WO2015149387A1

WO2015149387A1 - 狂犬病病毒ctn-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法

Info

Publication number: WO2015149387A1
Application number: PCT/CN2014/075232
Authority: WO
Inventors: 郭采平; 王春华; 罗姗; 刘永娣; 容伟华; 李慧; 周维; 周兰贞; 田华; 张佩; 丁玉江; 黄伟荣; 吴开永; 张运佳; 王红冰; 王锦才; 吴恩应
Original assignee: 深圳市卫光生物制品股份有限公司
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2015-10-08
Also published as: CN103865888A; CN103865888B

Abstract

提供一种狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，包括如下步骤：将狂犬病病毒CTN-1V5株在vero细胞中连续传10代，得到CTN-1V15株；将CTN-1V15株在鸡胚中传1代，获得一代病毒；将该一代病毒在鸡胚成纤维细胞中进行传代，使其逐渐适应鸡胚成纤维细胞。还提供了一种利用狂犬病毒的鸡胚细胞适应株制备的灭活疫苗，该疫苗具有良好的免疫保护性，可用于生产纯化的人用狂犬病疫苗。

Description

狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法

[1] 技术领域

[2] 本发明涉及狂犬病疫苗领域，具体涉及将狂犬病病毒 CTN-1株适应于原代鸡胚成纤维细胞的方法。

[3] 背景技术

[4] 狂犬病病毒（Rabies virus, RV) 是高度嗜神经病毒，为弹状病毒科（

Rhahdo viridae)狂犬病病毒属 (Lyssa virus genus

) 中不分节段的单股负链 RNA病毒，能引起人兽共患的世界性传染病-狂犬病。据报道全世界每年因狂犬病的死亡人数约有 5. 5 万例，实际死亡人数应明显高于该统计数字（http : //www. worldrabiesday. org/) 。目前除日本、英国、夏威夷等少数国家和地区没有狂犬病发生以外，该病呈世界性分布。亚洲和非洲是人狂犬病发生最严重的地区，占全世界死亡总人数的 99% 。在正式报告狂犬病的国家中，印度每年有 3万人以上死于狂犬病，居首位；我国近 20 年每年统计到的死亡人数超过 3000例，居第二位（Yunpeng wang et al. , 2012. Journal of Appl ied Virology. 1 : 10-19) 。目前尚无法医治狂犬病，疫苗接种免疫是预防狂犬病的唯一有效途径。

[5] 狂犬病疫苗是由灭活或减毒的 RV制备。由于 RV是嗜神经性病毒，几乎对所有哺乳动物的神经组织都具有侵染性。世界上首次试用的狂犬病疫苗就是用 RV感染兔脊髓研制的，以后经兔脑、小鼠脑、羊脑等动物神经组织培养，制备疫苗。但由于该类疫苗效力低且存在严重的变态反应而被 WHO停用（林放涛等 . 1992. 狂犬病学 . 203-221 ； Mesl in F. X. et. al. , 1996. Laboratory techniques in rabies. 4^th ed. WHO. 223-313 ) 。 1958年 Kissl ing等将 RV街毒株和固定毒株在原代地鼠肾细胞中传代 (Kissing P. E. et al. , 1958. Proc. Soc Exp Biol Med. 98 : 223 -225 ) 。 20世纪 60年代以后用细胞制备疫苗有了很大发展，人们开始利用各种细胞来大规模生产狂犬病疫苗，特别是人二倍体细胞培养疫苗（HDCV ) 的研制 (Wiktor et al. , 1964. J Immunol. 93 : 353-366 ) 。由于不存在神经元组织，与之前的脑组织疫苗相比，组织培养疫苗不仅更安全，而且更有效。目前已批准若干种组织培养疫苗，其具有与 HDCV相当的疗效和安全性，例如纯化鸡胚细胞疫苗 ( PCEC) (Barth et al. , 1984. J Biol Stand. 12 : 29-64 ; Schgal et al. , 1993. J. Commun. Dis. 27 : 36-43 ) 和纯化 vero细胞狂犬病疫苗 (PVRV) (Suntharasamal et al. , 1986. Lancet. 2 : 129-131) 。

RV CTN-1株是 WHO和我国有关部门批准用于疫苗生产的毒株，由中国食品药品检定研究院建株和保存。 20世纪 80年代李宏玲等将 RV CTN-1株在 vero 细胞中培养进行适应传代，得到较高滴度的 CTN vero细胞适应株，可用于疫苗生产（李宏玲等 . 1989. 生物制品学杂志 . 2 : 22-25 ) 。董关木等进一步证实 RV CTN-1株可在 vero细胞内快速适应，滴度可到 7. 0 logLD₅。/ml以上，并可多次收获病毒培养液（董关木等 . 1995. 微生物学免疫学进展 . 23 : 82-85 ) 。目前已有多家生产单位应用 RV CTN-1株生产 vero细胞疫苗并取得生产文号和投产（俞永新 . 2008. 狂犬病和狂犬病疫苗 . 第二版：192-208 ) 。但 vero细胞基质为永生性传代细胞系，因此有必要检测终产品中的细胞残留 DNA ( Ref. 欧洲药典 . 2004. 中国药典

. 2010 ) ，因为其可能具有传递潜伏病毒和其他物质的风险。 WHO也规定人用制品的残留 DNA剂量应不超过 10ng (WHO Expert Committee on Biological Standardition. Recommendations inactivated rabies vaccine for human use produced in cel l substrates and embryonated eggs. Genava. WHO. 2005

Rudolph Barth等人（US

4115195 ) 描述了生产狂犬病疫苗的过程，其中多种 RV毒株均可利用鸡胚成纤维细胞 ( Chicken embryo fibroblast cel ls ， CEC)

制备狂犬病疫苗，如 VP11株、 Pasteur株、 PM株、 Flury LEP和 Flury HEP。他们在专利中具体提供了利用 RV固定株 VP11、 Flury LEP 和 Flury HEP感染 CEC 的实例。 PATEL Pradip Maganlal和 PATEL Pankaj

Ramanbhai (PCT/IN2008/000262 ) 描述了 Pitman moore株 (Wistar 株 PM-HDCS\1503-3M) 适应于 CEC，所得到的 RV毒株产量高且生产时间短，易于成规模生产。 1984年底我国的陈道民和林放涛择用 Flury ( LEP) 株 68代鸡胚固定毒（兽用活疫苗株）适应到 CEC培植人用狂犬病疫苗株，初步获得一株既能使用 CEC又具有与 a G株（3 ) 免疫原性相仿的狂犬病鸡胚细胞适应株 - 武汉（Wuhan ) 34株（陈道民等 . 1988. 中国人寿共患病杂志 . 4 : 28-30 ) 。但未见到有关该适应毒株进一步的报道。王远征等人也尝试将 RV aG株在 CEC上进行传代适应，得到滴度可达 7. 0 lgLD₅。/ml的毒株，但该毒株是否已完全适应于 CEC尚不确定（王远征等. 2012 . 中国生物制品学杂志. 25 : 669-671 ) 。迄今为止，还没有文献提及使 RV CTN-1株适应于 CEC。

[8] 发明内容

[9] 本发明要解决的技术问题是提供一种使狂犬病病毒 CTN-1株适应于原代鸡胚成纤维细胞的方法以及利用方法得到的 CTNCEC25株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。

[10] 本发明提供了狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，包括如下步骤：

[11] 步骤一：将 RV CTN-1V5在 vero细胞中连续传 10代，得到 CTN-1V15株。

[12] 步骤二：将 CTN-1V15株毒种在鸡胚中传 1代，获得的 RV CTN鸡胚一代病毒。

[13] 步骤三：将 RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞中进行传代，使其逐渐适应鸡胚成纤维细胞。

[14] 所述步骤一中，是用 pH7. 4的 PBS将 RV

CTN-1V5做 10倍系列稀释，然后按照 1 : 100 〜 1： 1000的比例接种 vero单层细胞， 37 °C吸附 60分钟后补加细胞维持液，置于 37 V 、 5% C0₂培养箱内静置培养，培养 4〜6天收获病毒上清液，如此连续传 10代，得到 CTN-1V15株。

[15] 所述步骤二中，是将0^-1¥15株毒种经 117. 4的？85经1 : 10〜1 : 1000稀释后，取病毒稀释液经卵黄囊接种 6〜7日龄的 SPF鸡胚，每胚 0. 5ml，置于 37〜39 °C、相对湿度 40〜80%的全自动孵蛋箱内进行孵育，孵育至 72〜144小时，收取濒临死亡但未死亡的胚胎，去除鸡胚的头后，将躯干研磨粉碎，并按照鸡胚重量加入病毒保护液制备成 10%的病毒悬液，然后 2000rpm、 4°C离心 10分钟，如此传一代获得 CTNCE01。

所述步骤三中，是将 CTNCE01用 pH7. 4的 PBS以 10°〜10 ⁴稀释后，按照接种比例 1 : 10〜1 : 5 10⁵与 5(悬液混合均匀，分装入细胞培养瓶内，置于 35〜37 °C、 5%C0 ₂培养箱内培养，培养至细胞出现病变收获病毒液，继续将病毒在 CEC悬液上按照上述培养条件进行传代，适应并稳定后得到 CTNCEC25株。

步骤三中传代所使用的培养基为以 199培养基为基础，补充牛血清、 HEPES和人血白蛋白，使牛血清的终含量为 3〜10%， HEPES终含量为 20mmol/L，人血白蛋白的终含量为 0. 3〜3%，并用 7. 5% 的碳酸氢钠溶液将 pH调节至 7. 4〜7. 8。步骤三中传代所使用的温度为 33〜36 °C。

步骤三中传代病毒接种的最佳 M0I为 0. 001〜0. 05FFU/ 细胞，收获病毒液的最佳时间为接种后 72〜96小时。

每一代毒种的病毒滴度均采用细胞荧光灶转化单位实验进行。

本发明还提供了上述 CTNCEC25株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。

本发明具有以下有益效果：

第一方面，本发明提供了 RV CTN-1株对 CEC的适应方法，通过该方法获得了一株 RV CTN鸡胚细胞适应株 -RV CTNCEC25株，该毒株能在 CEC上稳定增殖，并具有良好的稳定性和免疫保护性。

第二方面，本发明提供了一种合适的培养工艺，可使得 CTN株在 CEC中快速、高效地增殖。

第三方面，本发明提供了一种利用 RV鸡胚细胞适应株建立三级病毒种子库，制备的灭活疫苗，具有良好的免疫保护性，其浓缩纯化前原液效价即可到 5IU/ml ，可用于生产精制纯化人用狂犬病疫苗。

附图说明

图 1RV CTNCEC25株的传代历史。

图 2RV CTN-1株在 CEC上的早期病变现象。

图 3RV CTN-1株在 CEC上的后期病变现象。

图 4RV CTN-1株驯化过程中的病毒增殖趋势。

图 5RV CTNCEC25株稳定性考察代次的细胞病变现象。 [32] 具体实施方式

[33] 本发明提供了狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，如图 1 所示，包括以下步骤：

[34] 步骤一：将 RV CTN-1V5在 vero细胞中连续传 10代，得到 CTN-1V15株。

[35] 步骤二：将 CTN-1V15株毒种在鸡胚中传 1代，获得的 RV CTN鸡胚一代病毒。

[36] 步骤三：将 RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞（CEC) 中进行传代，使其逐渐适应 CEC。

[37] 本发明涉及在 CEC上适应 RV

CTN-1株，所采用的是 SPF级白来航鸡种蛋（简称 SPF级种蛋，来源：新兴大华农禽蛋有限公司，地址：中国广东省新兴县勒竹镇榄根温氏集团总部后山 SPF场，下同），驯化所采用的 RV CTN-1株来源于中国食品药品检定研究院，为 CTN-1 株 vero细胞 5代毒种，即 RV CTN-1V5株。 SPF种蛋和 RV CTN-1株是 WHO批准用于制造人狂犬病疫苗的基质和病毒株。

[38] 本发明所涉及的 CEC悬液的制备过程如下所示：

[39] 选用产出一周以内、形态正常、蛋壳厚薄均匀一致、无裂纹、蛋白浓稠的 SPF 级白来航鸡种蛋（来源：新兴大华农禽蛋有限公司，地址：中国广东省新兴县勒竹镇榄根温氏集团总部后山 SPF场，下同），放入 37〜39°C 、相对湿度 40 〜80%的孵蛋器内进行孵育，用检卵灯观察是否为受精卵及其活力。选用 9〜11 日龄、鸡胚发育正常、可见清晰的血管及活动的鸡胚。用 0. 2% (m/v) 新洁尔灭溶液浸泡 5分钟后捞出，气室向上置于蛋托上，然后用 2% (m/v) 碘酊和 75% ( v/ v) 酒精消毒后移入超净台内。用无菌镊子取出鸡胚，放入盛有 I X Hanks溶液的平皿内。去除鸡胚的头、内脏，放入灭菌广口瓶内，用无菌剪刀剪切成 l〜3m m³的组织块，按照每枚鸡胚 5〜8ml的量加入预热至 37°C的 0. 1% (m/v) 胰酶溶液，置于 37°C水浴箱内消化 15〜30分钟。消化完毕，加入 50〜250 ml细胞生长液 (以 199培养基为基础，添加终浓度为 3〜5% ( v/v) 的牛血清， 199培养基可购自北京清大天一科技有限公司，型号为 M199MD505, 下同。为区别后面的培养基，该培养基最终溶液标记为 M0 ) ，用无菌细胞吹打管吹打分散细胞得到细胞悬液。取 1. 0ml细胞悬液经磷酸盐缓冲液（PBS， pH7. 4，下同） 10倍稀释后与等体积 0. 4% (m/v) 台盼蓝混合均匀后，用血球计数板进行细胞计数，根据计数结果，调整细胞密度为0. 8〜1. 4 10⁶个细胞/1111的悬液，备用。

本发明所涉及的 PBS (pH7. 4) 的制备方法如下所示：

称取 8. 0

g氯化钠， 0. 2g氯化钾， 0. 27g磷酸氢二钾， 1. 42g磷酸二氢钠，加入 800ml注射用水充分搅拌混匀，然后加入 38%的浓盐酸调 pH至 7. 4，最后定容至 1000ml。经 1 21 °C、 15分钟灭菌后，室温保存备用。

以下将通过具体实施例进行详细说明：

实施例 1

以 CTN-1 V5株为母毒株，通过多条传代途径和工艺的比较筛选，发现按下列工艺路线传代获得的毒株能逐渐适应在鸡胚细胞中的生长，该狂犬病毒鸡胚细胞适应株被命名为 CTNCEC25 株。

步骤一：将 CTN-1V5株在 vero细胞上进行传代，以提高病毒滴度。

用 PBS (pH7. 4) 将 RV

CTN-1V5 (来源于中国食品药品检定研究院，为 CTN-1株 vero细胞 5代毒种）做 10倍系列稀释，然后按照 1： 100〜1： 1000的比例接种 vero单层细胞（来源于中国食品药品检定研究院， 121 代）

， 37°C吸附 60分钟后补加细胞维持液（以 199培养基为基础，添加终浓度 10% ( v /v) 的牛血清， pH7. 2〜8. 0 ) ，置于 37°C、 5%C0₂

培养箱内静置培养，培养 4〜6天收获病毒上清液，如此连续传 10代，得到病毒滴度可达 7. 51gLD₅。/ml以上的 CTN-1V15株。

步骤二：将 CTN-1V15株毒种在鸡胚中传 1代，获得的 RV CTN鸡胚一代病毒。随后将获得的 CTN-1V15株毒种经 PBS (pH7. 4) 1： 10〜1： 1000稀释后，取病毒稀释液经卵黄囊接种 6〜7日龄的 SPF鸡胚，每胚 0. 5ml，置于 37〜39°C、相对湿度 4 0〜80%的全自动孵蛋箱内进行孵育，逐日观察（24小时内死亡的接种胚记为非特异性死亡），孵育至 72〜144小时，收取濒临死亡但未死亡的胚胎，去除鸡胚的头后，将躯干研磨粉碎，并按照鸡胚重量加入病毒保护液（以 199培养基为基础，添加终浓度 20% ( v/v) 牛血清， pH7. 2〜8. 0 ) 制备成 10% (m/v) 的病毒悬液，然后 2000 rpm (Revolutions Per Minute, rpm) 、 4°C离心 10分钟，取上清按照 1. 0ml/支分装至专用冻存管，取样进行病毒滴度测定，如此传一代，获得 RV CTN鸡胚一代病毒即 CTNCE01 , 检测其滴度为 5. 21gLD₅。/ml。

步骤三：将 RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞（CEC) 中进行传代，使其逐渐适应 CEC。

将步骤二获得的 RV CTN鸡胚一代病毒（CTNCE01 ) 用 PBS (pH7. 4) 适宜稀释后

( 10°〜10 ⁴) ，按照不同的接种比例（1 : 10〜1 : 5 X 10⁵) 与前述制备好的 CEC悬液（M0，细胞密度为0. 8〜1. 4 10⁶个细胞/1111 ) 混合均匀，分装入细胞培养瓶内，置于 35〜37°C、 5%∞₂培养箱内培养。培养至细胞出现病变（主要表现为病变细胞聚集，圆缩，更快老化与脱落，见图 2) 收获病毒液，

继续将病毒在 CEC上按照上述培养条件进行传代。

传代过程中采用倒置显微镜观察接种病毒后的细胞的形态变化，结果发现随着传代次数的增加，病毒在细胞上的病变渐渐增强，病变的细胞逐渐出现疏松、空泡、胞质浓缩、胞浆中细胞器大量破坏甚至溶解的现象（见图 3) ，有别于初期病变细胞只是聚集、圆缩的现象。

同时采用细胞荧光灶转化单位实验（Fluorescence Focus Units Assay, FFU ，具体操作如下）对每一代毒种均取样测定病毒滴度。结果表明， RV CTN开始不能良好复制，传四代后，病毒滴度降至最低（4. 51gFFU/ml ) ，但随后病毒滴度开始缓慢上升，传至 20代后，滴度升高并稳定至 6. 0 lgFFU/ml (结果详见图 4) 。

细胞荧光灶转化单位实验（Fluorescence Focus Units Assay, FFU) 测定病毒滴度：

①将待测病毒样品用 PBS先进行 10倍系列稀释，再进行 3倍系列稀释。然后取 50 μ 1稀释后的病毒液接种 50 μ 1细胞密度为 1 X 10⁶个细胞 /ml的 BSR细胞（来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所， 25 代）。混合均匀后置于 37°C

， 5%C0₂培养 24小时。

②丙酮固定及染色

a. 上述培养 24小时后，倒弃上清液，用 PBS (pH7. 4) 洗涤一遍。 [57] b. 每孔加入 50μ1 80% (ν/ν) 冷丙酮，置于 -20°C固定 30分钟。

[58] c. 每孔加入 50 μΐ

FITC标记的抗狂犬病病毒抗体（Millipore公司， Cat. NO.5100) ，置于 37°C孵育 30分钟，倒去抗体溶液。

[59] d. 用 PBS洗涤三遍，甩干，每孔加入 50 μΐ 80% (ν/ν) 甘油，直接置于荧光显微镜下观察每个稀释度的荧光灶数目。

[60] e. 取〉 10个和 <10个荧光灶的相邻两孔稀释度的数据按照下列公式计算结果

[61] 待测样品滴度（lg FFU/ml) =lg{[ (高稀释度的荧光平均数 X3+低稀释度的荧光平均数） ]/2X低稀释倍数 X 1000/50}

[62] 表 1

[Table 1]

备注：表格空白处表示荧光灶数目过多或者过少，无需记取。

根据表 1 中结果进行滴度的计算方法如下：

l#滴度（lgFFU/ml) =lg{ [ (8+9) /2] X 3+ (17+12) /2} /2 X 10² X 9 X 1000/50} =5.56

2#滴度（lgFFU/ml) =lg{ [ (8+6) /2] X 3+ (25+29) /2} /2 X 10³ X 27 X 1000/50} =7.11

实施例 2

按照实施例 1步骤三的条件连续传至 28代，得到 RV CTNCEC25株 28代毒种。如果按照上述条件继续传代，发现病毒滴度并未随着传代代次的增加而继续上升（滴度徘徊在 6. 0〜6. 51gFFU/ml左右），因此为进一步提高所获得的毒株的滴度，本发明从培养基配方、培养温度、 M0I、 pH值等方面进行工艺优化，优化后的工艺可将毒株的滴度提高至 7. OlgFFU/ml以上。优化后的工艺参数如下：确定培养基配方：以 199培养基为基础，补充适量 HEPES ( 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 ) 、牛血清和人血白蛋白，使 HEPES ( 4-羟乙基哌嗪乙磺酸）的终含量为 20mmol /L，牛血清的终含量为 3〜10% ( v/v) ，人血白蛋白的终含量为 0. 3〜3% (m/v ) ，并用 7. 5% (m/v) 碳酸氢钠溶液将 11调节至7. 4〜7. 8。

病毒接种 M0I为 0. 001〜0. 05FFU/细胞。

病毒培养温度为 33〜36°C。

收获病毒液的最佳时间为接种后 72〜96小时。

具体操作如下：

(1)培养基配方的选择

a.培养基组合 1 (Ml ) ：以 199培养基为基础，补充适量牛血清、 HEPES, 使牛血清的终含量为 3% ( v/v) ， HEPES终含量为 20mmol/L，并用 7. 5% (m/v) 碳酸氢钠溶液将 pH调节至 7. 4〜7. 8。

b. 培养基组合 2 (M2 ) ：以 199培养基为基础，补充适量 HEPES、牛血清、人血白蛋白，使 HEPES的终含量为 20mmol/L，牛血清的终含量为 3% ( v/v) ，人血白蛋白终含量为 0. 3% (m/v) ，并用 7. 5% (m/v) 碳酸氢钠溶液将 pH调节至 7.

4〜7· 8。

c.培养基组合 3 (Μ3 ) ：以 199培养基为基础，补充适量 HEPES、牛血清、人血白蛋白，使 HEPES 终含量为 20mmol/L，牛血清终含量为 10% ( v/v) ，人血白蛋白终含量为 3% (m/v) ，并用 7. 5% (m/v) 碳酸氢钠溶液将 pH调节至 7. 4〜7. 8。试验选用连续传代获得的 RV CTNCEC25株 28代毒种（M0培养基培养）病毒作为传代毒株，均采用 1 : 5000的接种比例与制备好的 CEC悬液（除采用不同培养基外按照如前所述方法制备 CEC悬液，细胞数量调整为 0. 8〜1. 4 X 10⁶个细胞 /ml ) 混合均匀，然后将已感染病毒的细胞悬液接种于细胞培养瓶或细胞工厂中，置于 3 3〜35 V 、 5%C0₂环境中培养。培养至 80%以上的细胞出现病变收获病毒液，即得到该培养基的第一代，以该毒液按同等条件继续传代，收获的病毒液为该培养基的第二代，三种培养基组合均如此平行连续传代 3代，实验重复 2次。

[79] 各代次病毒液均利用 FFU法测定病毒滴度，评估三种培养基的病毒培养效果。

结果如表 2所示：

[80] 表 2

[81] [Table 2]

[82] 从表中滴度测定的结果可以看出，与 Ml相比，采用 M2和 M3培养 RV，连续传三代后，病毒滴度明显提高并稳定至 7. 01gFFU/ml以上。

[83] 同时进行 T-检验分析，看三种培养基对于 RV培养的差异性。将表中数据输入 Ex eel表中，计算出 Ml与 M2的 p值为 0. 001， t值为 5. 96。 p <0. 05， t > t₀._{05 (6)} ( t₀.₀₅ ₍₆₎ =2. 447 ) ，证明 Ml与 M2也具有显著差异。 Ml与 M3的 p值为 0. 002， t值为 5. 15。 p <0. 05, t> t₀.₀₅ (6) , 证明 Ml与 Μ3也具有显著差异。 M2与 M3的 p值为 0. 88， t值为 0. 16。 p〉0. 05， t < t₀._{05 (6)} , 证明 M2与 M3没有明显差异。因此以 199培养基为基础，补充牛血清、 HEPES和人血白蛋白，使牛血清的终含量为 3〜 10%， HEPES 终含量为 20mmol/L，人血白蛋白的终含量为 0. 3〜3%，并用 7. 5%的碳酸氢钠溶液将 pH调节至 7. 4〜7.8的培养基为优化后的培养基。

[84] (2) 适宜的培养温度

[85] 温度 1 (Tml) ： 37°C培养 2天，转 32°C继续培养至 80%以上的细胞出现病变收获病毒液（第 4〜5天）收获。

[86] 温度 2 (Tm2) ： 33°C培养至 80%以上的细胞出现病变收获病毒液（第 4〜5天）收获。

[87] 温度 3 (Tm3) ： 36°C培养至 80%以上的细胞出现病变收获病毒液（第 4〜5天）收获。

[88] 按照上述步骤制备 CEC细胞，以实施例 1获得的 RV CTNCEC25株 28代毒株为传代毒种， CEC悬液的制备采用 M2培养基，置不同温度的 5%∞₂培养箱内培养，培养至 80%以上的细胞出现病变收获病毒液（第 4〜5天）收获病毒液，即为该温度条件下的第一代，再以该病毒液为种，连续传代三代。实验重复 2次。

[89] 利用倒置显微镜评价细胞的附着和生长，发现前期培养温度高， CEC贴壁速率、铺展速率及生长速率均优于低温培养下的细胞，表明前期温度高利于细胞生长。

[90] 采用 FFU法检测病毒滴度，评估不同温度下的病毒培养效果。结果如表 3所示：

[91]

[Table 3]

[92] 从表中滴度测定的结果可以看出，与 Tml相比， Tm2和 Tm3更有利 RV在原代 CEC上增殖，其连续传三代，每一代的病毒滴度均在 7. 0 lgFFU/ml以上。

[93] 同时进行 T-检验分析，看不同培养温度对于 RV培养的差异性。将表中数据输入 Excel表中，计算出 Tml与 Tm2的 p值为 0. 002， t值为 5. 04。 p<0. 05, t〉t₀._{05 (6)}

( t₀.05 ₍₆₎ =2. 447) ，证明 Tml与 Tm2具有显著差异。 Tml与 Tm3的 p值为 0. 001， t值为 3. 80。 p<0. 05， t>t₀._{05 (6)} , 证明 Tml与 Tm3也具有显著差异。 Tm2与 Tm3的 p值为 0. 66， t值为 2. 15。 p>0. 05, t<t₀._{05 (6)}，证明 Tm2与 Tm3没有显著差异，也就是说采用 33〜36°C培养 RV均可得到满意的病毒滴度。

[94] ( 3) 最佳 M0I和最佳收获时间以实施例 1获得的 RV CTNCEC25株 28代毒株为传代毒种，用不同数量的 RV感染 CEC悬液（除培养基不同外按照如前所述制备 CEC悬液，其细胞数量调整为 0. 8 X 10⁶个细胞 /ml ) ，病毒接种 MOI Multiple of infection, MOI ) 分别为 0· 1、 0. 05、 0. 01、 0. 001、 0. 0001和 0. 00001FFU/细胞。所有试验组 CEC悬液的制备均采用培养基 M2，并置于 33〜36°C、 5%C0₂ 培养。实验重复 2次，采用 FFU法评估不同接种量和不同培养时间的病毒培养效果。结果如表 4所示，其显示了病毒初始接种量对病毒最终产量的影响 _t

[95] 表 4

[Table 4]

MOI 培养时间平均病毒滴度（lg MOI 培养时间平均病毒滴度（lg

(FFU/细 (h) FFU/ml ) (FFU/细 (h) FFU/ml ) 胞）上清液细胞胞）上清液细胞

0. 1 4 4. 81 2. 91 0. 05 4 3. 97 2. 53

8 4. 74 3. 08 8 3. 55 2. 76

12 4. 45 3. 12 12 3. 73 2. 71

16 4. 35 3. 48 16 3. 30 2. 85

20 4. 23 4. 27 20 3. 46 3. 88

24 4. 35 5. 23 24 3. 85 4. 72

36 4. 98 5. 23 36 5. 03 5. 60

48 5. 55 5. 48 48 5. 98 6. 14

72 7. 50 6. 94 75 7. 40 6. 84

96 7. 41 7. 07 96 7. 66 7. 29

120 7. 01 7. 06 120 7. 37 7. 03

144 6. 5 6. 47 144 6. 93 6. 31

168 1 1 168 5. 94 5. 80

0. 0001 4 0 0 0. 00001 4 0 0

8 0 0 8 0 0

12 0 0. 89 12 0 0

16 0. 78 0. 95 16 0 0

20 0. 89 1. 83 20 0 0

24 2. 08 2. 17 24 0 0

36 2. 65 2. 84 36 0 2. 13

48 4. 32 5. 23 48 2. 62 3. 30

72 5. 50 5. 81 72 4. 91 5. 09

96 5. 50 5. 71 96 5. 00 5. 35

120 5. 66 6. 11 120 4. 95 5. 74

144 5. 71 5. 81 144 5. 12 5. 91

168 5. 60 5. 82 168 4. 62 5. 53

[96] 备注：表中' I '表示细胞完全脱落，没有样品。表中数据均为 2次平行试验结果的平均数值。

[97] 从表中可以看出，采用 M0I=0. 001〜0. 1FFU/细胞将 RV接种于 CEC进行感染，均可在 96〜120h得到滴度 7. 01gFFU/ml以上的病毒收获液。但是从前期 RV CTNCEC 病毒在 CEC上的复制周期结果来看，接种 M0I越大，前期上清液中残留的病毒就越多，因此病毒接种的最佳 M0I为 0. 001〜0. 05FFU/细胞，收获病毒液的最佳时间为接种后 72〜96小时。

[98] 实施例 3

[99] 本实施例提供了利用 CTNCEC25株进行原始种子批毒种、主种子批毒种和工作种子批毒种的制备。

[100] 原始种子批毒种的制备：将实施例 1得到的 CTNCEC25株 28代毒种为起始，利用实施例 2优化的工艺参数，采用培养基 M2，细胞数量0. 8〜1. 4 10⁶个细胞/1111及 0I=0. 01FFU/ 细胞接种，置于 33〜36°C、 5%C0₂培养箱内培养，培养 72〜96小时 (细胞病变 80%左右）收液，连续传 5代至 CTNCEC25株 33代，将病毒上清和底层细胞一起混合后进行收获，加入牛血清（终浓度 20%， v/v) 、人血白蛋白（终浓度 1〜2%， m/v) 、蔗糖（终浓度 3〜5%， m/v) 、明胶（终浓度 0. 5〜1. 0%， m/ v) ，混合均匀后按照 1. 0ml/支的量分装后，经低温冷冻干燥即为原始种子批毒种。

[101] 主种子批毒种的制备：取原始种子批毒种用 PBS溶液（pH7. 4) 复溶后，按上述条件连续传 3代，将 CTNCEC25株 36代病毒上清和底层细胞一起混合后进行收获，收获的病毒液加入牛血清（终浓度 20%， v/v) 、人血白蛋白（终浓度 1〜2%， m/ V ) 、蔗糖（终浓度 3〜5%， m/v) 、明胶（终浓度 0. 5〜1. 0%， m/v) ，混合均匀后按照 1. 0ml/支的量分装后，经低温冷冻干燥即为主种子批的毒种。

[102] 工作种子批毒种的制备：取主种子批毒种用 PBS溶液（pH7. 4) 复溶后，按上述条件连续传 4代，将 CTNCEC25株 40代病毒上清和底层细胞一起混合后进行收获，收获的病毒液按照终浓度 20% ( v/v) 的比例加入牛血清，混和均匀即为工作种子批的毒种。

[103] 采用 FFU法测定病毒感染性滴度。结果表明本发明制备的原始种子批毒种、主种子批和工作种子批毒种的感染性滴度分别为 6. 971gFFU/ml、 6. 801gFFU/ml和 7 • 591gFFU/ml。

[104] 按照 2010年版《中国药典》相关要求对三级病毒种子进行质量检测，结果符合药典要求（见表 5)。

[105] 表 5

[Table 5] 种子库检定项目标准规定检定结果原始库病毒滴定（IgFFU/ ^6. 5 6. 97 ml ) 鉴别试验中和指数 500 1381 无菌检査应无菌生长符合规定支原体检査（培养应无支原体生长符合规定法）

支原体检査（DNA 阴性符合规定染色法）外源因子检査（细阴性符合规定胞培养法）

外源因子检査（鸡阴性符合规定胚检査法）外源因子检査（动小鼠、乳鼠未出现符合规定物法）病毒免疫原性检査感染 53703 保护指数 100

主库病毒滴定（IgFFU/ ^6. 5 6. 80 ml ) 鉴别试验中和指数 500 5841 无菌检査应无菌生长符合规定支原体检査（培养应无支原体生长符合规定法）

支原体检査（DNA 阴性符合规定染色法）

外源因子检査（细阴性符合规定胞培养法）

外源因子检査（鸡阴性符合规定胚检査法）

外源因子检査（动小鼠、乳鼠未出现符合规定物法）病毒

免疫原性检査感染 61659

保护指数 100

工作库病毒滴定（lgFFU/ ^7. 0 7. 59

ml ) 鉴别试验中和指数 500 5422 无菌检査应无菌生长符合规定支原体检査（培养应无支原体生长符合规定

法）

支原体检査（DNA 阴性符合规定染色法）

外源因子检査（细阴性符合规定胞培养法）

外源因子检査（鸡阴性符合规定胚检査法）

外源因子检査（动小鼠、乳鼠未出现符合规定

物法）病毒

*免疫原性检査感染 63075 保护指数 100

[106] 备注： *表示可选择的检定项目。

[107] 实施例 4

[108] 按照 2010年版《中国药典》和国家食品药品监督管理局下发的《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》用于疫苗生产的毒种在传代的过程必须考察其生物学特征的稳定性和遗传稳定性，为毒种的传代限定次数提供依据。

[109] 取工作种子批毒种（即 CTNCEC25株 40代毒种）继续按上述实施例 3方法连续传至 60代。

[110] 采用倒置显微镜观察接种病毒后的细胞形态变化，与其原始批毒株进行比较。

结果发现工作种子批毒种继续传代得到的病毒接种 CEC，培养至 72小时，细胞病变现象与其原始批毒株性状一致（图 5 ) 。 [111] 通过 FFU法检测其病毒感染性滴度，结果发现连续传至 60代， RV CTNCEC25株在 CEC的感染性滴度仍能稳定在 7. 01gFFU/ml (见图 4) 。

[112] 参照 2010版《中国药典》对传代稳定性考察代次的毒种进行免疫原性测试。结果如表 6所示：

[113] 表 6

[114] [Table 6]

[115] 从上表可以看出， RV CTNCEC25株工作种子批毒种继续在 CEC上传代得到的病毒免疫保护指数均能达到 2010年版《中国药典》的'保护指数不低于 100 '的规定，表明 40代以后的毒株也具有良好的免疫保护性。

[116] 采用分子生物学的方法对其主要抗原蛋白（G蛋白）的遗传稳定性进行考察。

根据 NCBI网站 Genbank公布的 RV CTN-1株的序列，设计 RV CTNCEC25株 G蛋白特异性测序引物（引物序列为 CTN-MGL-F1 Sequence (5 ' to 3 ' )：

CGTACTCTAGTGACTCGTAA ； CTN- MGL- R (5 ' to 3 ' )： ATCTTGCGTAGAAAGTTCAT ) ，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

[117] 利用 RT-PCR的方法扩增该毒株的 G蛋白基因序列，进行序列测定和拼接（由北京六合华大基因科技股份有限公司完成），使用 DNAStar软件中的 MegAl ign工具对 RV CTNCEC25株各代次与 RV CTN-1株 G基因序列进行分析，结果如表 7所示：

[118] 表 7

[119] [Table 7]

[Table 8]

[120] 从上表的结果可以看出 RV CTNCEC25株在 CEC上连续传至 60代其 G蛋白完全没有变异，与其原始种子批毒种保持一致，表明该毒株具有良好的遗传稳定性。

[121] 综合以上结果显示 CTNCEC25株在 CEC上连续传至 60代获得的毒株均具有稳定的生物学特性和主要抗原蛋白基因遗传性，且免疫保护性良好，表明我们建立的 c

TNCEC25株三级病毒种子库是合适的。

[122] 实施例 5

[123] 1.用预定的工作种子批毒种连续制备三批原疫苗。

[124] 以 M0I=0.01FFU/细胞的接种量将 RV CTNCEC25株工作种子批病毒（SPCTNCEC25 株 40代毒种）接种于 CEC悬液（按照实施例 1所述制备 CEC悬液，培养基更换为 M2 或 M3，其细胞数量调整为 0.8〜1.4X10⁶个细胞 /ml) 中，混合均匀后分装于细胞瓶或细胞工厂，然后置于 33〜36°C 、 5%C0₂培养。

[125] 待 80%以上的细胞出现病变即可收获病毒上清液，收获的病毒上清液经针孔式过滤器（Φ0.60μπι， Millipore公司）过滤澄清后，加入 β_丙内酯，使其与病毒悬液的最终比例达到 1:4000 ( ν/ν) ，充分搅拌混匀后，置于 2〜8°C孵育至少 24小时，以确保充分灭活病毒的感染性而不丧失病毒的抗原性。 24小时后将已充分灭活的病毒液置于 37°C放置 2小时，充分水解病毒液中残余的 β_丙内酯，即得到待测疫苗，保存于 2〜8°C，以备疫苗效价和血清抗体水平检测。

[126] 2.采用 NIH法对待测疫苗的效价进行检测，以评估其免疫保护性。

[127] 按照狂犬病实验室技术（Laboratory Technologies for Rabies, WHO, 1996 ) 和 2010年版《中国药典》进行。通过比较保护小鼠免受致死量脑内狂犬病毒侵袭所需的实验疫苗剂量与给予相同保护所需的相应参考疫苗（中国食品药品检定研究院，批号 250009-201108， 6.6IU/ 剂）来确定狂犬病原疫苗的效价。

[128] 将参考疫苗用 1.0ml无菌注射用水重溶后，用 PBS对其进行 5倍梯度稀释，最终取稀释度范围为1:25〜1:3125 (即上述 4种稀释度，分别指 1:25、 1:125、 1:625 、 1:3125，下同）进行小鼠免疫。

[129] 制备好的待测疫苗也用 PBS进行 5倍梯度稀释，最终取稀释度范围为1:25〜1:31 25进行小鼠免疫。

[130] 取稀释后的参考疫苗和待测疫苗，通过腹腔途径对小鼠进行初次免疫，每个稀释度至少 16只小鼠，每只小鼠 0.5ml疫苗稀释液。初免后 7天，按照初次免疫接种的步骤和量对小鼠进行二次免疫。初次免疫后 14天，用含 5〜100LD₅。的 CVS病毒悬液（来源于中国食品药品检定研究院，初始为 CVS-8, 经小鼠脑内传 2代，即 CVS-10) 对免疫后的小鼠进行脑内攻击。脑内攻击后逐日观察 14天， 3天内死亡小鼠记为非特异性死亡。通过 Reed-Muench法进行计算效价。发现：

[131] 所述待测疫苗和参考疫苗的实际 ED₅。值均在给予实验动物的最高和最低剂量之间。

[132] 所述 CVS株病毒悬液的攻击量为 10LD₅。/0. 03ml，接受该攻击量病毒悬液的所有实验动物均出现死亡。

[133] 测试疫苗的效价按照下列公式进行计算：

[134] 测试疫苗相对效力 P= (T/S) X d_T/d_s X D

[135] 其中上述公式中 P 为待测疫苗效价， IU/ml

[136] T为待测疫苗 ED₅。的倒数；

[137] S为参考疫苗 ED₅。的倒数；

[138] d_T为待测疫苗的 1次人用剂量， ml ;

[139] d_s为参考疫苗的 1次人用剂量， ml ；

[140] D为参考疫苗的效价， IU/ml。

[141] 最终结果如表 8所示：

[142] 表 8

[143] [Table 9]

[144] 从上述实验可以得知，待测疫苗的平均效价是 5. 39IU/ml，每

一检测中应用的 CVS株病毒攻击剂量均在 5〜100 LD₅。之间。每一次检测中应用的参考疫苗的实际 ED₅。均处于最高和最低稀释度之间。因此可得出结论认为，该疫苗具有免疫保护性，且 NIH效价高于 WHO和中国现行版药典的质量标准 2. 5IU/

[Table 10]

Claims

权利要求书

[ 1] 狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：将 RV CTN-1V5在 vero细胞中连续传 10代，得到 CTN-1V15株。步骤二：将 CTN-1V15株毒种在鸡胚中传 1代，获得的 RV CTN鸡胚一代病毒。步骤三：将 RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞中进行传代，使其逐渐适应鸡胚成纤维细胞。

[2] 根据权利要求 1所述的狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，所述步骤一中，是用 PH7. 4 的 PBS将 RV CTN-1V5做 10倍系列稀释，然后按照 1： 100- 1： 1000的比例接种 vero 单层细胞， 37 °C吸附 60分钟后补加细胞维持液，置于 37 °C、 5%∞₂培养箱内静置培养，培养 4〜6天收获病毒上清液，如此连续传 10代，得到 CTN-1V15株。

[3] 根据权利要求 2所述的狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，所述步骤二中，是将 CTN-1V15株毒种经 pH7. 4 的 PBS经 1： 10〜1： 1000稀释后，取病毒稀释液经卵黄囊接种 6〜7日龄的 SPF鸡胚，每胚 0. 5 ml，置于 37〜39 °C、相对湿度 40〜80%的全自动孵蛋箱内进行孵育，孵育至 72〜144小时，收取濒临死亡但未死亡的胚胎，去除鸡胚的头后，将躯干研磨粉碎，并按照鸡胚重量加入病毒保护液制备成 10%的病毒悬液，然后 2000 rpm、 4°C离心 10分钟，如此传一代获得 CTNCE01。

[4] 根据权利要求 3所述的狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，所述步骤三中，是将 CTNCE01用 pH7. 4的 PBS以 1 0°〜 10 ⁴稀释后，按照接种比例 1： 10〜 1： 5 X 10⁵与 CEC悬液混合均匀，分装入细胞培养瓶内，置于 35〜37 °C、 5%∞₂培养箱内培养，培养至细胞出现病变收获病毒液，继续将病毒在 CEC悬液上按照上述培养条件进行传代，适应并稳定后得到 CTNCEC25株。

[5] 根据权利要求 1所述的狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，步骤三中传代中所使用的 CEC悬液制备中采用的培养基为以 199培养基为基础，补充牛血清、 HEPES和人血白蛋白，使牛血清的终含量为 3〜10%， HEPES终含量为 20mmol/L，人血白蛋白的终含量为 0. 3〜3%，并用 7. 5%的碳酸氢钠溶液将 pH调节至 7. 4〜7. 8

[6] 根据权利要求 1所述的狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，步骤三中传代所使用的温度为 33〜36°C。

[7] 根据权利要求 1所述的狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，步骤三中传代病毒接种的最佳 M0I为 0. 001〜0.

05 FFU/细胞，收获病毒液的最佳时间为接种后 72〜96小时。

[8] 根据权利要求 1所述的狂犬病病毒 CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，每一代毒种的病毒滴度均采用细胞荧光灶转化单位实验进行。

[9] 根据权利要求 4得到的 CTNCEC25株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。