CN1295339C

CN1295339C - 减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用

Info

Publication number: CN1295339C
Application number: CNB2005100181296A
Authority: CN
Inventors: 陈志伟; 张林琦; 方清; 田波
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2005-01-11
Filing date: 2005-01-11
Publication date: 2007-01-17
Anticipated expiration: 2025-01-11
Also published as: CN1654665A

Abstract

本发明公开了一种减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用，显著减毒痘苗病毒(TT.WHU.pZCI)，CCTCC：V200416。其制备步骤为：A、构建穿梭质粒，该质粒包含与痘苗病毒天坛株HA基因晚期启动子序列或其两侧序列同源的侧翼序列；B、使穿梭质粒与痘苗病毒天坛株同源重组，以使痘苗病毒HA基因部分失去功能，达到对痘苗病毒天坛株显著减毒的目的。该减毒痘苗病毒天坛株载体在制备治疗或预防传染性疾病的疫苗中的应用。

Description

减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种减毒痘苗病毒天坛株载体，它们衍生于痘苗病毒天坛株，它们的特征是失去或降低了在动物细胞中的繁殖复制能力，减少了对细胞的毒性；在动物体内显示了显著减毒的特性，尤其是痘苗病毒特有的神经毒性显著降低。本发明同时还涉及减毒痘苗病毒天坛株载体的制备方法。本发明的显著减毒痘苗病毒载体将比野生痘苗病毒天坛株具有更高的安全性，可用于构建人或动物的活病毒载体疫苗；该减毒痘苗病毒载体还可进一步用于研制肿瘤基因治疗或预防的药物；或用作外源基因的表达载体，大规模生产目的蛋白；或用于表达外源病原体抗原制备病原体检测和诊断试剂。

背景技术

痘苗病毒(Vaccinia Virus)属于痘病毒科正粘病毒属，曾被用作预防天花感染的疫苗而在世界范围内得到广泛应用，使得天花成为第一个被人类完全灭绝的恶性传染病(Riva，G.et al.，1979.A milestone in the history of mankind.Eradication of smallpox.MMW Munch Med Wochenschr，121(50)，1669-70)。近二十年来，随着基因工程技术的快速发展，痘苗病毒被用于研究设计基因表达载体，或用于重组活病毒疫苗的研究(Moss，B.1996.Genetically engineeredpoxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety.ProcNatl Acad Sci USA 93(21)，11341-8；Paoletti，E.et al.，1996.Applications ofpox virus vectors to vaccination：an update.Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)，11349-53)。已有多种重组痘苗病毒疫苗可以成功地表达狂犬病毒、日本脑炎病毒等病毒的抗原并用于动物传染病的防治(Kieny，M.P.etal.，1984.Expressionof rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus.Nature312(5990)，163-6；Konishi，E.et al.，1992.A highly attenuated hostrange-restricted vaccinia virus strain，NYVAC，encoding the prM，E，and NS1genes of Japanese encephalitis virus prevents JEV viremia in swine.Virology190(1)，454-8)。人用重组活病毒疫苗也取得许多重要进展，已有包括麻疹、EBV、HAV、HBV、HPV、HIV及狂犬病毒等进行了初步的人体免疫观察(郭斐等，2001，非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究。病毒学报17(1)，24-28；McMichael，A.et al.，2002.The quest for anAIDS vaccine：is the CD8+T-cell approach feasible？Nat Rev Immunol 2(4)，283-91；Moss，B.1996.Genetically engineered poxviruses for recombinantgene expression，vaccination，and safety.Proc Natl Acad Sci USA 93(21)，11341-8；Zhu，J.H.et at.，1996.Immunogenicity and relative attenuation ofdifferent vaccinia-rabies virus recombinants.Arch Virol 141(6)，1055-65)。

痘苗病毒天坛株(Tian Tan，TT)是中国特有的痘苗病毒毒株，曾作为预防天花传染的疫苗株在中国大量人群中长期使用过，具有相对毒力较弱、使用安全的特点，是研制适用于中国应用的基因工程病毒载体和重组活疫苗的理想毒株。然而，痘苗病毒产生的尽管罕见但却十分严重的副作用，是痘苗病毒作为载体使用的一个重要的安全性障碍(Wollenberg，A.at al.，2004.Smallpox，vaccinationand adverse reactions to smallpox vaccine.Curr Opin Allergy Clin Immunol4(4)，271-5.)，应用基因工程的方法对天坛株进一步减毒，以降低它在动物细胞中(in Vitro)及动物体内(in Vivo)的毒性(virulence)是解决这一问题的根本途径。

痘苗病毒的血凝素(Hemagglutinin，HA)是病毒的一种糖基化非结构蛋白，分子量为85KD。HA基因(A56R)的表达受早期和晚期两个启动子的控制，但其表达的有血凝功能的85KD蛋白通常积累于病毒基因表达的晚期(Brown，C.K.et al.，1991.Molecular characterization of the vaccinia virus hemagglutiningene.J Virol 65(7)，3598-606)。HA蛋白主要表达于被感染细胞的表面，同时也出现在痘苗病毒的胞外包膜病毒(Extracellular enveloped virus，EEV)的外膜上(Payne，L.G.et al.，1979.Identification of the vaccinia hemagglutininpolypeptide from a cell system yielding large amounts of extracellularenveloped virus.J Virol 31(1)，147-55；Payne，L.G.et al.，1985.Extracellularrelease of enveloped vaccinia virus from mouse nasal epithelial cells in vivo.JGen Virol 66 (Pt3)，643-6)。HA基因是痘苗病毒在细胞中复制的非必需基因，已被证实可以作为外源基因的插入位点，插入该位置的外源基因在体内和体外都能得到稳定的表达(Antoine，G.et al.，1996.Characterization of the vacciniaMVA hemagglutinin gene locus and its evaluation as an insertion site forforeign genes.Gene 177(1-2)，43-6)。HA基因在痘苗病毒生活周期中的确切功能和作用并不十分清楚，但有实验表明，失活HA基因可以导致痘苗病毒WR株在动物体内减毒(Flexner，C.et al.，1987.Prevention of vaccinia virus infectionin immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression.Nature 330(6145)，259-62)。Shida等也证实，缺失HA基因可以造成痘苗病毒Lister株(LO)或其衍生的LC16mO株减毒，但其减毒的程度远低于WR株(Shida，H.et al.，1988.Effects and virulences of recombinant vaccinia viruses derived from attenuatedstrains that express the human T-cell leukemia virus type I envelope gene.JVirol 62(12)，4474-80)。由此可见，不同痘苗病毒株系间遗传背景的差异，有可能导致减毒效果上的巨大差别。

中国痘苗病毒天坛株的全基因组测序于1997年完成，它为研究和阐明痘苗病毒天坛株独特的生物学特性及进行基因工程改造提供了重要的背景资料(金奇等，1997，痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析。中国科学(C辑) 27(6)，562-567)。对天坛株基因结构的研究表明，它与其它痘苗病毒毒株WR株及Copenhagen株等存在较大的差异，这些差异主要分布在其基因组的外侧区(Hind III的B和C片段)，在A片段上也发现有重大变异的现象(陈南海等，1992，我国痘苗病毒天坛株与WR株基因组的差异主要分布在其外侧区。病毒学报8(4)，303-308)。天坛株的这些变异的程度和范围是目前所研究的几种痘苗病毒中所没有的。对天坛株的HA基因(A56R)的序列分析发现，相对于WR株，它在核苷酸水平上存在1.2％的结构基因的变异，在氨基酸水平上有2.5％的变异率(黎志良等，1989.我国痘苗病毒天坛株血凝素基因全序列分析。病毒学报5(1)，2-9)。天坛株基因组结构的变异显示了它不同于其它痘苗病毒毒株的独特的遗传背景，这种独特的遗传背景有可能导致包括毒力在内的各种生物学特性的变化。

早在十多年前，天坛株已经被研究用于改造成表达载体表达不同的外源基因(高峰等，1992，甲型肝炎重组痘苗病毒(VMS11HAV25)的构建极其某些生物学特性。病毒学报8(2)，110-117；马海伦等，1999，同时表达多种外源基因的非复制型重组痘苗病毒的构建。病毒学报15(1)，21-28；徐水婵等，1998，麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)在痘苗病毒中的表达。病毒学报9(4)，301-307；谷淑燕等，1988，表达乙型肝炎病毒表面抗原和Epstein-Barr病毒膜抗原的双价痘苗病毒的组建。病毒学报4(1)，1-8；阮力等，1992，呼吸道合胞病毒糖蛋白F和G在同一个重组痘苗病毒中的表达。病毒学报8(2)，101-109；郭斐等，2001。非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究。病毒学报17(1)，24-28)。用于插入外源基因的位点主要包括胸苷激酶基因(thymidine kinase，TK)、HA基因和Hind III的C～K片段区等。其中，已有多种HIV-1的基因被插入到天坛株的HA基因位点，实验结果表明插入天坛株该位点的外源基因在体内和体外均能得到有效和稳定的表达(王玉红等，2000，重组痘苗病毒中共表达HIV-1 env与hL-6基因。中国人兽共患病杂志，16(4)，22-24；王玉红等，1999，HIV-1env与hL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究。免疫学杂志15(4)，217-219；毛春生等，1996，HIV-1gag基因重组痘苗病毒的构建和高效表达。中国兽医学报16(6)，562-569)，但有关重组病毒对生物体的毒性和其作为潜在疫苗使用的安全性未有研究和实验证明。同时，至今也未有任何其它实验结果或研究，表明通过失活或缺失HA可以导致痘苗病毒天坛株在体内和体外减毒。

为了获得更为安全的起源于天坛株的痘苗病毒载体，我们针对痘苗病毒天坛株的HA基因，在其晚期启动子序列区引入遗传序列的变化，导致HA基因部分失去功能，，获得了显著减毒的天坛痘苗病毒体。我们还同时，第一次系统的研究了减毒天坛痘苗病毒载体在动物细胞中复制的生物学特性，及其在体内(动物模型中)的毒性，由此提供该减毒病毒作为载体安全使用的重要的和科学的依据。显著减毒的天坛痘苗病毒将是更为安全的、理想的病毒载体，可广泛用于构建人和动物的活病毒载体基因工程疫苗，及其包括癌症在内的人类疾病的基因治疗；此外，该载体还可用作外源基因的表达载体，大规模生产目的蛋白，或用于表达外源病原体抗原，制备病原体检测和诊断试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种减毒痘苗病毒天坛株载体，该载体具有有限的宿主范围，在多数细胞中包括人源化细胞中显示繁殖复制能力降低，扩散水平下降，对细胞的毒性减轻。同时该载体也显示在动物体内毒性下降，尤其是痘苗病毒特有的神经毒性大为下降。因此，该载体比野生天坛病毒更为安全可靠，能有效地预防和减少痘苗病毒产生的副作用，包括接种后脑炎的发生；同时也能防止病毒载体在人群和环境中的随机扩散，以保护未接种人群和防止环境污染。

本发明的另一个目的在于提供一种制备减毒痘苗病毒天坛株载体的方法，该方法简便，操作方便，易于获得安全、显著减毒的痘苗病毒载体。同时，用该方法获得的减毒痘苗病毒载体在连续传代中还显示了外源基因插入和表达的高度稳定性。

本发明还涉及减毒痘苗病毒天坛株载体在制备治疗或预防传染病性疾病的疫苗中的应用。

本发明还涉及减毒痘苗病毒天坛株载体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明还涉及减毒痘苗病毒天坛株载体在表达外源基因中的应用。

本发明还涉及减毒痘苗病毒天坛株载体在表达外源病原体抗原制备病原体检测和诊断试剂中的应用。

为了实现上述任务，本发明的一个优选实施方案中提供了新的痘苗病毒，它衍生自痘苗病毒天坛株。痘苗病毒天坛株在中国有几十年的应用历史，自从上世纪20年代中国开始生产牛痘苗，一直使用天坛株作痘苗毒种。本发明使用的原始痘苗病毒毒种是中国生产的人用疫苗株天坛761。本发明提供的新的痘苗病毒，由于其基因组中的HA基因的晚期启动子序列存在至少一处基因序列上的改变，导致HA基因功能部分失活；新的痘苗病毒在多数动物细胞中具有降低的有限的复制能力，或完全失去复制能力，和/或降低了对动物细胞的毒性；它在模型动物小鼠中显示显著减毒的特征，该减毒痘苗病毒还显示神经毒性大幅下降，在连续传代中它还显示了外源基因插入和表达的高度稳定性。本发明还提供了可以获得显著减毒的天坛痘苗病毒的方法，和该减毒痘苗病毒进一步作为一种安全性的载体应用于人或动物疫苗的构建，或作为安全性的基因转移载体应用于肿瘤的基因治疗，或用作外源基因的表达载体大规模生产目的蛋白，或用于表达外源病原体抗原制备病原体检测和诊断试剂。

已将获得的新的痘苗病毒载体：显著减毒痘苗病毒(TT.WHU.pZCI)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2004年9月17日，保藏编号：CCTCC NO：V200416。在本文中TT.WHU.pZCI简写为pZCI。

本发明还发现，在痘苗病毒天坛株HA基因晚期启动子的不同位点引入外源核苷酸序列，或使晚期启动子缺失，均可导致HA基因功能的部分失活，获得与pZCl特征相同的显著减毒痘苗病毒。因此，对HA基因的晚期启动子进行遗传改造，使得HA基因功能部分失活，均可得到显著减毒痘苗病毒。

术语“遗传改造”是指，通过基因工程的方法对原有物种的核苷酸序列进行增加、减少或改变遗传顺序等操作。

为了便于研究和描述痘苗病毒在细胞中的复制特征，首先对实验的几个具体指标进行以下的介绍。

病毒的复制能力是指病毒的繁殖复制能力，通常按照以下方法计算：病毒感染细胞后在一定时间内产生的病毒量与感染细胞的输入病毒量之比，即为病毒在细胞中的增殖倍数。本发明以病毒感染细胞后72小时的产量(病毒的滴度，titre)比上感染细胞的输入病毒量作为判断病毒在该细胞中复制能力的标准，并用Moss B的方法对细胞进行分类(Carroll，M.W.，and Moss，B.1997.Host rangeand cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus：propagation and generation of recombinant viruses in a nonhumanmammalian cell line.Virology 238(2)，198-211)，即：

非允许细胞(nonpermissive cell，NP)：＜1倍的病毒复制增长倍数，病毒在该

细胞中缺乏繁殖性复制能力；

半允许细胞(semipermissive cell，SP)：1～25倍的病毒复制增长倍数，病毒

在该细胞中具有有限的繁殖性复制能

力；

允许细胞(permissive cell，P)：＞25倍的病毒复制增长倍数。病毒在该细胞

中具有繁殖性复制能力。

病毒在细胞间扩散的能力是病毒在细胞中复制生长的一种重要特性。用免疫染色的方法测定了野生天坛株病毒及其衍生的减毒天坛病毒载体在动物细胞中的扩散速度，进一步获得了减毒痘苗病毒在动物细胞中不同于野生天坛病毒的复制特性。对病毒在细胞中的扩散速度做了如下的规定，以便更好的描述和区分病毒在细胞中扩散能力的差异：以0.01MOI(Multiplicity of infection，MOI)的病毒量感染细胞，在不同的时间点(24小时、48小时和72小时)终止感染，对细胞进行免疫染色，观察病毒在细胞中感染和扩散的进程。病毒在细胞中的扩散按Moss B的方法分类，即以病毒感染后的72小时内能够染色的细胞数来判断病毒的扩散能力(Carroll，M.W.，and Moss，B.1997.Host range andcytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus：propagation and generation of recombinant viruses in a nonhumanmammalian cell line.Virology 238(2)，198-211)：

- 72小时内没有细胞被染色，该细胞不能被感染，

+ ＜5个细胞被染色，病毒仅有很低的扩散能力，

++ 5～25个细胞被染色，病毒在细胞中具有有限的扩散能力，

+++＞25个细胞被染色，病毒在细胞中具有较高的扩散能力。

病毒在细胞中复制时对细胞产生的毒性被称为致细胞病变效应(cytopathiceffects，CPE)。病毒对细胞的毒性是病毒在细胞中复制的一个重要特性，与病毒在动物体内的毒性直接相关。在细胞水平产生较少CPE的病毒通常对动物毒性(virulence)更低。因此，在研究病毒的扩散速度的同时观察了病毒在细胞中形成CPE的能力，包括病毒在细胞中形成噬斑(plaque)的能力。同时，还特别的观察了病毒在高感染复数(5.0MOI)下，在动物细胞中形成CPE的情况，并通过以下的方法予以描述：

- 72小时内没有细胞被染色，该细胞不能被感染，

+ ＜5个细胞被染色，病毒仅有很低的扩散能力，

++ 5～25个细胞被染色，病毒在细胞中具有有限的扩散能力，

+++＞25个细胞被染色，病毒在细胞中具有较高的扩散能力。

本发明研究了衍生于痘苗病毒天坛株的减毒痘苗病毒载体pZCI在动物细胞中的复制特性，包括病毒复制的动力学曲线、病毒在细胞中的扩散速度和病毒对细胞的毒性等；在相同条件下对其亲本痘苗病毒天坛株进行了比较性实验，由此获得了优选减毒天坛病毒在动物细胞中不同于野生天坛病毒的独特的复制特性。

为更明确的了解改良天坛病毒的复制特征，首先概括痘苗病毒天坛株在动物细胞中的复制特性。其特性为：

1.痘苗病毒天坛株具有广泛的宿主范围(host range)，它在所测试的11种动物细胞中均具有很好的繁殖复制能力，这些细胞都是痘苗病毒天坛株复制的允许细胞。

2.痘苗病毒天坛株在所测试的动物细胞中均表现出较快的细胞间扩散的速度和相当严重的对细胞的毒性。

显著减毒痘苗病毒显示了与野生天坛病毒完全不同的复制特性，其在动物细胞中复制的基本特征为：显著减毒的痘苗病毒在动物细胞中具有有限的宿主范围；在多数动物细胞中(包括人源化细胞中)具有有限的或降低的复制水平；具有更低的细胞到细胞间的扩散能力和/或更小的细胞毒性；仅在非洲绿猴肾细胞Vero和COS-7中，具有与野生天坛病毒相同水平的复制能力、相似的细胞间扩散水平和相当程度的对细胞的毒性。

显著减毒痘苗病毒在动物细胞中的复制特征具体描述如下：

1.具有有限的宿主范围(host range)和在多数细胞中包括人源化细胞中有限的或降低的繁殖性复制水平：

减毒的痘苗病毒载体在多种动物细胞中只能进行有限的复制或完全失

去复制能力，因而具有比野生天坛病毒更为有限的宿主范围。具体的，显著减毒的痘苗病毒pZCI在兔肾细胞系RK-13(ATCC CCL-37)中完全失去

繁殖性复制能力，其在RK-13细胞中的病毒增殖倍数小于0.01，比野生天坛痘苗病毒在该细胞中复制增殖倍数低40000倍以上。RK-13是减毒病毒pZCI的非允许细胞。

减毒痘苗病毒在多种动物细胞中仅具有有限的繁殖复制能力，这些细胞包括狗肾细胞系MDCK(ATCC CCL-34)、鼠脑神经胶质瘤细胞系C6(ATCCCCL-37)、猪肾细胞系PK(15)(ATCC CCL-33)和幼年仓鼠肾细胞系BHK-21(ATCC CCL-10)。具体的，显著减毒痘苗病毒pZCI在MDCK、C6、PK(15)和BHK-21中仅具有大于1倍但低于25倍的复制能力，其复制能力分别为野生天坛病毒的8.3％、1.9％、1.2％和16.9％。因而MDCK、C6、PK(15)和BHK-21是pZCI的半允许细胞。

优选的减毒痘苗病毒在两种人源化细胞系293T(ATCC CRL11268)和MRC-5(ATCC CCL-171)中也显示了明显下降的复制水平，尽管病毒的复制增殖倍数显示这两种细胞系是减毒病毒的允许细胞。pZCI在人胚肾细胞系293T中的复制倍数只有天坛株在293T中的36.8％，而在人胚肝细胞系MRC-5中的复制增殖倍数只有天坛株的14.7％。

减毒痘苗病毒在原代鸡胚细胞(Chick embryo fibriblasts，CEF，自制)、人宫颈癌细胞系HeLa(ATCC CCL-2)、两种非洲绿猴肾细胞Vero和COS-7中的复制能力与野生天坛株相比没有显著差异，以上三种细胞是野生天坛病毒和减毒痘苗病毒的允许细胞。

2.具有更低的细胞到细胞间的扩散水平

经测试，野生天坛病毒在测试的11种动物细胞中都有很强的扩散能力，其72小时内均有大于25个细胞被染色，因此野生天坛病毒在这些细胞中的扩散速度均被计为+++。

显著减毒痘苗病毒pZCI在RK-13细胞中仅显示单个被染色的细胞，显示pZCI在该细胞中不具有扩散能力；在MDCK和PK(15)中，优选的减毒病毒pZCI只有少于5个细胞被染色，表明pZCI在这两种细胞中仅具有很低的扩散能力。

在另两种细胞C6和HeLa中，减毒痘苗病毒pZCI的扩散速度也低于野生天坛病毒，72小时内均只有少于25个细胞被感染，显示pZCI在以上两种细胞系中仅有有限的扩散能力(++)。

尽管在BHK-21、MRC-5和原代CEF细胞中，优选的减毒痘苗病毒pZCI均有较高的扩散能力(+++)，但在相同的时间内，pZCI感染的细胞数仍然明显少于野生天坛病毒感染的细胞，表明减毒痘苗病毒pZCI在BHK-21、MRC-5和CEF中的扩散速度比野生病毒仍明显减缓。

减毒痘苗病毒pZCI仅在人胚肾细胞293T和非洲绿猴肾细胞Vero、COS-7中具有与野生病毒相似的扩散速度，表明Vero、COS-7和293T均能有效的支持野生天坛病毒及改良天坛病毒的繁殖性复制和扩散。

痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒在动物细胞中的复制增殖倍数见表

1。痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒在动物细胞中的扩散见表2。

表1痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒载体在动物细胞中的复制

细胞系	种类	组织	细胞形态	病毒的复制增值倍数*
				病毒的复制增值倍数*		pZCI	TT
				CEF293TBHK-21C6COS-7HeLaMDCKMRC-5PK(15)RK13Vero	Chick embryoHumanHamster，SyrianRatAfrican green monkeyHumanCanineHumanPigRabbitAfrican green monkey	pZCI	TT	AssortedKidneyKidneyBrain；glial cell；gliomaKidneyCervixKidneyLungKidneyKidneyKidney	FibroblastEpithelialFibroblastFibroblastFibroblastEpithelialEpithelialFibroblastEpithelialEpithelialEpithelial	196.88(P)25.45(P)11.67(SP)2.97(SP)125(P)67.42(P)12(SP)27.5(P)1.16(SP)0.0031(NP)500(P)	128.13(P)69.09(P)62.50(P)156.67(P)160(P)63.64(P)145(P)187.50(P)100.83(P)131.25(P)562.5(P)

^*0.05MOI的病毒感染成片的动物细胞，分别在0、24、48和72小时收集样品，

在Vero细胞中测定病毒的滴度。病毒的增殖倍数是以病毒感染细胞后72小时的产量比上感染细胞的输入病毒量。图中，细胞分为非允许细胞、半允许细胞和允许细胞：

NP＜1倍的病毒复制增长倍数

SP 1～25倍的病毒复制增长倍数

P ＞25倍的病毒复制增长倍数

表2痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒载体在动物细胞中的扩散

细胞或细胞系	种类	组织	细胞形态	病毒在细胞中的扩散*
				病毒在细胞中的扩散*		pZCI	TT
				CEF293TBHK-21C6COS-7HeLaMDCKMRC-5PK(15)RK13Vero	Chick embryoHumanHamster，SyrianRatAfrican green monkeyHumanCanineHumanPigRabbitAfrican green monkey	pZCI	TT	AssortedKidneyKidneyBrain；glial cell；gliomaKidneyCervixKidneyLungKidneyKidneyKidney	FibroblastEpithelialFibroblastFibroblastFibroblastEpithelialEpithelialFobroblastEpithelialEpithelialEpithelial	+++++++++++++++++++++++++	+++++++++++++++++++++++++++++++++

^*以0.01MOI的病毒感染成片的动物细胞，分别在24、48和72小时终止感染，

对细胞进行免疫染色。细胞的扩散根据72小时内能够染色的细胞数：

- 72小时内没有细胞被染色

+ ＜5个细胞被染色

++ 5～25个细胞被染色

+++ ＞25个细胞被染色

3.具有更小的对细胞的毒性(Cytopathicity)

高感染复数(5.0MOI)下，减毒痘苗病毒pZCI在多数被测试的动物细胞中具有比野生天坛病毒更少的CPE，这表现在CEF、BHK-21、C6、MDCK、RK13、PK(15)和293T中；或者出现CPE的时间比野生天坛病毒更晚，如在人源化细胞HeLa中。表明减毒痘苗病毒比野生天坛病毒具有更低的对细胞的毒性。

在MRC-5和非洲绿猴肾细胞Vero、COS-7中，减毒痘苗病毒未显示与野生天坛病毒明显的细胞毒性的差异，它们在这三种细胞中均能形成与野生天坛病毒相似严重程度的CPE现象。

减毒痘苗病毒减小的细胞毒性还表现在噬斑的形成上。免疫染色的结果显示，在原代CEF、C6、MDCK及RK13中，野生天坛病毒均能产生明显的噬斑，尤其是在鼠的神经胶质瘤细胞C6细胞和兔肾细胞RK13中，野生天坛病毒在病毒感染的早期即能形成典型的噬斑，在病毒感染的48小时后，几乎所有的细胞都被感染并且大量脱落死亡；而减毒痘苗病毒pZCI在CEF、MDCK、C6和RK13细胞中均不形成明显的噬斑，只显示经免疫染色而形成的被病毒感染的Foci(CEF、MDCK、C6)或被感染的单个细胞(RK13)，表明减毒痘苗病毒对上述细胞的毒性明显减小。此外在293T和BHK-21中，pZCI形成噬斑的时间也比野生天坛病毒晚。

痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒pZCI在动物细胞中的CPE见表3。

表3痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒载体在动物细胞中的CPE^*

	pZCICPE		野生天坛病毒TTCPE
	pZCICPE		野生天坛病毒TTCPE		细胞系	12h	24h	12h	24h
CEF293TBHK-21C6COS-7HeLaMDCKMRC-5PK(15)RK13Vero	++-/++++++++++++++++++++	++++++/++++++++++++++++++++/++++++++++	++++++++++++++++++++++++++++++++++++++	+++++++++++++++++++++++++++++++++/++++++++++++	细胞系	12h	24h	12h	24h

^*以5.0MOI的病毒感染细胞，分别在12和24小时观察接种细胞中出现CPE的情况：

+ 接种细胞与未感染病毒的对照细胞没有区别

++ ＜25％的细胞出现CPE

+++ 25％～50％的细胞出现CPE

++++ 50％～75％的细胞出现CPE

安全有效的病毒载体必须具有稳定的生物学性状，其外源基因插入和表达的稳定性尤为重要。将已插入外源GFP基因(绿色荧光蛋白基因)的显著减毒痘苗病毒以0.01MOI在Vero细胞中进行连续六次传代。将第一代和第六代的减毒痘苗病毒感染Vero细胞，48小时后首先在荧光显微镜下对产生绿色荧光的噬斑进行计数，然后对培养皿中的感染细胞进行免疫染色，对显示病毒感染的噬斑再次进行计数，与产生绿色荧光的噬斑数进行比较。实验发现，经免疫染色观察到的噬斑与显示绿色荧光的噬斑数完全相同，表明外源基因(GFP)已稳定插入减毒痘苗病毒载体并可连续传代和表达。

减毒痘苗病毒中外源基因GFP插入的遗传稳定性

表4

病毒代数	显示绿色荧光的噬斑	免疫染色显示的噬斑	绿色荧光的噬斑/免疫染色的噬斑(％)
病毒代数	显示绿色荧光的噬斑	免疫染色显示的噬斑	绿色荧光的噬斑/免疫染色的噬斑(％)	P1P6	7783	7783	100100

将第一代和第六代的减毒痘苗病毒以5.0MOI感染Vero细胞，24小时后收获被感染的细胞和上清液，未感染的Vero细胞作为阴性对照。取相同体积的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜后经Western blot用抗GFP的抗体检测不同代数病毒GFP的表达产量。结果显示，六次传代前后GFP的表达量相似(见图3)。表明显著减毒载体可稳定表达插入的外源目的蛋白。

总之，显著减毒痘苗病毒在动物细胞中具有有限的宿主范围，在多数细胞中包括人源化细胞中显示了降低的繁殖复制能力，而且具有更低的细胞到细胞间的扩散水平，和/或具有更小的对细胞的毒性。减毒痘苗病毒在动物细胞中的这些特性将有助于控制病毒在目标动物或人体内的复制水平和扩散速度，降低病毒对生物体毒性，同时也为防止病毒在人群和环境中的随机扩散提供了有效的屏障。此外，本发明获得的显著减毒痘苗病毒载体还显示了外源基因插入和表达的高度稳定性，为该载体的进一步应用提供了有效的保障。

在一个优选实施方案中，本发明的减毒痘苗病毒载体还具有在体内显著减毒的体内特征。在体内减毒的特征包括：1)鼻腔接种途径(intranasal route，IN)的减毒；2)颅腔接种途径(intracranail route，IC) 的减毒。‘在体内减毒’是指，病毒可在SPF级别的近交系封闭群BALB/c小鼠中进行毒力测定，并且在通过鼻腔接种途径时，可以显著减少免疫小鼠体重的下降；在通过颅腔接种途径时，能显著降低免疫小鼠的死亡率。具体的特征如下：

1)鼻腔途径的减毒：

对5周龄的BALB/c小鼠分别接种10⁶PFU的野生天坛病毒、优选

改良天坛病毒pZCI，在10天的观察期内，可分别最多造成小鼠体重下降28.6％和13.7％。接种10⁵PFU的野生天坛病毒、优选改良天坛病毒pZCI，在观察期内，可最多造成小鼠体重下降19.2％和13.3％。表明改良天坛病毒pZCI经过鼻腔途径检测具有显著减毒的体内特性。

2)颅腔接种途径的减毒：

痘苗病毒是嗜神经病毒，颅腔接种可直接造成病毒对中枢神经系统的毒害，并可由此引起急性脑炎的发生，这是接种痘苗病毒引起的较为严重的并发症之一。因而小鼠颅内注射半致死剂量(IC LD₅₀)能很灵敏的反映病毒神经毒性的强弱。

对3周龄的BALB/c小鼠接种系列稀释的野生天坛病毒和改良天坛病毒，在两周(14天)的观察期内观察并记录各组小鼠的死亡率，按Reed-Muench方法计算颅腔途径的半数致死量IC LD₅₀。经测试，野生天坛病毒、改良天坛病毒pZCI的IC LD₅₀分别是10^3.46PFU(3.46Log₁₀单位)和10^5.89PFU(5.89 Log₁₀单位)，改良天坛病毒pZCI的LD₅₀比野生天坛病毒的增加了2.4Log₁₀单位，减毒病毒pZCI的神经毒性比野生天坛病毒下降约240倍。

由此，无论是鼻腔接种途径，还是颅腔接种途径，都证实改良天坛病毒pZCI在体内显著减毒的体内特性。因此，以上改良天坛病毒将是更为安全的载体，在进一步应用于新型药物或试剂的研制或活病毒载体疫苗的开发时，具有比野生天坛病毒更高的安全性。

总之，优选本发明的改良天坛病毒具有下述七种特性：

1)具有有限的宿主范围和在多数动物细胞中具有比野生天坛病毒更低的繁殖性复制能力；

2)在多数动物细胞中具有比野生天坛病毒更低的细胞到细胞间的扩散水平；

3)在多数动物细胞中具有比野生天坛病毒更小的对细胞的毒性；

4)在非洲绿猴肾细胞Vero和COS-7中具有与野生天坛病毒相似水平的复制能力、相似的细胞间扩散水平和相似的细胞毒性；

5)具有经鼻腔途径接种在体内显著减毒的体内特征；

6)具有经颅腔接种显示神经毒性比野生天坛病毒显著降低的体内特征；

7)减毒痘苗病毒载体同时具有外源基因稳定插入和表达的特征。

本发明的研究人员已知如何获得具有以上特征的显著减毒天坛病毒。获得显著减毒天坛病毒的方法包括以下的步骤：

1)构建穿梭质粒，该质粒包含痘苗病毒特异性的启动子序列(如pSYN和pH5)。该质粒含与痘苗病毒天坛株HA基因晚期启动子序列或其外侧序列同源的侧翼序列，该质粒侧翼序列间可插入异源核苷酸序列(如标记基因GFP)，并使其处于痘苗病毒启动子控制之下；

2)在痘苗病毒的允许细胞中(如Vero或CEF)使穿梭质粒与痘苗病毒天坛株同源重组(同源重组可使用脂质体转染试剂盒(Qiagen)进行转染，方法见试剂盒说明书)，以使痘苗病毒HA基因晚期启动子破坏，HA基因部分失去功能，达到对痘苗病毒进行显著减毒的目的；

3)通过筛选标记(如GFP的绿色荧光)，对重组病毒进行单斑筛选，以分离获得纯的显著减毒痘苗病毒；

对以上获得的减毒重组痘苗病毒可进一步进行细胞学和动物学的鉴定。

包括在动物细胞中分析确定重组病毒的复制特性，如病毒复制动力学曲线、病毒在细胞中的扩散速度、病毒在细胞中的CPE等，以验证重组病毒在细胞水平减毒。在动物模型中通过不同的接种途径，如鼻腔途径、颅内途径，分析鉴定重组病毒在动物体内的毒力，以验证重组病毒在体内减毒的特征。

术语“重组病毒”是指病毒基因组中含有至少一种“异源”的核酸序列，即通常并非与所述病毒密切相关的核酸序列的任意组合。

本研究发明的的减毒痘苗病毒载体可用于构建候选疫苗，预防和/或治疗人类或动物的传染性疾病；该减毒痘苗病毒载体还可进一步用于研制肿瘤基因治疗或预防的药物；该载体还可用作外源基因的表达载体，在大规模生产中更为安全；此外，减毒痘苗病毒可用于表达外源病原体抗原制备病原体检测和诊断试剂。

1.减毒痘苗病毒用于构建候选疫苗

1)构建含目的外源DNA序列的穿梭质粒，其两侧的侧翼序列与用于重组获得减毒痘苗病毒pZCI的穿梭质粒的侧翼序列同源，并使外源DNA序列处于痘苗病毒启动子的控制之下。

2)在痘苗病毒的允许细胞中(如非洲绿猴肾细胞Vero)使穿梭质粒与减毒痘苗病毒天坛株pZCI同源重组，使目的外源DNA序列替换减毒痘苗病毒pZCI中的标记基因(如GFP)，以使外源目的DNA序列插入到痘苗病毒的HA基因的预定位置。

3)在允许细胞(如Vero细胞)中筛选失去特定标记(如失去GFP荧光)的重组病毒，获得可表达目的外源DNA序列的显著减毒的重组病毒作为候选疫苗，用于预防和治疗人类或动物的传染性疾病。

2.减毒痘苗病毒用于构建基因转移的载体应用于肿瘤基因治疗

1)构建含外源DNA序列的穿梭质粒，其两侧的侧翼序列与用于重组获得减毒痘苗病毒pZCI的穿梭质粒的侧翼序列同源。该外源DNA序列可置于痘苗病毒启动子的调控之下，以保证需要表达的外源DNA序列能够有效表达。此外源DNA序列是能表达抑制或有助于杀死肿瘤细胞的DNA序列，也可以是不表达的外源DNA序列，与减毒痘苗病毒天坛株pZCI同源重组后获得显著减毒的痘苗病毒基因转移载体。

2)构建的穿梭载体在痘苗病毒的允许细胞中(如Vero细胞)与减毒痘苗病毒天坛株pZCI同源重组，使目的外源DNA序列替换减毒痘苗病毒pZCI中的标记基因(如GFP)，以使外源目的DNA序列插入到痘苗病毒基因组的预定位置，获得可表达抑制或有助于杀死肿瘤细胞成分的减毒痘苗病毒基因转移载体。

3)通过基因工程的方法，进一步使以上减毒痘苗病毒的胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因失活，产生TK-的重组减毒痘苗病毒。该重组病毒由于无法正常表达胸苷激酶，可高选择性的在分裂旺盛的肿瘤细胞中进行感染和复制(McCart，J.A.et al.，2001，Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virusmutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Research，61(24)，8751-7)，而在正常细胞中则由于病毒显著减毒而相对安全。由此该减毒痘苗病毒基因转移载体可高靶向性感染肿瘤细胞，抑制或杀死肿瘤细胞，而对正常人体组织则相对安全。

3.减毒痘苗病毒用作外源基因的安全表达载体

1)构建含目的外源基因DNA序列的穿梭质粒，其两侧的侧翼序列与用于重组获得减毒痘苗病毒pZCI的穿梭质粒的侧翼序列同源，并使外源目的DNA序列处于痘苗病毒启动子的控制之下。

2)在痘苗病毒的允许细胞中使穿梭质粒与减毒痘苗病毒天坛株pZCI同源重组，使目的外源DNA序列替换减毒痘苗病毒pZCI中的标记基因(如GFP)，以使外源目的DNA序列插入到痘苗病毒的HA基因的预定位置。

3)在允许细胞中筛选失去特定标记(如失去GFP荧光)的重组病毒，获得可表达目的外源DNA序列的显著减毒的重组病毒，用于外源目的蛋白的表达和生产。由于该载体显著减毒，因而在应用该载体表达外源基因进行目的蛋白大规模生产时将具有更高的安全性，可减少生产过程中对接触人员可能产生的潜在危害和对环境的污染。

4.减毒痘苗病毒用于表达外源病原体抗原制备病原体检测和诊断试剂

1)构建含目的外源基因DNA序列的穿梭质粒，其两侧的侧翼序列与用于重组获得减毒痘苗病毒pZCI的穿梭质粒的侧翼序列同源，并使要表达的外源病原体抗原的DNA序列处于痘苗病毒启动子的控制之下。

2)在痘苗病毒的允许细胞中使穿梭质粒与减毒痘苗病毒天坛株pZCI同源重组，使目的外源病原体抗原的DNA序列替换减毒痘苗病毒pZCI中的标记基因(如GFP)，以使外源病原体抗原的DNA序列插入到痘苗病毒的HA基因的预定位置。

3)在允许细胞中筛选失去特定标记(如失去GFP荧光)的重组病毒，获得可表达目的外源病原体抗原的显著减毒的重组病毒，用于外源目的蛋白的表达和生产。用于制备病原体的检测和诊断试剂。由于痘苗病毒载体系统比其它表达系统(如细菌或酵母)制备的产物具有更好的抗原性和免疫原性，因而用该载体的表达产物制备的检测和诊断试剂(检测病原体抗原或相应抗体)将具有更高的特异性和敏感性，可广泛用于畜、禽、水生生物和人的病原学、流行病学、诊断学及病原体感染的预防控制。同时，由于该减毒痘苗病毒载体显著减毒，因而在应用该载体表达外源基因进行目的蛋白大规模生产时将具有更高的安全性，可减少生产过程中对接触人员可能产生的潜在危害和对环境的污染。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1)对天坛株HA基因的遗传改造使得减毒痘苗病毒在动物细胞中复制降低、毒性下降，在模型动物体内显著减毒，因此无论是以该痘苗病毒载体构建疫苗，或作为肿瘤基因治疗载体，或用该载体大量表达外源蛋白将更为安全可靠。尤其是减毒痘苗病毒的神经毒性大幅下降，将增加该病毒作为载体使用的安全性，将有效防止被接种者或接触者发生痘苗病毒相关的并发症如脑炎等。此外，应用该载体表达外源基因进行目的蛋白大规模生产时将具有更高的安全性，可减少生产过程中对接触人员可能产生的潜在危害和对环境的污染。

2)痘苗病毒载体比其它类型的载体具有更大的外源基因容量，可插入总量达25Kb的外源基因；存在包括TK、HA在内的多个非必需区，因此可同时插入多种外源基因，实现多种有效抗原成分或生物成分的组合，提高疫苗免疫或肿瘤基因治疗的效果。

附图说明

图1：痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒在动物细胞中的复制动力学。细胞接种0.05MOI的不同病毒，分别在0、24、48和72小时收集病毒样品，在Vero细胞中测定病毒的滴度。

图2：痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒在动物细胞中的扩散。细胞接种0.01MOI的不同病毒，分别在24、48和72小时终止感染，对细胞进行免疫染色，观察病毒在细胞中感染和扩散的进程，并在倒置显微镜下拍照。

图3：减毒痘苗病毒载体中外源基因表达的稳定性。含外源基因GFP的P1代和P6代的显著减毒痘苗病毒以5.0MOI感染Vero细胞，24小时收获被感染细胞和上清。未感染的Vero细胞作为阴性对照。取相同体积的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜后经Western blot用抗GFP的抗体检测GFP的表达产量。

图4：痘苗病毒天坛株及减毒痘苗病毒在模型动物中的毒力(鼻腔途径)。5周龄的BALB/c小鼠，分别经鼻腔接种30ulPBS稀释的10⁶PFU的病毒(A)和10⁵PFU的病毒(B)，在10天的观察期内记录每天小鼠体重的变化。

图5：重组env减毒痘苗病毒在允许细胞Vero中的表达。分别以env重组痘苗病毒(A)和减毒痘苗病毒pZCI(B)感染Vero细胞(0.01MOI)，24小时后用来自艾滋病人的抗血清为一抗进行免疫染色。

具体实施方式

以下实施例将进一步举例说明本发明。

实施例1

在动物细胞中减毒痘苗病毒的复制动力学和病毒复制相关特性。

1)病毒在动物细胞中的复制动力学：

为了了解减毒痘苗病毒在动物细胞中的复制能力，选择了来自不同种类、不同组织的动物细胞，包括来自人的细胞系，进行了病毒复制动力学的研究实验。同时，在相同条件下研究了亲本病毒天坛株在这些细胞中的复制动力学曲线，以便能够与减毒痘苗病毒的复制特性进行比较。

比较的病毒为：显著减毒痘苗病毒pZCI，野生天坛痘苗病毒TT。所选择的动物细胞及其种类、来源和细胞类型见表1。其中原代鸡胚细胞CEF为自制细胞，尽管在本文中注明是原代，但在使用中为前三代的传代细胞。Vero和C6细胞引自中国科学院典型培养物保藏委员会(Type Culture Collection of ChineseAcademy of Sciences，CTCCCAS)；293T引自美国细胞培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)：COS-7、PK(15)、RK13、HeLa、MDCK、MRC-5和BHK-21引自中国典型培养物保藏中心(China Centerfor Type Culture Collection，CCTCC)。有关细胞的培养方法均按照美国ATCC和中国CCTCC的要求培养和传代。

以下以COS-7为例介绍传代细胞的培养：

细胞在含10％新生牛血清(NCS)的DMEM培养基中培养生长至成片(37℃，5％CO₂)，吸掉培养液，用PBS洗1次。加入适当体积的0.25％的胰酶消化细胞。待细胞回缩间隙变大、细胞开始从瓶壁脱落时加入新鲜的培养基，吹匀，按1∶3的比例分装到新的培养瓶中，置于37℃、5％CO₂的培养箱培养。

原代鸡胚细胞CEF的制备和培养方法如下：

取9～11天的鸡胚消毒后置于蛋架上，用剪刀敲开鸡胚的钝头，挑出壳膜，取出鸡胚置于无菌的平皿中，去除头、翅、腿、内脏等并剪碎。用不含血清的培养基洗两次，10mi注射器抽取鸡胚至成糜状。加100ml0.25％的胰酶(预冷)于37℃消化15分钟。纱布过滤，滤液加入10％终体积的NCS中止反应。纱布上剩余的组织碎片重复消化一次。合并滤液，1500rpm 4℃离心10分钟。弃上清，细胞沉淀用含10％NCS的培养基重悬，1500rpm离心10分钟。用含10％NCS的新鲜培养基重悬沉淀后分装到培养瓶，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。传代方法同COS-7细胞，在三代之前使用。

测定病毒在细胞中的复制动力学曲线的方法如下：

在感染病毒前约24小时将适量的不同细胞接于24孔板，待细胞长至单层，在备用孔中对细胞进行计数，去除培养基，按0.05MOI分别接入各种痘苗病毒，24孔板置于37℃培养箱吸附病毒90分钟。从培养板中移去上清，并用培养基洗脱未吸附的病毒。加入含3％胎牛血清(FBS，GIBCO)和1％双抗(青霉素、链霉素)的新鲜培养基DMEM、MEM，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。0小时的样品在完成病毒吸附后即收获，此后于24、48和72小时分别收取样品。细胞使用的培养基按其引入单位的要求，如美国ATCC和中国CCTCC或中国科学院CTCCCAS。收获的不同时间的病毒复制样品冻化三次，以释放病毒。收获的病毒在Vero细胞中测定滴度。

病毒的滴定：

在24孔板中接入Vero细胞，待长至单层(约24小时)后，吸出培养基，接入系列稀释的病毒样品，37℃吸附90分钟。吸附完成后从培养板中移去上清，并用培养基洗脱未吸附的病毒。加入新鲜的半固定培养基(2倍的MEM培养基(GIBCO)和1％的琼脂糖1∶1，培养基含终浓度为3％的新生牛血清NCS(GIBCO)及1％的双抗)，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养48～72小时。用结晶紫对感染细胞进行染色，冲去结晶紫和琼脂糖，对细胞中产生的噬斑计数，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度。

病毒在细胞中复制倍数的确定及细胞的分类：以病毒的72小时的滴度(PFU)除病毒的输入滴度(Input)，为病毒在该细胞中的繁殖复制倍数。参照Moss B的方法对细胞进行分类(Carroll，M.W.，and Moss，B.1997.Host rangeand cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus：propagation and generation of recombinant viruses in a nonhumanmammalian cell line.Virology 238(2)，198-211)，即：

非允许细胞(nonpermissive cell，NP)：＜1倍的病毒复制增长倍数，

半允许细胞(semipermissive cell，SP)：1～25倍的病毒复制增长倍数，

允许细胞(permissive cell，P)：＞25倍的病毒复制增长倍数。

野生天坛病毒和减毒痘苗病毒pZCI在动物细胞中的复制增长倍数详见表1，复制动力学曲线见图1。实验结果显示，11种动物细胞中，包括原代鸡胚细胞(CEF)，3种人类细胞(293T、Hela和MRC-5)，2种非洲绿猴肾细胞(Vero和COS-7)，2种鼠细胞(BHK-21和C6)及三种其它动物肾细胞(MDCK、PK(15)和RK13)，对于天坛病毒TT来说都是允许细胞。这个结果表明，天坛株具有极其广泛的宿主范围，可以在绝大多数动物细胞中很好地增殖。

测试的减毒痘苗病毒在动物细胞中显示了与野生TT极为不同的复制及生长特征，它们具有更小的宿主范围，在大多数测试细胞中都有程度不同的复制水平的下降。pZCI在RK13中丧失了繁殖性复制能力，但在MDCK中只丧失了部分的复制能力，MDCK是pZCI的半允许细胞。在另两种鼠细胞(BHK-21和C6)和猪肾细胞PK(15)中，pZCI的复制都受到了很大程度的限制，它在这些细胞中通常只能维持野生TT复制能力的1％～17％。尽管病毒复制增长倍数显示293T和MRC-5是减毒痘苗病毒复制的允许细胞，但减毒痘苗病毒在它们中的复制水平仍然显示了很大程度的降低，其中pZCI在293T中的复制倍数只有天坛株的36.8％，而在人胚肝细胞系MRC-5中的复制倍数只有天坛株的14.7％。在CEF、Hela和两种非洲绿猴肾细胞Vero、COS-7中，两种减毒痘苗病毒的复制能力未显示与野生TT有明显区别，以上四种细胞均能支持减毒痘苗病毒进行有效的复制。

2)病毒在动物细胞中的细胞毒性(CPE)及病毒在细胞中的扩散

在6孔细胞培养板中每孔接种不同细胞至形成单层(约需24h)，按0.01MOI的感染复数接结入病毒感染细胞，于细胞培养箱中吸附90分钟。从培养板中移去上清，并用培养基洗脱未吸附的病毒。补加含3％FBS和1％双抗的培养基，置于细胞培养箱中继续培养，分别于24、48和72小时取出细胞培养板，进行免疫染色。免疫染色方法如下：吸出培养板中的培养基上清，PBS洗一次。用1∶1的甲醇：异丙酮溶液固定细胞，加入按一定效价比例稀释的兔抗痘苗病毒血清(一抗)，室温下作用2小时。吸出一抗，用PBS洗一次，加入按一定效价比例稀释的二抗蛋白-A(HRP标记)，室温下作用1小时。吸出二抗，用PBS洗一次，然后用新鲜配制的染色液(10mlPBS+200ul邻苯茴香胺在100％乙醇的饱和溶液+15ul新鲜配制的H₂O₂)显色。待出现清晰的红棕色Foci，吸出显色液，用PBS终止显色反应，在倒置显微镜下用数码相机拍摄细胞扩散结果。病毒在细胞中的扩散按Moss B的方法分类，即72小时内被染色的细胞数：

- 没有细胞被染色，表明该细胞不能感染

+ ＜5个细胞被染色，细胞可以被感染，但仅有很低的扩散能力

++ 5～25个细胞被染色，在细胞中具有有限的扩散能力

+++ ＞25个细胞被染色，在细胞中具有较高的扩散能力

病毒在细胞中的扩散见附图2和表2。

病毒对细胞的毒性称为致细胞病变效应(CPE)。在进行免疫染色的同时观察了在低感染复数(0.01MOI)下细胞中出现CPE的情况及病毒在细胞中是否形成噬斑。此外，还观察了高感染复数下病毒对细胞的毒性。实验方法如下：在感染病毒前约24小时将适量的不同细胞接于24孔板，待细胞长成单层，去除培养基，按5.0MOI接入野生天坛病毒TT和改良天坛病毒pZCI，24孔板置于37℃培养箱吸附病毒90分钟。从培养板中移去上清，并用培养基洗脱未吸附的病毒。加入含3％胎牛血清(FBS，GIBCO)和1％双抗(青霉素、链霉素)的新鲜培养基，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。于12小时、24小时观察细胞中出现的CPE，在倒置显微镜下拍照。参照Moss B的方法，将病毒对细胞的毒性按CPE出现的程度分为五类：

- 接种细胞与未感染病毒的对照细胞没有区别

+ ＜25％的细胞出现CPE

++ 25％～50％的细胞出现CPE

+++ 50％～75％的细胞出现CPE

++++ ＞75％的细胞出现CPE

高感染复数下病毒在动物细胞中的CPE见表2。

免疫染色的结果显示，野生TT病毒在测试的11种动物细胞中都有很强扩散能力，可以迅速地从被感染的细胞扩散至邻近细胞，尽管它在部分细胞系中扩散稍慢，如在PK(15)、293T和Hela细胞中。还发现，野生天坛病毒不仅能在细胞中快速扩散，而且在大多数动物细胞中都能形成典型的噬斑，其中在Vero、COS-7、RK13、C6、MDCK中在感染的早期即能形成很大的噬斑。此外在高感染复数(5.0MOI)下，野生天坛病毒在所有测试的细胞中都显示了严重的CPE现象。

在多数动物细胞中优选的显著减毒痘苗病毒显示细胞间的扩散下降。其中显著减毒痘苗病毒pZCI在RK-13细胞中显示不具有扩散能力；在MDCK和PK(15)中仅具有很低的扩散能力；在另两种细胞C6和HeLa中具有有限的扩散能力，72小时内有少于25个细胞被感染。

减毒痘苗病毒pZCI仅在人胚肾细胞293T和非洲绿猴肾细胞Vero、COS-7中具有与野生病毒相似的扩散速度，表明Vero、COS-7和293T均能有效的支持野生天坛病毒及减毒天坛病毒的繁殖性复制和扩散。

高感染复数(5.0MOI)下，减毒痘苗病毒pZCI在多数被测试的动物细胞中具有比野生天坛病毒更少的CPE，这表现在CEF、BHK-21、C6、MDCK、RK13、PK(15)和人源化的细胞293T中；或者出现CPE的时间比野生天坛病毒更晚，如在人源化细胞HeLa中，表明减毒痘苗病毒比野生天坛病毒具有更低的细胞毒性。

在MRC-5细胞和非洲绿猴肾细胞Vero、COS-7中，减毒痘苗病毒未显示与野生天坛病毒明显的细胞毒性的差异，它们在这三种细胞中均能形成与野生天坛病毒相似严重程度的CPE现象。

减毒痘苗病毒减小的细胞毒性还表现在噬斑的形成上。免疫染色的结果显示，在原代CEF、C6、MDCK及RK13中，野生天坛病毒均能产生明显的噬斑，尤其是在测试细胞C6和RK13中，野生天坛病毒在病毒感染的早期即能形成典型的噬斑，在病毒感染的48小时后，几乎所有的细胞都被感染并且大量脱落死亡。而减毒病毒pZCI在CEF、C6、MDCK和RK13细胞中均不形成明显的噬斑，只显示经免疫染色而产生的被病毒感染的Foci(CEF、C6和MDCK)或被感染的单个细胞(RK13)，表明减毒痘苗病毒对上述细胞的毒性明显减小。此外在293T和BHK-21中，pZCI形成噬斑的时间也比野生天坛病毒晚。

实施例2

显著减毒痘苗病毒中外源基因插入和表达的遗传稳定性

安全有效的病毒载体必须具有稳定的生物学性状，其外源基因插入和表达的稳定性尤为重要。将显著减毒痘苗病毒(HA基因晚期启动子区已插入外源GFP基因)以0.01MOI感染单层Vero细胞，吸附90分钟后去除培养基，用含10％NCS的DMEM培养基洗细胞一次，补加含10％NCS的新鲜培养基于37℃、5％CO₂的培养箱中培养48小时，收获病毒感染的细胞和上清，冻化三次，样品在Vero细胞中测定病毒的滴度。然后以同样的MOI感染Vero细胞。以此方法使减毒痘苗病毒在Vero细胞中进行6次连续传代。将第一代和第六代的减毒痘苗病毒感染培养于350mm培养皿的Vero细胞中，48小时后首先在荧光显微镜下对产生绿色荧光的噬斑进行计数，然后对培养皿中的感染细胞进行免疫染色(方法见免疫染色)，对显示病毒感染的噬斑再次进行计数，与产生绿色荧光的噬斑数进行比较。实验结果见表4。实验发现，免疫染色显示的噬斑与显示绿色荧光的噬斑数完全相同，表明外源基因(GFP)已稳定插入减毒痘苗病毒载体并可连续传代，这为该载体的进一步应用提供了有效的保障。

将第一代和第六代的减毒痘苗病毒以5.0MOI感染Vero细胞，24小时收获感染细胞和上清，未感染的细胞作为阴性对照。将收获的样品于4000转离心10分钟，沉淀用PBS洗两次，重悬沉淀于PBS中，经-70℃和室温反复冻化三次后，样品保存于-70℃。取相同体积的不同样品经沸水浴3分钟后进行SDS-PAGE电泳分离蛋白(12％的分离胶，5％的浓缩胶)。得到分离的蛋白凝胶转移至NC膜，用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBST(含0.2％土温20的PBS缓冲液)室温封阻2小时。PBST洗膜后按1∶1000加入抗GFP的特异性抗体(BD公司)，室温作用2小时后洗膜。按1∶5000加入过氧化物酶标记的二抗(HRP标记的羊抗兔抗体)，室温作用1小时后洗膜。用DAB进行显色(9mlTris，1ml NiCl₂，6mg DAB，10ul H₂O₂)，待特异带显色后用PBS中止反应。结果显示，插入GFP的显著减毒痘苗病毒载体第一代和第六代病毒表达的GFP蛋白量相似。表明显著减毒载体可稳定表达插入的外源目的蛋白。

实施例3

在模型动物小鼠中减毒痘苗病毒载体和野生天坛病毒的毒性比较

为了鉴定减毒痘苗病毒在体内毒力减小的特性，采用BALB/c小鼠模型系统，通过鼻腔和颅腔两种不同的途径分别测定了显著减毒痘苗病毒pZCI及其亲本病毒野生天坛株TT在小鼠中的毒力。BALB/c小鼠系统是国际上广泛使用的动物模型系统，已被证实对痘苗病毒敏感(Betakova et al.，2000，The vaccinia virusA14.5L gene encodes a hydrophobic 53-amino-acid virion membrane proteinthat enhances virulence in mice and is conserved among vertebratepoxviruses.J Virol，74(9)，4085-92；Lee，M.S.et al.，Molecular attenuation ofvaccinia virus：mutant generation and animal characterization.J Virol，66(5)，2617-30；Zhang.W.H.et al.，Vaccinia virus F12L protein is required for actintail formation，normal plaque size，and virulence.J Virol，74(24)，11654-62)，被大量用于痘苗病毒的毒性和感染性实验。

1)鼻腔接种途径的毒力实验

将5周龄的BALB/c小鼠分组，每组5只，从鼻腔途径分别接种用PBS稀释的10⁶PFU和10⁵PFU的改良天坛病毒pZCI和野生天坛病毒；用相同体积的PBS(30ul)鼻腔接种另一组小鼠作为对照组。在连续10天的观察期中，每天测定小鼠的平均体重，并以小鼠平均体重相当于起始体重的百分比作纵坐标对观察天数作图。不同病毒在BALB/c小鼠中的毒性见图4，其中图4A为接种10⁶PFU剂量病毒对小鼠体重的影响，图4B为接种10⁵PFU剂量病毒对小鼠体重的影响。

接种任何一组病毒的小鼠在试验期间都没有死亡，但却出现了不同的体重变化。接种10⁶PFU TT病毒的小鼠发生严重的体重下降，到第九天时，体重减少约30％；在接种10⁵PFU TT的小鼠中体重减轻也十分明显，在接种后的第八天，体重下降了约20％。接种两种剂量的改良天坛病毒pZCI的小鼠，体重下降约为13％，显示pZCI在体内的毒性比野生天坛病毒明显下降(图4 A、B)。

2)颅腔接种途径的毒力实验

将3周龄的BALB/c小鼠分组，每组6只，从颅腔途径分别接种10ul用PBS系列稀释的纯化改良天坛病毒和野生天坛病毒。在注射24小时内死亡的小鼠不计入实验结果。在连续14天的观察期中，每天观察小鼠接种后的反应，并记录小鼠的死亡情况，用Reed-Muench方法计算病毒的半数致死剂量LD₅₀。

术语‘半数致死剂量’(LD₅₀)是指，导致50％实验对象死亡的接种病毒的剂量。通常用Reed-Muench方法计算，公式为：半数致死剂量(LD₅₀)＝50％感染率的高临界稀释度倒数的对数+距离比×稀释系数的对数，式中，距离比＝(50％的高临界感染率-50％)/(50％高临界感染率-50％的低临界感染率)。

野生天坛病毒、改良天坛病毒pZCI的IC LD₅₀分别是10^3.46PFU(3.46Log₁₀单位)和10^5.89PFU(5.89 Log₁₀单位)，改良天坛病毒pZCI增加LD₅₀2.4Log₁₀单位。由于痘苗病毒是嗜神经性病毒，有可能导致种痘后的急性脑炎等严重并发症，而颅腔接种则可直接造成病毒对中枢神经系统的毒害，因而小鼠颅内注射半致死剂量(IC LD₅₀)与病毒的神经毒性密切相关。颅腔途径接种病毒的实验结果表明，减毒病毒pZCI的神经毒性下降约240倍。

实验结果证实，无论是鼻腔接种，还是进行直接的脑内注射，显著减毒痘苗病毒pZCI在体内的毒性比野生TT显著下降，其神经毒性被证实大大低于野生天坛株。因此，以显著减毒痘苗病毒为载体构建活病毒载体疫苗，或将其用于癌症等基因治疗及药物开发将比野生天坛病毒具有更好的安全性。

实施例4

显著减毒痘苗病毒在构建安全的人用候选艾滋疫苗中的应用

自1985年中国首次报告艾滋病病例以来，艾滋病在中国的流行呈逐年上升趋势，到目前已进入艾滋病发病的快速增长期。迅速采取有效措施遏制HIV-1的扩散和对AIDS患者进行有效的治疗，是中国政府和医疗科研人员刻不容缓的责任。国外学者提出的高效抗逆转录病毒治疗能够有效地抑制HIV-1的复制和延长AIDS患者的寿命，然而其昂贵的费用使得发展中国家望而却步。与此同时，AIDS疫苗作为有潜力的预防手段而使全世界寄以厚望。曾作为预防天花病毒疫苗的痘苗病毒，由于其诸多的优点而被改造成活病毒载体表达外源基因或构建基因工程疫苗，预防和治疗多种人类和动物的传染性疾病。痘苗病毒天坛株曾在中国广泛使用，有着很好的免疫原性和相对安全的特征，但由于其仍保留一定的对生物体的毒性，可能引起包括脑炎在内的各种并发症，尤其是有可能对免疫抑制的人群，如艾滋病病人或HIV病毒携带者产生严重的影响，因而不适合直接用作构建疫苗的载体。

本发明的减毒痘苗病毒，由于破坏HA基因的晚期启动子而导致显著减毒，尤其是其神经毒性大为降低，使得该载体具有更高的安全性，可用于构建针对中国人群使用的艾滋病治疗或预防性疫苗。

1)对在华中地区流行的HIV-1进行分子流行病学调查，确定此地区的主要流行株为HIV-1泰国B亚型毒株(B’)(Su et al.，2003，HIV-1 subtype B′dictates the AIDS epidemic among paid blood donors in the Henanand Hubei provinces of China.AIDS，17(17)，2515-20)。

2)据此构建了代表华中地区流行株的全长分子克隆，以此为基础，克隆流行株中的相应基因作为外源目的基因，以构建针对该地区艾滋病流行的预防和治疗性疫苗。

3)构建含目的外源基因HIV-1包膜蛋白Env的DNA序列的穿梭质粒，位于其两侧的侧翼序列与用于重组获得减毒痘苗病毒pZCI的穿梭质粒的侧翼序列相同，并使外源DNA序列处于痘苗病毒启动子的控制之下。

4)在痘苗病毒的允许细胞中(如Vero)使穿梭质粒与减毒痘苗病毒天坛株pZCI同源重组，使env序列插入减毒痘苗病毒pZCI中替换出标记基因GFP。

5)在允许细胞Vero中反向筛选失去GFP荧光标记的重组病毒，获得可表达Env的显著减毒的重组病毒，并在Vero细胞中扩大和纯化。

6)env减毒重组痘苗病毒在允许细胞Vero中的表达：

将含env基因的减毒重组痘苗病毒以0.01MOI接种成片的Vero细胞，吸附90分钟，更换新鲜的含10％NCS的DMEM培养基继续培养24小时。按本文前述的方法进行免疫染色，其中一抗为艾滋病患者血清，从一名小于20岁的艾滋病患者血样中分离获得。在阴性对照实验中，用相同MOI的减毒重组痘苗病毒pZCI接种Vero细胞，以相同的艾滋病患者血清为一抗进行免疫染色。env重组痘苗病毒感染产生的噬斑均显示棕红色(图5A)，而重组痘苗病毒pZCI感染产生的噬斑不能被染色(图5B)。该结果表明，env已成功重组到减毒痘苗病毒的基因组中，并能有效表达。

7)在该重组病毒的其它非必须基因区可进一步用同源重组的方法插入其它一种或几种来自艾滋病中国流行株的基因或其它刺激机体免疫的有效成分的基因，构建不同组合的多价艾滋病候选疫苗，以提高疫苗的预防或治疗效果。

Claims

1、一种减毒痘苗病毒天坛株载体，痘苗病毒载体为减毒痘苗病毒TT.WHU.pZCl，CCTCC：V200416。

2、一种用于实现权利要求1所述的一种减毒痘苗病毒天坛株载体的制备方法，它包括下列步骤：

A、构建穿梭质粒，该质粒包含与痘苗病毒天坛株HA基因晚期启动子序列或其两侧序列同源的侧翼序列；

B、在痘苗病毒的允许细胞中使穿梭质粒与痘苗病毒天坛株同源重组，以使痘苗病毒HA基因晚期启动子失去功能，达到对痘苗病毒减毒的目的，获得具有以上特征的减毒痘苗病毒；

C、通过筛选标记，对重组病毒进行单斑筛选，以分离获得纯的减毒痘苗病毒。

3、一种HA基因晚期启动子功能缺失的减毒痘苗病毒天坛株载体在制备治疗或预防传染性疾病的疫苗中的应用。

4、一种HA基因晚期启动子功能缺失的减毒痘苗病毒天坛株载体在表达外源基因中的应用。