CN102154293A - 抑制猪瘟病毒复制感染的小干扰rna及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制猪瘟病毒复制感染的小干扰RNA及其编码序列，同时还公开了制备抗猪瘟病毒感染生物制剂的方法，应用RNA干扰法生产治疗CSFV感染的生物制剂，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的siRNA，适用于工业化生产。本发明还提供了利用该方生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到95.04-98.59%，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病率和死亡。

Description

抑制猪瘟病毒复制感染的小干扰RNA及制备方法和应用

技术领域

本发明公开了抑制猪瘟病毒复制感染的小干扰RNA及其编码序列，同时还公开了制备抗猪瘟病毒感染生物制剂的方法，涉及治疗猪瘟病毒感染的药物，属于生物制药技术领域。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV) 引起的一种高度接触性传染病，也是OIE必须通报的疫病之一，该病流行广泛，发病率高，危害极大。CSFV是黄病毒科( Flaviviridae )瘟病毒属( Pestivirus)的成员，为有囊膜的正链RNA病毒，基因组全长12.3kb。目前，为了防止猪瘟病毒感染的一般采用被动免疫（注射高免血清）和主动免疫方法，但是仍然不能完全防治猪瘟流行。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）首次报道于1998年，是近几年才逐渐发展起来的一种全新的技术，RNAi从一发现开始就受到病毒学研究者的高度重视，被认为是抗病毒感染的最有效方法之一并被用于病毒学研究领域。应用RNAi技术抑制病毒增殖的关键是获得高效、特异的小干扰RNA。

发明内容

本发明的目的是提供能抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA。

本发明所提供的能抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一：

1）正义链为序列表中的SEQ ID 1，反义链为序列表中SEQ ID 2 的双链RNA序列；

2）正义链为序列表中的SEQ ID 3，反义链为序列表中SEQ ID 4的双链RNA序列；

3）正义链为序列表中的SEQ ID 5，反义链为序列表中SEQ ID 6的双链RNA序列。

将上述双链RNA序列分别命名为siNS3-1、siNS3-2和siNS3-3。

编码上述能抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA的DNA序列也属于本发明的保护范围，是下述双链核苷酸序列之一：

1）正义链为序列表中的SEQ ID 7所示的核苷酸序列，反义链为序列表中SEQ ID 8所示的核苷酸序列；

2）正义链为序列表中的SEQ ID 9所示的核苷酸序列，反义链为序列表中SEQ ID 10所示的核苷酸序列；

3）正义链为序列表中的SEQ ID 11所示的核苷酸序列，反义链为序列表中SEQ ID 12所示的核苷酸序列。

本发明提供了能抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA编码序列制成的生物制剂，可通过两种方法实现：

方法一：方法包括以下步骤：

按照T7、T3或SP6 RNA聚合酶使用方法，合成权利要求2所述编码序列的正义链和反义链模板DNA和T7 、T3或SP6 RNA 聚合酶结合序列，利用相应的聚合酶体外转录设计合成小干扰RNA，得到体外转录生成的小干扰RNA猪瘟治疗生物制剂。

方法二：方法包括以下步骤：

按照含H1或U6启动子体外转录载体使用方法，构建权利要求2所述编码序列能生成小干扰RNA发夹结构的质粒，得到猪瘟治疗生物制剂。

本发明还提供了能抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA编码序列制成的生物制剂在猪瘟病毒敏感动物实例，对猪瘟病毒的抑制效率高达到95.04-98.59%，在敏感动物体内能明显抑制猪瘟病毒的感染，使动物免于发病和死亡。

本发明涉及的猪瘟病毒以下简写CSFV；本发明涉及的小干扰RNA以下简写siRNA；本发明涉及的小干扰RNA发夹结构以下简写shRNA。

1. 能抑制CSFV复制与感染的siRNA作用的靶序列:

利用RNA干扰技术设计合成siRNA后，这些siRNA能特异、高效抑制CSFV增殖从而对CSFV感染有明显治疗作用。siRNA作用的靶序列如表1所示：

表1 siRNA作用的靶序列及其位置

针对CSFV基因	小干扰RNA作用的靶序列	位置*	命名
				NS3	5’AAGCTTATGAGTGGAATACAA 3’	5711-5731	NS3-1
NS3	5’CAGATGCCACAACCTAAGTTA 3’	6044-6064	NS3-2
				NS3	5’TACCACTATGATCTACTGCAA 3’	6722-6742	NS3-3

*：位置相对与参考毒株shimen, GenBank 登录号：AF092448。

能抑制CSFV复制与感染的siRNA编码序列制成的生物制剂：

可以通过以下两种方法制得

1）体外合成siRNA生物制剂：

根据siRNA编码序列分别合成编码siRNA的正义链和反义链模板DNA和 T7 RNA聚合酶结合序列，并确定对照序列为编码序列NS3-1的反向序列。利用T7 RNA聚合酶体外转录设计合成siRNA，得到体外转录生成的siRNA猪瘟治疗生物制剂。这些生物制剂分别命名为siNS3-1、siNS3-2和siNS3-3。

序列如下：

T7 RNA聚合酶结合序列: 5’GGATCCTAATACGACTCACTATA 3’

NS3-1正义链模板序列:

5’AATTGTATTCCACTCATAAGCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-1反义链模板序列:

5’AAGCTTATGAGTGGAATACAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-2正义链模板序列:

5’AATAACTTAGGTTGTGGCATCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-2反义链模板序列:

5’AAGATGCCACAACCTAAGTTATATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-3正义链模板序列:

5’AATTGCAGTAGATCATAGTGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-3反义链模板序列:

5’AACCACTATGATCTACTGCAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

对照的正义链模板序列：

5’AACGAATACTCACCTTATGTTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

对照的反义链模板序列:

5’AAAACATAAGGTGAGTATTCGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

将上述合成的DNA序列用无DNA酶、无RNA酶的水分别稀释为100 pmol/L，用PCR方法将它们分别合成为双链DNA序列，按照附图1所示体外合成siRNA。

2）质粒表达shRNA生物制剂：

根据pSilencer 3.1 H1 Hygro（Ambion）载体设计要求，根据siRNA的模板序列设计并构建能生成小干扰RNA发夹结构（shRNA）的质粒，得到猪瘟治疗生物制剂（见附图2）。这些生物制剂分别命名为shNS3-1、shNS3-2和shNS3-3。能生成shRNA的模板DNA序列如表2所示：

通过以下检测方法证明本发明制剂具有抑制CSFV增殖的作用：

例1

体外合成的siRNA抑制CSFV增殖:

①计数PK-15细胞，用含10 ％小牛血清、0.3 ％谷氨酰胺、无抗生素的MEM营养液以1.0×10⁴/孔传代于24孔细胞培养板，37℃ 5 ％ CO₂培养24 h，使贴壁细胞生长满度约为75％，吸去营养液，用无血清无抗生素的MEM营养液洗涤单层细胞3次，加入450 μL无血清无抗生素的MEM备用。

②用X-tremeGene siRNA Transfection Reagent (Roche)将合成的siRNA转染PK-15细胞，具体方法为：分别于无核酸酶的离心管中加入无血清无抗生素的MEM营养液47.5 μL、X-tremeGene siRNA Transfection Reagent 2.0 μL, 轻轻混匀，室温静置3-5 min，取另一无核酸酶的离心管，加入无血清无抗生素的MEM营养液48.0 μL，siRNA(siNS3-1、siNS3-2、siNS3-3或si对照)2.0 μL ,轻轻混合均匀，室温静置3-5 min，混合上述两个离心管中溶液，室温静置15-20 min，使脂质体和siRNA形成转染复合物，然后分别加入PK-15细胞单层中，轻轻混匀，37℃孵育4-6 h，用无血清无抗生素的MEM洗涤转染细胞，用5.0×10² TCID₅₀的CSFV Shimen株感染转染了siRNA的细胞，感染后培养72 h，用间接免疫荧光试验、Real-time PCR和病毒的半数细胞感染量（TCID₅₀）测定等方法检测CSFV在转染细胞中的增殖，测定siRNA对CSFV感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。

表3间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况结果 

siRNA	感染病毒72h后间接免疫荧光结果
		si对照	细胞100 %被感染
siNS3-1	感染细胞不到3 %
		siNS3-2	感染细胞不到1 %
siNS3-3	感染细胞不到3 %

转染siRNA的PK-15细胞感染CSFV后，间接免疫荧光检测结果表明，未转染的PK-15细胞和转染si对照的PK-15细胞，感染CSFV 72 h后，几乎所有的细胞均能被荧光抗体染色，转染CSFV特异的siRNA（siNS3-1、siNS3-2或siNS3-3）的细胞感染CSFV后，只有极少的细胞能被荧光抗体染色，出现荧光的细胞不到全部细胞的3 ％（见表3）。

结果显示：转染si对照的细胞感染病毒后72 h，细胞总RNA中的CSFV基因组RNA拷贝数为1.13×10⁵ copies/ng总RNA，而siNS3-1、siNS3-2和siNS3-3转染细胞的CSFV基因组RNA拷贝数分别为7.53×10³ copies/ng、4.19×10³ copies/ng 、6.28×10³ copies/ng 总RNA，分别为转染si对照细胞的1/15、1/27 、1/18（见表4），表明导入细胞的CSFV特异的siRNA抑制了病毒在感染细胞中的增殖。

表5 测定细胞中病毒的半数细胞感染量（TCID₅₀）增减情况 

siRNA	感染病毒72h后TCID50	和对照比值
			si对照	1×104.25	—
siNS3-1	1×102.75	1/32
			siNS3-2	1×102.50	1/55
siNS3-3	1×102.75	1/32

结果显示：转染si对照的细胞感染CSFV后，病毒能有效地在细胞中增殖，显示出较高的感染滴度，感染后72 h的TCID₅₀测定结果为1×10^4.25，与未转染细胞感染CSFV后72 h的相当，表明转染试剂及转染过程对细胞支持CSFV的增殖能力有效较小，而转染CSFV特异siRNA(siNS3-1、siNS3-2或siNS3-3)的细胞感染CSFV后，TCID₅₀较低，病毒感染后72 h，siNS3-1、siNS3-2和siNS3-3转染细胞的TCID₅₀与si对照的感染滴度相比， 其TCID₅₀分别为1/32、1/55、1/32倍（见表5），表明siNS3-1、siNS3-2和siNS3-3有效地抑制了CSFV的增殖。

例2.

质粒表达的shRNA抑制CSFV增殖:

用含有10％小牛血清、不含抗生素的MEM营养液传代PK-15细胞于24孔细胞培养板，每孔5.0×10⁴细胞/500 μL个，37℃，5 ％ CO₂培养箱中培养20-24 h，使细胞贴壁生长满度达到75 ％，用FuGENE HD（Roche）进行转染，(每孔细胞)方法为：

① 取0.8 μg质粒（shNS3-1、shNS3-2或shNS3-3）DNA加入50 μL无血清无抗生素的MEM中，混匀。

② 取2.0 μL FuGENE HD（Roche）加入50 μL无血清无抗生素的MEM中，轻轻混匀，于室温静置5 min。

③ 将稀释的质粒DNA加入稀释的FuGENE HD（Roche）中，轻轻混匀后于室温静置20 min，以形成FuGENE HD（Roche）复合体。

④ 将形成的FuGENE HD（Roche）加入到上述准备的中，轻轻混匀，置于37℃ 5 ％ CO₂培养箱中转染4-6 h，换用含有2 %小牛血清和抗生素的MEM，37℃ 5 ％ CO₂培养箱中培养备用。

⑤ 抗生素抗性筛选

将转染了shRNA表达质粒的细胞，按优化确定的传代细胞满度，用含10％血清的MEM传代于6孔细胞培养板中（同时传代相同满度的未转染的PK-15细胞作为加压的正常对照细胞），培养24 h后，换用含有杀细胞浓度的相应抗生素（G-418或hygromicin B）、含有2 ％血清的MEM，37℃培养，杀死未转入质粒的细胞。其间每隔3 d换用含抗生素的新鲜营养液，直至对照细胞完全死亡，转染质粒的细胞长出细胞集落。换用含有50 ％杀细胞浓度的相应抗生素继续培养转染细胞，细胞集落长满培养孔后，扩大培养筛选所得细胞备用。

⑥ 表达的shRNA抑制CSFV的效果检测: 筛选得到的有抗生素抗性的转染细胞，用无抗生素（G-418或hygromicin B）的MEM传代于96孔细胞培养板，培养20-24 h后，用1×10² TCID₅₀的CSFV Shimen株感染，病毒感染后培养72 h，用间接免疫荧光、Real-time PCR、病毒的半数细胞感染量（TCID₅₀）测定等方法检测CSFV在转染细胞中的增殖，测定siRNA对CSFV感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。

表6间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况

表达shRNA质粒	间接免疫荧光结果
		sh对照	细胞100 %被感染
shNS3-1	小于5 %细胞被感染
		shNS3-2	小于5 %细胞被感染
shNS3-3	小于5 %细胞被感染

间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况结果表明,设计的shRNA抑制了病毒感染细胞（见表6）。

注：抑制率＝(对照分子数－shRNA样品分子数)/对照分子数×100％，计算shRNA抑制病毒基因组复制的效率，表中抑制倍数为对照/shRNA的值－1。

Real-time PCR方法检测基因组RNA 拷贝数测定结果表明CSFV在转染细胞中的基因组复制受到了高效的抑制（见表7）。

检测结果表明：转染sh对照的细胞，在CSFV感染后，其感染滴度增加迅速，在感染后48-60 h达到高峰，体现了CSFV在PK-15细胞中增殖时其感染滴度的变化特点，而与对照细胞相比，转染CSFV特异的shRNA表达质粒的细胞，CSFV的感染滴度增加速度慢，且比对照细胞的感染滴度低得多，在对照细胞的感染滴度达到高峰（48-60 h）时，转染CSFV特异的shRNA表达质粒的细胞的感染滴度仍然保持在较低的水平，且呈现出较为平滑的增长趋势，表明质粒表达的CSFV特异的shRNA使CSFV的成熟的感染性的病毒粒子的组装过程受到了抑制，且抑制作用能持续较长的时间，转染CSFV特异的shRNA表达质粒的细胞感染病毒后即使在感染滴度最高的时间（72-120 h），其感染滴度仍比对照低一个数量级（见表8）。

检测结果表明，在感染后60 h，按sh对照/shRNA－1计算抑制倍数，则shNS3-1、shNS3-2、shNS3-3抑制CSFV TCID₅₀的倍数分别为60.65、60.65、31.62倍，即使在shRNA转染细胞TCID₅₀较高的120 h，仍然对病毒具有8-18倍的抑制效率。

例3

动物实验水平

① 购进36只日本大耳白家兔，进行编号，饲养观察7 d，测定家兔正常基础体温每天测定两次，将编号的家兔用SPSS软件进行随机分组，每组8只，分组及注射见表9。

表9 实验家兔分组 

组别	siRNA(μg)/只	质粒(μg)/只
			si对照	300	-
siNS3	300	-
			sh对照	-	500
shNS3	-	500

实验家兔分组后，按上表的所示的注射剂量，分别注射转录获得的siNS3(siNS3-1 + siNS3-2 + siNS3-3，质量比1：1：1)和shNS3(shNS3-1 + shNS3-2 + shNS3-3，质量比1：1：1)表达质粒，其中质粒在攻毒前24 h注射，注射部位为颈部皮下，siRNA与攻毒同时注射，为静脉注射。

② HCLV攻毒及体温测定：注射shNS3表达质粒和siNS3的家兔，通过静脉注射50×ID₅₀的猪瘟兔化弱毒株，注射后24 h内每12 h测量2次体温，24 h后每间隔6 h测定家兔体温，直到家兔体温恢复到正常体温值。

如表10所示，在体外转录的siRNA实验组：si对照、siNS3两个组中，注射转录的si对照组的家兔首次升温超过基础体温的0.6℃的时间是在30 h，之后动物持续出现高热，而实验组出现发热时间的明显比对照组延迟，siNS3组的时间在攻毒后48 h，比对照组的发热时间延迟了12 h，且发热期的平均体温均低于对照组。在注射shRNA表达质粒的两个个实验组中，注射sh对照表达质粒的家兔发热的时间出现在36 h，持续时间为36 h，而实验组shNS3的发热时间在54 h，比对照组延迟了18 h。

从表中的实验结果看出，注射CSFV特异干扰RNA的实验组均表现出发热时间延迟，发热平均温度比对照组略低，且发热持续时间比对照组大大缩短的特点，表明CSFV特异的干扰RNA延迟了猪瘟兔化弱毒株在家兔体内的增殖，推迟了使家兔出现高热反应所需的病毒量。从附图3中的家兔体温变化趋势图中可以看出，实验组的体温上升速度明显比对照组慢，出现持续高热的时间比对照组的短，且温度较对照组低。

③ 抑制病毒增殖测定：恢复到正常体温的家兔，在6 h内捕杀，无菌采集家兔脾脏和肠系膜淋巴结，用Real-time PCR、病毒的半数细胞感染量（TCID₅₀）测定等方法检测CSFV在家兔体内中的增殖，测定siRNA分子对猪瘟病毒感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。

在用50×ID₅₀的CSFV兔化弱毒株攻毒后测定家兔的体温，提取家兔脾脏总RNA，用Real-time PCR检测病毒基因组增殖情况,结果显示见表11。

对照组si对照和sh对照的基因组数量在较高的水平上波动，而实验组中的基因组数量则较低，证明病毒增殖受到抑制。

取采集的各组实验家兔的脾脏，等量混合研磨后测定它们的感染滴度，见表12。

结果表明，si对照, siNS3, sh对照, shNS3注射组所对应的HCLV 的ID₅₀分别为1×10^3.83, 1×10^3.08, 1×10^3.92, 1×10^3.17，对照组si对照的ID₅₀是siNS3的5.62倍，sh对照的ID₅₀是shNS3的3.10倍。测定结果表明注射转录的siRNA和shRNA表达质粒均有效地抑制了猪瘟兔化弱毒株在家兔体内的增殖。

本发明的积极效果在于：应用RNA干扰法生产治疗CSFV感染的生物制剂，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的siRNA，适用于工业化生产。本发明还提供了利用该方生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到95.04-98.59 %，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病率和死亡。

附图说明

图1为本发明体外转录合成siRNA示意图；

图2为本发明质粒表达shRNA的示意图；

图3家兔攻毒后的体温曲线。

具体实施方式

实施例1  siRNA作用的靶序列:

1. 能抑制CSFV复制与感染的siRNA

利用RNA干扰技术设计合成siRNA后，这些siRNA能特异、高效抑制CSFV增殖从而对CSFV感染有明显治疗作用。siRNA作用的靶序列及其在CSFV基因组中的位置如表13所示：

表13 siRNA作用序列及其位置

针对基因	siRNA分子干扰序列	位置*	命名
				NS3	5’AAGCTTATGAGTGGAATACAA 3’	5711-5731	NS3-1
NS3	5’CAGATGCCACAACCTAAGTTA 3’	6044-6064	NS3-2
				NS3	5’TACCACTATGATCTACTGCAA 3’	6722-6742	NS3-3

*：位置相对与参考毒株shimen, GenBank 登录号：AF092448。

实施例2  体外合成siRNA：

按T7 RiboMAX Express RNAi System（Promega）说明书设计合成实施例1中选定的3个片段的siRNA 分子的DNA序列和T7 RNA聚合酶结合序列，参见附图1；分别合成转录各个siRNA 分子的正义链和反义链的模板DNA，序列如下：

T7 RNA聚合酶结合序列: 5’GGATCCTAATACGACTCACTATA 3’

NS3-1正义链模板序列:

5’AATTGTATTCCACTCATAAGCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-1反义链模板序列:

5’AAGCTTATGAGTGGAATACAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-2正义链模板序列:

5’AATAACTTAGGTTGTGGCATCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-2反义链模板序列:

5’AAGATGCCACAACCTAAGTTATATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-3正义链模板序列:

5’AATTGCAGTAGATCATAGTGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

NS3-3反义链模板序列:

5’AACCACTATGATCTACTGCAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

对照的正义链模板序列：

5’AACGAATACTCACCTTATGTTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

对照的反义链模板序列:

5’AAAACATAAGGTGAGTATTCGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC 3’

具体步骤为：

将上述合成的DNA用无DNA酶、无RNA酶的水分别稀释为100pmol/L，按下面步骤分别合成3个siRNA分子。

用PCR方法将它们分别合成为双链DNA，在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中加入稀释的T7 RNA聚合酶结合序列DNA 5.0 μL，分别加入上述11个用来转录成siRNA分子的的正义链和反义链DNA 5.0 μL，10×pfu DNA polymerase buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，水33.8 μL，置于PCR仪95℃变性2 min，加入pfu DNA polymerase 0.2 μL (1U)，再于95℃变性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 10 s，5个循环后，72℃后延伸7 min。反应结束后，加入经DEPC处理并高压灭菌的3 mol/L醋酸钠（pH 5.2）5.0 μL ，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置10 min，12000 r/min离心10 min，弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10 min，加入无DNA酶、无RNA酶的水50 μL充分溶解沉淀，聚丙稀酰胺凝胶电泳检查模板DNA制备结果。转录方法按T7 RiboMAX Express RNAi System说明书进行体：在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中依次加入上述制备的模板DNA 4.0μL， RiboMAX  Express T7 2×Buffer 10.0μL，Nuclease-Free Water 4.0μL，Enzyme Mix, T7 Express 2.0μL，然后置于37℃反应1 h；加入无RNA酶的DNA酶 1.0 μL (1U)，37℃ 30 min；混合相应的siRNA正义和反义链转录物，70℃保温10 min，缓慢降温至室温；加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠（pH 5.2），加入等体积的异丙醇，混匀后冰浴5 min，13000 r/min离心10 min，小心吸去上清液，500 μL 70％乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10-15 min，加入100 μL水充分溶解沉淀，电泳检查，测定含量后分装为0.3μg/μL，-80℃保存备用。

得到体外合成的siRNA猪瘟治疗生物制剂,其碱基序列见表14。

实施例3  质粒表达shRNA的设计方法：

根据pSilencer3.1H1 Hygro（Ambion）shRNA载体设计要求，设计用于表达shRNA的DNA序列，两端酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ。设计合成的引物见表15。

具体步骤如下：

按下面步骤分别合成4个生成shRNA分子的质粒，将合成的单链DNA稀释为100 μmol/L，用PCR方法将它们分别合成为双链DNA：取稀释的DNA各 25 μL，置于PCR仪95℃变性2 min，56℃ 30 s。反应结束后，加入3 mol/L醋酸钠（pH 5.2）5.0 μL，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置10 min，12000 r/min离心10 min，弃去上清液，用1000 μL 70％乙醇洗涤沉淀，弃去上清液，沉淀于室温干燥10 min，加入25 μL水充分溶解沉淀，-80℃保存备用。用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切表达shRNA的DNA插入片段，酶切消化结束后于70℃保温15min灭活内切酶，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后分别将它们克隆到pSilencer3.1H1 Hygro载体的BamHⅠ和HindⅢ位点，转化大肠杆菌，对转化菌落用31H1FP（GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG）和31H1RP（GCGGATAACAATTTCACACAGG）为引物进行PCR快速鉴定，对PCR阳性克隆小量提取质粒，通过测序确定重组质粒中的插入片段的正确性。

得到的质粒表达的shRNA分子能抑制猪瘟病毒增殖，表达shRNA分子的pSilencer3.1H1 Hygro载体在BamHⅠ和HindⅢ酶切位点间插入序列见表16。

SEQ ID 1-6:

SEQ ID 1:  5' GCUUAUGAGUGGAAUACAAUU 3'

SEQ ID 2:  5' UUGUAUUCCACUCAUAAGCUU 3'

SEQ ID 3:  5' GAUGCCACAACCUAAGUUAUU 3'

SEQ ID 4:  5' UAACUUAGGUUGUGGCAUCUU 3'

SEQ ID 5:  5' CCACUAUGAUCUACUGCAAUU 3'

SEQ ID 6:  5' UUGCAGUAGAUCAUAGUGGUU 3'

SEQ ID 7-12:

SEQ ID 7:  5' GCTTATGAGTGGAATACAATT 3'

SEQ ID 8:  5' TTGTATTCCACTCATAAGCTT 3'

SEQ ID 9:  5' GATGCCACAACCTAAGTTATT 3'

SEQ ID 10:  5' TAACTTAGGTTGTGGCATCTT 3'

SEQ ID 11:  5' CCACTATGATCTACTGCAATT 3'

SEQ ID 12:  5' TTGCAGTAGATCATAGTGGTT 3'

Claims (5)

1. 抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA,是下述双链RNA序列之一：

1）正义链为序列表中的SEQ ID 1，反义链为序列表中SEQ ID 2 的双链RNA序列；

2）正义链为序列表中的SEQ ID 3，反义链为序列表中SEQ ID 4的双链RNA序列；

3）正义链为序列表中的SEQ ID 5，反义链为序列表中SEQ ID 6的双链RNA序列。

2. 权利要求1所述的能抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA的编码序列，其特征在于：所述能抑制猪瘟病毒复制与感染的小干扰RNA的编码序列是下述双链核苷酸序列之一：

1）正义链为序列表中的SEQ ID 7所示的核苷酸序列，反义链为序列表中SEQ ID 8所示的核苷酸序列；

2）正义链为序列表中的SEQ ID 9所示的核苷酸序列，反义链为序列表中SEQ ID 10所示的核苷酸序列；

3）正义链为序列表中的SEQ ID 11所示的核苷酸序列，反义链为序列表中SEQ ID 12所示的核苷酸序列。

3. 权利要求2所述的编码序列在制备抗猪瘟病毒生物制剂中的应用。

4. 权利要求2所述的编码序列制成的生物制剂，方法包括以下步骤：

按照T7、T3或SP6 RNA聚合酶使用方法，合成权利要求2所述编码序列的正义链和反义链模板DNA和T7 、T3或SP6 RNA 聚合酶结合序列，利用相应的聚合酶体外转录设计合成小干扰RNA，得到体外转录生成的小干扰RNA猪瘟治疗生物制剂。

5. 权利要求2所述的编码序列制成的生物制剂，方法包括以下步骤：

按照含H1或U6启动子体外转录载体使用方法，构建权利要求2所述编码序列能生成小干扰RNA发夹结构的质粒，得到猪瘟治疗生物制剂。

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