CN1654074A - 抗肝癌基因药物组合物、小分子干扰rna及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗肝癌基因药物组合物，包含安全、有效量的反义fup1基因和/或小分子干扰RNA，及药学上可接受的辅剂。其中所述反义fup1基因具有序列表中SEQ ID NO：2所示DNA序列，所述小分子干扰RNA包含序列表中SEQ ID NO：3所示RNA序列。还提供采用ambion网站提供的RNAi设计软件，针对fup1的编码区设计小分子干扰RNA的抗肝癌基因药物筛选方法。进一步提供包含序列表中SEQ ID NO：3所示RNA序列的抗肝癌小分子。本发明以在肝癌细胞中高表达的基因fup1为药靶，针对其基因序列设计拮抗分子，为肝癌的基因治疗提供了有力的武器，并为进一步筛选抗肝癌的基因药物提供了很好的筛选平台。

Description

抗肝癌基因药物组合物、小分子干扰RNA及其筛选方法

技术领域

本发明涉及基因治疗，具体涉及肝癌的基因治疗药物及其筛选方法。

发明背景

肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝炎和肝癌的高发病国家，全世界肝癌患者的48％集中在我国。近20年来我国肝癌的发病率上升了近40％，居恶性肿瘤中的第三位。肝癌的早期诊断非常困难，而手术后的复发率高达50％，肝癌的死亡率在我国仅次于胃癌。

已有的研究结果表明，肝癌的发生与肝炎病毒(HBV，HCV)感染、肝硬化、黄曲霉素B1以及一些遗传因子密切相关。与其它组织来源的肿瘤相似，肝癌的发生发展同样是多阶段多步骤的过程，肿瘤的发生经常与致癌基因的过表达和抑癌基因的沉默有关。目前已经证明与人类肝癌的发生相关的一切基因如：p21、p53、Ras、Raf、c-Myc(Naka T，Toyota N，Kaneko T，Kaibara N.AnticancerRes，1998：18：555-564.Fujimoto Y，Hampton LL，Wirth PJ，Wang NJ，XieJP，Thorgeirsson SS.Cancer Res.1994 Jan 1；54(1)：281-5.)等，牵涉多条信号传导途径；但其中尚未发现一个为肝癌发生过程所独有或在大量样品中拥有显著的检出率者，例如ras癌基因在肝癌中发生变异的检出率仅为10-25％，抑癌基因p53的变异在肝癌样品中的检出率也只有30-50％。

为了研究与肝癌相关的基因表达，本发明者选取来自肝癌组织和正常肝组织的RNA为模板，分别逆转录放射性cDNA探针后，用之杂交固定有人类基因(EST)的尼龙膜。杂交结果经放射自显影后将图像通过专用软件GDA处理后，我们发现一个EST(Gemome System克隆号Hs15496)在肝癌组织样品中高表达而在正常肝组织样品中无表达(ratio值为99.9999，为对比之最大值)，差异十分显著。然后根据已知的EST Hs15496的序列分别合成上下游引物，以人肝细胞cDNA文库中抽提的质粒为模板对该片段进行了扩增，并随即进行了放射性同位素标记，用于人肝细胞cDNA文库的杂交筛选。通过两轮筛选，将阳性克隆进行了DNA序列测定。用测序获得的较长的cDNA片段对GenBank数据库进行查询，发现该基因的全长cDNA序列此时已经登录。该基因在GenBank的注册号(GI)为11434794，其cDNA全长为1233bp，由STS定位于第14号染色体上，在数据库中被称为假想蛋白FLJ10648(hypothetical proteinFLJ10648)。经比较，通过cDNA文库筛选所获得的cDNA片段的核苷酸序列与该假想蛋白的C端序列完全一致。检索结果发现，该基因仅仅是编码序列被报道，相关的功能研究仍是空白，故我们将其命名为fup1(function-unknownprotein 1)(见序列表中SEQ ID NO：1，其中下划线表示fup1基因上游的结合位点，大写字母表示fup1基因的开放阅读框(ORF))。

分别采用带有BamHI和EcoRI切割位点的上下游引物，以人肝细胞cDNA文库中抽提的质粒为模板，通过PCR扩增得到目的基因fup1和反义fup1基因(见序列表中SEQ ID NO：2)。以上fup1基因和反义fup1基因的PCR产物分别经EcoRI和BamHI处理后，根据其引物两端酶切位点的差异，采用双粘性末端连接，定向插入用相同核酸内切酶处理的pcDNA3真核表达载体内。经DNA测序鉴定，其正反向序列与GenBank中登录的序列数据完全一致。经采用Sim4软件将fup1 cDNA序列与最新的人第14号染色体基因组DNA序列数据进行比较，发现包含fup1基因的DNA序列全长为7415bp；其开放阅读框(ORF)由3个外显子(起始碱基数分别是1-82，1115-2194和7345-7415)组成，编码一个含有410个氨基酸残基的蛋白。经TESS软件分析，FUP1基因的上游启动子区域中除了AP-1、TFIID、GATA等在真核细胞中常见转录因子结合位点外，还含有在肝脏中多见的AFP-1、C/EBP-β和HNF-4等转录因子的结合位点。这些转录因子的存在表明该基因的表达可能具有组织特异性。

编码fup1基因的长度约为7.5kb的DNA序列位于一个更大的、长度约为45kb的mRNA前体上。经过转录和剪切后，该段前体所对应的成熟的mRNA可由一段cDNA序列来表示。在这段长度为2548bp的cDNA上，第306位至1538位碱基构成了FUP1的ORF，其5’和3’方向各有一段由305和1010个核苷酸构成的非翻译区域。

本发明者进一步测定了fup1基因在人类细胞株中的分布。采用人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721和BEL 7404，抽提这些细胞的总RNA，在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳，然后将变性RNA转移至尼龙膜上。采用随机掺入法制备放射性探针，将标记好的fup1特异性探针和β-actin内参探针杂交固定有人类肝癌细胞株RNA的尼龙膜。Northern Blots结果显示fup11基因在所检测的4种人类肝癌细胞株中都有高表达，表达量远高于正常肝组织。

将fup1基因克隆到带FLAG标签的重组载体上，瞬时转染小鼠成纤维细胞NIH3T3，发现转染72小时后表达fup1的细胞在核内显示出很强的荧光信号，说明fup1蛋白定位于细胞核内。

九十年代初期发现21到28个核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表达，随后在动物细胞中也发现了这一现象。但直到1998年2月华盛顿卡耐基研究院的Fire和马塞诸塞大学癌症中心的Mello首次将双链RNA(dsRNA)注入线虫，结果发现诱导了比单独注射正义链或者反义链都要强的靶向专一性的基因表达沉默(gene silencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)。随后许多研究者先后采用不同长度的dsRNA使线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳动物等的靶向基因表达明显降低或沉默，因此人们把这种利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默，从而研究目的基因的功能即为RNA干扰技术(RNAi技术)(Hannon GJ.RNA interference.Nature.2002；418(6894)：244-51)。由于能够作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，所以可以毫不夸张地说，RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐，为此被SCIENCE评为2002年最重要的科研成果之一。科学家们逐渐意识到，将这项新颖的技术，应用于疾病治疗上可能具有莫大的潜力。如果进一步证实这种技术在人体内有效，将为许多疾病和感染提供新疗法。相对与其它的基因治疗手段如腺病毒、逆转录病毒等方法RNA干扰技术具有安全性高、用量低等优点。然而，目前并未发现用RNAi进行肝癌治疗的报道。

本发明者基于fup1基因在各种肝癌细胞株中高表达的发现，进行了大量潜心研究，并将RNA干扰技术应用到fup1基因体内外表达的研究上，试验了RNAi技术治疗肝癌的可能性，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供抗肝癌基因药物组合物。

本发明的另一个目的是提供抗肝癌基因药物的筛选方法，用以筛选拮抗肝癌高表达基因fup1的药物。

本发明的再一个目的是提供用所述抗肝癌基因药物筛选方法筛选出的抗肝癌小分子。

本发明提供的抗肝癌基因药物组合物包括安全、有效量的反义fup1基因和/或小分子干扰RNA，及药学上可以接受的辅剂。

所述抗肝癌基因药物组合物中的反义fup1基因具有序列表中SEQ ID NO：2所示的DNA序列。

所述抗肝癌基因药物组合物中的小分子干扰RNA包含序列表中SEQ ID NO：3所示序列。

“安全、有效量”指的是：所述反义fup1基因和/或小分子干扰RNA的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。所述反义fup1基因和/或小分子干扰RNA的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况在0.1-100mg的范围内选择。本发明的组合物宜包含0.1wt％(重量百分比)至10wt％的反义fup1基因和/或小分子干扰RNA，最佳为0.5％至5％。

“药学上可以接受的辅剂”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各辅剂能与活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。本发明的药物组合物中辅剂的选择取决于给药方式。

本发明者根据核酸杂交原理，分别构建了含有fup1基因序列(SEQ IDNO：1)和反义fup1基因序列(SEQ ID NO：2)的真核表达载体pcDNA3-fup1和pcDNA3-as-fup1，并测定了转染fup1基因和反义fup1基因的真核细胞的生长曲线和在裸鼠体内的成瘤性。实验结果说明，fup1基因的表达对小鼠成纤维细胞的增殖具有促进作用，并能使小鼠成纤维细胞较对照细胞表现出显著增强的成瘤性；而fup1反义基因能抑制肝癌细胞的增殖和在软琼脂上的集落的生长速度，并能明显减弱肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤性。

用细胞周期和凋亡芯片检测fup1基因的表达对小鼠成纤维细胞NIH3T3基因表达的影响，发现许多促癌生长因子上调，而抑癌生长因子下调，提示fup1基因的表达可能在fup1基因转化的小鼠成纤维细胞的恶性生长过程中起了重要作用。

本发明还提供了一种抗肝癌基因药物的筛选方法，用以筛选拮抗肝癌高表达基因fup1的基因药物。这种筛选方法的特征在于：采用ambion网站提供的RNAi设计软件，针对fup1的编码区设计小分子干扰RNA。

本发明进一步提供一种小分子RNA，所述小分子RNA包含序列表中SEQ IDNO：3所示序列。

本发明者用这种小分子干扰RNA(siRNA)分别转染人肝癌细胞和人正常肝细胞后得到的实验结果表明，这种小分子干扰RNA对肝癌细胞的增殖具有抑制作用，而对正常肝细胞的生长没有影响。

本发明采用反义技术和RNA干扰技术，以在肝癌细胞中高表达的基因fup1为药靶，针对其基因序列设计了拮抗分子，为肝癌的基因治疗提供了有力的武器，并为进一步筛选抗肝癌的基因药物提供了很好的筛选平台。

附图说明

图1显示fup1基因的表达对小鼠成纤维细胞NIH 3T3生长的影响。

图2显示反义fup1基因的表达对人肝癌细胞BEL-7404生长的影响。

图3为反义fup1基因转染的人肝癌细胞BEL-7404在软琼脂上的集落形成能力分析。其中，(a)反义fup1基因转染的肝癌细胞BEL-7404稳定株；(b)空载体转染的肝癌细胞BEL-7404稳定株。

图4为fup1基因转染的小鼠成纤维细胞NIH3T3在裸鼠体内的成瘤性分析。其中，A.裸鼠皮下注射空载体转染的NIH3T3细胞；B.裸鼠皮下注射fup1基因转染的NIH3T3细胞。

图5为反义fup1基因转染的人肝癌细胞BEL7404在裸鼠体内的成瘤性分析。其中，C.裸鼠皮下注射反义fup1基因转染的BEL7404细胞；D.裸鼠皮下注射空载体转染的BEL7404细胞。

图6为裸鼠皮下注射肿瘤细胞后产生的肿瘤。

图7显示fup1基因对裸鼠体内产生的肿瘤体积的影响。

图8显示fup1基因对裸鼠体内产生的肿瘤重量的影响。

图6-图8中的肿瘤细胞来自于：

(A)裸鼠皮下注射空载体转染的NIH3T3细胞；

(B)裸鼠皮下注射fup1转染的NIH3T3细胞；

(C)裸鼠皮下注射反义fup1转染的BEL7404细胞；

(D)裸鼠皮下注射空载体转染的BEL7404细胞。

图9显示siRNA转染对人肝癌细胞BEL-7404生长速率的影响。

图10显示siRNA转染对人肝癌细胞SMMC-7721生长速率的影响。

图11显示siRNA转染对人肝癌细胞Hep3B生长速率的影响。

图12显示siRNA转染对人正常肝细胞L02生长速率的影响。

具体实施方式

下列实施范例旨在进一步举例描述发明，而不是以任何形式限制本发明。在不违背本发明的基本精神和原则的前提下，对本发明的任何替代、改动或改进都将落入本发明待批权力要求的范围内。

实施例1  反义fup1基因序列的获得

根据fup1的编码基因序列(SEQ ID NO：1)用DNATool软件处理后得到了反义fup1基因的cDNA序列(SEQ ID NO：2)。分别采用带有BamHI和EcoRI切割位点的上下游引物，以人肝细胞cDNA文库中抽提的质粒为模板，通过PCR扩增得到目的基因fup1和反义fup1基因。以上fup1基因和反义fup1基因的PCR产物分别经EcoRI和BamHI处理后，根据其引物两端酶切位点的差异，采用双粘性末端连接，定向插入用相同核酸内切酶处理的pcDNA3真核表达载体内。

实施例2  转染fup1基因和反义fup1基因的真核细胞的生长曲线测定

将整合有fup1全长和反义fup1 cDNA的pcDNA3质粒和空载体用脂质体法转染小鼠成纤维细胞NIH3T3：NIH 3T3细胞培养于35mm的培养皿，待满度大约达到60％后，按每个转染反应使用2ug质粒和5ug脂质体进行操作：先将质粒和脂质体分别混匀于100ul DMEM基本培养基中，再将二者相互混合后于室温放置30分钟。此后向样品中加入0.8ml DMEM基本培养基并混匀，再将以上混合物加到经DMEM基本培养基洗去残余血清的细胞上。于37℃、5％CO2条件下培养5小时后，向转染细胞中加入1ml含20％血清的DMEM培基，于37℃、5％CO2条件下继续培养。在转染开始的24小时后用完全细胞培养基(即含有10％胎牛血清的DMEM)替换上述培养基，于37℃、5％CO₂条件下继续培养。72小时后将所培养的细胞以1∶10分盘，在G418浓度为0.8mg/ml条件下对阳性细胞株进行初筛。每2天更换一次选择性培养液，以及时除去死细胞。细胞培养2周后，挑取肉眼可辨的单克隆细胞株接种于24孔细胞培养皿中，在相同浓度的选择性培养基中培养，培养体系随细胞增殖而放大，最后转移至10厘米培养皿中培养。用RT-PCR鉴定所建细胞株中目的基因产物的表达：分别以抽提的1ug总RNA为模板，采用oligo-dT引物，用AMV反转录酶在50℃作用30分钟，以合成互补cDNA链。随后再以后者为模板，加入fup1特异性引物(上游引物5’GGTGCTAATGCATCTAATTA’3，下游引物5’AGATTGAGGCAGTAAGCAGC’3)及阳性对照G3PDH的特异性引物(上游引物5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物5’TCCACCACCCTG TTGCTGTA 3’)和Taq DNA聚合酶，在94℃解链、55℃退火和72℃延伸条件下反应35个循环；琼脂糖电泳检测反应结果。

将经RT-PCR鉴定的稳定转染fup1的NIH3T3细胞(样品)以及pcDNA3空载体转染的NIH3T3对照细胞(对照)，经计数后按每孔3×10³个细胞接种于96孔培养板中。我们从0时刻起检测第一组数据，其后每隔24小时检测一次：吸去每孔内的培养液，将MTT母液(100g/L)用含有10％胎牛血清的DMEM溶液进行1∶10稀释后按每孔100ul加入培养皿，于37℃，5％CO₂条件下培养4小时。弃去上述溶液，加入100ul DMSO使结晶状物完全溶解，于570nm波长下测吸收值。取5个点的平均值作为检测数据。如图1所示，在接种后的48小时以内，转染fup1基因的样品细胞，其增殖与对照比较基本没有区别；而从转染之后的第三天起，转染目的基因的细胞，其增殖明显较对照组为快。数据显示72小时后样品细胞的数量较对照组上升72％，以后基本按照相同比例生长；表明fup1基因在NIH 3T3细胞中的表达对细胞的增殖具有促进作用。

采用相同的方法，将经RT-PCR鉴定的稳定转染fup1反义cDNA的BEL7404细胞(样品)以及pcDNA3空载体转染的BEL7404对照细胞(对照)，经计数后按每孔3×10³个细胞接种于96孔培养板中。我们从0时刻起检测第一组数据，其后每隔24小时检测一次，取5个点的平均值作为检测数据。如图2所示，接种后的前72小时以内，转染fup1反义cDNA的样品细胞，其增殖与对照比较基本没有区别；而从转染的72小时之后起，转染FUP1反义cDNA的细胞，其增殖较对照组表现出明显的抑制效应。数据显示样品组细胞的生长在接种后的72小时至144小时内，较对照组平均下降了42.7％；表明fup1反义cDNA在BEL 7404细胞中的转录可能对细胞的增殖具有抑制作用，从而从反面证实了FUP1具有促进细胞增殖的功能。

实施例3  反义fup1基因转染人肝癌细胞BEL7404的软琼脂集落形成实验

混合0.5ml 1.2％琼脂和0.5ml 2×培养基，配成含有0.6％琼脂的完全培养基，迅速加入6孔培养板中，静置于室温使其凝固，作为下层培养基；再混合0.5ml 0.6％琼脂和0.5ml 2×培养基，配成含有0.3％琼脂的完全培养基。将经RT-PCR鉴定的稳定转染fup1反义cDNA的BEL7404细胞以及pcDNA3空载体转染的BEL7404对照细胞，经计数后按每孔5×10³个细胞接种于6孔培养板的软琼脂培养基内，并加在下层培养基上。待上层培养基于室温下凝固后，于37℃、5％CO₂条件下培养。培养2周后，于相差显微镜下观察细胞形态并摄影。分析结果表明，稳定转染fup1反义cDNA的BEL7404细胞在软琼脂上所形成的集落，不仅数目上减少了约10％，而且所形成集落的半径与作为正对照的BEL7404细胞所形成的集落相比也有明显减小(图3)。

实施例3  fup1基因和反义fup1基因的转染细胞的裸鼠皮下注射

将经RT-PCR鉴定的稳定转染fup1基因的NIH3T3细胞以及pcDNA3空载体转染的NIH3T3对照细胞进行离心收集后用PBS溶液淋洗并重悬，经计数后按每点5×10⁶细胞/100ul对裸鼠进行皮下注射。图4显示了B样品(即注射fup1基因转染的NIH3T3细胞之样品)脊柱右侧的皮下有较为明显的肿瘤形成，而A样品(对照组)中则无肿瘤形成(仅为细胞注射遗留的痕迹)。

采用相同方法，我们将经RT-PCR鉴定的稳定转染fup1反义cDNA的BEL7404细胞以及pcDNA3空载体转染的BEL7404对照细胞进行离心收集后用PBS溶液淋洗并重悬，经计数后按每点5×10⁶细胞/100ul对裸鼠进行皮下注射。图5显示了C样品(即注射转染fup1反义cDNA之样品)皮下所形成的肿瘤，其体积明显小于D样品(对照组)。

处死裸鼠后，用钝器将肿瘤从其皮下剥离，展示如图6。

简单测量肿瘤的最小直径(a)和最大直径(b)后，按照公式：肿瘤体积V＝a²×b粗略测算肿瘤的体积(图7)。

从肿瘤的体积可以看出，肿瘤样品2的体积和肿瘤样品1(阴性对照)相比，增加了近24倍，差异十分显著；证明了fup1的表达对于NIH3T3在体内环境中的成瘤作用有很大的促进，使后者发生了明显的致癌转变。而肿瘤样品3的体积和肿瘤样品4(阳性对照)比较，则缩小了近63％，表明fup1反义cDNA的转录对于BEL7404细胞的体内成瘤作用有明显的抑制作用。

实施例4肿瘤重量的比较分析

新鲜剥离的肿瘤标本经液氮快速冷冻后，分别用天平检测其重量。

从肿瘤的重量比较可以看出，肿瘤样品2的重量和肿瘤样品1(阴性对照)相比，增加了近19倍，差异十分显著。而肿瘤样品3的重量和肿瘤样品4(阳性对照)比较，则减轻了近60％，抑制效果也很明显(图8)。

以上肿瘤样品的重量测量与体积测量的结果基本一致，有力地证明了fup1在NIH3T3细胞中的表达所产生的体内成瘤性及其反义cDNA的转录对肿瘤生长的抑制作用。

实施例5针对fup1基因的siRNA的筛选

采用Ambion公司网站(www.ambion.com)的软件，针对fup1的编码区设计小分子干扰RNA。从fup1基因的转录本开始寻找长度为19个核苷酸的潜在靶位点。使用BLAST将潜在的序列和相应的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等等)进行比较，排除那些和其它编码序列/EST同源的序列。通过化学方法分别合成正链和负链，末端加上2个T以增加双链的稳定性。使用BECKMAN OLIGO1000M全自动合成仪，合成的正负链序列如下：正链：5’CAG CUG CUU ACU GCC UCAATT 3’；负链：5’UUG AGG CAG UAA GCA GCU GTT 3’。

实施例6对人肝癌细胞BEL7404中fup1表达的RNA干扰体外实验

将人肝癌细胞BEL7404以每孔1×10⁴个的密度接种到96孔板中，培养液为DMEM+10％FBS(胎牛血清)，培养16-20hr待细胞贴壁后，轻轻吸取上清培养液，用OPTI-MEM培养基洗两次。将针对fup1基因的siRNA(s3)以及不相关的siRNA(对照)分别用OPTI-MEM稀释，同样将转染试剂Oliogofectamine用OPTI-MEM稀释，5分钟内将上述稀释好的siRNA和Oliogofectamine混合，室温放置20-40min后，将不同量的上述混合物加入相应的细胞培养孔中，4-5hr后补加FBS至终浓度为10％，置于37度、5％CO₂培养箱内培养72hr后MTT法检测细胞数目。如图9所示，针对fup1基因的siRNA(s3)转染后能以剂量依赖的方式抑制人肝癌细胞BEL-7404的生长。

实施例7  对人肝癌细胞SMMC7721的中fup1表达的RNA干扰的体外实验

将人肝癌细胞SMMC7721以每孔1×10⁴个的密度接种到96孔板中，操作方法同实施例4。如图10所示，针对fup1基因的siRNA(s3)转染后能以剂量依赖的方式抑制人肝癌细胞7721的生长。

实施例8  对人肝癌细胞Hep3B的中fup1表达的RNA干扰的体外实验

将人肝癌细胞Hep3B以每孔4×10⁴个的密度接种到24孔板中，操作方法同实施例4。如图11所示，针对fup1基因的siRNA(s3)转染后能以剂量依赖的方式抑制人肝癌细胞Hep3B的生长。

实施例9对人肝癌细胞L02的中fup1表达的RNA干扰的体外实验

将人肝细胞L02以每孔1×10⁴个的密度接种到96孔板中，操作方法同实施例4。如图12所示，针对fup1基因的siRNA(s3)转染后对人肝癌细胞L02细胞的生长速率没有影响。

实施例10用细胞周期和凋亡芯片检测fup1基因的表达对小鼠成纤维细胞基因表达的影响

分别抽提转染fup1基因的小鼠成纤维细胞NIH3T3和对照细胞的总RNA，反转录后分别标记Cy5和Cy3荧光，再与人细胞周期及凋亡芯片杂交，检测两种荧光的强度后比较转染细胞和对照细胞中与细胞周期和凋亡相关的基因的表达量的变化。数据结果说明，与对照细胞相比，转染fup1基因的细胞中许多与细胞周期相关基因的表达水平上调，如CDC27、E2F3、E2F4、MAPK1、MAPK3、MAPK8、RFC5等；一些抗凋亡因子表达水平上调如VEGFC；而一些促凋亡因子表达水平下调如BZRP；还有一些癌基因如BRAF表达水平上调。总之，发现许多促癌生长因子上调，而抑癌生长因子下调，这可能在fup1基因转化的小鼠成纤维细胞的恶性生长过程中起了重要作用。

                          序列表

    SEQ ID NO：1

-600 attatacaga ttaaagattg atttttagca actttatttt aaggcagaaa aacaactaat

                       TFIID                   HNF-3B                C/EBP-β

-540 caattatgtg tta tttgtat gtgcggtac c agtgttgacc tcttaa atgt ttgtaaattg

                  C/EBP-β                               GATA-1                   AFP-1         TFIID

-480 cttaca atgt tagataataa tg aatggtga ttgcctc taa ggatttaaaa caaaaat taa

              TBP           NF-1        GATA-2          C/EBP-α(β)

-420  aaca tttatt ttcag tccaa gtacttttcc ct gtgttttc aaatactctt cctgtaac ta

       TFIID      CP-1(2)         GATA-2                 AP-1            TFIID  C/EBP-α(β)

-360  tatattta aa ttggtt tgat atgttacttt tta ctgactt agaaagt ata taattggtac

                  AP-1                     GATA-1                      APF      C/EBP-α(β)

-300  atttta tggc tcaaattgca gc taacacag ataattcaa g cttaaagatt tac attttat

                   AP-3       AP-5，GAGA              AFP-1

-240  gaaaatt tga catgt gaatt tgacagcg tg ttgttatttg tgaatgaaag cagtt ttcag

        AFP-1                  GATA-1                AFP-1

-180  tagcttttta aaaaaaactg tgatctg aga tacacttga a aaaatgaatt aaattattt t

         C/EBP-α(β)          PEA-3                 AP-4                   HNF-4

-120  tatttcatat caagaaa tgg atgaaaagag g ctgctggat cc agggttga aggtt cataa

       TFIID，AF-1                                              AP-1，CP-1     C/EBP-β

 -60  aggcctctgg gattatactc tgaagaaccc gcagacgga a tgcctgagtg  actgaagaaa

   1  ATGGGTGCTA ATGCATCTAA TTATCCTCAT TCATGTTCCC CGAGGGTAGG GGGAAATTCA

  61 CAGGCCCAAC   AGACTTTTAT AGgtaacttt cagtttttct aacttcattt tcttttgtga

 121 ctataataga   attgtgtttt cggtagtctc tgtagatgac aaaagaagtg agctgtagtt

 181 attataataa   ttctgcagca tctaggtttt ttcccccaac aaacgtaaat cttaagtctg

 241 gtttgtatgg   tttttatctt aaaccacttg tagcacaatt gagcttttct atgttttaac

 301 cataattgcc   aattacctta ggcaaactag cagtctccat tggtgttaaa acagcgaagt

 361 acatatttcc   tgtgtcccat ttcatttatt ttgcccatac aaatgcagac ttgtgtaatt

 421 aagaagaaaa   agaaacattt cacaattata tacaagtaat gttcttaatt tacaactctg

 481 cctatttttc   attcctaaaa acccatgatt aagatctatg acaaatgtcc tttgatagcc

 541 agggaacgaa   agactttttc taaaaaaatt tagactaatt tgctctgttt gtccctattt

 601 cttatttaat   ataaaaaatg taggccagtc acaatggctc acacctgtaa tcccagcact

 661 ttaggaggcc   aaggcaggaa gattgcatga ggccaggaca ggagttcaag accagcctga

 721 gcaacattag   tgagacccta tctctaccaa aaaaagaaaa aaaaattttt ttaattagcc

 781 aggcatggtg   gcacatgcct atactcccag ctacttggga agctgaggtt ggggagaatc

 841 ccttgagccc   aggagtttga ggctgcagtg agctatgatc ttcccactgc actccagctt

 901 gagcaacaca   gtgagactcc atctctaaaa attaaattga attgaaaact aaaatgagtt

 961 aattgaactt   tttgtcttcc tttataaaaa acaaatgcaa ttttgagtgg ttcggtaatg

1021 tctgcttaca   gaatttttca acatgaaaaa tgttaaacgt tgaaaatgaa tgttaagaaa

1081 aaataaattt   tcatttgttt aatttttttc ttagGGACCT CATCCTATTC TCAGCAAGGC

1141 TATGGTTGCG   AATCAAAGTT GTATAGCCTT GACCATGGCC ATGAGAAACC ACAAGACAAA

1201 AAAAAGAGAA   CCTCTGGTCT TGCCACCCTC AAAAAGAAGT TTATTAAGCG TCGGAAATCT

1261 AATAGGTCTG   CCGATCATGC CAAGCAGATG CGAGAACTCC TCTCTGGGTG GGATGTTAGA

1321 GATGTCAATG   CATTAGTGGA GGAATATGAG GGAACATCAG CATTAAAGGA GCTTTCTCTA

1381 CAAGCCAGTT   TGGCTAGACC AGAAGCCCGG ACATTGCAGA AAGATATGGC TGATCTTTAT

1441 GAGTACAAGT   ATTGTACTGA TGTAGACTTA ATATTTCAAG AAACTTGTTT TCCTGTTCAT

1501 CGTGCCATTT   TGGCAGCAAG GTGTCCATTT TTTAAAACAC TGCTTTCTTC CTCACCAGAG

1561 TATGGGGCAG   AGATAATAAT GGACATCAAT ACAGCTGGTA TTGATATGCC CATGTTTTCT

1621 GCTTTGTTAC   ACTACCTTTA TACAGGAGAG TTTGGAATGG AGGACTCAAG GTTTCAAAAT

1681 GTCGATATCC   TTGTTCAGCT TAGTGAAGAA TTTGGAACAC CAAATTCCCT TGATGTAGAT

1741 ATGCGTGGAC   TCTTTGATTA CATGTGTTAT TATGATGTCG TCCTTAGTTT TTCTTCAGAC

1801 TCTGAACTGG   TTGAAGCTTT TGGTGGAAAT CAGAACTGTT TAGATGAAGA GCTCAAAGCC

1861 CACAAGGCTG   TTATTTCTGC ACGGTCCCCA TTTTTTCGAA ATTTATTACA AAGGAGGATA

1921 CGAACTGGTG   AAGAAATCAC AGACCGAACT TTGAGGACTC CCACAAGAAT TATATTAGAT

1981 GAGTCCATTA   TACCAAAAAA ATATGCAACA GTGATATTAC ACTGTATGTA TACCGACGTG

2041 GTGGACCTCT   CTGTTTTGCA CTGTAGCCCC TCTGTGGGGA GTCTCAGTGA AGTTCAGGCT

2101 CTCGTCGCAG GGAAGCCAAA CATGACCAGG GCAGAAGAAG CCATGGAACT TTACCACATA

2161 GCACTGTTCT TGGAATTTAA CATGCTTGCA CAAGgtatga agttctggtt tttaattctg

2221 atttatagaa ttatgtattg atcttccaaa ttgaaaacac aaccagtata ttctatgatt

2281 tcagtgtttg ggatgttaca gggtcagttt ttttgaacct tcagttatga catctgagac

2341 agattgaggg tcagtattaa tgtggttctt tatttactag taaaaccaag tattcagtac

2401 taatgacttc agagcattaa atgagacttg aggttctttc ttccctaatg taagacgata

2461 ggtatgggaa tatataatta ccaacctaca ccctctccac ccaagctttg aaagagccca

2521 gtttcccaca ttttgagtct catatttatg ttcagtacct tgttgatgtt taaatgtttg

2581 gataagaata aaaattcatt acaaaaatga agatagtcac atttagatac gaatttagtt

2641 gaatcagaat tgggcagggt ttctgattta aattttaaaa tattccttat cttattttta

2701 gattcaactt gtacatcaag ccacagccta cagcgtgtaa aacacagtta gcgctagact

2761 catgtgcctt cttcatttaa tttaaactaa aattttttta aaattaggac ggcacgtttt

2821 ttgtgttata ggcaaacaaa ttcatgaaag ttacattaaa agaagtatac atctgttggt

2881 aaatgttaga atcttaacat ttcagagctg gaaagagacc ttttgtagga gagcaaagac

2941 agtttgctgt tttgacagag tgcattctta gctttctgtg accatatatt aaaagaaaat

3001 aagctatgtg acatgagact acttgagaaa tttagctaat gcatattagc taaaagaaca

3061 ttagaagttg ccagttagaa gaaaatatta atggtttggg taagagacat gaatttaaat

3121 aaggaaagct aagtactgaa cttgaaaata atatgtatta tatggttaag tcagcctatc

3181 aatagggctt tgagaaattg aaaaatagcc ccagttaaat aacaacatta agccagtctc

3241 agtggtgtgt ggttgtagtt ctatctactt gggaggctga ggcaggaaga ccgcttgagg

3301 tcaggagttc agggctgcag tgagctgtga tcatacctgt gaatagctac tgcactgtac

3361 tctgggcagc atagtgagaa ctcagctgta ttttttaaaa atctcagtaa taaaatggga

3421 acttacacag aagaaggcgt tgataaacat gagtgggaaa atgttgagat ttcttttaca

3481 taaagaatct tttaaaacct tactttacca taatcctttt ataatagatg ttttatttta

3541 ttacaacaac caaaatgtca ttaaaacagt ttattagttt agaataagaa ttattgtatc

3601 aataatagac tatttagatg tcaaactgta ggaaaaatat gttatcaaaa atagagtagc

3661 agtttaagct actatttttt tctgtaaaac caaatttgtc agaaaatgct tctacagaaa

3721 aatttgaagt ttgcaacatt accaaaaaaa aaactatatt ttctcaaaat atttttattt

3781 ttgatgcctt ttaataagaa accaaattat atagactttg tatgagaaag cattctttaa

3841 tatatgtttt tttgtttgtt tttaaaaacg gagtcttgat cttgtcaccc aggctggagt

3901 gcaatggcgc aatttcggct cactgcaacc tccgcctcct ggattcaagt gattctcctg

3961 cctcagcctc ttgagtagct gggattacag gctcctgcca ccatgcccag ctaatttctg

4021 tatttttagt agagacaggg ttttaccatg ttggccaggc tggtctcaaa ctcctaacct

4081 caggtgatcc acctgcctcg gcctcccaag gtgctgggat tacaggcatg agccaccgca

4141 ccttgcaggt ttttttaagt tttagatgca aagtaaaatt gtcagccagc tctaagatct

4201 ttggtaatac ttgattattt atctagagtt tatcttgagt taatttctct tttttttttt

4261 ttagtgttta gctaaaagtt gtattttatt cagtgtattt aaagatataa aataatactt

4321 tttgcattgt ctaatctggt tacttaaaac aagcaaaaaa aaatcttgtg tacaaatatt

4381 cccttaaatg tggatatata tgctcttctt tttccctttg ttactcaaaa tagagtttga

4441 gttatttttg ttttgttttt tgtaacccat gtggggcata tctttccccc atacccatga

4501 aatattcata ttaaggttta taaaagacta taactttaac ataattttta tctcatttcc

4561 ataggaagaa gaatattagc tcgcttgagg taggatttta taccataaag ctcaagagtt

4621 caggttctaa aaccagacag actgggtttc agttctctac cgtgtcttag tttgacctta

4681 accaagtcac atagcctaag cccctctttt ctcatttgta aaataaagat agtaaaccct

4741 ataagctatg atgattaaag gaaataatat atgttaaatg atctgagtag cacctgttac

4801 atagtaaaca ttcagtaaat gttagctgct aaactataat aatcaccaca acatatgtct

4861 ctcactacca tatagttttt ttctaaaaat aactttaagt ttaaaaaata attttactag

4921 gccaggtgtg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg agaggctgag gcaggaggat

4981 cacttgagcc caggagttca agatcagctt gggcaatata gtgagacctc gtctctacca

5041 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaactaggc ctagcacagt ggcccacact tgtaatccca

5101 gcactttggg aggccgaggt ggatggatca cttgaggcca ggagtttaag accagcttga

5161 ccaacatggt gaaaccccat ctctaccaaa aaatacaaaa attagccagg catcatggta

5221 cacgcttcta gtcccaggta ggctgaggca ggagaatcgt ttgaacccgg gagatggagg

5281 ttgcagtgag ctgagatcgc accactgcac accagcctgg gcgacagagt gagtctccat

5341 ctcaaaaaaa taaaaataca aaaaaattta gctgggtgtg gtggcacaca cctgtaatcc

5401 cagctaccca ggaggctgag gcatgagaat tacttgaacc caggagcggg aggtggcagt

5461 gagccaagat tgcaccactc cactccagcc cgggtgatag agtgagactt tgtcttaaaa

5521 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ggccaagtgc agtgggtcac gcctgtaacc ccagcacttt

5581 gggaggccgg ggcaggcaga tcacgaggtc aggagatcga gaccatcctg gctaacaggg

5641 tgaaaccccg tctctactaa aaatacaata aattagctgg gcatggtggc aggtgcctgt

5701 agtcccagct gctcaggagg ctgaggcagg agaatggcgt gaacccagga ggcgaagctt

5761 gcagtgagct gagatcgcac cactgcactc caacctgggc gacggagtga ac tgcgtct

5821 caaaaaaaaa aaaaaattaa aaggcagtat tggcagacag ctagagtggt ttggcaagtg

5881 ggtaaaagga ttcttggtgc caggtgcggt ggctcaaaca cctttaatcc cagcactttg

5941 ggaggccaag gcaggcggat cacctgaagt caggagttcg agaccagcct ggccaacatg

6001 gtgaaacccc cgtctctaac tacaaaaatt agttgggcgt ggtggtgcat acctgtaatc

6061 ccagctacta gggaggctga ggcacaataa ttgcttaaac ctaggaggca gaggttgcag

6121 taagtcgaga tcacagcact gca tccaag cctgggcaac tgagtgagac tctgtctcca

6181 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcccagagag ttgagattct tggcctacac agagaatgtg

6241 ttttatatca gtagggagga gcaggcagta ggcaatcaca agtagataac ggcctcaact

6301 tacaggcctg gcatttagga ccagatttaa cttcacttga ttttcattta aacataacaa

6361 aatgaatatg tttaatttta tttccttcaa agccctatta tcatagtgaa ggaataaaac

6421 aaatataagc tctcaaggac aaagagacaa agatacctaa ggagaaaaca acaatgggga

6481 agatgttgaa atttttggaa aatggaaagc agatagagac ttgattactg gcttaacaga

6541 ggagcagcct gtaattagat gctgtaaagg gggctactga ggagaagtga ggcagttcac

6601 ctgttagagc tctggcgtgg ctcaggccag gtggaactaa gtactctgga aagaagggat

6661 atgcatagca tagaactaaa aagacagagt tgattttaag tctgaatact gagggatcag

6721 accctttccc caaccctgga attcatcttt atgtatggta ttagaaaagg atgtggtttt

6781 gttcttctgc atatagtgag ccaagtattc cctactaatt ccctattcct gatttgtgcc

6841 actcttaaag ctgctatgta tgcatggatt gtattcatgc atcagtactc agtctccatt

6901 ttgtcccagt ggtccatttg tctgttcttg cattactatc acttgcaaca aggtgacatg

6961 cccttgtccc cgccccctca attcgcctct ctgctactgc ccccacaaca aaacacagga

7021 gacctgagat tttctaaaat tttctgaatt ttctaaagaa attagagaga ttccaaatct

7081 ggaaatagca acagaggagg gtagggatgt ggcacagggt tgaaatctat aattatgtga

7141 aaccctatgg tgaaatcacc tacttcctta acccctgctg taataccagc caggcaaata

7201 caagaagaaa ctggagtcct ggaaatggtg aacagctcaa aagtatatac acttacagat

7261 actgatgttt tgggtttcca cagtgaaatt acactcaggg gttataaaat gaaaaagcca

7321 gcttgccttc catttgtttt acagAGGAGA CTACAGTCAT CAGGCCTGCC TGTGCAGCAG

7381 AGCTTTCAAA CAGCTGCTTA CTGCCTCAAT CTTAAatatg aaaacccatc caaggataac

7441 tggacatttg aggaaagctt ccaaattgag acagagatca gagcaaaaag aacaaagtcc

7501 tggaggaagc agacaatgaa gggagcagag gaaaacttca gtagaatcaa aatatcctta

7561 tataaaagaa ctttttatgg aatcagtgag acataagcag gatgctatta aagtaaaaac

7621 aggagctttt agaaataaga tagcagaaat gaaagatata atggaagcat tgaaaggtac

7681 agttgaggaa atctagaaag taaataatat aataaagaga tgagtggaga caaataaaac

     SEQ ID NO：2

   1 TACCCACGAT TACGTAGATT AATAGGAGTA AGTACAAGGG GCTCCCATCC CCCTTTAAGT

  61 GTCCGGGTTG TCTGAAAATA TCCCTGGAGT AGGATAAGAG1 TCGTTCCGAT ACCAACGCTT

 121 AGTTTCAACA TATCGGAACT GGTACCGGTA CTCTTTGGTG TTCTGTTTTT TTTCTCTTGG

 181 AGACCAGAAC GGTGGGAGTT TTTCTTCAAA TAATTCGCAG CCTTTAGATT ATCCAGACGG

 241 CTAGTACGGT TCGTCTACGC TCTTGAGGAG AGACCCACCC TACAATCTCT ACAGTTACGT

 301 AATCACCTCC TTATACTCCC TTGTAGTCGT AATTTCCTCG AAAGAGATGT TCGGTCAAAC

 361 CGATCTGGTC TTCGGGCCTG TAACGTCTTT CTATACCGAC TAGAAATACT CATGTTCATA

 421 ACATGACTAC ATCTGAATTA TAAAGTTCTT TGAACAAAAG GACAAGTAGC ACGGTAAAAC

 481 CGTCGTTCCA CAGGTAAAAA ATTTTGTGAC GAAAGAAGGA GTGGTCTCAT ACCCCGTCTC

 541 TATTATTACC TGTAGTTATG TCGACCATAA CTATACGGGT ACAAAAGACG AAACAATGTG

 601 ATGGAAATAT GTCCTCTCAA ACCTTACCTC CTGAGTTCCA AAGTTTTACA GCTATAGGAA

 661 CAAGTCGAAT CACTTCTTAA ACCTTGTGGT TTAAGGGAAC TACATCTATA CGCACCTGAG

 721 AAACTAATGT ACACAATAAT ACTACAGCAG GAATCAAAAA GAAGTCTGAG ACTTGACCAA

 781 CTTCGAAAAC CACCTTTAGT CTTGACAAAT CTACTTCTCG AGTTTCGGGT GTTCCGACAA

 841 TAAAGACGTG CCAGGGGTAA AAAAGCTTTA AATAATGTTT CCTCCTATGC TTGACCACTT

 901 CTTTAGTGTC TGGCTTGAAA CTCCTGAGGG TGTTCTTAAT ATAATCTACT CAGGTAATAT

 961 GGTTTTTTTA TACGTTGTCA CTATAATGTG ACATACATAT GGCTGCACCA CCTGGAGAGA

1021 CAAAACGTGA CATCGGGGAG ACACCCCTCA GAGTCACTTC AAGTCCGAGA GCAGCGTCCC

1081 TTCGGTTTGT ACTGGTCCCG TCTTCTTCGG TACCTTGAAA TGGTGTATCG TGACAAGAAC

1141 CTTAAATTGT ACGAACGTGT TCTCCTCTGA TGTCAGTAGT CCGGACGGAC ACGTCGTCTC

1201 GAAAGTTTGT CGACGAATGA CGGAGTTAGA

SEQ ID NO：3

正链：5’CAG CUG CUU ACU GCC UCA ATT 3’；

负链：5’UUG AGG CAG UAA GCA GCU GTT 3’。

Claims (8)

1.一种抗肝癌基因药物组合物，包含安全、有效量的反义fup1基因和/或小分子干扰RNA，及药学上可接受的辅剂。

2.如权利要求1所述的基因药物组合物，其中所述的反义fup1基因具有序列表中SEQ ID NO：2所示DNA序列。

3.如权利要求1所述的基因药物组合物，其中所述的小分子干扰RNA具有序列表中SEQ ID NO：3所示RNA序列。

4.如权利要求1所述的基因药物，其中所述反义fup1基因的安全、有效量为0.1-100mg。

5.小分子RNA，包含序列表中SEQ ID NO：3所示序列。

6.如权利要求5所述的小分子RNA，所述小分子RNA具有干扰fup1基因在肝癌细胞中高表达的作用。

7.权利要求5所述小分子RNA在制备治疗肝癌药物上的应用。

8.一种抗肝癌基因药物的筛选方法，其特征在于：采用ambion网站提供的RNAi设计软件，针对fup1的编码区设计小分子干扰RNA。

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