CN111466338A - Ddx5基因缺失的生精障碍小鼠模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Ddx5基因缺失的生精障碍小鼠模型及其构建方法，发明人在研究中发现，Ddx5基因与生精障碍或生育功能障碍之间存在关系，Ddx5基因缺失的雄性小鼠的睾丸的体积比野生型小鼠显著减小，而且其小鼠睾丸中无生殖细胞，附睾中无精子存在，与雌性小鼠交配后，无法得到任何后代。因此，Ddx5基因缺失的雄性小鼠具有稳定、生精功能抑制彻底的优点，是一种很好的雄性生育障碍疾病的研究模型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种Ddx5基因缺失的生精障碍小鼠模型及其构建方法。
背景技术
随着现代社会经济的发展、人们生活方式的改变和自然环境的恶化，不育症发病率逐渐升高，目前世界已婚夫妇中约有15％不育。其中男性不育症已成为临床上常见的性医学疾病。研究并建立男性不育症研究的动物模型为探明疾病病因、发病机制和治疗药物开发具有重要意义。
目前生精障碍模型建立方法包括物理方法，如热效应和微波辐射法；化学方法，如雷公藤多苷、白消安、雌激素等；免疫方法，如实验性抗精子抗体模型；手术方法，如实验性隐睾模型和转基因技术，如Berk基因敲除鼠。但不同的造模方法均有其弊端，比如化学方法对机体其他系统功能的损伤，物理方法对生精功能的抑制不彻底。因此，构建出稳定、副作用小、影响机制明确的生精障碍动物模型对于男性不育症的研究十分重要。
DDX5是DEAD box蛋白家族中高度保守ATP依赖的RNA解旋酶，其不仅参与RNA调节的细胞过程，而且在转录调节中发挥重要作用。Ddx5在生物进化中高度保守，小鼠与人类的DDX5蛋白的相似性高达98％。DDX5可通过其RNA解旋酶活性参与调节RNA的多种生物学功能，如：RNA可变剪接以及rRNA和mRNA的加工等。有文献报道，DDX5可作为Drosha/DGCR8复合物的一个亚基参与调控小RNA的代谢。P53和SMAD等蛋白通过与DDX5相互作用从而参与小RNA的调节作用。DDX5通过影响微小RNA(microRNA)125b的表达水平，从而调控非经典PRC1复合物里的RING1和YY1结合蛋白(RYBP)的表达水平抑制体细胞重编程。此外，DDX5也可不依赖RNA解旋酶的活性发挥功能。有文献报道，DDX5可以通过与雌激素受体互作参与调控雌激素。DDX5还能与染色质绝缘子结合蛋白CTCF相互作用，并调控CTCF的染色质绝缘功能。目前，尚未有任何研究报道Ddx5基因与生精障碍或生育功能障碍之间的关系。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种Ddx5基因缺失的生精障碍小鼠模型及其构建方法。具体技术方案如下：
一种生精障碍小鼠模型，所述小鼠模型为Ddx5基因缺失的雄性小鼠。
在其中一些实施例中，所述Ddx5基因缺失的雄性小鼠由敲除小鼠的Ddx5基因得到。
在其中一些实施例中，所述敲除小鼠的Ddx5基因的方法包括：基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因、CRISPR/Cas9技术敲除Ddx5基因、TALEN技术敲除Ddx5基因。
在其中一些实施例中，所述敲除小鼠的Ddx5基因的方法：基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因。
在其中一些实施例中，所述基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因，包括以下步骤：
(1)选用生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre与flox化的Ddx5转基因小鼠交配；所述flox化的Ddx5转基因小鼠的基因型为Ddx5flox/flox；获得生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠，所述杂合子小鼠的基因型为Ddx5flox/+-Vasa-Cre；
(2)将所述生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠与flox化的Ddx5转基因小鼠交配，得生殖系特异敲除Ddx5的纯合子小鼠，所述纯合子小鼠的基因型为Ddx5flox/flox-Vasa-Cre，即得生精障碍小鼠模型。
本发明还提供一种生精障碍小鼠模型的构建方法，包括：敲除雄性小鼠的Ddx5基因，即得生精障碍小鼠模型。
在其中一些实施例中，所述构建方法包括以下步骤：
(1)选用生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre与flox化的Ddx5转基因小鼠交配；所述flox化的Ddx5转基因小鼠的基因型为Ddx5flox/flox；获得生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠，所述杂合子小鼠的基因型为Ddx5flox/+-Vasa-Cre；
(2)将所述生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠与flox化的Ddx5转基因小鼠交配，得生殖系特异敲除Ddx5的纯合子小鼠，所述纯合子小鼠的基因型为Ddx5flox/flox-Vasa-Cre，即得生精障碍小鼠模型。
在其中一些实施例中，如上所述的构建方法，还包括对所述杂合子小鼠和所述纯合子小鼠的基因型鉴定的步骤。
在其中一些实施例中，所述基因型鉴定的方法为：以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，PCR扩增后，电泳法鉴定小鼠的Ddx5基因型；
以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增后，电泳法鉴定小鼠的Vasa-Cre基因型。
本发明还提供一种生精障碍小鼠模型的应用，具体技术方案如下：
如上所述的生精障碍小鼠模型在研究雄性生育障碍疾病中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人在研究中发现，Ddx5基因与生精障碍或生育功能障碍之间存在关系，具体表现为Ddx5基因缺失的雄性小鼠的睾丸的体积比野生型小鼠显著减小，而且其小鼠睾丸中无生殖细胞，附睾中无精子存在，与雌性小鼠交配后，无法得到任何后代。因此，Ddx5基因缺失的雄性小鼠具有稳定、生精功能抑制彻底的优点，是一种很好的雄性生育障碍疾病的研究模型。
而且，本发明采用基于Cre/loxP的基因打靶，通过转基因技术中的条件性敲除方法将Ddx5基因的敲除限制于生殖细胞/生殖器官这一特定类型细胞、组织，得到的生殖系特异敲除Ddx5小鼠，实现了避免由于全身性敲除目的基因可能引发的其它组织的损伤和干扰，可以为雄性不育症研究提供更好的模型。
附图说明
图1为生殖系特异敲除Ddx5小鼠繁殖策略示意图；
图2为小鼠的Ddx5-flox与Vasa-Cre基因型鉴定的PCR检测电泳结果图；
图3为野生型小鼠和生殖系特异敲除Ddx5雄性小鼠的生殖器官组织形态观察及睾丸重量统计结果图；
图4为野生型小鼠和生殖系特异敲除Ddx5雄性小鼠的生殖器官病理学切片检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的提供的一种生精障碍小鼠模型，该小鼠为雄性小鼠，具有Ddx5基因缺失的特点。在其中一些实施例中，所述Ddx5基因缺失的雄性小鼠由敲除小鼠的Ddx5基因得到。
可选地，所述敲除小鼠的Ddx5基因的方法包括：基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因、采用CRISPR/Cas9技术敲除Ddx5基因或采用TALEN技术敲除Ddx5基因，或是采用其他敲除方法，使得小鼠的Ddx5基因缺失即可形成雄性小鼠的圣经缺陷。
优选地，所述敲除小鼠的Ddx5基因的方法：基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因。这一方法通过转基因技术中的条件性敲除方法将Ddx5基因的敲除限制于生殖细胞/生殖器官这一特定类型细胞、组织，得到的生殖系特异敲除Ddx5小鼠，可以实现避免由于全身性敲除目的基因可能引发的其它组织的损伤和干扰，可以为雄性不育症研究提供更好的模型。
具体地，所述基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因，包括以下步骤：(1)选用生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre与flox化的Ddx5转基因小鼠交配；所述flox化的Ddx5转基因小鼠的基因型为Ddx5flox/flox；获得生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠，所述杂合子小鼠的基因型为Ddx5flox/+-Vasa-Cre；(2)将所述生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠与flox化的Ddx5转基因小鼠交配，得生殖系特异敲除Ddx5的纯合子小鼠，所述纯合子小鼠的基因型为Ddx5flox/flox-Vasa-Cre，即得生精障碍小鼠模型。
本发明还提供一种生精障碍小鼠模型的构建方法，包括：敲除雄性小鼠的Ddx5基因，即得生精障碍小鼠模型。
具体地，所述构建方法包括以下步骤：(1)选用生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre与flox化的Ddx5转基因小鼠交配；所述flox化的Ddx5转基因小鼠的基因型为Ddx5flox/flox；获得生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠，所述杂合子小鼠的基因型为Ddx5flox/+-Vasa-Cre；(2)将所述生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠与flox化的Ddx5转基因小鼠交配，得生殖系特异敲除Ddx5的纯合子小鼠，所述纯合子小鼠的基因型为Ddx5flox/flox-Vasa-Cre，即得生精障碍小鼠模型。
在其中一些实施例中，如上所述的构建方法，还包括对所述杂合子小鼠和所述纯合子小鼠的基因型鉴定的步骤。进一步地，所述基因型鉴定的方法为：以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，PCR扩增后，电泳法鉴定小鼠的Ddx5基因型；以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增后，电泳法鉴定小鼠的Vasa-Cre基因型。
下面结合具体实施例对本发明进行更全面的说明：
实施例1获得生殖系特异敲除Ddx5小鼠
1、实验动物
生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre：品系为C57BL/6，由上海交通大学吴际和中国科学院动物所李卫赠送，雌4只。flox化的Ddx5转基因小鼠：Ddx5flox/flox，品系为C57BL/6，由第三军医大学新桥医院范晔赠送，雄2只。小鼠的饲养按照SPF动物饲养标准执行。
2、获得生殖系特异敲除Ddx5小鼠
生殖系特异敲除Ddx5小鼠繁殖策略示意图如图1所示，具体步骤如下：
(1)将生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre与flox化的Ddx5转基因小鼠(Ddx5flox/flox)交配，获得F1代；
(2)取F1代小鼠脚趾，提取基因组，PCR鉴定F1代小鼠的基因型；
(3)F1代(生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠)与flox化的Ddx5转基因小鼠交配，获得F2代；
(4)取F2代小鼠脚趾，提取基因组，PCR鉴定F2代小鼠的基因型。
其中，上述PCR反应使用的引物序列如表1：
| Primers | Sequence 5'-3' | SEQ ID NO. |
| Ddx5-flox-Forward | GCTGCTCACATTGCCTTTGC | 1 |
| Ddx5-flox-Reverse | CCTTCCCAACTGTCATTCTAAGG | 2 |
| Vasa-Cre-Forward | CACGTGCAGCCGTTTAAGCCGCGT | 3 |
| Vasa-Cre-Reverse | CAGCATTGCTGTCACTTGGTC | 4 |
PCR反应体系如表2：
其中，检测Ddx5时，P1、P2分别为Ddx5-flox-Forward、Ddx5-flox-Reverse；检测Vasa-Cre时，P1、P2分别为Vasa-Cre-Forward和Vasa-Cre-Reverse。
PCR反应程序设置如表3：
PCR检测基因型结果如图2所示。
其中，图2中各泳道的检测结果表示如表4：
可见，F2代得到生殖系特异敲除Ddx5小鼠，是纯合子敲除小鼠，Vasa-Cre阳性。
实施例2生殖器官病理形态检测
观察F2代得到生殖系特异Ddx5敲除的雄性小鼠的生殖器官睾丸的形态。结果如图3所示，结果表明生殖系特异敲除Ddx5对小鼠体型外观与野生型雄鼠无明显差异(图3A)，但是和野生型相比，生殖系特异敲除Ddx5小鼠的睾丸(图3B)体积显著性减小，各取5只野生型和生殖系特异敲除Ddx5雄鼠，称量睾丸重量，敲除鼠睾丸重量显著性降低(图3C)，其中P小于0.001，具有极显著差异。
生殖系特异Ddx5敲除的雄性小鼠的生殖器官组织病理学切片(睾丸和附睾)和H&E染色(苏木精-伊红染色)，结果如图4所示，4A为野生型小鼠的睾丸切片结果，4B为生殖系特异Ddx5敲除的雄性小鼠的睾丸切片结果，4C为野生型小鼠的附睾切片结果，4D为生殖系特异Ddx5敲除的雄性小鼠的附睾切片结果。可见，野生型雄性小鼠的睾丸的曲细精管中包含处于各个阶段的生精细胞，在管腔中由外向内可见精原干细胞、精母细胞、单倍体圆形精子细胞和正在形变的长形精子细胞，附睾内部管腔中充满成熟的精子，染成深色的精子头部清晰可见；本发明实施例构建得到的生殖系特异Ddx5敲除的雄性小鼠的睾丸中存在曲细精管，但是其管腔内部无各级生精细胞，只有管壁一圈支持细胞，附睾内部管腔无任何精子。生殖系特异Ddx5敲除的雄性小鼠可以作为生精障碍小鼠模型。
实施例3生育能力检测
对同窝的野生型雄性小鼠和生殖系特异敲除Ddx5的雄性小鼠，性成熟后分别和正常的野生型雌鼠进行交配；将见栓的雌鼠单独放置，观察其生仔率。结果如表5所示：
由上表可见，野生型雄鼠与17只雌鼠交配，共获得138只幼鼠，平均每窝8.12只，而生殖系特异敲除Ddx5雄性小鼠与15只雌鼠交配后，未得到任何后代。结果统计P小于0.001，具有极显著差异。可见，本发明构建得到的生殖系特异Ddx5敲除的雄性小鼠确实无生育能力，可以作为生精障碍小鼠模型用于研究。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> Ddx5基因缺失的生精障碍小鼠模型及其构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgctcaca ttgcctttgc 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttcccaac tgtcattcta agg 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacgtgcagc cgtttaagcc gcgt 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcattgct gtcacttggt c 21
Claims (10)
1.一种生精障碍小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型为Ddx5基因缺失的雄性小鼠。
2.根据权利要求1所述的生精障碍小鼠模型，其特征在于，所述Ddx5基因缺失的雄性小鼠由敲除小鼠的Ddx5基因得到。
3.根据权利要求2所述的生精障碍小鼠模型，其特征在于，所述敲除小鼠的Ddx5基因的方法包括：基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因、CRISPR/Cas9技术敲除Ddx5基因或TALEN技术敲除Ddx5基因。
4.根据权利要求3所述的生精障碍小鼠模型，其特征在于，所述敲除小鼠的Ddx5基因的方法：基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因。
5.根据权利要求4所述的生精障碍小鼠模型，其特征在于，所述基于Cre/loxP的生殖系特异性敲除Ddx5基因，包括以下步骤：
(1)选用生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre与flox化的Ddx5转基因小鼠交配；所述flox化的Ddx5转基因小鼠的基因型为Ddx5flox/flox；获得生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠，所述杂合子小鼠的基因型为Ddx5flox/+-Vasa-Cre；
(2)将所述生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠与flox化的Ddx5转基因小鼠交配，得生殖系特异敲除Ddx5的纯合子小鼠，所述纯合子小鼠的基因型为Ddx5flox/flox-Vasa-Cre，即得生精障碍小鼠模型。
6.一种生精障碍小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：敲除雄性小鼠的Ddx5基因，即得生精障碍小鼠模型。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选用生殖细胞特异基因驱动的外源Cre表达的转基因小鼠Vasa-Cre与flox化的Ddx5转基因小鼠交配；所述flox化的Ddx5转基因小鼠的基因型为Ddx5flox/flox；获得生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠，所述杂合子小鼠的基因型为Ddx5flox/+-Vasa-Cre；
(2)将所述生殖系特异敲除Ddx5的杂合子小鼠与flox化的Ddx5转基因小鼠交配，得生殖系特异敲除Ddx5的纯合子小鼠，所述纯合子小鼠的基因型为Ddx5flox/flox-Vasa-Cre，即得生精障碍小鼠模型。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，还包括对所述杂合子小鼠和所述纯合子小鼠的基因型鉴定的步骤。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定的方法为：以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，PCR扩增后，电泳法鉴定小鼠的Ddx5基因型；
以小鼠脚趾提取到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增后，电泳法鉴定小鼠的Vasa-Cre基因型。
10.权利要求1-5任一项所述的生精障碍小鼠模型在研究雄性生育障碍疾病中的应用。
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