CN1795929A - 一种产生雄性不育小鼠模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雄性不育小鼠模型、建立该雄性不育小鼠模型的方法，以及该雄性不育小鼠模型的用途。在本发明的雄性不育小鼠模型中，已从基因组中剔除Kif18a基因或在Kif18a基因中插入外源基因而导致Kif18a基因失活。该雄性不育动物模型的遗传稳定、表型稳定，可用于精子发生发育机制研究、精子发育相关基因研究、精原干细胞移植及精子发生重建、生殖细胞的迁移和分化研究、筛选新型生殖不育和计划生育相关药物等应用领域。

Description

一种产生雄性不育小鼠模型的方法

技术领域

本发明涉及转基因技术领域。更具体地，涉及一种雄性不育小鼠模型、建立该雄性不育小鼠模型的方法，以及该雄性不育小鼠模型的用途。

背景技术

精子发生的正常维持不但依赖睾丸生殖细胞与支持细胞间密切的联系，而且也有赖于位于曲细精管基底膜内精原干细胞(SSCs)的正常自增值和分化，正常动物(包括人)的SSCs即能增值产生新的干细胞，也能发育分化为各级生精细胞。SSCs产生新的干细胞与分化细胞之间的比例依赖于特定的生理及环境条件，有许多基因参与生殖细胞的增值和分化(诸如Vasa，Znf，Kssk，c-KIT等)。个体可因缺乏SSCs，生精细胞发育阻断，或产生无功能性精子等原因而造成不育。

精子的发生发育方面的研究已有很多的报道，但其发生发育的调控机理仍然存在不少的谜团，生精相关基因的功能及其相互之间的关系研究多数围绕着现象观察和描述方面，精子的发生发育机理的研究、雄性不育治疗方法，避孕药物的研发都需要有相应的动物模型才能深入展开。

迄今为止，适合研究精子发生发育相关的动物模型为数极少。生精障碍小鼠模型为少数用于精子发育机理研究的模型之一。

目前，人为产生生精障碍动物模型特别是雄性小鼠不育模型主要通过给小鼠注射或喂食busulfan(白消安，即甲磺酸丁二醇二酯，为一种烷基化试剂，临床上主要用于对髓系白血病的治疗)药物，诱发精原干细胞凋亡而产生，这种小鼠模型的制作过程周期长，需要小鼠的数量大，在轻剂量作用下，残留的少量内源性干细胞能重新启动精子发生；大剂量下，往往由于药物严重的副作用，不仅造成精原干细胞的凋亡，同时能引起其他胚胎干细胞包括血液干细胞的凋亡缺失，伴有出血、泡疹、抽筋、腹泻、恶心、呕吐、呼吸困难、降低机体免疫力、怀孕小鼠产子缺陷等，另外还可造成机体产生其他癌变比如白血病的危险性，从而影响小鼠整体的生长发育，为此后的研究工作带来不利的影响，这种人为产生的动物模型不尽如人意。

因此，本领域迫切需要开发遗传稳定、表型稳定的雄性不育动物模型，以便用于生殖发生发育及机理研究。

发明内容

本发明的目的就是提供一种用于建立遗传稳定、表型稳定的雄性不育小鼠模型的方法，以及用于该方法的转基因小鼠模型。

本发明的另一目的是提供该雄性不育小鼠模型的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种产生雄性不育的非人哺乳动物的方法，它包括步骤：

(a)通过从基因组中剔除Kif18a基因或在Kif18a基因中插入外源基因，产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物的受精卵；

(b)将步骤(a)中的受精卵再生成非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中Kif18a基因由于剔除或插入外源基因而失活。

在另一优选例中，所述的步骤(b)是将步骤(a)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管，然后产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的步骤(a)是通过在Kif18a基因中插入PLAG1-EGFP融合基因。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(c)对步骤(b)获得的非人哺乳动物进行鉴定。

在另一优选例中，在步骤(b)还包括对获得的非人哺乳动物进行交配建系，获得子代。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猴。

在另一优选例中，步骤(b)中的非人哺乳动物是纯合的，即基因组中的两个Kif18a基因都由于剔除或插入外源基因而失活。

在本发明第二方面，提供了用一种因从基因组中剔除Kif18a基因或在Kif18a基因中插入外源基因而产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物是一种雄性不育动物。更佳地，所述的动物是用本发明上述方法制备的。

在本发明第三方面，提供了一种本发明所述的非人哺乳动物的用途，它被用作雄性不育模型。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是纯合的，即基因组中的两个Kif18a基因都由于剔除或插入外源基因而失活，并且是雄性。

附图说明

图1显示了组织非特异性表达质粒pCMV-EGFP/PLAG1的结构图。

图2显示了对kif18a缺失小鼠基因型的PCR鉴定结果。野生型小鼠基因组扩出942bp带，纯合子小鼠扩出559bp带，杂合子小鼠扩出942bp、559bp两条带。

图3显示了12周龄kif18a^-/-、kif18a^+/+雄性小鼠睾丸HE染色切片分析结果。野生型小鼠睾丸曲细精管有大量的各级生精细胞及精子，而kif18a缺失纯合小鼠曲细精管各级生精细胞缺失，无精子存在，曲细精管间质细胞增生。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的雄性不育模型，它是由于kif18a基因被剔除或在Kif18a基因中插入外源基因而失活的小鼠或其他非人哺乳动物。本发明的不育雄性小鼠为小睾丸，其睾丸曲细精管萎缩，管壁变薄，各级生精细胞缺失，不能产生可育的健康精子，与人类男性不育相似，为人类生殖不育的遗传性动物模型。可用于精子发生发育机制研究、精子发育相关基因研究、精原干细胞移植及精子发生重建、生殖细胞的迁移和分化研究、筛选新型生殖不育和计划生育相关药物等应用领域。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，非人哺乳动物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠。

如本文所用，术语“kif18a基因”指Genebank登录号为BC016095的基因。应理解，该术语还包括各种天然存在的kif18a基因的变异形式。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的kif18a蛋白的核苷酸序列，编码野生型kif18a蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于小鼠之外的其他哺乳动物时，该术语指kif18a基因在该哺乳动物中的同系物。例如对于人而言，该术语指人的Kif18a(已知小鼠Kif18a基因与人类Kif18a同源76％)。

在本发明中，“kif18a蛋白的保守性变异多肽”指与野生型kif18a蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                    表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

如本文所用，术语“kif18a基因失活”包括一个或两个kif18a基因被失活的情况，即包括kif18a基因杂合地和纯合地失活。例如，kif18a基因失活的小鼠可以是杂合或纯合的小鼠。

在本发明中，可基因剔除或转入外源基因而使kif18a基因失活等方法制备kif18a基因失活的非人哺乳动物(如小鼠)。在本领域中，通过基因剔除或转入外源基因而使靶基因失活的技术是已知的，这些常规技术都可用于本发明。

在本发明的一优选例中，kif18a基因的失活是通过基因剔除实现的。

在本发明的另一优选例中，kif18a基因的失活是通过kif18a基因中插入外源基因而实现的。

在本发明的一具体实例中，通过对PLAG-EGFP融合基因进行转基因显微注射，获得转基因插入失活转基因小鼠。检测表明，该PLAG1-EGFP融合基因可以较高频率插入至小鼠2号染色体重组酶蛋白作用热点的位置内，造成小鼠Kif18a基因3′端编码序列缺失。

更佳地，一种产生雄性不育小鼠的方法可包括步骤：

(a)构建Plag1-Egfp转基因质粒。转基因质粒的构建按惯常转基因载体构建方法进行，并将其线性化。

(b)利用显微注射仪将一定浓度的线性化质粒注入受精卵雄原核内，并将一定数量的注受精卵移植入受体雌鼠输卵管内。约20天后获得转基因阳性Founder小鼠。

(c)基因突变小鼠之繁育通过Founder小鼠与C57小鼠常规交配产生。

(d)转基因整合沉默：利用RT-PCR和Western杂交确证。

(e)转基因定位：采用转基因插入位点检测方法获得转基因整合位点。

(f)利用PCR扩增、Southern法，筛选kif18a基因突变小鼠基因型。

(g)基因缺失表达分析采用RT-PCR和Western杂交。

(h)病理切片分析采用HE常规切片染色及精原干细胞碱性磷酸酶染色进行。

用本发明方法获得的纯合或杂合的雌性小鼠可育，发育正常。转基因杂合雄性小鼠具有生殖能力，失活的kif18a基因失活可以孟德尔规律遗传给后代小鼠。本发明的雄性kif18a缺失纯合小鼠不育，3月龄曲细精管各级生精细胞缺失，精原干细胞缺失，表型稳定。

在一优选例中，本发明提供了一种体细胞和生殖细胞缺失Kif18a基因的纯合不育雄性小鼠。所述不育雄性小鼠除了睾丸之外的其他器官发育基本正常。该模型可用于精子发生发育机制研究、精子发育相关基因研究、精原干细胞移植及精子发生重建、生殖细胞的迁移和分化研究、筛选新型生殖不育和计划生育相关药物等应用领域。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明雄性不育小鼠模型的遗传稳定、表型稳定。

(b)用本发明方法获得的纯合或杂合的雌性小鼠可育，发育正常。转基因杂合雄性小鼠具有生殖能力，失活的kif18a基因失活可以孟德尔规律遗传给后代小鼠。

(c)所述不育雄性小鼠除了睾丸之外的其他器官发育基本正常。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

PLAG1-EGFP转基因质粒构建

以小鼠肿瘤组织或胎盘组织约100mg，按Trizol试剂(Gibico公司)说明书提取总RNA，并用TaKaRa公司AMV标准RT-PCR试剂盒进行逆转录。PCR引物根据GenBack U65002序列为模板设计，使用以下引物：

引物1(381)：5’-TTACGACACCATGAAACTTGAG-3’(SEQ ID NO：1)

引物2(2003)：5’-TGAATCCATGTCCCAGAATCCT-3’(SEQ ID NO：2)

通过PCR方法，扩增获得含PLAG1完整编码框及起始密码前100余个碱基的1623bp核苷酸产物，克隆至pGEM-Teasy载体(购自Clontech公司)中，获得pGEM-PLAG1质粒。

经测序确认无错配后，经EcoR1酶切将该片段从pGEM-PLAG1质粒上切下，插入含有增强型绿色荧光蛋白的pCMV-EGFP载体(购自Clontech公司)的EcoRI位点，获得了组织非特异性表达质粒pCMV-EGFP/PLAG1(图1)。经酶切及测序鉴定方向，表明插入方向正确。

实施例2

转基因小鼠的制备

用NsiI酶切pCMV-EGFP/PLAG1质粒，回收3.8kb的DNA片段，用于显微注射。

取6-7周龄C57BL/6J×CBA F1雌鼠，超排卵后取受精卵。将3.8kb的DNA片段经显微操作注射到受精卵雄原核中，再将注射后的受精卵植入假孕鼠输卵管单侧。经3周怀孕后，获得10只转基因小鼠。

在转基因小鼠出生后三周，剪尾提取DNA，用两套PCR引物(见下表)行PCR扩增检测，分析转基因整合阳性小鼠，并用EcoRI酶切小鼠DNA，GFP序列作探针进行Southern杂交予以确认。获得转基因阳性小鼠。这些小鼠经过交配，建立了8个转基因小鼠系。

引物	序列(5’→3’)	SEQ ID NO：
			引物3(上游)	ATCACATGGTCCTGCTGGAGTT	3
引物4(下游)	CATGTGTCTCCGGACATCCT	4
			引物5(上游)	GATGGCCACTGTCATTCCTG	5
引物6(下游)	CATGTGTCTCCGGACATCCT	6

实施例3

通过基因组测序进行转基因定位

对于实施例2获得的8个转基因小鼠系，剪尾提取DNA。利用Sau3AI消化小鼠基因组DNA后，在其两端加接头，用DNA连接酶连接后，利用基于pGEM-Teasy载体(购自Clontech公司)两端已知序列的引物与基于两端接头序列的引物配对进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接克隆至pGEM-Teasy载体，进行测序，获得与转基因插入的邻接基因组序列。

测序结果表明，EGFP/PLAG1插入片段的5′端邻接序列如下：

gctcccggcc gccatggcgg ccgcgggaat tcgattcaat agggggcgta cttggcatat      60

gatacacttg atgtactgcc aagtgggcag tttaccgtaa atactccacc cattgacgtc     120

aatggaaagt ccctattggc gttactatgg gagcatacgt cattattggc gtcaatgggc     180

gggggtcgtt gggcggtcag ccaggcgggc catttaccgt aagttatgta acgcggaact     240

ccatatatgg gctatgaact aatgaccccg taattgatta ctattaataa ctaatgcatg     300

ctttgcatac ttttgcctgc tggggagcct ggggactttc cacacctaac tgacacacat     360

tccacagctg gttctttccg cctcaggact cttccttttt caatattatt gaagcattta     420

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat acttgaatgt atttgaaaaa taaacaaata     480

ggggttccgc gcacatttcc ccggaaagtg ccacctgacg gccctgtagc ggcgcattaa     540

gcgcggcggg tgtggtagaa cttggaactc tttccttctt c                         581

(SEQ ID NO：7)

EGFP/PLAG1插入片段的3′端邻接序列如下

agctatgcat ccaacgcgtt gggagctctc ccatatggtc gacctgcagg cggccgcgaa      60

ttcactagtg attactatag ggcacgcgtg gtcgacggcc cgggctggtg attcattctt     120

tttttttaat cacacatttt ctgggaaaaa aatctcacaa ttgtacagtt agttatggtg     180

gcccacccag cactcccagc atgtgagtaa aggagtcata agttcaagcc catcgaggct     240

gcattctgag agcccatctc tacatttaat atcccatttg gttaaagtac aactttaaag     300

ctagaaaccc agctttataa tacaaaaagg ggaaactgag gcttggaaaa cttctgttca     360

ttatctggga cctccagcta caagtggatg aatccagaaa gggaacacat gctttgcata     420

cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacccta actgacacac attccacagc     480

tggttctttc cgcctcagga ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt     540

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc     600

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacccg acggccctgt agcggcgcat taagcgcggc     660

gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc     720

(SEQ ID NO：8)

经过NCBI BLAST对上述两端序列以外的内源基因组序列比对，确定EGFP/PLAG1插入在小鼠2号染色体区域，引起kif18a基因六个外显子缺失。

为了验证该插入是否具有重复性，重复实施例2，并通过PCR法检测插入位点，结果表明该插入突变具有重复性，插入突变率为12％。

实施例4

PCR法鉴定kif18a缺失纯合小鼠

实施例2中，通过转基因EGFP/PLAG1阳性小鼠之间的交配，繁育得到子代小鼠。

根据kif18a缺失两端序列及相邻转基因序列，设计和合成以下三条引物，通过三引物同时扩增，来鉴定kif18a缺失小鼠基因型。其中杂合小鼠能扩出基因组带和基因组与转基因连接突变带(942bp，559bp)，共两条带型，野生小鼠只扩出基因组条带(942bp)，纯合小鼠只扩出插入突变带(559bp)。

引物	序列(5’→3’)	SEQ ID NO：
			引物7(上游)	CTAGAGTTTCTGTTTGTTAAGAGAGC	9
引物8(下游)	TTACCGTAAATACTCCACCCAT	10
			引物9(下游)	AGAGGATTGACCTATGAGTCAT	11

PCR法鉴定kif18a缺失纯合小鼠基因型的结果如图2所示。野生型小鼠(+/+)基因组扩出942bp带，纯合子小鼠(-/-)扩出559bp带，杂合子小鼠(+/-)扩出942bp、559bp两条带。

实施例5

EGFP-PLAG1融合基因转基因沉默验证

本实施例中通过Western印迹法验证EGFP-PLAG1融合基因转基因的表达与否，方法如下：提取转基因阳性小鼠各组织蛋白，进行SDS-PAGE电泳，BIO-RAD半干法电转移蛋白条带至PDFV膜，用兔抗鼠EGFP单克隆抗体(购自SantaCruz公司)为一抗。抽提表达绿色荧光蛋白的CMV-EGFP-PLAG1质粒瞬时转染和稳定转染的NIH3T3细胞的蛋白作为阳性对照。

Western印迹分析表明，插入的EGFP-PLAG1融合基因并不表达，即插入的转基因是沉默的。同时，用RT-PCR法亦证明该EGFP-PLAG1转基因小鼠不表达插入的EGFP-PLAG1融合基因。

实施例6

kif18a缺失纯合小鼠不育

取不同年龄段kif18a纯合、杂合、野生型小鼠睾丸，进行常规的病理切片HE染色分析。

雄性纯合子小鼠从出生后不久，其睾丸出现发育异常，一月龄纯合小鼠睾丸明显小于杂合与野生型小鼠，曲细精管数量少，官腔小，各级生精细胞稀少，到三月龄时，曲细精管完全塌陷，各级生精细胞缺失，睾丸间质细胞增生，附睾管、曲细精管中空，无可育精子发生(如图3所示)。通过全身器官病理切片普查分析，未见任何其他器官异常或病变。kif18a同龄雌性纯合小鼠可育后代，而缺失纯合雄性小鼠不育，但能正常交配，配笼雌鼠可见阴道栓。

其中，12周龄kif18a^-/-、kif18a^+/+雄性小鼠睾丸HE染色切片结果如图3所示：野生型小鼠睾丸曲细精管有大量的各级生精细胞及精子，而kif18a缺失纯合小鼠曲细精管各级生精细胞缺失，无精子存在，曲细精管间质细胞增生。

讨论

人类基因组计划完成后，生命科学研究的重心已从分子和基因水平扩大到对整体动物的功能性分析及其在临床上的应用。其中模式动物，包括果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠等是最主要的研究对象。小鼠基因组与人类具有90％以上的同源性，小鼠在胚胎发育、组织器官和功能、细胞内信息传导和生化代谢通路等与人类极为相似，经过基因工程修饰的小鼠动物模型，是基因功能、人类疾病发生机制及新药研究开发最重要的模式生物。作为人类疾病的模型，小鼠动物模型已经涵盖了包括糖尿病、肥胖症、心房纤颤等心血管系统障碍等多种人类疾病的动物模型。

利用小鼠模型研究未知基因的功能，是通过基因剔除，基因突变或转基因，产生经过遗传改造的小鼠，通过对动物表型变化的分析及生理生化代谢过程的变化分析，在整体动物、细胞及分子水平解析基因的功能，从而将相关基因作为药物作用的靶点，用来进行新型药物的筛选。

转基因小鼠即是将带有真核时空、全身或组织特异性强启动子驱动的目的基因完整编码序列通过显微注射入小鼠受精卵后，转基因序列插入小鼠基因组内，启动该转基因的高表达，从而引起相应的病理或生理生化指标的变化。受精卵显微注射后，转基因在染色体上的插入位点的选择似乎具有随机性，但也有证据表明可能具有某些共同特征。如，整合位点往往出现在正向和反向重复序列区段，富含AT的区域，拓扑异构酶i，ii作用位点以及一些结构域(SAR-like，S/MAR)等附近，存在有效整合，沉默整合和毒性整合三种整合方式，其表达水平也非均一。

整合位点序列的克隆及其相关序列特征由于转基因插入的随机性和首尾串联而缺乏简洁有效的鉴定方法。本发明利用本公司独有快速的转基因插入位点检测方法获得转基因插入位点，发现该转基因品系目的转基因插入二号染色体重组酶蛋白作用热点区域内。

Kif18a基因属于Kinesin超家族成员，在小鼠机体中广泛表达，特别是在睾丸和卵巢表达量较高。该基因位于小鼠二号染色体(2E3)，含有17个外显子，编码886Aa的蛋白分子，分子量101KD。小鼠Kif18a基因与人类Kif18a同源76％，和果蝇KLP67A59％同源。Kif18a蛋白的主要结构包括该家族成员共有的保守motor domain、ATP酶结合域(ATPase binding domain)、微管蛋白结合域(tubulin binding domain)。该家族成员多数通过与微管正极结合，在ATPase作用下，消耗能量，携带细胞内各种物质小泡，沿微管分子轨道向细胞的不同部位运输。在神经细胞，主要从细胞体向神经末稍运输，在上皮细胞，则主要向基底膜的方向运输。在Kinesin超家族的分子亚群中，N8分子亚群有三成员：来自果蝇的KLP67A，来自小鼠、人类、大鼠的Kif18a、Kif18b。

本发明通过对PLAG1-EGFP融合基因进行转基因显微注射，获得转基因插入失活转基因小鼠，再对转基因小鼠进行插入位点定位，确定该转基因以较高频率插入至小鼠2号染色体重组酶蛋白作用热点的位置内，造成小鼠Kif18a基因3′端编码序列缺失，从而导致丧失kif18a的功能。

雄性kif18a缺失纯合小鼠不育，3月龄曲细精管各级生精细胞缺失，精原干细胞缺失，表型稳定。为理想的人类生殖不育的遗传性动物模型。可通过对带有标记的或野生型精原干细胞移植实验，模拟精子发生重建过程，为生殖细胞的迁移和分化研究、精子发生发育机制研究、精子发育相关基因研究提供了极为理想的小鼠模型。

本发明的这些试验结果提示，Kif18a基因参与哺乳动物生殖细胞发育的有丝分裂和减数分裂过程，并主要与精原细胞的分裂发育有关。

目前，各国科学家都把避孕研究的重点转移到精子和卵子的发生、成熟和排放等阶段。本发明首次发现的Kif18a基因，是一种与雄性生殖发育相关的功能基因，在精子形成过程中起重要作用。Kif18a基因可望作为筛选新型生殖不育和计划生育相关避孕药物的靶点，人们可通过检测药物对kif18a基因表达水平的影响，测评系列相关男性避孕药物的效价，从而设计出针对kif18a基因的男性避孕药。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                       序列表

<110>上海南方模式生物科技发展有限公司等

<120>一种产生雄性不育小鼠模型的方法

<130>049477

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

ttacgacacc atgaaacttg ag                                             22

<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

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<400>2

tgaatccatg tcccagaatc ct                                             22

<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列

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atcacatggt cctgctggag tt                                             22

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<223>引物

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catgtgtctc cggacatcct                                                20

<210>7

<211>581

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>7

gctcccggcc gccatggcgg ccgcgggaat tcgattcaat agggggcgta cttggcatat     60

gatacacttg atgtactgcc aagtgggcag tttaccgtaa atactccacc cattgacgtc    120

aatggaaagt ccctattggc gttactatgg gagcatacgt cattattggc gtcaatgggc    180

gggggtcgtt gggcggtcag ccaggcgggc catttaccgt aagttatgta acgcggaact    240

ccatatatgg gctatgaact aatgaccccg taattgatta ctattaataa ctaatgcatg    300

ctttgcatac ttttgcctgc tggggagcct ggggactttc cacacctaac tgacacacat    360

tccacagctg gttctttccg cctcaggact cttccttttt caatattatt gaagcattta    420

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat acttgaatgt atttgaaaaa taaacaaata    480

ggggttccgc gcacatttcc ccggaaagtg ccacctgacg gccctgtagc ggcgcattaa    540

gcgcggcggg tgtggtagaa cttggaactc tttccttctt c                        581

<210>8

<211>720

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>8

agctatgcat ccaacgcgtt gggagctctc ccatatggtc gacctgcagg cggccgcgaa     60

ttcactagtg attactatag ggcacgcgtg gtcgacggcc cgggctggtg attcattctt    120

tttttttaat cacacatttt ctgggaaaaa aatctcacaa ttgtacagtt agttatggtg    180

gcccacccag cactcccagc atgtgagtaa aggagtcata agttcaagcc catcgaggct    240

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cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacccta actgacacac attccacagc    480

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cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacccg acggccctgt agcggcgcat taagcgcggc    660

gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc    720

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

ctagagtttc tgtttgttaa gagagc                                         26

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

ttaccgtaaa tactccaccc at                                             22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

agaggattga cctatgagtc at                                             22

Claims (10)

1.一种产生雄性不育的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)通过从基因组中剔除Kif18a基因或在Kif18a基因中插入外源基因，产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物的受精卵；

(b)将步骤(a)中的受精卵再生成非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中Kif18a基因由于剔除或插入外源基因而失活。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)是将步骤(a)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管，然后产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)是通过在Kif18a基因中插入PLAG1-EGFP融合基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

(c)对步骤(b)获得的非人哺乳动物进行鉴定。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)还包括对获得的非人哺乳动物进行交配建系，获得子代。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猴。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的非人哺乳动物是纯合的，即基因组中的两个Kif18a基因都由于剔除或插入外源基因而失活。

8.一种用权利要求1所述方法获得的非人哺乳动物的用途，其特征在于，用作雄性不育模型。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的非人哺乳动物是纯合的，即基因组中的两个Kif18a基因都由于剔除或插入外源基因而失活，并且是雄性。

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