CN101054591A - 靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶pkr的寡核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种靶向激活慢性粒细胞白血病细胞蛋白激酶PKR的寡核苷酸序列及携带有该寡核苷酸序列的逆转录病毒双表达载体。根据BCR－ABL b3a2型mRNA融合位点左右各20bp序列设计互补序列SEQ1和SEQ2，序列两端设计酶切位点，为防止转录过早终止，其中一对核苷酸T－A被更换为C－g，向急变期慢粒白血病K562细胞株转入这种特殊设计的重组逆转录病毒载体，可以在K562细胞内转录并与BCR－ABL mRNA杂交形成足够长度的双链RNA，靶向激活PKR，导致K562细胞的凋亡，而对机体内的正常细胞没有任何影响。将有效成分核苷酸序列制成临床所需的药物，能有效的治疗慢性粒细胞白血病，填补了医学方面的又一个空白。

Description

靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及治疗慢性粒细胞白血病的核苷酸序列，特别涉及一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸及其在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。

背景技术

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的发生是由于t(9；22)(q34；q11)所致的BCR-ABL融合基因编码产生了具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，该融合蛋白激活PI3K(Phosphatidylinositol-3kinase)、Ras(Renin-angiotensin system)、STAT(Signal transducer and activatorof transcription)等信号转导通路，导致细胞恶性转化。目前治疗慢性粒细胞白血病的药物主要有各种化疗药，这些药物对全身各个系统的毒副作用较大，病人难以坚持。针对BCR-ABL融合蛋白的治疗取得了一些进展，尤其以STI571(商品名Glivec)的作用最为显著。然而，随着STI571的使用，临床出现耐药和对其先天不敏感的病人，为此，本发明立足对CML治疗现状研究，开发了新的治疗手段。

双链RNA依赖性蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent proteinkinase，PKR)是在哺乳动物细胞中表达、双链RNA调节的丝/苏氨酸蛋白激酶。它是细胞被某些病毒感染后反应性防御机制的一个关键性成分，在正常细胞的分化、转化及凋亡等生理、病理过程中也起着重要的调节作用。它能被干扰素诱导表达而被双链RNA所激活，激活过程包括双链RNA分子对PKR单体的募集及结合、两分子PKR单体同源二聚化及相互使对方磷酸化等一系列反应。PKR一经激活便具有很强的丝/苏氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成启动因子eIF2的α亚单位上加上磷酸基团，并导致GDP-GTP交换因子eIF2B的隐蔽，从而抑制细胞内总体蛋白合成的启动。同时，活性PKR还激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，两种效应共同作用导致细胞的凋亡。有资料表明，激活的PKR可诱导某些病毒感染细胞凋亡和多种正常细胞及病理细胞的凋亡，而被认为是一种抑癌蛋白。在肿瘤细胞中诱导PKR的表达及活性增高是目前肿瘤生物治疗研究领域的新动向，目前还没有通过激活PKR诱导急变期CML癌细胞凋亡，从而达到治疗目的基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸序列及携带有该寡核苷酸序列的逆转录病毒双表达载体，本发明的目的还在于提供该寡核苷酸序列在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。

具体技术方案如下：一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸，其序列是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。

一种载体，其特征是携带有如权利要求1所述的寡核苷酸，并引入了增强型绿色荧光蛋白基因。

逆转录病毒载体因其转染效率高而最常使用，也可使用其他的载体，如：质粒、腺病毒等。

本发明的核心是通过设定的寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，利用载体携带该寡核苷酸序列，为了能测定该序列、便于追踪观察，便于观察实验过程中病毒载体的感染效率，载体上还引入增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)，达到双表达的效果。向急变期慢粒白血病K562细胞株转入这种特殊设计的重组逆转录病毒载体，可以在K562细胞内转录并与BCR-ABLmRNA杂交形成足够长度的双链RNA，特异性激活PKR，PKR一经激活便具有很强的丝/苏氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成启动因子eIF2的α亚单位上加上磷酸基团，并导致GDP-GTP交换因子eIF2B的隐蔽，从而抑制细胞内总体蛋白合成的启动。同时，活性PKR还激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，两种效应共同作用导致细胞的凋亡，而对机体内的正常细胞没有任何影响。最重要的是在设计寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO2时，为了为防止转录过早终止，其中一对核苷酸T-A(斜体下划线标记)被更换为C-g，实验证明单个碱基对的误配不会影响双链RNA对蛋白激酶PKR的激活，相反，如不误配，转录会过早终止，无法进行下一步的制备。同时SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的长短也必须限制，过长过短都将影响PKR的激活。

应用该策略治疗肿瘤有两个前提条件：①靶细胞需有PKR蛋白的表达。②需要有效的手段激活肿瘤细胞内PKR，而正常组织细胞内PKR不受影响。首先，CML细胞中BCR-ABL融合基因的形成及继发性遗传学改变并没有影响PKR的生成。文献检索发现，无论是慢性期还是急变期的CML细胞都表达PKR。其次，由于PKR能被双链RNA分子所激活，而双链RNA分子的长度决定了其对PKR的激活能力(要求30-85bp)，太短不能有效结合两分子PKR，太长也会由于形成空间结构等原因影响对PKR的激活。由于CML细胞内有独特的BCR-ABL融合基因，会转录出BCR-ABL mRNA，因此我们针对此融合部位设计一段SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(其中20nt针对BCR区，20nt针对ABL区)，在CML细胞内转录的反义RNA短片段将可以与BCR-ABLmRNA杂交形成40bp的双链RNA，进而特异性激活PKR；但在正常细胞内只能形成20bp(BCR区或ABL区)的双链RNA，长度不足以激活PKR，故对正常细胞没有影响。

本发明以慢性粒细胞白血病K562细胞作为实验模型，应用分子生物学、细胞生物学、实验血液学、实验动物学等方法，进行了一系列实验，实验证明了靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的逆转录病毒双表达载体对K562细胞的抑制作用。包含：特定长度的基因序列，靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的逆转录病毒载体的构建和病毒包装和K562细胞感染。逆转录病毒载体因其转染效率高而最常使用，也可以选择其他的载体，如：质粒、腺病毒等。

构建该寡核苷酸及载体所用的pMSCV-neo逆转录病毒载体购于美国BD公司，IRES2-EGFP质粒载体购于美国BD公司，pSilencer3.1-H1载体购自美国Ambion公司。根据BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陆号：AJ131466)融合位点左右各20bp序列设计互补序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。序列两端设计酶切位点，为防止转录过早终止，其中一对核苷酸T-A(斜体下划线标记)被更换为C-g(单个碱基对的误配不会影响双链RNA对蛋白激酶PKR的激活)。该寡核苷酸均由上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成，溶解后于-20℃保存备用。

具体来讲，制成携带特定序列、特定长度寡核苷酸的逆转录病毒载体大致可包括以下步骤：

1)pH1-BCR-ABL40as重组质粒的构建及鉴定

2)pMSCVeGFP逆转录病毒载体的构建及鉴定

3)pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS重组逆转录病毒双表达载体的构建及鉴定

4)病毒包装及滴度测定

通过以上步骤制得病毒毒液命名为：RV-GFP(pMSCVeGFP经过细胞包装获得的含有荧光蛋白基因的病毒液)、RV-40AS(pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS经过细胞包装获得的含有荧光蛋白基因和本发明核苷酸序列的病毒液)。

本发明的有益效果是携带特定序列、特定长度寡核苷酸的逆转录病毒载体，将外源性基因导入慢性粒细胞白血病K562细胞，通过靶向激活慢性粒细胞白血病细胞蛋白激酶PKR，抑制细胞内总体蛋白合成并能激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，两种效应共同作用导致细胞的凋亡，而对机体内的正常细胞没有任何影响。将上述有效活性成分制成临床上所需的药物，能有效的治疗慢性粒细胞白血病，填补了慢性粒细胞白血病治疗上的又一空白。

为了证实携带有该核苷酸序列的逆转录病毒双表达载体对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响进行了如下实验：

实验分组：试验分为：RV-GFP、RV-40AS(本发明组)、RV-40AS+2AP(2AP：二氨基嘌呤，是PKR的抑制剂)、polyIC(聚肌苷酸-聚胞啶酸：一种RNA双链的类似物，作为PKR非特异性激活组)和未处理组。所做实验方法如下：

1、重组逆转录病毒感染实验

收集RV-GFP和RV-40AS病毒上清，经0.45μm醋酸纤维素膜过滤后，分别以两种上清重悬提前离心收集的K562细胞，以6×10⁵/孔接种于12孔细胞培养板中，同时加polybrene(聚凝胺，其带正电可和带负电的DNA分子结合，使得DNA可以结合在细胞表面，终浓度为4μg/mL)，37℃，5％CO2，饱和湿度的恒温孵箱中培养；ECV304细胞提前24h接种于12孔细胞培养板中，2×10⁵/孔，以病毒滤液替换板孔中培养基，同时加入polybrene(终浓度为4μg/mL)，转移入37℃，5％CO2，饱和湿度的恒温孵箱中培养。感染12h后开始用倒置荧光显微镜观察荧光表达情况，确定重组逆转录病毒感染了K562细胞。

2、polyIC的细胞转染试验

参照DMRIE-C试剂说明书RNA转染步骤，分别转染K562细胞和ECV304细胞。polyIC的转染浓度为0.5~25μg/ml。

1)polyIC转染K562细胞

在12孔细胞培养板中加无血清RPMI 1640 400μl/孔，吸取混匀的脂质体DMRIE-C 0.5~5.0μl加入各孔，迅速轻轻的摇荡，混匀；再吸取一定量poly IC加入各孔，使其终浓度为0.5~20μg/ml，迅速轻轻的摇荡，使液体混匀；收集对数生长期的K562细胞，计数，使细胞数量达到6×10⁵/孔，800rmp/min×10min离心，弃上清，用无血清RPMI 1640洗涤细胞两次，弃上清；用上述DMRIE-C/poly IC混和液轻轻重悬K562细胞，并将该细胞悬液，接种于12孔细胞培养板，转移入37℃，5％CO2，饱和湿度的恒温培养箱中孵育4小时，加入15％FCS RPMI 1640 800μl/孔，继续培养。

2)polyIC转染ECV304细胞

提前24小时在12孔细胞培养板中接种1.5×10⁵个ECV304细胞，吸弃培养基，加入无血清RPMI 1640，冲洗细胞两次。配制转染混合液：400μl无血清RPMI 1640中加入混匀的脂质体DMRIE-C 0.5~5.0μl，迅速轻轻的摇荡，混匀；吸取一定量polyIC加入各孔，使其终浓度为0.5~20μg/ml，迅速轻轻的摇荡，使液体充分混匀；将转染混合液加入细胞培养板中，转移入37℃，5％CO2，饱和湿度的恒温培养箱中孵育4小时，加入15％FCS RPMI 1640800μl/孔，继续培养。

从以下各个指标来观察、检测，证实感染了重组逆转录病毒载体的K562细胞的抑制和凋亡：

1、细胞形态学检测

用PBS调整细胞密度至1×10⁶/ml。取洁净载玻片及有孔滤纸，置于离心杯中。将离心杯置于离心机上，加50~100μL细胞悬液于离心杯中。离心，1000~1500rpm 2min，取出玻片。滴加等量的瑞氏染液和PBS，室温染色10~15min，流水冲洗。晾干，显微镜观察并照相。

附图6.逆转录病毒对K562细胞增殖的影响瑞氏染色：48h后用光学显微镜观察，RV-40AS和polyIC处理组细胞表现明显的细胞胞体缩小，胞膜皱缩，泡状突起及不规则凹陷，核固缩，染色质浓聚，成块并分布于核膜周边，如附图6所示A：Untreated group.B：polyIC treated group.C：RV-40AStreated group.D：RV-GFP treated group.E：RV-40AS+2AP treated group.。

2、生长曲线实验

实验分组：RV-GFP、RV-40AS、RV-40AS+2AP、polyIC处理组和未处理组；同时以ECV304细胞为对照细胞株。每组做3个平行孔。K562细胞以1×10⁴/孔的密度接种于24孔板，ECV304细胞铺板2×10³/孔。然后分别加入病毒上清RV-40AS、RV-GFP感染细胞，根据预实验确定使其终浓度为5×10⁵CFU/mL。同时加入polybrene(终浓度为4μg/mL)，此外，PKR抑制剂处理组(RV-40AS+2AP组)还需加入PKR抑制剂2AP(终浓度5mmol/L)；polyIC处理组用脂质体转染，根据预实验确定终浓度为15μg/mL，接种后常规培养，3~5天后给没计数的孔离心换液，连续7天以台盼蓝染色计数活细胞数目，每次计数重复3次，以平均值绘制细胞生长曲线。

附图7、8.生长曲线实验通过生长曲线发现polyIC对K562细胞和ECV304细胞的生长都具有抑制作用，病毒RV-40AS仅对K562细胞的生长具有特异的抑制效应，而2AP能阻断RV-40AS对K562细胞生长的抑制效应。RV-GFP既不能抑制K562细胞的生长也不能抑制ECV304细胞的生长。细胞生长情况如图7、8和表1、2所示。

                           表1不同因素处理后不同时间的K562细胞数(×10⁴)

Time(day)	0	1	2	3	4	5	6	7
									RV-GFPRV-40ASRV-40AS+2APpolyICUntreated	11111	1.60.81.20.61.2	2.51.32.01.02.2	5.21.54.61.24.3	11.01.69.11.39.0	13.01.7510.01.5512.0	12.61.711.02.0012.0	11.41.810.61.911.0

              表2不同因素处理后不同时间的ECV304细胞数(×10³)

Time(day)	0	1	2	3	4	5	6
								RV-GFPRV-40ASRV-40AS+2APpolyICUntreated	22222	8.78.39.05.08.3	26.327.027.38.527.0	55.754.753.714.758.0	68.366.766.311.965.0	67.366.767.010.066.7	66.766.766.710.764.9

3、MTT实验

收集对数生长期的K562细胞，接种于96孔培养板(2×10⁴/孔)，ECV304细胞头天铺板4×10³/孔。实验分组同上，每组做3个平行孔。然后分别加入病毒上清RV-40AS、RV-GFP感染细胞，使其终浓度为5×10⁵CFU/mL。同时加入polybrene(终浓度为4μg/mL)，此外，PKR抑制剂处理组(RV-40AS+2AP组)还需加入PKR抑制剂2AP(终浓度5mmol/L)；polyIC处理组用脂质体转染，终浓度为15μg/mL。每孔总体积200μL，试剂空白以RPMI-1640培养基补足。置37℃，含5％CO2培养箱中培养72h，在每孔中加入20μL四甲基偶氮唑盐(MTT，浓度5mg/ml)，继续培养4h，K562细胞1000g离心10min，小心弃去上清，ECV304细胞，直接倾去上清，加入二甲基亚砜150μL，振荡5min，用酶标仪在570nm处读取吸光度值(A值)，按以下公式计算细胞增殖抑制率：

MTT实验检测到不同浓度RV-40AS对K562细胞增殖的抑制率不同，如附图5所示，可以看出病毒上清RV-40AS感染细胞的终浓度为5×10⁵CFU/mL。

附图9.MTT实验结果通过MTT实验发现polyIC对K562细胞和ECV304细胞的增殖都具有明显的抑制作用，增殖抑制率分别为59.1％和56.3％，病毒RV-40AS感染K562细胞和ECV304细胞，发现其仅对K562细胞的增殖具有特异的抑制效应，增殖抑制率为73.4％。而2AP能阻断RV-40AS对K562细胞的抑制效应。RV-GFP对K562细胞和ECV304细胞的增殖都没有明显的抑制效应。如表3和图9所示：

       表3不同因素处理后对K562细胞和ECV304细胞增殖的抑制效应(抑制率％)

	polyIC	RV-40AS	RV-40AS+2AP	RV-GFP
					K562ECV304	59.1±2.356.3±3.2	73.4±4.33.2±2.1	6.1±2.22.5±2.2	4.1±2.53.2±3.5

4、克隆形成实验

实验分组同上，每组做3个平行孔。将经过病毒上清(终浓度为5×10⁵CFU/mL)处理、polyIC(终浓度为15μg/mL)转染6h的K562细胞以及空白对照K562细胞，用台盼蓝染色后计数活细胞，用20％的RPMI-1640培养液逐步稀释成1×10³/ml，制成单个细胞悬液，加0.4ml细胞悬液，于24孔板，然后加0.3ml 2.7％甲基纤维素混匀。总体积为1ml，不足以20％的RPMI-1640培养液补足。置37℃，5％CO2培养箱中孵育10天，显微镜下计数，取直径大于75um或细胞数大于50个的为一个集落，计算克隆抑制率：

附图10、11.克隆形成实验用RV-40AS(C组)、RV-GFP(D组)、RV-40AS+2AP(E组)、polyIC(B组)，处理K562细胞后，A组为未处理组其中只有PolyIC和RV-40AS处理组细胞克隆形成能力受到明显抑制，抑制率分别为：53.1％、75.3％。结果如表4、图10，图11所示。

               表4不同因素处理后抑制K562细胞克隆的形成(抑制率％)

	PolyIC	RV-40AS	RV-40AS+2AP	RV-GFP
					抑制率(％)	53.1±3.9	75.3±4.2	5.1±4.1	3.9±3.5

5、Annexin V-PE/7AAD双染法检测凋亡

离心收集1×10⁶经处理的K562细胞和ECV304细胞，冰冷PBS洗涤两次后重悬于100μl反应缓冲液中，加入5μl Annexin V-PE、10μl7AAD，轻轻混匀，避光保存20min，加入200μl缓冲液，立即上流式细胞仪检测。检测结果如附图12～14 A：Untreated group.B：RV-40AS treated group.C：polyIC treated group.D：RV-40AS+2AP treated group.E：RV-GFP treated group

附图12所示：实验各组K562细胞凋亡的流式细胞仪测定结果图，横坐标FL2代表PE标记的Annexin-V荧光强度，纵坐标代表7AAD荧光强度。依据FL2及FL3将FCM分成4个区，LL代表活细胞，LR代表早期凋亡细胞，UR、ML分别代表晚期凋亡和死细胞。未处理组中的K562细胞大部分都是活细胞，24h早期凋亡细胞占3.24±0.66％，polyIC和RV-40AS处理后引起了K562细胞的凋亡，24h早期凋亡率分别为20.56±1.56％和22.70±1.42％，RV-40AS+2AP和RV-GFP处理基本未引起K562细胞凋亡，24h早期凋亡细胞分别为3.16±1.16％和2.98±0.92；而ECV304细胞组只有polyIC引起了凋亡，24h早期凋亡细胞占18.91±2.04％，如图13所示。结果还发现RV-40AS引起的凋亡效应具有时间依赖性：在12h、24h、36h和48h时早期凋亡率分别达到10.43±2.68％、22.70±1.42％、33.50±1.55％和39.51±1.72％，如图14所示。结果表明polyIC可以诱导K562细胞和ECV304细胞发生凋亡，RV-40AS处理后只引起了K562细胞的凋亡，且随着作用时间延长凋亡率逐渐升高，但RV-GFP感染对两种K562和ECV304细胞都没有明显的凋亡诱导作用；PKR抑制剂2AP可以有效抑制RV-40AS感染所致的K562细胞凋亡。

6、电镜检查细胞凋亡

分别收集1×10⁶经RV-40AS处理的K562细胞以及未处理K562细胞(对照组)，PBS洗涤两次，转入1.5mlEP管中，加4％戊二醛1ml，固定60min，1000rpm/min离心10min，PBS洗涤。1％锇酸固定1h，系列丙酮脱水：50％丙酮溶液1次，10min；70％丙酮溶液1次，10min；90％丙酮溶液2次，每次10min；100％丙酮溶液3次，每次10min。618环氧树脂包埋，光镜定位，超薄切片做成铜网；经醋酸铀，枸橼酸铅双重电子染色；在Hitachi-600透射电镜观察细胞形态、细胞膜、细胞器及细胞核的变化并照相。

附图15 K562细胞电镜检查结果见附图15  未处理组(A)组K562细胞体积较大，核膜完整、核仁清楚、染色质丰富，核浆比例大。RV-40AS处理后24h观察到凋亡细胞，其体积缩小，细胞表面微绒毛结构明显减少(如B图)。胞浆电子密度增高，染色质浓集，核固缩、核分裂等形态学改变(如C图)。并可见凋亡小体(如D图)。

7、细胞凋亡DNA梯带的观察

1)将5×10⁵细胞移人无菌的1.5ml EP管中，4℃2000rpm/min离心5分钟，弃上清。冰冷PBS洗涤细胞一次，离心，弃上清；

2)加入20μl消化缓冲液，用移液管尖混匀细胞沉淀，68℃水浴1h，4000rpm×5min，收集上清；

3)上清中加入RNA酶A(终浓度100μl/ml)轻弹管尖混匀，56℃水浴2h；

4)继续加入1蛋白酶K(终浓度20mg/ml)，轻弹管尖混匀，37℃水浴2h；

5)DNA电泳：配制1.5％琼脂糖，加入EB(终浓度为0.5μg/ml)；取DNA样品20μL加5μl 6×DNA加样缓冲液(30％甘油，0.25％溴酚蓝)混匀，上样；Marker为TIANGEN公司MD100-MarkerIII，3V/cm电泳3～4h后，凝胶成像仪观察、照相分析。

附图16 DNA ladder实验  检测结果显示：polyIC(3)及RV-40AS(2)处理48小时后出现典型的“梯状”条带，而未处理组(1)、RV-40AS+2AP(4)处理组和RV-GFP(5)处理组细胞DNA电泳相应位置未见条带出现。

8、细胞周期测定

实验分组同上，用病毒上清或polyIC处理1×10⁶个K562细胞，24h后收集细胞，PBS洗两次后，70％乙醇中固定过夜，上机前洗去乙醇，加入PCB溶液低渗处理室温30分钟，离心去上清，加入50μg/ml RNAse A消化30分钟，再加入终浓度为50μg/ml的PI染液室温避光孵育25分钟，用FCM检测。

附图17.逆转录病毒对K562细胞周期的影响K562细胞的细胞周期分析结果如附图17所示，纵坐标代表细胞数，横坐标代表PI强度，与细胞DNA含量成正比，依据PI荧光强度可以分为二倍体的G0/G1期，四倍体的G2/M期，及位于两者之间的S期。各组处理细胞24h后，与未处理(A组)细胞相比，RV-40AS(B)组和polyIC(C)组G0/G1期细胞比例增高，S期细胞比例下降，差别有统计学意义(P＜0.05)，结果如表5所示。提示RV-40AS和polyIC处理后阻滞了细胞周期由G0/G1期向S期推进。RV-GFP(D组)未明显影响细胞周期进程。2AP(E组)能逆转RV-40AS对K562细胞周期的影响。

                   表5不同因素处理对K562细胞周期的影响(％)

	G0/G1期	S期	G2/M期
				untreatedRV-40ASpolyICRV-GFPRV-40AS+2AP	36.44±4.2057.47±3.61*50.97±2.18*36.22±3.4137.88±2.45**	58.53±5.4231.48±3.65*37.26±2.35*58.07±3.2356.02±3.23**	5.03±1.4211.05±0.56*11.76±1.08*5.71±0.596.10±0.85**

*P＜0.05，V.s untreated group；**P＜0.05，V.s RV-40AS group

9、统计学分析

所有实验都独立重复3次，结果用 x±s表示，以SPSS10.0软件分析，多组数据间用单因素方差分析，两两比较用t检验。

附图说明

附图1 pH1-BCR-ABL40as测序结果图

附图2 pMSCVeGFP测序结果图

附图3 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS测序结果图

附图4 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS经过细胞包装获得病毒液(RV-40AS)感染NIH3T3细胞的效率分析结果图(倒置荧光显微镜×200)

附图5 MTT实验检测不同浓度RV-40AS对K562细胞增殖的抑制率

附图6 实验各组对K562细胞影响的形态学观察(普通显微镜×1000，瑞氏染色)

附图7 K562细胞的生长曲线图

附图8 ECV304细胞的生长曲线图

附图9 MTT实验分别检测K562细胞各组和ECV304细胞增殖的抑制率

附图10 不同因素对K562细胞克隆形成能力抑制的直方图

附图11 不同因素对K562细胞克隆形成能力抑制的细胞集落形态图(倒置显微镜×100)

附图12 实验各组K562细胞凋亡的流式细胞仪测定结果图

附图13 实验各组K562细胞凋亡的直方图

附图14 实验各组K562细胞凋亡效应与时间的关系图

附图15 RV-40AS引起K562细胞凋亡的电镜检查结果

附图16.DNA ladder实验

附图17.实验各组K562细胞周期的流式细胞仪测定结果图

具体实施例(共5例)

实施例1  pH1-BCR-ABL40as重组质粒的构建及鉴定

1.1 pH1-BCR-ABL40as插入片段的获得

设计两端分别含有限制性内切酶BamHI、HindIII位点的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。将1OD的各片段溶解于50μL退火缓冲液(10mM Tris，pH7.5～pH8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)中，充分颠倒混匀后，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2各取10μL到40as管，放置于沸水中，自然冷却退火成双链，放4℃用于连接反应。

1.2.酶切及回收

试剂盒提取质粒pSilencer3.1-H1，按下表6加入试剂酶切质粒。

pSilencer3.1-H1	BamHI	HindIII	10×K buffer	ddH2O	Totol
						40μL	3μL	3μL	6μL	8μL	20μL

将反应物混合离心后置37℃水浴过夜。酶切完成后全部进行1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒胶回收。

1.3.连接

通过SmartSpec^TM3000核酸蛋白测定仪检测核酸含量为：pSilencer3.1-H1质粒纯化产物110ng/μL。根据外源片段∶载体的摩尔比＝6∶1的原则，按以下公式计算连接反应中外源片段与载体的含量：

确定载体与插入片段的体积比为1∶5。按下表加入试剂，置PCR仪16℃连接过夜。

                       连接反应体系(体积单位：μL)

编号	40as	pSilencer3.1-H1	TE	Solution I	Total
						①②	5-	11	22	55	1010

1.4.转化

●在无菌1.5mL EP管中加2μL质粒、100μL E.coli DH5α感受态菌液，用吸头轻轻混匀，冰上静置30min。

●静置37℃水浴，热休克5min。

●立即放冰上静置，1～2min后加800μL LB培养液。

●放37℃水浴，1h后12,000rpm瞬时离心30sec。

●弃去一半上清，将剩余的菌液混匀后，在含Amp(100μg/ml)的LB琼脂平板上用无菌“L”玻棒将溶液均匀涂布于整个平板表面，37℃，2～3h，直至所有液体消失。

●隔夜或者12h后，接种环挑取阳性菌落，分区划线分纯阳性克隆菌，再挑取1～3个克隆LB AMP培养基中液体增菌。待提取质粒鉴定后，菌液与50％甘油1∶1混和，-70℃保存，避免反复冻融。

1.5.鉴定

●PCR鉴定

调取氨苄青霉素LB琼脂平板上的可疑菌落作PCR鉴定。用无菌牙签挑取部分菌体到含20μLLB的0.5ml无菌离心管中，再将离心管放入沸水5min后，转置于冰上，以菌液为PCR模板进行鉴定。以YP1为上游引物、SEQ ID 2为下游引物(表7)，PCR鉴定。

              表7合成的寡核苷酸序列

name	Sequence
		40as140as2Ec-GFPXh-GFPsaHdYP1YP2	SEQ ID 1SEQ ID 25′-CTAGAATTCAACCATGGTGAGC-3′(22nt)5′-GCACTCGAGCTTTACTTGTAC-3′(21nt)5′-GTCGTCGACGGTACCGAATTCAT-3′(23nt)5′-CCGCTCGAGAAGCTTTTCC-3′(19nt)5′-ATCGGTGCGGGCCTCTCC-3′(18bp)5′-ATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGC-3′(23bp)

①PCR反应体系

10×Buffer                          3μL

2mM dNTP                            3μL

25mM MgCl₂                         1.8μL

YP1(10pmol/μL)                     3μL

40as2(10pmol/μL)                   3μL

模板：菌液1ul                       1μL

pfu Taq(5u/μL)                     0.2μL

Add ddH₂O up to                    30μL

试剂全部加入到PCR管中，涡旋混匀后，12000rpm瞬时离心30sec，放入PCR仪进行PCR反应。

②PCR热循环反应条件

94℃ 5min                           1cycle

94℃ 1min

54℃ 50sec                          30cycles

72℃ 30sec

72℃ 5min                           1cycle

热循环完成后，12000rpm瞬时离心30sec，取4μL反应产物，在2％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

●酶切鉴定

将可疑菌落细菌增菌后，试剂盒抽提质粒，酶切鉴定，方法同第2个步骤。酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

●测序鉴定

取阳性重组质粒送上海Sangon公司作DNA测序鉴定。

pH1-BCR-ABL40as测序结果经过比对分析完全正确，测序结果见附图1。

实施例2  pMSCVeGFP逆转录病毒载体的构建及鉴定

2.1以引物Ec-GFP和Xh-GFP(表7)PCR扩增IRES2-EGFP载体eGFP片段

①PCR反应体系

10×Buffer                    3μL

2mM dNTP                      3μL

25mM MgCl₂                   1.8μL

Ec-GFP(10pmol/μL)            3μL

Xh-GFP(10pmol/μL)            3μL

IRES2-EGFP                    0.2μL

pfu Taq(5u/μL)               0.2μL

Add ddH₂O up to              30μL

试剂全部加入到100μLPCR管中，涡旋混匀后，12,000rpm瞬时离心30sec，放入PCR仪进行PCR反应。

②PCR热循环反应条件

94℃ 5min                     1cycle

94℃ 1min

55℃ 50sec                    30cycles

72℃ 40sec

72℃ 5min                     1cycle

热循环完成后，12,000rpm瞬时离心30sec，取5μL反应产物，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

2.2 PCR纯化产物(eGFP)及pMSCV-neo质粒载体的酶切

按下表加入各反应试剂。

eGFP	pMSCV-neo	BamHI	HindIII	10×K buffer	ddH2O	Total
							-30μL	40μL-	3μL3μL	3μL3μL	6μL6μL	8μL18μL	60μL60μL

将反应物混合离心后置37℃水浴过夜。酶切完成后全部进行1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒胶回收。

2.3连接  方法同1.3。

2.4转化  按实验方法1.4进行转化。

2.5鉴定  经PCR、酶切和DNA测序鉴定，方法同前。pMSCVeGFP测序

结果经过比对分析完全正确，测序结果见附图2。

实施例3  pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS重组逆转录病毒双表达载体的构建及鉴定

3.1插入片段的获取

由重组质粒pH1-BCR-ABL40as PCR扩增短片段RNA表达框：H1-40as，引物sa和Hd见表7。

①PCR反应体系

10×Buffer                          3μL

2mM dNTP                            3μL

25mM MgCl₂                         1.8μL

sa(10pmol/μL)                      3μL

Hd(10pmol/μL)                      3μL

各质粒模板                          0.2μL

Taq(5u/μL)                         0.2μL

加ddH₂O至                          30μL

试剂全部加入到100μLPCR管中，涡旋混匀后，12,000rpm瞬时离心30sec，放入PCR仪进行PCR反应。

②PCR热循环反应条件

94℃ 5min                    1cycle

94℃ 1min

55℃ 50sec                   30cycles

72℃ 40sec

72℃ 5min                    1cycle

热循环完成后，12,000rpm瞬时离心30sec，取5μL反应产物，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

3.2pMSCVeGFP重组质粒的酶切

按下表加入各反应试剂。

pMSCVeGFP	SalI	HindIII	10×K buffer	ddH2O	Total
						40μL	3μL	3μL	6μL	8μL	60μL

将反应物混合离心后置37℃水浴过夜。酶切完成后全部进行1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒胶回收。

3.3连接  方法同1.3。

3.4鉴定  经PCR、酶切鉴定方法同前。

测序鉴定

因为H140as片段插入位点在pMSCVneo载体的多克隆位点(MCS)之外，无通用引物测序，所以我们另外设计测序引物YP2(表7)，送重庆医科大学肝炎所测序中心测序。

pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS测序结果经过比对分析完全正确，测序结果见附图3。

实施例4 病毒包装及滴度测定

按lipofectamin2000阳离子脂质体转染说明书，将各重组逆转录病毒质粒转染PT67包装细胞。于转染48h后，培养基更换成含0.5mg/mL G418(GIBCO公司)的完全DMEM培养液继续培养，每4d换液1次，筛选7～14d，挑取阳性细胞克隆：PT67-MSCV/GFP和PT67-40as，继续培养至细胞完全融合时吸取培养基，离心取上清，各病毒毒液命名为：RV-GFP、RV-40AS，以NIH3T3为靶细胞测定病毒滴度。倒置荧光显微镜计数阳性细胞数(绿色荧光)。病毒滴度(colony forming unit，CFU/mL)计算公式如下：

将滴度大于5.0×10⁵CFU/mL病毒上清保存于-80℃备用。

pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS经过细胞包装获得病毒液(RV-40AS)感染NIH3T3细胞的效率分析结果见附图4(倒置荧光显微镜×200)。

实施例5 细胞的培养

K562细胞系由本室常规冻存，复苏后用含10％FCS的PRMI 1640液培养，培养于含5％CO₂的37℃恒温培养箱中，常规换液传代，取对数生长期的细胞作实验。

ECV304细胞系由本校超声研究所马芳博士惠赠，复苏后用含10％FCS的PRMI 1640培养基培养于含5％CO₂的37℃恒温培养箱中，隔日用0.25％胰酶消化换液传代，取对数生长期细胞做实验。实验前24h接种细胞培养板。

                           序列表

<160>2

<210>1

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陆号：AJ131466)融合位点左20bp序列设计互补序列，加下划线的是误配的碱基

<400>1

gatccactgg ccgctgaagg gcttctgaac tctgcttaaa tccttttttg gaaa 54

<210>2

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陆号：

AJ131466)融合位点右20bp序列设计互补序列，加下划线的是误配的碱基

<400>2

agcttttcca aaaaaggatt taagcagagt tcagaagccc ttcagcggcc agtg 54

Claims (5)

1.一种靶向激活慢性粒细胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸，其序列是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。

2.一种载体，其特征是携带有如权利要求1所述的寡核苷酸。

3如权利要求2所述的载体，其特征是引入了增强型绿色荧光蛋白基因。

4.如权利要求3所述的载体，其特征是用逆转录病毒作为载体。

5.如权利要求2所述的载体在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。

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