CN115992176A - 一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法。所述方法包括将rtTA调控元件敲入猪细胞基因组Rosa26位点，将Cas9蛋白表达元件敲入猪细胞基因组Hipp11位点，所述rtTA调控元件含有rtTA蛋白编码基因，所述Cas9蛋白表达元件含有TRE3G启动子和Cas9蛋白编码基因，所述TRE3G启动子启动Cas9蛋白编码基因表达。本发明获得的模型猪可以实现一猪多用，是猪体内简便高效的基因修饰操作的实施基础，模型猪具有可稳定传代的遗传元件，利于推广应用，为猪条件性体内基因组和表观基因组编辑提供强大而灵活的平台，促进基因修饰猪模型在生物医药和农业方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法。
背景技术
猪不仅是为人类提供食物的重要家畜，也是生物医学发现的理想模型，它们在免疫系统，解剖学，生理学，器官大小和新陈代谢方面与人类有许多相似之处。尽管基因修饰猪模型并不像啮齿动物模型那样被广泛使用，但迄今为止已经产生了越来越多的对农产品、异种移植和人类疾病模型至关重要的基因修饰猪。由于具有生殖系嵌合能力的猪胚胎干细胞尚未成功建系，目前基因修饰猪主要通过直接胚胎显微注射包含CRISPR的组分或应用CRISPR系统在体细胞中进行基因编辑，然后进行体细胞核移植(SCNT)克隆，然而这两种方法繁琐，费力，低效且耗时。
有研究报道通过将SpCas9和sgRNA的表达载体直接递送到成年小鼠的特定组织中直接进行体内基因组编辑(Platt et al.,2014,Sanchez-Rivera et al.,2014,Xue etal.,2014,Swiech et al.,2015,Dow et al.,2015)，然而，总体编辑效率较低，为了克服这个问题，进一步构建了Cre依赖性SpCas9表达盒特异性插入Rosa26基因座的小鼠模型，随后，将靶向目的基因的sgRNA和Cre引入特定的体内器官/组织/细胞，以此简便有效地进行体内基因组编辑。最近，组成型表达Cas9的动物模型(例如ROSA26-SpCas9转基因猪)的产生显著降低了病毒载体的包装大小和需要递送的组分的数量，从而促进了体内基因编辑。然而，由不可控制的SpCas9表达引起的基因组损伤(XU S X,KIM J,TANG Q S,etal.2020.CAS9 is a genome mutator by directly disrupting DNA-PKdependentDNArepair pathway.Protein&Cell[J],11:352-365.)，脱靶效应(FU Y F,FODENJ A,KHAYTER C,et al.2013.High-frequency off-target mutagenesis induced byCRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology[J],31:822-+.)和免疫清除反应将阻碍具有该组成型SpCas9表达系统的动物模型的应用，这对于基于Cre重组酶系统的诱导型表达系统也是不可避免的，因为Cre激活后存在可持续的组成型SpCas9表达。此外，Cre重组酶被证实对猪胚胎发育产生负面影响(WHITWORTH K M,CECIL R,BENNE J A,et al.2018.Zygote injection ofRNA encoding Cre recombinase results inefficient removal ofLoxP flanked neomycin cassettes in pigs.TransgenicResearch[J],27:167-178.)并且在哺乳动物基因组中具有假重组位点的潜在遗传毒性。
综上所述，提供一种高效构建基因修饰模型猪的方法，对于疾病治疗和药物研发领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪，以期解决目前Cas9蛋白在大动物猪上直接进行体内递送存在成本高、效率低、免疫原性大等问题，以及Cas9蛋白的长期或持续性表达引起的脱靶、基因组损伤等问题。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，所述方法包括：
将rtTA调控元件敲入猪细胞基因组Rosa26位点，将Cas9蛋白表达元件敲入猪细胞基因组Hipp11位点，所述rtTA调控元件含有rtTA蛋白编码基因，所述Cas9蛋白表达元件含有TRE3G启动子和Cas9蛋白编码基因，所述TRE3G启动子启动Cas9蛋白编码基因表达。
本发明通过将二元Tet-On元件，rtTA调控元件和TRE3G控制的Cas9蛋白表达元件分别敲入猪细胞基因组ROSA26和HIPP11位点，以此构建多西环素(Doxcycline，Dox)诱导Cas9蛋白表达的(Doxcycline Induced Cas9，DIC)模型猪，其允许通过体外和体内简单的化学诱导实现灵活地时间控制猪中的Cas9蛋白活性，只有在Dox存在的情况下，rtTA和Dox才能结合到TRE3G启动子，从而激活TRE3G启动子启动Cas9和红色荧光蛋白表达。利用这种模型猪，通过简单地将向导RNA(gRNA)传递至猪胎儿成纤维细胞(PFF)和/或特定组织中并在Dox诱导后，可以实现体外和/或体内基因编辑(基因敲除或基因激活)和染色体工程。与啮齿类相比，免疫系统和人类更相似的猪，通过体内基因突变建立癌症动物模型具有明显优势。DIC模型猪克服了Cas9蛋白的体内递送难题，避免了组成型Cas9表达的副作用，并消除了潜在的Cre介导的遗传毒性，这将为猪条件性体内基因组和表观基因组编辑提供强大而灵活的平台，促进基因修饰猪模型在生物医药和农业方面的应用。
优选地，所述rtTA调控元件敲入Rosa26位点的第一个内含子中。
优选地，所述rtTA蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
优选地，所述Cas9蛋白编码基因包括SpCas9蛋白编码基因。
优选地，所述SpCas9蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地，所述TRE3G启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
优选地，所述rtTA调控元件还含有药物筛选标记基因。
优选地，所述药物筛选标记基因包括neo基因。
优选地，所述neo基因的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
优选地，所述rtTA调控元件的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
优选地，所述Cas9蛋白表达元件还含有药物筛选标记基因。
优选地，所述药物筛选标记基因包括puro基因。
优选地，所述puro基因的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
本发明中，所述药物筛选标记基因可以为本领域通用的进行遗传改造后筛选的标记基因，如抗性基因等，不作特殊限制。
本发明中，所述rtTA调控元件和Cas9蛋白表达元件中的药物筛选标记基因不同，以便于进行遗传改造后筛选。
优选地，所述Cas9蛋白表达元件还含有报告基因。
本发明中，所述报告基因可以为本领域通用的表达产物易被检测、且易于与内源性背景蛋白区别的基因，例如荧光蛋白基因等，不作特殊限制。
优选地，所述报告基因包括tdTomato基因。
优选地，所述tdTomato基因的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
优选地，所述Cas9蛋白表达元件的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
SEQ ID NO.1：
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SEQ ID NO.2：
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SEQ ID NO.3：
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SEQ ID NO.4：
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SEQ ID NO.5：
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SEQ ID NO.6：
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SEQ ID NO.7：
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SEQ ID NO.8：
ttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttatacttgctagcgtcgacaagcttatggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaagacgatgacgataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgacaagcgtcctgctgctactaagaaagctggtcaagctaagaaaaagaaaggatccgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctcgggccccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagc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优选地，所述敲入的方法包括CRISPR/Cpf1方法。
优选地，所述猪细胞包括猪胎儿成纤维细胞。
本发明中，探索诱导DIC模型猪猪胰腺内Cas9高表达的给药方式，发现按照20～100mg/kg/d(天)的剂量，通过口服加上隔天腹腔注射Dox的生理盐水溶液，即可实现Cas9蛋白在胰腺不同部位的高表达，并且未观察到由Dox引起的不良反应。
第二方面，本发明提供第一方面所述的构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法在对猪进行基因编辑中的应用。
第三方面，本发明提供一种对猪进行基因编辑的方法，所述方法包括；
利用第一方面所述的构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法方法构建模型猪，将基因编辑元件导入所述模型猪的细胞中进行基因编辑。
优选地，所述基因编辑元件包括向导RNA和/或外源基因表达盒。
本发明中，所述向导RNA可以是任意靶向目的基因的向导RNA，不作特殊限制。
本发明中，可通过向导RNA对目的基因进行敲除，亦可通过含有MS2环的deadsgRNA激活或增强靶基因的mRNA转录，从而增加表达水平。
本发明中，基于第一方面所述的构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法方法构建的DIC模型猪，通过简单地将向导RNA传递至DIC模型猪胎儿成纤维细胞(PFF)和/或特定组织中并在Dox诱导后，可以实现体外和/或体内基因编辑(基因敲除或基因激活)和染色体工程。
本发明一具体实施例中，应用DIC模型猪，通过递送TP53 sgRNA，LKB1 sgRNA和KRASG12D突变体至胰腺内，进行Dox诱导后，构建了原发和转移性胰腺导管腺癌(PDAC)猪模型。
第四方面，本发明提供由第一方面所述的构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法或第三方面所述的对猪进行基因编辑的方法构建的模型猪在药物实验和药物筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明设计构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，获得的DIC模型猪可以实现一猪多用，是猪体内简便高效的基因修饰操作的实施基础，DIC猪具有可稳定传代的遗传元件，已形成种系，利于推广应用；
(2)利用DIC模型猪，单或多基因的遗传干扰，包括基因敲除和基因表达激活，均可以通过简单地递送工程化的向导RNA或与转录激活蛋白组合来实现，亦适用于Cas9蛋白的毒性作用和线性追踪研究；
(3)本发明还实现了成体猪的体内基因编辑，从而快速建立了由肿瘤抑制基因TP53和LKB1敲除，以及活化的原癌基因KRASG12D表达，驱动的原发恶性PDAC猪模型。
附图说明
图1A为Cpf1介导的猪Hipp11位点定点敲入TRE3G启动SpCas9表达元件示意图；
图1B为PCR鉴定不同细胞克隆Hipp11位点敲入5’同源臂和3’同源臂结果图；
图1C为Dox诱导的阳性克隆1#和23#的红色荧光表达图；
图1D为Dox诱导体细胞核移植重构胚胎的红色荧光表达图；
图2为流式分析Dox诱导克隆猪耳朵成纤维细胞红色荧光表达比例图；
图3为Dox诱导克隆猪耳朵成纤维细胞红色荧光表达图；
图4为Western Blot分析Dox诱导克隆猪耳朵成纤维细胞红色荧光蛋白表达水平图；
图5A为PCR鉴定猪胎儿Rosa26和Hipp11位点基因型图；
图5B为Western Blot分析Dox诱导猪胎儿成纤维细胞红色荧光蛋白表达水平图；
图5C为流式分析Dox诱导猪胎儿成纤维细胞红色荧光表达比例图；
图5D为Dox诱导猪胎儿成纤维细胞红色荧光表达图，比例尺为200μm；
图5E为Dox诱导以及撤掉Dox不同时间猪胎儿成纤维细胞红色荧光表达图，比例尺为200μm；
图5F为流式统计Dox诱导以及撤掉Dox不同时间猪胎儿成纤维细胞红色荧光表达比例图；
图6为Dox诱导的不同靶基因的编辑效率图；
图7为ALK-EML4染色体重排示意图；
图8为PCR及Sanger测序验证染色体倒位(inversion)、大片段删除(Largefragement deletion)情况图；
图9为RT-PCR及Sanger测序检测融合基因EML4-ALK结果图；
图10为Q-PCR检测CDX2基因表达情况图；
图11为Q-PCR检测SOX2基因表达情况图；
图12为Western Blot分析Dox诱导猪各器官SpCas9蛋白表达水平图；
图13为免疫组织化学检测不同Dox处理方式诱导猪各器官SpCas9蛋白表达水平图；
图14为PET-CT检测AAV6-PKL注射及Dox诱导后DIC猪结果图；
图15为DIC猪解剖后不同器官图；
图16为Q-PCR检测胰腺肿瘤组织KRASG12D表达水平图；
图17为免疫组织化学染色检测胰腺细胞及肿瘤标志物表达情况图；
图18为HE染色分析不同器官生理结构图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例构建及繁育Dox诱导Cas9表达的模型猪。
首先针对猪基因组内开放性位点ROSA26和文献已报道的安全性位点HIPP11，采用CRISPR/Cpf1技术，分别设计gRNA(靶序列：ACTAAACGGTAGAAAACAGCCTGA，通过引物对退火和T4 DNA连接酶(NEB)将其克隆到BbsI酶切的U6 gRNA的质粒(Addgene 48962)或表达H1gRNA的质粒(Addgene53186)中)和打靶载体(从pFlexibleDT-pRosa26-iCas9靶向质粒PCR扩增SpCas9-T2A-tdTomato片段，随后用多片段重组试剂盒(Vazyme)按照说明书方法，重组扩增的上述片段和Nhe I(Thermo Fisher)和Pme I(Thermo Fisher)酶切的pFlexible-Hipp11-TRE3G-tdTomato质粒，从而获得Sanger测序验证正确的pFlexible-Hipp11-TRE3G-SpCas9-T2A-tdTomato质粒)，然后在猪场取怀孕35天左右母猪子宫，放入灭菌塑料袋置于冰盒内保存，运回实验室，在细胞间洁净环境内，用已灭菌的手术剪刀剪开子宫，小心剥离胎儿，用PBS冲洗3遍，在超净工作台内除去胎儿头部、尾部、四肢及内部脏器，留下胎儿躯干皮肤，剪碎后用胶原酶消化，接着贴壁培养获得胎儿成纤维细胞，将上述gRNA、打靶载体及Cpf1质粒通过Life technologies电转染系统导入胎儿成纤维细胞内，同时将带有neo抗性的rtTA元件(SEQ ID NO.5)敲入ROSA26位点第一个内含子，实现猪内源ROSA26启动子启动rtTA表达，将带有puro抗性的TRE3G启动Cas9-T2A-tdTomato表达元件(SEQ ID NO.8)敲入HIPP11位点(如图1A所示)，进行G418和puro双药物筛选及PCR鉴定，结果如图1B所示，能同时扩增出目的大小5’，3’同源臂的克隆为阳性克隆，对筛选阳性克隆进行荧光检测，结果表明可以成功实现在细胞水平(图1C)及胚胎水平(图1D)的Dox(Doxycycline，多西环素)诱导SpCas9-T2A-tdTomato表达，获得了双位点定点敲入阳性细胞克隆。
然后以阳性细胞克隆为供核细胞进行体细胞核移植，成功获得了3头Dox诱导Cas9表达的Founder公猪，其中有1头是弱仔，出生后不久死亡。10个月后，Founder猪发育到性成熟，与野生型母猪交配，获得了F1代Dox诱导Cas9表达模型猪模型。进一步繁殖选育大量模型猪模型，建立稳定的Dox诱导Cas9表达的模型猪品系。对从模型猪(编号为9602-1，9602-3，9602-5，0101-5，其中9602-3为双位点敲入猪)分离的耳朵成纤维细胞及其核移植克隆胚胎进行Dox诱导实验，免疫荧光图片(图3)和Western Blot实验结果(图4)均仅在9602-3可以检测到Cas9表达，流式分析结果(图2)也可以检测到9602-3红色荧光蛋白表达比例，而不加Dox情况下没有检测到Cas9表达泄漏，表明成功构建Dox诱导Cas9表达的模型猪。
实施例2
本实施例进行体外验证Dox诱导的基因组以及表观基因组编辑。
为了在体外验证Dox诱导的SpCas9蛋白的DNA切割活性，从与实施例1获得的DICFounder猪交配的怀孕野生型母猪取回的35日龄胎儿中分离获得6株DIC猪胎儿成纤维细胞(PFF)，分别编号为DIC-F-PFF-1，2，3，4，5，6，如图5A所示，琼脂糖凝胶电泳PCR产物图显示DIC-F-PFF-3，4号为双位点定点敲入。蛋白质印迹(图5B)，流式分析(图5C)，免疫荧光染色结果(图5D)均显示，在DIC阳性PFF中，Dox严格控制着SpCas9的表达。通过用Dox连续刺激，如图5E和5F所示tdTomato阳性PFF的百分比从第1天到第6天逐渐增加，撤回Dox后，tdTomato阳性PFF的百分比逐渐下降。
然后构建了8个分别靶向猪TP53，APC，KRAS，OCT4，LMNA，ALK和EML4基因的sgRNA(表1)质粒并转入DIC猪胎儿成纤维细胞中，在培养基中添加Dox，对上述8个基因进行扩增并对扩增产物进行测序，扩增的这8个靶位点的PCR产物Sanger测序结果显示诱导的SpCas9可以切割所有测试的靶位点的猪基因组，基因组编辑的效率范围为4.5％至64.3％(图6)。
表1
| 目标基因 | 目标位点 | 目标序列 |
| TP53 | Exon4 | GCAGCTATGATTTCCGTCTAGGG |
| APC | Exon7 | GGCAACTTCGGGTAACGGTCAGG |
| KRAS | Exon2 | GTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGG |
| OCT4 | Exon1 | GCGCACCTCAGGTCGGAGTGGGG |
| LMNA | Exon3 | GGCATCAAGTCTGCCTACGAGG |
| ALK | Intron13 | GGATTAGAACACAAGTCCTCGGG |
| EML4 | Intron14 | GTGAAGTGCCAGAGCATACAAGG |
| PCSK9 | Exon1 | GGTGCTCGGCTTCAGGTCGGAGG |
接下来，本实施例进一步研究了DIC系统是否可用于改造染色体，如染色体倒位和大片段缺失(图7)。将测试的ALK sgRNA和/或EML4 sgRNA(表1)转染到DIC猪的PFF中，PCR和Sanger测序结果显示，在Dox处理的DIC细胞中成功诱导染色体倒位(inversion)和大片段缺失(deletion)(如图8所示)，同时递送ALK sgRNA和EML4 sgRNA，TA克隆的RT-PCR和随后的Sanger测序结果表明(图9)，EML4-ALK融合转录本也已在这些细胞中成功表达，此外，通过pre-tRNA序列的ALK-sgRNA连接的EML4-sgRNA的级联结构也可以导致DIC的PFF中染色体倒位和大片段缺失，具有相似的Dox诱导染色体工程效率。
为了扩大DIC系统在基因组编辑之外的适用性，本实施例测试了内源基因激活是否可以通过含有MS2环的dead sgRNA及转录激活复合物的组合来实现。为了避免由SpCas9和sgRNA复合物产生的双链断裂，选择携带短靶序列(14bp)的sgRNA来失活SpCas9的切割活性。设计了含有转录激活复合物MS2-P65-HSF1(MPH)和具有MS2环的系列工程化dead sgRNA表达质粒，在翻译起始位点(ATG)的上下游150bp范围内选择用于基因激活的短dgRNAs，并将其克隆到BbsI酶切消化的MS2-sgRNA质粒(Addgene 61424)中。将质粒lenti-MS2-P65-HSF1(Addgene 61426)的MPH反式激活域克隆到CMV启动子下游。表观基因组编辑载体含有六个由U6启动子驱动的sgRNA片段，通过Golden Gate方法组装(Cermak,T.et al.NucleicAcids Res.39,doi:10.1093/nar/gkr218(2011)。当含有转录激活复合物MS2-P65-HSF1(MPH)和具有MS2环的系列工程化dead sgRNA表达质粒共转染Dox处理的DIC细胞时，转录机器可以通过SpCas9蛋白和含有MS2环dead sgRNA复合物募集到靶基因座，然后激活或增强靶基因的mRNA转录，从而增加表达水平。针对CDX2和SOX2基因座，分别设计并构建了位于翻译起始位点上游100bp内的六个含有MS2环dead sgRNA(dgRNA-1，dgRNA-2，dgRNA-3，dgRNA-4，dgRNA-5和dgRNA-6)，还通过Golden Gate技术构建了六个串联的含有MS2环dead sgRNA来引发更高水平的基因激活，如表2所示。对于CDX2基因座，Q-PCR结果表明所有六种dgRNA可用于增加转录水平1.74至170.10倍，使用六种dead sgRNA串联更可实现高达187倍的变化(图10)。对于SOX2基因座，仅dgRNA-4和dgRNA-6单独显示出分别以3.8倍变化和2.8倍变化增加基因表达(图11)。然而，当六个dgRNA串联使用时，SOX2表达实现了15.1倍的变化。
表2
| CDX2-dgRNA1-F | CACCGTCCCCAGGCAGCA |
| CDX2-dgRNA1-R | AAACTGCTGCCTGGGGAC |
| CDX2-dgRNA2-F | CACCGCAGCCTCCAGCGT |
| CDX2-dgRNA2-R | AAACACGCTGGAGGCTGC |
| CDX2-dgRNA3-F | CACCGGGGAAGGGGCGAG |
| CDX2-dgRNA3-R | AAACCTCGCCCCTTCCCC |
| CDX2-dgRNA4-F | CACCGCAGCAGCGCGCTC |
| CDX2-dgRNA4-R | AAACGAGCGCGCTGCTGC |
| CDX2-dgRNA5-F | CACCGCGGTCCCTCCCTC |
| CDX2-dgRNA5-R | AAACGAGGGAGGGACCGC |
| CDX2-dgRNA6-F | CACCGAAGGAAGAAAGAG |
| CDX2-dgRNA6-R | AAACCTCTTTCTTCCTTC |
| SOX2-dgRNA1-F | CACCGCTGTGCGCGGGCC |
| SOX2-dgRNA1-R | AAACGGCCCGCGCACAGC |
| SOX2-dgRNA2-F | CACCGGGTCGGCTGCTGC |
| SOX2-dgRNA2-R | AAACGCAGCAGCCGACCC |
| SOX2-dgRNA3-F | CACCGGCCGGGACTTTGG |
| SOX2-dgRNA3-R | AAACCCAAAGTCCCGGCC |
| SOX2-dgRNA4-F | CACCGAGGAGAGGCGGGC |
| SOX2-dgRNA4-R | AAACGCCCGCCTCTCCTC |
| SOX2-dgRNA5-F | CACCGTCTGATTTTCCTCG |
| SOX2-dgRNA5-R | AAACCGAGGAAAATCAGAC |
| SOX2-dgRNA6-F | CACCGGCAAACTGGAATC |
| SOX2-dgRNA6-R | AAACGATTCCAGTTTGCC |
实施例3
本实施例分析诱导DIC模型猪胰腺内SpCas9高表达的给药方式。
对实施例1获得DIC模型猪进行体内药物诱导实验，检测是否能诱导包括胰腺在内的各器官SpCas9蛋白表达，按照50mg/kg/d的剂量，连续灌喂刚出生模型猪Dox溶液，一周后处死，解剖获取胰腺(Pancreas)，在暗室内激光灯激发下可以观察到胰腺内有明显的红色荧光蛋白表达，用RIPA裂解液提取包括胰腺在内的各器官总蛋白进行WB实验，检测到SpCas9蛋白表达(图12)。取一小块新鲜取得各器官/组织用OCT包埋剂进行包埋，在液氮里速冻然后进行冰冻切片，通过免疫组织化学染色实验也检测到各器官存在SpCas9蛋白的表达(图13)。由于长期过量服用Dox会引起恶心、呕吐、腹泻等胃肠不良反应，严重时还会产生肝肾毒性，为了实现更安全且高效率的Dox诱导胰腺内SpCas9表达，给予模型猪不同剂量的Dox及通过不同给药方式，包括口服、腹腔注射、肌肉注射等，然后对其诱导SpCas9表达的效率进行检测。用4％多聚甲醛(PFA)分别固定新鲜取样的胰腺头部、中部及尾部组织，进行石蜡切片以及免疫组化(IHC)实验检测，结果发现按照50mg/kg/d的剂量，通过口服加上隔天腹腔注射Dox的生理盐水溶液，即可实现SpCas9蛋白在胰腺不同部位的高表达，并且未观察到由Dox引起的不良反应。
实施例4
本实施例利用DIC工具猪构建胰腺癌模型猪。
向实施例1获得的DIC模型猪胰腺导管及腺体内注射含有KRASG12D表达盒(atgactgaatataaacttgtggtagttggagctgAtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagaggagtacagtgcaatgagggaccagtacatgaggactggggagggctttctttgtgtatttgccataaataatactaaatcatttgaagatattcaccattatagagaacaaattaaaagagttaaggactctgaagatgtacctatggtcctagtaggaaataaatgtgatttgccttctagaacagtagacacaaaacaggctcaggacttagcaagaagttatggaattccttttattgaaacatcagcaaagacaagacagggtgttgatgatgccttctatacattagttcgagaaattcgaaaacataaagaaaagatgagcaaagatggtaaaaagaagaaaaagaagtcaaagacaaagtgtgtaattatgtaa)及靶向抑癌基因TP53和LKB1的gRNA(U6-TP53-sgRNA：aaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGCAGCTATGATTTCCGTCTAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt；U6-LKB1-sgRNA：aaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggactcagaaacgctgtgcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt)的腺相关病毒(AAV)。恢复两周，然后按照50mg/kg/d的剂量，口服加隔天腹腔注射Dox溶液诱导SpCas9表达一周，在胰腺内产生致癌的基因突变，三个月至六个月后，致癌突变进一步累积，最后诱导产生胰腺癌猪模型，利用PET-CT进行影像学分析，监测到胰腺癌发生及向其它器官转移(图14和图15)。取肿瘤组织样本，提取基因组，利用高保真的DNA聚合酶进行PCR扩增加接头建库、NGS，统计、分析TP53和LKB1的基因编辑情况。另取新鲜肿瘤组织样本将其完全浸泡在4％PFA中固定，然后进行石蜡包埋切片，利用苏木精-伊红染色(H&E)进行胰腺癌组织病理学诊断，IHC检测胰腺癌相关肿瘤标志物，利用Trizol分别提取肿瘤组织与对照正常组织的总RNA，Q-PCR检测KRASG12D在胰腺癌组织内的表达情况(图16)，IHC结果显示实验组胰腺导管上皮标志物CK-19，E-cadherin表达阳性，肿瘤标志物PCNA表达阳性，肿瘤基质标志物Vimentin表达阳性(图17)，HE和Masson染色结果均显示异常紊乱的肿瘤增生结构(图18)，上述均证明成功构建胰腺癌猪模型。
综上所述，本发明设计构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，获得的DIC模型猪可以实现一猪多用，包括基因敲除和基因表达激活，均可以通过简单地递送工程化的向导RNA或与转录激活蛋白组合来实现，亦适用于Cas9蛋白的毒性作用和谱系示踪研究，还实现了成体猪的体内基因编辑，从而快速建立了由肿瘤抑制基因TP53和LKB1敲除，以及活化的原癌基因KRASG12D表达，驱动的原发恶性PDAC猪模型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，其特征在于，所述方法包括：
将rtTA调控元件敲入猪细胞基因组Rosa26位点，将Cas9蛋白表达元件敲入猪细胞基因组Hipp11位点；
所述rtTA调控元件含有rtTA蛋白编码基因；
所述Cas9蛋白表达元件含有TRE3G启动子和Cas9蛋白编码基因，所述TRE3G启动子启动Cas9蛋白编码基因表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rtTA调控元件敲入Rosa26位点的第一个内含子中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述rtTA蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
优选地，所述Cas9蛋白编码基因包括SpCas9蛋白编码基因；
优选地，所述SpCas9蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；
优选地，所述TRE3G启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述rtTA调控元件还含有药物筛选标记基因；
优选地，所述药物筛选标记基因包括neo基因；
优选地，所述neo基因的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列；
优选地，所述rtTA调控元件的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白表达元件还含有药物筛选标记基因；
优选地，所述药物筛选标记基因包括puro基因；
优选地，所述puro基因的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白表达元件还含有报告基因；
优选地，所述报告基因包括tdTomato基因；
优选地，所述tdTomato基因的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列；
优选地，所述Cas9蛋白表达元件的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
7.权利要求1-6任一项所述的构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法在对猪进行基因编辑中的应用。
8.一种对猪进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括；
利用权利要求1-6任一项所述的构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法构建模型猪，将基因编辑元件导入所述模型猪的细胞中进行基因编辑。
9.根据权利要求8所述的对猪进行基因编辑的方法，其特征在于，所述基因编辑元件包括向导RNA和/或外源基因表达盒。
10.由权利要求1-6任一项所述的构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法或权利要求8或9所述的对猪进行基因编辑的方法构建的模型猪在药物实验和药物筛选中的应用。
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Cited By (1)
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| CN116790676A (zh) * | 2023-08-24 | 2023-09-22 | 苏州药明康德新药开发有限公司 | 一种基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法 |
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2022
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| CN116790676B (zh) * | 2023-08-24 | 2023-11-28 | 苏州药明康德新药开发有限公司 | 一种基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法 |
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