CN108431226A - 基因修饰测定 - Google Patents
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Abstract
在某些实施方案中,本文提供了基于核酸的工具,其可以用于高通量功能性基因组学研究以及用于制备敲除的(基因失活或缺失)或敲入的(基因活化或插入)细胞系。本发明的工具包括“可活化报告盒”、指导RNA构建体和核酸酶,它们可以一起使用,例如,以修饰和分离被靶向的目标细胞。
Description
相关申请
本申请要求2016年1月15日提交的美国临时申请号62/279,337在美国法典第35篇第119(e)条下的权益,该申请通过引用整体并入本文。
背景
簇集的、规则间隔的、短回文重复(CRISPR)-相关的蛋白9 (Cas9)系统是一种用于哺乳动物细胞中的精确基因组编辑的技术。越来越多的数目的研究成功地利用CRISPR技术以混合的或排列的方式执行基因筛选,最常见地通过指导RNA文库的慢病毒递送。Cas9和指导RNA文库的基于病毒的递送的关键优点是:在宽范围的细胞类型中的高转导效率,在混合表型筛选的下游是通过下一代测序可检测的,和使用抗生素选择标记富集转导的细胞的可能性。
发明概述
在某些实施方案中,本文提供了基于核酸的工具,其可以用于高通量功能性基因组学研究以及用于制备敲除的(基因失活或缺失)或敲入的(基因活化或插入)细胞系。本发明的工具包括“可活化报告盒”、指导RNA构建体和核酸酶,它们可以一起使用,例如,以修饰和分离被靶向的目标细胞。如在下面更详细地讨论的,可活化报告盒包括侧接两个选择标记基因的核酸酶识别位点(NRS)。例如,第一个选择标记基因通常是无启动子的(没有可操作地连接至启动子),且可以用于以最小的随机整合风险选择经修饰的细胞(例如,敲入的或敲除的细胞),且第二个选择标记基因(其在NRS的下游且在框架外构建)可以用于在筛选过程中富集被靶向的细胞。在所述可活化报告盒整合进内源性表达的目标基因的内含子以后,第一个(上游)选择标记基因的转录被活化。所述第一个选择标记从该基因的内源性启动子转录。通过位于两个选择标记基因之间的核酸酶识别位点的核酸酶切割而调节第二个(下游)选择标记基因的转录。该位点的切割会导致第二个选择标记从框架外向框架内的重构,从而允许它从位于上游的内源性启动子转录。
因而,第一个(上游)选择标记基因的表达指示所述可活化报告盒整合进内源性表达的目标基因中,且第二个(下游)选择标记基因的表达指示所述核酸酶识别位点的切割。
通常,用于基因修饰测定的细胞例如含有可活化报告盒和指导RNA (gRNA)构建体(例如,用其共转染)。gRNA构建体编码至少两种不同的gRNA:一种靶向可活化报告构建体的核酸酶识别位点(与其互补)的gRNA,和至少一种靶向目标基因中对该目标基因特异性的位点的gRNA。切割核酸酶识别位点的核酸酶也被用在本文提供的方法中。在某些实施方案中,所述可活化报告盒包括编码切割核酸酶识别位点的核酸酶的核酸。在其它实施方案中,所述gRNA构建体包括编码所述核酸酶的核酸。在其它实施方案中,可以将编码所述核酸酶的核酸在单独的(独立地复制的)载体上引入细胞中。在其它实施方案中,可以将切割核酸酶识别位点的核酸酶直接引入(例如,作为经纯化的蛋白)表达可活化报告盒和gRNA构建体的细胞中,或可以由所述细胞表达。
图1A显示了可以如何实施本发明的不同工具来鉴别(例如,筛选)失活的目标靶基因的一个实施例。如在图1A所示的实施方案中所示,将可活化报告盒插入细胞的AAVS 1基因座中,并且它的表达由位于AAVS 1基因座处的内源性启动子驱动。该盒含有核酸酶识别位点(NRS 1),其侧接编码嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(其赋予对嘌呤霉素的抗性)的上游选择标记基因和编码杀稻瘟素S脱氨酶(其赋予对杀稻瘟素S的抗性)的下游框架外选择标记基因。目标内源基因(基因X)也含有核酸酶识别位点(NRS2),尽管NRS2的序列不同于NRS 1的序列。还描述了与靶向NRS 1的gRNA有关的核酸酶(例如,Cas9或Cpf1)和与靶向NRS2的gRNA有关的核酸酶。每种gRNA将所述核酸酶引导至各自的核酸酶识别位点。
在没有识别和切割核酸酶识别位点的核酸酶存在下,可活化报告盒的下游(框架外)选择标记基因不会表达,且目标全长基因被表达。在有识别和切割核酸酶识别位点的核酸酶存在下,在所述位点的切割后,下游选择标记基因发生重构,使得它是在框架内且表达,并且目标基因不再被表达。下游选择标记基因(其仅在可活化报告盒(在NRS 1处)的切割后表达)的表达充当目标基因也被切割和可能被失活(在NRS2处)的指示。
本发明的构建体和方法可以用于,例如,促进排列的或混合的形式筛选指导RNA文库,或促进单一和指导RNA的克隆和表达,从而允许有成本效益的基于质粒的指导RNA(gRNA)文库的制备。此外,在某些实施方案中,本发明的构建体和方法可以用于增强负选择筛选和合成致死性筛选。
因而,本发明的一些实施方案提供了经工程改造的核酸构建体,其包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。在某些实施方案中,所述上游选择标记基因是无启动子的。在某些实施方案中,所述上游选择标记基因可操作地连接至启动子。
本发明的一些实施方案提供了细胞,其包含:(a)目标靶基因,其包含至少一个对所述目标基因特异性的核酸酶识别位点(NRS),(b)经工程改造的核酸构建体,其包含DNA-BDRS和可活化报告盒,所述报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的NRS,和(c)结合所述DNA-BDRS的可编程的核酸酶。在某些实施方案中,细胞进一步包含与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA。在某些实施方案中,细胞进一步包含切割所述可活化报告盒的NRS和切割所述目标基因的NRS的核酸酶。
本文还提供了本发明的细胞群体以及包含细胞培养基和细胞群体的培养物。
本发明的一些实施方案提供了细胞,其表达:(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,(c)核酸酶,其切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点并切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点,和(d)与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA。
本发明也提供了生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(c)核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
一些实施方案提供了生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:(a)用至少一种经工程改造的核酸转染第一细胞群体,所述细胞表达(i)第一目标靶基因,其包含对所述第一目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)核酸酶,其切割(a)(i)的核酸酶识别位点和(a)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(a)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA;和(b)用至少一种经工程改造的核酸转染第二细胞群体,所述细胞表达(i)包含核酸酶识别位点的第二目标靶基因,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)核酸酶,其切割(b)(i)的核酸酶识别位点和(b)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(b)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
一些实施方案提供了生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:向细胞中引入至少一种经工程改造的与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,所述细胞表达:(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(c)核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
本文还提供了生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
本发明进一步提供了生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用经工程改造的核酸构建体转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点并切割可活化报告盒的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
本文进一步提供了生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用经工程改造的核酸构建体转染细胞,所述细胞表达目标靶基因,所述目标靶基因包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
附图说明
图1A显示了本发明的排列筛选方法的一个实施例的示意图。将一种含有人工核酸酶(识别)切割位点(“CrNRS 1”)且靶向AAVS 1基因座的可活化报告物转染(例如,稳定地转染)进表达Cas9核酸酶(或类似核酸酶)和目标靶基因(“基因X”)的细胞中,所述目标靶基因含有对所述目标基因特异性的核酸酶切割位点(“CrNRS2”)。所述可活化报告物含有无启动子的选择标记基因(“Puro”)和框架外选择标记基因(“BSD”),其仅在CrNRS 1位点的切割以后被表达。在某些情况下,在本文中将含有侧接无启动子的选择标记基因和框架外选择标记基因的CrNRS 1切割位点的构建体称作“REM插入缺失盒(REMindel)”。然后将编码对CrNRS 1和CrNRS2特异性的指导RNA (gRNA) (例如,单gRNA、双gRNA或多个gRNA)的核酸转染进目标细胞中。然后针对BSD (的表达)的活化选择细胞。例如,可以在表达BSD的细胞上执行表型分析。图1B显示了gRNA-NRS2—gRNA-NRS 1—Cas9构建体的一个实施例的示意图。
图2显示了用于产生表达可活化报告盒的细胞系的构建体的实施例的示意图。
图3显示了Cas9和gRNA-表达质粒的示意实施例。
图4显示了本发明的可活化报告盒的一个实施例。
图5A显示的示意图描绘了两个核酸酶识别靶位点(Cr1和Cr2)的位置和用于扩增周围区域的引物。图5B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向MAP3K1基因(SEQ ID NO: 1-6, 左图, 从上至下; SEQ ID NO: 1和7-24,右图,从上至下)的NRS (Cr1)的gRNA (gRNA-Cr1)。在没有BSD存在下,16%的测序的等位基因发生突变。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率增加至67%。
图6A显示的示意图描绘了两个核酸酶识别靶位点(Cr1和Cr2)的位置和用于扩增周围区域的引物。图6B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向MAP3K1基因(SEQ ID NO: 25-27,左图,从上至下,SEQ ID NO: 25, 28-43,右图,从上至下)的NRS (Cr2)的gRNA (gRNA-Cr2)。在没有BSD存在下,10%的测序的等位基因发生突变。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率增加至93%。
图7A显示的示意图描绘了两个核酸酶识别靶位点(Cr1和Cr2)的位置和用于扩增周围区域的引物。图7B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向MAK3K1基因(SEQ ID NO: 44-47,上图,从上至下,SEQ ID NO: 44, 48-56,下图,从上至下)的两个不同核酸酶识别位点(Cr1和Cr2)的双gRNA (gRNA-Cr1+Cr2)。在没有BSD存在下,30%的测序的等位基因发生突变。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率增加至92%。
图8A显示的示意图描绘了两个核酸酶识别靶位点(Cr1和Cr2)的位置和用于扩增周围区域的引物。图8B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向AAVS 1基因(SEQ ID NO: 57-68,左图,从上至下,SEQ ID NO: 57, 69-79,右图,从上至下)的NRS (Cr1)的gRNA (gRNA-Cr1)。在没有BSD存在下,32%的测序的等位基因发生突变。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率增加至75%。
图9A显示的示意图描绘了两个核酸酶识别靶位点(Cr1和Cr2)的位置和用于扩增周围区域的引物。图9B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向AAVS 1基因(SEQ ID NO: 80-84,左图,从上至下,SEQ ID NO: 80, 85-89,右图,从上至下)的NRS (Cr2)的gRNA (gRNA-Cr2)。在没有BSD存在下,10%的测序的等位基因发生突变。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率增加至53%。
图10A显示的示意图描绘了两个核酸酶识别靶位点(Cr1和Cr2)的位置和用于扩增周围区域的引物。图10B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向AAVS 1基因(SEQ ID NO: 90-96, 从上至下)的两个不同核酸酶识别位点(Cr1和Cr2)的双gRNA (gRNA-Cr1+Cr2)。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率是85%。
图11A显示的示意图描绘了三个核酸酶识别靶位点(Cr1、Cr2和Cr3)的位置和用于扩增周围区域的引物。图11B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向GFAP基因(gRNA-Cr1+Cr3) (SEQ ID NO: 97-110, 从上至下)的两个不同核酸酶识别位点(Cr1和Cr3)的双gRNA。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率是97%。
图12A显示的示意图描绘了三个核酸酶识别靶位点(Cr1、Cr2和Cr3)的位置和用于扩增周围区域的引物。图12B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向GFAP基因(SEQ ID NO: 111-126, 从上至下)的两个不同核酸酶识别位点(Cr2和Cr3)的双gRNA (gRNA-Cr2+Cr3)。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率是100%。
图13A显示的示意图描绘了四个核酸酶识别靶位点(Cr1、Cr2、Cr3和Cr4)的位置和用于扩增周围区域的引物。图13B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向BCL6基因(SEQ ID NO: 127-141, 从上至下)的两个不同核酸酶识别位点(Cr1和Cr3)的双gRNA (gRNA-Cr1+Cr3)。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率是75%。
图14A显示的示意图描绘了四个核酸酶识别靶位点(Cr1、Cr2、Cr3和Cr4)的位置和用于扩增周围区域的引物。图14B显示了从细胞提取的DNA的测序结果,所述细胞表达:可活化报告盒,其含有框架外BSD基因和编码Cas9的质粒;靶向所述可活化报告盒的NRS的gRNA;和靶向BCL6基因(SEQ ID NO: 142- 155, 从上至下)的两个不同核酸酶识别位点(Cr2和Cr4)的双gRNA (gRNA-Cr2+Cr4)。在有BSD存在下,突变的等位基因的频率是88%。
图15对比了在没有和有BSD表达存在下的插入缺失率。
图16显示的数据表证实,双-gRNA不总是产生相同的突变模式。
图17A-17E显示的数据证实,不论转染效率,使用可活化报告盒对突变的细胞的富集是有效的。
图18A-18B表明,位于框架外选择标记上游的CrNRS 1可以呈现为单或双gRNA。图18A表明,例如使用单gRNA靶向可活化报告盒可以导致移码,且仅1/3的被靶向的细胞获得抗性。图18B例如显示了重复2次的CrNRS 1,且取决于修复机制的保真度,在CrNRS 1靶向以后更高百分比的细胞(超过2/3)表达BSD。
图19显示了在负选择测定中可以如何使用可活化报告盒的一个实施例。将细胞用核酸转染,所述核酸编码可活化报告盒(puro-NRS 1-BSD(框架外))、Cas9和gRNA构建体:靶向所述可活化报告盒的NRS 1的gRNA,和靶向在Alu中的识别位点(Cr1) (图1-3 (从左至右))、5.8S或端粒的gRNA。预期靶向前述位点中的每一个会导致细胞致死性。在有BSD存在下,大多数或所有的细胞死亡,这指示,在转染的细胞中,致死基因被正确地靶向。但是,在没有BSD选择存在下,细胞表现出100%汇合-小比例的未转染的(WT)细胞掩蔽了读出。
图20描绘了合成致死性筛选,其中两种或更多种因素(例如,改变的基因)的组合导致细胞死亡,而每个受影响的单个基因不会。本申请可以用于鉴别“靶向治疗剂”,其用于选择性地杀死肿瘤细胞。
图21显示的示意图描绘了用于CRISPRa/i的可活化报告盒。例如,细胞接受靶向可活化报告盒的CrNRS 1位点的全长gRNA以及与活化/抑制(失活)结构域融合的野生型Cas9。用于将Cas9引导至基因X的启动子区域的截短的gRNA的共同递送可以导致基因活化。针对BSD-活化的细胞的选择可以转化成具有活化的/抑制的基因X的细胞的富集。
图22显示了CRISPR敲除筛选的高通量gRNA克隆的质量控制试验的结果。96种gRNA中的94种被正确地克隆并通过Sanger测序证实。
图23A-23C显示了使用可活化报告盒将细胞加条形码的方法的一个实施例。GFP-阳性细胞(带阴影的灰色) (图23A)具有由可活化报告盒(具有NRS 1位点)代表的特定条形码。该条形码是对该细胞特异性的,且因此杀稻瘟素抗性仅可以在用针对NRS 1的gRNA和Cas9转染后的细胞中得到。在某些实施方案中,可以使用1012个条形码,且可以分离实验中的所有单个细胞(例如,在单个平板上)。可以使用杀稻瘟素选择(在用特定gRNA选择以后)来分离与特定条形码有关的特定细胞。图23C显示了在BSD选择以后2周GFP-阳性的细胞。
图24显示了REM插入缺失实验的一个实施例的示意图。(1)在组成性地表达EGFP的细胞中,使用FuGeneHD试剂敲入REM插入缺失盒。Cas9和gRNA靶向REM位点,其为人基因组中没有脱靶的人工靶位点。(2)然后应用排列的CRISPR文库(可以使用针对基因X的超过一种gRNA)。所述gRNA可以经由质粒、IVT、PCT或合成的crRNA递送。(3)然后选择活化的BSD,并研究表型。在转染后3天,将细胞在两个孔中传代,将其中之一保持在杀稻瘟素选择下。1周以后,使用FACS测量EGFP阳性细胞的部分。结果指示,EGFP-破坏的细胞在杀稻瘟素选择以后被富集。
图25A显示了来自一个实验的示意图和结果,其中PCR扩增的含有EGFP的盒(在EF1a启动子的控制下)导致EGFP在HEK293细胞中的表达。在转染以后48小时测量EGFP。图25B显示了基于PCR的gRNA相对于基于质粒的gRNA的对比。将三种gRNA (包括gRNA-REM和双gRNA, #1和#2,靶向AAVS 1基因座)共转染进组成性地表达Cas9的HEK293-REM细胞中。为具有(+)和没有(-) REM插入缺失富集的三个重复(Rep1、Rep2和Rep3)指出了突变的等位基因(*)的频率。结果指示在基于PCR的和基于质粒的实验中突变的细胞的富集。图25C显示了使用PCR产生gRNA(针对Cas9和Cpf1 is)的两种策略的示意图。在两种策略中,可以使用带接头的引物扩增前间隔序列(protospacer)。
图26A显示了用于PCR方法的寡核苷酸的重叠延伸设计,其可以用于扩增含有U6启动子以及gRNA主链的任何盒。图26B表明,基于PCR的gRNA产物在稳定地表达Cas9的HEK293细胞中可有效地诱导基因敲除。
图27A显示了可以如何将重叠延伸寡核苷酸用于gRNA的无连接克隆的一个实施例。图27B表明,使用通过重叠延伸产生的PCR产物将11种gRNA中的9种正确地组装进所述载体中。
图28A-28B显示了在实施例5中讨论的实验的示意图。
图29A,上图,是凝胶的照片,其表明使用两种靶向目标基因的gRNA可以实现更高的插入缺失频率。图29A,下图,显示了来自在样品上的NGS分析的结果,所述样品含有由双-gRNA诱导的大插入缺失。图29B的图表明,应用双-gRNA和REM插入缺失可以导致在富集的细胞群体中的不同基因座处超过80%的插入缺失频率。图29C的图显示了来自扩增子测序的结果,其提供了关于靶向基因座上的DNA修复机制的输出的洞察。
图30显示了针对Alu元件设计的三种gRNA的示意图,所述Alu元件在人基因组中具有非常高的丰度。
图31显示了具有和没有REM插入缺失的gRNA的转染以后,使用INCUCYTE®的汇合测量。表示了三种靶向Alu元件的致死gRNA (Alu cr1、Alu cr2和Alu Cr3)和一种靶向HEK293-REM细胞中的AAVS 1基因座的非致死gRNA的致死性筛选结果。在2周中每天测量汇合。对比了三种不同的转染效率,其具有两种不同的初始细胞数目(30%和50%汇合),具有和没有选择。在没有选择下,因为未转染的细胞,Alu gRNA (致死性)的正确读出被掩蔽。但是,REM插入缺失成功地揭示致死gRNA的正确读出。
图32A显示了含有Cas9GFP以及串联的两个gRNA的质粒的示意图。图32B显示了精确地靶向CLU4基因中的限制性酶位点的CLU4-gRNA的示意图。图32C显示了按比例缩小用于将gRNA-Cas9质粒转染进固定量的细胞中的转染试剂的量的结果。图32D的图表明,在REM插入缺失富集以后,在所有差别地转染的样品中检测到相同的插入缺失频率。
图33A的示意图显示了使用基于脂质的(FuGeneHD转染试剂)转染方案以质粒形式将Cas9和针对REM位点和PIG基因(它们参与GPI锚生物合成途径)的gRNA转染进HEK293-REM细胞中。3天以后,将细胞在两个孔中传代,并将一个孔保持在杀稻瘟素选择下1周。在FLAER染色之前,将具有PIG基因(同种型)的野生型基因型的mCherry阳性细胞与HEK-REM细胞混合。使用FACS测量mCherry和FLAER-阳性细胞的百分比。图33B显示了使用FLAER (荧光素-标记的气单胞菌溶素原)测定的FACS分析的结果。在FLAER染色以后在Q1中门控具有野生型表型的HEK293-REM细胞。在Q3中门控具有被破坏的GPI (对于两个基因, PIGM和PIGN,在选择之前和之后)的细胞。图33C的图表明,REM插入缺失在“真实地”敲除的细胞群体中富集。在条形图中显示了7个PIG基因(GPI锚生物合成所必需的)和DPM2 (GPI锚生物合成非必需的)的结果,ns;非显著的(p-值> 0.05), *;统计上显著的(p-值< 0.05)。
图34显示了38个含有溴区结构域的基因的致死性筛选的结果。
图35显示了汇合端点测量和靶向38个含有溴区结构域的基因中的每一个的gRNA的数目。
发明详述
在某些实施方案中,本发明提供了基于核酸的工具,其包括“可活化报告盒”、指导RNA构建体和受RNA引导的核酸酶,它们可以一起使用以修饰和分离被靶向的目标细胞。有利地,在某些实施方案中,本文提供的方法是稳健的、有成本效益的和用户友好的。进一步,在某些实施方案中,本文提供的方法是无病毒的。
使用本发明的构建体和方法可以解决限制基于慢病毒的指导RNA文库(特别对于排列筛选)的应用的实际缺点。这些限制中的一些包括昂贵的和费力的生产、对于最终用户而言不可再生的储备物、对生物安全水平2设施的需要和病毒相容的自动化基础设施。此外,由于病毒DNA的随机整合,基于慢病毒的系统可以干扰一些表型研究。另外,具有Cas9的基因组的长期暴露和由慢病毒提供的指导RNA表达可以增加脱靶事件的机会。
类似地,使用本发明的构建体和方法可以解决限制基于转染的系统(例如,质粒的转染)用于递送指导RNA文库的应用的实际缺点。在许多细胞类型中,核酸转染效率是低的,且蛋白转染效率是甚至更低的。对于负选择实验,潜在地小比例的未转染的细胞将具有生长优势,从而掩蔽表型读出。此外,基于质粒的筛选(类似于基于病毒的筛选)可以延迟表型分析。这是因为,基于质粒的排列筛选经常在微孔板中进行,且Cas9的转录和翻译所需要的另外时间(例如,在质粒转染以后)会导致过度汇合。该过度汇合使得难以读出表型。
取决于被靶向的基因的生物学,还必须考虑关于时间的另外变动,从基因诱变发生时开始且在细胞获得对应表型时结束。
本文提供的方法和核酸构建体可以用于克服与基于慢病毒的系统和基于转染/质粒的系统有关的许多上述缺点。
可活化报告盒
“可活化报告盒”表示包含核酸酶识别位点(NRS)的核酸,所述核酸酶识别位点(NRS)侧接上游选择标记基因和不同于(异于)所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因。
“核酸酶识别位点”是被相应核酸酶(切割所述核酸酶识别位点的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶)切割的核苷酸序列。在某些实施方案中,所述相应核酸酶是受RNA引导的核酸酶,例如,Cas9。如本文别处所述,受RNA引导的核酸酶结合指导RNA (gRNA),后者含有核酸酶结合所必需的支架序列和限定要修饰/切割的靶标(与其互补)的由用户限定的靶向序列。因而,人们可以通过简单地改变存在于gRNA中的靶向序列而改变核酸酶的靶标。目标靶基因通常含有对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点(NRS),这意味着限定所述目标靶基因的NRS的核苷酸序列仅存在于所述目标靶基因中(不存在于细胞中的其它基因中)。应当理解,尽管NRS可以是对目标靶基因特异性的,切割NRS的核酸酶(例如,Cas9或Cpf1)能够切割其它核酸酶识别位点,每个由它与用户限定的gRNA的互补性限定。所述核酸酶的特异性依赖于有关的gRNA的靶向序列。例如,可活化报告盒和目标靶基因各自包括不同的NRS (彼此不同)。尽管目标靶基因的NRS对目标靶基因是特异性的,切割目标靶基因的NRS的核酸酶(例如,Cas9)也可以切割可活化报告盒的NRS。
在以下情况下,认为核酸酶识别位点“侧接”选择标记:一个选择标记基因位于核酸酶识别位点的上游且与其邻近(例如,在1-100个核苷酸内),且一个选择标记基因位于核酸酶识别位点的下游且与其邻近。在下面更详细地讨论核酸酶识别位点。
“选择标记”是引入细胞中的基因,其赋予适合人工选择的特性或编码可以被用于人工选择的蛋白。选择标记可以是例如抗生素抗性基因。抗生素抗性基因的非限制性例子包括编码对嘌呤霉素、杀稻瘟素S、氨苄青霉素、卡那霉素、遗传霉素、三氯生、氯霉素、四环素、潮霉素或诺尔丝菌素-二氢硫酸酯(clonNAT)的抗性的基因。例如,来自链霉菌属(Streptomyces)的嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶基因(pac)会给宿主细胞赋予嘌呤霉素抗性,来自土曲霉(Aspergillus terreus)的杀稻瘟素S脱氨酶基因会给宿主细胞赋予杀稻瘟素S抗性,β-内酰胺酶基因会给宿主细胞赋予氨苄青霉素抗性,得自Tn5的neo基因会在细菌细胞中赋予卡那霉素抗性和在真核细胞中赋予遗传霉素抗性,得自大肠杆菌基因组的突变体FabI基因(mFabI)会给宿主细胞赋予三氯生抗性,氯霉素乙酰基转移酶基因会赋予氯霉素抗性,且超过60个不同的基因可以赋予四环素抗性。潮霉素B磷酸转移酶(Hph)会给宿主细胞赋予潮霉素抗性。
选择标记基因不限于抗生素抗性基因。选择标记基因也包括编码报告蛋白(例如,荧光报告蛋白)的基因。荧光报告分子的非限制性例子包括绿色荧光蛋白(例如,AcGFP1、ZsGreen1)、红色荧光蛋白(例如,DsRed-Express2、DsRed-Express、tdTomato、DsRed-单体、DsRed2、AsRed2、mStrawberry、mCherry)、远红外荧光蛋白(例如,HcRed1、mRaspberry、E2-Crimson、mPlum)、黄色荧光蛋白(例如,ZsYellow1、mBanana)、蓝绿色荧光蛋白(例如,AmCyan1)、橙色荧光蛋白(例如,mOrange、mOrange2)及其变体。
在某些实施方案中,选择标记基因编码可以用于人工选择的蛋白。例如,可活化报告盒可以含有框架外选择标记基因,其编码否则不会被所述盒引入其中的细胞表达的蛋白(例如,细胞膜受体)。在核酸酶对可活化报告盒的靶向切割后,将框架外选择标记基因重构,使得它是在框架内且被表达。因而,编码的蛋白被表达且可以用作选择标记。在某些实施方案中,细胞包含含有下游框架外选择标记基因的可活化报告盒,所述下游框架外选择标记基因编码否则不会在所述细胞中表达的细胞膜受体。在核酸酶对可活化报告盒的靶向切割后,将框架外选择标记基因重构,使得它是在框架内且所述细胞膜受体被表达。例如,特异性地结合所述受体的抗体药物(例如,毒素)缀合物然后可以用于选择在其中发生可活化报告盒的切割的细胞。应当理解,可以如上所述使用任何相应蛋白结合对(例如,受体-配体)。
“上游”和“下游”表示核酸(例如,DNA或RNA)的相对位置。DNA或RNA的每条链具有5'末端和3'末端,所以针对在脱氧核糖(或核糖)环上的碳位置命名。按照惯例,上游和下游是指发生RNA转录的5'至3'方向。上游朝向RNA分子的5'末端,且下游朝向3'末端。当考虑双链DNA时,上游朝向目标基因的编码链的5'末端,且下游朝向所述编码链的3'末端。因而,上游选择标记和下游选择标记在单个核酸上相对于彼此定义。上游选择标记位于朝向核酸的5'末端,且下游选择标记位于朝向核酸的3'末端。
在大多数实施方案中,可活化报告盒的上游选择标记不同于相同可活化报告盒的下游选择标记。例如,上游选择标记可以是赋予嘌呤霉素抗性的抗生素抗性基因,而下游选择标记可以是赋予对杀稻瘟素S、氨苄青霉素、卡那霉素、遗传霉素、三氯生、氯霉素或四环素的抗性的抗生素抗性基因。作为另一个实施例,上游选择标记可以是赋予杀稻瘟素S抗性的抗生素抗性基因,而下游选择标记可以是赋予对嘌呤霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、遗传霉素、三氯生、氯霉素或四环素的抗性的抗生素抗性基因。
可活化报告盒通常含有上游框架内选择标记基因和下游框架外选择标记基因。所述上游框架内选择标记基因简称为“上游选择标记基因”。没有具体地指明为“框架外”的任何基因应当被视作“框架内”。“框架内”和“框架外”表示核酸的读码框。读码框是将核酸(DNA或RNA)中的核苷酸序列分成连贯的不重叠三联体的集合的方式。在翻译过程中等同于氨基酸或停止信号的三联体被称作密码子。如果读码框是完整的且翻译可以进行至结束,认为选择标记基因是框架内。如果读码框不是完整的且翻译不可以进行至结束,认为选择标记基因是框架外。
例如,在图1A中,编码可活化报告盒(上图)的嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(“Puro”)的选择标记基因是框架内,而编码杀稻瘟素S脱氨酶(“BSD”)的选择标记基因是框架外。在该构型中,表达嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶,但是不表达杀稻瘟素S脱氨酶。在切割Cr REM位点(例如,被Cas9)以后,编码杀稻瘟素S脱氨酶的选择标记基因从框架外转移至框架内,且现在可以更晚地翻译,从而导致杀稻瘟素S脱氨酶的表达。
在某些实施方案中,可活化报告盒含有“无启动子的”上游选择标记基因,这意味着,所述上游选择标记基因没有可操作地连接至启动子。当启动子相对于它调节的核酸序列(例如,以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达)处于正确的功能位置和取向时,认为所述启动子是“可操作地连接的”。构造可活化报告盒,使得无启动子的选择标记基因仅在以下情况下表达:与在其中引入所述可活化报告盒的细胞的基因组的启动子一起在框架内插入(敲入或连接)。以此方式,含有无启动子的选择标记基因的可活化报告盒更象基因捕获盒一样起作用。当插入表达的基因的内含子时,基因捕获盒以融合转录物的形式从该基因的内源性启动子转录,其中在插入位点上游的外显子被剪接成与报告/选择标记基因在框架内。因为转录在插入的多腺苷酸化位点处过早终止,经处理的融合转录物编码所述细胞蛋白和所述报告/选择标记的截短且无功能形式。
核酸酶识别位点和同族核酸酶
可活化报告盒含有(至少一个)位于两个选择标记基因之间的核酸酶识别位点。如以上所讨论的,核酸酶识别位点是被相应核酸酶(切割(切/水解)核酸酶识别位点的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶)识别并切割的核苷酸序列。
对于细胞而言内源性的或引入细胞的基因组中的目标基因也含有核酸酶识别位点。
在某些实施方案中,核酸酶识别位点含有这样的核苷酸序列:其与指导RNA互补(例如,完美互补),且可以被受RNA引导的核酸酶(诸如Cas9或Cpf1,例如)切割。核酸酶识别位点通常包含前间隔序列邻近基序(PAM)紧跟在被靶向的序列后面。在某些实施方案中,所述PAM是5' NGG 3',例如,对于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9。
核酸酶识别位点的长度和组成(例如,A、T、C、G百分比)可以变化。例如,核酸酶识别位点可以具有10-50个核苷酸的长度。在某些实施方案中,核酸酶识别位点具有10-15、10-20、10-30、10-40、10-50、15-20、15-30、15-40、15-50、20-30、20-40或20-50个核苷酸的长度。在某些实施方案中,核酸酶识别位点具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
在某些实施方案中,核酸酶识别位点被可编程的核酸酶识别和切割,包括锌指核酸酶(ZFN) (Kim等人. Proc Natl Acad Sci USA 93 (3): 1156-60, 1996; Bitinaite等人. Proc Natl Acad Sci USA 95 (18): 10570-5, 1998;和Cathomen等人. Mol. Ther.16 (7): 1200-7, 2008)、TAL效应物核酸酶(TALEN,转录活化剂-样效应物核酸酶) (Boch等人. Science 326 (5959): 1509-12, 2009; Christian等人. Genetics 186 (2):757-61, 2010);和Miller等人. Nature Biotechnology 29 (2): 143-8, 2011)、从细菌簇集的规则间隔的短回文重复(CRISPR)-Cas (CRISPR-有关的)系统衍生出的受RNA引导的经工程改造的核酸酶(RGEN)和它们的功能等同物(Kim H. 等人, Nature ReviewsGenetics 15, 321-334 (2014))。可编程的核酸酶通常包含DNA结合结构域(其识别和结合预定的DNA序列)和DNA裂解结构域(其在所述DNA结合结构域处或附近(例如,在10个核苷酸内)切割所述DNA)。例如,ZFN包含结合DNA的锌指结构域和切割DNA的Fok I结构域(Kim等人. Natl Acad Sci USA 93 (3): 1156-60, 1996)。类似地,TALEN包含结合DNA的TAL效应物单元和切割DNA的Fok I结构域。受RNA引导的Cas9核酸酶切割DNA,但是为此目的,它必须首先被指导RNA引导至靶切割位点,所述指导RNA与DNA切割位点互补并与其结合。
在某些实施方案中,核酸酶是受RNA引导的核酸酶,诸如Cas9或Cpf1。
Cas9 (CRISPR有关的蛋白9)是在酿脓链球菌以及其它细菌中的2类CRISPR (簇集的规则散布的回文重复)适应性免疫系统的受RNA引导的核酸酶。用于编辑、调节和靶向基因组的CRISPR系统可以包含至少两种独特组分:(1)指导RNA (gRNA)和(2) Cas9。gRNA是单一嵌合转录物,其将内源性细菌CRISPR靶向RNA (crRNA)的靶向特异性与反式-活化crRNA(tracrRNA)的支架性能组合。通常,用于基因组编辑的gRNA从细胞内的质粒或基因组基因座转录。gRNA转录物与Cas9形成复合物,然后由于例如crRNA序列和它在基因组DNA中的互补靶序列之间的碱基配对而将gRNA/Cas9复合物募集至靶序列。
在一个典型的合成的CRISPR/Cas9基因组编辑系统中,通过使用与目标序列互补的gRNA来修饰目标基因组序列(基因组靶序列),所述gRNA将gRNA/Cas9复合物引导至靶标(Sander JD等人, 2014 Nature Biotechnology 32, 247-355,通过引用并入本文)。Cas9内切核酸酶切割在前间隔序列邻近基序(PAM)上游的基因组靶DNA,从而导致双链断裂。双链断裂的修复经常导致在双链断裂位点处的插入或缺失。
Cpf1也是2类CRISPR-Cas系统的受RNA引导的核酸酶(Zetsche等人, 2015, Cell163: 1-13,通过引用并入本文)。Cpf1与Cas9一样是双组分RNA可编程的DNA核酸酶。被靶向的DNA被切割为在5' 富含T的前间隔序列邻近基序(PAM)的远侧的5-核苷酸交错切口。存在两种在人细胞中表现出稳健核酸酶活性的Cpf1直系同源物,其中的任一种可以如在本文中提供的那样使用。根据本发明可以使用在功能上类似于Cpf1的酶。
指导RNA构建体和受RNA引导的核酸酶
本发明的基因修饰方法使用指导RNA将受RNA引导的核酸酶引导至可活化报告盒或目标基因的核酸酶识别位点。“导向”RNA (gRNA)是簇集的规则间隔的短回文重复(CRISPR)II型系统的两个组分之一,该系统是已经为了基因组工程而修饰的细菌免疫系统。其它组分是非特异性的CRISPR-相关的内切核酸酶(Cas9)。gRNA是由Cas9-结合所必需的支架序列和用户限定的约20 (例如,20±5或20±10)个核苷酸“间隔物”或“靶向”序列(其限定要修饰的基因组靶标)组成的短合成RNA。因而,人们可以通过简单地改变存在于gRNA中的靶向序列而改变Cas9的(基因组)靶标。在某些实施方案中,gRNA具有10-100个核苷酸的长度。例如,gRNA可以具有10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10- 15、15- 100、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-35、20-30或20-25个核苷酸的长度。在某些实施方案中,gRNA具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的长度。本发明包括更长的gRNA。
图1B显示了gRNA构建体的一个实施例:将编码gRNA (gRNA NRS1)(其靶向可活化报告盒的核酸酶识别位点(NRS1))的核酸可操作地连接至U6启动子;和将编码gRNA (gRNANRS2)(其靶向目标基因的核酸酶识别位点(NRS2))的核酸可操作地连接至另一个U6启动子。该特定实施例构建体包括编码受RNA引导的核酸酶Cas9的核酸,其可操作地连接至CMV启动子。所述构建体还含有聚腺苷酸(pA)信号、卡那霉素抗性基因和复制起点(Ori)。
含有特定核酸的构建体在本文中被称作“双gRNA构建体”,所述特定核酸编码靶向可活化报告盒的NRS 1的一个gRNA和各自靶向目标基因特有的NRS的两个gRNA。例如,双gRNA构建体可以编码靶向可活化报告盒的NRS 1的gRNA、靶向目标靶基因的Cr1的gRNA和靶向目标靶基因的Cr2的gRNA (参见,例如,图7B和10B,显示了来自实验的数据,所述实验使用靶向目标靶基因的Cr1和Cr2位点的双gRNA)。
在某些实施方案中,将编码双gRNA (例如,在相同载体上或在单独载体上)的核酸转染进细胞中,而在其它实施方案中,将两种gRNA (例如,以相等摩尔量)转染进细胞中,例如,通过电穿孔或通过已知的化学或物理转染方法。
“受RNA引导的核酸酶”是一种可编程的内切核酸酶,其可以用于执行被靶向的基因组编辑。受RNA引导的核酸酶(诸如Cas9或Cpf1)的可编程性质是它与指导RNA (gRNA)的结合的结果,所述指导RNA在它的5'末端处使用约20个可变核苷酸以与被所述核酸酶切割的靶DNA序列碱基配对(互补)。在某些实施方案中,所述受RNA引导的核酸酶是Cas9。在某些实施方案中,所述受RNA引导的核酸酶是Cpf1。本发明包括其它受RNA引导的核酸酶。
基因组整合
在某些实施方案中,以含有脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)的经工程改造的核酸构建体的形式提供本发明的可活化报告盒。该DNA-BDRS用于促进所述构建体的线性化形式向基因组的基因座中的直接位点特异性连接。直接连接通过不同源的末端连接(NHEJ)途径而发生{参见,例如,Maresca等人. Genome Res. 2013 Mar;23(3):539-46,通过引用并入本文)。位点特异性的整合部分地取决于含有DNA结合结构域和DNA裂解结构域(通常FokI结构域)的可编程的核酸酶的存在和含有至少一个DNA-结合结构域识别序列的核酸的存在。“DNA-结合结构域识别序列”是这样的核苷酸序列:可编程的核酸酶的核酸酶DNA-结合结构域与其结合,且可编程的核酸酶的核酸酶DNA裂解结构域将其切割。经工程改造的构建体可以含有至少一个被可编程的核酸酶识别和切割的DNA-结合结构域识别序列。经工程改造的构建体的切割产生线性化形式,然后可以将其以位点特异性的方式“连接”进基因组中。
在某些实施方案中,经工程改造的构建体的DNA-结合结构域识别序列对应于位于Rosa26基因座中的序列,使得所述核酸可以整合进小鼠基因组中。在某些实施方案中,经工程改造的构建体的DNA-结合结构域识别序列对应于位于AAVS 1基因座中的序列,使得所述核酸可以整合进人基因组中。本发明包括位于其它基因组基因座中的其它DNA-结合结构域识别序列。
用于线性化经工程改造的构建体的可编程的核酸酶的例子包括、但不限于,如上所述的锌指核酸酶(ZFN)、Tale核酸酶(TALEN)和dCas9-FokI融合蛋白(与FokI融合的催化上失活的Cas9)。
在某些实施方案中,所述DNA-结合结构域识别序列是ZFN DNA结合结构域识别序列,其被一个或多个锌指结合。各个ZFN的DNA-结合结构域可以含有3-6个单独的锌指重复,且可以各自识别9-18个碱基对。如果锌指结构域对它们的预期靶位是特异性的,那么甚至一对识别共计18个碱基对的3-指ZFN可以靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。
在某些实施方案中,所述DNA-结合结构域识别序列是TALEN DNA结合结构域识别序列,其被一个或多个TAL效应物单元结合。TAL效应物是由黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白。DNA结合结构域通常含有重复的高度保守的33-34氨基酸序列(除了第12个和第13个氨基酸以外)。这两个位置是高度可变的(重复可变二残基,RVD),并表现出与特异性核苷酸识别的强关联(Boch等人. Science 326 (5959): 1509-12, 2009; Moscou等人.Science 326 (5959): 1501, 2009,它们中的每一篇通过引用并入本文)。在某些实施方案中,通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程改造特定DNA-结合结构域(Boch等人.Nature Biotechnology 29 (2): 135-6, 2011)。
在某些实施方案中,所述DNA-结合结构域识别序列是与(至少一种)指导RNA (例如,两种共表达的gRNA)互补(例如,100%互补)的序列。在某些实施方案中,所述DNA-结合结构域识别序列是与gRNA (例如,两种共表达的gRNA)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%互补性的序列。在这样的实施方案中,与FokI核酸酶融合的催化上无活性的Cas9 (dCas9)可以用于在经工程改造的核酸中产生双链断裂。
经工程改造的核酸
“经工程改造的核酸”是在自然界中不存在的核酸(例如,至少两个核苷酸共价地连接在一起,且在某些情况下,含有磷酸二酯键,被称作磷酸二酯“主链”)。经工程改造的核酸包括重组的核酸和合成的核酸。“重组的核酸”是通过连接核酸(例如,分离的核酸、合成的核酸或它们的组合)而构建的分子,且在某些实施方案中,可以在活细胞中复制。“合成的核酸”是扩增的或者化学地或通过其它方式合成的分子。合成的核酸包括化学修饰的或以其它方式修饰的核酸,但是可以与天然存在的核酸分子碱基配对(也被称作“结合”,例如,短暂地或稳定地)。重组的和合成的核酸也包括从前述任一种的复制产生的那些分子。
尽管经工程改造的核酸作为整体不是天然存在的,但是它可以包括野生型核苷酸序列。在某些实施方案中,经工程改造的核酸包含得自不同生物(例如,得自不同物种)的核苷酸序列。例如,在某些实施方案中,经工程改造的核酸包括鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列、病毒核苷酸序列、或前述序列中的任意两种或多种的组合。
经工程改造的核酸“构建体”表示人工构建的核酸(例如,包括DNA序列的组装),其可以单独地以圆环形式存在,且可以转染进细胞中。本发明的经工程改造的核酸构建体通常含有DNA-结合结构域识别位点,其指导可编程的核酸酶对所述构建体的切割和线性化。经工程改造的核酸构建体经常含有目标基因(例如,选择标记基因)的表达所需的所有元件,包括、例如,启动子、目标基因(转基因)和停止序列。但是,应当理解,本发明的经工程改造的核酸构建体不一定含有目标基因的表达所需的所有元件。在某些实施方案中,如本文别处所述,经工程改造的构建体包含含有无启动子的选择标记基因的可活化报告盒。
核酸“盒”(非常类似于“构建体”)表示人工构建的核酸(例如,包括DNA序列的组装)。但是,盒不单独以圆环形式存在。核酸构建体可以包含一个或多个核酸盒。例如,图2描绘了一种圆环状的经工程改造的核酸构建体(供体),其包括可活化报告盒。所述可活化报告盒包括核酸酶识别位点(CrREM),其侧接编码嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶的核酸和编码杀稻瘟素S脱氨酶的下游框架外选择标记基因。
在某些实施方案中,本发明的经工程改造的核酸可以包含除了磷酸二酯主链以外的主链。例如,在某些实施方案中,经工程改造的核酸可以包含磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺连接、肽核酸或任意两个或更多个前述连接的组合。经工程改造的核酸可以是单链的(ss)或双链的(ds),如指定的,或经工程改造的核酸可以含有单链和双链序列的部分。在某些实施方案中,经工程改造的核酸含有三链序列的部分。经工程改造的核酸可以包含DNA (例如,基因组DNA、cDNA、或基因组DNA和cDNA的组合)、RNA或杂合分子,例如,在所述核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如,人工的或天然的)的任意组合和两个或多个碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的任意组合的情况下。
使用标准的分子生物学方法(参见,例如,Green和Sambrook, MolecularCloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press),可以生产本发明的经工程改造的核酸。在某些实施方案中,使用GIBSON ASSEMBLY®克隆生产核酸(参见,例如,Gibson, D.G. 等人. Nature Methods, 343-345, 2009;和Gibson, D.G. 等人.Nature Methods, 901-903, 2010,它们中的每一篇通过引用并入本文)。GIBSON ASSEMBLY®通常在单试管反应中使用三种酶活性:5' 外切核酸酶,DNA聚合酶的3' 延伸活性和DNA连接酶活性。5' 外切核酸酶活性将5' 末端序列向后切割并暴露出互补序列用于退火。聚合酶活性然后填充退火的区域上的缺口。DNA连接酶然后密封切口并将DNA片段共价地连接到一起。邻接片段的重叠序列比在Golden Gate Assembly中使用的那些长得多,且因此导致更高百分比的正确组装。生产经工程改造的核酸的其它方法是本领域已知的,且可以根据本发明使用。
本发明的经工程改造的核酸可以包括一个或多个遗传元件。“遗传元件”表示这样的核苷酸序列:其在核酸表达中起作用(例如,启动子、隔离子、增强子、终止子和分子(例如,DNA或蛋白)结合区域),或编码核酸的产物(例如,编码核酸酶的核苷酸的序列)。
经工程改造的核酸的表达通常由与所述经工程改造的核酸可操作地连接的启动子驱动。“启动子”表示核酸的控制区,在此处控制核酸序列的剩余部分的转录的起始和速率。启动子驱动它所调节的核酸序列的转录或,因而,它通常位于基因的转录起始位点处或附近。在某些实施方案中,启动子是100-1000个核苷酸的长度。启动子还可以含有调节蛋白和其它分子可结合的亚区域,诸如RNA聚合酶和其它转录因子。启动子可以是组成型的(例如,CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子)、可诱导的(也被称作可活化的)、可抑制的、组织特异性的、发育阶段特异性的或前述两种或多种的任意组合。
当启动子相对于它所调节的核酸的序列处于正确的功能位置和取向(例如,以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达)时,认为启动子是“可操作地连接的”。
在某些实施方案中,启动子与核酸天然地结合,且可以通过分离位于给定核酸的编码区上游的5' 非编码序列得到。
在某些实施方案中,启动子没有与核酸天然地结合。这样的启动子被称作“异源”启动子,且包括,例如,调节其它核酸的启动子和得自其它细胞的启动子。异源启动子可以是合成的或重组的。在某些实施方案中,合成的异源启动子含有一个得自已知的转录调节区的不同元件。在某些实施方案中,合成的异源启动子含有突变,其通过本领域已知的基因工程方法改变表达。在某些实施方案中,通过重组克隆、核酸扩增(例如,聚合酶链式反应(PCR))、或重组克隆和核酸扩增的组合(参见美国专利号4,683,202和美国专利号5,928,906),生产重组异源启动子。在本文中预见到生产合成的和重组的异源启动子的其它方法。
在某些实施方案中,启动子是诱导型启动子。当“诱导型启动子”受对应的调节蛋白影响或被其接触时,所述启动子调节(例如,活化或失活)它所可操作地连接的核酸的转录活性。诱导型启动子的例子包括、但不限于,化学上或生化上受调节的和物理上受调节的启动子,诸如酒精-调节型启动子、四环素-调节型启动子(例如,失水四环素(aTc)-响应性的启动子和其它四环素-响应性的启动子系统,其包括四环素阻遏蛋白(tetR)、四环素操纵基因序列(tetO)和四环素反式激活因子融合蛋白(tTA))、类固醇-调节型启动子(例如,基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子,和来自类固醇/类视色素/甲状腺受体超家族的启动子)、金属-调节型启动子(例如,从来自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白(结合和隔离金属离子的蛋白)基因衍生出的启动子)、发病机制-调节型启动子(例如,由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导)、温度/热-诱导型启动子(例如,热激启动子)和光-调节型启动子(例如,来自植物细胞的光响应性启动子)。其它诱导型启动子是本领域已知的,且可以根据本发明使用。
在某些实施方案中,经工程改造的核酸包含增强子。“增强子”是核苷酸的顺式作用调节序列,其参与可操作地连接至启动子的核酸序列的转录活化。增强子可以位于在启动子的上游或下游的任何功能位置处。
在某些实施方案中,经工程改造的核酸包含终止子。“终止子”是造成转录停止的核苷酸序列。终止子可以是单向的或双向的。终止子包含参与RNA聚合酶对RNA转录物的特异性终止的DNA序列,并阻止上游启动子对下游核酸序列的转录活化。
最常用的终止子类型是正向终止子。当置于通常转录的核酸序列的下游时,正向转录终止子将造成转录中止。在某些实施方案中,使用双向转录终止子,其经常在正向和反向链上造成转录终止。在某些实施方案中,提供了反转录终止子,其经常仅在反向链上终止转录。
用于根据本发明的用途的终止子的例子包括、但不限于,基因的终止序列,例如,牛生长激素终止子和病毒终止序列,例如,T0终止子、TE终止子、λT1和在细菌系统中发现的T1T2终止子。在某些实施方案中,所述终止信号可以是不可转录或翻译的序列,诸如从序列截短产生的那些。
细胞
可以将本发明的经工程改造的构建体引入多种不同的细胞中。在其中可以引入经工程改造的构建体的细胞的例子包括、但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞(例如,大肠杆菌细胞)和酵母细胞(例如,酿酒酵母细胞)。哺乳动物细胞可以是例如人细胞、灵长类动物细胞(例如,vero细胞)、大鼠细胞(例如,GH3细胞、OC23细胞)或小鼠细胞(例如,MC3T3细胞)。存在多种人细胞系,包括、但不限于,HEK细胞(例如,HEK 293或HEK 293T细胞)、HeLa细胞、来自国立癌症研究所(National Cancer Institute)的60种癌细胞系(NCI60)的癌症细胞、DU145 (前列腺癌)细胞、Lncap (前列腺癌)细胞、MCF-7 (乳腺癌)细胞、MDA-MB-438(乳腺癌)细胞、PC3 (前列腺癌)细胞、T47D (乳腺癌)细胞、THP-1 (急性髓性白血病)细胞、U87 (胶质母细胞瘤)细胞、SHSY5Y人神经母细胞瘤细胞(从骨髓瘤克隆)和Saos-2 (骨癌)细胞。
在某些实施方案中,在干细胞(例如,人干细胞)例如多能干细胞(例如,人多能干细胞,包括人诱导的多能干细胞(hiPSC))中表达经工程改造的构建体。“干细胞”表示具有在培养的无限阶段中分裂和产生专门细胞的能力的细胞。“多能干细胞”表示这样的干细胞类型:其能够分化成生物体的所有组织,但是单独地不能维持整个生物发育。“人诱导的多能干细胞”表示这样的体(例如,成熟的或成体的)细胞:其已经通过被迫表达对于维持胚胎干细胞的确定性能而言重要的基因和因子而被重新程序化至胚胎干细胞-样状态(参见,例如,Takahashi和Yamanaka, 2006 Cell 126 (4): 663-76,通过引用并入本文)。人诱导的多能干细胞表达干细胞标志物,并且能够产生所有三个胚层(外胚层、内胚层、中胚层)特有的细胞。
根据本发明可以使用的细胞系的另外非限制性例子包括293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B 16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C 12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five细胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L细胞、Jurkat、JY细胞、K562细胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1、2、3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC 6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL细胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2细胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1和YAR细胞。
在某些实施方案中,修饰本发明的细胞。经修饰的细胞是含有外源核酸或在自然界中不存在的核酸的细胞。在某些实施方案中,经修饰的细胞含有在基因组核酸中的突变。在某些实施方案中,经修饰的细胞含有外源的独立地复制的核酸(例如,存在于附加型载体上的经工程改造的核酸)。在某些实施方案中,通过将外来或外源核酸引入细胞中来生产经修饰的细胞。
通过方法例如电穿孔(参见,例如,Heiser W.C. Transcription FactorProtocols: Methods in Molecular Biology™2000; 130: 117-134)、化学法(例如,磷酸钙或脂质)、转染(参见,例如,Lewis W.H., 等人, Somatic Cell Genet. 1980 May; 6(3): 333-47; Chen C, 等人, Mol Cell Biol. 1987 August; 7(8): 2745-2752)、与含有重组质粒的细菌原生质体融合(参见,例如,Schaffner W. Proc Natl Acad Sci USA.1980 Apr; 77(4): 2163-7)或经纯化的DNA向细胞核中的直接显微注射(参见,例如,Capecchi M.R. Cell. 1980 Nov; 22(2 Pt 2): 479-88),可以将经工程改造的构建体引入细胞中。
使用常规哺乳动物细胞培养方法(参见,例如,Phelan M.C. Curr Protoc CellBiol. 2007年9月;第1章: 第1.1单元,通过引用并入本文),可以培养(例如,维持在细胞培养物中)被修饰成包含本发明的经工程改造的构建体的哺乳动物细胞(例如,人细胞)。例如,可以在细胞培养箱中在适当的温度和气体混合物(例如,对于哺乳动物细胞,37℃,5%CO2)下培养和维持细胞。培养条件可以针对每种细胞类型变化。例如,细胞生长培养基可以在pH、葡萄糖浓度、生长因子和其它营养物的存在方面变化。用于补充培养基的生长因子经常源自动物血液的血清,诸如胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清和/或猪血清。在某些实施方案中,如本文所述使用的培养基可以是商购可得的和/或充分描述的(参见,例如,BirchJ. R., R.G. Spier (编) Encyclopedia of Cell Technology, Wiley. 411-424, 2000;Keen M. J. Cytotechnology 17: 125-132, 1995; Zang, 等人. Bio/Technology. 13:389-392, 1995)。在某些实施方案中,使用化学成分确定的培养基。
生产用于基因修饰测定的细胞的方法
本发明的基于可活化报告盒的系统通常需要具有核酸酶识别位点(NRS 1)的可活化报告盒、具有核酸酶识别位点(NRS2)的靶基因、受RNA引导的核酸酶(例如,Cas9或Cpf1)和两个gRNA:一个靶向所述可活化报告盒,且一个靶向所述靶基因。本发明包括多种生产包含前述工具的细胞的方法。
例如,可以将gRNA或编码gRNA的核酸转染进已经表达靶基因、可活化报告盒(例如,已经被事先转染)和受RNA引导的核酸酶(例如,Cas9或Cpf1)的细胞中。因而,在某些实施方案中,生产用于基因修饰测定的细胞的方法包括用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(c)受RNA引导的核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。应当理解,在某些实施方案中,用gRNA (而不是编码gRNA的核酸)转染细胞。在某些实施方案中,生产用于基因修饰测定的细胞的方法包括:(a)用至少一种经工程改造的核酸转染第一细胞群体,所述细胞表达(i)第一目标靶基因,其包含对所述第一目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)受RNA引导的核酸酶,其切割(a)(i)的核酸酶识别位点和(a)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(a)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA,和(b)用至少一种经工程改造的核酸转染第二细胞群体,所述细胞表达(i)包含核酸酶识别位点的第二目标靶基因,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)受RNA引导的核酸酶,其切割(b)(i)的核酸酶识别位点和(b)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(b)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
作为另一个实施例,可以将gRNA或编码gRNA的核酸转染进这样的细胞中:其已经表达靶基因和可活化报告盒,但是不表达受RNA引导的核酸酶(例如,Cas9)。因而,在某些实施方案中,生产用于基因修饰测定的细胞的方法包括用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。在某些实施方案中,所述至少一种经工程改造的核酸进一步编码受RNA引导的核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点。在某些实施方案中,所述方法进一步包括用经工程改造的核酸转染所述细胞,所述经工程改造的核酸编码受RNA引导的核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点。在某些实施方案中,可以将经纯化的受RNA引导的核酸酶(例如,Cas9或Cpf1)引入所述细胞中。
作为另一个实施例,可以将可活化报告盒和gRNA,或编码gRNA的核酸转染进这样的细胞中:其已经表达或包括靶基因和受RNA引导的核酸酶(例如,Cas9)。因而,在某些实施方案中,生产用于基因修饰测定的细胞的方法包括用经工程改造的核酸构建体转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)受RNA引导的核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点并切割可活化报告盒的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述可活化报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
作为再另一个实施例,可以将可活化报告盒和gRNA,或编码gRNA的核酸转染进这样的细胞中:其已经表达靶基因,但是不表达受RNA引导的核酸酶(例如,Cas9)。因而,在某些实施方案中,生产用于基因修饰测定的细胞的方法包括用经工程改造的核酸构建体转染表达目标靶基因的细胞,所述目标靶基因包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述可活化报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。在某些实施方案中,所述至少一种经工程改造的编码gRNA的核酸进一步编码受RNA引导的核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点并切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点。在某些实施方案中,所述经工程改造的编码DNA-BDRS和可活化报告构建体的核酸构建体进一步编码核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点并切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点。在某些实施方案中,所述方法进一步包括用编码受RNA引导的核酸酶的核酸转染所述细胞,所述受RNA引导的核酸酶切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点并切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点。
应用
本发明的经工程改造的核酸构建体(包括可活化报告盒)可以用在多种应用中,包括、但不限于,合成致死性筛选(参见,例如,图18-20)、CRISPRi/a(失活/活化)筛选(图21)、CRISPR/Cas9敲除排列筛选测定(参见,例如,图22)、脱靶检测测定、细胞系产生(例如,富集敲入事件)、混合-至-排列筛选和加条形码(图23A-23C)。可活化报告盒的其它应用和用途包括、但不限于,单细胞分析、在细胞群体中分离特定突变、分析在细胞中的抗药性、抗体产生、分离能够高蛋白生产的克隆、以及全基因组标记和分离。参见,例如,Mali P, 等人.Science. 2013年2月15日; 339(6121):823-6; Want T, 等人. Science. 2014年1月3日;343(6166):80-4;Shalem O, 等人. Science. 2014年1月3日; 343(6166):84-7; Koike-Yusa H, 等人. Nat Biotechnol. 2014年3月;32(3):267-73;和Zhou Z, 等人. Nature.2014年5月22日;509(7501):487-91。
在某些实施方案中,可以使用可活化报告盒来制备敲除的细胞或生物。例如,通过在细胞中共表达(或向细胞中引入)可活化报告盒、对所述可活化报告盒的核酸酶识别位点特异性的gRNA、对存在于目标靶基因中的核酸酶识别位点特异性的gRNA和切割所述核酸酶识别位点的受RNA引导的核酸酶(例如,Cas9或Cpf1),可以产生敲除的细胞。在某些实施方案中,所述靶基因含有对所述靶基因特异性的约20个核苷酸DNA序列,且所述靶序列在前间隔序列邻近基序(PAM)的上游紧邻处。
在某些实施方案中,可以使用可活化报告盒来活化或抑制靶基因。例如,Cas9的一个特征是它的结合靶DNA的能力,该能力独立于它的切割靶DNA的能力。具体地,通过点突变(在SpCas9中的D10A和H840A),可以使RuvC-和HNH-核酸酶结构域成为无活性的,从而产生不可切割靶DNA的核酸酶死亡Cas9 (dCas9)分子。所述dCas9分子保留基于gRNA靶向序列而结合靶DNA的能力。在某些实施方案中,dCas9可以靶向转录起始位点以通过阻断转录起始来“抑制”或“击昏”转录。在某些实施方案中,可以用转录阻遏物或活化剂标记dCas9,且可以将这些dCas9融合蛋白靶向启动子区域,从而导致下游靶基因的稳健转录抑制或活化。最简单的基于dCas9的活化剂和阻遏物包括直接与单一转录活化剂A (例如,VP64)或转录阻遏物R (例如,KRAB)融合的dCas9。在某些实施方案中,通过在细胞中共表达(或向细胞中引入)可活化报告盒、对所述可活化报告盒的核酸酶识别位点特异性的gRNA、Cas9或Cpf 1核酸酶、对靶基因的转录起始位点特异性的gRNA和基于dCas9的活化剂或阻遏物,可以活化或抑制细胞中的靶基因。
在某些实施方案中,可活化报告盒可以用于全基因组筛选应用。
在某些实施方案中,本文提供的方法是无病毒的。也就是说,所述方法不需要使用基于病毒的递送系统。但是,应当理解,尽管本发明的经工程改造的核酸可以在不用病毒载体的情况下插入基因组的精确和预定位置,但是在某些实施方案中,所述构建体的递送可以经由病毒载体(例如,慢病毒载体)随机地引入基因组中。
本发明也提供了组合物和试剂盒,其包含至少一种本发明的经工程改造的核酸构建体(例如,可活化报告盒)。
本发明进一步提供了被以下编号的段落包括的实施方案:
1. 一种经工程改造的核酸构建体,其包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述可活化报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
2. 段落1的经工程改造的核酸构建体,其中所述上游选择标记基因是无启动子的。
3. 段落1的经工程改造的核酸构建体,其中所述上游选择标记基因可操作地连接至启动子。
4. 段落1-3中的任一段的经工程改造的核酸构建体,所述核酸构建体进一步包含编码目标基因的核酸。
5. 段落4的经工程改造的核酸构建体,其中所述目标基因编码核酸酶。
6. 段落5的经工程改造的核酸构建体,其中所述核酸酶是Cas9。
7. 段落5的经工程改造的核酸构建体,其中所述核酸酶是Cpf1。
8. 一种细胞,其包含(a)包含至少一个核酸酶识别位点的目标靶基因,(b)段落1-7中的任一段的经工程改造的核酸构建体,和(c)结合所述DNA-BDRS的可编程的核酸酶。
9. 段落8的细胞,其中所述可编程的核酸酶是锌指核酸酶、转录活化剂-样效应物核酸酶或Cas9-FokI核酸酶。
10. 段落8或9的细胞,所述细胞进一步包含核酸酶,所述核酸酶切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点且切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点。
11. 段落10的细胞,其中所述核酸酶是Cas9。
12. 段落10的细胞,其中所述核酸酶是Cpf1。
13. 段落8-12中的任一段的细胞,所述细胞进一步包含与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA。
14. 段落13的细胞,其中与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA由位于相同构建体上的经工程改造的核酸编码。
15. 段落14的细胞,其中所述构建体进一步包含编码所述核酸酶的核酸。
16. 段落8-15中的任一段的细胞,所述细胞包含多个gRNA,每个与所述目标靶基因的不同核酸酶识别位点互补。
17. 段落8-16中的任一段的细胞,其中由所述上游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性、潮霉素抗性、clonNAT抗性或三氯生抗性。
18. 段落8-17中的任一段的细胞,其中由所述下游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性、潮霉素抗性、clonNAT抗性或三氯生抗性。
19. 段落8-18中的任一段的细胞,其中所述可活化报告盒的核酸酶识别位点否则不会存在于所述细胞的基因组中。
20. 段落8-19中的任一段的细胞,其中所述细胞是细菌细胞。
21. 段落8-19中的任一段的细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
22. 段落21的细胞,其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
23. 段落21或22的细胞,其中所述细胞是多能干细胞。
24. 段落23的细胞,其中所述细胞是诱导的多能干细胞。
25. 一个细胞群体,其包含段落8-24中的任一段的细胞。
26. 一种培养物,其包含细胞培养基和段落25的细胞群体。
27. 一种细胞,其表达: (a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点;(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点;(c)核酸酶,其切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点并切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点;和(d)与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA。
28. 段落27的细胞,其中由所述上游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性或三氯生抗性。
29. 段落27或28的细胞,其中由所述下游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性或三氯生抗性。
30. 段落27-29中的任一段的细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
31. 段落30的细胞,其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
32. 段落27-31中的任一段的细胞,其中所述细胞是多能干细胞。
33. 段落32的细胞,其中所述细胞是诱导的多能干细胞。
34. 一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(c)核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
35. 段落34的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: (a)第一核苷酸序列,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二核苷酸序列,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
36. 段落34的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: 第一核苷酸序列,其编码与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二核苷酸序列,其编码与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
37. 段落34的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
38. 段落34-37中的任一段的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致(a)的核酸酶识别位点的切割、(b)的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
39. 段落38的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
40. 段落39的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
41. 一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括: (a)用至少一种经工程改造的核酸转染第一细胞群体,所述细胞表达(i)第一目标靶基因,其包含对所述第一目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)核酸酶,其切割(a)(i)的核酸酶识别位点和(a)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(a)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA;和(b)用至少一种经工程改造的核酸转染第二细胞群体,所述细胞表达(i)包含核酸酶识别位点的第二目标靶基因,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)核酸酶,其切割(b)(i)的核酸酶识别位点和(b)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(b)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
42. 段落41的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述第一群体的细胞和所述第二群体的细胞,所述特定条件分别导致(a)(i)、(a)(ii)、(b)(i)和(b)(ii)的核酸酶识别位点的切割和(a)(ii)和(b)(ii)的下游选择标记基因与(a)(ii)和(b)(ii)的上游选择标记基因一起从框架外至框架内的重构。
43. 段落42的方法,所述方法进一步包括选择第一群体的细胞和选择第二群体的细胞,所述第一群体的细胞表达由(a)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记,所述第二群体的细胞表达由(b)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记。
44. 段落43的方法,所述方法进一步包括分析第一群体的细胞的表型和分析第二群体的细胞的表型,所述第一群体的细胞表达由(a)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记,所述第二群体的细胞表达由(b)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记。
45. 一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:向细胞中引入至少一种经工程改造的与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(c)核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
46. 段落45的方法,其中通过电穿孔将所述gRNA引入所述细胞中。
47. 一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
48. 段落47的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: 第一经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
49. 段落47的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: 第一经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
50. 段落47的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
51. 段落47-50中的任一段的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸进一步编码切割(a)和(b)的核酸酶识别位点的核酸酶。
52. 段落47-50中的任一段的方法,所述方法进一步包括用经工程改造的核酸转染所述细胞,所述经工程改造的核酸编码切割(a)和(b)的核酸酶识别位点的核酸酶。
53. 段落51或52的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致(a)的核酸酶识别位点的切割、(b)的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
54. 段落53的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
55. 段落54的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
56. 一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用经工程改造的核酸构建体转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点并切割可活化报告盒的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化的报告盒,所述可活化的报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
57. 段落56的方法,其中所述上游选择标记基因是无启动子的。
58. 段落56的方法,其中所述上游选择标记基因可操作地连接至启动子。
59. 段落56-58中的任一段的方法,其中所述细胞进一步表达可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
60. 段落56-58中的任一段的方法,所述方法进一步包括用核酸转染所述细胞,所述核酸编码可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
61. 段落59或60的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述可活化报告盒向所述细胞的基因组中的插入和所述上游选择标记基因的表达。
62. 段落61的方法,所述方法进一步包括选择表达所述上游选择标记基因的细胞。
63. 段落62的方法,所述方法进一步包括用至少一种经工程改造的核酸转染表达所述上游选择标记基因的细胞,所述经工程改造的核酸编码与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
64. 段落63的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: 第一经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
65. 段落63的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: 第一经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
66. 段落63的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
67. 段落63-66中的任一段的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述目标靶基因的核酸酶识别位点的切割、所述可活化报告盒的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
68. 段落67的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
69. 段落68的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
70. 一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用经工程改造的核酸构建体转染细胞,所述细胞表达包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点的目标靶基因,所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述可活化报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
71. 段落70的方法,其中所述上游选择标记基因是无启动子的。
72. 段落70的方法,其中所述上游选择标记基因可操作地连接至第一启动子。
73. 段落70-72中的任一段的方法,其中所述细胞进一步表达可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
74. 段落70-72中的任一段的方法,所述方法进一步包括用核酸转染所述细胞,所述核酸编码可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
75. 段落73或74的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述可活化报告盒向所述细胞的基因组中的插入和所述上游选择标记基因的表达。
76. 段落75的方法,所述方法进一步包括选择表达所述上游选择标记基因的细胞。
77. 段落76的方法,所述方法进一步包括用至少一种经工程改造的核酸转染表达所述上游选择标记基因的细胞,所述经工程改造的核酸编码与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
78. 段落77的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: 第一经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
79. 段落77的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括: 第一经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和第二经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
80. 段落79的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
81. 段落77-80中的任一段的方法,其中所述至少一种经工程改造的编码gRNA的核酸进一步编码核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点且切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点。
82. 段落70-81中的任一段的方法,其中所述经工程改造的编码DNA-BDRS和可活化报告构建体的核酸构建体进一步编码核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点且切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点。
83. 段落82的方法,其中所述可活化报告构建体的上游选择标记基因可操作地连接至第一启动子,且所述核酸酶由可操作地连接至不同于所述第一启动子的第二启动子的基因编码。
84. 段落81或82的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述目标靶基因的核酸酶识别位点的切割、所述可活化报告盒的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
85. 段落84的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
86. 段落85的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
87. 一种方法,其包括(a)将试剂引入混合群体的细胞中,所述细胞包含(i)包含至少一个核酸酶识别位点的目标靶基因,和(ii)至少一个可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,其中所述试剂包含切割所述至少一个核酸酶识别位点的核酸酶、与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此产生包含所述试剂的细胞;(b)在特定条件下温育(a)的包含所述试剂的细胞,所述特定条件导致所述上游选择标记基因的表达和所述至少一个核酸酶识别位点的切割,由此产生表达所述上游选择标记基因的细胞;和(c)在特定条件下使(b)的表达所述上游选择标记基因的细胞与所述下游选择标记基因的有关选择剂接触,所述特定条件导致不表达所述下游选择标记基因的细胞的死亡,由此产生表达所述下游选择标记基因的细胞。
88. 一种方法,其包括(a)将试剂引入混合群体的细胞中,所述细胞包含(i)包含至少一个核酸酶识别位点的目标靶基因,(ii)至少一个可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)切割所述至少一个核酸酶识别位点的核酸酶,其中所述试剂包含与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此产生包含所述试剂的细胞;和(b)在特定条件下温育(a)的包含所述试剂的细胞,所述特定条件导致所述上游选择标记基因的表达和所述至少一个核酸酶识别位点的切割,由此产生表达所述上游选择标记基因的细胞;和(c)在特定条件下使(b)的表达所述上游选择标记基因的细胞与所述下游选择标记基因的有关选择剂接触,所述特定条件导致不表达所述下游选择标记基因的细胞的死亡,由此产生表达所述下游选择标记基因的细胞。
89. 段落87或88的方法,所述方法进一步包括分析在(c)中产生的表达所述下游选择标记基因的细胞。
实施例
实施例1
本文提供的研究的结果表明特定细胞系的有效产生,所述特定细胞系含有在AAVS 1基因座中的编码Cas9的转基因以及可活化报告盒。
本文提供的研究的结果也表明,rpsL-BSD反选择可以用于有效地制备基于质粒的指导RNA文库。最初,实验检验了转化体是否可以直接用于含有卡那霉素和链霉素的液体培养,从而省略铺板和集落挑选的艰苦步骤。对比来自接种了单个集落或转化产物的培养物的分离质粒。使用Sanger测序方法和Fragment Analyzer™针对96种靶向含溴区结构域的基因的指导RNA执行该对比,以分别控制正确地连接的寡核苷酸二聚体在pU6质粒中的质量和数量。结果证实,该方法可以以高通量方式使用,并实质上减小质粒文库制备所需的努力。
实施例2
图23A显示了具有特定条形码的GFP-阳性细胞(带阴影的灰色),所述特定条形码由含有NRS 1识别位点的可活化报告盒表示。该条形码是对该细胞特异性的,因而在用Cas9和靶向NRS 1的gRNA转染后仅在该细胞中可以得到杀稻瘟素抗性。杀稻瘟素选择(在用特定指导RNA转染以后)将分离与特异性条形码结合的特定细胞。在某些实施方案中,可以分离盘(培养皿)上的所有细胞,各自含有对该细胞特异性的条形码。在某些实施方案中,可以使用至少1012个不同的条形码。
用于加条形码的实施例方案:
(1)第0天–用Cas9和gRNA转染含有条形码(可活化报告盒)的细胞的混合群体;
(2)第3天–添加选择剂(例如,杀稻瘟素)和分析细胞生长
(3)第14天–分析对选择剂有抗性的残余细胞中的GFP表达。
实施例3
CRISPR筛选代表一种有前途的鉴别适合用于治疗靶向的基因的方案。越来越多的研究成功地利用CRISPR技术以混合的或排列的方式执行基因筛选,最常见地通过指导RNA文库的慢病毒递送。但是,慢病毒文库的实际缺点(包括成本、费力生产、对于最终用户而言不可再生的储备物、对生物安全2级设施的需要和病毒相容的自动化基础设施)正在限制基于病毒的指导RNA文库的应用。此外,病毒DNA的随机整合性质可以潜在地干扰一些表型分析。另外,向Cas9的长期暴露和由慢病毒提供的指导RNA表达可能产生有害效应。
可替换地,质粒文库的转染可以用于递送指导RNA。但是,核酸的转染效率在许多细胞类型中是次优的。在潜在小比例的未转染细胞将具有生长优势从而掩蔽读出和损害结果的情况下,这对于负选择筛选而言是特别有关的。
在某些实施方案中,可以使用本发明的方法(REM插入缺失)有效地富集被靶向的细胞和促进指导RNA文库以基于载体的排列形式的筛选。REM插入缺失盒可以精确地整合在靶细胞的安全港基因座(AAVS 1)中。REM插入缺失盒包括串联的两种抗生素选择:第一种(例如,嘌呤霉素)允许选择具有正确盒整合的细胞,而第二种是框架外(REM位点的下游,例如,图24)无功能标志物(例如,杀稻瘟素),其在REM位点的CRISPR切割后通过DNA修复而重构(图24)。用靶向目标基因(GFP, 图24)和REM位点的CRISPR转染REM插入缺失细胞会同时活化杀稻瘟素和在目标基因中建立敲除(KO)。杀稻瘟素选择会实现KO细胞的富集(图24)。因此,细胞“想起”向Cas9的暴露,具有选择标记的永久活化。
实施例4
与大规模指导RNA (gRNA)文库组合的Cas9核酸酶已经作为令人激动的用于正向基因筛选的新工具出现。在用于培养的细胞的基因筛选的排列策略中,将gRNA安排在多孔平板中以通过转染或病毒转导来递送。每个gRNA必须单独地制备,所以迫切需要有成本效益的方法来制备大规模排列的资源。
本实施例表明,可以将PCR产物形式的GFP盒有效地转染进人细胞中,从而导致可检测的表达(图25)。用于PCR方法的寡核苷酸的重叠延伸设计可以用于扩增含有U6启动子的任何盒,例如,与gRNA主链一起(图26 A)。所述PCR产物在稳定地表达Cas9的HEK293细胞中诱导基因敲除(图26B)。可以使用PCR-gRNA来制备有成本效益的gRNA文库。此外,重叠延伸寡核苷酸也可以用于gRNA的无连接克隆(图27 A)。这通过证实以下内容来验证:使用用重叠延伸产生的PCR产物,将11种gRNA中的9种正确地组装进所述载体中(图27B)。
这种用于制备gRNA的方法是特别有用的,例如,当与无病毒的排列筛选策略(REM插入缺失)一起以较大规模使用时,如本文中提供的。
实施例5
Cas9 DNA切割系统已经作为用于基因靶向的有效且简单方法出现。在这里,使用靶向人基因组中的不同基因座的单和双指导RNA (gRNA)检查基于REM插入缺失的编辑过基因组的人细胞的富集。
以质粒形式制备两个或更多个针对被靶向的基因的gRNA (图28 A)并单独地或与编码REM插入缺失gRNA和Cas9的质粒一起转染进HEK293-REM细胞中。在用细胞测定和扩增子下一代测序选择之前和之后,测量插入缺失频率(图28B)。
使用两个靶向目标基因的gRNA实现了更高的插入缺失频率(图29A, 上图)。在含有被双-gRNA诱导的大插入缺失的样品上成功地执行NGS分析(图29B, 下图)。应用双-gRNA和REM插入缺失,在富集的细胞群体中的不同基因座处产生超过80%的插入缺失频率(图29B)。这可以翻译为更高的敲除机会,并从而增加使用CRISPR系统的表型筛选的成功率。除了相对于细胞测定提供关于测量插入缺失频率更一致的结果以外,扩增子测序也提供了关于靶向基因座上的DNA修复机制的输出的洞察(图29C)。总之,这些数据指示,REM插入缺失对于富集含有Cas9核酸酶诱导的突变的细胞而言是非常有效的。
实施例6
将负选择筛选用于治疗靶标发现以鉴别不同细胞类型中与基础过程有关的必需基因集合。如本文提供的,'REM插入缺失'可以用作朝向基于CRISPR/Cas9的敲除筛选的无病毒方法。REM插入缺失能够经由转染实现质粒形式指导RNA (gRNA)文库,从而降低将文库制备为病毒颗粒所需的成本和努力。在这里,聚焦于在不同实验条件下的负选择来检查REM插入缺失方案的效力。
针对在人基因组中具有高丰度的Alu元件设计gRNA (图30)。预期Cas9与这些gRNA一起的表达会诱导基因组中高数目的双链断裂并触发细胞死亡。在具有(在有REM插入缺失盒存在下)和没有(在没有REM插入缺失盒存在下) REM插入缺失选择的HEK293细胞中相对于靶向非必需基因(AAVS 1)的gRNA单独地测试了这三种gRNA。还用接种的细胞的两种不同开始汇合在三种不同转染效率设置(如通过转染以后48小时的GFP表达所测量的)下执行实验。使用INCUCYTE®来确定转染效率和汇合的测量(图31)。
结果表明,在不使用REM插入缺失下,未转染的细胞具有超过转染的细胞的生长优势并掩蔽致死性读出。REM插入缺失能够实现未转染的细胞的消除并成功地检测Alu gRNA的致死性效应。排列格式筛选通常在微孔平板中进行。因而,开始细胞群体应当尽可能低以避免在实验时程中细胞的过度汇合。值得注意的是,使用仅REM插入缺失用低开始细胞密度实现了预期的实验成功(图31)。这些结果表明,REM插入缺失的应用会增加关于必需基因的排列格式筛选的准确度和效力。
实施例7
使用CRISPR系统执行成功的排列格式基因靶向的一个步骤是,确保Cas9和导向-RNA(gRNA)向细胞中的有效递送。尽管通过病毒转导实现的gRNA递送可以提供在转导的细胞中的有效表达,但是向Cas9的长期基因组暴露和由整合的病毒提供的gRNA可以导致脱靶效应,从而损害实验读出。可替换地,还可以使用经由质粒的转染实现的gRNA的瞬时表达。但是,一般而言,质粒转染不是象病毒转导一样有效的操作,并且该变化(特别是关于CRISPR试剂)可能潜在地影响实验的总体结果,因为具有获得的表型的细胞亚群依赖于转染效率。可以使用'REM插入缺失'作为用于增强CRISPR系统的敲除应用的基于转染的方法。在该实施例中,试验了具有不同转染效率的REM插入缺失结果。
首先制备了质粒,其含有Cas9-GFP以及串联的两个gRNA (图32A)。CLU4-gRNA精确地靶向CLU4基因中的限制性酶位点。所述位点在成功靶向后将被破坏,从而避免消化效率的定量和片段分析(图32B)。为了得到不同的转染效率,以逐步方式缩减用于将gRNA-Cas9质粒转染进固定量的细胞中的转染试剂的量(图32C)。转染以后,将所述细胞分成两组(以用REM插入缺失选择或不选择)。最后,使用片段分析仪测量靶向效率。
结果表明,增加的转染效率与增加的插入缺失频率直接相关。尽管如此,在REM插入缺失富集以后,在所有差别地转染的样品之间检测到相同的插入缺失频率(图图32D)。
这些数据证实,REM插入缺失选择能够实现相同的插入缺失富集水平,不论转染效率。
实施例8
CRISPR-Cas9系统已经作为用于在选择的基因上建立突变和产生敲除的细胞的有效工具出现。但是,如果所述突变不会造成移码,被靶向的基因仍然可以被转录以产生功能蛋白。此外,接受者细胞系的倍性极大地影响突变结果。就二倍体细胞中的KO而言,两个等位基因(优选地在影响所有转录物变体的基因区域中)需要具有适当的移码。如本文提供的,'REM插入缺失' 是用于富集突变的细胞的方法。在该实施例中,使用REM插入缺失来产生和富集敲除的表型。
靶向了糖基磷脂酰肌醇(GPI锚)生物合成所必需的7个基因(PIG),并使用灵敏的FACS读出(FLAER测定)。在HEK293-REM插入缺失细胞(主要是三倍体)中以排列形式靶向PIG基因,并将细胞的百分比与具有或没有REM插入缺失选择的敲除表型进行对比。使用基于脂质的转染方案以质粒形式转染所有gRNA (图33 A)。
使用FLAER测定的FACS分析(图33B)提供了GPI敲除的HEK293细胞的高灵敏度检测。REM插入缺失显著地富集“真实地”敲除的细胞的群体,且在一种情况下(PIGN),KO表型的检测在没有REM插入缺失下已经是不可能的(图33C)。该研究证实,REM插入缺失是对敲除细胞富集的有效方法。
实施例9
在HCT116-REM细胞中以排列形式针对38个含有溴区结构域的基因执行了致死性筛选。在3周中每天测量汇合。将Alu gRNA和AAVS 1分别用作致死和非致死对照。使用FuGeneHD转染试剂将含有Cas9和gRNA的质粒转染进HCT116细胞中。在第3天直到第9天,选择1周(1 μg/mL嘌呤霉素和10 μg/mL杀稻瘟素)。在96-孔格式平板中培养细胞,并每天更换培养基。结果显示在图34中。图35显示了汇合端点测量结果和靶向每个基因的gRNA的数目。
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请关于各自引用的主题通过引用并入,其在某些情况下可以包括所述文件的整体。
除非明确地相反指出,否则本文在说明书中和在权利要求中使用的不定冠词“一个/种”应当被理解为是指“至少一个/种”。
还应当理解,除非明确地相反指出,否则在本文要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中,所述方法的步骤或动作的次序不一定限于列举所述方法的步骤或动作的次序。
在权利要求中以及在上述说明书中,所有过渡短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“包括”、“容纳”、“由……构成”等应当理解为开放式的,即,意在包括、但不限于。仅过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭式或半封闭式过渡短语,如在美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures), 第2111.03部分中所述。
Claims (89)
1.一种经工程改造的核酸构建体,其包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述可活化报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
2.权利要求1的经工程改造的核酸构建体,其中所述上游选择标记基因是无启动子的。
3.权利要求1的经工程改造的核酸构建体,其中所述上游选择标记基因可操作地连接至启动子。
4.权利要求1的经工程改造的核酸构建体,所述核酸构建体进一步包含编码目标基因的核酸。
5.权利要求4的经工程改造的核酸构建体,其中所述目标基因编码核酸酶。
6.权利要求5的经工程改造的核酸构建体,其中所述核酸酶是Cas9。
7.权利要求5的经工程改造的核酸构建体,其中所述核酸酶是Cpf1。
8.一种细胞,其包含(a)包含至少一个核酸酶识别位点的目标靶基因, (b)权利要求1的经工程改造的核酸构建体,和(c)结合所述DNA-BDRS的可编程的核酸酶。
9.权利要求8的细胞,其中所述可编程的核酸酶是锌指核酸酶、转录活化剂-样效应物核酸酶或Cas9-FokI核酸酶。
10.权利要求8的细胞,所述细胞进一步包含核酸酶,所述核酸酶切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点且切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点。
11.权利要求10的细胞,其中所述核酸酶是Cas9。
12.权利要求10的细胞,其中所述核酸酶是Cpf1。
13.权利要求8的细胞,所述细胞进一步包含与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA。
14.权利要求13的细胞,其中与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA由位于相同构建体上的经工程改造的核酸编码。
15.权利要求14的细胞,其中所述构建体进一步包含编码所述核酸酶的核酸。
16.权利要求8的细胞,所述细胞包含多个gRNA,每个与所述目标靶基因的不同核酸酶识别位点互补。
17.权利要求8的细胞,其中由所述上游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性、潮霉素抗性、clonNAT抗性或三氯生抗性。
18.权利要求8的细胞,其中由所述下游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性、潮霉素抗性、clonNAT抗性或三氯生抗性。
19.权利要求8的细胞,其中所述可活化报告盒的核酸酶识别位点否则不会存在于所述细胞的基因组中。
20.权利要求8的细胞,其中所述细胞是细菌细胞。
21.权利要求8的细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
22.权利要求21的细胞,其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
23.权利要求21的细胞,其中所述细胞是多能干细胞。
24.权利要求23的细胞,其中所述细胞是诱导的多能干细胞。
25.一个细胞群体,其包含权利要求8的细胞。
26.一种培养物,其包含细胞培养基和权利要求25的细胞群体。
27.一种细胞,其表达:
(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点;
(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点;
(c)核酸酶,其切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点并切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点;和
(d)与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA。
28.权利要求27的细胞,其中由所述上游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性或三氯生抗性。
29.权利要求27的细胞,其中由所述下游选择标记基因编码的选择标记给所述细胞赋予嘌呤霉素抗性、杀稻瘟素S脱氨酶抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、遗传霉素抗性或三氯生抗性。
30.权利要求27的细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
31.权利要求30的细胞,其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
32.权利要求27的细胞,其中所述细胞是多能干细胞。
33.权利要求32的细胞,其中所述细胞是诱导的多能干细胞。
34.一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(c)核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
35.权利要求34的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一核苷酸序列,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二核苷酸序列,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
36.权利要求34的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一核苷酸序列,其编码与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二核苷酸序列,其编码与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
37.权利要求34的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
38.权利要求34的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致(a)的核酸酶识别位点的切割、(b)的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
39.权利要求38的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
40.权利要求39的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
41.一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:
(a)用至少一种经工程改造的核酸转染第一细胞群体,所述细胞表达(i)第一目标靶基因,其包含对所述第一目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)核酸酶,其切割(a)(i)的核酸酶识别位点和(a)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(a)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(a)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
(b)用至少一种经工程改造的核酸转染第二细胞群体,所述细胞表达(i)包含核酸酶识别位点的第二目标靶基因,(ii)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)核酸酶,其切割(b)(i)的核酸酶识别位点和(b)(ii)的核酸酶识别位点,所述经工程改造的核酸编码与(b)(i)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)(ii)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
42.权利要求41的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述第一群体的细胞和所述第二群体的细胞,所述特定条件分别导致(a)(i)、(a)(ii)、(b)(i)和(b)(ii)的核酸酶识别位点的切割和(a)(ii)和(b)(ii)的下游选择标记基因与(a)(ii)和(b)(ii)的上游选择标记基因一起从框架外至框架内的重构。
43.权利要求42的方法,所述方法进一步包括选择第一群体的细胞和选择第二群体的细胞,所述第一群体的细胞表达由(a)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记,所述第二群体的细胞表达由(b)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记。
44.权利要求43的方法,所述方法进一步包括分析第一群体的细胞的表型和分析第二群体的细胞的表型,所述第一群体的细胞表达由(a)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记,所述第二群体的细胞表达由(b)(ii)的下游选择标记基因编码的下游选择标记。
45.一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:
向细胞中引入至少一种经工程改造的与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(c)核酸酶,其切割(a)和(b)的核酸酶识别位点,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
46.权利要求45的方法,其中通过电穿孔将所述gRNA引入所述细胞中。
47.一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:
用至少一种经工程改造的核酸转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,
所述经工程改造的核酸编码与(a)的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与(b)的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此生产用于基因修饰测定的细胞。
48.权利要求47的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的特异性核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的特异性核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
49.权利要求47的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的特异性第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的特异性第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
50.权利要求47的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
51.权利要求47的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸进一步编码切割(a)和(b)的核酸酶识别位点的核酸酶。
52.权利要求47的方法,所述方法进一步包括用经工程改造的核酸转染所述细胞,所述经工程改造的核酸编码切割(a)和(b)的核酸酶识别位点的核酸酶。
53.权利要求51的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致(a)的核酸酶识别位点的切割、(b)的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
54.权利要求53的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
55.权利要求54的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
56.一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:
用经工程改造的核酸构建体转染细胞,所述细胞表达(a)目标靶基因,其包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点,和(b)核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点并切割可活化报告盒的核酸酶识别位点,
所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化的报告盒,所述可活化的报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
57.权利要求56的方法,其中所述上游选择标记基因是无启动子的。
58.权利要求56的方法,其中所述上游选择标记基因可操作地连接至启动子。
59.权利要求56的方法,其中所述细胞进一步表达可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
60.权利要求56的方法,所述方法进一步包括用核酸转染所述细胞,所述核酸编码可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
61.权利要求59的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述可活化报告盒向所述细胞的基因组中的插入和所述上游选择标记基因的表达。
62.权利要求61的方法,所述方法进一步包括选择表达所述上游选择标记基因的细胞。
63.权利要求62的方法,所述方法进一步包括用至少一种经工程改造的核酸转染表达所述上游选择标记基因的细胞,所述经工程改造的核酸编码与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
64.权利要求63的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
65.权利要求63的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
66.权利要求63的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
67.权利要求63的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述目标靶基因的核酸酶识别位点的切割、所述可活化报告盒的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
68.权利要求67的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
69.权利要求68的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
70.一种生产用于基因修饰测定的细胞的方法,所述方法包括:
用经工程改造的核酸构建体转染细胞,所述细胞表达包含对所述目标靶基因特异性的核酸酶识别位点的目标靶基因,所述经工程改造的核酸构建体包含脱氧核糖核酸-结合结构域识别位点(DNA-BDRS)和可活化报告盒,所述可活化报告盒包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点。
71.权利要求70的方法,其中所述上游选择标记基因是无启动子的。
72.权利要求70的方法,其中所述上游选择标记基因可操作地连接至第一启动子。
73.权利要求70的方法,其中所述细胞进一步表达可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
74.权利要求70的方法,所述方法进一步包括用核酸转染所述细胞,所述核酸编码可编程的核酸酶,其结合并切割所述DNA-BDRS。
75.权利要求73的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述可活化报告盒向所述细胞的基因组中的插入和所述上游选择标记基因的表达。
76.权利要求75的方法,所述方法进一步包括选择表达所述上游选择标记基因的细胞。
77.权利要求76的方法,所述方法进一步包括用至少一种经工程改造的核酸转染表达所述上游选择标记基因的细胞,所述经工程改造的核酸编码与所述目标靶基因的核酸酶识别位点互补的指导RNA(gRNA)和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
78.权利要求77的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第一目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二经工程改造的核酸,其编码与由所述细胞表达的第二目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
79.权利要求77的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸包括:
第一经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA;和
第二经工程改造的核酸,其编码与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的gRNA且编码与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的gRNA。
80.权利要求79的方法,其中所述至少一种经工程改造的核酸编码至少三种gRNA:与所述目标靶基因的第一核酸酶识别位点互补的第一gRNA;与所述目标靶基因的第二核酸酶识别位点互补的第二gRNA;和与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的第三gRNA。
81.权利要求77所述的方法,其中所述至少一种经工程改造的编码gRNA的核酸进一步编码核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点且切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点。
82.权利要求70所述的方法其中所述经工程改造的编码DNA-BDRS和可活化报告构建体的核酸构建体进一步编码核酸酶,其切割所述目标靶基因的核酸酶识别位点且切割所述可活化报告盒的核酸酶识别位点。
83.权利要求82的方法,其中所述可活化报告构建体的上游选择标记基因可操作地连接至第一启动子,且所述核酸酶由可操作地连接至不同于所述第一启动子的第二启动子的基因编码。
84.权利要求81的方法,所述方法进一步包括在特定条件下温育所述细胞,所述特定条件导致所述目标靶基因的核酸酶识别位点的切割、所述可活化报告盒的核酸酶识别位点的切割和所述下游选择标记基因与所述上游选择标记基因从框架外至框架内的重构。
85.权利要求84的方法,所述方法进一步包括选择表达所述下游选择标记的细胞。
86.权利要求85的方法,所述方法进一步包括分析表达所述下游选择标记的细胞的表型。
87.一种方法,其包括:
(a)将试剂引入混合群体的细胞中,所述细胞包含(i)包含至少一个核酸酶识别位点的目标靶基因,和(ii)至少一个可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,其中所述试剂包含切割所述至少一个核酸酶识别位点的核酸酶、与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此产生包含所述试剂的细胞;
(b)在特定条件下温育(a)的包含所述试剂的细胞,所述特定条件导致所述上游选择标记基因的表达和所述至少一个核酸酶识别位点的切割,由此产生表达所述上游选择标记基因的细胞;和
(c)在特定条件下使(b)的表达所述上游选择标记基因的细胞与所述下游选择标记基因的有关选择剂接触,所述特定条件导致不表达所述下游选择标记基因的细胞的死亡,由此产生表达所述下游选择标记基因的细胞。
88.一种方法,其包括:
(a)将试剂引入混合群体的细胞中,所述细胞包含(i)包含至少一个核酸酶识别位点的目标靶基因,(ii)至少一个可活化报告盒,其包含侧接上游选择标记基因和不同于所述上游选择标记基因的下游框架外选择标记基因的核酸酶识别位点,和(iii)切割所述至少一个核酸酶识别位点的核酸酶,其中所述试剂包含与所述可活化报告盒的核酸酶识别位点互补的指导RNA (gRNA)和与目标靶基因的核酸酶识别位点互补的gRNA,由此产生包含所述试剂的细胞;和
(b)在特定条件下温育(a)的包含所述试剂的细胞,所述特定条件导致所述上游选择标记基因的表达和所述至少一个核酸酶识别位点的切割,由此产生表达所述上游选择标记基因的细胞;和
(c)在特定条件下使(b)的表达所述上游选择标记基因的细胞与所述下游选择标记基因的有关选择剂接触,所述特定条件导致不表达所述下游选择标记基因的细胞的死亡,由此产生表达所述下游选择标记基因的细胞。
89.权利要求87所述的方法,所述方法进一步包括分析在(c)中产生的表达所述下游选择标记基因的细胞。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000039347A1 (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-06 | St. Jude Children's Research Hospital | A tumor suppressor protein involved in death signaling, and diagnostics, therapeutics, and screening based on this protein |
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US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US5928906A (en) | 1996-05-09 | 1999-07-27 | Sequenom, Inc. | Process for direct sequencing during template amplification |
BR112016000571B1 (pt) * | 2013-07-10 | 2023-12-26 | President And Fellows Of Harvard College | Métodos in vitro para modular a expressão e para alterar um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula simultaneamente com a regulação da expressão de um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula, bem como célula de levedura ou bactéria compreendendo ácidos nucleicos |
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---|---|---|---|---|
WO2000039347A1 (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-06 | St. Jude Children's Research Hospital | A tumor suppressor protein involved in death signaling, and diagnostics, therapeutics, and screening based on this protein |
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Non-Patent Citations (2)
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---|
SURESH RAMAKRISHNA等: "Surrogate reporter-based enrichment of cells containing RNA-guided Cas9 nuclease-induced mutations", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
ZUYONG HE等: "Comparison of surrogate reporter systems for enrichment of cells with mutations induced by genome editors", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
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