MXPA06003572A - Metodos y composiciones para definir la funcion genetica. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un proceso para producir y analizar clones de celulas mutadas insercionalmente. Se proporcionan celulas que incorporan mutaciones insercionales. Tambien se proporciona una coleccion de clones de celulas mutadas insercionalmente.

Description

M ÉTODOS Y COMPOSICION ES PARA D EFINI R LA FU NCIÓN GEN ÉTICA La presente solicitud reclama prioridad a la solicitud estadounidense provisional número 60/507,437, presentada el 30 de septiembre de 2003, la cual está incorporada aquí mediante referencia para cualquier propósito.

CAM PO DE LA I NVENCIÓN Se proporcionan métodos para generar y caracterizar mutaciones insercionales en las células. También se proporcionan células q ue i ncorporan establemente mutaciones insercionales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchas terapéuticas humanas (con ciertas excepciones, incluyendo, por ejemplo, antibióticos q ue apuntan directamente al patógeno) interactúan directa o indirectamente con un producto o elemento codificado mediante un conjunto finito de información de secuencia genómica. Consecuentemente, el escrutinio científico se ha dirigido a definir esa parte de la información de secuencia codificada que puede presentar una ruta clara para la intervención médica. Muchos productos terapéuticos actúan modulando la fisiolog ía. De los miles de productos relacionados bioquímica y estructuralmente, codificados dentro del genoma humano, la comunidad científica ha definido claramente los papeles fisiológicos solamente de una fracción de estos productos. Por una variedad de razones, en ciertos casos el ratón ha surg ido como un organism o modelo para caracterizar por sustitución la significación fisiológica de las secuencias biológ icas humanas. Como mam ífero, el ratón comparte muchos de los sistemas de órganos principales de . los seres humanos y con frecuencia modula las funciones de estos sistemas de órganos usando productos ortólogos. Adicionalmente, en ciertos casos, el ratón tam bién permite la ingeniería genética de su genoma . En ciertos casos, la tecnolog ía de células madre embriónicas (ES, según siglas en inglés) de ratón , proporciona un enfoque para la ingeniería cromosómica, y consecuentemente, la prueba directa de hipótesis genómicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En ciertas modalidades, se proporciona un proceso para producir una colección de clones de células de mamíferos m utadas insercionalmente, caracterizadas individualmente. En ciertas modalidades, el proceso comprende infectar células de mamífero con una construcción con trampa genética retroviral. En ciertas modalidades, el proceso comprende además seleccionar clones de células de mamífero incorporando establemente una forma proviral de dicha construcción con trampa genética retroviral. En ciertas modalidades, el proceso comprende adicionalmente identificar in vitro una región de ADN genómico adyacente a la forma proviral integrada de dicha construcción con trampa genética retroviral. En ciertas modalidades, las células de mamíferos están infectadas con una construcción con trampa genética retroviral en una multiplicidad de infección (M.O.I., según siglas en inglés) de menos de 5. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección es menor que 1. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección es menor que 0.5. En ciertas modalidades, la identificación comprende una reacción de cadena polimerasa inversa (IPCR, según siglas en inglés). En ciertas modalidades, la reacción de cadena polimerasa inversa contiene al menos una polimerasa seleccionada de Pfu, Taq, Isis, Vent, Pwo, Phusion, y Tth. En ciertas modalidades, la identificación es por secuenciación de al menos 50 bases de ADN genómico adyacentes a la forma proviral integrada de dicha construcción con trampa genética retroviral. En ciertas modalidades, la identificación no involucra una reacción de transcriptasa inversa. En ciertas modalidades, se selecciona una colección de al menos 10,000 clones de células de mamífero diferentes. En ciertas modalidades, se selecciona la colección de al menos 10,000 clones de células de mamífero diferentes que comprende al menos 10,000 clones de células de mamífero diferentes, que cada una tiene una forma proviral integrada de dicha construcción con trampa genética retroviral en un gen diferente. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de células de mamífero mutadas insercionalmente, caracterizadas individualmente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.

La figura 1 muestra una representación esquemática de una reacción de cadena polimerasa inversa (IPCR). La figura 2 muestra una representación de VICTR 48.

"LTR" es una repetición retroviral de termina! largo. "SA" es un sitio aceptor de empalme. "NEO" es un gen resistente a la neomicina. "pA" es un sitio de poliadenilacíón. "SV40tpa" es la secuencia de poliadenilación triple. "PGK" es un promotor PK. "BTK" y "SD" son el primer exón y el sitio donante de empalme del gen BTK de ratón. El sitio donante de empalme está seguido por una porción del primer intrón del gen BTK. Se indican los sitios de restricción . Un asterisco (*) después del nombre del sitio de restricción, indica que es un sitio único en la construcción. La figura 3 muestra productos de ejemplo de un análisis IPCR de varios clones de células ES atrapadas con gen, tal como se describe en el ejemplo 6.2. La figura 4 muestra la secuencia dé una repetición de terminal largo (LTR) de virus de leucemia murina Moloney, que carece de al menos una parte de la región potenciadora (SEQ ID NO: La figura 5 muestra una LTR, que carece de al menos una parte de la región potenciadora, y también carece de un donante de em palme críptico dentro de la LTR (SEQ I D NO: 6) . La figura 6A-C muestra la secuencia de VICTR 48 (SEQ I D NO: 7).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCIÓN Los títulos de las secciones que se usan aquí, solamente tiene propósitos organizacionales, y no deben ser interpretados como limitantes de la materia del asunto descrito. Todas las referencias citadas en esta solicitud, están incorporadas expresamente mediante referencia aquí para cualquier propósito. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural, a menos que se indique específicamente otra cosa. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o", a menos que se indique otra cosa. Adicionalmente, el uso del término "incluyendo" así como de otras formas, tales como "incluye", e "incluido", no es limitante. En diversas modalidades, se puede usar técnicas estándar para el ADN recom binante, síntesis de oligonucleótidos, cultivo de tejidos, transformación y transfección. En diversas modalidades, se puede realizar reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante o tal como se realizan comúnmente en la técnica o como se describen aquí. En diversas modalidades, las técnicas y procedimientos pueden realizarse generalmente de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la materia, y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que están citadas y que se discuten a través de la presente especificación y/o que son familiares para los conocedores de la materia. Véase por ejemplo, Sambrook y co-autores. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). En ciertas modalidades, se proporciona un proceso para definir el papal fisiológico de las secuencias biológicas codificadas genéticamente (incluyendo, sin limitación a ellas, proteínas, polipéptidos, secuencias de aminoácidos, secuencias de polinucleótidos y secuencias de nucleótidos) dentro del contexto de la biología de mamíferos. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para cultivar y procesar células eucarióticas tal como se generan los clones de células eucarióticas diseñados genéticamente, con inserciones/mutaciones. Las células eucarióticas para su uso en los métodos, en diversas modalidades, incluyen, sin limitación a ellos, células de insectos (incluyendo, sin limitación a ellos, células de Drosophila melanogaster), células de C. elegans, células de roedores (incluyendo, sin limitación a ellos, células de ratón, células de rata y células de hámster), células de pollo, células de primate (incluyendo, sin limitación a ellos, células de mono y células humanas). En ciertas modalidades, las células son manipuladas genéticamente mediante mutación insercional no específica. En ciertas modalidades , se proporcionan métodos para el cultivo y procesamiento de células ES de ratón, tal como se generan los clones de células ES diseñados genéticamente, que tienen inserciones/m utaciones genómicas definidas. En ciertas modalidades, el método no incluye ciertos pasos costosos y/o consumidores de tiempo. En ciertas modalidades, el método puede ser apropiado para la producción en escala comercial de células eucarióticas mutadas, incluyendo, sin limitación a ellas, las células ES de ratón m utadas. Ciertas modalidades se refieren a procesos para cultivar, generar y caracterizar células eucarióticas mutadas, incluyendo, sin limitación a ellos, células ES de ratón mutadas. En ciertas modalidades, las células eucarióticas mutadas pueden usarse para producir organismos capaces de transmisión de l ínea germinal del alelo mutado insercionalmente. En ciertas modalidades, una construcción con trampa genética se integra en un intrón o en un exón de un gen. En ciertas modalidades, las construcciones de trampa genética se diseñan para integrarse preferiblemente en intrones y/o en exones. En diversas modalidades, después de la integración en un intrón o en un exón, la maquinaria de empalme celular empalma secuencias codificadas con construcciones, con una o más secuencias endógenas que son co-transcritas en el mismo ARNm. En ciertas modalidades, una construcción con trampa genética contiene una secuencia que codifica un marcador seleccionable. En ciertas modalidades, la secuencia que codifica el marcador seleccionable no está precedida por un promotor. En ciertas modalidades, la maquinaria de empalme celular empalma una secuencia endógena del gen atrapado en el extremo 5' q ue codifica el marcador seleccionable. En ciertas modalidades, el marcador seleccionable se expresa solamente si la construcción con trampa genética que codifica el marcador seleccionable se ha integrado en un intrón. En ciertas modalidades , el marcador seleccionable se expresa solamente si la construcción con trampa genética que codifica el marcador seleccionable se ha integrado en un exón. En ciertas modalidades, por ejemplo, cuando el gen marcador seleccionable codifica resistencia a los antibióticos, se pueden seleccionar en el cultivo las células que tienen la construcción con trampa genética integrada en sus genomas de tal forma que se exprese el marcador seleccionable. La mutagénesis insercional ejemplar de las células eucarióticas está descrita, por ejemplo, en Friedrich y Soriano, 1991 , Genes Dev. 5 (9): 1513-23 ; Friedrich y Soriano, 1993, Methods Enzymol. 1993 ; 225: 681 -701 ; Publicaciones TCP números WO 98/14614 ; WO 99/07389; WO 99/50426 ; y WO 00/31236 ; y patentes estadounidenses números 5, 364,783; 6,303,327; 6,080,567; 6, 136,566; 6,207,371 ; 6,228,639; 6,436,707; 6,776,988; WO 00/31236 y 6, 139,833; cada una de las cuales está incorporada aquí mediante referencia en su totalidad para cualquier propósito. Ciertas construcciones descritas en las publicaciones y patentes citadas, pueden ser apropiadas para practicar ciertas modalidades de los métodos descritos aquí. En ciertas modalidades , se usa una o más construcciones descritas en las publicaciones TCP números WO 98/14614; WO 99/07389 ; WO 99/50426; y WO 00/31236; y en las patentes estadounidenses números 5 , 364,783; 6, 303, 327; 6,080,567; 6, 136,566; 6,207,371 ; 6 ,228,639; 6,436,707; 6 ,776,988; WO 00/31236; y 6, 139,833, en los métodos descritos aqu í. En ciertos casos, se puede modificar una construcción antes de ser usada para ciertos métodos descritos aquí. Así, en ciertas modalidades, se puede omitir una o más características estructurales de una construcción, o se puede modificar antes de que se use en ciertas modalidades de los métodos descritos aquí. En ciertas modalidades, un conocedor de la materia puede modificar una construcción particular para su uso en ciertos métodos descritos aquí. Se conocen ciertos métodos para usar células ES de ratón modificadas genéticamente, con el fin de producir ratones quiméricos capaces de transmitir la línea germinal de alelos diseñados genéticamente (véase, por ejemplo, entre otras, las patentes estadounidenses números 6,204,061 ; 5,789,215 y 6,087,555, cada una de las cuales está incorporada aquí mediante referencia en su totalidad para cualquier propósito). En ciertas modalidades, las células ES de ratón están co-cultivadas con células de alimentador que han sido diseñadas para expresar el factor inhibidor de leucocitos (LIF). en ciertas modalidades, mediante co-cultivo con estas células alimentadoras, se puede evitar incurrir en el gasto adicional de elaborar y/o comprar LI F exógeno para ser añadido al cultivo. En ciertas modalidades, la presencia de una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno (I RES, según siglas en inglés) colocada operativamente corriente arriba de un marcador seleccionado de una construcción con trampa genética, aumenta la posibilidad de seleccionar un clon de célula mutada , que no tenga integrada la construcción con tram pa genética en la región codificadora de un gen. En ciertas modalidades, la integración den la región codificadora de un gen (es decir, la integración en intrones o exones localizados corriente abajo del codón de iniciación, y corriente arriba del codón de terminación) es una característica de un evento de trampa genética q ue altera o interrumpe la función del gen . Así, en ciertas modalidades, la presencia de un elemento IRES situado funcionalmente corriente arriba de un marcador seleccionable codificado en la construcción con trampa genética no es deseable. Como se usa aquí, un marcador seleccionable es un marcador que proporciona una forma de identificar células que contienen el gen que codifica el marcador. Los marcadores seleccionables incluyen, sin limitación a ellos, marcadores de resistencia a los antibióticos, marcadores productores de luz, y marcadores fluorescentes. En ciertas modalidades, la construcción carecerá de un IRES colocado operativamente corriente arriba del marcador seleccionable.

En ciertos casos , la presencia de u n sitio donante de empalme (SD) crítico, en orientación inversa dentro de una repetición con terminal retroviral largo (LTR) puede aumentar la probabilidad e seleccionar un clon de célula mutada que ha incorporado la construcción con trampa genética proviral fuera de la región codificadora de proteína del gen . En ciertos casos, ciertos vectores derivados del virus de leucemia murina Moloney (MLV) pueden aumentar la probabilidad de seleccionar un clon de célula mutada que tenga incorporada la construcción con trampa genética proviral fuera de la región codificadora de proteínas del gen. En ciertos casos, el sitio SD orientado inversamente puede ser empalmado mediante la maquinaria de empalme celular con un sitio aceptor de empalme (SA, según siglas en inglés) que está colocado operativamente corriente arriba de un marcador seleccionable en la construcción con trampa genética. De acuerdo con esto, en ciertas modalidades, las construcciones con trampa genética están diseñadas para carecer de un sitio SD colocado operativamente corriente arriba de un marcador seleccionable. En ciertos casos, los clones de células ES atrapados genéticamente, son identificados y catalogados usando productos de amplificación rápida 3'- o 5'- de los extremos de ADNc (RACE, según siglas en inglés). En ciertos casos, el ARNm se aisla de una muestra de células ES (en ciertos casos, la cantidad de células ES presentes en un receptáculo "confluente" de una placa para microtitulación de 96 receptáculos), se transcribe inversamente, y se emplea un conjunto anid ado de sensibilizadores en la reacción de cadena polimerasa para prod ucir una plantilla q ue es secuenciada subsig uientemente. En ciertos casos, dadas las dificultades inherentes de trabajar con muestras pequeñas de ARN , estas operaciones pueden funcionar en niveles prácticos de detección o cerca de el los. Así, en ciertos casos, cuando los procedimientos de tipo RACE están adaptados para procesamiento robótico "de alto desempeño", se intercambia aún más sensibilidad para mayor rendimiento. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para identificar un gen que ha sido mutado insercionalmente por una construcción con trampa genética . En ciertas modalidades, el gen ha sido mutado insercionalmente usando un retrovirus diseñado. En ciertas modalidades, el gen ha sido mutado insercionalmente usando una construcción con trampa genética. En ciertas modalidades, al usar ADN genómico como plantilla para la amplificación de PCR inversa, no se usa la "captura" (por ejemplo, enriquecimiento o aislamiento del ARN) y/o transcripción inversa del ARN. Por ejemplo, la automatización de reacciones RACE 3' puede involucrar un método de captura de ARN en fase sólida que utiliza placas para microtitulación de 96 receptáculos derivadas con una porción oligo dT (para "capturar" ARN poliA). Estas placas para microtitulación "a la medida" pueden ser costosas y perecederas. Adicionalmente, en ciertos casos, la transcriptasa inversa también puede ser costosa y perecedera, y por lo tanto indeseable para una prueba de alto desempeño. De acuerdo con lo anterior, en ciertas modalidades, los métodos descritos aquí incluyen un proceso para el análisis de alto desempeño de una colección o biblioteca, de clones de células eucarióticas atrapadas, incluyendo, sin limitación, a clones de células ES atrapadas. En ciertas modalidades, el método no incluye el enriquecimiento o "captura" selectiva del ARN de los clones de células eucarióticas (por ejemplo, usando "aislamiento" con ARN, incluyendo métodos de enriquecimiento de ARN tales como, por ejemplo, el uso de oligo dT para enlazar el ARNm poliadenilado). En ciertas modalidades, el proceso no incluye el uso de transcriptasa inversa para preparar plantillas para secuenciación y/o para identificar secuencias de exón endógenas que flanquean la construcción con trampa genética integrada. En ciertas modalidades, la PCR inversa (IPCR) se usa para análisis de alto rendimiento de células atrapadas genéticamente. Un ejemplo de IPCR se describe, por ejemplo, en Ochman y co-autóres, Genetics 120: 621-623 (1988); Hui y coautores, Methods Mol. Biol. 192: 249-274 (2002); Hui y co-autores, Cell Mol. Life Sci. 54: 1403-1411 (1998) ; Benkel y co-autores Genet. Anal. 13: 123-127 (1996) ; Offringa y co-autores Methods Mol. Biol. 49: 181-195 (1995); y Garces y co-autores Methods Mol. Biol. 161: 3-8 (2001); y en las referencias citadas en ellos, cada uno de los cuales está incorporado aquí mediante referencia para cualquier propósito. Una representación esquemática de un ejemplo de IPCR se muestra en la figura 1. El ADN genómico de una célula atrapada genéticamente se aisla y se digiere con una enzima de restricción, X. Después de la digestión, el ADN genómico se liga para formar círculos intramoleculares. El ADN genómico se somete entonces a una reacción de PCR en la presencia de dos sensibilizadores, A y B. Los sensibilizadores A y B se aparean con las secuencias de construcción con trampa genética, de tal manera que la reacción de PCR amplifica la secuencia genómica que está localizada entre los sitios de apareamiento para los sensibilizadores A y B en el círculo intramolecular. El resultado de la reacción de PCR es un ADN lineal que contiene una secuencia genómica que estaba adyacente a la construcción con trampa genética en el ADN genómico de la célula, flanqueado por secuencias de construcción que se aparean a los sensibilizadores A y B. Uno o ambos de los sensibilizadores A y B pueden usarse para secuencias el ADN genómico. Alternativamente, se puede usar uno o más sensibilizadores, además de los sensibilizadores A y B, o en lugar de ellos, para secuenciar la secuencia genómica en el ADN amplificado. La secuencia del ADN genómico puede usarse entonces en una búsqueda BLAST para identificar el gen en el cual el objetivo atrapado por gen se ha integrado en la célula atrapada por gen. En ciertas modalidades, una reacción IPCR incluye al menos una polimerasa. En ciertas modalidades, una reacción IPCR incluye al menos dos polimerasas. En ciertas modalidades, una reacción IPCR incluye al menos tres polimerasas. En ciertas modalidades , al menos una polimerasa presente en una reacción IPCR es una polimerasa termoestable. En diversas modalidades, las polimerasas que se puede usar en las reacciones I PCR, incluyen, sin limitación a ellas, Pfu, Taq , Isis, Vent, Pwo, Phusion , y Tth. En ciertas modalidades, se usa de 0.005 a 1 unidades por µL de una polimerasa en una reacción I PCR. En ciertas modalidades, se usa de 0.01 a 0.5 unid ades por µL de una polimerasa en una reacción I PCR. En ciertas modalidades, se usa de 0.01 a 0.1 unidades por µL de una polimerasa en una reacción I PCR. En ciertas modalidades, las unidades se definen de acuerdo con la definición del fabricante de la polimerasa . En ciertas modalidades, los sensibilizadores que se aparean con las secuencias de construcción con trampa genética, se seleccionan para la IPCR. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador para que se aparee con una secuencia de construcción con trampa genética adyacente a un sitio de corte con enzima de restricción seleccionado. En ciertas modalidades, se selecciona un segundo sensibilizador para q ue se aparee con un extremo de la construcción con trampa genética de la forma en que está predícho el apareamiento adyacente al ADN genómico en el cual la construcción con trampa genética se ha integrado. Los sensibilizadores se seleccionan, en ciertas modalidades, de tal forma que ambos se aparearán con el mismo pedazo contiguo de ADN después de la digestión por la enzima de restricción . Adicionalmente, en ciertas modalidades, se seleccionan dos sensibilizadores de tal forma que, después de la ligación del ADN digerido en círculos intramoleculares, los sensibilizadores se extenderán en direcciones opuestas alrededor del círculo. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador de tal forma que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté dentro de 100 bases de un sitio de corte de la enzima de restricción seleccionada. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté dentro de 50 bases de un sitio de corte de la enzima de restricción seleccionada. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté dentro de 20 bases de un sitio de corte de la enzima de restricción seleccionada. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté dentro de 10 bases de un sitio de corte de la enzima de restricción seleccionada. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté a más de 100 bases de un sitio de corte de la enzima de restricción seleccionada. Un conocedor de la materia puede seleccionar una longitud de sensibilizador y secuencia apropiadas para la PCR. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté dentro de 100 bases del extremo de la construcción con trampa genética cuando se integra en un genoma celular. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté dentro de 50 bases del extremo de la construcción con trampa genética cuando se integra en un genoma celular. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté deritro de 20 bases del extremo de la construcción con trampa genética cuando se integra en un genoma celular. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté dentro de 10 bases del extremo de la construcción con trampa genética cuando se integra en un genoma celular. En ciertas modalidades, se selecciona un sensibilizador tal que cuando se aparee, el extremo 3' del sensibilizador esté a más de 100 bases del extremo de la construcción con trampa genética cuando se integra en un genoma celular. Un conocedor de la materia puede seleccionar una longitud de sensibilizador y secuencia apropiadas para la PCR. En ciertas modalidades, el uso de PCR inversa (IPCR) para analizar la secuencia genómica que flanquea el sitio de integración de la construcción con trampa genética proporciona suficiente sensibilidad de tal forma que el procedimiento requiere menos material inicial que los métodos basados en RACE para identificar uno o más exones flanqueantes. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se usa menos de 2 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos para generar una plantilla con el fin de identificar una o más regiones flanqueantes del ADN genómico. En ciertas modalidades, se usa menos de 5 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 10 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 20 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 30 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 40 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 50 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 60 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 70 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se usa menos de 80 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidad es, se usa menos de 90 por ciento de las células clónales presentes en un receptáculo confluente de una placa de microtitulación con 96 receptáculos. En ciertas modalidades, la identificación de una o más regiones flanqueantes del ADN genómico , involucra secuenciar la plantilla y comparar su secuencia con datos de secuencia génómica conocidos. En ciertas modalidades, para facilitar la identificación del sitio de integración de la construcción con trampa genética, se secuencia al menos 35 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 40 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 45 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 50 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 70 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 85 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 100 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 150 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 200 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 250 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 350 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 450 bases de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertas modalidades, se secuencia al menos aproximadamente 500 bases o más de ADN genómico de una región que flanquea el sitio de integración. En ciertos casos, los métodos basados en RACE enriquecen la secuencia de exón lejos corriente arriba (para RACE 5'), o corriente abajo (para RACE 3') del sitio de inserción de la construcción con trampa genética. En ciertas modalidades, usando los métodos descritos aquí, las secuencias de exón que están lejos corriente arriba o lejos corriente abajo son menos enriquecidas comparadas con ciertos métodos basados en RACE. En ciertas modalidades, la secuenciación mediada por IOCR de ADN genómico flanqueante, proporciona sensibilidad de secuenciación mejorada. Así, en ciertas modalidades, se puede usar menos células para producir suficiente ADN genómico para la IPCR, lo que deja células disponibles para otros usos y/o para una o más reacciones adicionales de IPCR. En ciertas modalidades, un solo receptáculo de una placa de 96 receptáculos contiene suficientes células tanto para la I PCR como para a l menos otro uso, lo q ue puede inclu ir una o más reacciones I PCR adicionales. En ciertas modalidades, solamente 1 /3 de las células en una placa con 96 receptáculos se usa para producir ADN genómico para I PCR, dejando 2/3 de las células para al menos otro uso . En ciertas modalidades, solamente 1 /4 de las células en una placa con 96 receptáculos se usa para producir ADN genómico para I PCR, dejando 3/4 de las células para al menos otro uso. En ciertas modalidades, solamente 1 /5 de las células en una placa con 96 receptáculos se usa para producir ADN genómico para I PCR, dejando 4/5 de las células para al menos otro uso. En ciertas modalidades, solamente 1 /10 de las células en una placa con 96 receptáculos se usa para producir ADN genómico para IPCR, dejando 9/10 de las células para al menos otro uso. En ciertas modalidades, el uso de I PCR para amplificar la secuencia flanqueante proporciona un producto que es apropiado para la secuenciación. En ciertos casos, una plantilla generada a partir de una reacción RACE requiere un paso de "limpieza" que involucra correr la plantilla a través de una col umna de cromatografía para exclusión por tamaño antes de la secuenciación. En contraste, en ciertas modalidades, una plantilla generada por IPCR no requiere de cromatografía antes de iniciar una reacción de secuenciación. En ciertas modalidades, los métodos de I PCR permiten el uso de formatos de placa con densidades mayores, incluyendo, sin limitación a ellas , placas con 384 receptáculos y otros formatos de placas de alta densidad. Como se usa aquí, "formatos de placa de alta densidad" incluye placas que tienen más receptáculos por área de placa que una placa de 96 receptáculos. En ciertas modalidades, usar formatos de placa de alta densidad mej ora el desempeño automatizado, por ejemplo, aumentando la tasa de rendimiento y/o disminuyendo la cantidad de reactivos usados por muestra analizada. En diversas modalidades, la transferencia de una parte de las células atrapadas genéticamente, por ejemplo, a un formato con 384 receptáculos durante el empalme, proporciona eficiencias aumentando el volumen de los cultivos, disminuyendo la cantidad de reactivos requerida para cada reacción , y/o d isminuyendo la cantidad de placas q ue se manejan y procesan para definir el sitio de inserción genómica de la construcción con trampa genética dentro de los clones de células. En ciertas modalidades, el ADN genómico se obtiene de clones de células atrapadas genéticamente en un formato de 96 receptáculos. En ciertas modalidades, se puede usar las células cultivadas en un formato de 96 receptáculos cuando se desea mayores cantidades de ADN genómico. En ciertas modalidades, se puede realizar una o más de ciertas reacciones subsiguientes, incluyendo, sin limitación a ellas, digestión de restricción, ligación , amplificación de PCR, y secuenciación, en un formato de placa de mayor densidad (por ejemplo, una placa de 384 receptáculos u otro formato de mayor densidad). En ciertas modalidades, se puede emplear formatos de placa estándar, de manera que ciertas placas a utomatizadas/robóticas y dispositivos para el manejo de fluidos se puedan usar durante el procesamiento (estos dispositivos incluyen , sin limitación a ellos, un Biomex Beckman Coulter FX, un Mini Track Packard, etc. , y sus variantes actualizadas o relacionadas). En ciertas moda lidades, ciertas enzimas de " restricción, y/o ciertas combinaciones de enzimas de restricción proporcionan rendimientos mejorados de la plantilla amplificada con I PCR. En ciertas modalidades, se puede usar el mismo par de sensibilizadores específicos para la construcción, para dos o más construcciones diferentes. Así, en ciertas modalidades, se puede usar el mismo par de sensibilizadores específicos para la construcción para sensibilizar una reacción I PCR de plantilla circularizada de primeras células que han sido atrapadas genéticamente con una primera construcción, y para sensibilizar una reacción IPCR de plantilla circularizada de segundas células que han sido atrapadas genéticamente con una segunda construcción. En ciertas modalidades, se puede usar el mismo par de sensibilizadores específicos para la construcción, para sensibilizar una reacción IPCR de plantilla circularizada creada usando una primera enzima de restricción o combinación de enzimas de restricción, y también se puede usar para sensibilizar una reacción I PCR de plantilla circularizada creada usando una segunda enzima de restricción o combinación de enzimas de restricción. En ciertas modalidades, el ADN genómico de células atrapadas genéticamente, es digerido con una enzima de restricción.

En ciertas modalidades, el ADN genóm ico de células atrapadas genéticamente, es digerido con al menos dos enzimas de restricción diferentes en la misma reacción . En ciertas modalidades, el ADN genóm ico de células atrapadas genéticamente, es digerido con al menos tres enzimas de restricción diferentes en la misma reacción. En ciertas modalidades, el ADN genómico de células atrapadas genéticamente, es digerido con al menos cuatro enzimas de restricción diferentes en la m isma reacción. En ciertas modalidades, el ADN genómico de células atrapadas genéticamente, es digerido con al menos cinco enzimas de restricción diferentes en la misma reacción . En ciertas modalidades, el ADN genómico de células atrapadas genéticamente, es digerido con al menos seis enzimas de restricción diferentes en la misma reacción. En ciertas modalidades, la construcción con trampa genética que está integrada en el ADN genómico no es cortada en la reacción de digestión. En ciertas modalidades, la construcción con trampa genética que está integrada en el ADN genóm ico se corta en un sitio de la reacción de digestión. En ciertas modalidades, la construcción con trampa genética que está integrada en el ADN genómico, se corta en dos sitios en la reacción de digestión. En ciertas modalidades, la construcción con trampa genética que está integrada en el ADN genómico, se corta en tres sitios en la reacción de digestión. En ciertas modalidades, la construcción con trampa genética que está integrada en el ADN genómico, se corta en cuatro o más sitios en la reacción de digestión.

En ciertas modalidades, el ADN genómico de las células atrapadas genéticamente, es sometido al menos a dos reacciones separadas, en donde ninguna de las dos reacciones contiene la misma combinación de enzimas de restricción. En ciertas modalidades, el ADN genómico de las células atrapadas genéticamente es sometido al menos a tres reacciones separadas, en donde ninguna de las dos reacciones contiene la m isma combinación de enzimas de restricción. En ciertas modalidades, el ADN genómíco de células atrapadas genéticamente, es sometido al menos a cuatro reacciones separadas, en donde ninguna de las dos reacciones contiene la misma combinación de enzimas de restricción. En ciertas modalidades, un sitio para clonación múltiple (MCS) se incorpora en la construcción con trampa genética. en ciertas modalidades, una enzima de restricción particular cortará la construcción en una o más ubicaciones. En ciertas modalidades, una enzima de restricción particular cortará la construcción en el MCS y en al menos una ubicación fuera del MCS . En ciertas modalidades, se mantiene suficiente secuencia de construcción con trampa genética después de la digestión, para permitir la sensibilización mediante oligos por IPCR. En ciertas modalidades, dos o más enzimas de restricción pueden cortar la construcción con trampa genética en ubicaciones cercanas una de la otra. En ciertas modalidades, se puede usar el mismo par de sensibilizadores específicos para la construcción, para sensibilizar las reacciones de I PCR de plantillas circularizadas de ADN genómico que han sido d igeridas con diferentes enzimas . En ciertas modalidades, la construcción con trampa genética incluye uno o más sitios para una primera enzima de restricción que deja un extremo "pegajoso" que es combatible con el extremo pegajoso dejado por una seg unda enzima de restricción que tam bién corta la construcción con trampa genética en uno o más sitios. En ciertas modalidades, tres o más enzimas de restricción dejan los mismos extremos pegajosos compatibles. Como se usa aquí, un extremo pegajoso se refiere a una proyección 5' o a una proyección 3'. En ciertas modalidades, se deja una proyección de dos nucleótidos después de la escisión. En ciertas modalidades, se deja una proyección de tres nucleótidos después de la escisión. En ciertas modalidades, se deja una proyección de dos nucleótidos después de la escisión. En ciertas modalidades, se deja una proyección de cuatro nucleótidos después de la escisión. En ciertas modalidades, se deja una proyección que tiene más de cuatro nucleótidos después de la escisión. Los ejemplos de ciertos grupos de enzimas de restricción que dejan extremos pegajosos compatibles son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, The New England Biolabs 2003 Catalog , Beverly, MA). Los ejemplos de grupos de enzimas de restricción que dejan extremos pegajosos compatibles incluyen, sin limitación a ellos, Bgll l , BamHI, Bell , y BstYI ; EcoRI, Mfel , y Apol ; Pstl, Nsil , y Sbfl ; ApaLI y Sfcl ; Ncol, BspHI, Real, y Pcil ; Spel , Nhel , Xbal , y Avrll ; Acc651 , BsiWI, y BsrG I ; Acll, Clal , BstBI, HinPl l , Hpal l , y Narl Agel , Xma l, BsaWl, y BspEl ; Mlul, Ascl , y BssH I ; Ascl , Ndel , Msel , y Bfa l ; Pvu l , Pací , y AsiS I ; Eael , Eag l, y Notl ; Xhol , PspXI , y Sal í . U n conocedor de la materia puede identificar miembros ad icionales de los grupos de ejemplo y/o de grupos ad icionales de enzimas de restricción q ue dejan extremos pegajosos compatibles. En ciertas modalidades, se usan menos q ue todos los miembros de un grupo en una reacción . En ciertas modalidades, u na construcción con trampa genética incluye uno o más sitios para una enzima de restricción que deja extremos romos (es decir, una enzima de restricción que no deje proyecciones) . En ciertas modalidades, una construcción con trampa genética incluye al menos un sitio para cada una de al menos dos enzimas de restricción diferentes q ue dejan extremos romos. En ciertas modalidades, se usa una o más enzimas de restricción diferentes que dejan extremos romos en una reacción. Los ejemplos de enzimas de restricción que dejan extremos romos incluyen, sin limitación a ellos, Fspl , Hindi, EcoRV, Hpal , Mscl , Nael, Nrul, Pvull, Seal, Sfol , Smal , SnaBi, y Stul . En ciertas modalidades, una sola copia de la construcción con trampa genética está incorporada en el genoma de una célula. De esta manera, en ciertas modalidades en donde la mutación ocasionada por inserción de la construcción con trampa genética ejerce un efecto negativo dominante, el fenotipo observado puede asociarse con el alelo atrapado por el gen. De manera similar, en ciertas modalidades, el fenotipo observado puede asociarse con el alelo atrapado genéticamente, cuando la mutación ocasionada por inserción de la construcción con trampa genética está presente en el estado homocigótico (por ejemplo, un cromosoma sexual ha sido mutado y/o la célula ha sido manipulada adicionalmente para producir un homocigoto de célula para el alelo atrapado por el gen). En ciertas modalidades, para enriquecer la cantidad de clones de células atrapadas genéticamente, que tienen solamente una construcción con trampa genética incorporada en sus genomas, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es reducida. En ciertas modalidades, se predice (con aproximadamente 95% de certeza) que una m.o.i. de 0.3 (virus:célula) producirá aproximadamente 95% de células que contienen un solo evento de trampa genética, después de la selección de células que tengan al menos una construcción con trampa genética incorporada en sus genomas. En ciertas modalidades, las preparaciones empaquetadas de construcción con trampa genética retroviral se someten a prueba para determinar su habilidad para conferir expresión de un marcador seleccionable codificado para la construcción para las células ES y se determina un título viral. En ciertas modalidades, el título viral se usa para estimar la cantidad de células ES transducidas establemente que serán producidas por una preparación dada de virus empaquetados. En ciertas modalidades, la población de células alimentadoras en ei cultivo también es infectada por el virus. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 100. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 50. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 25. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 10. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 5. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 1. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 0.5. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 0.3. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 0.2. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente 0.1. En ciertas modalidades, la multiplicidad de infección (m.o.i.) es menor que aproximadamente .05. Ciertos métodos para producir retrovirus que albergan construcciones genéticas usando líneas celulares productoras de retrovirus son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Cone y co-autores., (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6349-6353; y Miller y co-autores, (1986) Mol. Cell. Biol., 6: 2895-2902. En ciertas modalidades, se usan líneas celulares productoras de retrovirus que han sido cultivadas activamente durante menos de aproximadamente tres meses, para producir construcciones con trampa genética que alberguen retrovirus. En ciertas modalidades, cuando se usan líneas celulares productoras de retrovirus que han sido cultivadas activamente durante más de aproximadamente tres meses, para prod ucir construcciones con trampa genética q ue albergan retrovirus , la producción de clones de células mutadas (hecha mediante infección con ese retrovirus) a partir de la cual se adquiere la secuencia genóm ica flanqueante, dism inuye. En ciertos casos, las construcciones con trampa genética retroviral se recombinan con las secuencias retrovirales endógenas presentes dentro del genoma de ratón. As í, en ciertos casos , los eve ntos de recombinación pueden acumularse durante el cultivo y paso extendidos. En ciertas modalidades , tales eventos de recombinación ocurren cuando se usa la l ínea celular murina empacada G P + E. En ciertas modalidades, estos eventos de recombinación ocurren en una extensión que interfiere con la generación eficiente de clones de células atrapadas genéticamente, mutadas por los vectores retrovirales deseados. En ciertas modalidades, las existencias retrovirales diseñadas se obtienen de células productoras de retrovirus que han sido mantenidas en cultivo activo durante menos de aproximadamente seis meses. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente cuatro meses. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente tres meses. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente dos meses. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente 1.5 meses. En ciertas modalidades, las cél ulas prod uctoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente un mes. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente 21 d ías . En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo d urante menos de aproximadamente 14 d ías . En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo dura nte menos de aproximadamente 10 días. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo d urante menos de aproximadamente 5 d ías. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente 3 días. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus se han mantenido en cultivo activo durante menos de aproximadamente 2 días. La longitud de tiempo que una célula productora de retrovirus ha sido mantenida en cultivo activo se mide a partir del tiempo en que una célula productora de retrovirus es descongelada y cultivada a partir de una existencia congelada. En ciertas modalidades, las existencias retrovirales para la trampa genética se recolectan después de que las células productoras de retrovirus se cultivan hasta la confluencia. En ciertas modalidades, después de cultivar las células productoras de retrovirus hasta la confluencia, se cambia el medio, y la existencia retroviral se recolecta después de 4 hasta 48 horas. En ciertas modalidades, la existencia retroviral se recolecta después de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 36 horas después de se cambia el med io. En ciertas modalidades, la existencia retroviral se recolecta después de aproximadamente 12 hasta aproximadamente 24 h oras después de q ue se cam bia el medio. En ciertas modalidades , las células productoras de retrovirus pueden ser transfectadas establemente o transitoriamente con un genoma retroviral diseñado genéticamente. En ciertas modalidades, las células productoras de retrovirus transfectadas transitoriamente, contienen un genoma viral diseñado genéticamente q ue al menos parcialmente está presente episomáticamente. En ciertas modalidades, los métodos permiten la generación eficiente de una colección de clones de células atrapadas genéticamente que tienen mutaciones «n el genoma. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de clones de células mutadas, de cuyas mutaciones se ha identificado al menos 5,000 genes diferentes, caracterizados por la identificación de una o más regiones de secuencia de ADN genómico que flanquean el sitio de integración de la construcción con trampa genética. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de células de clones mutadas, de cuyas mutaciones se han caracterizado al menos 7,000 genes diferentes. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de células de clones mutadas, de cuyas mutaciones se han caracterizado al menos 10,000 genes diferentes. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de células de clones mutadas, de cuyas mutaciones se han caracterizado al menos 15,000 genes diferentes. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de células de clones mutadas, de cuyas mutaciones se han caracterizado al menos 20,000 genes diferentes. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de células de clones mut.adas, de cuyas mutaciones se han caracterizado al menos 25,000 genes diferentes. En ciertas modalidades, se proporciona una colección de células de clones mutadas, de cuyas mutaciones se han caracterizado al menos 30,000 genes diferentes. En ciertas modalidades, la colección de clones de células mutadas son clones de células ES mutadas. Los siguientes ejemplos se proporcionan con propósitos ilustrativos solamente, y no deben ser interpretados como limitantes de la presente invención en manera alguna.

EJEMPLOS PRODUCCIÓN DE CIERTAS CÉLULAS ES ATRAPADAS GENÉTICAMENTE Se mutaron células madres embriónicas (células Lex-1 derivadas de lá cepa A129-Sv/Ev murina), mediante infección con la construcción con trampa genética retroviral VICTR48 con un m.o.i. de aproximadamente 0.3 de acuerdo con el método descrito en Zambrowicz et al. (1998) Nature, 392: 608- 11. Una representación esquemática de VICTR48 se muestra en la figura 2. La secuencia de VICTR48 se muestra en las figuras 6A-C (SEQ ID NO: 7). Se predijo que aproximadamente 95 por ciento de los clones ES que se integraron establemente a la forma proviral de la construcción, contenían un solo evento de integración. Después de seleccionar los clones de ES que se incorporaron establemente a la construcción usando selección G418, las células seleccionadas se sembraron en células alimentadoras irradiadas (células SNL, las cuales expresan establemente LIF), y se cultivaron hasta la confluencia. Los receptáculos confluentes fueron divididos subsiguientemente 1 hasta 3 en tres placas de 96 receptáculos, y nuevamente se dejaron crecer hasta la confluencia. Dos de las placas resultantes se conservaron criogénicamente, y la tercera placa se procesó como sigue.

ANÁLISIS DE LAS CÉLULAS ES ATRAPADAS GENÉTICAMENTE Se eliminó el medio y se enjuagaron las células dos veces con 100 µL de PBS. Se añadió 50 µL de solución de lisis (50 mM de Tris, con pH de 7.5, 50 mM de EDTA con pH 8.0, 100 mM de NaCI, 1% de SDS, y 2 mg/mL de proteinasa K) a cada receptáculo, se selló la placa, y se incubó la placa a 65 °C durante la noche. Se añadió 150 µL de etanol al 95% a cada receptáculo, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se aspiró el supernadante y se lavó con 150 µL de etanol al 70%. Se aspiró el etanol al 70-5, se lavó y se dejó secar los receptáculos durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió 200 µL de TE (10 mM de Tris, con pH 8.0, 1 mM de EDTA) a cada receptáculo, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche para rehidratar suavemente el ADN genómico. Se transfirió 10 µL de cada ADN genómico a cada una de las seis nuevas placas de 96 receptáculos para la digestión con endonucleasa. Se preparó seis mezclas de digestión, una para cada de las seis diferentes enzimas de restricción o combinaciones de enzimas de restricción, las cuales son BamHl, EcoRI, Hindlll, Ncol, BamHI/BglII, y EcoRI/Mfel. Cada mezcla de digestión contiene 0.125 unidades/µL de enzima de restricción en el regulador de pH de la reacción 1X recomendado por el fabricante, con BSA 1X Para cada mezcla de digestión, se añade 30 µL de mezcla de digestión a cada receptáculo de la placa de digestión. Se sellan las placas de digestión y se incuban a 37 °C durante 4 horas durante la noche. Las reacciones de digestión que contienen enzimas de restricción que no pueden ser inactivadas por calor se incuban durante la noche. Las placas de digestión se incuban luego a 65 °C durante 20 minutos. Se añade 110 µL de mezcla de ligación (2.7 unidades/µL (concentración final en cada reacción) de ligasa de ADN T4 en regulador de pH de la reacción 1X recomendado por el fabricante) a cada receptáculo de cada placa de digestión. Se sellan las placas y se incuban a 15 °C durante la noche. Luego se añade aproximadamente 10 µL de cada producto de ligación a los receptáculos de una nueva placa de 96 receptáculos para su uso como plantilla para PCR. La plantilla para secuenciación se genera añadiendo 40 µL de mezcla para PCR de la primera serie a cada receptáculo. La mezcla para PCR de la primera serie contiene 0.05 unidades/µL (concentración final en cada reacción) de polimerasa de ADN Taq en el regulador de pH para PCR 1X recomendado por el fabricante, 1.5 mM de MgCI2, 200 nM de cada dNTP, 1 M de betaína, y 0.1 pmol/µL de cada sensibilizador de primera serie. Los sensibilizadores de primera serie son: directo: 5'TGAGTCAAAACTAGAGCCTGGACC 3' (SEQ ID NO: 1), inverso: 5'AGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCG 3' (SEQ ID NO: 2). Se sellan las placas y se ciclan en termocicladores MJ. La PCR dé la serie 1 es como sigue. El ADN se desnaturaliza a 95 °C durante 2 minutos, y se pre-aparea a 80 °C durante 3 minutos. Luego se someten las placas a 15 ciclos de 94 °C durante 30 segundos seguido por apareamiento durante 3 minutos. La temperatura de apareamiento en el primer ciclo es de 70 °C, y luego se reduce la temperatura de apareamiento en 0.5 °C por ciclo subsiguiente. Luego se someten las placas a 20 ciclos de 94 °C durante 30 segundos seguido por apareamiento a 62 °C. El tiempo de apareamiento para el primer ciclo es de 3 minutos, y luego el tiempo de apareamiento se aumenta en 1 segundo por ciclo. Se transfiere aproximadamente 2 µL del producto de la reacción PCR de la primera serie, a una nueva placa y se usa como una plantilla para la PCR de la segunda serie. Para la segunda serie, se añade 23 µL de PCR de la segunda serie a cada receptáculo. La mezcla para PCR de la segunda serie contiene 0.05 unidades/µL (concentración final en cada reacción), polimerasa de ADN TAQ en el regulador de pH para PCR 1X recomendado por el fabricante, 1.5 mM de MgCI2, 200 nM de cada dNTP, 1 M de betaína, y 0.1 pmol/µL cada sensibilizador de la segunda serie. Los sensibilizadores de la segunda serie son: Directo: 5'AAATTGGACTAATCGATACCGTCG 3" (SEQ ID NO: 3), Inverso: 5'GAGTGATTGACTACCCGTCAGCG 3' (SEQ ID NO: 4) Se sellan las placas y luego se ciclan en termocicladores MJ tal como se describió anteriormente para la serie 1. La figura 3 muestra ejemplos de productos de IPCR para cinco clones de células ES atrapadas genéticamente, usando las seis enzimas de restricción descritas anteriormente. En ese experimento, la combinación de BamH I y Bgl II dio como resultado el producto de la PCR para cuatro de los cinco clones. Se transfiere aproximadamente 1 µL del producto de la PCR de la segunda serie a una nueva placa de 96 receptáculos y se añade 9 µL de mezcla de secuenciación (1/8 de una reacción estándar Applied Biosystems Big Dye versión 1.1) a cada receptáculo. La plantilla se secuencia r usando 1 µM del sensibilizador inverso de la segunda serie (SEQ ID NO: 4). Para la secuenciación, se someten las placas a 25 ciclos de PCR a 94 °C durante 45 segundos, 52 °C durante 15 segundos, y 60 °C durante 2 minutos. Las reacciones de secuenciación terminadas se limpian antes de la electroforesis usando placas sephadex de 96 receptáculos (placas Millipore Multiscreen de 96 receptáculos que contienen Sephadex G-50 Fine hidratado de Amersham Biosciences), las cuales se centrifugan a 2000 rpm durante 5 minutos. Las reacciones eluidas se secan y luego se resuspenden en 8 µL de agua. Luego se carga la resuspensión en 8 µL de agua. Luego se carga la resuspensión en un analizador de ADN ABI Prism® 3700 (Applied Biosystems) con RunModule "MGCore". Las secuencias resultantes se depositan en formato FASTA en una base de datos local disponible para la búsqueda BLAST. Además, los datos de secuencia para los clones se alinean mediante BLAST para obtener una sola secuencia de consenso que se pueda usar para mapear cada mutación al genoma de ratón.

RESULTADOS DEL ANÁLISIS USANDO Bg1ll/BamHI v IPCR Los ejemplos de resultados muestran que emplear un solo par de enzimas (Bg1 ll/BamHI) produce secuencia (longitud promedio mayor q ue aproximadamente 250 pares base) en aproximadamente 60 por ciento de los clones de células ES que son examinados usando este método. En los resultados del ejemplo, otras enzimas producen secuencias como sigue: Ncol produce secuencia en 20 por ciento de los clones de células ES examinados; Hind l l l produce secuencia en 23 por ciento de los clones de células ES examinados; y EdoRI produce secuencia en 14 por ciento de los clones de células ES exam inados. La producción neta de los clones de cél ulas ES para los cuales se obtiene la secuencia en los ejemplos de resultados es de aproximadamente 85 por ciento (algunos clones de células ES producen secuencia para más de una enzima y/o combinación de enzimas).

ELIMINACIÓN DE DONANTE DE EMPALME CRÍPTICO DE LA LTR La repetición de terminal largo del virus de leucemia murina Moloney puede modificarse borrando al menos una parte de la región potenciadora (figura 4, SEQ ID NO: 5). La LTR del virus de leucemia murina Moloney puede modificarse adicionalmente borrando un donante de empalme críptico dentro de la LTR, además de al menos una parte de la región potenciadora (figura 5, SEQ ID NO: 6). En ciertos casos, el donante de empalme potenciador y/o críptico puede funcionar en la orientación inversa de la transcripción retroviral normal. En ciertas modalidades, borrando el donante de empalme críptico con orientación inversa, se potencia la fidelidad de obtención de eventos de trampa con genes dentro de los genes. La presente invención no debe ser limitada en alcance por las modalidades específicas descritas aquí, las cuales solamente tienen la intención de servir como ilustraciones de ciertos aspectos de ciertas modalidades de la invención, y los métodos y componentes equivalentes funcibnalmente están dentro del alcance de la invención. Sin duda, diversas modificaciones, además de las que se muestran y describen aquí, serán evidentes para los conocedores de la materia a partir de la descripción precedente. Se pretende que estas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas, están incorporadas aquí mediante referencia en su totalidad para cualquier propósito.

Claims (10)

REIVINDICACIO NES

1. Un proceso para producir una colección de clones de células de mamíferos mutados insercionalmente, caracterizados individualmente, que comprende: a) infectar células de mamífero con una construcción con trampa genética retroviral en una multiplicidad de infección de menos de 5; b) seleccionar clones de células de mamífero que incorporen establemente una forma proviral integrada de dicha construcción con trampa genética; y c) identificar in vitro una región de ADN genómico adyacente a la forma proviral integrada de dicha construcción con trampa genética retroviral, caracterizado porque la identificación no involucra una reacción de transcriptasa inversa.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha multiplicidad de infección es menor que 1.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha multiplicidad de infección es menor que 0.5.

4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha identificación es por secuenciación de al menos 50 bases de ADN genómico adyacentes a la forma proviral integrada de dicha construcción con trampa genética retroviral.

5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado además porque se selecciona una colección de al menos 10,000 clones diferentes de células de mamífero.

6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado además porque la colección de al menos 10,000 clones de células de mamífero diferentes comprende al menos 10,000 clones diferentes de células de mamífero, cada de las cuales tiene una forma proviral integrada de dicha construcción con trampa genética retroviral en un gen diferente.

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque la identificación comprende una reacción de cadena polimerasa inversa (IPCR).

8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado además porque la reacción de cadena polimerasa inversa incluye al menos una polimerasa seleccionada de Pfu, Taq, Isis, Vent, Pwo, Phusion y Tth.

9. Una colección de clones de células de mamífero mutadas insercionalmente, producidos mediante el proceso de la reivindicación 1.

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado además porque la reacción de cadena polimerasa inversa no incluye polimerasa Pushion.