 중쇄 유전자좌가 인간 유래 염색체 단편 상에 보유되는 인간 항체 생산 마우스.
  4. 제3항에 있어서, 인간 항체 중쇄 유전자좌가 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 상에 보유되는 인간 항체 생산 마우스.
  5. 제1항에 있어서, 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌가 인간 유래 염색체 단편 상에 보유되는 인간 항체 생산 마우스.
  6. 제5항에 있어서, 인간 항체 λ 경쇄 유전자좌가 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 상에 보유되는 인간 항체 생산 마우스.
  7. 제1항에 있어서, 인간 항체 κ 경쇄 유전자좌가 마우스 염색체에 삽입된 인간 항체 생산 마우스.
  8. 제7항에 있어서, 인간 항체 κ 트랜스 유전자(transgene) Kco5가 마우스 염색체에 삽입되어 있는 인간 항체 생산 마우스.
  9. 제1항에 있어서, 인간 항체 중쇄 유전자좌 및 λ 경쇄 유전자좌가 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 상에 보유되고, 인간 항체 κ 트랜스 유전자 Kco5가 마우스 염색체에 삽입되어 있는 인간 항체 생산 마우스.
  10. 제1항에 있어서, 마우스가 키메라 마우스가 아닌 것을 특징으로 하는 인간 항체 생산 마우스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 마우스를 면역화시키는 단계, 및 상기 마우스로부터 폴리클로날 항체를 얻는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 폴리클로날 항체가 마우스의 혈액으로부터 얻어지는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 마우스를 원하는 항원으로 면역화시키는 단계, 계속해서 상기 마우스 유래의 비장 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계, 및 상기 항원에 대한 인간 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 마우스를 원하는 항원으로 면역화시키는 단계, 계속해서 상기 마우스 유래의 비장 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계, 이 하이브리도마로부터 인간 항체 유전자의 적어도 가변 영역 부분을 단리하여 상기 인간 항체 유전자를 동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포에 도입하는 단계, 및 이 세포를 인간 항체 유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 배양하여 상기 항원에 대한 인간 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 적어도 가변 영역 부분을 포함하는 모노클로날 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 마우스를 원하는 항원으로 면역화시키는 단계, 상기 마우스의 B 세포에서 유래한 인간 항체 유전자의 적어도 가변 영역 부분을 파지 디스플레이법에 의해 선별하여 선별된 인간 항체 유전자를 동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포에 도입하는 단계, 및 이 세포를 인간 항체 유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 배양하여 상기 항원에 대한 인간 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 적어도 가변 영역 부분을 포함하는 모노클로날 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
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