CN113337540B - 特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法，属于动物模型构建技术领域。本发明方法包括如下步骤：将Notch2flox/flox小鼠和Foxp3‑Cre小鼠杂交后，得到基因型为Notch2flox/+.Foxp3‑Cre+及Notch2flox/+.Foxp3‑Cre‑的两种第一代小鼠；将两种第一代小鼠进行交配，得到第二代小鼠；从第二代小鼠当中筛选出基因型为Notch2flox/ flox.FoxP3‑Cre+的小鼠，此基因型小鼠为在Treg细胞中特异性敲除Notch2基因的小鼠。本发明为研究Notch2基因在Treg细胞中的功能和作用机制提供了很好的研究模型。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法。
背景技术
近年来研究发现，调节性T细胞(Treg细胞)抑制免疫活性功能及在自身免疫疾病中发挥重要作用。叉状头/翅膀状螺旋转录因子(FOXP3)为Treg细胞的关键转录因子，在Treg细胞失衡中起到了重要作用。Treg细胞发挥免疫调节作用依赖于FOXP3高水平稳定表达。同时，Notch2基因也在机体免疫系统中发挥重要功能，Notch2基因表达异常和/或Notch2蛋白功能异常可引起免疫细胞分化和功能障碍。
故发明一种简单易行，能够快速准确建立特异性敲除Treg细胞中Notch2基因的动物模型，可以为深入研究Treg细胞中Notch2通路相关的疾病机制提供了很好的工具，具有重要的科研和临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法，为研究Treg细胞中Notch2通路相关的疾病机制提供工具。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法，包括如下步骤：将Notch2flox/flox小鼠(Notch2flox/flox小鼠在Notch2基因外显子两端插有Loxp位点)和Foxp3-Cre小鼠(Foxp3-Cre小鼠在Foxp3基因座中插入了Cre重组酶基因)杂交后，得到基因型为Notch2flox/+.Foxp3-Cre+及Notch2flox/+.Foxp3-Cre-的两种第一代小鼠；将两种第一代小鼠进行交配，得到第二代小鼠；从第二代小鼠当中筛选出基因型为Notch2flox/flox.FoxP3-Cre+的小鼠，此基因型即为成功构建的在Treg细胞中特异性敲除Notch2基因的小鼠。
优选的，所述的模型构建方法中，从第二代小鼠当中筛选出基因型为Notch2flox /flox.FoxP3-Cre+小鼠的方法为PCR方法，所用引物序列如下：
Notch2flox/flox上游引物：5'-CAACCCCAGATAGGAAGCAG-3'；
Notch2flox/flox下游引物：5'-GAGCCTTTTCCCCATATTCC-3'；
Foxp3-Cre上游引物：5'-GTGTGACTGCATGACTAACTTTGA-3'；
Foxp3-Cre下游引物：5'-TGGCTGGACCAATGTGAAC-3'。
以第二代小鼠的基因组DNA为模板进行PCR扩增，满足下述要求的小鼠为在Treg细胞中特异性敲除Notch2基因的小鼠：使用Notch2flox/flox上游引物和下游引物扩增得到1条240bp的条带，且使用Foxp3-Cre上游引物和下游引物扩增得到1条511bp的条带。
通过上述模型构建方法得到的在Treg细胞中特异性敲除Notch2基因的小鼠可用于研究Notch2基因在Treg细胞中的功能、作用机制。
本发明的优点和有益效果：本发明首次公开了一种基因敲除构建动物模型的方法，应用Cre-loxp系统成功条件性敲除Notch2基因，成功建立了特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的动物模型，以避免小鼠全身基因敲除在其它免疫细胞或者组织中产生的影响，为深入研究Notch2基因在Treg细胞中的作用奠定基础。适合于医学、生命科学、实验科研中，为探索Notch2在Treg细胞中的功能和作用机制提供了很好的研究模型，尤其是免疫学领域、肿瘤学领域的进行Notch2基因和Treg细胞的相关研究。本发明方法科学可靠可行，操作方便简单，值得推广。
附图说明
图1是Treg细胞中条件性敲除Notch2基因小鼠的构建流程图。
图2是第二代小鼠各基因型的PCR鉴定结果图。1-9号小鼠基因型分别为：Notch2+/+.Fo xp3-Cre-、Notch2flox/+.Foxp3-Cre+、Notch2flox/+.Foxp3-Cre+、Notch2flox/+.Foxp3-Cre-、Notch2flox/flox.Foxp3-Cre+、Notch2flox/+.Foxp3-Cre-、Notch2+/+.Foxp3-Cre+、Notch2flox/flox.Foxp3-Cre+。
图3是Foxp3-Cre结合后出现的基因改变示意图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、材料
1、实验动物
B6.Notch2flox/flox小鼠(货号：010525)和B6.Foxp3-Cre(货号：016959)小鼠均引种自美国Jackson实验室。B6.Notch2flox/flox小鼠在Notch2基因外显子两端插有Loxp位点，该小鼠和表达Cre重组酶小鼠杂交后，后代会在特异性表达Cre重组酶组织中特异性缺失Notch2基因。B6.Foxp3-Cre小鼠的Foxp3基因座中插入了Cre重组酶基因，当这种小鼠与含有Loxp位点序列的小鼠杂交，后代在Cre重组酶的作用下，会特异性的在Treg细胞中缺失目的基因。两种小鼠引种后于武汉大学人民医院动物中心在无特定病原体环境(SPF级)下饲养。
2、引物与主要试剂
Notch2flox/flox上游引物：5'-CAACCCCAGATAGGAAGCAG-3'；
Notch2flox/flox下游引物：5'-GAGCCTTTTCCCCATATTCC-3'。
Foxp3-Cre上游引物：5'-GTGTGACTGCATGACTAACTTTGA-3'；
Foxp3-Cre下游引物：5'-TGGCTGGACCAATGTGAAC-3'。
基因鉴定试剂盒(货号：10185)购自上海翌圣生物股份有限公司。
二、方法
1、条件性Treg细胞中Notch2基因敲除小鼠的繁育
小鼠初次交配周龄为12周，交配方式为雌雄1:1长期同居，仔鼠3周龄断乳。
条件性Treg细胞中Notch2基因敲除小鼠的构建流程图如图1所示。
对B6.Notch2flox/flox和B6.Foxp3-Cre小鼠进行杂交，获得基因型为Notch2flox/+Foxp3-Cre+及Notch2flox/+Foxp3-Cre-的第一代小鼠，然后将第一代小鼠进行杂交得到第二代子鼠。通过PCR鉴定出具有Notch2flox/flox.Foxp3-Cre+基因型的第二代子鼠，此基因型即为在Treg细胞中条件性敲除Notch2基因的小鼠。
2.Notch2基因和Foxp3-Cre重组酶基因鉴定
小鼠长至2～3周时剪取鼠尾4mm，提取鼠尾基因组DNA，使用PCR方法进行基因型的鉴定。同时取鼠尾基因组的DNA分别使用Notch2基因引物、Cre重组酶基因引物进行扩增，进行相关的基因鉴定。含有LOXP位点的纯合子Notch2基因扩增产物长度是240bp，不含Loxp位点的Notch2基因(野生型)扩增产物长度是202bp，杂合子产物240bp和202bp。Cre重组酶转基因产物长度是511bp。
三、结果
1、小鼠基因型鉴定
根据孟德尔基因分离和自由组合规律，将第一代小鼠Notch2flox/+.Foxp3-Cre+和Notch2flox/+.Foxp3-Cre-进行杂交，得到的第二代小鼠的基因型可能为：Notch2flox/ flox.Foxp3-Cre-、Notch2flox/flox.Foxp3-Cre+、Notch2flox/+.Foxp3-Cre+、Notch2flox/+.Foxp3-Cre-、Notch2+/+.Foxp3-Cre-、Notch2+/+.Foxp3-Cre+。其中基因型为Notch2flox/flox.Foxp3-Cre+的小鼠为条件性Treg细胞中Notch2基因敲除小鼠。
第二代小鼠各基因型的PCR鉴定结果见图2。
2、Foxp3-Cre基因的鉴定
Loxp位点与Cre重组酶结合，就会发生基因删除(图3)。Notch2引物PCR扩增获得的基因组产物，仅在240bp处出现1条条带的为flox纯合子，仅在202bp处出现一条条带的为野生型，在240bp、202bp处各出现1条条带的为杂合子。之后再用Cre引物PCR扩增备选小鼠的基因组，产物为511bp，可认为该小鼠的基因组中带有Foxp3-Cre基因。如果扩增产物中没有511bp，则该小鼠未携带Cre基因。
本发明首次公开了一种基因敲除构建动物模型的技术方法，应用Cre-loxp系统成功条件性敲除Notch2基因，成功建立了特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的动物模型，为深入研究Notch2基因在Treg细胞中的作用奠定基础。适合于医学、生命科学、实验科研中，需要探索Notch2在Treg细胞中的功能和作用机制提供了很好的研究模型，尤其是免疫学领域、肿瘤学领域的进行Notch2基因和Treg细胞的相关研究。本技术方法科学可靠可行，操作方便简单，值得推广。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法
<160> 4
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Claims (3)
1.一种特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法，其特征在于：包括如下步骤：将Notch2flox/flox小鼠和Foxp3-Cre小鼠杂交后，得到基因型为Notch2flox/+.Foxp3-Cre+及Notch2flox/+.Foxp3-Cre-的两种第一代小鼠；将两种第一代小鼠进行交配，得到第二代小鼠；从第二代小鼠当中筛选出基因型为Notch2flox/flox.FoxP3-Cre+的小鼠，此基因型小鼠为在Treg细胞中特异性敲除Notch2基因的小鼠。
2.根据权利要求1所述的特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法，其特征在于：从第二代小鼠当中筛选出基因型为Notch2flox/flox.FoxP3-Cre+小鼠的方法为PCR方法，所用引物序列如下：
Notch2flox/flox上游引物：5'-CAACCCCAGATAGGAAGCAG-3'；
Notch2flox/flox下游引物：5'-GAGCCTTTTCCCCATATTCC-3'；
Foxp3-Cre上游引物：5'-GTGTGACTGCATGACTAACTTTGA-3'；
Foxp3-Cre下游引物：5'-TGGCTGGACCAATGTGAAC-3'。
3.根据权利要求2所述的特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法，其特征在于：以第二代小鼠的基因组DNA为模板进行PCR扩增，满足下述要求的小鼠为在Treg细胞中特异性敲除Notch2基因的小鼠：使用Notch2flox/flox上游引物和下游引物扩增得到1条240bp的条带，且使用Foxp3-Cre上游引物和下游引物扩增得到1条511bp的条带。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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