具体实施方式
为了开发有效的抑制TM4SF4基因表达的试剂,本发明人经过深入的研究,首次开发了一种在TM4SF4 mRNA水平上发挥干扰作用的分子,并基于此制备了诱导RNAi的腺病毒,其在细胞水平上或动物水平上均具有很高的TM4SF4基因表达抑制效率,呈现明显的抑癌效果。
如本文所用,术语“RNA干扰(RNA interference,RNAi)”是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,其也被称为RNA干预或者RNA干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默,它是体内抵御外在感染的重要保护机制之一。简要地说,RNA干扰包含一个由小型干扰RNA(siRNA)所激发的机制,造成靶mRNA的降解。RNA干扰(RNAi)现象广泛发现于大多数真核生物中,是一种具有高度的序列专一性,特异地使特定基因沉默,使其功能丧失或降低的一种RNA诱导的转录后调节方式。RNAi的基本过程一般分为两步:首先进入细胞的dsRNA被Dicer切割成19-23个核苷酸的siRNA,siRNA与一系列的蛋白形成RISC后,靶基因的mRNA与siRNA的正义链置换,并在同样的位置被切割,从而使目的基因沉默。RNAi技术因其高度序列专一性和高效靶基因抑制效率的特点而成为抑制基因功能的有效工具,它比同源共抑制和反义RNA技术更有效。
如本文所用,术语“小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。
如本文所用,术语“小发夹RNA (Small hairpin RNA,shRNA,或称为hpRNA)”是指能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。
如本文所用,除非另外说明,术语“寡核苷酸”是指与本发明所述的siRNA相应的DNA分子,所述的“寡核苷酸”也可以是与所述的siRNA的其中一条链互补的。所述的“寡核苷酸”在被制成构建物并导入到细胞后,可使得细胞内形成双链的siRNA。
如本文所用,术语“互补”指的是核苷酸之间的碱基配对,如通过氢键结合配对,胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过2个氢键与腺嘌呤结合,胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过3个氢键结合。总体来讲,一条核酸含有一对与另一特定的核苷酸序列有“互补百分率”的核苷酸序列。例如,一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列可能有80%,90%或100%的互补性,提示这个核苷酸序列的10个核苷酸中有8个,9个,或10个与另一个特定的核苷酸序列互补。两条互补的核苷酸序列含有一个正义链(sense)和一个反义链(antisense)。术语“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80%,较佳的90%,更佳的95%,最佳的100%的互补性。
如本文所用和所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”;“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
抑制TM4SF4的干扰分子
基于抑制TM4SF4的表达可抑制肝癌细胞的特点,可针对TM4SF4来设计干扰分子(如siRNA)序列,从而用于抑制细胞内TM4SF4的表达。
本发明人经过长期研究,根据TM4SF4的序列,在该序列上找到了若干个对于抑制TM4SF4 mRNA转录有用的靶点,所述靶点对应TM4SF4 mRNA(GenBank登录号为NM_004617)上的位置分别为:第835-855位、第395-413位、第487-505位。本发明人在选择靶序列时,制定以下原则:(1)从TM4SF4的mRNA的起始密码开始,寻找“AA或者NA”二连序列,记下其3’端的19-21个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用19-21个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计;(2)siRNA序列的GC含量应为30-60%左右,以GC含量在45-55%左右的优先;(3)在设计siRNA时尽量避开5’端和3’端的非编码区,因为这些区域可能会有调控蛋白的结合。此外,在筛选siRNA靶序列时,还需进行比对分析,从而排除任何与TM4SF4以外的任何人类基因同源的靶序列,找出最佳的有效片段。任何经辨认属于非特异性的靶序列被排除在外。靶序列与核酸数据库中其它序列对比可通过目前已知的多种比较方法进行。一种常用的比较方法如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析。经过本发明人大量的分析和比较,对应TM4SF4 mRNA上的位置分别为第835-855位、第395-413位、第487-505位的靶序列与其它的人类核酸序列没有显著的同源性。作为本发明的优选方式,所述的靶序列是对应于TM4SF4 mRNA上第487-505位的靶序列。
基于上述靶点,本发明提供了抑制TM4SF4表达的siRNA,所述的siRNA可特异性地干扰TM4SF4基因的转录。所述的siRNA可以被制备成一种包含正义链和反义链的双链核酸,在其中正义链和反义链基本上互补。互补的正义链和反义链随意地包含1-2个核苷酸悬突在一条或两条链上的3’末端。作为一种优选方式,所述的双链核酸包含正义链和反义链,每条链有19-21个核苷酸。较佳地,所述的siRNA与选自TM4SF4 mRNA上的第835-855位、第395-413位、第487-505位的靶序列互补。
本发明对siRNA的制备方法没有特别的限制,包括但不限于:化学合成法,体外转录法、Rnase III(如Silencer siRNA Construction Kit,Ambion公司)或Dicer酶消化dsRNA法等。应理解,本领域技术人员在得知了本发明所提供的TM4SF4上的靶序列以后,可以以各种途径方便地制备或表达所述的siRNA。例如,所述的siRNA是化学合成的。
siRNA通常制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链,这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此,举例来讲,互补的正义链和反义链是化学合成的,其后可通过退火杂交,产生合成的双链RNA复合物。
此外,siRNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时,它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链,其后杂交生成双链siRNA。在Engelke,D.R.写的RNA Interference(RNAi):Nuts and Bolts of RNAiTechnology一书中,特别是第5和第6章,DNA Press LLC,Eagleville,PA,2003可以读到制备siRNA的合成和重组方法。
作为本发明的优选方式,一种双链“短发夹”RNA复合物(称作“shRNA”“hpRNA”或“发夹siRNA”)包含一条反义链和一条正义链,通过一个间隔序列相连。shRNA可以化学合成,也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。shRNA有互补结构区,在杂交条件下形成“发夹”构象,在其中互补的正义链和反义链相连接,例如,通过一个1-20个核苷酸的核苷酸序列连接。总体来讲,每一个互补的正义链和反义链有大约14-30个核苷酸。
如上述,shRNA可以由编码需要的转录物的双链DNA模板来表达。编码需要的转录物的双链DNA模板(本发明的寡核苷酸)被插进一个载体,例如质粒或病毒载体,然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下,可被切割成小干扰RNA分子,从而进入RNAi途径。
“构建物”及“表达盒”在这里是指重组DNA分子,它包含预期的核酸编码序列,这个序列编码一个siRNA或shRNA;这个DNA分子还包含转录在体外或体内可操作的连接编码序列所必需的或预期的适合的调控元件。“调控元件”在这里指的是可一定程度上控制核酸序列表达的核苷酸序列。一些常规的的调控元件包括增强子,内核糖体进入位点(IRES),复制起点,多腺苷酸化信号,启动子,转录终止序列,以及上游调节区,这些调控元件有助于核酸的复制、转录、转录后修饰等。
所述的构建物通常具有以下式I结构:
Seq正向-X-Seq反向 式I,
式I中,Seq正向、Seq反向、X的定义同前所述。
式I所示的结构在转入细胞后,形成式II所示的二级结构:
式II,
式II中,||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的氢键。
式II所示的构建物在细胞内可生成双链的小干扰RNA(siRNA)。较佳的,所述的间隔序列具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
作为本发明的优选方式,所述的Seq正向或Seq反向具有SEQ ID NO:3所示的寡核苷酸序列。
基因转移
在获得的可有效抑制TM4SF4表达的siRNA后,需要通过特定的方法来将所述的siRNA特异性转移或递送到肿瘤细胞内或者使所述的siRNA在肿瘤细胞内被生成,从而使肿瘤细胞与所述的siRNA接触。这种特异性递送可通过多种不同的递送方法来完成,例如直接在局部部位注射所述的siRNA。然而,研究递送方法的同时还需要考虑对于人体的安全性问题。
基因转移的方法包括物理方法、化学方法和病毒载体生物学方法,这些方法均可用于本发明。腺病毒、腺相关病毒和慢病毒都可以作为基因转移的载体,它们都可被用于本发明。
本发明人在研究中找到了一种特别有效的递送方法,以腺病毒(Ad)作为载体,将所述的siRNA或shRNA递送到靶细胞中。以腺病毒作为递送载体的优点如下:首先,大多数的癌细胞都是上皮细胞来源的,而腺病毒具有嗜上皮细胞性,因此采用腺病毒具有很好的选择性;其次,腺病毒产生的滴度高,腺病毒DNA不整合到靶细胞基因组,对于人体有良好的安全性;再次,腺病毒的理化性质稳定,易于制备、纯化、浓缩。
腺病毒是一种直径约80-110nm的双链DNA病毒,双链DNA长约36Kb,基因组由九个区组成,四个表达较早(E1-E4)称作早区,五个表达较晚(L1-L5)称作晚区,表达受细胞转录因子和E1区控制,E2区主要调节DNA复制,E3区基因产物与病毒逃避宿主免疫系统的清除有关,而E4区的产物参与病毒DNA复制、晚区基因表达和转录本拼接等活动。腺病毒宿主较广,而且对增殖和非增殖的细胞都能感染,但是绝大部分腺病毒对人的致病性都低。腺病毒通过衣壳上纤毛的头节区与细胞上的CAR受体结合,黏附并进入细胞,然后开始复制和病毒颗粒的释放,在整个病毒周期中并不整合到染色体中。人腺病毒根据颗粒表面表位的不同分为6个亚属、50多个血清型,目前主要用于基因载体的是C亚属的5型腺病毒。腺病毒的E1区基因编码的两个蛋白能够与人的RB和P53蛋白相互作用,所以被改造成基因转移和治疗载体时都去掉了E1区,替换上需要转移的外源基因。作为本发明的优选方式,采用复制缺陷型Ad5,缺失与病毒复制相关的基因E1,必须由宿主细胞(如293细胞)提供E1蛋白,才能复制出具有感染能力的病毒。
腺病毒可通过受体介导的细胞内摄途径进入细胞,核内体酸化后破裂,胞浆内病毒DNA于溶酶体降解之前释出,然后进入细胞核而变成附着体状态。
本发明提供一种重组的腺病毒,所述的腺病毒的基因组中含有一重组表达盒,所述的重组表达盒含有如式I结构的构建物:
Seq正向-X-Seq反向 式I,
式I中,Seq正向、Seq反向、X的定义同前所述。
在重组表达盒中,除了所述构建物以外,还包括与所述构建物操作性相连的其它元件,包括但不限于:启动子、终止子等。
在进入到细胞内后,所述的构建物在RNA聚合酶III启动子(或RNA聚合酶III改造的CMV启动子)的作用下,形成式II所示的二级结构:
式II的二级结构在细胞内被诸如Dicer酶加工后,形成可抑制TM4SF4转录的siRNA。
所述的Seq正向或Seq反向选自下组(或与选自下组的序列互补):(a)具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列;(b)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;(c)具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。优选的,所述的Seq正向或Seq反向具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
此外,还可以使重组的腺病毒表达靶向元件或与靶向元件相结合,靶向元件例如可以是增强所述重组腺病毒穿越细胞(特别是癌细胞)膜屏障的。例如蛋白质,肽类,抗体,抗原结合抗体片段,激素,抗原,半抗原,碳水化物结合部分如凝集素,酶,酶底物,受体,受体配体,运载体的底物等,以及其它能够与结合配偶体分子特异性相互作用的分子。更特别的,增强腺病毒到细胞内特定位置的递送作用的靶向元件可以是不同的细胞器定位信号,例如核定位信号。或者,靶向元件可与靶细胞的标记物(如特定的肿瘤标记物)发生相互作用。
评估腺病毒将siRNA或shRNA引入细胞的有效量的适合方法是已知的,包括测定TM4SF4蛋白和/或TM4SF4编码mRNA的以下方法中的一种或多种:RT-PCR,RNA印迹,免疫印迹,免疫沉淀作用以及ELISA(酶联免疫吸附测定)。此外还包括:对接触所述抑制制剂后诱导的细胞凋亡进行测定,例如对特异性凋亡指示物测定。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物,所述的药物组合物包括有效量的所述重组腺病毒以及药学上可接受的药学载体,所述药学载体是与所述腺病毒相容的。所述的药学载体本质上对于人和/或动物无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即有合理的效益/风险比的物质,并在本质上与腺病毒、任何所用到的靶向元件以及其它成分无作用。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
所述“药学上可接受的药学载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明所述的重组腺病毒的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的siRNA的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常,当本发明的重组腺病毒制剂每天以约103-1015pfu/kg(优选的为104-1012pfu/kg;进一步优选的为105-1010pfu/kg)动物体重的剂量给予,能得到令人满意的效果,较佳地每天以2-4次分开的剂量给予,或以缓释形式给药。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
任何适用的给药途径都是可以的,包括但不限于:静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予、肿瘤内给予等;优选的,所述给药方式是非肠道给予的。
本发明的主要优点在于:
(1)首次揭示可高效和特异地抑制TM4SF4表达的干扰分子,并采用RNA干扰技术验证了TM4SF4在肿瘤的发生和发展中的重要作用。
(2)提供一种良好的抑肿瘤制剂,以腺病毒作为将所述siRNA或shRNA递送到细胞内的载体。由于大多数的癌细胞都是上皮细胞来源的,而腺病毒具有嗜上皮细胞性,因此具有很好的选择性;并且,本发明的腺病毒产生的滴度高,不整合宿主基因组,对于人体的安全性高;此外,腺病毒的理化性质稳定,易于制备、纯化、浓缩。
(3)本发明的产品在细胞水平上或动物水平上均具有很高的TM4SF4基因表达抑制效率,呈现明显的抑癌效果
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
以下实验例中涉及的实验所用到的实验材料和方法:
对照细胞株选用不表达TM4SF4的正常肝细胞株L02(购自中国科学院细胞库),实验细胞株选用表达TM4SF4的肝癌细胞株之一BEL-7404(购自中国科学院细胞库),但这并不意味着本发明仅限于所列举的细胞株。
实施例1.针对TM4SF4的RNAi靶序列的选择
本发明人选择靶序列的原则如下:
1.从TM4SF4的mRNA的起始密码开始,寻找“AA或者NA”二连序列,并记下其3’端的19-21个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用19-21个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。
2.siRNA序列的GC含量应为30-60%左右,以GC含量在45-55%左右的优先。
3.在设计siRNA时尽量避开5’端和3’端的非编码区,因为这些区域可能会有调控蛋白的结合。
4.将候选的序列与人的基因组数据库做比较,排除那些和其它编码序列同源的序列。
5.选择合适的序列,一般一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。
发明人根据以上原则,选择了3条序列,对应TM4SF4的mRNA(GenBank登录号为NM_004617)上的位置分别为:第835-855位、第395-413位、第487-505位。序列如下:
S835-855:5’-GTTTAAACCTCCGAGATGAGC-3’(SEQ ID NO:1);
S395-413:5’-GCGGTGTCTTGATGATCTT-3’(SEQ ID NO:2);
S487-505:5’-CGATTTGCGATGTTCACCT-3’(SEQ ID NO:3)。
实施例2.诱导RNAi的质粒的构建和抑制效率的检验
将上述的三条序列设计成发夹结构插入到pSpressorAdeno质粒(购自IMGENEX Corporation)中,构建出能表达hpRNA,进而产生siRNA的质粒。对应每条靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸。再将两条互补的寡核苷酸退火后配对形成带有黏性末端的dsDNA片段,然后连接到酶切后的质粒中。合成寡核苷酸的序列如下:
对应S835-855的两条寡核苷酸为:
S835-855(正向):5’-tcgaGCTCATCTCGGAGGTTTAAACaatcgataGTTTAAACCTCCGAGATGAGC-3’(SEQ ID NO:4);
S835-855:(反向):5’-ctagGCTCATCTCGGAGGTTTAAACtatcgattGTTTAAACCTCCGAGATGAGC-3’(SEQ ID NO:5);
对应S395-413的两条寡核苷酸为:
S395-413(正向):5’-tcgaGCGGTGTCTTGATGATCTTaatcgataAAGATCATCAAGACACCGC-3’(SEQ ID NO:6);
S395-413(反向):5’-ctagGCGGTGTCTTGATGATCTTtatcgattAAGATCATCAAGACACCGC-3’(SEQ ID NO:7);
对应S487-505的两条寡核苷酸为:
S478-505(正向):5’-tcgaCGATTTGCGATGTTCACCTaatcgataAGGTGAACATCGCAAATCG-3’(SEQ ID NO:8);
S478-505(反向):5’-ctagCGATTTGCGATGTTCACCTtatcgattAGGTGAACATCGCAAATCG-3’(SEQ ID NO:9)。
退火操作如下:在无菌管中加入正向和反向寡核苷酸各1μg、退火缓冲液10μl,补无菌水到100μl体系。95℃置10min,然后逐渐冷却到室温。退火得到的dsDNA片段表示如下:
dS835-855:5’-tcgaGCTCATCTCGGAGGTTTAAACaatcgataGTTTAAACCTCCGAGATGAGC-3’(SEQ ID NO:4);
3’-CGAGTAGAGCCTCCAAATTTGttagctatCAAATTTGGAGGCTCTACTCGgatc-5’(SEQ ID NO:5);
dS395-413:5’-tcgaGCGGTGTCTTGATGATCTTaatcgataAAGATCATCAAGACACCGC-3’(SEQ ID NO:6);
3’-CGCCACAGAACTACTAGAAttagctatTTCTAGTAGTTCTGTGGCGgatc-5’(SEQ ID NO:7);
dS478-505:5’-tcgaCGATTTGCGATGTTCACCTaatcgataAGGTGAACATCGCAAATCG-3’(SEQ ID NO:8);
3’-GCTAAACGCTACAAGTGGAttagctatTCCACTTGTAGCGTTTAGCgatc-5’(SEQ ID NO:9)。
这三条dsDNA中间引入的环(Loop)序列为5’-aatcgata-3’(SEQ ID NO:16),其中含有Cla I的酶切位点。两端引入的黏性末端分别为Xho I和Xba I切后的黏性末端。
用Sal I和Xba I将pSpressorAdeno质粒进行酶切线性化,将退火的dsDNA片段分别和经酶切线性化的质粒连接起来。连接体系为10μl:线性化的质粒1μl,退火片段2μl,T4 DNA连接酶1μl,2×连接酶缓冲液5μl,灭菌水1μl。室温连接30min后,转化到DH5α中,挑取单克隆菌落,抽取质粒,酶切验证。阳性克隆不能被Sal I切开,但是能被Cla I切开。取酶切验证呈阳性的克隆再进一步测序验证。
将插入了片段dS835-855、dS395-413和dS478-505后构建的重组质粒分别命名为pSi1,pSi2和pSi3。质粒的结构和插入序列的示意图见图1。
用Lipofectamine2000共转染pCDNA3(购自Invitrogen Corporation)、pCDNA3-flag-TM4SF4、pEGFP-C2(购自BD Biosciences Clontech)和腺病毒质粒(pSi1或pSi2或pSi3质粒)到293T细胞(购自ATCC),检验针对3条靶序列的RNAi质粒对外源TM4SF4表达的抑制效果。接种293T细胞到24孔板,每孔6×105个细胞,37℃、5%CO2条件下贴壁培养。培养24h后转染,每孔转染pEGFP-C2为0.2μg,pCDNA3-flag-TM4SF4为0.5μg,腺病毒质粒为0.5μg或1μg,用pCDNA3将转染DNA的总量补齐到1.7μg。转染48h后加SDS-PAGE电泳上样缓冲液收细胞,western blot检验flag-TM4SF4的蛋白水平。其中针对于S487-505位点的质粒pSi3抑制外源TM4SF4表达的效率最高,结果见图2。
其中,pCDNA3-flag-TM4SF4质粒如下构建:通过常规方法反转录获得TM4SF4基因。TM4SF4基因通过PCR的方法获取,并插入到pCDNA3-flag质粒多克隆位点处的XbaI和EcoRI位点之间。
实施例3.诱导RNAi的重组腺病毒(AdSiTM4SF4)的制备和检测
1.将重组的pSi3质粒线性化。体系为50μl:pSi3质粒15μg,Nhe I 5μl,10×酶切缓冲液5μl,无菌水补到50μl。37℃酶切3h,然后70℃置15min使酶失活。加入1/10体积的3M NaAc和2体积的无水乙醇沉淀纯化线性化的质粒。
2.用Lipofectamine2000共转染线性化的pSi3质粒15μg和线性化(以PacI线性化)的pacAd5(购自IMGENEX Corporation)4μg到6cm皿的HEK293细胞中。转染5h后换10%FBS的DMEM培养基持续培养。
3.第7天左右观察病毒空斑的形成,如果有60%以上的细胞飘起,则收集细胞和上清。
4.取收集的细胞和上清反复冻融(-80℃/37℃)3次后,感染大量扩增的细胞,大量制备重组病毒。
5.收集感染后飘起的细胞,PBS洗一遍,用10mM Tris(pH 8.1)重悬。然后反复冻融(-80℃/37℃)3次,12000rpm离心20min,收集上清。
6.取收集的上清,CsCl密度梯度离心,收集离心后的病毒带,在3%蔗糖/PBS溶液中透析。收集纯化透析后的病毒,保存于-80℃。
由于在重组腺病毒的产生过程中可能会与HEK293细胞基因组中的一段序列发生同源重组,进而重新获得E1基因,产生复制型的病毒(RCA)。本发明人通过PCR的方法检验RCA的污染。取纯化后的重组腺病毒,加入含100μg/ml蛋白酶K的TNE溶液,55℃置2h,抽取重组腺病毒的基因组。PCR验证未见有E1基因的掺入,结果见图3。
检验RCA的引物用两条,如下:
E1F(正向):5’-GGAGCGAAGAAACCCATCTGAG-3’(SEQ ID NO:10);
E1R(反向):5’-CCTATCCTCCGTATCTATCTCCAC-3’(SEQ ID NO:11);
E1AF(正向):5’-ATCGAAGAGGTACTGGCTGA-3’(SEQ ID NO:12);
E1AR(反向):5’-CCTCCGGTGATAATGACAAG-3’(SEQ ID NO:13)。
检验插入序列的引物如下,并取PCR后的片段测序验证。
PF(正向):5’-GTGGATAGCGGTTTGACT-3’(SEQ ID NO:14);
PR(反向):5’-CTCATCGTACCTCAGCAC-3’(SEQ ID NO:15)。
纯化后的重组腺病毒通过OD260值和50%组织培养感染计量法测定滴度。一个OD260的值相当于1×1012pt/ml左右的病毒颗粒数,但是它不能区分感染性和缺陷性的病毒颗粒。50%组织培养感染计量法能够测定含有感染性病毒的量,其得到的单位为TCID50/ml,最后换算成以pfu/ml为单位。最后得到纯化的重组腺病毒的滴度数量级为1012pt/ml和1010pfu/ml。
制备对照病毒AdSiGFP如下:AdSiGFP的制备过程与AdSiTM4SF4的制备过程相同。在HEK293细胞中共转Nhe I线性化的AdenosiGFP质粒(购自IMGENEX Corporation)和PacI线性化的pacAd5,经同源重组获得AdSiGFP。
实施例4.重组腺病毒诱导的RNAi能有效抑制内源TM4SF4的表达
纯化的重组腺病毒直接感染高表达TM4SF4的BEL-7404细胞株,诱导的RNAi能有效的抑制内源TM4SF4的表达,TM4SF4的mRNA水平显著降低。
1.取BEL-7404细胞,以4×105细胞/孔接种6孔板。
2.第2天取AdSiTM4SF4和对照病毒AdSiGFP,按合适的病毒量感染细胞。感染时,每孔换无血清的培养基800μl,加入病毒。感染后的2小时内,每隔15min摇晃孔板一次,感染9小时后换新鲜的含10%FBS的培养基。
3.收取感染病毒2天后的细胞,检测TM4SF4的RNA水平。具体方法如下:弃去培养基,PBS洗一遍细胞,每孔加入500μl Trizol(Invitrogen)收取细胞,抽提RNA,RT-PCR检验TM4SF4的RNA水平。
感染AdSiTM4SF4后2天即能检测到TM4SF4的RNA水平明显降低。结果见图4。
实施例5.AdSiTM4SF4具有抑制肝癌细胞生长的活性(MTT法)
1.接种L02细胞和BEL-7404细胞到96孔板,每孔1000个细胞。
2.第2天感染重组腺病毒。分3组:空白对照组,AdSiGFP处理组和AdSiTM4SF4处理组。每组6个复孔。感染时,每孔用70μl无血清的培养基。病毒处理9小时后,每孔换含10%胎牛血清的正常培养基100μl持续培养。
3.每2天更换一次新鲜的培养基。每天MTT比色法检测一次。具体如下:每孔培养液中加入10μl 5mg/ml的MTT溶液,37℃培养箱中孵育4小时。吸掉反应混合液,每孔加入200μl的DMSO,混匀后,在酶标仪上检测490nm的吸光度。以培养天数为横坐标,OD490为纵坐标,绘制细胞的生长曲线。
AdSiTM4SF4感染BEL-7404后,细胞的生长速度被明显抑制;而不表达TM4SF4的L02细胞经过同样的处理后,生长状况未见有明显的变化。结果见说明书附图中的图5。
实施例6.AdSiTM4SF4具有抑制肝癌细胞克隆形成能力的活性
1.接种L02和BEL-7404细胞到6孔板,每孔1000个细胞。
2.接种后的第2天取重组腺病毒按适当的病毒量感染细胞。感染时,每孔用800μl无血清的培养基。感染后的2小时内,每隔15分钟摇晃孔板一次。感染9小时后,每孔换含10%胎牛血清的正常培养基1.5ml,持续培养,每2天更换一次新鲜的培养基。
3.培养2周后,弃去培养基,PBS洗一遍细胞,甲醇固定20min。PBS洗2次,加入0.1%的结晶紫染色,水洗2次,晾干。拍照并记取细胞克隆数目。
结果表明,诱导针对TM4SF4 RNAi的重组腺病毒能有效抑制肝癌细胞株BEL-7404的克隆形成能力,见图6。
实施例7.AdSiTM4SF4影响肝癌细胞的细胞周期的检测(FCM)
1.接种L02和BEL-7404细胞到24孔板,每孔4×104个细胞。
2.接种后的第2天取重组腺病毒按适当的病毒量感染细胞。感染时,每孔用300μl无血清的培养基。感染后的2小时内,每隔15分钟摇晃孔板一次。感染9小时后,每孔换含10%胎牛血清的正常培养基500μl,持续培养,每2天更换一次新鲜的培养基。
3.病毒感染4天后,收细胞,FCM检测。收集所有的细胞,2000rpm离心5min,弃去上清,PBS洗一次。加入500μl 70%的乙醇吹匀,冰上固定30min。离心去掉乙醇,PBS洗2遍。加入含500μg/ml RNaseA的PBS溶液重悬,37℃消化RNA至少2h,其间每半小时混匀一次。加入30μg/ml的PI,4℃染色30min。上机检测。
BEL-7404经过该能抑制TM4SF4表达的重组腺病毒感染后,sub-G1期的细胞明显增多;而对L02细胞基本没有影响,见图7。
实施例8.AdSiTM4SF4具有抑制肝癌细胞成瘤性的活性
1.接种3×106的BEL-7404细胞到10cm的培养皿。
2.第2天按适当的病毒量感染病毒。分3组:空白对照组,AdSiGFP感染组,AdSiTM4SF4感染组。感染时,每皿用6ml无血清的培养基。感染后的2小时内,每隔15分钟摇晃孔板一次。感染9小时后,换10ml含10%胎牛血清的正常培养基。
3.培养24小时后,消化细胞,调细胞数,注射到小鼠右侧背部皮下。每只小鼠注射量为100μl,注射细胞数为5×106个。
4.4周后观察成瘤状况并记录荷瘤的大小。
结果见图8,可见该能抑制TM4SF4表达的重组腺病毒感染后,可显著抑制肝癌细胞成瘤性。
实施例9.AdSiTM4SF4对肝癌细胞的裸鼠荷瘤具有抑瘤能力
1.接种BEL-7404细胞到裸鼠皮下,每只剂量100μl,细胞数为5×106。
2.待瘤的直径达到4mm后,按成瘤的大小将裸鼠平均分为2组,每组5只。
3.每只裸鼠注射2×108pfu的重组腺病毒,每2天注射一次,给药4次。
4.每周观察成瘤状况并记录荷瘤的大小。
结果见图9。可见该能抑制TM4SF4表达的重组腺病毒感染后,可显著抑制肿瘤的生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>抑制TM4SF4表达的干扰分子及其应用
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