CN103088025B

CN103088025B - 一种抗猪瘟病毒的肽核酸

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Publication number: CN103088025B
Application number: CN201310014160.7A
Authority: CN
Inventors: 韩健宝; 曲向阳; 顾宏伟; 王远孝; 马国辅
Original assignee: Individual
Current assignee: Nanjing Meisen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-01-15
Also published as: CN103088025A

Abstract

本发明提供了一种抗猪瘟病毒的肽核酸，所说的肽核酸为针对抗猪瘟病毒的C蛋白和/或N^pro蛋白的反义核酸序列。本发明还提供了含有所述的抗猪瘟病毒的肽核酸的药物组合物。本发明还提供了所述的抗猪瘟病毒在制备动物药物上的用途。本发明的用于防控猪瘟病毒CSFV的特异性抗病毒肽核酸动物药物，是针对CSFVC和 N^pro 的基因保守部分设计高效特异性的反义核酸序列，并采用特定工艺人工合成肽核酸片段，该序列与上述保守性靶基因互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与CSFVC和 N^pro 的对应的靶基因相结合，诱导核酶对靶基因进行降解，从而阻断靶基因的转录与表达，抑制CSFV在机体内复制与装配，以达到防控猪瘟的目的。

Description

一种抗猪瘟病毒的肽核酸

技术领域

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种抗猪瘟病毒的肽核酸。

背景技术

猪瘟（Hog Cholera, HC），又称之为经典猪瘟（Classical Swine Fever, CSF），不同于非洲猪瘟，系由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性传染病。猪瘟最早于19世纪30年代在美国的俄亥俄州发现，是一种接触性传染，流行广、死亡率高的猪的传染病。猪瘟造成的经济损失巨大，历来是各国研究的热点，国际兽医局（OIE）国际委员会将猪瘟列入A类16种法定传染病之一。我国是世界上养猪最多的国家，也是猪瘟流行严重的国家之一，我国近几年因各种疾病死亡的猪占饲养总数的8%～10%，其中1/3以上由猪瘟致死，每年的直接经济损失数十亿元，造成了巨大的人力和资源浪费。间接影响如猪群中存在猪瘟时主要国际市场都禁止进口其活猪和猪肉。

根据发病的程度，将其分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF由强毒株引发，一般导致高发病率和死亡率,而弱毒病毒感染则无明显临床症状。介于疫苗的广泛应用，有效地控制了猪瘟的大流行，减少了急性死亡。但自上世纪70年代末以来，全世界猪瘟流行的特点均发生了重大变化，如临床症状不典型，病程变长, 呈周期性、波浪形的地区散发性流行，持续感染普遍存在,疫苗的预防效果明显下降。同时疫点明显减少，多局限于所谓的“猪瘟的不稳定地区”的散发性流行。近年来，国内又出现猪瘟的反弹现象，而且疫情变得异常复杂，如既有区域性大流行又有零散式发生，既有高死亡率的急性症状，又有顽固的持续发生的温和性症状。

目前世界各国针对CSF疫情的处理主要有两种手段：1，扑杀，建立完善且严格的疫情监测与报告体系, 及时发现、划定及封锁疫区、采取彻底扑杀所有感染猪群与感染动物并进行无害化处理和彻底消毒环境，消灭传染源；2，免疫，强化以猪瘟病毒（CSFV）疫苗接种为主要手段。中国猪瘟兔化弱毒（C2株）疫苗自从问世以来，一直享誉海内外，被许多国家竟相引用。自从二十世纪60年代以来，C2株疫苗及其换代产品（细胞苗）在我国以防为主的猪瘟防治策略的实施中起到了决定性的作用，有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但自20世纪80年代以来，非典型性猪瘟成为该病的主要发生形式，持续感染普遍存在,疫苗的预防效果明显下降，使猪瘟防制遇到了新的困难。经流行病学调研发现近年来猪瘟流行毒已呈远向疫苗毒的方向演变, 近期猪瘟流行毒与古典猪瘟毒之间有较大差异（核酸和氨基酸同源性分别为82.2%～84.3%和87.9%～90.4%）。

猪瘟病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属。病毒颗粒呈圆形，直径为40 - 50 nm，有囊膜，病毒表面有6 nm～8 nm 类似穗样的突起，内部为二十面体的对称核衣壳，内部核心直径大约30 nm，猪瘟病毒不耐热，pH5～10时稳定，不耐酸（如<pH3.0），对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐等脂溶剂敏感，可很快使病毒失活。参考猪瘟流行毒株的序列，该病毒可分为三个群：CSFV-1，称为古典猪瘟, 以Brescia株为代表。CSFV-2，以Alfort 株为代表。CSFV-3，与上述二个群均有较大差异，包括了一些日本、泰国和台湾地区近年来流行毒株。中国流行的优势毒株多属CSFV-2。

CSFV基因组为单股线性正链RNA分子，基因组大约12.5 kb，由5’非编码区（5’- UTR）、一个开放阅读框（ORF）和3’-非编码区（3’-UTR）构成。其5′端无甲基化帽子结构，3′端也无poly（A）尾巴结构。5′端UTR长度为373 nt或374 nt，有茎环，发夹等复杂二级结构，其5′端没有帽子结构，因而翻译起始机制与一般真核生物的mRNA 分子不同，是由5′端UTR内有一个称为核糖体内部进入位点（Internal Ribosome Entry Site， IRES）的结构元件与核糖体40S 亚基结合，启动蛋白质的翻译。5′端UTR不仅与翻译有关，与病毒基因组的复制也有关。3’端长度215 nt～239 nt，随毒株不同而有差异。在所有瘟病毒中3′端是高度保守的，特别是最后大约100 nt的区域。3′端在病毒的复制繁殖过程中有重要作用，它参与病毒基因组的复制、多聚蛋白的翻译和病毒粒子的装配。中间的ORF编码一个3898个氨基酸的多聚蛋白，分子量约438 kDa 的多聚蛋白（N^pro、C、E^rns（E0）、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）, 并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白, CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码。

蛋白及其功能

C 蛋白为猪瘟病毒的核衣壳蛋白，为结构蛋白，由86～89个氨基酸残基组成，分子质量14 kDa，又被称之为p14，该蛋白的N端为Ser19。C蛋白富含碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸），带正电荷。C蛋白除构成病毒的核衣壳外，同时在病毒增殖过程中对基因表达调控发挥着重要的作用。研究表明，该蛋白179～180、194～198、208～212氨基酸的突变将显著降低病毒的增殖能力。C蛋白主要分布在细胞核和细胞浆中，这可能与C蛋白参与病毒复制和转录调控有关，但其具体作用机制还需深入研究。另有研究表明，重组表达的C蛋白可激活人HSP70基因的启动子，但对SV40启动子具有抑制作用，这也证明了C蛋白对基因表达有调节作用，而且对不同的启动子有截然相反的调控作用。

^pro 蛋白及其功能

Npro蛋白，也称p23，为猪瘟病毒编码的非结构蛋白，分子量为23kDa，处于ORF编码的多聚蛋白N端的第一位，由168个氨基酸残基组成，是一种具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶，其具有在自身C端剪切产生病毒核衣壳蛋白的N端的功能，是病毒在细胞内增殖所必需的构件，当它缺失后，从培养物中分离不到存活的病毒。研究表明Npro有助于CSFV逃避机体的自然免疫,建立持续性感染。Xu等通过基因沉默技术，干扰Npro表达可有效抑制CSFV在PK-15细胞中的繁殖。Wen等以家兔为模型，发现家兔感染CSFV后，干扰Npro表达同样可以能有效抑制猪瘟病毒的增殖。Ruggli 等研究表明，Npro能抑制机体的天然免疫系统，使病毒逃避宿主的免疫清除，因此，Npro实可能与猪瘟病毒的毒力及致病性有关。

反义核酸（antisense nucleic acid）是一段与靶基因（mRNA或DNA）的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。

反义核酸包括反义RNA（antisense RNA）和反义DNA（antisense DNA），具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物，掀起了一场药理学领域的革命，即新的药物受体mRNA通过新受体结合方式（Watson-Crick杂交）、引发新的药物受体结合后反应：（1）RNase H介导的靶RNA的降解；（2）抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸（ODNs）疗法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二十世纪70年代末到现在，在这三十年的时间中，反义核酸药物已走出实验室，进入了实际临床应用。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen通过FDA批准上市后，人们对反义疗法尤为关注。

反义核酸作用原理基于碱基配对原则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有：①反义RNA与病毒mRNA结合形成互补双链阻断核糖体与病毒mRNA的结合，从而抑制了病毒mRNA翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与靶基因形成一种三链核酸（triple helix nucleic acid），它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。③反义核酸与病毒mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与病毒mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达的抑制或调控，且这种调控是高度特异性的。

反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所打靶的基因，从理论来分析，研究人员以动物细胞为例，其染色体大约有几十亿对碱基，如果4个碱基（A、G、C和T）的数目大致相同，并在整个基因中随机分布，那么按照统计学原理，大于17个碱基的反义核酸与非靶基因杂交的可能性不大，所以长度超过17个碱基的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯一的，从而使反义核酸具有高度的特异性。

研究表明，在细胞内部一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个具有生物活性的蛋白质分子。传统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几个作用位点，事实上蛋白的结构是非常复杂的，且在生物体内，活性蛋白的空间结构又是千变万化的，以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到理想的效果，因而不难看出传统药物的局限性。由mRNA可翻译出几十到几百个蛋白，反义核酸在mRNA水平对靶基因直接进行调控，这个步骤相当于将传统药物作用放大了数十到数百倍，可见反义核酸的调控是极其经济合理的。

毒理学研究表明，反义核酸在体内具有很低的毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。与传统药物相比，反义核酸药物具有特异性强，效率高和毒副作用低等优点，在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。目前已有多个药物进入美国和欧洲市场，另还有30多种反义核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期实验。

由于动物体内存在大量的核酸外切酶，反义核酸若不经过化学修饰，很快就被降解，失去活性。目前对反义核酸的化学修饰有很多方法，常见的有硫代修饰反义核酸及2’-甲氧基修饰反义核酸等。且目前硫代修饰药物的研究最为全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同时可促进核酸酶Rase H的活性，目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药物。但这些还只是第一代反义核酸的修饰方法，随着技术的发展与进步，新的修饰途径与方法被开发出来，使得反义核酸的研究进入了第二、三代，其中肽核酸的修饰最为引人关注。

肽核酸（peptidenucleic acids，PNAs），是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA类似物，其骨架的结构单元为N（2-氨基乙基）-甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上。尽管PNA在结构上相对寡核苷酸有了显著的改变，但PNA与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对原则，甚至比天然核苷酸具有更高的亲和性。PNA可序列特异性地靶向作用于DNA或RNA，为反义核酸的第二、三代产品。PNA与对应的DNA或RNA形成稳定的PNA-DNA或PNA-RNA结构，这种结构非常稳定，几乎不受环境因素变化的影响，如离子，pH值等。近年来，科研人员对最初开发出的PNA进一步优化，在结构方面作了很大改进（如骨架结构、在 N-(2-氨基乙基)甘氨酸上连接手性和非手性的基团、碱基的类型等），提高其生物学稳定性和利用度、靶结合特性以及药代动力学特性, 并将PNA应用于诊断和治疗等方面。

壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖, 具有来源丰富、无毒、易化学修饰性、生物相容性和可再生性等优越的功能性质和独特分子结构。壳聚糖作为可生物降解材料用于新型给药系统, 通过改变给药途径可大大提高药物疗效, 具有控制释放、增加靶向性、减少刺激和降低毒副作用以及提高疏水性药物通过细胞膜、增加药物稳定性等作用特点。

由于猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，是危害养猪业最重要的传染病之一。近年来，猪瘟病毒变异导致猪瘟又出现反弹现象，原来开发出的疫苗免疫保护力明显下降，使得疫情变得异常复杂，如今既有区域性大流行又有零散式发生，既有高死亡率的急性症状，又有顽固的持续发生的温和性症状，严重影响养猪业的发展，因此开发预防和治疗CSFV感染的新手段显得尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，将肽核酸技术与反义核酸技术结合起来，提供一种抗猪瘟病毒的肽核酸，用于预防和治疗猪瘟病毒。

本发明的抗猪瘟病毒的肽核酸，所说的肽核酸为针对抗猪瘟病毒的C蛋白和/或N^pro蛋白的反义核酸序列，所述的针对C蛋白的反义核酸序列选自SEQ ID.1、SEQ ID.2和SEQ ID.3核苷酸序列中的一种或一种以上；所述的针对N^pro蛋白的反义核酸序列选自SEQ ID.4、SEQ ID.5和SEQ ID.6核苷酸序列中的一种或一种以上。

本发明还提供了含有所述的抗猪瘟病毒的肽核酸的药物组合物。

本发明还提供了所述的抗猪瘟病毒在制备动物药物上的用途。

本发明的用于防控猪瘟病毒（CSFV）的特异性抗病毒肽核酸（反义寡核苷酸）动物药物，是针对CSFV（C和N ^pro）的基因保守部分设计高效特异性的反义核酸序列，并采用特定工艺人工合成肽核酸片段，该序列与上述保守性靶基因互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与CSFV（C和N ^pro）的对应的靶基因相结合，诱导核酶对靶基因进行降解，从而阻断靶基因的转录与表达，抑制CSFV在机体内复制与装配，以达到防控猪瘟的目的。本发明还涉及含有该反义核酸序列的药物组合物，及其在动物药物上的用途。本发明无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制CSFV复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。

具体实施方式

具体实施方式中的主要材料与试剂如下：

1）病毒毒株：CSFV毒株：SN-05株，毒价为10^6.2 TCID_50/mL，由楠森兽医诊断技术研究中心实验室提供。

2）细胞株：SK-6细胞，楠森兽医诊断技术研究中心实验室提供。

3）反义核酸的合成：采用特定的肽核酸的合成工艺进行反义核酸的人工合成。

4）反义核酸的修饰：为了获得良好的实际应用效果，以壳聚糖进一步对PNA进行化学修饰。

5）反义核酸的剂型

a、采用控释制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成结肠溶控释微丸制剂；

b、采用冷冻干燥制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成注射用冻干制剂；

c、采用冻干后再制粒工艺将经修饰过的肽核酸制备成口服用水溶性颗粒剂。

6)药剂稳定性分析

高温：流通蒸汽高温105℃，20分钟灭菌不影响其生物活性。

极端温度：50℃存放6个月不影响其生物活性。

室温：存放24个月不影响其生物活性。

低温：-20℃存放48个月不影响其生物活性。

实施例1 针对CSFV的肽核酸体外抗病毒效果分析

从GenBank数据库检索出CSFV的基因组，特别是近年来在我国所报道流行的CSFV毒株的序列，用生物学软件进行序列分析，综合考虑序列的保守性，G+C%含量，碱基分布特点，然后从中挑选出合适的区域设计反义核酸，最后所确定的针对病毒两种关键蛋白的C和N^pro靶位点如下。

C蛋白

C-1: 5’- AGGATCAACAAGGGTAAATTAAA -3’

C-2: 5’- GTCAAAAAGAAAGGTAAAGTTAA -3’

C-3: 5’- GGCGGTAATAACAATTATGTTGT -3’

N^pro蛋白

N-1: 5’- CACTATTAGGCTAGTATAAAAAT -3’

N-2: 5’- GAGTTGAATTATTTTGATTTTTT -3’

N-3: 5’- AACAAACAAACAAAAATCAATGG-3’

1.1 以不同浓度分析它们抗病毒效果

取生长状态良好的SK-6细胞，用胰酶消化后，铺板于24孔细胞板中，0.5 mL/孔（2.0×10⁵个细胞），5%CO₂ 37℃条件下培养24 h后吸去培养液，加入0.1 mL的100TCID₅₀CSFV SN-05株感染上述细胞，感染后24h，每孔加入300μl待筛选药物，以完全培养基作稀释液，肽浓度（0.05μM，0.1μM，0.2μM，0.4μM，0.8μM，1.6μM），每个药物梯度设4个平行孔。加药处理24h后收集上清和细胞，运用TaqMan探针Real-time PCR法定量检测各处理组中CSFV病毒拷贝数。同时设病毒感染阳性对照组，空白对照组，细胞阴性对照组。

本发明参考Zhao等提供的引物，采用real-time PCR定量检测CSFV。

引物CSFV-P1 ： 5′-GAACTGGGGCTAGCCATG-3′

引物CSFV-P2 ： 5′-ACTGTCCTGTACTCAGGAC-3′

探针CSFV- probe： 5′-AGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCG-3′-FAM

以下述公式来计算不同的肽核酸对CSFV病毒复制产生的抑制率。

肽核酸体外抗病毒结果

表1结果显示，各肽核酸对CSFV病毒复制产生的抑制率，通过统计学分析确定出各反义肽核酸的半数有效量浓度。

以不同时间点分析它们抗病毒效果

病毒感染和药物处理方法同上，参考前一步所筛选出的C-1，C-2，C-3，N-1 ，N-2和N-3半数有效量浓度，分别分析各自在不同时间点抗病毒效果。SK-6细胞感染CSFV株后60、72、84、96、120h，每孔加入300μl待筛选药物（以完全培养基作稀释液），每个药物4个平行孔。加药处理24h后收集上清和细胞，运用用TaqMan探针Real-time PCR法定量检测各处理组中CSFV病毒拷贝数，统计分析各用药组之间病毒抑制率，结果见表2。

1.3 药物组合处理

方法同上，针对前一步所筛选出的C-1，C-3，N-2和N-3进行浓度和时间梯度分析后确定出各自合适的用药量与时间点。然后，在前面的这些实验基础上，对筛选出的有效抗病毒作用的药物进行组合使用，比较各组合组的抗病毒效果之间的差异。SK-6细胞感染 CSFV SN-05株后，分别加入C或N^pro药物组合，同时设病毒对照组和阴性对照组，用Real-time PCR方法进行检测，统计分析各用药组之间病毒抑制率，确定药物的组合优选方案，如表3。

细胞毒性实验

1) 以SK-6细胞作检测对象，96孔板，每孔加100微升5000个细胞。药物浓度（0.02，0.1， 0.5，1，5，10μm），每个梯度设置3个重复孔，另设未处理细胞对照、无细胞培养基对照。

2) 处理结束后，每孔每100 μl培养基加入10μl MTT Stock，37 oC培养箱内继续孵育4小时。也可更换100 μl新鲜无血清培养基后再加MTT Stock。

3) 吸去培养基，每孔加入100μl MTT 溶解剂，保持各孔内液体体积一致。

4) 在570nm测定OD吸光度并进行比较计算。注意：为准确考虑可在699 nm处测定未还原的MTT本身的吸光度OD值，然后用OD₅₇₀减去OD₆₉₉。

5) 结果判断：细胞增殖或毒性＝100％ x （OD_实验－OD_本底） / （OD_对照－OD_本底）。

OD实验是接受处理细胞的OD值，OD对照是未处理细胞对照管OD值，OD本底是无细胞培养基对照OD值。处理后细胞增殖或毒性变化表示为未处理对照的百分数。检测结果表明，均无毒性。

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Claims

1.一种抗猪瘟病毒的肽核酸，其特征在于，所说的肽核酸为针对抗猪瘟病毒的C蛋白和/或N^pro蛋白的反义核酸序列，所述的针对C蛋白的反义核酸序列选自SEQ ID.1、SEQ ID.2和SEQ ID.3核苷酸序列中的一种或一种以上；所述的针对N^pro蛋白的反义核酸序列选自SEQ ID.4、SEQ ID.5和SEQ ID.6核苷酸序列中的一种或一种以上。

2.含有如权利要求1所述的抗猪瘟病毒的肽核酸的药物组合物。

3.如权利要求1所述的抗猪瘟病毒的肽核酸在制备抗猪瘟病毒动物药物上的应用。