CN1249243C - 靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达载体及其构建方法与用途 - Google Patents

Abstract

靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达载体及其构建方法与用途，属于生物医药技术领域。以pSilencer3.0-H1为载体，由H1启动子启动针对AFP基因的发夹状双链RNA分子的表达，本载体质粒针对AFP基因编码区序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′，是用于与AFP相关的肝细胞癌的治疗性物质。靶向AFP基因的siRNAs表达载体用于制备分泌AFP蛋白的肝癌的基因治疗药物。

Description

靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达载体及其构建方法与用途

(一)技术领域

本发明涉及表达AFP基因的肝癌的基因治疗药物，具体涉及靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达质粒，属于生物医药技术领域。

(二)背景技术

原发性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma，PHCC)是最常见的恶性肿瘤之一，从诊断建立开始，其平均生存期仅为4个月左右，是一个严重危害人类健康的疾病。虽然现在有很多的方法已经用于治疗原发性肝癌，如化疗、放疗、外科手术、生物治疗等，但是还没有一个方法能够明显的提高原发性肝癌患者的生存率。因此寻找有效的治疗手段有非常重要的社会及经济效益。

甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)是哺乳动物和其他脊椎动物胚胎时期由肝脏和卵黄囊产生的主要的血清蛋白，在正常成年人的外周血中基本检测不到，而在PHCC患者外周血中，甲胎蛋白常显著升高，现已经成为诊断原发性肝癌的一个重要的肿瘤标志物。

近年，AFP的生物学功能已经得到了广泛的研究，其中AFP的两个功能已经得到了验证。第一，AFP能象白蛋白一样结合与转运很多的配体，如胆红素、脂肪酸、类维生素A、类固醇、重金属、染料、类黄酮、植物雌激素、二氧(杂)芑、及多种药物等。第二，AFP具有免疫调节活性。研究发现AFP能抑制NK细胞活性及T细胞依赖的抗原反应，诱导抑制性T细胞的产生。另外AFP分子能快速下调单核细胞表面的MHC-II分子，及抑制肿瘤坏死因子对肿瘤细胞的细胞毒性作用h。

除此之外，AFP的第三个功能是近年才引起人们关注的，既AFP能够直接调节细胞的生长。在一些体外研究中发现，低浓度的AFP能够促进小鼠肝癌细胞系H-22和人肝癌细胞系SMMC-7721，BEL-7404，QGY-7703及Hep G₂的增殖。2001年Wang XW等在《世界胃肠杂志》7(3)：345-351上发表了“AFP基因反义核酸在体外和在小鼠体内抗肝细胞瘤的作用”研究(Wang XW，Yuan JH，Zhang RG，Guo LX，Xie Y，Xie H.Antihepatoma effect of alpha fetoprotein antisense phosphorothioateoligodeoxyribonucleotides in vitro and in mice.World J Gastroenterol，2001；7(3)：345-351)，发现抑制AFP基因的表达能够明显的抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡。动物实验结果也表明，在裸鼠体内AFP反义核酸能够直接抑制肿瘤细胞的生长，并且发现反义核酸在免疫功能正常的小鼠体内比在裸鼠体内更能抑制肿瘤细胞的生长，这也从另一个角度验证了AFP具有抑制免疫功能的作用。另外一个经典的AFP受体已经在单核细胞、生殖细胞、免疫系统细胞、和肿瘤细胞，特别是肝癌和MCF-7乳腺癌细胞表面检测到并且已经在单核细胞膜中得到纯化。由此可以推测，AFP可通过与肿瘤细胞表面的AFP受体结合调节细胞的生长。因此，阻断AFP基因的表达及其生物学活性同时结合其他的治疗手段有可能是一个治疗与AFP有关的肿瘤的一个新的策略。

反义核酸技术是八十年代兴起的一种在基因转录后通过同源性RNA、DNA或者化学修饰的核酸分子与mRNA分子以序列特异性的方式杂交，抑制基因的表达的实验方法，虽然反义核酸技术在研究基因功能方面是有用的，但是作为一种基因治疗的手段却有很大的局限性。反义核酸分子与经典的小分子不同，其分子量大于1000Da，因此，在药物的传输方面存在很大的难题。其他的基于核酸分子的技术如Triplex也存在相同的问题。另外，反义核酸分子在较高浓度时才能达到抑制基因表达的作用，其价格和大批量生产问题也是一个制约因素。因此寻找更有效的基因治疗方法是当务之急。

当前，一项新的基因治疗技术正日益引起人们的广泛关注，既“RNA干涉技术”。RNA干涉技术用于基因干涉治疗，主要有以下优势：(1)siRNA分子有较高的稳定性。与反义核酸不同，siRNA分子3’末端有两个TT，化学性质很稳定，不需要修饰；(2)只需少量dsRNAs就可以产生高效的基因沉默；(3)RNA干涉有严格的序列特异性，研究发现如果dsRNAs中有一个碱基与靶序列错配，既可使其完全失去活性。(4)基因沉默能够系统化。人们发现，dsRNA、双链病毒或质粒载体表达的dsRNA不仅会在导入的组织细胞中引起RNA干涉效应，而且还会在远离导入的组织细胞中引起RNA干涉效应。这种现象称为基因沉默“系统化”。但在哺乳动物中还没有发现这一现象。不过最近的研究发现，在鼠和人细胞中有很多与线虫的沉默传播基因同源的基因。2002年Brummelkamp TR等在《科学》2002，4月19；296(5567)：550-3上发表了“一个能在哺乳动物细胞中稳定的表达小干涉性RNA分子的系统“的研究(Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs inmammalian cells.Science.2002Apr 19；296(5567)：550-3.)，构建了一个能在哺乳动物细胞中表达小发夹状RNA分子的表达质粒，成功的抑制了同源性基因的表达。该研究采用相似的技术构建了针对AFP基因的SiRNAs表达质粒，成功的抑制了AFP基因的表达。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达载体及其构建方法与用途。本载体质粒能高效的特异性的抑制AFP基因的表达，可用于分泌AFP蛋白的肝癌的基因治疗。

本发明采用RNA干涉技术，构建了能够在哺乳动物细胞中表达小发夹状干涉性RNA分子(siRNAs)的表达载体质粒pSilencer3.0-H1-afp，该质粒靶向肝癌AFP基因(GenBankaccession no.NM 005030)编码区序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′由H1启动子启动针对AFP基因的发夹状双链RNA分子的表达。该质粒在肝癌细胞系SMMC-7721中能高效沉默AFP基因的表达，抑制率达34％。为在实验动物体内及在人体中用于治疗与AFP有关的肝癌奠定了基础。本发明的靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达载体pSilencer3.0-H1-afp为透明液体或白色粉状DNA，其示意图谱见图1。

为了对AFP基因SiRNAs表达质粒对AFP基因的抑制效果及对肝癌细胞的抑制作用进行鉴定，脂质体转染细胞，抽提总RNA，收集培养上清，化学发光法测定AFP蛋白的表达，相对荧光定量法测定对AFP基因表达的抑制作用，采用MTT法及流式细胞术检测对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响。

本发明的针对AFP基因SiRNAs表达质粒是可用于AFP基因相关肝细胞肝癌的治疗物质，能显著抑制肝癌细胞的生长并能诱导肿瘤细胞凋亡，可用于进一步研究AFP基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。

本发明的靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达载体的制备方法和生物学活性的鉴定主要包括如下内容：

一、质粒的制备，包括RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成，将上述合成的两段寡核苷酸与线性化的Psilencer 3.0-H1的连接、转化、扩增与质粒的纯化，质粒的鉴定。

二、质粒生物学活性的鉴定，包括脂质体转染效率的估测及DNA与Lipofectamine2000最佳比例的测定；质粒pSilencer3.0-H1-afp的转染及其对AFP基因表达抑制率的real-time RT-PCR检测；化学发光法测定AFP蛋白的表达；MTT实验；流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。

下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法：

(1)RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成构建基因特异性的siRNA表达质粒，首先要进行靶序列的选择。通常沿着mRNA序列寻找连续两个AA及后面19个核苷酸，即为靶序列，然后通过同源性比较，选择那些与其他任何基因无同源性的序列即为潜在的SiRNA靶位点。按照试剂盒说明，针对AFP基因(GenBank accession no.NM 005030)编码区序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′设计并合成了两段互补的寡核苷酸序列，序列如下：

5’-gatcccgctcagtgaggacaaactatttcaagagaatagtttgtcctcactgagttttttggaaa-3’；

5’-agcttttccaa-aaaactcagtgaggacaaactattctcttgaaatagtttgtcctcactgagcgg-3’。其结构见图2。

(2)合成的两段寡核苷酸与线性化的Psilencer 3.0-H1的连接、转化、扩增与质粒的纯化按照《分子克隆》实验指南(2002年8月\科学出版社，J.萨姆布鲁克et al.)及试剂盒说明书进行，首先将合成的两段寡核苷酸等量混合，90℃3min，37℃孵育1h，然后将结合的双链寡核苷酸与带有BamH1和HindIII粘性末端的Psilencer 3.0-H1质粒连接，，最后，将连接成功的质粒转化DH5a大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选，挑选耐药菌落大量培养。质粒的提取及纯化采用经典的碱裂解法和聚乙二醇质粒纯化法。

(3)质粒的鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳，及应用M13的通用测序引物进行测序，以确定合成的寡核苷酸是否已经转入pSilencer 3.0-H1质粒中及是否有碱基异常存在。

上述方法所构建质粒生物活性的鉴定方法如下：

l、肿瘤细胞培养及质粒的脂质体转染人类肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养在含有10％(vol/vol)胎牛血清的RPMl-1640培养基中(Invitrogen)，置于37℃、5％CO2培养箱中。质粒的转染采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)。转染前一天，将肿瘤细胞接种24孔培养板，每孔细胞约7×10⁴个细胞，使每孔的细胞饱和度在转染前达到80％以上。转染前，将1ug质粒和2ul Lipofect-amine2000分别用50ul不含血清的Opti-MEM I(Invitrogen)稀释，孵育5分钟后，将稀释的质粒DNA与稀释的Lipofectamine2000混匀，室温孵育20分钟，然后将10ul混合物加入到细胞培养基中，轻轻混匀，于37℃培养4小时，然后将其中的培养基吸出，加入新鲜的培养基，继续孵育不同的时间，如12h，24h，48h等。

2、脂质体转染效率的估测及DNA与Lipofectamine2000最佳比例的测定。

①转染效率的估测将编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pCDNA3.1/Zeo+EGFP(5.76kb)用Lipofectamine2000转入SMMC-7721细胞中，在荧光显微镜下记数能发绿色荧光的细胞所占的比例即可粗略估计转染效率。在24孔培养板上培养SMMC-7721肝癌细胞，每孔加入7×10⁴细胞，当细胞长到培养面积的90％以上时，即可进行转染，每孔中质粒和Lipofectamine 2000(Invitrogen)的用量见表1。

表1.pcDNA3.1/Zeo+EGFP与Lipof ectamine^TM2000的的比例(ug/ul)与转染效率

DNA与

Lipof

ectamine^TM     1∶0.5        1∶1        1∶1.5        1∶2        1∶2.5

2000的量

(ug/ul)

转染效率        5.8％         18.2％      22.5％        30.1％      20.4％

②pSilencer3.0-H1与Lipofectamine2000最佳比例的测定采用阳性对照质粒pSilencer 3.0-H1-gapdh与Lipofectamine2000(ug/ul)以1∶1，1∶2，1∶3，2∶1，2∶2，2∶3的比例混合，按照1.2所述方法转染肝癌细胞，然后提取总RNA，以Actin-β为内参照，以Real-Time RT-PCR的方法检测GAPDH基因表达的抑制率，以抑制率最大时的比例为最佳比例。

③总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的定量Real-time PCR检测

总RNA的抽提采用TRIZOL(Invitrogen)总RNA提取试剂盒。根据试剂盒说明，每孔中加入0.8ml TRIZOL试剂，用移液器吹打几次，在室温下孵育5分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟，于4℃12000g离心15分钟。然后将液相部分转移到一个新管中，加入0.5ml异丙醇，室温下静置10分钟，于4℃12,000g离心10分钟。弃去上清夜，加入1ml乙醇，混匀，于4℃7,500g离心5min。倒掉75％的乙醇，然后将RNA沉淀置于室温约15分钟，使乙醇慢慢挥发掉，然后加入38ul DEPC水，溶解RNA沉淀。

cDNA的合成及Real-Time PCR检测

cDNA的合成：

cDNA的合成应用ABI公司的反转录试剂盒进行。首先将38ul的总RNA加入到100ul的反转录体系中，其中包括10ul 10x TaqMan RT Buffer，22ul 25mM Mgcl₂，20uldeoxyNTPs(2.5mM)混合物，Oligo d(T)₁₆(50uM)5ul，RNase Inhibitor(20U/L)2ul，MultiScribe^TM Reverse Transcriptase(50U/ul)2.5ul.最后按照25℃10分钟，然后48℃30分钟，95℃5分钟的步骤合成cDNA。

Real-Time PCR：

Actin-β，GAPDH和AFP基因的表达采用相对荧光定量Real-Time PCR法检测，所用仪器为GeneAmp5700SDS。各种引物的序列如表2所示，均由Primer Express software(Applied Biosystems)设计而成，引物均设计在两个外显子相接处，以排除基因组DNA的污染。PCR试剂采用Sybr Green Mastermix(Applied Biosystems)，阴性对照和实验组均取复孔。反应体积为25ul，反应条件为95℃10分钟，激活AmpliTaq GoldDNA聚合酶，然后95℃30秒，60℃1分钟循环50个周期。每一对引物均经过引物优化实验决定最佳引物浓度，PCR扩增产物均经3％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。每次PCR之后均进行分离曲线测定，以排除非特异性扩增。标准曲线由不经任何处理的数量大致相当的肝癌细胞经相同方法处理并合成cDNA，然后等倍稀释，在相同条件下扩增，绘制标准曲线，标本中基因的拷贝数可由标准曲线得出。本研究采用管家基因Actin-β及GAPDH作为内参照。

3、化学发光法测定AFP蛋白的表达AFP蛋白表达的检测采用免疫化学发光法检测，所用仪器为AXSYM(美国雅培)，试剂采用配套的AFP定量检测试剂盒。

4、MTT实验绘制生长曲线在转染后8h，用胰酶消化收集细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，96孔板中每孔加入100ul(即1×10⁴个细胞)，分别于培养0，24，48，和72h后每孔加入20ulMTT液(5mg/ml)，继续培养4h后，吸去上清液，加入100ul DMSO液，稍震荡待兰色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A₄₉₂。每个时间点测定3孔求平均值，以时间为横轴，以A值为纵轴绘制生长曲线。

5、流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡

本发明应用Annexin V-FITC和PI双染色法检测肿瘤细胞凋亡。在转染48h后，经胰酶消化收集细胞，用冷PBS洗两遍，然后用1x的结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个细胞/ml，吸取100ul(即1×10⁵个细胞)加入一个新管中，分别加入5ul PI及5ul AnnexinV-FIT C，轻轻混匀，置暗处25℃孵育15分钟，然后加入400ul结合缓冲液，在1h内以流式细胞仪分析肿瘤细胞凋亡。

所构建质粒及生物活性的鉴定结果如下：

1琼脂糖凝胶电泳  经琼脂糖凝胶电泳检测，发现经碱裂解法提取的质粒的大小与试剂盒中所带阳性质控质粒大小相同，并且分子量大小与预期的结果大致相同，pSilencer3.0-H1的分子量是2.8Kb，见图3所示。

2测序为了确定提取的质粒中是否存在我们插入的序列及插入的序列中是否有异常存在，我们以M13通用测序引物作为引物，经ABI310基因测序，结果如图4所示。测序结果与我们插入的寡核苷酸的序列完全相符，并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在，表明已经成功的构建了针对AFP基因的siRNAs表达质粒。

3脂质体转染效率的估测及DNA与Lipofectamine2000最佳比例的测定。

3.1脂质体转染效率的估测  以表1所示pCDNA3.1/Zeo+EGFP与Lipofectamine2000的的比例(ug/ul)分别转染肿瘤细胞，转染24小时后胰酶消化并收集细胞，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。在荧光显微镜下可以观察到肿瘤细胞中有明亮的绿色荧光蛋白表达(图5)，并且发绿色荧光的细胞所占比例数随着pCDNA3.1/Zeo+EGFP与Lipof ectamine2000的的比例变化而变化，，当pCDNA3.1/Zeo+EGFP与Lipofectamine2000的比例为1∶2时的转染效率最高，可达30％左右(表I)。

3.2阳性对照质粒pSilencer3.0-H1-gapdh与Lipofectamine2000最佳比例的测定及抑制效果的检测

因为本研究所用质粒p-silencer 3.0-H1与pCDNA3.1/Zeo+EGFP的大小不同，因此其转染效率必然存在一定的差异，我们采用阳性对照质粒pSilencer 3.0-H1-gapdh进一步检测其与Lipofectamine2000的最佳比例及在最佳比例时对GAPDH基因的抑制率。如图6及图7所示，在pSilencer3.0-H1-gapdh与Lipofectamine2000比例为1∶2时的抑制作用最为明显，其最高抑制率可达60％左右。

3.3质粒pSilencer3.0-H1-afp的转染及其对AFP基因表达抑制率的real-time RT-PCR检测结果见图8。可见质粒pSilencer3.0-H1-afp对AFP基因的抑制率为34％，与阳性对照相比略低，阳性对照为60％左右。

3.4化学发光法测定AFP蛋白的表达  阴性对照及实验组均取2孔，在转染后48h，吸取上清夜检测AFP蛋白的表达量，检测结果如图9，AFP蛋白表达量实验组与对照组相比明显减少。减少量约为40％左右，与mRNA的减少量大致相符。

3.5MTT实验  如图10所示，质粒pSilencer 3.0-H1与阴性对照质粒相比明显的抑制了肿瘤细胞的生长，并且发现在32h时的抑制作用最为明显。

3.6流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡  由图11可见，pSilencer 3.0-H1-afp处理组与阴性对照组相比早期凋亡细胞所占比例差不多，但晚期凋亡细胞和死亡细胞略微增多，阴性对照为12.95％，实验组为15.68％。

本发明的优良效果如下：

本发明在近几年国内外RNA干涉研究的工作基础上，根据当前国际基因转移技术的最新进展，针对AFP基因，利用基因重组技术成功构建了H1启动子驱动的siRNAs表达质粒。通过在肝癌细胞内表达AFP基因发夹状siRNAs分子，特异性的抑制AFP基因的表达，以达到特异性的阻断AFP表达及治疗肝癌的目的。

1、本发明构建的AFP基因发夹状siRNAs表达表达质粒可有效抑制AFP基因的表达。主要有如下优点：①本质粒既可在大肠杆菌DH5α中大量扩增，又可以直接用于细胞转染；②转染效率高；③安全性高，无“插入突变”的危险，亦无免疫毒性反应；④稳定性强，有研究显示，抑制作用能持续120天左右；

2、本发明构建的AFP基因发夹状siRNAs表达质粒针对AFP基因，抑制效果明显，抑制作用达到了34％。本发明的针对AFP基因SiRNAs表达质粒是可用于AFP基因相关肝细胞肝癌的治疗物质，能显著抑制肝癌细胞的生长并能诱导肿瘤细胞凋亡，可用于进一步研究AFP基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。

(四)附图说明

图1.质粒pSilencer3.0-H1示意图。

图2.合成的两段寡核苷酸的结构示意图。

图3.DNA琼脂糖凝胶电泳1.分子量标准，2.构建的质粒，3阳性质控。

图4.插入片段的测序图。

图5.pCDNA3.1/Zeo+EGFP在肝癌细胞SMMC-7721中的表达。

图6.在不同阳性对照质粒DNA/LIP02000(ug/ul)比例时的RNA干涉效应。

图7.阳性对照质粒pSilencer3.0-H1-gapdh的RNA干涉效应。

图8.质粒pSilencer 3.0-H1-afp对AFP基因的抑制效果。

图9.不同处理组AFP蛋白表达的差异。

图10.MTT法测定转染不同质粒肝癌细胞的增殖曲线。

图11.不同处理组细胞凋亡率，阴性对照组。

图12.不同处理组细胞凋亡率，pSilencer 3.0-H1-afp处理组。

(五)具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。

1.制备靶向肝癌AFP基因的siRNAs表达载体所用材料

1.1质粒和菌株  质粒pSilencer 3.0-H1购自Ambion公司，见图1，工程菌DH5α购自山东大学分子生物学研究所。

1.2酶和主要试剂  T4DNA连接酶购自美国Promega公司，质粒的提取及纯化采用经典的碱裂解法和聚乙二醇质粒纯化法制备。

1.3测序引物  质粒中插入片段的测序采用M13通用引物。Forward Primer：5’-CACGACGTTGTAAAAGAC-3’，Reverse Primer：3’-GGACACATTTAACAATAG G-5’，购自上海申友公司。

1.4细胞系与培养基：肝癌细胞系SMMC-7721购自上海细胞生物学研究所。

1.5试剂：细菌液体培养基(LB)：精解蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；加蒸馏水至1000ml，溶解后用氢氧化钠调pH至7.5，高压灭菌。

细菌液体培养基(LA)：在上述LB培养基中加氨苄青霉素使终浓度为50μg/ml。

LB、LA固体培养基：在LB、LA培养基中加入2％琼脂。

缓冲溶液(GET)：50mmol/l葡萄糖；10mmol/lEDTA；25mmol/LTris·CL(pH8.0)，溶解后高压灭菌。

碱溶液(pH12.6)：0.2mol/lNaOH；1％SDS。

酸溶液(pH4.8)：3mol/lNaAc；2mol/lNaAC。

饱和酚(pH8.0)；氯仿/异戊醇(24∶1)；3mol/lNaAC。

RNA酶使用液(TER)：含有无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(PH8.0缓冲液)。

含13％(W/V)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/L的氯化钠溶液。

缓冲液(TE)：10mmol/LTris·Cl(pH7.6)；1mmol/L EDTA)(pH8.0)，高压灭菌。

电泳缓冲液(TBE)(5×)：Tris碱54g；硼酸27.5g；0.5molEDTA(pH8.0)20ml，加双蒸水至1000ml。

上样缓冲液(6×)：0.25％溴酚蓝；40％(W/V)蔗糖，溶于双蒸水中，4℃保存。

磷酸盐缓冲液(PBS)：137mmol/l NaCl；2.7mmol/l KCl；4.3mmol/l Na2HPO4；1.4mmol/lKH2PO4，用双蒸水配制，高压灭菌。

脂质体Lipofectamine-2000：Invitrogen公司

1.6主要仪器设备及其它：

TGL-16型高速台式离心机：上海医疗器械六厂产品。

低温高速离心机、核酸定量分析仪(Eppendorf Biophotometer)、微量移液器：德国爱本道夫Eppendof公司产品。

LKB2103型电泳仪：德国LKB公司产品。

ZF-BI型紫外分光光度仪：上海长明电子仪器厂产品。

涡旋混合器：北京同正生物技术发展公司产品。

凝胶自动成像系统：美国安.发玛西亚Amersham Pharmacia Biotech公司产品。

希尔(Hear)细胞培养箱：美国GB公司产品。

流式细胞仪(FACSCAN)：美国BD公司产品。

荧光定量PCR仪(5700sequence Detection system)：基因(GENE Amp)公司产品。

超净工作台、倒置显微镜、血细胞计数器、电子天平、贝克曼(Beckman)高速低温离心机

Whatman滤纸、硝酸纤维素膜、25cm2细胞培养瓶、24孔细胞培养板、D25mm可换膜滤器、吸管(1ml、5ml)、滴管、EP管、华试管。

2.制备方法和生物学活性的鉴定

(1)RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成构建基因特异性的siRNA表达质粒，首先要进行靶序列的选择。通常沿着mRNA序列寻找连续两个AA及后面19个核苷酸，即为靶序列，然后通过同源性比较，选择那些与其他任何基因无同源性的序列即为潜在的SiRNA靶位点。按照试剂盒说明，针对AFP基因(GenBank accession no.NM 005030)编码区序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′设计并合成了两段互补的寡核苷酸序列，序列如下：

5’-gatcccgctcagtgaggacaaactatttcaagagaatagtttgtcctcactgagttttttggaaa-3’；

5’-agcttttccaa-aaaactcagtgaggacaaactattctcttgaaatagtttgtcctcactgagcgg-3’。

(2)合成的两段寡核苷酸与线性化的Psilencer 3.0-H1的连接、转化、扩增与质粒的纯化按照《分子克隆》实验指南及试剂盒说明书进行，首先将合成的两段寡核苷酸等量混合，90℃3min，37℃孵育1h，然后将结合的双链寡核苷酸与带有BamH1和HindIII粘性末端的Psilencer 3.0-H1质粒连接，，最后，将连接成功的质粒转化DH5a大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选，挑选耐药菌落大量培养。质粒的提取及纯化采用经典的碱裂解法和聚乙二醇质粒纯化法。

(3)质粒的鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳，及应用M13的通用测序引物进行测序，以确定合成的寡核苷酸是否已经转入pSilencer 3.0-H1质粒中及是否有碱基异常存在。

(4)肿瘤细胞培养及质粒的脂质体转染人类肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养在含有10％(vol/vol)胎牛血清的RPMI-1640培养基中(Invitrogen)，置于37℃、5％CO2培养箱中。质粒的转染采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)。转染前一天，将肿瘤细胞接种24孔培养板，每孔细胞约7×10⁴个细胞，使每孔的细胞饱和度在转染前达到80％以上。转染前，将1ug质粒和2ul Lipofect-amine2000分别用50ul不含血清的Opti-MEM I(Invitrogen)稀释，孵育5分钟后，将稀释的质粒DNA与稀释的Lipofectamine2000混匀，室温孵育20分钟，然后将100ul混合物加入到细胞培养基中，轻轻混匀，于37℃培养4小时，然后将其中的培养基吸出，加入新鲜的培养基，继续孵育不同的时间，如12h，24h，48h等。

(5)脂质体转染效率的估测及DNA与Lipofectamine2000最佳比例的测定。

转染效率的估测将编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pCDNA3.1/Zeo+EGFP(5.76kb)用Lipofectamine2000转入SMMC-7721细胞中，在荧光显微镜下记数能发绿色荧光的细胞所占的比例即可粗略估计转染效率。在24孔培养板上培养SMMC-7721肝癌细胞，每孔加入7×10⁴细胞，当细胞长到培养面积的90％以上时，即可进行转染，每孔中质粒和Lipofectamine 2000(Invitrogen)的用量见表1。

pSilencer3.0-H1与Lipofectamine2000最佳比例的测定采用阳性对照质粒pSilencer 3.0-H1-gapdh与Lipofectamine 2000(ug/ul)以1∶1，1∶2，1∶3，2∶1，2∶2，2∶3的比例混合，按照1.2所述方法转染肝癌细胞，然后提取总RNA，以Actin-β为内参照，以Real-Time RT-PCR的方法检测GAPDH基因表达的抑制率，以抑制率最大时的比例为最佳比例。

(6)总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的定量Real-time PCR检测①总RNA的抽提采用TRIZOL(Invitrogen)总RNA提取试剂盒。根据试剂盒说明，每孔中加入0.8ml TRIZOL试剂，用移液器吹打几次，在室温下孵育5分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟，于4℃12000g离心15分钟。然后将液相部分转移到一个新管中，加入0.5ml异丙醇，室温下静置10分钟，于4℃12,000g离心10分钟。弃去上清夜，加入1ml乙醇，混匀，于4℃7,500g离心5min。倒掉75％的乙醇，然后将RNA沉淀置于室温约15分钟，使乙醇慢慢挥发掉，然后加入38ul DEPC水，溶解RNA沉淀。

②cDNA的合成及Real-Time PCR检测

  cDNA的合成：

  cDNA的合成应用ABI公司的反转录试剂盒进行。首先将38ul的总RNA加入到100ul的反转录体系中，其中包括10ul 10x TaqMan RT Buffer，22ul 25mM Mgcl₂，20uldeoxyNTPs(2.5mM)混合物，Oligo d(T)₁₆(50uM)5ul，RNase Inhibitor(20U/L)2ul，MultiScribe^TM Reverse Transcriptase(50U/ul)2.5ul.最后按照25℃10分钟，然后48℃30分钟，95℃5分钟的步骤合成cDNA。

Real-Time PCR：

Actin-β，GAPDH和AFP基因的表达采用相对荧光定量Real-Time PCR法检测，所用仪器为GeneAmp5700SDS。各种引物的序列如表2所示，均由Primer Express software(Applied Biosystems)设计而成，引物均设计在两个外显子相接处，以排除基因组DNA的污染。PCR试剂采用Sybr Green Mastermix(Applied Biosystems)，阴性对照和实验组均取复孔。反应体积为25ul，反应条件为95℃10分钟，激活AmpliTaq GoldDNA聚合酶，然后95℃30秒，60℃1分钟循环50个周期。每一对引物均经过引物优化实验决定最佳引物浓度，PCR扩增产物均经3％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。每次PCR之后均进行分离曲线测定，以排除非特异性扩增。标准曲线由不经任何处理的数量大致相当的肝癌细胞经相同方法处理并合成cDNA，然后等倍稀释，在相同条件下扩增，绘制标准曲线，标本中基因的拷贝数可由标准曲线得出。本研究采用管家基因Actin-β及GAPDH作为内参照。

(7)化学发光法测定AFP蛋白的表达AFP蛋白表达的检测采用免疫化学发光法检测，所用仪器为AXSYM(美国雅培)，试剂采用配套的AFP定量检测试剂盒。

(8)MTT实验绘制生长曲线在转染后8h，用胰酶消化收集细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，96孔板中每孔加入100ul(即1×10⁴个细胞)，分别于培养0，24，48，和72h后每孔加入20ulMTT液(5mg/ml)，继续培养4h后，吸去上清液，加入100ul DMSO液，稍震荡待兰色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A₄₉₂。每个时间点测定3孔求平均值，以时间为横轴，以A值为纵轴绘制生长曲线。

(9)流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡

本发明应用Annexin V-FITC和PI双染色法检测肿瘤细胞凋亡。在转染48h后，经胰酶消化收集细胞，用冷PBS洗两遍，然后用1x的结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个细胞/ml，吸取100ul(即1×10⁵个细胞)加入一个新管中，分别加入5ul PI及5ul AnnexinV-FIT C，轻轻混匀，置暗处25℃孵育15分钟，然后加入400ul结合缓冲液，在1h内以流式细胞仪分析肿瘤细胞凋亡。

3.结果

3.1琼脂糖凝胶电泳  经琼脂糖凝胶电泳检测，发现经碱裂解法提取的质粒的大小与试剂盒中所带阳性质控质粒大小相同，并且分子量大小与预期的结果大致相同，pSilencer3.0-H1的分子量是2.8Kb，见图1所示。

3.2测序  为了确定提取的质粒中是否存在我们插入的序列及插入的序列中是否有异常存在，我们以M13通用测序引物作为引物，经ABI310基因测序，结果如图2所示。测序结果与我们插入的寡核苷酸的序列完全相符，并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在，表明已经成功的构建了针对AFP基因的siRNAs表达质粒。

3.2脂质体转染效率的估测及DNA与Lipofectamine2000最佳比例的测定。

3.2.1脂质体转染效率的估测  以表1所示pCDNA3.1/Zeo+EGFP与Lipofectamine 2000的的比例(ug/ul)分别转染肿瘤细胞，转染24小时后胰酶消化并收集细胞，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。在荧光显微镜下可以观察到肿瘤细胞中有明亮的绿色荧光蛋白表达(图5)，并且发绿色荧光的细胞所占比例数随着pCDNA3.1/Zeo+EGFP与Lipof ectamine2000的的比例变化而变化，，当pCDNA3.1/Zeo+EGFP与Lipofectamine2000的比例为1∶2时的转染效率最高，可达30％左右(表1)。

3.2.2阳性对照质粒pSilencer3.0-H1-gapdh与Lipofectamine2000最佳比例的测定及抑制效果的检测

因为本研究所用质粒p-silencer 3.0-H1与pCDNA3.1/Zeo+EGFP的大小不同，因此其转染效率必然存在一定的差异，我们采用阳性对照质粒pSilencer 3.0-H1-gapdh进一步检测其与Lipofectamine 2000的最佳比例及在最佳比例时对GAPDH基因的抑制率。如图6及图7所示，在pSilencer3.0-H1-gapdh与Lipofectamine 2000比例为1∶2时的抑制作用最为明显，其最高抑制率可达60％左右。

3.2.3质粒pSilencer3.0-H1-afp的转染及其对AFP基因表达抑制率的real-time RT-PCR检测结果见图8。可见质粒pSilencer3.0-H1-afp对AFP基因的抑制率为34％，与阳性对照相比略低，阳性对照为60％左右。

3.2.4化学发光法测定AFP蛋白的表达阴性对照及实验组均取2孔，在转染后48h，吸取上清夜检测AFP蛋白的表达量，检测结果如图9，AFP蛋白表达量实验组与对照组相比明显减少。减少量约为40％左右，与mRNA的减少量大致相符。

3.2.5MTT实验如图10所示，质粒pSilencer 3.0-H1与阴性对照质粒相比明显的抑制了肿瘤细胞的生长，并且发现在32h时的抑制作用最为明显。

3.2.6流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡由图11可见，pSilencer 3.0-H1-afp处理组与阴性对照组相比早期凋亡细胞所占比例差不多，但晚期凋亡细胞和死亡细胞略微增多，阴性对照为12.95％，实验组为15.68％。

Claims (2)

1.靶向AFP基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pSilencer3.0-H1为载体，由H1启动子启动针对AFP基因的发夹状双链RNA分子的表达，本载体质粒针对AFP基因编码区序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′，是用于与AFP相关的肝细胞癌的治疗性物质，由以下方法制得：

(1)RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成

选择AFP基因编码区序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′，设计并合成了两段互补的寡核苷酸序列，序列如下：

5’-gatcccgctcagtgaggacaaactatttcaagagaatagtttgtcctcactgagttttttggaaa-3’，

5’-agcttttccaa-aaaactcagtgaggacaaactattctcttgaaatagtttgtcctcactgagcgg-3’；

(2)将上述合成的两段寡核苷酸与线性化的Psilencer 3.0-H1的连接、转化、扩增及质粒的纯化

首先将合成的两段寡核苷酸等量混合，90℃3min，37℃孵育1h，然后将结合的双链寡核苷酸与带有BamH1和HindIII粘性末端的Psilencer 3.0-H1质粒连接，，最后，将连接成功的质粒转化DH5a大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选，挑选耐药菌落大量培养，质粒的提取及纯化采用经典的碱裂解法和聚乙二醇质粒纯化法；

(3)质粒的鉴定

DNA琼脂糖凝胶电泳，及应用M13的通用测序引物进行测序，以确定合成的寡核苷酸是否已经转入pSilencer 3.0-H1质粒中及是否有碱基异常存在。

2.权利要求1的靶向AFP基因的siRNAs表达载体在制备治疗分泌AFP蛋白的肝癌的基因药物中的应用。

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